DE60023539T2

DE60023539T2 - Immunologischer nachweis von rna:dna-hybriden auf mikroarrays

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Publication number: DE60023539T2
Application number: DE60023539T
Authority: DE
Inventors: G. James LAZAR; M. Joan ZAKEL; M. Christina STRANGE; R. Inna WILLIAMS; T. Attila LORINCZ; Abel De La Rosa
Original assignee: Qiagen Gaithersburg LLC
Current assignee: Qiagen Gaithersburg LLC
Priority date: 1999-11-15
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-11-15
Also published as: EP1230396A2; US6686151B1; EP1230396B1; DE60023539D1; BR0015582A; ATE307903T1; WO2001036681A2; AU784821B2; AU1764601A; WO2001036681A3; CA2391558A1; BRPI0015582B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung liegt, wie hier weiter beschrieben, auf dem allgemeinen Gebiet der Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf einer Festphase unter Verwendung eines Hybridisierungs-Assays.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die RNA oder DNA von einer Vielzahl von Genen, einschließlich solchen, die mit Krankheitszuständen, Mikroorganismen und Viren in Verbindung stehen, wurde isoliert und sequenziert. Nukleinsäuresonden, die auf solchen Sequenzen basieren, sind gegenwärtig verfügbar, um eine große Anzahl von Genen und Infektionen zu identifizieren. Nukleinsäuresonden sind detektierbare Nukleinsäuresequenzen, die an komplementäre RNA- oder DNA-Sequenzen in einer Testprobe hybridisieren. Die Detektion der Sonde weist auf das Vorliegen einer bestimmten Nukleinsäuresequenz in der Testprobe, für welche die Sonde spezifisch ist, hin. Neben dem hilfreichen Einsatz in der wissenschaftlichen Forschung können Nukleinsäuresonden verwendet werden, um das Vorliegen von Viren und Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen und Protozoen, sowie genetischen Mutationen, die mit spezifischen Krankheiten verbunden sind, in Patientenproben nachzuweisen.
Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961 (1975) und Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975), beschreiben Hybridisierungstechniken unter Verwendung von radioaktiv markierten Nukleinsäuresonden. Nukleinsäurehybridisierungssonden besitzen die Vorteile einer hohen Empfindlichkeit und Spezifität gegenüber anderen Nachweisverfahren und erfordern keinen lebensfähigen Organismus. Hybridisierungssonden sind oft mit einer radioaktiven Substanz markiert, die leicht nachgewiesen werden kann.
Die bestehenden Hybridisierungstechniken, die Radioisotope einsetzen, um Sonden zu markieren, verursachen zusätzliche Ausgaben aufgrund der hohen Kosten für das Entfernen von radioaktiven Abfallprodukten und der Notwendigkeit zur Überwachung des Personals und des Arbeitsplatzes auf Kontamination. Zusätzlich erfordert die kurze Halbwertszeit von radioaktiven Verbindungen, wie ³²P, eine regelmäßige Herstellung von radioaktiven Sonden. Eine radioaktive Nukleinsäurehybridisierung wird daher in kommerziellen Gebieten, wie der klinischen Diagnose, weniger eingesetzt.
Sonden wurden indirekt markiert, um zu versuchen, die Probleme, die mit einer direkten radioaktiven Markierung verbunden sind, zu vermeiden. Ein übliches Verfahren zur indirekten Markierung ist die Bindung von Biotin, einem kleinen Vitamin, an die Nukleinsäuresonde unter Verwendung einer chemischen oder Enzymtechnik. Nach der Hybridisierung an die spezifische Nukleinsäure wird das Biotin durch Reaktion mit Streptavidin, einem Protein, das Biotin fest bindet, und das mit einem Enzym oder Fluorochrom markiert ist, nachgewiesen. Der gebundene Biotin-Streptavidin-Komplex kann durch Reaktion mit Farb-erzeugenden Substraten nachgewiesen werden und das Fluorochrom kann sichtbar gemacht werden, wenn es Anregungslicht einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird. Jedoch erhöht eine indirekte Markierung von Hybridisierungssonden mit Biotin oder anderen Haptenen oft die "Hydrophobizität" der Sonde. Die Sonde tendiert dazu, mit anderen Stoffen als das komplementäre Nukleinsäureziel in nicht-spezifischer Weise zu interagieren, was zu einem hohen Hintergrund führt. Die Biotin-Markierung erhöht eine nichtspezifische Bindung, die zu einem hohen Hintergrund führt, wobei dadurch die Empfindlichkeit reduziert wird und die Wahrscheinlichkeit eines Falsch-Positiv-Ergebnisses erhöht wird. Eine indirekte Markierung ist auch weniger empfindlich als eine direkte Markierung, da die Markierungsdichte beschränkt ist; lediglich eine kleine Fraktion der Basen ist markiert, was eine beschränkte Anzahl von Stellen für eine Signalerzeugung ergibt. Ein Anstieg bei der Markierungsdichte einer Sonde führt zu einer erhöhten nicht-spezifischen Bindung, einem höheren Hintergrund und folglich dazu, dass die Sonde aufgrund der Interferenz des Haptens mit der Basenpaarung nicht mit ihrem Ziel hybridisieren kann. Indirekt markierte Sonden sind daher wegen ihrer Ungenauigkeit und falsch-positiven Ergebnisse für eine klinische Diagnose nicht gut geeignet.
Eine Hybridisierung einer Sonde an die spezifischen Nukleinsäuresequenzen wurde unter Verwendung eines interkalierenden Agenzes wie Acridin-Orange oder Ethi diumbromid wie in der US-PS 4,563,417 von Albarella et al. beschrieben, nachgewiesen. Das interkalierende Agenz wird zwischen den hybridisierten Basenpaaren der Sonde und der Probennukleinsäuren inseriert und führt zu einer Entwindung der Tertiärstruktur der Helix. Ein Antikörper, der spezifisch für die neu gebildete antigenische Determinante ist, die durch das interkalierende Agenz erzeugt wurde, und die entwundene Helix werden durch konventionelle Mittel nachgewiesen. Bei diesem Verfahren ist keine Selektivität für die Zielhybride vorhanden, da interkalierende Agenzien nicht-spezifische Sequenzen erkennen. Weiter erkennen die Antikörper lediglich den Komplex des/der interkalierenden Agenzes/Nukleinsäure, aber sie detektieren keine spezifische Sequenz. Daher sind zusätzliche Selektions- oder Aufreinigungsschritte erforderlich, um ein nicht-spezifisches Signal zu vermeiden, was diesen zeitaufwändigen und laborintensiven Ansatz für eine klinische Diagnose nur wenig geeignet macht.
Eine Hybridisierung der Sonde an die spezifischen Nukleinsäuresequenzen kann auch mit Hilfe eines Antikörpers nachgewiesen werden, der spezifisch für eine markierte Sonde ist, wie beispielsweise in der US-PS 4,743,535 von Carrico beschrieben. Die Sonde wird mit einer detektierbaren Substanz, wie Flavinadenindinukleotid (FAD) oder einem fluoreszierenden Agenz markiert. Ein Antikörper, der für die markierte Sonde spezifisch ist, wird, nachdem er an die spezifische Nukleinsäuresequenz hybridisiert ist, durch eine biochemische Reaktion nachgewiesen. Dieses Detektionsverfahren erzeugt allerdings auch eine nicht-spezifische Bindung sowie eine Wahrscheinlichkeit von falsch-positiven Ergebnissen und ist daher für ein klinisches Screening nicht gut geeignet.
Es wurden Versuche unternommen, die Empfindlichkeit von Nukleinsäure-Assays durch Zielamplifikation zu erhöhen. Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen sind kommerziell erhältlich. Diese Verfahren umfassen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligationsamplifikationsreaktion (LCR) und die Transkriptions-basierte Amplifikationsreaktion (TMA). Die PCR-Technologie ist beschrieben in PCR Protocols A Guide to Methods and Applications von Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky und Thomas J. White, Seiten 39–45 und 337–385 (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, 1990). Die PCR-Technologie ist auch beschrieben von Marx, J. L., Science 140: 1408–1410 (1988) und in den US-PSen 4,683,195 und 4,683,202 von Mullis. Die Ligationsamplifikationsreaktion ist beschrieben von Wu, D. Y. und Wallace, R. B. Genomics 4: 560–569 (1989) und Barringer, K. J. et al., Gene 89: 117–122 (1990). Die Transkriptions-basierte Amplifika tionsreaktion ist beschrieben von Kwoh, D. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177 (1989). Diese Verfahren besitzen die Vorteile einer hohen Empfindlichkeit, aber die Nachteile einer langwierigen, aufwändigen und teuren Probenpräparation, so dass sie aufgrund einer Kontamination der Reaktionsprodukte zu falsch-positiven Ergebnissen neigen und nicht in der Lage sind, die Anfangsmenge von Zielnukleinsäuren genau zu quantifizieren. Amplifikationsreaktionsprodukte werden meistens mit Hilfe eines Hybridisierungs-Assays nachgewiesen.
Der Empfindlichkeitsgrad, der in Assays zur Detektion von Nukleinsäuremolekülen, entweder RNA oder DNA, in einer Probe erreicht wird, ist im Allgemeinen für RNA geringer als für DNA, da die RNA einer Degradation durch endogene RNAsen in der Probe ausgesetzt ist, was RNA für eine Detektion weniger verfügbar macht. Zusätzlich ist eine Hintergrundsinterferenz, die durch Kontaminanten in der Probe hervorgerufen wird, schwierig auszuschalten, ohne einen weiteren Abbau der Zielnukleinsäure, wie RNA, zu verursachen.
Hybridisierungs-Assays für die Detektion von Nukleinsäuremolekülen, d.h. RNA, wurden entwickelt. Zum Beispiel ist ein Hybridisierungsprotektions-Assay für RNA von Gen-Probe Inc. (San Diego, CA) kommerziell erhältlich. Der Hybridisierungsprotektions-Assay verwendet eine einzelsträngige Nukleinsäuresonde, die an einen Acridiniumester gebunden ist, wie beschrieben von Engleberg, N. C., ASM News 57: 183–186 (1991), Arnold et al. Clin. Chem. 35: 1588–1594 (1989) und in der US-PS 4,851,330. Die Hybridisierung der Sonde an ein Ziel-RNA-Molekül schützt die Acridiniumesterbindung vor einer Hitzehydrolyse, so dass das detektierte chemilumineszierende Signal proportional zu der Menge der Ziel-RNA in der Probe ist. Die Empfindlichkeit dieses Protektions-Assays wird durch die Hintergrundlumineszenz, die von der nicht-hybridisierten Sonde hervorgerufen wird, begrenzt.
Ein weiterer Assay zur Detektion von RNA verwendet reverse Transkriptase (WO 99/40224; Veröffentlichungsdatum: 12. August 1999). Dieser Assay bewirkt eine spezifische reverse Transkription des interessierenden RNA-Moleküls mit einer reversen Transkriptase, bei der die RNase H-Funktion fehlt. Der in der WO 99/40224 beschriebene Assay ist auf die Verwendung von reverser Transkriptase zur Detektion von RNA beschränkt.
Nicht-Mikroarrayverfahren zur Detektion von Nukleinsäuren sind üblich. Die WO 99/29909 (Veröffentlichungsdatum: 17. Juni 1999) beschreibt die Detektion von viralen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere Hepatitis B-Virus, worin RNA:DNA-Hybride durch Antikörper abgefangen werden, die gegen RNA:DNA-Hybride gerichtet sind. Ein nicht-radioaktiver Hybridisierungs-Assay und Kit, der vorzugsweise in Teströhrchen verwendet wird, ist in der WO 93/10263 (Veröffentlichungsdatum: 27. Mai 1993) beschrieben. Zusätzlich beschreibt die WO 00/60116 (Veröffentlichungsdatum: 12. Oktober 2000) ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen und die Detektion von Nukleinsäuren, worin ein bevorzugtes Mittel die Verwendung von einzelsträngigen Sonden ist, die an einen Festträger gebunden sind, z.B. Stifte. Im Allgemeinen sind diese Assays limitiert und stellen keine schnelle Mittel zur Detektion von Nukleinsäuren dar.
Polyklonale und monoklonale Antikörper und andere ähnliche Mittel werden üblicherweise für Detektionszwecke verwendet. Dabei erkennen polyklonale Antikörper eine Vielzahl von Epitopen, während monoklonale Antikörper lediglich ein spezifisches Epitop erkennen. Monoklonale Antikörper, die RNA:DNA-Hybride detektieren, sind gegenwärtig verfügbar. Polyklonale Antikörper, die RNA:DNA-Hybride detektieren, wurden hergestellt, obwohl sie im Allgemeinen nicht so spezifisch waren wie die monoklonalen Antikörper, die so entworfen sind, dass sie an ein spezifisches Epitop binden.
Monoklonale Antikörper für RNA:DNA-Hybride sind nun erhältlich. Die US-PS 4,732,847 von Stuart et al. und die Veröffentlichung von Stuart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3751 (1981) beschreiben ein Verfahren für eine Hybridisierungsdetektion von spezifischen Nukleinsäuresequenzen auf einer festen Oberfläche, bei dem ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch für einen poly(A)-poly(dT)-Duplex ist, beteiligt ist. In Stuart bildet eine Anlagerung von DNA- oder RNA-Sequenzen, die komplementär zu der interessierenden Sequenz sind, RNA:DNA-Hybride. Die Lehre von Stuart richtet sich insbesondere gegen die Verwendung von polyklonalen Antikörpern, da man bei polyklonalen Antikörpern eine signifikante Bindung an einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren nicht ausschließen kann. Weiter geht Stuart im Gegensatz zu der hier beschriebenen Erfindung nicht auf die Vorteile von polyklonalen Antikörpern für Anordnungen von sehr kurzen Oligomeren auf Glas oder Siliziumchips ein. Zusätzlich betrachtet Stuart nicht Mikroarrays, insbesondere Arrays mit hoher Dichte auf Glasobjektträgern oder Siliziumchips. Auch offenbart Stuart nicht das Binden einer Nukleinsäuresonde an die Oberfläche einer Festphase. Stattdessen fixiert Stuart ein Probenpolynukleotid an eine Oberfläche, während die Sonde (z.B. eine vorbestimmte Nukleotidsequenz) in der Flüssigphase vor liegt. Angesichts des Vorhergehenden liefert die vorliegende Erfindung wesentliche Nutzen und Vorteile gegenüber dem Stand der Technik.
Boguslawski et al., J. Immunol. Methods 89: 123–130 (1986) entwickelten einen Hybridisierungs-Assay unter Verwendung von Antihybrid-beschichteten Polystyrol-Beads, die auf einem Filterpapier isoliert sind, in einem Versuch, eine nichtspezifische Bindung zu verringern und komplizierte Waschvorgänge zu vermeiden. Ein monoklonaler Antikörper, der für RNA:DNA-Hybride spezifisch ist und von dem Hybridom HB 8730 sekretiert wird, ist in der US-PS 4,833,084 von Carrico et al. offenbart. In Carrico können RNA:DNA-Hybride, die durch eine spezifische Wiederanlagerung eines Sondenpolynukleotids und der interessierenden Sequenz gebildet werden, sensitiv und spezifisch durch Bindung an die monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden.
Mikroarrays sind eine geordnete Anreihung von bestimmten biologischen Molekülen, einschließlich RNA, DNA, Protein oder dergleichen, die an ein festes Substrat angeordnet oder immobilisiert sind. Diese Mikroarrays von Bindungsagenzien wie Oligonukleotide und Sonden wurden zunehmend ein wichtiges Werkzeug in der biotechnologischen Industrie und verwandten Gebieten. Mikroarrays, die eine Vielzahl von Bindungsagenzien oder Elementen umfassen, werden auf der Oberfläche eines festen Trägers geordnet oder als Muster immobilisiert und finden in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich dem Arzneimittel-Screening, der Nukleinsäuresequenzierung, der Mutationsanalyse und dergleichen, Verwendung. Die hier im Zusammenhang mit einem Mikroarray verwendeten Elemente sind hybridisierbare Nukleinsäuresequenzen, Oligonukleotide, Primer, Sonden und/oder Aminosäuresequenzen, die in einer bestimmten und identifizierbaren Weise auf der Oberfläche eines Substrats angeordnet sind. Der Nachweis von biologischen Molekülen über die Verwendung von Mikroarrays ist für die Analyse von zahlreichen Proben und biologischen Molekülen nützlich, so dass die für die Analyse erforderliche Probenmenge verringert wird, die experimentelle Variabilität und die Probenpräparationszeit verringert wird, Ergebnisse bestätigt werden und die Kosten einer solchen Analyse verringert werden.
Gegenwärtig ist eine der Hauptverwendungen von Mikroarrays die Messung der Gen-Expression in biologischen Proben. Gen-Expressionsmessungen umfassen die Detektion des Vorliegens oder Fehlens von mRNA oder die Messung von erhöhten oder verminderten Konzentrationen von mRNA. Um eine Hybridisierung nachzuwei sen und um eine Gen-Expression anhand konventioneller Verfahren zu messen, muss die Probe jedoch zuerst aufgereinigt und markiert werden. Zwei übliche Techniken zur Aufreinigung und Markierung der Probe sind: 1) RNA-Amplifikation, Markierung und Hybridisierung und 2) cDNA-Markierung und Hybridisierung. Der Amplifikationsteil der ersten Technik ist in den US-PSen 5,716,785 und 5,891,636, die 1998 bzw. 1999 erteilt wurden, von Van Gelder et al. beschrieben. Es wird hoch aufgereinigte Gesamt-RNA oder mRNA verwendet, was eine teure und zeitaufwändige Prozedur ist. Ein Oligo-dT-Primer wird auch verwendet, um die mRNA mit poly A-Schwanz in eine einzelsträngige Antisinn-cDNA revers zu transkribieren. Das Oligo-dT enthält weiter die Sequenz für T7-RNA-Polymerase am 5'-Ende der dT-Sequenzen. Nach der reversen Transkription wird eine Kombination von RNase H, DNA-Ligase und DNA-Polymerase verwendet, um eine doppelsträngige cDNA zu erzeugen. Da der ursprüngliche RT-Primer einen T7-RNA-Polymerase-Promoter enthielt, enthält die doppelsträngige cDNA einen vollständigen T7-RNA-Promoter. Die doppelsträngige cDNA wird dann als Matrize für die T7-RNA-Polymerase verwendet. Ungefähr 100–1000 zusätzliche Kopien von RNA werden von jeder cDNA-Kopie erzeugt. Während des Transkriptionsprozesses werden markierte Nukleotide in die transkribierte RNA eingebaut. Die markierte RNA wird dann an den DNA-Mikroarray hybridisiert, so dass sich markierte RNA:DNA-Hybride bilden. Fluoreszierende Markierungen können direkt nachgewiesen werden, während indirekte Markierungen nach der Reaktion mit einem sekundären Bindungsagenz nachgewiesen werden können.
Eine zweite Probenpräparationstechnik erzeugt und misst markierte cDNA. Bei dieser Technik wird Gesamt-RNA oder mRNA von der biologischen Probe aufgereinigt. Es wird ein Oligo-dT-Primer zur reversen Transkription der mRNA mit poly A-Schwanz in eine einzelsträngige Antisinn-cDNA verwendet. Während der reversen Transkription werden markierte Nukleotide in den neu gebildeten DNA-Strang eingebaut. Nach der Synthese wird der RNA-Strang zerstört. Der markierte cDNA-Strang wird dann an den Mikroarray hybridisiert. Wenn die Nukleotide mit Fluoreszenz markiert waren, werden die Hybride dann direkt mit einem Fluoreszenzarray-Scanner sichtbar gemacht. Wenn die Nukleotide mit Biotin markiert waren, wird der Mikroarray zuerst mit markiertem Streptavidin reagieren gelassen und dann gescannt.
Diese beiden Techniken haben mehrere Nachteile. Erstens erfordern beide eine große Menge von hoch aufgereinigten Nukleinsäuren (d.h. RNA oder DNA). Die Aufrei nigung erfordert zusätzliche Schritte, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind. Zusätzlich sind diese Techniken nicht genau. Eine reverse Transkription findet mit unterschiedlichen Effizienzen und kinetischen Raten statt, was von den Nukleinsäuresequenzen abhängt, so dass sich die Konzentration von spezifischen Nukleinsäuresequenzen künstlich verändert. Prokaryontische mRNA und einige eukaryontische mRNA enthalten keine poly A-Sequenz oder den Schwanz am 3'-Ende, oder der poly A-Schwanz kann während der Aufreinigung abgebaut werden und kann daher nicht mit den gegenwärtigen Techniken markiert oder detektiert werden, da keine Sequenz vorhanden ist, um den reversen Transkriptaseschritt einzuleiten. Die gegenwärtigen Techniken sind daher auf Probentypen beschränkt, die zur Detektion verwendet werden können. Auch verwenden diese Verfahren markierte Nukleotide. Der Einbau von markierten Nukleotiden in nicht-markierte Nukleinsäuren findet mit einer geringeren Effizienz und bei einer geringeren Rate statt als bei natürlichen Nukleotiden. Auch können Markierungen mit unterschiedlichen Effizienzen eingebaut werden, was von der Sequenz abhängt. Daher kann sich die Markierungsdichte bei verschiedenen Sequenzen unterscheiden, was die gemessene Menge dieser Nukleinsäuren künstlich verändert. Daher ist die Quantifizierung lediglich relativ. Markierte Nukleinsäuren besitzen auch andere Hybridisierungskinetiken als natürliche Nukleinsäuren, was sie gewöhnlicherweise weniger spezifisch macht. Zusätzlich können die vorliegenden Verfahren Hybridisierungsbedingungen mit höherer Stringenz erfordern als bei nicht-modifizierten Nukleotiden, um denselben Spezifizitätsgrad zu erreichen. Jedoch wird die Verwendung von Bedingungen mit höherer Stringenz, um eine annehmbare Spezifität zu erreichen, die Detektionsempfindlichkeit verringern. Daher besteht ein Bedarf an einem Assay zur Detektion und zur quantitativen Analyse von RNA, der genau, zeit- und kosteneffizient ist und zum Screening einer oder mehrerer biologischer Probenmoleküle mit höchster Empfindlichkeit und geringster nicht-spezifischer Bindung fähig ist.
Daher kann es nützlich sein, ein Verfahren zur Detektion und Messung der Menge einer oder mehrerer RNA zu besitzen, das leicht verwendet werden kann, hoch spezifisch, genau und beim Screening von biologischen Molekülen empfindlich ist.
Daher ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Assay zur Detektion des Fehlens oder Vorliegens und Quantifizierung von RNA bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion eines RNA:DNA-Hybrids, das ein spezifisches erstes biologisches Zielmolekül in einer Probe und eine zweite biologische Sonde umfasst, bereitzustellen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen sensitiven und quantitativen Assay mit geringen falsch-Positiven bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Assay für ein groß angelegtes paralleles Screening bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Offenbart ist ein Assay zur Detektion und Messung von RNA in einer Probe durch Hybridisierung des Biomoleküls an eine komplementäre Biomolekülsonde unter Bildung von doppelsträngigen Hybriden, gefolgt von einer immunologischen Detektion dieser doppelsträngigen Hybride, die auf einer Festphase gebildet werden, mit einem Antikörper oder einem anderen Mittel, das spezifisch RNA:DNA-Hybride erkennt und detektierbar ist. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um das Vorliegen eines oder mehrerer spezifischer biologischer Moleküle, die in einer Vielzahl von Proben vorliegen, nachzuweisen.
Die Erfindung stellt ein Verfahren, wie in Anspruch 1 definiert, zur gleichzeitigen Überwachung der Menge (z.B. Detektion und Quantifizierung der Menge) einer Vielzahl von RNA-Molekülen bereit.
Die vorliegende Offenbarung betrifft einen Assay zur Detektion von RNA:DNA-Hybriden unter Verwendung von detektierbar markierten Mitteln, die zur Erkennung von RNA:DNA-Hybriden spezifisch sind. Vorzugsweise ist das Mittel ein detektierbar markierter RNA:DNA-Hybrid-spezifischer Antikörper oder ein Fragment davon. Der zur Detektion von RNA:DNA-Hybriden verwendete Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein und ist bevorzugt ein polyklonaler Antikörper, um kurze biologische Molekülsonden mit einer Länge von weniger als 30 Basen nachzuweisen.
Die vorliegende Offenbarung betrifft auch einen Assay unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroarrays zur Bestimmung von physiologischen Antworten durch Gen-Expression, Polymorphismus-Mutationsdetektion, SNP-Analyse oder derglei chen. Das Verfahren kann verwendet werden, um beliebige oder alle genotypische Variationen nachzuweisen, einschließlich Insertions- oder Deletionsmutationen.
Weiter betrifft die vorliegende Offenbarung einen Assay unter Verwendung von reverser Transkriptase zur Verlängerung von kurzen biologischen Molekülen, wobei dadurch die Detektion von RNA:DNA-Hybriden erhöht wird. Vorzugsweise ist die reverse Transkriptase thermostabil und besitzt keine RNase H-Funktion.
Die vorliegende Offenbarung betrifft weiter einen Kit zur Detektion und Quantifizierung von biologischen Molekülen, wobei der Kit verwendet werden kann, um Proben auf eine große Anzahl von Zielen, die hier durch die vorliegende Erfindung beschrieben sind, zu durchmustern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–D sind eine schematische Darstellung zur lediglichen Veranschaulichung der immunologischen Antikörper-Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf Mikroarrays. 1A zeigt eine Hybridisierung der RNA-Probe an die komplementäre DNA-Sequenz, die an den Mikroarray gebunden ist, so dass ein RNA:DNA-Hybrid gebildet wird, wie in 1B gezeigt. Dann binden entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper die RNA:DNA-Hybride wie in 1C gezeigt. 1D veranschaulicht die Detektion von fluoreszierenden Markierungen unter Verwendung eines fluoreszierenden Laserscanners.
2A–D sind eine schematische Darstellung zur lediglichen Veranschaulichung der immunologischen Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf Mikroarrays, worin der Mikroarray universelle Abfang-Sequenzen umfasst. 2A zeigt die Hybridisierung des universellen Arrays mit einzelsträngiger DNA und Proben-RNA. Jedes auf dem Mikroarray gebildete Hybrid umfasst eine DNA:DNA-Region und eine RNA:DNA-Region, wie in 2B gezeigt. Antikörper detektieren und binden RNA:DNA-Hybride in 2C. 2D veranschaulicht ein Mittel zur Detektion, das fluoreszierende Antikörpermarkierungen unter Verwendung eines fluoreszierenden Laserscanners umfasst.
3A–E sind eine schematische Darstellung zur lediglichen Veranschaulichung der immunologischen Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf Mikroarrays, worin der Mikroarray exprimierte Sequenzmarkierungen ("expressed sequence tags", EST) zur Quantifizierung von mRNA, bei der die Sequenz mit voller Länge nicht bekannt ist, umfasst. 3A zeigt die Hybridisierung von Proben-RNA an die kurzen ESTs, die an den Mikroarray gebunden sind. Die Bildung von RNA- und kurzen DNA-Hybriden ist in 3B gezeigt. Die DNA wird zur RNA voller Länge durch Verwendung von, z.B., reverser Transkriptase (RT) verlängert, wie in 3C gezeigt. 3D und 3E veranschaulichen die Antikörpererkennung von RNA:DNA-Hybriden bzw. die Detektion von fluoreszierenden Antikörpermarkierungen mit einem Laserscanner.
4A–D sind eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung der immunologischen Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf Mikroarrays, wobei die Erfindung ein Zweifarben-Detektionsverfahren betrifft. 4A zeigt, dass jede DNA-Sonde, die an den Mikroarray gebunden ist, eine Region mit identischer Sequenz und eine Region mit variabler Sequenz enthält. Die markierte DNA hybridisiert an die gemeinsame Sequenz und die RNA-Probe hybridisiert an die variable Sequenz. RNA:DNA-Hybride und DNA-markierte DNA-Hybride werden gebildet, wie in 4B gezeigt. Antikörper, die gegen RNA:DNA-Hybride gerichtet sind, binden an die passende Region; der Mikroarray wird mit Fluoreszenzlasern mit zwei unterschiedlichen Farben gescannt und das Signal wird normalisiert, wie in den 4C bis 4D gezeigt.
5A–D sind eine schematische Darstellung zur lediglichen Veranschaulichung der immunologischen Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf Mikroarrays, wobei die Erfindung eine markierte degenerierte n-mer-DNA und Proben-RNA umfasst. 5A zeigt, dass jede DNA-Sonde, die an den Mikroarray gebunden ist, gleichzeitig oder hintereinander an die RNA-Probe und/oder die markierte degenerierte DNA hybridisiert. RNA:DNA-Hybride und/oder DNA:markierte DNA-Hybride werden gebildet, wie in 5B gezeigt. Antikörper, die gegen RNA:DNA-Hybride gerichtet sind, binden an die passende Region; der Mikroarray wird mit zwei Fluoreszenzlasern mit unterschiedlichen Farben gescannt und das Signal wird normalisiert, wie in den 5C–5D gezeigt.
6A–D sind Diagramme, die einen Längenvergleich von Festphasen-gebundenem Oligonukleotid unter Verwendung einer Detektion mit einem monoklonalen Antikörper (6A) und einem polyklonalen Antikörper (6B) als Funktion des Signal-/Hintergrundsverhältnisses des Mikroarrays darstellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Assay für die Detektion und Quantifizierung eines oder mehrerer RNA-Zielmoleküle in einer oder mehreren Proben bereitgestellt. Es wird allgemein eine Testprobe, die RNA-Moleküle umfasst, gesammelt und entweder direkt oder indirekt an eine Festphasen-gebundene Nukleinsäuresonde, die für das Zielbiomolekül spezifisch ist, hybridisiert. Nicht-hybridisierte Nukleinsäuresequenzen werden vorzugsweise durch Waschen entfernt. Es wird dann eine Hybridisierung durch eine Reaktion mit einem RNA:DNA-Hybrid-Antikörper nachgewiesen, der direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Markierung markiert ist, und/oder durch eine markierte Nukleinsäuresequenz nachgewiesen, die komplementär ist zu der gebundenen Nukleinsäuresondensequenz.
Das Verfahren wird durch die anhängenden Patentansprüche definiert.
Die vorliegende Erfindung besitzt aufgrund der Verwendung von Mikroarrays wesentliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Da entweder eine unbehandelte oder gereinigte Probe verwendet werden kann, beinhaltet die Erfindung einen vereinfachten Probenpräparationsprozess, was eine genauere Detektion und Messung von RNA-Molekülen ermöglicht. Auch müssen RNA-Moleküle nicht direkt zur Detektion und Messung markiert werden, so dass dadurch eine durch die Markierung hervorgerufene Beeinträchtigung vermieden wird. Die vorliegende Erfindung liefert ein extrem sensitives Verfahren zur Detektion und Messung von biologischen Molekülen, da eine sehr hohe Markierungsdichte erreicht werden kann, indem ein Mittel eingesetzt wird, das RNA:DNA-Hybride bindet. Eine solche außerordentliche Empfindlichkeit verringert die für die Analyse erforderliche Probenmenge. Im Gegensatz zu anderen Verfahren kann die vorliegende Erfindung prokaryontische mRNA und einige eukaryontische mRNA messen, die keinen poly A-Schwanz besitzen oder die nach der Aufreinigung abgebaut worden sind.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass eine reverse Transkription nicht erforderlich ist, sie kann jedoch eingesetzt werden, wenn eine erhöhte Empfindlichkeit erwünscht ist. Einer der am meisten vorteilhaften Aspekte der vorliegenden Erfindung ist eine direkte Quantifizierung von RNA-Molekülen. Im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten Techniken, die RNA nur relativ quantifizieren, z.B. kompetitive 2-Farbenverfahren, verwendet die vorliegende Erfindung einen direkten Ansatz, um die Ergebnisse zu interpretieren, und eine vereinfachte Analyse von biologischen Molekülen. Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von RNA-Molekülen aufgrund ihres vereinfachten Probenprozesses gleichzeitig analysieren. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung eine unmittelbare Interpretation und Vereinfachung von Ergebnissen.
In der vorliegenden Erfindung ist eine "Sonde" oder eine "Nukleinsäuresonde", wie hier verwendet, als Sammlung einer oder mehrerer Nukleinsäuren- oder Nukleinsäure-ähnlichen Fragmente definiert, deren Hybridisierung an eine zweite Nukleinsäure nachgewiesen werden kann. Die Sonde kann nicht markiert oder markiert sein, wie unten beschrieben, so dass ihre Bindung an die zweite Nukleinsäure nachgewiesen werden kann. Die Sonde kann von einer Nukleinsäurequelle von einem oder mehreren bestimmten Teilen des Genoms hergestellt werden, die bekannt oder unbekannt sein können, z.B. ein oder mehrere Klone, ein isoliertes vollständiges Chromosom oder Chromosomfragment, eine Sammlung von Produkten einer Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Amplifikation oder eine synthetische Nukleinsäure oder ein PNA-Molekül. Alternativ kann eine Sonde eine zufällige, fast zufällige oder Zielsequenz umfassen. Die Sonde kann auf bestimmte Weise prozessiert werden, z.B. durch Blockieren oder Entfernen von repetitiven Nukleinsäuren oder Anreicherung mit einzigartigen Nukleinsäuren. Daher bezeichnet das hier verwendete Wort "Sonde" nicht nur die detektierbaren Nukleinsäuren, sondern auch detektierbare Nukleinsäuren in der Form, in der sie auf das Ziel angewendet werden, z.B. zusammen mit den Blockierungsnukleinsäuren. Auf die Blockierungsnukleinsäure kann auch getrennt Bezug genommen werden. Was mit "Sonde" gemeint ist, wird insbesondere aus dem Zusammenhang, in dem das Wort verwendet wird, klar. Eine Sonde kann auch als Primer im Zusammenhang mit ihrer Verwendung als ein Initiationspunkt zur Polymerisation fungieren, d.h. zur Transkription oder Replikation.
Die Sonde kann auch eine isolierte Nukleinsäure sein, die an eine feste Oberfläche immobilisiert ist. In einigen Ausführungsformen kann die Sonde ein Mitglied eines Mikroarrays von Nukleinsäuren sein, wie beispielsweise in der WO 96/17958 beschrieben. Techniken, die zur Herstellung von Mikroarrays mit hoher Dichte fähig sind, können auch für diesen Zweck verwendet werden (siehe z.B. Fodor et al. Science 767–773 (1991) und die US-PS 5,143,854 von Pirrung, M. C.). Sonden können auch als Elemente auf dem Reaktionssubstrat abgeschieden sein, um die Zielmoleküle auszuwählen, und können entweder direkt oder indirekt markiert sein.
Der erfindungsgemäße offenbarte Assay kann verwendet werden, um ein beliebiges biologisches Molekül oder eine Kombination von biologischen Molekülen in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren, wobei die Begriffe "biologisches Molekül" und "Biomolekül", die austauschbar verwendet werden, wie hier definiert, RNA betreffen. "Nukleinsäure" bezeichnet Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon von einer beliebigen Quelle, einschließlich in nicht begrenzender Weise synthetischer Substanzen und Substanzen, die von Bakterien, Hefen, Viren und Zellen oder Geweben von höheren Organismen, wie Pflanzen oder Tieren abstammen, und kann, so weit nicht auf andere Weise beschränkt, bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden umfassen, die eine ähnliche Funktion besitzen können, wie natürlich vorkommende Nukleotide. Peptidnukleinsäuren (PNAs) fallen auch unter den Ausdruck Nukleinsäure.
Eine "Nukleinsäure" wird hier weiter als eine einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure mit einer Länge im Bereich von 2 bis etwa 10 000 Basen definiert. Der hier verwendete Ausdruck "Nukleinsäure" bezeichnet Oligonukleotide, cDNA, mRNA, Amplicons, Plasmide und dergleichen. Ein "Oligonukleotid" ist eine bevorzugte Nukleinsäuresonde, die mindestens 6 bis ungefähr 60 Nukleotide, vorzugsweise ungefähr 15 bis 30 Nukleotide und mehr bevorzugt ungefähr 20 bis 25 Nukleotide umfasst, die bei einer PCR-Amplifikation oder einem Hybridisierungs-Assay oder einem Mikroarray verwendet werden kann. Wie hier verwendet, ist der Ausdruck Oligonukleotid im Wesentlichen äquivalent zu den Ausdrücken "Amplimere" und "Oligomere", wie sie üblicherweise auf dem Gebiet definiert sind, und kann als "Primer" und "Sonden", wie hier beschrieben, verwendet werden.
Auch umfasst der Ausdruck, soweit nicht anders angegeben, Nukleinsäuren, die bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden enthalten, die ähnliche Bindungseigenschaften aufweisen wie die Referenznukleinsäure und die auf ähnliche Weise wie natürlich vorkommende Nukleotide metabolisiert werden. Zusätzlich umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz auch implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z.B. degenerierte Codon-Substitutionen) und komplementäre Sequenzen sowie die explizit angegebene Sequenz.
Nukleinsäuresequenzen zur Detektion, die hier als interessierende Nukleinsäuremoleküle bezeichnet werden, oder Zielnukleinsäuremoleküle werden basierend auf den Bedürfnissen und dem Zweck der Detektion ausgewählt. Im Allgemeinen kann ein interessierendes Nukleinsäuremolekül basierend auf bekannten Kriterien zur Auswahl einer Nukleinsäuresequenz zur Detektion ausgewählt werden. Zum Beispiel kann ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül mit einem Pathogen, einem Krankheitszustand oder einer Prädisposition für eine Krankheit assoziiert sein und die Detektion eines solchen Nukleinsäuremoleküls kann von diagnostischem Wert sein. Zum Beispiel kann eine mRNA, die für Tumorzellen oder normale Zellen spezifisch ist, nachgewiesen werden. Zusätzlich ermöglicht das offenbarte Verfahren auch die Detektion von RNA-Molekülen. Die Detektion von Nukleinsäuren umfasst auch die Detektion von Mutationen, Deletionen, Insertionen von Einzelnukleotid-Polymorphismen und anderen Polymorphismen.
Eine "Probe" oder "Zielprobe", wie hier austauschbar verwendet, wird in ihrem breitesten Sinn definiert und umfasst sowohl biologisches Material als auch synthetisches Material von biologischen Molekülen, einschließlich in nicht begrenzender Weise Nukleinsäuren, Aminosäuren, Proteine, Peptide und dergleichen, und betrifft eine Probe, die die genomische Gesamt-DNA, Gesamt-RNA, genomische DNA oder mRNA beispielsweise von Chromosomen oder ausgewählten Sequenzen (z.B. bestimmte Promotoren, Gene, Amplifikations- oder Restriktionsfragmente, cDNA, etc.) innerhalb von bestimmten Amplicons oder Deletionen enthält. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird entweder das Vorliegen oder das Fehlen der Zielnukleinsäureprobe nachgewiesen und die Menge der zu quantifizierenden Probe gemessen. Der Ausdruck "Zielnukleinsäure" kann die spezifische Untersequenz einer größeren Nukleinsäure, gegen die die Sonde gerichtet ist, oder die Gesamtsequenz (z.B. Gen oder mRNA) betreffen, deren Menge nachgewiesen, quantifiziert werden soll und deren Vorliegen oder Fehlen bestimmt werden soll. Die unterschiedliche Benutzung des Ausdrucks wird aus dem Zusammenhang ersichtlich.
Die Biomolekülprobe kann von bestimmten Zellen oder Geweben extrahiert werden. Die Gewebeprobe, von der die Biomolekülprobe präpariert wird, wird typischerweise von einem Patienten entnommen, von dem angenommen wird, dass er die Krankheit besitzt, die mit der Amplifikation oder Deletion, die nachgewiesen werden soll, assoziiert ist. In einigen Fällen können die biologischen Moleküle, z.B. Nukleinsäuren, unter Verwendung von Standardtechniken, wie PCR, vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Die besondere Verwendung des Ausdrucks "Nukleinsäureprobe" wird dem Fachmann aus dem Zusammenhang, in dem dieser Ausdruck verwendet wird, ersichtlich sein. Zum Beispiel kann die Nukleinsäureprobe eine Gewebeextrakt- oder Zelllysatprobe sein, die durch bekannte Verfahren präpariert wurde. Die Probe wird so präpariert, dass interessierende biologische Moleküle von den Zellen freigesetzt werden und zur Hybridisierung verfügbar sind.
Alternativ kann eine Probe für das offenbarte erfindungsgemäße Verfahren von einer beliebigen Quelle stammen, die eine Nukleinsäure enthält oder von der angenommen wird, dass sie eine Nukleinsäure enthält. Die Nukleinsäurequelle kann in gereinigter oder nicht gereinigter Form vorliegen. Bevorzugte Probenarten oder Probenquellen, die zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren geeignet sind, sind solche Proben, bei denen bereits bekannt ist, dass sie als Proben zur Verwendung in anderen Verfahren zur Nukleinsäuredetektion geeignet sind oder dahingehend identifiziert wurden. Viele solche Proben sind bekannt. Zum Beispiel kann die Probe von einem Landwirtschafts- oder Nahrungsmittelprodukt stammen oder kann eine menschliche Probe oder eine Probe aus der Tiermedizin sein. Proben können eine biologische Flüssigkeit, wie Plasma, Serum, Blut, Urin, Sputum, Zell-Lysat oder dergleichen sein. Die Probe kann Bakterien, Hefe, Viren und Zellen oder Gewebe höherer Organismen, wie Pflanzen oder Tiere, enthalten, von denen angenommen wird, dass sie ein interessierendes biologisches Molekül enthalten. Verfahren zur Extraktion und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren, z.B. von RNA, wurden von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben.
Da Proben auch in einem unbehandelten oder unaufgereinigtem Zustand vorliegen können, ist die Probenpräparation oder Aufarbeitung vereinfacht. Indem Proben verwendet werden, die in einem natürlichen Zustand angetroffen werden, kann eine genaue Expressionsdetektion und -quantifizierung erreicht werden. Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung, im Gegensatz zu anderen Techniken, welche eine poly A-Sequenz zum Priming des reversen Transkriptaseschritts benötigen, um eine Probe zu markieren und nachzuweisen, verwendet werden, um prokaryontische mRNA und eukaryontische mRNA, die keinen poly A-Schwanz am 3'-Ende besitzt, zu messen.
Interessierende biologische Zielmoleküle zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren können von verschiedenen Quellen, sowohl von natürlichen als auch synthetischen Quellen, abstammen. Zum Beispiel umfassen verschiedene Typen von RNA Boten-RNA, ribosomale RNA, nukleoläre RNA, Transfer-RNA, virale RNA und heterogene nukleare RNA oder dergleichen. Zusätzlich können vollständige natürlich vorkommende Mittel oder Fragmente davon verwendet werden.
Festphasen- oder feste Träger umfassen in nicht begrenzender Weise solche aus Kunststoffen, Harzen, Polysacchariden, Silica- oder Silica-basierenden Materialien, funktionalisiertem Glas, modifiziertem Silizium, Kohlenstoff, Metallen, anorganischen Gläsern, Membranen, Nylon, Naturfasern wie Seide, Wolle und Baumwolle, und Polymeren. Festphasen oder feste Träger können porös oder nicht-porös sein. In einigen Ausführungsformen besitzt das Material, das von dem festen Träger umfasst ist, reaktive Gruppen wie Carboxy-, Amino-, Hydroxygruppen etc., die zur kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung der Sonden verwendet werden. Geeignete Polymere umfassen in nicht begrenzender Weise Polystyrol, Polyethylenglykoltetraphthalat, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Butylgummi, Styrolbutadiengummi, natürlichen Gummi, Polyethylen, Polypropylen, (Poly)tetrafluorethylen, (Poly)vinylidenfluorid, Polycarbonat und Polymethylpenten. Bevorzugte Polymere umfassen solche, die in der US-PS 5,427,779 von Elsner, H. et al. beschrieben sind. Festphasen und feste Träger umfassen in nicht begrenzender Weise ein jegliches festes Material, an das die Sonden, Primer, Oligonukleotide, Proteine, Peptide oder dergleichen gekoppelt oder angebunden sein können. Festphasen und feste Träger können eine jegliche verwendbare Form besitzen, einschließlich dünner Filme oder Membranen, Beads, Flaschen, Mikrowellplatten, Schalen, Objektträgern, Fasern, Gewebefasern, geformter Polymere, Partikel, Chips und Mikropartikel. Bevorzugte Substratformen für eine Festphase sind Mikrotiterplatten, Siliziumchips, Glasobjektträger und markierte Beads.
Zur allgemeinen Anwendung, bei der ein Molekül kovalent an die Oberfläche des festen Substrats gebunden werden soll, kann die Oberfläche unter Verwendung einer Vielzahl von Reaktionsfunktionalitäten aktiviert werden, in Abhängigkeit von der Art der gebundenen Komponente und der Art der Oberfläche des festen Substrats. Daher kann die Oberfläche des festen Substrats, wenn erforderlich, durch Einbringen von Funktionalitäten modifiziert werden, die dann mit der gebundenen Komponente reagieren können.
"Mikroarrays" umfassen eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Molekülen, einschließlich cDNA, Amplicons, Plasmiden, Proteinen, Peptiden und dergleichen, wobei eine Vielzahl mindestens zwei unterschiedliche biologische Moleküle umfasst, worin die Biomoleküle an eine Festphase in einer geordneten Matrix oder Struktur immobilisiert sind. Theoretisch braucht es lediglich eine Komponente, aber in einer bevorzugten Ausführungsform werden es mindestens 10, häufiger mindestens 20, häufig mindestens 50, bevorzugt 100 oder mehr und sogar 1000 oder mehr aber gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 104, gewöhnlicher nicht mehr als ungefähr 100 000 sein, wobei ungefähr 10 bis 1000, die an eine Festphase oder einen festen Träger immobilisiert sind, bevorzugt sind. Während theoretisch die Anzahl an unterschiedlichen Bestandteilen mehr als 10⁵ betragen kann, besteht aufgrund der Fähigkeit, eine kleine Menge oder ein kleines Volumen an einer spezifizierten begrenzten Stelle spezifisch zu besitzen, für den größten Teil kein Bedarf über 100 000 zu gehen, und eine solch große Anzahl von unterschiedlichen Bestandteilen fügt einiges an Komplexität für die Herstellung des Mikroarrays bei. Da die Anzahl von Bestandteilen, die an einer Festphase immobilisiert sind, gewöhnlich nicht mehr als 10⁵ betragen wird, kann die Anzahl von einzelnen adressierbaren Stellen wesentlich größer sein, in Abhängigkeit von der Art des gebundenen Bestandteils, der Herkunft des Signals und der Art des detektierten Signals, der Empfindlichkeit, mit der ein Signal detektiert werden kann, der Art des gebundenen Mikroarrays, wie der Größe des Mikroarrays, der Art, in der der Mikroarray hergestellt wird, und dergleichen. Daher werden Mikroarrays vorzugsweise für ein "groß angelegtes paralleles Screening" verwendet, das hier als gleichzeitiges Screening von mindestens ungefähr 10, vorzugsweise ungefähr 1000 und mehr bevorzugt ungefähr 10 000 unterschiedlichen biologischen Molekül-Hybridisierungen bezeichnet wird.
Eine bevorzugte Form eines Mikroarrays umfasst eine gepunktete Anordnung, auf der 1–10, 10–100 und am meisten bevorzugt mehr als 100 getrennte Nukleinsäuren, vorzugsweise Oligonukleotide, Primer oder dergleichen, abgeschieden, punktförmig aufgetragen oder als Anordnung von kleinen Punkten oder Elementen, wie hier beschrieben, synthetisiert werden können. Diese auf einer Festphase abgeschiedenen, punktförmig aufgetragenen oder synthetisierten Nukleinsäuren werden hier als "Elemente" bezeichnet. Typischerweise hat ein Element einen Durchmesser von weniger als ungefähr 1 mm. Im Allgemeinen liegen die Elementgrößen in einem Bereich von 1 μm bis ungefähr 5 mm, vorzugsweise zwischen ungefähr 1 μm und ungefähr 1 mm. Nukleinsäureprimer zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren können unter Verwendung etablierter Nukleotidsyntheseverfahren synthetisiert werden. Solche Verfahren reichen von einem Standard-Enzymverdau, über eine Nukleotidfragrnent-Isolierung (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Kapitel 5, 6) bis hin zu reinen synthetischen Verfahren, z.B. dem Cyanethylphosphoramidit-Verfahren, bei dem ein Milligen- oder Beckman System 1 Plus DNA-Synthesegerät (z.B. automatisiertes Synthesegerät Modell 8700 von Milligen-Biosearch, Burlington, MA oder ABI Modell 380B) verwendet wird. Synthetische Verfahren, die zur Herstellung von Oligonukleotiden verwendbar sind, sind auch von Ikuta et al. (Ann. Rev. Biochem. 53: 323–356 (1984) (Phosphotriester- und Phosphittriester-Verfahren)) und Narang et al. (Methods Enzymol., 65: 610–620 (1980) (Phosphotriester-Verfahren)) beschrieben.
Eine andere Form eines Mikroarrays ist ein dreidimensionaler Array, und Beispiele davon umfassen einen Array von farbkodierten Beads (Luminex, Austin, TX) und einen Array von Hochfrequenz-markierten Beads (PharmaSeq; Monmouth Junction, NJ). Ein dreidimensionaler Mikroarray, wie hier verwendet, besteht aus einer beliebigen Festphase, die drei Dimensionen besitzt, wobei jeder Mikroarray eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Molekülen umfasst, vorzugsweise Nukleinsäureprimer, die an die Oberfläche gebunden sind. Daher ermöglicht die Lokalisierung von jedem Primer auf dem Festphasenmikroarray die Identifizierung von jeder Nukleinsäure-Primersequenz. Es können Modifikationen des offenbarten Assays durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein dreidimensionaler Mikroarray, der eine Vielzahl von Nukleinsäureprimern umfasst, mit interessierenden Zielnukleinsäuren vermischt werden. Wenn die Primer kurz sind, kann es wünschenswert sein, diese Moleküle mit Polymerasen zu verlängern, wie z.B. reverser Transkriptase, so dass sie die Bindungskapazität des RNA:DNA-Hybrid-spezifischen Teils, wie hier beschrieben, einschließlich Antikörpern und Fragmenten davon, enthalten. Durch das Einfangen der Antikörper auf einer Festphase können die Primer des Festphasenmikroarrays, auf dem sich RNA:DNA-Hybride gebildet haben, von den Primern abgetrennt werden, bei denen sich kein Hybrid gebildet hat. Die Einheiten, die für RNA:DNA-Hybride spezifisch sind, können dann nachgewiesen werden und die Identitäten der Primer bestimmt werden. Es können viele andere Assay-Schemata für das offenbarte Verfahren verwendet werden.
Der Mikroarray hat sich als bevorzugtes Format für die Miniaturisierung von Assays herausgestellt, die RNA, DNA, Proteine und dergleichen detektieren und messen, insbesondere für eine Anwendung zur, z.B., Gen-Expression, Mutations- und Polymorphismusanalyse, SNPs, Detektion von genetischen Variationen etc. Die Mikroarrays erlauben die Messung der Menge von zehn bis mehreren Tausend Genen oder genetischen Variationen (z.B. SNPs) von einer einzelnen Probe auf einer einzelnen Vorrichtung. Eine Schwäche der traditionellen Mikroarray-Verfahren ist, dass das zu messende biologische Molekül, vorzugsweise Nukleinsäure (entweder RNA oder DNA) zuerst markiert werden muss, was oftmals über eine Umwandlung von einer Art Nukleinsäure in eine andere bewirkt wird, z.B. RNA in markierte DNA, um nachgewiesen und gemessen zu werden.
Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise einen Nukleinsäuremikroarray, der wie hier definiert, eine Vielzahl von Nukleinsäuresequenzen umfasst, einschließlich in nicht begrenzender Weise DNA, RNA, Amplicons, Plasmide und dergleichen, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, an dem komplementäre Zielnukleinsäuren hybridisiert sind. Die Nukleinsäuren des Mikroarrays können beispielsweise eine Sequenz von spezifischen Genen oder Klonen, Sonden, Primern oder Oligonukleotiden enthalten, die an eine poröse oder nicht-poröse Festphase oder einen festen Träger gebunden sind. Es können Nukleinsäuren verschiedener Abmessungen in den erfindungsgemäßen Mikroarrays verwendet werden.
Die Nukleinsäuren können an den Festträger oder das feste Substrat gekoppelt werden. Ein solcher Mikroarray ist ein fester Träger, an dem mehrere unterschiedliche Nukleinsäuren in einer Anordnung, einem Gitter oder einem anderen organisierten Muster gekoppelt oder angeheftet worden sind. "Nukleinsäuremikroarrays" umfassen vorzugsweise Arrays von Nukleinsäuresequenzsträngen auf Siliziumchips, Glasobjektträgern oder einem anderen festen Träger und finden vielfältige Verwendung zur Detektion und Messung der Gen-Expressions-, Mutations- und Polymorphismusanalyse etc. Es sind mehrere Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuremikroarrays verfügbar. Stränge von Nukleinsäuresequenzen können nicht-kovalent oder kovalent an ein festes Substrat über passive oder chemische Kopplungsverfahren gebunden werden. Andere Ansätze verwenden synthetische Verfahren, um die Nukleinsäuremoleküle direkt auf der Oberfläche des Substrats auszubilden. Ein einfacherer aber zugleich beschränkterer Ansatz ist es, markierte Nukleinsäuresequenzen herzustellen und dann die markierten Nukleinsäuresequenzen an ein Substrat, das mit einem Bindungspartner beschichtet ist, zu binden.
Ein "Hybrid" ist eine doppelsträngige Nukleinsäure, die RNA oder DNA umfasst. Das Duplex kann DNA:DNA, RNA:RNA oder RNA:DNA sein oder künstliche Nukleotide umfassen. Ein RNA-Homoduplex ist eine basengepaarte doppelsträngige RNA. Ein RNA:DNA-Heteroduplex umfasst einen RNA-Strang und einen Strang, der DNA-Nukleotidmonomere umfasst. Die gesamte oder eine Region des Duplex kann doppelsträngig sein. Typischerweise werden mindestens 10 Basen des Duplex doppel strängig sein. Die Ausdrücke "spezifisch hybridisieren" oder "spezifische Hybridisierung" oder "selektives Hybridisieren an" oder dergleichen bezeichnet die Bindung, Duplexbildung oder Hybridisierung eines Nukleinsäuremoleküls, an vorzugsweise eine bestimmte Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch vorliegt (z.B. zelluläre Gesamt-) DNA oder RNA.
Nukleinsäuresonden, die auf einem festen Substrat immobilisiert sind, ermöglichen die Bildung von RNA:DNA-Hybriden, die auf dem Substrat lokalisiert sind. Eine solche Lokalisierung stellt ein einfaches Mittel zum Abwaschen von Reaktionsbestandteilen bereit, die mit den nachfolgenden Detektionsschritten interferieren könnten, und eine einfache Möglichkeit, um mehrere unterschiedliche Zielnukleinsäuresequenzen gleichzeitig zu untersuchen. RNA:DNA-Hybride können unabhängig an jeder Stelle, an der ein unterschiedlicher Primer gebunden ist, gebildet werden. Zur Immobilisierung von Sonden, um einen Festphasenmikroarray von biologischen Molekülen zu bilden, können die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Ein "Mittel", wie hier definiert, bezeichnet ein beliebiges Molekül, das spezifisch RNA:DNA-Hybride erkennt. Beispiele von Mitteln, die RNA:DNA-Hybride erkennen können, umfassen in nicht begrenzender Weise chimäre Antikörper und natürlich oder genetisch manipulierte Proteine oder Nukleinsäuren, die spezifisch an RNA:DNA-Hybride binden.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines Mittels ist ein "Antikörper". Wie hier verwendet, soll der Begriff Antikörper im weitesten Sinne verstanden werden, und umfasst vollständige intakte Antikörper, Antikörperfragmente, rekombinante Antikörper, chimäre Antikörper, polyfunktionelle Antikörperaggregate oder, ganz allgemein, eine beliebige von einem Antikörper abgeleitete Substanz, die mindestens eine Antikörperkombinationsstelle mit den hier beschriebenen Eigenschaften oder andere Mittel umfasst. Vorzugsweise detektieren und binden in der vorliegenden Erfindung diese Mittel RNA:DNA-Hybride spezifisch. Antikörper von einer beliebigen der bekannten Klassen und Unterklassen von Immunoglobulinen sind vorgesehen, beispielsweise IgG, IgM und so weiter, sowie aktive Fragmente, wie die IgG-Fragmente, die allgemein als Fab, F(ab') und F(ab')2 bekannt sind. Antikörper können monoklonale Antikörper umfassen (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierende Antikörper), die an ein spezifisches Epitop binden, und polyklonale Antikörper mit einer Polyepitopspezifität oder andere Mittel.
Es können beliebige Antikörper oder Mittel, die für doppelsträngige RNA:DNA-Hybride spezifisch sind, verwendet werden, um das erfindungsgemäße Hybrid direkt nachzuweisen. In der vorliegenden Erfindung sind polyklonale Antikörper in der Ausführungsform bevorzugt, bei der diese zur Detektion von kurzen Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise solchen, die eine Länge von weniger als 30 Basen besitzen, verwenden werden.
Die Antikörper, die zum Nachweis von RNA:DNA-Hybriden verwendet werden, können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Es kann auch vorteilhaft sein, ein Gemisch von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern zu verwenden. Weiter umfasst die Erfindung die Verwendung von angepassten polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die mit spezifischen Bindungseigenschaften hergestellt werden können. Beispielsweise können monoklonale oder polyklonale Antikörper, die sehr kurze (weniger als 20 Basenpaare) RNA:DNA-Hybride spezifisch binden, hergestellt werden und zur Detektion von sehr kurzen RNA:DNA-Hybriden verwendet werden. Zusätzlich können monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt werden, die entweder mehr oder weniger sensitiv für Fehlpaarungen innerhalb des RNA:DNA-Hybrids sind. Antikörper, die sensitiver für Fehlpaarungen innerhalb des RNA:DNA-Hybrids sind, werden eine darüber hinausgehende Verwendung für die Detektion einer genetischen Variation finden, während Antikörper, die weniger empfindlich für Fehlpaarungen in dem RNA:DNA-Hybrid sind, Verwendung für die Detektion und Quantifizierung von spezifischen Klassen von Nukleinsäuren finden werden. Es können auch andere Antikörper verwendet werden, die spezifisch Nukleinsäuretriplexe (DNA:RNA:DNA oder RNA:DNA:RNA) oder DNA:PNA- oder RNA:PNA-Hybride detektieren, worin PNA hier als eine Peptidnukleinsäure definiert ist.
Polyklonale Antikörper, die gegen RNA:DNA-Hybride gerichtet sind, werden durch Injektion eines geeigneten Labortieres mit einer wirksamen Menge der Peptide oder des antigenischen Bestandteils, Gewinnung von Serum von dem Tier und Isolieren von spezifischen Seren durch eine der bekannten Immunadsorbenztechniken hergestellt. Tiere, die zur Herstellung von polyklonalen RNA:DNR-Hybrid-Antikörpern leicht verwendet werden können, umfassen Hühner, Mäuse, Kaninchen, Ratten, Ziegen, Pferde und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Assays stammt ein polyklonaler RNA:DNA-Hybridantikörper von Ziegen ab, die mit einem RNA:DNA-Hybrid immunisiert wurden. Der Hybrid-spezifi sche Antikörper wird von dem Ziegenserum durch eine Affinitätsaufreinigung gegen das RNA:DNA-Hybrid, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, aufgereinigt.
Monoklonale Antikörper, die durch Standardtechniken hergestellt werden, können anstelle der polyklonalen Antikörper verwendet werden. Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um geeignete Antikörper, die für RNA:DNA-Hybride spezifisch sind, zu erhalten (z.B. die US-PS 4,833,084 von Carrico, US-PS 4,732,847 von Stuart et al. und Stuart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3751 (1981)). Ein monoklonaler Antikörper, der für RNA:DNA-Hybride spezifisch ist, der von dem Hybridom HB 8730 sekretiert wird, ist in der US-PS 4,833,084 von Carrico offenbart. Vorzugsweise werden gemäß der vorliegenden Erfindung monoklonale Antikörper zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet, die eine Länge von mehr als 30 Basen aufweisen.
Die Isolation von Anti-RNA:DNA-Hybridomen hat die Entwicklung von Assays für genetische Mutationen, die mit spezifischen Defekten in Verbindung stehen, und die Detektion von bakteriellen und viralen Infektionen verbessert. Jedoch besitzen die Assays, die diese RNA:DNA-Hybrid-spezifischen monoklonalen Antikörper einsetzen, oft den Nachteil einer hochgradigen nicht-spezifischen Bindung, was falschpositive Ergebnisse verursacht. Boguslawski et al., J. Immunol. Methods 89: 123–130 (1986), entwickelten einen Hybridisierungs-Assay, bei dem Antihybrid-beschichtete Polystyrol-Beads verwendet wurden, die auf einem Filterpapier isoliert waren, in einem Versuch, die nicht-spezifische Bindung zu verringern und komplizierte Waschvorgänge zu vermeiden.
Der bevorzugte Antikörper für RNA:DNA-Hybride wird durch das Verfahren von Kitawaga, Y. und Stollar, B. D., Mol. Immunology 19: 413–420 (1982) oder gemäß dem in der US-PS 4,732,847, erteilt am 22. März 1988, von Stuart et al., hergestellt.
Die Identifizierung des Vorliegens der Hybride kann erreicht werden, indem entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper oder andere Mittel, die für den RNA:DNA-Hybridkomplex spezifisch sind, verwendet werden. Eine Detektion kann erreicht werden, indem entweder der Antikörper, der für den Hybrid-RNA:DNA-Komplex spezifisch ist, markiert wird, oder indem markierte Antikörper, die an den Antikomplex binden, verwendet werden. Zum Beispiel können Antikörper gegen Maus-Antikörper, z.B. Anti-Maus-IgG des Kaninchens, so markiert werden, dass sie an einen Antikomplex binden, der an den Komplex gebunden ist, der an den festen Träger gekoppelt ist, wenn der Antikörper von einer Maus abstammt.
Eine Vielzahl von Markierungen wurden in anderen Zusammenhängen verwendet und können hier verwendbar sein. Eine der üblicheren Markierungen, die zusammen mit einer Autoradiographie verwendet werden können, um die Bindungsregionen sichtbar zu machen, sind Radionuklide. Eine andere Markierung ist ein Fluoreszenzfarbstoff, wie Fluorescein, Mercocyanin oder Rhodamin, mit der durch Bestrahlung mit einem Anregungslicht das Auftreten von Fluoreszenz verfolgt werden kann. Alternativ kann ein Enzym verwendet werden, das ein Produkt hervorbringt, das im Bereich des Enzyms nachgewiesen und lokalisiert werden kann. Eine große Anzahl von Farbstoffen oder Metallen, die zur Reduktion fähig sind, können verwendet werden, um eine Detektion zu ermöglichen. Übliche Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, Glukoseoxidase, Galactosidase, alkalische Phosphatase oder dergleichen. Die spezifische Markierung oder die Art, mit der das detektierbare Signal nachgewiesen wird, ist für diese Erfindung nicht entscheidend. Durch den Einsatz von Antikörpern gegen den Antikomplex kann die Anzahl von Markierungen, die mit einer spezifischen Bindung des Antikomplexes an den Komplex gebunden ist, stark erhöht werden.
Um eine Detektion der entstandenen Bindung des Antikörpers oder des anderen Mittels, das für die doppelsträngigen Hybride spezifisch ist, an das Hybrid zu ermöglichen, wird der Antikörper üblicherweise mit einer detektierbaren chemischen Gruppe markiert. Beispiele von detektierbaren chemischen Gruppen, die als Markierungen dienen können, sind enzymatisch aktive Gruppen, wie Coenzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren und Enzyme selbst, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, Lumineszenzfarbstoffe, spezifisch bindungsfähige Liganden, wie Biotin oder Haptene, die durch Bindung mit markiertem Avidin oder markierten Hapten-Antikörpern detektierbar sind, und Radioisotope.
Damit eine vollständige Hybridisierung stattfindet, sind optimale Bedingungen zur Bildung von doppelsträngigen Hybriden notwendig. Der Ausdruck "stringente Bedingungen" bezeichnet Bedingungen, bei denen eine Sonde vorzugsweise an eine komplementäre Sequenz und in einem geringeren Ausmaß oder überhaupt nicht an andere Sequenzen hybridisieren wird. Die Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen kann "partiell" sein, so dass lediglich einige Nukleinsäuren binden, oder sie kann vollständig sein, wenn eine Gesamtkomplementarität zwi schen den einzelsträngigen Molekülen vorhanden ist. Der Grad der Komplementarität zwischen Nukleinsäuresträngen hat signifikante Wirkungen auf die Effizienz und Hybridisierungsstärke zwischen Nukleinsäuresträngen. Dies ist von besonderer Wichtigkeit in Amplifikationsreaktionen, die von der Bindung zwischen Nukleinsäuresträngen, und dem Design und der Verwendung von PNA-Molekülen abhängen. Eine "stringente Hybridisierung" und "stringente Hybridisierungswaschbedingungen" im Zusammenhang mit Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimenten, wie z.B. Southern- und Northern-Hybridisierungen, sind Sequenz-abhängig und bei verschiedenen Umgebungsparametern unterschiedlich. Ein umfassender Leitfaden für die Hybridisierung von Nukleinsäuren ist Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes Teil 1 Kapitel 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y.
"Substantiell bindet/binden" bezeichnet eine Komplementaritätshybridisierung zwischen einer Nukleinsäuresonde und einer Zielnukleinsäure und umfasst auch kleinere Fehlpaarungen, denen durch eine Verringerung der Stringenz der Hybridisierungsmedien Rechnung getragen werden kann, um so die gewünschte Detektion der Zielpolynukleotidsequenz, die an die gebundene Oligonukleotidsequenz hybridisiert ist, welche cDNA, Amplicons, Plasmide und dergleichen umfasst, zu erreichen.
Eine Hybridisierung der Sondennukleinsäure an das interessierende Nukleinsäuremolekül kann unter beliebigen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, und vorzugsweise unter Bedingungen, die eine Hybridisierung begünstigen und die doppelsträngige Hybride bilden (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)).
Beispielsweise wird ein Primer benötigt, um eine reverse Transkription zu starten. Ein "Primer" wird hier als ein Nukleinsäuremolekül definiert, das sich an ein DNA- oder RNA-Matrizenmolekül anlagern kann und als Einleitungspunkt für die Nukleinsäuresynthese dient. Ein üblicher Primer ist allgemein ein synthetisches Oligonukleotid, einschließlich cDNA, Amplicons, Plasmide und dergleichen, aber auch natürlich vorkommende Nukleotide wirken als Primer sowohl in vitro als auch in vivo. In vitro-Verwendungen von Primern umfassen z.B. die cDNA-Synthese, eine Sanger-Didesoxy-Sequenzierung und PCR.
Diese bestimmte Ausführungsform erfordert eine interessierende Nukleinsäure"Matrize", um die interessierende(n) Zielnukleinsäure(n) zu identifizieren, wenn die Zielnukleinsäureprobe(n) erhalten wird/werden. Nukleinsäure-"Matrize" oder "Matrize", wie hier austauschbar verwendet, definiert eine Polynukleotidsequenz, von der eine Information abgelesen wird, um die Synthese von einem anderen Makromolekül zu steuern. Zum Beispiel kann der Ausdruck einen DNA-Strang bezeichnen, der während der DNA-Synthese oder Transkription von RNA kopiert wird, oder einen RNA-Strang, der während einer reversen Translation kopiert wird.
Ein Primer des offenbarten Verfahrens kann ein Oligonukleotid, cDNA, Amplicons, Plasmide und dergleichen sein, entweder RNA oder DNA, mit einer Sequenzkomplementarität zu einer Region auf einem interessierenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet, wird die komplementäre Sequenz des Primers als "komplementärer Teil" bezeichnet. Wie hier verwendet, wird die Region auf dem interessierenden Zielnukleinsäuremolekül, die zu dem Primer komplementär ist, als "Primerkomplementregion" bezeichnet. Die Primerkomplementregion von einem interessierenden Zielnukleinsäuremolekül kann eine beliebige Region des interessierenden Zielmoleküls sein. Bei der Ausführungsform des vorliegenden Assays, bei dem eine reverse Transkriptase verwendet wird, umfasst eine bevorzugte Ausführungsform, dass die Primerkomplementregion eines Zielnukleinsäuremoleküls von dem 5'-Ende des Matrizen-Nukleinsäuremoleküls in gewissem Abstand entfernt liegt. Dies stellt eine größere Region der Nukleinsäure-Matrize zwischen der Stelle der Primer-Hybridisierung und dem Ende des Matrizen-Nukleinsäuremoleküls bereit, wobei dadurch die Menge des zu detektierenden RNA:DNA-Hybrids amplifiziert wird.
Im Allgemeinen wird die Primerkomplementregion von einem interessierenden Nukleinsäuremolekül basierend auf bekannten Kriterien zur Selektion einer Nukleinsäuresequenz zur Detektion ausgewählt. Beispielsweise ist es zur Detektion eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls unter anderen Nukleinsäuremolekülen bevorzugt, dass die Primerkomplementregion charakteristisch oder einzigartig für das interessierende Zielnukleinsäuremolekül ist. Wenn es erwünscht ist, dass ein beliebiges einer Klasse von RNA-Molekülen detektiert wird, ist es bevorzugt, dass die Primerkomplementregion so ausgewählt ist, dass sie eine Sequenz besitzt, die in allen interessierenden Zielnukleinsäuremolekülen dieselbe ist oder im Wesentlichen dieselbe ist. Wenn eine Primerkomplementregion ausgewählt worden ist, wird die Sequenz des Primers so entworfen oder so ausgewählt, dass sie zu der ausgewählten Primerkomplementregion des interessierenden Moleküls komplementär ist. Ein beliebiges Nukleinsäuremolekül, für das eine Sequenz bekannt ist oder für das eine Sequenz abgeleitet werden kann, kann unter Verwendung des offenbarten Verfahrens nachgewiesen werden.
In dem Verfahren hat der komplementäre Teil eines Primers eine Länge, die eine spezifische und stabile Hybridisierung zwischen dem Primer und der Primerkomplementregion unterstützt. Im Allgemeinen umfasst ein Primer der vorliegenden Erfindung 10 bis 100 Nukleotide, aber hat vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotide.
Die Fähigkeit, ein Individuum anhand dessen Genoms zu charakterisieren, ist auf die inhärente Variabilität der genetischen Information zurückzuführen. Obwohl DNA-Sequenzen, die für notwendige Proteine kodieren, unter Spezies gut konserviert sind, gibt es DNA-Bereiche, die nicht-kodierend sind oder die für Teile von Proteinen kodieren, welche keine kritischen Funktionen besitzen, und daher ist eine absolute Konservierung der Nukleinsäuresequenz nicht im großen Maße erforderlich. Diese variablen Regionen werden durch genetische Marker identifiziert. Typischerweise werden genetische Marker von Sonden, wie Oligonukleotiden oder Amplicons, gebunden, die spezifisch an einzigartige variable Regionen des Genoms binden. In einigen Fällen kann man durch das Vorliegen oder Fehlen einer Bindung an einen genetischen Marker Individuen anhand ihrer einzigartigen Nukleinsäuresequenz identifizieren. In anderen Fällen bindet ein Marker an Nukleinsäuresequenzen von allen Individuen, aber das Individuum wird anhand der Position in dem Genom, an die eine Markersonde gebunden ist, identifiziert. Die Hauptursachen einer genetischen Variabilität sind Additions-, Deletions- oder Punktmutationen, Rekombination und transponierbare Elemente innerhalb des Genoms von Individuen in einer Pflanzenpopulation. Die vorliegende Offenbarung kann zur Detektion und Messung von einer genetischen Variation angewendet werden. Zum Beispiel können Polymorphismen, wie SNPs, die durch unterschiedliche Sequenzen wiedergegeben sind, nachgewiesen werden.
Der offenbarte Assay kann verwendet werden, um eine Vielzahl von unterschiedlichen interessierenden biologischen Molekülen in einer Probe nachzuweisen. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass entweder auf eine Sequenz gescreent wird, die in jedem der interessierenden biologischen Zielmoleküle vorhanden ist, oder indem mit mehreren Sonden gescreent wird, die zusammen komplementär zu Regionen auf den interessierenden biologischen Molekülen sind. Der letztere Ansatz ist zur Detektion von beispielsweise einigen Krankheiten oder Prädispositionen ei ner Krankheit, die mit zahlreichen unterschiedlichen Mutationen bei bestimmten Genen oder genetischen Variationen, einschließlich in nicht begrenzender Weise Insertions- oder Deletionsmutationen, assoziiert sind, bevorzugt.
Das offenbarte Verfahren kann auch verwendet werden, um das Verhältnis der Expression von unterschiedlichen biologischen Molekülspezies von einzelnen Organismen oder einer individuellen Probe zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird das Verfahren verwendet, um mehrere Spezies gleichzeitig nachzuweisen. Eine Mikroarray-Detektion, wie hier beschrieben, ist für diesen Zweck geeignet. Das offenbarte Verfahren kann auch verwendet werden, um ähnliche oder verwandte Biomolekülsequenzen nachzuweisen, bei denen die verwandten biologischen Moleküle ein gemeinsames Sequenzmotiv besitzen, aber ansonsten unterschiedlich sind. Zum Beispiel können Zellen mehrere biologische Molekülspezies mit ähnlichen regulatorischen Sequenzen, ähnlichen Strukturmotiven oder anderen gemeinsamen Sequenzen enthalten. Solche Klassen von Nukleinsäuremolekülen können mit einer einzelnen Sondenspezies nachgewiesen werden, indem die Sonde so entworfen wird, dass sie an die gemeinsame Sequenz hybridisiert.
In dem offenbarten Assay wird ein Mittel, das spezifisch für RNA:DNA-Hybride ist, einschließlich RNA:DNA-Hybrid-spezifischen Antikörpern und deren Fragmente, verwendet, um biologische Moleküle, die an den Sondenmikroarray hybridisiert haben, nachzuweisen, was die Markierung der Zielbiomoleküle nicht länger erforderlich macht, aber als eine Option bleibt. In diesem Ansatz ist, je länger das RNA:DNA-Hybrid ist, das Signal um so stärker, da ein längeres RNA:DNA-Hybrid mehr Antikörper binden kann als ein kürzeres RNA:DNA-Hybrid. Je länger die Nukleinsäurensondenstränge auf dem Mikroarray sind, umso empfindlicher ist die Detektion der Zielnukleinsäuren oder, alternativ, umso größer ist die Signalintensität für eine gegebene Menge von hybridisierten Zielnukleinsäuren. Unglücklicherweise wird es schwieriger und zunehmend teurer, längere Stränge von Sonden für die Herstellung dieser Mikroarrays zu synthetisieren, herzustellen oder einzusetzen.
Eine offenbarte Ausführungsform des vorliegenden Assays beschreibt relativ kurze Nukleinsäuresondensequenzen, die an ein festes Substrat gebunden sind, was die Zeit, den Aufwand und die Kosten verringert, die notwendig sind, um den Mikroarray herzustellen. Zielnukleinsäuresequenzen in der Probe werden an diese kurzen Sonden hybridisiert, was ein kurzes RNA:DNA-Hybrid mit einem langen Nukleinsäureschwanz hervorbringt. Dieses kurze RNA:DNA-Hybrid bindet vielleicht nur ei nen oder zwei RNA:DNA-Antikörper. Wenn eine reverse Transkriptase zugesetzt wird und die Bedingungen so sind, dass eine reverse Transkription erfolgt, wird der Nukleinsäuresondenteil des RNA:DNA-Hybrids bis zu der Länge des Zielnukleinsäurestrangs verlängert, so dass dadurch die Länge des RNA:DNA-Hybrids stark zunimmt. Wenn der Zielnukleinsäurestrang eine Länge von 1500 Basen hätte, dann würde sich das entstehende RNA:DNA-Hybrid einer Länge von 1500 Basenpaaren nähern. Ein RNA:DNA-Hybrid dieser Länge bindet signifikant mehr RNA:DNA-Antikörper, so dass dadurch die Intensität des erzeugten Signals stark ansteigt und die Empfindlichkeit der Detektion von spezifischen Zielnukleinsäuresequenzen zunimmt.
Eine offenbarte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Detektion von Zielnukleinsäuresequenzen durch reverse Transkription der gesamten oder eines Teils der gebundenen Nukleinsäurensondensequenz mit einer reversen Transkriptase, bei der eine RNA:DNA-Hybrid-abhängige Exonukleasefunktion fehlt (im Allgemeinen als RNase-H-Funktion oder -Bestandteil bezeichnet), und Nachweis des entstandenen DNA:RNA-Hybrids mit einem Antikörper, der spezifisch für RNA:DNA-Hybride ist. Die Nukleinsäuresonden werden auf einem festen Träger immobilisiert, um das RNA:DNA-Hybrid mit dem festen Träger zu assoziieren. Dies ermöglicht eine leichte Abtrennung von Hybriden von der Probenlösung und eine spezifische Detektion von Nukleinsäuremolekülen basierend auf der Position des Hybrids auf dem festen Träger.
In einem Verfahren wird eine reverse Transkription durchgeführt, indem eine reverse Transkriptase verwendet wird, vorzugsweise eine reverse Transkriptase, bei der die RNase-H-Funktion fehlt. Das Reaktionsgemisch, einschließlich des interessierenden Nukleinsäuremoleküls, in dieser Ausführungsform vorzugsweise RNA, der hybridisierte immobilisierte Nukleinsäureprimer und die reverse Transkriptase werden dann unter Bedingungen inkubiert, welche eine reverse Transkription des interessierenden RNA-Moleküls und eine Bildung von DNA:RNA-Hybriden ermöglichen. Beispiele von reversen Transkriptasen, die in dem offenbarten Verfahren verwendet werden können oder die zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren angepasst werden können, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Bevorzugte reverse Transkriptasen zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren umfassen reverse Transkriptasen 18053-017, 18064-014 und 18064-071 von Life Technology, reverse Transkriptasen M5301 und M5302 von Promega und reverse Transkriptase 600085 von Stratagene, wobei jede davon in Tabelle 1 offenbart ist.
Eine reverse Transkription kann im Allgemeinen bei einer beliebigen Temperatur innerhalb des funktionellen Temperaturbereichs der reversen Transkriptase durchgeführt werden. Vorzugsweise ist die Inkubationstemperatur eine beliebige Temperatur, bei der die reverse Transkriptase funktionell ist und der Primer an das Zielnukleinsäuremolekül hybridisiert bleibt. Für nicht-thermophile reverse Transkriptasen sind bevorzugte Temperaturen solche Temperaturen, die der oder ungefähr der optimalen Temperatur für die reverse Transkriptase entsprechen. Für die meisten nicht-thermophilen reversen Transkriptasen wird diese Temperatur zwischen ungefähr 25°C und 45°C liegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine thermophile reverse Transkriptase zum Erhöhen der Selektivität verwendet. Die höchste Temperatur, bei der eine thermophile reverse Transkriptase funktionell ist, kann ziemlich hoch sein. Aus diesem Grund werden bevorzugte Temperaturbereiche für eine reverse Transkription bei Verwendung einer thermophilen reversen Transkriptase am einfachsten in Form von der berechneten Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen dem interessierenden RNA-Molekül und dem Primer beschrieben. Eine solche Schmelztemperatur wird hier als RNA-/Primer-Schmelztemperatur (R/P Tm) bezeichnet. Bevorzugte Bereiche umfassen eine Temperatur von 20°C unterhalb der Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen dem interessierenden RNA-Molekül und dem Primer und 5°C oberhalb der Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen dem interessierenden RNA-Molekül und dem Primer. Andere bevorzugte Bereiche umfassen solche, wie in Tabelle 2 aufgeführt, wenn eine thermophile reverse Transkriptase verwendet wird.
TABELLE 2:
Es ist spezifisch anzumerken, dass jeder spezifische, jedoch nicht genannte Bereich innerhalb der vorstehend aufgeführten Bereiche als ein alternativer bevorzugter Bereich angesehen wird. Bevorzugte Temperaturen für eine reverse Transkription umfassen ungefähr 20°C unter R/P Tm, ungefähr 15°C unter R/P Tm, ungefähr 12°C unter R/P Tm, ungefähr 10°C unter R/P Tm, ungefähr 7°C unter R/P Tm, ungefähr 5°C unter R/P Tm, ungefähr 3°C unter R/P Tm, 20°C unter R/P Tm, 15°C unter R/P Tm, 12°C unter R/P Tm, 10°C unter R/P Tm, 7°C unter R/P Tm, 5°C unter R/P Tm und 3°C unter R/P Tm. Je näher die Temperatur an dem R/P Tm-Wert ist, umso größer wird im Allgemeinen der Unterscheidungsgrad zwischen den spezifischen und nicht-spezifischen Hybriden der RNA und Primer sein. Wenn die Temperatur nahe dem R/P Tm-Wert liegt, kann jedoch eine niedrigere Stabilität von spezifischen Hybriden dazu führen, dass das Priming weniger effizient ist.
Der R/P Tm-Wert kann entweder durch Berechnung oder empirische Messung bestimmt werden. Zur Berechnung von R/P Tm kann eine beliebige etablierte Formel zur Berechnung der Stabilität von Nukleinsäurehybriden verwendet werden. Eine bevorzugte Formel zur Berechnung von R/P Tm ist
die von Studien über die Stabilität von perfekt-gepaarten DNA:DNA-Hybriden stammt. Bei RNA:DNA-Hybriden, die die Formamidkonzentration in die Formel einschließen, trifft dies nicht zu, da die Beziehung zwischen der Formamidkonzentration und der Absenkung von Tm nicht linear ist. Bei 80% Formamid sind die RNA:DNA-Hybride stabiler als DNA:DNA-Hybride, was zu einer Erhöhung des Tm-Werts um ungefähr 10 bis 30°C führt, in Abhängigkeit von der Sequenz (Hames & Higgins, Nucleic Acid Hybridisation: A Pratical Approach (IRL Press Limited, Oxford, England. 1985)). Das Durchführen der Reaktion in 80% Formamid kann daher auch ausgenutzt werden, um eine Bildung von DNA:DNA-Duplexen zu unterdrücken, um vorzugsweise RNA:DNA-Hybride auszuwählen und um den Tm-Wert für R/P abzuschätzen. Da die empirisch abgeleiteten Formeln zur Abschätzung des Tm-Werts von RNA:DNA-Hybriden für kurze Nukleinsäureprimer nicht so genau sein könnten, wird die Hybridisierungstemperatur vorzugsweise bestimmt, indem die Hybridstabilität in 0,1–0,4 M monovalenten Kationen bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 60°C untersucht wird. Der R/P Tm-Wert kann auch empirisch bestimmt werden (Lesnick und Freier, Biochemistry 34: 10807–10815 (1995), McGraw et al., Biotechniques 8: 674–678 (1990), und Rychlik et al., Nucleic Acids Res. 18: 6409–6412 (1990)).
Wie hier verwendet, ist eine thermophile reverse Transkriptase eine beliebige reverse Transkriptase, die mindestens 5% ihrer maximalen Aktivität bei einer beliebigen Temperatur über 50°C beibehält oder die eine optimale Temperatur von mindestens 50°C besitzt. Bevorzugte reverse Transkriptasen sind solche mit einer optimalen Temperatur von mindestens 50°C. Wie hier verwendet, wird die maximale Aktivität einer reversen Transkriptase als die Aktivität definiert (wie in dem unten beschriebenen Assay gemessen), die eine gegebene reverse Transkriptase bei ihrer optimalen Temperatur aufweist. Wie hier verwendet, wird die optimale Temperatur einer reversen Transkriptase als die Temperatur definiert, bei der die Aktivität der reversen Transkriptase am größten ist, was anhand des unten beschriebenen Assays gemessen wird. Die optimale Temperatur für eine gegebene reverse Transkriptase kann bestimmt werden, indem ihre Aktivität in dem folgenden Assay bei verschiedenen Temperaturen gemessen wird. Im Allgemeinen braucht eine optimale Temperatur nur innerhalb eines Bereichs bestimmt werden, so dass die Assays nur bei Intervallen von 5 bis 10 Grad durchgeführt werden müssen.
Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuresequenzen an Festphasensubstrate sind gut etabliert. Oligonukleotide, einschließlich Halbsonden und Rolling Circle-Replikationsprimern, können an Substrate unter Verwendung von etablierten Kopplungsverfahren gekoppelt werden. Zum Beispiel sind Anbindungsverfahren von Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11): 5022–5026 (1994) und Khrapko et al., Mol. Biol. (Mosk)(USSR) 25: 718–730 (1991) beschrieben. Ein Verfahren zur Immobilisierung von 3'-Aminoligonukleotiden auf Kasein-beschichteten Objektträgern ist von Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6379–6383 (1995) beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren zum Anbringen von Oligonukleotiden an Substrate im festen Zustand ist von Guo et al., Nucleic Acids Res. 22: 5456–5465 (1994), beschrieben.
Die Immobilisierung und Anordnung von Nukleinsäuren oder Primer-Molekülen an feste Träger können unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Technik bewerkstelligt werden. Beispielsweise kann eine Immobilisierung entweder durch in situ-Nukleinsäuresynthese (Maskos und Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679–1684 (1992); Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5022–5026 (1994)) oder durch kovalente oder passive Anbringung von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden (Guo et al., Nucleic Acids Research, 22: 5456–5465 (1994)) oder durch kovalente oder passive Anbringung anderer Nukleinsäuren, Amplicons, cDNAs und dergleichen in Kombination mit Roboter-Array-Technologien bewerkstelligt werden. Andere Immobilisierungstechniken sind in der US-PS 5,412,087 von McGall et al., US-PS 5,429,807 von Matson et al., und US-PS 5,510,087 von Fodor et al. beschrieben. Tausende unterschiedlicher Primer können auf einer kleinen Fläche auf einem festen Träger angeordnet sein, um Tausende von Zielnukleinsäuremolekülen zu untersuchen. Die Dichte von Nukleinsäuren oder Primern sollte mit dem Verfahren zur Anordnung und den Detektionsmitteln übereinstimmen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung umfasst eine Hybridisierung von Zielnukleinsäuresequenzen an den universellen Array, der spezifische Nukleinsäuresonden umfasst, wobei ein "universeller Array" oder "universelle Arraysequenzen" hier austauschbar als kurze Nukleinsäuresequenzen mit jeder möglichen Basenkombination definiert ist. Die universellen Arraysequenzen umfassen einen Bereich von 6–10 Basen, vorzugsweise 5–6 Basen, worin die Anzahl der möglichen Kombinationen (d.h. unterschiedliche Sonden, die an die Festphase gebunden sind) 1024 bzw. 4096 beträgt, so dass eine Nukleinsäureexpressionsanalyse ermöglicht wird, wobei das Ergebnis als "Fingerprint" verwendet werden kann, bei dem unterschiedliche Gewebe oder Proben unterschiedliche Fingerprints ergeben.
Die Ausführungsformen, die eine dritte Nukleinsäuresonde umfassen, können an den Festphasenarray unter Verwendung von "Abfang-Tags" immobilisiert werden. Wie hier verwendet, ist ein Abfang-Tag eine beliebige Verbindung, die eine andere Verbindung oder Gruppe binden kann. Der Primer wird über eine Bindung an einen gebundenen Abfang-Tag an dessen Bindungspartner auf diese Weise immobilisiert. Solche Bindungspartner werden hier als "Abfang-Docks" bezeichnet. Ein Abfang-Tag ist eine Verbindung, wie ein Ligand oder Hapten, die mit einer anderen Verbindung, wie Ligand-Bindungsmolekülen oder einem Antikörper, bindet oder interagiert. Es ist auch bevorzugt, dass eine solche Interaktion zwischen dem Abfang-Tag und dem Abfang-Dock eine spezifische Interaktion ist, wie zwischen einem Hapten und einem Antikörper oder einem Liganden und einem Ligand-Bindungsmolekül.
Eine weitere Ausführungsform von diesem Assay umfasst ein Abfang-Tag mit zwei benachbarten Regionen: eine Zielnukleinsäure-spezifische Region und ein "Abfang-Sequenzkomplement". Wie hier verwendet, umfasst ein Abfang-Sequenzkomplement eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu "universellen Abfang-Sequenzen" ist, die an dem Festphasenmikroarray immobilisiert sind, worin "universelle Abfangsequenzen" kurze Nukleinsäuresequenzen bezeichnen, die bekannt sind und deren Lokalisation auf dem Festphasenmikroarray vorbestimmt ist. Der Abfang-Tag oder die Sonde, der/die ein "Abfang-Sequenzkomplement" umfasst, kann an den Festphasenmikroarray durch Hybridisierung an dessen komplementäre "universelle Abfang-Sequenz" immobilisiert sein.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung bezeichnet der "Abfang-Tag" eine markierte Nukleinsäuresonde, die an dessen "Abfang-Dock" hybridisiert, der an den Festphasenmikroarray gebunden ist, wobei der "Abfang-Dock" eine gemeinsame Sequenz ist, die spezifisch für die markierte Nukleinsäuresonde ist.
Alternative Abfang-Tags umfassen Hapten- oder Ligandenmoleküle, die an Oligonukleotide gekoppelt sein können. Abfang-Tags, die in Zusammenhang mit Nukleinsäuresonden beschrieben sind, wurden von Syvnen et al., Nucleic Acids Res., 14: 5037 (1986), beschrieben. Abfang-Tags umfassen auch Biotin, das in Nukleinsäuren eingebaut werden kann.
Das Anbinden oder Koppeln von Primern an ein Substrat kann durch Anbinden oder Koppeln von Abfang-Docks an das Substrat bewerkstelligt werden. Die Abfang-Docks vermitteln eine Anheftung eines Primers durch Bindung an oder Interaktion mit einem Abfang-Tag auf dem Primer. Abfang-Docks, die auf einem Substrat immobilisiert sind, ermöglichen das Abfangen des Primers auf dem Substrat. Durch Anbringung von unterschiedlichen Abfang-Docks an unterschiedliche Regionen eines Substrats können unterschiedliche Abfang-Tags, die an unterschiedliche Primer gebunden sind, an unterschiedlichen und damit diagnostischen Orten auf dem Substrat abgefangen werden. Zum Beispiel können in einem Mikrotiterplattenmultiplex-Assay Abfang-Docks, die für bis zu 96 unterschiedliche Abfang-Tags spezifisch sind, auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert sein, jedes in einem anderen Well. Das Abfangen und der Nachweis wird lediglich in solchen Wells stattfinden, die den Abfang-Tags entsprechen, bei denen die korrespondierenden Nukleinsäuremoleküle in einer Probe vorhanden waren.
In einer Ausführungsform ist das Abfang-Dock ein Oligonukleotid. Verfahren zur Immobilisierung und Kopplung von Oligonukleotiden an Substrate sind hinreichend etabliert. Zum Beispiel sind Anbringungsverfahren von Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (11): 5022–5026 (1994), und Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25: 718–730 (1991), beschrieben. Ein Verfahren zur Immobilisierung von 3'-Aminoligonukleotiden auf Kasein-beschichteten Objektträgern ist von Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6379–6383 (1995), beschrieben. Ein weiteres Ver fahren zur Anbringung von Oligonukleotiden an Festphasensubstrate ist von Guo et al., Nucleic Acids Res. 22: 5456–5465 (1994), beschrieben.
Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen an Substrate sind hinreichend etabliert. Eine Immobilisierung kann beispielsweise durch Anbringung an beispielsweise aminierte Oberflächen, carboxylierte Oberflächen oder hydroxylierte Oberflächen unter Verwendung von Immobilisierungs-Chemieverfahren erreicht werden. Beispiele von Anbringungsagenzien sind Bromcyan, Succinimid, Aldehyde, Tosylchlorid, Avidin-Biotin, strahlungsvernetzbare Agenzien, Epoxide, Maleimide und Glutaraldehyd. Diese und andere Anbringungsagenzien sowie Verfahren zu deren Verwendung zur Anbringung sind in Protein immobilization: Fundamentals and Applications, Richard F. Taylor, Hrsg. (M. Dekker, New York, 1991), Johnstone und Torpe, Immunochemistry In Practice (Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1987), Seiten 209–216 und 241–242 und Immobilized Affinity Ligands, Craig T. Hermanson et al., Hrsg. (Academic Press, New York, 1992) beschrieben. Proteine können an ein Substrat durch chemisches Vernetzen einer freien Aminogruppe auf dem Antikörper an reaktive Seitengruppen, die in dem Substrat vorhanden sind, angebracht werden. Beispielsweise können Proteine chemisch an ein Substrat, das freie Amino- oder Carboxylgruppen enthält, unter Verwendung von Glutaraldehyd oder Carbodiimiden als Vernetzungsagenzien chemisch vernetzt werden. Bei diesem Verfahren werden wässrige Lösungen, die freie Proteine enthalten, mit dem Festphasensubstrat in Gegenwart von Glutaraldehyd oder Carbodiimid inkubiert. Standardimmobilisierungs-Chemieverfahren sind dem Fachmann bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Empfindlichkeit des offenbarten Verfahrens durch wiederholtes Waschen der Hybridprobe, um freie nicht-hybridisierte Nukleinsäuren, die in der Probe vorliegen, zu entfernen, erhöht. Es ist vorteilhaft, die nicht-spezifische, nicht-hybridisierte Nukleinsäure zu entfernen, da Sekundärstrukturen in der Nukleinsäure durch die Detektionsmittel erkannt werden könnten, was zu einem erhöhten Assay-Hintergrund führt.
Die bevorzugten Hybridisierungs-Probennukleinsäure-Detektionskits zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren können hergestellt werden, indem einige oder alle für das Verfahren erforderlichen Bestandteile verwendet werden. Der Kit enthält vorzugsweise einen immobilisierten Primer, der zu einer Region auf einem interessierenden Nukleinsäuremolekül komplementär ist, und enthält mehr bevorzugt eine Vielzahl von immobilisierten Primern, die jeweils zu einer Region auf einem interessierenden Nukleinsäuremolekül komplementär sind.
Vorzugsweise enthalten Kits alle oder einige der folgenden Bestandteile: ein Probentransportmedium zur Stabilisierung der Probe; einen Festphasen-gebundenen Mikroarray von Biomolekülen, der spezifisch für ein zweites zu detektierendes Biomolekül ist; Hybridisierungspuffer; Mittel, das spezifisch für RNA:DNA-Hybride ist; Waschpuffer; Verstärkungspuffer und die Reagenzien, die zur Detektion des RNA:DNA-Hybrid-spezifischen Antikörpers notwendig sind. Zusätzlich können einige Kits eine thermostabile reverse Transkriptase einschließen, bei der die RNA:DNA-Hybrid-abhängige Exonuklease(RNase H)-Funktion fehlt. Eine weitere Zusammensetzung der Kits kann eine Nukleinsäuresonde einschließen, die eine Abfang-Sequenzkomplementregion umfasst. Zusätzlich können die Kits auch eine markierte Biomolekülsonde einschließen, welche an eine gemeinsame Sequenz des Festphasen-gebundenen Biomoleküls hybridisiert. Kits können weiter einen universellen Array von biologischen Molekülen zur Detektion eines Probenbiomoleküls umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Kits können sämtliche dieser Bestandteile oder Teile davon umfassen.
Zur amplifizierten Antikörper-Detektion können zusätzlich zu den Reagenzien, die in den Hybridisierungskits zur direkten Detektion, wie oben beschrieben, enthalten sind, die folgenden Reagenzien vollständig oder teilweise in die Kits eingeschlossen sein: detektierbar markiertes Anti-Maus-IgG; biotiniliertes Anti-Maus-IgG; markiertes Anti-Maus-Streptavidin; biotiniliertes Anti-Streptavidin oder acetylierte BSA-Lösung.
Die Kits sollten eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle enthalten. Vorzugsweise sind Sonden für Negativ- und Positivkontrollen auf der Festphase mit den Nukleinsäuresequenzen eingeschlossen.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung des vorliegenden Assays.
Beispiele
Es wird angemerkt, dass die Singularformen, wie hier und in den anhängenden Patentansprüchen verwendet, "ein", "eine/r" und "der/die/das" auch die Pluralformen einschließen, soweit es nicht im Zusammenhang anders angegeben ist. Daher umfasst beispielsweise eine Bezugnahme auf "eine Wirtszelle" eine Vielzahl von solchen Wirtszellen, eine Bezugnahme auf "den Antikörper" ist eine Bezugnahme auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, usw.
Soweit nicht anders angegeben, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselben Bedeutungen, wie sie üblicherweise von dem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, ähnlich oder äquivalent denen, die hier beschrieben sind, zur Durchführung und Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien diejenigen, die beschrieben sind.
Beispiel 1
Detektion von RNA:DNA-Hybriden auf Sonden-Mikroarrays
Im Folgenden wird ein Beispiel eines bevorzugten Verfahrens zur Durchführung einer Ausführungsform des offenbarten Verfahrens zur Detektion von Ziel-Biomolekülsequenzen in einer Probe beschrieben.
Im Allgemeinen wird der Assay vorzugsweise verwendet, um eine Probengröße von 0,05 μg Nukleinsäuren nachzuweisen. Vorzugsweise werden 0,05 μg bis 10 μg Gesamtnukleinsäuren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Assays nachgewiesen. Die Zielnukleinsäureprobe wurde in einem Nuklease-freien Wasser resuspendiert und zu Hybridisierungspuffer zugegeben. Die Hybridisierungslösung wurde bei 95°C 2 bis 5 Minuten denaturiert. Die Hybridisierungslösung, welche die Zielnukleinsäure enthält, wurde zu dem Glasobjektträger gegeben, der einen Mikroarray von punktförmig aufgetragenen Oligonukleotiden aufweist. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C für 16 bis 20 Stunden. Darauf folgte entweder eine direkte Detektion oder amplifizierte Detektion.
Für eine direkte Detektion wurde der Glasobjektträger mit einem Mikroarray von Primern, die an die Oberfläche gebunden waren, dreimal für 1 bis 2 Minuten mit 1XPBS/0,05% Tween 20^TM gewaschen und auf einem Rotationsschüttler geschüttelt (1100 UpM). Die RNA:DNA-Antikörperfärbelösung wurde so zugegeben, dass die Endkonzentration 0,144 μg/μl betrug. Der Glasobjektträgermikroarray wurde in Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln (1100 UpM) inkubiert. Der Glasobjektträger wurde mit 1XPBS/0,05% Tween 20^TM gewaschen und 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt (1100 UpM). Der Mikroarray wurde dann in einem Maus-Antikörper, der spezifisch gegen Cy3 oder Cy5 gerichtet war, in Färbelösung bei Raumtemperatur inkubiert und eine Stunde bei 1100 UpM geschüttelt. Es kann eine Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffen verwendet werden, wie z.B. Cy3 oder Cy5. Die Endkonzentration des Cy-Farbstoffs betrug 0,04 μg/μl in einer Lösung aus 10% Ziegenserum und 1XPBS/0,05% Tween 20^TM. Unter Verwendung von leicht harscheren Mitteln wurde der Objektträger viermal ungefähr 10 Sekunden in jedem Waschpuffer gewaschen. Der Objektträger wurde dann bei 53°C 15 Minuten in Verstärkungspuffer inkubiert. Der Objektträger wurde dann in Waschpuffer viermal jeweils ungefähr 10 Sekunden unter Verwendung von mild harschen Mitteln gewaschen. Der Mikroarray, der an den Glasobjektträger gebunden ist, wurde durch Zentrifugation bei 2000 UpM für 7 bis 10 Minuten oder bis zur Trockne getrocknet. Die Ergebnisse wurden analysiert, indem der Objektträger in einem Arrayscanner (Affymetrix 417 Array Scanner oder Äquivalent davon) bei einer Strahlungsanregung bei 532 nm und 635 nm zum Scannen von Objektträgern, die mit Cy3 bzw. Cy5-markierten Antikörpern entwickelt wurden, ausgelesen wurde.
Für eine amplifizierte Detektion wurde der Objektträger dreimal 1–2 Minuten in 1XPBS/0,05% Tween 20^TM gewaschen und auf einem Rotationsschüttler bei 1100 UpM geschüttelt. Der Objektträger wurde in RNA:DNA-Hybrid-spezifischer Antikörperfärbelösung für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln (1100 UpM) inkubiert. Die Endkonzentration der RNA:DNA-Antikörperfärbelösung betrug 0,144 μg/μl. Der Objektträger wurde in 1XPBS/0,05% Tween 20^TM 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln (1100 UpM) gewaschen. Der mit Spots versehene Objektträger wurde mit biotiniliertem Maus-IgG-Antikörper einer Ziegenfärbelösung überschichtet und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Mikroarray wurde zweimal 1–2 Minuten in 1XPBS/0,05% Tween 20^TM gewaschen. Der mit Spots versehene Objektträger wurde mit Ziegen-Antimaus-R-Phycoerythrinstreptavidin (0,01 μg/μl; SA-PE)-Färbelösung überdeckt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Waschen wurde wie oben beschrieben wiederholt. Der mit Spots versehene Objektträger wurde mit Färbelösung von biotiniliertem Ziegen-Antikörper, der gegen Streptavidin gerichtet war, (0,5 mg/ml) beschichtet und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde wiederum mit Ziegen-Antimaus-R-Phycoerythrinstreptavidin(0,01 μg/μl; SA-PE)-Färbelösung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde dann dreimal 1–2 Minuten in 1XPBS/0,05% Tween 20^TM gewaschen. Der Mikroarray wurde dann durch Zentrifugation bei 2000 UpM für 7–10 Minuten oder bis zur Trockne getrocknet. Die Ergebnisse wurden durch Auslesen des Objektträgers in einem Arrayscanner oder einem äquivalenten Mittel (Affymetrix 417 Array Scanner) bei einer Strahlungsanregung bei 532 nm bzw. 635 nm zum Scannen von Objektträgern, die mit Cy3- oder PE- und Cy5-markierten Antikörpern entwickelt wurden, analysiert.
Beispiel 2
Markierte Oligonukleotid-Hybridisierung vor Sondenhybridisierung
Ein Cy3- oder Cy5-markiertes n-mer-Oligonukleotid wurde zu einem Hybridisierungspuffer gegeben, der SSC und SDS enthielt, und wurde bei 95°C 2–5 Minuten denaturiert. Eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden, wie z.B. Cy3 oder Cy5. Der Glasobjektträger, der die punktförmig aufgetragenen Oligonukleotide umfasst, wurde mit der Hybridisierungslösung überdeckt und bei Raumtemperatur 20 Sekunden inkubiert. Das Deckgläschen wurde mit starken Eintauchungen in 2 × SSC/0,2% SDS entfernt. Restliches SDS wurde durch Eintauchen des Objektträgers in 0,05 × SSC für 30 Sekunden weggewaschen. Der Objektträger wurde durch Zentrifugation bei 2000 UpM für 7–10 Minuten oder bis zur Trockne getrocknet. Der Glasobjektträger wurde dann in einem Arrayscanner (Affymetrix 417 Array Scanner oder äquivalentes Mittel) bei einer Strahlungsanregung bei 532 nm bzw. 635 nm zum Scannen von Objektträgern, die mit Cy3- bzw. Cy5-markierten Oligonukleotiden entwickelt waren, zur Analyse ausgelesen. Es folgte eine Probenhybridisierung.
Beispiel 3
Detektion von RNA, vermittelt durch reverse Transkriptase, bei der die RNase H-Funktion fehlt
Im Folgenden wird ein Beispiel eines Verfahrens zur Durchführung einer Ausführungsform des offenbarten Verfahrens zur Detektion von Zielnukleinsäuresequenzen in einer Probe beschrieben.
Die 5'-biotinilierten 20 bis 30 Nukleotidprimer wurden mit einer Streptavidin-beschichteten Festphase vermischt und 30 bis 60 Minuten bei 20–27°C unter konstantem Schütteln (1100 UpM) inkubiert. Eine Probe von Zielnukleinsäuren wurde zu der Festphase gegeben. Hybridisierungs-/Verlängerungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 150 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 20 mM DTT und jeweils 1 mM dNTP) wurden dann zugegeben. Die Zielnukleinsäure und Primer wurden durch Erhitzen des Gemisches auf die optimale Anlagerungstemperatur, vorzugsweise 60°C (die optimale Anlagerungstemperatur variiert mit dem verwendeten Primer und der verwendeten Nukleinsäure), für 20 bis 30 Minuten angelagert. Das Gemisch wurde dann auf 20–27°C für 10 Minuten abgekühlt. Zusätzliche Hybridisierungs-/Verlängerungspuffer und reverse Transkriptase, vorzugsweise thermostabile Transkriptase, der RNAse H fehlt, wurden zugegeben. Die Reaktion wurde für 30 bis 60 Minuten bei 42°C durchgeführt. EDTA (0,5 M) wurde zugegeben und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Der RNA:DNA-Hybrid-spezifische alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörpermix wurde zugegeben und bei 20–27°C 30 bis 60 Minuten inkubiert. Jeder nicht-gebundene Antikörper wurde weggewaschen, gefolgt von dem Zusatz eines chemilumineszierenden Substrats. Die Lösung wurde 15–30 Minuten bei 20–27°C inkubiert. Das ausgesendete Signal wurde mit einem Luminometer bei einer geeigneten Wellenlänge ausgelesen.
Beispiel 4
Bindung von RNA:DNA-Hybrid-spezifischen Antikörpern
Hybridisierte RNA:DNA-Proben wurden mit den Antikörpern für eine ausreichende Dauer, um eine Konjugation der Hybride zu ermöglichen, inkubiert. Die Hybride wurden an die Antikörper durch Inkubation für 5 Minuten bis 24 Stunden bei 15 bis 65°C auf einem Plattformschüttelgerät mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 0 bis 1500 UpM gebunden. Vorzugsweise betrug die Inkubationszeit 30 bis 120 Minuten bei 20 bis 40°C bei Schütteln zwischen 300 bis 1200 UpM. Vorzugsweise trat eine Bindung bei einer Inkubation bei einer Stunde bei Raumtemperatur unter starkem Schütteln auf einem Rotationsplattformschüttelgerät mit einer Rotationsschüttelgeschwindigkeit zwischen ungefähr 300 und 1000 UpM auf. Es soll verstanden werden, dass die Inkubationsdauer, Temperatur und das Schütteln variieren werden können, um alternative Abfang-Kinetiken, wie erwünscht, zu erreichen.
Beispiel 5
Oligonukleotidlänge-Vergleich, detektiert durch monoklonale und polyklonale Antikörper
Ein einzelnes Oligonukleotid mit verschiedener Länge wurde bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 10fach punktförmig aufgetragen. Das punktförmig aufgetragene 72-mer-Oligonukleotid war Teil des IMAGE-Klons #259983, das dem ribosomalen 40S Protein SI1 entspricht. Die kürzeren Oligonukleotide waren sequenzielle Verkürzungen des parentalen 72-mers. Diese Mikroarrays wurden mit verschiedenen Konzentrationen komplementärer RNA hybridisiert und wurden unter Verwendung des monoklonalen primären RNA:DNA-Hybridantikörpers sichtbar gemacht. Bei einer Zielkonzentration von 800 pM wurde ein substanzielles Signal bei einer Oligonukleotid-Länge von 30 Basen nachgewiesen, wobei es ein Abfallen des Signals bei 25 Basen gab. 6A zeigt die Ergebnisse das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis als Funktion der Oligonukleotid-Länge bei einer RNA-Konzentration von 800 pM mit verschiedenen punktförmig aufgetragenen Oligonukleotid-Konzentrationen nach einer RNA:DNA-Hybrid-spezifischen monoklonalen Antikörper-Detektion.
Das polyklonale Antikörper-Detektionsprotokoll war dasselbe, wie oben für den monoklonalen Antikörper beschrieben, mit der Ausnahme, dass ein Cy3-markierter sekundärer Ziegen-Antikörper von Kaninchen anstelle des Maus-Antikörpers von der Ziege verwendet wurde. Die Ergebnisse (6B) mit dem polyklonalen Antikörper zeigten eine signifikant verbesserte Detektion im Vergleich zu dem monoklonalen Antikörper für Oligonukleotide, die eine Länge von weniger als 30 Basen aufwiesen. Bei Oligonukleotiden, die mehr als 30 Basen aufwiesen, gab es keinen signifikanten Unterschied beim Signal.
Der polyklonale RNA:DNA-Antikörper stellte ein signifikant empfindlicheres Verfahren zur Detektion von RNA:DNA-Hybriden, die weniger als 30 Basenpaare lang sind, bereit, im Vergleich zu einer Detektion mit dem monoklonalen Antikörper (siehe 6A–B).

Claims

Verfahren zum Quantifizieren einer Ziel-RNA, umfassend: (a) Hybridisieren der Ziel-RNA an einen ersten Teil einer immobilisierten DNA, wobei das Ziel komplementär dazu ist und ein RNA:DNA-Hybrid bildet. (b) Hybridisieren einer markierten DNA-Sonde an einen zweiten Teil der immobilisierten DNA, wobei die Sonde komplementär dazu ist und einen detektierbaren DNA:DNA-Komplex bildet, wobei die Markierung ein erstes Reagenz ist. (c) Binden eines RNA:DNA-Hybrid-spezifischen detektierbaren Restes an den RNA:DNA-Hybrid, wobei der detektierbare Rest mit einem zweiten Reagenz markiert ist; (d) Messen der Ziel-RNA durch Detektion des RNA:DNA-Hybrids; und (e) Messen der immobilisierten DNA durch Detektion des DNA:DNA-Hybridkomplexes.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der detektierbare Rest ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein Bindungsfragment ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper monoklonal ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper polyklonal ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroanordnung Probendetektionsstellen im Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 100 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroanordnung Probendetektionsstellen im Bereich von ungefähr 100 bis ungefähr 1000 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroanordnung Probendetektionsstellen im Bereich von ungefähr 1000 bis ungefähr 10000 besitzt.