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Dies
ist eine Continuation-Anmeldung von US Provisional Application Nr.
60/167,228, eingereicht am 24. November 1999.
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue zytotoxische Mittel und ihre
therapeutische Anwendung. Die Erfindung betrifft insbesondere neue
zytotoxische Mittel, die Taxane umfassen und deren therapeutische
Anwendung. Diese neuen zytotoxischen Mittel weisen eine therapeutische
Anwendbarkeit als Folge der Abgabe beziehungsweise des Transports
der Taxane an eine spezifische Zellpopulation in einer zielgerichteten
Art und Weise auf, durch chemisches Binden der Taxane an ein Zell
bindendes Mittel.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es
sind viele Berichte über
das versuchsweise spezifische Targeting von Tumorzellen mit monoklonalen
Antikörper-Arzneistoffkonjugaten
erschienen (Sela et al., in Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel,
Herausgeber 1987); Ghose et al., in Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg,
Herausgeber 1983); Diener et al., in Antibody mediated delivery
Systems 1-23 (J. Rodwell, Herausgeber 1988); Bumol et al., in Antibody
mediated delivery systems 55-79
(J. Rodwell, Herausgeber 1988)). Alle Referenzen und Patente, die
hierin erwähnt
sind, sind durch Bezugnahme mit aufgenommen.
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Zytotoxische
Arzneistoffe wie beispielsweise Methotrexat, Daunorubicin, Doxorubicin,
Vincristin, Vinblastin, Melphalan, Mitomycin C und Chlorambucil
wurden an eine Vielzahl muriner monoklonaler Antikörper konjugiert.
In einigen Fällen
wurden die Arzneistoffmoleküle
an die Antikörpermoleküle durch
ein Zwischenträger-Molekül, wie beispielsweise
Serumalbumin (Garnett et al., 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa
et al. 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al.,
47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)), Dextran (Hurwitz et al., 2 Appl.
Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291
(1985); Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986) ; Sho val
et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. 8276-8280 (1988)), oder Polyglutaminsäure gebunden
(Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984); Kato et
al. 27 J. Med. Chem. 1602-1607
(1984); Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)).
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Ein
breites Aufgebot an Linker-Technologien wurde zur Herstellung derartiger
Immunkonjugate verwendet und sowohl spaltbare als auch nicht-spaltbare
Linker wurden untersucht. In den meisten Fällen konnte das volle zytotoxische
Potential der Arzneistoffe jedoch nur beobachtet werden, wenn die
Arzneistoffmoleküle aus
den Konjugaten in unmodifizierter Form am Zielort freigesetzt wurden.
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WO
98/19705 beschreibt Verfahren zum Konjugieren von Arzneistoffen,
einschließlich
von Taxolen unter anderen Beispielen, an zellbindende Mittel, einschließlich unter
anderem von Antikörpern, über einen
verzweigten Peptid-Linker. In den für Taxane angegebenen Beispielen
werden zwei Paclitaxel-Moleküle über eine Carbonatbindung
an C-7 an einen langen symmetrischen Peptidlinker gebunden, der
eine Maleimidogruppe zum Koppeln eines Zellbindungsmittels enthält. Der
Peptidlinker enthält
zwei Lysinreste zur unmittelbaren Freisetzung von Paclitaxel. EP-A-0
624 377 umfasst dieselbe Offenbarung wie WO 98/19705 und beschreibt
Arzneistoffe, die über
Peptidlinker an zellbindende Mittel gebunden sind, die durch lysosomale
Enzyme gespalten werden können.
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J.
Med. Chem., Band 42, 1999, Seiten 4919 bis 4924 offenbart Paclitaxel-Konjugate,
die eine Bindung durch C-2' über einen
einfachen Succinat-Linker umfassen. Dasselbe trifft für EP-A-1
033 372 und WO 99/25729 zu, die die Verwendung von öffentlich
bekannten Taxanen feststellen.
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WO
89/12624 beschreibt heterobifunktionelle Kopplungsmittel, die sterisch
gehinderte Disulfid-Brücken
zwischen Amin-enthaltendem Material wie beispielsweise Proteinen
oder Peptiden, beispielsweise Antikörpern oder Antikörperfragmenten,
insbesondere eines Anti-Tumor-Antikörpers, Träger-Proteinen, aminierten chromatographischen
Trägern
und aminierten Membranen und Thiol enthaltenen Materialien wie beispielsweise
Toxinen, Fab-Fragmenten, Cytokinen mit Thiolgruppen, die für ihre biologische
Aktivität
nicht notwendig sind, wie beispielsweise Interleukine, Interferone
etc. und andere Proteine wie beispielsweise TPA, chromatographische
Materialien, Polysaccharide und inerte Materia lien, vorzugsweise
enzymatisch aktive Toxine von bakteriellem, Pilz- oder Pflanzen-Ursprung, bereitstellen.
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WO
98/52614 beschreibt die Bindung von Arzneistoffmolekülen an Transportpolymere,
die dazu in der Lage sind, Arzneistoffe durch Zellmembranen zu transportieren.
Ins Auge gefasste Arzneistoffmoleküle schließen Metall-Chelate, kleine
organische Moleküle
wie beispielsweise Taxane und Makromoleküle ein. Die Bindung erfolgt
auf einem solchen Wege, dass unverändert Arzneistoff aus dem Polymer
freigesetzt wird.
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Einer
der spaltbaren Linker, der für
die Herstellung von Antikörper-Arzneistoffkonjugaten
verwendet wird, ist ein Säure-labiler
Linker auf Grundlage von cis-Aconitinsäure, der von der sauren Umgebung
unterschiedlicher intrazellulärer
Kompartimente wie beispielsweise den Endosomen, was während einer
Rezeptor-vermittelten Endozytose eintritt, und den Lysosomen, profitiert.
Shen und Ryser haben dieses Verfahren zur Herstellung von Konjugaten
von Daunorubicin mit makromolekularen Trägern eingeführt (102 Biochem. Biophys.
Res. Commun. 1048-1054 (1981)). Yang und Reisfeld verwendeten dieselbe
Technologie, um Daunorubicin an Anti-Melanom-Antikörper zu
binden (80 J. Natl. Canc. Inst. 1154-1159 (1988)). Dillman et al.
verwendeten ebenfalls einen Säure-labilen
Linker in einer ähnlichen
Weise zur Herstellung von Konjugaten von Daunorubicin mit einem
Anti-T-Zell-Antikörper (48
Cancer Res. 6097-6102 (1988)).
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Ein
alternativer Ansatz, erforscht von Trouet et al., schloss die Bindung
von Daunorubicin an einen Antikörper über einen
Peptid-Spacer-Arm ein (79 Proc. Natl. Acad. Sci. 626-629 (1982)).
Dies wurde unter der Prämisse
durchgeführt,
dass freier Arzneistoff aus einem solchen Konjugat durch die Wirkung
lysosomaler Peptidasen freigesetzt werden könnte.
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Jedoch
haben in vitro Zytotoxizitätstests
gezeigt, dass Antikörper-Arzneistoff-Konjugate
selten dieselbe zytotoxische Wirksamkeit wie die freien unkonjugierten
Arzneistoffe erreichen. Dies legt nahe, dass Mechanismen, durch
die Arzneistoff-Moleküle
aus den Antikörpern
freigesetzt werden, sehr uneffizient sind. Auf dem Gebiet von Immuntoxinen
wurde gezeigt, dass Konjugate, die über Disulfid-Brücken zwischen
monoklonalen Antikörpern
und katalytisch aktiven Proteintoxinen gebildet wurden, zytotoxischer
als Konjugate sind, die andere Linker enthalten. Siehe Lambert et
al., 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al., in Immunotoxins
175-209 (A. Frankel, Herausgeber 1988); Ghetie et al., 48 Cancer
Res. 2610-2617 (1988). Dies wurde der hohen intrazellulären Konzentration
von Glutathion zugeschrieben, die zu einer effizienten Spaltung
der Disulfid-Brücke
zwischen einem Antikörper-Molekül und einem
Toxin beiträgt.
Trotzdem existieren nur einige berichtete Beispiele der Verwendung
von Disulfid-Brücken
zur Herstellung von Konjugaten zwischen Arzneistoffen und Makromolekülen. Shen
et al. (260 J. Biol. Chem. 10905-10908
(1985)) beschreiben die Umwandlung von Methotrexat in ein Mercaptoethylamidderivat
gefolgt von einer Konjugation mit Poly-D-lysin über eine Disulfid-Brücke. Ein
anderer Bericht beschrieb die Herstellung eines Konjugats des Trisulfid
enthaltenden toxischen Arzneistoffs Calicheamycin mit einem Antikörper (Hinman
et al., 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993)).
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Ein
Grund für
das Fehlen von Disulfid-gebundenen Antikörper-Arzneistoff-Konjugaten
ist die mangelnde Verfügbarkeit
zytotoxischer Arzneistoffe, die eine Schwefel-Atom enthaltende Komponente
besitzen, die einfach zur Bindung des Arzneistoffs an einen Antikörper über eine
Disulfid-Brücke
verwendet werden können. Darüber hinaus
ist eine chemische Modifikation existierender Arzneistoffe ohne
Verringerung ihres zytotoxischen Potentials schwierig.
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Ein
anderer Hauptnachteil bei existierenden Antikörper-Arzneistoff-Konjugaten
ist ihr mangelndes Vermögen,
eine ausreichende Konzentration eines Arzneistoffes an den Zielort
wegen der beschränkten
Anzahl von als Ziel definierten Antigenen zu liefern und wegen der
relativ moderaten Zytotoxizität
von cancerostatischen Arzneistoffen wie Methotrexat, Daunorubicin
und Vincristin. Um eine signifikante Zytotoxizität zu erreichen, wird eine Bindung
einer großen
Anzahl von Arzneistoffmolekülen
entweder direkt an den Antikörpern oder
durch ein polymeres Trägemolekül notwendig.
Jedoch zeigen derartig schwere modifizierte Antikörper oftmals
eine verschlechterte Bindung an das Ziel-Antigen und eine rasche
in vitro Clearance aus dem Blutstrom.
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Trotz
der oben beschriebenen Schwierigkeiten wurde von nützlichen
zytotoxischen Mitteln, die Zellbindungskomponenten umfassen, und
der Gruppe von zytotoxischen Arzneistoffen, die als Maytansinoide
bekannt ist, berichtet (USP 5,208,020, USP 5,416,064 und R.V.J.
Chari, 31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104 (1998)). In ähnlicher
Weise wurde von nützlichen
zytotoxischen Mitteln, die Zellbindungskomponenten und Analoge und
Derivate des wirksamen Antitumor-Antibiotikums CC-1065 umfassen,
ebenfalls berichtet (USP 5,475,092 und USP 5,585,499).
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Paclitaxel
(Taxol), ein zytotoxisches Naturprodukt und Docetaxel (Taxotere),
ein halbsynthetisches Derivat (siehe 1) sind
in der Behandlung von Krebs weithin verwendet. Diese Verbindungen
gehören
zur Familie von Verbindungen, die als Taxane bezeichnet werden.
Taxane sind Mitose-Spindelgifte, die die Depolymerisation von Tubulin
hemmen, was eine Zunahme der Rate beziehungsweise Geschwindigkeit
des Mikrotubuli-Zusammenbaus
und einen Zelltod zur Folge hat. Während Docetaxel und Paclitaxel
nützliche
Mittel bei der Behandlung von Krebs sind, ist ihre Anti-Tumor-Aktivität wegen
ihrer unspezifischen Toxizität
gegenüber normalen
Zellen beschränkt.
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Weiterhin
sind Verbindungen wie Paclitaxel und Docetaxel selbst nicht ausreichend
wirksam, um in Konjugaten von zellbindenden Mitteln verwendet zu
werden. Kürzlich
wurden einige neue Docetaxel-Analoga mit einer größeren Wirkstärke als
entweder Docetaxel oder Paclitaxel beschrieben (Tao Wang et al.,
Synthesis and Biological Activity of Advanced 2nd Generation Taxoids,
Dept. of Chem, State University of NY at Stony Brook, NY 11794-3400;
Dept of Exp Therapeutics, Roswell Park Cancer Inst, Elm and Carlton
Streets, Buffalo, NY 14263, Seiten 1-12; und 1). Jedoch
fehlt diesen Verbindungen eine geeignete Funktionalität, die eine Bindung über eine
spaltbare Bindung an Zellbindungsmittel ermöglicht.
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Demgemäß besteht
ein großer
Bedarf nach einem Verfahren zur Behandlung von Krankheiten mit Taxanen,
wobei deren Nebenwirkungen reduziert werden, ohne ihre Zytotoxizität zu beeinträchtigen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Taxane bereitzustellen,
die in hohem Maße
toxisch sind und die in der Behandlung vieler Erkrankungen noch
effektiv verwendet werden können.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Taxane
bereitzustellen.
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Diese
und weitere Aufgaben wurden durch Bereitstellung eines zytotoxischen
Mittels gelöst,
das ein oder mehrere Taxane an ein Zellbindungsmittel gebunden umfasst.
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In
einer zweiten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung
bereit, die Folgendes umfasst:
- (A) eine wirksame
Menge eines oder mehrerer Taxane, gebunden an ein Zellbindungsmittel,
und
- (B) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Trägerstoff.
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In
einer dritten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen
bereit, umfassend das In-Berührung-Bringen
von Zielzellen oder Gewebe-enthaltenden Zielzellen mit einer zytotoxischen
Menge eines zytotoxischen Mittels, das ein oder mehrere Taxane gebunden
an ein Zellbindungsmittel umfasst.
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In
einer vierten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung Taxane bereit, die eine Bindungsgruppe
umfasst, die dazu in der Lage ist, Taxane an ein Zellbindungsmittel
oder andere chemische Komponenten zu binden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine chemische Formel, die die Strukturen verschiedener Taxane repräsentiert,
einschließlich
einiger der wirksameren Taxane, beschrieben von Ojima et al., siehe
oben.
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2 ist
eine chemische Formel, die Strukturen einiger der Disulfid-enthaltenden
Taxane gemäß der vorliegenden
Erfindung repräsentiert.
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3 zeigt
die Struktur von 10-Diacetylbaccatin III, das das Ausgangsmaterial
zur Herstellung von Taxanen ist.
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4 zeigt
die Anti-Tumor-Wirkung von Anti-EGF-Rezeptor-Antikörper-Taxankonjugaten auf
humane Plattenepitelkrebs(A431)xenotransplantate in SCID-Mäusen.
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5 zeigt
die Körpergewichtsveränderung
der SCID-Mäuse,
die in dem in Beispiel 10 beschriebenen Experiment verwendet wurden.
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6 zeigt
die Ergebnisse einer Zytotoxizitätsbestimmung
für das
Anti-EGF-Rezeptortaxankonjugat auf
die Targetantigen-positive Zell-Linie A431 und für das N901-Taxankonjugat, für das die
A431-Zell-Linie das Zielantigen nicht exprimiert.
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7 zeigt
die zytotoxische Wirksamkeit und Selektivität des TA.1-Taxankonjugats in der Zielantigen-positiven
Zell-Linie SK-BR-3 und die Zielantigen-negative Zell-Linie A431.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Synthese neuer Taxane, die
eine hohe Zytotoxizität
beibehalten und die effektiv an Zellbindungsmittel gebunden werden
können.
Es wurde kürzlich
gezeigt, dass die Bindung von in hohem Maße zytotoxischen Arzneistoffen
an Antikörper
unter Verwendung einer spaltbaren Bindung, wie beispielsweise einer
Disulfid-Brücke, die
Freisetzung von voll aktivem Arzneistoff innerhalb der Zelle sicherstellt
und solche Konjugate sind in einer Antigen-spezifischen Art und
Weise zytotoxisch (R.V.J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992);
U.S. Pat. Nr. 5,475,092 und U.S. Pat. 5,416,064). Jedoch zeigt der
Stand der Technik, dass es extrem schwierig ist, existierende Arzneistoffe
zu modifizieren, ohne ihr zytotoxisches Potential zu verringern.
Die offenbarte Erfindung überwindet
dieses Problem durch Modifizieren der offenbarten Taxane mit chemischen
Komponenten und insbesondere solchen, die Thiol oder Disulfidgruppen enthalten,
an die geeignete Zellbindungsmittel gebunden werden können. Als
Folge konser vieren die offenbarten neuen Taxane die zytotoxische
Potenz bzw. Wirksamkeit bekannter Taxane und in einigen Fällen können sie
diese sogar erhöhen.
Die Zellbindungsmittel-Taxankomplexe
ermöglichen
ein volles Maß an
zytotoxischer Wirkung der Taxane in einer zielgerichteten Anwendung
gegen unerwünschte
Zellen und verhindert deswegen Nebenwirkungen aufgrund einer Schädigung von
nicht als Ziel definierten gesunden Zellen. Diese Erfindung ermöglicht,
dass Taxane ortsgerichtet ausgerichtet werden, was bis jetzt nicht
möglich
war. Somit stellt die vorliegende Erfindung nützliche Mittel zur Eliminierung
erkrankter oder abnormaler Zellen bereit, die getötet oder lysiert
werden sollen, wie beispielsweise Tumorzellen (insbesondere feste
Tumorzellen), Virus-infizierte Zelle, mit Mikroorganismen infizierte
Zellen, Parasiten-infizierten Zellen, Autoimmunzellen (Zellen, die
Autoantikörper
produzieren), aktivierte Zellen (solche, die in einer Transplantatabstoßung oder
Graft-Versus-Host-Disease involviert sind) oder irgendeinen anderen
Typ von erkrankten oder abnormalen Zellen, während sie nur minimale Nebenwirkungen
zeigen.
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Das
zytotoxische Mittel gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst ein oder mehrere Taxane, die an ein Zellbindungsmittel über ihre
Bindungsgruppe gebunden sind. Die Bindungsgruppe ist Teil einer
chemischen Komponente, die kovalent an ein Taxan über konventionelle
Verfahren gebunden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die chemische Komponente an Taxan über eine Ether-Bindung kovalent
gebunden sein.
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Die
in der vorliegenden Erfindung nützlichen
Taxane weise die unten dargestellte Formel (I) auf:
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Diese
neuen Taxane können
in vier Ausführungsformen
unterteilt werden, nämlich
jeweils (1), (2), (3) und (4). Beispiele der vier Ausführungsformen
sind in 2 dargestellt.
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In
den Ausführungsformen
(1) bis (4) ist Reine Elektronen ziehende Gruppe, wie beispielsweise
F, NO2, CN, Cl, CHF2 oder
CF3 oder eine Elektronen schiebende Gruppe
wie beispielsweise OCH3, OCH2CH3, NR7R8,
OR9, und R1' und R1'' sind gleich
oder verschieden, und sind H, eine Elektronen ziehende Gruppe oder eine
Elektronen schiebende Gruppe. R1 kann ebenfalls
H sein.
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R7 und R8 sind gleich
oder verschieden und sind lineare, verzweigte oder zyklische Alkylgruppen
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einfaches oder substituiertes
Aryl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise ist die Anzahl
der Kohlenstoffatome für
R7 und R8 1 bis
4. Ebenfalls sind vorzugsweise R7 und R8 gleich. Beispiele für bevorzugte NR7R8-Gruppen
schließen
Dimethylamino, Diethylamino, Dipropylamino und Dibutylamino ein,
wobei die Butylkomponente entweder primär, sekundär, tertiär oder Isobutyl ist. R9 ist lineares, verzweigtes oder zyklisches
Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. R1 ist
vorzugsweise F, NO2 oder CF3.
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Vorzugsweise
liegt R1 in der Metaposition vor und sind
R1' und
R1'' H.
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In
den Ausführungsformen
(1), (2) und (4) ist R
2O ein heterozyklischer,
linearer oder verzweigter oder zyklischer Ester oder ein Ether mit
von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein
Carbamat der Formel -OCONR
10R
11, wobei R
10 und R
11 gleich
oder verschieden sind und H linear oder verzweigt oder zyklisches
Alkyl mit 1 bis 10 Atomen oder einfaches oder substituiertes Aryl
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen sind. Für Ester schließen bevorzugte
Beispiele für
R
2 -COCH
2CH
3 und -COCH
2CH
2CH
3 ein. Für Carbamate
schließen
bevorzugte Beispiele für
R
2 -CONHCH
2CH
3, -CONHCH
2CH
2CH
3, -CO-Morpholino, -CO-Piperazino, -CO-Piperidino
oder -CO-N-Metyhlpiperazino ein.
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In
Ausführungsform
3 ist R2 die Verbindungs-Gruppe.
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In
den Ausführungsformen
(1), (3) und (4) ist R3 Aryl oder ist lineares,
verzweigtes oder zyklisches Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise CH2CH(CH3)2.
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In
Ausführungsform
(2) ist R3 -CH=C(CH3)2.
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In
allen Ausführungsformen
ist R4 -OC(CH3)3 oder -C6H5.
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In
den Ausführungsformen
(1) und (2) ist R5 die Verbindungsgruppe
und ist R6 H oder R6O
weist dieselbe Definition wie oben für R2O
für die
Ausführungsformen
(1), (2) und (4) auf.
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In
Ausführungsform
(3) ist R5 H oder R5O
weist dieselbe Definition wie oben für R2O
für die
Ausführungsformen
(1), (2) und (4) auf.
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In
Ausführungsform
(3) ist R6 H oder R6O
weist dieselbe Definition wie oben für R2O
für die
Ausführungsformen
(1), (2) und (4) auf.
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In
Ausführungsform
(4) ist R5 H oder weist R5O
dieselbe Definition wie oben für
R2O für
die Ausführungsformen
(1), (2) und (4) auf und ist R6 eine Verbindungsgruppe.
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Die
bevorzugten Positionen zur Einfügung
der Verbindungsgruppe sind R2 und R5, wobei R2 am meisten
bevorzugt ist. Geeignete Verbindungsgruppen sind in der Technik
wohlbekannt und schließen
Disulfidgruppen und Thioethergruppen ein.
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Wenn
die Bindungsgruppe eine Thiol- oder Disulfid-enthaltende Gruppe
ist, kann die Seitenkette, die eine Thiol- oder Disulfidgruppe trägt, linear
oder verzweigtkettig sein, aro matisch oder heterozyklisch. Der Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet kann leicht geeignete Seitenketten identifizieren.
Spezielle Beispiele für
die Thiol- oder Disulfid-enthaltenden
Substituenten schließen
-(CH2)nSZ, -CO(CH2)nSZ, -(CH2)nCH(CH3)SZ, -CO(CH2)nCH(CH3)SZ,
-(CH2)nC(CH3)2SZ, -CO(CH2)nC(CH3)2SZ, -CONR12(CH2)nSZ, -CONR12(CH2)nCH(CH3)SZ oder -CONR12(CH2)nC(CH3)2SZ, -CO-Morpholino-XSZ, -CO-Piperazino-XSZ; -CO-Piperidino-XSZ
und -CO-N-Methylpiperazino-XSZ, wobei Z H oder SR ist, X ein lineares
Alkyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
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R
und R12 sind gleich oder verschieden und
sind lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl oder zyklisches Alkyl mit
1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einfaches oder substituiertes Aryl
mit von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder heterozyklisch und R12, kann zusätzlich H sein und,
n ist
eine ganze Zahl von 1 bis 10.
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Beispiele
für lineare
Alkyle schließen
Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und Hexyl ein.
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Beispiele
für verzweigte
Alkyle schließen
Isopropyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Isopentyl und 1-Ethyl-propyl
ein.
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Beispiele
für zyklische
Alkyle schließen
Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl ein.
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Beispiele
für einfache
Aryle schließen
Phenyl und Naphthyl ein.
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Beispiele
für substituierte
Aryle schließen
Aryle ein, wie beispielsweise solche, die oben beschrieben wurden,
substituiert mit Alkylgruppen, mit Halogenen wie beispielsweise
Cl, Br, F, Nitrogruppen, Aminogruppen, Sulfonsäuregruppen, Carboxylsäuregruppen,
Hydroxygruppen oder Alkoxygruppen.
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Beispiele
für Heterozyklen
sind Verbindungen, bei denen die Heteroatome aus O, N und S ausgewählt sind
und schließen
Morpholino, Piperidino, Piperazino, N-Methylpiperazino, Pyrollyl,
Pyridyl, Furyl und Thiophen ein.
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Die
Taxane der vorliegenden Erfindung, die einen Thiol- oder Disulfid-enthaltenden
Substituenten aufweisen, sind an sich selbst neu.
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Die
Taxane, die einen Thiol- oder Disulfid-enthaltenden Substituenten
aufweisen, können
gemäß bekannter
Verfahren synthetisiert werden. Das Ausgangsmaterial für die Synthese
ist kommerziell erhältliches 10-Diacetylbaccatin
III, dargestellt in 3. Die Chemie zur Einführung verschiedener
Substituenten ist in mehreren Publikationen beschrieben (Ojima et
al., J. Med. Chem. 39, 3889-3896 (1996), Ojima et al., 40 J. Med.
Chem. 267-278 (1997); I. Ojima et al., 96 Proc. Natl. Acad. Sci.,
4256-4261 (1999); I. Ojima et al., U.S. Pat. Nr. 5,475,011 und U.S.
Pat. Nr. 5,811,452.
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Der
Substituent R1 am Phenylring und die Position
des Substituenten R1 kann variiert werden,
bis eine Verbindung der gewünschten
Toxizität
erzielt wird. Darüber
hinaus kann der Grad der Substitution am Phenylring variiert werden,
um die erwünschte
Toxizität
zu erreichen. Das heißt,
der Phenylring kann ein oder mehrere Substituenten aufweisen (beispielsweise
Mono-, Di- oder Tri-Substitution des Phenylrings), welche ein weiteres
Mittel zum Erreichen einer erwünschten
Toxizität
bereitstellen. Eine hohe Zytotoxizität ist als eine Toxizität definiert,
die einen IC50, im Bereich von 1 × 10–12 bis
3 × 10–9M
aufweisen, wenn sie in vitro mit kultivierten Krebszellen nach einer
72-ständigen
Expositionszeit gegenüber
dem Arzneistoff in vitro gemessen wurden. Ein Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet kann die geeignete chemische Komponente für R1 und die geeignete Position für R1 unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten
bestimmen.
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Beispielsweise
wird erwartet, dass Elektronen ziehende Gruppen an der Meta-Position
die zytotoxische Wirksamkeit erhöhen,
während
eine Substitution in der Para-Position erwarteterweise die Wirkstärke im Vergleich
zum Stamm-Taxan nicht erhöhen
wird. Typischerweise werden einige repräsentative Taxane mit Substituenten
in unterschiedlichen Position (ortho, meta und para) anfänglich hergestellt
und bezüglich
einer in vitro Zytotoxizität
ausgewertet.
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Der
Disulfid- oder Thiol-enthaltende Substituent kann an einer der Positionen
eingebracht werden, in denen bereits eine Hydroxylgruppe existiert.
Die Chemie zum Schützen
der verschiedenen Hydroxylgruppen, während die erwünschte reagiert,
wurde kürzlich
beschrieben (siehe beispielsweise die oben zitierten Referenzen).
Der Substituent wird durch einfaches Umwandeln der freien Hydroxylgruppe
in einen Disulfid-enthaltenden Ether, einen Disulfid-enthaltenden
Ether, einen Disulfid-enthaltenden Ester oder ein Disulfid-enthaltendes Carbamat
eingebracht. Diese Transformation wird wie folgt erreicht. Die erwünschte Hydroxylgruppe
wird durch Behandlung mit dem kommerziell erhältlichen Reagenz Lithiumhexamethyldisilazan
(1,2 Äquivalente)
in Tetrahydrofuran bei –40°C wie in
I. Ojima et al., siehe oben, deprotoniert. Das sich ergebende Alkoxid-Anion wird
dann mit einem Überschuss
einer Dihalovrbindung umgesetzt, wie beispielsweise Dibromethan,
so dass sich ein Haloether ergibt. Die Verdrängung des Halogens durch ein
Thiol (durch Umsetzung mit Kaliumthioacetat und Behandlung mit einer
milden Base oder Hydroxylamin) wird das erwünschte Thiol-enthaltende Taxan bereitstellen.
Die Thiolgruppe kann durch Umsetzung mit Methylmethanthiolsulfonat
oder Dithiodipyridin jeweils in ein Methyl- oder Pyridyldisulfid umgewandelt werden.
Dieses Verfahren ist in U.S. Pat. Nr. 5,416,064 beschrieben.
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Alternativ
kann die erwünschte
Hydroxylgruppe direkt durch Reaktion mit einem Acylhalogenid verestert
werden, wie beispielsweise einem 3-Brompropionylchlorid, so dass
sich ein Bromester ergibt. Die Verdrängung der Bromgruppe durch
Behandlung mit Kaliumthioacetat und eine weitere Verarbeitung wie
oben beschrieben, ergibt den Thiol- oder Disulfid-enthaltenden Taxanester.
Um Disulfid-enthaltende Carbamate herzustellen, kann die Hydroxylgruppe
mit einem im Handel erhältlichen
Chloroformiat umgesetzt werden, wie beispielsweise Para-Nitrophenylchloroformiat,
gefolgt von Reaktion mit einem Aminoalkyldisulfid (beispielsweise Methyldithiocysteamin).
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Disulfid-enthaltende
und Thiol-enthaltende Taxan-Arzneistoffe der Erfindung können auf
ihre Fähigkeit hin überprüft werden,
die Proliferation verschiedener unerwünschter Zell-Linien in vitro zu
unterdrücken.
Beispielsweise können
Zell-Linien wie beispielsweise die humane epidermoide Karzinomlinie
A431, die humane Brusttumorlinie SKBR3 und die Burkitt Lymphomalinie
Namalwa einfach zur Bestimmung der Zytotoxizität dieser Verbindungen verwendet
werden. Zu evaluierende Zellen können
den Verbindungen für
72 Stunden gegenüber
ausgesetzt werden und die überlebenden
Fraktionen der Zellen können
in direkten Assays durch bekannte Verfahren gemessen werden. Die
IC50-Werte können dann aus den Ergebnissen
der Assays berechnet werden.
-
Die
Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung als therapeutische Mittel
hängt von
der sorgfältigen Auswahl
eines geeigneten Zellbindungsmittels ab. Zellbindungsmittel können von
irgendeiner gegenwärtig
bekannten Art sein oder derjenigen, die bekannt werden und schließen Peptide
und Nicht-Peptide ein. Im Allgemeinen können diese Antikörper oder
Fragmente hiervon (insbesondere monoklonale Antikörper), Lymphokine,
Hormone, Wachstumsfaktoren, Vitamine, Nahrungs-Transportmoleküle (wie
beispielsweise Transferrin) oder irgendein anderes Zellbindungsmolekül oder -substanz
sein.
-
Speziellere
Beispiele von Zellbindungsmitteln, die verwendet werden können, schließen Folgendes ein:
- – Fragmente
von Antikörpern
wie beispielsweise sFv, Fab, Fab' und
F(ab')2 (Parham,
131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring et al., 113 J. Immunol.
470-478 (1974); Nisonoff et al. 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244
(1960));
- – Interferone
(beispielsweise α, β, γ);
- – Lymphokine
wie beispielsweise IL2, IL3, IL4, IL6;
- – Hormone
wie beispielsweise Insulin, TRH (Thyrotropin-freisetzende Hormone),
MSH (Melanozyten-stimulierendes Hormon), Steroidhormone wie beispielsweise
Androgene und Östrogene;
- – Vitamine
wie beispielsweise Folsäure;
- – Wachstumsfaktoren
und Kolonie-stimulierende Faktoren wie beispielsweise EGF, TGF-α, G-CSF,
M-CSF und GM-CSF (Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984)); und
- – Transferrin
(O'Keefe et al.,
1601. Biol. Chem. 932-937 (1985)).
-
Monoklonale
Antikörpertechniken
ermöglichen
die Produktion extrem spezifischer Zellbindungsmittel in Form spezifischer
monoklonaler Antikörper
oder Fragmente hiervon. Insbesondere sind in der Technik wohlbekannt
Techniken zur Erzeugung monoklonaler Antikörper oder von Fragmenten hiervon
durch Immunisieren von Mäusen,
Ratten, Hamstern oder irgendeines anderen Säugetiers mit dem Antigen von
Interesse, wie beispielsweise der intakten Targetzelle, Antigene,
die aus der Targetzelle isoliert wurden, ganzen Viren, attenuierten
ganzen Viren und viralen Proteinen, wie beispielsweise viralen Hüllproteinen.
Empfindlich gemachte humane Zellen können ebenfalls verwendet werden.
Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper oder
Fragmenten hiervon ist die Verwendung von Phagenbibliotheken von
sFv (einkettige variable Region), insbesondere humanes sFv. Siehe
beispielsweise Griffiths et all., USP 5,885,793; McCafferty et al.,
WO 92/01047, Liming et al., WO 99106587).
-
Die
Auswahl der geeigneten Zellbindungsmittel ist eine Frage der Auswahl,
die von der speziellen, als Ziel definierten Zellpopulation abhängt, jedoch
im Allgemeinen sind monoklonale Antikörper bevorzugt, wenn ein Geeigneter
verfügbar
ist.
-
Beispielsweise
ist der monoklonale Antikörper
15 ein muriner IgG2a-Antikörper, der
für das
Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen (CALLA) spezifisch ist
(Ritz et al., 283, Nature 583-585 (1980)) und kann verwendet werden,
wenn die Zielzellen CALLA wie beispielsweise bei einer Erkrankung
einer akuten lymphoblastischen Leukämie exprimieren. In ähnlicher
Weise ist der monoklonale Antikörper
Anti-B4 ein murines IgG1, das an das CD19-Antigen
an B-Zellen bindet (Nadler et al., 131 J. Immunol. 244-250 (1983))
und kann verwendet werden, wenn die Zielzellen B-Zellen oder erkrankte
Zellen sind, die dieses Antigen exprimieren, wie beispielsweise
in einem Nicht-Hodgkinschen Lymphom oder einer chronischen lymphoblastischen
Leukämie.
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Zusätzlich kann
GM-CSF, das an Myeloid-Zellen bindet, als Zellbindungsmittel an
erkrankte Zellen aus einer akuten myelogenen Leukämie verwendet
werden. IL-2, das an aktivierte T-Zellen bindet, kann zur Vorbeugung
einer Transplantatabstoßung,
zur Therapie und Vorbeugung einer Graft-Versus-Host-Disease und zur
Behandlung einer akuten T-Zell-Leukämie verwendet
werden. MSH, das an Melanozyten bindet, kann zur Behandlung eines
Melanoms verwendet werden. Folsäure,
das den Folat-Rezeptor als Ziel definiert, der auf Ovarial- und
anderen Krebsarten exprimiert wird, ist ebenfalls ein geeignetes
Zellbindungsmittel.
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Krebs
der Brust und Hoden kann erfolgreich mit Östrogen (oder Östrogenanaloga)
oder Androgen (oder Androgenanaloga) jeweils als Zellbindungsmittel
als Ziel definiert werden.
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Konjugate
der Taxane der Erfindung und eines Zellbindungsmittels können unter
Verwendung irgendeiner Technik gebildet werden, die gegenwärtig bekannt
sind oder später
entwickelt werden. Zahlreiche Verfahren zur Konjugation sind in
U.S. Pat. Nr. 5,416,064 und U.S. Pat. Nr. 5,475,092 gelehrt worden.
Der Taxanester kann modifiziert werden, so dass sich eine freie
Aminogruppe ergibt und kann dann an einen Antikörper oder ein anderes Zellbindungsmittel über einen
säurelabilen
Linker oder einen photolabilen Linker gebunden werden. Der Taxanester
kann mit einem Peptid kondensiert und anschließend an ein Zellbindungsmittel gebunden
werden, um einen Peptidase-labilen Linker zu erzeugen. Die Hydroxylgruppe
am Taxanester kann succinyliert und an ein Zellbindungsmittel gebunden
werden, um ein Konjugat zu erzeugen, das durch intrazelluläre Esterasen
gespalten werden kann, um freien Arzneistoff freizusetzen. Am meisten
bevorzugt werden die Taxanether, -Ester oder -Carbamate behandelt,
so dass eine freie oder geschützte
Thiolgruppe erzeugt wird und danach werden die Disulfid- oder Thiol-enthaltenden
Taxane an das Zellbindungsmittel über Disulfid-Brücken gebunden.
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Repräsentative
Konjugate der Erfindung sind Antikörper-Taxan, Antikörperfragment-Taxan, epidermaler
Wachstumsfaktor (EGF)-Taxan, Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH)-Taxan,
Schilddrüsen-stimulierendes
Hormon (TSH)-Taxan, Östrogen-Taxan, Östrogenanalog-Taxan,
Androgen-Taxan, Androgenanalog-Taxan und Folat-Taxan.
-
Taxan-Konjugate
von Antikörpern,
Antikörperfragmenten,
Protein- oder Peptidhormonen, Protein- oder Peptidwachstumsfaktoren
und anderen Proteinen werden in derselben Art und Weise durch bekannte Verfahren
hergestellt. Beispielsweise können
Peptide und Antikörper
mit Vernetzungsreagenzien wie beispielsweise N-Succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionat,
N-Succinimidyl-4(2-pyridyldithio)pentanoat (SPP), 4- Succinimidyl-oxycarbonyl-α-methyl-α(2-pyridyldithio)toluol
(SMPT), N-Succinimidyl-3(2-pyridyldithio)butyrat (SDPB),
2-Iminothiolan oder S-Acetylbernsteinsäureanhydrid durch bekannte
Verfahren modifiziert werden. Siehe Carlsson et al., 173 Biochem.
J. 723-737 (1978);
Blattler et al., 24 Biochem. 1517-1524 (1985); Lambert et al., 22
Biochem. 3913-3920 (1983); Klotz et al., Arch. Biochem. Biophys.
605 (1962); und Liu et al., 18 Biochem. 690 (1979), Blakey und Thorpe,
1 Antikörper,
Immunoconjugates Zellbindungsmittel & Radiopharmaceuticals, 1-16 (1988),
Worrell et al., 1 Anti-Cancer Drug Design 179-184 (1986). Das freie
oder geschützte Thiol-enthaltende
Zellbindungsmittel, das somit gewonnen wurde, wird dann mit einem
Disulfid- oder Thiol-enthaltenden Taxan zur Erzeugung von Konjugaten
umgesetzt. Die Konjugate können
durch HPLC oder durch Gelfiltration aufgereinigt werden.
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In ähnlicher
Weise können Östrogen-
und Androgen-Zellbindungsmittel, wie beispielsweise Östradiol und
Androstendiol an der C-17 Hydroxygruppe mit einer geeigneten Disulfidenthaltenden
Carbonsäure
unter Verwendung beispielsweise von Dicyclohexylcarbodiimid als
Kondensationsmittel verestert werden. Beispiele für solche
Carbonsäuren,
die verwendet werden können,
sind 3(2-Pyridyldithio)propansäure,
3-Methyldithiopropansäure,
4-(2-Pyridyldithio)pentansäure und
3-Phenyldithiopropansäure.
Die Veresterung der C-17 Hydroxygruppe kann ebenfalls durch Umsetzung
mit einer geeigneten geschützten
Thiolgruppe erreicht werden, die Carbonsäurechlorid enthält, wie
beispielsweise 3-S-Acetylpropanoylchlorid.
Weitere Verfahren zur Veresterung können ebenfalls verwendet werden,
wie sie in der Literatur beschrieben sind (Haslam, 36 Tetrahedron 2409-2433
(1980)). Das geschützte
oder freie Thiol-enthaltende Androgen oder Östrogen kann dann mit einem Disulfid-
oder Thiol-enthaltenden Taxan umgesetzt werden, um Konjugate zu
erzeugen. Die Konjugate können durch
Säulenchromatographie
auf Silicagel oder durch HPLC aufgereinigt werden. Die Folsäure kann
mit einem geeigneten Hydrazid, wie beispielsweise 4-(2-Pyridyldithio)pentansäurehydrazid
in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid
kondensiert werden, so dass sich ein Hydrazon, das aktives Disulfid
enthält,
ergibt. Das Disulfid-enthaltende Folat kann dann mit einem Thiol-enthaltenden
Taxan umgesetzt werden, so dass ein Konjugat erzeugt wird, das durch
Säulenchromatographie über Silicagel
oder durch HPLC aufgereinigt wird.
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Vorzugsweise
sind monoklonale Antikörper
oder Zellbindungsmittel-Taxankonjugate solche, die über eine
Disulfid-Brücke
wie oben beschrieben verbunden sind, die dazu in der Lage sind,
Taxanmoleküle
abzugeben. Derartige Zellbindungskonjugate werden durch bekannte
Verfahren hergestellt, wie beispielsweise durch Modifizieren monoklonaler
Antikörper
mit Succinimidylpyridyldithiopropionat (SPDP) (Carlsson et al., 173
Biochem. J. 723-737 (1978)). Die sich ergebende Thiopyridylgruppe
wird dann durch Behandlung mit Thiol-enthaltenden Taxanen verdrängt, so
dass Disulfid-verbundene Konjugate erzeugt werden. Alternativ wird
im Falle der Aryldithiotaxane die Bildung des Zellbindungskonjugates
durch direkte Verdrängung
des Aryl-Thiols des Taxanes durch Sulfhydrylgruppen bewirkt, die
früher
in Antikörpermoleküle eingebracht
waren. Konjugate, die 1 bis 10 Taxan-Arzneistoffe gebunden über eine
Disulfid-Brücke
enthalten, werden in einfacher Weise durch irgendein Verfahren hergestellt.
-
Spezieller
wird eine Lösung
des Dithiopyridyl-modifizierten Antikörpers in einer Knnzentration
von 1 mg/ml in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei pH 6,5, der 1 mM EDTA
enthält,
mit dem Thiol-enthaltenden Taxan behandelt (1,25 molare Äquivalente/Dithiopyridylgruppe).
Die Freisetzung des Thiopyridins aus dem modifizierten Antikörper wird
spektrophotometrisch bei 343 nm überwacht
und ist in ungefähr
20 Stunden abgeschlossen. Das Antikörper-Taxankonjugat wird aufgereinigt
und von nicht umgesetztem Arzneistoff und anderen Niedermolekulargewichtsmaterialien
durch Gelfiltration durch eine Säule
von Sephadex G-25 oder Sephacryl S300 befreit. Die Anzahl der Taxankomponenten,
die pro Antikörpermolekül gebunden
ist, kann durch Messen des Verhältnisses
der Extinktion bei 230 nm und 275 nm bestimmt werden. Ein Durchschnitt
von 1 bis 10 Taxanmolekülen/Antikörpermolekülen kann über Disulfid-Brücken durch
dieses Verfahren gebunden werden.
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Antikörper-Taxankonjugate
mit nicht-spaltbaren Bindungen können
ebenfalls hergestellt werden. Der Antikörper kann mit Vernetzungsmitteln
wie beispielsweise Succinimidyl-4(maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat
(SMCC), Sulfo-SMCC, m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester
(MBS), Sulfo-MBS oder Succinimidyl-Todacetat wie in der Literatur
beschrieben modifiziert werden, um 1 bis 10 reaktive Gruppen einzubringen.
Seihe Yoshitake et al., 101 Euro. J. Biochem. 395-399 (1979); Hashida
et al., J. Applied Biochem. 56-63 (1984); und Liu et al., 18 Biochem.
690-697 (1979). Der modifi zierte Antikörper wird dann mit dem Thiol-enthaltenden
Taxanderivat zur Erzeugung eines Konjugats umgesetzt. Das Konjugat
kann durch Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-Säule aufgereinigt werden.
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Die
modifizierten Antikörper
oder Fragmente hiervon werden mit den Thiol-enthaltenden Taxanen (1,25
Molaräquivalent/Maleimidogruppe)
behandelt. Die Gemische werden über
Nacht bei ungefähr
4°C inkubiert.
Die Antikörper-Taxankonjugate
werden durch Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-Säule aufgereinigt. Typischerweise
werden durchschnittlich 1 bis 10 Taxane pro Antikörper gebunden.
-
Ein
bevorzugtes Verfahren besteht darin, Antikörper oder Fragmente hiervon
mit Succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)
zur Einbringung von Maleimidogruppen gefolgt von einer Umsetzung
des modifizierten Antikörpers
oder Fragmentes mit den Thiol enthaltenden Taxanen einzubringen,
um ein Thioether-gebundenes Konjugat zu ergeben. Wiederum können sich
Konjugate mit 1 bis 10 Arzneistoffmolekülen pro Antikörpermolekül ergeben.
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Die
Zytotoxizität
der Taxane und ihrer Antikörperkonjugate
an nicht adhärente
Zell-Linien wie beispielsweise Namalva und HL-60 können durch
Rückextrapolierung
von Zellproliferationskurven wie in Goldmacher et al., 135 J. Immunol.
3648-3651 (1985) beschrieben gemessen werden. Die Zytotoxizität dieser
Verbindung an adhärente
Zell-Linien wie beispielsweise SKBR3 und A431 kann durch klonngene
Assays bestimmt werden, wie in Goldmacher et al., 102 J. Cell Biol.
1312-1319 (1986) beschrieben ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine therapeutische Zusammensetzung
bereit, die Folgendes umfasst:
- (A) eine wirksame
Menge eines oder mehrerer Taxane, gebunden an ein Zellbindungsmittel,
und
- (B) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsstoff oder Trägerstoff.
-
In ähnlicher
Weise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Abtöten ausgewählter Zellpopulationen
bereit, das das In-Berührung-Bringen
von Zielzellen oder Gewebe, das Zielzellen enthält, mit einer wirksamen Menge
eines zytotoxischen Mittels umfasst, umfassend ein oder mehrere
Taxane gebunden an ein Zellbindungsmittel.
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Das
zytotoxische Mittel wird wie oben beschrieben hergestellt.
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Geeignete
pharmazeutisch verträgliche
Träger,
Verdünnungsmittel
und Trägerstoffe
sind wohlbekannt und können
durch den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bestimmt werden,
wie es die klinische Situation erfordert.
-
Beispiele
für geeignete
Träger,
Verdünnungsmittel
und/oder Träger
schließen
Folgendes ein: (1) Dulbeccos Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH
ungefähr
7,4, die ungefähr
1 mg/ml bis 25 mg/ml humanes Serumalbumin enthält, (2) 0,9% Salzlösung (0,9%
G/V NaCl), und (3), 5% (G/V) Dextrose; und kann ebenfalls ein Antioxidans
enthalten wie beispielsweise Tryptamin und ein Stabilisierungsmittel
wie beispielsweise Tween 20.
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Das
Verfahren zum Abtöten
ausgewählter
Zellpopulationen kann in vitro, in vivo oder ex vivo ausgeübt werden.
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Beispiele
für in
vitro-Anwendungen schließen
Behandlungen von autologem Knochenmark vor ihrer Transplantation
in denselben Patienten ein, um erkrankte oder maligne Zellen abzutöten. Behandlungen
von Knochenmark vor ihrer Transplantation, um kompetente T-Zellen
abzutöten
und eine Graft-Versus-Host-Krankheit (GVHD) zu verhindern; Behandlungen
von Zellkulturen, um alle Zellen abzutöten außer erwünschte Varianten, die das Zielantigen
nicht exprimieren; oder um Varianten abzutöten, die unerwünschtes Antikörper exprimieren.
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Die
Bedingungen einer nicht-klinischen in vitro-Anwendung sind leicht
von dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet zu bestimmen.
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Beispiele
für eine
klinische ex vivo-Anwendung bestehen darin, Tumorzellen oder Lymphoidzellen
aus Knochenmark vor einer autologen Transplantation in der Krebsbe handlung
oder in der Behandlung einer Autoimmunkrankheit zu entfernen oder
T-Zellen und andere Lymphoidzelien aus autologen oder allogenen
Knochenmark oder Gewebe vor einer Transplantation zu entfernen,
um eine GVHD zu vermeiden. Die Behandlung kann wie folgt durchgeführt werden.
Knochenmark wird vom Patienten oder einem anderen Individuum gewonnen
und danach in einem Medium inkubiert, das Serum enthält, dem
das zytotoxische Mittel der Erfindung zugesetzt wurde, wobei sich
die Konzentrationen von ungefähr
10 μm bis
1 pM bewegen, für
ungefähr
30 Minuten bis ungefähr
48 Stunden bei ungefähr
37°C. Die
exakten Bedingungen der Konzentration und Zeit der Inkubation, das
heißt
die Dosis, sind leicht für
den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet zu bestimmen. Nach der Inkubation
werden die Knochenmarkszellen mit Medium gewaschen, das Serum enthält und werden
dem Patienten intravenös
gemäß bekannter
Verfahren wieder zurück
verabreicht. Unter Umständen,
unter denen der Patient eine andere Behandlung empfängt wie
beispielsweise eine ablative Chemotherapie oder eine Ganzkörperbestrahlung
zwischen dem Zeitpunkt der Gewinnung des Marks und der Reinfusion
der behandelten Zellen werden die behandelten Markzellen in flüssigem Stickstoff
gefroren unter Verwendung von medizinischer Standardausrüstung aufbewahrt.
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Zur
klinischen in vivo-Anwendung wird das zytotoxische Mittel der Erfindung
als Lösung
oder als lyophilisiertes Pulver verabreicht werden, das bezüglich einer
Sterilität
und auf Endotoxinkonzentrationen getestet ist. Beispiele für geeignete
Vorschriften der Konjugatverabreichung sind wie folgt. Konjugate
werden wöchentlich
für 4 Wochen
als intravenöser
Bolus jede Woche verabreicht. Die Bolus-Dosen werden in 50 bis 100
ml normaler beziehungsweise physiologischer Salzlösung verabreicht,
der 5 bis 10 ml humanes Serumalbumin zugesetzt werden kann. Die
Dosierungen werden 10 μg
bis 2000 mg pro Verabreichung intravenös (im Bereich von 100 ng bis
20 mg/kg pro Tag) sein. Nach 4-wöchiger
Behandlung kann der Patient eine Behandlung auf einer wöchentlichen
Basis empfangen. Spezielle klinische Vorschriften bezüglich des
Verabreichungsweges, der Trägerstoffe,
Verdünnungsmittel,
Dosierungen, Zeitpunkte etc. können
vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bestimmt werden, wie es
die klinische Situation erfordert.
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Beispiele
von medizinischen Zuständen,
die gemäß der in
vivo oder ex vivo-Verfahren des Abtötens ausgewählter Zellpopulationen behandelt
werden können,
schließen
eine Malignität
irgendeines Typs ein, einschließlich
beispielsweise Krebs der Lunge, Brust, Colon, Prostata, Nieren,
Pakreas, Ovar und lymphatischen Organen; Autoimmunerkrankungen wie
beispielsweise systemischer Lupus, rheumatoide Arthritis und multiple Sklerose.
Transplantatabstoßungen
wie beispielsweise Nierentransplantatabstoßung, Lebertransplantatabstoßung, Lungentransplantatabstoßung, Herztransplantatabstoßung und
Knochenmarkstransplantationsabstoßung; Graft-Versus-Host-Krankheit;
virale Infektionen wie beispielsweise CMV-Infektionen, HIV-Infektionen, AIDS
etc.; und Parasiteninfektionen wie beispielsweise Giardiasis, Amoebiasis,
Schistosomiasis und andere, wie sie vom Durchschnittsfachmann auf
dem Gebiet bestimmt werden.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf nicht einschränkende Beispiele
beschrieben werden. Soweit nichts anderes angegeben ist, sind alle
Prozentsätze,
Verhältnisse,
Teile etc. auf das Gewicht bezogen.
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Beispiel 1
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In vitro Zytotoxizität-Assays
-
Die
Sulfid-, Disulfid- und Sulfidryl-enthaltenden Taxan-Arzneistoffe
der Erfindung können
bezüglich
ihrer Fähigkeit
evaluiert werden, eine Proliferation verschiedener humaner Tumorzell-Linien
in vitro zu unterdrücken.
Zwei adherente Zell-Linien, nämlich
A431 (humanes epidermoides Karzinom) und SKBR3 (humaner Brusttumor)
und die nicht adherente Zell-Linie, Namalwa (Burkitt Lymphom) werden
zur Bestimmung der Zytotoxizität
dieser Verbindungen verwendet. Die Zellen werden gegenüber den
Verbindungen für
24 Stunden exponiert und die überlebenden
Fraktionen der Zellen werden in direkten Assays gemessen (A431 und
SKBR3 werden bezüglich
einer Ausplattierungseffizienz untersucht (Goldmacher et al., 102
J. Cell Biol. 1312-1319 (1986) und Namalwa werden durch Wachstums-Rück-Extrapolation
untersucht (Goldmacher et al, 135 J. Immunol. 3648-3651 (1985)).
IC50-Werte werden dann aus diesen Daten
berechnet.
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Beispiel 2
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Konjugation
an Antikörper
-
Konjugation
von Thiol-enthaltendem Taxan an Antikörper über Disulfid-Brücken: Die
Konjugation von Thiol-enthaltenden Taxanen an Antikörper oder
Fragmenten hiervon über
Disulfid-Brücken
wird in zwei Schritten dargestellt. Im ersten Schritt werden Dithiopyridylgruppen
in Antikörper
oder Antikörperfragmente
unter Verwendung von Succinimidylpyridyldithiopentanoat (SPP) wie
von Carlsson et al. beschrieben eingebracht. Die Thiopyridylgruppen
werden dann durch Reaktion mit dem Thiol-enthaltenden Taxan zur
Erzeugung eines Konjugats verdrängt.
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Erzeugung
von Antikörper-SS-Taxankonjugaten.
Antikörper
Anti-B4, Anti-EGF-Rezeptor und N901 oder Fragmente hiervon werden
mit SPDP oder SPP wie in der Literatur beschrieben modifiziert.
Zwischen 1 bis 10 Dithiopyridylgruppen werden durchschnittlich pro
Antikörpermolekül eingebracht.
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Eine
Lösung
des Dithiopyridyl-modifizierten Antikörpers in einer Konzentration
von 1 mg/ml in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 6,5, der 1 nM EDTA
bei 25° enthält, wird
mit einem Thiol-enthaltenden Taxan (1,25 Moläquivalent/Dithiopyridylgruppe).
Die Freisetzung von Thiopyridin aus dem modifizierten Antikörper oder Fragment
hiervon wird spektrophotometrisch bei 343 nm überwacht und ist in ungefähr 20 Stunden
abgeschlossen. Das Antikörper-Taxankonjugat
wird aufgereinigt und von nicht umgesetztem Arzneistoff und anderem
Niedermolekulargewichtsmaterial durch Gelfiltration durch eine Säule von
Sephadex G-25 befreit. Die Anzahl der Taxanmoleküle, die pro Antikörpermolekül gebunden
ist, wird durch Messen des Verhältnisses
zwischen der Extinktion bei 230 nm und 275 nm gemessen. Ein Durchschnitt
von 1-10 Taxanmolekülen
pro Antikörpermolekül kann über die
Disulfid-Brücken
durch dieses Verfahren gebunden werden.
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Konjugation
von Thiol-enthaltendem Taxan an Antikörper über eine nicht spaltbare Thioetherbindung: Die
Konjugation eines Thiol-enthaltenden Taxans wird in zwei Schritten
durchgeführt.
Der Antikörper
oder das Fragment hiervon wird zunächst mit Succinimidylmaleimidomethylcyclohexancarboxylat
(SMCC) zur Einbringen von Maleimidogruppen umgesetzt. Der modifizierte
Antikörper
wird dann mit dem Thiol-enthaltenden Taxan unter Bildung von Thioetherbindungen
umgesetzt.
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Herstellung
von Antikörper-Taxankonjugaten
(nicht spaltbar). Antikörper,
Anti-B4, Anti-EGF-Rezeptor und
N901 oder Fragmente hiervon werden mit SMCC wie in der Literatur
beschrieben modifizier.
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Die
modifizierten Antikörper
oder Antikörperfragmente
werden mit Thiol-enthaltendem Taxan (1,25 molare Äquivalente/Maleimidogruppe)
behandelt. Die Gemische werden über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Die Antikörper-Taxankonjugate
werden wie oben beschrieben aufgereinigt. Typischerweise werden
durchschnittlich 1-10 Taxanmoleküle
pro Antikörpermolekül verbunden.
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Spezielle Herstellung
von Antikörper-Taxankonjugaten.
-
Murine
monoklonale Antikörper,
die gegen den humanen EGF-Rezeptor (EGFR) gerichtet sind, wurden
entwickelt. Der EGF-Rezeptor wird bekanntermaßen in mehreren humanen Plattenepitelzellkarzinmomen überexprimiert,
wie beispielsweise Kopf und Nacken, Lunge und Brust. Vier unterschiedliche
Antikörper,
nämlich
KS-61 (IgG2a), KS-77 (IgG1), KS-78
(Ig2a) und KS-62 (IgG2a) wurden an Taxane über Disulfid-Brücken gebunden.
Der murine monoklonale Antikörper
TAI, gerichtet gegen das Neu-Onkogen, überexprimiert in humanem Brust-
und Ovarialkrebs, wurde zur Herstellung von TA1-Taxankonjugaten
verwendet. die Herstellung dieser speziellen Konjugate ist in den
Beispielen 3 bis 7 beschrieben.
-
Beispiel 3
-
Herstellung von Anti-EGFR
Antikörper
KS-61-Taxankonjugat
-
Der
Anti-EGFR Antikörper
KS-61 wurde zunächst
mit N-Succinimidyl-4-[2-pyridyldithio]pentanoat (SPP)
zur Einführung
von Dithiopyridylgruppen modifiziert. Der Antikörper (2,3 mg/ml) in 50 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH 6,5, der NaCl (50 mM) und EDTA (2 mM) enthielt, wurde mit SPP
(11 molare Äquivalente
in Ethanol) behandelt. Die endgültige
Ethanol-Konzentration betrug 1,4% (V/V). Nach 90 Minuten bei Umgebungstemperatur
wurde Lysin (50 mM) zugesetzt, um die Entfernung von irgendwelchen
nicht kovalent gebundenem SPP zu unterstützen. Man ließ die Reaktion
für 2 Stunden
fortlaufen und danach wurde durch Gelfiltration durch eine Sephadex
G-25-Säule,
die im obigen Puffer äquilibriert
wurde, gereinigt. Antikörper
enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und der Grad der Modifikation
wurde durch Behandlung einer Probe mit Dithiothreitol und durch
Messen der Veränderung
der Extinktion bei 343 nM (Freisetzung von Pyyridin-2-thion mit ε343=8,080
M–1cm–1)
bestimmt. Die Gewinnung des Antikörpers betrug ungefähr 90% mit
5,0 Pyridyldithiogruppen pro Antikörpermolekül gebunden.
-
Der
modifizierte Antikörper
wurde mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, verdünnt, der
NaCl (50 mM) und EDTA (2 mM) in einer Endkonzentration von 1,28
mg/ml enthielt. Taxan-SH (1,7 Äq.
pro Dithiopyridylgruppe) in Ethanol (10% V/V im endgültigen Reaktionsgemisch)
wurde danach der modifizierten Antikörperlösung zugesetzt. Die Reaktion
schritt bei Umgebungstemperatur unter Argon für 24 Stunden voran. Der Fortschritt
der Reaktion wurde spektrophotometrisch bei 343 nm zur Freisetzung
vom Pyridin-2-thion überwacht, verursacht
durch Disulfid-Austausch zwischen den Taxan-SH und den Dithiopyridylgruppen
am Antikörper.
Die Zunahme der Extinktion bei 343 nm zeigte an, dass sich das Taxan
an den Antikörper
gebunden hatte. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Sephadex
G-25 SF Gelfiltrationssäule
aufgeladen, die mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 6,5) äquilibriert
war, die 20% Propylenglykol enthielt. Der Hauptpeak umfasste monomeres
KS-61-Taxan. Die Konzentration des Konjugats wurde durch Messen
der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Das Konjugat wurde mit Tween
80 (0,05%) und humanem Serumalbumin (HSA, 1 mg/ml) formuliert.
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Beispiel 4
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Herstellung von Anti-EGFR
Antikörper
KS-77-Taxankonjugat
-
Der
Anti-EGFR Antikörper
KS-77 wurde mit N-Succinimidyl-4-[2-pyridyldithio]pentanoat (SPP) zur Einbringung
von Dithiopyridylgruppen modifiziert. Der Antikörper (5,0 mg/ml) in 50 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH 6,5, wurde mit SPP (11 molare Äquivalente in Ethanol) behandelt.
Die endgültige
Ethanolkonzentration betrug 2% (V/V). Nach 90 Minuten bei Umgebungstemperatur
wurde Lysin (50 mM) zugesetzt, um bei der Entfernung von jeglichem
nicht kovalent gebundenem SPP zu helfen. Man ließ das Reaktionsgemisch für 2 Stunden
inkubieren und danach wurde es durch Gelfiltration durch eine Sephadex
G-25-Säule
aufgereinigt, die im obigen Puffer äquilibriert wurde. Antikörper enthaltende
Fraktionen wurden gepoolt und der Modifikationsgrad wurde durch
Behandeln einer Probe mit Dithiothreitol und Messen der Veränderung
in der Extinktion bei 343 nm (Freisetzung von 2-Mercaptopyridin
mit ε343=8,080 M–1cm–1 bestimmt.
Die Wiedergewinnung des Antikörpers
betrug ungefähr
90% mit 4,24 Pyridyldithiogruppen gebunden pro Antikörpermolekül.
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Der
modifizierte Antikörper
wurde mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, verdünnt, der
NaCl (50 mM) und EDTA (2 mM) in einer Endkonzentration von 1,4 mg/ml
enthielt. Taxan-SH (1,7 Äquivalente
pro Dithiopyridylgruppe) in Ethanol (10% V/V im endgültigen Reaktionsgemisch)
wurde der modifizierten Antikörperlösung zugesetzt.
Die Reaktion schritt bei Umgebungstemperatur unter Argon für 24 Stunden
voran. Eine Zunahme der Extinktion bei 343 nm wurde erwähnt, was
darauf hinweist, dass Pyridin-2-thion freigesetzt wurde und sich
das Taxan an den Antikörper
gebunden hatte. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Sephacryl S300HR
Gelfiltrationssäule
aufgeladen, die mit die Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS,
pH 6,5) äquilibriert war.
Der Hauptpeak umfasste monomeres KS-77-Taxan. Die Konzentration
von Antikörper
KS-77 wurde durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Das
Konjugat wurde mit Tween 80 (0,06%) und HSA (1 mg/ml) formuliert.
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Beispiel 5
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Herstellung von Anti-EGFR
Antikörper
KS-62-Taxankonjugat
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Das
Anti-EGF Antikörper-Taxankonjugat
(KS-62 Taxan) wurde in einer Art und Weise hergestellt, die derjenigen
in Beispiel 4 beschriebenen Weise ähnlich ist. Der modifizierte
Antikörper
wurde mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, verdünnt, der
NaCl (50 mM) und EDTA (2 mM) in einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml
enthielt. Der Antikörper
wurde mit SPP modifiziert, um 5,25 Pyridyldithiogruppen pro Antikörpermolekül einzubringen.
Taxan-SH (1,7 Äq.)
in Ethanol (10% V/V im endgültigen
Reaktionsgemisch) wurden dann der modifizierten Antikörperlösung zugesetzt.
Die Reaktion schritt bei Umgebungstemperatur unter Argon für 24 Stunden
voran. Das Konjugat wurde durch Passage durch eine Sephacryl S300HR
Gelfiltrationssäule
aufgereinigt, die mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 6,5) äquilibriert
wurde. Der Hauptpeak umfasste monomeres KS-62 Taxan. Das Konjugat
wurde in PBS formuliert, das Tween 80 (0,01 % G/V) und HSA (1 mg/ml) enthielt.
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Beispiel 6
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Herstellung von Anti-EGFR
Antikörper
KS-78-Taxankonjugat
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Das
Anti-EGFR Antikörper-Taxankonjugat
KS-78-Taxan wurde in einer Art und Weise hergestellt, die derjenigen
in Beispiel 4 beschriebenen ähnlich
ist. Der modifizierte Antikörper
wurde mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, verdünnt, der
NaCl (50 mM) und EDTA (2 mM) in einer Endkonzentration von 1,6 mg/ml enthielt.
Der Antikörper
wurde mit SPP modifiziert, um 4,5 Pyridyldithiogruppen pro Antikörpermolekül einzubringen.
Taxan-SH (1,7 Äq.)
in Ethanol (15% V/V im endgültigen
Reaktionsgemisch) wurden dann der modifizierten Antikörperlösung zugesetzt.
Die Reaktion schritt bei Umgebungstemperatur unter Argon für 24 Stunden voran.
Die Lösung
wurde dann in zwei Ansätze
aufgespalten, nämlich
Ansatz A und Ansatz B, die separat behandelt wurden. Ansatz A wurde
gegen PBS, pH 6,5, dialysiert, das zwei 2 mM CHAPS (3-[(Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat)
und 20% (V/V) Propylenglykol enthielt. Der pH der endgültigen Lösung betrug
6,0. Ansatz B wurde in PBS, pH 6,5, dialysiert, das 20% (V/V) Propylenglykol
enthielt. Nach den Dialysen wurde HSA (1 mg/ml) beiden Anätzen zugesetzt.
Charge B beziehungsweise Ansatz B wurde weiter mit Tween 80 (0,05%,
G/V) behandelt.
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Beispiel 7
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Herstellung von TA 1-Taxankonjugat
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Der
murine monoklonale Antikörper
TA1, der an das Neu-Onkogen bindet, das auf Brust- und Ovarialtumoren
exprimiert wird, wurde in der Herstellung von Taxankonjugaten verwendet.
TA 1 (3,2 mg/ml) in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, der NaCl
(50 mM) und EDTA (2 mM) enthielt wurde mit SPP (8,0 molare Aquivalente
in Ethanol) behandelt.
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Die
endgültige
Ethanolkonzentration betrug 5% (V/V). Nach 90 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde
Lysin (50 mM) zugesetzt, um bei der Entfernung jeglich nicht kovalent
gebundenen SPPs zu helfen. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 Stunden
inkubiert und danach durch eine Sephadex G-25-Säule filtriert, die im obigen
Puffer äquilibriert
wurde. Antikörper-enthaltende
Fraktionen wurden gepoolt und der Modifikationsgrad wurde durch
Behandeln einer Probe mit Dithiothreitol und durch Messen der Veränderung
der Extinktion bei 343 nm (Freisetzung von Pyridin-2-thion mit ε343=8,080
M–1cm–1)
bestimmt. Die Gewinnung des Antikörpers betrug ungefähr 90%,
wobei 4,9 Pyridyldithiogruppen pro Antikörpermolekül gebunden wurden.
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Der
modifizierte Antikörper
wurde mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, verdünnt, der
NaCl (50 mM) und EDTA (2 mM) in einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml
enthielt. Taxan-SH (1,7 Äq.
pro Pyridyldithiogruppe, die eingebaut wurde) in Ethanol (10% V/V
im endgültigen
Reaktionsgemisch) wurden danach der modifizierten Antikörperlösung zugesetzt.
Die Reaktion schritt bei Umgebungstemperatur unter Argon für 24 Stunden
voran. Die Freisetzung vom Pyridin-2-thion (überwacht bei 343 nm) zeigte,
dass der Disulfid-Austausch zwischen
dem Taxan-SH und dem Pyridyldithinsubstituenten am Antikörper vollständig war.
Ein Anteil des Reaktionsgemisches (4,0 mg) wurde dann auf eine Sephacryl
S300HR Gelfiltrationssäule
aufgeladen, die mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 6,5) äquilibriert
war PBS, pH 6,5). Der Hauptpeak umfasste monomeres TA1-Taxan. Das
verbleibende Konjugat wurde zu 0,5 mg/ml verdünnt und in 50 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH 6,5, der NaCl (50 mM), EDTA (2 mM) und 20% Propylenglykol enthielt,
dialysiert. Die Konzentration von Antikörper TA1 wurde in beiden Spezies
durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Die Konjugate wurde
in PBS formuliert, das Tween 80 (0,05%) und HSA (1 mg/ml) enthielt.
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Beispiel 8
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Weitere Verfahren zur
Verbindung von Taxanen
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Säurelabile Linker
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Taxane
können
mit N-geschützten
Aminosäuren
verestert werden, wie beispielsweise N-tboc-L-Alanin in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid
und Dimethylaminopyridin (DMAP) durch Standardverfahren, die in der
chemischen Literatur beschrieben sind. Die Spaltung der t-boc-Schutzgruppe
mit Trifluoressigsäure
ergibt einen Taxan-Ester, der eine terminale Aminogruppe enthält. Diese
Aminogruppe, die ein Taxan enthält,
kann an Antikörper
oder Fragmente hiervon gebunden werden und an andere Zellbindungsmittel über einen
säurelabilen
Linker wie es kürzlich
beschrieben wurde (Blättler
et al., 24 Biochemistry, 1517-1524 (1985), U.S Patente Nr. 4,542,225,
4,569,789 und 4,764,368).
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Photolabile
Linker
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Das
Aminogruppen enthaltende Taxanderivat, das oben beschrieben wurde,
kann an Zellbindungsmittel über
photolabile Linker wie kürzlich
beschrieben gebunden werden (Senter et al., 42 Photochemistry and Photobiology,
231-237 (1985), U.S. Patent Nr. 4,625,014).
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Peptidase-labile
Linker
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Das
Aminogruppen-enthaltende Taxan, das oben beschrieben wurde, kann
ebenfalls an Zellbindungsmittel über
Peptid-Spacer-Linker gebunden werden. Es wurde kürzlich gezeigt, dass kurze
Peptid-Spacer zwischen Arzneistoffen und makromolekularen Proteincarriern
in Serum stabil sind, jedoch einfach durch intrazelluläre lysnsomale
Peptidasen hydrolysiert werden (Trouet et al., 79 Proc. Natl. Acad.
Sci. 626-629 (1982)). Das Aminogruppen-enthaltende Taxan kann mit
Peptiden wie beispielsweise Ala-Leu, Leu-ala-Leu oder einem Dimer
von Ala-Leu unter Verwendung eines Kondensationsmittels wie beispielsweise
1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-HCl kondensiert,
so dass sich ein Peptidderivat des Taxans ergab, das danach an Zellbindungsmittel
gebunden werden kann.
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Esterase-labile
Linker
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Taxane
können
durch Reaktion der Hydroxylgruppe mit Bernsteinsäureanhydrid verestert und danach an
ein Zellbindungsmittel gebunden werden, um ein Konjugat zu erzeugen,
das durch intrazelluläre
Esterasen zur Freisetzung des freien Arzneistoffes gespalten werden kann
(siehe beispielsweise: Awoud-Pirak et al., 38 Biochem. Pharmacol.,
641-648 (1989), Laguzza et al., 32 J. Med. Chem., 549-555 (1989)).
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Beispiel 9
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In vivo Anti-Tumor Aktivität
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Die
Anti-Tumor-Wirkung des Anti-EGF Rezeptorantikörper-Taxankonjugats auf humane
Plattenepitelkarzinom(A431)xenotransplantate in SCID-Mäusen wurde
wie folgt etabiliert. Die Anti-Tumor-Wirkung zweier unterschiedlicher
Anti-humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor-Taxankonjugate
(Anti-EGFR-Taxankonjugate), KS-61-Taxan und KS-77-Taxan wurde in einem
humanen Tumor-Xenotransplantatmodell in SCID-Mäusen evaluiert.
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5
Wochen alte weibliche SCID-Mäuse
(25 Tiere) wurden subkutan in die rechte Flanke mit A431 humanem
Plattenepitelkarzinomzellen (1,5 × 106 Zellen/Maus)
in 0,1 ml serumfreien Medium inokuliert. Die Tumore wurden für 1 1 Tage
bis zu einer durchschnittlichen Größe von 100.0 mm3 (Bereich
von 54-145 mm3) gezüchtet. Die Tiere wurden dann
zufallsbedingt in vier Gruppen eingeteilt (3-5 Tiere pro Gruppe),
gemäß ihrer Tumorgröße. Die
erste Gruppe empfing KS-61-Taxankonjugat (10 mg/kg, qd × 5), das
intravenös
verabreicht wurde. Die zweite Gruppe empfing KS-77-Taxankonjugat
(10 mg/kg, qd × 5),
das intravenös
verabreicht wurde. Die dritte Gruppe empfing freies (nicht konjugiertes)
Taxan (0,24 mg/kg, qd × 5,
intravenös)
in derselben Dosis wie diejenige, die im Konjugat vorlag. Die vierte
Gruppe, ein Kontrollgruppe von Tieren, empfing PBS unter Verwendung
derselben Behandlungsvorschrift wie in die Gruppen 1 bis 3.
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Die
Größe der Tumore
wurde zweimal wöchentlich
gemessen und die Tumorvolumina wurden mit der folgenden Formel berechnet:
% (Länge × Breite × Höhe). Das
Gewicht der Tiere wurde ebenfalls zweimal pro Woche gemessen. Die
Ergebnisse sind in den 4 und 5 dargestellt.
Die Tumoren in der Kontrollgruppe der Mäuse wuchsen bis zu einer Größe von ungefähr 1000
mm3 in 31 Tagen. Die Behandlung mit freiem
Taxan zeigte keine therapeutische Wirkung und die Tumoren in dieser
Gruppe wuchsen in im Wesentlichen derselben Geschwindigkeit wie
in der Kontrollgruppe von Tieren, die PBS erhielt.
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Im
Gegensatz hierzu zeigten beide der Anti-EGFR-Taxankonjugate eine
bemerkenswerte Anti-Tumor-Aktivität, die eine vollständige Hemmung
des Tumorwachstums in allen behandelten Tieren für eine Zeitdauer des Experimentes – 34 Tage
für das
KS-61-Taxankonjugat
und 27 Tage für
das KS-77-Taxankonjugat zur Folge hatte. Die Daten zeigen ebenfalls,
dass die zielgerichtete Abgabe des Taxans unter Verwendung eines
Tumorspezifischen Antikörpers
für die
Anti-Tumor-Aktivität
essentiell ist, weil eine äquivalente
Dosis von nicht konjugiertem Taxan keine Anti-Tumor-Wirkung in diesem
Modell zeigte. Bedeutenderweise waren die Dosen von Antikörper-Taxankonjugat,
die verwendet wurden, gegenüber
den Tieren nicht toxisch, wie es durch das Fehlen irgendeines Gewichtsverlustes
demonstriert wird (siehe 5).
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Beispiel 10
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In vitro Zytotoxizität von Antikörper-Taxankonjugaten
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Die
Zytotoxizität
von Anti-EGFR-Taxankonjugat, KS-78-Taxan wurde in einem klonogenen
Assay unter Verwendung der EGF-Rezeptor-positiven humanen A431 Zell-Linie
(ATCC CRL 1555) gemessen. N901-Taxankonjugat, ein ähnliches
Konjugat, das mit dem monoklonalen Mausantikörper N901 gegen humanes CD56 hergestellt
wurde, wurde als Spezifitäts-Kontrolle
getestet, weil A431-Zellen sein Targetantigen, nämlich CD56, nicht exprimieren.
Die Zytotoxizität
des TA.1-Taxankonjugats, ein Konjugat, das mit dem monoklonalen Mausantikörper TA.1
gegen humanes Neu-Antigen hergestellt wurde, wurde mit der Antigen-positiven
humanen Zell-Linie SK-BR-3 (ATCC HTB 30) und der Antigen negativen
A431-Zell-Linie gemessen. Die Zellen wurden in unterschiedlichen
Dichten in 6-Well-Gewebskulturplatten in DMEM-Medium ausplattiert,
das mit 10% fötalem
Kalbsserum ergänzt
wurde. Immunkonjugate in verschiedenen Konzentrationen wurden zugesetzt
und die Zellen wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre bei 37°C in 6% CO2 gehalten, bis Kolonien von ungefähr 20 Zellen
oder mehr gebildet wurden (6 bis 10 Tage). Kontrollplatten enthielten
kein Immunkonjugat. Die Zellen wurden dann mit Formaldehyd fixiert,
mit Kristall violett angefärbt
und unter einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung gezählt. Die Ausplattierungseffizienz
wurde danach aus der Kolonienanzahl bestimmt und die überlebenden
Zellfraktionen wurden als das Verhältnis der Ausplattierungseffizienz
der behandelten Probe und der Ausplattierungseffizienz der Kontrolle
berechnet.
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6 zeigt
die Ergebnisse der Zytotoxizitätsbestimmung
für die
beiden Ansätze
des KS-78-Taxankonjugats
auf die Targetantigen-positive Zell-Linie A431. Konjugate von beiden
Ansätzen
zeigen eine ähnliche
Toxizität
für die
Zielzellen; eine Behandlung für
6 Tage bei Konzentrationen von 10–8 M
erreichten überlebende Fraktionen
von weniger als 10–2 (weniger als 1 % der
Zellen überleben).
Ein Kontrollkonjugat, N901-Taxan, für das keine Antigene auf der
Oberfläche
von A431-Zellen vorliegen, zeigt keine Toxizität für die Zellen bei Konzentrationen
von bis zu 3-10–8 M. Unkonjugierter
KS-78-Antikörper
zeigt ebenfalls einen sehr geringen zytotoxischen Effekt. Diese
Ergebnisse demonstrieren die Targetantigen-spezifische Zytotoxizität des KS-78-Taxankonjugats.
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Die
zytotoxische Potenz und Selektivität des TA.1-Taxankonjugates
wurde mit der Targetantigen-positiven Zell-Linie SK-BR-3 und der
Targetantigen-negativen Zell-Linie A431 untersucht. Die Ergebnisse
sind in 7 dargestellt. In einer Konjugatkonzentration
von 10–9 M
wurden mehr als 90% der Ziel-SK-BR-3-Zellen abgetötet (überlebende
Fraktion von weniger als 0,1), während
keine Toxizität
gegenüber
der Nicht-Target-A431-Zellen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse
demonstrieren das selektive Abtöten
von Antigenpositiven Zellen und das die zytotoxische Wirkung des
Konjugats von der spezifischen Bindung durch ihren Antikörperbestandteil
abhängig
ist.
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Während die
Erfindung ausführlich
und unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen hiervon beschrieben
wurde, wird für
den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet klar sein, dass verschiedene
Veränderungen
und Modifikationen hierin durchgeführt werden können, ohne
vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.