DE60101939T2 - Mit stickstoffheterozyklen substituierte elektronenmangel-fluoresceinfarbstoffe - Google Patents

Mit stickstoffheterozyklen substituierte elektronenmangel-fluoresceinfarbstoffe Download PDF

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Description

  • I. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Fluoreszenzfarbstoff-Verbindungen, die als Markierungsreagenzien zur Herstellung molekularer Sonden verwendbar sind. Spezifischer betrifft die Erfindung Fluorescein-Farbstoffe mit einer Xanthen-Ringstruktur und Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-Substituenten.
  • II. HINTERGRUND
  • Die nicht-radioaktive Detektion von biologischen Analyten unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern ist eine wichtige Technologie in der modernen analytischen Biotechnologie. Durch Beseitigung des Bedarfs an radioaktiven Markern wird die Sicherheit erhöht und der Einfluss auf die Umwelt und Kosten, die mit der Entsorgung von Reagenzien verbunden sind, werden stark reduziert. Beispiele für Verfahren, die solche Fluoreszenzdetektionsverfahren verwenden, umfassen automatisierte DNA-Sequenzierung, Oligonukleotid-Sondenverfahren, Detektion von Polymerase-Kettenreaktionsprodukten, Immunoassays und dergleichen.
  • In vielen wichtigen Anwendungen ist es von Vorteil, mehrere, spektral unterscheidbare Fluoreszenzmarker zu verwenden, um eine unabhängige Detektion einer Vielzahl von räumlich überlappenden Analyten zu erreichen, d.h. eine mehrfache Fluoreszenzdetektion. Beispiele für Verfahren, die eine mehrfache Fluoreszenzdetektion verwenden, umfassen mehrfache DNA-Sonden-Assays mit einem einzigen Röhrchen, PCR, Einzel-Nukleotid-Polymorphismen, Immunoassays und automatisierte Vielfarben-DNA-Sequenzierung. Die Anzahl von Reaktionsgefäßen kann vermindert werden, was experimentelle Protokolle vereinfacht und die Herstellung von anwendungsspezifischen Reaktions-Kits erleichtert. In dem Fall der automatisierten Vielfarben-DNA-Sequenzierung ermöglicht eine mehrfache Fluoreszenzdetektion die Analyse von mehreren Nukleotiden in einer einzigen Elektrophoresespur, wodurch der Durchsatz gegenüber Einfarben-Verfahren erhöht wird und Unbestimmtheiten, die mit elektrophoretischen Mobilitätsvariationen zwischen den Spuren verbunden sind, vermindert werden. Eine automatisierte Vierfarben-DNA-Sequenzierung des Sanger-Typs ermöglichte die Charakterisierung des gesamten Genoms auf einer molekularen Ebene.
  • Das Zusammenstellen eines Satzes von mehreren, spektral-unterscheidbaren Fluoreszenzmarkern, die für eine mehrfache Fluoreszenzdetektion geeignet sind, ist problematisch. Eine mehrfache Fluoreszenzdetektion führt zu mindestens sechs schweren Einschränkungen bezüglich der Auswahl von Komponent-Fluoreszenz-Farbstoffmarkern, insbesondere für Anwendungen, die eine einzige Anregungsstrahlungsquelle, eine elektrophoretische Trennung und/oder eine Behandlung mit Enzymen benötigen, beispielsweise eine automatisierte DNA-Sequenzierung. Erstens ist es schwierig, einen Satz von strukturell ähnlichen Farbstoffen zu finden, deren Emissionsspektren spektral aufgelöst sind, da die typische Halbwertsbreite von Emissionsbanden für organische Fluoreszenzfarbstoffe etwa 40 bis 80 Nanometer (nm) beträgt. Zweitens kann, selbst wenn Farbstoffe mit nicht-überlappenden Emissionsspektren identifiziert werden, der Satz immer noch nicht geeignet sein, wenn die entsprechenden Fluoreszenz-Quantenausbeuten zu gering sind. Drittens wird, wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe zusammen verwendet werden, die gleichzeitige Anregung schwierig, weil die Absorptionsbanden der Farbstoffe gewöhnlich weit auseinander liegen. Viertens dürfen die Ladung, Molekülgröße und Konformation der Farbstoffe die elektrophoretische Mobilität des Analyten nicht nachteilig beeinflussen. Fünftens müssen die Fluoreszenzfarbstoffe mit der Chemie kompatibel sein, die für die Herstellung oder Manipulation des Analyten eingesetzt wird, z.B. DNA-Synthese-Lösungsmittel und -Reagenzien, Puffer, Polymerase-Enzyme, Ligase-Enzyme und dergleichen. Sechstens muss der Farbstoff eine ausreichende Fotostabilität aufweisen, um einer Laseranregung zu widerstehen.
  • Zur Zeit erhältliche mehrfache Farbstoffsätze, die für eine Verwendung in automatisierten Vierfarben-DNA-Sequenzierungen geeignet sind, benötigen blaue oder blaugrüne Laserstrahlung, um Fluoreszenzemissionen von allen Farbstoffen, die den Satz bilden, in geeigneter Weise anzuregen, z.B. Argon-Innenlaser. Da billigere rote Laser erhältlich werden, entwickelt sich eine Bedarf an Fluoreszenzfarbstoffverbindungen und deren Konjugate, die den vorstehenden Ein schränkungen genügen und durch Laserstrahlung mit einer Wellenlänge von über etwa 500 nm anregbar sind.
  • III. ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung betrifft Farbstoffverbindungen, die für die Bildung von Sätzen von spektral auflösbaren Fluoreszenzmarkern geeignet sind, die für eine Mehrfarben-Fluoreszenzdetektion geeignet sind.
  • Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Farbstoffe eine Fluoresceinartige Xanthen-Ringstruktur I:
    Figure 00030001
    die mit mindestens einem Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus substituiert ist, der mit dern Fluorescein-Ringsystem an R1, R2, R3, R4, R5 oder R7 gebunden ist.
    • R1, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R7 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R2, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
    • R3, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
    • R4, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R5 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R5, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R4 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R7, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R1 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R6 kann eine (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, Cyan-, heterocyclische Aromaten-, Phenyl- und substituierte Phenylgruppe der Struktur II:
      Figure 00040001
      sein, worin X1, X2, X3, X4 und X5 für sich genommen ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, CO2H-, SO3H-, CH2OH-Gruppe oder eine reaktive Verbindungsgruppe sind.
  • In einem Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Markierung eines Substrates mit einem Fluorescein-Farbstoff der Struktur I bereitgestellt, wobei sich das Substrat mit der reaktiven Verbindungsgruppe des Farbstoffs umsetzt und ein Substrat-Farbstoff-Konjugat gebildet wird. Substrat-Farbstoff-markierte Konjugate umfassen den Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoff gemäß I und ein Substrat, d.h. ein anderes Molekül oder eine andere Substanz. Das Substrat kann mit einem oder mehreren erfin dungsgemäßen Farbstoffen markiert werden, die gleich oder verschieden sein können. Die Fluoreszenz der Farbstoffe stellt detektierbare Signale über einen Spektralbereich bereit, wodurch eine Unterscheidung von unterschiedlich markierten Substraten in einer einzigen Probe oder einem Gemisch ermöglicht wird.
  • In einer Ausführungsform ist der Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoff kovalent mit einer weiteren Farbstoffverbindung konjugiert, um eine Energie-Transfer-Farbstoffverbindung zu bilden.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist der Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoff kovalent mit einem Nukleosid, Nukleotid, Nukleosid- und Nukleotid-Analogon, Polynukleotid oder Polynukleotid-Analogon konjugiert, um markierte Konjugate damit zu bilden.
  • In einem noch weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Phosphoramidit-Reagenzien bereitgestellt, die erfindungsgemäße Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoffe einschließen.
  • In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß verschiedene Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden, die mit den Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffen markiert sind, und zur Verwendung der Farbstoffe zur Detektion von fluoreszenzmarkierten Polynukleotiden bereitgestellt.
  • In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Kits bereitgestellt, die Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoffe und Reagenzien umfassen, die zur Markierung von Molekülen und/oder zur Durchführung von Assays, wie DNA-Sequenzierung und -Amplifikation, z.B. Polymerase-Kettenreaktion, geeignet sind.
  • Die erfindungsgemäßen Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffe stellen signifikante Vorteile gegenüber derzeit bekannten Fluorescein-Farbstoffen bereit.
  • IV. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Strukturen der Verbindungen 1–5.
  • 2 zeigt die Strukturen der Verbindungen 6–12.
  • 3 zeigt die Strukturen der Verbindungen 13 und 14.
  • 4 zeigt die Strukturen der Verbindungen 15 und 16.
  • 5 zeigt die Strukturen der Verbindungen 1a–22.
  • 6 zeigt die Strukturen der Verbindungen 23–25.
  • 7 zeigt die Strukturen der Verbindungen 26–28.
  • 8 zeigt die Strukturen der Verbindungen 29–33.
  • 9 zeigt die Strukturen der Verbindungen 34–36.
  • 10 zeigt die Strukturen der Verbindungen 37–41.
  • 11 zeigt eine repräsentative Auswahl von Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen.
  • 12 zeigt fluorimetrische Scans der Verbindung 19, Anregungsmaximum bei 530 nm, Emissionsmaximum bei 554 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
  • 13 zeigt fluorimetrische Scans der Verbindung 22, Anregungsmaximum bei 531,5 nm, Emissionsmaximum bei 556 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
  • 14 zeigt einen fluorimetrischen Scan der Verbindung 25, Emissionsmaximum bei 562,5 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
  • 15 zeigt fluorimetrische Scans der Verbindung 33, Anregungsmaximum bei 545,5 nm, Emissionsmaximum bei 571,5 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
  • 16 zeigt eine Fluoreszenzdetektion von markierten Sequenzfragmenten des ABI PRISM 310. Base 183 bis Base 276-Bereich der G-Terminiationssequenz des pGEM-Targets unter Verwendung eines -21M13 Vorwärts-Primers. Reagenzien: POP6-Elektrophoresemedium, Taq FS-Polymerase, dNTP-Mix jeweils 25 pmol von dATP, dCTP, dITP, dTTP. Oberes Feld: dNTP-Mix und Terminator 3'FddGTP-EO-13. Unteres Feld: dNTP-Mix und Energietransfer-Farbstoff-Terminator 3'FddGTP-E0-6FAM-Bn-dR110.
  • V. GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es wird nun genau auf die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen Bezug genommen, und Beispiele davon sind in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht. Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben werden wird, soll verstanden werden, dass sie nicht die Erfindung auf diese Ausführungsformen beschränken sollen. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung alle Alternativen, Modifikationen und Äquivalente umfassen, die innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert, eingeschlossen sein können.
  • V.1 DEFINITIONEN
  • Soweit nicht anders angegeben, sollen die nachstehenden Begriffe und Ausdrücke, wie hierin verwendet, die nachstehenden Bedeutungen aufweisen:
  • "Nukleobase" betrifft eine stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe, die zur Bildung von Watson-Crick-Wasserstoffbindungen mit einer komplementären Nukleobase oder einem Nukleobasen-Analogon, z.B. einem Purin, einem 7-Deazopurin oder einem Pyrimidin, fähig ist. Typische Nukleobasen sind die natürlich vorkommenden Nukleobasen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin und Analoga der natürlich vorkommenden Nukleobasen, z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, Inosin, Nebularin, Nitropyrrol, Nitroindol, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudouridin, Pseudocytidin, Pseudoisocytidin, 5-Propinylcytidin, Isocytidin, Isoguanin, 7-Deazaquanin, 2-Thiopyrimidin, 6-Thioguanin, 4-Thiothymin, 4-Thiouracil, O6-Methylguanin, N6-Methyladenin, O4-Methylthymin, 5,6-Dihydrothymin, 5,6-Dihydrouracil, 4-Methylindol und Ethenoadenin (Fasman, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Seiten 385-394, CRC Press, Boca Raton, FL (1989)).
  • "Nukleotid" betrifft eine Verbindung, die eine Nukleobase umfasst, die an ein C-1'-Kohlenstoffatom eines Ribosezuckers gebunden ist. Die Ribose kann substituiert oder nicht-substituiert sein. Substituierte Ribosezucker umfassen in nicht-begrenzender Weise diejenigen Ribosen, in denen ein oder mehrere der Kohlenstoffatome, vorzugsweise das 3'-Kohlenstoffatom, mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen substituiert ist, worin jede R-Gruppe unabhängig -H, eine (C1-C6)-Alkyl- oder (C5-C14)-Arylgruppe ist. Besonders bevorzugte Ribosen sind Ribose, 2'-Desoxyribose, 2',3'-Didesoxyribose, 3'-Halogenribose, 3'-Fluorribose, 3'-Chlorribose und 3'-Alkylribose. Wenn die Nukleobase A oder G ist, ist der Ribosezucker an die N9-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase C, T oder U ist, ist der Pentosezucker an die N1-Position der Nukleobase gebunden (Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflage, Freeman, San Francisco, CA (1992)).
  • "Nukleotid" betrifft einen Phosphatester eines Nukleosids als eine Monomereinheit oder innerhalb eines Polynukleotids. Nukleotide werden manchmal als "NTP" oder "dNTP" und "ddNTP" bezeichnet, um insbesondere die strukturellen Eigenschaften des Ribosezuckers herauszustellen. "Nukleotid-5'-triphosphat" betrifft ein Nukleotid mit einer Triphosphatestergruppe an der 5'-Position. Die Triphosphatestergruppe kann Schwefelsubstitutionen für die verschiedenen Sauerstoffatome umfassen, z.B. α-Thionukleotid-5'-triphosphate.
  • Wie hierin verwendet, umfassen die Begriffe "Polynukleotid" oder "Oligonukleotid" eine jegliche Polymerverbindung, die aus Nukleosiden, Nukleotiden oder Analoga davon besteht. "Oligonukleotid" und "Polynukleotid", die austauschbar verwendet werden, betreffen einzelsträngige und doppelsträngige Polymere von Nukleotidmonomeren, einschließlich 2'-Desoxyribonukleotide (DNA) und Ribonukleotide (RNA). Ein Oligonukleotid kann vollständig aus Desoxyribonukleotiden, vollständig aus Ribonukleotiden oder chimären Gemischen davon, die durch Internukleotid-Phosphodiesterbindung-Verbindungen verbunden sind, oder Internukleotid-Analoga und zugehörigen Gegenionen, z.B. H+-, NH4 +-, Trialkylammonium-, Mg2+-, Na+-Ionen und dergleichen, bestehen. Oligonukleotide können aus Nukleobasen- und Zucker-Analoga bestehen. Polynukleotide weisen typischerweise eine Größe von wenigen Monomereinheiten, z.B. 5–40, wenn sie herkömmlich als Oligonukleotide bezeichnet werden, bis hin zu mehreren Tausend Monomer-Nukleotid-Einheiten auf. Wenn nicht anders angegeben, soll verstanden werden, dass, wann immer eine Oligonukleotid-Sequenz dargestellt wird, die Nukleotide in 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts angegeben sind und dass "A" Desoxyadenosin bezeichnet, "C" Desoxycytidin bezeichnet, "G" Desoxyguanosin bezeichnet und "T" Thymidin bezeichnet, wenn nicht anders angegeben.
  • Der Begriff "Watson/Crick-Basenpaarung" betrifft die Wasserstoff-bindende Basenpaarung, die herkömmlicherweise in doppelsträngiger DNA beobachtet wird.
  • "Anbindungsstelle" betrifft eine Stelle an einer Gruppe, z.B. einem Fluorescein-Farbstoff, einem Nukleotid oder einem Oligonukleotid, an die ein Linker kovalent gebunden ist.
  • "Linker" betrifft eine Gruppe, die einen Farbstoff mit einem Substrat, z.B. einem Oligonukleotid, oder einen Farbstoff mit einem anderen, z.B. in einem Energie-Transfer-Farbstoffpaar, verbindet.
  • "Alkyl" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest, der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkans, -alkens oder -alkins abgeleitet ist. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylgruppen und dergleichen. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Methylgruppe (-CH3), Ethylgruppen wie Ethanyl- (-CH2-CH3), Ethenyl- (-CH=CH2), Ethinylgruppe (-C≡CH), Propylgruppen wie Propan-1-yl- (-CH2-CH2-CH3), Propan-2-yl-, Cyclopropan-1yl-, Prop-1-en-1-yl- (-CH=CH-CH3), Prop-1-en-2-yl-, Prop-2-en-1-yl(-CH2-CH=CH2), Prop-2-en-2-yl-, Cycloprop-1-en-1-yl-, Cycloprop-2-en-1-yl-, Prop-1-in-1-yl- (-C-=C-CH3), Prop-2-in-1-ylgruppe (-CH2-C≡CH), usw., Butylgruppen wie Butan-1-yl- (-CH2-CH2-CH2-CH3), Butan-2-yl-, Cyclobutan-1-yl-, But-1-en-1-yl- (-CH=CH2-CH2-CH3), But-1-en-2-yl-, But-2-en-1-yl- (-CH2-CH=CH-CH3), But-2-en-2-yl-, Buta-1,3-dien-1-yl- (-CH=CH-CH=CH2), Buta-1,3-dien-2-yl-, Cyclobut-1-en-1-yl-, Cyclobut-1-en-3-yl-, Cyclobuta-1,3-dien-1-yl-, But-1-in-1-yl- (-C≡C-CH2-CH3), But-1-in-3-yl-, But-3-in-1-ylgruppe (-CH2-CH2-C≡CH), usw. und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkylgruppen (C1-C6)-Alkylgruppen, wobei (C1-C3)-Gruppen besonders bevorzugt sind.
  • "Alkoxy" betrifft -OR, worin R eine (C1-C6)-Alkylgruppe ist.
  • "Alkyldiyl" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 1–12 Kohlenstoffatomen und mit zwei monovalenten Radikalzentren, abgeleitet durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von dem gleichen oder zwei verschiedenen Kohlenstoffatomen eines Stammalkans, -alkens oder -alkins. Typische Alkyldiylreste umfassen in nicht-begrenzender Weise Methano- (-CH2-), 1,2-Ethyldiyl-, 1,3-Propyldiyl-, 1,4-Butyldiylgruppe und dergleichen.
  • "Aryl" betrifft einen monovalenten aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 6–20 Kohlenstoffatomen, der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzelnen Kohlenstoffatom eines aromatischen Stammringsystems abgeleitet ist. Typische Arylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Reste, die von Benzol, substituiertem Benzol, Naphthalin, Anthracen, Biphenyl und dergleichen abgeleitet sind.
  • "Aryldiyl" betrifft einen ungesättigten, cyclischen oder polycyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 6–20 Kohlenstoffatomen mit einem konjugierten Resonanz-Elektronensystem und mindestens zwei monovalenten Radikalzentren, abgeleitet durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von zwei verschiedenen Kohlenstoffatomen einer Stammarylverbindung.
  • "Substituiertes Alkyl", "substituiertes Alkyldiyl", "substituiertes Aryl" und "substituiertes Aryldiyl" betreffen Alkyl-, Alkyldiylreste, Aryl bzw. Aryldiylreste, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nichtbegrenzender Weise -X, -R, -O , -OR, -SR, -S , -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jede X-Gruppe unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, eine Alkyl-, Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heterocyclusgruppe und Verbindungsgruppe.
  • "Reaktive Verbindungsgruppe" betrifft eine chemisch reaktive Gruppe, z.B. ein Nukleophil oder Elektrophil, die fähig ist, sich mit einem anderen Molekül umzusetzen, um eine kovalente Bindung oder Verbindung auszubilden.
  • "Heterocyclus" betrifft ein Molekül mit einem Ringsystem, in dem ein oder mehrere Ringatome durch ein Heteroatom, z.B. Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatom, ersetzt wurden.
  • "Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-Substituent" betrifft einen monovalenten Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus, der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Atom des Ringsystems abgeleitet ist, um den Heterocyclus mit dem erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoff zu verbinden (Joule et al., Heterocyclic Chemistry, 3. Auflage, Stanley Thornes Publisher, Ltd., Cheltenham, U.K. (1998); Acheson R., An Introduction to the Chemistry of Heterocyclic Compounds, 2. Auflage, Interscience Publishers, Abteilung von John Wiley & Sons, New York (1967)). Verschiedene Beispiele für Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen sind in 11 dargestellt.
  • "Substrat" ist eine Einheit, an die erfindungsgemäße Farbstoffverbindungen gebunden werden. Substrate umfassen in nicht-begrenzender Weise ein (i) Polynukleotid, (ii) Nukleotid und Nukleotid, (iii) Peptid und Protein, (iv) Kohlenhydrat, (v) einen Ligand und (vi) ein jegliches Analogon der vorherstehenden (i) bis (v).
  • "Enzymatisch einbaubar" betrifft eine Eigenschaft eines Nukleotids, nach der es fähig ist, enzymatisch an den Terminus, z.B. 3', einer wachsenden Polynukleotidkette durch die Wirkung eines Polymerase-Enzyms eingebaut zu werden.
  • "Terminator" betrifft ein enzymatisch einbaubares Nukleotid, das nachfolgende Einbauten von Nukleotiden in die sich ergebende Polynukleotidkette verhindert und dadurch die Polymerase-Verlängerung stoppt. Typischen Terminatoren fehlt ein 3'-Hydroxylsubstituent und sie umfassen 2',3'-Didesoxyribose, 2',3'-Didehydroribose und 2',3'-Didesoxy-3'-halogenribose, z.B. 3'-Fluor. Alternativ kann ein Ribofuranose-Analogon wie Arabinose verwendet werden. Bespiele für Nukleotid-Terminatoren umfassen 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl, β-D-Arabinofuranosyl, 3'-Desoxy-β-D-arabinofuranosyl, 3'-Amino-2',3'-didesoxy-β-D-ribofuranosyl und 2',3'-Didesoxy-3'-fluor-β-D-ribofuranosyl (Chidgeavadze et al., (1984) Nucleic Acids Research 12:1671–1686 und Chidgeavadze et al., (1985) FEB. Lett. 183:275–278). Nukleotid-Terminatoren umfassen auch reversible Nukleotid-Terminatoren (Metzker et al., (1994) Nucleic Acids Research 22(20):4259).
  • "Enzymatisch erweiterbar" betrifft eine Eigenschaft eines Nukleotids, nach der es an den Terminus eines Polynukleotids enzymatisch einbaubar ist und das sich ergebende Polynukleotid nachfolgende Einbauten von Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga durchlaufen kann.
  • "Internukleotid-Analogon" betrifft ein Phosphatester-Analogon von Oligonukleotiden, die in nicht-begrenzender Weise Alkylphosphonate, Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphotriester, Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphoroamidate umfassen. Internukleotid-Analoga umfassen auch Nicht-Phosphat-Analoga, bei denen die Zucker/Phosphatgruppe durch Amidbindungen wie 2-Aminoethylglycin-Einheiten, die als PNA bezeichnet werden, ersetzt ist (Nielsen et al., (1991) "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymidine-substituted Polyamide", Science 254:1497–1500).
  • "Zielsequenz" betrifft ein Polynukleotid, eine DNA oder RNA, einzelsträngig oder doppelsträngig, das/die der Gegenstand einer Hybridisierung mit einem Primer oder einer Sonde, einer enzymatischen Aktivität oder einer Detektion ist.
  • "Spektral auflösbar" bedeutet bezüglich eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen, dass die Fluoreszenz-Emissionsbanden der entsprechenden Farbstoffe ausreichend getrennt, d.h. ausreichend nicht-überlappend, sind, so dass die Farbstoffe, entweder allein oder wenn sie mit anderen Verbindungen konjugiert (markiert) sind, voneinander auf der Basis ihrer Fluoreszenzsignale unter Verwendung von Standard-Fotodetektionssystemen, wie Fotodetektoren, die eine Reihe von Bandfiltern und Photomultipliern verwenden, ladungsgekoppelte Bauelemente (CCD), Spektrographen, usw., unterscheidbar sind (Wheeless et al., (1985) Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis, Seiten 21–76, Academic Press, New York). Vorzugsweise sind alle Farbstoffe, umfassend einen spektral auflösbaren Satz von Farbstoffen, durch eine einzige Strahlungsquelle anregbar.
  • "Mobilitäts-übereinstimmend" betrifft einen Satz von Fluoreszenzfarbstoffen, der, wenn er zur Markierung gleich langer Polynukleotide verwendet wird, verschieden markierte Polynukleotide mit im Wesentlichen ähnlichen elektrophoretischen Mobilitäten ergibt. Typischerweise werden die relativen elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden, die mit einem Satz von Mobilitäts-übereinstimmenden Farbstoffen markiert sind, um weniger als etwa ein halbes Nukleotid variieren. Vorzugsweise sind die Mobilitäts-übereinstimmenden Farbstoffe, wie vorstehend definiert, spektral auflösbar.
  • "Relative Fotostabilität" betrifft die chemische Stabilität von Fluoreszenzfarbstoffen relativ zu einem Referenzstandard, 5-Carboxyfluorescein, wie durch Aussetzen gegenüber weißer Strahlung hoher Intensität mit Probenmessung des verbleibenden Farbstoffs an dessen Absorptionsmaximum gemessen. Gleiche optische Dichteinheiten des Testfarbstoffs und der Referenz werden nebeneinander Strahlung als einem Korrelationstest für die Stabilität unter der Laserinduzierten Fluoreszenz ausgesetzt, die für automatisierte DNA-Sequenzierung- und Fragmentanalyse-Anwendungen üblich ist.
  • V.2 FARBSTOFFE
  • In einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung eine neue Klasse von Fluoresceinartigen Xanthenring-Verbindungen gemäß Struktur I:
    Figure 00130001
    die mit mindestens einem Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus substituiert ist, der an das Fluorescein-Ringsystem an R1, R2, R3, R4, R5 oder R7 gebunden ist. Der Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus kann an das Fluorescein-Ringsystem über eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder über eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung gebunden sein. Alle molekularen Strukturen, die überall in dieser Beschreibung bereitgestellt werden, sollen nicht nur die exakte dargestellte elektronische Struktur umfassen, sondern auch alle Resonanzstrukturen, Tautomere, Enantiomere, Diastereomere und Protonierungszustände davon umfassen.
    • R1, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R7 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R2, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
    • R3, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
    • R4, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R5 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R5, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R4 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R7, wenn für sich allein genommen, ist ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn mit R1 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe.
    • R6 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alken-, (C1-C6)-Alkin-, Cyan-, heterocyclischer Aromaten-, Phenyl- und substituierter Phenylgruppe mit der Struktur II:
      Figure 00150001
      worin X1, X2, X3, X4 und X5 für sich genommen ein H-, Cl-, F-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, CO2H-, SO3H-, CH2OH-Gruppe oder eine reaktive Verbindungsgruppe sind.
  • Besonders bevorzugte Farbstoffe gemäß Y umfassen diejenigen, in denen R4 mit R5 zusammen genommen einen kondensierten Ring, z.B, eine Benzogruppe, bildet. Ähnlich bevorzugt ist, wenn R1 zusammen genommen mit R7 einen kondensierten Ring, z.B. eine Benzogruppe, bildet.
  • Bevorzugte Farbstoffe umfassen diejenigen, in denen R1, R2, R3 und R4 jeweils für sich genommen eine Phenyl- und substituierte Phenyl-, Naphthyl-, substituierte Naphthylgruppe, ein Fluor-, Chloratom, eine 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 2-Chinolyl- oder 3-Chinolylgruppe sind. R5 und R7 sind vorzugsweise Wasserstoffatome.
  • Eine weitere Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß II umfasst diejenigen, in denen die substituierte Phenylgruppe die Struktur IIa aufweist:
  • Figure 00150002
  • Eine bevorzugte Ausführungsform von IIa ist diejenige, in der eine der X3- und X4-Gruppen eine reaktive Verbindungsgruppe ist und die andere ein Wasserstoffatom ist. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform von IIa ist diejenige, in der eine der X3- und X4-Gruppen eine Carboxylgruppe ist und die andere ein Wasserstoffatom ist.
  • Verschiedene Aspekte der vorstehend beschriebenen Erfindung ermöglichen einen oder mehrere der nachstehenden wichtigen Vorteile gegenüber bekannten Fluoreszenzfarbstoffverbindungen, die für eine mehrfache Fluoreszenzdetektion geeignet sind: (1) die Emissionsspektren der erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen können durch geringe Veränderungen bezüglich der Art und Position des Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus und/oder der Arylsubstituenten moduliert werden, was die Bildung von Farbstoffsätzen mit ähnlichen Absorptionseigenschaften, aber spektral auflösbaren Fluoreszenz-Emissionsspektren ermöglicht, (2) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen können leicht an Substrate ohne Beeinträchtigung ihrer positiven Fluoreszenzeigenschaften angefügt werden, (3) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen weisen enge Emissionsbandbreiten auf, d.h. die Emissionsbandbreite weist eine Halbwertsbreite (FWHM) der Emissionsintensität von weniger als etwa 45 nm auf, (4) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind in gepufferten wässrigen Lösungen hochgradig löslich, während sie eine hohe Quantenausbeute beibehalten, (5) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind relativ fotostabil und (6) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen weisen relativ hohe Extinktionskoeffizienten auf, d.h. höher als etwa 50000 (Benson et al., "Aromatic-substituted xanthene dyes", US-PS 6,008,379 , erteilt am 28. Dezember 1999). Enge Emissionsbandbreiten, wie sie beispielhaft durch den FWHM-Wert erläutert sind, sind wünschenswert zur Erleichterung der spektralen Auflösung in einem Gemisch von Substraten, die mit mehr als einem (einem Satz) Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Fotostabilität ist eine wichtige Eigenschaft, insofern Substrate, z.B. Polynukleotide, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind, intensiver Laserstrahlung ausgesetzt werden können, um Fluoreszenz für eine Detektion zu induzieren. Ein Fotoausbleichen oder andere chemische Abbaumechanismen vermindern oder verhindern eine Detektion von Substraten, die mit Farbstoffen mit einer geringeren als optimalen Fotostabilität markiert sind.
  • 11 zeigt eine repräsentative Auswahl von Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen, die als Substituenten an den erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen verwendet werden können. Diese Heterocyclussubstituenten weisen direkte Wirkungen auf wichtige spektrale Eigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen auf. Diese Wirkungen werden beispielhaft durch die spektralen Eigenschaften von erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen wie (i) Anregungs-, Emissions- und Absorptionsmaxima und -Spektren, (ii) Fotostabilität, (iii) Quantenausbeute und (iv) Energie-Transfer-Wirksamkeit erläutert.
  • Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen können einen 5- bis 6-gliedrigen Ring aufweisen, der ein oder mehrere Stickstoffatome in dem Ring enthält (11). Der 5- bis 6-gliedrige Ring kann an einen zweiten aromatischen Ring, z.B. einen Benzo- oder substituierten Benzoring, oder gesättigten Ring, z.B. einer Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppe, kondensiert sein. Der Heterocyclus kann andere Heteroatome, z.B. Sauerstoff- oder Schwefelatome, in dem Ringsystem enthalten.
  • Bevorzugte Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen umfassen in nichtbegrenzender Weise diejenigen in der 11 und 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 4-Pyridyl-, 2-Chinolyl-, 3-Chinolyl-, 4-Chinolyl-, 2-Imidazol-, 4-Imidazol-, 3-Pyrazol-, 4-Pyrazol-, Pyridazin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Cinnolin-, Phthalazin-, Chinazolin-, Chinoxalin-, 3-(1,2,4-N)-Triazolyl-, 5-(1,2,4-N)-Triazolyl-, 5-Tetrazolyl-, 4-(1-O, 3-N)-Oxazol-, 5-(1-O, 3-N)-Oxazol-, 4-(1-S, 3-N)-Thiazol-, 5-(1-S, 3-N)-Thiazol-, 2-Benzoxazol-, 2-Benzothiazol-, Benzotriazol-, 4-(1,2,3-N)-Benzotriazin- und Benzimidazolgruppe. Der Heterocyclus kann an das Xanthen-Ringsystem direkt über eine Bindung mit einem Kohlenstoffatom des heterocyclischen Rings gebunden sein. Alternativ kann der Heterocyclus an das Xanthen-Ringsystem über einen ungesättigten Linker gebunden sein, der die Delokalisierung der Aromatizität zwischen dem Heterocyclus und dem Xanthen-Ringsystem erweitert. Linker, die die erweiterte elektronische Delokalisierung erlauben, umfassen in nichtbegrenzender Weise: (i) olefinische, -CR=CR-, (ii) polyolefinische, -(CR=CR)n-, worin n 2 bis 10 beträgt, (iii) acetylenische, -C≡C-, (iv) polyacetylenische, -(C≡C)n-, worin n 2 bis 10 beträgt, (v) squarinische und (vi) andere cyclisch konjugierte Linker. R ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C1-C6)-Alkylgruppe, Halogen-, Fluor-, Chloratom, CN-, CF3-, Aryl- und substituierter Arylgruppe. Die Geometrie der olefinischen Verbindungen kann cis oder trans, E oder Z sein.
  • V.2A ENERGIETRANSFER-FARBSTOFFE
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Energietransfer-Farbstoffverbindungen, die die Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffverbindungen der Struktur I enthalten. Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Energietransfer-Farbstoffe einen Donor-Farbstoff, der Strahlung bei einer ersten Wellenlänge absorbiert und Anregungsenergie als Antwort emittiert, einen Akzeptor-Farbstoff, der fähig ist, die Anregungsenergie, die von dem Donor-Farbstoff emittiert wurde, zu absorbieren und bei einer zweiten Wellenlänge als Antwort zu fluoreszieren, und einen Linker, der den Donor-Farbstoff mit dem Akzeptor-Farbstoff verbindet, wobei der Linker wirksam ist, einen effizienten Energietransfer zwischen dem Donor- und Akzeptor-Farbstoff zu ermöglichen und eine hohe Emissions-Quantenausbeute des Akzeptor-Farbstoffs aufrechtzuerhalten (Lee et al., "Energy transfer dyes with enhanced fluorescence", US-PS 5,800,996 , erteilt am 1. September 1998; Lee et al., "Energy transfer dyes with enhanced fluorescence", US-PS 5,945,526 , erteilt am 31. August 1999; Mathies et al., "Fluorescent labels and their use in separations", US-PS 5,654,419 , erteilt am 5. August 1997). In dem erfindungsgemäßen Energietransfer-Farbstoff ist mindestens einer der Donor-Akzeptor-Farbstoffe ein Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierter Fluorescein-Farbstoff.
  • Energietransfer-Farbstoffe weisen Vorteile bei einer Verwendung in der gleichzeitigen Detektion von mehrfach markierten Substraten in einem Gemisch wie DNA-Sequenzierung auf. Ein einziger Donor-Farbstoff kann in einem Satz von Energietransfer-Farbstoffen verwendet werden, so dass jedes Farbstoffpaar eine starke Absorption bei einer gemeinsamen Wellenlänge aufweist. Durch Variieren des Akzeptor-Farbstoffs in dem Energietransfersatz können dann die Akzeptor-Farbstoffe durch ihre entsprechenden Emissionsmaxima spektral aufgelöst werden. Energietransfer-Farbstoffe stellen auch eine größere effektiven Stokes-Verschiebung als Nicht-Energietransfer-Farbstoffe bereit. Die Stokes-Verschiebung ist die Differenz zwischen dem Anregungsmaximum, die Wellenlänge, bei der der Donor-Farbstoff Strahlung maximal absorbiert, und dem Emissionsmaximum, die Wellenlänge, bei der der Akzeptor Strahlung maximal emittiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Linker zwischen dem Donor-Farbstoff und Akzeptor-Farbstoff eine funktionelle Gruppe, die dem Linker einen gewissen Grad an struktureller Starrheit verleiht, wie ein Alken, Dien, ein Alkin, ein 5- oder 6-gliedriger Ring mit mindestens einer ungesättigten Bindung oder eine kondensierte Ringstruktur. Der Donor-Farbstoff und der Akzeptor-Farbstoff des Energietransfer-Farbstoffs können über Linker gebunden sein, die die Strukturen:
    Figure 00190001
    aufweisen, worin n 1 oder 2 beträgt.
  • Die Anbindungsstelle des Linkers zwischen dem Donor-Farbstoff und dem Akzeptor-Farbstoff eines Energietransfer-Farbstoffs kann an einer jeglichen Position R1-R7 liegen, wobei einer von dem Donor-Farbstoff und dem Akzeptor-Farbstoff oder beide ein erfindungsgemäßer Farbstoff sind. Bevorzugte Anbindungsstellen umfassen R2, R3, X3 und X4.
  • Die Energietransfer-Farbstoffverbindung ist an ein Substrat über einen Linker kovalent gebunden. Dieser Linker kann eine Alkyldiyl- (C1-C12) oder Aryldiyl- (C6-C20) Gruppe sein und funktionelle Gruppen enthalten, einschließlich Amid-, Carbamat-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Phosphat-, Phosphorothioatgruppe und dergleichen. Bevorzugte Linker umfassen eine 1,2-Ethyldiyl- und 1,6-Hexyldiylgruppe. Die Anbindungsstellen des Linkers zwischen dem Energietransfer-Farbstoff und dem Substrat können an einer jeglichen Position R1-R7 auf dem Energietransfer-Farbstoff liegen, wobei einer von dem Donor-Farbstoff und dem Akzeptor-Farbstoff oder beide ein erfindungsgemäßer Farbstoff sind. Bevorzugte Anbindungsstellen umfassen R2, R3, X3 und X4. Wenn das Substrat ein Nukleosid oder Nukleotid ist, liegt eine bevorzugte Anbindungsstelle auf der Nukleobase. Wenn das Substrat ein Oligonukleotid ist, umfassen bevorzugte Anbindungsstellen die 3'- und 5'-Termini. Wenn das Substrat ein Peptid oder Protein ist, umfassen bevorzugte Anbindungsstellen die Amino- und Carboxyl-Termini.
  • V.3 SYNTHESEVERFAHREN
  • Mehrere Syntheseverfahren sind für die Synthese der erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffe verfügbar. Ein bevorzugtes Verfahren für eine Synthese von Zwischenprodukten erfolgt über die Palladium-katalysierte Suzuki-Boronat-Kopplungsreaktion, wobei eine Arylboronsäure mit einem Arylhalogenid gekoppelt wird, um ein Biarylprodukt mit Regioselektivität zu ergeben (Zhang et al., (1988) "Base and cation effects on the Suzuki cross-coupling of bulky arylboronic acid with halopyridines: synthesis of pyridylphenols", J. Org. Chem. 63:6886-90; Martin et al., (1993) "Palladium-catalyzed cross-coupling reactions of organoboronic acids with organic electrophiles", Acta Chemica Scan. 47:221-30; Aliprantis et al., (1994) "Observation of catalytic intermediates in the Suzuki reaction by electrospray mass spectrometry", J. Am. Chem. Soc. 116:6985-86; Thompson et al., (1984) "A general synthesis of 5-arylnicotinates", J. Org. Chem. 49:5237-43).
  • Das Cyclisierungssubstrat 5 wird in 1 synthetisiert. Die Suzuki-Reaktion wird wiederholt, zuerst durch Koppeln von 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure mit 2-Bromtoluol unter Tetrakis(triphenylphosphin)palladium-Katalyse, um die Biphenylverbindung 1 zu ergeben. Eine regioselektive Bromierung von 1 ergibt 2, gefolgt von einer Suzuki-Reaktion mit Pyridin-3-boronsäure unter Palladium-Katalyse, um 3 zu ergeben. Eine Demethylierung von 3 mit Bromwasserstoffsäure und Essigsäure ergab 4, gefolgt von einer Friedel-Crafts-Acylierung mit 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid, um 5 zu ergeben.
  • Die bromierte Naphthylverbindung 8 dient als ein gemeinsames Zwischenprodukt für die Synthese der cyclisierten Zwischenprodukte 11 und 12, was in 2 dargestellt ist. Ein Suzuki-Koppeln von Pyridin-3-boronsäure und Tol-2-ylboronsäure ergab 9 bzw. 10, die zu 11 und 12 demethylisiert wurden.
  • Eine Cyclisierung eines äquimolaren Gemisches der Zwischenprodukte 5 und 11 in Methansulfonsäure bei 100°C ergab eine 30%ige Ausbeute an Farbstoff 13 (3) nach Chromatographie (Beispiel 13). Ebenso wurde 14 durch Cyclisierung von 5 mit 12 gebildet (Beispiel 14). Farbstoff 15 (4) wurde durch Cyclisierung von 5 und 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin gebildet (Benson et al., "Asymmetric benzoxanthene dyes", US-PS 5,840,999 , erteilt am 24. November 1998). Der symmetrische Farbstoff 16 (4) wurde durch doppelte Cyclisierung von 2 Moläquivalenten 4 und einem Moläquivalent 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid synthetisiert (Beispiel 16).
  • Durch die gleichen Verfahren wurden die Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffe 19, 22 (5), 25 (6), 28 (7), 33 (8), 36 (9) und 41 (10) synthetisiert (Beispiele 17-41).
  • V.4 MARKIERUNGSREAGENZIEN DER FARBSTOFFE
  • Die Erfindung umfasst Markierungsreagenzien, worin Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoffe in einer reaktiven Form vorliegen, um sich mit Substraten umzusetzen. In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Substrate, die mit den erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen, d.h. Struktur I, markiert oder konjugiert sind. Substrate können nahezu ein jegliches Molekül oder eine jegliche Substanz sein, mit dem/die die erfindungsgemäßen Farbstoffe konjugiert werden können, einschließlich beispielsweise und nicht darauf begrenzt Proteine, Polypeptide, Polysaccharide, Nukleoside, Nukleotide, Polynukleotide, Lipide, Festträger, organische und anorganische Polymere und Kombination und Vereinigungen davon, wie Chromosomen, Zellkerne, lebende Zellen (z.B. Bakterien oder andere Mikroorganismen, Säugetierzellen, Gewebe, usw.) und dergleichen. Die Farbstoffe werden mit dem Substrat über einen optionalen Linker durch eine Vielzahl von Mitteln konjugiert, einschließlich hydrophobe Anziehung, ionische Anziehung und kovalente Bindung. Vorzugsweise sind die Farbstoffe mit dem Substrat über eine kovalente Bindung konjugiert.
  • Eine Markierung entsteht typischerweise durch Mischen eines geeigneten reaktiven Fluoreszenzfarbstoffs und eines zu konjugierenden Substrats in einem geeigneten Lösungsmittel, in dem beide löslich sind, unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren (Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643-71 (1996)), gefolgt von einer Trennung des Konjugats von jeglichen unkonjugierten Ausgangsmaterialien oder ungewollten Nebenprodukten. Das Farbstoffkonjugat kann für eine spätere Verwendung trocken oder in Lösung gelagert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffe können eine reaktive Verbindungsgruppe an einer der Substituentenpositionen R1-R5, R7, X1-X5 oder eine kovalente Bindung des Farbstoffs an ein anderes Molekül, d.h. ein Substrat, umfassen. Reaktive Verbindungsgruppen sind Gruppen auf dem Farbstoff und auf dem Substrat, die zur Ausbildung einer kovalente Bindung fähig sind. Typischerweise weist der Farbstoff (eine) elektrophile funktionelle Gruppe(n), die zur Umsetzung mit (einer) nukleophilen funktionellen Gruppe(n) auf dem Substrat fähig ist/sind. Beispiele für Substrat-Nukleophile umfassen Alkohole, Alkoxide, Amine, Hydroxylamine und Thiole. Die Auswahl der reaktiven Verbindungsgruppen, die verwendet werden, um den Farbstoff an das Substrat zu binden, hängt typischerweise von der komplementären Funktionalität auf dem zu konjugierenden Substrat ab. Beispiele für elektrophile reaktive Verbindungsgruppen umfassen Succinimidylester, Isothiocyanat, Sulfonylchlorid, Sulfonatester, Silylhalogenid, 2,6-Dichlortriazinyl, Pentafluorphenylester, Phosphoramidit, Maleinimid, Halogenacetyl, Epoxid, Alkylhalogenid, Allylhalogenid, Aldehyd, Keton, Acylazid, Anhydrid und Iodacetamid. Ein einziger Typ einer reaktiven Verbindungsgruppe kann auf dem Substrat verfügbar sein (typisch für Polysaccharide) oder eine Vielzahl von Gruppen kann auftreten (z.B. Amine, Thiole, Alkohole, Phenole), wie es für Proteine typisch ist. Ein konjugiertes Substrat kann an mehr als einen Farbstoff, der gleich oder verschieden sein kann, oder an ein Substrat konjugiert werden, das zusätzlich durch ein Hapten modifiziert ist. Obwohl eine gewisse Selektivität durch eine vorsichtige Steuerung der Reaktionsbedingungen erhalten werden kann, wird die beste Markierungsselektivität durch eine Auswahl eines geeigneten reaktiven Farbstoffs erhalten.
  • Eine bevorzugte reaktive Verbindungsgruppe ist ein N-Hydroxysuccinimidylester (NHS) eines Carboxylgruppensubstituenten des Fluorescein-Farbstoffs. Die NHS-Esterform des Farbstoffs ist ein bevorzugtes Markierungsreagenz. Der NHS-Ester des Farbstoffs kann vorher gebildet, isoliert, gereinigt und/oder charakterisiert werden oder er kann in situ gebildet und mit einer nukleophilen Gruppe eines Substrats, wie eines Oligonukleotids, eines Nukleotids, eines Peptids oder dergleichen, umgesetzt werden. Typischerweise wird die Carboxyl-Form der erfindungsgemäßen Farbstoffe, z.B. die Farbstoffverbindungen der Tabelle 1, mit einem Carbodiimidreagenz, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, oder einem Uroniumreagenz, z.B. HBTU (O-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'tetramethyluroniumhexafluorophosphat) oder HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat), und einem Aktivator, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und N-Hydroxysuccinimid, umgesetzt, um den NHS-Ester des Farbstoffs zu ergeben.
  • Bevorzugte Substituentenpositionen für NHS-Ester auf dem erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoff sind X3 und X4 (Ia). Ein repräsentatives Beispiel eines NHS-Esters ist die Struktur Ib:
  • Figure 00230001
  • Eine weitere bevorzugte reaktive Verbindungsgruppe ist eine Phosphoramid-Form der erfindungsgemäßen Farbstoffe. Phopshoramidit-Farbstoffreagenzien sind für die automatisierte Synthese von Oligonukleotiden besonders geeignet, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind. Oligonukleotide werden herkömmlich auf Festträgern durch das Phosphoramidit-Verfahren unter Verwendung von Phosphoramidit-Nukleosid-Reagenzien synthetisiert (Caruthers M. und Beaucage S., "Phosphoramidite compounds and processes", US-PS 4,415,732 , erteilt am 15. November 1983; Caruthers M. und Matteucci M., "Process for preparing polynucleotides", US-PS 4,458,066 , erteilt am 3. Juli 1984; Beaucage S. und Iyer R., (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311). Die Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien können nukleosidisch oder nichtnukleosidisch sein und können in geeigneter Weise zur Markierung von synthetischen Oligonukleotiden oder Polynukleotid-Analoga an deren 3'-Terminus, 5'-Terminus und/oder an einer oder mehreren inneren Positionen verwendet werden. Nicht-nukleosidische Formen der Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien weisen die allgemeine Struktur III
    Figure 00230002
    auf, worin DYE eine geschützte oder ungeschützte Form des Farbstoffs I ist, einschließlich eines Energietransfer-Farbstoffs. L ist ein Linker. R11 und R12, für sich genommen, sind Alkyl- (C1-C12), Alken-, Aryl- und Cycloalkylgruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder R11 und R12 zusammen genommen mit dem Stickstoffatom bilden einen gesättigten Stickstoffheterocyclus. R13 ist eine Phosphitester-Schutzgruppe, die eine unerwünschte Verlängerung des Oligonukleotids verhindert. Im Allgemeinen ist R13 stabil gegenüber Oligonukleotid-Synthesebedingungen, kann jedoch von einem synthetischen Oligonukleotidprodukt mit einem Reagenz entfernt werden, das die Integrität des Oligonukleotids oder des Farbstoffs nicht nachteilig beeinflusst. Eine Vielzahl von Phosphitestergruppen mit diesen Eigenschaften ist bekannt. Vorzugsweise ist R13 eine Methyl-, 2-Cyanethylgruppe, -CH2CH2CN, und 2-(4-Nitrophenyl)ethylgruppe, -CH2CH2(p-NO2Ph). Bevorzugte Ausführungsformen von Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien sind diejenigen, in denen: (i) R11 und R12 jeweils eine Isopropylgruppe sind, (ii) R11 und R12 zusammen genommen eine Morpholinogruppe sind, (iii) L eine Alkyl- (C1-C12) Gruppe ist, (iv) R13 eine 2-Cyanethylgruppe ist und (v) DYE an R6 über einen Linker gebunden ist. Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien III bewirken ein Markieren eines Substrats mit einem einzelnen erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoff. Wenn das Substrat ein Oligonukleotid ist, wird der Farbstoff an den 5'-Terminus des Oligonukleotids als eine Folge der 3'- zu 5'-Richtung der Synthese gebunden sein. Andere Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien, nukleosidische und nicht-nukleosidische, ermöglichen ein Markieren an anderen Stellen eines Oligonukleotids, z.B. 3'-Terminus, Nukleobase, Internukleotidverbindung, Zucker. Ein Markieren an der Nukleobase, Internukleotidverbindung und den Zuckerstellen ermöglicht ein internes und mehrfaches Markieren mit Fluoreszenzfarbstoffen.
  • Bei Umsetzung mit einer Hydroxylgruppe, z.B. einer 5'-terminalen OH-Gruppe eines an einem Festträger gebundenen Oligonukleotids, unter milder Säure-Aktivierung reagiert das Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenz III, um eine Internukleotid-Phosphitgruppe zu bilden, die sodann zu einer Internukleotid-Phosphatgruppe oxidiert wird. In einigen Fällen kann der Farbstoff funktionelle Gruppen enthalten, z.B. phenolische Sauerstoffe wie in Struktur I, die ein Schützen entweder während der Synthese des Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzes oder während seiner nachfolgenden Verwendung zur Markierung von Molekülen wie Oligonukleotiden benötigen. Die verwendete(n) Schutzgruppe(n) wird/werden von der Art der funktionellen Gruppen abhängen und werden dem Fachmann ersichtlich sein (Greene T. und Wuts P., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, 1991). Im Allgemeinen sollten die verwendeten Schutzgruppen unter den sauren Bedingungen (z.B. Trichloressigsäure, Dichloressigsäure), die herkömmlicherweise in einer Oligonukleotidsynthese verwendet werden, um 5'-Hydroxyl-Schutzgruppen (z.B. Dimethoxytritylgruppe) zu entfernen, stabil sein und unter den basischen Bedingungen (Ammoniumhydroxid, wässriges Ethylamin), die zum Deprotonieren und/oder Abspalten synthetischer Oligonukleotide von Festträgern verwendet werden, labil sein.
  • Stabile Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien können durch anfängliches Schützen der Xanthenring-Sauerstoffe der Struktur I gebildet werden, typischerweise durch Veresterung, z.B. Acylierung als Pivalat- (R=tBu) oder Benzoat- (R=Ph) Ester. Eine Veresterung bewirkt eine Lactonisierung der Strukturen Ia, was das Reagenz in den nicht-fluoreszierenden, geschützten Zustand, z.B. Struktur Ic, bringt:
  • Figure 00250001
  • Wenn eine der X3- und X4-Gruppen ein Wasserstoffatom ist und die andere eine Carboxylgruppe ist, kann der Farbstoff in ein nicht-nukleosidisches Phosphoramidit-Farbstoff-Markierungs-Reagenz, z.B. Id, durch bekannte Reaktionen umgewandelt werden, wie eine Aktivierung der Carboxylgruppe, Amidierung mit 6-Amino-1-hexanol und Phosphitylierung von Hydroxylgruppen mit Bis(diisopropylamino)cyanethylphosphit (Theisen et al., (1992) "Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides", in Nucleic Acid Symposium Series Nr. 27, Oxford University Press, Oxford, Seiten 99–100).
  • Figure 00260001
  • Erfindungsgemäße Farbstoffe können auch kovalent an Festträger für die automatisierte Synthese von Oligonukleotiden gebunden werden (Mullah B, und Andrus A., "Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labelled polynucleotides", US-PS 5,736,626 , erteilt am 7. April 1998; Caruthers M. und Matteucci M., "Process for preparing polynucleotides", US-PS 4,458,066 , erteilt am 3. Juli 1984). In einer Ausführungsform ist der Farbstoff an einen Linker gebunden, der eine Anbindung an einen Festträger, z.B. kontrolliertes Porenglas (Nelson et al., (1992) "Oligonucleotide labeling methods 3. Direct Labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone", Nucl. Acids Res. 20:6253-59; Nelson P., "Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis", US-PS 5,141,813 , erteilt am 25. August 1992) oder Polystyrol (Andrus et al., "Automated system for polynucleotide synthesis and purification", US-PS 5,047,524 , erteilt am 10. September 1991 und US-PS 5,262,530, erteilt am 16. November 1993), und eine säurelabile Funktionalität für eine Verlängerung mit Phosphoramidit-Nukleosid-Reagenzien aufweist. Nach Abspaltung und Entschützen kann das markierte Oligonukleotid einen erfindungsgemäßen Farbstoff an dem 3'-Terminus tragen.
  • V.4A NUKLEOTID-MARKIERUNG
  • Eine bevorzugte Klasse von markierten Substraten umfasst Konjugate von Nukleosiden und Nukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Derartig markierte Nukleoside und Nukleotide sind zum Markieren von Polynukleotiden, die durch enzymatische Synthese gebildet werden, besonders geeignet, z.B. markierte Nukleotid 5'-triphosphate, die im Zu sammenhang mit PCR-Amplifikation, Polynukleotid-Sequenzierung des Sanger-Typs und Nick-Translationsreaktionen verwendet werden.
  • Der Farbstoff kann entweder an den Zucker oder die Nukleobase konjugiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung ein terminierendes Ribonukleosid-5'-triphosphat, ein "Terminator", worin der Farbstoff kovalent an die Nukleobasen-Gruppe gebunden ist. Solche Terminatoren können, wenn sie zusammen mit 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphaten, "dNTP", oder Ribonukleosid-5'-triphosphaten, "NTP", geeigneten Polymerase-Enzymen und mit einem Primer versehenden Ziel-Polynukleotiden verwendet werden, verwendet werden, um eine Reihe von terminierten Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoff-markierten Polynukleotid-Fragmenten über Ziel-vermittelte enzymatische Synthese für Anwendungen wie DNA-Sequenzierung zu erzeugen. Nukleoside und Nukleotide können an Stellen auf den Zucker- oder Nukleobasen-Gruppen markiert werden. Bevorzugte Nukleobasen-Markierungsstellen umfassen das 8-C-Atom einer Purin-Nukleobase, das 7-C- oder 8-C-Atom einer 7-Deazapurin-Nukleobase und die 5-Position einer Pyrimidin-Nukleobase. Zwischen einem Nukleosid oder Nukleotid und einem Farbstoff kann ein Linker an den Farbstoff an einer jeglichen Position R1 bis R7 gebunden sein.
  • Die markierten Nukleoside oder Nukleotide können enzymatisch einbaubar und enzymatisch erweiterbar sein. Nukleoside oder Nukleotide, die mit erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind, können die Struktur IV:
    Figure 00270001
    aufweisen, worin DYE eine geschützte oder ungeschützte Form des Farbstoffs I ist, einschließlich eines Energietransfer-Farbstoffs. B ist eine Nukleobase, z.B. Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin. R8 ist H, ein Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Thiophosphat oder Phosphat-Analogon. R9 und R10, wenn für sich genommen, sind jeweils unabhängig H, HO, F. Wenn das markierte Nukleosid oder Nukleotid ein Terminator ist, werden R9 und R10 ausgewählt, um die Polymerase-vermittelte Ziel-gerichtete Polymerisation zu blockieren. In Terminator-Nukleotiden sind R9 und R10, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig H, F und eine Gruppe, die eine Polymerasevermittelte Ziel-gerichtete Polymerisation blockiert, oder, wenn sie zusammen genommen werden, bilden sie 2'-3'-Didehydroribose.
  • Der Linker L kann:
    Figure 00280001
    sein, worin n den Wert 0, 1 oder 2 aufweist.
  • V.4B OLIGONUKLEOTID-MARKIERUNG
  • Eine weitere bevorzugte Klasse von markierten Substraten umfasst Konjugate von Oligonukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen markiert sind. Derart markierte Polynukleotide oder Analoga sind in einer Vielzahl von wichtigen Zusammenhängen verwendbar, einschließlich als DNA-Sequenzierungsprimer, PCR-Primer, Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, Oligonukleotid-Ligationssonden, doppelmarkierte 5'-Exonuklease- (TaqManTM)- Sonden und dergleichen (Fung et al., "Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof", US-PS 4,757,141 , erteilt am 12. Juli 1988; Andrus A., "Chemical methods of 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54; Hermanson, (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643-71). Ein markiertes Oligonukleotid kann die Struktur V:
    Figure 00280002
    aufweisen, wobei das Oligonukleotid 2 bis 100 Nukleotide umfasst. DYE ist ein Fluoreszenzfarbstoff I, einschließlich eines Energietransfer-Farbstoffs. B ist eine Nukleobase, z.B. Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin. L ist ein Linker. R10 ist H, OH, ein Halogenid, Azid, Amin, Alkylamin, eine Alkyl- (C1-C6), Allyl-, Alkoxy- (C1-C6), OCH3- oder OCHaCH=CH2-Gruppe. R15 ist H, ein Phosphat, Internukleotid-Phosphordiester oder Internukleotid-Analogon. R16 ist H, ein Phosphat, Internukleotid-Phosphordiester oder Internukleotid-Analogon. In dieser Ausführungsform, Struktur V, kann das Nukleobase-markierte Oligonukleotid mehrere erfindungsgemäße Farbstoffe tragen, die über die Nukleobasen gebunden sind.
  • Das Nukleobase-markierte Oligonukleotid V kann gebildet werden durch: (i) enzymatischen Einbau von enzymatischen einbaubaren Nukleotid-Reagenzien IV, wobei R8 ein Triphosphat ist, durch eine DNA-Polymerase oder Ligase und (ii) Koppeln von Phoshoramidit-Farbstoff-Nukleosidreagenzien VI durch automatisierte Synthese.
  • Im Allgemeinen wird, wenn das markierte Oligonukleotid durch enzymatische Synthese hergestellt wird, das nachstehende Verfahren verwendet. Eine Ziel-DNA wird denaturiert und ein Oligonukleotidprimer wird an die Ziel-DNA angelagert. Ein Gemisch von enzymatisch einbaubaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die zur Unterstützung einer kontinuierlichen Ziel-gerichteten enzymatischen Verlängerung des mit einem am Ziel angelagerten Primers (z.B. ein Gemisch, umfassend dGTP, dATP, dCTP und dTTP oder dUTP) fähig sind, wird zu dem mit einem am Ziel angelagerten Primer gegeben. Mindestens eine Fraktion der Nukleotide ist mit einem Farbstoff I markiert oder sind markierte Terminatoren, wie zuvor beschrieben. Als nächstes wird ein Polymerase-Enzym zu dem Gemisch unter solchen Bedingungen gegeben, unter denen das Polymerase-Enzym aktiv ist. Ein markiertes Oligonukleotid wird durch den Einbau der markierten Nukleotide oder Terminatoren während der Polymerase-vermittelten Strangsynthese gebildet.
  • In einem alternativen enzymatischen Syntheseverfahren werden zwei Primer anstelle von einem verwendet: einer, der komplementär zum (+)-Strang der Zielsequenz ist, und ein anderer, der komplementär zum (-)-Strang der Zielsequenz ist, die Polymerase ist eine thermostabile Polymerase und die Reaktionstemperatur wird zwischen einer Denaturierungstemperatur und einer Verlängerungstemperatur cyclisiert, wodurch ein markiertes Gegenstück zu der Zielsequenz durch PCR exponentiell amplifiziert wird (Innis et al., (1990) PCR Protocols, Hrsg., Academic Press). Ein oder beide Primer können mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert sein. Alternativ kann ein oder mehrere der Nukleotid-5'-triphosphate mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert sein. Jedes Markierungsschema führt zu einem DNA-Amplifikationsprodukt, das einen oder mehrere erfindungsgemäße Farbstoffe trägt.
  • Internes Markieren von Oligonukleotiden mit erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoffen kann mit Nukleosid-Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien der allgemeinen Struktur VI:
    Figure 00300001
    erfolgen, worin DYE eine geschützte oder ungeschützte Form von Farbstoff I ist. Die exocyclischen Amine und andere Funktionalitäten der Nukleobase B können ein Schützen während der Synthese des Nukleosid-Phoshporamidit-Farbstoff-Reagenzes und/oder während seiner nachfolgenden Verwendung, um markierte Oligonukleotide zu synthetisieren, erfordern. Die ausgewählte(n) bestimmte(n) Schutzgruppe(n) wird/werden von der Art der Nukleobase oder des Nukleobasen-Analogons abhängen und wird/werden für den Fachmann ersichtlich sein. Beispielsweise können die exocyclischen Amine von Adenin und Cytosin mit einer Benzoylgruppe (bz) geschützt werden und das exocyclische Amin von Guanin kann mit Dimethylformamid (dmf) oder einer Isobutyrylgruppe (ibu) unter Verwendung bekannter Verfahren geschützt werden. Vorzugsweise wird die Nukleobase mit Gruppen geschützt, die leicht unter milden basischen Bedingungen entfernt werden können. Beispielsweise können Oligonukleotide, die mit dAbz-, dCbz-, dGdmf- und T-Phosphoramidit-Nukleosiden (und deren entsprechenden 3'-Nukleosid-Festträgern) synthetisiert wurden, in 60 Minuten in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 65°C gespalten und entschützt werden (Beaucage S. und Iyer R., (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311).
  • R11 und R12 für sich genommen werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- (C1-C6), Alken-, Aryl- und Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, z.B. Isopropylgruppe, oder R11 und R12 zusammen genommen mit dem Stickstoffatom bilden einen gesättigten Stickstoffheterocyclus, z.B. eine Morpholinogruppe. R13 ist eine Phosphitester-Schutzgruppe, z.B. eine Methyl-, 2-Cyanethyl- und 2-(4-Nitrophenyl)ethylgruppe. R14 ist eine säurespaltbare Hydroxyl- Schutzgruppe, z.B. eine Dimethoxytritylgruppe, die eine anschließende Monomer-Kopplung ermöglicht.
  • Der Linker L von VI kann
  • Figure 00310001
  • Reagenzien IV und VI sind bei der Herstellung von Oligonukleotiden V, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen I markiert sind, wirksam. Eine weitere Ausführungsform eines markierten Oligonukleotids am 5'-Terminus gemäß der Struktur VII:
    Figure 00310002
    markiert, worin X O, NH oder S ist, L eine Alkyldiyl- (C1-C12) Gruppe oder ein Mobilitäts-Modifizierungsmittel ist und das markierte Oligonukleotid nur eine DYE-Gruppe enthält. Mobilitäts-Modifizierungsmittel-Linker beeinflussen die elektrophoretische Mobilität oder hydrophoben Eigenschaften des Oligonukleotids. Beispiele für Mobilitäts-Modifizierungsmittel-Linker umfassen Ethylenoxy-Einheiten, -(CH2CH2O)n-, worin n 1 bis 100 sein kann (Grossman et al., "Method of DNA sequencing employing a mixed DNA-polymer chain probe", US-PS 5,624,800 , erteilt am 29. April 1997). Vorzugsweise weist n einen Wert von 2 bis 20 auf. Markierte Oligonukleotide VII können durch automatisierte Synthese mit Phosphoramidit-Reagenzien III, insbesondere für Beispiel Id, gebildet wer den. Alternativ können markierte Oligonukleotide VII bei der Umsetzung einer reaktiven Verbindungsgruppen-Form eines erfindungsgemäßen Farbstoffs, z.B. Ib, mit einem 5'-Aminoalkyl-Oligonukleotid gebildet werden.
  • In einem bevorzugten chemischen Nachsynthesemarkierungsverfahren wird ein Oligonukleotid wie folgt markiert. Ein Farbstoff gemäß Struktur Ib wird in DMSO gelöst oder suspendiert und im Überschuss (10-20x) zu einem 5'-Aminohexyl-Oligonukleotid in 0,25 M Bicarbonat/Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von etwa 9 gegeben und eine Umsetzung für 6 Stunden wird ermöglicht, z.B. US-PS 4,757,141 . Das farbstoffmarkierte Oligonukleotid VII kann von nichtumgesetztem Farbstoff mittels eines Durchlaufs durch eine Größenausschluss-Chromatographiesäule getrennt werden, wobei mit Puffer, z.B. 0,1 molares Triethylaminacetat (TEAA), eluiert wird. Die Fraktion mit dem unbehandelten markierten Oligonukleotid VII, worin L -(CH2)6- ist, wird durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Gradientenelution weiter gereinigt.
  • V.5 KITS
  • Die Erfindung umfasst Kits, die die erfindungsgemäßen Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffe und/oder deren markierte Konjugate umfassen. In einer Ausführungsform sind die Kits für die Konjugation der erfindungsgemäßen Farbstoffe an andere Moleküle, d.h. Substrate, geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen einen erfindungsgemäßen Farbstoff, einschließlich einer optionalen Verbindungsgruppe, und Reagenzien, Enzyme, Puffer, Lösungsmittel, usw., die für eine Konjugation des Farbstoffs an ein anderes Molekül oder eine andere Substanz geeignet sind.
  • In einer Ausführungsform sind die Kits zur Markierung von enzymatisch synthetisierten Oligonukleotiden und Polynukleotiden mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen ein markiertes enzymatisch einbaubares, erfindungsgemäßes Nukleotid oder Nukleotid-Analogon, ein Gemisch von enzymatisch einbaubaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die zur Unterstützung einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, und ein Polymerase-Enzym. Vorzugsweise ist das markierte enzymatisch einbaubare Nukleotid oder Nukleotid-Analogon eine Verbindung gemäß der Struktur IV, am meisten bevorzugt ein markierter Terminator. Bevorzugte Polymer asen sind thermostabil wie AMPLITAQ®-DNA-Polymerase FA (PE Biosystems, Foster City, CA).
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die Kits zur Markierung von synthetischen Oligonukleotiden mit den erfindungsgemäßen Phosphoroamidit-Farbstoffreagenzien geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen ein Phosphoramidit-Farbstoffreagenz, andere Synthesereagenzien und/oder Festträger, gegebenenfalls zur Durchführung einer Oligonukleotidsynthese (Andrus et al., "Automated system for polynucleotide synthesis and purification", US-PS 5,262,530 , erteilt am 16. November 1993).
  • V.6 VERFAHREN ZUR VERWENDUNG MARKIERTER REAGENZIEN
  • Die erfindungsgemäßen Farbstoffe und Reagenzien sind für ein jegliches Verfahren gut geeignet, das Fluoreszenzdetektion verwendet, insbesondere Verfahren, die die gleichzeitige Detektion von vielen räumlich-überlappenden Analyten benötigen (Menchen et al., "4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes", US-PS 5,188,934, erteilt am 23. Februar 1993). Erfindungsgemäße Farbstoffe und Reagenzien sind zur Identifizierung von Klassen von Polynukleotiden gut geeignet, die einem biochemischen Trennungsverfahren wie Elektrophorese unterzogen wurden oder die über Positionen in einer räumlich adressierbaren Hybridisierungsanordnung verteilt worden sind.
  • Diese Anwendungen umfassen eine Verwendung der markierten Oligonukleotide als 5'-markierte Sequenzierungsprimer, 5'-markierte Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Primer, Hybridisierungssonden und Ligations-Assay-Sonden. PCR-Anwendungen umfassen die Verwendung von markierten Oligonukleotiden für eine Genotypisierung durch Verfahren mit Tandemwiederholung mit variabler Anzahl (VNTR), kurzer Tandemwiederholung (STR) und Mikrosatellitenverfahren zur Amplifikation von Wiederholungsabschnitten von doppelsträngiger DNA, die benachbarte mehrfache Kopien einer bestimmten Sequenz enthält, wobei die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten variabel ist. Vorzugsweise ist in solchen PCR-Genotypisierungsverfahren der PCR-Primer mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffe in quantitativen Verfahren und Reagenzien verwen det werden, die Echtzeit- oder Endpunktsmessungen von Amplifikationsprodukten während der PCR bereitstellen (Gelfand et al., "Homogenous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase", US-PS 5,210,015 , erteilt am 9. Mai 1993; Livak et al., "Method for Detecting Nucleic Acid Amplification Using Self-Quenching Fluorescence Probe", US-PS 5,538,848 , erteilt am 23. Juli 1996). Der Exonuklease-Assay (Tagman®), der Fluoreszenzfarbstoff-Löscher-Sonden einsetzt (Livak et al., "Self-quenching fluorescence probe", US-PS 5,723,591 , erteilt am 3. März 1998; Mullah et al., (1998) "Efficient synthesis of double dye-labelled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay", Nucl. Acids Res. 26:1026-1031), ergibt eine direkte Detektion von Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Produkten in einem geschlossenen Gefäßsystem ohne Probenverarbeitung über diejenige hinaus, die für die Durchführung der PCR benötigt wird. In dem Tagman-Assay setzt die Polymerase, die eine Primer-Verlängerung durchführt und das Polynukleotid amplifiziert, auch eine Sonde, die an die Zielsequenz angelagert ist, frei und spaltet diese Sonde durch 5'- zu 3'-Exonuklease-Aktivität. In einem Tagman-artigen Assay ist die Sonde selbstlöschend, mit einem Fluoreszenzfarbstoff und Löscher-Gruppen markiert, wobei einer von beiden ein erfindungsgemäßer Farbstoff sein kann. Eine spektrale Überlappung ermöglicht einen effizienten Energietransfer (FRET), wenn die Sonde intakt ist (Clegg R., (1992) "Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids", Meth. Enzymol. 211:353-388). Die Sonde wird, wenn sie an eine Zielsequenz hybridisiert, während der PCR abgespalten, um ein Fluoreszenzsignal freizusetzen, das zu der Menge des vorhandenen Ziel-Sonden-Hybrids proportional ist (Livak et al., "Method for Detecting Nucleic Acid Amplification Using Self-Quenching Fluorescence Probe", US-PS 5,538,848 , erteilt am 23. Juli 1996; Livak et al., "Self-quenching fluorescence probe", US-PS 5,723,591 , erteilt am 3. März 1998).
  • In einem noch weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffe bereitgestellt, um ein Ziel-Polynukleotid zu sequenzieren. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen die Bildung einer Reihe von Polynukleotiden unterschiedlicher Größe, die mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert sind, eine Größen-basierende Trennung der Reihe von markierten Polynukleotiden unterschiedlicher Größe und eine Detektion der getrennten markierten Polynukleotide, basierend auf der Fluoreszenz des Farbstoffs.
  • Die Reihe von markierten Polynukleotiden unterschiedlicher Größe kann herkömmlich durch enzymatische Verlängerung einer Primerzielsequenz gemäß bekannten Methoden hergestellt werden (Sanger et al., (1977) "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467; Hunkapiller et al., "Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing", US-PS 4,811,218 , erteilt am 7. März 1989; PE Corp., Januar 1995, ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, Kapitel 2 (P/N 903433, PE Coprporation, Foster City, CA)). Zum Beispiel kann die Reihe von markierten Polynukleotiden dadurch erhalten werden, dass ein markierter Primer verwendet und eine Zielsequenz, an der das markierte Ziel angelagert ist, in der Gegenwart einer Polymerase, dNTP und mindestens eines Terminators (z.B. 2',3'-Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphat) enzymatisch verlängert wird. Alternativ kann die Reihe von markierten Polynukleotiden dadurch erhalten werden, dass ein unmarkiertes Ziel, an das ein Primer angelagert ist, in der Gegenwart einer Polymerase, dNTP und mindestens eines markierten Terminators enzymatisch verlängert wird (Bergot et al., "Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination", US-PS 5,366,860 , erteilt am 22. November 1994). In beiden Ausführungsformen dient die Polymerase zur Verlängerung des Primers mit dNTP, bis ein Terminator eingebaut wird, der die Verlängerungsreaktion stoppt. Einmal abgestoppt wird die Reihe von markierten Polynukleotiden basierend auf der Größe getrennt und die getrennten Polynukleotide werden detektiert, basierend auf der Fluoreszenz der Farbstoffmarkierungen.
  • In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens werden vier unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Terminatoren verwendet, wobei jedes Nukleosid mit einem unterschiedlichen spektral auflösbaren Fluorophor markiert ist und mindestens eines der Fluorophore ein erfindungsgemäßer Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierter Fluorescein-Farbstoff ist, so dass der Satz von Fluorophoren „Mobilitäts-übereinstimmend" ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird die mit einem Primer versehene Zielsequenz enzymatisch in der Gegenwart einer Polymerase, dNTP und der vier unterschiedlichen fluoreszenzmarkierten Terminatoren verlängert. Nach einer auf Größe basierenden Trennung wird eine Reihe von getrennten markierten Polynukleotiden erhalten, in der die Emissionseigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs die Identität des 3'-terminalen Nukleotids zeigen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind alle Fluoreszenzfarbstoffe des Mobilitäts-übereinstimmendes Satzes unter Verwendung einer einzigen Strahlungsquelle anregbar.
  • In einer bevorzugten Kategorie von Verfahren, die hierin als "Fragmentanalyse"- oder "genetische Analyse"-Verfahren bezeichnet werden, werden markierte Polynukleotidsequenzen oder "Fragmente" durch Ziel-gerichtete enzymatische Synthese unter Verwendung von markierten Primern oder Nukleotiden, z.B. durch Ligation oder Polymerase-gerichtete Primer-Verlängerung, erzeugt. Die Fragmente werden einem Größe-abhängigen Trennungsverfahren, z.B. Elektrophorese oder Chromatographie, unterzogen und die getrennten Fragmente werden nach der Trennung, z.B. durch Laser-induzierte Fluoreszenz, detektiert (Hunkapiller et al., "Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing", US-PS 4,811,218 , erteilt am 7. März 1989). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Klassen von Polynukleotiden gleichzeitig getrennt und die verschiedenen Klassen werden durch spektral auflösbare Markierungen unterschieden.
  • In einem besonders bevorzugten Fragmentanalyseverfahren werden Fragmente, die mit erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind, durch die relative Größe identifiziert. Eine Übereinstimmung zwischen Fragmentgröße und Sequenz wird durch einen Einbau der vier möglichen terminierenden Basen ("Terminatoren") und den Mitgliedern eines Satzes von spektral auflösbaren Farbstoffen festgestellt. Solche Sätze werden leicht aus den erfindungsgemäßen Farbstoffen durch Messung von Emissions- und Absorptionsbandbreiten mit käuflich erhältlichen Spektrophotometern zusammengestellt. Vorzugsweise werden Kettenterminierungsverfahren der DNA-Sequenzierung, d.h. Didesoxy-DNA-Sequenzierung, oder Sequenzierung des Sanger-Typs und Fragmentanalyse verwendet. Jeder der Terminatoren trägt einen unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff und zusammen tragen die Terminatoren des Experiments einen Satz von Farbstoffen, einschließlich eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Farbstoffe.
  • Spektral auflösbare erfindungsgemäße Fluoreszenzfarbstoffe sind auch in genotypisierenden Experimenten nach der PCR-Amplifikation des Ziels verwendbar. Insbesondere kann ein Satz von Oligonukleotideprimern, die an dem 5'-Terminus mit jeweils unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, mehrfache Loci amplifizieren und unterschiedliche Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) unterscheiden. Eine elektrophoretische Trennung der farbstoffmarkierten Amplifikationsprodukte mit Größenstandards erzeugt ein Profil oder einen charakteristischen Datensatz, der einen bestimmten Genotyp, abhängig von dem Satz von Primersequenzen, anzeigt.
  • Das kovalente Verbinden von Polynukleotidsonden durch Ligase-Enzyme ist eines der nützlichsten Werkzeuge, die den Molekularbiologen zur Verfügung stehen. Wenn sich zwei Sonden an eine Zielsequenz angelagert haben, wobei die zwei Sonden aneinander liegen und keine dazwischen liegenden Lücken auftreten, kann eine Phosphordiesterbindung zwischen einem 5'-Terminus der einen Sonde und dem 3'-Terminus der anderen Sonde durch ein Ligase-Enzym gebildet werden (Whiteley et al., "Detection of specific sequences in nucleic acids", US-PS 4,883,750 , erteilt 1989; Landegren et al., (1988) "A ligase mediated gene detection technique", Science 241:1077-80; Nickerson et al., (1990) "Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide assay", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:8923-27). Oligonukleotid-Ligations-Assays detektieren das Vorhandensein von spezifischen Sequenzen in einer Zielprobe. Wenn eine oder beide Sonden mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert sind, kann das Ligationsprodukt durch Fluoreszenz detektiert werden (Grossman et al., (1994) "High-density multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence-coded separation", Nucl. Acids Res. 22:4527-34).
  • Eine Sequenzierung des Sanger-Typs beinhaltet die Synthese eines DNA-Strangs durch eine DNA-Polymerase in vitro unter Verwendung einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Ziel-DNA, deren Sequenz zu bestimmten ist. Eine Synthese wird an einer definierten Stelle gestartet, basierend darauf, wo ein Oligonukleotidprimer sich an das Ziel anlagert. Die Synthesereaktion wird durch den Einbau eines Nukleotid-Analogons beendet, das die kontinuierliche DNA-Verlängerung nicht unterstützt. Beispielhafte kettenterminierende Nukleotid-Analoga umfassen die 2',3'-Didesoxynukleosid-5'-triphosphate (ddNTP), denen die 3'-OH-Gruppe fehlt, die für die 3'- zu 5'-DNA-Kettenverlängerung notwendig ist. Wenn geeignete Anteile an dNTP (2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphate) und eines der vier ddNTPs verwendet werden, wird eine Enzym-katalysierte Polymerisation in einem Teil der Kettenpopulation an einer jeglichen Stelle beendet, an der das ddNTP eingebaut wird. Wenn fluoreszenzfarbstoffmarkierte Primer oder markiertes ddNTP für jede Reaktion verwendet werden, kann die Sequenzinformation durch Fluoreszenz nach Trennung durch hochauflösende Elektrophorese detektiert werden. In dem Kettenterminationsverfahren können erfindungsgemäße Farbstoffe entweder an Sequenzierungsprimern oder an Didesoxynukleotiden gebunden sein. Farbstoffe können an eine komplementäre Funktionalität an dem 5'-Terminus des Primers (Fung et al., "Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof', US-PS 4,757,141 , erteilt am 12. Juli 1998), an der Nukleobase eines Primers oder an der Nukleobase eines Didesoxynukleotids, z.B. über Alkinylamino-Verbindungsgruppen (Khan et al., "Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same", US-PS 5,770,716 , erteilt am 23. Juni 1998 und US-PS 5,821,356 , erteilt am 13. Oktober 1998; Hobbs F. und Trainor G., "Alkynylamino-nucleotides", US-PS 5,151,507 , erteilt am 29. September 1992), gebunden sein.
  • Ein typischer Sequenzierungstest ist in 16 veranschaulicht, worin ein 3'-Fluor-Terminator mit der Farbstoffverbindung 13 über einen Propargylethoxyamido-Linker (EO) : 3'FddGTP-EO-13 markiert ist:
    Figure 00380001
  • In den vorstehenden Fragmentanalyseverfahren werden markierte Polynukleotide durch chromatographische, Affinitäts- oder elektrophoretische Verfahren getrennt. Vorzugsweise ist die Trennung Elektrophorese (Rickwood und Hames, Hrsg., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach, IRL Press Limited, London, 1981). Die bevorzugte Art von elektrophoretischer Matrix ist quervernetztes oder unvernetztes Polyacrylamid oder anderes Amid-enthaltendes Polymer mit einer Konzentration (Gewicht zu Volumen) von etwa 2-20 Gew.-% (Madabhushi et al., "Polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis", US-PS 5,552,028 , erteilt am 3. September 1996). Die elektro phoretische Matrix kann als ein Plattengel oder im Kapillarformat konfiguriert sein (Mathies et al., "Capillary array confocal fluorescence scanner and method", US-PS 5,274,240 , erteilt am 28. Dezember 1993). Bevorzugter beträgt die Polyacrylamidkonzentration etwa 4–8%. Vorzugsweise und insbesondere im Zusammenhang mit der DNA-Sequenzierung umfasst die elektrophoretische Matrix ein Denaturierungsmittel, z.B. Harnstoff, Formamid und dergleichen (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 179–185 (1982); PE Corp., ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, Kapitel 2 (P/N 903433, PE Corporation, Foster City, CA), Januar 1995). Die optimalen Elektrophorese-Bedingungen, z.B. Polymer, Polymerkonzentration, pH-Wert, Temperatur, Konzentration des Denaturierungsmittels, die in einer bestimmten Trennung eingesetzt werden, hängen von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich dem Größenbereich der zu trennenden Polynukleotide, deren Basenzusammensetzung, ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind, und der Art der Klassen, für die Informationen durch Elektrophorese gesucht werden (Grossman P., "High resolution DNA sequencing method using low viscosity medium", US-PS 5,374,527 , erteilt am 20. Dezember 1994). Demzufolge kann eine erfindungsgemäße Anwendung vorausgehende Standardtests zur Optimierung von Bedingungen für bestimmte Trennungen erfordern.
  • Polynukleotide, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind, können auch mit Gruppen markiert werden, die die Geschwindigkeit einer elektrophoretischen Wanderung beeinflussen, z.B. Mobilitäts-modifizierende Markierungen. Mobilitäts-modifizierende Markierungen umfassen Polymere von Ethylenoxy-Einheiten, -(CH2CH2O)n-, worin n den Wert 1 bis 100 aufweisen kann (Grossman et al., "Method of DNA sequencing employing a mixed DNApolymer chain probe", US-PS 5,624,800 , erteilt am 29. April 1997). Vorzugsweise weist n einen Wert von 2 bis 20 auf. Spezifisch markierende Fluorescein-Farbstoffe-markierte Polynukleotide mit zusätzlichen Polyethylenoxy-Markierungen mit diskreter und bekannter Größe ermöglichen eine andere Dimension der Trennung durch Elektrophorese und Detektion, unabhängig von der Anzahl der Nukleotide in dem Polynukleotid. Das heißt, Polynukleotide der gleichen Länge können auf der Basis von spektral auflösbaren Farbstoffmarkierungen und Mobilitäts-modifizierenden Markierungen unterschieden werden. Polynukleotide, die sowohl Farbstoffmarkierungen als auch Mobilitäts-modifizierende Markierungen tragen, können enzymatisch durch Ligation oder Polymerase-Verlängerung des einzel-markierten Polynukleotid- oder Nukleotidbausteins gebildet werden. Alternativ können synthetische Oligonukleotide erfindungsgemäße Farbstoffmarkierungen und Mobilitäts-Modifizierungsmittel tragen, die während der automatisierten Synthese, z.B. Phosphoramidit-Reagenzien, oder über Koppeln nach der Synthese, z.B. NHS-Markierungskoppeln an Amino- oder Thiol-Oligonukleotide, eingebaut werden.
  • Nach der elektrophoretischen Trennung werden die Farbstoff-Polynukleotid-Konjugate durch Messen der Fluoreszenzemission von den farbstoffmarkierten Polynukleotiden detektiert. Um eine solche Detektion durchzuführen, werden die markierten Polynukleotide durch Standardmittel, z.B. Quecksilber-Dampflampen hoher Intensität, Laser oder dergleichen, angeregt. Vorzugsweise ist das Anregungsmittel ein Laser mit einem Anregungsstrahl bei einer Wellenlänge von über etwa 450 nm. Bevorzugter werden die Farbstoff-Polynukleotide durch Laserstrahlung angeregt, die durch einen Argonionen- oder He-Ne-Gaslaser oder einen Festphasen-Diodenenlaser erzeugt wird. Die Fluoreszenz wird sodann durch einen lichtempfindlichen Detektor, z.B. einem Photomultiplier, ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder dergleichen, detektiert. Beispielhafte elektrophoretische Detektionssysteme sind an anderer Stelle beschrieben (Hoff et al., "Real-time scanning fluorescence electrophoresis apparatus for the analysis of polynucleotide fragments", US-PS 5,543,026 , erteilt am 6. August 1996; Mathies et al., "Capillary array confocal fluorescence scanner and method", US-PS 5,274,240 , erteilt am 28. Dezember 1993; Hunkapiller et al., "Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing", US-PS 4,811,218 , erteilt am 7. März 1989).
  • VI.7 BEISPIELE
  • Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nur beispielhaft für die Erfindung sein und den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
  • BEISPIEL 1 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)benzol 1.
  • 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure:
  • Figure 00410001
  • (10 g, 54,95 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 2-Bromtoluol (18,81 g, 110 mmol), Glykolether (200 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium, (Ph3P)4Pd0 (4 g, 3,46 mmol) wurden 15 Minuten gerührt, gefolgt von der Zugabe von 8 g Kaliumcarbonat in 35 ml Wasser (ref). Nach 6-stündigem Refluxieren wurde das Reaktionsgemisch in 800 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser und Ethylacetat geschüttet. Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml × 2) und mit Kochsalzlösung (200 ml × 1) gewaschen, das Lösungsmittel wurde entfernt und das Rohprodukt durch Silicagel-Chromatographie (Hexan, Ethylacetat 0% bis 10%) gereinigt, um 10,5 g (84%) 1 (1) zu ergeben.
  • BEISPIEL 2 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-brombenzol 2.
  • 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)benzol 1 (10 g, 43,86 mmol), N-Bromsuccinimid (8,26 g, 46,4 mmol) und Perchlorsäure (70%, 0,5 ml) wurden in Dichlormethan (200 ml) gemischt und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Natriumbicarbonatlösung (5%, 100 ml) gequencht, die Dichlormethanphase wurde mit Wasser (100 ml), Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und das Lösungsmittel wurde entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt, wobei mit Hexan und Ethylacetat (0% bis 10% Ethylacetat) eluiert wurde, um 10,8 g (80%) 2 zu ergeben.
  • BEISPIEL 3 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)benzol 3.
  • Pyridin-3-boronsäure (5,81 g, 47,27 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-brombenzol (2) (10,7 g, 34,8 mmol), Glykolether (200 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (Ph3P)4Pd0 (4 g, 3,46 mmol) wurden 15 Minuten gerührt, gefolgt von der Zugabe von Kaliumcarbonat (16 g in 70 ml Wasser). Nach 10-stündigem Refluxieren wurde das Reaktionsgemisch in 800 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser und Ethylacetat geschüttet. Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml × 2) und Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, das Lösungsmittel wurde entfernt und das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt, wobei mit Hexan und Ethylacetat (10% bis 25% Ethylacetat) eluiert wurde, um 8,8 g (83%) 3 zu ergeben.
  • BEISPIEL 4 Synthese von 2-(Tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 4.
  • 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)benzol 3 (3,5 g, 11,46 mmol), Essigsäure (30 ml) und Bromwasserstoffsäure (48%) (15 ml) wurden 24 Stunden refluxiert. Nach Abkühlung des Reaktionsgemisches wurden das meiste Reagenz unter vermindertem Druck entfernt. Die verbleibende Säure wurde durch Mischen des Konzentrates mit Natriumbicarbonatlösung (5%) (100 ml) entfernt. Das Produkt wurde in Ethylacetat (100 ml) extrahiert, mit Wasser (100 ml × 2) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und das Ethylacetat wurde verdampft. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatrographie gereinigt, wobei mit Dichlormethan und Aceton (0% bis 10% Aceton) eluiert wurde, um 2,8 g (90%) 4 zu ergeben.
  • BEISPIEL 5 Synthese des Ketons 5
  • 2-(Tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 4 (630 mg, 2,25 mmol), 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid:
  • Figure 00420001
  • (Menchen S., et al., "4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes", US-PS 5,885,778 , erteilt am 23. März 1999) (590 mg, 2,25 mmol), Nitrobenzol (20 ml) und Aluminiumchlorid in Nitrobenzol (12 ml, 1M) wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in ein Gemisch aus Eiswasser (50 ml), Ethylacetat (100 ml) und n-Butanol (20 ml) geschüttet, gefolgt von der Zugabe von 10%iger HCl (50 ml), um die Aluminiumsalze zu lösen. Die organische Phase wurde mit Wasser (50 ml × 2) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und das Lösungsmittel wurde verdampft, um ein Produkt als ein Gemisch der Isomere 5a und 5b zu ergeben. Eine Trennung durch Silicagel-Säulenchromatographie mit Methanol in Dichlormethan (10% bis 30% Methanol) und (1%iger) Essigsäure ergab 380 mg (31%) des gewünschten, sich langsam bewegenden Isomers 5b, von dem angenommen wird, dass es die in 1 dargestellte Struktur aufweist.
  • BEISPIEL 6 1,3-Dimethoxynaphthalin 6
  • Zu 1,3-Dihydroxynaphthalin (15 g, 93,6 mmol) und Kaliumcarbonat (20 g, 144,7 mmol) in Aceton (200 ml) wurde Dimethylsulfat (21 ml, 222 mmol) gegeben. Nach Rühren über Nacht wurde das Reaktionsgemisch mit 10%iger Natriumhydroxidlösung (100 ml) gemischt und mit Ethylacetat (200 ml × 2) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (100 ml × 2) gewaschen, verdampft und der Rückstand mit Ammoniumhydroxid (50 ml) 2 Stunden gerührt, um jegliches nicht umgesetztes Dimethylsulfat zu quenchen. Das Produkt wurde mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert und mit Wasser (100 ml × 2) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, um 15 g (85%) 6 zu ergeben.
  • BEISPIEL 7 Bis(1,3-dimethoxynaphth-2-yl)dimethylzinn 7
  • 1,3-Dimethoxynaphthalin (6) (7,1 g, 37,73 mmol) wurde in wasserfreiem THF (60 ml) gelöst, auf –70°C abgekühlt und Tetramethylethylendiamin (0,2 ml), gefolgt von n-Butyllithium (26 ml, 1,6 M in Hexan) wurden zugegeben. Nach kaltem Rühren der Lösung für 30 Minuten und Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde die Lösung wieder auf –20°C abgekühlt und Dimethylzinndichlorid, SnMe2Cl2 (5,05 g in 20 ml THF), wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt, in Wasser (100 ml) geschüttet und mit Ethylacetat (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (50 ml), Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und verdampft. Der Rückstand wurde aus Hexan (50 ml) auskristallisiert, um 6,8 g (69%) 7 zu ergeben.
  • BEISPIEL 8 1,3-Dimethoxy-2-bromnaphthalin 8
  • Bis(1,3-dimethoxynaphth-2-yl)dimethylzinn 7 (11 g, 21 mmol) in THF (500 ml) wurde auf –30°C gekühlt und N-Bromsuccinimid (8 g, 45 mmol) wurde zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei –30°C wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser (200 ml) und Ethylacetat (200 ml) gequencht. Die organische Phase wurde mit 10%iger Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (100 ml × 2), Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und verdampft. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt, wobei mit Hexan-Ethylacetat (0% bis 10% Ethylacetat) eluiert wurde, um 9 g (80%) 8 zu ergeben.
  • BEISPIEL 9 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin 9
  • Pyridin-3-boronsäure (3,94 g, 32 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 1,3-Dimethoxy-2-bromnaphthalin 8 (6,6 g, 24,7 mmol), Glykolether (200 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (Ph3P)4Pd (3 g, 2,7 mmol) wurden 15 Minuten gerührt, gefolgt von der Zugabe von Kaliumcarbonat (11,4 g in 50 ml Wasser). Nach Refluxieren über Nacht wurde das Reaktionsgemisch in 800 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser:Ethylacetat geschüttet. Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml × 2) und Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, das Lösungsmittel wurde entfernt und das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt, wobei mit Dichlormethan und Aceton (0% bis 5% Aceton) eluiert wurde, um 5,1 g (84%) 9 zu ergeben.
  • BEISPIEL 10 2-(Tol-2-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin 10
  • Diese Verbindung wurde im Wesentlichen durch das gleiche Verfahren, wie dasjenige in Beispiel 9, unter Verwendung von 8 und Tol-2-ylboronsäure (Frontier Scientific, Inc.) hergestellt.
  • BEISPIEL 11 Synthese von 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin 11
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin 9 hergestellt, um 11 zu ergeben.
  • BEISPIEL 12 Synthese von 2-(Tol-2-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin 12
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 2-(Tol-2-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin 10 hergestellt, um 12 zu ergeben.
  • BEISPIEL 13 Synthese des Farbstoffs 13
  • Das Keton 5b (250 mg, 0,45 mmol) und 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin 11 (109 mg, 0,45 mmol) wurden mit Methansulfonsäure (7 ml) gemischt und 1 Stunde bei 100°C gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und sodann in Eiswasser (50 ml) geschüttet. Der Farbstoff wurde in n-Butanol (50 ml × 2) extrahiert und mit Wasser (20 ml × 2) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Farbstoff wurde durch Umkehrphasen-Silicagel-Chromatographie (50% Methanol) gereinigt, um 103 mg (30%) 13 (3) zu ergeben.
  • BEISPIEL 14 Synthese des Farbstoffs 14
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 13 verwendet, unter Verwendung von 2-(Tol-2-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin 12 und 5 hergestellt.
  • BEISPIEL 15 Synthese des Farbstoffs 15
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleichen Verfahren, wie in Beispiel 13 verwendet, unter Verwendung von 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin (Benson et al., "Asymmetric benzoxanthene dyes", US-PS 5,840,999 , erteilt am 24. November 1998) und 5 hergestellt.
  • BEISPIEL 16 Synthese des Farbstoffs 16
  • 2-(Tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 4 (52 mg, 0,28 mmol), 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid (Menchen et al., "4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes", US-PS 5,885,778 , erteilt am 23. März 1999) (36,5 mg, 14 mmol) und Methansulfonsäure (1 ml) wurden erhitzt und bei 130–135°C zwei Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und sodann in Eiswasser (50 ml) geschüttet. Der Rohfarbstoff wurde mit n-Butanol (50 ml × 2) extrahiert und der Extrakt wurde mit Wasser (20 ml × 2) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, um den Rohfarbstoff als ein Gemisch von zwei Isomeren zu ergeben. Die Isomere wurden durch präparative Dünnschichtchromatographie (Silicagel; Dichlormethan:Methanol: Essigsäure / 100:10:2 (v:v:v) als mobile Phase) getrennt, um 24 mg (30%) des gewünschten, sich langsamer bewegenden Isomers 16 zu ergeben.
  • BEISPIEL 17 Synthese von 2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-3-yl)benzol 17
  • 2,4-Dimethoxyphenyl-4-ylboronsäure (0,9 g, 4,97 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 3-Brompyridin (0,82 g, 5 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (Ph3P)4Pd0 (0,65 g, 0,56 mmol), N,N-Dimethylformamid (20 ml) und Triethylamin (2,1 ml) wurden gemischt und bei 110–120°C 16 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser und Ethylacetat geschüttet und die organische Phase wurde mit Wasser (50 ml × 2) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt durch Silicagel-Chromatographie (0% bis 10% Aceton in Dichlormethan) gereinigt, um 0,45 g (42,5%) 17 zu ergeben.
  • BEISPIEL 18 Synthese von 4-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 18
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-3-yl)benzol 17 hergestellt, um 18 zu ergeben.
  • BEISPIEL 19 Synthese des Farbstoffs 19
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 4-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 18 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 20 Synthese von 2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-2-yl)benzol 20
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 17 verwendet, unter Verwendung von 2,4-Dimethoxyphenyl-4-ylboronsäure und 2-Brompyridin hergestellt, um 20 zu ergeben.
  • BEISPIEL 21 Synthese von 2,3-Dihydroxy-4-(pyrid-2-yl)benzol 21
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-2-yl)benzol 20 hergestellt, um 21 zu ergeben.
  • BEISPIEL 22 Synthese des Farbstoffs 22
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 4-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 21 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 23 Synthese von 1,3-Dimethoxy-4-(chinon-3-yl)benzol 23
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 17 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-4-ylboronsäure und 3-Bromchinolin hergestellt, um 23 zu ergeben.
  • BEISPIEL 24 Synthese von 1,3-Dihydroxy-4-(chinon-3-yl)benzol 24
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-4-(chinon-3-yl)benzol 23 hergestellt, um 24 zu ergeben.
  • BEISPIEL 25 Synthese des Farbstoffs 25
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-4-(chinon-3-yl)benzol 24 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 26 Synthese von 1,3-Dimethoxy-4-(chinon-2-yl)benzol 26
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 17 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-4-ylboronsäure und 2-Bromchinolin hergestellt, um 26 zu ergeben.
  • BEISPIEL 27 Synthese von 1,3-Dihydroxy-4-(chinon-2-yl)benzol 27
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-4-(chinon-2-yl)benzol 26 hergestellt, um 27 zu ergeben.
  • BEISPIEL 28 Synthese des Farbstoffs 28
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-4-(chinon-2-yl)benzol 27 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 29 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)benzol 29
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure und 3-Brompyridin hergestellt, um 29 zu ergeben.
  • BEISPIEL 30 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-brombenzol 30
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 2 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)benzol 29 und N-Bromsuccinimid hergestellt, um 30 zu ergeben.
  • BEISPIEL 31 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol 31
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-brombenzol 30 und Phenylboronsäure hergestellt, um 31 zu ergeben.
  • BEISPIEL 32 Synthese von 1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol 32
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol 31 hergestellt, um 32 zu ergeben.
  • BEISPIEL 33 Synthese des Farbstoffs 33
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol 32 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 34 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol 34
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-brombenzol 2 und Phenylboronsäure hergestellt, um 34 zu ergeben.
  • BEISPIEL 35 Synthese von 1,3-Dihydroxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol 35
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol 34 hergestellt, um 35 zu ergeben.,
  • BEISPIEL 36 Synthese des Farbstoffs 36
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol 35 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 37 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)benzol 37
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure und 2-Brompyridin hergestellt, um 37 zu ergeben.
  • BEISPIEL 38 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-brombenzol 38
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 2 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)benzol 37 und N-Bromsuccinimid hergestellt, um 38 zu ergeben.
  • BEISPIEL 39 Synthese von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 39
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-brombenzol 38 und Naphth-2-ylboronsäure hergestellt, um 39 zu ergeben.
  • BEISPIEL 40 Synthese von 1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 40
  • Diese Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 verwendet, hergestellt, wobei 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 39 demethyliert wurde, um 40 zu ergeben.
  • BEISPIEL 41 Synthese des Farbstoffs 41
  • Dieser Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16 verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 40 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid hergestellt.
  • BEISPIEL 42 Eigenschaften der Farbstoffe
  • Bestimmte Eigenschaften einiger erfindungsgemäßer Fluorescein-Farbstoffe wurden gemessen, siehe Tabelle 1.
  • Figure 00500001
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hierin durch eine Referenz in dem gleichen Ausmaß eingeschlossen, als wenn für jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben wäre, dass sie durch eine Referenz eingeschlossen ist.
  • Obwohl bestimmte Ausführungsformen vorstehend genau beschrieben wurden, wird der Fachmann eindeutig verstehen, dass viele Modifikationen in den bevorzugten Ausführungsformen möglich sind, ohne die Lehren davon zu verlassen. Alle solche Modifikationen sollen von den nachstehenden Ansprüchen umfasst sein.

Claims (57)

  1. Verbindung der Formel.
    Figure 00520001
    worin: mindestens eine der Gruppen R1, R2, R3, R4, R5 oder R7 ein elektronenarmer Stickstoff-Heterocyclus ist, R1, wenn für sich genommen, ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist oder, wenn mit R7 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe ist, R2, wenn für sich genommen, ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist, R3, wenn für sich genommen, ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist, R4, wenn für sich genommen, ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist oder, wenn mit R5 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe ist, R5, wenn für sich genommen, ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist oder, wenn mit R4 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe ist, R7, wenn für sich genommen, ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C1-C6)-substituierte Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe ist oder, wenn mit R1 zusammen genommen, eine Benzo- oder Heterocyclusgruppe ist und R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, Cyan-, heterocyclischer Aromaten-, Phenyl- und substituierter Phenylgruppe mit der Struktur
    Figure 00530001
    worin X1, X2, X3, X4 und X5 für sich genommen ein H-, Cl-, F-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, CO2H-, SO3H-, GH2OH-Gruppe oder eine reaktive Verbindungsgruppe sind.
  2. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin der elektronenarme Heterocyclus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 4-Pyridyl-, 2-Chinolyl-, 3-Chinolyl-, 4-Chinolyl-, 2-Imidazol-, 4-Imidazol-, 3-Pyrazol-, 4-Pyrazol-, Pyridazin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Cinnolin-, Phthalazin-, Chinazolin-, Chinoxalin-, 3-(1,2,4-N)-Triazolyl-, 5-(1,2,4-N)-Triazolyl-, 5-Tetrazolyl-, 4-(1-O, 3-N)-Oxazol-, 5-(1-O, 3-N)-Oxazol-, 4-(1-S, 3-N)-Thiazol-, 5-(1-S, 3-N)-Thiazol-, 2-Benzoxazol-, 2-Benzothiazol-, 4-(1,2,3-N)-Benzotriazol- und Benzimidazolgruppe.
  3. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin R4 zusammen genommen mit R5 eine Benzogruppe ist.
  4. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin R1 zusammen genommen mit R7 eine Benzogruppe ist.
  5. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin R6 eine substituierte Phenylgruppe mit der Struktur
    Figure 00540001
    ist.
  6. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 5, worin eine der Gruppen X3 und X4 eine Carboxylgruppe und die andere ein Wasserstoffatom ist.
  7. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin R1, R2, R3 und R4 jeweils für sich genommen eine Phenyl- oder substituierte Phenyl- oder Naphthyl- oder substituierte Naphthylgruppe sind.
  8. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin R2 und R3 jeweils für sich genommen ein Fluor-, Chloratom, eine 2-Pyndyl-, 3-Pyridyl-, 2-Chinolyl- oder 3-Chinolylgruppe sind.
  9. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin R5 und R7 Wasserstoffatome sind.
  10. Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, worin die reaktive Verbindungsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Succinimidylester-, Isothiocyanat-, Sulfonylchlorid-, 2,6-Dichlortriazinyl-, Pentafluorphenylester-, Phosphoramidit-, Maleimid-, Halogenacetyl- und Iodacetamidgruppe.
  11. Fluorescein-Farbstoffe nach Anspruch 1 mit den Strukturen:
    Figure 00540002
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Figure 00570001
  12. Verfahren zum Markieren eines Substrats mit einem Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1, umfassend den Schritt eines Umsetzens des Substrats mit der reaktiven Verbindungsgruppe des Fluorescein-Farbstoffs, wobei ein Substrat-Farbstoff-Konjugat hergestellt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die reaktive Verbindungsgruppe eine N-Hydroxysuccinimidgruppe ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die reaktive Verbindungsgruppe eine Phosphoramiditgruppe ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Polynukleotid, einem Nukleotid, einem Nukleosid, einem Peptid, einem Protein, einem Kohlenhydrat, einem Liganden, einem Partikel und einer Oberfläche.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Partikel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Nanopartikel, einer Mikrosphäre, einem Kügelchen und einem Liposom.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Oberfläche Glas ist.
  18. Enexgietransfer-Farbstoffverbindung, umfassend: einen Donor-Farbstoff, der zur Absorption von Strahlung einer ersten Wellenlänge und Emission von Anregungsenergie in Reaktion darauf fähig ist und durch einen Linker mit einem Akzeptor-Farbstoff verbunden ist, der zur Absorption von Anre gungsenergie, die von dem Donor-Farbstoff ausgesendet wird, und Fluoreszieren bei einer zweiten Wellenlänge in Reaktion darauf fähig ist, wobei mindestens einer der Donor- und Akzeptor-Farbstoffe ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 ist.
  19. Energietransfer-Farbstoff nach Anspruch 18, wobei der Linker eine Struktur der Formel
    Figure 00580001
    aufweist, worin n den Wert 1 oder 2 hat.
  20. Markiertes Nukleosid oder Nukleotid der Formel
    Figure 00580002
    worin DYE ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 oder ein Energietransfer-Farbstoff nach Anspruch 18 ist, B eine Nukleobase ist, R8 ein H-Atom, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Thiophosphat oder Phosphat-Analogon ist, R9 und R10, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander eine H-, HO-, F-Gruppe oder eine Gruppe sind, die eine Polymerase-vermittelte, Zielgerichtete Polymerisierung blockiert, oder, wenn zusammen genommen, 2'-3'-Didehydroribose bilden und L ein Linker ist.
  21. Markiertes Nukleosid oder Nukleotid nach Anspruch 20, worin B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin.
  22. Markiertes Nukleosid oder Nukleotid nach Anspruch 20, worin L
    Figure 00590001
    ist, worin n den Wert 0, 1 oder 2 hat.
  23. Markiertes Nukleosid oder Nukleotid nach Anspruch 20, das enzymatisch einbaubar ist.
  24. Markiertes Nukleosid oder Nukleotid nach Anspruch 20, das ein Terminator ist.
  25. Terminator-Nukleotid nach Anspruch 24, das die Struktur
    Figure 00590002
    aufweist, worin DYE ein Fluorescein-Farbstoff ist, B eine Nukleobase ist, R8 ein Triphosphat, α-Thiotriphosphat oder Triphosphat-Analogon ist, R9 und R10, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander eine H-, F-Gruppe oder eine Gruppe sind, die eine Polymerase-vermittelte, Ziel-gerichtete Polymerisierung blockiert, oder, wenn zusammen genommen, 2'-3'-Didehydroribose bilden und L ein Linker ist.
  26. Markiertes Nukleosid oder Nukleotid nach Anspruch 20, das enzymatisch verlängerbar ist.
  27. Markiertes Oligonukleotid der Formel
    Figure 00600001
    worin das Oligonukleotid 2 bis 100 Nukleotide umfasst, DYE ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 oder ein Energietransfer-Farbstoff nach Anspruch 18 ist, B eine Nukleobase ist, L ein Linker ist, R10 eine H-, OH-, Halogenid-, Azid-, Amin-, Alkylamin-, Alkyl-(C1-C6)-, Allyl-, Alkoxy-(C1-C6)-, OCH3- oder OCH2CH=CH2-Gruppe ist, R15 ein H-Atom, Phosphat, Internukleotid-Phosphodiester oder Internukleotid-Analogon ist und R16 ein H-Atom, Phosphat, Internukleotid-Phosphodiester oder Internukleotid-Analogon ist.
  28. Markiertes Oligonukleotid der Formel
    Figure 00600002
    worin das Oligonukleotid 2 bis 100 Nukleotide umfasst, DYE ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 ist, X eine O-, NH- oder S-Gruppe ist, B eine Nukleobase ist, L ein Linker ist, R10 eine H-, OH-, Halogenid-, Azid-, Amin-, Alkylamin-, Alkyl-(C1-C6)-, Allyl-, Alkoxy-(C1-C6)-, OCH3- oder OCH2CH=CH2-Gruppe ist und R15 ein Internukleotid-Phosphodiester oder Internukleotid-Analogon ist.
  29. Markiertes Oligonukleotid nach Anspruch 28, worin L eine Alkyldiyl-(C1-C12)-Gruppe oder eine Mobilitäts-modifizierende Gruppe ist, umfassend -(CH2CH2O)n-, worin. n den Wert 1 bis 100 hat.
  30. Phosphoramiditverbindung der Formel
    Figure 00610001
    worin DYE ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 oder Energietransfer-Farbstoff nach Anspruch 18 ist, L ein Linker ist, R11 und R12 für sich genommen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-(C1-C12)-, Alken-, Aryl- und Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder R11 und R12 zeit dem Stickstoffatom zusammen genommen einen gesättigten Stickstoff-Heterocyclus bilden und R13 eine Phosphitester-Schutzgruppe ist.
  31. Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 30, worin R13 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl-, 2-Cyanethyl- und 2-(4-Nitrophenyl) ethylgruppe.
  32. Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 30, worin R11 und R12 jeweils eine Isopropylgruppe sind oder worin R11 und R12 zusammen genommen eine Morpholinogruppe sind.
  33. Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 30, worin L eine Alkyldiyl-(C1-C12)-Gruppe ist.
  34. Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 30, worin der Fluorescein-Farbstoff an R6 durch einen Linker gebunden ist.
  35. Phosphoramiditverbindung der Struktur
    Figure 00610002
    worin DYE ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 ist.
  36. Phosphoramiditverbindung der Formel
    Figure 00620001
    worin DYE ein Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 oder ein Energietransfer-Farbstoff nach Anspruch 18 ist, B eine Nukleobase ist, L ein Linker ist, R11 und R12 für sich genommen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-(C1-C6)-, Alken-, Aryl- und Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder R11 und R12 mit dem Stickstoffatom zusammen genommen einen gesättigten Stickstoff-Heterocyclus bilden, R13 eine Phosphitester-Schutzgruppe ist und R14 eine Säure-spaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe ist.
  37. Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 36, worin. R13 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl-, 2-Cyanethyl- und 2-(4-Nitrophenyl) ethylgruppe.
  38. Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 36, worin R11 und R12 jeweils eine Isopropylgruppe sind oder worin R11 und R12 zusammen genommen eine Morpholinogruppe sind.
  39. Verbindung nach Anspruch 36, worin L ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00620002
    worin n 2 bis 10 beträgt,
    Figure 00630001
    worin n den Wert 0, 1 oder 2 hat, und
    Figure 00630002
    worin n 1 bis 10 beträgt.
  40. Verbindung nach Anspruch 30, worin B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin.
  41. Verfahren zum. Synthetisieren eines markierten Oligonukleotids, umfassend den Schritt eines Koppelns einer Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 30 an ein Oligonukleotid auf einem Festträger.
  42. Verfahren zum Synthetisieren eines markierten Oligonukleotids, umfassend den Schritt eines Koppelns eines Nukleosid-Phosphoramidit-Reagenzes an einen Festträger, wobei der Festträger mit einem Farbstoff nach. Anspruch 1 oder einer Energietransfer-Verbindung nach Anspruch 18 markiert ist.
  43. Verfahren zum Herstellen eines markierten Primer-Verlängerungsprodukts, umfassend den Schritt eines enzymatischen Verlängerns eines Primer-Ziel-Hybrids in Gegenwart eines Gemisches von enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden, die zu einer Unterstützung einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, und einem Terminator, wobei der Primer oder der Terminator mit einem Farbstoff nach Anspruch 1 oder einer Energietransfer-Verbindung nach Anspruch 18 markiert ist.
  44. Verfahren zum Oligonukleotid-Ligieren, umfassend die Schritte: Anlagern von zwei Sonden an eine Zielsequenz und Bilden einer Phosphodiester-Bindung zwischen dem 5'-Terminus einer Sonde und dem 3'-Terminus der anderen Sonde, wobei eine oder beide Sonden mit einem Farbstoff nach Anspruch. 1 oder einer Energietransfer-Verbindung nach Anspruch 18 markiert sind.
  45. Verfahren zur Fragmentanalyse, umfassend die Schritte: Unterziehen von Polynukleotid-Fragmenten, wobei die Fragmente mit einem Fluorescein-Farbstoff nach Anspruch 1 oder einer Energietransfer-Verbindung nach Anspruch 18 markiert sind, einem größenabhängigen Trennverfahren und Nachweis des markierten Poly-nukleotid-Fragments nachfolgend auf das Trennverfahren.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Fragmente mit einem Mobilitätsmodifizierenden Marker markiert sind.
  47. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Fragmente durch Ligation hergestellt werden.
  48. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das größenabhängige Trennverfahren Elektrophorese ist und das markierte Polynukleotid-Fragment durch Fluoreszenz nachgewiesen wird.
  49. Verfahren zur Amplifikation, umfassend die Schritte: Anlagern von zwei oder mehreren Primern an eine Ziel-DNA-Sequenz und Verlängern der Primer durch Polymerase und ein Gemisch aus enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden, wobei ein Primer oder ein Nukleotid mit einem Farbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
  50. Verfahren zum Amplifizieren, umfassend die Schritte: Anlagern von zwei oder mehreren Pximern und. einer fluoreszierenden Farbstoff-Quencher-Sonde an eine Ziel-DNA-Sequenz und Verlängern der Primer durch Polymerase und ein Gemisch aus enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden, wobei die Sonde mit einem Farbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
  51. Kit zum Markieren eines Oligonukleotids, umfassend einen eine reaktive Verbindungsgruppe beinhaltenden Farbstoff nach Anspruch 1 und ein Oligonukleotid.
  52. Kit zum Markieren eines Oligonukleotids, umfassend eine Phosphoramiditverbindung nach Anspruch 30 und ein Oligonukleotid.
  53. Kit zum Herstellen eines markierten Primer-Verlängerungsprodukts, umfassend enzymatisch verlängerbare Nukleotide, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, einen Terminator und einen Primer, wobei der Primer oder der Terminator mit einem Farbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
  54. Kit zum Herstellen eines markierten Primer-Verlängerungsprodukts, umfassend enzymatisch verlängerbare Nukleotide, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, einen Terminator und einen Primer, wobei der Primer oder der Terminator mit einem Energietransfer-Farbstoff nach Anspruch 18 markiert ist.
  55. Kit zum Herstellen eines markierten Primer-Verlängerungsprodukts, umfassend enzymatisch verlängerbare Nukleotide, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, einen Terminator und einer Primer, wobei der Primer oder der Terminator mit einem Farbstoff nach Anspruch 11 markiert ist.
  56. Kit nach Anspruch 55, wobei der Terminator ein Satz an vier verschiedenen Terminatoren ist, von denen einer an einem Ziel A terminiert, einer an einem Ziel G terminiert, einer an einem Ziel C terminiert und einer an einem Ziel T oder U terminiert.
  57. Kit nach Anspruch 56, wobei der Satz an vier verschiedenen Terminatoren ein Satz an Mobilitäts-übereinstimmenden Terminatoren ist.
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