DE60033431T2

DE60033431T2 - Chimärische natriuretische peptide

Info

Publication number: DE60033431T2
Application number: DE60033431T
Authority: DE
Inventors: John Burnett Jr.; Ondrej Lisy
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: JP2003517005A; US6407211B1; US7384917B2; WO2001044284A3; EP1242452A2; ES2282160T3; DK1242452T3; WO2001044284A2; US7964564B2; PT1242452E; ATE353916T1; EP1242452B1; US20050059600A1; US20030069186A1; US20020082219A1; AU2433901A; US20090170756A1; JP5031964B2; DE60033431D1; CA2395585C

Description

Hintergrund der Erfindung
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) ist das erste beschriebene Peptid in einer Familie von Hormonen, die die Homöostase der Körperflüssigkeiten regeln (siehe Brenner et al., 1990). Die Beschreibung der starken diuretischen und natriuretischen Eigenschaften von atrialen Extrakten durch de Bold et al., (1981) war der erste Beweis, dass das Herz ein endokrines Organ sein kann. Die nachfolgende Isolierung und Charakterisierung dieser Aktivität durch Gruppen, zu denen Flynn et al. (1981) gehörte, charakterisierte ANP als das erste sezernierte Herzhormon. ANP wird von atrialen Myozyten als Reaktion auf einen Anstieg des intravaskulären Volumens sezerniert. Sobald es einmal im Kreislauf ist, beeinflusst es in erster Linie die Niere, das Gefäßgewebe und die Nebennierendrüse, wobei seine Wirkungen zur Ausscheidung von Natrium und Wasser durch die Nieren und eine Verringerung des intravaskulären Volumens und Blutdrucks führen (Atlas et al., 1987).
Matsuo und seine Mitarbeiter isolierten zwei andere natriuretische Peptide. Das natriuretische Peptid des Gehirns (Brain natriuretic peptide (BNP) und das natriuretische Peptid vom C-Typ (CNP) wurden beide anhand ihrer starken relaxierenden Wirkungen auf den Hühnerenddarm aus Schweinehirnextrakten isoliert (Sudeh et al., 1988; Sudeh et al., 1990). BNP stammt aus den Myokardzellen und zirkuliert wie ANP im menschlichen Plasma (de Bold et al., 1981; Burnett et al., 1984). BNP ist natriuretisch, reninhemmend, vasodilatierend und lusitrop (Mukoyama et al., 1991; Yamamoto et al., 1996; Grantham et al., 1996). CNP stammt aus den Endothelzellen und fungiert als vasodilatierendes und wachstumsinhibierendes Peptid (Suga et al., 1992; Stingo et al., 1992; Koller et al., 1991). ANP und BNP nehmen im Plasma und im Herzen während des kongestiven Herzversagens (congestive heart failure, CHF) beim Menschen zu, und zusätzlich dazu, dass sie als Serummarker für Ventrikeldysfunktion dienen, erfüllen sie wichtige Herz-Nieren-Schutzfunktionen (Stevens et al., 1995; Yamamoto et al., 1997; McDonagh et al., 1998).
ANP, BNP und CNP werden aus großen Vorläuferproteinen synthetisiert, und die reifen, aktiven Peptide haben eine 17-Aminosäure-Schleife, die aus einer intramolekulären Disulfid-Brücke gebildet wird. Bei den menschlichen Peptiden sind elf dieser Aminosäuren zwischen ANP, BNP und CNP identisch, während die – und C-terminalen Schwänze sowohl in ihrer Länge als auch in ihrer Zusammensetzung variieren (siehe Kambayashi et al., 1990; und Tawaragi et al., 1991). CNP hat keinen C-terminalen Schwanz, und Untersuchungen der Struktur des Gens für CNP zeigten, dass die Translation durch ein Stopcodon unmittelbar nach dem letzten Cysteincodon in der mRNA terminiert wird.
Zwischen den Spezies sind die Aminosäurensequenzen sowohl von ANP als auch von CNP in hohem Maße konserviert, wohingegen die Struktur von BNP stark variiert. Zum Beispiel sind die reifen 28-Aminosäuren-ANPs aus dem Menschen und dem Schwein identisch, und im Rattenpeptid gibt es nur eine Substitution. Zusammen mit der Existenz von mindestens drei Arten von für natriuretische Peptide spezifischen Rezeptoren lässt die Existenz dieser Strukturvariation vermuten, dass die physiologische Kontrolle der Homöostase der Körperflüssigkeiten komplex ist. Sowohl ANP als auch CNP verringern die Herz-Vorlast. Jedoch ist CNP im Gegensatz zu ANP nicht natriuretisch (Stingo et al., 1992).
Die unterschiedlichen Wirkungen von ANP, BNP und CNP sowohl auf das Herz-Kreislaufsystem als auch auf die Niere ebenso wie ihre Rollen bei pathophysiologischen Zuständen wie Herzversagen, Bluthochdruck und Nierenerkrankung haben die nativen Peptide und ihre molekularen Analoga sowohl für klinische Forscher als auch für Grundlagenforscher sehr interessant gemacht. Siehe z. B. Lewicki et al., (US Patent Nrn. 5,114,923, 4,804,650 und 4,757,048), Johnson et al., (US Patent Nr. 5,047,397) und Johnson et al. (US Patent Nr. 4,935,492) und Wei et al. (US Patent Nr. 5,583,108). US Patent Nr. 5,583,108 betrifft eine Chimäre von ANP und CNP, als Vasonatrinpeptid (VNP) bezeichnet. VNP, das 22 Aminosäuren des CNP und die 5 Aminosäuren am Carboxyterminus des ANP umfasst, hat arterielle und venöse vasodilatierende und natriuretische Effekte.
Ein viertes natriuretisches Peptid (NP), das natriuretische Peptid von Dendroaspis (DNP), besitzt Strukturähnlichkeit mit ANP, BNP und CNP. DNP, aus dem Gift von Dendroaspis angusticeps, der Grünen Mamba, isoliert, ist ein 38 Aminosäuren-Peptid, das eine 17-Aminosäuren-Disulfidringstruktur enthält, die der von ANP, BNP und CNP ähnelt (1), von denen alle biologische Wirkungen durch bestimmte Guanylylcyclaserezeptoren und die Erzeugung von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) vermitteln (Schweitz et al., 1992). DNP führt zu Vasorelaxation in der Nagetieraorta und in isolierten Hundeherzkranzgefässen mit einer Wirksamkeit, die mit der von ANP vergleichbar ist (Schweitz et al., 1992; Wennberg et al., 1997). Weiterhin steigert DNP in erheblichem Maße die Bildung von cGMP, den „second messenger" für die anderen natriuretischen Peptide, in Aortenendothelzellen (Schweitz et al., 1992).
Daher gibt es ein fortbestehendes Bedürfnis nach der Identifikation von Peptiden mit Eigenschaften wie denen der natriuretischen Peptide, die verwendbar zur Vorbeugung oder Behandlung von Herz-/Kreislauferkrankungen, z. B. kongestivem Herzversagen, sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte und gereinigte Peptidverbindung bereit, die bei Säugern mindestens eine Wirkung ausgewählt unter Natriurese, Renin-Suppression, Diurese und/oder Vasodilation besitzt. Dieses Peptid ist ein Fragment des Carboxyterminus des natriuretischen Peptids von Dendroaspis, umfassend SEQ ID NO: 3 oder eine biologisch aktive Variante oder ein Fragment von SEQ ID NO: 3. Es kann weiterhin einen Teil eines natriuretischen Peptides umfassen, das nicht das natriuretische Peptid von Dendroaspis ist. Wenn letzteres vorliegt, ist dieses Fragment der N-Terminus des menschlichen BNP, d. h. Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Glu-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly (SEQ ID NO: 7), oder der N-Terminus des menschlichen CNP, d. h. Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly (SEQ ID NO: 8).
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Peptid umfasst ein chimäres Peptid, das ein 41-Aminosäuren-Peptid ist, das die BNP-Kernringstruktur mit dem DNP-C-Terminus kombiniert. Somit ist eine bevorzugte Verbindung der Formel (I) ein chimäres Peptid, umfassend Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala (SEQ ID NO: 1; BD-NP; siehe 4), oder eine biologisch aktive Variante oder ein Fragment davon. Vorzugsweise hat das chimäre Peptid eine Disulfid-Brücke zwischen Cys-10 und Cys-26. Zu anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Peptiden gehören ein 37-Aminosäuren-Peptid, das die CNP-Kernringstruktur mit dem DNP-C-Terminus kombiniert. Somit ist eine andere bevorzugte Verbindung der Formel (I) ein chimäres Peptid, umfassend Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-lle-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala (SEQ ID NO: 2; CD-NP; siehe 4) oder eine biologisch aktive Variante oder ein Fragment davon. Vorzugsweise hat das chimäre Peptid eine Disulfid-Brücke zwischen Cys-6 und Cys-22. Noch ein anderes bevorzugtes Peptid umfasst einen Anteil des Carboxyterminus von DNP, vorzugsweise einen, der die carboxyterminalen 15 Aminosäuren umfasst (SEQ ID NO: 3; siehe 4), oder eine biologisch aktive Variante oder ein Fragment davon. Hier wird die Bezeichnung „biologisch aktiv" verwendet, um zu bezeichnen, dass ein erfindungsgemäßes Peptid mindestens eine der Aktivitäten eines nativen natriuretischen Peptids besitzt.
Wie nachfolgend beschrieben, hat BD-NP in vivo einen kombinierten Effekt, der starke Vasodilation mit einem Schwerpunkt auf pulmonarer Vasodilation, Natriurese und Renin-Suppression umfasst. Zum Beispiel erhöht bei normalen Säugern die Verabreichung von BD-NP in erheblichem Maße die glomeruläre Filtrationsrate (GFR), während sie die proximate fraktionale Natriumreabsorption (PFRNa) verringert und im Vergleich zur DNP-Verabreichung stärker die Plasmareninaktivität supprimiert. Weiterhin hat die Verabreichung von BD-NP (z. B. mit 50 ng/kg/Minute) bei normalen Säugern keine Wirkung auf die Nierendurchblutung (renal blood flow (RBF)), steigert die Urin-cGMP-Exkretion (UcGMPV), hat eine starke reninsupprimierende Wirkung, und senkt im Vergleich zur BNP-Verabreichung stärker den mittleren Arteriendruck (mean arterial pressure (MAP)) und in stärkerem Maße den rechtsatrialen Druck (RAP) und den Lungenkapillardruck (pulmonary capillary wedge pressure, PCWP) mit stärkerer pulmonarer Vasodilation.
Wie gleichfalls nachfolgend beschrieben, lag DNP-artige Immunreaktivität (DNP-LI) in menschlichem Plasma und im atrialen Myokard ebenso wie im menschlichen Urin vor. Des Weiteren war DNP-LI in menschlichem Plasma von CHF-Patienten erhöht. DNP liegt auch in anderen Säugerspezies vor, z. B. in Hundeplasma, -urin und -myokard. In vivo ist DNP ein sehr starker Stimulator der Bildung von cGMP in Plasma und Urin und hat starke natriuretische, diuretische, vasodilatorische und reninsupprimierende Eigenschaften (Lisy et al., 1999b). Weiterhin zeigt DNP therapeutische Wirksamkeit bei normalen Hunden (siehe Lisy et al., 1999b) ebenso wie bei einem Hundemodell des experimentellen Herzversagens (Lisy et al, 1999a).
Wie weiterhin nachfolgend beschrieben, führte die exogene Verabreichung von DNP an Hunde mit mildem oder manifestem kongestivem Herzversagen zum Absinken von Herzfülldruck und mittlerem Arteriendruck, erhält die Herzleistung und steigert die glomeruläre Filtrationsrate. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von kongestivem Herzversagen bereit, umfassend die Verabreichung von DNP oder einem biologisch aktiven Anteil davon, von einem Peptid, das ein chimäres natriuretisches DNP-Peptid ist, oder von einer biologisch aktiven Variante oder einem biologisch aktiven Fragment davon.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch eine als Natriuretikum, Renin-Suppressor, Diuretikum oder Vasodilator verwendbare Zusammensetzung bereit. Die Zusammensetzung umfasst eine therapeutische wirksame Menge mindestens eines erfindungsgemäßen Peptids in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff. Daher stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Auslösung von Natriurese, Diurese oder Vasodilation bei einem Säuger, z. B. einem Menschen, bereit. Das Verfahren umfasst es, dem Säuger eine pharmazeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder Zusammensetzung zu verabreichen. Die vorliegenden Peptide können entweder einzeln oder in Kombination zur Behandlung (Linderung oder Vorbeugung) einer Anzahl von Krankheitsbildern, darunter kongestivem Herzversagen, akutem oder chronischem Nierenversagen, Bluthochdruck, Leberzirrhose, nephrotischem Syndrom und anderen ödematösen Zustände, verwendbar sein.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Aminosäurestrukturen des atrialen natriuretischen Peptids (ANP, 28 Aminosäuren), des natriuretischen Peptids des Gehirns (BNP, 32 Aminosäuren), des natriuretischen Peptids vom C-Typ (CNP, 22 Aminosäuren) und des natriuretischen Peptids von Dendroaspis (38 Aminosäuren).
2 ist ein Boxplot der dem natriuretischen Peptid von Dendroaspis ähnelnden Immunreaktivität in Plasma bei normalen menschlichen Freiwilligen (N = 19) und Menschen mit Herzversagen (N = 19) (NYHA-Klassen III und IV; Schirger et al., 1999). Horizontale Mittellinien = Mittelwert; senkrechte Linien = Standardabweichung der Mittelwerte.
3 zeigt eine Immunfärbung des natriuretischen Peptids von Dendroaspis.
Links, normales menschliches Herz. Mitte, menschliches Herz mit kongestivem Herzversagen (CHF). Rechts, Färbung mit nichtimmunem reaktivem Serum (NRS) aus dem gleichen Herzen wie dem in dem mittleren Bild gezeigten (ursprüngliche Vergrößerung 400-fach).
4 zeigt die Aminosäurensequenz beispielhafter erfindungsgemäßer Peptide (SEQ ID NO: 1-3).
5 illustriert die Detektion von BD-NP durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC).
6 zeigt die Detektion von CD-NP durch HPLC.
7 illustriert die Detektion des C-Terminus des DNP durch HPLC.
8 zeigt die Codons für verschiedene Aminosäuren.
9 zeigt beispielhafte und bevorzugte Aminosäurenaustausche.
10 zeigt die basalen Plasmaspiegel von DNP bei normalen Hunden, Hunden mit mildem und Hunden mit manifestem CHF vor der Infusion von exogenem DNP. Der offene Balken stellt den Normalfall, der schraffierte Balken mildes CHF und der ausgefüllte Balken manifestes CHF dar. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05 gegenüber dem Normalfall.
11 zeigt die maximale Veränderung des Herzausstosses – ΔCO (A), des systemischen Gefäßwiderstandes – ΔSVR (B), des rechten atrialen Drucks – ΔRAP (C), und des Lungenkapillarmaximaldrucks – ΔPCWP (D) während der DNP-Verabreichung. Der offene Balken stellt den Normalfall, der schraffierte Balken mildes CHF und der ausgefüllte Balken manifestes CHF dar. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05 gegenüber dem Normalfall.
12 zeigt das Verhältnis von Plasma cGMP/Plasma DNP bei hochdosiertem DNP in normalen Hunden, Hunden mit mildem CHF und Hunden mit manifestem CHF. Der offene Balken stellt den Normalfall, der schraffierte Balken mildes CHF und der ausgefüllte Balken manifestes CHF dar. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05 gegenüber dem Normalfall.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Wie hier verwendet, schließt der Ausdruck „natriuretisches Peptid" oder „NP" ein natives NP, z. B. ANP, BNP, CNP oder DNP, Teile eines NP, Varianten eines NP oder Chimären davon ein. Vorzugsweise umfassen Chimären nur Anteile der reifen Form des NP.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „isoliert und/oder gereinigt" auf die in vitro-Präparation, Isolation und/oder Reinigung einer Nukleinsäure, z. B. DNA oder eines Polypeptidmoleküls aus seiner bzw. ihrer natürlichen zellulären Umgebung und aus der Assoziation mit anderen Zellbestandteilen, wie z. B. Nukleinsäure oder Polypeptid, d. h., die Nukleinsäure oder das Polypeptid ist nicht mit in vivo-Substanzen assoziiert. Somit ist im Hinblick auf ein „isoliertes Nukleinsäuremolekül", das ein Polynukleotid genomischen, cDNA- oder synthetischen Ursprungs oder irgendeine Kombination davon umfasst, das „isolierte Nukleinsäuremolekül" (1) nicht mit der Gesamtheit oder einem Teil eines Polynukleotids assoziiert, in dem das „isolierte Nukleinsäuremolekül" in der Natur gefunden wird, (2) auf funktionsfähige Weise mit einem Polynukleotid verbunden, mit dem es nicht in der Natur verbunden ist, oder (3) in der Natur nicht als ein Teil einer größeren Sequenz vorkommend. Ein isoliertes Nukleinsäurenmolekül bedeutet eine polymere Form von Nukleotiden mit mindestens 10 Basen Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine modifizierte Form eines dieser beiden Nukleotidtypen. Der Ausdruck umfasst einzel- und doppelsträngige DNA-Formen. Der Begriff „Oligonukleotide" wird hier verwendet, um in der Natur vorkommende und modifizierte Nukleotide zu umfassen, die durch in der Natur vorkommende und durch nicht in der Natur vorkommende Oligonukleotidbindungen verknüpft sind. Oligonukleotide sind eine Untergruppe der Polynukleotide mit einer Länge von 200 Basen oder weniger. Vorzugsweise haben Oligonukleotide eine Länge von 10 bis 60 Basen und besonders bevorzugt von 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 bis 40 Basen. Oligonukleotide sind üblicherweise einzelsträngig, z. B. für Sonden; obwohl Oligonukleotide doppelsträngig sein können, z. B. zur Verwendung bei der Konstruktion einer Variante der Nukleinsäuresequenz. Erfindungsgemäße Oligonukleotide können entweder Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide sein. Der Begriff „in der Natur vorkommende Oligonukleotide" wird hier verwendet, um Desoxyribonukleotide und Ribonukleotide zu bezeichnen. Der Begriff „modifizierte Nukleotide" wird hier verwendet, um Nukleotide mit modifizierten oder ersetzten Zuckergruppen und dergleichen zu bezeichnen. Der Begriff „Oligonukleotidbindungen" wird hier verwendet, um Oligonukleotidbindungen wie Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenoat, Phosphordiselenoat, Phosphoranilothioat, Phosphoraniladat, Phosphoramidat und dergleichen zu bezeichnen. Gewünschtenfalls kann ein Oligonukleotid eine Markierung zur Detektion umfassen.
Zum Beispiel ist „isolierte DNP-Nukleinsäure" eine RNA oder DNA, die mehr als 9, vorzugsweise 36, und besonders bevorzugt 45 oder mehr sequentielle Nukleotidbasen umfasst, die mindestens einen Anteil von DNP codieren, oder eine dazu komplementäre RNA oder DNA, die komplementär zu einer DNP codierenden RNA oder DNA ist bzw. damit hybridisiert und unter stringenten Bedingungen stabil gebunden bleibt, wie durch aus dem Stand der Technik wohlvertraute Verfahren bestimmt, z. B. in Sambrook et al, (1989). Somit ist die RNA oder DNA in dem Sinne „isoliert", dass sie von mindestens einer kontaminierenden Nukleinsäure, mit der sie normalerweise in der natürlichen Quelle der RNA oder DNA assoziiert ist, frei ist, und dass sie vorzugsweise frei von allen anderen zellulären, z. B. eukaryontischen oder aus Säugern stammenden RNAs oder DNAs ist. Der Satz „frei von mindestens einer kontaminierenden Quellnukleinsäure mit der sie normalerweise assoziiert ist" schließt den Fall ein, in dem die Nukleinsäure in die Quelle oder natürliche Zelle wieder eingeführt wird, aber in einer anderen chromosomalen Lokation vorliegt oder ansonsten von normalerweise nicht in der Quellzelle gefundenen Nukleinsäuresequenzen flankiert ist.
Die Begriffe „rekombinante Nukleinsäure" oder „präselektierte Nukleinsäure", z. B. „rekombinante DNA-Sequenz oder rekombinantes DNA-Segment" oder „präselektierte DNA-Sequenz" oder „präselektiertes DNA-Segment" werden hier verwendet, um eine Nukleinsäure, z. B. DNA, zu bezeichnen, die aus einer beliebigen geeigneten Gewebsquelle abgeleitet oder isoliert wurde, und die nachfolgend in vitro chemisch verändert sein kann, so dass ihre Sequenz nicht in der Natur vorkommt oder in der Natur vorkommenden Sequenzen entspricht, die nicht so angeordnet sind, wie sie es in einem Genom wären, das nicht mit exogener DNA transformiert worden ist. Ein Beispiel präselektierter aus einer Quelle „abgeleiteter" DNA wäre eine DNA-Sequenz, die als verwendbares Fragment innerhalb eines bestimmten Organismus identifiziert und dann im im wesentlichen reiner Form chemisch synthetisiert wird. Ein Beispiel solcher aus einer Quelle „isolierter" DNA wäre eine verwendbare DNA-Sequenz, die auf chemische Weise aus dieser Quelle ausgeschnitten oder entfernt worden ist, z. B. durch Verwendung von Restriktionsendonukleasen, so dass sie durch die Methodologie der Gentechnik zur erfindungsgemäßen Verwendung weiter manipuliert, z. B. amplifiziert werden kann. Somit kann die Rückgewinnung oder Isolation eines bestimmten DNA-Fragmentes aus einem Restriktionsverdau die Auftrennung des Verdaus auf Polyacrylamid- oder Agarose-Gel durch Elektrophorese, die Identifikation des interessierenden Fragmentes durch Vergleich seiner Beweglichkeit mit der von Marker-DNA-Fragmenten bekannten Molekulargewichts, Entfernung des Gelabschnittes, der das gewünschte Fragment enthält, und Abtrennung des Gels von der DNA verwenden. Siehe Lawn et al. (1981) und Goeddel et al. (1980). Somit gehören zur „präselektierten DNA" vollsynthetische DNA-Sequenzen, semisynthetische DNA-Sequenzen, aus biologischen Quellen isolierte DNA-Sequenzen und von RNA abgeleitete DNA-Sequenzen ebenso wie Gemische davon.
Der Begriff „abgeleitet" bedeutet hier im Hinblick auf ein RNA-Molekül, dass das RNA-Molekül komplementäre Sequenzidentität zu einem bestimmten DNA-Molekül besitzt.
Der Begriff „isoliertes Polypeptid oder Peptid" bezeichnet ein Polypeptid oder Peptid, z. B. von DNA oder RNA einschließlich von synthetischer DNA oder RNA oder irgendeiner Kombination davon codiert, welches isolierte Polypeptid oder Peptid (1) nicht mit in der Natur vorkommenden Proteinen assoziiert ist, (2) frei von anderen Proteinen aus der gleichen Quelle ist, z. B. frei von menschlichen Proteinen (3) von einer Zelle von einer anderen Spezies exprimiert wird, oder (4) nicht in der Natur vorkommt. Ein „isoliertes" Peptid enthält mehr als 3, vorzugsweise mehr als 6 und besonders bevorzugt 12 oder mehr Aminosäurenreste.
Der Begriff „Sequenzhomologie" bezeichnet den Anteil der zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen übereinstimmenden Basen oder den Anteil der zwischen zwei Aminosäuresequenzen übereinstimmenden Aminosäuren. Wenn die Sequenzhomologie als Prozentsatz ausgedrückt wird, z. B. 50%, bezeichnet der Prozentsatz den Anteil der Übereinstimmungen über die Länge der Sequenz, die mit einer anderen Sequenz verglichen wird. Lücken (in jeder der beiden Sequenzen) sind zur Maximierung der Übereinstimmung erlaubt; Lückenlängen von 15 Basen oder weniger werden normalerweise verwendet, 6 Basen oder weniger sind bevorzugt, wobei 2 Basen oder weniger besonders bevorzugt sind. Bei der Verwendung von Oligonukleotiden als Sonden oder Behandlungen beträgt die Sequenzhomologie zwischen der Zielnukleinsäure und der Oligonukleotidsequenz im allgemeinen nicht weniger als 17 Zielbasenübereinstimmungen unter 20 möglichen Oligonukleotidbasenpaarübereinstimmungen (85%), vorzugsweise nicht weniger als 9 Übereinstimmungen unter 10 möglichen Basenpaarübereinstimmungen (90%), und besonders bevorzugt nicht weniger als 19 Übereinstimmungen unter 20 möglichen Basenpaarübereinstimmungen (95%.)
Der Begriff „selektive Hybridisierung" bezeichnet eine detektierbare und spezifische Bindung. Erfindungsgemäße Polynukleotide, Oligonukleotide und Fragmente hybridisieren unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die die wahrnehmbaren Mengen detektierbarer Bindung an unspezifische Nukleinsäuren minimieren, selektiv mit Nukleinsäuresträngen. Bedingungen mit hoher Stringenz können verwendet werden, um selektive Hybridisierungsbedingungen zu erreichen, wie aus dem Stand der Technik bekannt und hier diskutiert. Grundsätzlich beträgt die Nukleinsäuresequenzhomologie zwischen den erfindungsgemäßen Polynukleotiden, Oligonukleotiden und Fragmenten und einer interessierenden Nukleinsäuresequenz mindestens 65%, und typischerweise mit vorzugsweise zunehmenden Homologien mindestens ungefähr 70%, ungefähr 90%, ungefähr 95%, ungefähr 98% und 100%.
Zu den in den Bereich der Erfindung fallenden Nukleinsäuremolekülen gehören solche, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem ein erfindungsgemäßes NP codierenden Nukleinsäuremolekül hybridisieren, z. B. mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 codierenden Nukleinsäuremolekülen. Mäßige und stringente Hybridisierungsbedingungen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt, siehe z. B. Sektionen 9.47-9.51 von Sambrook et al. (1989). Stringente Bedingungen sind z. B. diejenigen, die (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen zum Waschen verwenden, z. B. 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat (SSC); 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS) bei 50°C, oder die (2) ein denaturierendes Mittel wie z. B. Formamid während der Hybridisierung verwenden, z. B. 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbum/0,1% FicoII/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumphosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS), und 10% Dextransulfat bei 42°C, wobei in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C gewaschen wird.
Zwei Aminosäuresequenzen sind homolog, wenn es eine teilweise oder vollständige Identität zwischen ihren Sequenzen gibt. Zum Beispiel bedeutet 85% Homologie, dass 85% der Aminosäuren identisch sind, wenn die beiden Sequenzen zur maximalen Übereinstimmung miteinander abgeglichen werden. Lücken (in jeder der beiden miteinander abgeglichenen Sequenzen) sind zur Maximierung der Übereinstimmung erlaubt; Lückenlängen von 5 oder weniger sind bevorzugt, wobei 2 oder weniger besonders bevorzugt sind. Alternativ und vorzugsweise sind zwei Proteinsequenzen (oder von ihnen abgeleitete Polypeptidsequenzen mit einer Länge von mindestens 30 Aminosäuren) homolog in dem Sinne, in dem dieser Begriff hier verwendet wird, wenn sie einen ALIGN-Score von mehr als 5 (in Standardabweichungseinheiten) bei Verwendung des Programmes ALIGN mit der Mutationsdatenmatrix und einer Lücken-Strafgewichtung von 6 oder mehr verwenden. Siehe Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, Band 5, National Biomedical Research Foundation, Seiten 101-110, und Supplement 2 dieses Bandes, Seiten 1-10. Die beiden Sequenzen oder Teile davon sind besonders bevorzugt homolog, wenn ihre Aminosäuren 50% oder mehr Identität bei optimalem Abgleich unter Verwendung des ALIGN-Programms besitzen.
Der Begriff „entspricht" wird hier verwendet, um die Homologie einer Polynukleotidsequenz (d. h. ihre Identität, nicht notwendigerweise eine evolutionäre Beziehung) mit der Gesamtheit oder einem Teil einer Referenzpolynukleotidsequenz oder die Identität einer Polypeptidsequenz mit einer Referenzpolypeptidsequenz zu bezeichnen. Diesem gegenübergestellt wird der Begriff „komplementär", der hier verwendet wird, um die Homologie der komplementären Sequenz mit der Gesamtheit oder einem Teil einer Referenzpolynukleotidsequenz zu bezeichnen. Beispielsweise entspricht die Nukleotidsequenz „TATAC" einer Referenzsequenz „TATAC" und ist komplementär zu einer Referenzsequenz „GTATA".
Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzverhältnisse zwischen zwei oder mehr Polynukleotiden zu bezeichnen: „Referenzsequenz", „Vergleichsfenster", „Sequenzidentität", „Sequenzidentitätsgrad" und „wesentliche Übereinstimmung". Eine „Referenzsequenz" ist eine definierte Sequenz, die als Grundlage für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann eine Untermenge einer größeren Sequenz sein, z. B. ein Abschnitt einer cDNA voller Länge oder einer in einem Sequenzprotokoll angegebenen Sequenz, oder sie kann eine vollständige cDNA- oder Gen-Sequenz umfassen. Grundsätzlich ist eine Referenzsequenz mindestens 20 Nukleotide lang, häufig mindestens 25 Nukleotide lang und oftmals mindestens 50 Nukleotide lang. Da zwei Polynukleotide jeweils (1) eine Sequenz (d. h. ein Anteil der vollständigen Polynukleotidsequenz) umfassen können, die zwischen den beiden Polynukleotiden ähnlich ist, und (2) weiterhin eine Sequenz umfassen können, die zwischen den beiden Polynukleotiden divergent ist, werden die Sequenzvergleiche zwischen den beiden (oder mehreren) Polynukleotiden typischerweise dadurch durchgeführt, dass man Sequenzvergleiche der beiden Polynukleotide über ein „Vergleichsfenster" durchführt, um lokale Regionen der Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen.
Ein „Vergleichsfenster" bezeichnet, wie hier verwendet, ein konzeptuelles Segment von mindestens 20 zusammenhängenden Nukleotiden, wobei der Anteil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Insertionen oder Deletionen (d. h. Lücken) von 20 Prozent oder weniger im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Insertionen oder Deletionen enthält) zum optimalen Abgleich der beiden Sequenzen enthalten kann. Ein optimaler Abgleich von Sequenzen zum Abgleichen eines Vergleichsfensters kann durch den Lokalhomologiealgorithmus von Smith and Waterman (1981), durch den Homologie-Abgleichs-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970), durch das Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren von Pearson and Lipman (1988), durch computerisierte Implementierung dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) oder durch visuelle und/oder manuelle Inspektion erfolgen, und der beste durch die verschiedenen Verfahren gebildete (d. h. der zu dem höchsten Homologiegrad über das Vergleichsfenster führende) Abgleich wird ausgewählt.
Der Begriff „Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynukleotidsequenzen über das Vergleichsfenster identisch (d. h. auf einer Einzelnukleotidbasis identisch) sind. Der Begriff „Sequenzidentitätsgrad" bedeutet, dass zwei Polynukleotidsequenzen über das Vergleichsfenster identisch (d. h. auf einer Einzelnukleotidbasis) sind. Der Begriff „Sequenzidentitätsgrad" wird dadurch berechnet, dass man zwei optimal miteinander abgeglichene Sequenzen über das Vergleichsfenster vergleicht, die Anzahl der Positionen bestimmt, an denen in beiden Sequenzen die gleiche Nukleinsäurenbase vorkommt (z. B. A, T, C, G, U oder I), um die Anzahl der Übereinstimmungspositionen zu ermitteln, die Anzahl der Übereinstimmungspositionen durch die Gesamtzahl der Positionen in dem Vergleichsfenster (d. h. die Fenstergröße) dividiert und das Ergebnis mit 100 multipliziert, um den Sequenzidentitätgrad in Prozent zu erhalten. Der Begriff „wesentliche Identität" wird hier verwendet, um ein charakteristisches Merkmal einer Polynukleotidsequenz zu bezeichnen, wobei das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens 85 Prozent Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 90 bis 95 Prozent Sequenzidentität, üblicherweise mindestens 99 Prozent Sequenzidentität im Vergleich zu einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von wenigstens 20 Nukleotidpositionen, oftmals über ein Fenster von mindestens 20-50 Nukleotiden, hat, wobei der Grad der Sequenzidentität dadurch berechnet wird, dass man die Referenzsequenz mit der Polynukleotidsequenz vergleicht, die Deletionen oder Insertionen umfassen kann, die 20 Prozent oder weniger der Referenzsequenz für das Vergleichsfenster ausmachen.
In Bezug auf Polypeptide bezeichnet der Begriff „wesentliche Identität", dass zwei Peptidsequenzen bei optimalem Abgleich, wie mit den Programmen GAP oder BESTFIT unter Verwendung der vorgegebenen Lückengewichtung, mindestens ungefähr 80 Prozent Sequenzidentität gemeinsam haben, vorzugsweise mindestens ungefähr 90 Prozent Sequenzidentität, bevorzugter mindestens 95 Prozent Sequenzidentität und ganz besonders bevorzugt mindestens 99 Prozent Sequenzidentität.
1. Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle
A. Quellen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle
Zu den Nukleotidsequenzquellen, aus denen Nukleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäßes NP codieren, oder dazu komplementäre Nukleinsäuren erhalten werden können, gehören gesamte oder polyadenylierte RNA aus einer beliebigen eukaryontischen zellulären Quelle, vorzugsweise einem Reptil, z. B. einer Schlange, oder einem Säuger, z. B. einem Menschen, einer Ratte, einer Maus, einem Hundeartigen, einem Rinderartigen, einem Pferdeartigen, einem Schafartigen, einem Ziegenartigen, einem Katzenartigen, besonders bevorzugt einem Primaten, z. B. einem Menschen, aus welcher Quelle cDNAs durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren abgeleitet werden können. Zu anderen Quellen für erfindungsgemäße DNA-Moleküle gehören genomische Bibliotheken, die aus einer beliebigen eukaryontischen, zellulären Quelle, vorzugsweise einem Säuger, abgeleitet sind, z. B. die oben exemplarisch dargestellten.
B. Isolation eines NP-codierenden Gens
Ein ein natives NP codierendes Nukleinsäuremolekül kann durch Verwendung von Standardverfahren, wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, identifiziert und isoliert werden. Zum Beispiel kann Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) verwendet werden, um NP-cDNAs zu isolieren und zu klonieren. Oligo-dT kann als Primen in einer reversen Transkriptasereaktion verwendet werden, um erststrängige cDNAs aus isolierter RNA, die RNA-Sequenzen von Interesse enthält, herzustellen, z. B. aus aus menschlichem Gewebe isolierter Gesamt-RNA. RNA kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert werden, z. B. unter Verwendung des TRIZOL^TM-Reagens (GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Die resultierenden erststrängigen cDNAs werden dann in PCR-Reaktionen amplifiziert.
„Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" bezeichnet ein Verfahren oder eine Technik, wobei Mengen eines zuvor ausgewählten Nukleinsäure-Fragmentes, RNA und/oder DNA, wie in US Patent Nr. 4,683,195 beschrieben amplifiziert werden. Grundsätzlich wird Sequenzinformation von den Enden der interessierenden Region oder jenseits davon verwendet, um Oligonukleotidprimer zu entwerfen, die mindestens 7 bis 8 Nukleotide umfassen. Diese Primer sind mit gegenüberliegenden Strängen der zu amplifizierenden Vorlage sequenzidentisch oder -ähnlich. Die PCR kann verwendet werden, um spezifisch RNA-Sequenzen, spezifische DNA-Sequenzen aus gesamter genomischer DNA und aus zelluläre Gesamt-RNA transkribierte cDNA, Bakteriophagen oder Plasmidsequenzen und dergleichen zu amplifizieren. Allgemein siehe Mullis et al., 1987; Erlich, 1989. Somit beruhen PCR-basierte Klonierungsansätze auf aus Abgleichen von verwandten Gen- oder Polypeptidsequenzen hergeleiteten konservierten Sequenzen.
Primer werden so hergestellt, dass sie hochkonservierten Regionen von Polypeptiden oder Nukleotidsequenzen entsprechen, die identifiziert und verglichen wurden, um die Primer zu erzeugen, z. B. durch einen Sequenzvergleich anderer eukaryontischer NPs. Ein Primer wird hergestellt, von dem vorhergesagt wird, dass er an den Gegensinnstrang bindet, und ein anderer Primer wird herstellt, von dem vorhergesagt wird, dass er an den Sinnstrang eines DNA-Moleküls bindet, das z. B. ein menschliches DNP-artiges immunoreaktives Polypeptid (z. B. DNP-LI) codiert.
Die Produkte jeder PCR-Reaktion werden mittels eines Agarosegels aufgetrennt, und alle konsistent amplifizierten Produkte werden aus dem Gel gereinigt und direkt in einen geeigneten Vektor wie z. B. einen bekannten Plasmidvektor einkloniert. Die resultierenden Plasmide werden einer Restriktionsendonukleaseanalyse und Didesoxysequenzierung von doppelsträngigen Plasmid-DNAs unterzogen.
Ein anderer Ansatz zur Identifikation, Isolation und KIonierung von cDNAs, die ein NP codieren, besteht im Durchmustern einer cDNA-Bibliothek. Die Durchmusterung auf DNA-Fragmente, die die Gesamtheit oder einen Teil einer cDNA, die ein NP codiert, codieren, kann dadurch bewerkstelligt werden, dass man die Bibliothek mit einer Sonde sondiert, die Sequenzen besitzt, die zwischen denen, von denen angenommen wird, dass sie mit dem NP verwandt sind, hochkonserviert sind, z. B. das Homologon eines bestimmten NPs aus einer anderen Spezies, oder indem man Plaques auf die Bindung an Antikörper, die spezifisch ein NP erkennt, hin durchmustert. DNA-Fragmente, die an eine Sonde binden, die mit NP verwandte Sequenzen besitzt, oder die mit Anti-NP-Antikörpern immunreaktiv sind, können in einen geeigneten Vektor umkloniert und sequenziert und/oder als Sonden zur Identifikation anderer cDNAs, die die Gesamtheit oder einen Teil des NPs codieren, verwendet werden.
C. Variantes oder chimäres NP, von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen codiert
Nukleinsäuremoleküle, die Aminosäuresequenzvarianten eines nativen NPs codieren, werden durch eine Vielzahl von aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt. Zu diesen Verfahren gehören ohne Beschränkung darauf die Isolation aus einer natürlichen Quelle (im Fall natürlich vorkommender Aminosäurenvarianten) oder die Herstellung durch oligonukleotidvermittelte (oder ortsgerichtete) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer zuvor hergestellten Varianten- oder Nichtvarianten-Version des NPs, oder durch chemische Synthese (siehe unten). Chimäre NPs können z. B. unter Verwendung von auf rekombinanter DNA basierenden Methodologien oder von chemischen Synthesen hergestellt werden. Ein chimäres NP kann z. B. unter Verwendung überlappender Oligonukleotide und PCR hergestellt werden. Ein Sinn-Oligonukleotid, das mindestens einen Teil der aminoterminalen Reste eines NPs und einen Anteil eines zweiten NPs umfasst, wird an ein Gegensinn-Oligonukleotid angelagert, das zu den Sequenzen am 3'-Ende des Sinn-Oligonukleotids komplementäre Sequenzen und andere, zu den den Carboxy-Terminus des chimären NPs codierenden komplementäre, Sequenzen umfassen. PCR wird dann verwendet, um eine doppelsträngige DNA herzustellen, die die gesamte Länge des chimären NPs codiert.
Für Aminosäurensubstitutionsvarianten eines NPs ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Varianten die oligonukleotidvermittelte Mutagenese. Diese Technik ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt, wie von Adelman et al. (1983) beschrieben. Kurz gesprochen wird z. B. die DNP-DNA durch Hybridisierung eines Oligonukleotids, das die gewünschte Mutation enthält, an eine DNA-Vorlage verändert, wobei die Vorlage die einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, der bzw. das die unveränderte oder native DNA-Sequenz des DNP enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen vollständigen zweiten komplementären Strang der Vorlage zu synthetisieren, der auf diese Weise den Oligonukleotid-Primer inkorporiert und die selektierte Veränderung der DNP-DNA codiert.
Grundsätzlich werden Oligonukleotide von mindestens 25 Nukleotidenlänge verwendet. Ein optimales Oligonukleotid hat 12 bis 15 Nukleotide, die vollständig komplementär zu der Vorlage auf jeder Seite der die Mutation codierenden Nukleotide sind. Dies stellt sicher, dass das Oligonukleotid richtig an das einzelsträngige DNA-Vorlagenmolekül bindet. Die Olginonukleotide werden unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Techniken, wie der von Crea et al. (1978) beschriebenen, ohne weiteres synthetisiert.
Die DNA-Vorlage kann durch diejenigen Vektoren, die entweder von Bakteriophage-M13-Vektoren abgeleitet sind (die kommerziell verfügbaren M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet), oder durch Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung umfassen, wie von Viera et al. (1987) beschrieben, gebildet werden. Somit kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren eingefügt werden, um eine einzelsträngige Vorlage zu bilden. Die Bildung der einzelsträngigen Vorlage ist in Sektionen 4.21-4.41 von Sambrook et al. (1989) beschrieben.
Alternativ kann eine einzelsträngige DNA-Vorlage durch Denaturierung doppelsträngiger Plasmid-DNA (oder anderer DNA) unter Verwendung von Standardtechniken gebildet werden.
Zur Veränderung der nativen DNA-Sequenz (z. B. zur Bildung von Aminosäuresequenzvarianten), wird das Oligonukleotid unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an die einzelsträngige Vorlage hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, wird hinzugesetzt, um den komplementären Strang der Vorlage zu synthetisieren, wobei das Oligonukleotid als Primer für die Synthese verwendet wird. Auf diese Weise entsteht somit ein Heteroduplex-Molekül, so dass ein Strang der DNA die mutierte Form von z. B. DNP codiert und der andere Strang (die Originalvorlage) die native, unveränderte DNP-Sequenz codiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle, üblicherweise einen Prokaryonten wie z. B. E. coli JM101, transformiert. Nachdem die Zellen herangezogen worden sind, werden sie auf Agaroseplatten ausplattiert und unter Verwendung des mit 32-Phosphat radiomarkierten Oligonukleotidprimers durchmustert, um die bakteriellen KoIonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten. Die mutierte Region wird dann entfernt und in einen zur Peptid- oder Polypeptidbildung geeigneten Vektor, allgemein einen Expressionsvektor des für die Transformation eines geeigneten Wirtes typischerweise verwendeten Typs, platziert.
Das unmittelbar zuvor beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplex-Molekül entsteht, worin beide Stränge des Plasmids die Mutation oder Mutationen enthalten. Die Modifikationen sind wie folgt: Das einzelsträngige Oligonukleotid wird wie oben beschrieben an die einzelsträngige Vorlage angeheftet. Ein Gemisch von drei Desoxyribonukleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGPT) und Desoxyribothymidin (dTTP), wird mit einem modifizierten Thiodesoxyribocytosin namens cDTP-(αS) (welches von der Amersham Corporation erhalten werden kann) kombiniert. Dieses Gemisch wird dem Vorlage-Oligonukleotid-Komplex zugesetzt. Bei Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wird ein, mit Ausnahme der mutierten Basen, mit der Vorlage identischer DNA-Strang gebildet. Weiterhin enthält dieser neue DNA-Strang cDTP-(αS) anstelle von dCTP, was dazu dient, ihn vor dem Restriktionsendonukleaseverdau zu schützen.
Nach dem einzelsträngigen Schneiden („Nicking") des Vorlagestranges des doppelsträngigen Heteroduplexes mit einem geeigneten Restriktionsenzym kann der Vorlagenstrang mit ExoIII-Nuklease oder einer anderen geeigneten Nuklease über die Region, die die zu mutagenisierende Stelle oder Stellen enthält, hinaus verdaut werden. Die Reaktion wird dann abgebrochen, um ein Molekül übrig zu lassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständig doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase unter Verwendung von DNA-Polymerase gebildet. Dieses Homoduplex-Molekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle wie z. B. E. coli JM101 transformiert werden.
Zum Beispiel ist eine Ausführungsform der Erfindung ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das ein DNA-Segment umfasst, das die carboxyterminalen 15 Aminosäuren von DNP (SEQ ID NO: 3) codiert, welche Aminosäuren von jedem beliebigen Codon codiert werden können, das die jeweilige Aminosäure codiert (siehe 8 und Seite D1 in Appendix D in Sambrook et al. (1989)).
Es wird auch in Betracht gezogen, dass einer oder mehrere der Reste des von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen codierten Peptids verändert werden kann oder können, solange die Peptidvariante biologische Aktivität besitzt. Vorzugsweise hat die Variante mindestens ungefähr 10% der biologischen Aktivität eines erfindungsgemäßen Peptids, z. B. ein Peptid mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3. Die biologische Aktivität eines erfindungsgemäßen Peptids kann unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, darunter Immunoassays und in vivo-Studien wie die nachfolgend beschriebenen, bestimmt werden.
II. Herstellung von Mitteln, die in den Bereich der Erfindung fallen
A. Chimäre Expressionskassetten
Zur Herstellung von Expressionskassetten zur Transformation kann die rekombinante oder präselektierte DNA-Sequenz oder das rekombinante oder präselektierte DNA-Segment zirkulär oder linear, doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Eine präselektierte DNA-Sequenz, die eine RNA-Sequenz codiert, die im wesentlichen komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die ein NP codiert, wie z. B. eine DNA, die ein chimäres NP codiert, das BNP und DNP umfasst, ist typischerweise eine „Sinn"-DNA-Sequenz, die in der entgegengesetzten Richtung in eine Kassette einkloniert ist (d. h. 3'-5' anstelle von 5'-3'). Grundsätzlich hat die präselektierte DNA-Sequenz oder das präselektierte DNA-Segment die Form einer chimären DNA, wie z. B. einer Plasmid-DNA, die auch codierende Regionen enthalten kann, die von Kontrollsequenzen flankiert sind, die die Expression der in der resultierenden Zelllinie vorliegenden präselektierten DNA fördern.
Der Ausdruck „chimär" wird hier im Hinblick auf eine Kassette oder einen Vektor für einen Vektor verwendet, der DNA aus mindestens zwei verschiedenen Spezies oder DNA aus der gleichen Spezies enthält, die auf eine Weise verknüpft oder verbunden ist, die in der Spezies „nativ" oder im Wildtyp nicht vorkommt.
Neben präselektierten DNA-Sequenzen, die als Transkriptionseinheiten für NP oder Teile davon dienen, kann ein Teil der präselektierten DNA untranskribiert sein und eine regulatorische Funktion oder eine Strukturfunktion erfüllen. Beispielsweise kann die präselektierte DNA ihrerseits einen Promotor umfassen, der in Säugerzellen aktiv ist, oder kann einen Promotor verwenden, der bereits in dem Genom, das das Transformationssystem ist, vorliegt. Zu solchen Promotoren gehören der CMV-Promotor ebenso wie der späte SV40-Promotor und retrovirale LTRs („long terminal repeat"-Elemente), obwohl viele andere aus dem Stand der Technik wohlbekannte Promotor-Elemente in der Ausführung der Erfindung verwendet werden können.
Auch andere in den Wirtszellen funktionale Elemente wie z. B. Introns, Enhancer, Polyadenylierungssequenzen und dergleichen können ein Teil der präselektierten DNA sein. Solche Elemente können für die Funktion der DNA notwendig oder nicht notwendig sein, aber können verbesserte Expression der DNA durch Beeinflussung der Transkription, der mRNA-Stabilität oder dergleichen bereitstellen. Solche Elemente können gewünschtenfalls in die DNA eingeschlossen werden, um die optimale Leistung der transformierenden DNA in der Zelle zu erreichen.
Der Begriff Kontrollsequenzen" bezeichnet definitionsgemäß DNA-Sequenzen, die zur Expression einer funktionsfähig verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen die beispielsweise für prokaryontische Zellen geeignet sind, umfassen einen Promotor, gewünschtenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle. Von eukaryontischen Zellen ist bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
„Funktionsfähig verbunden" bedeutet definitionsgemäß, dass die Nukleinsäuren in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz gebracht werden. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder ein sekretorisches Leaderpeptid mit einer DNA für ein Peptid oder ein Polypeptid funktionsfähig verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Peptids oder Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer codierenden Sequenz funktionsfähig verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist mit einer codierenden Sequenz funktionsfähig verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Grundsätzlich bedeutet „funktionsfähig verbunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend und im Falle eines sekretorischen Leaderpeptids zusammenhängend und im gleichen Leseraster sind. Enhancer brauchen jedoch nicht zusammenhängend zu sein. Die Verbindung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsschnittstellen bewirkt. Wenn keine solchen Stellen existieren, werden synthetische Oligonukleotidadaptor oder Linker auf die übliche Weise verwendet.
Die in den Zellen einzuführende präselektierte DNA enthält im allgemeinen weiterhin entweder ein selektierbares Markergen oder ein Reportergen oder beide, um die Identifikation und Selektion transformierter Zellen aus der Zellpopulation, die transformiert werden soll, zu erleichtern. Alternativ kann der selektierbare Marker auf einem separaten DNA-Stück getragen und in einem Co-Transformationsverfahren verwendet werden. Sowohl die selektierbaren Marker als auch die Reportergene können von geeigneten regulatorischen Sequenzen flankiert sein, um Expression in den Wirtszellen zu ermöglichen. Nützliche selektierbare Marker sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt, und es gehören z. B. Antibiotikums- und Herbizidresistenzgene hierzu, wie z. B. neo, hpt, dhfr, bar, aroA, dapA und dergleichen. Siehe auch die in Tabelle I von Lundquist et al., (US Patent Nr. 5,848,956) aufgelisteten Gene.
Reportergene werden verwendet, um potentiell transformierte Zellen zu identifizieren und die Funktionalität von regulatorischen Sequenzen zu evaluieren. Reportergene, die leicht messbare Proteine codieren, sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Grundsätzlich ist ein Reportergen ein Gen, das in dem Empfängerorganismus oder -gewebe nicht vorliegt oder nicht exprimiert wird, und das ein Protein codiert, dessen Expression sich in einer leicht detektierbaren Eigenschaft manifestiert, z. B. in enzymatischer Aktivität. Zu bevorzugten Genen gehören das Chloramphenicolacetyltransferasegen (cat) aus Tn9 von E. coli, das Beta-Glucuronidasegen (gus) des E. coli-Locus uidA, und das Luziferasegen aus dem Glühwürmchen Photinus pyralis. Die Expression des Reportergens wird zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Einführung der DNA in die Empfängerzellen gemessen.
Die allgemeinen Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten DNA, die Zielzellen transformieren kann, sind dem Fachmann wohlbekannt, und die gleichen Zusammensetzungen und Konstruktionsverfahren können verwendet werden, um die hier verwendbare DNA zu konstruieren. Beispielsweise stellt Sambrook et al. (1989) geeignete Konstruktionsverfahren bereit.
B. Transformation in Wirtszellen
In die Wirtszellen, z. B. Säugerzellen, Bakterienzellen, Hefezellen oder Insektenzellen, kann die rekombinante DNA ohne weiteres durch Transfektion mit einem Expressionsvektor eingeführt werden, der eine ein NP, eine Variante davon oder eine Chimäre davon codierende DNA oder ihr Komplement umfasst, durch ein beliebiges zum Einführen in eine bestimmte Zelle verwendbares Verfahren eingeführt werden, z. B. durch physikalische oder biologische Methoden, um eine transformierte Zelle mit stabil in ihr Genom integrierter rekombinanter DNA zu ergeben, so dass die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, -Sequenzen oder -Segmente von der Wirtszelle exprimiert werden.
Zu den physikalischen Verfahren zur Einführung einer präselektierten DNA in eine Wirtszelle gehören Calciumphosphatfällung, Lipofektion, Partikelbeschuss, Mikroinjektion, Elektroporation und dergleichen. Zu biologischen Verfahren zur Einführung der interessierenden DNA in eine Wirtszelle gehören die Verwendung von viralen DNA- und RNA-Vektoren. Der Hauptvorteil physikalischer Methoden ist, dass sie nicht mit pathologischen oder onkogenen Prozessen von Viren assoziiert sind. Jedoch sind sie weniger präzise, was oftmals zur Insertion mehrfacher Kopien, zufälliger Integration, Zerstörung fremder und endogener Gensequenzen und unvorhersagbarer Expression führt. Zur Gentherapie von Säugern sind virale Vektoren zu den am häufigsten verwendeten Verfahren zum Einführen von Genen in Säugerzellen, z. B. menschliche Zellen, geworden. Virale Vektoren können von Pockenviren, Herpes simplex Virus I, Adenoviren, adenoassoziierten Viren, Retroviren, Lentiviren und dergleichen abgeleitet sein.
Der Begriff „Zelllinie" oder „Wirtszelle" soll, wie hier verwendet, wohlcharakterisierte homogene, biologisch reine Zellpopulationen bezeichnen. Diese Zellen können eukaryontische Zellen sein, die neoplastisch sind oder in vitro durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren „immortalisiert" worden sind, ebenso wie primäre Zellen oder prokaryontische Zellen. Die Zelllinie oder Wirtszelle stammt vorzugsweise von einem Säuger, aber aus Nichtsäugern stammende Zelllinien oder Wirtszellen können verwendet werden, darunter Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz- oder Bakterienquellen. Grundsätzlich ist die präselektierte DNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz verwandt, die im Genom der Wirtszelle zu finden ist, aber nicht exprimiert oder nicht in hohem Maße exprimiert oder, alternativ, überexprimiert wird.
Der Begriff „transfiziert" oder „transformiert" wird hier verwendet, um jede beliebige Wirtszelle oder Zelllinie einzuschließen, deren Genom durch die Gegenwart von mindestens einer präselektierten DNA-Sequenz verändert oder erweitert wurde, welche DNA im Stand der Gentechnik auch als „heterologe DNA", „rekombinante DNA", „exogene DNA", „gentechnisch verändert", „nichtnativ" oder „fremde DNA" bezeichnet wird, wobei diese DNA isoliert und durch das gentechnische Verfahren isoliert und ins Genom der Wirtszelle oder Zelllinie eingeführt wurde. Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden typischerweise durch Transfektion mit einer DNA-Sequenz in einem Plasmidexpressionsvektor, einem viralen Expressionsvektor oder als isolierter linearer DNA-Sequenz hergestellt. Vorzugsweise ist die transfizierte DNA eine chromosomal integrierte rekombinante DNA-Sequenz, die ein ein NP codierendes Gen oder sein Kompliment umfasst, welche Wirtszelle signifikante Spiegel an autologem oder „nativem" NP exprimieren oder nicht exprimieren kann.
Zur Bestätigung der Gegenwart der präselektierten DNA-Sequenz in der Wirtszelle kann eine Vielzahl von Assays durchgeführt werden. Zu solchen Assays gehören z. B. „molekularbiologische" Assays, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wie z. B. Southern- und Northern-Blotting, RT-PCR und PCR; „biochemische" Assays wie Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten NP, z. B. durch immunologische Mittel (Immunoassays wie z. B. ELISA und Western-Blot) oder durch hier beschriebene Assays zur Identifikation von Mitteln, die in den Bereich der Erfindung fallen.
Zur Detektion und Quantifikation von von eingeführten präselektierten DNA-Segmenten gebildete RNA kann RT-PCR verwendet werden. In dieser PCR-Anwendung ist es zuerst notwendig, RNA unter Verwendung von Enzymen wie z. B. reverser Transkriptase revers in DNA zu transkribieren und dann unter Verwendung konventioneller PCR-Techniken die DNA zu amplifizieren. In den meisten Fällen können PCR-Techniken, wiewohl nützlich, nicht die Integrität des RNA-Produkts zeigen. Weitere Informationen über die Natur des RNA-Produkts können durch Northern-Blotting erhalten werden. Diese Technik zeigt die Gegenwart einer RNA-Spezies und liefert Informationen über die Integrität dieser RNA. Die Gegenwart oder Abwesenheit einer RNA-Spezies kann auch unter Verwendung von Dot- oder Slot-Blot-Northernhybridisierungen bestimmt werden. Diese Techniken sind Modifikationen des Northern-Blottings und zeigen nur die Gegenwart oder Abwesenheit einer RNA-Spezies.
Während Southern-Blotting und PCR verwendet werden können, um das fragliche präselektierte DNA-Segment zu detektieren, liefern sie keine Informationen, ob das präselektierte DNA-Segment exprimiert wird. Die Expression kann durch spezifische Identifikation der Peptidprodukte der eingeführten präselektierten DNA-Sequenzen oder durch Messung der phenotypischen Veränderungen, die von der Expression des eingeführten präselektierten DNA-Segments in den Wirt oder der Wirtszelle vermittelt werden, gemessen werden.
III. Erfindungsgemäße Peptide
Erfindungsgemäße Peptide können durch das Festphasenpeptidsyntheseverfahren (oder Merrifield-Verfahren) synthetisiert werden. Dieses etablierte und weit verwendete Verfahren ist einschließlich der experimentellen Prozeduren in der folgenden Referenz beschrieben: Stewart et al., 1969; Merrifield, 1963; Meienhofer, 1973; und Barany und Merrifield, 1980. Die Synthese wird vom carboxyterminalen Ende des Peptides unter Verwendung einer alpha-amino-geschützten Aminosäure begonnen. Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) oder t-Butyloxycarbonyl (Boc)-Schutzgruppen können für alle Aminosäuren verwendet werden, obwohl auch andere Schutzgruppen geeignet sind. Zum Beispiel können Boc-Asn-OH, Boc-Ser-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Arg-OH oder Boc-Tyr-OH (d. h. selektierte ANP-analoge carboxy-terminale Aminosäuren) an chlormethylierte Polystyrol-Harzträger verestert werden. Der Polystyrolharzträger ist vorzugsweise ein Copolymer von Stryrol mit ungefähr 0,5 bis 2% Divinylbenzol als Quervernetzungsmittel, das Unlöslichkeit des Polystyrolpolymers in bestimmten organischen Lösungsmitteln bewirkt. Siehe Carpino et al., 1972; Meinhofer, 1978; und Merrifield, 1963. Diese und andere Verfahren zur Peptidsynthese sind auch beispielhaft dargestellt in den US-Patenten Nrn. 3,862,925; 3,842,067, 3,972,859, 4,105,602 und in US-Patent Nr. 4,757,048.
Das immobilisierte Peptid wird dann am Stickstoff entschützt, und andere Aminosäuren mit geschützten Aminogruppen werden schrittweise dem immobilisierten Peptid zugesetzt. Am Ende des Verfahrens wird das fertige Peptid von dem Harz abgespalten, und alle verbleibenden Schutzgruppen werden durch Behandlung unter sauren Bedingungen entfernt, wie z. B. durch Behandlung mit einem Gemisch von Bromwasserstoff und Trifluoressigsäure oder mit Flusssäure, oder die Abspaltung von Harz kann unter basischen Bedingungen erfolgen, z. B. mit Triethylamin, wobei die Schutzgruppen dann unter sauren Bedingungen entfernt werden.
Die abgespaltenen Peptide werden durch aus dem Stand der Technik wohlbekannte Mittel isoliert und gereinigt, wie z. B. durch Lyophilisierung gefolgt von entweder Exklusions- oder Partitionschromatographie auf Polysaccharidgelmedien wie z. B. Sephadex G-25 oder Gegenstromaustausch. Die Zusammensetzung des fertigen Peptids kann durch Aminosäurenanalyse nach Abbau des Peptids durch Standardverfahren bestätigt werden.
Die Salze von Carboxylgruppen des Peptides können auf die übliche Weise hergestellt werden, indem man das Peptid mit einem oder mehreren Äquivalenten einer gewünschten Base in Kontakt bringt, wie z. B. einer Metallhydroxidbase, z. B. Natriumhydroxid; einer Metallcarbonat- oder Bicarbonatbase wie z. B. Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat; oder einer Aminbase wie z. B. Triethylamin, Triethanolamin und dergleichen.
Die Säureadditionssalze der Polypeptide können hergestellt werden, indem man das Polypeptid mit einem oder mehreren Äquivalenten der gewünschten anorganischen oder organischen Säure in Kontakt bringt, wie z. B. Salzsäure.
Die Ester von Carboxylgruppen der Polypeptide können durch ein beliebiges der aus dem Stand der Technik bekannten üblichen Verfahren zur Umwandlung einer Carbonsäure oder eines Vorläufers in einen Ester hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Estern der erfindungsgemäßen Polypeptide bei Verwendung der oben beschriebenen Merrifield-Synthesetechnik ist es, das vollendete Polypeptid in Gegenwart des gewünschten Alkohols in Abhängigkeit von dem Harz entweder unter basischen oder unter sauren Bedingungen von dem Harz abzuspalten. Auf diese Weise wird das C-terminale Ende des Peptids, wenn es von dem Harz befreit wird, direkt ohne Isolation der freien Säure verestert.
Auch die Amide der erfindungsgemäßen Polypeptide können durch aus dem Stand der Technik wohlbekannte Techniken zur Umwandlung einer Carbonsäuregruppe oder eines Vorläufers in ein Amid hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Amidbildung an der C-terminalen Carboxylgruppe ist es, das Polypeptid mit einem geeigneten Amin oder in Gegenwart eines Alkohols von einem festen Träger abzuspalten, was einen Ester ergibt, gefolgt von Aminolyse mit dem erwünschten Amin.
Die N-Acyl-Derivate einer Aminogruppe der vorliegenden Polypeptide können unter Verwendung einer N-Actyl-geschützten Aminosäure für den letzten Kondensationsschritt oder durch Acylierung eines geschützten oder ungeschützten Peptids hergestellt werden. O-Acyl-Derivate können z. B. durch Acylierung eines freien Hydroxy-Peptids oder Peptidharzes hergestellt werden. Jede Acylierung kann unter Verwendung von Standard-Acylierungsmitteln wie Acylhaliden, Anhydriden, Acylimidazolen und dergleichen durchgeführt werden. Sowohl – als auch O-Acylierung können gewünschtenfalls zusammen durchgeführt werden.
Die Synthese kann manuelle Techniken verwenden oder vollständig automatisiert sein, z. B. unter Verwendung eines Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, Calif.) oder eines Biosearch SAM II-Peptidsyntheseautomaten (Biosearch, Inc., San Rafael, Calif.) gemäß den im Instruktionshandbuch bereitgestellten Anweisungen und unter Verwendung der vom Hersteller gelieferten Reagenzien. Disulfid-Brücken zwischen Cys-Resten können durch milde Oxidation des linearen Peptids mit KCN, wie in US-Patent Nr. 4,757,048, Spalte 20, dargestellt, eingeführt werden.
Die erfindungsgemäßen zyklischen Verbindungen können durch Verknüpfung von Cysteinresten bereitgestellt werden, jedoch wird auch der Ersatz einer Sulfhydrylgruppe an dem Cysteinrest durch eine alternative Gruppe, z. B. -CH₂-CH₂-, in Betracht gezogen. Zum Beispiel werden zum Ersatz von Sulfhydrylgruppen durch eine -CH₂-Gruppe die Cysteinreste durch die analoge Alpha-Aminobuttersäure ersetzt. Diese zyklischen analogen Peptide können z. B. nach dem Verfahren von M. Lebl und Hruby (1984) oder durch Einsatz des in US Patent Nr. 4,161,521 offenbarten Verfahrens gebildet werden.
Ester- oder Amidbrücken können ebenfalls gebildet werden, indem man die OH-Gruppen von Serin oder Threonin und die Carboxylgruppen von Aspartat oder Glutamat reagieren lässt, um eine Brücke mit der Struktur -CH₂-CO₂CH₂- zu bilden. Auf ähnliche Weise kann ein Amid erhalten werden, indem man die Seitengruppen von Lysin und Aspartat oder Glutamat zu einer Brücke der Struktur -CH₂-C(O)NH-(CH₂)₄- reagieren lässt. Verfahren zur Synthese dieser Brücken sind bei Schiller et al. (1985a) und Schiller et al. (1985b) zu finden. Andere brückenbildende Aminosäurenreste und Reaktionen sind in US Patent Nr. 4,935,492 bereitgestellt.
Die folgenden Referenzen beschreiben die Herstellung von Peptidanaloga, die Nichtpeptidylbindungen zur Verbindung von Aminosäurenresten umfassen: Spatola, 1983a; Spatola, 1983b; Morley, 1980; Hudson et al., 1979; Spatola et al., 1986; Hann, 1982; Almquist et al, 1980; Jennings-White et al., 1982; Szelke et al., Europäische Patentanmeldung EP 45665 (1982); Holladay et al., 1983; und Hruby, 1982.
IV. Dosierungen, Formulierungen und Verabreichungswege der erfindungsgemäßen Mittel
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und Peptide werden vorzugsweise einem Säuger, z. B. einem Menschen oder einem nichtmenschlichen Säuger wie z. B. einem Haustier, in Dosierungen von mindestens ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 mg/kg verabreicht, bsonders bevorzugt von ungefähr 0,05 bis ungefähr 50 mg/kg und nochmals besonders bevorzugt von 0,1 bis ungefähr 30 mg/kg Körpergewicht (z. B. ungefähr 10 bis ungefähr 50 ng/kg bei Hunden), obwohl andere Dosierungen günstige Ergebnisse bewirken können. Die verabreichte Menge variiert in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, darunter ohne Beschränkung darauf das ausgewählte Mittel, die Erkrankung, und ob Vorbeugung oder Behandlung erreicht werden soll. Sowohl lokale als auch systemische Verabreichung werden in Betracht gezogen. Die systemische Verabreichung ist bevorzugt.
Somit kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel kontinuierlich oder in Intervallen sein, in Abhängigkeit z. B. von dem physiologischen Zustand des Empfängers, ob der Sinn der Verabreichung ein therapeutischer oder ein prophylaktischer ist, und anderen Faktoren, die den Fachleuten bekannt sind. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Mittel kann im wesentlichen über einen zuvor festgelegten Zeitraum hinweg kontinuierlich oder in einer Reihe von Dosen mit Intervallen erfolgen.
Die Verabreichung von Sinn- oder Gegensinn-Nukleinsäuremolekülen kann durch die Einführung von mit einer Expressionskassette, die das Nukleinsäuremolekül enthält, transformierten Zellen (siehe z. B. WO 93/02556) oder durch Verabreichung des Nukleinsäuremoleküls (siehe z. B. Felgner et al., US Patent No. 5,580,859, Pardoll et al., 1995; Stevenson et al., 1995; Molting, 1997; Donnelly et al., 1995; Yang et al., 1996; Abdallah et al., 1995; Wolff et al., 1990; Tripathy et al., 1994; Tripathy et al., 1996a; Tripathy et al., 1996b; Tsurumi et al., 1996; Baumgartner et al., 1997; Lin et al., 1990) bewerkstelligt werden. Pharmazeutische Formulierungen, Dosierungen und Verabreichungswege für Nukleinsäuren sind z. B. in Felgner et al., oben, allgemein offenbart.
Die Peptidverbindungen können als neutrale Formen oder Salzformen zu den Zusammensetzungen formuliert werden. Zu den pharmazeutisch akzeptablen ungiftigen Salzen gehören die (mit den freien Aminogruppen gebildeten) Säureadditionssalze und solche, die durch Reaktion mit anorganischen Säuren wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie z. B. Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure, Zitronensäure, Apfelsäure und dergleichen gebildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können von anorganischen Basen abgeleitet werden wie z. B. Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxiden, und solchen organischen Basen, wie z. B. Aminen, d. h. Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen.
Eine oder mehrere geeignete Einzeldosisformen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid enthalten, die, wie nachfolgend beschrieben, gewünschtenfalls für retardierte Freisetzung formuliert sein können, können auf einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden, darunter auf oralen oder parenteralen Wegen, einschließlich von rektalen, buccalen, vaginalen und sublingualen, transdermalen, subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, intrathoraziellen, intracoronalen, intrapulmonaren und intranasalen Wegen. Die Formulierungen können gewünschtenfalls zweckmäßigerweise in getrennten Einzeldosisformen dargeboten und durch jedes der in der Pharmazeutik wohlvertraute Verfahren hergestellt werden. Zu solchen Verfahren kann der Schritt gehören, dass man das therapeutische Mittel mit flüssigen Trägerstoffen, festen Matrizes, halbfesten Trägern, feingeteilten festen Trägern oder Kombinationen davon in Verbindung bringt und dann nötigenfalls das Produkt in das gewünschte Abgabesystem einführt oder es dazu formt.
Wenn das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid zur oralen Verabreichung hergestellt wird, wird es vorzugsweise mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff kombiniert, um eine pharmazeutische Formulierung oder Einzeldosisform zu bilden. Die Gesamtmenge der aktiven Inhaltsstoffe in solchen Formulierungen umfasst von 0,1 bis 99,9 Gew.% der Formulierung. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet, dass der Träger, das Verdünnungsmittel, der Hilfsstoff und/oder das Salz mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel sein muss und für den Empfänger nicht schädlich sein darf. Der aktive Inhaltsstoff für die orale Verabreichung kann als Pulver oder Granulat vorliegen; als Lösung, als Suspension oder als Emulsion; oder in einer geeigneten Grundlage wie einem synthetischen Harz für die Aufnahme der aktiven Inhaltsstoffe aus einem Kaugummi. Der aktive Inhaltsstoff kann auch als Bolus, als Latwerge oder Paste dargeboten werden.
Die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid enthaltende pharmazeutische Formulierungen können durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren unter Verwendung wohlbekannter und ohne weiteres verfügbare Inhaltsstoffe hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Nukleinsäuremolekül oder Peptid mit gängigen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägerstoffen formuliert und in die Form von Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen gebracht werden. Zu Beispielen für Hilfsstoffe, Träger und Verdünnungsmitteln, die für solche Formulierungen geeignet sind, gehören die folgenden Füll- und Erweiterungsstoffe wie z. B. Stärke, Zucker, Mannitol und Kieselsäurederivate; Bindemittel wie Carboxymethylzellulose, HPMC und andere Zellulosederivate, Alginate, Gelatin und Polyvinyl-Pyrrolidon; Befeuchtungsmittel wie z. B. Glycerol; zerfallsfördernde Mittel wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat; Mittel zur Verzögerung der Auflösung wie z. B. Paraffin; Resorptionsbeschleuniger wie quaternäre Ammoniumverbindungen; oberflächenaktive Mittel wie Cetylalkohol, Glycerolmonostearat; adsorptive Trägerstoffe wie Kaolin und Bentonit; und Schmiermittel wie z. B. Talk, Calcium und Magnesiumstearat und feste Polyethylglykole.
Zum Beispiel können das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid enthaltende Tabletten oder Kapseln Pufferungsmittel wie z. B. Calciumcarbonat, Magnesiumoxid und Magnesiumcarbonat umfassen. Caplets und Tabletten können auch inaktive Inhaltsstoffe wie z. B. Zellulose, vorgelatinierte Stärke, Siliziumdioxid, Hydroxypropylmethylzellulose, Magnesiumstearat, mikrokristalline Zellulose, Stärke, Talk, Titandioxid, Benzoesäure, Zitronensäure, Maisstärke, Mineralöl, Polypropylenglycol, Natriumphosphat, Zinkstearat und dergleichen enthalten. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid enthaltende Hart- oder Weichgelatinekapseln können inaktive Inhaltssstoffe wie z. B. Gelatin, mikrokristalline Zellulose, Natriumlaurylsulfat, Stärke, Talk und Titandioxid und dergleichen ebenso wie flüssige Vehikel wie z. B. Polyethylenglycol (PEGs) und pflanzliche Öle enthalten. Weiterhin sind magensaftresistente Caplets oder Tabletten des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder Peptids so gestaltet, dass sie der Auflösung im Magen widerstehen und sich in der eher neutralen bis alkalischen Umgebung des Duodenums auflösen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid kann auch als Elixier oder Lösung für bequeme orale Administration oder als zur parenteralen Verabreichung, z. B. auf intramuskulärem, subkutanem oder intravenösem Weg, geeignete Lösung formuliert werden.
Die pharmazeutischen Formulierungen des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder Peptid kann auch die Form einer wässrigen oder wasserfreien Lösung oder Dispersion oder alternativ die Form einer Emulsion oder Suspension annehmen.
Somit kann das Nukleinsäuremolekül oder Peptid zur parenteralen Verabreichung (z. B. durch Injektion, z. B. Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion) formuliert und die Einzeldosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen, kleinvolumigen Infusionsbehältern oder in Multidosiscontainern mit einem zusätzlichen Konservierungsmittel dargeboten werden. Die aktiven Inhaltsstoffe können solche Formen annehmen, wie z. B. Suspension, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Grundlagen, und sie können Formulierungshilfsstoffe wie Suspensionsmittel, Stabilisatoren und/oder Emulgatoren enthalten. Alternativ können die aktiven Inhaltsstoffe in Pulverform sein, erhalten durch aseptische Isolierung eines sterilen Feststoffs oder durch Lyophilisierung aus der Lösung, zur Rekonstitution mit einer geeigneten Grundlage, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Anwendung.
Diese Formulierungen können pharmazeutisch akzeptable Grundlagen und Hilfsstoffe enthalten, die aus dem Stand der Technik wohlbekannt sind. Es ist z. B. möglich, unter Verwendung von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, das bzw. die aus der physiologischen Perspektive akzeptabel und zusätzlich zum Wasser unter Lösungsmitteln wie z. B. Aceton, Ethanol, Isopropylalkohol, Glycolestern wie den unter dem Namen „Dowanol" verkauften Produkten, Polyglykolen und Polyethylenglykol, C₁-C₄-Alkylestern kurzkettiger Säuren, vorzugsweise Ethyl oder Isopropyllactat, Fettsäuretriglyceriden, wie den unter dem Namen „Miglyol" vermarkteten Produkten, Isopropylmyristat, tierischen Fetten, Mineral- und Pflanzenölen und Polysiloxanen ausgewählt ist oder sind, Lösungen herzustellen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch Verdickungsmittel wie z. B. Zellulose und/oder Zellulosederivate enthalten. Sie können auch Gummen wie z. B. Xanthan, Guar oder Carbogummi oder Gummi arabicum oder alternativ Polyethylenglycole, Bentone und Montmorillonite und dergleichen enthalten.
Es ist möglich, nötigenfalls einen unter Antioxidantien, oberflächenaktiven Mitteln, anderen Konservierungsstoffen, filmbildenden, keratolytischen oder comedolytischen Mitteln, Aroma- und Farbstoffen ausgewählten Hilfstoff zuzusetzen. Es können auch andere Inhaltsstoffe zugesetzt werden, ob für die beschriebenen Krankheitsbilder oder irgendein anderes Krankheitsbild.
Zum Beispiel können unter den Antioxidantien t-Butylhydrochinon, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol und α-Tocopherol und seine Derivate genannt werden. Die hauptsächlichen für die topische Applikation vorgesehenen galenischen Formen nehmen die Formen von Cremes, Milchen, Gelen, Dispersionen oder Mikroemulsionen, mehr oder minder stark verdickten Lotionen, imprägnierten Pflastern, Salben oder Sticks oder alternativ die Form von Aerosolformulierungen in Spray oder Schaumform oder alternativ in der Form eines Seifenkuchens an.
Alternativ eignen sich die Mittel gut zur Formulierung als Dosierungsformen mit Retard-Freisetzung und dergleichen. Die Formulierungen können so zusammengestellt werden, dass sie nur den aktiven Inhaltsstoff freisetzen, vorzugsweise in einem bestimmten Bereich des Darm- oder Atemtraktes, eventuell über einen Zeitraum hinweg. Die Beschichtungen, Umhüllungen und Schutzmatrizes können z. B. aus polymeren Substanzen wie z. B. Polylactidglycolaten, Liposomen, Mikroemulsionen, Mikropartikeln, Nanopartikeln oder Wachs hergestellt werden. Diese Beschichtungen, Hüllen und Schutzmatrizes sind verwendbar zur Beschichtung von implantierten Geräten, z. B. Stents, Kathetern, Peritonealdialyseröhren und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid kann über Pflaster zur transdermalen Verabreichung abgegeben werden. Siehe US Patent Nr. 5,560,922 für Beispiele von zur transdermalen Abgabe eines therapeutischen Mittels geeignete „Pflaster". Pflaster zur transdermalen Abgabe können eine Abdeckschicht und eine Polymermatrix, in welcher ein therapeutisches Mittel zusammen mit einem oder mehreren Hautdurchdringungsverbesserern dispergiert oder gelöst ist, umfassen. Die Abdeckschicht kann aus jedem geeigneten Material bestehen, das für das therapeutische Mittel undurchdringlich ist. Die Abdeckschicht dient als Schutzschicht für die Matrixschicht und stellt auch eine Stützfunktion bereit. Die Abdeckung kann so gebildet werden, dass sie eine Schicht von im wesentlichen gleicher Größe wie die Polyermatrix bildet, oder sie kann von größeren Dimensionen sein, so dass sie sich über die Seite der Polymermatrix erstrecken oder die Seite oder Seiten der Polymermatrix überlappen und sich dann nach außen auf eine Weise, dass die Erweitenang der Abdeckschicht die Basis für ein Adhäsionsmittel sein kann, nach außen erstrecken kann. Alternativ kann die Polymermatrix ein adhäsives Polymer wie z. B. Polyacrylat oder ein Acrylatvinylacetatcopolymer enthalten oder daraus formuliert sein. Für längerfristige Anwendungen kann es wünschenswert sein, mikroporöse und/oder atmungsfähige Abdeckungslaminate zu verwenden, so dass die Hydration oder Mazeration der Haut minimiert werden kann.
Zu Beispielen für geeignete Materialien zur Herstellung der Abdeckschicht gehören Filme aus Polyethylen mit hoher und niedriger Dichte, Polypropylen, Polyurethan, Polyvinylchlorid, Polyester wie z. B. Polyethylenphthalat, Metallfolie, Metallfolienlaminate solcher geeigneter Polymerfilme und dergleichen. Vorzugsweise sind die für die Abdeckschicht verwendeten Materialien Laminate solcher Polymerfilme mit Metallfolien wie z. B. Aluminiumfolie. In solchen Laminaten steht ein Polymerfilm des Laminats üblicherweise in Kontakt mit der adhäsiven Polymermatrix.
Die Abdeckschicht kann eine beliebige geeignete Dicke haben, die die gewünschte Schutz- und Stützfunktionen bereitstellt. Eine geeignete Dicke beträgt von ungefähr 10 bis ungefähr 200 Mikrometer.
Grundsätzlich sind die zur Bildung der biologisch akzeptablen adhäsiven
Polymerschicht verwendeten Polymere solche, die imstande sind, Formkörper, dünne Wände oder Beschichtungen zu bilden, durch welche die therapeutischen Mittel mit einer kontrollierten Geschwindigkeit hindurchtreten können. Geeignete Polymere sind biologisch und pharmazeutisch kompatibel, nicht allergen, in Körperflüssigkeiten oder Geweben, mit denen die Vorrichtung in Kontakt kommt, unlöslich und mit ihnen kompatibel. Die Verwendung löslicher Polymere ist zu vermeiden, da Auflösung oder Erosion der Matrix durch Hautfeuchtigkeit die Freisetzungsgeschwindigkeit des therapeutischen Mittels ebenso wie die Fähigkeit der Dosierungsform zur bequemen Entfernung am Ort zu bleiben, beeinflussen würde.
Zu beispielhaften Materialien zur Herstellung der adhäsiven Polymerschicht gehören Polyethylen, Polypropylen, Polyurethan, Ethylen/Propylen-Copolymere, Ethylen/Ethylacrylat-Copolymere, Ethylen/Vinylacetat-Copolymere, Silikonelastomere, insbesondere Polydimethylsiloxane zu medizinischen Zwecken, Neoprengummi, Polyisobutylen, Polyacrylate, chloriertes Polyethylen, Polyvinylchlorid, Vinylchlorid-Vinylacetatcopolymer, quervernetzte Polymethacrylatpolymere (Hydrogel), Polyvinylidenchlorid, Polyethylenterephthalat, Butylgummi, Epichlorohydringummis, Ethylenvinylalkoholcopolymere, Ethylenvinyloxyethanolcopolymere; Silikoncopolymere, z. B. Polysiloxan-Polycarbonatcopolymere, Polysiloxanpolyethylenoxidcopolymere, Polysiloxan-Polymethacrylatcopolymere, Polysiloxanalkylencopolymere (z. B. Polysiloxan-Ethylencopolymere), Polysiloxan-Alkylensilancopolymere (z. B. Polysiloxan-Ethylensilancopolymere) und dergleichen; Zellulosepolymere, z. B. Methyl- oder Ethylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose und Zelluloseester; Polycarbonate; Polytetrafluorethylen; und dergleichen.
Vorzugsweise sollte eine biologisch akzeptable adhäsive Polymermatrix unter Polymeren mit einer Glasübergangstemperatur unterhalb der Raumtemperatur ausgewählt sein. Der Polymer kann einen Grad der Kristallinität bei Raumtemperatur besitzen, muss es aber nicht. Quervernetzende monomere Einheiten oder Stellen können in solche Polymere inkorporiert werden. Zum Beispiel können quervernetzende Monomere in Polyacrylatpolymere inkorporiert werden, die Stellen zur Quervernetzung der Matrix nach Dispersion des therapeutischen Mittels in dem Polymer bereitstellen. Zu den bekannten quervernetzenden Monomeren für Polyacrylatpolymere gehören Polymethacrylester von Polyolen wie z. B. Butylendiacrylat und -dimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat und dergleichen. Zu anderen Monomeren, die solche Stellen bereitstellen, gehören Allylacrylat, Allylmethacrylat, Diallylmaleat und dergleichen.
Vorzugsweise ist in der adhäsiven Polymermatrix ein Weichmacher und/oder Befeuchtungsmittel dispergiert. Wasserlösliche Polyole sind für diesen Zweck grundsätzlich geeignet. Die Einbeziehung eines Befeuchtungsmittels in die Formulierung erlaubt es der Darreichungsform, auf der Oberfläche der Haut Feuchtigkeit aufzunehmen, was wiederum hilft, die Hautreizung zu verringern, und die adhäsive Polymerschicht des Abgabesystems davon abhält, sich abzulösen.
Die von einem transdermalen Abgabesystem freigesetzten therapeutischen Mittel müssen imstande sein, jede Hautschicht zu durchdringen. Zur Steigerung der Durchdringungsgeschwindigkeit eines therapeutischen Mittels muss ein transdermales Pharmakonabgabesystem insbesondere imstande sein, die Permeabilität der äußersten Hautschicht, des Stratum corneum, das der Durchdringung von Molekülen den größten Widerstand entgegensetzt, zu erhöhen. Die Herstellung von Pflastern zur transdermalen Abgabe therapeutischer Mittel ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Für die inhalative Verabreichung an den oberen (Nasenbereich) oder unteren Atmungstrakt wird das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Peptid zweckmäßigerweise von einem Insufflator, Vernebler oder einer Druckpackung oder einem anderen zweckmäßigen Mittel zur Abgabe eines Aerosolsprays abgegeben. Druckpackungen können ein geeignetes Treibgas wie z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas enthalten. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann festgelegt werden, dass die Dosisform ein Ventil zur Abgabe einer bemessenen Menge bereitstellt.
Alternativ kann die Zusammensetzung zur inhalativen oder insufflativen Verabreichung die Form eines trockenen Pulvers annehmen, z. B. eines Pulvergemischs des therapeutischen Mittels und einer geeigneten Pulvergrundlage wie z. B. Laktose oder Stärke. Die pulvrige Zusammensetzung kann in Einzeldosisform dargeboten werden, z. B. in Kapseln oder Kartuschen oder z. B. Gelatine oder Blisterpackungen, aus denen das Pulver mittels eines Inhalators, Insufflators oder Inhalationsgerät für abgemessene Dosierungen verabreicht werden kann.
Für die intranasale Verabreichung kann das Nukleinsäuremolekül oder Peptid durch Nasentropfen, oder ein Flüssigspray wie z. B. durch einen Plastikflaschenzerstäuber oder einen Inhalator für abgemessene Dosierungen verabreicht werden. Typische Zerstäuber sind das Mistometer (Wintrop) und der Medihaler (Riker).
Die lokale Abgabe des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder Peptids kann auch durch eine Vielzahl von Techniken erfolgen, die das Mittel am Ort der Erkrankung oder in seiner Nähe verabreichen. Die Beispiele ortsspezifischer oder gezielter lokaler Abgabetechniken sollen nicht beschränkend sein, sondern die verfügbaren Techniken illustrieren. Zu den Beispielen gehören Katheter für die lokale Abgabe, wie z. B. ein Infusionskatheter oder ein implantierbarer Katheter, z. B. ein Nadelinfusionskatheter, Shunts und Stents oder andere implantierbare Vorrichtungen, ortsspezifische Träger, direkte Injektionen oder direkte Applikationen.
Für die topische Verabreichung kann das Nukleinsäuremolekül oder Peptid wie aus dem Stand der Technik bekannt zur direkten Applikation auf eine Zielfläche formuliert werden. Zu den konventionellen Formen zu diesem Zweck gehören Wundbandagen, beschichtete Bandagen oder andere Polymerabdeckungen, Salben, Cremes, Lotionen, Pasten, Gelees, Sprays und Aerosols, ebenso Zahnpastas und Mundspülungen, oder andere geeignete Formen, z. B. ein beschichtetes Kondom. Salben und Cremes können z. B. mit einer wässrigen oder öligen Grundlage unter Zusatz geeigneter Eindickungs- und/oder Gelierungsmittel formuliert werden. Lotionen können mit einer wässrigen oder öligen Grundlage formuliert werden und enthalten im allgemeinen auch einen oder mehrere Emulgatoren, Stabilisatoren, Dispersionsmittel, Suspensionsmittel, Eindickungsmittel oder Farbstoffe. Die aktiven Inhaltsstoffe können auch durch Ionophorese abgegeben werden, z. B. wie in US-Patent Nrn. 4,140,122; 4,383,529 oder 4,051,842 offenbart. Der prozentuale Gewichtsanteil des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder Peptids, das in einer topischen Formulierung vorliegt, hängt von verschiedenen Faktoren ab, aber beträgt im allgemeinen von 0,01% bis 95% des Gesamtgewichts der Formulierung und typischerweise 0,1 bis 25 Gew.-%.
Gewünschtenfalls können die oben beschriebenen Formulierungen angepasst werden, um Retardfreisetzung des verwendeten aktiven Inhaltsstoffes zu bewirken, z. B. durch Kombination mit bestimmten hydrophilen Polymermatrizes, z. B. solchen, die natürliche Gele, synthetische Polymergele oder Gemische davon enthalten.
Tropfen, wie z. B. Augentropfen oder Nasentropfen, können mit einer wässrigen oder nichtswässrigen Grundlage formuliert werden, die auch ein oder mehrere Dispersionsmittel, Lösungsvermittler oder Suspensionsmittel umfasst. Flüssige Sprays werden zweckmäßigerweise aus Druckpackungen abgegeben. Tropfen können über eine einfache Flasche mit Kappe zur Augeneinträufelung abgegeben werden oder über eine Plastikflasche, die dafür vorgesehen ist, durch einen speziell geformten Verschluss flüssige Inhaltsstoffe tropfenweise abzugeben.
Das Nukleinsäuremolekül oder Peptid kann zur topischen Verabreichung im Mund oder in der Kehle formuliert werden. Zum Beispiel können die aktiven Inhaltsstoffe als Lutschpastille formuliert werden, die weiterhin eine aromatisierte Grundlage umfasst, üblicherweise Saccharose und Akaziengummi oder Tragacanth; als Pastillen, die die Zusammensetzung in einer inerten Grundlage wie z. B. Gelatine und Glyzerin oder Saccharose und Akaziengummi enthalten; als Mundspülungen, die die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten; und als Pasten und Gele, z. B. Zahnpastas oder Gele, die die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten.
Die hier beschriebenen Formulierungen und Zusammensetzungen können auch andere Inhaltsstoffe wie z. B. antimikrobielle Mittel oder Konservierungsstoffe enthalten. Weiterhin können die aktiven Inhaltsstoffe auch in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben.
Beispiel 1
Materialien und Verfahren
VNP wurde in der Mayo Protein Core Facility unter Verwendung von Fluorenylmethoxy-Carbonyl (FMOC)-Chemie auf einem ABI 431A-Peptidsynthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) mit dem vom Hersteller bereitgestellten Protokollen und Reagenzien synthetisiert. Das Peptid wurde durch Reversphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Vydac C8-Säule (The Separations Group, Hesperia, Calif.) gereinigt. Die Synthese wurde durch Aminosäurenanalyse und Plasmaabsorptionsmassenspektrometrie bestätigt.
Die Proben aus dem Plasma und Urin wurden unter Verwendung von Reversphasen-HPLC mit einer Vydac C18-Säule (4,6 mm × 250 mm) (The Separations Group, Hesperia, Calif.) analysiert. Die Komponenten des HPLC-Systems waren zwei Beckman 114-Pumpen (Beckman Instruments, San Ramon, Calif.), ein ABI 759A Absorptionsdetektor (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.) und ein IBM PS2 50Z-Computer mit Beckman System Gold Chromatographie-Software. Der Puffer A war 0,1% Trifluoressigsäure, und der Puffer B war 80% Acetonitril/20% Wasser/0,1% Trifluoressigsäure. Die Trennung erfolgte mit einem Gradienten von 5% bis 70% Puffer B innerhalb von 60 Minuten.
Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung. Bei den Organkammerstudien bezeichnet n die Anzahl der Hunde, von denen Ringe entnommen wurden. Ringe mit und ohne Endothel wurden parallel untersucht, und Students t-Test für ungepaarte Beobachtungen wurde verwendet, um statistische Signifikanz unter den Reaktionen von Ringen mit und ohne Endothelium und zwischen den Reaktionen von Arterien und Venen zu bestimmen. Bei den Rattenuntersuchungen wurden die Daten unter Verwendung von ANOVA für wiederholte Messungen, gefolgt von Fishers Mindestsignifikanzdifferenztest, analysiert, wenn es in der Gruppe passend war. Die Daten zwischen den Gruppen wurden durch Student's ungepaarten t-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde bei p < 0,05 bestimmt.
Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Welfare Act durchgeführt. Wistar-Ratten und spontan hypertensive Ratten (SHR) (400 g; Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, In.) wurden mit Inactin anästhesiert (100 mg/kg; intraperitoneal, BYK Gulden, Konstanz, Deutschland). Die Körpertemperatur wurde durch ein Wärmekissen zwischen 36°C und 38°C gehalten. Es wurde ein Luftröhrenschnitt durchgeführt; jedoch wurden die Tiere nicht künstlich beatmet. Polyethylenkatheter (PE-50, Becton Dickinson Co., Parsippay, N. J.) wurden in der rechten Jugularvene zur Infusion von Salzwasser und Pharmaka platziert, in der rechten Jugularvene zum rechten Atrium, um den Druck im rechten Atrium zu messen, und in der Carotisarterie zur Entnahme von Blutproben und zur Überwachung des mittleren Arteriendrucks. Ein PE-90-Katheter wurde zur Urinsammlung in der Blase platziert.
Die Experimente wurden in drei Gruppen an normalen Ratten durchgeführt: ANP-Gruppe (n = 4), CNP-Gruppe (n = 4) und VNP-Gruppe (n = 4). VNP wurde auch bei SHR- Ratten untersucht (n = 4). Intravenöse Infusionen von Salzlösung (0,9% NaCl) wurden durch den Katheter in der linken Jugularvene durchgeführt (1 ml/100 g Körpergewicht/Stunde). Nach dem Abschluß des chirurgischen Eingriffs ließ man die Ratten sich 30 Minuten lang stabilisieren. In jeder Gruppe folgte eine 15-minütige Grundlinienphase. Nach der Grundlinienphase wurde Salzlösung (0,9% NaCl) bolusweise verabreicht (0,1 ml) wurde von einer 15-minütigen Phase gefolgt. Nach der Salzphase wurde das Peptid (ANP, CNP oder VNP) bolusweise (0,1 ml) und mit 5 μg/kg verabreicht, gefolgt von einer 15-minütigen Phase. Dieser folgte ein zweiter Bolus (0,1 ml) von 50 μg/kg und eine 15-minütige Phase. Nach 30-minütiger Auswaschung folgte eine 15-minütige Erholungsphase. Während jeder experimentellen Phase wurden mittlerer Arteriendruck (mean arterial pressure, MAP), Herzfrequenz (heart rate, HR) und Druck im rechten Atrium (RAP) gemessen. In der Mitte der Grundlinie, des zweiten Bolus (50 μg/kg) und der Erholungsphasen wurden Blutproben zur Plasma-cGMP-Bestimmung entnommen. Am Ende jeder Phase wurde der Urin auf sein Volumen gemessen (UV) und Proben wurden für die Analyse von Elektrolyten und cGMP gelagert.
Das Blut für die Plasma-cGMP-Analyse wurde in EDTA-Röhrchen entnommen, sofort auf Eis gestellt und bei 2500 rpm und 4°C zentrifugiert. Das Plasma wurde abgetrennt und bis zur Messung bei –20°C gelagert. Der Urin für die cGMP-Bestimmung wurde vor der Lagerung auf > 90°C erhitzt. Plasma und Urin-cGMP wurden durch ein spezifisches RIA bestimmt, wie zuvor beschrieben von A. L. Steiner et al., J. Hypertension, 5 (Suppl. 5), 551-553 (1987).
Tabelle 2 fasst die Herz-/Kreislauf- und Nieren-Wirkungen von ANP, CNP und VNP-Verabreichung bei normalen Ratten zusammen.
Wie von den Daten in Tabelle 2 gezeigt, hatte eine Bolusadministration (0,1 ml) von Salzlösung keine Herz-Kreislauf- oder Nieren-Wirkungen. Die Bolusadministration (0,1 ml) einer hohen Dosis (50 μg/kg) an ANP, CNP und VNP führte zu einem erheblichen Absinken des MAP und des RAP und zur Erhöhung von Urinfluss, Natriumexkretion, Plasma-cGMP und Urin cGMP-Volumen. Die Zunahme des Urinflusses, der Natriumexkretion und des Urin cGMP-Volumens waren bei VNP signifikant höher als bei CNP, aber waren geringer als bei ANP.
Tabelle 3 zeigt die Herz-Kreislauf- und Nieren-Wirkungen von VNP bei normalen und SHR-Ratten.
Wie von den Daten in Tabelle 3 gezeigt, war der basale MAP von SHRn signifikant höher als bei normalen Ratten, und das basale Urinvolumen war bei SHRn deutlich geringer als bei normalen Ratten. Während der hochdosierten Bolusinfusion von VNP sanken MAP und RAP in signifikantem Maße ab, und Urinfluss, Natriumexkretion, Plasma-cGMP und Urin-CGMP-Volumen stiegen in signifikantem Maße sowohl bei den Normalratten als auch bei der SHR-Gruppe. Während die MAP-Absenkung durch VNP in beiden Gruppen ähnlich war, waren die Nierenwirkungen und Urin-cGMP-Wirkungen von VNP bei SHRn im Vergleich zu normalen Ratten abgemildert. VNP ist ein stärkeres, Endothel-unabhängiges vasorelaxatives Peptid sowohl in Arterien als auch in Venen im Vergleich zu ANP und CNP. VNP hat auch in vivo einen starken natriuretischen Effekt.
Beispiel 2
Patienten und Verfahren
Das Studienprotokoll entsprach den Richtlinien des Mayo Institutional Review Board. Informierte Zustimmung wurde von jedem Patienten und seiner oder ihrer Familie erhalten.
Studienpatienten für zirkulierendes DNP
Zirkulierendes DNP wurde bei 19 normalen gesunden menschlichen Freiwilligen und 19 Patienten mit Herzversagen gemessen. Alle Patienten mit Herzversagen durchliefen eine vollständige physische Untersuchung und Laboruntersuchung und wurden nach der physischen Untersuchung anhand ihrer Herzsymptome als Klasse III oder IV nach den Kriterien der New York Heart Association (NYHA)-Funktionsklasse kategorisiert. Zu den Ursachen der Ventrikeldysfunktion bei diesen Patienten mit Herzversagen gehörten ideopathische dilatierte Kardiomyopathie und ischämische Kardiomyopathie. Alle Patienten mit Herzversagen erhielten standardmäßige Herz-Kreislauf-Behandlung.
Messung der Plasma-DNP-Konzentration
Die Blutproben für den DNP-Assay wurden in gekühlten Röhrchen aufgefangen, die Ethylendiaminotetraessigsäure enthielten, und sofort auf Eis gestellt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 2500 rpm und 4°C wurde das Plasma abgegossen und bis zur Analyse bei –20°C gelagert. Plasma (1 ml) wurde auf C-8 Bond Elute Kartuschen extrahiert, die mit Methanol und destilliertem Wasser gewaschen wurden. Das DNP wurde mit 95% Methanol, das 1% Trifluoressigsäure enthielt, eluiert. Die konzentrierten Eluate wurden dann mit einem spezifischen und sensitiven Radioimmunoassay für DNP (Phoenix Pharmaceuticals, Mountain View, California) gemessen. Die Proben und Standards wurden 24 Stunden lang mit Anti-DNP-Kaninchenantikörpern bei 4°C inkubiert. ¹²⁵I-markiertes DNP (100 μl) wurde zugesetzt, und die Inkubation wurde weitere 24 Stunden lang bei 4°C fortgesetzt. Die freien und gebundenen Fraktionen wurden dann durch Zugabe eines Zweitantikörpers und normalem Kaninchenseriums getrennt und zentrifugiert. Die Radioaktivität der gebundenen Fraktion wurde mit einem Gammazähler gemessen. Das minimale detektierbare Niveau für diesen Assay ist 0,5 pg pro Röhrchen, und die 50%-Inhibitions-Konzentration der Standardkurve war 29,0 pg. Die Rückgewinnung war 83,0 ± 1,8% die Variation von Versuch zu Versuch war 10,0 ± 3,2%. Keine Kreuzreaktivität des Antikörpers gegen DNP mit ANP, BNP, CNP oder Endothelin wurde beobachtet.
Studienpatienten für DNP-Immunohistochemie
Menschliches Herzgewebe für immunhistochemische Untersuchungen wurde aus dem atrialen Myokard von vier Patienten mit terminalem CHF erhalten, die an der Mayo Klinik, Rochester, Herztransplantationen durchliefen. Zu den CHF-Ursachen gehörten idiopathische dilatierte Kardiomyopathie und ischämische Kardiomyopathie. Aus den atrialen Anhängen und den freien Wänden wurden die Gewebeschnitte erhalten. Normales atriales Gewebe wurde von drei Spenderherzen zum Zeitpunkt der Herztransplantation erhalten.
Immunhistochemische Färbung
Immunhistochemische Studien wurden durch das indirekte Immunoperoxidaseverfahren, wie zuvor von Wei et al. (1993) beschrieben, durchgeführt. Die Gewebe wurden sofort mit 10% gepuffertem Formalin fixiiert und in Paraffin eingebettet; 6 μm dicke Schnitte wurden angefertigt und auf silanisierte Glasträger aufgetragen. Die Schnitte wurden bei 60°C inkubiert und mit abgestuften Konzentrationen von Xylol und Ethanol entparaffinisiert. Um die Aktivität endogener Peroxidase zu blockieren, inkubierten wir die Schnitte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,6% Wasserstoffperoxid in Methanol. Nach dem Waschen wurden die Schnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 5% Ziegenserum (Dako Corp., Carpinteria, California) inkubiert, um die unspezifische Hintergrundfärbung zu verringern, und sie wurden dann 24 Stunden lang bei Raumtemperatur mit polyklonalem Kaninchen-Anti-DNP-Antiserum (Phoenix Pharmaceuticals) bei einer Verdünnung von 1 : 500 (in normalem Ziegenserium) in feuchten Kammern inkubiert.
Alle Schnitte wurden 30 Minuten lang mit einem Zweitantikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugat (BioSource, Camarillo, California) inkubiert. Die Reaktion wurde sichtbar gemacht, indem man die Schnitte mit einem frisch zubereiteten Reagens inkubierte, das 3'-Amino-9'-ethylcarbazol (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) in Dimethylformamid und Natriumacetat enthielt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Deckgläschen abgedeckt und unter Verwendung eines Olympus-Mikroskops begutachtet. Sechs unabhängige Beobachter ohne Kenntnis der jeweiligen Gruppen, von denen diese Gewebe stammten, begutachteten diese Schnitte. Die Gegenwart von DNP-LI wurde anhand der folgenden Färbungsskala quantifiziert: 0 = kein DNP-LI; 1 = minimale Dichte; 2 = geringe Dichte; 3 = mäßige Dichte und 4 = maximale Dichte. Die Kontrollschnitte wurden mit 1% nicht-immunem Ziegenserum gefärbt.
Statistische Analyse
Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwertes aufgetragen sofern nicht anders bezeichnet. Die statistischen Vergleiche zwischen den Gruppen erfolgten unter Verwendung von Students ungepaarten t-Test unter Verwendung der Graph Pad Prism-Software. P-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse
DNP-LI im Plasma von normalen Personen und von Patienten mit CHF
In einer Studie an 19 normalen Freiwilligen wurde DNP-LI in normalem menschlichen Plasma gefunden (Mittelwert 6,3 ± 1,0 pg/mL; Median 4,7; Standardabweichung 2.3). Weiterhin wurde beobachtet, dass die Plasma-DNP-LI bei 19 Menschen mit CHF im Vergleich zu den normalen Kontrollpatienten erhöht war (37,3 ± 15,0 pg/ml; Median 17,0; Standardabweichung, 58,9; P < 0,05) (2).
Immunhistochemische Studien des Myokards von normalen Personen und von Patienten mit CHF
Immunhistochemische Studien zeigten die Gegenwart von DNP-LI im atrialen Myokard des normalen und des versagenden menschlichen Herzens (3). DNP-LI wurde innerhalb des Zytoplasmas atrialer Myozyten beobachtet und war im peripheren Zytoplasma weit verteilt. DNP-LI war auch in der perinukleären Region lokalisiert. Die immunhistochemischen Werte für DNP-LI im atrialen Myokard unterschieden sich im normalen (N = 3) und versagenden (N = 4) menschlichen Herzen nicht signifikant (1,8 ± 0,5 gegenüber 2,2 ± 0,7).
Diskussion
Unter Verwendung eines empfindlichen Radioimmunoassays für die DNP, der einen polykIonalen Kaninchenantikörper gegen DNP verwendet, der keine Kreuzreaktität mit ANP, BNP oder CNP besitzt, wurde DNP-LI in normalem menschlichem Plasma detektiert. Die gemessenen Konzentrationen ähnelten den für die anderen natriuretischen Peptide beschriebenen (Mukoyama et al., 1991; Burnett et al., 1986; Wei et al., 1993). Überdies wurden unter Verwendung dieses Antikörpers gegen DNP die Gegenwart und Verteilung von DNP-LI im menschlichen atrialen Myokard bestimmt. Ähnlich wie bei ANP und BNP wurden für DNP-LI Gegenwart und weite Verbreitung im peripheren Zytoplasma von atrialen Myozyten und auch in der perinukleären Region (Wei et al, 1993) beobachtet. Zusammengenommen lässt die Gegenwart von DNP-LI in menschlichem Plasma und atrialem Myokard vermuten, dass DNP, wie ANP und BNP, vom menschlichen Herzen gebildet und sezerniert wird.
Ein weiterer wichtiger Befund war, dass Plasma-DNP-LI bei Menschen mit CHF, insbesondere bei Patienten in den NYHA-Klassen III oder IV, erhöht war. Diese Erhöhung der Plasmakonzentration von DNP-LI ist analog zu der bei ANP und BNP beobachteten, die bei chronischem CHF in Folge der Erhöhung von Herzfülldruck und atrialer Spannung (Bruneau et al., 1997; Edwards et al., 1988). aktiviert werden. Die erhöhte DNP-LI-Konzentration bei menschlichem CHF lässt zusammen mit den vasorelaxierenden Eigenschaften von DNP in der Rattenaorta und Hundeherzkranzgefässen und mit der Potenzierung von cGMP durch DNP in vitro, vermuten, dass die DNP-LI-Steigerung wie die von ANP und BNP ein Teil einer neurohumoralen Kompensationsreaktion des versagenden Herzens zur Aufrechterhaltung der Herz-Kreislauf-Homöostase sein kann (Schweitz et al., 1992; Wennberg et al., 1997). Weiterhin kann die Gegenwart von DNP-LI in Plasma wie die von ANP und BNP bei linksventrikulärer Dysfunktion ein diagnostisches Potential haben (Stevens et al., 1995; Yamamoto et al., 1997; McDonagh et al., 1998.
Die in diesen Untersuchungen beschriebenen atrialen Niveaus der immunohistochemischen DNP-LI-Färbung unterschieden sich bei CHF im Vergleich zu normalen Vorhöfen nicht. Dieser Befund läßt Ähnlichkeiten mit ANP vermuten, das im normalen und im versagendem menschlichen atrialen Myokard als Ergebnis gesteigerter Produktion und Sekretion durch das versagende Myokard, die bei CHF zu gesteigerten zirkulierende ANP führen (Bruneau et al., 1997), in ähnlichen Konzentrationen vorliegt. Die DNP-Produktion und -Sekretion durch das atriale Myokard bei menschlichem CHF kann für die gesteigerte Plasmakonzentration von DNP-LI in Abwesenheit jeglicher Veränderungen des DNP-LI in den Atrien, wie durch immunohistochemische Untersuchungen detektiert, verantwortlich sein. Alternativ kann der Anstieg eines zirkulierenden DNP-LI auch verringerte Leber- und Nieren-Clearance involvieren, die der Beeinträchtigung der Leber- und Nierenfunktionen bei Menschen mit CHF zuzuschreiben sein können. Weiterhin werden, obwohl die vorliegenden Untersuchungen, die einen polykIonalen Antikörper (ohne Kreuzreaktivität mit ANP, BNP, CNP oder Endothelin) gegen eine aus Schlangengift isolierte DNP-Aminosäurensequenz verwenden, die Existenz von DNP im Plasma und in Vorhöfen von Menschen nahelegen, weitere Untersuchungen benötigt, um menschliches DNP spezifischer zu charakterisieren und seine genaue artspezische Aminosäurensequenz zu synthetisieren.
Beispiel 3
Die bekannten natriuretischen Peptide ANP, BNP und CNP haben starke biologische Wirkungen, zu denen Natriurese, Diurese, Vasodilation und Antimitogenese gehören. Da die chimären Peptide BD-NP und CD-NP und der DNP-C-Terminus einige der Eigenschaften von ANP, BNP und CNP gemeinsam ebenso wie einige einzigartige Merkmale besitzen können, wurden die in vivo-Eigenschaften von BD-NP, CD-NP und dem DNP-C-Terminus gemessen.
Verfahren
Die Untersuchungen wurden an sieben Mischlingsrüden mit 20 bis 25 kg Körpergewicht durchgeführt. Die Hunde wurden mit Standard-Hundefutter mit normalem Natriumgehalt ernährt (Lab Canine Diet 5006; Purina Mills, St. Louis, MO) und hatten freien Zugang zu Leitungswasser. Alle Studien entsprachen den Richtlinien der American Physiological Society und wurden von Mayo Clinic Animal Care and Use Committee gebilligt.
Am Abend vor dem Experiment wurden 300 mg Lithiumcarbonat zur Messung der Nierentubulusfunktion oral verabreicht, und man ließ die Hunde über Nacht fasten. Am Tag des eigentlichen Experiments wurden alle Tiere mit intravenös verabreichtem Pentobarbital-Natrium (30 mg/kg) anästhesiert. Ergänzende nichthypotensive Pentobarbital-Natrium-Dosierungen wurden während des Experimentes nach Bedarf verabreicht. Nach Luftröhrenintubation wurden die Hunde mit 4 Liter/Minute an zusätzlichem Sauerstoff mechanisch beatmet (Harvard respirator; Harvard Apparatus, Millis, MA).
Auf der linken Seitenflanke wurden Einschnitte vorgenommen, und die linke Niere wurde durch einen retroperitonalen Zugang exponiert. Der Harnleiter wurde für eine zeitlich abgestimmte Urinentnahme mit Polyethylenkathetern (PE-200) kanalisiert, und eine geeichte, nichtkanalisierende elektromagnetische Strömungssonde wurde vorsichtig um die linke Nierenarterie gelegt und mit einem Durchflussmesser (Modell FM 5010, Caroline Medical Electronics, King, NC, USA) zur kontinuierlichen Überwachung der Nierendurchblutung (renal blond flow, RBF) verbunden. Schließlich wurde die rechte Femoralisvene mit zwei Polyethylenkathetern (PE-24), einem zur Infusion von Inulin und dem anderen zur Infusion eines erfindungsgemäßen Peptids, z. B. BD-NP, kanalisiert. Die rechte Femoralisarterie wurde mit einem Polyethylenkatheter (PE-240) zur direkten arteriellen Blutdruckmessung und zur Entnahme von Arterienblutproben kanalisiert.
Nach Abschluß der chirurgischen Vorbereitung wurde eine Einleitungsdosis Inulin (ICN Biomedicals, Cleveland, OH, USA) in isotoner Salzlösung gelöst, injiziert, gefolgt von einer konstanten Infusion von 1 ml/Minute zum Erreichen einer stationären Plasmainulinkonzentration zwischen 40 und 60 mg/dl. Man platzierte die Hunde in Rückenlage und ließ sie 60 Minuten lang ohne weitere Einflussnahme äquilibrieren. Die Körpertemperatur wurde durch eine externe Wärmequelle (Infrarotheizlampe) aufrechterhalten.
Nach einer Äquilibrierungsphase von 60 Minuten, wurde eine 30-minütige basale Clearance (Grundlinie) durchgeführt. Hierauf folgte eine 15-minütige Einleitungsphase, während derer eine intravenöse BD-NP-Infusion mit 10 ng/kg/Minute begonnen wurde, wonach die zweite 30-minütige Clearance-Phase durchgeführt wurde. Nach der zweiten Clearance-Phase wurde die intravenöse BD-NP-Infusion auf 50 ng/km/Minute geändert. Nach einer 15-minütigen Einleitungsphase mit dieser BD-NP-Dosierung, wurde eine 30-minütige Clearance durchgeführt. Nach dem Ende der dritten Clearance wurde die Infusion beendet, und eine 30-minütige Auswaschphase folgte mit einer 30-minütigen Erholungs-Clearance (Erholung).
Analytische Verfahren
Das Plasma für die Elektrolyt- und Inulinmessungen wurde aus in heparinisierten Röhrchen aufgefangenem Blut erhalten. Plasma- und Urinelektrolyte einschließlich von Lithium wurden mit einem Flammenemissionsspektrophotometer (IL943, Flame Photometer; Instrumentation Laboratory, Lexington, MA) gemessen. Plasma- und Urin-Inulin-Konzentrationen wurden durch das Anthron-Verfahren gemessen, und die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) wurde anhand der Inulin-Clearance gemessen. Die Lithium-Clearance-Technik wurde verwendet, um die proximale und distale fraktionale Natriumreabsorption zu bestimmten. Die proximale fraktionale Reabsorption wurde anhand der folgenden Formel berechnet: [1 – (Lithium-Clearance/GFR)] × 100. Die distale fraktionale Natriumreabsorption wurde anhand der folgenden Formel bestimmt: [(Lithium-Clearance – Natrium-Clearance)/Lithium-Clearance] × 100.
Plasma- und Urin-cGMP wurden durch Radioimmunassay unter Verwendung des Verfahrens von Steiner et al. (1972) gemessen. Der Urin für die cGMP-Messungen wurde vor der Lagerung bei –20°C auf 90°C erhitzt, um abbauende Enzymaktivität zu inhibieren.
Ergebnisse
In der ersten Studie wurden die Herz-Nieren-Wirkungen und die humoralen Wirkungen von parenteral verabreichten BD-NP, das die Kernstruktur von BNP und den DNP-C-Terminus hat, gemessen. Das therapeutische Potential von BD-NP auf Herz-Nieren- und endokrine Funktionen wurde an 7 normalen betäubten Hunden bestimmt. Intravenöse BD-NP wurde nach den Grundlinienmessungen mit 10 bis 50 ng/kg/Minute infundiert.
Die BD-NP-Verabreichung führte zu einer Absenkung von MAP (von 133 ± 5 auf 123 ± 4 und 106 ± 3* mmHg; *p < 0,05 gegenüber Grundlinie)), RAP (von 3,0 ± 0,4 auf 1,8 ± 0,3* und 1,2 ± 0,3* mmHg), PAP (von 16,6 ± 0,7 auf 15,1 ± 0,5* und 12,4 ± 0,3* mmHg) und Pulmonarkapillardruck (PCWP) (von 5,3 ± 0,4 auf 3,6 ± 0,4* und 2,0 ± 0,4* mmHg). Die glomuläre Filtrationsrate (GFR) stieg (von 30 ± 2 auf 45 ± 4* und 45 ± 4* ml/Minute) ohne Veränderung der Nierendurchblutung (RBF). Somit hat die BD-NP eine signifikante diuretische (UV: von 0,24 ± 0,1 auf 1,12 ± 0,3 und 2,17 ± 0,5* ml/Minute) und natriuretische Wirkung (UNaV: von 12,7 ± 8 auf 105,1 ± 44* und 181,7 ± 52* mEq/Minute) mit einer Verringerung der proximalen fraktionalen Natrium-Reabsorption an Natrium (PFRNa) (von 84,9 ± 4,3 auf 66,5 ± 3,8* und 59,0 ± 4,1*%). Plasma-cGMP (von 11 ± 1,5 auf 26 ± 2,5* und 45 ± 4,9* pmol/ml) und Urin-cGMP-Exkretion (von 1414 ± 164 auf 3044 ± 269 und 10840 ± 1872* pmol/Minute) stiegen während der Verabreichung von BD-NP erheblich. Beide BD-NP-Dosierungen senkten die Plasma-Renin-Aktivität in signifikantem Maß (von 8,9 ± 1 auf 3,9 ± 0,6* und 5,1 ± 1,1* ng/ml/Stunde).
Somit verringert BD-NP wirksam die Herzfülldrücke, erhöht die Diurese und die Natriurese und besitzt reninsupprimierende Wirkungen. Diese Befunde unterstützen eine mögliche Rolle für dieses chimäre Peptid bei der Behandlung von CHF.
Das zweite Peptid, CD-NP, das die Kernstruktur mit CNP und den C-Terminus mit DNP gemeinsam hat, wurde in einer anderen Hundegruppe, aber unter den gleichen experimentellen Bedingungen getestet. Verabreichung der gleichen Dosierung (10 und 50 ng/kg/Minute) von CD-NP führte zu einer Senkung von MAP (von 135 auf 133 und 125 mmHg), RAP (von 3,0 auf 2,8 und 2,0 mmHg), PAP (von 13,5 auf 13,0 und 12,5 mmHg) und PCWP (von 8,0 auf 6,0 und 5,0 mmHg) mit einem GFR-Anstieg (von 38 auf 47 und 49 ml/Minute). Mit diesen Veränderungen ging eine Verringerung des systemischen Gefäßwiderstandes während der Verabreichung von niedrigdosiertem DNP (SVR: von 39 auf 33 mmHg/l/Minute) einher. CD-NP hatte eine diuretische (UV: von 0,14 auf 0,27 und 1,01 ml/Minute) und natriuretische Wirkung (UNaV: von 3,4 auf 14,2 und 63,8 μEq/Minute) mit einer PFRNa-Senkung (von 87 auf 73 und 61%). Plasma-cGMP (11 bis 15 und 35 pmol/ml) und Urin-cGMP-Exkretion (1931 bis 2844 und 7551 pmol/Minute) stiegen während der Verabreichung von DC-NP erheblich. Somit verringert die Verabreichung von CD-NP wirksam die Herzfülldrücke und steigert die Diurese und die Natriurese. Diese Wirkungen gehen mit der Aktivierung des cGMP-Systems einher.
Ein drittes Peptid, nämlich der DNP-C-Terminus, wurde an einer anderen Gruppe normaler betäubter Hunde in vivo getestet. Die Verabreichung des DNP-C-Terminus (gleiche Dosis) führte zu Diurese (UV: von 0,55 auf 0,70 und 1,83 ml/Minute) und Natriurese (UNaV: von 64 auf 75 und 123 μEq/Minute) mit einer PFRNa-Senkung (67 bis 58 und 56%). Es gab eine GFR-Steigerung während der Verabreichung der höheren Dosierung (von 36 auf 36 und 41 ml/Minute). Diese Wirkungen des DNP-C-Terminus gingen mit einer Steigerung des Plasma-cGMP (von 7 auf 11 und 12 pmol/ml) und der Urin-cGMP-Exkretion (von 1538 auf 1842 und 1786 pmol/Minute), aber keinen Veränderungen der Herz-Kreislauf-Hämodynamik einher. Jedoch senkten beide Dosierungen des DNP-C-Terminus die Plasmareninaktivität (4,0 bis 1,8 und 1,9 ng/ml/Stunde). Somit hat der DNP-C-Terminus, wenn er Hundeartigen verabreicht wird, natriuretische, diuretische und reninsupprimierende Wirkungen.
Beispiel 4
Verfahren
Zur Bestimmung der Herz-Nieren-Eigenschaften und endokrinen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide bei CHF wird ein Tiermodell für mildes und manifestes CHF verwendet. Die Studien werden an drei Gruppen von Mischlingsrüden durchgeführt. Die erste Gruppe besteht aus normalen Hunden (normal; n = 5), die zweite Gruppe besteht aus Hunden mit mildem Herzversagen, induziert durch schnelle Ventrikelsteuerung mit 180 Schlägen pro Minute über 10 Tage (mildes CHF; n = 7), und die dritte Gruppe besteht aus Hunden mit manifestem Herzversagen, ausgelöst durch schnelle Ventrikelsteuerung mit 245 Schlägen pro Minute über 10 Tage (manifestes CHF, n = 7). Die Hunde werden mit einer Diät mit festgelegten Natriumgehalt (Hill's Prescription Diet, Canine i/d) mit freiem Zugang zu Leitungswasser ernährt. Alle Studien entsprechen den Richtlinien der American Physiological Society und wurden von Mayo Clinic Animal Care and Use Committee gebilligt.
Schrittmacher-Implantation
Die Hunde aus der zweiten und dritten Gruppe wurden zuerst unter Verwendung von Pentobarbital-Natrium (30 mg/kg, i.v.) zwei Wochen vor dem Protokoll betäubt. Nach Luftröhrenintubation wurden die Hunde unter Verwendung eines Harvard-Respirators (Harvard Apparatus, Millis, MA) mit 4 L/Minute an zusätzlichem Sauerstoff mechanisch bearbeitet. Durch eine linksseitige Thorakotomie mit einer Perikardiotomie von 1-2 cm wird eine epikardiale Elektrode (Medtronic, Minneapolis, MN) auf den rechten Ventrikel eingepflanzt. Die Schrittmacherelektrode wird mit einem Impulsgenerator (Medtronic, Minneapolis, MN, Modell 8329) verbunden, der dann subkutan in die Wand des Brustkorbs implantiert wird. Die Wirksamkeit der Steuerung wird intraoperativ vor dem Schließen der Brusthöhle überprüft. Das Perikard wird vernäht, wobei mit großer Sorgfalt darauf geachtet wird, nicht die Anatomie des Perikard zu verzerren. Die Brusthöhle, tiefe und oberflächliche Einschnitte werden dann schichtenweise geschlossen. Die Hunde erhalten prä- und postoperative prophylaktische Antibiotikumsbehandlungen mit 225 mg subkutanem Clindamyin und 400.000 Einheiten Procain-Penicillin G plus 500 mg Dihydrostreptomycin intramuskulär (Combiotic, Pfizer, Inc., New York, NY). Die prophylaktische antibiotische Behandlung wird über die beiden ersten postoperativen Tage hinweg fortgesetzt.
Nach einer 14-tägigen postoperativen Erholungsphase wird mildes CHF durch schnelle ventrikuläre Steuerung bei 180 Schlägen pro Minute über 10 Tage hinweg hervorgerufen. Manifestes CHF wird durch schnelle ventrikuläre Steuerung bei 245 Schlägen pro Minute über 10 Tage hinweg hervorgerufen.
Akutes Protokoll
Am Abend vor dem eigentlichen Experiment ließ man die Hunde über Nacht fasten und verabreichte ihnen 300 mg Lithiumcarbonat zur Messung der Nierentubulusfunktion oral und erlaubte ihnen freien Zugang zu Wasser. Am Tag des eigentlichen Experiments (11. Tag der Ventrikelsteuerung bei den Herzversagensgruppen) wurden alle Tiere mit intravenös verabreichten Pentobarbital-Natrium (15 mg/kg) anästhesiert. Ergänzende nichthypotensive Pentobarbitalnatrium-Dosierungen wurden während des Experimentes nach Bedarf verabreicht. Nach Luftröhrenintubation wurden die Hunde mechanisch beatmet (Harvard respirator; Harvard Apparatus, Millis, MA) mit 4 Liter/Minute an zusätzlichem Sauerstoff. Ein flußorientierter Thermoverdünnungskatheter (Ohmede, Criticath, Madison, WI) wurde für Messungen der Herz-Hämodynamik durch die äußere Jugularvene in die Lungenarterie eingeschoben. Auf der linken Seitenflanke wurden Einschnitte vorgenommen, und die linke Niere wurde durch einen retroperitonalen Zugang exponiert.
Der Harnleiter wurde für ein zeitlich abgestimmte Urinentnahme mit Polyethylenkathetern (PE-200) kanalisiert, und eine geeichte, nichtkanalisierende elektromagnetische Strömungssonde wurde vorsichtig um die linke Nierenarterie gelegt und mit einem Durchflussmesser (Modell FM 5010, Caroline Medical Electronics, King, NC, USA) zur kontinuierlilchen Überwachung des Nierenblutstroms (renal blood flow (RBF) verbunden. Schließlich wurde die rechte Femoralisvene mit zwei Polyethylenkathetern (PE-240), dem einen zur Infusion von Inulin und dem anderen zur Infusion eines erfindungsgemäßen Peptids (NP) kanalisiert. Die rechte Femoralisarterie wurde mit einem Polyethylenkatheter (PE-240) zur direkten arteriellen Blutdruckmessung und zur Entnahme von Arterienblutproben kanalisiert. Nach Abschluß der chirurgischen Vorbereitung wurde eine Einleitungsdosis Inulin (ICN Biomedicals, Cleveland, OH, USA) in isotoner Salzlösung gelöst, injiziert, gefolgt von einer konstanten Infusion von 1 ml/Minute zum Erreichen einer stationären Plasmainulinkonzentration zwischen 40 und 60 mg/dl. Man platzierte die Hunde in Rückenlage und ließ sie 60 Minuten lang ohne weitere Einflussnahme äquilibrieren. Die Körpertemperatur wurde durch eine externe Wärmequelle aufrechterhalten.
Nach einer Äquilibrierungsphase von 60 Minuten wurde eine 30-minütige basale Clearance (Grundlinie) durchgeführt. Hierauf folgte eine 15-minütige Einleitungsphase, während der eine intravenöse NP-Infusion mit 10 ng/kg/Minute begonnen wurde, wonach die zweite 30-minütige Clearance-Phase durchgeführt wurde. Nach der zweiten Clearance-Phase wurde die intravenöse NP-Infusion auf 50 ng/km/Minute geändert. Nach einer 15-minütigen Einleitungsphase mit dieser NP-Dosierung, wurde eine 30-minütige Clearance durchgeführt. Nach dem Ende der dritten Clearance wurde die Infusion beendet, und eine 90-minütige Auswaschphase folgte mit einer 30-minütigen Erholungs-Clearance (Erholung).
Analytische Verfahren
Zu den während des akuten Experimentes gemessenen Herz-Kreislauf- Parametern gehören mittlerer Arteriendruck (mean arterial pressure, MAP), rechter atrialer Druck (RAP), Pulmonararteriendruck (PAP), Herzausstoß (cardiac output, CO) und Pulmonarkapillarendruck (PCWP). Der CO wird in Triplikaten durch Thermodilution bestimmt, und es wird der Mittelwert berechnet (kardiac Output Computer, Modell 9510-A, American Edwards Laboratories, Irvine, CA). Der MAP wird durch direkte Messung aus den Femoralisarterienkatheter bestimmt. Der systemische Gefäßwiderstand (systemic vascular resistance, SVR) wird berechnet als [SVR = (MAP – RAP)/CO]. Der Lungengefäßwiderstand (pulmonary vascular resistance (PVR) wird als [PVR = (PAP – PCWP)/CO] berechnet.
Das Plasma für die Elektrolyt- und Inulinmessungen wurde aus in heparinisierten Röhrchen aufgefangenem Blut erhalten. Plasma- und Urinelektrolyte einschließlich von Lithium wurden mit einem Flammenemissionsspektrophotometer (IL943, Flame Photometer; Instrumentation Laboratory, Lexington, MA) gemessen. Plasma- und Urin-Inulin-Konzentrationen wurden durch das Anthron-Verfahren gemessen, und die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) wurde anhand der Inulin-Clearance gemessen. Die Lithium-Clearance-Technik wurde verwendet, um die distale fraktionale Natriumreabsorption abzuschätzen. Der proximale Reabsorptionsanteil wurde anhand der folgenden Formel berechnet: (1 – (Lithium-Clearance/GFR)] × 100. Der distale Anteil der Natriumreabsorption wurde anhand der folgenden Formel bestimmt: [(Lithium-Clearance – Natrium-Clearance)/Lithium-Clearance] × 100. Der Nierengefäßwiderstand (renal vascular resistance, RVR) wurde als [RVR = (MAP – RAP)/RBF] berechnet. Plasma- und Urin-cGMP wurden durch Radioimmunassay unter Verwendung des Verfahrens von Steiner et al. (1972) gemessen. Der Urin für die cGMP-Messungen wurde vor der Lagerung bei –20°C auf 90°C erhitzt, um abbauende Enzymaktivität zu inhibieren.
Plasma- und Urin-NP wurden vor, während und nach der NP-Verabreichung unter Verwendung eines Radioimmunassays bestimmt (Lisy et al. 1999a, und Schirger et al. 1999).
Ergebnisse für Verabreichung von synthetischem DNP Grundliniencharakteristika
Die Grundliniencharakteristika sind für alle drei Gruppen in Tabelle 4 dargestellt. Bei mildem CHF waren MAP und CO verringert, RAP und PCWP erhöht. GFR und UNaV waren verringert, während das Plasma-ANP erhöht war. Bei manifestem CHF waren alle diese Parameter auf ähnliche Weise mit einer weiteren Zunahme von RAP, PAP und PCWP und markierter Absenkung von UNaV verändert. Wie in 10 dargestellt, waren vor der Infusion von exogenem DNP die Grundlinienspiegel von DNP-LI bei mildem und manifestem CHF höher als die DNP-Plasmaspiegel bei Normaltieren. Tabelle 4

MAP bedeutet mittleren Arteriendruck; CO, Herzausstoss; SVR, systemischen Gefäßwiderstand; RAP, rechten atrialen Druck; PAP, Lungenarteriendruck; PCWP, Pulmonarkapillarendruck; GFR, glomeruläre Filtrationsrate; UnaV, Urin-Natrium-Exkretion; ANP, atriales natriuretisches Peptid; PRA, Plasmareninaktivität.
*P < 0,05 gegenüber Normalgruppe; *τP < 0,05 gegenüber mildem CHF.

Herz-Kreislauf-Hämodynamik während der Verabreichung von DNP
Die Herz-Kreislauf-Hämodynamik vor und während der Verabreichung von DNP ist in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5

PvR, Pulmonargefäßwiderstand. *p < 0,05 gegenüber Grundlinie.

Die Verabreichung von DNP führte zur Verringerung des MAP während der Verabreichung der höheren DNP-Dosis bei der Normalgruppe und der Gruppe mit manifestem CHF, mit einer Neigung zur Verringerung des MAP bei mildem CHF. Während bei manifestem CHF die blutdrucksenkende Wirkung von DNP nachhaltig war, kehrte bei der Normalgruppe und bei mildem CHF der MAP nach der DNP-Verabreichung zur Grundlinie zurück. In der Normalgruppe sank der CO während der DNP-Infusion, während er bei milden und manifestem CHF erhalten blieb. RAP, PCWP und PAP sanken in allen Gruppen, insbesondere in beiden CHF-Gruppen, die bereits deutlich erhöhte Grundlinien zeigten. In beiden CHF-Gruppen gab es einen Trend zur Senkung von SVR und PVR während der DNP-Verabreichung.
Die maximalen Veränderungen der CO-, SVR-, RAP- und PCWP-Werte während der DNP-Verabreichung sind in 11 dargestellt. Feld A zeigt einen signifikanten Aufwärtstrend des CO in beiden CHF-Gruppen im Vergleich zur Normalgruppe. Feld B zeigt einen signifikanten Abwärtstrend bei SVR auch sowohl beim milden als auch beim manifesten CHF. Die Senkung der Herzfülldrücke in allen drei Gruppen in Reaktion auf DNP ist in den Feldern C und D dargestellt.
Nierenhämodynamik und Exkretionsfunktion während der DNP-Verabreichung
Tabelle 6 stellt die Nierenhämodynamik und die Exkretionsfunktion während der DNP-Verabreichung dar. Tabelle 6

RBF, Nierendurchblutung; RVR, Nierengefäßwiderstand; UV, Urinfluss; PFRNa, proximale fraktionale Natriumreabsorption; DFRNa, distale fraktionale Natriumreabsorption. *p < 0,05 gegenüber Grundlinie.

Die DNP-Verabreichung erhöhte die GFR bei mildem und manifestem CHF, eine Wirkung, die bei der Normalgruppe nicht beobachtet wurde, in Abwesenheit von RBF-Veränderungen. DNP erhöhte die UNaV bei der Normalgruppe und in den Gruppen mit milden und manifestem CHF während der hohen Dosierung von DNP. Obwohl die natriuretische Wirkung von DNP bei manifestem CHF abgemildert war, trat die Steigerung der Natriumexkretion bei manifestem CHF trotz signifikanter MAP-Verringerung ein. Hochdosiertes DNP führte auch zu einer signifikanten diuretischen Reaktion bei allen Gruppen. Bei mildem und bei manifestem CHF senkte DNP den PFRNa-Wert, während der DFRNa-Wert nur bei der normalen Gruppe sank.
Humoralfunktionen während der DNP-Verabreichung
Tabelle 7 beschreibt die Hormonreaktion auf die DNP-Verabreichung. Tabelle 7

UDNPV, Urin-DNP-Exkretion; cGMP, zyklisches Guanosinmonophosphat; UcGMPV, Urin-cGMP-Exkretion; ANP, atriales natriuretisches Peptid. *p < 0,05 gegenüber Grundlinie.

Plasma- und Urin-DNP stiegen während der Verabreichung von DNP bei allen Gruppen. DNP erhöhte in allen Gruppen das Plasma cGMP in signifikantem Maße, während die Steigerung der Urin-cGMP-Exkretion nur bei der Verabreichung der hohen DNP-Dosis signifikant war. Plasma-ANP oder -BNP stiegen in keiner der drei Gruppen während der DNP-Verabreichung an. Die niedrige DNP-Dosierung führte bei der Normalgruppe und bei manifestem CHF zu einer signifikanten PRA-Senkung.
Weiterhin wurde für alle drei Gruppen das Verhältnis von Plasma cGMP/Plasma DNP bei hoher Dosis von DNP berechnet (12). Das Verhältnis war bei den CHF-Gruppen im Vergleich zur Normalgruppe höher, was eine gesteigerte cGMP-Bildung durch DNP bei CHF unterstützt.
Diskussion
Die vorliegende Studie zeigt, dass eine exogene Verabreichung von DNP vorteilhafte Herz-Kreislauf-, Nieren- und humorale Wirkungen bei experimentellem mildem und manifestem CHF hat. Insbesondere senkte DNP bei mildem und manifestem CHF in deutlichem Maß die gesteigerten Herzfülldrücke und bewahrte den Herzausstoß. Zum zweiten steigerte DNP die glomuläre Filtrationsrate bei CHF in Abwesenheit von Veränderungen der Nierendurchblutung. Überdies war DNP natriuretisch, obwohl diese Wirkung bei manifestem CHF abgemildert war. Die Natriurese ging auch mit einer Verringerung der Natriumreabsorption im proximalen Tubulus trotz Verringerung des Nierenperfussionsdrucks einher. Die Nierenwirkungen gingen weiterhin mit Verringerung der Plasmareninaktivität bei niedrigerer Dosierung bei manifestem CHF einher. Schließlich gingen die DNP-Wirkungen mit einer verstärkten Fähigkeit bei CHF, Plasma-cGMP zu steigern, einher.
Eine wichtiger Fund war die Fähigkeit von DNP, deutlich erhöhte Herzfülldrücke zu verringern. Diese Wirkung war mit einem Trend zur Erhöhung des Herzausstosses und zur Verringerung des systemischen Gefäßwiderstandes, die in der Normalgruppe nicht gesehen wurden, verbunden. Eine solche akute hämodynamische Reaktion steht am besten mit einer Verringerung der Vorlast in Verbindung mit einer mäßigen Dilation der peripheren Arterie in Übereinstimmung. Die Verringerung der Herzfülldrücke geschah unabhängig und war daher wahrscheinlich eine Folge einer direkten Gefäßwirkung, die von der natriuretischen Nierenreaktion unabhängig war. Weiterhin wurden die beobachteten hämodynamischen Wirkungen, da das Plasma-ANP in Übereinstimmung mit verringerter Sekretion infolge von verringerter atrialer Dehnung abzusinken neigte, nicht durch eine indirekte ANP-Steigerung vermittelt.
Bei milden und manifesten CHF erhöhte die DNP-Verabreichung auf einmalige Weise die GFR, eine in der Normalgruppe nicht beobachtete Wirkung. In Abwesenheit einer Zunahme der Nierendurchblutung können die glomerulären DNP-Wirkungen durch Dilation der zuführenden Arteriolen und Konstriktion der abführenden Arteriolen und/oder eine direkte Steigerungswirkung auf den Filtrationskoeffizienten erklärt werden. Diese GFR-Zunahme ist signifikant, da sie während einer weitergehenden Verringerung des Nierenperfusionsdrucks eintrat. Das hochdosierte DNP war in allen Gruppen signifikant natriuretisch. Obwohl die natriuretische Wirkung des DNP bei manifestem CHF abgemildert war, erfolgte die Zunahme der Natriumexkretion trotz signifikanter Verringerung des mittleren Arteriendrucks. Überdies war die natriuretische Wirkung mit einer Verringerung der proximalen Reabsorption von Natrium verbunden, wie durch die Lithium-Clearance-Technik bestimmt. Diese Nierenreaktion, insbesondere im Hinblick auf die GFR, ist wichtig, da ein Merkmal des manifesten experimentellen CHF eine mangelnde Reaktivität der Niere auf exogen verabreichtes ANP ist (Cavero et al., 1990). Hochdosiertes DNP führte auch zu einer signifikanten diuretischen Reaktion bei allen Gruppen. Somit scheinen die DNP-Nierenwirkungen insofern einzigartig zu sein, als trotz weiterer Verringerung des Nierenperfusionsdrucks die GFR zunahm und die proximate Natriumreabsorption in Verbindung mit Natriurese und Diurese sank.
In normalem menschlichen Plasma hat DNP-LI einen Mittelwert von 6 pg/ml mit einer Bandbreite von 2 bis 11 pg/ml. Bei menschlichem CHF (NYHA III oder IV) hat das Plasma-DNP-LI einen Mittelwert von 37 pg/ml einer Bandbreite von 3 bis 200 pg/ml. Unter Verwendung einer spezifischen und sensitiven Radioimmunoassays hat normales Hundeplasma-DNP-LI einen Mittelwert von 6 pg/ml mit einer Bandbreite von 4 bis 7 pg/ml. Bei experimentellem CHF bei Hunden ist DNP-LI auf einen Mittelwert von 12 pg/ml mit einer Bandbreite von 9 bis 15 pg/ml erhöht. Die DNP-Plasmakonzentrationen bei CHF sind geringer als die für ANP und BNP beschriebenen, aber größer als die für CNP beschriebenen (Burnett et al., 1986; Wei et al., 1993).
Zwei verschiedene Dosierungen wurden für die DNP-Verabreichung ausgewählt, um einen breiten Bereich von Plasmakonzentrationen zur Definition potentieller therapeutischer Wirkungen von DNP bei CHF zu etablieren. Es ist wichtig, dass die niedrigere Dosierung von 10 ng/kg/Minute an DNP Kreislaufkonzentrationen von ungefähr 300 pg/ml bei den Normal- und CHF-Gruppen erreichte, die nahe der Obergrenze der bei menschlichem Herzversagen beobachteten liegen und daher als pathophysiologisch betrachtet werden können. Die höhere Dosierung, 50 ng/kg/Minute, etabliert eindeutig die pharmakologischen Wirkungen von DNP. Bei Verwendung dieser Dosis erreichten die Plasmakonzentrationen von DNP ungefähr 3.000 pg/ml bei der Normalgruppe, aber nur 1.000 pg/ml bei beiden CHF-Gruppen. Die verringerten DNP-Plasmaspiegel, die während der Infusion bei CHF erreicht wurden, können die Vermutung nahelegen, dass die Halbwertszeit des infudierten DNP verringert ist, was verringerte Clearance-Mechanismen reflektieren könnte. Trotz der während der Infusion bei CHF erreichten niedrigeren DNP-Spiegel bleibt die Reaktivität des Gewebes auch im DNP bewahrt und ist möglicherweise erhöht, wie die Steigerung des Verhältnisses von Plasma-cGMP zu Plasma-DNP vermuten läßt (12).
Von ANP wurde eine renininhibierende Wirkung im Normalzustand ebenso wie bei menschlichem CHF beschrieben, während beim Herzversagen die inhibitorischen Wirkungen abgemildrt sind (Richards et al., 1988; Nicholls, 1994). Auch DNP besitzt diese Wirkung, da die Fähigkeit niedrigdosierten DNPs, die PRA zu verringern, in der Normalgruppe und auch bei manifestem CHF beobachtet wurde. Im Gegensatz hierzu wird diese Wirkung während kurzfristiger Verabreichung von exogenem BNP bei normalen und CHF-Hunden nicht beobachtet, bei denen BNP die PRA nicht supprimiert (Clavell et al., 1993). Solche renininhibitorischen Wirkungen tragen trotz der Gegenwart bekannter Reninstimuli wie z. B. Verringerung des atrialen Druckes und des Nierenperfusionsdruckes ein.
Das therapeutische Potential der exogenen DNP-Administration wird weiter durch den Bericht einer klinischen Studie betreffend CHF unterstützt, bei der die Bewahrung der Nierenfunktion, insbesondere der Nierenfiltrationsrate, der wichtigste überlebensbestimmende Faktor bei Patienten mit schwerem CHF war (Girbes et al., 1998). Weiterhin war diese GFR-verbessernde Wirkung mit der Fähigkeit von DNP verbunden, deutlich erhöhte Herzfülldrücke in Verbindung mit Natriurese, Diurese und renininhibitorischen Eigenschaften zu senken. Diese Wirkungen waren weiterhin mit einer erhaltenden Fähigkeit von DNP verbunden, das cGMP-„second messenger"-System zu aktivieren.
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Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen. In der vorangegangenen Spezifikation wurde diese Erfindung mit Blick auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben, und viele Details wurden zu illustrativen Zwecken dargestellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und gereinigtes biologisch aktives Peptidfragment des natriuretischen Peptids von Dendroaspis (DNP), umfassend SEQ ID NO: 3, wobei das Peptid mindestens eine Aktivität ausgewählt unter Vasodilation, Natriurese, Diurese und reninsupprimierender Aktivität besitzt.
Peptid nach Anspruch 1, weiterhin mindestens einen Abschnitt eines natriuretischen Peptids, das nicht das natriuretische Peptid von Dendroaspis ist, umfassend.
Peptid nach Anspruch 2, wobei das natriuretische Peptid, welches nicht das natriuretische Peptid von Dendroaspis ist, das natriuretische Peptid des Gehirns (BNP) oder das natriuretische Peptid vorn C-Typ (CNP) ist.
Peptid nach Anspruch 2, umfassend SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO2.
Peptidverbindung der Formel (H)-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala-(R) (SEQ ID NO: 3); oder der Formel (H)-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala-(R) (SEQ ID NO: 1); oder der Formel (H)-Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala(R) (SEQ ID NO: 2); wobei R für OH, NH₂, NHR³ oder N(R³)(R⁴) steht, wobei R³ und R⁴ unabhängig voneinander für Phenyl oder (C₁-C₄)-Alkyl stehen; und wobei in SEQ ID NOs: 1 und 2 die beiden Cysteinreste durch eine Disulfid-Brücke verbunden sind; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Peptidverbindung nach Anspruch 5, zur Verwendung bei einer medizinischen Behandlung.
Als Natriuretikum, Diuretikum, Renin-Suppressor oder Vasodilator verwendbare Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 5 oder eine Kombination davon mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff.
Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder der Peptidverbindung nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Vorbeugung von Herzversagen bei einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament zur parenteralen Verabreichung ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament zur lokalen oder systemischen Verabreichung ist.
Verwendung eines biologisch aktiven Fragments des natriuretischen Peptids von Dendroaspis (DNP), wie in Anspruch 1 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herzversagen bei einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 11, wobei der Säuger ein Mensch, eine Ratte, eine Maus, ein Hundeartiger, ein Rinderartiger, ein Pferdeartiger, ein Schafartiger, ein Ziegenartiger oder ein Katzenartiger ist.
Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder der Peptidverbindung nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Vorbeugung von Nierenversagen bei einem Säuger.