DE60019547T2

DE60019547T2 - Biosensor

Info

Publication number: DE60019547T2
Application number: DE60019547T
Authority: DE
Inventors: Yuko Taniike; Shin Ikeda; Shiro Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: CN1172181C; EP1126032B1; EP1126032A1; US7060168B2; ES2238254T3; CN1301962A; US20010006149A1; US6599407B2; DE60019547D1; US20030205464A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor für die schnelle Quantifizierung eines in einer Probe enthaltenden Substrats mit hoher Genauigkeit.
Herkömmlicherweise wurden Verfahren unter Verwendung von Polarimetrie, Kolorimetrie, Reduktimetrie und einer Vielzahl von Chromatographieverfahren als Messverfahren für die quantitative Analyse von Zuckern, wie etwa Saccharose und Glukose entwickelt. Jedoch haben diese herkömmlichen Verfahren alle eine schlechte Spezifität für Zucker und haben folglich eine schlechte Genauigkeit. Von ihnen ist die Polarimetrie am einfachsten in der Handhabung, aber sie wird stark durch die Temperatur während der Handhabung beeinflusst. Daher ist dieses Verfahren nicht für die einfache Quantifizierung von Zuckern durch normale Menschen zuhause geeignet.
In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von Biosensoren entwickelt, welche eine spezifische katalytische Wirkung von Enzymen nutzen.
Im Folgenden wird ein Verfahren für die quantitative Analyse von Glukose, als ein Beispiel des Verfahrens für die Quantifizierung eines in einer Probe enthaltenden Substrats erläutert. Die herkömmlich bekannte elektrochemische Quantifizierung von Glukose schließt ein Verfahren unter Verwendung einer Kombination von Glukoseoxidase (EC 1.1.3.4: hiernach als „GOD" abgekürzt) als ein Enzym mit einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode ein (siehe z.B. „Biosensor" hg. von Shuichi Suzuki, Kodansha).
GOD oxidiert selektiv β-D-Glukose als ein Substrat zu D-Glukono-δ-Lakton unter Verwendung von Sauerstoff als ein Elektronenvermittler. Sauerstoff wird zu Wasserstoffperoxid während der Oxidationsreaktion durch GOD in der Anwesenheit von Sauerstoff reduziert. Ein vermindertes Sauerstoffvolumen wird durch die Sauerstoffelektrode gemessen, oder ein erhöhtes Wasserstoffperoxidvolumen wird durch Wasserstoffperoxidelektrode gemessen. Das verminderte Sauerstoffvolumen oder, andererseits, das erhöhte Wasserstoffperoxidvolumen ist proportional zu dem Glukosegehalt in der Probe. Es ist daher möglich, Glukose auf der Grundlage des verminderten Sauerstoffvolumens oder des erhöhten Wasserstoffperoxidvolumens zu quantifizieren.
In dem vorher erwähnten Verfahren ist es möglich Glukose in der Probe unter Verwendung der Spezifität der Enzymreaktion genau zu quantifizieren. Jedoch, wie aus der Reaktion ersichtlich, hat dieses Verfahren des Stands der Technik den Nachteil, dass das Messergebnis stark durch die Sauerstoffkonzentration in der Probe beeinträchtigt wird. Folglich, in dem Fall dass kein Sauerstoff in der Probe vorhanden ist, ist die Messung undurchführbar.
Unter derartigen Umständen wurde ein neuartiger Glukosesensor entwickelt, welcher als den Elektronenvermittler eine organische Verbindung oder einen Metallkomplex, wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat oder ein Chinonderivat anstelle von Sauerstoff in der Probe verwendet. Diese Art von Sensor oxidiert den reduzierten Elektronenvermittler, der aus der Enzymreaktion an der Arbeitselektrode resultiert, um so die Glukosekonzentration in der Probe auf der Grundlage des Oxidationsstroms, erzeugt durch die Oxidationsreaktion, zu bestimmen. Zu diesem Zeitpunkt wird an der Gegenelektrode der oxidierte Elektronenvermittler reduziert und eine Reaktion für die Erzeugung des reduzierten Elektronenvermittlers läuft ab. Mit der Verwendung einer derartigen organischen Verbindung oder eines Metallkomplexes als dem Elektronenvermittler anstelle von Sauerstoff ist es möglich, eine Reagenzschicht durch genaue Anordnung einer bekannten Menge an GOD zusammen mit dem Elektronenvermittler in ihrem stabilen Zustand auf der Elektrode zu bilden, wodurch eine genaue Quantifizierung von Glukose ohne Beeinträchtigung durch die Sauerstoffkonzentration in der Probe ermöglicht wird. In diesem Fall ist es ebenfalls möglich, die Reagenzschicht, die das Enzym und den Elektronenvermittler enthält, mit einem Elektrodensystem zu integrieren, während die Reagenzschicht in einem nahezu trockenen Zustand ist, und daher wurde ein Einweg-Glukosesensor auf der Grundlage dieser Technologie vor kurzem beträchtlich beachtet. Ein typisches Beispiel eines derartigen Glukosesensors ist ein Biosensor offenbart in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Hei 3-202764. Mit einem derartigen Einweg-Glukosesensor ist es möglich, die Glukosekonzentration einfach mit einer Messvorrichtung durch simples Einbringen einer Probe in einen Sensor zu messen, der abnehmbar mit der Messvorrichtung verbunden ist. Die Anwendung einer derartigen Technik ist nicht auf die Quantifizierung von Glukose begrenzt und kann auf die Quantifizierung jedes anderen in der Probe enthaltenden Substrats ausgedehnt werden.
Jedoch läuft in den vorher beschriebenen herkömmlichen Biosensoren, wenn die Probe ein Substrat in hohen Konzentrationen enthält, die Enzymreaktion ebenfalls an der Gegenelektrode ab und die Zufuhr des Elektronenvermittlers zu der Gegenelektrode wird folglich unzureichend, so dass die Reaktion an der Gegenelektrode ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt wird, welcher es unmöglich macht eine Stromantwort proportional zu der Substratkonzentration zu erhalten. Daher weisen derartige Biosensoren das Problem auf, dass die Quantifizierung eines Substrats nicht möglich ist, wenn die Probe ein Substrat in hohen Konzentrationen enthält.
In den letzten Jahren gibt es eine Nachfrage für einen Biosensor, der eine geringe Antwort aufweist, wenn die Substratkonzentration Null ist und eine hervorragende Lagerstabilität hat. Die Antwort, die erhalten wird, wenn die Substratkonzentration Null ist, wird hiernach als „Leerantwort" bezeichnet.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen Biosensor zur Verfügung umfassend: ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode für die Bildung eines elektrochemischen Messsystems durch in Kontakt kommen mit einer zugeführten Probelösung; ein elektrisch isolierendes, tragende Element für das Tragen des Elektrodensystems; eine erste Reagenzschicht, gebildet auf der Arbeitselektrode; und eine zweite Reagenzschicht, gebildet auf der Gegenelektrode, wobei die erste Reagenzschicht keinen Elektronenvermittler enthält und ein Enzym als Hauptbestandteil umfasst, und die zweite Reagenzschicht kein Enzym enthält und einen Elektronenvermittler als Hauptbestandteil umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das tragende Element eine elektrisch isolierende Grundplatte, auf welcher die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode gebildet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das tragende Element eine elektrisch isolierende Grundplatte und ein elektrisch isolierendes Deckelement für die Bildung eines Probenlösungszufuhrweges oder eines Probenlösungsspeicherabschnitts zwischen dem Deckelement und der Grundplatte, wobei die Arbeitselektrode auf der Grundplatte gebildet wird, und die Gegenelektrode auf einer inneren Oberfläche des Deckelements gebildet wird, um der Arbeitselektrode gegenüberzuliegen.
Es ist bevorzugt, dass das Deckelement ein Blattelement mit einem nach außen gebogenen Abschnitt für die Bildung des Probenlösungszufuhrweges oder des Probenlösungslagerabschnitts zwischen dem Deckelement und der Grundplatte umfasst.
In einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Deckelement einen Abstandshalter mit einem Schlitz für die Bildung des Probenlösungszufuhrweges und eine Abdeckung für die Abdeckung des Abstandshalters.
Es ist bevorzugt, dass wenigstens die erste Reagenzschicht ein hydrophiles Polymer umfasst.
Während die neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den angehängten Ansprüchen dargelegt werden, wird die Erfindung, sowohl ihr Aufbau als auch ihr Inhalt, zusammen mit anderen Aufgaben und Merkmalen davon, aus der folgenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen besser verstanden und eingeschätzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG VERSCHIEDENER ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung.
Die 2 ist eine auseinander gezogene Darstellung des Glukosesensors, welche dessen Reagenzienschichten und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels weglässt.
Die 3 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors gemäß eines weiteren Beispiels der vorliegenden Erfindung.
Die 4 ist eine perspektivische Ansicht des Glukosesensors, welche dessen Reagenzienschichten und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels weglässt.
Die 5 ist eine vertikale Querschnitts eines Glukosesensors gemäß eines noch weiteren Beispiels der vorliegenden Erfindung.
Die 6 ist eine auseinander gezogene Darstellung des Glukosesensors, welche dessen Reagenzienschichten und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels weglässt.
Die 7 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors eines Vergleichsbeispiels.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Biosensor gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine elektrisch isolierende Grundplatte; eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode gebildet auf der Grundplatte; eine erste Reagenzschicht gebildet auf der Arbeitselektrode; und eine zweite Reagenzschicht gebildet auf der Gegenelektrode, wobei die erste Reagenzschicht keinen Elektronenvermittler enthält und ein Enzym als den Hauptbestandteil umfasst, und die zweite Reagenzschicht kein Enzym enthält und einen Elektronenvermittler als Hauptbestandteil umfasst.
In diesem Biosensor läuft die Reaktion kaum an der Gegenelektrode ab, insbesondere wenn die Probe ein Substrat in hohen Konzentrationen enthält, da der Elektronenvermittler der Hauptbestandteil der zweite Reagenzschicht auf der Gegenelektrode ist. Folglich ist die Wahrscheinlichkeit einer Kollision zwischen dem Enzym und dem Elektronenvermittler in der Probenlösung, in welchem die Reagenzien gelöst sind, herabgesetzt, so dass die Linearität des Antwortstroms gesenkt wird. Da jedoch ausreichend Elektronenvermittler an der Gegenelektrode für die Reaktion zurückgehalten wird, wird die Reaktion an der Gegenelektrode ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt. In dem Ergebnis kann die Linearität des Antwortstroms erhalten werden, selbst bis zu einem Bereich einer hohen Substratkonzentration.
Ein Biosensor in Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine elektrisch isolierende Grundplatte; ein elektrisch isolierendes Deckelement für die Bildung eines Probenlösungszufuhrweges oder eines Probenlösungsspeicherabschnitts zwischen dem Deckelement und der Grundplatte; eine auf der Grundplatte gebildete Arbeitselektrode,; eine auf einer inneren Oberfläche des Deckelements gebildete Gegenelektrode, um der Arbeitselektrode gegenüberzuliegen; eine auf der Arbeitselektrode gebildete erste Reagenzschicht; und eine auf der Gegenelektrode gebildete zweite Reagenzschicht.
Das Deckelement umfasst ein Blattelement mit einem nach außen gebogenen Abschnitt für die Bildung des Probenlösungszufuhrweges oder des Probenlösungslagerabschnitts zwischen dem Deckelement und der Grundplatte.
Ein bevorzugteres Deckelement umfasst einen Abstandshalter mit einem Schlitz für die Bildung des Probenlösungszufuhrweges und eine Abdeckung für die Abdeckung des Abstandhalters.
In einem derartigen Biosensor, da die erste Reagenzschicht bzw. die zweite Reagenzschicht auf separaten Elementen gebildet werden, können die erste Reagenzschicht und die zweite Reagenzschicht mit unterschiedlichen Zusammensetzung leicht voneinander getrennt werden. Überdies, da die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode in gegenüberliegenden Positionen gebildet werden, wird der Innentransfer zwischen den Elektroden erleichtert, wodurch die Stromantwort weiter erhöht wird.
In einem Biosensor, dessen Deckelement den Abstandshalter und die Abdeckung enthalten, wird, da die physikalische Festigkeit der Abdeckung erhöht wird, die erste Reagenzschicht und die zweite Reagenzschicht nicht durch externen physikalischen Druck miteinander in Kontakt gebracht, wodurch der Abbau der Enzymaktivität aufgrund des Kontakts zwischen dem Enzym und dem Elektronenvermittler vermieden wird.
In jeder der vorher beschriebenen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass wenigstens die erste Reagenzschicht ein hydrophiles Polymer enthält. Da das hydrophile Polymer die Adsorption von Proteinen usw. an die Arbeitselektrode verhindert, wird die Sensitivität der Stromantwort weiter verbessert. Daneben wird während der Messung, da die Viskosität einer Probenlösung durch das hydrophile Polymer gelöst in der Probenlösung erhöht wird, die Wirkungen von physikalischen Stößen usw. auf die Stromantwort reduziert, wodurch die Stabilität der Stromantwort verbessert wird.
In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, für die Grundplatte, die Abstandshalter und die Abdeckung jedes Material mit Isolationseigenschaften und ausreichender Festigkeit während Lagerung und Messung zu verwenden. Beispiele derartiger Materialien enthalten thermoplastische Harze, wie Polyethylen, Polystryol, Polyvinylchlorid, Polyamid und gesättigtes Polyesterharz oder wärmehärtende Harze, wie etwa Harnstoffharz, Melaminharz, Phenolharz, Epoxidharz und ungesättigte Polyesterharze. Von diesen Harzen ist Polyethylenterephthalat mit Blick auf die Haftfestigkeit der Elektrode bevorzugt.
Für die Arbeitselektrode ist es möglich, jedes leitfähige Material zu verwenden, wenn es nicht selbst bei der Oxidation des Elektronenvermittlers oxidiert wird. Für die Gegenelektrode ist es möglich ein allgemein verwendetes leitfähiges Material, wie etwa Palladium, Silber, Platin oder Kohlenstoff zu verwenden.
Es ist möglich, als das Enzym eines zu verwenden, dass sich für die Art des Substrats in der Probe eignet, welches der Gegenstand der Messung ist. Beispiele für Enzyme schließen Fruktosedehydrogenase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Laktatoxidase, Cholesterinoxidase, Xantinoxidase und Aminosäureoxidase ein.
Beispiele des Elektronenvermittlers enthalten Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Methylen blau und Ferrocenderivate. Daneben wird, selbst wenn Sauerstoff als der Elektronenvermittler verwendet wird, eine Stromantwort erhalten. Diese Elektronenvermittler werden einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet.
Eine Vielzahl von hydrophilen Polymeren sind einsetzbar. Beispiele für das hydrophile Polymer enthalten Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäure, wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine und ihre Derivate, Polyacrylsäure und ihre Salze, Polymethacrylsäure und ihre Salze, Stärke und ihre Derivate, und ein Polymer von Maleinsäureanhydrid oder einem Maleat. Von ihnen sind Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylcellulose besonders bevorzugt.
Die folgende Beschreibung wird die vorliegende Erfindung ausführlicher durch veranschaulichende Beispiele davon erläutern.
Beispiel 1
Ein Glukosesensor wird als ein Beispiel eines Biosensors erläutert.
Die 1 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors dieses Beispiels, und die 2 ist eine auseinander gezogene Darstellung des Glukosesensors, wobei dessen Reagenzienschichten und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels weggelassen sind.
Zunächst wird eine Silberpaste auf eine elektrisch isolierende Grundplatte 1 aus Polyethylenterephthalat durch Siebdruck gedruckt, um Leitungen 2 und 3 und die Grundlage der später beschriebenen Elektroden zu bilden. Dann wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode 4 zu bilden. Diese Arbeitselektrode 4 war in Kontakt mit der Leitung 2. Ferner wird eine isolierende Paste auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine Isolationsschicht 6 zu bilden. Die Isolationsschicht 6 bedeckt den peripheren Abschnitt der Arbeitselektrode 4, so dass eine festgesetzte Fläche der Arbeitselektrode 4 exponiert wurde. Als nächstes wurde eine Gegenelektrode 5 durch Drucken einer leitfähigen Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel gebildet, so dass sie in Kontakt mit der Leitung 3 ist.
Eine erste wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym und keinen Elektronenvermittler enthält, wurde auf die Arbeitselektrode 4 der Grundplatte 1 getropft und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 zu bilden. Daneben wurde eine zweite wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenvermittler und kein Enzym enthält, auf die Gegenelektrode 5 der Grundplatte 1 getropft und dann getrocknet, um eine zweite Reagenzschicht 8 zu bilden. Um weiterhin eine gleichmäßige Zufuhr einer Probe zu erreichen, wird eine Schicht 9 mit Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel ausgebildet, um die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 abzudecken.
Schließlich wird die Grundplatte 1, eine Abdeckung 12 und ein Abstandhalter 10 in einer Positionsbeziehung, wie durch die gestrichelten Linien in der 2 gezeigt, angehaftet, um den Glukosesensor zu erzeugen.
Der zwischen die Grundplatte 1 und die Abdeckung 12 einzubringende Abstandshalter 10 hat einen Schlitz 11 für die Bildung eines Probenlösungszufuhrweges zwischen der Grundplatte 1 und der Abdeckung 12.
Da eine Entlüftung 14 der Abdeckung 12 mit diesem Probenlösungszufuhrweg kommuniziert wenn die Probe mit einer Probenzufuhröffnung 13 gebildet an einem offenen Ende des Schlitzes 11 in Kontakt gebracht wird, erreicht die Probe leicht die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 in dem Probenlösungszufuhrweg aufgrund des Kapillarphänomens.
Als ein Vergleichsbeispiel wurde ein Glukosesensor in der gleichen Art und Weise wie in diesem Beispiel fabriziert, mit Ausnahme des Verfahrens für die Bildung der Reagenzienschichten. Die 7 ist eine vertikale Querschnittsansicht des Glukosesensors des Vergleichsbeispiels. Eine Reagenzschicht 30 wurde durch Auftropfen einer GOD und Kaliumferricyanid enthaltenden wässrigen Lösung auf die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 und dem Trocknen der wässrigen Lösung gebildet. Überdies wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthält, auf der Reagenzschicht 30 gebildet.
Als nächstes wurden mit den Glukosesensoren des Beispiels 1 und des Vergleichsbeispiels die Glukosekonzentration unter Verwendung einer Lösung als eine Probe gemessen, die eine bestimmte Menge an Glukose enthält. Diese Probe wurde zu dem Probenlösungszufuhrpfad über die Probenzufuhröffnung 13 zugeführt und es wurde, nach Ablauf einer bestimmten Zeit, eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 unter Verwendung der Gegenelektrode 5 als Referenz angelegt. Da der Abstandhalter 10 zwischen der Abdeckung 12 und der Grundplatte 1 angeordnet ist, wird die Beständigkeit des Sensors gegenüber einem externen physikalischen Druck erhöht. Als Konsequenz wird das Volumen des Probenlösungszufuhrweges einfach konstant gehalten und die Wirkungen des physikalischen Drucks usw. auf die Stromantwort sind reduziert.
Der Wert eines Stromes, welcher zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 nach Anlegung dieser Spannung fließt, wurde gemessen. Als ein Ergebnis wurde sowohl im Beispiel 1 als auch im Vergleichsbeispiel eine Stromantwort proportional zu der Glukosekonzentration in der Probe beobachtet. Wenn die Probe in Kontakt mit der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8 kommt, dissoziiert Kaliumferricyanid als die oxidierte Form des Elektronenvermittlers in Ferricyanidionen und Kaliumionen. Die Glukose in der Probe, die in die Probe aus der zweiten Reagenzschicht 8 gelösten Ferricyanidionen und die GOD reagieren miteinander. Im Ergebnis wird Glukose zu Glukonolakton oxidiert und die oxidierte Form des Ferricyanidions wird zu der reduzierten Form der Ferrocyanidions reduziert. Eine Reaktion der Oxidation von Ferrocyanidionen zu Ferricyanidionen läuft an der Arbeitselektrode 4 ab, während eine Reaktion der Reduktion von Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen an der Gegenelektrode 5 abläuft. Da die Konzentration an Ferrocyanidionen proportional zu der Konzentration an Glukose ist, ist es möglich, die Konzentration der Glukose auf der Grundlage des Oxidationsstromes der Ferrocyanidionen zu messen.
In dem Glukosesensor dieses Beispiels wurde aus den folgenden Gründen eine hohe Linearität bis zu einer höheren Glukosekonzentration beobachtet, als in dem Glukosesensor des Vergleichsbeispiels.
Da GOD und Kaliumferricyanid getrennt auf der Arbeitselektrode bzw. der Gegenelektrode getragen werden, läuft die Enzymreaktion kaum an der Gegenelektrode ab. Folglich wird eine ausreichende Konzentration an Kaliumferricyanid auf der Gegenelektrode zurückgehalten, was vermeidet, dass die Reaktion an der Gegenelektrode ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt wird, selbst wenn die Probe ein Substrat in hohen Konzentrationen enthält. Im Ergebnis ist es möglich, die Linearität des Antwortstroms bis zu einem Bereich einer hohen Konzentration zu erhalten. Andererseits läuft bei dem Sensor des Vergleichsbeispiels die Enzymreaktion an der Gegenelektrode in einem Umfang ab, welcher nahezu äquivalent zu dem der Arbeitselektrode ist, welche die Reduktion der Ferricyanidionen in Ferricyanidionen verursacht. Als Konsequenz werden die Ferricyanidionen unbrauchbar für die Reaktion an der Gegenelektrode, so dass die Reaktion an der Gegenelektrode ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt wird.
Ferner wurde in dem Glukosesensor dieses Beispiels die Leerantwort gesenkt und die Stromantwort wurde im Vergleich mit dem Glukosesensor des Vergleichsbeispiels nicht zu sehr geändert, selbst nach einer Langzeitlagerung. Dies ist so, weil GOD und Kaliumferricyanid voneinander getrennt wurden, so dass es möglich war den Kontakt und die Interaktion zwischen GOD und Kaliumferricyanid zu vermeiden, wodurch ein Anstieg in der Leerantwort und der Abbau der Enzymaktivität während einer Langzeitlagerung unterdrückt wurde.
Beispiel 2
Die 3 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors dieses Beispiels, und die 4 ist eine perspektivische Ansicht des Glukosesensors, wobei dessen Reagenzienschichten und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels weggelassen wurde.
Eine Arbeitselektrode 4 und eine Leitung 2 wurden durch Sputtern von Palladium auf einer elektrisch isolierenden Grundplatte 21 gebildet. Als nächstes wurden die Arbeitselektrode 4 und ein in die Messvorrichtung einzubringender Endabschnitt durch Anheften eines isolierenden Blatts 23 auf die Grundplatte 21 definiert.
Derweil wurde eine Gegenelektrode 5 durch Sputtern von Palladium auf die innere Wandoberfläche eines nach außen gebogenen Abschnitts 24 eines elektrisch isolierenden Deckelements 22 gebildet. Ein Endabschnitt des gebogenen Abschnitts 24 wurde mit einer Entlüftung 14 versehen.
Eine erste wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym und keinen Elektronenvermittler enthält, wurde auf die Arbeitselektrode 4 auf der Grundplatte 21 aufgetropft und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 zu bilden. Daneben wurde eine zweite wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenvermittler und kein Enzym erhält, auf die Gegenelektrode 5 des Deckelements 22 aufgetropft, um eine zweite Reagenzschicht 8 zu bilden. Ferner wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthält, auf der ersten Reagenzschicht 7 gebildet.
Schließlich wurden die Grundplatte 21 und die Abdeckung 22 aneinandergehaftet, um den Glukosesensor zu erzeugen. Dem gemäß werden die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 angeordnet, um einander gegenüber zu liegen mit einem zwischen der Grundplatte 21 und dem gebogenen Abschnitt 24 des Deckelements 22 gebildeten Raum dazwischen. Dieser Raum dient als ein Probenlagerungsabschnitt und, wenn eine Probe in Kontakt mit einem offenen Ende des Raumes gebracht wird, bewegt sich die Probe einfach in Richtung der Entlüftung 14 aufgrund des Kapillarphänomens und kommt mit der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8 in Kontakt.
Als nächstes wurde die Konzentration an Glukose gemäß dem gleichen Vorgehen wie in Beispiel 1 gemessen. Als ein Ergebnis wurde eine Stromantwort proportional zu der Konzentration an Glukose in der Probe beobachtet. Die Gegenelektrode 5 war elektrisch durch Halten eines Endabschnitts des gebogenen Bereichs 24 mit einem Clip verbunden mit einem Leitungsdraht verbunden.
In dem Glukosesensor des Beispiels 2 enthielt die zweite Reagenzschicht 8 nur Kaloumferricyanid, so dass, wie in Beispiel 1, eine hohe Linearität bis zu einer höheren Glukosekonzentration als in dem Glukosesensor des Vergleichsbeispiels beobachtet wurde. Ebenso wurde in diesem Biosensor, wie im Beispiel 1, die Leerantwort herabgesetzt und die Stromantwort wird nicht zu stark geändert, selbst nach Langzeitlagerung im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel, da GOD und Kaliumferricyanid voneinander getrennt waren. Ferner wurde, im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel, ein Anstieg in dem Antwortwert beobachtet, da die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 an gegenüberliegenden Positionen gebildet wurden, so dass der Innentransfer zwischen den Elektroden vereinfacht war.
Beispiel 3
Die 5 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors dieses Beispiels und die 6 ist eine auseinander gezogene Darstellung des Glukosesensors, wobei dessen Reagenzschichten und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels weggelassen wurde.
Zunächst wurde eine Silberpaste auf eine elektrisch isolierende Grundplatte 31 aus Polyethylenterphthalat durch Siebdruck aufgedruckt, um eine Leitung 2 zu bilden. Dann wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, die ein Harzbindemittel enthält, auf die Grundplatte 31 gedruckt, um eine Arbeitselektrode 4 zu bilden. Diese Arbeitselektrode war in Kontakt mit der Leitung 2. Ferner wurde eine isolierende Paste auf die Grundplatte 31 gedruckt, um eine Isolationsschicht 6 zu bilden. Die Isolationsschicht 6 bedeckte den peripheren Bereich der Arbeitselektrode 4, so dass eine festgelegte Fläche der Arbeitselektrode 4 exponiert wurde.
Als nächstes wurde eine Silberpaste auf die innere Oberfläche einer elektrisch isolierenden Abdeckung 32 gedruckt, um eine Leitung 3 zu bilden, und dann wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste gedruckt, um eine Gegenelektrode 5 zu bilden. Ferner wurde eine isolierende Paste gedruckt, um eine Isolationsschicht 6 zu bilden. Die Abdeckung 32 wurde mit einer Entlüftung 14 versehen.
Eine erste wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym und keinen Elektronenvermittler enthält, wurde auf die Arbeitselektrode 4 der Grundplatte 31 aufgetropft und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 zu bilden, während eine zweite wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenvermittler und kein Enzym enthält, auf die Gegenelektrode 5 der Abdeckung 32 aufgetropft und dann getrocknet wurde, um eine zweite Reagenzschicht 8 zu bilden. Weiterhin wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthält, auf der ersten Reagenzschicht 7 gebildet.
Schließlich wurden die Grundplatte 31, die Abdeckung 32 und ein Abstandshalter 10 in einer Positionsbeziehung, wie durch die gestrichelten Linien in der 6 gezeigt, aneinander gehaftet, um den Glukosesensor zu erzeugen.
Der zwischen der Grundplatte 31 und der Abdeckung 32 eingeschobene Abstandshalter 10 hat einen Schlitz 11 für die Bildung eines Probenlösungszufuhrweges zwischen der Grundplatte 31 und der Abdeckung 32. Die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 sind angeordnet, um einander in dem Probenlösungszufuhrweg, geformt durch den Schlitz 11 des Abstandshalters 10, gegenüberzuliegen.
Wenn eine Probe mit einer Probenzufuhröffnung 13, gebildet an einem offenen Ende des Schlitzes 11, in Kontakt gebracht wird, erreicht die Probe leicht die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 in dem Probenlösungszufuhrweg, aufgrund des Kapillarphänomens, da die Entlüftung 14 der Abdeckung 32 mit diesem Probenlösungszufuhrweg kommuniziert.
Als nächstes, wurde die Konzentration an Glukose gemäß dem gleichen Vorgehen wie in Beispiel 1 gemessen. Als ein Ergebnis der Messung wurde eine Stromantwort proportional zu der Glukosekonzentration in der Probe beobachtet.
In dem Glukosesensor des Beispiels 3 enthielt die zweite Reagenzschicht 8 nur Kaliumferricyanid, so dass, wie in Beispiel 1, eine hohe Linearität bis zu einer höheren Glukosekonzentration als in dem Glukosesensor des Vergleichsbeispiels beobachtet wurde. Ebenso war, wie in Beispiel 2, die Stromantwort im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel erhöht, da die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 an gegenüberliegenden Positionen gebildet wurden.
Überdies war, da wie in Beispiel 1 das GOD und das Kaliumferricyanid voneinander getrennt waren, die Leerantwort gesenkt und die Stromantwort war nicht so stark verändert, selbst nach Langzeitlagerung im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel.
Überdies war, da der Abstandshalter 10 zwischen der Grundplatte 31 und der Abdeckung 32 eingeschoben war, die Beständigkeit des Sensors gegen externen physikalischen Druck erhöht. Im Ergebnis wurden die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 durch den physikalischen Druck niemals in Kontakt miteinander gebracht, wodurch die Schwankung der Stromantwort durch den Abbau der Enzymaktivität verursacht durch den Kontakt zwischen GOD und Kaliumferricyanid vermieden wurde. Zusätzlich war, da das Volumen des Stromlösungszufuhrweges einfach konstant gehalten wurde, die Stabilität der Stromantwort im Vergleich mit Beispiel 2 verbessert.
Beispiel 4
In dieser Ausführungsform wurde ein Glukosesensor in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 3 fabriziert, mit der Ausnahme des Vorgangs der Bildung der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8.
Eine erste wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym, Carboxymethylcellulose als ein hydrophiles Polymer und keinen Elektronenvermittler enthält, wurde auf die Arbeitselektrode 4 auf der Grundplatte 31 aufgetropft und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 zu bilden, während eine zweite wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenvermittler, Carboxymethylcellulose und kein Enzym enthielt, auf die Gegenelektrode 5 der Abdeckung 32 aufgetropft und dann getrocknet wurde, um eine zweite Reagenzschicht 8 zu bilden. Überdies wurde die Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthält, auf der ersten Reagenzschicht 7 gebildet.
Als nächstes wurde die Konzentration an Glukose gemäß dem gleichen Vorgehen wie in Beispiel 1 gemessen. Als ein Ergebnis der Messung wurde eine Stromantwort proportional zu der Konzentration an Glukose in der Probe beobachtet.
In dem Glukosesensor dieses Beispiels enthielt die zweite Reagenzschicht 8 nur Kaliumferricyanid, so dass, wie in Beispiel 1, eine hohe Linearität bis zu einer höheren Glukosekonzentration als in dem Glukosesensor des Vergleichsbeispiels beobachtet wurde. Ebenso wurde, da die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 an gegenüberliegenden Positionen gebildet waren, ein Anstieg in dem Antwortwert im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel beobachtet.
Überdies war, da GOD und Kaliumferricyanid voneinander getrennt waren, selbst nach Langzeitlagerung im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel, die Leerantwort herabgesetzt und die Stromantwort nicht so stark verändert.
Überdies war, da der Abstandshalter 10 zwischen der Grundplatte 31 und der Abdeckung 32 eingeschoben war, es möglich, die Schwankung der Stromantwort durch den Abbau der Enzymaktivität, verursacht durch den Kontakt zwischen GOD und Kaliumferricyanid, zu vermeiden. Zusätzlich war, da das Volumen des Probenlösungszufuhrweges leicht konstant gehalten wurde, die Stabilität des Antwortstroms im Vergleich mit Beispiel 2 verbessert.
Nebenbei war im Vergleich mit Beispielen 2 und 3 aus dem folgenden Grund die Stromantwort weiter erhöht. Die Anwesenheit von Carboxymethylcellulose in der ersten Reagenzschicht 7 vermied die Adsorption von Proteinen an die Oberfläche der Arbeitselektrode 4 und folglich lief die Elektrodenreaktion an der Arbeitselektrode 4 gleichmäßig ab. Ferner, da die Viskosität der Probe während der Messung anstieg, waren die Wirkungen von physikalischen Stößen usw. auf den Sensor reduziert und die Schwankungen in der Sensorantwort war herabgesetzt.
In den vorher beschriebenen Beispielen, in denen eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 unter Verwendung der Gegenelektrode 5 als Referenz angelegt wurde, ist die Spannung nicht notwendigerweise auf 500 mV begrenzt. Jede Spannung, die die Oxidation des durch die Enzymreaktion reduzierten Elektronenvermittlers ermöglicht, kann verwendet werden.
In den vorhergehenden Beispielen enthielt die zweite auf der Gegenelektrode gebildete Reagenzschicht nur den Elektronenvermittler, aber sie kann andere Bestandteile als den Elektronenvermittler enthalten, solange der Einschluss von derartigen Bestandteilen auf die Reaktion an der Gegenelektrode nicht zu einem geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt machen, und der Einfluss, den sie auf die Leerantwort und die Lagerstabilität haben, so gering ist, dass er zu vernachlässigen ist. Ebenfalls enthält in diesen Beispielen die erste auf der Arbeitselektrode gebildete Reagenzschicht entweder nur das Enzym oder das Enzym und das hydrophile Polymer, aber es kann ebenfalls die anderen Komponenten enthalten, solange der Einfluss, den ein derartiger Einschluss haben kann, auf die Leerantwort und die Lagerstabilität so klein ist, dass er zu vernachlässigen ist.
In den vorher beschriebenen Beispielen wurde nur eine Art von Elektronenvermittler verwendet, aber zwei oder mehrere Sorten an Elektronenvermittler können verwendet werden.
Die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 kann auf der Arbeitselektrode 4 oder der Gegenelektrode 5 immobilisiert werden, um so das Enzym oder den Elektronenvermittler unlöslich zu machen. In dem Fall, wo die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 immobilisiert werden, ist es bevorzugt ein Vernetzer-Immoblisierungsverfahren oder ein Adsorptionsverfahren zu verwenden. Alternativ können der Elektronenvermittler und das Enzym in die Arbeitselektrode bzw. die Gegenelektrode gemischt werden.
Es ist möglich, ein anderes Material als Lecithin als das oberflächenaktive Mittel zu verwenden. Nebenbei ist in der vorhererwähnten Beispielen, obwohl die Dichte des oberflächenaktiven Mittels 9 nur auf der ersten Reagenzschicht 7 oder auf der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8 gebildet wurde, die Bildung der Schicht des oberflächenaktiven Mittels 9 nicht notwendigerweise auf diese Beispiele beschränkt, und die Schicht des oberflächenaktiven Mittels 9 kann an einer Position gegenüber dem Probenlösungszufuhrweg 9 gebildet werden, wie etwa eine Seitenfläche des Schlitzes 11 des Abstandhalters 10.
In den vorher beschriebenen Beispielen wird ein Zweielektrodensystem bestehend aus nur der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode beschrieben. Jedoch, wenn ein Dreielektrodensystem, einschließlich einer zusätzlichen Referenzelektrode, eingesetzt wird, ist es möglich eine genauere Messung durchzuführen.
Es ist bevorzugt, dass die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 nicht in Kontakt miteinander sind und voneinander mit einem dazwischen eingeschobenen Raum getrennt werden. Dem gemäß ist es möglich, weiterhin die Wirkung der Unterdrückung eines Anstiegs der Leerantwort und die Wirkung der Verbesserung der Lagerungsstabilität zu erhöhen.
Wie vorher beschrieben ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, einen Biosensor mit einer vorteilhaften Stromantworteigenschaft bis zu einem hohen Konzentrationsbereich zu erhalten. Ferner ist es möglich einen Biosensor mit einer geringen Leerantwort und einer hohen Lagerungsstabilität zu erhalten.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Bezug auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist zu verstehen, dass eine derartige Offenbarung nicht als begrenzend zu interpretieren ist. Verschiedene Veränderungen und Modifikationen werden ohne Zweifel für diejenigen Fachleute offensichtlich sein, die diese Erfindung betrifft, nachdem sie die vorherige Offenbarung gelesen haben.

Claims

Biosensor umfassend: ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode (4) und einer Gegenelektrode (5) für die Bildung eines elektrochemischen Messsystems durch in Kontakt kommen mit einer zugeführten Probelösung; ein elektrisch isolierendes, tragende Element (1, 21, 22, 31, 32) für das Tragen des Elektrodensystems; eine erste Reagenzschicht (7), gebildet auf der Arbeitselektrode (4); und eine zweite Reagenzschicht (8), gebildet auf der Gegenelektrode (5), wobei die erste Reagenzschicht (7) keinen Elektronenvermittler enthält und ein Enzym als Hauptbestandteil umfasst, und die zweite Reagenzschicht (8) kein Enzym enthält und einen Elektronenvermittler als Hauptbestandteil umfasst.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei das tragende Element eine elektrisch isolierende Grundplatte (1) umfasst, auf welcher die Arbeitselektrode (4) und die Gegenelektrode (5) gebildet werden.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei das tragende Element eine elektrisch isolierende Grundplatte (21, 31) und ein elektrisch isolierendes Deckelement (22, 32) für die Bildung eines Probenlösungszufuhrweges oder eines Probelösungsspeicherabschnitts zwischen dem Deckelement (22, 32) und der Grundplatte (21, 31) umfasst, wobei die Arbeitselektrode (4) auf der Grundplatte (21, 31) gebildet wird, und die Gegenelektrode (5) auf einer inneren Oberfläche des Deckelements (22, 32) gebildet wird, um der Arbeitselektrode (4) gegenüber zu liegen.
Biosensor nach Anspruch 3, wobei das Deckelement (22) ein Blattelement mit einem nach außen gebogenen Abschnitt (24) für die Bildung des Probenlösungszufuhrweges oder des Probenlösungslagerabschnitts zwischen dem Deckelement (22) und der Grundplatte (21) umfasst.
Biosensor nach Anspruch 3, wobei das Deckelement einen Abstandshalter (10) mit einem Schlitz (11) für die Bildung des Probenlösungszufuhrweges umfasst, und eine Abdeckung (32) für die Abdeckung des Abstandshalters (10).
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Reagenzschicht (7) ein hydrophiles Polymer umfasst.