DE60014028T2

DE60014028T2 - Funktionalisierte verbindung, gegebenenfalls markierte polynukleotide und verfahren zur detektion einer zielnukleinsäure

Info

Publication number: DE60014028T2
Application number: DE60014028T
Authority: DE
Inventors: Eric Defranc; Ali Laayoun; Jean Lhomme; Emmanuelle Trevisiol
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-01-05
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2020-01-06
Also published as: CA2357793A1; AU3050800A; ATE277065T1; US6875858B1; WO2000040590A2; EP1140963A2; EP1140963B1; DE60014028D1; WO2000040590A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Folgendes, nämlich eine neue nucleotidische oder nucleotidische Verbindung, die mit einer Alkylketongruppe funktionalisiert wurde, ein Polynucleotid das zumindest eine nucleotidische Einheit aufweist, die mit einer Alkylketongruppe funktionalisiert wurde, vor und nach einer Markierung, sowie die Herstellung und die Anwendung dieser Produkte, insbesondere zur Detektion von Nucleinsäuresequenzen.
Auf dem Gebiet der Nucleinsäuren ist die Synthese von funktionalisierten Nucleotiden, insbesondere im Bereich der Diagnostik und ganz besonders zur Herstellung von markierten Nucleinsonden, beschrieben, die zur Detektion einer Zielnucleinsäure verwendbar sind.
Bei dem Erhalt dieser Sonden stellen sich zwei Hauptprobleme. Erstens muss das funktionalisierte Nucleotid in ein Polynucleotid eingebaut werden. Zweitens muss die durch das Nucleotid getragene Funktion für die Verwendung des Polynucleotids als Detektionssonde in der Lage sein, auf spezifische und effiziente Weise mit einem Tracer zu reagieren.
So beschreibt das Patent EP-A-0 407 816 Derivate von Uracil, die in 5-Position modifiziert sind, zur Herstellung von Sonden auf chemischem oder enzymatischem Weg. Mit dem gleichen Ziel beschreiben die Patente WO-A-86/06726 und EP-A-0 212 951 Cytosinderivate, die in 4-Position modifiziert sind. Das Patent EP-A-0 254 646 beschreibt ein Derivat von Adenosin, das in 8-Position modifiziert ist.
Das Patent WO-A-92/00989 beschreibt die Verwendung, insbesondere von modifizierten Nucleotiden zum Einführen von Proteinen in Polynucleotide.
Der Patentanmeldung WO-A-98/05766 der Anmelderin stellt sich das Problem der Aufnahme von funktionalisierten Nucleotiden, die durch eine enzymatische Reaktion und insbesondere durch enzymatische Amplifikationstechniken aufgenommen werden können, nicht nur zur Herstellung von markierten Sonden, sondern auch direkt, um ein markiertes Ziel zu erzeugen. In diesem Fall sind die Anforderungen an die Empfindlichkeit besonders wichtig und die Auswahl des funktionalisierten Nucleotids ist entscheidend, um eine angemessene Empfindlichkeit zu erreichen.
Eine gewisse Anzahl an nucleophilen Funktionen, wie Aminfunktionen oder Alkoxyaminfunktionen, oder elektrophilen Funktionen, wie Aldehydfunktionen, die eine effiziente Aufnahme des funktionalisierten Nucleotids im Laufe der Amplifikation ermöglichen, sind beschrieben, aber es besteht trotzdem ein Bedarf an noch effizienteren funktionalisierten Nucleotiden, insbesondere im Hinblick auf die Einfachheit der Herstellung, im Hinblick auf die Neutralität gegenüber enzymatischen oder chemischen Reaktionen und im Hinblick auf die Reaktivität für die Markierung des Nucleotids mit einem Tracer nach der Aufnahme.
Es wurde von der Anmelderin gefunden, dass die Alkylketonfunktion überraschenderweise die zuvor genannten Nachteile beseitigt.
Wenn der Stand der Technik die Verwendung von R-CO-Motiven, in denen R eine Alkylgruppe ist im Fall von der Synthese von Oligonucleotiden (WO-A-93/22326) beschreibt, ist das Ziel dieser Funktion das exocyclische Amin der Basen zu schützen. Am Ende der Synthese wird das Amin durch die Wirkung eines alkalischen Mittels entschützt.
Um diesen Stand der Technik zu illustrieren, kann man die folgenden Dokumente zitieren. Der Artikel von K. K. Ogilvie und M. J. Nemer, Tetrahedron Letters, Vol. 21, (1980), Seiten 4145 bis 4148 offenbart als Zwischenprodukt der Synthese eines Nucleotids eine nucleotidische Verbindung, die eine Laevulinoylgruppe trägt, die mit der Hydroxylfunktion in 3'-Stellung der Pentose verbunden ist. Die Einführung dieser Gruppe hat zum Ziel, die OH-Funktion zu schützen, und wird außerdem nach Erhalt dieser Verbindung entfernt. Der Artikel von C. T. J. Wreesmann et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, No. 23, (1983), Seiten 8389 bis 8405 beschreibt den Erhalt eines dinucleotidischen Zwischenprodukts einer Synthese, dessen Hydroxylfunktionen durch Laevulinoylgruppen geschützt sind. In Anwesenheit von Ammoniak werden die Hydroxylfunktionen freigesetzt.
Die Alkylketonfunktion, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist ausreichend stabil, um dieser Art der Behandlung zu widerstehen, und stellt daher keine Schutzgruppe dar und ihre Stabilität gegenüber anderen chemischen Syntheseverfahren hat eine größere Einfachheit bei der Herstellung zur Konse quenz, insbesondere im Vergleich mit Amin-, Aldehyd- oder Alkoxyaminfunktionen wie im Patent WO-A-98/05766 beschrieben.
Desgleichen sind in den zuvor genannten Patenten (EP-A-0 407 816, WO-A-86/06726, EP-A-0 212 951, EP-A-0 254 646 und WO-A-92/00989) die zum Funktionalisieren der Nucleotide beschriebenen Funktionen ausgewählt aus den unter chemischen Gesichtspunkten reaktiven Funktionen wie den Amin- und Thiolfunktionen, die ggf. geschützt sind. Wenn diese Funktionen geschützt sind, ist ein Schritt des Entschützens notwendig, was den Schritt der Markierung komplizierter macht. Wenn diese Funktionen frei sind, kann eine Inhibition der enzymatischen Reaktion oder im Fall der chemischen Synthese können Nebenreaktionen stattfinden.
Obwohl die chemische Stabilität der Alkylketonfunktion keinen guten Kandidaten für eine Kopplungsreaktion mit einem Marker ergibt, beweist die vorliegende Erfindung auf überraschende Weise, dass diese Funktion gegenüber der Markierung reaktiv ist und dass außerdem die Detektion des Produkts nach der Markierung sehr empfindlich ist.
Schließlich zeigen die Nucleotide, die diese Funktion tragen, eine ausgezeichnete Neutralität gegenüber enzymatischen Reaktionen und somit ist es in einer enzymatischen Reaktion möglich, ein natürliches Nucleotid vollständig durch ein Nucleotid zu ersetzen, das diese Alkylketonfunktionen trägt, ohne die Ausbeute dieser Reaktion zu beeinträchtigen und diese noch überraschender in gewissen Fällen zu verbessern.
Das Dokument WO-95/24185 beschreibt ein Nucleosid, das mit einer Alkylketongruppe modifiziert wurde, deren Alkylabschnitt bis zu 20 Kohlenstoffatome aufweisen kann. Diese Verbindung wird insbesondere zur Synthese von Oligonucleotiden vorgesehen, die Anwendung in der Therapie und in der Diagnostik finden. Die Aufnahme einer Gruppe, insbesondere einer Alkylketongruppe im pyrimidinischen Kern des Nucleotids, wie sie beschrieben ist, hat nicht die Funktionalisierung dieser Gruppe im Hinblick auf eine spätere Reaktion zum Ziel, sondern den Erhalt von Analoga von Oligonucleotiden, die im Vergleich mit natürlichen Oligonucleotiden interessante Eigenschaften zum Ziel ihrer Verwendung aufweisen, wie z.B. eine größere Fähigkeit zur Hybridisierung mit Zielnucleinsäuren oder eine stärkere Resistenz gegenüber Nucleasen.
Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue funktionalisierte Verbindung zu beschreiben, die eine Alkylketonfunktion trägt und die die folgende Formel (I) aufweist:
in der
W ein Nucleotidanalog darstellt;
L einen Verbindungsarm zwischen W und der Alkylketongruppe darstellt, der zumindest vier Atome, vorteilhafterweise zumindest acht Atome aufweist; wobei L insbesondere ausgewählt ist aus den gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffketten, die ggf. durch zumindest eine Amin-, Amid- und Oxid-Funktion unterbrochen sind; vorzugsweise weist der Verbindungsarm eine Kette aus acht bis dreißig Atomen auf; insbesondere weist der Verbindungsarm acht bis zwanzig Atome und zumindest eine Amidfunktion auf;
R₁ eine lineare oder verzweigte Alkylkette darstellt, vorzugsweise eine Alkylkette mit höchstens sechs Kohlenstoffatomen; vorteilhafterweise ist R₁ eine Methylgruppe.
Unter einem Nucleotidanalog ist Folgendes zu verstehen, nämlich ein Nucleosid oder ein Nucleotid, ein Nucleosid oder ein Nucleotid, das eine oder mehrere Modifikationen an einem der Bestandteile des Nucleosids oder Nucleotids trägt, wie eine Modifikation des Desoxyribose- oder Ribosezuckers, wie Xylose, Arabinose, Zucker mit Alphakonfiguration (FR 2 607 507), die PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., (1992), 114, Seiten 1895 bis 1897), Zuckeranaloga wie 4'-Thioribose oder -Desoxyribose, Zucker mit den Konfigurationen D oder L; eine Modifikation der stickstoffhaltige Base, eine Modifikation des Phosphats oder dessen Äquivalent bei Nucleotiden, sowie alle Schutzgruppen, die in der chemischen Synthese verwendet werden.
Vorteilhafterweise entspricht die Verbindung der Formel (I), in der W der allgemeinen Formel (II)
entspricht, in der:
– R₂ ein H oder eine Schutzgruppe darstellt;
– R₃ ein H, F, OH, SH, NH₂, OCH₃ oder OR₅ darstellt, wobei R₅ eine Schutzgruppe oder eine Alkylkette darstellt;
– R₄ einen H-Rest, eine Schutzgruppe oder eine Mono-, Di-, oder Triphosphatgruppe darstellt;
– B eine stickstoffhaltige Base darstellt, und
– W über B an L gebunden ist.
Die stickstoffhaltige Base ist insbesondere ausgewählt aus den Purinen oder Pyrimidinen, wie Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin, Thymin oder jede andere modifizierte Base, die eine Hybridisierung erlaubt, wie die modifizierten natürlichen Basen (wie 6-Ketopurin, Xanthin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin) oder die modifizierten, nicht natürlichen Basen (wie Thioguanin oder 8-Oxoguanin, Deazapurin, Azapurin) oder Analoga der Basen (wie universelle Basen, wie Nebularin-, Nitroindol- oder Nitropyrolderivate). Gewisse Funktionen von Basen, die dazu neigen, die chemische Synthesestrategien an fester oder in flüssiger Phase zu stören, können mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden.
Bevorzugterweise ist die stickstoffhaltige Base Adenin, Uracil oder Cytosin.
Der Verbindungsarm L ist an irgendeiner Position der stickstoffhaltigen Base oder ihres Analogons angeordnet. Vorzugsweise ist der Verbindungsarm an einer Position angeordnet, die die Hybridisierung nicht stört. Insbesondere ist der Verbindungsarm in 4-Position von Cytosin, in 5-Position von Uracil oder in 6-Position von Adenin an dem Amin angeordnet.
Unter einer Schutzgruppe sind die Gruppen zu verstehen, die klassischerweise in der chemischen Synthese von Nucleosiden, Nucleotiden und Oligonucleotiden verwendet werden (siehe z.B. Chemistry of Nucleotides and Nucleotides, herausgegeben von Leroy B. Townsend, Plenum Press, New York and London und Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, herausgegeben von S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey). Vorzugsweise ist im Falle einer chemischen Synthese R₄ eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe und R₂ ist eine 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditgruppe und R₃ ist ein H oder OR₅, wobei R₅ eine Schutzgruppe ist, die bei der Synthese eines Oligoribonucleotids eingesetzt wird.
Im Falle der enzymatischen Synthese ist R₄ vorzugsweise eine Triphosphatgruppe, R₂ ist vorzugsweise H und R₃ ist vorzugsweise OH.
Die Phosphatgruppen liegen im Allgemeinen in Form von Salzen, insbesondere von Lithiumsalzen, von Natriumsalzen oder von Salzen von Triethylammoniumacetat vor.
Die Erfindung betrifft ferner ein funktionalisiertes Polynucleotid, das zumindest ein funktionalisiertes Nucleotid, wie zuvor definiert, aufweist. Dieses kann durch eine chemische und/oder eine enzymatische Reaktion synthetisiert werden. Im Fall einer Synthese durch eine enzymatische Reaktion und insbesondere im Falle einer enzymatischen Amplifikation ermöglicht die Neutralität des funktionalisierten Nucleotids gegenüber enzymatischen Reaktionen die Aufnahme von mehreren funktionalisierten Nucleotiden.
Der Ausdruck enzymatische Reaktion schließt alle Reaktionen ein im Verlaufe derer zumindest ein Enzym eingreift, dessen Aktivität mit einem Nucleotid verbunden ist. Somit sind darunter alle Reaktionen zu verstehen, die zumindest einen enzymatischen Schritt aufweisen, in dem ein Nucleotid als Substrat für ein Enzym dient, wobei dieses Nucleotid im Laufe dieses enzymatischen Schritts transformiert wird oder auch nicht. Diese Reaktionen sind bspw. ausgewählt aus denen, die in den Techniken der Molekularbiologie verwendet werden, wie der Transkription, der Ligation, der Verlängerung, des Schneidens und insbesondere aus den Techniken der Amplifikation (siehe z.B. den Artikel von E. Winn-Deen, Journal of Clinical assay, Vol. 19, Seiten 21 bis 26 (1996)).
Die Enzyme, deren Aktivitäten mit Nucleotiden verbunden sind, können insbesondere aus der folgenden, nicht erschöpfenden Liste ausgewählt werden: den DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, wie das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli, die TAQ-Polymerase, die T7-, T4- oder T5-DNA-Polymerasen, den eukaryotischen zellulären oder viralen Polymerasen, den RNA-abhängigen DNA-Polymerasen, wie den Polymerasen von AMV (Avian Myoblastosis Virus), von MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus); den RNA-Polymerasen, wie den T7-, T3 SP6-, N4-, PBSII-RNA-Polymerasen, den RNA-Polymerasen von E. coli; den Enzymen mit Nucleasenaktivitäten, wie den Restriktionsendonucleasen, der RNase H oder auch den Poly-A-Polymerasen, den Replikasen, wie der Q-Beta-Replikase, den terminalen Transferasen oder den Ligasen.
Thermostabile Enzyme, die die hier zuvor beschriebenen enzymatischen Aktivitäten zeigen, sind ebenfalls in der Erfindung verwendbar.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wählt man zur Synthese des funktionalisierten Polynucleotids die Techniken, die einen Transkriptionsschritt verwenden, wie die NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), die TMA (Transcription Mediated Amplifikation) oder eine Posttranskriptions-PCR (Polymerase Chain Reaction), wie sie in den Artikeln von R. J. Lipshutz et al., Biotechniques, 19(3), Seiten 442 bis 447, 1995 oder M. Kozal et al., Nature Medecine, 2(7), Seiten 753 bis 759, 1996 beschrieben sind.
Die Bestandteile und Bedingungen, die notwendig sind, um diese enzymatischen Reaktionen durchzuführen, um ein Polynucleotid zu erhalten, sind dem Fachmann bekannt. Das Buch Current Protocols in Molecular Biology, herausgegeben von F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith und K. Struhl, John Wiley & Sons, 1996, Band 1, Kapitel 3, zeigt Verfahren zur enzymatischen Manipulation von DNA und RNA. Das Buch „Molecular Methods for Virus Detection", herausgegeben von D. L. Wiedbrand und D. H. Farkas, Academic Press, San Diego, 1995 gibt insbesondere in den Kapiteln 8, 9, 12, 13, 14, 15 und 16 Beispiele für Techniken zur enzymatischen Amplifikation.
Unter chemischer Synthese sind alle Verfahren sowohl an fester Phase als auch in flüssiger Phase zu verstehen, in denen ein geeignet geschütztes nucleotidisches Monomer durch eine Kopplungsreaktion mit einem anderen nucleotidischen Monomer oder Polymer reagiert.
Verfahren zur chemischen Synthese sind z.B. in „Methods in Molecular Biology, volume 20, Protocols for oligonucleotides and analogs", herausgegeben von S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993 und in „Methods in Molecular Biology, volume 26, Protocols for oligonucleotides conjugates", herausgegeben von S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1994 beschrieben.
Unter einem Polynucleotid sind Ketten aus zumindest zwei nucleotidischen Monomeren zu verstehen. Wenn das Polynucleotid auf chemischem Wege synthetisiert wird, liegt seine Größe vorzugsweise bei unter 300 Nucleotiden und vorteilhafterweise bei 150. Wenn das Polynucleotid durch eine enzymatische Reaktion synthetisiert wird, liegt seine Größe vorzugsweise bei weniger als 20 kB und vorteilhafterweise bei weniger als 10 kB.
Die beiden Synthesewege chemisch und enzymatisch können kombiniert werden, um ein Polynucleotid herzustellen.
Die Erfindung betrifft ferner ein markiertes funktionalisiertes Polynucleotid, das zumindest eine funktionalisierte Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (I') aufweist:
in der
W ein nucleotidisches Analogon wie zuvor definiert darstellt,
L einen Verbindungsarm darstellt, der zumindest vier Atome aufweist,
n eine Zahl gleich 0 oder 1 darstellt,
R₁ eine lineare oder verzweigte Alkylkette darstellt,
wobei die Alkylketongruppe dieser funktionalisierten Verbindung mit einem Markierungsreagens in Wechselwirkung getreten ist.
W, L und R₁ entsprechen vorteilhafterweise den Definitionen, die hier zuvor zum Beschreiben der bevorzugten funktionalisierten Verbindungen der Erfindung angegeben sind.
Unter einem Markierungsreagens ist ein Tracer zu verstehen, der direkt oder indirekt ein detektierbares Signal erzeugt und der dazu neigt, mit der Alkylketonfunktion zu reagieren.
Eine nicht beschränkende Liste dieser Tracer schließt Folgendes ein:

– Enzyme, die ein z.B. durch Colorimetrie, Fluoreszenz, Lumineszenz detektierbares Signal erzeugen, wie Meerrettichperoxidase, alkaline Phosphatase, beta-Galactosidase, Glucose-6-Phosphatdehydrogenase;
– Chromophore, wie fluoreszierende, lumineszierende oder gefärbte Verbindungen;
– Gruppen mit einer Elektronendichte, die durch elektronische Mikroskopie oder durch deren elektrische Eigenschaften, wie die Leitfähigkeit, Amperometrie, Voltametrie oder Impedanzmessung detektierbar ist;
– Gruppen, die durch optische Methoden, wie Diffraktion, Oberflächenplasmonresonanz, Veränderungen des Kontaktwinkels oder mit physikalischen Verfahren, wie der Rasterkraftspektroskopie oder dem Tunneleffekt, detektierbar sind;
– radioaktive Moleküle, wie ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I.

Vorzugsweise ist der Tracer eine fluoreszierende Verbindung mit geringer sterischer Hinderung wie Fluorescein, Dansyl, die Chromophoren vom Typ IR (LiCor Inc., Lincoln NE, USA), CY5 und CY3 (Randolph J. B. and al, Nucleic Acids Res., 25(14), Seiten 2923 bis 2929, 1997) und deren Derivate. Unter niedriger sterischer Hinderung versteht man ein Molekulargewicht von weniger als 1000 g/mol.
Um mit der Alkylketonfunktion zu reagieren, muss dieses Markierungsreagens eine nucleophile Funktion tragen, die dazu neigt, mit einer Alkylketonfunktion zu reagieren, wie eine Alkoxyamin- oder eine Hydrazinfunktion.
Vorteilhafterweise ist die gewählte Funktion ein Alkoxyamin, die auf alle direkten oder indirekten Wege eingeführt werden kann. Unter einem direkten Weg versteht man eine kovalente Bindung zwischen dem Tracer oder einem Molekül, das den Tracer trägt und der Alkoxyaminfunktion. Unter einem indirektem Weg versteht man Komplexierungssysteme vom Typ Metall/Chelat oder Affinitätssysteme, d.h. Haptene, die durch einen spezifischen Antikörper detektierbar sind, oder ein Protein, wie die Paare Biotin/Avidin oder Streptavidin, Zucker/Lecitin. In diesem Fall ist es der Antikörper oder das Protein, das den Tracer trägt und das Hapten, das die Alkoxyaminfunktion trägt.
Insbesondere weist das Markierungsreagens folgende Formel auf
Die Erfindung betrifft außerdem einen festen Träger, an dem ein Nucleotid, ein Nucleosid oder ein Polynucleotid gemäß der Erfindung kovalent befestigt ist.
Um diese Befestigung durchzuführen, lässt man ein Nucleotid, ein Nucleosid oder ein Polynucleotid, das eine Alkylketongruppe aufweist, mit einem festen Träger reagieren, auf dem eine Alkoxyamin- oder Hydrazinfunktion, vorzugsweise eine Alkoxyaminfunktion, vorliegt.
In einer ersten Ausführungsform ist das Polynucleotid vorgeformt und die endgültige Reaktion besteht darin, das Polynucleotid an einer vorbestimmten Position auf dem Träger zu befestigen. In einer speziellen Ausführungsform sind die Polynucleotide synthetische Oligonucleotide (auf chemischem Wege) hergestellt mit einer kurzen Länge (weniger als 50 Basen), in einer zweiten speziellen Ausführungsform weisen die Polynucleotide eine Größe von mehr als 50 Basen auf und sind durch enzymatische Verfahren, wie durch enzymatische Amplifikation, hergestellt.
In einer zweiten Ausführungsform werden die Nucleoside oder Nucleotide durch aufeinander folgende Schritte auf den Träger hinzugefügt (Verlängerung der Kette) und am Ende des Synthesezyklus wird ein Polynucleotid erhalten, das an einer vorbestimmten Position an dem festen Träger befestigt ist.
Eine bevorzugte Verwendung dieser bepfropften Träger ist der Erhalt von Biochips zur Analyse von Genen.
Zur Illustration sind Beispiele dieser Biochips in den folgenden Publikationen gegeben, nämlich G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, Seiten 40 bis 44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, Seiten 1 bis 10, 1997; J. Cheng et al., Molecular diagnosis, 1(3), Seiten 183 bis 200, 1996; T. Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), Seiten 2915 bis 2921, 1994; J. Cheng et al., Nature Biotechnology, 16, Seiten 541 bis 546, 1998 oder in den Patenten US-A-4 981 783 (Augenlicht), US-A-5 700 637 (Southern), US-A-5 445 934 (Fodor), US-A-5 744 305 (Fodor), US-A-5 807 522 (Brown).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion einer Zielnucleinsäure in einer Probe, bei dem die Zielnucleinsäure, die ggf. vorbehandelt ist, mit zumindest einer funktionalisierten Verbindung, die der Formel (I') entspricht, in Anwesenheit von Elementen und unter Bedingungen, die notwendig sind zum Erhalt eines Polynucleotids der Erfindung, in Kontakt gebracht wird, um ein funktionalisiertes Polynucleotid zu erhalten; um das Polynucleotid mit einem Markierungsreagens zu markieren und danach das markierte Polynucleotid zu detektieren. Die zuvor genannten Elemente und Bedingungen sind dem Fachmann bekannt.
Unter Vorbehandlung sind die verschiedenen Schritte der Behandlung einer Probe zu verstehen, um die Zielnucleinsäure zugänglich zu machen, z.B. die Lyse, die Verflüssigung, die Konzentrierung.
Vorzugsweise wird das funktionalisierte Polynucleotid durch eine enzymatische Amplifizierungsreaktion erhalten, die auf die Zielnucleinsäure einwirkt, die als Matrix dient und die in der Lage ist, das funktionalisierende Nucleotid einzuführen.
Vorzugsweise ist die enzymatische Amplifikationstechnik die NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), die TMA (Transcription Mediated Amplification) oder eine Posttranskriptions-PCR (Polymerase Chain Reaction), wie sie in den Artikeln von R. J. Lipshutz et al., Biotechniques, 19(3), Seiten 442 bis 447, 1995 oder M. Kozal et al., Nature Medecine, 2(7), Seiten 753 bis 759, 1996 beschrieben sind.
Das markierte Polynucleotid kann in homogener oder heterogener Phase qualitativ oder quantitativ detektiert werden. Ein bevorzugtes Detektionsverfahren weist das Anbringen des markierten Polynucleotids an einem festen Träger durch eine Hybridisierungsreaktion zwischen dem markierten Polynucleotid und einem anderen Polynucleotid, das selbst auf dem festen Träger angebracht ist, und danach das Erkenntlichmachen der Anwesenheit des markierten Polynucleotids nach einem Waschschritt auf. Dieses Erkenntlichmachen erfolgt, wenn der Tracer ein fluoreszierendes Molekül ist, direkt durch Auslesen, wie z.B. mit einem Scanner oder einer Kamera.
Das Verfahren zur Detektion ist besonders nützlich in dem Fall, in dem eine Vielzahl von Polynucleotiden an einer vorbestimmten Position an einem festen Träger befestigt sind, um einen „DNA-Chip" zu bilden.
Die Dichte der an dem festen Träger angeordneten Polynucleotide stellt bei der Hybridisierung starke sterische Anforderungen und das markierte Polynucleotid gemäß der Erfindung ermöglicht eine gute Detektionsempfindlichkeit. Beispiele für solche Chips sind bspw. in den zuvor genannten Publikationen und Patenten gegeben.
Das Verfahren zur Detektion ist für Folgendes anwendbar, nämlich zur Sequenzierung eines Expressionsprofils von Messenger-RNA oder zum Aussieben von Mutationen, für die Diagnose von infektiösen oder genetischen Krankheiten.
Um die Hybridisierung der markierten Polynucleotide auf dem DNA-Chip zu fördern, kann vor, gleichzeitig mit oder nach dem Schritt des Markierens eine Fragmentation stattfinden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion einer Zielnucleinsäure in einer Probe, bei dem die Zielnucleinsäure mit einem funktionalisierten Polynucleotid gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht wird, dieses mit dem Markierungsreagens reagieren gelassen wird und die Anwesenheit der Zielnucleinsäure detektiert wird.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden das funktionalisierte Polynucleotid und das Markierungsreagens vor der Hybridisierung mit der Zielnucleinsäure miteinander reagie ren gelassen. Die Zielnucleinsäure kann dabei durch eine enzymatische Amplifikationstechnik amplifiziert worden sein.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion einer Nucleinsäure, gemäß dem ein markiertes Polynucleotid gemäß der Erfindung bereitgestellt, eine Nucleinsäure mit dem markierten Polynucleotid in Kontakt gebracht und die Anwesenheit der Zielnucleinsäure detektiert wird.
Der Ausdruck „fester Träger" , wie er hier verwendet wird, schließt alle Materialien ein, auf denen ein Polynucleotid zur Verwendung in diagnostischen Tests und in Verfahren zur Trennung immobilisiert werden kann. Es können dabei natürliche oder synthetische, chemisch modifizierte oder nicht modifizierte Materialien als feste Träger verwendet werden, insbesondere Polysaccharide, wie Materialien auf Basis von Cellulose, z.B. Papier, von Derivaten von Cellulose, wie Celluloseacetat und Nitrocellulose, von Dextran; Polymere, wie Polyvinylchloride, Polyethylene, Polystyrole, Polyacrylate, Polyamide oder Copolymere auf Basis von Monomeren vom Styroltyp, von ungesättigten Carbonsäureestern, von Vinylidenchlorid, von Dienen oder von Verbindungen, die eine Nitrilfunktion aufweisen (wie Acrylonitril); Copolymere aus Vinyl/Propylen, Vinylchlorid/Vinylacetat; natürliche Fasern, wie Baumwolle, und synthetische Fasern, wie Nylon; anorganische Materialien, wie Siliciumdioxid, Quarzglas, Keramiken; Latexe, d.h. wässrige kolloidale Dispersion eines Polymers, das in Wasser unlöslich ist; magnetische Partikel, metallische Derivate, Gele etc.
Die folgenden Beispiele erlauben es, gewisse Vorteile der Erfindung zu illustrieren, ohne den Schutzbereich in irgendeiner Weise einzuschränken.
Die angehängte Figur stellt die Ausbeuten einer Transkription dar, die in Abhängigkeit der verwendeten Nucleotide gemessen wurden.
BEISPIEL 1: SYNTHESE VON METHYLKETONNUCLEOTIDEN I.1. Synthese von Uridin(C5)-C9-methylketon 1
Syntheseschema
Das Schützen der Positionen 2',3'-OH wurde durch Einwirken von Aceton in saurem Milieu gemäß dem in „Nucleic acid chemistry, Herausgeber Townsend-Tipson, Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, Seiten 765 bis 766 (1978)" beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Synthese der Methylketonkette
Das Einführen des Methylketonmotivs in den Arm erfolgt durch Peptidkopplung zwischen Propargylamin und 6-Oxoheptansäure.
6-Oxoheptansäure (2,75 g, 18,16 mmol) wurde in 40 ml wasserfreiem THF gelöst. Die Lösung wurde bei 0°C unter eine Argonatmosphäre verbracht. Danach wurde N-Methylmorpholin (2 ml, 18,16 mmol) und dann nach 15 Minuten Propargylamin (1,25 ml, 18,16 mmol) zugegeben und die Temperatur wurde auf Raumtemperatur ansteigen gelassen. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten wurde das Präzipitat abfiltriert und zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan wieder aufgenommen und mit einer 0,1 N wässrigen Lösung von Soda und danach mit einer 1 N wässrigen Chlorwasserstofflösung und schließlich mit Wasser gewaschen, das mit Natriumchlorid gesättigt war.
Nach Trocknen über Na₂SO₄ wurde das Dichlormethan abgedampft und der Rückstand wurde auf Kieselgel (Elutionsmittel: Essigester) chromatografiert. Das Produkt wird auf diese Weise in Form eines weißen Pulvers (2,6 g, 14,4 mmol; 80 %) erhalten.
Die Methylketonkette wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Einführen der Methylketonkette in das Nucleosid: Heck-Kupplung (Hobbs, J. Org. Chem., 1989, 54, 3420 bis 3422)
Zu 5 ml entgastem und unter Argon verbrachtem DMF wurden 5-Ioduridin-2',3'-isopropyliden (500 mg; 1,22 mmol) und Kupferiodid (44 mg, 0,232 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde ins Dunkle verbracht und danach wurden Triethylamin (323 μl, 2,32 mmol) und die Kette, die die Methylketylfunktion enthielt (630 mg, 3,48 mmol) zugegeben.
Die Mischung wurde 10 Minuten unter Argon belassen. Danach wurde Tetrakistriphenylphosphinpalladium (134 mg, 0,116 mmol) zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden wurde das DMF abgedampft und mit Acetonitril co-eingedampft. Der Rückstand wurde in Essigester wieder aufgenommen und die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Nach Trocknen über Na₂SO₄ und Abdampfen wurde der Rückstand über Kieselgel chromatografiert (Elutionsmittel: Essigester/Methanol: 90/10).
Nach dem Eindampfen wurde das Methylketonnucleosid in Form eines weißlichen Pulvers (340 mg, 0,73 mmol, 60 %) erhalten. Das Produkt wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und durch Massenspektroskopie charakterisiert. Es wurde so das Methylketonnucleosid erhalten, das korrekt für die Einführung des Triphosphats in 5'-Position geschützt ist.
Erhalt des Nucleosids Uridin(C5)-C9-methylketontriphosphat 1 Phosphorylierung: Eckstein, J. Org. Cem., 1989, 54, 631 bis 635
Das Methylketonnucleosid (46 mg, 0,1 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin gelöst und zweimal eingedampft. Danach wurden unter Argon 100 ml Pyridin, 300 ml Dioxan und eine frisch hergestellte Lösung von 2-Chlor-4H-1,2,3-dioxaphosphorin-4-on (1 M) in Dioxan (130 μl; 130 μmol) zugegeben, es wurde 20 Minuten rühren gelassen, wonach eine Lösung von 0,5 M Tributylammoniumpyrophosphat in wasserfreiem DMF (320 μl, 0,16 mmol) und gleichzeitig 130 μl Tributylamin zugegeben wurden. Nach 30 Minuten wurden 2 ml einer Lösung von Iod mit 1 % in einer Mischung aus Pyrridin/Wasser (98/2 : v/v) zugegeben.
Nach 20 Minuten Rühren wurde der Überschuss an Iod mit einer wässrigen Lösung von NaHSO₃ mit 5 % zerstört und das Rühren wurde für 10 Minuten fortgesetzt. Es wurde zur Trockne eingedampft und eine Extraktion mit einer Mischung aus Wasser/Dichlormethan durchgeführt. Die wässrige Phase wurde abgedampft, wonach eine Chromatographie (Flash) auf inverser C18-Phase durchgeführt wurde (Elutionsmittel: Wasser/Methanol 1/1).
Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, wurden eingedampft und der Gegenionenaustausch wurde durch Durchleiten durch das Harz Dowex Na+ durchgeführt. Auf diese Weise wurde das geschützte Triphosphat erhalten (0,03 mmol; 30 %).
Entschützung
Das geschützte Triphosphat (0,03 mmol) wurde in 15 ml Milli-Q-Wasser aufgenommen, zu denen 15 ml einer wässrigen Lösung von TFA mit 25 % zugegeben wurden. Die Lösung wurde 15 Minuten gerührt und dann eingedampft und zweimal mit Wasser coeingedampft.
Es wurde in 10 ml Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen und mit 0,1 N Soda bis zu pH 8 neutralisiert. Nach dem Eindampfen wurde das geschützte Triphosphat an inverser Phase C18 gereinigt (H₂O/MeOH, 1/1). Der Gegenionenaustausch wurde durch Durchleiten durch ein Kationentauscherharz (Dowex Na⁺) durchgeführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft und dosiert. Es wurden so 0,021 mmol (70 %) des Nucleosids Uridin(C5)-C9-methylketontriphosphat 1 erhalten, das durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und ³¹Posphor-NMR charakterisiert wurde.
I.2. Synthese von Adenosin(N6)-C10-methylketon 2
Syntheseweg
Das Einführen des Diaminobutans in 6-Position des Adenosins wird durch Substitution der Triazolgruppe, die durch das geschützte Nucleosidzwischenprodukt getragen wird, durchgeführt. Die Methylketonfunktion wird danach durch Peptidkopplung auf Höhe des Nucleosids eingeführt. Nach dem Entschützen der Silylgruppe in 5'-Position wird die Phosphorylierung durch das Verfahren nach Eckstein erreicht. Nach dem Entschützen erhält man das erwartete Triphosphat, das durch Protonen-NMR und ³¹Phosphor-NMR charakterisiert wurde.
Synthese des Triazol-geschützten Nucleosids
Herstellung von 2',3'-Isopropylidenadenosin
(Nucleic Acid Chemistry, Part 2, Herausgeber Townsend, Tipson, Wiley Interscience, John Wiley & Sons, Seite 768, (1978))
Zu einer Suspension von Adenosin (5 g, 18,7 mmol) in Aceton (10 ml), die APTS (para-Toluolsulfonsäure) (3,9 g, 20,6 mmol) enthielt, wurde tropfenweise unter Argon Ethylorthoformiat (12,44 ml, 74,8 mmol) zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wurden 110 ml Wasser zugegeben, die 1,86 ml Ammoniak mit 27 % enthielten. Nach 30 Minuten Rühren wurde das Reaktionsmedium bis zum Auftreten von weißen Kristallen eingedampft. Nach 12 Stunden bei 4°C wurde ein weißes Präzipitat erhalten, das in Wasser umkristallisiert wurde. Es wurden 4,17 g (13,5 mmol, 72 %) des Produkts in Form eines weißen Pulvers erhalten. Dieses Zwischenprodukt wurde durch Protonen-NMR charakterisiert.
Synthese des Amidins (Bartlett und Humphreg, J. Chem. Soc., 1967, 1664 bis 1666)
Thionylchlorid (39,96 g, 24,5 ml, 0,338 mol) wurde tropfenweise bei 10°C zu N-N'-Diformylhydrazin (12 g, 0,136 mol) in DMF (270 ml) zugegeben. Die Mischung wurde gelb. Das Rühren wurde für 2 Tage fortgesetzt. Das erhaltene Präzipitat wurde abfiltriert und mit DMF und dann mit Ether gewaschen. Nach Trocknen unter Vakuum wurde das Amidin in einer Ausbeute von 95 % (28 g, 0,130 mol) erhalten.
Herstellung des Triazolzwischenprodukts (Samano, Miles, Robins, J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 9331 bis 9332)
Isopropylidenadenosin (1 g, 3,2 mmol) und das zuvor beschriebene Amidin (1,4 g, 6,5 mmol) wurden bei 100°C unter Argon 48 Stunden in Pyridin (15 ml) gerührt. Das Pyridin wurde danach abgedampft und mit Toluol co-eingedampft. Das erhaltene Öl wurde dann in Essigester wieder aufgenommen und diese organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, das mit NaCl gesättigt war. Nach einem Trocknen über Na₂SO₄ und dem Eindampfen wurde das Triazolnucleosid in Form eines weißen Pulvers in einer Ausbeute von 60 % (700 mg, 1,9 mmol) erhalten. Es wurde dann durch Protonen-NMR charakterisiert.
Schützen des Triazolderivats in 5'-du-Position
Das Triazolnucleosid (1 g, 2,8 mmol) wurde in 20 ml Pyridin gelöst. TBDMS-Cl (Tertbutyldimethylsilylchlorid) (462 mg, 3 mmol) wurden bei 0°C unter Argon zugegeben. Das Rühren wurde für 2 Stunden beibehalten und das Pyridin danach abgedampft. Der so erhaltene Rückstand wurde über Kieselgel chromatografiert (Elutionsmittel: CH₂Cl₂:/Methanol : 95/5). Nach dem Eindampfen wurde das vollständig geschützte Adenosinzwischenprodukt in Form eines weißen Pulvers (1,25 mg, 2,6 mmol, 93 %) erhalten. Dieses Nucleosid wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Einführen der Diaminobutankette in das geschützte Adenosinzwischenprodukt
Das Triazoladenosin (1,25 mg, 2,64 mmol) wurde in 10 ml Acetonitril gelöst. Diaminobutan (2,7 ml, 25,4 mmol) wurde zugegeben und es wurde bei 50°C unter Argon gerührt. Nach 5 Stunden wurde das Lösemittel abgedampft und der Rückstand in Essigester wieder aufgenommen. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, das mit NaCl gesättigt war. Nach einem Trocknen über Na₂SO₄ und dem Eindampfen wurde über Kieselgel chromatografiert (Elutionsmittel: CH₂Cl₂/MeOH : 8/2, danach CH₂Cl₂/MeOH 8/2 in Anwesenheit von 2 % Ammoniak).
Nach dem Eindampfen wurde das Produkt in Form eines Öls (1 g, 2 mmol, 80 %) erhalten.
Das aminierte Nucleosid wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Kopplung mit der Methylketonkette und Entschützen in 5'-Position
6-Oxoheptansäure (288 mg, 2 mmol) wurde in 5 ml wasserfreiem THF gelöst. Die Lösung wurde bei 0°C unter Argon verbracht. N-Methylmorpholin (223 μl, 2 mmol) und 5 Minuten später Isobutyldichlorformiat (258 μl, 2 mmol) wurden zugegeben. Nach 15 Minuten wurde das aminierte Nucleosid zugegeben. Nach 2 Stunden wurde das THF abgedampft und der Rückstand in Ether wieder aufgenommen. Es wurde mit einer wässrigen 1 N Lösung von NaOH und danach mit Wasser gewaschen, das mit NaCl gesättigt war. Nach einem Trocknen über Na₂SO₄ und dem Eindampfen wurde ein Öl erhalten. Die Desilylierung wurde durch Wiederaufnehmen des Öls in 10 ml THF erreicht, zu dem TBAF (3,25 ml einer 1 M Lösung in THF) zugegeben wurde. Nach einer Stunde wurde das Lösemittel abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und ein Waschen mit Wasser wurde durchgeführt, das mit NaCl gesättigt war. Nach einem Trocknen und dem Eindampfen wurde der Rückstand über Kieselgel chromatografiert (Elutionsmittel: CH₂Cl₂, danach CH₂Cl₂/MeOH: 95/5).
Nach dem Eindampfen wurden 870 mg des Nucleotids erhalten, das die Methylketylfunktion trägt und in 5'-Position entschützt ist (1,7 mmol, 85 % über 2 Schritte). Es wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Phosphorylierung und Erhalt des Adenosin-(N6)-C10-methylketonnucleotids 2
Das in 2',3'-Position mit Isopropyliden geschützte Adenosin-(N6)-C10-Methylketon wurde in wasserfreiem Pyridin gelöst und zweimal eingedampft. Danach wurden unter Argon 500 μl Pyridin, 1,5 ml Dioxan und eine frisch hergestellte Lösung von 2-Chlor-4H-1,2,3-dioxaphosphain-4-on (1 M) in Dioxan (650 μl, 0,65 mmol) zugegeben. Es wurde 20 Minuten rühren gelassen, wonach eine 0,5 M Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat in wasserfreiem DMF (1,6 ml, 0,8 mmol) und gleichzeitig 650 μl Tributylamin zugegeben wurden.
Nach 30 Minuten wurden 10 ml einer Iodlösung mit 1 % in einer Mischung aus Pyridin/Wasser (98,2, v/v) zugegeben. Nach 20 Minuten wurde das überschüssige Iod mit einer wässrigen Lösung von NaHSO₃ mit 5 % zerstört und das Rühren für 10 Minuten fortgesetzt, wonach zur Trockne eingedampft und eine Extraktion mit Wasser/Dichlormethan durchgeführt wurde. Die wässrige Phase wurde eingedampft und danach wurde eine Aufreinigung an inverser Phase (C18), (Elutionsmittel: H₂O/MeOH) durchgeführt. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden eingedampft und der Gegenionenaustausch wurde durch Durchleiten durch Dowex Na⁺ Harz durchgeführt. Es wurde so das geschützte Triphosphat erhalten (0,28 mmol, 56 %).
Entschützen
0,035 mmol des geschützten Triphosphats wurden in 17,5 ml Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, zu dem 17,5 ml einer wässrigen Lösung von TFA mit 25 % zugegeben wurden. Es wurde 15 Minu ten gerührt, wonach eingedampft und zweimal mit Wasser coeingedampft wurde, in 10 ml Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen und mit 0,1 M Soda bis zu pH 8 neutralisiert wurde. Nach dem Eindampfen wurde eine Aufreinigung an C18 (Elutionsmittel: H₂O; H₂O/MeOH) durchgeführt. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden eingedampft und dosiert. Es wurden so 0,022 mmol (63 %) des Adenosin-(N6)-C10-Methylketontriphosphats 2 erhalten.
I.3. Synthese von Cytidin(N4)-C10-Methylketon
3
Dieses Nucleotid wurde auf zwei Weisen hergestellt:
– nucleotidischer Weg: Kopplung zwischen einem aktivierten Ester der Methylketonkette und dem aminierten Cytidintriphosphat.

– nucleosidischer Weg: Synthese des Nucleosidmethylketons und dann Phosphorylierung durch das Eckstein-Verfahren.
BEISPIEL II: SYNTHESE DES FLUOROPHOREN OXYAMIN 4
II.1.Syntheseschema
Das Einführen der Oxyaminkette in das Fluorescein erfolgt in drei Schritten: Der erste Schritt ist eine nucleophile Addition von 1,3-Diaminopropan an das Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Nach Aufreinigung an inverser Phase wird das in Form des Fmocs geschützte Oxyaminmotiv durch Peptidkopplung eingeführt. Das freie Oxyamin wird durch Entschützen in basischem Milieu hergestellt.
Einführen der 1,3-Diaminopropankette
Zu 20 ml wasserfreiem DMF wurde Diaminopropan (585 μl, 6,96 mmol) zugegeben. Danach wurde tropfenweise unter Argon Fluoresceinisothiocyanat (FITC), (500 mg, 1,16 mmol) zugegeben, das in 7 ml wasserfreiem DMF gelöst war. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren für 15 Minuten fortgesetzt. Es wurde zur Trockne eingedampft und zweimal mit Wasser co-eingedampft. Der Rückstand wurde an inverser Phase (C18) chromatografiert: (Elutionsmittel: H₂O/MeOH: 1/1).
Das Produkt wurde so in Form eines orangenen Pulvers (420 mg, 0,93 mmol, 80 %) erhalten. Es wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Einführung der geschützten Alkoxyamingruppe
Das Fmoc-geschützte Carboxyalkoxyamin: HOOC – CH₂ – ONH -Fmoc (473 mg, 1,5 mmol) wurde in 10 ml wasserfreiem DMF gelöst. Es wurde bei 0°C unter Argon verbracht. Es wurde dann N-Methylmorphonin (166 μl, 1,5 mmol) und 15 Minuten später das Fluorescein zugegeben, das die Diaminopropankette trägt (350 mg, 0,75 mmol). Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde wurde das DMF zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde an Kieselgel chromatografiert (CH₂Cl₂/MeOH: 85/15 (fester Rückstand). Das geschützte Fluoresceinalkoxyamin wurde so in Form eines orangenen Pulvers (227 mg, 0,3 mmol, 40 %) erhalten. Es wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Erhalt des Fluorescein-Alkoxyamin-Markers 4
Das Fmoc-geschützte Fluorescein (100 mg, 0,13 mmol) wurde in 2 ml wasserfreiem DMF gelöst. Anschließend wurde Pyridin (20 μl, 0,2 mmol) zugegeben. Nach 15 wurde zur Trockne eingedampft und eine Aufreinigung an inverser Phase C18 durchgeführt (Elutionsmittel: H₂O/CH₃CN: 1/1 dann CH₃CN). Nach dem Eindampfen wurde das Produkt in Form eines orangenen Pulvers (49 mg, 0,09 mmol, 70 %) erhalten. Dieser Fluorophor wurde durch Protonen-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
BEISPIEL III: REAKTIVITÄT DER METHYLKETONVERBINDUNG MIT DEM FLUOROPHOR
Die Reaktivität wurde auf der nucleosidischen und auf der nucleotidischen Stufe getestet:
Die Reaktion wurde in Anwesenheit von 1,1 Äquivalent des Fluorophor-ONH₂ (4), bezogen auf die Methylketonverbindung, durchgeführt. Die Reaktion ist schnell und selektiv. Auf der nucleosidischen Stufe wurden die Addukte durch Protonen-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
BEISPIEL IV: AUFNAHME VON URIDINMETHYLKETON UND POST-TRANSKRIPTIONSMARKIERUNG
IV.1.Beschreibung der Hauptschritte
Transkriptionen
Die Transkriptionen wurden ausgehend von der Ziel-PCR (16 S RNA-Fragment von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) (Troesch A. et al., J. Clin. Microbiol., 37(1), 49 bis 55, 1999) oder einem Fragment der reversen Transkriptase von HIV (Kozal M.J. et al., Nature Medecine, 2(7), 753 bis 759, 1996) unter Verwendung von T7 RNA-Polymerase und unterschiedlichen Verhältnissen zwischen dem funktionalisierten Nucleotid und den natürlichen Nucleotiden durchgeführt, wobei die Gesamtkonzentration von jedem Nucleotid bei 1 mM gehalten wurde. Das Verhältnis zwischen dem funktionalisierten Nucleotid und dem entsprechenden natürlichen Nucleotid ist als Prozentsatz ausge drückt und die verwendeten Verhältnisse liegen im Allgemeinen bei 0, 30, 70 und 100 %. Der Punkt bei 0 % dient als Transkriptionskontrolle, da in diesem Fall kein funktionalisiertes Nucleotid vorliegt und die Transkriptionsreaktion die 4 natürlichen Nucleotide aufweist. Im Falle eines Verhältnisses von 100 % bedeutet dies, dass das funktionalisierte Nucleotid 100 % des studierten Nucleotids darstellt (die drei anderen Nucleotide, die für die Transkriptionsreaktion notwendig sind, sind natürlich natürliche Nucleotide). Das Verhältnis von 100 % für das funktionalisierte Nucleotid ist das aussagekräftigste für die Neutralität gegenüber einer enzymatischen Reaktion, da das Enzym dieses Nucleotid aufnehmen muss, um korrekt zu funktionieren. Die Inkubationszeit der Transkriptionsreaktion lag bei 1 Stunde bei 42°C.
Die Transkriptionen wurden durch Gelelektrophorese über Polyacrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen (6 % Acrylamid, 7 M Harnstoff, 1XTBE) durchgeführt. Die aufgetragene Menge lag bei 5 μl und die Wanderung erfolgte während 45 Minuten bei 150 V. Die Visualisierung der natürlichen oder mit der Metylketonfunktion funktionalisierten Transkripte wurde nach Anfärben mit Ethidiumbromid unter einer UV-Lampe durchgeführt.
Dosierung
Die Menge der produzierten Transkripte in jeder Reaktion wurde durch UV-Dosierung nach Aufreinigung eines aus der Transkriptionsreaktion entstandenen Aliquots bestimmt.
Enzymatische Verdauung
Die Transkripte wurden auf Microcon-50-Filtern (Amicon, Beverly, MA) auf gereinigt, um überschüssige, nicht aufgenommene Nucleotide zu entfernen. Sie wurden danach gemäß dem in der Patentanmeldung WO 98/05766 beschriebenen Protokoll unter Verwendung der Nuclease P1 (Boehringer Referenznummer 2362251, 2U, 2 Stunden bei 37°C) und alkaliner Phosphatase (Boehringer-Mannheim Referenznummer 713023, 1U, 1 Stunde bei 37°C) hydrolysiert. Diese Verdauungen werden mit 4·10¹⁴ Kopien der Transkripte durchgeführt. Die Nucleotidzusammensetzung wurd durch HPLC mit inverser Phase durch Vergleich mit Standardnucleosiden durchgeführt, die aus einer Mischung von natürlichen Nucleosiden zusammengesetzt waren.
Die HPLC-Bedingungen waren die Folgenden:

– analytische C18-Säule (250 × 4,6 mm) auf 45°C erwärmt,
– Elutionsmittel: A: Natriumphosphatpuffer, 50 M, pH 7; B: MeOH/H₂O: 95/5, v/v
– Gradient: 0 % B für 10 Minuten, Anstieg auf 30 % B über 10 Minuten, Anstieg auf 80 % B über 10 Minuten, 5 Minuten bei 80 % B, Anstieg auf 100 % B über 2 Minuten.

Markierung
Die Markierung der Transkripte wurde unter Verwendung von verschiedenen Anteilen des Fluorophors durchgeführt. Die Reaktionszeit lag bei 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Markierung wurde an Iranskripten ausgeführt, die, ausgehend von dem Mtb-Ziel und/oder dem HIV-Ziel, erzeugt wurden und die durch die Aufnahme von 100 % eines Methylketonnucleotids erhalten wurden. Zuerst wurden die markierten Transkripte durch Gelelektrophorese an Polyacrylamid analysiert und vor und nach dem Anfärben mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert.
Spaltung
Vor der Hybridisierung auf dem DNA-Chip wurde bei 65°C für 30 Minuten eine Spaltung der markierten Transkripte unter Verwendung von Imidazol und Manganchlorid (MnCl₂) mit einer Konzentration von jeweils 30 mM durchgeführt.
Sybridisierung an einem DNA-Chip
Nach der Spaltung wurden die erhaltenen Fragmente an einem DNA-Chip (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll hybridisiert, detektiert und analysiert.
Die als „Myco" bezeichneten Chips sind für die Resequenzierung des Abschnitts 213 bis 415 der Sequenz von M20940 „Genbank" der 16S-RNA von Mycobacterium tuberculosis (Troesch A. et al., J. Clin. Microbiol., 37(1), 49 bis 55, 1999) ausgelegt. Die als „HIV PRT 440" bezeichneten sind zur Resequenzierung der RT- (reverse Transkriptase) und Proteaseabschnitte des HIV-Virus (Kozal M. J. et al., Nature Medecine, 2(7), 753 bis 759, 1996) ausgelegt.
Im Falle des Mtb-Transkripts wurden 10¹⁴ Kopien an den Chip hybridisiert.
Im Falle des HIV-Transkripts wurden 5·10¹² Kopien an den Chip hybridisiert.
IV.2.Ergebnisse
Aufnahme des Uridin(C5)-C9-methylketonnucleotids 1 (U-COCH₃)
Die Ergebnisse der vorhergehenden Tabelle zeigen, dass das Uridinmethylketonnucleotid (1) sehr gut durch die T7 RNA-Polymerase aufgenommen wird. Dies ermöglicht die Herstellung von aktiven Transkripten, die in der Lage sind, mit einem Marker zu reagieren, der eine Alkoxyaminfunktion trägt.
Untersuchung der Aufnahme durch HPLC
Im chromatografischen Profil des Hydrolysats der Transkripte, die 100 % U-COCH₃ (1) aufwiesen und die ausgehend vom Ziel Mtb erhalten wurden, ist der Peak, der dem U-Methylketonnucleosid entspricht (Retentionszeit 26,2 Minuten), leicht wiederzufinden, was zeigt, dass das Nucleotid während den Transkriptions- und den enzymatischen Verdauungsschritten nicht modifiziert wird. Es wurde außerdem das Fehlen eines Peaks beobachtet, der natürlichem Uridin entspricht (Retentionszeit 14,97 Minuten).
Dies zeigt, dass das U-Methylketon-Nucleotid gut aufgenommen wird und zu 100 % in einer Transkriptionsreaktion eingesetzt werden kann.
Bewertung der Markierung durch ein Polyacrylamidgel
Die Markierungen wurden an rohen Transkripten ausgeführt, die ausgehend von Ziel-Mtb unter Verwendung von 100 % des U-COCH₃-Nucleotids (1) erzeugt wurden. Die Menge des Fluorophors bezogen auf die Anzahl der reaktiven Zentren wurde variiert. Diese Verhältnisse sind wie folgt, nämlich 2, 5, 10, 15, 20 und 50 Äquivalente des Fluorophor-ONH₂. 10 Äquivalente eignen sich, um eine intensive und selektive Markierung zu erhalten.
Auf einem Markierungsgel unter Verwendung von 5, 10 und 50 Äquivalenten des Fluorophors wurde vor einer Anfärbung mit BET eine mehr oder minder starke Markierung entsprechend der verwendeten Anzahl der Äquivalente des Fluorophors beobachtet, unabhängig jedoch von der Menge des verwendeten Markers war eine Bande sichtbar. Es wurde außerdem das Auftauchen von neuen Banden bei höheren Dosierungen des Fluorophors beobachtet. Dies geschieht mit Sicherheit auf Grund einer hohen Dichte des Markers am Ziel.
Hybridisierung und Analyse der Ergebnisse
Die Mtb- und HIV-Transkripte, die ausgehend von den entsprechenden Zielen unter Verwendung von 100 % UTP-COCH₃ (1) erzeugt wurden, wurden den zuvor beschriebenen Behandlungen unterzogen. Während des Schritts der Spaltung wurde ein „Blocker"-Mittel (Aceton oder Glutaraldehyd) verwendet, um eine Sättigung des Chips mit überschüssigem Fluorophor-ONH₂ zu vermeiden, der an der Oberfläche davon absorbiert. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung der Hybridisierungsstation Gene Chip fluidics Station (800101 Affymetix, Santa Clara, CA), den geeigneten Chips und Puffern und dem durch den Hersteller bereitgestellten Protokoll durchgeführt.
Die folgenden Parameter, nämlich der Prozentsatz der angesprochenen Basen (Base Call), die mittlere Intensität des Signals, die Medianintensität und das Hintergrundrauschen wurden unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten Software (GenChip Sequence Analysis System, Referenznummer 900135, Affymetrix, Santa Clara, CA) berechnet. Die Ergebnisse sind in den beiden nachstehenden Tabellen dargestellt. Die Intensität des Signals ist in RFU (Fluoreszenzeinheiten des Herstellers) ausgedrückt.
Mtb-Transkripte
Angesprochene Basen: Prozentsatz der richtig identifizierten Basen.
HIV-Transkripte
In beiden Fällen Mtb und HIV beobachtet man eine sehr effiziente Markierung mit Intensitäten von mehr als 1000 Rfu und Prozentsätzen der Resequenzierung (angesprochene Basen) nahe an 100 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reaktion zwischen dem Alkoxyamin und dem Methylketon, die im Monomerzustand gezeigt wurde, auch zwischen RNA-Sequenzen, die Methylketonfunktionen aufweisen, und Fluoreszenzmarker, die die Alkoxyaminfunktion tragen, spezifisch und effizient ist. Man erhält mit nur 2 Äquivalenten des Alkoxyaminmarkers pro Methylketonfunktion eine ausreichende Anzahl an markierten und detektierbaren Transkriptfragmenten.
BEISPIEL V: AUFNAHME DES CYTIDINMETHYLKETONS 3 UND POST-TRANSKRIPTIONSMARKIERUNG
Das Cytidin 3 wurde, wie in Beispiel III beschrieben, zu 100 % in RNA-Transkripte von Mtb aufgenommen. Das Spaltungs- und Markierungsverfahren wurde ebenfalls, wie zuvor erläutert, durchgeführt.
Auch hier ist eine sehr effiziente Markierung zu beobachten. Die Intensität des Signals ist größer als 6000 Rfu und die Resequenzierung liegt bei 94 %. Wie in dem vorhergehenden Beispiel zeigt dieses Ergebnis, dass die Reaktion zwischen dem Alkoxyamin und dem Methylketon, zwischen RNA-Sequenzen, die Methylketonfunktionen aufweisen, und dem Fluoreszenzmarker, der die Alkoxyaminfunktion trägt, spezifisch effizient ist.
BEISPIEL VI: VORTEILE DER METHYLKETONFUNKTIONEN IM VERGLEICH MIT ALKOXYAMIN-, ALDEHYD-, AMINFUNKTIONEN
1. Vergleich zwischen der Alkoxyaminfunktion und der Methylketonfunktion am Nucleotid U
Ein Uridin, das eine Alkoxyaminkette in Position 5 trägt, wurde gemäß dem in Beispiel 4 der Patentanmeldung WO-A-98/05766 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Synthese des Fluoresceinmarkeraldehyds (FLUO-CHO) ist in Beispiel 18 der Anmeldung WO-A-98/05766 beschrieben.
Es ist wichtig zu bemerken, dass die Alkoxyaminfunktion einen permanenten Schutz durch eine Tertbutoxycarbonyl(BOC)-Gruppe nötig macht. Diese Funktion wird zur gleichen Zeit wie das Isopropyliden in 2',3'-Position, und zwar nach der Phosphorylierung in Anwesenheit von 50 % Trifluoressigsäure, entschützt. Dieser Prozentsatz TFA ist nötig, um eine Entschützung des Alkoxyamins nahe 90 % zu erhalten. Um eine vollständige Entschützung zu erhalten, sind noch konzentriertere Lösungen von Säure nötig. In diesen Lösungen baut sich das Triphosphat jedoch schnell zu Diphosphat und Monophosphat ab.
Im Falle der Methylketonfunktion ist keine Entschützung nötig und es werden nur 25 % TFA für eine vollständige Entschützung des Isopropylidens in 2',3'-Position nach der Phosphorylierung verwendet. Mit diesem Prozentsatz TFA wird keinerlei Abbau beobachtet.
Die Methylketonkette ist auch nach dem Entschützen ausreichend hydrophob, sie trägt somit zu einer guten Abtrennung des Nucleotidtriphosphats während seiner Aufreinigung durch HPLC an inverser Phase bei. Diese Abtrennung ist im Falle der Alkoxyaminkette schwieriger.
Aufnahme und Postmarkierung des UTP-Alkoxyamins
Die Transkriptionsreaktion, die enzymatische Hydrolyse der Transkripte, die HPLC-Analyse und die Postmarkierung wurden unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel IV beschrieben, durchgeführt.
Die Figur zeigt die Ausbeuten für die Transkription gemessen als die Menge der Amplicons (ausgedrückt als Kopien/Mikroliter) in Abhängigkeit der 3 verwendeten Nucleotide.
In diesem Beispiel wird die Aufnahme der beiden Nucleotide Alkoxyamin (U-ONH₂) und Methylketon (U-COCH₃ Verbindung 1) studiert.
Das Uridinmethylketon 1 hat bei 100 % keinen Einfluss auf die Ausbeute der Transkription. Bei der Aufnahme des gleichen Nucleotids, das eine Alkoxyaminfunktion trägt, ist die Ausbeute geringer.
Postmarkierung
Der Prozentsatz der Resequenzierung unter Verwendung von Uridinalkoxyamin ist geringer als der, der mit dem Homologen erhalten wurde, das die Methylketonfunktion trägt.
2. Vergleich zwischen der Aldehydfunktion und der Methylketonfunktion am Nucleotid U
Uridin mit einer Aldehydkette (U-CHO) wird gemäß dem folgenden Schema hergestellt
Die Kette wird durch Peptidkopplung zwischen 4-Aminobutyraldehyddiethylacetal und 4-Pentinsäure synthetisiert. Die Heck-Kupplung wird mit dem geschützten Nucleosid durchgeführt. Die Phosphorylierung, gefolgt von einem Entschützen in saurem Milieu, führt gut zum erwarteten Nucleotid. Die Nucleotide wurden durch ¹H-NMR und ¹³C-NMR charakterisiert.
Hier ist ebenfalls der Schutz der Alehydfunktion vor den Schritten der Kopplung und der Phosphorylierung nötig. Das Entschützen des Aldehyds wird zur gleichen Zeit wie das des Isopropyliden (25 % TFA) durchgeführt, die Aufreinigung und Entsalzung des entschützten Produkts ist jedoch im Vergleich zum Methylketonnucleotid (U-COCH₃, Verbindung 1) schwieriger. Die Ausbeute des Phosphorylierungsschritts liegt bei 20 %.
Die HPLC-Analyse der UTP-Aldehyd enthaltenden Transkripte, die durch die im Beispiel IV beschriebene enzymatische Technik hydrolysiert wurden, zeigt, dass das Aldehydnucleotid transformiert wurde. Diese Transformierung geht mit Sicherheit auf Interaktionen zwischen der Aldehydfunktion und Bestandteilen des Puffers während der Transkription oder der enzymatischen Hydrolyse der Transkripte zurück.
Die Postmarkierungsreaktion unter Verwendung von Fluoresceinalkoxyamin zeigt nach der Analyse auf einem Gel oder auf einem DNA-chip mit Transkripten von Mycobacterium keine Ergebnisse. Dies zeigt, dass sich die Transformierung des Aldehyds während des Transkriptionsschritts ereignet, was das Interesse an der Methylketonfunktion im Vergleich zum Aldehyd zeigt.
3. Vergleich zwischen der Aminfunktion und der Methylketonfunktion am Nucleotid U
Uridin, das in 5-Position eine Aminkette trägt (U-NH₂) wird gemäß dem in Beispiel 3 der Patentanmeldung WO 98/05766 beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Schützen der Aminfunktion mit einer Boc-Gruppe ist auch in diesem Fall nötig.
Die Transkriptionsausbeuten, die mit 100 % U-NH₂ erhalten wurden, sind viel geringer als im Fall der Verwendung der Methylketonfunktion und erlaubten keine effiziente Resequenzierung an einem DNA-Chip, sowohl im Fall von Mtb wie auch im Fall von HIV.
4. Vergleich zwischen der Aminfunktion und der Methylketonfunktion am Nucleotid C
Cytidin, das eine Aminkette in 4-Position trägt (C-NH₂), wird gemäß Beispiel 16 der Patentanmeldung WO-A-98/05776 hergestellt.
Dieses Nucleotid wurde durch eine Transkriptionsreaktion, ausgehend von Ziel-PCR gemäß dem in Beispiel IV beschriebenen Protokoll, in die 16S-RNA-Fragmente von Mycobacterium tuberculosis aufgenommen.
Die HPLC-Analyse der Transkripte, die C-NH₂ enthalten und die durch die enzymatische Technik hydrolysiert wurden, die in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben ist, zeigt, dass das Amin gut aufgenommen wurde und intakt ist.
Die Ausbeuten der Transkription mit verschiedenen Prozentsätzen C-NH₂, die ebenfalls, wie in Beispiel IV angegeben, bestimmt wurden, sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.
Es ist bemerkenswert, dass mit 100 % C-NH₂ die Menge der erhaltenen Amplicons 20 Mal geringer ist als die, die mit einer Transkription erhalten wurde, die 100 % natürliche Nucleotide enthält.
In der Postmarkierungsreaktion wurde als Markierungsreagens Fluoresceinisothiocyanat verwendet, das von Sigma-Aldrich (St. Quentin, Falavier, Frankreich) erhalten wurde.
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
Die Markierung der durch die Aufnahme von C-NH₂ erhaltenen Transkripte wurden durch FITC markiert, auf einen zur Identifikation des Mtb-Ziels ausgelegten DNA-Chip hybridisiert und die Signale wurden gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll analysiert. Die mit und ohne Blockermittel erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.
ND: nicht bestimmt, die Oberfläche des Chips ist vollständig gesättigt.
Diaminblocker: H₂N-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH₂
Ohne Zugabe der Diaminkette nach der Markierung war die Oberfläche des Chips vollkommen durch die 100 eq Marker gesättigt und die Signale waren nicht verwertbar. Diese Sättigung geht mit Sicherheit auf eine Wechselwirkung zwischen der Isothiocyanatfunktion und den exocyclischen Aminfunktionen der Basen zurück.
Die Postmarkierungszugabe von 1000 eq eines Diaurins, das die gleiche Struktur aufweist wie die, die von Cytidin getragen wird, scheint diese Hypothese zu bestätigen, da die Oberfläche des Chips nicht mehr gesättigt war und 86 % Resequenzierung erreicht wurden. Die Intensität des Signals ist im Vergleich mit dem, das mit den Transkripten erhalten wurde, die Methylketon aufweisen und mit Fluoresceinalkoxyamin markiert wurden, niedrig.
Zusätzlich zu seiner Inhibitorwirkung während der Transkription ist der Prozentsatz der Resequenzierung unter Verwendung von C-NH₂ viel geringer als der, der mit dem Homolog erhalten wurde, das die Methylketonfunktion trägt (C-COCH₃, Verbindung 3).

Claims

Funktionalisierte Verbindung mit der allgemeinen Formel (I):
in welcher W ein Nucleotidanalog darstellt, welches ausgewählt ist aus einem Nucleosid und einem Nucleotid, wobei das Nucleosid und das Nucleotid eine oder mehrere Modifikationen an einem ihrer Grundelemente tragen können, welche der Ribose- oder der Desoxyribosezucker, die stickstoffhaltige Base und das Phosphat oder eines seiner Äquivalente sind, L einen Verbindungsarm mit einer Verkettung von 8 bis 30 Atomen darstellt, und L eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette ist, die ggf. durch zumindest eine Funktion unterbrochen ist, die ausgewählt ist aus einer Amin-, Amid- und Oxid-Funktion, und R₁ eine lineare oder verzweigte Alkylkette darstellt.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ eine Alkylkette mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen darstellt.
Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ eine Methylgruppe darstellt.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass W der allgemeinen Formel (II)
entspricht, in der – R₂ für H oder eine Schutzgruppe steht, – R₃ für H, F, OH, SH, NH₂, OCH₃ oder OR₅ steht, wobei R₅ für eine Schutzgruppe oder eine Alkylkette steht, – R₄ für einen H-Rest, eine Schutzgruppe oder eine Mono-, Di- oder Triphosphat-Gruppe steht, – B eine stickstoffhaltige Base darstellt und – W über B an L gebunden ist.
Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die stickstoffhaltige Base Cytosin, Uracil oder Adenin ist.
Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass R₂ ein H, R₃ eine OH-Gruppe und R₄ eine Triphosphat-Gruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass R₂ eine 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoamidit-Gruppe ist, und R₃ für H oder OR₅ steht, wobei R₅ eine Schutzgruppe ist, die bei der Synthese eines Oligoribonucleo tids eingesetzt wird, und dass R₄ eine 4,4'-Dimethoxytrityl-Gruppe ist.
Funktionalisiertes Polynucleotid mit zumindest einer funktionalisierten Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche.
Funktionalisiertes Polynucleotid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid auf chemische und/oder auf enzymatische Weise hergestellt wird.
Funktionalisiertes Polynucleotid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid durch eine enzymatische Amplifikationsreaktion hergestellt wird.
Markiertes funktionalisiertes Polynucleotid, welches aus einer Kopplung zwischen einem Markierungsreagens, das eine nucleophile Funktion trägt, und der Alkylketonfunktion eines funktionalisierten Polynucleotids nach einem der Ansprüche 8 bis 10 entsteht.
Polynucleotid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens eine Hydrazin- oder Alkoxyamin-Funktion aufweist.
Polynucleotid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens
ist.
Verfahren zur Detektion einer Ziel-Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass – die Ziel-Nucleinsäure mit zumindest einem funktionalisierten Nucleotid der Formel (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, in Gegenwart von zumindest einem Enzym in Kontakt gebracht wird, damit zumindest ein funktionalisiertes Nucleotid in die Ziel-Nucleinsäure eingebaut und eine funktionalisierte Ziel-Nucleinsäure gewonnen werden kann, – dass man ein Markierungsreagens, welches eine nucleophile Funktion trägt, an der Alkylketon-Funktion der funktionalisierten Nucleinsäure reagieren lässt, – und dass die markierte Nucleinsäure detektiert wird.
Verfahren zur Detektion einer Ziel-Nucleinsäure nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die nucleophile Funktion des Markierungsreagens eine Alkoxyamin-Funktion ist.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Ziel-Nucleinsäure durch eine enzymatische Amplifikationsreaktion gewonnen wird.
Verfahren zur Detektion einer Ziel-Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass – die Ziel-Nucleinsäure mit einem funktionalisierten Polynucleotid in Kontakt gebracht wird, das zumindest eine funktionalisierte Verbindung der Formel (I) aufweist, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, – dass man ein Markierungsreagens, welches eine nucleophile Funktion trägt, an der Alkylketon-Funktion des funktionalisierten Polynucleotids reagieren lässt, – und dass das Vorliegen der Ziel-Nucleinsäure durch die Detektion des markierten Hybrides nachgewiesen wird.
Verfahren zur Detektion einer Ziel-Nucleinsäure nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die nucleophile Funktion des Markierungs-Reagens eine Alkoxyamin-Funktion ist.
Verfahren zur Detektion einer Ziel-Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass – ein markiertes, funktionalisiertes Polynucleotid bereitgestellt wird, das aus einer Kopplung zwischen einem Markierungsreagens, das eine nucleophile Funktion trägt und der Alkylketon-Funktion eines funktionalisierten Polynucleotids stammt, welches zumindest eine funktionalisierte Verbindung der Formel (I) aufweist, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, – dass diese Ziel-Nucleinsäure mit dem markierten, funktionalisierten Polynucleotid in Kontakt gebracht wird, – dass ein Hybrid aus dem Ziel und dem markierten, funktionalisierten Polynucleotid gebildet wird, – und dass das Vorliegen der Ziel-Nucleinsäure durch die Detektion des markierten Hybrids detektiert wird.