-
Technisches Gebiet
-
Diese
Erfindung bezieht sich auf Verbesserungen in Verfahren und Vorrichtungen
zum Differenzieren bzw. Unterscheiden und Aufzählen bzw. Spezifizieren von
verschiedenen ausbildenden Subpopulationen oder Arten bzw. Typen
von Zellen in einer Gesamtblutprobe.
-
Stand der Technik
-
Beim
Diagnostizieren von unterschiedlichen Krankheiten und Krankheitszuständen ist
es üblich,
ein peripheres Blut eines Patienten zu analysieren, um die verschiedenen
Arten von ausbildenden Blutkörperchen und
Plättchen
zu differenzieren und aufzuzählen,
ebenso wie bestimmte Parameter oder Charakteristika bzw. Merkmale
davon zu bestimmen. Die entsprechenden Konzentrationen und relativen
Prozentsätze
der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen sind hoch hinweisend
für bestimmte
Krankheiten und das Ausmaß,
bis zu welchem sich derartige Krankheiten verbreitet haben. Allgemein
umfaßt
eine Probe von Gesamtblut verschiedene Arten von Zellen, sowohl
Blutzellen bzw. -körperchen
als auch Nicht-Blutzellen (beispielsweise Tumorzellen, Bakterien,
usw.), die in einem flüssigen
Medium oder Plasma suspendiert sind. Die Blutkörperchen sind drei grundsätzliche
Arten, nämlich
rote Blutkörperchen
(Erythrozyten), weiße
Blutkörperchen
(Leukozyten) und Plättchen.
In Abhängigkeit
von dem Grad einer Reife sind rote Blutkörperchen weiter häufig in
drei Teilmengen bzw. Subsätze
klassifiziert, nämlich
kernhaltige rote Blutkörperchen
(NRBC's), retikuläre rote
Zellen- bzw. Blutkörperchen
("Retics") und reife rote
Blutkörperchen
(RBC's). Reife weiße Zellen
bzw. Blutkörperchen
auf der anderen Seite fallen in eine von fünf unterschiedlichen Teilmengen,
nämlich
Monozyten, Lymphozyten, Eosinophile, Neutrophile und Basophile.
Jede der Teilmengen von weißen
Blutkörperchen
kann weiter in Unterklassen basierend auf ihrem entsprechenden Niveau
von Reife, Aktivierung und Abnormalität klassifiziert werden. Typischerweise übersteigt
die Anzahl von roten Blutkörperchen
die Anzahl der weißen
Blutkörperchen
um etwa 1000:1. Plättchen,
welche wenigstens aus dem Standpunkt von Interesse sind, daß sie die Fähigkeit
des Bluts zum Verklumpen steuern bzw. regeln, sind von drei allgemeinen
Arten bzw. Typen, reife Plättchen,
retikuläre
Plättchen
und große
Plättchen.
-
Zusätzlich zum
Bestimmen der entsprechenden bzw. jeweiligen Konzentrationen und
relativen Prozentsätze
von jeder der obigen Zellarten und Teilmengen wird eine sorgfältige Analyse
einer Blutprobe auch Information betreffend verschiedene Blutparameter
und Zellcharakteristika geben, beinhaltend beispielsweise die Hämoglobin
(Hgb) Konzentration, den Hämatokritwert
(Hct), mittleres Zellvolumen (MCV), die Gesamtanzahl von roten und
weißen
Blutkörperchen
und Plättchen
pro Einheitsvolumen, die Verteilungsweite bzw. -breite der roten
Blutkörperchen
(RDW) und Plättchen
(PDW) usw.
-
Die
Detektion und Zählung
bzw. Aufzählung
der meisten der obigen Zellarten ebenso wie eine Bestimmung der
obigen Zellparameter können
unter Verwendung von irgendeinem von einigen kommerziell verfügbaren Hämatologieinstrumenten
durchgeführt
werden. Derartige Instrumente beinhalten GEN•STM,
STKSTM und MAXMTM Hämatologieinstrumente
von Beckman Coulter; Cell Dyne 3000/4000 Hämatologieinstrumente von Abbott
Laboratories; und Sysmex Serie von Hämatologieinstrumenten von Toa.
In bzw. bei einem automatischen Erfassen von Daten betreffend jede
Zellart verwenden alle der oben erwähnten Hämatologieinstrumente wenigstens
zwei gesonderte, eine Zelle analysierende Transducer. Einer (oder
mehrere) dieser Transducer bzw. Meßgrößenumformer arbeitet bzw. arbeiten,
um Daten zu erhalten, die beim Differenzieren und Aufzählen der
fünf unterschiedlichen
Arten von weißen
Blutkörperchen
verwendbar bzw. nützlich
sind, und ein weiterer Meßgrößenumformer
ist einem Zählen
und Dimensionieren von roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und
Plättchen
in einem präzisen
Volumen der Probe zugewiesen. Die entsprechenden Ausgaben der mehrfachen
Transducer werden durch eine zentrale Verarbeitungseinheit verarbeitet,
um einen integrierten Zellanalysenbericht zur Verfügung zu
stellen. In den Instrumenten von Beckman Coulter bildet eine (ein)
elektro-optische Strömungs-
bzw. Flußzelle
(Transducer) Signale, die für
Eigenschaften des entsprechenden bzw. jeweiligen Volumens (V), der
elektrischen Leitfähigkeit
(C) und Lichtstreuung (S) von jedem weißen Blutkörperchen, das durchtritt, hinweisend
sind, um ein "fünfteiliges
Differential" der
fünf weißen Blutkörperchen
zur Verfügung zu
stellen. Zusätzliche
Meßwertumformer
arbeiten auf dem gut bekannten Coulter-Prinzip, wobei einer dazu dient,
um rote Blutkörperchen
und Plättchen
in einer hoch verdünnten
Probe zu zählen,
und andere dazu dienen, um weiße
Blutkörperchen
in einer lysierten Probe zu zählen.
Information von den drei Meßwertwandlern bzw.
-umformern werden bearbeitet und in einigen Fällen korreliert (beispielsweise
durch Vervielfältigen
des relativen Prozentsatzes von jeder Teilmenge von weißen Blut körperchen,
wie sie von der elektro-optischen Flußzelle erhalten ist, mit der
absoluten Anzahl von weißen
Blutkörperchen,
die durch den Coulter-Transducer gezählt ist), um Information betreffend
jede Zellart oder jede Teilmenge zu erhalten, beispielsweise die
Konzentration (Anzahl pro Einheitsvolumen) von jeder Teilmenge der
weißen
Blutkörperchen
in der Gesamtblutprobe, die analysiert ist. In den Abbott-Instrumenten
wird die fünfteilige
Differentiationsinformation durch eine optische Flußzelle zur
Verfügung
gestellt, welche nur Lichtstreuungs- und Lichtpolarisationsinformation
detektiert. Auch hier dient ein Paar von zusätzlichen Meßwertwandlern, die auf dem
Coulter-Prinzip arbeiten, dazu, um weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen
und Plättchen
zu dimensionieren und zu zählen.
Die entsprechenden Ausgaben der zwei Meßwertwandler werden miteinander
korreliert, um Information betreffend unterschiedliche Zellarten
und Teilmengen bzw. Subsätze
zu berichten. In den Toa-Instrumenten wird die fünfteilige differentielle Information
durch ein Paar von elektrischen Flußzellen (Coulter-Meßwertwandlern)
zur Verfügung gestellt,
welche lediglich das DC- bzw. Gleichstromvolumen und die RF Leitfähigkeit
der Zelle messen. Unterschiedliche Lysierreagenzien werden verwendet,
um unterschiedlich bzw. differentiell zwei oder mehrere Aliquote
der Blutprobe vor einem Durchtritt durch die zwei Meßwertwandler
zu bearbeiten. Ein dritter Coulter-Meßwertwandler arbeitet, um rote
Blutkörperchen
und Plättchen
zu detektieren und zu zählen.
Wie in den Instrumenten von Beckman Coulter und Abbott werden die
entsprechenden Ausgaben der zahlreichen Meßwertwandler korreliert, um
die fünfteilige
differentielle bzw. Differentialinformation zur Verfügung zu
stellen.
-
Wie
oben angedeutet, können
konventionelle Hämatologieinstrumente,
während
sie fähig
sind, die größte Vielzahlen
von Zellarten und Teilmengen in einer peripheren Blutprobe zu differenzieren
und aufzuzählen,
nicht zuverlässig
bzw. leicht alle Teilmengen von Zellen differenzieren, insbesondere
jene, welche abnormal oder nicht reif sind. Eine "erstreckte differentielle" Messung, durch welche
abnormale und nicht reife Zellen detektiert und gezählt werden
können,
kann händisch
durchgeführt
werden, indem zuerst ein Blutabstrich einer Probe von Interesse
auf einem Glas-Mikroskopträger ausgebildet
wird, der Abstrich mit einer Farbe gefärbt wird, um den Zellen zu
ermöglichen,
sichtbar gemacht zu werden, wodurch abnormale und nicht reife Zellen von
Interesse sichtbar von anderen Zellen differenziert werden können, und
dann der resultierende gefärbte Blutabstrich
unter einem Mikroskop überprüft bzw.
untersucht wird. Alternativ können
einige Blutarten einer erstreckten bzw. ausgeweiteten differentiellen
bzw. Differentialmessung unter Verwendung eines konventionellen
Flußzytometers
detektiert werden. In einem derartigen Instrument wird eine Blutprobe,
welche zuvor beispielsweise durch entweder (1) Mischen der Probe
mit Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern oder dgl., welche dazu
dienen, um selektiv bestimmte Zellen von Interesse zu "markieren", oder (2) Mischen der
Probe mit einer fluoreszierenden Farbe hergestellt wurde, die adaptiert
ist, um selektiv Zellen von Interesse zu markieren, durch eine optische
Flußzelle
geleitet. Da jede Zelle in der Probe durch die Flußzelle durchtritt, wird
sie mit einem Strahl von Photonen bestrahlt, die adaptiert sind,
um das fluoreszierende Material zu erregen, das mit den Zellen von
Interesse assoziiert ist. Fluoreszierende Strahlung, die durch jede
der markierten Zellen emittiert wird, gemeinsam mit Strahlung, die
durch jede der Zellen gestreut wird, wird detektiert und verwendet,
um die Zellen von Interesse von anderen Zellen in der Probe zu differenzieren.
Kommerzielle unabhängige
bzw. freistehende Flußzytometer
werden durch Beckman Coulter, Toa Medical Electronics, Cytomation,
Bio-Rad und Becton
Dickinson hergestellt. Es ist in dem Stand der Technik bekannt,
Flußzytometer
und Hämatologieinstrumente
in ein einziges automatisiertes Laboratoriumsystem zu integrieren,
in welchem Blutproben automatisch entlang eines Weges vorbei an
diesen unterschiedlichen Instrumenten vorgerückt bzw. weitergeführt werden.
Wenn probenhaltige Phiolen jedes Instrument passieren, wird eine
Blutprobe von jeder Phiole angesaugt bzw. aufgenommen und durch
das Instrument analysiert. Instrumentensysteme, die gesonderte Hämatologie-
und Flußzytometrieinstrumente
kombinieren, sind kommerziell von Beckham Coulter und Toa Medical
Electronics erhältlich,
wobei auf die HST Serie von Toa bezug genommen wird.
-
In
U.S. Patent Nr. 5,631,165 und 5,565,499 wird ein Versuch gemacht,
vollständig
die entsprechenden Funktionen von Hämatologie- und Flußzytometrieinstrumenten
in ein einziges Instrument zu integrieren. Ein derartiges Instrument
umfaßt
eine Mehrzahl von Meßwertwandeln,
beinhaltend eine optische Strömungs-
bzw. Flußzelle,
die adaptiert ist, um Fluoreszenz- und Mehrwinkel-Lichtstreuungsmessungen
durchzuführen,
einen eine elektrische Impedanz messenden Meßwertwandler bzw. Transducer
(ein Coulter-Transducer), und ein Kolorimeter zum Messen des gesamten
Hämoglobingehalts
einer Blutprobe. Die entsprechenden Ausgaben von diesen Meßwertwandlern
werden verarbeitet und korreliert, um einen Bericht betreffend rote,
weiße
und fluoreszierende Körperchen
bzw. Zellen zu geben.
-
Wie
oben nahegelegt bzw. vorgeschlagen, kann das Erfordernis zum Korrelieren
der entsprechenden Ausgaben von mehreren Meßwertwandlern, um bestimmte
Charakteristika einer Zellart oder einer Teilmenge zu berichten,
unter bestimmten Umständen
dahingehend problematisch sein, daß es eine Ungenauigkeit in den
analytischen Ergebnissen einbringt. Die Gültigkeit des erforderlichen
Korrelationsschritts setzt voraus, daß die durch einen Meßwertwandler
bearbeitete Probe identisch im Inhalt zu jener ist, die durch den
(die) anderen Meßwertwandler
behandelt wird. Dies kann bzw. muß nicht immer der Fall sein.
Idealerweise sollten alle Messungen, die an einer Zelle ausgeführt werden,
gleichzeitig durch denselben Meßwertwandler
durchgeführt
werden. In einem derartigen Fall würde kein Erfordernis zum Korrelieren
von Daten von unabhängigen
oder gesonderten Meßwertwandlern
bestehen. Weiterhin ermöglicht
die simultane Messung von mehreren Parametern an einer einzigen
Zelle unter Verwendung eines einzelnen bzw. einzigen Meßwertwandlers
eine mehrdimensionale Zellanalyse, welche nicht möglich wäre unter
Verwendung von gesonderten Meßwertwandlern bzw.
Transducern, oder selbst unter Verwendung eines einzigen Meßwertwandlers,
wenn die Parametermessungen räumlich
in der Zeit getrennt sind.
-
Der
Wunsch eines Verwendens eines einzigen elektro-optischen Transducers, um gleichzeitig
das Volumen (V), die Leitfähigkeit
(C), die Lichtstreuung (S) und die Fluoreszenz (F) einer einzigen
Zelle zu messen, wurde in dem Stand der Technik nahegelegt bzw.
vorgeschlagen. Wie oben festgehalten, bietet ein derartiger Transducer
den Vorteil, daß alle
Messungen gleichzeitig an derselben Zelle ausgeführt werden, statt daß einige
Messungen an einer Zelle mit einem Transducer durchgeführt werden,
andere Messungen an einer anderen Zelle derselben Art unter Verwendung
eines anderen Transducers durchgeführt werden, und dann versucht
wird, die Ergebnisse von den zwei Meßwertwandlern zu korrelieren,
um bestimmte Schlußfolgerungen über die
Zellprobe zu ziehen. In einer Offenbarung durch Thomas et al., Journal
of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 25, Nr. 7, S. 827-835
(1977) ist ein automatisiertes Mehrparameter-Analysiergerät für Zellen (AMAC)
vorgeschlagen. Ein derartiges Analysiergerät umfaßt einen einzigen Meßwertwandler,
der adaptiert ist, um gleichzeitig vier unterschiedliche Zellcharakteristika
zu messen, nämlich
die oben festgehaltenen V, C, S und F Charakteristika. In dem Artikel
von Thomas et al. werden zwei unterschiedliche elektro-optische
Flußzellen
geoffenbart, wobei eine Flußzelle
(die AMAC III) einen Flußdurchtritt
von quadratischem bzw. transversalem Querschnitt hat, der 100 Mikrometer
an jeder Seite mißt,
und die andere Flußzelle
(AMAC IV) einen kreisförmigen
transversalen Querschnitt hat. Während
die AMAC IV Flußzelle
bestimmte Vorteile im Hinblick auf eine Herstellbarkeit bietet,
wurde die AMAC III Flußzelle
aufgrund ihrer ebenen bzw. flachen Flächengeometrie und ihrer inhärenten Fähigkeit
bevorzugt, optische Aberrationen zu reduzieren, wodurch es besser möglich wird,
daß der
Strahl einer Erregerstrahlung auf den Zellpfad fokussiert wird,
und besser ermöglicht wird,
daß die
Zellfluoreszenz mit einem Photodetektor gekoppelt wird. Obwohl sie
für ein
Durchführen
von simultanen Messungen von V, C, S und F vorgeschlagen sind, gibt
es keinen Nachweis, daß entweder
die AMAC III oder IV Flußzelle
jemals für
eine Durchführung
derartiger Messungen verwendet wurde. Beispielsweise wird in dem
Artikel von Thomas et al. festgehalten, daß eine RF Messung (welche beim
Bestimmen des "Opazitäts"-Parameters verwendet
wird), die an Kugeln durchgeführt
wird, die durch die AMAC III Flußzelle hindurchtreten, unpräzise Ergebnisse
ergab. Diese Ergebnisse waren einem Signal-zu-Rausch-Problem zuschreibbar, das
mit dem relativ großen
Querschnittsbereich 100 × 100
Mikrometer) der Flußzelle
assoziiert war. Weiterhin ist es ersichtlich, daß Lichtstrahlenmessungen niemals
unter Verwendung der AMAC Flußzellen
durchgeführt wurden.
Somit hat, obwohl andere einen einzelnen VCSF Transducer zum Durchführen von
simultanen Messungen an jeder Zelle vorgeschlagen haben, keiner
entweder ein derartiges Konzept auf die Praxis reduziert oder eine
technisch machbare Offenbarung für
eine derartige Durchführung
zur Verfügung
gestellt.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Im
Hinblick auf die vorhergehende Diskussion ist es ein erstes Ziel
dieser Erfindung, ein automatisiertes Instrument zur Verfügung zu
stellen, durch welches alle der zuvor erwähnten Zellcharakteristika,
d.h. DC-Volumens-, RF-Leitfähigkeits-(Opazitäts-), Lichtstreuungs-
und Fluoreszenzcharakteristika gleichzeitig bestimmt werden können, wodurch
jegliches Erfordernis zum Korrelieren von Daten, die von gesonderten
Meßwandlern
gewonnen werden, vermieden ist.
-
Ein
weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, eine verbesserte Flußzellenvorrichtung
zur Verfügung
zu stellen, um Blutkörperchenarten
in einer Gesamt- bzw. Vollblutprobe aufzuzählen bzw. zu spezifizieren.
-
In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Differenzieren
bzw. Unterscheiden und Aufzählen
bzw. Spezifizieren der entsprechenden Konzentra tionen von verschiedenen
Arten von Zellen in einer Vollblutprobe in Anspruch 1 definiert.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausbildung sind die oben erwähnten Abgabemittel effektiv
bzw. wirksam, um ein zweites Aliquot der angesaugten Vollblutprobe
abzugeben, und die Vorrichtung umfaßt weiterhin die folgenden
zusätzlichen
Elemente:
- (m) Mittel zum Unterwerfen des zweiten
Aliquoten von Vollblut an ein Verdünnungsmittel, um eine verdünnte Probe,
enthaltend vorherrschend rote Blutkörperchen und Plättchen zur
Verfügung
zu stellen;
- (n) Mittel zum Unterwerfen der verdünnten Probe an ein fluoreszierendes
Material, wodurch wenigstens eine gewählte Teilmenge von roten Blutkörperchen
oder Plättchen
mit einem derartigen fluoreszierenden Material markiert wird; und
- (o) Mittel zum Abgeben bzw. Dispergieren eines abgemessenen
Volumens der verdünnten
Probe und Veranlassen, daß das
abgemessene Volumen der verdünnten
Probe durch die Zellabfragezone der Flußzelle so hindurchfließt, daß Blutkörperchen
in einem derartigen abgemessenen Volumen durch die Zellabfragezone
der Flußzelle
hintereinander durchfließen.
In dieser Ausführungsform
arbeiten die Analysiermittel darüber
hinaus, um die entsprechenden Konzentrationen von unterschiedlichen
Teilmengen von roten Blutkörperchen
und Plättchen
basierend auf ihren entsprechenden DC- bzw. Gleichstromvolumens-(V),
RF-Leitfähigkeits-(C),
Lichtstreuungs-(S) und Fluoreszenz-(F) Eigenschaften zu differenzieren
und zu bestimmen.
-
Vorzugsweise
werden die fünf
unterschiedlichen Teilmengen von reifen weißen Blutkörperchen durch Analysieren
der Kombination ihrer entsprechenden DC- bzw. Gleichstromvolumens-(V), RF-Leitfähigkeits-(C) und
Lichtstreuungs-(S) Eigen schaften differenziert. Andere Teilmengen
von weißen
Blutkörperchen,
abnormalen Körperchen
und nicht reifen Zellen bzw. Körperchen
(beispielsweise NRBC's,
Blasts bzw. Zellvorstufen, CD4/CD8 positive Lymphozyten, nicht reife
Granulozyten, atypische Lymphozyten und Stammzellen) werden basierend
auf ihren entsprechenden DC- bzw. Gleichstromvolumens-, RF-Leitfähigkeits-,
Fluoreszenzmarkierungs- und Lichtstreuungseigenschaften differenziert.
-
Alternativ
umfaßt
die Vorrichtung der Erfindung Mittel zum Differenzieren verschiedener
Teilmengen von roten Blutkörperchen
und Plättchen
durch ein simultanes Bestimmen der V, C, S und F Charakteristika
von individuellen Teilchen in derartigen Teilmengen.
-
Die
Erfindung und ihre zahlreichen Vorteile werden besser aus der nachfolgenden
detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausbildungen geschätzt bzw.
erkannt werden, wobei auf die beiliegenden Zeichnungen bezug genommen
wird.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 ist
ein Blockdiagramm eines Blutkörperchen-Analysierinstruments,
das die vorliegende Erfindung verkörpert;
-
2 ist
eine perspektivische Darstellung bzw. Illustration, die zahlreiche
der Komponenten des Instruments von 1 zeigt.
-
3 ist
eine vergrößerte perspektivische
Ansicht des optischen Elements, umfassend den Mehrparameter-Meßwertwandler
bzw. -Transducer, der in 2 gezeigt ist;
-
4A ist
eine schematische Illustration des Meßwertwandlers von 3,
die den hydrodynamischen Fluß dadurch
zeigt;
-
4B ist
eine perspektivische Ansicht eines Abschnitts der Probendüse, die
in 4A gezeigt ist;
-
5 und 6 sind
jeweils eine perspektivische bzw. Querschnittsansicht einer bevorzugten
Strömungs-
bzw. Flußzelle,
die in dem Instrument gemäß 1 verwendet
wird;
-
7 ist
eine Draufsicht auf gesonderte Elemente des Lichtstreuungsdetektors,
der ein Teil des Instruments von 1 ausbildet;
-
8 ist
eine schematische Darstellung der Elemente, umfassend die Datenanalysierkomponente des
Instruments gemäß 1;
und
-
9A-23 sind
Streuungsdiagramme, die Daten illustrieren, die durch das Instrument
gemäß 1 erfaßt bzw.
erhalten sind.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Indem
nun auf die Zeichnungen bezug genommen wird, illustriert 1 schematisch
eine automatisierte Zellanalysiervorrichtung CA, die die vorliegende
Erfindung darstellt bzw. verkörpert.
Eine derartige Analysiervorrichtung ist adaptiert, um eine Vollblutprobe
WBS aus einem Behälter
oder einer Phiole 10 anzusaugen, ihren zellulären Aufbau
zu analysieren, wie dies durch eine Steuer- bzw. Regeleinrichtung
bzw. einen Controller 11 instruiert ist, und ihre Erkenntnisse
zu berichten. Eine oder mehrere Phiole(n) 10, die durch
einen Probentransporter ST, beispielsweise einen Einzelrohrhalter,
einen Probenträger
bzw. ein Probentablett oder einen Gestellhalter getragen ist bzw.
sind, wird bzw. werden durch einen Förderer (nicht gezeigt) vorgetrieben bzw.
vorbewegt, um die Blutprobe einem Ansaugetestkopf P zu präsentieren.
Der Letztere ist selektiv betätigbar
bzw. betreibbar, um ein vorbestimmtes Volumen der Blutprobe aus
der Phiole 10 in ein konventionelles Blutsammel- bzw. -probenventil 12 oder
dgl. zu ziehen, wie dies beispielsweise in den ebenfalls übertragenen U.S.
Patenten Nr. 5,255,568; 4,702,889; 4,507,977; und 4,445,391 geoffenbart
ist. Derartige Ventile arbeiten auf eine bekannte Weise, um die
Probe in präzise
Aliquote, Mikroliter im Volumen für eine Analyse zu unterteilen
bzw. zu aliquotieren. Eine Mehrzahl von derartigen Aliquoten A1, A2, A3 wird
zu einer Probenvorbereitungsstation 14 abgegeben bzw. dispersiert
bzw. dispergiert, bei welcher jedes Aliquot gemischt wird oder anders
einem Reagenz unterworfen wird, das adaptiert ist, um gewählte Zellen
in der Probe zu behandeln. Gemäß einer
bevorzugten Ausbildung kann die Probenvorbereitungsstation beispielsweise
eine lysierte und gefärbte
Probe SL erzeugen bzw. ausbilden, umfassend
vorherrschend weiße
Blutkörperchen
und andere Zellen bzw. Körperchen
(beispielsweise NRBC's),
welche mit einer fluoreszierenden Farbe gefärbt worden sind; eine verdünnte und
gefärbte
Probe SD, enthaltend alle Blutkörperchenarten
in einer hoch verdünnten
Suspension, wobei einige der Zellen bzw. Körperchen (beispielsweise die
retikuläre
Teilmenge) mit einer fluoreszierenden Farbe gefärbt sind; und eine analysierte
und markierte Probe ST, umfassend vorherrschend
weiße
Blutkörperchen
in einer Suspension, beinhaltend gewählte weiße Blutkörperchen (beispielsweise CD4
und CD8 positive Zellen), welche (radioaktiv) markiert oder anders
markiert bzw. bezeichnet wurden, beispielsweise mittels eines monoklonalen
Antikörpers
mit einem Fluorochrom. Präzise
abgemessene Volumina von jeder der hergestellten Proben, wie sie
durch einen Meßmechanismus 16 zur
Verfügung
gestellt werden, werden dann sequentiell durch einen einzigen Mehrparameter-Meßwertwandler
bzw. -Transducer 18 durchgeleitet, welcher arbeitet, wie
dies im Detail unten beschrieben werden wird, um gleichzeitig vier
unterschiedliche Merkmale bzw. Charakteristika von jedem Körperchen
in jedem Aliquot zu messen, nämlich
das DC- bzw. Gleichstromvolumen (V) jeder Zelle, seine RF Leitfähigkeit
(C), seine Lichtstreuungseigenschaften (S) und seine Fluoreszenz (F),
wie dies durch die zuvor erwähnte
fluoreszierende Farbe zur Verfügung
gestellt wird oder durch die fluorochrome Markierung oder Etikettierung
bzw. Bezeichnung. Während
das DC- bzw. Gleichstromvolumen und die RF Leitfähigkeit jeweils einen einzigen
Meßparameter
liefern, wird die Lichtstreuungscharakteristik jeder Zelle bzw.
jedes Körperchens
innerhalb mehrerer unterschiedlicher diskreter Winkelbereiche gemessen,
die jeweils einen unterschiedlichen Meßparameter zur Verfügung stellen.
-
In
der bevorzugten Ausbildung wird eine Lichtstreuung innerhalb vier
unterschiedlicher Winkelbereiche gemessen, d.h. (a) zwischen etwa
10 Grad und etwa 70 Grad, welche als Lichtstreuungen unter mittlerem Winkel
oder MALS bezeichnet wird; (b) zwischen etwa 10 Grad und etwa 20
Grad, die als Lichtstreuung unteren mittleren Winkels oder LMALS
bezeichnet wird; (c) zwischen etwa 20 Grad und etwa 70 Grad, die
als Lichtstreuung oberen mittleren Winkels oder UMALS bezeichnet
wird; und (d) zwischen etwa 80 Grad und etwa 100 Grad, nominell
orthogonal bzw. senkrecht, welches als Seitenstreuung oder SS bezeichnet
wird. In ähnlicher Weise
wird die Fluoreszenz einer Zelle vorzugsweise innerhalb gesonderter
bzw. diskreter mehrerer Wellenlängenbereiche
F1, F2 und F3 gemessen, wobei derartige Bereiche durch die entsprechenden
Fluoreszenzemissionsspektren der Farbstoffe und Fluorochrome bestimmt
sind, die für
eine Markierung für
die Zellen von Interesse verwendet werden. Somit werden in der Ausbildung,
die unten beschrieben ist, neun unterschiedliche Messungen an jedem
Körperchen
bzw. jeder Zelle oder jedem Plättchen
gleichzeitig ausgeführt,
nämlich V
und C, plus vier Lichtstreuungs- und drei Fluoreszenzmessungen.
Offensichtlich kann die Anzahl von Lichtstreuungsmessungen auf so
viele wie gewünscht
erhöht
werden, und die Anzahl von Fluoreszenzmessungen kann (innerhalb
vernünftiger
Grenzen) erhöht
werden, indem die Anzahl von Photodetektoren erhöht wird, welche mit der Anzahl
von Fluoreszenzspektren übereinstimmen,
die durch die Farbe(n) und das (die) Fluorochrom(e) emittiert werden,
die verwendet werden, um die Zellen von Interesse zu markieren.
Eine Diskussion der V, C und S Parameter, ebenso wie verschiedener
anderer Parameter, auf die hier bezug genommen wird, beispielsweise
gedrehte Lichtstreuung (RLS) und Opazität (RF/DC oder C/V), kann in
dem gemeinsam bzw. allgemein übertragenen
U.S. Patent Nr. 5,125,737 gefunden werden, welches an C. Rodriguez
und W. Coulter erteilt wurde. Die entsprechenden Meßwertwandlerausgaben
V, C, S und F werden einer Analysierereinrichtung 20 zugeführt, welche
basierend auf programmierten Algorithmen arbeitet, um die unterschiedlichen
Zellarten und Teilmengen in der Probe zu differenzieren und zu unterscheiden,
ebenso wie um verschiedenes Blut- und Zellparameter zu bestimmen,
beispielsweise Hgb, Hct, MCV usw., und um einen Bericht R zur Verfügung zu
stellen. Da der Mehrparameter-Meßwertwandler 18 alle
vier Zellparameter gleichzeitig mißt, und da präzise abgemessene
Volumina der Probe durch den Meßwertwandler
durchgeführt
werden, besteht kein Erfordernis zum Korrelieren der entsprechenden
Ausgaben von mehreren Meßwertwandlern,
wie dies durch alle konventionellen Zellanalysesysteme erforderlich ist,
und die Genauigkeit der Analysiereinrichtung ist somit weiter erhöht. Auch
ist bzw. wird durch ein gleichzeitiges Messen von allen vier Parametern
auf bzw. an einer einzigen Zelle eine mehrdimensionale Analyse mit
vier Parametern von jeder Zelle bzw. jedem Körperchen möglich gemacht, wodurch eine
genauere (unzweifelhafte) Bestimmung einer Zellart möglich gemacht
wird.
-
Die
zentrale Komponente der Zellanalysiereinrichtung, die kurz oben
beschrieben ist, ist der einzige Mehrparameter-Meßwertwandler 18.
Wie dies besser in den vergrößerten Ansichten
von 2-7 gesehen werden wird, ist der
Meßwertwandler 18 eine
speziell konfigurierte zytometrische Flußzelle FC, die allgemein ein
optisches Element 30 umfaßt, das einen inneren Durchtritt 32 aufweist,
durch welchen Zellen pro Zeiteinheit (seriell bzw. der Reihe nach)
für eine
Analyse hindurchtreten können.
Das Zentrum des Durchtritts 32 ist an dem geometrischen
Zentrum des optischen Elements 30 angeordnet, welches sich
verschmälert,
um eine Zellabfragezone Z zu definieren, in welcher die V, C, S
und F Parameter von jeder durchtretenden Zelle gleichzeitig bestimmt
werden. Konusförmige
Kappen 34, 35 sind mit den gegenüberliegenden
Endwänden 36 des
optischen Elements gekoppelt und dienen als ein Mittel, durch welches
sowohl eine analysierende Blutprobe als auch eine Scheideflüssigkeit,
welche verwendet ist, um hydrodynamisch die Probe in der Zellabfragezone
zu fokussieren oder zu zentrieren, zu dem optischen Element eingebracht
werden kann und nach einem Durchtritt derselben zu dem Abfall drainagiert
werden kann. Die eingeschlossenen Kammern 34A, 35A, die
jeweils durch Kappen 34, 35 definiert sind, enthalten
beabstandete Elektroden 38, 40, welche mit DC/RF Schaltkreisen
bzw. Schaltungen 41 (unten beschrieben) verbindbar sind.
Die Komponenten einer derartigen Schaltung arbeiten, um (a) DC und
RF Ströme
durch die Zellabfragezone auszubilden, während die Zellen, jeweils eine
pro Zeiteinheit durchtreten, und (b) um Modulationen in den entsprechenden
DC und RF Strömen zu
detektieren, wie sie durch den Durchtritt von Zellen durch die Abfrage-
bzw. Interrogationszone gebildet werden. Es wird verstanden, daß der elektrische
Widerstand der Zellen sich von jenem des suspendierenden Fluids
in der Probe und der Scheideflüssigkeit
unterscheidet, wodurch die Strommodulationen erzeugt bzw. ausgebildet
werden. Wenn bzw. wie jede Zelle durch die Abfragezone durchtritt,
wird sie mit einem fokussierten Laserstrahl B bestrahlt, wie er
durch einen geeigneten Laser 42 kontinuierlicher Welle
zur Verfügung
gestellt wird, und Strahlung (Licht), das von jeder Zelle gestreut
wird, wird durch ein Paar von Lichtstreuungsdetektoren LSD1 und
LSD2 detektiert. Zur selben Zeit wird fluoreszierende Strahlung,
sofern sie vorhanden ist, die durch die fluoreszierende Farbe oder
die fluoreszierende Markierung der Zelle emittiert wird, als ein
Ergebnis, daß sie
durch die Laserstrahlung erregt wird, durch einen Fluoreszenzdetektor
FD detektiert, der unten beschrieben ist.
-
Indem
auf die vergrößerte Ansicht
von 3 Bezug genommen wird, hat das optische Element 30 eine
quadratische Prismenform, umfassend vier rechteckige bzw. rechtwinkelige
optisch flache Seiten 50 und die zuvor erwähnten einander
gegenüberliegenden
Endwände 36.
Vorzugsweise sind die entsprechenden Breiten W von jeder Seite 50 die
gleichen, wobei jede vorzugsweise etwa 4,2 mm mißt, und die entsprechende Länge L jeder
Seite 50 ist etwa 6,3 mm. Es ist insbesondere bevorzugt,
daß das
optische Element 30 aus geschmolzenem Siliziumdioxid oder
Quarz hergestellt ist. Der Strömungs-
bzw. Flußdurchtritt 32,
der durch den zentralen Bereich des optischen Elements 30 ausgebildet
ist, ist konzentrisch in bezug auf die Längsachse A konfiguriert, die
durch das Zentrum des Elements 30 durchtritt, und parallel
zu der Richtung eines Probenflusses. Der Flußdurchtritt 32 umfaßt die zuvor
erwähnte
Zellabfragezone Z und ein Paar von einander gegenüberliegenden
verjüngten
Bohrungslöchern 54,
die Öffnungen
in der Nachbarschaft ihrer entsprechenden Basen aufweisen, welche
mit der Zellabfragezone in Fluidverbindung stehen. Der transversale
Querschnitt der Zellabfragezone ist quadratisch in der Form, wobei
die Breite W' jeder
Seite nominell 50 Mikrometer ± 10
Mikrometer mißt
und die Länge
L' der Abfragezone,
gemessen entlang der Achse A, 65 Mikrometer ± 10 Mikrometer ist. Diese
Geometrie wurde als notwendig ge- bzw.
befunden, um die DC und RF Messungen (nachfolgend beschrieben) zu
optimieren, die an Zellen bzw. Körperchen
durchgeführt
werden, die durch die Abfragezone durchtreten. Der maximale Durchmesser
der verjüngten
Bohrungslöcher 54,
gemessen an den Endwänden 36,
ist etwa 1,2 mm. Eine plankonvexe Linse 51 ist geeignet
(beispielsweise durch optischen Zement) an einer der flachen Seiten 50 des
optischen Elements festgelegt, wobei eine derartige Linse funktioniert,
um optisch fluoreszierende Strahlung aus der Abfragezone und auf
die eine Fluoreszenz detektierende Photodetektorpackung FD zu koppeln,
wie dies unten diskutiert ist. Eine optische Struktur der Art, wie
sie beschrieben ist, wurde aus einer quadratischen Quarzstange,
enthaltend eine 50 × 50
Mikrometer Kapillaröffnung
gefertigt bzw. hergestellt und nachfolgend bearbeitet, um die kommunizierenden
Bohrungslöcher 54 zu
definieren.
-
Bezugnehmend
auf 2 sind die Endkappen 34, 35 der
Flußzelle
mit einer Mehrzahl von Öffnungen bzw.
Ports P1-P8 versehen, welche dazu dienen, um 1) eine oder mehrere
Probe(n), die zu analysieren ist bzw. sind, und eine Scheideflüssigkeit
in die Flußzelle
zuzuführen,
2) Probe(n) und Scheidefluid abzuziehen, 3) eine oder beide Kappenkammer(n)
zum Abfall zu spülen,
und 4) ein Vakuum zur Verfügung
zu stellen, um die Flußzellenlinien
vorzubereiten. Die Öffnungen
P1-P3 sind mit dem Meßmechanismus 16 fluidmäßig gekoppelt
und dienen dazu, um die gemessenen Aliquote SL,
SD und ST der Probe
zu einer Mehrkanaldüse
N (am besten in 4B gezeigt) einzubringen, die
verwendet wird, um die Aliquote in den Durchtritt 32 für eine Analyse
einzuspritzen. Das Port bzw. die Öffnung P4 ist auch mit dem
Meßmechanismus 16 gekoppelt
und dient dazu, um abgemessene Volumina eines Hüll- bzw. Scheidefluids SF zur
Kappe 34 einzubringen, wobei ein derartiges Fluid dazu
dient, um hydrodynamisch die Probe in der Zellabfragezone zu fokussieren
oder zu zentrieren. Bezugnehmend auf 4B weist
die Probendüse
N, welche teilweise gezeigt ist, drei parallele Kanäle C1, C2, C3
auf, einen für
jedes Probenaliquot und entsprechend einer der Probenabgabeöffnungen
P1-P3. Wie dies in dem Beispiel von 4A gezeigt
ist, hat die Meßvorrichtung 16 von 2 ein
präzise
abgemessenes Probenvolumen in den zentralen Kanal der Probendüse N abgegeben.
Die Letztere dient, um die Probe zu der Abfragezone Z vorragen zu
lassen. Währenddessen
fließt
ein abgemessenes Volumen von Scheidefluid SF, welches in die Kammer 34A unter
Druck und durch die Öffnung
P4 eingetreten ist, durch den Durchtritt 32. Indem dies
durchgeführt
wird, umgibt das Hüll-
bzw. Scheidefluid gleichmäßig den
Probenstrom und bewirkt, daß die
Probe durch das Zentrum der Zellabfragezone Z fließt, wodurch
ein hydrodynamisches Fokussieren erzielt wird. Überschüssiges Scheidefluid wird aus
der Kammer 34A durch die Öffnung P5 abgezogen. Nachdem
sie die Zone Z verlassen haben, werden die Probe und das Scheidefluid
durch ein Probenaustrittsrohr 58 gesammelt, wodurch verhindert
wird, daß rezirkulierende
Zellen die DC und RF Messungen beeinflussen. In 4A ist
ein Blutkörperchen
BC1 gezeigt, das die zentrale Öffnung
der Probeneintragsdüse
N verläßt, ein Blutkörperchen
BC2 ist im Zentrum der Zone Z und in einem elliptisch fokussierten
Laserstrahl B (unten beschrieben) gezeigt, und ein Blutkörperchen
BC3 ist beim Eintreten in das Probenaustrittsrohr 58 gezeigt,
welches mit dem Abfall verbunden ist. Um den Fluiddruck in der Kammer 35A zu
steuern bzw. zu regeln und dadurch den Fluß der Probe zu steuern bzw.
zu regeln, nachdem sie aus der Abfragezone austritt, wird die Kammer 35A voll
Scheidefluid gehalten, wobei ein derartiges Fluid durch die Öffnung P7
eintritt und durch die Abfalldurchtrittsöffnung P8 ausgetragen wird.
-
Zusätzlich zu
der oben beschriebenen Flußzelle
umfaßt
der Mehrparameter-Transducer bzw. -Meßwertwandler 18 einen
Laser 42 oder dgl. um einen Strahlungsstrahl B auszubilden,
der eine Wellenlänge
aufweist, die adaptiert ist, um ein fluoreszierendes Material zu
erregen, das durch gewählte
Zellen von Interesse geführt
wird, und eine Linse 62, um den Laserstrahl in eine elliptisch
geformte Taille bzw. Form 64 zu fokussieren, wie dies in 3-5 gezeigt
ist, die in der Abfragezone Z an einem Ort angeordnet ist, durch
welche die Zellen hindurchtreten müssen. Geeignete Laserquellen
sind ein Argon-Laser kontinuierlicher Welle bzw. Wellenlänge, welcher
bei 488 nm emittiert, und ein diodengepumpter Feststofflaser, der
bei 532 nm emittiert. Bevorzugte Abmessungen 1/e2 des
elliptischen Mittelstücks 64 sind
etwa 10 × 100
Mikrometer mit der kleineren Abmessung in der Richtung eines Probenstroms,
d.h. entlang der Achse A. Strahlung, die durch eine bestrahlte Zelle
gestreut wird, innerhalb der Abfragezone wird durch die zwei Lichtstrahlendetektoreinheiten LSD1
und LSD2 detektiert. LSD1 ist angeordnet, um Licht zu detektieren,
das in einer Richtung im wesentlichen normal (d.h. etwa 90° ⩲ etwa 10
Grad) in bezug auf die Achse des Strahls B gestreut ist, und LSD2
ist angeordnet und strukturiert, um Licht zu detektieren, das in
einer Vorwärtsebene
innerhalb eines Winkelbereichs zwischen etwa 10 Grad und 70 Grad
(MALS) gestreut ist. LSD1 umfaßt
vorzugsweise eine fokussierende bzw. Fokussierlinse 65,
welche arbeitet, um zur Seite gestreutes Licht auf eine Stiftdiode 66 oder
dgl. zu fokussieren. Die Letztere sammelt die zur Seite gestreute
Strahlung und gibt ein LS90 Pulssignal durch einen Vorverstärker P und
zu der Analysiereinrichtung 20 von 1 aus. Der
MALS Lichtstreuungsdetektor LSD2, wobei ein Detail in 7 gezeigt
ist, hat zwei photoaktive Regionen bzw. Bereiche, einen Lichtstreuungs-(UMALS)
Bereich 78 oberen mittleren Winkels, und einen Lichtstreuungs-(LMALS)
Bereich 80 eines unteren mittleren Winkels. Wie oben festgehalten,
ist der UMALS Bereich adaptiert, um Licht zu detektieren, das innerhalb des
Winkelbereichs zwischen 20 und 70 Grad gestreut ist, und der LMALS
Bereich ist adaptiert, um Licht zu detektieren, das innerhalb des
Winkelbereichs zwischen 10 und 20 Grad gestreut ist. Eine bogensehnenförmige Maske 82 verhindert,
daß nicht
gestreutes Laserlicht, ebenso wie gestreutes Laserlicht bei weniger
als 10 Grad verhindert wird, den LMALS Bereich trifft. Die Maske 82 verhindert
auch, daß jegliches
gestreute oder gebeugte Licht in der Nachbarschaft der horizontalen
Ebene von entweder auf den UMALS oder den LMALS Bereich auftrifft.
LSD2 produziert individuell MALS, UMALS und LMALS Pulssignale, welche
zu der Analysiereinrichtung 20 durch geeignete Vorverstärker P ausgegeben
werden.
-
Fluoreszierende
Strahlung, die durch bestrahlte Zellen in der Abfragezone emittiert
wird, wird durch die zuvor erwähnte
Linse 51 gesammelt, die an dem optischen Element 30 festgelegt
ist, kollimiert und räumlich
durch eine Linsenanordnung 70 gefiltert und zu einer Mehrzahl
von Photovervielfältigerrohren
PMT-1, PMT-2 und PMT-3 durch ein Netzwerk von strahlteilenden dichroitischen
Spiegeln BS-1, BS-2 und Filtern 71, 72 und 73 geleitet.
In einer konventionellen Weise detektiert jedes Photomultiplier-
bzw. Photovervielfältigerrohr
fluoreszierende Strahlung in einem Wellenlängenbereich, der durch die
optischen Beschichtungen auf den dichroitischen Spiegeln und Filtern
bestimmt ist. Die entsprechenden Ausgaben der Photovervielfältigerrohre
sind bzw. werden geeignet verstärkt
und zu der Analysiereinrichtung 20 von 1 als
Pulssignale FL1, FL2 und FL3 geleitet.
-
Die
DC/RF Schaltung 41 umfaßt eine DC- bzw. Gleichstromquelle 82,
einen RF Oszillator/Detektor 84, eine Kopplungsschaltung 86 und
Vorverstärker
P. Die Kopplungsschaltung kombiniert linear die Ströme, die durch
die DC Quelle und den RF Oszillator/Detektor produziert sind und
legt diesen Strom an der Zellabfragezone an, wie dies zuvor beschrieben
wurde. Vorzugsweise hat die RF Komponente eine Frequenz von etwa 22,5
MHz. Wenn eine Zelle durch die Zone Z durchtritt, wird die Impedanz
der Zone verändert,
was in einer Modulation des DC bzw. Gleichstroms als eine Funktion
des physischen Volumens V der Zelle (häufig als das DC- bzw. Gleichstromvolumen
bezeichnet) und einer Modulation des RF Stroms als eine Funktion
der inneren bzw. internen Leitfähigkeit
C der Zelle resultiert. Die Kopplungsschaltung trennt die modulierten
Ströme
derart, daß ein
DC Pulssignal zu einem DC- bzw. Gleichstromvorverstärker P geführt wird,
und der modulierte RF Strom durch den Oszillator/Detektor detektiert
wird, was in einem RF Pulssignal resultiert, welches zu dem RF Vorverstärker P geführt wird.
Sowohl DC als auch RF Pulssignale werden an dem Analysierer bzw.
die Analysiereinrichtung 20 ausgegeben.
-
Bezugnehmend
auf 2 funktioniert die Probenvorbereitungsstation 14,
wie dies oben festgehalten ist, um eine Mehrzahl von Aliquoten A1,
A2, A3 des Vollbluts für
eine Analyse vorzubereiten. Somit umfaßt die Station 14 eine
Mehrzahl von Mischkammern MC1, MC2, MC3, welche adaptiert sind,
um Aliquote A1, A2, A3 zu empfangen, die von dem Blutsammelventil 12 durch
eine geeignete Pumpe (nicht gezeigt) dispensiert sind. Wie dies
gezeigt ist, ist die Mischkammer MC1 positioniert, um ein erstes
Aliquot A1 des Vollbluts zu empfangen und es mit einem Verdünnungsmittel
D zu mischen, welches eine fluoreszierende Farbe enthalten kann. Auf
diese Weise wird eine verdünnte
Probe SD für die Analyse von roten Blutkörperchen/Plättchen vorbereitet. In ähnlicher
Weise ist die Mischkammer MC2 positioniert, um ein zweites Aliquot
A2 von Vollblut für
eine Analyse zu empfangen bzw. zu erhalten. In der Mischkammer MC2
ist die Vollblutprobe einem geeigneten Lysierreagenz L, einem Abschreckreagenz
Q und gegebenenfalls einer fluoreszierenden Farbe S unterworfen.
Auf diese Weise werden die roten Blutkörperchen aus der Probe eliminiert
und die Probe wird für
eine Differentialanalyse für
weiße
Blutkörperchen
vorbereitet. In einer ähnlichen
Weise wird ein drittes Aliquot A3 zu einer Mischkammer MC3 abgegeben
bzw. dispensiert, welche positioniert ist, um ein Reagenz zu empfangen,
das adaptiert ist, um die Probe für eine ausgeweitete Analyse
unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern vorzubereiten, um gewählte Zellen
mit Fluorochromen zu markieren. Derartige Reagenzien können ein
Lysierreagenz L, ein Abschreckmittel Q und mit Fluorochrom markierte
monoklonale Antikörper
M beinhalten.
-
Wie
dies in 2 gezeigt ist, umfaßt die Meßstation 16 eine
Mehrzahl von Meßpumpen
MP1-MP5. Jede Pumpe ist vorzugsweise von der Spritzenabwandlung,
die jeweils durch einen geeigneten Schrittmotor (nicht gezeigt)
angetrieben ist, welcher unter der Steuerung bzw. Regelung der Steuer- bzw. Regeleinrichtung bzw.
des Controllers 11 arbeitet, um Flüssigkeiten mit bzw. bei einer
präzisen
Geschwindigkeit bzw. Rate zu pumpen. Die Meßpumpen MP1-MP3 sind zugewiesen,
um vorbestimmte Volumina der Proben SL,
SD und ST von ihren
entsprechenden Mischkammern MC1-MC3 und zu den Eingabeöffnungen
P1-P3 der Flußzellen
mit bzw. bei festgelegten Geschwindigkeiten bzw. Raten abzugeben.
In einer bekannten Weise dienen die Meßpumpen MP4 und MP5, um abgemessene
Volumina eines Scheidefluids SF zu der Strömungs- bzw. Flußzelle zuzuführen, wobei
ein derartiges Fluid zum hydrodynamischen Fokussieren der Zellen
in der Erfassungs- bzw. Abtastzone
Z dient.
-
Während die
Vorrichtung der Erfindung betätigt
bzw. betrieben werden kann, um jede der Proben SL, SD und ST alleine
zu analysieren, um beispielsweise lediglich eine Analyse roter Blutkörperchen
oder lediglich ein Fünf-Teil-Differential von
weißen
Blutkörperchen
zur Verfügung
zu stellen, ist es bevorzugt, daß wenigstens zwei Analysen
nebeneinander bzw. tandemartig ausgeführt werden, um sicherzustellen,
daß sich
die Probe nicht merkbar zwischen den Analysen geändert hat. Wie dies oben festgehalten
wurde, ist es jedoch nicht notwendig, die Ergebnisse von einer Analyse
mit einer anderen zu korrelieren, beispielsweise die Analyse von roten
Blutkörperchen
mit der Analyse von weißen
Blutkörperchen,
um verwendbare Ergebnisse zu erzielen. Somit werden beispielsweise
die Aliquote A1 und A2 zu ihren entsprechenden Kammern MC1 und MC2
geliefert bzw. abgegeben. Die verdünnte und gefärbte Probe
SD wird vorbereitet und in dem Meßwertwandler 18 analysiert,
während
die lysierte und gefärbte
Probe SL immer noch hergestellt bzw. vorbereitet
wird. Die Flußzelle
FC wird gespült,
um zu ermöglichen,
daß die
nächste
Probe ohne irgendeine Verunreinigung analysiert wird. Die lysierte
und gefärbte
Probe SL wird dann vorbereitet und in dem
Meßwertwandler 18 analysiert.
-
Bezugnehmend
auf 8 besteht eine Analysiereinrichtung 20 aus
einem Datenerfassungsmodul 88 und einem Computer 90.
Das Datenerfassungsmodul 88 gibt Pulssignale (FL1, FL2,
FL3, DC, RF, UMALS, LMALS, LS90) von dem VCSF Transducer ein; verstärkt, filtert
und zählt
die Pulssignale; erhält
Pulsinformation, beispielsweise Spitzenspannung von jedem der Pulssignale;
und wandelt die Pulsinformation in digitale Werte um (FL1', FL2', FL3', DC', RF', UMALS', LMALS', LS90'). Die Pulsspitzen-Digitalwerte
und die Pulszählung(en)
werden dem Computer 90 zur Klassifikation, Unterscheidung
und Charakterisierung transferiert. Der Computer 90 beinhaltet
Standardkomponenten, wie eine zentrale Verarbeitungseinheit (CPU),
Direktzugriffsspeicher (RAM), Nur-Lese-Speicher (ROM), Tastatur,
Anzeige, Drucker und Netzwerkverbindung.
-
Der
Betrieb des Blutanalysierinstruments, das oben beschrieben ist,
wird aus den nachfolgenden Arbeitsbeispielen ersichtlich werden.
-
Beispiel 1
-
Die
oben beschriebene automatisierte Zellanalyseeinrichtung wurde verwendet,
um das Verfahren, das unten beschrieben ist, zum Differenzieren
und Aufzählen
von roten Blutkörperchen
und Plättchen
durchzuführen.
Das Verfahren verwendet ein Verdünnungsmittel
D (siehe 2), umfassend die folgenden
Komponenten:
- 1. Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)
- 2. Coriphosphin-O (CPO) – 8 μg/ml
- 3. Dodecyl-β-D-Maltose – 20 μg/ml
- 4. Proclin 300 – 0,05%
-
CPO
ist ein membrandurchlässiges
fluoreszierendes Farbstoffmolekül,
das eine hohe Affinität
für Nukleinsäuren besitzt.
CPO ist ein metachromatisches Molekül, das, wenn es mit Licht bei
einer geeigneten Wellenlänge
erregt wird, Fluoreszenz bei einer Wellenlänge emittieren wird, die durch
die molekulare Struktur der Substanz bestimmt ist, an welcher es
festgelegt ist. Somit wird, wenn es verwendet wird, um eine Zelle,
enthaltend sowohl DNA als auch RNA (wobei beide Nukleinsäuren sind)
zu färben,
CPO bei einer Wellenlänge (FL1)
fluoreszieren, wenn es an den DNA Gehalt der Zelle festgelegt ist,
und bei einer anderen Wellenlänge (FL2),
wenn es an dem RNA Gehalt der Zelle festgelegt ist. Bezugnehmend
auf 2 werden etwa 2 μl des Gesamtblutaliquots A2
zu einer Mischkammer MC2 in der Probenvorbereitungsstation 14 abgegeben
und mit 2 ml Verdünnungs mittel
D für etwa
2 Sekunden vermischt, um eine verdünnte Probe SD herzustellen.
Ein Teil der Probe SD wird durch ein Vakuum
(angewandt bzw. angelegt an die Flußzellenöffnung 5) von der Kammer MC2
und in eine Leitung abgezogen, die diese Kammer und das Port bzw.
die Öffnung
2 der Flußzelle
verbindet, wodurch die Leitung vorab mit Probe beladen wird. Die
Meßpumpe
MP2 wird durch einen Schrittmotor betätigt, um die Probe durch die
Flußzelle
mit bzw. bei einer Geschwindigkeit bzw. Rate von 2 Mikroliter/Sekunde
für ein
Zehn-Sekunden-Intervall vorzutreiben bzw. vorwärts zu bewegen. Während dieses
Zeitintervalls wurden alle Zellen, die durch die Abfragezone Z hindurchtreten,
gezählt
und differenziert bzw. unterschieden (d.h. charakterisiert als Art
oder Subsatz bzw. Teilmenge). Somit wird ein präzises Volumen von 20 Mikroliter der
Probe für
eine Analyse präsentiert
bzw. zur Verfügung
gestellt. Zur selben Zeit gibt die Meßpumpe MP4 Hüll- bzw.
Scheidefluid mit bzw. bei einer Geschwindigkeit von 8 Mikroliter/Sekunde
ab. Aufgrund des Unterschieds in der Fläche der Öffnungen P1 und P4 treten die
Probe und die Scheidefluide durch die Flußzelle mit bzw. bei derselben
Geschwindigkeit durch. Die gesamte Inkubationszeit, welche Mischen
und Primen bzw. Vorbereiten beinhaltet, ist nominal 5,5 Sekunden,
mit einem Arbeitsbereich von 5 bis 15 Sekunden. Wie zuvor beschrieben,
werden V, C, S und F Messungen an jeder Zelle in dem einzelnen bzw.
einzigen Mehrparameter-Meßwertwandler 18 durchgeführt, und
Meßdaten
werden in einer konventionellen Weise durch die Analysiereinrichtung 20 bearbeitet,
um einen Bericht zu ergeben, welcher Absolutzählungen von roten Blutkörperchen
und Plättchen,
absolute und relative Konzentrationen der retikulozyten und retikulären Plättchen,
Zellhämoglobininformation
für rote
Blutkörperchen
und Retikulozyten, mittlere Volumina der zuvor erwähnten Zellarten
und abgeleitete Parameter, beinhaltend Gesamthämoglobin für die Probe zur Verfügung stellt.
-
CPO
ist der bevorzugte fluoreszierende Nukleinsäure-Farbstoff, wobei jedoch
andere ähnliche
Farbstoffe verwendet werden können,
um akzeptable Ergebnisse zu erzielen. Die Dodecyl-β-D-Maltose-Komponente
hat zwei Funktionen: 1) sie wirkt als ein isovolumetrisches Zellkugelbildungsreagenz,
um die Messung von Erythrozyten Zell-für-Zell-Hämoglobin (HC) zu messen, und
2) fördert
sie einen signifikanten Anstieg in einer Farbpenetration durch die
Zellmembran und Nukleinsäurefärbung, was
in einer etwa hundertfachen Reduktion in einer Färbezeit resultiert (welche
etwa 60 Minuten in der Standardflußzytometrie ist). Proclin 300
ist ein antibakterielles Agens. CPO kann mit einem Argon-Ionen-Laser bei 488 nm
oder einem diodengepumpten Feststofflaser erregt werden, der bei
532 nm arbeitet, welches die bevorzugte Erregung für dieses
Beispiel ist. Das Fluoreszenz-Detektionssystem
FD wird eingestellt, um eine Emission bei 575 nm (FL1), welche in
erster Linie auf eine Farbwechselwirkung mit DNA anspricht, und
bei 675 nm (FL2) zu empfangen, welche in erster Linie auf eine Farbwechselwirkung
mit RNA anspricht. In diesem Beispiel ist die RNA das Signal (FL2)
von Interesse und ist bzw. wird als Fluoreszenz in den nachfolgenden
Figuren bezeichnet bzw. markiert. 9A ist
ein Streuungsdiagramm, das das Volumen (DC) gedruckt gegen Opazität (RF/DC)
für rote
Blutkörperchen und
Plättchen
zeigt. Reife rote Blutkörperchen
und Retikulozyten überlappen
und erscheinen als eine einzige Population von roten Blutkörperchen.
Plättchen
erscheinen bei einem kleineren Volumen. Geister (d.h. rote Blutkörperchen,
die ihr Hämoglobin
verloren haben), umfassen eine sehr geringe Anzahl von roten Blutkörperchen,
wel che beschädigt
sind, und somit von der HC Messung entfernt werden müssen. 9B zeigt
das DC Volumen gegen UMALS. Während
die Muster analog zu jenen von 9A sind,
wird ein zusätzlicher
Cluster von zusammenfallenden roten Blutkörperchen, die durch zwei oder
mehrere rote Blutkörperchen
bewirkt sind, die durch die Öffnung
gleichzeitig durchtreten, identifiziert. Zusammenfallende rote Blutkörperchen
werden von der HC Messung entfernt, wobei sie jedoch in Betracht
gezogen werden, wenn der Retikulozytenprozentsatz (RET%) und die
absolute Konzentration (RET#) gemessen werden. 9C zeigt
das DC Volumen gegen Fluoreszenz der roten Blutkörperchen und Plättchen.
Reife rote Blutkörperchen
und Retikulozyten sind bzw. werden leicht unterschieden. Rote Geisterblutkörperchen
können
reife rote Blutkörperchen
oder Retikulozyten sein und beeinflussen die Ergebnisse nicht. Ein
Cluster von retikulären
Plättchen
wird rechts (höhere
Fluoreszenz) der Hauptplättchenpopulation
wahrgenommen.
-
Ein
bevorzugtes Datenanalysenverfahren ist wie folgt beschrieben: Bezugnehmend
auf 10A werden das DC Volumen und
die Opazität
verwendet, um Plättchen
P, rote Blutkörperchen
R und Geister G zu identifizieren. Bezugnehmend auf 10B werden das DC Volumen und UMALS verwendet,
um die Identifikation von Plättchen
P und Geistern G gegenüber
roten Blutkörperchen
R zu verfeinern. Es werden koinzidente rote Blutkörperchen
C gegen nicht koinzidente reife rote Blutkörperchen MC plus Retikulozyten
RET identifiziert. Bezugnehmend auf 10C wird
das DC Volumen gegen FL2 verwendet, um reife rote Blutkörperchen MC
und Retikulozyten RET, sowohl koinzidente als auch nicht koinzidente
zu identifizieren, und eine Subpopulation bzw. Teilmenge von retikulären Plättchen RP
von Plättchen
P zu identifizieren.
-
Weiße Blutkörperchen
W werden in dieser Analyse aufgrund ihres höheren DC Volumens und signifikant
höheren
Fluoreszenzniveaus auf FL2 und FL1 (nicht gezeigt) differenziert.
Unter Verwendung der Klassifikation, die mit Volumen, Opazität, UMALS
und Fluoreszenz erhalten ist, und unter Verwendung der Zellzählungsinformation,
die vom DC Volumen oder irgendeiner der anderen gleichzeitigen Messungen
erhalten ist, werden der Retikulozytenprozentsatz (RET%), retikuläre Plättchen oder
Prozentsatz der nicht reifen Plättchenfraktion
(IPF%) und absoluten Konzentration (IPF#) berichtet. Auch werden
absolute Konzentrationen für
die folgenden Populationen berichtet: rote Blutkörperchen (RBC), Retikulozyten
(RET#), Plättchen
(PLT), retikuläre
Plättchen
und weiße
Blutkörperchen
(WBC). Unter Verwendung der zuvor erwähnten Parameter wird eine Charakterisierung
der Teilmengen bzw. Subpopulationen von roten Blutkörperchen
durchgeführt:
Bezugnehmend auf 10B und unter Verwendung einer
Funktion von UMALS und Volumen werden Zell-für-Zell-Hämoglobin für Retikulozyten (CHr) und alle
roten Blutkörperchen
(CH) erhalten, welche beide histogrammiert bzw. als Histogramm dargestellt
werden können,
um zusätzliche
klinische Information zur Verfügung
zu stellen. Auch werden der Mittelwert für Zell-für-Zell-Hämoglobin für Retikulozyten (MCHr) und
das gesamte mittlere korpuskuläre
Hämoglobin
für rote
Blutkörperchen
(MCH) erhalten. Unter Verwendung eines DC Volumens werden das mittlere
Plättchenvolumen
(MPV), das mittlere Retikulozytenvolumen (MRV), gesamte mittlere
korpuskuläre
Volumen (MCV) für
rote Blutkörperchen
und die Verteilungsbreite (RDW) für rote Blutkörperchen
berechnet. Es wird Hämatokrit
(HCT) = MCV × RBC/10
berechnet. Berechnen von Gesamthämoglobin
(HGB) = MCH × RBC.
Berechnen der mittleren Konzentration von korpuskulärem Hämoglobin
(MCHC) = MCH/MCV.
-
Beispiel 2
-
Die
oben beschriebene automatisierte Zellanalysiereinrichtung wurde
verwendet, um das unten beschriebene Verfahren auszuführen, um
ein ausgedehntes bzw. erstrecktes Differential bzw. eine Unterscheidung
von weißen
Blutkörperchen
zur Verfügung
zu stellen. Das Verfahren verwendet eine metachromatische Farbe
(CPO 625 μg/ml),
ein Lysierreagenz für
rote Blutkörperchen
und ein Abschreckreagenz, um die Effekte der Lysierung auf die verbleibenden
nicht lysierten Zellen zu inhibieren und weiter zu verzögern. Beispiele
von zwei unterschiedlichen bevorzugten Lysier- und Abschreckreagenzien,
ihre Volumina und ihre Freilegungszeiten sind in der folgenden Tabelle
gezeigt. Alternative Lysier- und Abschreckreagenzien können auch
mit dem Erfordernis angewandt bzw. eingesetzt werden, daß die Reagenzien
effektiv die RBC's
lysieren, während
sie die gewünschten
elektro-optischen
Charakteristika der verbleibenden Zellen (WBC's und NRBC's) beibehalten.
-
-
Bezugnehmend
auf 2 werden 34 μl
von Aliquot A3 zu einer Mischkammer MCI in der Probenvorbereitungseinheit 14 abgegeben
bzw. geliefert und mit 3,4 μl
CPO für
30 Sekunden vermischt. Bezugnehmend auf die obige Tabelle werden
dann 507 μl
Erythrolyse II zu dem CPO gefärbten
Blut zugesetzt und für
weitere 5,3 Sekunden vermischt, zu welcher Zeit 200 μl Stabilyse
bei bzw. mit fortgesetztem Mischen für weitere 8,5 Sekunden zugesetzt
wird.
-
Unter
Verwendung einer Meßpumpe
MP3 wird ein Volumen der Probe SL durch
die Flußzelle
für ein vorbestimmtes
Zeitintervall geleitet und unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen
Verfahrens werden alle Zellen in einem 40 Mikroliter Volumen der
Proben SL abgefragt. Wie zuvor beschrieben,
werden V, C, S und F Messungen von jeder Zelle in der Probe erhalten,
und diese Messungen werden durch die Analysiereinrichtung 20 bearbeitet,
um einen Bericht zu erhalten bzw. ergeben, welcher absolute und
relative Konzentrationen der fünf
normalen Arten von weißen
Blutkörperchen
und wenigstens einer abnormalen Körperchenart zur Verfügung stellt,
beinhaltend, jedoch nicht begrenzt auf kernige rote Blutkörperchen
(NRBC), Blasts und nicht reife Zellen. CPO kann mit einem Argon-Ionen-Laser
488 nm oder einem diodengepumpten Feststofflaser erregt werden,
der bei 532 nm arbeitet, was die bevorzugte Erregung für dieses
Beispiel ist. Das Fluoreszenz-Detektionssystem FD wird aufgebaut
bzw. festgelegt, um eine Emission bei 575 nm (FL1), welche in erster
Linie auf eine Farbstoffwechselwirkung mit DNA anspricht, und bei
675 nm (FL2) zu erhalten, welche in erster Linie auf eine Farbstoffwechselwirkung
mit RNA anspricht.
-
11A, 11B, 12A, 12B, 13A, 13B, 14A und 14B zeigen
Streuungsdiagramme von verschiedenen Kombinationen von Messungen
für eine
normale periphere Blutprobe, d.h. eine, welche lediglich die fünf normalen
weißen
Zellpopulationen, Lymphozyten (Lymph), Monozyten (Mono), Neutrophile
(Neut), Eosinophile (Eo) und Basophile (Baso) enthält. Auch
gezeigt ist ein Cluster bzw. Klumpen, Debris (Schmutz) genannt,
welcher Fragmente von roten Blutkörperchen, Plättchen und
nicht lebensfähige weiße Blutkörperchen
enthält,
und kernige rote Blutkörperchen
(NRBC) enthalten kann. 11A zeigt
ein Streuungsdiagramm von DC Volumen gegen LMALS. LMALS stellt eine
optimale Trennung von Lymph + Mono + Baso gegen Neut + Eo zur Verfügung. 11B zeigt ein Streuungsdiagramm von DC gegen UMALS.
UMALS stellt eine optimale Trennung des Eo-Clusters zur Verfügung. 12A zeigt ein Streuungsdiagramm von DC Volumen
gegen RLS. RLS wird durch ein Summieren der LMALS und UMALS Messungen,
Erhalten des Logarithmus der Summe, und Rotieren oder Normalisieren
des Ergebnisses relativ zu der Messung des DC Volumens erhalten.
RLS kombiniert die unterscheidenden Merkmale von LMALS und UMALS.
Sowohl in 11A als auch 12A ist es offensichtlich, daß der Monocluster von Lymph
+ Baso durch DC trennbar ist. 12B zeigt
ein Streuungsdiagramm von DC Volumen gegen RF (Leitfähigkeit)/DC(Volumen),
wobei die Baso- und Lymph-Cluster durch RF/DC getrennt sind. Die Überlappung
von Baso mit Neut und Eo wird als ein Ergebnis der Trennung aufgelöst, die
mit den Lichtstreuungsmessungen erhalten sind bzw. werden, die in 11A-12A gezeigt sind. 13A und 13B zeigen
ein Streuungsdiagramm von DC Volumen gegen FL2 (RNA Fluoreszenz,
gemessen wie oben beschrieben) bzw. ein Streuungsdiagramm von DC
Volumen gegen FL1 (DNA Fluoreszenz, gemessen wie oben beschrieben).
In diesen zwei Ansichten sind die fünf normalen Populationen in
verschiedenen Graden einer Überlappung
gezeigt. 14A zeigt ein Streuungsdiagramm
von FL1 gegen FL2. Aus einem Vergleichen dieser Figur mit den vorhergehenden
zwei ist es ersichtlich, daß alle
fünf normalen
Populationen unterscheidbar sind. Zu sätzlich ist bzw. wird ein größtenteils
leerer Bereich BL als der Ort auf diesem Streuungsdiagramm identifiziert,
wo Blasten gefunden würden,
wenn die Probe irgendwelche hätte. 14B zeigt ein Streuungsdiagramm von DC gegen FL2/FL1.
Das Verhältnis
der zwei Fluoreszenzmessungen bewahrt den Blastenbereich BL und
erleichtert ein Erfassen oder Bestimmen einer Grenze für diesen
Bereich. 15A-18B zeigen
Streuungsdiagramme von verschiedenen Kombinationen von Messungen
für eine
periphere Blutprobe einer abnormalen akuten lymphozytischen Leukämie (ALL),
welche vier der normalen weißen
Blutkörperchen-
bzw. Zellpopulationen, Lymphozyten (Lymph), Monozyten (Mono), Neutrophile
(Neut) und Eosinophile (Eo) und eine sehr hohe Konzentration von
Blasten (Blast) enthält. 15A-16B zeigen jeweils Streuungsdiagramme
von DC Volumen gegen LMALS, DC Volumen gegen UMALS, DC Volumen gegen
RLS und DC Volumen gegen RF/DC. In allen Figuren überlappt
die Blastenpopulation mit allen anderen Clustern, was es unmöglich macht,
eine geeignete bzw. ordnungsgemäße Klassifikation
mit diesen Messungen alleine zu erzielen. 17A-17B zeigen Streuungsdiagramme von DC gegen FL1
und DC gegen FL2. Die Blastenpopulation überlappt in beiden Fällen schwerwiegend
mit den anderen Clustern. 18A zeigt
ein Streuungsdiagramm von FL1 gegen FL2. In diesem Fall sind die
meisten der Populationen aufgelöst,
mit Ausnahme, daß der
Blastencluster mit dem Lymphcluster überlagert. 18B zeigt ein Streuungsdiagramm von DC Volumen
gegen FL2/FL1. Lymph, Blast, Mono und Neut sind vollständig aufgelöst. Ein
Bereich BA zeigt den Bereich, wo Basophile gefunden würden. Der
Eo-Cluster ist durch UMALS trennbar (15B).
-
19A-B zeigen Streuungsdiagramme von Log FL2 gegen
Log FL1 für
eine normale Blutprobe und eine abnormale Blut probe, enthaltend
gekernte rote Blutkörperchen
(NRBC). Ein Cluster bzw. Klumpen W beinhaltet weiße Blutkörperchen
und ist das Äquivalent
aller Populationen von weißen
Blutkörperchen,
die in 11A-18B gezeigt
ist. Ein Satz von Clustern D besteht aus einem Cluster RP, welcher
Fragmente von roten Blutkörperchen
und Plättchen
beinhaltet, einem Cluster NRBC, welcher kernige bzw. gekernte rote
Blutkörperchen
beinhaltet, und einem Cluster 126, welcher nicht lebensfähige weiße Blutkörperchen
enthält.
Der Clustersatz D ist das Äquivalent
der Debris-Population, die in 11A-18B gezeigt ist. Drei Grenzwerte bzw. Grenzen 120, 122, 124 definieren
und klassifizieren die Cluster, umfassend den Clustersatz D. Die
Grenze 120 trennt die weißen Blutkörperchen W von dem Clustersatz
D. Die Grenze 122 trennt die Fragmente von roten Blutkörperchen
und Plättchen
RP von dem NRBC Cluster und Cluster 126 von nicht lebensfähigen weißen Blutkörperchen.
Die Grenze 124 trennt den NRBC Cluster von dem Cluster 126 von
nicht lebensfähigen weißen Blutkörperchen.
-
Ein
bevorzugtes Datenanalyseverfahren ist wie folgt beschrieben. Bezugnehmend
auf 20A-21B werden
das DC Volumen und FL1 verwendet, um die Debris-Population D von
den weißen Blutkörperchen
W zu identifizieren. RLS, DC Volumen, RF/DC, FL1 und Fl2 werden
verwendet, um die fünf normalen
Populationen von weißen
Blutkörperchen
zu klassifizieren: Neutrophile N und Eosinophile E sind bzw. werden
mit RLS identifiziert; Monozyten M sind mit RLS und DC Volumen identifiziert;
Lymphozyten L und Basophile B werden zuerst als eine Gruppe durch
RLS und DC Volumen identifiziert und dann durch RF/DC, FL1 und FL2
getrennt. Blasten BL werden durch FL1, FL2 und DC Volumen identifiziert.
Der FL2/FL1 berechnete Parameter stellt eine normalisierte orthogonale
Ansicht zur Verfügung,
welche eine Klassifikation erleichtert. Nicht reife Granulozyten
IG werden durch ein Messen einer signifikanten Verschiebung zu einem
niedrigen Fluoreszenzniveau in sowohl FL1 und FL2 Parametern identifiziert,
ebenso wie eine Verschiebung zu höheren Niveaus von DC Volumen.
Alle zuvor erwähnten
normalen und abnormalen Arten von weißen Blutkörperchen werden als Prozentsätze der
gesamten Population von weißen
Blutkörperchen
berichtet, ebenso wie als absolute Konzentrationen (LYMPH%, LYMPH#,
MONO%, MONO#, NEUT%, NEUT#, EO%, EO#, BASO%, BASO#, IMMGRAN%, IMMGRAN#,
BLAST, BLAST#). Die absolute gesamte Zählung von weißen Blutkörperchen (WBC)
wird auch berichtet. Bezugnehmend auf 22 werden
die weißen
Blutkörperchen
W mit FL1 durch die Grenze 120 identifiziert. Die Fragmente
von roten Blutkörperchen
und Plättchen
RP werden mit FL1 durch die Grenze 122 identifiziert. Die
kernigen roten Blutkörperchen
NRBC und die nicht lebensfähigen
weißen
Blutkörperchen
werden mit FL1 durch die Grenzen 120, 122 identifiziert
und durch die Grenze 124 getrennt, welche eine Funktion
von FL1 und FL2 ist. Kernige rote Blutkörperchen NRBC werden als ein
Prozentsatz von weißen
Blutkörperchen
(NRBC) und als eine absolute Konzentration (NRBC#) berichtet. Wenn
nicht lebensfähige
weiße
Blutkörperchen 126 vorhanden
sind, werden sie als Fragile White Cell Fraction Prozentsatz und absolute
Konzentration (FWCF%, FWCF#) berichtet und die absolute Zählung von
weißen
Blutkörperchen (WBC)
wird entsprechend eingestellt.
-
Beispiel 3
-
Nachfolgend
wird ein Verfahren zum Erhalten einer erstreckten bzw. ausgeweiteten
Analyse von einer oder mehreren Population(en) von weißen Blutkörperchen
beschrie ben, indem die Zellen von Interesse mit einem oder mehreren
Fluorochrom(en) markiert werden. In diesem Beispiel werden Lymphozyten
mit einem Cocktail aus monoklonalen Antikörpern, enthaltend CD3, CD4
und CD8 markiert, wobei jeder Antikörper mit einem unterschiedlichen
Fluorochrom konjugiert ist, wie dies in Tabelle 2 gezeigt ist. Bezugnehmend
auf
2 werden 34 μl
von Aliquot A3 zu einer Mischkammer MC3 in der Probenherstellungseinheit
14 abgegeben,
mit 10 μl
monoklonalem Antikörper-Cocktail
M vermischt und für
30-60 Sekunden inkubiert.
Lyse und Abschreckmittel werden zu der Probe gemäß Tabelle 1 in Beispiel 2 hinzugefügt. Die
Meßpumpe
MP3 wird verwendet, um ein Volumen der Probe S
T zu
der Flußzelle
durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren abzugeben. Die Probe
wird dann durch die Flußzelle
wie in Beispiel 1 abgefragt bzw. untersucht. In diesem Beispiel
werden die unterschiedlichen Fluorochrome der markierten Lymphozyten
mit einem der Laser erregt, auf die in Beispielen 1 und 2 Bezug
genommen ist. Nachfolgend ist die Fluorochromkonfiguration für dieses
Beispiel: Tabelle
2
- PE – Phycoerythrin
- PE-CY5 – Phycoerythrin
Cychrome 5 Konjugat
-
23 zeigt
ein Streuungsdiagramm von Log FL1 (CD4) gegen Log FL2 (CD8). Ein
Cluster 140 enthält
CD4 positive Lymphozyten. Ein zweiter Cluster 142 enthält CD8 positive
Lymphozyten. Ein dritter Cluster 144 enthält Lymphozyten,
welche weder CD4 positiv noch CD8 positiv sind, und weitere bzw.
andere weiße Blutkörperchen.
Bezugnehmend auf die VCS (Volumen-Leitfähigkeits-Streuung) Analyse
von 12A-B kann die Lymphozytenpopulation
isoliert werden, oder gegatet werden, so daß eine Immunofluoreszenzanalyse durchgeführt werden
kann, und Teilmengen können
klassifiziert und unterschieden werden, was Prozentsätze betreffend
Lymphozyten und eine absolute Konzentration ergibt. Von speziellem
Interesse ist die absolute CD4 Zählung,
welche verwendet wird, um das Fortschreiten und eine Behandlung
von HIV zu verfolgen.
-
Beispiel 4
-
In
dem Beispiel wurde die oben beschriebene automatisierte Zellanalysiereinrichtung
verwendet, um rote Blutkörperchen
und Plättchen
zu differenzieren und aufzuzählen,
ein ausgedehntes Differential von weißen Blutkörperchen zu erhalten, und eine
ausgedehnte bzw. erstreckte Analyse von einer oder mehreren Population(en)
von weißen
Blutkörperchen
zu erhalten, indem die Zellen von Interesse mit einem oder mehreren Fluorochrom(en)
markiert wurden. In diesem Beispiel werden die Probenvorbereitungen,
die in Beispiel 1-3 oben beschrieben sind, simultan (d.h. parallel)
ausgeführt,
während
die Probenabfragen, die in Beispiel 1-3 beschrieben sind, sequentiell
ausgeführt
werden. Somit wird die gesamte Analyse in einer Zeitdauer von etwa 60
Sekunden durchgeführt.
Die Ergebnisse der drei Zellabfragen können zusammengetragen bzw.
-gefaßt werden,
jedoch sind bzw. werden sie nicht korreliert, d.h. die Ergebnisse
von irgendeiner der Abfragen hängt nicht
von den Ergebnissen der anderen zwei Abfragen ab. Ein interpretierender
Bericht kann durch ein Kombinieren der gesamten Informationen von
den drei gesonderten Abfragen erhalten werden, um zusätzliche
Information betreffend befürchtete
Abnormalitäten
der analysierten Blutprobe zur Verfügung zu stellen.
-
Die
Erfindung wurde im Detail unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte
Ausbildungen beschrieben. Es wird jedoch erkannt bzw. geschätzt werden,
daß verschiedene Änderungen
und Modifikationen daran innerhalb des Rahmens gemacht werden können, der
durch die beiliegenden Ansprüche
definiert ist.
