DE60025529T2 - Magnetische glasteilchen, herstellungsverfahren und benutzung - Google Patents

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Description

  • Die folgende Erfindung betrifft magnetische Teilchen, die eine Glasoberfläche aufweisen und im wesentlichen kugelförmig sind. Ebenso betrifft die folgende Erfindung Verfahren zu deren Herstellung ebenso wie Suspensionen davon und ihre Verwendungen zur Reinigung von biologischem Material, insbesondere in automatisierten Prozessen.
  • Viele biologische Materialien, vor allem Nukleinsäuren, stellen hinsichtlich ihrer Isolierung aus ihrer natürlichen Umgebung eine besondere Herausforderung dar. Einerseits liegen sie häufig in sehr kleinen Konzentrationen vor und werden andererseits häufig in Gegenwart vieler anderer fester und gelöster Substanzen angetroffen, die ihre Isolierung oder Messung erschweren, insbesondere in biospezifischen Tests.
  • Biospezifische Bindungstests gestatten den Nachweis spezifischer Analyte, beispielsweise Nukleinsäuren, oder spezifischer Analyteigenschaften und spielen eine wichtige Rolle auf dem Gebiet der Diagnostik und Bioanalytik. Dabei handelt es sich beispielsweise um Hybridisierungstests, Immuntests sowie Rezeptor-Liganden-Tests.
  • Bei Hybridisierungstests wird die spezifische Basenpaarung zum molekularen Nachweis von Nukleinsäureanalyten, z.B. RNA und DNA, genutzt. Somit können Oligonukleotidsonden mit einer Länge von 18 bis 20 Nukleotiden die spezifische Erkennung einer ausgewählten Sequenz im menschlichen Genom ermöglichen. Ein weiterer Test, bei dem die selektive Bindung von zwei Oligonukleotidprimern genutzt wird, ist die in der US 4,683,195 beschriebene Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Bei diesem Verfahren wird die selektive Amplifikation eines spezifischen Nukleinsäurebereichs auf nachweisbare Niveaus mittels einer temperaturstabilen Polymerase in Gegenwart von Desoxynukleotidtriphosphaten in mehreren Zyklen genutzt.
  • Bei Nukleinsäuren handelt es sich um vergleichsweise komplexe Analyte, die normalerweise aus komplexen Gemischen extrahiert werden müssen, bevor sie sich in einem Test auf Sondenbasis verwenden lassen.
  • Es gibt mehrere Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren:
    • – sequenzabhängige oder biospezifische Verfahren, wie z.B.: • Affinitätschromatographie • Hybridisierung an immobilisierten Sonden auf Kügelchen (Beads)
    • – sequenzunabhängige oder physikalisch-chemische Verfahren, wie z.B.: • Flüssig-flüssig-Extraktion, z.B. mit Phenolchloroform • Präzipitation, z.B. mit reinem Ethanol • Extraktion mit Filterpapier • Extraktion mit Mizellen bildenden Agenzien wie Cetyltrimethylammoniumbromid • Bindung an immobilisierte, interkalierende Farbstoffe, z.B. Acridinderivate • Adsorption an Kieselgel oder Diatomeenerden • Adsorption an magnetische Glasteilchen (Magnetic Glas Particles, MGP) oder Organosilanteilchen unter chaotropen Bedingungen
  • Viele Verfahrensweisen und Materialien zur Isolierung von Nukleinsäuren aus ihrer natürlichen Umgebung wurden in letzter Zeit unter Nutzung ihres Bindungsverhaltens an Glasoberflächen vorgeschlagen. So wird beispielsweise in Proc. Natl. Acad. USA 76, 615–691 (1979) eine Verfahrensweise zur Bindung von Nukleinsäuren in Agarosegelen in Gegenwart von Natriumiodid in zermahlenem Flintglas vorgeschlagen.
  • In Anal. Biochem. 121, 382–387 (1982) wird die Reinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien an Glasstaub in Gegenwart von Natriumperchlorat beschrieben.
  • In der DE-A 37 34 442 wird die Isolierung von Einzelstrang-M13-Phagen-DNA an Glasfaserfiltern durch Ausfällen der Phagenpartikel mit Essigsäure und Lyse der Phagenpartikel mit Perchlorat beschrieben. Die an die Glasfaserfilter gebundenen Nukleinsäuren werden gewaschen und danach mit einem mentholhaltigen Puffer in Tris/EDTA-Puffer eluiert.
  • Eine ähnliche Verfahrensweise zur Reinigung von DNA aus Lambda-Phagen ist in Anal. Biochem. 175, 196–201 (1988) beschrieben.
  • Aus der EP 757 106 ist ein zur Bindung an Nukleinsäuren fähiger magnetischer Träger bekannt, der ein superparamagnetisches Metalloxid enthaltende magnetische Siliziumdioxidteilchen umfaßt, wobei die magnetischen Siliziumdioxidteilchen eine spezifische Oberfläche von etwa 100 bis etwa 800 m2/g aufweisen.
  • Von Pal, M. et al., J. Magnetism Magnetic Materials 164 (1996) 256–260 ist ein über den Glas-Keramik-Weg hergestelltes Nanokristallines Nickel-Zink-Ferrit offenbart.
  • Bei der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrensweise werden Nukleinsäuren an Glasoberflächen in chaotropen Salzlösungen selektiv gebunden und von Verunreinigungen, wie beispielsweise Agarose, Proteinen oder Zelltrümmern, getrennt. Um die Glasteilchen von den Verunreinigungen nach dem Stand der Technik zu trennen, werden die Teilchen entweder zentrifugiert, oder es werden Flüssigkeiten durch Glasfaserfilter gezogen. Hierbei handelt es sich allerdings um einen limitierenden Schritt, der verhindert, daß die Verfahrensweise zur Bearbeitung großer Probenmengen eingesetzt wird.
  • Es konnte gezeigt werden, daß mit einer Glasoberfläche versehene magnetische Teilchen beträchtliche Vorteile für die Isolierung biologischer Materialien bieten. Sind die magnetischen Teilchen nicht mit einem Magnetfeld in Kontakt gebracht worden, so ist die Schwerkraft die einzige Kraft, die sie zum Absetzen bringen kann. Durch Schütteln der Lösung können sie wieder in eine Suspension überführt werden. Das Sedimentationsverfahren, bei dem kein Magnetfeld eingesetzt wird, läuft langsamer ab als die Immobilisierung von biologischen Materialien auf der Oberfläche der Teilchen. Dies trifft vor allem für Nukleinsäuren zu. Die magnetischen Teilchen lassen sich leicht an einem bestimmten Ort in der Probenflüssigkeit mittels eines Magneten sammeln. Die Flüssigkeit wird dann von den Teilchen und damit von den immobilisierten biologischen Materialien abgetrennt.
  • Die Verwendung magnetischer Teilchen zur Immobilisierung von Nukleinsäuren nach Präzipitation durch Zugabe von Salz und Ethanol ist in Anal. Biochem. 201, 166–169 (1992) und PCT GB 91/00212 beschrieben. Bei dieser Verfahrensweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit den magnetischen Teilchen agglutiniert. Das Agglutinat wird von dem ursprünglichen Lösungsmittel durch Anlegen eines Magnetfeldes und Durchführen eines Waschschritts getrennt. Nach einem ersten Waschschritt werden die Nukleinsäuren in einem Tris-Puffer gelöst. Diese Verfahrensweise hat jedoch einen Nachteil, der darin besteht, daß die Präzipitation für Nukleinsäuren nicht selektiv ist. Vielmehr werden ebenso verschiedene feste und gelöste Substanzen agglutiniert. Daher läßt sich diese Verfahrensweise nicht zur Abtrennung signifikanter Mengen eventuell vorhandener Inhibitoren spezifischer enzymatischer Reaktionen verwenden. Ebenso ist magnetisches, poröses Glas kommerziell erhältlich, das magnetische Teilchen in einer porösen, besonderen Glasmatrix enthält und mit einer Streptavidin enthaltenden Schicht bedeckt ist. Dieses Produkt läßt sich zur Isolierung biologischer Materialien beispielsweise von Proteinen oder Nukleinsäuren, einsetzen, falls diese in einem komplexen Präparationsschritt so modifiziert werden, daß sie kovalent an Biotin binden. Bestimmte magnetisierbare Adsorbentien erwiesen sich als sehr wirksam und tauglich für die automatische Probenpräparation. Dabei können für diesen Zweck ferrimagnetische und ferromagnetische ebenso wie superparamagnetische Pigmente verwendet werden.
  • Nach allgemeinem Fachwissen handelt es sich bei Teilchen um feste Materialien mit einem kleinen Durchmesser. Teilchen wie diese werden häufig auch als Pigmente bezeichnet.
  • Als magnetisch werden diejenigen Materialien bezeichnet, die zu einem Magneten gezogen werden, d.h. beispielsweise ferromagnetische oder superparamagnetische Materialien. Superparamagnetismus wird als vorteilhaft angesehen und ist im Stand der Technik bevorzugt (z.B. US 5,928,958 ; US 5,925,573 ; EP 757 106 ). Die Glas- oder Organosilanoberflächen sind häufig zum Einsatz bei biospezifischen Einfangreaktionen funktionalisiert, z.B. US 5,928,958 , US 5,898,071 , US 5,925,573 , EP 937 497 , US 4,554,088 oder US 4,910,148 . Andererseits können Glas- oder Organosilanoberflächen mit verschiedenen Lösungsmitteln oder Salzen behandelt werden, um ihre Hydorphilität und/oder Elektropositivität zu modifizieren, z.B. US 5,438,127 .
  • Jedoch können die nicht derivatisierten Silanolgruppen der Glas- bzw. Silanoberfläche zur Adsorption mit rein physikalisch-chemischen Kräften unter geeigneten Reaktionsbedingungen verwendet werden, wie beispielsweise in DE 195 20 964 , DE 195 37 985 , WO 96/41840, WO 96/41811, EP 757 106 oder US 5,520,899 beschrieben. Typischerweise sind dabei magnetische Kerne oder magnetische Kernaggregate mit einer Glasoberfläche versehen, die über einen säure- oder basenkatalysierten Sol-Gel-Prozeß gebildet wird. Diese Teilchen werden Kern-Schale-Teilchen genannt. Der Glasmantel weist dabei eine typische Schichtdicke auf (siehe z.B. DE 195 20 964 ), wobei die Größe und die Form des Pigments, das einen nichtmagnetischen Träger, wie z.B. Glimmer, zusätzlich zu dem magnetischen Metalloxid enthalten kann, die Größe und Form des produzierten Teilchens bestimmt (siehe z.B. DE 195 37 985 sowie die zugehörige WO 96/41811). Um eine hohe Oberflächenaktivität zu erhalten, wird ein Glasmaterial mit einer hohen Porosität verwendet (siehe z.B. EP 757 106 ; WO 99/26605). Ferner sind magnetische Verbundteilchen beschrieben, beispielsweise silikatbeschichtetes Eisenoxid, das mit einer anorganischen Siliziumdioxidmatrix aus Siliziumdioxidteilchen ( EP 757 106 ) oder Gemischen aus Glas und Kieselgel (WO95/06652) bedeckt ist.
  • Die von der vorliegenden Erfindung zu lösende Aufgabe kann darin gesehen werden, magnetische Glasteilchen mit verbesserten Eigenschaften zur Probenpräparation und für biologische Tests, insbesondere für automatisierte Prozesse, bereitzustellen.
  • Die Mängel der magnetischen Glasteilchen im Stand der Technik werden durch die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung überwunden.
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung von magnetischen Glasteilchen. Dabei handelt es sich bei den magnetischen Glasteilchen (MGPs) gemäß der vorliegenden Erfindung um eine feste Dispersion kleiner magnetischer Kerne in Glas. Die MGPs sind vergleichsweise klein und weitgehend kugelförmig. Der nichtmagnetische Feingehalt einer Zusammensetzung der MGPs ist aufgrund ihres Herstellungsverfahrens sehr niedrig. Dies führt dazu, daß Suspensionen der MGPs langsam sedimentieren und sich daher vorteilhaft zu Prozessen in der Molekularbiologie, die automatisiert werden können, verwenden lassen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Zusammensetzungen und Suspensionen der MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Zusammensetzung der MGPs bereitgestellt. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Reinigung von DNA oder RNA bereitgestellt, bei dem die MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung von magnetischen Glasteilchen bereitzustellen, die weitgehend kugelförmig sind und einen kleinen Durchmesser aufweisen sowie mindestens ein magnetisches Objekt mit einem Durchmesser zwischen 5 und 500 nm enthalten. Dies hat überraschende Folgen für die Sedimentationskinetik, quantifiziert durch die Halbwertszeiten t1/2, wobei es sich hier um die Zeitspanne handelt, nach der sich 50% der Partikel aus einem spezifischen Volumenelement abgesetzt haben (siehe Beispiel 6). Die Halbwertszeit für die Sedimentation einer 3 mg/ml Suspension (Gewicht pro Volumen) der Zusammensetzung in Isopropanol beträgt mehr als 3 min, vorzugsweise 4 min, stärker bevorzugt 6 min. Die am meisten bevorzugten Werte für die Halbwertszeit betragen jedoch mehr als 10 min oder sogar mehr als 20 min. Je kleiner und je näher der idealen Kugelform die MGPs sind, desto länger sind sie suspendiert. Dies kann man dadurch erklären, daß die Möglichkeit, daß zwei oder mehr Partikel zusammenkleben und Aggregate aufbauen, die sich schneller absetzen können, um so geringer ist, je näher die Form einer idealen Kugelform gleichkommt. Diese Daten sind in Beispiel 6 gezeigt, und hochaufgelöste, mit einem Rasterelektronenmikroskop aufgenommene Abbildungen sind in 4 bis 10 zu sehen. Dies hat den Vorteil, daß bei automatisierten Prozessen die erforderliche Mischintensität und Mischfrequenz der die MGP-Suspension enthaltenden Aufbewahrungsbehälter verringert wird, da die wiederholte Dosierung eines spezifischen MGP-Suspensionsvolumens aus einem Überschußvolumen sich leichter in eine Spritze saugen läßt (genauere Zuführung im Hinblick auf MasseMGP/Volumen).
  • Bei den MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Glaströpfchen, in denen sehr kleine nicht aggregierende magnetische Objekte dispergiert sind. Als magnetisch bezeichnete Objekte werden zu einem Magneten gezogen, d.h. beispielsweise ferromagnetische oder superparamagnetische Materialien. Bevorzugt dabei sind ferromagnetische Materialien, insbesondere, wenn sie noch nicht vormagnetisiert wurden. Unter Vormagnetisierung versteht man in diesem Zusammenhang das Inkontaktbringen mit einem Magneten, wodurch die Remanenz erhöht wird. Als magnetische Materialien bevorzugt sind Eisen oder Eisenoxid, wie z.B. Magnetit (Fe3O4) oder Fe2O3, vorzugsweise γ-Fe2O3. Im Prinzip könnten Bariumferrit, Nickel, Kobalt, Al-Ni-Fe-Co-Legierungen oder andere ferri- oder ferromagnetische verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei den magnetischen Objekten um ein magnetisches Pigment handeln. Die Größe der magnetischen Objekte liegt im Nanomaßstabsbereich, d.h. gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt der Durchmesser zwischen 5 bis 500 nm, vorzugsweise zwischen 10 bis 200 nm, am meisten bevorzugt zwischen 15 bis 50 nm. Geeignete magnetische Pigmente werden von der Firma CERAC hergestellt und besitzen einen mittleren Durchmesser von 23 nm und bestehen aus γ-Fe2O3 (BET-Oberfläche 50 m2/g, CERAC: P.O.Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201–1178 USA; Artikel-Nr. I-2012). Die magnetischen Glasteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung sind ferner dadurch gekennzeichnet, daß die MGPs einen Teilchendurchmesser zwischen 0,5 μm und 5 μm, vorzugsweise zwischen 1 μm bis 2 μm, wie durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie bestimmt, aufweisen, wohingegen die magnetischen Objekte einen Durchmesser zwischen 5 bis 500 nm, vorzugsweise zwischen 10 und 200 nm, am stärksten bevorzugt im Bereich von 15 bis 50 nm, aufweisen, wie oben erwähnt. Somit sind die MGPs der vorliegenden Erfindung ferner durch ein Durchmesserverhältnis von magnetischem Pigmentkern zu magnetischem Glasteilchen von weniger als 1 bis 10, wie durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie bestimmt, gekennzeichnet. Aufgrund dieser Durchmesserverhältnisse ebenso wie der Abwesenheit jeglicher inerter Träger, die die Form und Größe der Teilchen bestimmen würden, werden die Geometrie der MGPs sowie die Anzahl an eingebauten magnetischen Objekten durch die Herstellungsbedingungen festgelegt. Die MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung sind mikroporös, weisen jedoch eine hochstrukturierte und daher relativ große Oberfläche mti mehr als 6 m2/g auf. Vorzugsweise weisen die magnetischen Glasteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Oberfläche im Bereich von 5 bis 100 m2/g, vorzugsweise 5 bis 90 m2/g, stärker bevorzugt im Bereich von 10 bis 50 m2/g, am stärksten bevorzugt im Bereich von 15 bis 30 m2/g, auf. Dabei weist diese Oberfläche ungefähr die doppelte Größe der in der DE 195 37 985 beschriebenen Teilchen auf. Dies läßt sich mit dem Braunauer-Emett-Teller-Verfahren unter Verwendung eines automatischen kommerziellen Geräts bestimmen (siehe Beispiel 4). Hinsichtlich einer Diskussion dieses Verfahrens, das unter dem geläufigen Namen BET-Verfahren bekannt ist, siehe S. Braunauer, The Adsorption of Gases and Vapors, Bd. 1, Princeton University Press, 1943. So weist beispielsweise die Probe EJ0096.5R-01 die von bevorzugtem Interesse ist (siehe Beispiel 1 und Tabelle 1 bis Tabelle 3 für eine Zusammenfassung der Produktionsparameter) eine BET- Oberfläche von 26,8525 m2/g, eine Mikroporenfläche von 2,3058 m2/g sowie einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 24,9132 nm auf. Dies bedeutet, daß die Porenoberfläche weniger als 10% der Gesamtoberfläche ausmacht und daß das magnetische Glasteilchen mikroporös ist.
  • Unter einer Pore versteht man eine Vertiefung in der äußeren Oberfläche des Teilchens. Dabei reicht die Oberfläche so weit in das Teilchen hinein, daß eine in der Vertiefung auf der Oberfläche gezogene senkrechte Linie das Teilchen mindestens einmal in Richtung der nächsten Umgebung des Teilchens schneidet. Darüber hinaus reichen Poren in das Teilchen bis zu einer Tiefe, die mehr als ein Radius der Pore beträgt.
  • Die langsamere Sidementationskinetik, größere Oberfläche sowie die aggregationshemmende Kugelform werden an der besseren funktionellen Leistung als Adsorbens bei der Nukleinsäurediagnose (siehe Beispiel 3, 5 und 7) im Vergleich mit den deutschen Patentanmeldungen DE 198 54 973 bzw. DE 198 55 259 deutlich. Dieses Kriterium läßt sich über eine Verschiebung der Schwellenzyklen in sogenannten TaqMan®-Assays, des Signal-Rausch-Verhältnisses sowie der statistisch validierten unteren Nachweisgrenze quantifizieren. Die Verfahren für diesen Assay sind in der WO 92/02638 sowie den entsprechenden US-Patenten US 5,210,015 , US 5,804,375 , US 5,487,972 offenbart. Radiotracing-Experimente (siehe Beispiel 5.2) zeigten, daß das Bindungsverhalten hinsichtlich DNA und RNA verglichen mit im Stand der Technik bekanntem Referenzmaterial gleich war. Überraschenderweise hatten die Produktionsparameter einen Einfluß auf die Leistung in den Radiotracing-Experimenten. Ein weiterer Vorteil des MGP-Typs der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß aufgrund der inneren Struktur (feste Dispersion kleiner magnetischer Kerne in einem Glastropfen) keine Spannungen in der Glasschicht zu Rissen während des Trocknungsvorgangs sowie entsprechender Schäden im Glasmantel führen können. Dies kann mit bilderzeugenden Verfahren untersucht werden (siehe Beispiel 3).
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einer Suspension von magnetischen Teilchen. Für den Fachmann ist die Herstellung einer Suspension durch Zugabe einer Flüssigkeit zu einer Zusammensetzung der MGPs und Mischen der Suspension zur Homogenität offensichtlich. Dabei kann eine Flüssigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung eine beliebige Flüssigkeit umfassen, die sich nicht auf die Stabilität der magnetischen Teilchen auswirkt und die zur Herstellung einer homogenen Suspension verwendet werden kann.
  • Vorzugsweise werden Flüssigkeiten verwendet, die sich für Prozesse in der Molekularbiologie eignen, insbesondere Desoxyribonukleinsäure(DNA)- oder Ribonukleinsäure(RNA)-Reinigungsprozesse, die sich die Bindung dieser Substanzen an Glasteilchen unter bestimmten Bedingungen zunutze machen. Bevorzugte Flüssigkeiten umfassen Alkohole oder beliebige Gemische davon mit Wasser oder Ketonen. Dabei sind erfindungsgemäß zu den Alkoholen vorzugsweise primäre, sekundäre oder tertiäre Alkohole der allgemeinen Formel R-OH zu zählen, wobei das R für die allgemeine Formel -(-CH2)n-CH3 mit n >= 0 steht. Es können jedoch auch andere Alkohole eingesetzt werden, falls sie sich für molekularbiologische Zwecke eignen, wie z.B. Glycerin. Besonders geeignet sind die Alkohole Isopropanol, Ethanol oder Gemische davon mit Wasser, vorzugsweise ein Gemisch aus 80 Volumenteilen Isopropanol mit 20 Volumenteilen Wasser. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Flüssigkeit Ketone, wie z.B. Aceton. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthalten diese Suspensionen zwischen 5 bis 60 mg/ml MGPs. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die MGPs in wäßrigen gepufferten Lösungen suspendiert, die gegebenenfalls ein Chaotrop in einer Konzentration zwischen 2 und 8 mol/l und vorzugsweise zwischen 4 und 6 mol/l enthalten können. Bei chaotropen Salzen kann es sich um Natriumiodid, Natriumperchlorat, Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorit handeln. Andere Verbindungen sind ebenso möglich. Bei einem Chaotrop gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine beliebige chemische Substanz, die die geordnete Struktur von flüssigem Wasser stört und den Effekt hat, daß DNA oder RNA an die MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, falls dieses Agens in der DNA- oder RNA-haltigen Lösung vorhanden ist. Für den Fachmann ist die Herstellung geeigneter wäßriger gepufferter Lösungen offensichtlich. Puffersysteme, die für molekularbiologische Zwecke eingesetzt werden können, können beispielsweise in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA, entnommen werden. Als Puffersubstanzen bevorzugt sind Tris-Hydroxymethylamin (TRIS), Phosphat, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES), Salze davon oder andere geeignete Substanzen. Zusätzlich können Substanzen vorhanden sein, die die Ionenstärke der Lösung modifizieren, wie beispielsweise NaCl, KCl oder CaCl2, oder bei denen es sich um Metallkationenkomplexierer handelt, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder deren Salze. Dem Fachmann bekanntes biologisches Material kann auch vorhanden sein. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Suspension von MGPs darüber hinaus DNA oder RNA, gegebenenfalls in einem Gemisch mit Proteinen, Fettsäuren, Kohlenhydraten und anderem Material biologischen Ursprungs, enthalten. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Flüssigkeit ein Gemisch aus einem oder mehreren Bestandteilen, ausgewählt aus der Gruppe Alkohole, Ketone, wäßrige gepufferte Lösungen, Chaotrope, Substanzen, die die Ionenstärke der Lösung modifizieren, Komplexierer, biologisches Material, DNA oder RNA, die alle die wie oben beschriebenen Merkmale aufweisen, enthalten.
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein die erfindungsgemäßen Suspension enthaltendes Röhrchen oder Reaktionsgefäß bereitgestellt. Das Röhrchen kann dabei aus Kunststoff bestehen, kann aber auch Teil einer größeren Struktur, beispielsweise Teil einer Mikrotiterplatte im 96- oder 384-Loch-Format, sein. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Aufbewahrungsbehälter bereitgestellt, der eine Zusammensetzung von magnetischen Glasteilchen oder Suspensionen davon enthält. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Kit-of-parts bereitgestellt, das einen die magnetischen Glasteilchen oder eine Suspension davon gemäß der vorliegenden Erfindung enthaltenden Aufbewahrungsbehälter umfaßt. Das Kit kann zur Reinigung von DNA oder RNA verwendet werden. Derartige im Fachgebiet bekannte Kits umfassen ferner Kunststoffartikel, die während des Reinigungsverfahrens verwendet werden können, wie beispielsweise Mikrotiterplatten im 96- oder 384-Loch-Format oder wie gewöhnliche Reaktionsröhrchen, wie sie beispielsweise von der Firma Eppendorf, Hamburg, hergestellt werden. Das Kit kann ferner eine Waschlösung umfassen, die sich für den Waschschritt der magnetischen Gasteilchen eignet, wenn DNA oder RNA daran gebunden ist. Häufig wird die Waschlösung als Stammlösung bereitgestellt, die vor Gebrauch verdünnt werden muß. Das Kit kann ferner ein Elutionsmittel, d.h. eine Lösung oder einen Puffer (z.B. TE, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) oder reines Wasser, umfassen, um die an die magnetischen Glasteilchen gebundene DNA oder RNA zu eluieren. Ferner können zusätzliche Reagentien vorhanden sein, die sich für den Reinigungsprozeß einer Nukleinsäure, d.h. DNA oder RNA, einsetzen lassen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Kit-of-parts gemäß der vorliegenden Erfindung zur Reinigung einer Nukleinsäure verwendet.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Zusammensetzung von MGPs zur Herstellung einer Suspension, wie bereits beschrieben, verwendet werden.
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Suspensionen gemäß der vorliegenden Erfindung zur Reinigung von Nukleinsäuren, d.h. RNA oder DNA, aus diese enthaltenden komplexen Gemischen mit anderen biologischen Substanzen verwendet werden. Dadurch können auch Gemische aus unterschiedlichen Nukleinsäuren und sogar Gemische, die eine interessierende Nukleinsäure in geringer Menge enthalten, aufgereinigt werden. Der Reinigungseffekt ergibt sich aus dem Verhalten von DNA oder RNA, an magnetische Glasteilchen unter bestimmten Bedingungen, z.B. in Gegenwart einer bestimmten Konzentration eines Chaotrop, zu binden. Vorzugsweise werden die MGPs mit der gebundenen DNA oder RNA anschließend mindestens einmal, vorzugsweise mit einem Gemisch aus 70 Volumenteilen Ethanol mit 30 Volumenteilen Wasser („70% Ethanol") gewaschen. Anschließend werden die Bedingungen umgekehrt; beispielsweise wird die Konzentration des Chaotrop verringert, um die an das MGP-Teilchen gebundene DNA oder RNA zu eluieren. Dies erfolgt vorzugsweise durch Pelletieren der magnetischen Glasteilchen, beispielsweise mittels Schwerkraft oder durch Verwendung eines Magneten, sowie Resuspendieren in einer Lösung mit keinem oder nur einer geringen Menge an Chaotrop. als Alternative kann die Lösung mit einer Lösung, die kein oder nur eine geringe Menge Chaotrop enthält, verdünnt werden. Die gereinigte DNA oder RNA läßt sich nun für weitere Reaktionen einsetzen. Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Herstellungsverfahren für die MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Dabei versteht man unter einem Glas gemäß der vorliegenden Erfindung ein amorphes Material, das Silizium enthält. Glas kann auch weitere Materialien, wie z.B. B2O3 (0–30%) , Al2O3 (0–20%), CaO (0–20%), BaO (0–10%), K2O (0–20%), Na2O (0–20%), MgO (0–18%), Pb2O3 (0–15%) enthalten. Glas kann auch einen geringeren Prozentanteil (0–5%) einer Reihe anderer Oxide, wie z.B. Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO, CoO usw. enthalten.
  • Bevorzugt gemäß der vorliegenden Erfindung sind vor allem Glase, die unter Verwendung des in der WO 96/41811 beschriebenen Gel-Sol-Prozesses gebildet und anschließend getrocknet und komprimiert werden. Die Grundprinzipien dieses Prozesses sind bekannt und wurden beispielsweise in C.J. Brinker, G.W. Scherer „Sol Gel Science – The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, Lisa C. Klein, Hrsg. Kluwer Academic Publishers 1994, S. 450 ff und in DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041, DE-A-4217432 und WO 96/41811 beschrieben. Im Prinzip werden bei dem Gel-Sol-Prozeß Alkoxide netzwerkformender Komponenten, z.B. SiO2, B2O3, Al2O3, TiO2, ZrO2, GeO2, mit Oxiden und Salzen anderer Bestandteile, beispielsweise in einer Alkohollösung, kombiniert und dann hydrolisiert. Die unten angegebene Gleichung beschreibt die Verfahrensweise zur Herstellung von Natriumboraluminiumsilikat-Glas:
  • Figure 00150001
  • Zum Start des Hydrolyseprozesses der Ausgangskomponenten wird Wasser zugegeben. Die Reaktion läuft relativ schnell ab, da die Alkaliionen eine katalytische Wirkung auf die Geschwindigkeit der Hydrolyse des Kieselsäureesters ausüben. Sobald sich das Gel gebildet hat, kann es mittels eines thermischen Prozesses unter Bildung von Glas getrocknet und verdichtet (oder kondensiert) werden.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Glasmatrix durch säure- oder basenkatalysierte Sol-Gel-Synthese hergestellt, wie es schematisch in 1 und 2 sowie ausführlich in Beispiel 1 beschrieben ist. Hierbei werden kolloidale Systeme verwendet, wobei zunächst die festen Bestandteile in der flüssigen Phase dispergiert werden (= Sol), wobei sie nach der Prozessierung wie ein Honigwabenmuster miteinander verbunden sind (= Gel). Die Zusammensetzung des Glases (Code EJ), wie aus der Menge der Edukte berechnet, betrug 70,67 Mol-% SiO2, 14,33 Mol-% B2O3, 5,00 Mol-% Al2O3, 4,00 Mol-% K2O, 2,00 Mol-% CaO, 4,00 Mol-% ZnO. Die Zusammensetzung des Glases (Code RN) betrug 74 Mol-% SiO2, 15 Mol-% B2O3, 5,00 Mol-% Al2O3, 4,00 Mol-% K2O, 2,00 Mol-% CaO. Die Zusammensetzung des Glases (Code EP) betrug 73,61 Mol-% SiO2, 14,93 Mol-% B2O3, 5,21 Mol-% Al2O3, 4,17 Mol-% K2O, 2,08 Mol-% CaO.
  • Die Reaktion kann wie folgt beschrieben werden: entweder säurekatalysiert, z.B.: BCl3 + 3 H2O → B(OH)3 + 3 H(+)Cl(–) AlG3 + 3 H2O → Al(OH)3 + 3 H(+)Cl(–) SiCl4 + 4 H2O → Si(OH)4 + 4 H(+)Cl(–) Na(+)NO3 (–) + H2O → Na(+)OH(–) + H(+)NO3 (–) K(+)(–)OOCCH3 + H2O → K(+)OH(–) + H(+)(–)OOCCH3 oder Alkali-katalysiert, z.B. K(+)(–)OCH2CH3 + H2O → K(+)OH(–) + HOCH2CH3 Na(+)(–)OCH3 + H2O → Na(+)OH(–) + HOCH3 Al(3+)[(–)OCH2CH2CH3]3 + 3 H2O → Al(OH)3 + 3 HOCH2CH2CH3 B(OCH2CH3)3 + 3 H2O → B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
  • Die verschiedenen Hydroxide kondensieren an die entsprechenden Oxide, die ein dreidimensionales Netzwerk bilden, nämlich die amorphe Glasmatrix aus SiO2/B2O3/Al2O3, wobei Metallionen die Zwischengitterplätze belegen. Zusätzlich zu den oben aufgeführten Alkali- und Erdalkalimetallionen können Übergangsmetallionen, wie z.B. Zn2+ und Zr2+ in die Matrix als netzwerkmodifizierende Agenzien eingebaut werden.
  • Figure 00170001
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das Glas mit im Fachgebiet bekannten Verfahren durch Schmelzen des Rohmaterials SiO2 und von Carbonaten der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Na2CO3, K2CO3 oder CaCO3 hergestellt werden.
  • Die Reaktion kann wie folgt beschrieben werden: Na2CO3 + SiO2 → Na2SiO3 (= Na2O·SiO2) + CO2 ↑ K2CO3 + SiO2 → K2SiO3 (= K2O·SiO2) + CO2 ↑ CaCO3 + SiO2 → CaSiO3 (= CaO·SiO2) + CO2 ↑
  • In den meisten Fällen liegt jedoch keine reine Silikatmatrix, sondern eine Borat-Aluminat-Silikatmatrix vor, d.h. hinsichtlich des netzwerkbildenden Bestandteils ist ein Teil des SiO2 durch B2O3 und Al2O3 substituiert.
  • Das Sol:Pigment-Verhältnis hat eine beträchtliche Auswirkung auf die Ausbeute an durch die folgende Erfindung bereitgestellten magnetischen Teilchen. Für den Prozeß ist es wesentlich, daß sich das Sol noch pumpen und sprühen läßt, was im Können des Fachmanns liegt.
  • Um ein Pulver zu erzeugen, wird die Aufschlämmung vorzugsweise durch eine Sprühdüse für zwei Flüssigkeiten gesprüht, wie in 1 und in Beispiel 1.3 beschrieben. Geeignete Systeme zur Sprühtrocknung werden von der Firma Nubilosa Molekularzerstäubung, Ladisch GmbH & Co. KG, Konstanz, Deutschland, z.B. der „Labor-Zerstäubungstrockner (Typ LTK)", oder von der Firma Büchi AG, Uster, Schweiz, z.B. der Mini Spray Dryer (Typ B-191), hergestellt.
  • Da die Verhältnisse der Durchmesser der magnetischen Kerne zum Glasmantel weniger als 1 bis 10, vorzugsweise zwischen 1:10 und 1:1000, betragen, bestimmen nicht die Geometrie und Anzahl der eingebauten magnetischen Kerne oder ihrer inerten Träger die Form und Größe der Teilchen, sondern die Bedingungen der Herstellung, insbesondere die Bedingungen während der Sprühtrocknung. Mit anderen Worten sind die Wahl des Druckes, der Eingangstemperatur, der Ausgangstemperatur und der Fließgeschwindigkeit während des Sprühtrocknungsverfahrens die Freiheitsgrade, die die Größenverteilung, die Form der Glastropfen bestimmen und damit die MGPs modifizieren. Wird der Sprühdruck erhöht, so verschiebt sich die Größenverteilung in den Sub-μ-Bereich. Die reduzierte Temperatur des Sprühtrocknungsprozesses führt zu einer langsameren Verdampfung des Lösungsmittels, wodurch die Form der MGPs einer idealen Kugelform näher kommt, d.h. das Verhältnis der Radien in der xy- bzw. xz-Ebene wird ungefähr 1. Das Verhältnis der Radien variiert zwischen 0,8 und 1,2, vorzugsweise zwischen 0,9 und 1,1. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Sprühdüsen beheizt. Die Eingangstemperatur liegt zwischen 120°C und 500°C, vorzugsweise zwischen 170°C und 230°C oder 150°C und 230°C, am stärksten bevorzugt zwischen 150°C und 200°C oder 190°C und 210°C oder bei 200°C oder etwas darunter. Die Ausgangstemperatur hängt vom Kochpunkt des Sols und damit vom Lösungsmittel ab und kann oberhalb, auf gleicher Höhe oder leicht d.h. weniger als 10°C, unterhalb des Kochpunkts des Lösungsmittels liegen. Wird Ethanol als Lösungsmittel verwendet, so liegt sie zwischen 50°C und 300°C, vorzugsweise 70°C und 150°C, am stärksten bevorzugt zwischen 80°C und 110°C. Die optimale Temperatur liegt zwischen 90°C und 100°C. Der Sprühdüsendruck beträgt mehr als 3 Bar, und wird vorzugsweise auf 4 bis 6 Bar reguliert. Der Fachmann ist sich der Tatsache bewußt, daß die genauen Parameter von dem verwendeten Sprühtrocknungssystem abhängen. Er ist jedoch in der Lage, die Lehren der vorliegenden Erfindung auf jede andere Art von Sprühtrocknung zu übertragen und unter Berücksichtigung der Offenbarungen der vorliegenden Erfindung die Parameter herauszufinden. Dabei können Formeln, wie sie in Masters: Spray Drying Handbook, fünfte Auflage, John Wiley & Sons, 1991, New York, beschrieben sind, den Weg weisen, um herauszufinden, welche Parameter für einen anderen Ansatz gewählt werden müssen. Vorzugsweise wird er dabei die Handbücher seines Sprühtrocknungssystems konsultieren oder mit dem technischen Service des Herstellers des Sprühtrocknungssystems Kontakt aufnehmen.
  • Zur Optimierung der Ausbeute sollte die Verdichtungs- oder Sintertemperatur so hoch wie möglich liegen, d.h. leicht unterhalb des Schmelzbereichs. Liegt sie jedoch zu hoch, so kleben die Teilchen aneinander und bilden Agglomerate, die ausgesiebt werden müssen. Liegt sie zu niedrig, so werden die MGPs nicht optimal verdichtet. Eine zusätzliche Behandlung der Partikel bei einer zu hohen Temperatur führt zu einem Verlust der magnetischen Eigenschaften. Daher sollten zu hohe Temperaturen ausgeschlossen werden. Die genauen Temperaturen hängen von der Glaszusammensetzung ab, können jedoch zwischen 400°C bis 1200°C liegen. Bei der EJ-Glaszusammensetzung liegt die Sintertemperatur zwischen 720°C und 770°C, vorzugsweise um 750°C. Es liegt im fachmännischen Können, die Temperaturen für jede Glaszusammensetzung unter Berücksichtigung der Lehren der vorliegenden Erfindung herauszufinden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das sprühgetrocknete MGP-Pulver weiter bearbeitet werden, wie in 2 dargestellt und in Beispiel 1.4 beschrieben. Vorzugsweise wird das Pulver eine Stunde bei 200°C erhitzt, gegebenenfalls auf Raumtemperatur abgekühlt und auf 750°C (Verdichtungs- oder Sintertemperatur) in einer Stickstoffatmosphäre mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 K/min erhitzt und 1 Stunde bei dieser Temperatur gehalten. Danach wird der Ofen auf 150°C abgekühlt und wiederum eine Stunde in Luft auf 200°C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Pulver auf ein Sieb (50 μm) übertragen und 30 min gesiebt. Die gesiebte Probe wird in Flaschen abgefüllt und 4 h bei 200°C sterilisiert und anschließend auf 80°C abgekühlt. Danach werden die Glasgefäße aus dem Ofen genommen, mit steriler Folie abgedeckt und verschlossen.
  • Überraschenderweise eignen sich die erfindungsgemäß bereitgestellten magnetischen Teilchen vor allem zur Isolierung von biologischen Materialien aus Proben. Darüber hinaus handelt es sich bei dem Kernmaterial um einen natürlichen Rohstoff, das daher nur wenig ökologische Bedenken auslöst. Zudem sind die erfindungsgemäßen Teilchen kostengünstig und leicht herzustellen.
  • Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist eine Verfahrensweise zur Isolierung eines biologischen Materials durch Inkontaktbringen einer das biologische Material in einer Flüssigkeit enthaltenden Probe mit den erfindungsgemäßen magnetischen Teilchen unter Bedingungen, unter denen das biologische Material an die Teilchenoberfläche bindet, und Trennen des biologischen Materials von der Flüssigkeit. Erfindungsgemäß versteht man unter dem Begriff „in einer Flüssigkeit", daß Flüssigkeit vor Zugabe der magnetischen Teilchen zu der Probe gegeben werden kann. Es soll jedoch auch die Situation umfaßt sein, in der die Probe selbst eine geringe Viskosität aufweist und selbst eine Flüssigkeit darstellt, so daß keine zusätzliche Flüssigkeit bzw. kein zusätzlicher Puffer zu der Probe für die Probenpräparation zugegeben werden muß, was durch Zugabe von Feststoffen vor Zugabe der magnetischen Glasteilchen erfolgen kann. Die Reihenfolge der Zugabe von Reagentien kann entsprechend den Prozeßerfordernissen variieren.
  • Unter biologischen Materialien versteht man Materialien mit einer bestimmten oder molekularen Basis. Dazu gehören insbesondere Zellen, wie z.B. Viren oder Bakterien, ebenso wie isolierte Zellen aus vielzelligen Organismen, wie z.B. menschliche und tierische Zellen, wie beispielsweise Leukozyten, sowie immunologisch aktive niedrigmolekulare und hochmolekulare chemische Verbindungen, wie z.B. Haptene, Antigene, Antikörper und Nukleinsäuren. Bevorzugt sind vor allem Nukleinsäuren, wie z.B. DNA oder RNA. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Gemische aus spezifischen Nukleinsäuren aufgereinigt, wobei es sich bei der bzw. den Zielnukleinsäure(n) hinsichtlich der Konzentration um einen Nebenbestandteil handeln kann (oder wobei die Zielnukleinsäure(n) in geringer Menge vorhanden sein kann (können)). Erfindungsgemäß soll es sich bei einer Zielnukleinsäure um die interessierende Nukleinsäure, d.h. eine Nukleinsäure, die untersucht werden soll, handeln, da ihre Gegenwart ein bestimmtes Leiden oder eine bestimmte Krankheit bei einem Menschen oder einem Tier anzeigt. So zeigt beispielsweise das Vorhandensein einer Virussequenz (z.B. von Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus oder dem menschlichen Immunschwächevirus) an, daß das entsprechende Individuum mit dem spezifischen Virus infiziert ist. In diesem Fall würde diese Virussequenz die Zielsequenz darstellen. Andere Zielsequenzen sind Sequenzen, die eine Prädisposition eines Individuums gegenüber einer bestimmten Krankheit, wie beispielsweise einer Erbkrankheit, wie z.B. Sichelzellanämie, oder gegenüber gewissen Krebserkrankungen anzeigen. Diese Beispiele sollten der Veranschaulichung der Erfindung dienen, jedoch keine Beschränkung der letzteren darstellen.
  • Zu den erfindungsgemäßen Proben gehören klinische Proben, wie z.B. Blut, Serum, Mundspülungen, Urin, Liquor, Speichel, Stuhl, Biopsieproben und Knochenmarksproben. Bei der Probe kann es sich auch um eine für die Umweltanalyse, Lebensmittelanalyse oder molekularbiologische Forschung verwendete Probenart handeln, beispielsweise aus Bakterienkulturen, Phagenlysaten und Produkten von Amplifikationsverfahren, wie z.B. der PCR.
  • Die beschriebene Verfahrensweise läßt sich zur Isolierung von nativem oder modifiziertem biologischem Material einsetzen. Unter nativem biologischem Material versteht man Material, dessen Struktur verglichen mit den natürlich vorkommenden biologischen Materialien nicht irreversibel verändert wurde. Dies bedeutet jedoch nicht, daß andere Bestandteile der Probe nicht modifiziert werden können. Zu den modifizierten biologischen Materialien gehören Materialien, die nicht in der Natur vorkommen, beispielsweise Nukleinsäuren, die modifiziert werden, indem daran Gruppen gebunden werden, die reaktiv, nachweisbar oder zur Immobilisierung fähig sind. Ein Beispiel hierfür sind biotinylierte Nukleinsäuren.
  • In bestimmten Fällen kann die Probe ohne Vorbehandlung im erfindungsgemäßen Isolierungsverfahren verwendet werden. In vielen Fällen sollte jedoch die Probe mit einem entsprechenden Verfahren lysiert werden, wobei das in der Probe enthaltene biologische Material freigesetzt wird. Verfahrensweisen zur Lysierung von Proben sind dem Fachmann bekannt und können chemischer, enzymatischer oder physikalischer Natur sein. Dabei kann ebenso eine Kombination aus diesen Verfahrensweisen angewandt werden. So läßt sich beispielsweise die Lyse unter Verwendung von Ultraschall, hohem Druck, durch Scherkräfte, unter Verwendung von Alkali, Detergentien oder chaotropen Salzlösungen oder mittels Proteinasen oder Lipasen durchführen. Hinsichtlich des Lyseverfahrens zur Gewinnung von Nukleinsäuren wird insbesondere auf Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY und Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY, verwiesen.
  • Zusätzlich zum zu isolierenden biologischen Material kann die Probe auch andere Bestandteile in einer Flüssigkeit enthalten, wie beispielsweise Zelltrümmer, Proteine, Salze oder andere Substanzen, die nicht isoliert werden sollen. Diese Probe, die vorzugsweise das biologische Material in nativer Form enthält, wird mit den Teilchen unter Bedingungen, bei denen das biologische Zielmaterial an die Teilchenoberfläche bindet, in Kontakt gebracht. Die Bedingungen dafür hängen von der Art des beteiligten biologischen Materials ab, sind jedoch im wesentlichen bekannt. Sie hängen auch von dem Verfahren ab, mit dem das biologische Material an die Oberfläche gebunden wird. Werden beispielsweise zur Bindung immunologische Wechselwirkungen genutzt, so müssen Bedinungen ausgewählt werden, die für die Bildung von Immunkomplexen geeignet sind. Werden modifizierte Nukleinsäuren verwendet, so kann die Bindung über diejenigen Gruppen der Nukleinsäuren, welche die Modifikation repräsentieren, erfolgen, z.B. Biotin über die Bindung mit Streptavidin beschichteten Oberflächen. Allerdings ist insbesondere bei Nukleinsäuren eine direkte Bindung von Nukleinsäuren an Glas bevorzugt, da neben anderen Gründen die Nukleinsäuren nicht modifiziert werden müssen und selbst native Nukleinsäuren gebunden werden können. Die Verfahrensweise zur Bindung nativer Nukleinsäuren an Glasteilchen kann analog zu der im Stand der Technik beschriebenen Verfahrensweise erfolgen. Sie wird vorzugsweise in Gegenwart chaotroper Salze in einer Konzentration zwischen 2 und 8 mol/l und vorzugsweise zwischen 4 und 6 mol/l durchgeführt. Bei den chaotropen Salzen kann es sich um Natriumiodid, Natriumperchlorat, Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorit handeln. Andere Verbindungen sind ebenso möglich.
  • Um die Probe mit den Teilchen in Kontakt zu bringen, wird die Probe mit den Teilchen gemischt und über einen für das Stattfinden der Bindung ausreichenden Zeitraum inkubiert. Dem Fachmann ist normalerweise die Dauer des Inkubationsschritts von Verfahrensweisen zur Durchführung einer Behandlung mit nichtmagnetischen Teilchen eher geläufig. Dieser Schritt läßt sich dadurch optimieren, daß man die Menge des immobilisierten biologischen Materials auf der Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Dabei können Inkubationszeiten zwischen 10 Sekunden und 30 Minuten für Nukleinsäuren geeignet sein.
  • Je nach Größe und Art der magnetischen Teilchen werden die Teilchen entweder während der Inkubationszeit selbst aus der Flüssigkeit abgetrennt oder die Suspension bleibt über einen längeren Zeitraum intakt. Falls die Teilchen sehr klein und nichtmagnetisiert sind, bleibt die Suspension über einen längeren Zeitraum intakt. Sind die Teilchen größer, so trennen sich die Teilchen langsam während der Inkubatinszeit aus der Flüssigkeit ab.
  • Vorzugsweise wird die Immobilisierung nicht über eine Präzipitation durch Absenken der Löslichkeit der zu immobilisierenden Materialien durchgeführt. Vielmehr beruht die Immobilisierung auf biospezifischen Wechselwirkungen (Einfangmolekülen) oder Adsorption. Dies verhindert weitgehend den nichtspezifischen Einschluß von Verunreinigungen.
  • Nach der Inkubation wird das biologische Material von der Flüssigkeit getrennt. Dies erzielt man im allgemeinen dadurch, daß das an die magnetischen Teilchen gebundene Material durch Anlegen eines Magnetfelds abgetrennt wird. So lassen sich die magnetischen Teilchen beispielsweise an die Wand des Gefäßes, in dem die Inkubation durchgeführt wurde, ziehen. Anschließend kann die den Probeninhalt, der nicht an die magnetischen Teilchen gebunden wurde, enthaltende Flüssigkeit abgetrennt werden. Das verwendete Abtrennverfahren hängt von der Art des Gefäßes, in dem die Inkubation durchgeführt wurde, ab. Zu geeigneten Schritten gehört das Abtrennen der Flüssigkeit über Pipettieren oder Absaugen.
  • Die magnetischen Teilchen lassen sich dann ein- oder mehrmals auf reinigen, wobei, falls gewünscht, eine Waschlösung verwendet wird. Dabei wird eine Waschlösung verwendet, die nicht dazu führt, daß das biologische Material von der Teilchenoberfläche freigesetzt wird, sondern mit der die unerwünschten Verunreinigungen so gründlich wie möglich weggewaschen werden. Dieser Waschschritt erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man die Waschlösung mit den Teilchen inkubiert. Während dieses Schritts werden die Teilchen vorzugsweise resuspendiert, beispielsweise mittels Schütteln oder durch Anlegen eines Magnetfeldes, das mit dem ersten Magnetfeld nicht identisch ist. Die kontaminierte Waschlösung wird vorzugsweise genau wie die Probe in dem oben für die Bindung des biologischen Materials beschriebenen Schritt abgetrennt.
  • Nach dem letzten Waschschritt können die magnetischen Teilchen kurz im Vakuum getrocknet werden, oder man läßt die Flüssigkeit verdampfen. Es kann auch ein Vorbehandlungsschritt mit Aceton durchgeführt werden. Falls gewünscht, läßt sich das gereinigte biologische Material auf diese Weise von den magnetischen Teilchen trennen. Dieser Schritt hängt auch von der Art, in der das biologische Material an die magnetischen Teilchen gebunden wurde, ab. Falls es sich bei dem biologischen Material um native Nukleinsäuren und bei den magnetischen Teilchen um glasbeschichtete Teilchen handelt, so lassen sich die Nukleinsäuren von den erfindungsgemäßen Teilchen unter Verwendung eines Elutionspuffers mit einem geringen Salzgehalt abtrennen. Puffer dieser Art sind aus der DE 3724442 sowie aus Analytical Biochemistry 175, 196–201 (1988) bekannt. Bei den Elutionspuffern mit einem geringen Salzgehalt handelt es sich insbesondere um Puffer mit einem Gehalt von weniger als 0,2 mol/l. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Elutionspuffer Tris. In einer weiteren speziellen Ausführungsform handelt es sich bei dem Elutionspuffer um entmineralisiertes Wasser.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird die beschriebene Verfahrensweise zur Reinigung und Isolierung durchgeführt, nachdem die Zellen (z.B. Viruspartikel oder prokaryontische oder eukaryontische Zellen) immunmagnetisch von einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe getrennt sind. Bei diesem Schritt wird die Probe beispielsweise unter Schütteln mit magnetischen Teilchen, an die ein Antikörper gegen ein Antigen auf der Zelle immobilisiert ist, inkubiert. Bei diesen Teilchen kann es sich um erfindungsgemäße Teilchen oder um im Handel erhältliche Teilchen (z.B. MACS Microbeads der Firma Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland) handeln. Nach Anlegen eines Magnetfeldes werden ein oder mehrere Waschschritte unter Verwendung einer Kochsalzlösung durchgeführt. Es werden Teilchen erhalten, an die die gewünschten Zellen gebunden sind. Die gebundenen Zellen werden dann in einem Salzpuffer resuspendiert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Salzpuffer um eine chaotrope Salzlösung, so daß die in der Zellen enthaltenen Nukleinsäuren aus den Zellen freigesetzt werden.
  • Eine ganz besonders vorteilhafte Verfahrensweise zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen enthaltenden Proben wird dadurch erhalten, daß man die oben beschriebene Isolierung von Zellen mit der ebenso oben beschriebenen Isolierung von Nukleinsäuren auf den erfindungsgemäßen magnetischen Teilchen kombiniert. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in ihrer potentiellen Einfachheit (Ein-Röhrchen-Verfahren), hohen Empfindlichkeit (ganz besonders wichtig in der medizinischen Mikrobiologie und Onkologie) sowie der Leichtigkeit, mit der sie sich automatisieren läßt.
  • Die mit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise isolierten biologischen Materialien können nun falls notwendig weiter verwendet werden. So lassen sie sich beispielsweise als Substrat bei verschiedenen enzymatischen Reaktionen einsetzen. Sind Nukleinsäuren beteiligt, so können diese zur Sequenzierung, radioaktiven oder nicht radioaktiven Markierung, Amplifikation einer oder mehrerer der darin enthaltenen Sequenzen, Transkription, Hybridisierung mit markierten Sondennukleinsäuren, Translation oder Ligation verwendet werden. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahrensweise besteht darin, daß das biologische Material sehr leicht von der Flüssigkeit getrennt werden kann. Im Stand der Technik wurde zur Trennung der Glasteilchen von Verunreinigungen ein Zentrifugationsschritt verwendet, oder es wird, wenn das biologische Material an Glasfaserfilter gebunden ist, die Flüssigkeit durch die Filter gezogen. Dies stellt einen limitierenden Schritt dar, der es schwer macht, große Probenmengen zu bearbeiten. Die biologischen Materialien lassen sich unter Verwendung der erfindungsgemäßen Teilchen wirksamer von Verunreinigungen trennen. Insbesondere können Inhibitoren bei bestimmten enzymatischen Reaktionen erfindungsgemäß weitgehend abgetrennt werden.
  • In der bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Teilchen zu dem Lysegemisch gegeben. Nach einer geeigneten Zeitspanne, um die Adsorption stattfinden zu lassen – was durch mechanische Bewegung optimiert werden kann – werden die Teilchen von der umgebenden Flüssigkeit, die zusätzliche Zellbestandteile, die nicht nachgewiesen werden sollen, enthält, getrennt. Dies erfolgt vorzugsweise durch Anlegen eines Magnetfeldes, indem ein Magnet gegen die Gefäßwand planiert wird.
  • Zur Abtrennung eventuell noch vorhandener Verunreinigungen wird vorzugsweise ein Waschschritt mit einer Flüssigkeit, die nicht dazu führt, daß die zu bestimmenden Nukleinsäuren von der Glasoberfläche freigesetzt werden, durchgeführt. Zur Abtrennung der Nukleinsäuren von der Glasoberfläche wird ein Elutionspuffer mit Reagenzbedingungen, unter denen die Nukleinsäuren von der Glasoberfläche getrennt werden, zugegeben. Bei diesen Bedingungen handelt es sich insbesondere um Niedrigsalzbedingungen. Je nach der vorgesehenen weiteren Verwendung der Nukleinsäuren kann die Flüssigkeit nun von den Teilchen getrennt und weiter bearbeitet werden. Dieser Trennschritt erfolgt vorzugsweise über das Anlegen eines Magnetfelds, so daß die Teilchen von dem Eluat getrennt werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der MGPs der vorliegenden Erfindung in automatisierbaren Verfahren, wie beispielsweise in der WO 99/16781 beschrieben.
  • Automatisierbares Verfahren bedeutet, daß die Schritte des Verfahrens zur Durchführung mit einer Vorrichtung oder einer Maschine, die mit geringer oder keiner äußeren Kontrolle oder Beeinflussung durch den Menschen betrieben werden kann, geeignet sind. Automatisiertes Verfahren bedeutet, daß die Verfahrensschritte mit einer Vorrichtung oder Maschine, die mit geringer oder keiner äußeren Kontrolle oder Beeinflussung durch den Menschen betrieben werden kann, durchgeführt werden. Lediglich die Präparationsschritte für das Verfahren müssen eventuell von Hand durchgeführt werden; beispielsweise müssen die Aufbewahrungsbehälter aufgefüllt und in Position gebracht werden, die Wahl der Proben muß von einem Menschen durchgeführt werden ebenso wie weitere, dem Fachmann bekannte Schritte, beispielsweise der Betrieb des Kontrollrechners. Die Vorrichtung bzw. Maschine kann beispielsweise automatisch Flüssigkeiten zugeben, die Proben mischen oder Inkubationsschritte bei bestimmten Temperaturen durchführen. Typischerweise handelt es sich bei einer solchen Maschine oder Vorrichtung um einen von einem Rechner gesteuerten Roboter, wobei der Rechner ein Programm ausführt, in dem die einzelnen Schritte und Befehle aufgeführt sind. Als automatische Verfahren bevorzugt sind solche, die in einem Hochdurchsatzformat durchgeführt werden, was bedeutet, daß die Verfahren sowie die verwendete Maschine oder Vorrichtung für einen hohen Durchsatz von Proben in kurzer Zeit optimiert sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung in einem halbautomatischen Prozeß verwendet, was bedeutet, daß einige Reaktionsschritte eventuell von Hand ausgeführt werden müssen. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung enthaltende Suspension einem Aufbewahrungsbehälter entnommen, und Teilvolumen werden in unterschiedliche Reaktionsgefäße gegeben. Bei den Reaktionsgefäßen kann es sich um aus Kunststoff hergestellte Reaktionsröhrchen, eventuell im Mikrotiterplattenformat mit 96 oder 384 oder mehr Vertiefungen, in denen eine Reaktion durchgeführt werden kann, handeln. Diese Gefäße können jedoch auch aus einem anderen Material, beispielsweise aus Stahl, hergestellt werden.
  • Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform sind Reinigungsverfahren mit anschließendem Nachweisschritt oder Reinigungsverfahren mit einem anschließenden Amplifikations- und Nachweisschritt. Die Zielnuklein- oder interessierende Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren kann bzw. können in einer Matrix von Nicht-Zielnukleinsäuren enthalten sein und sogar in dem besagten Gemisch spezifischer Nukleinsäuren einen Nebenbestandteil darstellen. Geeignete DNA-Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt und in Standardlehrbüchern, wie etwa Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY und Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY, beschrieben. Es können auch weitere Reinigungsschritte vor Durchführung des DNA-Nachweisschritts erfolgen, wie z.B. ein Präzipitationsschritt. Zu den Nachweisverfahren gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Bindung oder Interkalierung spezifischer Farbstoffe, wie etwa Ethidiumbromid, das in die doppelsträngige DNA interkaliert und seine Fluoreszenz danach ändert. Die gereinigte DNA kann auch mit elektrophoretischen Verfahren, gegebenenfalls nach einer Restriktionsverdauung, getrennt und anschließend sichtbar gemacht werden. Es gibt auch Tests auf Sondenbasis, bei denen eine Oligonukleotidhybridisierung an spezifische Sequenzen sowie der nachfolgende Nachweis des Hybrids verwendet wird. Ebenso besteht die Möglichkeit, die DNA nach weiteren, dem Fachmann bekannten Schritten zu sequenzieren. Bei neueren Verfahren werden verschiedenartige DNA-Sequenzen auf einen Siliziumchip aufgetragen, an den spezifische Sonden gebunden sind, die ein Signal erzeugen, wenn komplementäre Sequenzen binden.
  • Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Verfahren gehören Amplifikationsverfahren, wie etwa die Ligasekettenreaktion und die Polymerasekettenreaktion, die spezifisch Zielsequenzen auf nachweisbare Mengen amplifizieren. Zu den besonders bevorzugten Nachweisverfahren gehören das in der WO 92/02638 sowie den entsprechenden US-Patenten US 5,210,015 , US 5,804,375 , US 5,487,972 offenbarte TaqMan®-Verfahren. Bei diesem Verfahren wird die Exonukleaseaktivität einer Polymerase zur Erzeugung eines Signals genutzt. Im einzelnen wird dabei die Nukleinsäure durch einen Prozeß nachgewiesen, bei dem man die Probe mit einem eine zu einem Bereich der Zielnukleinsäure komplementäre Sequenz enthaltenden Oligonukleotid sowie einem eine zu einem zweiten Bereich des gleichen Zielnukleinsäuresequenzstrangs komplementäre Sequenz, die jedoch nicht die durch das erste Oligonukleotid definierte Nukleinsäuresequenz enthält, enthaltenden markierten Oligonukleotid in Kontakt bringt, so daß unter Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch aus Duplexen erzeugt wird, wobei die Duplexe die an das erste Oligonukleotid und an das markierte Oligonukleotid gebundene Zielnukleinsäure umfassen, so daß das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids unmittelbar neben dem 5'-Ende des markierten Oligonukleotids liegt. Anschließend wird dieses Gemisch mit einer matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase mit einer 5'-3'-Nukleaseaktivität behandelt, und zwar unter Bedingungen, die ausreichen, um die Spaltung des gebundenen, markierten Oligonukleotids und Freisetzung markierter Fragmente durch die 5'-3'-Nukleaseaktivität der Polymerase zu gestatten; dabei wird das durch die Hydrolyse des markierten Oligonukleotids erzeugte Signal nachgewiesen und/oder gemessen. Aufgrund der TaqMan®-Technologie braucht kein Festphasen-gebundener Reaktionskomplex mehr gebildet und nachweisbar gemacht werden.
  • Allgemeiner ausgedrückt wird eine Verfahrensweise zur Reinigung von biologischem Material mit einem anschließenden Nachweisschritt offenbart, wobei es sich bei der Amplifikations- und/oder Nachweisreaktion um einen homogenen Lösungsphasen-Multiplex-Assay für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Ziele handelt (siehe Beispiel 7.2).
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das beschriebene Reinigungsverfahren mit einem Amplifikationsverfahren unter Verwendung einer der im folgenden beschriebenen Verfahren, vorzugsweise der Verwendung blockierender Oligonukleotide kombiniert. Ein häufig im Zusammenhang mit der Amplifikation vor allem geringer Mengen an Zielnukleinsäure auftretendes Problem ist die Aktivität temperaturstabiler Polymerasen bei relativ niedrigen Temperaturen (Raumtemperatur bis zu 40°C). Bei dieser Temperatur binden Primer-Oligonukleotide häufig unspezifisch aneinander oder an Hintergrundnukleinsäure und können durch die Polymerase verlängert werden. Dies führt zu einer Abnahme an Reaktionskomponenten ebenso wie zu einem höheren Niveau an Hintergrundsignal und infolgedessen zu einer reduzierten Empfindlichkeit. Ebenso können dadurch falsch-positive Ergebnisse hervorgerufen werden. Mehrere Ansätze zur Vermeidung unspezifischer Aktivität von Polymerasen sind beschrieben worden, wie etwa „Hot Start"-PCR (Chou et al., 1992, Nucl. Acid Res 20, 1717–1723), kovalent modifizierte Polymerasen (z.B. AmpliTaq Gold, Perkin Elmer) oder Antikörper (Scalice et al., J Immunol. Methods, 172, 147–163, 1994) sowie Oligonukleotide (Dang und Jayasena, JMB 264, 268–278, 1996; US 5,763,173 ; US 5,693,502 ). Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen unter blockierenden Oligonukleotiden Oligonukleotide verstanden werden, die in der Lage sind, das aktive Zentrum der Polymerasen bis zu der genannten Temperatur zu blockieren. Bei diesen Oligonukleotiden kann es sich beispielsweise um ein Aptamer handeln, wie in Beispiel 7.2.2.1.3. beschrieben.
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können Aptamere (siehe z.B. in Beispiel 7.2.2.1.3.) und/oder modifizierte Primer allein (siehe z.B. in Beispiel 7.2.2.1.3.) in einer Amplifikationsreaktion und den damit verbundenen Nachweisverfahren eingesetzt werden. Dies hat vorteilhafte Auswirkungen und kann für sich allein als Erfindung betrachtet werden, die zu besseren Ergebnissen führt. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die 3'-terminale Nukleobase, vorzugsweise ein Adenin, mit einem p-(tert-Butyl)-benzylrest modifiziert. Weitere Modifikationen, einschließlich solchen an der 3'-1-Position, sind in der EP 866 071 A2 , die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben.
  • In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform zur Reinigung von biologischem Material mit einem anschließenden Nachweisschritt wird offenbart, wobei für mindestens 5 Zyklen der Polymerase Kettenreaktion die Annealing-Temperatur weniger als 8°C, vorzugsweise weniger als 3°C, oberhalb der Dissoziationstemperatur des Polymerase-Aptamer-Komplexes liegt.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
  • Figurbeschreibungen:
  • 1: Fließdiagramm für die Herstellung mittels Sol-Synthese und Sprühtrocknung:
  • 2: Fließdiagramm zur Herstellung der rohen MGPs
  • 3: Schematische Darstellung des von der Firma Nubilosa hergestellten Sprühtrockners. Die Einzelheiten sind im Text unter Beispiel 1.3 beschrieben
  • 4: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit Merck-Pigment BM
  • 5: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit CERAC-Pigment
  • 6: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit Merck-Pigment MMB
  • 7: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit Strem-Pigment
  • 8: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit BASF-Pigment FA
  • 9: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit BASF-Pigment CE-HQ
  • 10: Hochaufgelöste Rasterelektronenmikroskopaufnahme von MGP mit BASF-Pigment CE-SU
  • 11: Einfluß des magnetischen Kernpigments bzw. des Sprühtrockners auf die RNA-Isolierung (Sprühtrockner: Büchi (B) oder Nubilosa (N))
  • 12: Einfluß des Parameters „Sprühdruck" auf die Isolierung von DNA oder RNA
  • 13: Einfluß verschiedener MGP-Herstellungsparameter auf die Isolierung von RNA (Sprühdruck, (L = Luft, N = Stickstoff), Eingangstemperatur (E) oder Ausgangstemperatur (A)
  • 14a, b: Sedimentationsverhalten unterschiedlicher MGPs in unterschiedlichen Suspensionsmedien
  • 15: HREM-Aufnahme der Probe EJ0096.5R-01; MGP mit CERAC-Pigment
  • 16: HREM-Aufnahme von EJ0100.5R-01, gesprüht bei niedrigem Druck und hoher Temperatur, hauptsächlich bestehend aus deformierten Teilchen im μ-Maßstab
  • 1 Beispiel 1: Herstellung der magnetischen Glasteilchen
  • Klassisch werden Rohmaterialien wie etwa SiO2 und Alkali- oder Erdalkalicarbonate (Na2CO3, K2CO3, CaCO3) zusammengeschmolzen
  • Reaktionstyp: Na2CO3 + SiO2 → Na2SiO3 (= Na2O·SiO2) + CO2 ↑ K2CO3 + SiO2 → K2SiO3 (= K2O·SiO2) + CO2 ↑ CaCO3 + SiO2 → CaSiO3 (= CaO·SiO2) + CO2 ↑
  • In den meisten Fällen wird jedoch eine Verbundmatrix aus Silikat, Borat und Aluminat verwendet, d.h. bezüglich der Matrixbestandteile wird SiO2 teilweise durch B2O3 und Al2O3 ersetzt. Als Alternative kann das Glas über eine Sol-Gel-Reaktion synthetisiert werden.
  • Reaktionstyp:
    entweder säurekatalysierte Sol-Gel-Reaktion, z.B. BCl3 + 3 H2O → B(OH)3 + 3 H(+)Cl(–) AlCl3+ 3 H2O → Al(OH)3 + 3 H(+)Cl(–) SiCl4 + 4 H2O → Si(OH)4 + 4 H(+)Cl(–) Na(+)NO3 (–) + H2O → Na(+)OH(–) + H(+)NO3 (–) K(+)(–)OOCCH3 + H2O → K(+)OH(–) + H(+)(–)OOCCH3 oder basenkatalysiert, wie in unserem Fall, z.B.
  • Figure 00350001
  • Vorteil: Alkohole werden leicht während der Sprühtrocknung verdampft; idealerweise keine Umkristallisation von Salzen auf der Oberfläche Somit werden Alkoholate in Hydroxide umgewandelt, aus denen sich über Wasserausschluß die entsprechenden Oxide ergeben. Diese bilden dann eine 3-dimensionale, amorphe Glasmatrix, bestehend aus SiO2/B2O3/Al2O3, in die bestimmte Metalloxidinhaltsstoffe als Matrixbindungsseparatoren eingebettet werden, z.B.
  • Figure 00360001
  • Für die hier beschriebenen Experimente wurde die Glaskomponente über eine basenkatalysierte Sol-Gel-Synthese hergestellt. Dabei war die in allen Experimenten verwendete Glaszusammensetzung (wenn nicht anders angegeben) wie folgt:
    70, 67 Mol% SiO2, 14,33 Mol% B2O3, 5,00 Mol% Al2O3, 4,00 Mol% K2O, 2,00 Mol% CaO, 4,00 Mol% ZnO
    (berechnet aus der Masse bestimmter, zur Reaktion gebrachter Edukte)
  • 1.1 Beschreibung der untersuchten magnetischen Pigmente
  • Unterschiedliche Arten magnetischer Pigmente wurden untersucht und sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
  • 1.2 Herstellung des Beschichtungssols (EJ-Zusammensetzung)
  • Die Edukte werden in der folgenden Reihenfolge und Menge in das beheizbare Rührgefäß gegeben:
    Tetraethoxysilan (TEOS) 10 700 ml
    Triethylborat (TEB) 3305 mlö
    K-Methanolat 25% (W/V) in 1601 ml
    Methanol
    Ethanol 11 292 ml
    Aluminiumisopropanolat 1385 g
    Calcium 54,4 g
    Zinkacetat 498 g
  • Das Gefäß wird danach verschlossen. Das Sol wird auf 70°C erwärmt und über Nacht gerührt (15 h). Die Temperatur wird über einen Temperaturfühler, der in die Flüssigkeit eintaucht, reguliert.
  • Danach wird das Sol auf 90°C erwärmt und das Alkohol/Wasser-Gemisch (Ethanol: 3781 ml, H2O: 1512 ml) mit einer Rate von 5000 ml/h zugegeben. Nach beendeter Zugabe des Gemisches wird das Gefäß auf 20°C abgekühlt.
  • Nach Öffnen des Deckels werden 10 249 g magnetisches Pigment (CERAC) unter heftigem Rühren zugegeben. Das hergestellte Sol wird über einen Schlauch in den Sprühtrockner überführt.
  • 1.3 Sprühtrocknung
  • Die Eingangstemperatur des Sprühtrockners wird auf 200°C reguliert. Der Sprühdüsendruck wird auf 6 bar reguliert und die Sprühdüse 3 min lang mit Ethanol gekühlt.
  • Anschließend wird der Schlauch mit dem Ausgang des Glasbehälters verbunden und das pigmenthaltige Sol mit einer Geschwindigkeit von 110 ml/min über eine Ultraschallvorrichtung (200 W) zu der Zwei-Flüssigkeiten-Sprühdüse (Durchmesser der Öffnung: 2 mm; Lieferfirma: Nubilosa, Typ 1B1VVS1) des Sprühtrockners gepumpt. Das Sprühtrocknungssystem ist schematisch in 3 gezeigt. Die in den ersten beiden Minuten gebildeten Teilchen werden verworfen. Nach vollständigem Versprühen des Sols wird der Behälter unter dem Zyklon (AVO, siehe 3) mit den Teilchen entnommen, und die Partikel werden wie in den nächsten Schritten beschrieben weiterbehandelt.
  • Das pigmenthaltige Sol wird im Rührgefäß gerührt, um das Absetzen der suspendierten Teilchen zu verhindern. Das Sol wird vom Gefäß mit einer Pumpe (SP) zur Sprühdüse überführt. Als Trocknungsgas wird mit einem elektrischen Heizgerät (EWT) erhitzter Stickstoff verwendet. Das beschichtete Pigment wird von der Trockenkammer (T) in den Zyklon (ZY) überführt. Das getrocknete Pulver kann dem Behälter (AVO) unter dem Zyklon entnommen werden. Sehr feine Teilchen werden vom Stickstoff mit einem Filter (SF) abgetrennt. Der Sprühtrockner wird unter Überdruck verwendet, um die Aufnahme von Luft in den Trockner zu verhindern. Der Gasstrom wird von einem Gasgebläse (AV) produziert.
  • 1.4. Weitere Bearbeitung des sprühgetrockneten Pulvers
  • Das Pulver wird in eine Keramikschale überführt und in einem Ofen bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 K/min auf 200°C erhitzt. Anschließend wird die Temperatur eine Stunde bei 200°C gehalten und der Ofen danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Schale wird in einen Atmosphärenofen mit einem Volumen von 27 l überführt, der mit 60 l Stickstoff pro Stunde gespült wird. Der Ofen wird mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 K/min auf 750°C aufgeheizt und bei dieser Temperatur 1 Stunde gehalten. Anschließend wird der Ofen auf 150°C abgekühlt und mit 60 l Luft pro Stunde gespült. Der Ofen wird mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 2 K/min auf 200°C aufgeheizt und bei dieser Temperatur 1 Stunde gehalten und anschließend auf Temperatur abgekühlt. Das Pulver wird auf ein Sieb (50 μm) überführt und 30 min gesiebt. Anschließend wird die gesiebte Probe in Glasbehälter abgefüllt, die unverschlossen in einem Ofen, der mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 K/min auf 200°C aufgeheizt wird, bei dieser Temperatur 4 h gehalten und danach auf 80°C abgekühlt wird, sterilisiert werden. Anschließend werden die Glasgefäße dem Ofen entnommen, mit steriler Folie abgedeckt und mit einem Deckel verschlossen. Eine Zusammenfassung der wichtigen Prozeßparameter ist in Tabelle 2 und Tabelle 3 dargestellt, wobei die produzierten individuellen Proben zusammen mit einigen Daten in Tabelle 3 angegeben sind. Dabei weist jede Probe einen spezifischen Code auf. Die ersten beiden Buchstaben beschreiben die verwendete Glaschemie (siehe unten), und die nächsten vier Nummern codieren den Herstellungsprozeß (siehe Tabelle 2). Die Nummer hinter der beschreibt das verwendete Pigment (siehe Tabelle 1). Der Buchstabe R bedeutet, daß der Feingehalt nicht entfernt wurde, wohingegen E bedeutet, daß der Feingehalt mit Ethanol abgetrennt wurde. Die letzten beiden Zahlen beschreiben die Chargennummer. Die Zusammensetzung des Glases (Code EJ), wie aus der Menge der Edukte berechnet, betrug 70,67 Mol% SiO2, 14,33 Mol% B2O3, 5,00 Mol % Al2O3, 4,00 Mol % K2O, 2,00 Mol % CaO, 4,00 Mol% ZnO. Die Zusammensetzung des Glases (Code RN) betrug 74 Mol % SiO2, 15 Mol % B2O3, 5,00 Mol % Al2O3, 4,00 Mol% K2O, 2,00 Mol% CaO. Die Zusammensetzung des Glases (Code EP) betrug 73,61 Mol% SiO2, 14,93 Mol% B2O3, 5,21 Mol % Al2O3, 4,17 Mol % K2O, 2,08 Mol % CaO.
  • 2 Beispiel 2: Hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie
  • Um Informationen über die Oberfläche, Größe und Form des MGP zu erhalten, führten wir Untersuchungen mit einem hochauflösenden Rasterelektronenmikroskop der Firma JEOL (JSM) durch. Dabei wurden die Proben auf den Probenhalter mit einem elektrisch leitfähigen doppelseitigen Kleber ausgebreitet und mit einem Strom von 30 mA 36 s mit Gold bespritzt. Zur Abbildung der Oberfläche wurden die emittierten sekundären Elektronen (Topographie) ebenso wie die rückgestreuten Elektronen (Ordnungszahlkontrast) betrachtet. Die verwendete Primärelektronenspannung betrug 10 kV (sekundäre Elektronen) oder 25 kV (rückgestreute Elektronen).
  • 4 zeigt MGPs mit mit Eisenoxid als Magnetpigment beschichtetem Glimmer (BM). Der Riß im Glasmantel lassen sich deutlich erkennen, wobei diese von der Sprühtrocknung der Teilchen herrühren, wenn die Schicht auf einem nichtschrumpfenden Substrat zu schrumpfen beginnt (Trocknungsrisse). Weiterhin ist eine größere Anzahl an kugelförmigen Teilchen erkennbar, die keines der größeren magnetischen Teilchen (10–60 μm) enthalten. Diese Kugeln ohne magnetischen Kern (nichtmagnetischer Feingehalt) können in einem Magnetfeld nicht abgetrennt werden, können in die PCR-Reaktion übertragen werden und stören diese Reaktion.
  • Die Teilchen mit CERAC-Pigment (siehe 5) weisen keine Risse auf, da das Magnetpigment (durchschnittliche Teilchengröße 23 nm) keine Spannungskräfte in der Schicht verursacht, so daß während des Sprühtrocknungsprozesses keine Risse entstehen. Weiterhin sind auch die kleinen CERAC-Teilchen im Feingehalt eingebaut, so daß dort keine nichtmagnetischen Teilchen darin enthalten sind. Die Teilchen sind auch wesentlich kleiner als die Teilchen mit Glimmer, was anhand dieser Figuren bei gleicher Vergrößerung beobachtet werden kann. MGPs mit den anderen magnetischen Pigmenten sind bei gleicher Vergrößerung in 6 bis 10 gezeigt.
  • 3 Beispiel 3: Physikalische Untersuchungen der MGPs
  • Um eine Beurteilung der MGPs vor den eigentlichen Funktionstests zu gestatten, wurden zusätzlich den HREM-Untersuchungen weitere physikalische Messungen mit den MGPs durchgeführt. Dabei wurden interessante Kenntnisse über die Eisenlöslichkeit in Wasser, die Magnetkraft, den Feingehalt und die Dichte erhalten. Im folgenden sind die Experimente beschrieben und die Ergebnisse dargestellt.
  • 3.1 Extinktionsmessungen
  • Um zu testen, ob die Feinbestandteile abgetrennt wurden, werden 1000 mg des temperaturbehandelten und gesiebten Pulvers in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Sarstedt) eingewogen, mit 40 ml Wasser versetzt und durch Schütteln dispergiert. Anschließend wird das Röhrchen mit der gesamten Füllhöhe in ein Ultraschallbad (Sonorex (RK 102H; 120/240 W)) getaucht und in einen magnetischen Separator (Roche Diagnostics GmbH RD Art. Nr. 1858 025) gestellt. Nach 3,5 min magnetischer Trennung wird dem Gefäß Flüssigkeit mit einer Pasteur Glaspipette in Höhe der 15-ml-Marke auf der dem Magneten gegenüberliegenden Seite entnommen und in eine 5-mm-Quarzküvette gefüllt (Typ 110-QS, Hellma). Die Extinktion des Überstands wird in einem UV-VIS-NIR-Spektrometer (Hitachi U-3000) gegen eine entsprechende, mit entionisiertem Wasser gefüllte Küvette gemessen. Der Meßbereich betrug 200 bis 1100 nm in Schritten von 1 nm, um diesen Wellenlängenbereich auf Absorptionsbanden eventueller Verunreinigungen zu untersuchen. Die Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm und 400 nm wurde als Referenz genommen.
  • 3.2 Dichtemessungen
  • Für die Dichtemessungen wird ein Gaspyknometer (AccuPyc 1330, Fa. Micromeritics) verwendet. Als Gas wird Helium 6,0 verwendet. Die Vorrichtung wird mit dem mitgelieferten Standard (Stahlkügelchen mit bekanntem Volumen) kalibriert. Ferner wird die Probe mindestens eine Stunde bei 150°C getrocknet und anschließend in den Meßbehälter gefüllt und gewogen. Nach Einsetzen des Meßbehälters in das Gaspyknometer werden zur Bestimmung des Durchschnittswerts und der Standardabweichung 10 Waschzyklen und 5 Meßzyklen verwendet.
  • 3.3 Bestimmung der Eisenlöslichkeit
  • Die Eisenlöslichkeit der beschichteten und temperaturbehandelten Proben wird mittels „Inductive Coupled Plasma – Atomic Emission Spectroscopy" (JY 24, Firma ISA) bestimmt. Dazu wird 1 g der Probe in ein 50-ml-Polypropylenröhrchen überführt, mit destilliertem Wasser aufgefüllt und 20 Stunden bei einer Temperatur von 60°C gehalten. Anschließend werden die Proben mit einem 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert und das Filtrat gemessen. Vier Einzelbestimmungen werden bei einer Wellenlänge von 259.940 nm durchgeführt und daraus ein Durchschnittswert berechnet.
  • 3.4 Messung der Magnetkraft
  • Zum Messen der Magnetkraft wird ein PP-Wiegeröhrchen (Firma Licefa, Art. Nr. V2-3), das vollständig mit MGPs gefüllt ist, gewogen. Mit Hilfe einer Schablone wird dieser Probenbehälter in die Mitte eines LDPE-Röhrchens (Firma Kartell, TS 735), das mit Messing beschwert ist, so daß sich der Deckel des Röhrchens noch schließen läßt, plaziert. Das Gefäß wird in die Mitte einer Waage (Nachweisgenauigkeit 0,1 g) mit Hilfe einer weiteren Schablone positioniert. Nach dem Tarieren der Waage wird eine Plastikkappe, die einen zylinderförmigen Magneten (Durchmesser: 30 mm; Höhe: 113,5 mm, Material: Samarium-Kobalt 2/17) enthält, über der Waage positioniert.
  • Dadurch werden die MGPs in der Waage entgegen der Schwerkraft angezogen, wodurch sich ihr Gewicht verringert. Nach Einstellung des Gleichgewichts (1,5 min) wird der Gewichtsverlust der Probe bestimmt und der Wert für 250 mg MGP normiert.
  • 3.5 Ergebnisse
  • Die Ergebnisse der physikalischen Charakterisierung der MGPs mit EJ-Zusammensetzung und unterschiedlichen Pigmenten sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Dabei läßt sich erkennen, daß die Extinktionswerte sehr niedrig liegen, wenn das CERAC-Pigment verwendet wird. Dies läßt sich durch das Fehlen von nichtmagnetischem Feingehalt erklären, da das kleine CERAC-Pigment (23 nm) in jedes magnetisches Glasteilchen eingebaut werden kann. Die Dichte der CERAC-MGPs ist nicht sehr hoch. Dies wirkt sich positiv auf die Sedimentationsgeschwindigkeit aus. Die Magnetkraft ist starken Schwankungen unterworfen, wird jedoch durch die Verwendung von CERAC-Pigmenten positiv beeinflußt. Die CERAC-MGPs geben vergleichsweise viel Eisen an das Wasser ab. Allerdings zeigten selbst zehnfach höhere Werte keine Auswirkung auf den PCR-Prozeß.
  • Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die physikalischen Eigenschaften keine signifikanten Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Pigmenten aufweisen, daß jedoch die CERAC-MGPs einen sehr geringen Feingehalt besitzen.
  • 4 Beispiel 4: Einfluß des magnetischen Kernpigments und des Sprühtrockners auf die BET-Oberfläche
  • Die Oberflächen wurden unter Verwendung einer Vorrichtung der Firma Micromeritics (Typ ASAP 2400) bestimmt. Dabei wurde die Messung bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff durchgeführt. Als Meßgas wurde Nitrogen 5.0 und als Inertgas Helium 4.6 verwendet. Typischerweise wurden 5 g Probe für eine Messung eingesetzt.
  • Die Oberfläche der MGPs spielt eine offensichtliche Rolle bei der Isolierung von DNA und RNA. Je höher die Oberfläche, desto mehr DNA kann von der gleichen Masse an MGPs gebunden werden. Ebenso ist es möglich, weniger MGPs zu verwenden und dabei die gleiche Leistung zu erhalten. Dies hat den Effekt, daß das Zwischenkornvolumen geringer ist, was bedeutet, daß weniger Alkohol als Verunreinigung in die PCR-Reaktion eingeführt werden kann. Die Daten für die gemessenen BET-Oberflächen sind für einige Proben in Tabelle 4 zusammengefaßt. Beim Vergleich der auf dem großen Sprühtrockner produzierten Oberflächen der Proben sollte angemerkt werden, daß die Proben mit kleinen Pigmenten (BASF-FA, STREM und CERAC) relativ hohe Oberflächen aufweisen, wohingegen die großen Merck-Pigmente kleine Oberflächen besitzen. Dies kann dadurch verursacht werden, daß große magnetische Teilchen zu großen MGPs führen, wohingegen die kleinen magnetischen Teilchen während des Sprühtrocknungsvorgangs in die kugelförmigen Tröpfchen eingebaut werden und daher unter ähnlichen Sprühbedingungen ähnliche Oberflächen aufweisen. Die BASF-CE-SU-Teilchen weisen eine Größenverteilung auf, die zwischen den kleinen Teilchen (BASF-FA, STREM und CERAC) und den großen Merck-Teilchen liegt. Im Gegensatz zu den Merck-Teilchen besitzen sie keine strukturierte Oberfläche, so daß diese Teilchen eine sehr glatte Glasoberfläche aufweisen. Dadurch ergibt sich eine kleinere Oberfläche. Mit dem kleineren Sprühtrockner wurde ein höherer Druck verwendet, wobei die Sprühdüse dieses Sprühtrockners deutlich kleiner ist als die des größeren Sprühtrockners. Dies führt zu kleineren Teilchen, wodurch sich die Oberfläche deutlich vergrößert. Dies stimmt gut mit den Ergebnissen des Beispiels 5.2.1 überein.
  • Eine eventuelle Beeinflussung der Ergebnisse weiterer physikalischer Untersuchungen durch das magnetische Pigment oder den Sprühdruck läßt sich nicht erkennen, außer der obenerwähnten Beeinflussung der Rißbildung und des Feingehalts. Allerdings zeigen lediglich die Messungen der Oberfläche eine direkte Verbindung zu den Ergebnissen der funktionellen Untersuchungen. Andere physikalische Untersuchungsergebnisse zeigen diese direkte Korrelation nicht.
  • 5 Beispiel 5: Bindungsstudien über Radiotracing
  • Es gibt mehrere Verfahren zur Beurteilung von MGPs hinsichtlich ihrer Eignung für die Extraktion von Nukleinsäuren. Die Bestimmung der Extinktion bei 260 nm vor und nach der Reinigung ist nicht sehr empfindlich und entspricht nicht der Situation, wenn kleine Mengen an Zielnukleinsäure aus klinischem Material extrahiert werden. Die Ergebnisse funktioneller Auswertungsverfahren, die auf einem Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren, wie beispielsweise mittels PCR, RT-PCR, NASBA oder dergleichen, beruhen, sind häufig nicht überzeugend genug. Weiterhin sind diese Verfahren, die zur Bestimmung einer kleinen Anzahl von Kopien des Zielgenoms geeignet sind, anfällig gegenüber Störungen durch Substanzen aus dem Probenmaterial oder aus dem Probenpräparationsprozeß. Bei radioaktiven Bindungsstudien handelt es sich um ein geeignetes Analyseverfahren, das die Analyse des Probenpräparationsprozesses Schritt für Schritt möglich macht. Bei den Leistungswerten handelt es sich um keine absoluten Daten, sondern sie sind immer auf die Leistung eines Referenzteilchens bezogen.
  • 5.1 Versuchsprotokoll
  • Zunächst wird radioaktiv markierte DNA oder RNA enzymatisch in einer PCR oder in einem in-vitro-Transkriptionsprozeß in Gegenwart von 32P-markiertem Desoxynukleosid oder Nukleosidtriphosphaten synthetisiert. Anschließend wird die markierte DNA oder RNA von den freien Nukleosidtriphosphaten getrennt, der Gehalt bestimmt und eine definierte Verdünnung hergestellt. Vor der Untersuchung wird jede Probe jeweils mit einer kleinen Menge an markierter DNA oder RNA versetzt. Während der Probenpräparation binden alle Nukleinsäuren an die MGPs in Gegenwart von Chaotropen. Die MGPs werden durch Ausübung von Magnetkräften pelletiert, und die Überstände können verworfen werden. Das Pellet wird gewaschen, und die gebundenen Nukleinsäuren werden bei erhöhter Temperatur durch Umkehren der Reaktionsbedingungen, d.h. durch die Zugabe eines Niedrigsalz-Elutionspuffers eluiert. Nach der Bindung und gegebenenfalls nach dem Waschschritt wird eine Portion des Teilchenüberstands punktförmig auf ein Filter aufgetragen. Das Eluat wird ebenso wie das in Wasser redispergierte MGP ebenfalls punktförmig auf ein Filter aufgetragen und danach getrocknet. Schließlich werden die Filter in einem Beta.Counter gemessen und für jede Probenpräparation jeweils eine Verteilung berechnet.
  • 5.1.1 Präparation radioaktiv markierter DNA
  • 5.1.1.1 A.1.1 Reagentien
    • – Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals Kat. Nr. 732641)
    • – dNTP Mix (Roche Molecular Biochemicals Kat. Nr. 1277049)
    • – Desoxycytidin-5'-alpha-P32-triphosphat, dCTP, 3000 Ci/mmol (Amersham Kat. Nr. PB 10205)
    • – Lambda-DNA (Roche Kat. Nr. 1029053) Konzentration 1 ng/ml
    • – Radiotracer-Primer 1 (SEQ ID NO 1) Konzentration 5,3 OD260/ml Radiotracer-Primer 2 (SEQ ID NO 2) Konzentration 5,2 OD260/ml
    • – QIA Quick PCR Purification Kit (Qiagen Kat. Nr. 28104)
  • 5.1.1.2 Reaktion
    • – 29,5 μl doppelt destilliertes Wasser
    • – 5 μl Expand High Fidelity Buffer
    • – 2,5 μl dNTP-Mix (1:10), verdünnt mit doppelt destilliertem Wasser
    • – 1 μl Radiotracer-Primer 1 (SEQ ID NO 1)
    • – 1 μl Radiotracer-Primer 2 (SEQ ID NO 2)
    • – 0,3 μl 32P-dCTP
    • – 10 μl Lambda-DNA
    • – 0,75 μl Expand High Fidelity-Enzyme Mix
  • 5.1.1.3 Amplifikation
    • – 2 min 94°C
    • – 10 Zyklen (10 s 94°C/30 s 60°C/60 s 72°C)
    • – 20 Zyklen (10 s 94°C/30 s 60°C/60 s 72°C, + 10 s Verlängerung bei 72°C, pro Zyklus)
    • – 7 min 72°C
    • – 4°C
  • 5.1.1.4 Reinigung
    • – Gemäß dem QIA Quick PCR Purification Protocol (Qiagen)
  • 5.1.1.5 Verdünnung
    • 1:10-Verdünnung von DNA in doppelt destilliertem Wasser und Messung in Beta-Counter.
  • 5.1.2 A.2. Präparation radioaktiv markierter RNA
  • 5.1.2.1 – Reagenzien
    • – SP6/T7 Transcription Kit (Roche Molecular Biochemicals Kat. Nr. 999644)
    • – Uridin-5'-alpha-P32-triphosphat, UTP 3000 Ci/mmol (Amersham Kat. Nr. PB 10203)
    • – Plasmid pBKBH10S, linearisiert mit EcoRI bei 100 μg/ml
    • – High Pure RNA Isolation Kit (Roche Molecular Biochemicals Kat. Nr. 1828665)
  • 5.1.2.2 – Reaktion
    • – 2 μl 10×-Puffer
    • – 3 μl NTP Mix (AGC)
    • – 1 μl UTP (1:50 mit doppelt destilliertem Wasser)
    • – 5 μl 32P-UTP
    • – 7 μl linearisiertes Plasmid
    • – 1 μl RNAse Inhibitor (Roche Molecular Biochemicals Kat. Nr. 802808)
    • – 1 μl T7 RNA-Polymerase
  • 5.1.2.3 Transkription und DNAse-Verdauung
    • – 20 min Inkubation bei 37°C
    • – Zugabe von 2 μl DNAse, RNAse-frei
    • – 10 min Inkubation bei 37°C
    • – Zugabe von 178 μl doppelt destilliertem Wasser
  • 5.1.2.4 – Reinigung
    • – Gemäß dem High Pure RNA Isolation Protocol (Roche Molecular Biochmicals)
  • 5.1.2.5 – Verdünnung:
    • 1:30-Verdünnung von RNA in doppelt destilliertem Wasser und Messung am Beta-Counter
  • 5.1.3 – Radioaktive Probenpräparation
  • 5.1.3.1 – Reagenzien
    • – Negatives Plasma
    • – Proteinase-K-Konzentration 20 mg/ml (z.B. Roche Id. Nr. 1942387)
    • – Poly-A-RNA (z.B. Roche Id. Nr. 108626) Konzentration 1 mg/ml; 1:1000 (Volumen/Volumen-Verhältnis) verdünnt mit Lysepuffer
    • – Lysepuffer (50 mM Tris pH 7,0, 15% (v/v) Polydocanol, 5M Guanidiniumisothiocyanat, 1 mM DTT)
    • – MGP (mit Glaszusammensetzung EJ und unterschiedlichen Kernpigmenten (BM, MMB, CERAC, STREM, BASF-FA, BASF-CE)), suspendiert in Isopropanol bei 60 mg/ml oder bei 6 mg/ml
    • – Waschpuffer (20 mM Tris pH 7,5, 20 mM NaCl, 70% (v/v) Ethanol)
    • – Elutionslösung: doppelt destilliertes Wasser
    • – Hilfsmaterial: GF/D-Filter von Whatman
  • 5.1.3.2 – Reaktion (1,5-ml-Protokoll)
    • – 80 μl Proteinase K
    • – 410 μl negatives Plasma zugeben und mischen
    • – 500 μl Lysepuffer zugeben und mischen
    • – 10 μl radioaktiv markierte DNA oder RNA zugeben und mischen
    • – 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln
    • – 500 μl MGP-Suspension (Konzentration 6 mg/ml) zugeben und mischen
    • – 20 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln
    • – 2 min trennen in Magnetic-Separator (Dynal)
    • – Überstand verwerfen und 300 μl punktförmig auf ein Filter auftragen
    • – 750 μl Waschpuffer zugeben, am Vortex-Gerät mischen, 2 min trennen
    • – Überstand verwerfen, schließlich 375 μl Überstand auf ein Filter punktförmig auftragen
    • – Waschprozedur zweimal wiederholen
    • – 100 μl Elutionslösung zugeben, 5 min bei 80°C in einem Thermomixer inkubieren
    • – 2 min in einem Magnethalter trennen, Überstand punktförmig auf ein Filter auftragen
    • – 100 μl Elutionslösung zugeben, MGPs resuspendieren und punktförmig auf ein Filter auftragen
    • – Filter 60 min bei 75°C in einem Trockenofen trocknen
    • – Filter in Szintillationsröhrchen überführen, 5 ml Szintillationslösung zugeben und in Beta-Counter messen
  • 5.1.3.3. – Versuchsprotokoll (1-ml-Protokoll)
    • – 25 μl Proteinase-K
    • – 415 μl negatives Plasma zugeben und mischen
    • – 500 μl Lysepuffer zugeben und mischen
    • – 10 μl radioaktiv markierte DNA oder RNA zugeben und mischen
    • – 5 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln
    • – 50 μl MGP-Suspension (Konzentration 60 mg/ml) zugeben und mischen
    • – 20 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln
    • – 2 min trennen im magnetischen Separator (Dynal)
    • – Überstand verwerfen und 300 μl punktförmig auf ein Filter auftragen
    • – 700 μl Waschpuffer zugeben, am Vortex-Gerät mischen, 2 min trennen
    • – Überstand verwerfen, schließlich 350 μl Überstand auf ein Filter punktförmig auftragen
    • – Waschprozedur zweimal wiederholen
    • – 120 μl Elutionslösung zugeben, 10 min bei 80°C in einem Thermomixer inkubieren
    • – 2 min in einem Magnethalter trennen, Überstand punktförmig auf ein Filter auftragen
    • – 100 μl Elutionslösung zugeben, MGPs resuspendieren und punktförmig auf ein Filter auftragen
    • – Filter 60 min bei 75°C in einem Trockenofen trocknen
    • – Filter in Szintillationsröhrchen überführen, 5 ml Szintillationslösung zugeben und in Beta-Counter messen
  • 5.2. Ergebnisse der Radiotracing-Experimente
  • 5.2.1 Einfluß des magnetischen Kernpigments oder des Sprühtrockners auf die RNA-Isolierung
  • Unterschiedliche MGP-Typen, die unter Verwendung der EJ-Glaschemie und verschiedenen Kernen im Nano- oder Mikrobereich (MMB, CERAC, usw.) auf verschiedenen Sprühtrocknern (Büchi bzw. Nubilosa) hergestellt wurden, wurden hinsichtlich ihres Verhaltens bei der Nukleinsäureextraktion aus virusnegativem Pool-Material mit dem Radiotracing-Verfahren nach Beispiel 5.1.3.2 charakterisiert. Dabei stellte sich im Lauf der Untersuchungen der RNA-Parameter als am empfindlichsten heraus und wurde daher als Parameter gewählt. 11 zeigt, daß BASF-CE sich nicht als Kernmaterial eignet, da sich nur kleine Mengen der gebundenen RNA im Eluat finden lassen. Die EJ/CERAC-Teilchen, die im Büchi-System bei 6 bar gesprüht wurden, zeigten die Leistung der Referenz EJ/MMB, die im Nubilosa-System gesprüht wurden.
  • 5.2.2 Einfluß des Parametersprühdrucks auf die Isolierung von DNA oder RNA
  • Unterschiedliche MGP-Typen, die mit dem Nubilosa-System mit verschiedenen Sprühdrücken hergestellt wurden, werden gemäß 5.1.3.3 verglichen. Bei den Referenzteilchen handelt es sich um EJ/MMB-MGP . Es werden die DNA- und RNA-Bindungseigenschaften untersucht. Während der DNA-Parameter keine Abhängigkeit vom Sprühdruck zeigt, zeigt der RNA-Parameter signifikante Leistungsunterschiede. Die Leistung der mit 1,5 bar Sprühdruck mit dem Nubilosa-System hergestellten EJ/CERAC-Teilchen ist geringer als die der Referenz. Es liegt eine geringere Leistung in der Reihe in Abhängigkeit vom Sprühdruck, der von 1,5 bis 3,4 bar (~ 30%) variierte, vor. Teilchen, die mit 4,3 bar gesprüht werden, erreichten 90% der Leistung der Teilchen, die bei 1,5 bar gesprüht werden (siehe 12). Die Experimente bestätigen den direkten Zusammenhang zwischen den Prozeßparametern für die Herstellung der MGPs und der Leistung im Test. Es sollte angemerkt werden, daß eine Erhöhung des Sprühdrucks zu einer geringeren Testleistung führt, das sich jedoch, beginnend mit einem bestimmten Sprühdruck, die Teilcheneigenschaften verbessern, was zu einer besseren Leistung führt.
  • 5.2.3 Einfluß unterschiedlicher MGP-Herstellungsparameter auf die Isolierung von RNA und DNA
  • Diese Experimente sollten zu dem Ergebnis führen, ob eine Variierung des Sprühdrucks zu MPGs mit noch besserer Leistung führt.
  • Dazu werden MGPs auf dem Nubilosa-System bei einem Druck von 1,5 bar, 4,3 bar und 6 bar mit Stickstoff als Sprühgas hergestellt.
  • Um einen vorsichtigen Trocknungsprozeß zu erhalten, werden die Eingangs- und Ausgangstemperatur des Sprühtrockners zusätzlich herabgesetzt. Der Einfluß dieser Faktoren auf die RNA-Isolierung wird gemäß 5.1.3.3. mit EJ/MMB-MGP als Referenz untersucht.
  • Die Ergebnisse (siehe 13) zeigen den überraschenden Effekt einer dramatischen Leistungsverminderung, die durch die Abnahme der Sprühtemperatur verursacht wird und die nicht vorhergesehen werden konnte. Die Leistung der Referenzqualität konnte durch Erhöhung des Sprühdrucks erreicht werden. Gleichzeitig mit besserer Suspensionsstabilität sind diese Teilchen daher der Referenz überlegen.
  • 6 Beispiel 6: Sedimentationsanalyse der magnetischen Glasteilchen
  • 6.1 Versuchsvorschrift
  • Zur Bewertung des Sedimentationsverhaltens der magnetischen Glasteilchen wird ein von der Firma Kontron Instruments produziertes Gerät, das Uvikon Spectrophotometer Modell 930, verwendet. Dieses Spektrophotometer ist modifiziert, um die variable Einstellung der Küvette entlang eines Skalierungsbalkens zu gestatten. Für die Messungen wird die Küvette in eine Position gebracht, bei der der Meßstrahl mit einer Wellenlänge von 650 nm die Küvette an einer Position, die bei 2/3 der Füllhöhe liegt (Skalenposition 7,5) durchquert. Dabei werden aus Polystyrol hergestellte Makroküvetten mit einem Volumen von 4 ml und einer Schichtdicke von 1 cm verwendet. Vor den Messungen wird in einem Ein-Strahl-Verfahren eine Kalibrierung gegen reines Suspensionsmedium durchgeführt. Die MGP-Proben werden zur Homogenität in Suspensionsmedium dispergiert, typischerweise bei einem Masse/Volumen-Verhältnis von 3 mg/ml, und sofort gemessen. Die zeitliche Änderung der Extinktion wird kontinuierlich bei der genannten Wellenlänge von 650 nm verfolgt.
  • Die für den Vergleich der Sedimentationsgeschwindigkeit unterschiedlicher Proben verwendete physikalische Größe ist die Halbwertszeit (t1/2) in einem bestimmten Suspensionsmedium. Dabei handelt es sich um den Zeitraum, bis die Extinktion der Suspension im oberen Drittel der Küvette die Hälfte des Werts zu Beginn der Messung beträgt. Die Abnahme der Extinktion wird durch das Absetzen der Teilchen und die gleichzeitige Klärung des oberen Drittels des Testvolumens verursacht.
  • Die oben beschriebene Vorrichtung gestattet ferner die Installation eines Magneten unterhalb der Küvette. Dadurch läßt sich die Geschwindigkeit der magnetischen Trennung bestimmen.
  • 6.2. Ergebnisse der Sedimentationsanalyse
  • 6.2.1. Experiment 1:
  • Mehrere mit EJ-Glaschemie hergestellte MGP-Typen mit unterschiedlichen Kernen im Nano- oder Mikrometerbereich werden spektrophotometrisch auf ihr Sedimentations- und Trennverhalten untersucht, d.h. mit und ohne Magnet unter der Küvette. Masse/Volumen beträgt in diesem Fall 6 mg/ml. Bei dem Suspensionsmedium handelt es sich um ein 1:1-Gemisch aus Isopropanol und Lysepuffer. Die Ergebnisse sind in zusammengefaßt. Die Teilchen vom CERAC-Typ zeigen einen deutlichen Vorteil bei der Stabilität der Suspension, jedoch keine Nachteile bei der magnetischen Trennung (siehe auch 14).
  • 6.2.2. Experiment 2:
  • Das Sedimentationsverhalten unterschiedlicher MGPs vom Typ CERAC, die mit EJ-Glaschemie hergestellt wurden, werden in reinem Isopropanol untersucht.
  • Wichtige Herstellungsparameter
    • EJ0100.5R-01 – 1,5 bar Sprühdruck, 230°C Eingangstemperatur, Nubilosa-System
    • EJ0108.5R-01 – 4,3 bar Sprühdruck, 230°C Eingangstemperatur, Nubilosa-System
    • EJ0096.5R-01 – 6,0 bar Sprühdruck, 150°C Eingangstemperatur, Büchi-System
    • EJ0096.5R-01 ist in 15 gezeigt. Diese Kügelchen sind weitgehend kugelförmig, weisen eine hochstrukturierte Oberfläche sowie eine Größe von vorwiegend 0,5–5 μm auf. Die bei geringem Druck und hoher Temperatur gesprühte Probe EJ0100.5R-01 besteht hauptsächlich aus deformierten Teilchen im μ-Maßstab (siehe 16, in der ein funktionelles Äquivalent zu
    • EJ0100.5R gezeigt ist). Abschließend läßt sich sagen, daß Teilchen wie etwa EJ0096.5R-01 eine signifikante Verzögerung der Sedimentation zeigen, welche äußerst vorteilhaft für Flüssigtransfers von MGP-Suspensionen ist (siehe 14b). Die Ergebnisse sind in zusammengefaßt.
  • 7. Beispiel 7: Funktionstest mit PCR
  • 7.1. Heterogene Funktionstests: Amplifikation mit PCR am GeneAmp 9600® von Perkin Elmer und Nachweis mit einem biospezifischen Bindungstest mit einer Chemilumineszenz-markierten Nachweissonde an einem modifizierten Elecsys1010®
  • 7.1.1 Allgemeine Betrachtungen
  • Viruspartikel in der Probe (z.B. Plasma) werden in Gegenwart von Protease sowie hohen Konzentrationen an chaotropem Salz ebenso wie Detergens lysiert. Anschließend wird das partikuläre Adsorbens (= MGP) zur physikalisch-chemischen Adsorption freigesetzter Nukleinsäuren auf der Glasoberfläche zugegeben und anschließend die magnetische Trennung sowie das Waschen der beladenen Kügelchen, d.h. Trennung von gebunden/frei, durchgeführt. Schließlich wird die Dissoziation gebundener Nukleinsäuren von den Kügelchen (= Elution) unter relativ zur Adsorption umgekehrten Reaktionsbedingungen, d.h. mit Niedrigsalzpuffer oder sogar destilliertem Wasser, ausgeführt. Anschließend wird eine Portion des Eluats mit einer Portion PCR-Mastermix gemischt, um die Amplifikation der eluatgewonnenen Nukleinsäuren zu starten. Diese Reaktion ist durch die folgende Gleichung charakterisiert: Ni = N0 × (1 + E)n, wobei
    • N0
    = Anzahl Moleküle beim Start der Polymerasekettenreaktion
    Ni
    = Anzahl Moleküle am Ende der Polymerasekettenreaktion
    E
    = Effizienz der Amplifikation = 0 ≤ E ≤ 1
    N
    = Anzahl Reaktionszyklen = typischerweise 20 ≤ n ≤ 35
  • Nach der PCR mit wenigstens einem biotinylierten Primer wird eine Portion des Amplikons mit Biotin-Tag mit Hybridisierungspuffer sowie der Nachweissonde gemischt. Nach der Inkubation werden Streptavidin-beschichtete Kügelchen zugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation. Schließlich werden die Kügelchen gewaschen, Signalpuffer wird zugegeben und die Intensität des Chemilumineszenzsignals gemessen, wobei letztere mit der Masse der amplifizierten gebundenen Nukleinsäure und somit mit der Viruslast der Plasmaprobe korreliert.
  • Der Fachmann kann ebenso das 1-ml-Protokoll von Hand aus durchführen.
  • 7.1.2 Versuchsprotokoll
  • 7.1.2.1 Reagenzien
  • 7.1.2.1.1 Probenpräparation
    • Proteinase K, flüssig in Glycerin/Calciumacetat, 20 mg/ml
    • Poly-A-RNA, 1 mg/ml, Gebrauchskonzentration ist eine 1:1000-Verdünnung in Lysepuffer
  • Lysepuffer, bestehend aus:
    • • Tris-Puffer, 50 mmol/l, pH 7,0 (1,0 bzw. Extraktorprotokoll) oder 4,0 (1,5 ml Protokoll)
    • • Polydocanol, 15% (v/v) (1,0 bzw. Extraktorprotokoll) oder Triton X-100 20% (v/v) (1,5 ml Protokoll)
    • • Guanidiniumisothiocyanat, 5 ml/l
    • • 1 mmol/I DTT
    • – magnetische Glasteilchen (MGP), entweder vom Typ EJ/BM EJ/MMB oder EJ/CERAC, suspendiert in Isopropanol (Reinheit 99,8%) bei 60 mg/ml
    • – Waschpuffer, bestehend aus
    • • Trispuffer, 20 mmol/l, pH 7,5
    • • 60% Ethanol/aq (1,0 bzw. Extraktorprotokoll) oder 70% (1,5 ml Protokoll)
    • • NaCl, 20 mmol/l
    • Elutionsmittel = doppelt destilliertes Wasser
  • Amplifikation/Mastermix
    • – PCR-Puffer bestehend aus Puffermedium
    • RT-PCR (Menschlicher Immunschwächevirus (HIV), Hepatitis-C-Virus (HCV)): 250 mmol/l Bicin/KOH pH 8,2, 557 mmol/l K-Acetat, 40% Glycerin
    • HBV-PCR (Hepatitis-B-Virus (HBV)): 20 mmol/l Tris-HCl pH 8,3; 100 mmol/l KCl, 0,012% Brij 35 (= 2×-Konzentrat)
    • Metallkationen, MgCl2 (HBV-PCR) 3 mmol/l oder MnCl2, (RT-PCR) 2,5 mmol/l (HCV) und 1,25 mmol/l (HIV)
    • Desoxynukleosidtriphosphat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP)
    • Analytspezifischer Vorwärtsprimer
    • Analytspezifischer Rückwärtsprimer
    • Uracil-N-Glycosidase (UNG)
    • DNA-Polymerase (Taq oder Tth-Polymerase für HBV bzw. HIV/HCV)
    • H2O-entmineralisiert (molekularbiologische Qualität) zur Volumeneinstellung auf 100 μl
  • Stopreagens für UNG nach der Amplifikation
    • – N-Lauroylsarcosin (z.B. Roche Id. Nr. 133895), 1% w/v); 5 μl pro 100 μl Amplikon
  • 7.1.2.1.2 Nachweis
  • Hybridisierungspuffer (z.B. Roche Id. Nr. 1930273) Chemilumineszenzmarkierte Nachweissonden:
    • HCV (Roche BMO 28.140336), Arbeitsstammlösung = 8,0 nmol/l
    • HIV (Roche BMO 28.540948), Arbeitsstammlösung = 7,8 nmol/l
    • HBV (Roche BMO 28.540917), Arbeitsstammlösung = 9,2 nmol/l
    • SA-beschichtete ECL-Beads (z.B. Roche Id. Nr. 1865943001)
    • Denaturierungslösung (z.B. Roche Id. Nr. 1930257)
    • ProCell (z.B. Roche Id. Nr. 1717685)
    • CleanCell (z.B. Roche Id. Nr. 1717642)
    7.1.2.1.3 Primer und Sonden
    Primer:
    HIV-Forward: SEQ ID NO 3
    HIV-Reverse: SEQ ID NO 4
    HCV-Forward: SEQ ID NO 5
    HCV-Reverse: SEQ ID NO 6
    HBV-Forward: SEQ ID NO 7
    HBV-Reverse: SEQ ID NO 8
    Nachweissonden:
    HIV: SEQ ID NO 9
    HCV: SEQ ID NO 10
    HBV: SEQ ID NO 11
  • 7.1.2.2 Reaktionsbedingungen und Testverfahren
  • Probenpräparation:
  • – 1,0-ml-Manuelles Protokoll: => für Experiment 1 verwendet, siehe Beispiel 7.3.1
    • 25 μl Proteinase K zu 425 μl Plasmaprobe geben, am Vortex-Gerät mischen,
    • 500 μl Lysepuffer zugeben, 5 min bei Raumtemperatur unter mechanischer Bewegung (1300 UpM in Eppendorf-Mixer) inkubieren,
    • 50 μl in Isopropanol suspendierte MGP (Konzentration 60 mg/ml) zugeben, am Vortex-Gerät mischen und 20 min bei Raumtemperatur auf einem Rollenmischer inkubieren, magnetisches Trennen unter Verwendung eines magnetischen Dynal-Separators (2 min);
    • nichtgebundene Fraktion durch Absaugen entfernen und
    • 700 μl Waschpuffer zugeben, am Vortex-Gerät mischen, trennen, absaugen;
    • Waschprozedur noch 4mal wiederholen,
    • 120 μl DEPC-Wasser zugeben, am Vortex-Gerät mischen und
    • 10 min bei 80°C in einem Eppendorf-Thermomixer bei
    • 1300 UpM und mit nicht verdeckelten Röhrchen eluieren,
    • Kügelchen von wäßrigem Überstand (= Eluat) mit dem magnetischen Dynal-Separator trennen (2 min),
    • Eluat bis zur weiteren Verwendung einfrieren.
  • – Automatisches Protokoll am intern gebauten Extraktor; => für Experiment 2 und 3 verwendet (siehe Beispiel 7.3.2 und Beispiel 7.3.3)
  • Im Prinzip die gleiche Verfahrensweise und der gleiche Satz von Reagenzien wie oben. Zusätzlich wird jede einzelne Probe mit einer geliebten RNA („amoured RNA") als interner Kontrolle (IC, siehe unten) versetzt, der Extraktionsprozeß wird bei ca. 40°C temperiert, und die Volumen werden auf ein Gesamtvolumen von 2 ml Lyse-Mix eingestellt, d.h.
    • 50 μl IC
    • 50 μl Proteinase K
    • 850 μl Probe
    • 1000 μl Lysepuffer
    • 100 μl MGP-Suspension
    • 200 μl Waschpuffer für jeweils 5 Waschschritte
    • 125 μl Elutionsmittel
  • – Manuelles Protokoll (1,5 ml); => für Experiment 4 verwendet, siehe Beispiel 7.3.4
    • 80 μl Proteinase K zu 420 μl Plasmaprobe geben, am Vortex-Gerät mischen,
    • 500 μl Lysepuffer zugeben, 10 min bei Raumtemperatur unter mechanischer Bewegung (1300 UpM in Eppendorf-Mixer) inkubieren,
    • 500 μl in Isopropanol suspendierte MGP (Konzentration 6 mg/ml) zugeben, am Vortex-Gerät mischen und 20 min bei Raumtemperatur auf einem Rollenmischer inkubieren,
    • magnetisches Trennen unter Verwendung eines magnetischen Dynal-Separators (2 min);
    • nichtgebundene Fraktion durch Absaugen entfernen und 700 μl Waschpuffer zugeben, am Vortex-Gerät mischen, trennen, absaugen;
    • Waschprozedur noch 4mal wiederholen,
    • 100 ml DEPC-Wasser zugeben, Röhrchen verschließen, am Vortex-Gerät mischen und 15 min bei 80°C in einem Eppendorf-Thermomixer bei 1300 UpM eluieren,
    • Kügelchen von wäßrigem Überstand (= Eluat) mit dem magnetischen Dynal-Separator trennen (2 min),
    • Eluat bis zur weiteren Verwendung einfrieren.
  • Amplifikation
    • Gesamtreaktionsvolumen = 100 μl für alle Tests
    • HBV: Eluatvolumen für PCR = 20 μl
  • Figure 00600001
    • HCV: Eluatvolumen für PCR = 40 μl
  • Figure 00610001
    • HIV: Eluatvolumen für PCR = 40 μl
  • Figure 00610002
  • Nach der PCR wird UNG durch Zugabe von Laurylsarcosin (Gebrauchskonzentration 1%) blockiert.
  • Es werden die folgenden Thermocycling-Abläufe durchgeführt.
  • Figure 00610003
  • Figure 00620001
  • Nachweis am modifizierten Elecsys 1010®
  • Figure 00620002
  • 7.2 Homogene Funktionstests: 5'-Nuklease-Assay-Technologie an einem Cobas Taqman®
  • 7.2.1 Allgemeine Betrachtungen
  • Die Lyse der Viruspartikel wird ebenso wie die Adsorption, Reinigung und Elution von aus der Probe extrahierten Nukleinsäuren wie oben beschrieben ausgeführt (siehe Beispiel 7.1.2). Wiederum wird die Amplifikation von Zielmolekülen durch die Gleichung Ni = N0 × (1 + E)n beschrieben, wobei
    • N0
    = Anzahl Moleküle beim Start der Polymerasekettenreaktion
    Ni
    = Anzahl Moleküle am Ende der Polymerasekettenreaktion
    E
    = Effizienz der Amplifikation = 0 ≤ E ≤ 1
    n
    = Anzahl Reaktionszyklen = in diesem Fall typischerweise 40 ≤ n ≤ 60.
  • Bei der 5'-Nuklease-Technologie sind jedoch Amplifikations- bzw. Nachweisreaktionen eng miteinander verwoben und finden in der Lösungsphase statt, d.h. ohne Festphasenimmobilisation und entsprechende Waschschritte (= homogene PCR). Hierzu wird der PCR-Mastermix mit Nachweissonden mit zwei bestimmten chemischen Modifikationen versetzt. Bei einer dieser Modifikationen handelt es sich um eine fluorogene Reportergruppe (R, beispielsweise ein Derivat von 6-Carboxyfluorescein), das kovalent am Grundgerüst der Sonde gebunden ist, wobei es sich bei der anderen Modifikation um einen Farbstoff (beispielsweise ein Polymethin-Cyanin-Derivat) handelt, das zur Absorption des Fluoreszenzlichts des Reporters und zum Quenchen davon fähig ist (Quencher). Der Quencher wird typischerweise am 5'-Ende des Sondengrundgerüsts gebunden, wohingegen der Reporter innerhalb der Oligosequenz lokalisiert und vom Quencher durch eine Reihe von Nukleotidbausteinen räumlich getrennt ist.
  • Diese Sonden binden an die Zielnukleinsäure (Sense- oder Antisense-Strang) nahe am 3'-Ende eines Primers (rückwärts oder vorwärts). Sobald ein Primer an das Ziel gebunden hat und DNA-Polymerase an das Primer:Ziel-Hybrid bindet, beginnt die Elongation. Aufgrund der 5'-Nukleaseaktivität des Enzyms wird die Sonde gleichzeitig mit der Synthese des Kopienstrangs gespalten, sobald die Polymerase die Sondenbindungsstelle erreicht, woraufhin der Reporter und der Quencher getrennt werden und das Fluoreszenzsignal meßbar wird. Dieser Vorgang wird mit jedem Zyklus wiederholt, wobei mehr und mehr Fluoreszenzreporter in der Lösung angereichert wird, bis am Ende der Reaktion die Lösung an Reagenz verarmt. So werden in einer graphischen Auftragung von Signal gegen Zeit sigmoidale Wachstumskurven erzeugt. Je größer N0 ist, desto früher steigt die Signalkurve über das Rauschniveau.
  • Derjenige Punkt auf der Zeitachse, an dem das Fluoreszenzsignal vom Hintergrundsignal deutlich getrennt werden kann, wird Schwellenzyklus („threshold cycle", ct) genannt. ct ist ein Maß für die Empfindlichkeit des Tests: Je kleiner der ct-Wert, desto empfindlicher ist der Test. ct-Werte können mittels unterschiedlicher mathematischer Operationen berechnet werden, beispielsweise Cut-off-Ansätzen (die mit einem konstanten Faktor multiplizierte durchschnittliche Hintergrundsignalintensität ergibt eine Cut-off-Signalintensität, um negativ von positiv zu trennen) oder Ansätze, bei denen der Ort des Maximums der ersten Ableitung der Signal-gegen-Zeit-Kurve (d.h. das Steilheitsprofil) oder der Ort des Maximums der zweiten Ableitung auf der Zeitachse berechnet und als ct definiert werden.
  • Diese Amplifikations-/Nachweistechnologie erlaubt das Verfolgen der PCR in Echtzeit und ebenso die Bearbeitung in geschlossenen Röhrchen, d.h. im Gegensatz zu Standardverfahren bleiben die PCR-Röhrchen nach dem Pipettieren von Eluat und Mastermix geschlossen, wodurch die Kontaminationsgefahr wirksam reduziert wird.
  • Zudem besteht, falls man Primer- und Sondensätze für unterschiedliche Virusspezies (und somit unterschiedliche Analytmoleküle und Zielsequenzen) kombiniert in einem Mastermix verwendet, die Möglichkeit, mehrere Amplifikations-/Nachweisreaktionen gleichzeitig durchzuführen, je nach der Viruslast des untersuchten Individuums. Dies stellt die Grundlage für sogenannte Multiplex-Assays dar.
  • Darüber hinaus werden aufgrund der Allgemeingültigkeit der auf MGP beruhenden Probenpräparation alle in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren über physikalischchemische Adsorption an die Teilchenoberfläche unabhängig von Sequenzeigenschaften extrahiert. Dies schließt auch aus aufgebrochenen Blutzellen, z.B. Leukozyten, freigesetzte menschliche DNA (hDNA) ein, deren Titer entsprechend dem physiologischen oder pathologischen Zustand des individuellen Blutprobenspenders starke Unterschiede aufweisen kann. So können beispielsweise im Fall von Autoimmunkrankheiten, wie etwa SLE, hDNA-Niveaus beträchtlich erhöht sein. So stellen hDNA und eine oder mehrere in einer gegebenen Probe vorhandene pathogene Nukleinsäuren ein Gemisch aus verschiedenen Nukleinsäuren unterschiedlicher Sequenzspezifitäten dar, die koextrahiert werden. Sie bilden eine Matrix von Polynukleotiden, die ohne Unterscheidung extrahiert werden, woraufhin eine sequenzspezifische Amplifikation und sequenzspezifischer Nachweis von Zielnukleinsäuren über die Wechselwirkung mit spezifischen Primern und Sonden unter entsprechenden Reaktionsbedingungen erfolgt.
  • Bei einem gegebenen pathologischen Spiegel von 4000 ng/ml hDNA im Plasma im Fall von SLE sowie einer geringen Viruslast von 50 Kopien genomischer Virus-RNA pro ml Plasma sowie 10 000 Nukleotiden pro genomischer RNA, mit ca. 325 Dalton (1 Dalton = 1,66 × 10–24 g) pro Nukleotid, produzieren 50 Kopien oder 500 000 Nukleotide Ziel-RNA ca. 2,7 × 10–7 ng pro ml Plasma, was zu einer relativen Häufigkeit von Ziel:Nichtziel-Nukleinsäure von ungefähr 1:10+12 führt! Hut ist mehr, um den Gesamtprozeß zu verfolgen, kann den Proben ein künstliches Nukleinsäurekonstrukt zugesetzt werden, das vorzugsweise in einem modifizierten Viruspartikel verpackt (geschützt) ist und das mit dem natürlichen Ziel koextrahiert und koamplifiziert wird. Das Merkmal dieser internen Kontrolle (IC) ist ein einzigartiger Sondenbindungsbereich für eine IC-Nachweissonde, die sich von zielspezifischen Sonden durch eine unterschiedliche Reportergruppe mit unterscheidbaren Emissionseigenschaften unterscheidet. Somit kann das IC-Signal vom Zielsignal unterschieden werden und fungiert, da man weiß, daß die IC in der Probe vorhanden ist, als Überwachungsagens. Somit erweitert eine Mehrfachmarkierung die Nützlichkeit der Multiplex-Assay-Technologie. Die interne Kontrolle (IC) ist in der WO98/00547 beschrieben.
  • 7.2.2 Versuchsprotokoll
  • 7.2.2.1 Reagentien
  • 7.2.2.1.1 Probenpräparation
    • Siehe oben (Beispiel 7.1.2 => automatisches Protokoll am intern gebauten Extraktor)
  • 7.2.2.1.2 5'-Nuklease-Test, Edukte und Reaktionsbedingungen
    Figure 00670001
    • * Das restliche Glycerin wird über die Enzyme ZO5 (ein Mutein der Tth-DNA-Polymerase) und UNG (Uracil-N-glycosidase) zugegeben.
  • Der allgemeine zeitliche Ablauf des Multiplex-Thermocycling ist für alle Testparameter wie folgt:
    UNG-Schritt 45°C–10 min
    Denaturierung 94°C–30 s
    Reverse Transkription 58°C–30 min
    PCR 95°C–20 s/59°C–50 s 5× 91°C–15 s/52°C–50 s 55×
    7.2.2.1.3 Sequenzen
    Primer:
    HIV-Forward SEQ ID NO 12
    HIV-Forward SEQ ID NO 13
    HIV-Reverse SEQ ID NO 14
    HCV-Forward SEQ ID NO 15
    HCV-Reverse SEQ ID NO 16
    HBV-Forward SEQ ID NO 17
    HBV-Reverse SEQ ID NO 18
    Sonden:
    HIV: SEQ ID NO 19
    HCV: SEQ ID NO 20
    HBV: SEQ ID NO 21
    IC: SEQ ID NO 22
    Aptamer: SEQ ID NO 23
    • Schmelztemperatur des DNA-Polymerase-Aptamer-Komplexes = 51,7°C (= 50% Dissoziation)
  • Terminologie der chemischen Derivatisierungen:
  • Einige der Oligonukleotide werden mit Cy5 derivatisiert, bei dem es sich um ein an einen Alkylphosphatidyl-linker gekoppeltes Pentamethindiindocarbocyanin handelt (Cy5-N-Ethylphosphoramidit von Pharmacia Biotech) und das als Quencher fungiert (Q); λEX = 630 nm, λEM = 665 nm. Einige der Oligonukleotide sind mit FAM derivatisiert, wobei es sich um an einen 2-(Aminocyclohexyl)propan-1,3-diol-linker gekoppeltes 6-Carboxyfluorescein handelt (CX-FAM-Phosphoramidit von Biogenex) und das als Reporter für Zielmoleküle fungiert (R) ; λEX = 485 nm, λEM = 515 nm. Einige der Oligonukleotide sind mit derivatisiert, wobei es sich um an einen 2-(Aminocyclohexyl)propan-1,3-diol-linker gekoppeltes Hexachlor-6-carboxyfluorescein handelt (CX-HEX-Phosphoramidit von Biogenex) und das als Reporter für die interne Kontrolle fungiert (R); λEX = 530 nm, λEM = 585 nm.
  • 7.2.2.1.4 Reaktionsbedingungen
  • Die Reaktionsbedingungen sind in den Ergebnissen der Experimente beschrieben (siehe Beispiel 7.3).
  • 7.2.2.1.5 Weitere Materialien
    • – Virus-negatives Plasma (0-Matrix, Einzelplasma oder Plasma-Pool), z.B. Citrat-Plasma oder EDTA-Plasma
    • – Virus-positives Plasma oder virushaltige Kulturüberstände, die zur Einstellung bestimmter Virustiter durch Mischen mit 0-Matrix in entsprechenden Verhältnissen verwendet werden können.
    • – Alternativ: in-vitro-Transkripte mit den zu untersuchenden Zielsequenzen
    • – menschliche Plazenta-DNA (a. genomisch, Sigma Kat.-Nr. D4642; b. fragmentiert, Sigma Kat.-Nr. D3287), zu den Proben gegeben, um pathologische Bedingungen zu simulieren, die zur verstärkten Freisetzung intrazellulärer Substanzen und somit zu erhöhten Spiegeln von DNA/RNA im Blut führen, z.B. Autoimmunkrankheit wie etwa SLE oder Hämolyse.
  • 7.3 Ergebnisse der Funktionstests
  • 7.3.1 Experiment 1
  • Unterschiedliche MGP-Proben des Typs EJ/CERAC werden mit den in 7.1 beschriebenen Verfahren untersucht. Bei der Testvariablen handelte es sich um den Sprühdruck:
    • EJ0100.5R – 1,5 bar
    • EJ0106.5R – 2,5 bar
    • EJ0107.5R – 3,5 bar
    • EJ0108.5R – 4,3 bar
  • Es konnte gezeigt werden, daß mit steigendem Sprühdruck, d.h. Verschiebung zu einem kleineren durchschnittlichen Kügelchendurchmesser, die unspezifische Bindung (USB) abnimmt, wohingegen die hochspezifische Signalerzeugung unverändert ist, was zu erhöhten Signal-Rausch-Verhältnissen führt.
  • Die Virustitereinstellung von 0,5 × GG entspricht ungefähr 100 sgu/ml (sgu = signalerzeugende Einheiten) im Falle von HBV, und ungefähr 150 sgu/ml im Fall von HIV. Die Daten sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
  • 7.3.2 Experiment 2
  • Jeweils zwei Varianten des Typs EJ/MMB bzw. EJ/CERAC werden funktionell unter Verwendung des in Beispiel 7.2 in Verbindung mit Multipool- (MP) und einzelnen (PL) Plasmaproben beschriebenen Verfahrens verglichen. EJ0047.2R (MMB) und EJ0100.5R (CERAC) werden unter Standardbedingungen, d.h. 1,5 bar, 230°C Eingangstemperatur und ungefähr 110°C Ausgangstemperatur gesprüht. Bei EJ0102.2R (MMB) und EJ0108.5R (CERAC) handelt es sich bezüglich den Sprühbedingungen um Entwicklungsvarianten (Eingangstemperatur reduziert auf 200°C [MMB]) und Sprühdruck erhöht auf 4,3 bar [CERAC]). Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt und zeigen das Potential der CERAC-Nano-Kern-Teilchen für die Erzielung einer höheren Empfindlichkeit, wie beispielhaft anhand des früheren Schwellenzyklus und/oder der größeren Signalunterschiede (Sättigungssignal minus Rauschniveau, S-N) dargestellt.
  • 7.3.3. Experiment 3
  • Mehrere MGP-Präparationen des Typs EJ/MMB und EJ/CERAC (siehe Tabelle 9) werden funktionell mit den wie in Beispiel 7.2 beschriebenen Verfahren verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefaßt und zeigen das Potential der Teilchen vom Typ EJ0096.5R-01 zur Erzielung einer höheren Empfindlichkeit, wie beispielhaft anhand des früheren Schwellenzyklus oder der höheren Trefferrate unabhängig vom jeweiligen Test dargestellt.
  • 7.3.4. Experiment 4
  • Mehrere MGP-Präparationen des Typs EJ/MMB und EJ/CERAC werden unter Verwendung des wie in Beispiel 7.1 beschriebenen Verfahrens funktionell verglichen, wobei die Adsorptionsinkubation mit oder ohne Schütteln ausgeführt wird. Dadurch wird die Sedimentationsgeschwindigkeit kritisch, d.h. je höher die Sedimentationsgeschwindigkeit, desto höher die Anzahl an Teilchen, die von der Wechselwirkung mit dem Analyten in dem sich bildenden Präzipitat entfernt werden. Ist dagegen die Sedimentationsgeschwindigkeit kleiner, so liegt eine längere Zeitspanne vor, in der Analytmoleküle aus der Flüssigkeit an die Oberfläche des Adsorbens adsorbieren können. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt (EJ0047.2R wurde als Referenz verwendet) und zeigen, daß ohne mechanische Bewegung der Leistungsverlust am höchsten (> 40%) beim MMB-Typ (unterscheidet sich beträchtlich von den Charakteristika der vorliegenden Erfindung) und am geringsten bzw. praktisch nicht vorhanden ist beim CERAC-Typ (am nächsten zu den erfindungsgemäßen Charakteristika innerhalb dieser Reihe).
  • Um die Funktionalität der unterschiedlichen Typen von MGP gründlich zu beurteilen, wurde für jeden Typ ein Leistungsindex auf die folgende Weise berechnet:
    • – Das Eluat mehrerer Ansätze für jeden Typ von MGP bzw. jedes Titerniveau werden in 1-Eluat-Pool vereinigt
    • – Aus jedem Eluat-Pool werden 3 Amplifikationen für jeden Test (HIV, HCV, HBV) durchgeführt
    • – Jedes Amplikon wurde in Einzelform am modifizierten Elecsys 1010® gemessen
    • – Signale werden für jeden Typ von MGP, Test und Titernivau gemittelt
    • – Signal-Rausch(S/N)-Faktoren werden für jeden Typ von MGP bzw. Test berechnet, d.h. niedriger Titer (schwach positiv) über O-Matrix (negativ) und erhöhter Titer über O-Matrix
    • – S/N-Faktoren werden auf den MGP-Referenztyp zu der Zeit normiert
    • – Berechnung der Summe von normierten S/N-Faktoren für jeden Typ von MGP, über alle Tests und Titernivaus kumuliert; S/N-Faktoren für den Niedrigtiterbereich weisen eine 2fache Wichtung gegenüber denjenigen für das hohe Titernivau auf, um so die Empfindlichkeitsaspekte zu betonen
    • – Bei der erhaltenen Summe handelt es sich um den jeweils jedem untersuchten Typ von MGP zugeordneten Leistungsindex
  • 7.3.5 Experiment 5
  • Unterschiedliche Typen von MGP wurden zur Extraktion von HCV-in-vitro-Transkripten verwendet, die in einem Verdünnungsmittel mit 10 mmol/l Tris, pH 80, 1 mM EDTA, 20 μg/ml poly-A-RNA und 0,05% NaN3 auf verschiedene Titerniveaus verdünnt wurden, und dem vereinigten Plasma zugesetzt.
  • Menschliche Hintergrund-DNA (hBG-DNA) wurde bei 0 bzw. 4000 ng/ml der Probe zugesetzt. Überraschenderweise ist es möglich, die Störung durch hBG-DNA über die Kügelchenauswahl zu verringern, die sich anhand der in Tabelle 12 angegebenen Daten zeigt.
  • 7.3.6. Experiment 6
  • Verschiedene Arten von MGP wurden zur Bearbeitung HCV-positiver Plasmaproben verwendet. Dabei wurde menschliche Hintergrund-DNA (hBG-DNA) bei 0 bzw. 4000 ng/ml der Probe zugesetzt. Wiederum wird ein signifikanter Einfluß der Kügelchengröße und Kügelchengeometrie beobachtet. Die MGP-Präparation EJ0096.5R, die die MGP-Qualität gemäß der vorliegenden Erfindung am besten repräsentiert, zeigt sehr eindeutige Vorteile, sowohl hinsichtlich einer minimalen Verschiebung der ct-Werte als auch eines geringeren Verlusts an spezifischer Signalerzeugung (S-N), wie von den in Tabelle 13 dargestellten Daten angezeigt wird.
  • Tabelle 1
    Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Tabelle 2
    Figure 00760001
  • Tabelle 3
    Figure 00770001
  • Tabelle 4
    Figure 00780001
  • Tabelle 5
    Figure 00790001
  • Tabelle 6
    Figure 00800001
  • Tabelle 7
    Figure 00810001
  • Tabelle 8
    Figure 00820001
  • Tabelle 9
    Figure 00830001
  • Tabelle 10
    Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Tabelle 11
    Figure 00860001
  • Tabelle 12
    Figure 00870001
  • Tabelle 13
    Figure 00880001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • Figure 00970001
  • Figure 00980001
  • Figure 00990001
  • Figure 01000001
  • Figure 01010001

Claims (54)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung von magnetischen Glasteilchen, bei dem man a) magnetische Objekte mit einem Durchmesser zwischen 5 und 500 nm in einem Sol suspendiert, b) die Suspension in einem Sprühtrockner mit zwei Sprühdüsen sprühtrocknet und c) das sprühgetrocknete Pulver sintert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Eingangstemperatur des Sprühtrockners mit zwei Sprühdüsen zwischen 120 °C und 500°C liegt, die Ausgangstemperatur gemäß dem Kochpunkt des Sols gewählt wird und der Sprühdruck mindestens 3 bar beträgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Eingangstemperatur des Sprühtrockners mit zwei Sprühdüsen zwischen 170°C und 230°C, vorzugsweise zwischen 190°C und 210°C liegt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Sprühdruck zwischen 4 und 6 bar liegt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Sol als Lösungsmittel Ethanol enthält.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangstemperatur zwischen 50°C und 300°C liegt.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangstemperatur zwischen 90°C und 100°C liegt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sintertemperatur zwischen 400°C und 1200°C, vorzugsweise zwischen 720°C und 770°C liegt.
  9. Magnetische Glasteilchen, erhältlich mit einem Prozeß gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Zusammensetzung von magnetischen Glasteilchen, erhältlich mit einem Prozeß gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, die mindestens ein magnetisches Objekt mit einem mittleren Durchmesser zwischen 5 und 500 nm enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die Halbwertszeit für die Sedimentation einer Suspension der Zusammensetzung in Isopropanol von 3 mg/ml (Gewicht pro Volumen) mehr als 3 min beträgt.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Objekt einen mittleren Durchmesser zwischen 10 und 200 nm, vorzugsweise zwischen 15 und 50 nm aufweist.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Halbwertszeit mehr als 6 min beträgt.
  13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Objekt einen mittleren Durchmesser von 23 nm aufweist.
  14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des Durchmessers des Magnetkörpers zu dem des Glasmantels weniger als 1:10 beträgt.
  15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Glasteilchen einen mittleren Durchmesser zwischen 0,5 μm und 5 μm aufweisen.
  16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Glasteilchen Mikroporen aufweisen.
  17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Porenoberfläche der magnetischen Glasteilchen weniger als 10% der Gesamtoberfläche beträgt.
  18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Objekt superparamagnetisch ist.
  19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Objekt ferrimagnetisch oder ferromagnetisch ist.
  20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Objekt Eisen oder Eisenoxid umfaßt.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Eisenoxid um Fe3O4 oder γ-Fe2O3 handelt.
  22. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Glasteilchen eine Oberfläche von mehr als 4 m2/g aufweisen.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Glasteilchen eine Oberfläche zwischen 5 und 100 m2/g, vorzugsweise im Bereich von 10 bis 50 m2/g, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 15 bis 30 m2/g, aufweisen.
  24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Glasteilchen weitgehend kugelförmig sind.
  25. Suspension, enthaltend eine Zusammensetzung von magnetischen Glasteilchen in einer Flüssigkeit nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
  26. Suspension nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit einen Alkohol umfaßt.
  27. Suspension nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Alkohol um Isopropanol oder Ethanol handelt.
  28. Suspension nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Flüssigkeit um eine gepufferte wäßrige Lösung handelt.
  29. Suspension nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension zusätzlich DNA oder RNA enthält.
  30. Suspension nach einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension zusätzlich ein Chaotrop enthält.
  31. Suspension nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Chaotrop in einer Konzentration zwischen 2 und 8 mol/l und vorzugsweise zwischen 4 und 6 mol/l vorliegt.
  32. Suspension nach einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension 5 bis 60 mg/ml einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10–24 enthält.
  33. Röhrchen, enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 24 oder eine Suspension nach einem der Ansprüche 25 bis 32.
  34. Kit-of-parts, enthaltend ein Röhrchen nach Anspruch 33.
  35. Kit-of-parts nach Anspruch 34, ferner enthaltend eine Waschlösung oder ein Elutionsmittel.
  36. Kit-of-parts nach Anspruch 34 oder 35, ferner umfassend zur Aufreinigung einer Nukleinsäure geeignete Reagentien.
  37. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 24 zur Herstellung einer Suspension.
  38. Verwendung einer Suspension nach einem der Ansprüche 25 bis 32 zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.
  39. Verwendung eines Kit-of-parts nach Anspruch 34 oder 35 zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.
  40. Verfahrensweise zur Isolierung eines biologischen Materials, bei der man a) eine das biologische Material in einer Flüssigkeit enthaltende Probe mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 24, magnetischen Glasteilchen nach Anspruch 9 oder einer Suspension nach einem der Ansprüche 25 bis 32 unter Bedingungen, bei denen das biologische Material direkt an die Glasoberfläche bindet, in Kontakt bringt und b) das biologische Material von der Flüssigkeit trennt.
  41. Verfahrensweise nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologischen Material um eine Nukleinsäure handelt.
  42. Verfahrensweise nach Anspruch 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung mit Hilfe eines Magneten bewerkstelligt wird.
  43. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen beim Inkontaktbringen mit der Probe nicht vormagnetisiert sind.
  44. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Verfahrensweise automatisiert ist.
  45. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die Verfahrensweise ein Format mit hohem Durchsatz aufweist.
  46. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Verfahrensweise einem Aufbewahrungsbehälter eine Suspension nach einem der Ansprüche 25 bis 28 entnommen wird und Teilvolumen der Suspension in unterschiedliche Reaktionsgefäße gegeben werden.
  47. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure nach der Aufreinigung nachgewiesen wird.
  48. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure nach einem Amplifikationsschritt nachgewiesen wird.
  49. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 40 bis 48, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure durch einen Prozeß nachgewiesen wird, bei dem man: a) die Probe mit einem eine zu einem Bereich der Zielnukleinsäure komplementäre Sequenz enthaltenden Oligonukleotid und einem eine zu einem zweiten Bereich der gleichen Zielnukleinsäure komplementäre Sequenz enthaltenden markierten Oligonukleotid, das jedoch nicht die durch das erste Oligonukleotid definierte Nukleinsäuresequenz enthält, zur Erzeugung eines Gemischs aus Duplexen bei Hybridisierungsbedingungen in Kontakt bringt, wobei die Duplexe die in einer Annealing-Reaktion an das erste Oligonukleotid und an das markierte Oligonukleotid angelagerte Zielnukleinsäure umfassen, so daß das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids neben dem 5'-Ende des markierten Oligonukleotids liegt, b) das Gemisch aus Schritt a) mit einer eine 5'-nach-3'-Nukleaseaktivität aufweisenden matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase unter Bedingungen, die ausreichen, um die Spaltung des angelagerten, markierten Oligonukleotids durch die 5'-nach-3'-Nukleaseaktivität der Polymerase und die Freisetzung markierter Fragmente zu gestatten, behandelt und c) das durch die Hydrolyse des markierten Oligonukleotids erzeugte Signal nachweist und/oder mißt.
  50. Verfahrensweise nach Anspruch 48 und 49, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis in Gegenwart eines Blockierungsoligonukleotids durchgeführt wird.
  51. Verfahrensweise nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Blockierungsoligonukleotid um ein Aptamer handelt.
  52. Verfahrensweise nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß das Aptamer die Sequenz SEQ ID NO: 23 aufweist.
  53. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 50 bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikations- und Nachweisreaktion in einem Multiplex-Assay-Format mit homogener Lösungsphase für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Ziele durchgeführt wird.
  54. Verfahrensweise nach einem der Ansprüche 51 bis 53, dadurch gekennzeichnet, daß über mindestens 5 Zyklen der Polymerasekettenreaktion die Annealing-Temperatur weniger als 8 °C, vorzugsweise weniger als 3 °C oberhalb der Dissoziationstemperatur des Polymerase-Aptamer-Komplexes liegt.
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