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I. GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Fluoreszenzfarbstoff-Verbindungen,
die als Markierungsreagenzien zur Herstellung molekularer Sonden
verwendbar sind. Spezifischer betrifft die Erfindung Fluorescein-Farbstoffe
mit einer Xanthen-Ringstruktur und Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-Substituenten.
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II. HINTERGRUND
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Die
nicht-radioaktive Detektion von biologischen Analyten unter Verwendung
von Fluoreszenzmarkern ist eine wichtige Technologie in der modernen
analytischen Biotechnologie. Durch Beseitigung des Bedarfs an radioaktiven
Markern wird die Sicherheit erhöht
und der Einfluss auf die Umwelt und Kosten, die mit der Entsorgung
von Reagenzien verbunden sind, werden stark reduziert. Beispiele
für Verfahren,
die solche Fluoreszenzdetektionsverfahren verwenden, umfassen automatisierte
DNA-Sequenzierung, Oligonukleotid-Sondenverfahren, Detektion von
Polymerase-Kettenreaktionsprodukten, Immunoassays und dergleichen.
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In
vielen wichtigen Anwendungen ist es von Vorteil, mehrere, spektral
unterscheidbare Fluoreszenzmarker zu verwenden, um eine unabhängige Detektion
einer Vielzahl von räumlich überlappenden
Analyten zu erreichen, d.h. eine mehrfache Fluoreszenzdetektion.
Beispiele für
Verfahren, die eine mehrfache Fluoreszenzdetektion verwenden, umfassen
mehrfache DNA-Sonden-Assays mit einem einzigen Röhrchen, PCR, Einzel-Nukleotid-Polymorphismen,
Immunoassays und automatisierte Vielfarben-DNA-Sequenzierung. Die Anzahl
von Reaktionsgefäßen kann
vermindert werden, was experimentelle Protokolle vereinfacht und
die Herstellung von anwendungsspezifischen Reaktions-Kits erleichtert.
In dem Fall der automatisierten Vielfarben-DNA-Sequenzierung ermöglicht eine mehrfache
Fluoreszenzdetektion die Analyse von mehreren Nukleotiden in einer
einzigen Elektrophoresespur, wodurch der Durchsatz gegenüber Einfarben-Verfahren
erhöht wird
und Unbestimmtheiten, die mit elektrophoretischen Mobilitätsvariationen
zwischen den Spuren verbunden sind, vermindert werden. Eine automatisierte
Vierfarben-DNA-Sequenzierung des Sanger-Typs ermöglichte die Charakterisierung
des gesamten Genoms auf einer molekularen Ebene.
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Das
Zusammenstellen eines Satzes von mehreren, spektral-unterscheidbaren
Fluoreszenzmarkern, die für
eine mehrfache Fluoreszenzdetektion geeignet sind, ist problematisch.
Eine mehrfache Fluoreszenzdetektion führt zu mindestens sechs schweren
Einschränkungen
bezüglich
der Auswahl von Komponent-Fluoreszenz-Farbstoffmarkern, insbesondere
für Anwendungen,
die eine einzige Anregungsstrahlungsquelle, eine elektrophoretische
Trennung und/oder eine Behandlung mit Enzymen benötigen, beispielsweise
eine automatisierte DNA-Sequenzierung. Erstens ist es schwierig,
einen Satz von strukturell ähnlichen
Farbstoffen zu finden, deren Emissionsspektren spektral aufgelöst sind,
da die typische Halbwertsbreite von Emissionsbanden für organische
Fluoreszenzfarbstoffe etwa 40 bis 80 Nanometer (nm) beträgt. Zweitens
kann, selbst wenn Farbstoffe mit nicht-überlappenden Emissionsspektren
identifiziert werden, der Satz immer noch nicht geeignet sein, wenn
die entsprechenden Fluoreszenz-Quantenausbeuten zu gering sind.
Drittens wird, wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe zusammen
verwendet werden, die gleichzeitige Anregung schwierig, weil die Absorptionsbanden
der Farbstoffe gewöhnlich
weit auseinander liegen. Viertens dürfen die Ladung, Molekülgröße und Konformation
der Farbstoffe die elektrophoretische Mobilität des Analyten nicht nachteilig
beeinflussen. Fünftens
müssen
die Fluoreszenzfarbstoffe mit der Chemie kompatibel sein, die für die Herstellung
oder Manipulation des Analyten eingesetzt wird, z.B. DNA-Synthese-Lösungsmittel
und -Reagenzien, Puffer, Polymerase-Enzyme, Ligase-Enzyme und dergleichen.
Sechstens muss der Farbstoff eine ausreichende Fotostabilität aufweisen,
um einer Laseranregung zu widerstehen.
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Zur
Zeit erhältliche
mehrfache Farbstoffsätze,
die für
eine Verwendung in automatisierten Vierfarben-DNA-Sequenzierungen
geeignet sind, benötigen
blaue oder blaugrüne
Laserstrahlung, um Fluoreszenzemissionen von allen Farbstoffen,
die den Satz bilden, in geeigneter Weise anzuregen, z.B. Argon-Innenlaser. Da
billigere rote Laser erhältlich
werden, entwickelt sich eine Bedarf an Fluoreszenzfarbstoffverbindungen
und deren Konjugate, die den vorstehenden Ein schränkungen
genügen
und durch Laserstrahlung mit einer Wellenlänge von über etwa 500 nm anregbar sind.
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III. ZUSAMMENFASSUNG
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Die
Erfindung betrifft Farbstoffverbindungen, die für die Bildung von Sätzen von
spektral auflösbaren Fluoreszenzmarkern
geeignet sind, die für
eine Mehrfarben-Fluoreszenzdetektion geeignet sind.
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Im
Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Farbstoffe eine Fluoresceinartige
Xanthen-Ringstruktur I:
die mit mindestens einem
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus substituiert ist, der mit
dern Fluorescein-Ringsystem an R
1, R
2, R
3, R
4,
R
5 oder R
7 gebunden
ist.
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- R1, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R7 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R2, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
- R3, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
- R4, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R5 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R5, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R4 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R7, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R1 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R6 kann eine (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, Cyan-, heterocyclische Aromaten-,
Phenyl- und substituierte Phenylgruppe der Struktur II: sein, worin X1,
X2, X3, X4 und X5 für sich genommen
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, CO2H-, SO3H-, CH2OH-Gruppe oder eine reaktive Verbindungsgruppe
sind.
-
In
einem Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren
zur Markierung eines Substrates mit einem Fluorescein-Farbstoff
der Struktur I bereitgestellt, wobei sich das Substrat mit der reaktiven
Verbindungsgruppe des Farbstoffs umsetzt und ein Substrat-Farbstoff-Konjugat
gebildet wird. Substrat-Farbstoff-markierte Konjugate umfassen den
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoff
gemäß I und
ein Substrat, d.h. ein anderes Molekül oder eine andere Substanz.
Das Substrat kann mit einem oder mehreren erfin dungsgemäßen Farbstoffen
markiert werden, die gleich oder verschieden sein können. Die
Fluoreszenz der Farbstoffe stellt detektierbare Signale über einen
Spektralbereich bereit, wodurch eine Unterscheidung von unterschiedlich
markierten Substraten in einer einzigen Probe oder einem Gemisch
ermöglicht
wird.
-
In
einer Ausführungsform
ist der Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoff
kovalent mit einer weiteren Farbstoffverbindung konjugiert, um eine
Energie-Transfer-Farbstoffverbindung zu bilden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist der Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoff
kovalent mit einem Nukleosid, Nukleotid, Nukleosid- und Nukleotid-Analogon,
Polynukleotid oder Polynukleotid-Analogon
konjugiert, um markierte Konjugate damit zu bilden.
-
In
einem noch weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Phosphoramidit-Reagenzien
bereitgestellt, die erfindungsgemäße Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte
Fluorescein-Farbstoffe einschließen.
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In
einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß verschiedene Verfahren zur
Synthese von Oligonukleotiden, die mit den Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten
Fluorescein-Farbstoffen markiert sind, und zur Verwendung der Farbstoffe
zur Detektion von fluoreszenzmarkierten Polynukleotiden bereitgestellt.
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In
einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Kits bereitgestellt, die
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte Fluorescein-Farbstoffe
und Reagenzien umfassen, die zur Markierung von Molekülen und/oder
zur Durchführung
von Assays, wie DNA-Sequenzierung und -Amplifikation, z.B. Polymerase-Kettenreaktion,
geeignet sind.
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Die
erfindungsgemäßen Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten
Fluorescein-Farbstoffe stellen signifikante Vorteile gegenüber derzeit
bekannten Fluorescein-Farbstoffen bereit.
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IV. KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 1–5.
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2 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 6–12.
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3 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 13 und 14.
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4 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 15 und 16.
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5 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 1a–22.
-
6 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 23–25.
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7 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 26–28.
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8 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 29–33.
-
9 zeigt die Strukturen der
Verbindungen 34–36.
-
10 zeigt die Strukturen
der Verbindungen 37–41.
-
11 zeigt eine repräsentative
Auswahl von Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen.
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12 zeigt fluorimetrische
Scans der Verbindung 19, Anregungsmaximum bei 530 nm, Emissionsmaximum
bei 554 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
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13 zeigt fluorimetrische
Scans der Verbindung 22, Anregungsmaximum bei 531,5 nm, Emissionsmaximum
bei 556 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
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14 zeigt einen fluorimetrischen
Scan der Verbindung 25, Emissionsmaximum bei 562,5 nm in 1 X TBE
bei Raumtemperatur.
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15 zeigt fluorimetrische
Scans der Verbindung 33, Anregungsmaximum bei 545,5 nm, Emissionsmaximum
bei 571,5 nm in 1 X TBE bei Raumtemperatur.
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16 zeigt eine Fluoreszenzdetektion
von markierten Sequenzfragmenten des ABI PRISM 310. Base 183 bis
Base 276-Bereich der G-Terminiationssequenz des pGEM-Targets unter
Verwendung eines -21M13 Vorwärts-Primers.
Reagenzien: POP6-Elektrophoresemedium, Taq FS-Polymerase, dNTP-Mix
jeweils 25 pmol von dATP, dCTP, dITP, dTTP. Oberes Feld: dNTP-Mix
und Terminator 3'FddGTP-EO-13. Unteres Feld: dNTP-Mix
und Energietransfer-Farbstoff-Terminator 3'FddGTP-E0-6FAM-Bn-dR110.
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V. GENAUE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Es
wird nun genau auf die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen Bezug genommen, und
Beispiele davon sind in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht.
Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben werden wird, soll verstanden werden, dass sie nicht
die Erfindung auf diese Ausführungsformen
beschränken
sollen. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung alle Alternativen,
Modifikationen und Äquivalente
umfassen, die innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie durch die
beigefügten
Ansprüche
definiert, eingeschlossen sein können.
-
V.1 DEFINITIONEN
-
Soweit
nicht anders angegeben, sollen die nachstehenden Begriffe und Ausdrücke, wie
hierin verwendet, die nachstehenden Bedeutungen aufweisen:
-
"Nukleobase" betrifft eine stickstoffhaltige
heterocyclische Gruppe, die zur Bildung von Watson-Crick-Wasserstoffbindungen
mit einer komplementären
Nukleobase oder einem Nukleobasen-Analogon, z.B. einem Purin, einem
7-Deazopurin oder einem Pyrimidin, fähig ist. Typische Nukleobasen
sind die natürlich vorkommenden
Nukleobasen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin und Analoga
der natürlich
vorkommenden Nukleobasen, z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, Inosin,
Nebularin, Nitropyrrol, Nitroindol, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin,
Hypoxanthin, Pseudouridin, Pseudocytidin, Pseudoisocytidin, 5-Propinylcytidin,
Isocytidin, Isoguanin, 7-Deazaquanin, 2-Thiopyrimidin, 6-Thioguanin,
4-Thiothymin, 4-Thiouracil, O6-Methylguanin, N6-Methyladenin, O4-Methylthymin,
5,6-Dihydrothymin, 5,6-Dihydrouracil, 4-Methylindol und Ethenoadenin (Fasman,
Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Seiten
385-394, CRC Press,
Boca Raton, FL (1989)).
-
"Nukleotid" betrifft eine Verbindung,
die eine Nukleobase umfasst, die an ein C-1'-Kohlenstoffatom
eines Ribosezuckers gebunden ist. Die Ribose kann substituiert oder
nicht-substituiert sein. Substituierte Ribosezucker umfassen in
nicht-begrenzender Weise diejenigen Ribosen, in denen ein oder mehrere
der Kohlenstoffatome, vorzugsweise das 3'-Kohlenstoffatom, mit einer oder mehreren
der gleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen
substituiert ist, worin jede R-Gruppe unabhängig -H, eine (C1-C6)-Alkyl- oder (C5-C14)-Arylgruppe
ist. Besonders bevorzugte Ribosen sind Ribose, 2'-Desoxyribose, 2',3'-Didesoxyribose,
3'-Halogenribose,
3'-Fluorribose,
3'-Chlorribose und
3'-Alkylribose. Wenn
die Nukleobase A oder G ist, ist der Ribosezucker an die N9-Position
der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase C, T oder U ist, ist
der Pentosezucker an die N1-Position der
Nukleobase gebunden (Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflage,
Freeman, San Francisco, CA (1992)).
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"Nukleotid" betrifft einen Phosphatester
eines Nukleosids als eine Monomereinheit oder innerhalb eines Polynukleotids.
Nukleotide werden manchmal als "NTP" oder "dNTP" und "ddNTP" bezeichnet, um insbesondere
die strukturellen Eigenschaften des Ribosezuckers herauszustellen. "Nukleotid-5'-triphosphat" betrifft ein Nukleotid
mit einer Triphosphatestergruppe an der 5'-Position. Die Triphosphatestergruppe
kann Schwefelsubstitutionen für
die verschiedenen Sauerstoffatome umfassen, z.B. α-Thionukleotid-5'-triphosphate.
-
Wie
hierin verwendet, umfassen die Begriffe "Polynukleotid" oder "Oligonukleotid" eine jegliche Polymerverbindung, die
aus Nukleosiden, Nukleotiden oder Analoga davon besteht. "Oligonukleotid" und "Polynukleotid", die austauschbar
verwendet werden, betreffen einzelsträngige und doppelsträngige Polymere
von Nukleotidmonomeren, einschließlich 2'-Desoxyribonukleotide (DNA) und Ribonukleotide
(RNA). Ein Oligonukleotid kann vollständig aus Desoxyribonukleotiden,
vollständig
aus Ribonukleotiden oder chimären
Gemischen davon, die durch Internukleotid-Phosphodiesterbindung-Verbindungen
verbunden sind, oder Internukleotid-Analoga und zugehörigen Gegenionen,
z.B. H+-, NH4 +-, Trialkylammonium-, Mg2+-,
Na+-Ionen und dergleichen, bestehen. Oligonukleotide
können
aus Nukleobasen- und Zucker-Analoga bestehen. Polynukleotide weisen
typischerweise eine Größe von wenigen
Monomereinheiten, z.B. 5–40,
wenn sie herkömmlich
als Oligonukleotide bezeichnet werden, bis hin zu mehreren Tausend
Monomer-Nukleotid-Einheiten auf. Wenn nicht anders angegeben, soll
verstanden werden, dass, wann immer eine Oligonukleotid-Sequenz
dargestellt wird, die Nukleotide in 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts angegeben
sind und dass "A" Desoxyadenosin bezeichnet, "C" Desoxycytidin bezeichnet, "G" Desoxyguanosin bezeichnet und "T" Thymidin bezeichnet, wenn nicht anders
angegeben.
-
Der
Begriff "Watson/Crick-Basenpaarung" betrifft die Wasserstoff-bindende
Basenpaarung, die herkömmlicherweise
in doppelsträngiger
DNA beobachtet wird.
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"Anbindungsstelle" betrifft eine Stelle
an einer Gruppe, z.B. einem Fluorescein-Farbstoff, einem Nukleotid oder einem
Oligonukleotid, an die ein Linker kovalent gebunden ist.
-
"Linker" betrifft eine Gruppe,
die einen Farbstoff mit einem Substrat, z.B. einem Oligonukleotid,
oder einen Farbstoff mit einem anderen, z.B. in einem Energie-Transfer-Farbstoffpaar,
verbindet.
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"Alkyl" betrifft einen gesättigten
oder ungesättigten,
geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest,
der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen
Kohlenstoffatom eines Stammalkans, -alkens oder -alkins abgeleitet
ist. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylgruppen und dergleichen. Typische
Alkylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Methylgruppe (-CH3), Ethylgruppen wie Ethanyl- (-CH2-CH3), Ethenyl-
(-CH=CH2), Ethinylgruppe (-C≡CH), Propylgruppen
wie Propan-1-yl- (-CH2-CH2-CH3), Propan-2-yl-, Cyclopropan-1yl-, Prop-1-en-1-yl-
(-CH=CH-CH3), Prop-1-en-2-yl-, Prop-2-en-1-yl(-CH2-CH=CH2), Prop-2-en-2-yl-,
Cycloprop-1-en-1-yl-, Cycloprop-2-en-1-yl-, Prop-1-in-1-yl- (-C-=C-CH3), Prop-2-in-1-ylgruppe (-CH2-C≡CH), usw., Butylgruppen
wie Butan-1-yl- (-CH2-CH2-CH2-CH3), Butan-2-yl-,
Cyclobutan-1-yl-, But-1-en-1-yl- (-CH=CH2-CH2-CH3),
But-1-en-2-yl-, But-2-en-1-yl- (-CH2-CH=CH-CH3), But-2-en-2-yl-, Buta-1,3-dien-1-yl- (-CH=CH-CH=CH2), Buta-1,3-dien-2-yl-, Cyclobut-1-en-1-yl-,
Cyclobut-1-en-3-yl-, Cyclobuta-1,3-dien-1-yl-, But-1-in-1-yl- (-C≡C-CH2-CH3), But-1-in-3-yl-,
But-3-in-1-ylgruppe (-CH2-CH2-C≡CH), usw.
und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkylgruppen
(C1-C6)-Alkylgruppen, wobei (C1-C3)-Gruppen besonders bevorzugt sind.
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"Alkoxy" betrifft -OR, worin
R eine (C1-C6)-Alkylgruppe
ist.
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"Alkyldiyl" betrifft einen gesättigten
oder ungesättigten,
verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest
mit 1–12
Kohlenstoffatomen und mit zwei monovalenten Radikalzentren, abgeleitet durch
die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von dem gleichen oder
zwei verschiedenen Kohlenstoffatomen eines Stammalkans, -alkens
oder -alkins. Typische Alkyldiylreste umfassen in nicht-begrenzender
Weise Methano- (-CH2-), 1,2-Ethyldiyl-,
1,3-Propyldiyl-, 1,4-Butyldiylgruppe und dergleichen.
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"Aryl" betrifft einen monovalenten
aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 6–20 Kohlenstoffatomen, der
durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzelnen
Kohlenstoffatom eines aromatischen Stammringsystems abgeleitet ist.
Typische Arylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Reste,
die von Benzol, substituiertem Benzol, Naphthalin, Anthracen, Biphenyl
und dergleichen abgeleitet sind.
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"Aryldiyl" betrifft einen ungesättigten,
cyclischen oder polycyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 6–20 Kohlenstoffatomen
mit einem konjugierten Resonanz-Elektronensystem
und mindestens zwei monovalenten Radikalzentren, abgeleitet durch
die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von zwei verschiedenen
Kohlenstoffatomen einer Stammarylverbindung.
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"Substituiertes Alkyl", "substituiertes Alkyldiyl", "substituiertes Aryl" und "substituiertes Aryldiyl" betreffen Alkyl-,
Alkyldiylreste, Aryl bzw. Aryldiylreste, in denen ein oder mehrere
Wasserstoffatome jeweils unabhängig
durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten
umfassen in nichtbegrenzender Weise -X, -R, -O– ,
-OR, -SR, -S– ,
-NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO,
-NCS, -NO, -NO2, =N2,
-N3, -S(O)2O–,
-S(O)2OH, -S(O)2R,
-P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R,
-C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–,
-C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin
jede X-Gruppe unabhängig
ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, eine Alkyl-, Aryl-
oder Heterocyclusgruppe ist. Besonders bevorzugte Substituenten
sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R,
-C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus -H, Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heterocyclusgruppe und Verbindungsgruppe.
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"Reaktive Verbindungsgruppe" betrifft eine chemisch
reaktive Gruppe, z.B. ein Nukleophil oder Elektrophil, die fähig ist,
sich mit einem anderen Molekül
umzusetzen, um eine kovalente Bindung oder Verbindung auszubilden.
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"Heterocyclus" betrifft ein Molekül mit einem
Ringsystem, in dem ein oder mehrere Ringatome durch ein Heteroatom,
z.B. Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatom, ersetzt wurden.
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"Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-Substituent" betrifft einen monovalenten
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus, der durch die Entfernung
eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Atom des Ringsystems abgeleitet
ist, um den Heterocyclus mit dem erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoff zu
verbinden (Joule et al., Heterocyclic Chemistry, 3. Auflage, Stanley
Thornes Publisher, Ltd., Cheltenham, U.K. (1998); Acheson R., An
Introduction to the Chemistry of Heterocyclic Compounds, 2. Auflage,
Interscience Publishers, Abteilung von John Wiley & Sons, New York
(1967)). Verschiedene Beispiele für Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen
sind in 11 dargestellt.
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"Substrat" ist eine Einheit,
an die erfindungsgemäße Farbstoffverbindungen
gebunden werden. Substrate umfassen in nicht-begrenzender Weise
ein (i) Polynukleotid, (ii) Nukleotid und Nukleotid, (iii) Peptid
und Protein, (iv) Kohlenhydrat, (v) einen Ligand und (vi) ein jegliches
Analogon der vorherstehenden (i) bis (v).
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"Enzymatisch einbaubar" betrifft eine Eigenschaft
eines Nukleotids, nach der es fähig
ist, enzymatisch an den Terminus, z.B. 3', einer wachsenden Polynukleotidkette
durch die Wirkung eines Polymerase-Enzyms eingebaut zu werden.
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"Terminator" betrifft ein enzymatisch
einbaubares Nukleotid, das nachfolgende Einbauten von Nukleotiden
in die sich ergebende Polynukleotidkette verhindert und dadurch
die Polymerase-Verlängerung
stoppt. Typischen Terminatoren fehlt ein 3'-Hydroxylsubstituent und sie umfassen
2',3'-Didesoxyribose,
2',3'-Didehydroribose
und 2',3'-Didesoxy-3'-halogenribose, z.B.
3'-Fluor. Alternativ
kann ein Ribofuranose-Analogon wie Arabinose verwendet werden. Bespiele
für Nukleotid-Terminatoren
umfassen 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl, β-D-Arabinofuranosyl,
3'-Desoxy-β-D-arabinofuranosyl,
3'-Amino-2',3'-didesoxy-β-D-ribofuranosyl
und 2',3'-Didesoxy-3'-fluor-β-D-ribofuranosyl
(Chidgeavadze et al., (1984) Nucleic Acids Research 12:1671–1686 und
Chidgeavadze et al., (1985) FEB. Lett. 183:275–278). Nukleotid-Terminatoren
umfassen auch reversible Nukleotid-Terminatoren (Metzker et al.,
(1994) Nucleic Acids Research 22(20):4259).
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"Enzymatisch erweiterbar" betrifft eine Eigenschaft
eines Nukleotids, nach der es an den Terminus eines Polynukleotids
enzymatisch einbaubar ist und das sich ergebende Polynukleotid nachfolgende
Einbauten von Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga durchlaufen kann.
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"Internukleotid-Analogon" betrifft ein Phosphatester-Analogon
von Oligonukleotiden, die in nicht-begrenzender Weise Alkylphosphonate,
Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphotriester, Phosphorothioate,
Phosphorodithioate, Phosphoroamidate umfassen. Internukleotid-Analoga
umfassen auch Nicht-Phosphat-Analoga,
bei denen die Zucker/Phosphatgruppe durch Amidbindungen wie 2-Aminoethylglycin-Einheiten, die
als PNA bezeichnet werden, ersetzt ist (Nielsen et al., (1991) "Sequence-selective
recognition of DNA by strand displacement with a thymidine-substituted
Polyamide", Science
254:1497–1500).
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"Zielsequenz" betrifft ein Polynukleotid,
eine DNA oder RNA, einzelsträngig
oder doppelsträngig, das/die
der Gegenstand einer Hybridisierung mit einem Primer oder einer
Sonde, einer enzymatischen Aktivität oder einer Detektion ist.
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"Spektral auflösbar" bedeutet bezüglich eines
Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen, dass die Fluoreszenz-Emissionsbanden
der entsprechenden Farbstoffe ausreichend getrennt, d.h. ausreichend
nicht-überlappend,
sind, so dass die Farbstoffe, entweder allein oder wenn sie mit
anderen Verbindungen konjugiert (markiert) sind, voneinander auf
der Basis ihrer Fluoreszenzsignale unter Verwendung von Standard-Fotodetektionssystemen,
wie Fotodetektoren, die eine Reihe von Bandfiltern und Photomultipliern
verwenden, ladungsgekoppelte Bauelemente (CCD), Spektrographen,
usw., unterscheidbar sind (Wheeless et al., (1985) Flow Cytometry:
Instrumentation and Data Analysis, Seiten 21–76, Academic Press, New York).
Vorzugsweise sind alle Farbstoffe, umfassend einen spektral auflösbaren Satz
von Farbstoffen, durch eine einzige Strahlungsquelle anregbar.
-
"Mobilitäts-übereinstimmend" betrifft einen Satz
von Fluoreszenzfarbstoffen, der, wenn er zur Markierung gleich langer
Polynukleotide verwendet wird, verschieden markierte Polynukleotide
mit im Wesentlichen ähnlichen
elektrophoretischen Mobilitäten
ergibt. Typischerweise werden die relativen elektrophoretischen
Mobilitäten
von Polynukleotiden, die mit einem Satz von Mobilitäts-übereinstimmenden
Farbstoffen markiert sind, um weniger als etwa ein halbes Nukleotid
variieren. Vorzugsweise sind die Mobilitäts-übereinstimmenden Farbstoffe,
wie vorstehend definiert, spektral auflösbar.
-
"Relative Fotostabilität" betrifft die chemische
Stabilität
von Fluoreszenzfarbstoffen relativ zu einem Referenzstandard, 5-Carboxyfluorescein,
wie durch Aussetzen gegenüber
weißer
Strahlung hoher Intensität mit
Probenmessung des verbleibenden Farbstoffs an dessen Absorptionsmaximum
gemessen. Gleiche optische Dichteinheiten des Testfarbstoffs und
der Referenz werden nebeneinander Strahlung als einem Korrelationstest
für die
Stabilität
unter der Laserinduzierten Fluoreszenz ausgesetzt, die für automatisierte
DNA-Sequenzierung- und
Fragmentanalyse-Anwendungen üblich
ist.
-
V.2 FARBSTOFFE
-
In
einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung eine neue Klasse von Fluoresceinartigen
Xanthenring-Verbindungen gemäß Struktur
I:
die mit mindestens einem
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus substituiert ist, der an
das Fluorescein-Ringsystem an R
1, R
2, R
3, R
4,
R
5 oder R
7 gebunden
ist. Der Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus kann an das Fluorescein-Ringsystem über eine
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder über eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung
gebunden sein. Alle molekularen Strukturen, die überall in dieser Beschreibung
bereitgestellt werden, sollen nicht nur die exakte dargestellte
elektronische Struktur umfassen, sondern auch alle Resonanzstrukturen,
Tautomere, Enantiomere, Diastereomere und Protonierungszustände davon
umfassen.
-
- R1, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R7 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R2, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
- R3, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe.
- R4, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R5 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R5, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R4 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R7, wenn für sich allein genommen, ist
ein H-, F-, Cl-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-,
(C1-C6)-substituierte
Alkyl-, (C1-C6)-Alkoxy-,
Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Imminium-, Amido-, Nitrilgruppe, eine
reaktive Verbindungsgruppe, eine Phenyl-, substituierte Phenyl-,
Aryl-, substituierte Aryl- oder Heterocyclusgruppe oder ist, wenn
mit R1 zusammen genommen, eine Benzo- oder
Heterocyclusgruppe.
- R6 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus (C1-C6)-Alkyl,
(C2-C6)-Alken-,
(C1-C6)-Alkin-,
Cyan-, heterocyclischer Aromaten-, Phenyl- und substituierter Phenylgruppe
mit der Struktur II: worin X1,
X2, X3, X4 und X5 für sich genommen
ein H-, Cl-, F-Atom, eine (C1-C6)-Alkyl-, (C2-C6)-Alken-, (C2-C6)-Alkin-, CO2H-, SO3H-, CH2OH-Gruppe oder eine reaktive Verbindungsgruppe
sind.
-
Besonders
bevorzugte Farbstoffe gemäß Y umfassen
diejenigen, in denen R4 mit R5 zusammen
genommen einen kondensierten Ring, z.B, eine Benzogruppe, bildet. Ähnlich bevorzugt
ist, wenn R1 zusammen genommen mit R7 einen kondensierten Ring, z.B. eine Benzogruppe,
bildet.
-
Bevorzugte
Farbstoffe umfassen diejenigen, in denen R1,
R2, R3 und R4 jeweils für sich genommen eine Phenyl-
und substituierte Phenyl-, Naphthyl-, substituierte Naphthylgruppe,
ein Fluor-, Chloratom, eine 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 2-Chinolyl- oder 3-Chinolylgruppe
sind. R5 und R7 sind
vorzugsweise Wasserstoffatome.
-
Eine
weitere Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß II umfasst
diejenigen, in denen die substituierte Phenylgruppe die Struktur
IIa aufweist:
-
-
Eine
bevorzugte Ausführungsform
von IIa ist diejenige, in der eine der X3-
und X4-Gruppen eine reaktive Verbindungsgruppe
ist und die andere ein Wasserstoffatom ist. Eine besonders bevorzugte
Ausführungsform
von IIa ist diejenige, in der eine der X3-
und X4-Gruppen eine Carboxylgruppe ist und
die andere ein Wasserstoffatom ist.
-
Verschiedene
Aspekte der vorstehend beschriebenen Erfindung ermöglichen
einen oder mehrere der nachstehenden wichtigen Vorteile gegenüber bekannten Fluoreszenzfarbstoffverbindungen,
die für
eine mehrfache Fluoreszenzdetektion geeignet sind: (1) die Emissionsspektren
der erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen
können
durch geringe Veränderungen
bezüglich
der Art und Position des Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus
und/oder der Arylsubstituenten moduliert werden, was die Bildung
von Farbstoffsätzen
mit ähnlichen
Absorptionseigenschaften, aber spektral auflösbaren Fluoreszenz-Emissionsspektren
ermöglicht,
(2) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen
können
leicht an Substrate ohne Beeinträchtigung
ihrer positiven Fluoreszenzeigenschaften angefügt werden, (3) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen
weisen enge Emissionsbandbreiten auf, d.h. die Emissionsbandbreite
weist eine Halbwertsbreite (FWHM) der Emissionsintensität von weniger
als etwa 45 nm auf, (4) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind
in gepufferten wässrigen
Lösungen
hochgradig löslich,
während
sie eine hohe Quantenausbeute beibehalten, (5) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen
sind relativ fotostabil und (6) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen
weisen relativ hohe Extinktionskoeffizienten auf, d.h. höher als
etwa 50000 (Benson et al., "Aromatic-substituted
xanthene dyes",
US-PS 6,008,379 , erteilt
am 28. Dezember 1999). Enge Emissionsbandbreiten, wie sie beispielhaft
durch den FWHM-Wert erläutert
sind, sind wünschenswert
zur Erleichterung der spektralen Auflösung in einem Gemisch von Substraten,
die mit mehr als einem (einem Satz) Fluoreszenzfarbstoff markiert
sind. Fotostabilität
ist eine wichtige Eigenschaft, insofern Substrate, z.B. Polynukleotide,
die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen
markiert sind, intensiver Laserstrahlung ausgesetzt werden können, um Fluoreszenz
für eine
Detektion zu induzieren. Ein Fotoausbleichen oder andere chemische
Abbaumechanismen vermindern oder verhindern eine Detektion von Substraten,
die mit Farbstoffen mit einer geringeren als optimalen Fotostabilität markiert
sind.
-
11 zeigt eine repräsentative
Auswahl von Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen, die als Substituenten
an den erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen
verwendet werden können.
Diese Heterocyclussubstituenten weisen direkte Wirkungen auf wichtige
spektrale Eigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen auf. Diese Wirkungen
werden beispielhaft durch die spektralen Eigenschaften von erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen
wie (i) Anregungs-, Emissions- und Absorptionsmaxima und -Spektren,
(ii) Fotostabilität, (iii)
Quantenausbeute und (iv) Energie-Transfer-Wirksamkeit erläutert.
-
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen
können
einen 5- bis 6-gliedrigen Ring aufweisen, der ein oder mehrere Stickstoffatome
in dem Ring enthält
(11). Der 5- bis 6-gliedrige
Ring kann an einen zweiten aromatischen Ring, z.B. einen Benzo-
oder substituierten Benzoring, oder gesättigten Ring, z.B. einer Cyclopentyl-
oder Cyclohexylgruppe, kondensiert sein. Der Heterocyclus kann andere
Heteroatome, z.B. Sauerstoff- oder Schwefelatome, in dem Ringsystem
enthalten.
-
Bevorzugte
Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclen umfassen in nichtbegrenzender
Weise diejenigen in der 11 und
2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 4-Pyridyl-, 2-Chinolyl-, 3-Chinolyl-, 4-Chinolyl-,
2-Imidazol-, 4-Imidazol-, 3-Pyrazol-, 4-Pyrazol-, Pyridazin-, Pyrimidin-,
Pyrazin-, Cinnolin-, Phthalazin-, Chinazolin-, Chinoxalin-, 3-(1,2,4-N)-Triazolyl-,
5-(1,2,4-N)-Triazolyl-, 5-Tetrazolyl-, 4-(1-O, 3-N)-Oxazol-, 5-(1-O,
3-N)-Oxazol-, 4-(1-S, 3-N)-Thiazol-, 5-(1-S, 3-N)-Thiazol-, 2-Benzoxazol-,
2-Benzothiazol-, Benzotriazol-, 4-(1,2,3-N)-Benzotriazin- und Benzimidazolgruppe.
Der Heterocyclus kann an das Xanthen-Ringsystem direkt über eine
Bindung mit einem Kohlenstoffatom des heterocyclischen Rings gebunden
sein. Alternativ kann der Heterocyclus an das Xanthen-Ringsystem über einen
ungesättigten
Linker gebunden sein, der die Delokalisierung der Aromatizität zwischen
dem Heterocyclus und dem Xanthen-Ringsystem erweitert. Linker, die
die erweiterte elektronische Delokalisierung erlauben, umfassen
in nichtbegrenzender Weise: (i) olefinische, -CR=CR-, (ii) polyolefinische, -(CR=CR)n-, worin n 2 bis 10 beträgt, (iii) acetylenische, -C≡C-, (iv)
polyacetylenische, -(C≡C)n-, worin n 2 bis 10 beträgt, (v) squarinische und (vi)
andere cyclisch konjugierte Linker. R ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Wasserstoffatom, (C1-C6)-Alkylgruppe,
Halogen-, Fluor-, Chloratom, CN-, CF3-,
Aryl- und substituierter Arylgruppe. Die Geometrie der olefinischen
Verbindungen kann cis oder trans, E oder Z sein.
-
V.2A ENERGIETRANSFER-FARBSTOFFE
-
In
einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Energietransfer-Farbstoffverbindungen,
die die Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten Fluorescein-Farbstoffverbindungen
der Struktur I enthalten. Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Energietransfer-Farbstoffe
einen Donor-Farbstoff, der Strahlung bei einer ersten Wellenlänge absorbiert
und Anregungsenergie als Antwort emittiert, einen Akzeptor-Farbstoff,
der fähig
ist, die Anregungsenergie, die von dem Donor-Farbstoff emittiert
wurde, zu absorbieren und bei einer zweiten Wellenlänge als
Antwort zu fluoreszieren, und einen Linker, der den Donor-Farbstoff
mit dem Akzeptor-Farbstoff verbindet, wobei der Linker wirksam ist,
einen effizienten Energietransfer zwischen dem Donor- und Akzeptor-Farbstoff
zu ermöglichen
und eine hohe Emissions-Quantenausbeute des Akzeptor-Farbstoffs aufrechtzuerhalten
(Lee et al., "Energy
transfer dyes with enhanced fluorescence",
US-PS 5,800,996 ,
erteilt am 1. September 1998; Lee et al., "Energy transfer dyes with enhanced fluorescence",
US-PS 5,945,526 , erteilt am 31. August
1999; Mathies et al., "Fluorescent
labels and their use in separations",
US-PS
5,654,419 , erteilt am 5. August 1997). In dem erfindungsgemäßen Energietransfer-Farbstoff
ist mindestens einer der Donor-Akzeptor-Farbstoffe ein Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierter
Fluorescein-Farbstoff.
-
Energietransfer-Farbstoffe
weisen Vorteile bei einer Verwendung in der gleichzeitigen Detektion
von mehrfach markierten Substraten in einem Gemisch wie DNA-Sequenzierung
auf. Ein einziger Donor-Farbstoff kann in einem Satz von Energietransfer-Farbstoffen
verwendet werden, so dass jedes Farbstoffpaar eine starke Absorption
bei einer gemeinsamen Wellenlänge
aufweist. Durch Variieren des Akzeptor-Farbstoffs in dem Energietransfersatz
können
dann die Akzeptor-Farbstoffe
durch ihre entsprechenden Emissionsmaxima spektral aufgelöst werden.
Energietransfer-Farbstoffe stellen auch eine größere effektiven Stokes-Verschiebung
als Nicht-Energietransfer-Farbstoffe bereit. Die Stokes-Verschiebung
ist die Differenz zwischen dem Anregungsmaximum, die Wellenlänge, bei
der der Donor-Farbstoff Strahlung maximal absorbiert, und dem Emissionsmaximum,
die Wellenlänge,
bei der der Akzeptor Strahlung maximal emittiert.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Linker zwischen dem Donor-Farbstoff und Akzeptor-Farbstoff eine
funktionelle Gruppe, die dem Linker einen gewissen Grad an struktureller
Starrheit verleiht, wie ein Alken, Dien, ein Alkin, ein 5- oder
6-gliedriger Ring mit mindestens einer ungesättigten Bindung oder eine kondensierte
Ringstruktur. Der Donor-Farbstoff und der Akzeptor-Farbstoff des
Energietransfer-Farbstoffs können über Linker
gebunden sein, die die Strukturen:
aufweisen,
worin n 1 oder 2 beträgt.
-
Die
Anbindungsstelle des Linkers zwischen dem Donor-Farbstoff und dem
Akzeptor-Farbstoff eines Energietransfer-Farbstoffs kann an einer
jeglichen Position R1-R7 liegen,
wobei einer von dem Donor-Farbstoff und dem Akzeptor-Farbstoff oder beide
ein erfindungsgemäßer Farbstoff
sind. Bevorzugte Anbindungsstellen umfassen R2,
R3, X3 und X4.
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Die
Energietransfer-Farbstoffverbindung ist an ein Substrat über einen
Linker kovalent gebunden. Dieser Linker kann eine Alkyldiyl- (C1-C12) oder Aryldiyl-
(C6-C20) Gruppe sein und funktionelle Gruppen
enthalten, einschließlich
Amid-, Carbamat-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Phosphat-, Phosphorothioatgruppe
und dergleichen. Bevorzugte Linker umfassen eine 1,2-Ethyldiyl-
und 1,6-Hexyldiylgruppe. Die Anbindungsstellen des Linkers zwischen
dem Energietransfer-Farbstoff und dem Substrat können an einer jeglichen Position
R1-R7 auf dem Energietransfer-Farbstoff
liegen, wobei einer von dem Donor-Farbstoff und dem Akzeptor-Farbstoff oder
beide ein erfindungsgemäßer Farbstoff
sind. Bevorzugte Anbindungsstellen umfassen R2,
R3, X3 und X4. Wenn das Substrat ein Nukleosid oder Nukleotid
ist, liegt eine bevorzugte Anbindungsstelle auf der Nukleobase.
Wenn das Substrat ein Oligonukleotid ist, umfassen bevorzugte Anbindungsstellen
die 3'- und 5'-Termini. Wenn das
Substrat ein Peptid oder Protein ist, umfassen bevorzugte Anbindungsstellen
die Amino- und Carboxyl-Termini.
-
V.3 SYNTHESEVERFAHREN
-
Mehrere
Syntheseverfahren sind für
die Synthese der erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffe
verfügbar.
Ein bevorzugtes Verfahren für
eine Synthese von Zwischenprodukten erfolgt über die Palladium-katalysierte
Suzuki-Boronat-Kopplungsreaktion,
wobei eine Arylboronsäure
mit einem Arylhalogenid gekoppelt wird, um ein Biarylprodukt mit
Regioselektivität
zu ergeben (Zhang et al., (1988) "Base and cation effects on the Suzuki
cross-coupling of bulky arylboronic acid with halopyridines: synthesis
of pyridylphenols",
J. Org. Chem. 63:6886-90; Martin et al., (1993) "Palladium-catalyzed cross-coupling reactions
of organoboronic acids with organic electrophiles", Acta Chemica Scan.
47:221-30; Aliprantis
et al., (1994) "Observation
of catalytic intermediates in the Suzuki reaction by electrospray
mass spectrometry",
J. Am. Chem. Soc. 116:6985-86; Thompson et al., (1984) "A general synthesis
of 5-arylnicotinates",
J. Org. Chem. 49:5237-43).
-
Das
Cyclisierungssubstrat 5 wird in 1 synthetisiert.
Die Suzuki-Reaktion wird wiederholt, zuerst durch Koppeln von 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure mit
2-Bromtoluol unter Tetrakis(triphenylphosphin)palladium-Katalyse,
um die Biphenylverbindung 1 zu ergeben. Eine regioselektive Bromierung
von 1 ergibt 2, gefolgt von einer Suzuki-Reaktion mit Pyridin-3-boronsäure unter
Palladium-Katalyse,
um 3 zu ergeben. Eine Demethylierung von 3 mit Bromwasserstoffsäure und
Essigsäure
ergab 4, gefolgt von einer Friedel-Crafts-Acylierung mit 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid,
um 5 zu ergeben.
-
Die
bromierte Naphthylverbindung 8 dient als ein gemeinsames Zwischenprodukt
für die
Synthese der cyclisierten Zwischenprodukte 11 und 12, was in 2 dargestellt ist. Ein Suzuki-Koppeln
von Pyridin-3-boronsäure
und Tol-2-ylboronsäure ergab
9 bzw. 10, die zu 11 und 12 demethylisiert wurden.
-
Eine
Cyclisierung eines äquimolaren
Gemisches der Zwischenprodukte 5 und
11 in Methansulfonsäure bei
100°C ergab
eine 30%ige Ausbeute an Farbstoff 13 (
3)
nach Chromatographie (Beispiel 13). Ebenso wurde 14 durch Cyclisierung
von 5 mit 12 gebildet (Beispiel 14). Farbstoff 15 (
4) wurde durch Cyclisierung von 5 und
2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin gebildet (Benson et al., "Asymmetric benzoxanthene
dyes",
US-PS 5,840,999 , erteilt am 24. November
1998). Der symmetrische Farbstoff 16 (
4)
wurde durch doppelte Cyclisierung von 2 Moläquivalenten 4 und einem Moläquivalent
2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
synthetisiert (Beispiel 16).
-
Durch
die gleichen Verfahren wurden die Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten
Fluorescein-Farbstoffe 19, 22 (5),
25 (6), 28 (7), 33 (8), 36 (9)
und 41 (10) synthetisiert (Beispiele
17-41).
-
V.4 MARKIERUNGSREAGENZIEN
DER FARBSTOFFE
-
Die
Erfindung umfasst Markierungsreagenzien, worin Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierte
Fluorescein-Farbstoffe in einer reaktiven Form vorliegen, um sich
mit Substraten umzusetzen. In einem weiteren Aspekt umfasst die
Erfindung Substrate, die mit den erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen, d.h.
Struktur I, markiert oder konjugiert sind. Substrate können nahezu
ein jegliches Molekül
oder eine jegliche Substanz sein, mit dem/die die erfindungsgemäßen Farbstoffe
konjugiert werden können,
einschließlich beispielsweise
und nicht darauf begrenzt Proteine, Polypeptide, Polysaccharide,
Nukleoside, Nukleotide, Polynukleotide, Lipide, Festträger, organische
und anorganische Polymere und Kombination und Vereinigungen davon,
wie Chromosomen, Zellkerne, lebende Zellen (z.B. Bakterien oder
andere Mikroorganismen, Säugetierzellen,
Gewebe, usw.) und dergleichen. Die Farbstoffe werden mit dem Substrat über einen
optionalen Linker durch eine Vielzahl von Mitteln konjugiert, einschließlich hydrophobe
Anziehung, ionische Anziehung und kovalente Bindung. Vorzugsweise
sind die Farbstoffe mit dem Substrat über eine kovalente Bindung
konjugiert.
-
Eine
Markierung entsteht typischerweise durch Mischen eines geeigneten
reaktiven Fluoreszenzfarbstoffs und eines zu konjugierenden Substrats
in einem geeigneten Lösungsmittel,
in dem beide löslich
sind, unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren (Hermanson,
Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643-71
(1996)), gefolgt von einer Trennung des Konjugats von jeglichen
unkonjugierten Ausgangsmaterialien oder ungewollten Nebenprodukten.
Das Farbstoffkonjugat kann für eine
spätere
Verwendung trocken oder in Lösung
gelagert werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffe
können
eine reaktive Verbindungsgruppe an einer der Substituentenpositionen
R1-R5, R7, X1-X5 oder
eine kovalente Bindung des Farbstoffs an ein anderes Molekül, d.h.
ein Substrat, umfassen. Reaktive Verbindungsgruppen sind Gruppen
auf dem Farbstoff und auf dem Substrat, die zur Ausbildung einer
kovalente Bindung fähig
sind. Typischerweise weist der Farbstoff (eine) elektrophile funktionelle
Gruppe(n), die zur Umsetzung mit (einer) nukleophilen funktionellen
Gruppe(n) auf dem Substrat fähig
ist/sind. Beispiele für
Substrat-Nukleophile umfassen Alkohole, Alkoxide, Amine, Hydroxylamine
und Thiole. Die Auswahl der reaktiven Verbindungsgruppen, die verwendet
werden, um den Farbstoff an das Substrat zu binden, hängt typischerweise
von der komplementären
Funktionalität
auf dem zu konjugierenden Substrat ab. Beispiele für elektrophile
reaktive Verbindungsgruppen umfassen Succinimidylester, Isothiocyanat, Sulfonylchlorid,
Sulfonatester, Silylhalogenid, 2,6-Dichlortriazinyl, Pentafluorphenylester,
Phosphoramidit, Maleinimid, Halogenacetyl, Epoxid, Alkylhalogenid,
Allylhalogenid, Aldehyd, Keton, Acylazid, Anhydrid und Iodacetamid.
Ein einziger Typ einer reaktiven Verbindungsgruppe kann auf dem
Substrat verfügbar
sein (typisch für
Polysaccharide) oder eine Vielzahl von Gruppen kann auftreten (z.B.
Amine, Thiole, Alkohole, Phenole), wie es für Proteine typisch ist. Ein
konjugiertes Substrat kann an mehr als einen Farbstoff, der gleich
oder verschieden sein kann, oder an ein Substrat konjugiert werden,
das zusätzlich
durch ein Hapten modifiziert ist. Obwohl eine gewisse Selektivität durch
eine vorsichtige Steuerung der Reaktionsbedingungen erhalten werden
kann, wird die beste Markierungsselektivität durch eine Auswahl eines
geeigneten reaktiven Farbstoffs erhalten.
-
Eine
bevorzugte reaktive Verbindungsgruppe ist ein N-Hydroxysuccinimidylester
(NHS) eines Carboxylgruppensubstituenten des Fluorescein-Farbstoffs.
Die NHS-Esterform des Farbstoffs ist ein bevorzugtes Markierungsreagenz.
Der NHS-Ester des
Farbstoffs kann vorher gebildet, isoliert, gereinigt und/oder charakterisiert
werden oder er kann in situ gebildet und mit einer nukleophilen
Gruppe eines Substrats, wie eines Oligonukleotids, eines Nukleotids,
eines Peptids oder dergleichen, umgesetzt werden. Typischerweise
wird die Carboxyl-Form der erfindungsgemäßen Farbstoffe, z.B. die Farbstoffverbindungen
der Tabelle 1, mit einem Carbodiimidreagenz, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid,
Diisopropylcarbodiimid, oder einem Uroniumreagenz, z.B. HBTU (O-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'tetramethyluroniumhexafluorophosphat)
oder HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat),
und einem Aktivator, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)
und N-Hydroxysuccinimid, umgesetzt, um den NHS-Ester des Farbstoffs zu ergeben.
-
Bevorzugte
Substituentenpositionen für
NHS-Ester auf dem erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoff
sind X3 und X4 (Ia).
Ein repräsentatives
Beispiel eines NHS-Esters ist die Struktur Ib:
-
-
Eine
weitere bevorzugte reaktive Verbindungsgruppe ist eine Phosphoramid-Form der erfindungsgemäßen Farbstoffe.
Phopshoramidit-Farbstoffreagenzien sind für die automatisierte Synthese
von Oligonukleotiden besonders geeignet, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen
markiert sind. Oligonukleotide werden herkömmlich auf Festträgern durch
das Phosphoramidit-Verfahren unter Verwendung von Phosphoramidit-Nukleosid-Reagenzien
synthetisiert (Caruthers M. und Beaucage S., "Phosphoramidite compounds and processes",
US-PS 4,415,732 , erteilt am 15. November
1983; Caruthers M. und Matteucci M., "Process for preparing polynucleotides",
US-PS 4,458,066 , erteilt am 3. Juli
1984; Beaucage S. und Iyer R., (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides
by the phosphoramidite approach",
Tetrahedron 48:2223-2311). Die Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien
können
nukleosidisch oder nichtnukleosidisch sein und können in geeigneter Weise zur
Markierung von synthetischen Oligonukleotiden oder Polynukleotid-Analoga
an deren 3'-Terminus, 5'-Terminus und/oder an einer oder mehreren
inneren Positionen verwendet werden. Nicht-nukleosidische Formen
der Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien weisen die allgemeine Struktur
III
auf, worin DYE eine geschützte oder
ungeschützte
Form des Farbstoffs I ist, einschließlich eines Energietransfer-Farbstoffs.
L ist ein Linker. R
11 und R
12,
für sich
genommen, sind Alkyl- (C
1-C
12),
Alken-, Aryl- und Cycloalkylgruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen
oder R
11 und R
12 zusammen
genommen mit dem Stickstoffatom bilden einen gesättigten Stickstoffheterocyclus.
R
13 ist eine Phosphitester-Schutzgruppe,
die eine unerwünschte
Verlängerung
des Oligonukleotids verhindert. Im Allgemeinen ist R
13 stabil
gegenüber
Oligonukleotid-Synthesebedingungen, kann jedoch von einem synthetischen
Oligonukleotidprodukt mit einem Reagenz entfernt werden, das die
Integrität
des Oligonukleotids oder des Farbstoffs nicht nachteilig beeinflusst.
Eine Vielzahl von Phosphitestergruppen mit diesen Eigenschaften
ist bekannt. Vorzugsweise ist R
13 eine Methyl-,
2-Cyanethylgruppe,
-CH
2CH
2CN, und 2-(4-Nitrophenyl)ethylgruppe,
-CH
2CH
2(p-NO
2Ph).
Bevorzugte Ausführungsformen
von Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien sind diejenigen, in denen:
(i) R
11 und R
12 jeweils
eine Isopropylgruppe sind, (ii) R
11 und
R
12 zusammen genommen eine Morpholinogruppe
sind, (iii) L eine Alkyl- (C
1-C
12) Gruppe
ist, (iv) R
13 eine 2-Cyanethylgruppe ist
und (v) DYE an R
6 über einen Linker gebunden ist.
Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien III bewirken ein Markieren eines
Substrats mit einem einzelnen erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoff. Wenn
das Substrat ein Oligonukleotid ist, wird der Farbstoff an den 5'-Terminus des Oligonukleotids
als eine Folge der 3'-
zu 5'-Richtung der
Synthese gebunden sein. Andere Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien,
nukleosidische und nicht-nukleosidische, ermöglichen ein Markieren an anderen Stellen
eines Oligonukleotids, z.B. 3'-Terminus,
Nukleobase, Internukleotidverbindung, Zucker. Ein Markieren an der
Nukleobase, Internukleotidverbindung und den Zuckerstellen ermöglicht ein
internes und mehrfaches Markieren mit Fluoreszenzfarbstoffen.
-
Bei
Umsetzung mit einer Hydroxylgruppe, z.B. einer 5'-terminalen OH-Gruppe eines an einem
Festträger
gebundenen Oligonukleotids, unter milder Säure-Aktivierung reagiert das Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenz
III, um eine Internukleotid-Phosphitgruppe zu bilden, die sodann
zu einer Internukleotid-Phosphatgruppe oxidiert wird. In einigen
Fällen
kann der Farbstoff funktionelle Gruppen enthalten, z.B. phenolische
Sauerstoffe wie in Struktur I, die ein Schützen entweder während der
Synthese des Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzes oder während seiner
nachfolgenden Verwendung zur Markierung von Molekülen wie
Oligonukleotiden benötigen.
Die verwendete(n) Schutzgruppe(n) wird/werden von der Art der funktionellen
Gruppen abhängen und
werden dem Fachmann ersichtlich sein (Greene T. und Wuts P., Protective
Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York,
1991). Im Allgemeinen sollten die verwendeten Schutzgruppen unter
den sauren Bedingungen (z.B. Trichloressigsäure, Dichloressigsäure), die
herkömmlicherweise
in einer Oligonukleotidsynthese verwendet werden, um 5'-Hydroxyl-Schutzgruppen
(z.B. Dimethoxytritylgruppe) zu entfernen, stabil sein und unter
den basischen Bedingungen (Ammoniumhydroxid, wässriges Ethylamin), die zum Deprotonieren
und/oder Abspalten synthetischer Oligonukleotide von Festträgern verwendet
werden, labil sein.
-
Stabile
Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien können durch anfängliches
Schützen
der Xanthenring-Sauerstoffe der Struktur I gebildet werden, typischerweise
durch Veresterung, z.B. Acylierung als Pivalat- (R=tBu) oder Benzoat-
(R=Ph) Ester. Eine Veresterung bewirkt eine Lactonisierung der Strukturen
Ia, was das Reagenz in den nicht-fluoreszierenden, geschützten Zustand,
z.B. Struktur Ic, bringt:
-
-
Wenn
eine der X3- und X4-Gruppen
ein Wasserstoffatom ist und die andere eine Carboxylgruppe ist, kann
der Farbstoff in ein nicht-nukleosidisches Phosphoramidit-Farbstoff-Markierungs-Reagenz,
z.B. Id, durch bekannte Reaktionen umgewandelt werden, wie eine
Aktivierung der Carboxylgruppe, Amidierung mit 6-Amino-1-hexanol und Phosphitylierung
von Hydroxylgruppen mit Bis(diisopropylamino)cyanethylphosphit (Theisen
et al., (1992) "Fluorescent
dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides", in Nucleic Acid
Symposium Series Nr. 27, Oxford University Press, Oxford, Seiten
99–100).
-
-
Erfindungsgemäße Farbstoffe
können
auch kovalent an Festträger
für die
automatisierte Synthese von Oligonukleotiden gebunden werden (Mullah
B, und Andrus A., "Solid
support reagents for the direct synthesis of 3'-labelled polynucleotides",
US-PS 5,736,626 , erteilt am 7. April
1998; Caruthers M. und Matteucci M., "Process for preparing polynucleotides",
US-PS 4,458,066 , erteilt am 3. Juli
1984). In einer Ausführungsform
ist der Farbstoff an einen Linker gebunden, der eine Anbindung an
einen Festträger,
z.B. kontrolliertes Porenglas (Nelson et al., (1992) "Oligonucleotide labeling
methods 3. Direct Labeling of oligonucleotides employing a novel,
non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone", Nucl. Acids Res. 20:6253-59; Nelson
P., "Multifunctional
controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis",
US-PS 5,141,813 , erteilt am 25. August
1992) oder Polystyrol (Andrus et al., "Automated system for polynucleotide synthesis
and purification",
US-PS 5,047,524 , erteilt
am 10. September 1991 und US-PS 5,262,530, erteilt am 16. November
1993), und eine säurelabile
Funktionalität
für eine
Verlängerung
mit Phosphoramidit-Nukleosid-Reagenzien aufweist. Nach Abspaltung
und Entschützen
kann das markierte Oligonukleotid einen erfindungsgemäßen Farbstoff
an dem 3'-Terminus tragen.
-
V.4A NUKLEOTID-MARKIERUNG
-
Eine
bevorzugte Klasse von markierten Substraten umfasst Konjugate von
Nukleosiden und Nukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoffen
markiert sind. Derartig markierte Nukleoside und Nukleotide sind
zum Markieren von Polynukleotiden, die durch enzymatische Synthese
gebildet werden, besonders geeignet, z.B. markierte Nukleotid 5'-triphosphate, die
im Zu sammenhang mit PCR-Amplifikation, Polynukleotid-Sequenzierung
des Sanger-Typs
und Nick-Translationsreaktionen verwendet werden.
-
Der
Farbstoff kann entweder an den Zucker oder die Nukleobase konjugiert
sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Verbindung ein terminierendes Ribonukleosid-5'-triphosphat, ein "Terminator", worin der Farbstoff
kovalent an die Nukleobasen-Gruppe gebunden ist. Solche Terminatoren
können,
wenn sie zusammen mit 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphaten, "dNTP", oder Ribonukleosid-5'-triphosphaten, "NTP", geeigneten Polymerase-Enzymen
und mit einem Primer versehenden Ziel-Polynukleotiden verwendet
werden, verwendet werden, um eine Reihe von terminierten Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten
Fluorescein-Farbstoff-markierten Polynukleotid-Fragmenten über Ziel-vermittelte
enzymatische Synthese für
Anwendungen wie DNA-Sequenzierung zu erzeugen. Nukleoside und Nukleotide
können
an Stellen auf den Zucker- oder Nukleobasen-Gruppen markiert werden.
Bevorzugte Nukleobasen-Markierungsstellen
umfassen das 8-C-Atom einer Purin-Nukleobase, das 7-C- oder 8-C-Atom einer
7-Deazapurin-Nukleobase und die 5-Position einer Pyrimidin-Nukleobase.
Zwischen einem Nukleosid oder Nukleotid und einem Farbstoff kann
ein Linker an den Farbstoff an einer jeglichen Position R1 bis R7 gebunden
sein.
-
Die
markierten Nukleoside oder Nukleotide können enzymatisch einbaubar
und enzymatisch erweiterbar sein. Nukleoside oder Nukleotide, die
mit erfindungsgemäßen Farbstoffen
markiert sind, können
die Struktur IV:
aufweisen, worin DYE eine
geschützte
oder ungeschützte
Form des Farbstoffs I ist, einschließlich eines Energietransfer-Farbstoffs.
B ist eine Nukleobase, z.B. Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin,
Guanin und 8-Deazaguanosin. R
8 ist H, ein
Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Thiophosphat oder Phosphat-Analogon.
R
9 und R
10, wenn
für sich
genommen, sind jeweils unabhängig
H, HO, F. Wenn das markierte Nukleosid oder Nukleotid ein Terminator
ist, werden R
9 und R
10 ausgewählt, um
die Polymerase-vermittelte Ziel-gerichtete Polymerisation zu blockieren.
In Terminator-Nukleotiden sind R
9 und R
10, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig H,
F und eine Gruppe, die eine Polymerasevermittelte Ziel-gerichtete
Polymerisation blockiert, oder, wenn sie zusammen genommen werden,
bilden sie 2'-3'-Didehydroribose.
-
Der
Linker L kann:
sein, worin n den Wert 0,
1 oder 2 aufweist.
-
V.4B OLIGONUKLEOTID-MARKIERUNG
-
Eine
weitere bevorzugte Klasse von markierten Substraten umfasst Konjugate
von Oligonukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffen
markiert sind. Derart markierte Polynukleotide oder Analoga sind
in einer Vielzahl von wichtigen Zusammenhängen verwendbar, einschließlich als
DNA-Sequenzierungsprimer, PCR-Primer, Oligonukleotid-Hybridisierungssonden,
Oligonukleotid-Ligationssonden, doppelmarkierte 5'-Exonuklease- (TaqMan
TM)- Sonden und dergleichen (Fung et al., "Amino-derivatized
phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors,
and useful conjugates thereof",
US-PS 4,757,141 , erteilt
am 12. Juli 1988; Andrus A., "Chemical
methods of 5' non-isotopic
labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach,
Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54; Hermanson, (1996) Bioconjugate
Techniques, Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643-71).
Ein markiertes Oligonukleotid kann die Struktur V:
aufweisen, wobei das Oligonukleotid
2 bis 100 Nukleotide umfasst. DYE ist ein Fluoreszenzfarbstoff I,
einschließlich
eines Energietransfer-Farbstoffs. B ist eine Nukleobase, z.B. Uracil,
Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin.
L ist ein Linker. R
10 ist H, OH, ein Halogenid,
Azid, Amin, Alkylamin, eine Alkyl- (C
1-C
6), Allyl-, Alkoxy- (C
1-C
6), OCH
3- oder OCHaCH=CH
2-Gruppe.
R
15 ist H, ein Phosphat, Internukleotid-Phosphordiester
oder Internukleotid-Analogon. R
16 ist H,
ein Phosphat, Internukleotid-Phosphordiester oder Internukleotid-Analogon.
In dieser Ausführungsform,
Struktur V, kann das Nukleobase-markierte Oligonukleotid mehrere
erfindungsgemäße Farbstoffe
tragen, die über
die Nukleobasen gebunden sind.
-
Das
Nukleobase-markierte Oligonukleotid V kann gebildet werden durch:
(i) enzymatischen Einbau von enzymatischen einbaubaren Nukleotid-Reagenzien
IV, wobei R8 ein Triphosphat ist, durch
eine DNA-Polymerase oder Ligase und (ii) Koppeln von Phoshoramidit-Farbstoff-Nukleosidreagenzien
VI durch automatisierte Synthese.
-
Im
Allgemeinen wird, wenn das markierte Oligonukleotid durch enzymatische
Synthese hergestellt wird, das nachstehende Verfahren verwendet.
Eine Ziel-DNA wird
denaturiert und ein Oligonukleotidprimer wird an die Ziel-DNA angelagert.
Ein Gemisch von enzymatisch einbaubaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga,
die zur Unterstützung
einer kontinuierlichen Ziel-gerichteten enzymatischen Verlängerung
des mit einem am Ziel angelagerten Primers (z.B. ein Gemisch, umfassend
dGTP, dATP, dCTP und dTTP oder dUTP) fähig sind, wird zu dem mit einem
am Ziel angelagerten Primer gegeben. Mindestens eine Fraktion der
Nukleotide ist mit einem Farbstoff I markiert oder sind markierte
Terminatoren, wie zuvor beschrieben. Als nächstes wird ein Polymerase-Enzym
zu dem Gemisch unter solchen Bedingungen gegeben, unter denen das
Polymerase-Enzym aktiv ist. Ein markiertes Oligonukleotid wird durch
den Einbau der markierten Nukleotide oder Terminatoren während der
Polymerase-vermittelten Strangsynthese gebildet.
-
In
einem alternativen enzymatischen Syntheseverfahren werden zwei Primer
anstelle von einem verwendet: einer, der komplementär zum (+)-Strang
der Zielsequenz ist, und ein anderer, der komplementär zum (-)-Strang
der Zielsequenz ist, die Polymerase ist eine thermostabile Polymerase
und die Reaktionstemperatur wird zwischen einer Denaturierungstemperatur
und einer Verlängerungstemperatur
cyclisiert, wodurch ein markiertes Gegenstück zu der Zielsequenz durch
PCR exponentiell amplifiziert wird (Innis et al., (1990) PCR Protocols,
Hrsg., Academic Press). Ein oder beide Primer können mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert
sein. Alternativ kann ein oder mehrere der Nukleotid-5'-triphosphate mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff
markiert sein. Jedes Markierungsschema führt zu einem DNA-Amplifikationsprodukt,
das einen oder mehrere erfindungsgemäße Farbstoffe trägt.
-
Internes
Markieren von Oligonukleotiden mit erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoffen
kann mit Nukleosid-Phosphoramidit-Farbstoff-Reagenzien der allgemeinen
Struktur VI:
erfolgen, worin DYE eine
geschützte
oder ungeschützte
Form von Farbstoff I ist. Die exocyclischen Amine und andere Funktionalitäten der
Nukleobase B können
ein Schützen
während
der Synthese des Nukleosid-Phoshporamidit-Farbstoff-Reagenzes und/oder
während
seiner nachfolgenden Verwendung, um markierte Oligonukleotide zu
synthetisieren, erfordern. Die ausgewählte(n) bestimmte(n) Schutzgruppe(n)
wird/werden von der Art der Nukleobase oder des Nukleobasen-Analogons
abhängen
und wird/werden für
den Fachmann ersichtlich sein. Beispielsweise können die exocyclischen Amine
von Adenin und Cytosin mit einer Benzoylgruppe (bz) geschützt werden
und das exocyclische Amin von Guanin kann mit Dimethylformamid (dmf)
oder einer Isobutyrylgruppe (ibu) unter Verwendung bekannter Verfahren
geschützt
werden. Vorzugsweise wird die Nukleobase mit Gruppen geschützt, die
leicht unter milden basischen Bedingungen entfernt werden können. Beispielsweise
können
Oligonukleotide, die mit dA
bz-, dC
bz-, dG
dmf- und T-Phosphoramidit-Nukleosiden
(und deren entsprechenden 3'-Nukleosid-Festträgern) synthetisiert
wurden, in 60 Minuten in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 65°C gespalten
und entschützt
werden (Beaucage S. und Iyer R., (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides
by the phosphoramidite approach",
Tetrahedron 48:2223-2311).
-
R11 und R12 für sich genommen
werden ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- (C1-C6), Alken-, Aryl- und Cycloalkylgruppe mit
bis zu 10 Kohlenstoffatomen, z.B. Isopropylgruppe, oder R11 und R12 zusammen
genommen mit dem Stickstoffatom bilden einen gesättigten Stickstoffheterocyclus,
z.B. eine Morpholinogruppe. R13 ist eine
Phosphitester-Schutzgruppe, z.B. eine Methyl-, 2-Cyanethyl- und
2-(4-Nitrophenyl)ethylgruppe. R14 ist eine
säurespaltbare
Hydroxyl- Schutzgruppe,
z.B. eine Dimethoxytritylgruppe, die eine anschließende Monomer-Kopplung
ermöglicht.
-
Der
Linker L von VI kann
-
-
Reagenzien
IV und VI sind bei der Herstellung von Oligonukleotiden V, die mit
den erfindungsgemäßen Farbstoffen
I markiert sind, wirksam. Eine weitere Ausführungsform eines markierten
Oligonukleotids am 5'-Terminus
gemäß der Struktur
VII:
markiert, worin X O, NH oder
S ist, L eine Alkyldiyl- (C
1-C
12)
Gruppe oder ein Mobilitäts-Modifizierungsmittel
ist und das markierte Oligonukleotid nur eine DYE-Gruppe enthält. Mobilitäts-Modifizierungsmittel-Linker
beeinflussen die elektrophoretische Mobilität oder hydrophoben Eigenschaften
des Oligonukleotids. Beispiele für Mobilitäts-Modifizierungsmittel-Linker
umfassen Ethylenoxy-Einheiten,
-(CH
2CH
2O)
n-, worin n 1 bis 100 sein kann (Grossman
et al., "Method
of DNA sequencing employing a mixed DNA-polymer chain probe",
US-PS 5,624,800 , erteilt am 29. April
1997). Vorzugsweise weist n einen Wert von 2 bis 20 auf. Markierte
Oligonukleotide VII können
durch automatisierte Synthese mit Phosphoramidit-Reagenzien III,
insbesondere für
Beispiel Id, gebildet wer den. Alternativ können markierte Oligonukleotide
VII bei der Umsetzung einer reaktiven Verbindungsgruppen-Form eines
erfindungsgemäßen Farbstoffs,
z.B. Ib, mit einem 5'-Aminoalkyl-Oligonukleotid
gebildet werden.
-
In
einem bevorzugten chemischen Nachsynthesemarkierungsverfahren wird
ein Oligonukleotid wie folgt markiert. Ein Farbstoff gemäß Struktur
Ib wird in DMSO gelöst
oder suspendiert und im Überschuss (10-20x)
zu einem 5'-Aminohexyl-Oligonukleotid
in 0,25 M Bicarbonat/Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von etwa
9 gegeben und eine Umsetzung für
6 Stunden wird ermöglicht,
z.B.
US-PS 4,757,141 .
Das farbstoffmarkierte Oligonukleotid VII kann von nichtumgesetztem
Farbstoff mittels eines Durchlaufs durch eine Größenausschluss-Chromatographiesäule getrennt
werden, wobei mit Puffer, z.B. 0,1 molares Triethylaminacetat (TEAA),
eluiert wird. Die Fraktion mit dem unbehandelten markierten Oligonukleotid
VII, worin L -(CH
2)
6-
ist, wird durch Umkehrphasen-HPLC
unter Verwendung einer Gradientenelution weiter gereinigt.
-
V.5 KITS
-
Die
Erfindung umfasst Kits, die die erfindungsgemäßen Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten
Fluorescein-Farbstoffe und/oder deren markierte Konjugate umfassen.
In einer Ausführungsform sind
die Kits für
die Konjugation der erfindungsgemäßen Farbstoffe an andere Moleküle, d.h.
Substrate, geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen einen erfindungsgemäßen Farbstoff,
einschließlich
einer optionalen Verbindungsgruppe, und Reagenzien, Enzyme, Puffer,
Lösungsmittel,
usw., die für
eine Konjugation des Farbstoffs an ein anderes Molekül oder eine
andere Substanz geeignet sind.
-
In
einer Ausführungsform
sind die Kits zur Markierung von enzymatisch synthetisierten Oligonukleotiden
und Polynukleotiden mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen geeignet. Solche
Kits umfassen im Allgemeinen ein markiertes enzymatisch einbaubares,
erfindungsgemäßes Nukleotid
oder Nukleotid-Analogon, ein Gemisch von enzymatisch einbaubaren
Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die zur Unterstützung einer
kontinuierlichen Primer-Verlängerung
fähig sind,
und ein Polymerase-Enzym. Vorzugsweise ist das markierte enzymatisch
einbaubare Nukleotid oder Nukleotid-Analogon eine Verbindung gemäß der Struktur
IV, am meisten bevorzugt ein markierter Terminator. Bevorzugte Polymer asen
sind thermostabil wie AMPLITAQ®-DNA-Polymerase FA (PE
Biosystems, Foster City, CA).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
sind die Kits zur Markierung von synthetischen Oligonukleotiden mit
den erfindungsgemäßen Phosphoroamidit-Farbstoffreagenzien
geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen ein Phosphoramidit-Farbstoffreagenz,
andere Synthesereagenzien und/oder Festträger, gegebenenfalls zur Durchführung einer
Oligonukleotidsynthese (Andrus et al., "Automated system for polynucleotide
synthesis and purification",
US-PS 5,262,530 , erteilt
am 16. November 1993).
-
V.6 VERFAHREN ZUR VERWENDUNG
MARKIERTER REAGENZIEN
-
Die
erfindungsgemäßen Farbstoffe
und Reagenzien sind für
ein jegliches Verfahren gut geeignet, das Fluoreszenzdetektion verwendet,
insbesondere Verfahren, die die gleichzeitige Detektion von vielen
räumlich-überlappenden
Analyten benötigen
(Menchen et al., "4,7-dichlorofluorescein
dyes as molecular probes", US-PS 5,188,934, erteilt
am 23. Februar 1993). Erfindungsgemäße Farbstoffe und Reagenzien
sind zur Identifizierung von Klassen von Polynukleotiden gut geeignet,
die einem biochemischen Trennungsverfahren wie Elektrophorese unterzogen
wurden oder die über
Positionen in einer räumlich
adressierbaren Hybridisierungsanordnung verteilt worden sind.
-
Diese
Anwendungen umfassen eine Verwendung der markierten Oligonukleotide
als 5'-markierte
Sequenzierungsprimer, 5'-markierte
Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Primer, Hybridisierungssonden und
Ligations-Assay-Sonden. PCR-Anwendungen
umfassen die Verwendung von markierten Oligonukleotiden für eine Genotypisierung
durch Verfahren mit Tandemwiederholung mit variabler Anzahl (VNTR),
kurzer Tandemwiederholung (STR) und Mikrosatellitenverfahren zur
Amplifikation von Wiederholungsabschnitten von doppelsträngiger DNA,
die benachbarte mehrfache Kopien einer bestimmten Sequenz enthält, wobei
die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten variabel ist. Vorzugsweise
ist in solchen PCR-Genotypisierungsverfahren der PCR-Primer mit
einem erfindungsgemäßen Farbstoff
markiert.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen Fluorescein-Farbstoffe
in quantitativen Verfahren und Reagenzien verwen det werden, die
Echtzeit- oder Endpunktsmessungen von Amplifikationsprodukten während der
PCR bereitstellen (Gelfand et al., "Homogenous assay system using the nuclease
activity of a nucleic acid polymerase",
US-PS
5,210,015 , erteilt am 9. Mai 1993; Livak et al., "Method for Detecting
Nucleic Acid Amplification Using Self-Quenching Fluorescence Probe",
US-PS 5,538,848 , erteilt am 23. Juli
1996). Der Exonuklease-Assay (Tagman
®),
der Fluoreszenzfarbstoff-Löscher-Sonden
einsetzt (Livak et al., "Self-quenching
fluorescence probe",
US-PS 5,723,591 , erteilt
am 3. März
1998; Mullah et al., (1998) "Efficient
synthesis of double dye-labelled oligodeoxyribonucleotide probes
and their application in a real time PCR assay", Nucl. Acids Res. 26:1026-1031), ergibt
eine direkte Detektion von Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Produkten
in einem geschlossenen Gefäßsystem
ohne Probenverarbeitung über
diejenige hinaus, die für
die Durchführung
der PCR benötigt
wird. In dem Tagman-Assay setzt die Polymerase, die eine Primer-Verlängerung
durchführt
und das Polynukleotid amplifiziert, auch eine Sonde, die an die
Zielsequenz angelagert ist, frei und spaltet diese Sonde durch 5'- zu 3'-Exonuklease-Aktivität. In einem
Tagman-artigen Assay ist die Sonde selbstlöschend, mit einem Fluoreszenzfarbstoff
und Löscher-Gruppen markiert,
wobei einer von beiden ein erfindungsgemäßer Farbstoff sein kann. Eine
spektrale Überlappung
ermöglicht
einen effizienten Energietransfer (FRET), wenn die Sonde intakt
ist (Clegg R., (1992) "Fluorescence
resonance energy transfer and nucleic acids", Meth. Enzymol. 211:353-388). Die Sonde
wird, wenn sie an eine Zielsequenz hybridisiert, während der
PCR abgespalten, um ein Fluoreszenzsignal freizusetzen, das zu der
Menge des vorhandenen Ziel-Sonden-Hybrids
proportional ist (Livak et al., "Method
for Detecting Nucleic Acid Amplification Using Self-Quenching Fluorescence
Probe",
US-PS 5,538,848 , erteilt
am 23. Juli 1996; Livak et al., "Self-quenching
fluorescence probe",
US-PS 5,723,591 , erteilt
am 3. März
1998).
-
In
einem noch weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verwendung
der erfindungsgemäßen Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierten
Fluorescein-Farbstoffe bereitgestellt, um ein Ziel-Polynukleotid
zu sequenzieren. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen die Bildung
einer Reihe von Polynukleotiden unterschiedlicher Größe, die
mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff
markiert sind, eine Größen-basierende
Trennung der Reihe von markierten Polynukleotiden unterschiedlicher
Größe und eine
Detektion der getrennten markierten Polynukleotide, basierend auf
der Fluoreszenz des Farbstoffs.
-
Die
Reihe von markierten Polynukleotiden unterschiedlicher Größe kann
herkömmlich
durch enzymatische Verlängerung
einer Primerzielsequenz gemäß bekannten
Methoden hergestellt werden (Sanger et al., (1977) "DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors",
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467; Hunkapiller et al., "Real time scanning
electrophoresis apparatus for DNA sequencing",
US-PS
4,811,218 , erteilt am 7. März 1989; PE Corp., Januar 1995,
ABI PRISM
TM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A,
Kapitel 2 (P/N 903433, PE Coprporation, Foster City, CA)). Zum Beispiel
kann die Reihe von markierten Polynukleotiden dadurch erhalten werden,
dass ein markierter Primer verwendet und eine Zielsequenz, an der
das markierte Ziel angelagert ist, in der Gegenwart einer Polymerase,
dNTP und mindestens eines Terminators (z.B. 2',3'-Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphat) enzymatisch
verlängert
wird. Alternativ kann die Reihe von markierten Polynukleotiden dadurch
erhalten werden, dass ein unmarkiertes Ziel, an das ein Primer angelagert
ist, in der Gegenwart einer Polymerase, dNTP und mindestens eines
markierten Terminators enzymatisch verlängert wird (Bergot et al., "Spectrally resolvable
rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination",
US-PS 5,366,860 , erteilt am 22. November
1994). In beiden Ausführungsformen
dient die Polymerase zur Verlängerung
des Primers mit dNTP, bis ein Terminator eingebaut wird, der die
Verlängerungsreaktion
stoppt. Einmal abgestoppt wird die Reihe von markierten Polynukleotiden
basierend auf der Größe getrennt
und die getrennten Polynukleotide werden detektiert, basierend auf
der Fluoreszenz der Farbstoffmarkierungen.
-
In
einer besonders vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens
werden vier unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Terminatoren verwendet,
wobei jedes Nukleosid mit einem unterschiedlichen spektral auflösbaren Fluorophor
markiert ist und mindestens eines der Fluorophore ein erfindungsgemäßer Elektronenmangel-Stickstoffheterocyclus-substituierter
Fluorescein-Farbstoff ist, so dass der Satz von Fluorophoren „Mobilitäts-übereinstimmend" ist. Gemäß dieser
Ausführungsform
wird die mit einem Primer versehene Zielsequenz enzymatisch in der
Gegenwart einer Polymerase, dNTP und der vier unterschiedlichen
fluoreszenzmarkierten Terminatoren verlängert. Nach einer auf Größe basierenden
Trennung wird eine Reihe von getrennten markierten Polynukleotiden
erhalten, in der die Emissionseigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs
die Identität des
3'-terminalen Nukleotids
zeigen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind alle Fluoreszenzfarbstoffe
des Mobilitäts-übereinstimmendes
Satzes unter Verwendung einer einzigen Strahlungsquelle anregbar.
-
In
einer bevorzugten Kategorie von Verfahren, die hierin als "Fragmentanalyse"- oder "genetische Analyse"-Verfahren bezeichnet werden, werden
markierte Polynukleotidsequenzen oder "Fragmente" durch Ziel-gerichtete enzymatische
Synthese unter Verwendung von markierten Primern oder Nukleotiden,
z.B. durch Ligation oder Polymerase-gerichtete Primer-Verlängerung,
erzeugt. Die Fragmente werden einem Größe-abhängigen Trennungsverfahren,
z.B. Elektrophorese oder Chromatographie, unterzogen und die getrennten
Fragmente werden nach der Trennung, z.B. durch Laser-induzierte
Fluoreszenz, detektiert (Hunkapiller et al., "Real time scanning electrophoresis apparatus
for DNA sequencing",
US-PS 4,811,218 , erteilt
am 7. März 1989).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Klassen
von Polynukleotiden gleichzeitig getrennt und die verschiedenen
Klassen werden durch spektral auflösbare Markierungen unterschieden.
-
In
einem besonders bevorzugten Fragmentanalyseverfahren werden Fragmente,
die mit erfindungsgemäßen Farbstoffen
markiert sind, durch die relative Größe identifiziert. Eine Übereinstimmung
zwischen Fragmentgröße und Sequenz
wird durch einen Einbau der vier möglichen terminierenden Basen
("Terminatoren") und den Mitgliedern
eines Satzes von spektral auflösbaren
Farbstoffen festgestellt. Solche Sätze werden leicht aus den erfindungsgemäßen Farbstoffen
durch Messung von Emissions- und Absorptionsbandbreiten mit käuflich erhältlichen
Spektrophotometern zusammengestellt. Vorzugsweise werden Kettenterminierungsverfahren
der DNA-Sequenzierung, d.h. Didesoxy-DNA-Sequenzierung, oder Sequenzierung
des Sanger-Typs und Fragmentanalyse verwendet. Jeder der Terminatoren
trägt einen
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff und zusammen tragen die Terminatoren
des Experiments einen Satz von Farbstoffen, einschließlich eines
oder mehrerer erfindungsgemäßer Farbstoffe.
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Spektral
auflösbare
erfindungsgemäße Fluoreszenzfarbstoffe
sind auch in genotypisierenden Experimenten nach der PCR-Amplifikation
des Ziels verwendbar. Insbesondere kann ein Satz von Oligonukleotideprimern,
die an dem 5'-Terminus
mit jeweils unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, mehrfache
Loci amplifizieren und unterschiedliche Einzel-Nukleotid-Polymorphismen
(SNP) unterscheiden. Eine elektrophoretische Trennung der farbstoffmarkierten
Amplifikationsprodukte mit Größenstandards
erzeugt ein Profil oder einen charakteristischen Datensatz, der
einen bestimmten Genotyp, abhängig
von dem Satz von Primersequenzen, anzeigt.
-
Das
kovalente Verbinden von Polynukleotidsonden durch Ligase-Enzyme
ist eines der nützlichsten Werkzeuge,
die den Molekularbiologen zur Verfügung stehen. Wenn sich zwei
Sonden an eine Zielsequenz angelagert haben, wobei die zwei Sonden
aneinander liegen und keine dazwischen liegenden Lücken auftreten,
kann eine Phosphordiesterbindung zwischen einem 5'-Terminus der einen
Sonde und dem 3'-Terminus der
anderen Sonde durch ein Ligase-Enzym gebildet werden (Whiteley et
al., "Detection
of specific sequences in nucleic acids",
US-PS
4,883,750 , erteilt 1989; Landegren et al., (1988) "A ligase mediated
gene detection technique",
Science 241:1077-80; Nickerson et al., (1990) "Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide
assay", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 87:8923-27). Oligonukleotid-Ligations-Assays detektieren das
Vorhandensein von spezifischen Sequenzen in einer Zielprobe. Wenn
eine oder beide Sonden mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert sind,
kann das Ligationsprodukt durch Fluoreszenz detektiert werden (Grossman
et al., (1994) "High-density
multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay
and sequence-coded separation",
Nucl. Acids Res. 22:4527-34).
-
Eine
Sequenzierung des Sanger-Typs beinhaltet die Synthese eines DNA-Strangs
durch eine DNA-Polymerase in vitro unter Verwendung einer einzelsträngigen oder
doppelsträngigen
Ziel-DNA, deren Sequenz zu bestimmten ist. Eine Synthese wird an
einer definierten Stelle gestartet, basierend darauf, wo ein Oligonukleotidprimer
sich an das Ziel anlagert. Die Synthesereaktion wird durch den Einbau
eines Nukleotid-Analogons beendet, das die kontinuierliche DNA-Verlängerung
nicht unterstützt.
Beispielhafte kettenterminierende Nukleotid-Analoga umfassen die
2',3'-Didesoxynukleosid-5'-triphosphate (ddNTP),
denen die 3'-OH-Gruppe fehlt,
die für
die 3'- zu 5'-DNA-Kettenverlängerung
notwendig ist. Wenn geeignete Anteile an dNTP (2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphate) und eines der vier ddNTPs
verwendet werden, wird eine Enzym-katalysierte Polymerisation in
einem Teil der Kettenpopulation an einer jeglichen Stelle beendet,
an der das ddNTP eingebaut wird. Wenn fluoreszenzfarbstoffmarkierte
Primer oder markiertes ddNTP für
jede Reaktion verwendet werden, kann die Sequenzinformation durch
Fluoreszenz nach Trennung durch hochauflösende Elektrophorese detektiert
werden. In dem Kettenterminationsverfahren können erfindungsgemäße Farbstoffe
entweder an Sequenzierungsprimern oder an Didesoxynukleotiden gebunden
sein. Farbstoffe können an
eine komplementäre
Funktionalität
an dem 5'-Terminus
des Primers (Fung et al., "Amino-derivatized
phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors,
and useful conjugates thereof',
US-PS 4,757,141 , erteilt
am 12. Juli 1998), an der Nukleobase eines Primers oder an der Nukleobase
eines Didesoxynukleotids, z.B. über
Alkinylamino-Verbindungsgruppen (Khan et al., "Substituted propargylethoxyamido nucleosides,
oligonucleotides and methods for using same",
US-PS
5,770,716 , erteilt am 23. Juni 1998 und
US-PS 5,821,356 , erteilt am 13. Oktober
1998; Hobbs F. und Trainor G., "Alkynylamino-nucleotides",
US-PS 5,151,507 , erteilt am 29. September
1992), gebunden sein.
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Ein
typischer Sequenzierungstest ist in
16 veranschaulicht,
worin ein 3'-Fluor-Terminator
mit der Farbstoffverbindung 13 über
einen Propargylethoxyamido-Linker (EO) : 3'FddGTP-EO-13 markiert ist:
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In
den vorstehenden Fragmentanalyseverfahren werden markierte Polynukleotide
durch chromatographische, Affinitäts- oder elektrophoretische
Verfahren getrennt. Vorzugsweise ist die Trennung Elektrophorese (Rickwood
und Hames, Hrsg., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical
Approach, IRL Press Limited, London, 1981). Die bevorzugte Art von
elektrophoretischer Matrix ist quervernetztes oder unvernetztes
Polyacrylamid oder anderes Amid-enthaltendes Polymer mit einer Konzentration
(Gewicht zu Volumen) von etwa 2-20 Gew.-% (Madabhushi et al., "Polymers for separation
of biomolecules by capillary electrophoresis",
US-PS
5,552,028 , erteilt am 3. September 1996). Die elektro phoretische
Matrix kann als ein Plattengel oder im Kapillarformat konfiguriert
sein (Mathies et al., "Capillary
array confocal fluorescence scanner and method",
US-PS
5,274,240 , erteilt am 28. Dezember 1993). Bevorzugter beträgt die Polyacrylamidkonzentration
etwa 4–8%.
Vorzugsweise und insbesondere im Zusammenhang mit der DNA-Sequenzierung
umfasst die elektrophoretische Matrix ein Denaturierungsmittel,
z.B. Harnstoff, Formamid und dergleichen (Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New
York, Seiten 179–185
(1982); PE Corp., ABI PRISM
TM 377 DNA Sequencer
User's Manual, Rev.
A, Kapitel 2 (P/N 903433, PE Corporation, Foster City, CA), Januar
1995). Die optimalen Elektrophorese-Bedingungen, z.B. Polymer, Polymerkonzentration, pH-Wert,
Temperatur, Konzentration des Denaturierungsmittels, die in einer
bestimmten Trennung eingesetzt werden, hängen von verschiedenen Faktoren
ab, einschließlich
dem Größenbereich
der zu trennenden Polynukleotide, deren Basenzusammensetzung, ob
sie einzelsträngig
oder doppelsträngig
sind, und der Art der Klassen, für
die Informationen durch Elektrophorese gesucht werden (Grossman
P., "High resolution
DNA sequencing method using low viscosity medium",
US-PS
5,374,527 , erteilt am 20. Dezember 1994). Demzufolge kann
eine erfindungsgemäße Anwendung
vorausgehende Standardtests zur Optimierung von Bedingungen für bestimmte
Trennungen erfordern.
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Polynukleotide,
die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen
markiert sind, können
auch mit Gruppen markiert werden, die die Geschwindigkeit einer
elektrophoretischen Wanderung beeinflussen, z.B. Mobilitäts-modifizierende
Markierungen. Mobilitäts-modifizierende
Markierungen umfassen Polymere von Ethylenoxy-Einheiten, -(CH
2CH
2O)n-, worin n
den Wert 1 bis 100 aufweisen kann (Grossman et al., "Method of DNA sequencing
employing a mixed DNApolymer chain probe",
US-PS
5,624,800 , erteilt am 29. April 1997). Vorzugsweise weist
n einen Wert von 2 bis 20 auf. Spezifisch markierende Fluorescein-Farbstoffe-markierte
Polynukleotide mit zusätzlichen
Polyethylenoxy-Markierungen mit diskreter und bekannter Größe ermöglichen eine
andere Dimension der Trennung durch Elektrophorese und Detektion,
unabhängig
von der Anzahl der Nukleotide in dem Polynukleotid. Das heißt, Polynukleotide
der gleichen Länge
können
auf der Basis von spektral auflösbaren
Farbstoffmarkierungen und Mobilitäts-modifizierenden Markierungen
unterschieden werden. Polynukleotide, die sowohl Farbstoffmarkierungen
als auch Mobilitäts-modifizierende
Markierungen tragen, können
enzymatisch durch Ligation oder Polymerase-Verlängerung des einzel-markierten
Polynukleotid- oder Nukleotidbausteins gebildet werden. Alternativ
können
synthetische Oligonukleotide erfindungsgemäße Farbstoffmarkierungen und
Mobilitäts-Modifizierungsmittel
tragen, die während
der automatisierten Synthese, z.B. Phosphoramidit-Reagenzien, oder über Koppeln
nach der Synthese, z.B. NHS-Markierungskoppeln an Amino- oder Thiol-Oligonukleotide,
eingebaut werden.
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Nach
der elektrophoretischen Trennung werden die Farbstoff-Polynukleotid-Konjugate durch Messen der
Fluoreszenzemission von den farbstoffmarkierten Polynukleotiden
detektiert. Um eine solche Detektion durchzuführen, werden die markierten
Polynukleotide durch Standardmittel, z.B. Quecksilber-Dampflampen hoher
Intensität,
Laser oder dergleichen, angeregt. Vorzugsweise ist das Anregungsmittel
ein Laser mit einem Anregungsstrahl bei einer Wellenlänge von über etwa
450 nm. Bevorzugter werden die Farbstoff-Polynukleotide durch Laserstrahlung
angeregt, die durch einen Argonionen- oder He-Ne-Gaslaser oder einen
Festphasen-Diodenenlaser erzeugt wird. Die Fluoreszenz wird sodann
durch einen lichtempfindlichen Detektor, z.B. einem Photomultiplier,
ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder dergleichen, detektiert.
Beispielhafte elektrophoretische Detektionssysteme sind an anderer
Stelle beschrieben (Hoff et al., "Real-time scanning fluorescence electrophoresis
apparatus for the analysis of polynucleotide fragments",
US-PS 5,543,026 , erteilt am 6. August
1996; Mathies et al., "Capillary
array confocal fluorescence scanner and method",
US-PS 5,274,240 ,
erteilt am 28. Dezember 1993; Hunkapiller et al., "Real time scanning
electrophoresis apparatus for DNA sequencing",
US-PS
4,811,218 , erteilt am 7. März 1989).
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VI.7 BEISPIELE
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Die
Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht,
die nur beispielhaft für die
Erfindung sein und den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
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BEISPIEL 1 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)benzol 1.
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1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure:
-
-
(10
g, 54,95 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 2-Bromtoluol (18,81 g,
110 mmol), Glykolether (200 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium,
(Ph3P)4Pd0 (4 g, 3,46 mmol) wurden 15 Minuten gerührt, gefolgt
von der Zugabe von 8 g Kaliumcarbonat in 35 ml Wasser (ref). Nach
6-stündigem
Refluxieren wurde das Reaktionsgemisch in 800 ml eines 1:1-Gemisches
aus Wasser und Ethylacetat geschüttet.
Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml × 2) und mit Kochsalzlösung (200
ml × 1)
gewaschen, das Lösungsmittel
wurde entfernt und das Rohprodukt durch Silicagel-Chromatographie
(Hexan, Ethylacetat 0% bis 10%) gereinigt, um 10,5 g (84%) 1 (1) zu ergeben.
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BEISPIEL 2 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-brombenzol 2.
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1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)benzol
1 (10 g, 43,86 mmol), N-Bromsuccinimid (8,26 g, 46,4 mmol) und Perchlorsäure (70%,
0,5 ml) wurden in Dichlormethan (200 ml) gemischt und 4 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit Natriumbicarbonatlösung (5%,
100 ml) gequencht, die Dichlormethanphase wurde mit Wasser (100
ml), Kochsalzlösung
(100 ml) gewaschen und das Lösungsmittel
wurde entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt,
wobei mit Hexan und Ethylacetat (0% bis 10% Ethylacetat) eluiert
wurde, um 10,8 g (80%) 2 zu ergeben.
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BEISPIEL 3 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)benzol 3.
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Pyridin-3-boronsäure (5,81
g, 47,27 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-brombenzol
(2) (10,7 g, 34,8 mmol), Glykolether (200 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
(Ph3P)4Pd0 (4 g, 3,46 mmol) wurden 15 Minuten gerührt, gefolgt
von der Zugabe von Kaliumcarbonat (16 g in 70 ml Wasser). Nach 10-stündigem Refluxieren
wurde das Reaktionsgemisch in 800 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser
und Ethylacetat geschüttet.
Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml × 2) und Kochsalzlösung (200
ml) gewaschen, das Lösungsmittel
wurde entfernt und das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt,
wobei mit Hexan und Ethylacetat (10% bis 25% Ethylacetat) eluiert
wurde, um 8,8 g (83%) 3 zu ergeben.
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BEISPIEL 4 Synthese von
2-(Tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 4.
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1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)benzol
3 (3,5 g, 11,46 mmol), Essigsäure
(30 ml) und Bromwasserstoffsäure
(48%) (15 ml) wurden 24 Stunden refluxiert. Nach Abkühlung des
Reaktionsgemisches wurden das meiste Reagenz unter vermindertem
Druck entfernt. Die verbleibende Säure wurde durch Mischen des
Konzentrates mit Natriumbicarbonatlösung (5%) (100 ml) entfernt.
Das Produkt wurde in Ethylacetat (100 ml) extrahiert, mit Wasser
(100 ml × 2)
und Kochsalzlösung
(100 ml) gewaschen und das Ethylacetat wurde verdampft. Das Rohprodukt
wurde durch Silicagel-Chromatrographie gereinigt, wobei mit Dichlormethan
und Aceton (0% bis 10% Aceton) eluiert wurde, um 2,8 g (90%) 4 zu
ergeben.
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BEISPIEL 5 Synthese des
Ketons 5
-
2-(Tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol
4 (630 mg, 2,25 mmol), 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid:
-
-
(Menchen
S., et al., "4,7-dichlorofluorescein
dyes as molecular probes",
US-PS 5,885,778 , erteilt
am 23. März
1999) (590 mg, 2,25 mmol), Nitrobenzol (20 ml) und Aluminiumchlorid
in Nitrobenzol (12 ml, 1M) wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in ein Gemisch aus Eiswasser (50 ml),
Ethylacetat (100 ml) und n-Butanol (20 ml) geschüttet, gefolgt von der Zugabe
von 10%iger HCl (50 ml), um die Aluminiumsalze zu lösen. Die
organische Phase wurde mit Wasser (50 ml × 2) und Kochsalzlösung (50 ml)
gewaschen und das Lösungsmittel
wurde verdampft, um ein Produkt als ein Gemisch der Isomere 5a und 5b
zu ergeben. Eine Trennung durch Silicagel-Säulenchromatographie mit Methanol
in Dichlormethan (10% bis 30% Methanol) und (1%iger) Essigsäure ergab
380 mg (31%) des gewünschten,
sich langsam bewegenden Isomers 5b, von dem angenommen wird, dass
es die in
1 dargestellte
Struktur aufweist.
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BEISPIEL 6 1,3-Dimethoxynaphthalin
6
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Zu
1,3-Dihydroxynaphthalin (15 g, 93,6 mmol) und Kaliumcarbonat (20
g, 144,7 mmol) in Aceton (200 ml) wurde Dimethylsulfat (21 ml, 222
mmol) gegeben. Nach Rühren über Nacht
wurde das Reaktionsgemisch mit 10%iger Natriumhydroxidlösung (100
ml) gemischt und mit Ethylacetat (200 ml × 2) extrahiert. Die organische
Phase wurde mit Wasser (100 ml × 2)
gewaschen, verdampft und der Rückstand
mit Ammoniumhydroxid (50 ml) 2 Stunden gerührt, um jegliches nicht umgesetztes
Dimethylsulfat zu quenchen. Das Produkt wurde mit Ethylacetat (200
ml) extrahiert und mit Wasser (100 ml × 2) und Kochsalzlösung (100
ml) gewaschen. Das Lösungsmittel
wurde verdampft, um 15 g (85%) 6 zu ergeben.
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BEISPIEL 7 Bis(1,3-dimethoxynaphth-2-yl)dimethylzinn
7
-
1,3-Dimethoxynaphthalin
(6) (7,1 g, 37,73 mmol) wurde in wasserfreiem THF (60 ml) gelöst, auf –70°C abgekühlt und
Tetramethylethylendiamin (0,2 ml), gefolgt von n-Butyllithium (26
ml, 1,6 M in Hexan) wurden zugegeben. Nach kaltem Rühren der
Lösung
für 30
Minuten und Rühren
bei Raumtemperatur für
1 Stunde wurde die Lösung
wieder auf –20°C abgekühlt und
Dimethylzinndichlorid, SnMe2Cl2 (5,05
g in 20 ml THF), wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei
Raumtemperatur 2 Stunden gerührt,
in Wasser (100 ml) geschüttet
und mit Ethylacetat (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde
mit Wasser (50 ml), Kochsalzlösung
(50 ml) gewaschen und verdampft. Der Rückstand wurde aus Hexan (50
ml) auskristallisiert, um 6,8 g (69%) 7 zu ergeben.
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BEISPIEL 8 1,3-Dimethoxy-2-bromnaphthalin
8
-
Bis(1,3-dimethoxynaphth-2-yl)dimethylzinn
7 (11 g, 21 mmol) in THF (500 ml) wurde auf –30°C gekühlt und N-Bromsuccinimid (8
g, 45 mmol) wurde zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei –30°C wurde das Reaktionsgemisch
mit Wasser (200 ml) und Ethylacetat (200 ml) gequencht. Die organische
Phase wurde mit 10%iger Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (100 ml × 2), Kochsalzlösung (100
ml) gewaschen und verdampft. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie
gereinigt, wobei mit Hexan-Ethylacetat (0% bis 10% Ethylacetat)
eluiert wurde, um 9 g (80%) 8 zu ergeben.
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BEISPIEL 9 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin
9
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Pyridin-3-boronsäure (3,94
g, 32 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 1,3-Dimethoxy-2-bromnaphthalin
8 (6,6 g, 24,7 mmol), Glykolether (200 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
(Ph3P)4Pd (3 g,
2,7 mmol) wurden 15 Minuten gerührt,
gefolgt von der Zugabe von Kaliumcarbonat (11,4 g in 50 ml Wasser).
Nach Refluxieren über
Nacht wurde das Reaktionsgemisch in 800 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser:Ethylacetat
geschüttet.
Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml × 2) und Kochsalzlösung (200
ml) gewaschen, das Lösungsmittel
wurde entfernt und das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie
gereinigt, wobei mit Dichlormethan und Aceton (0% bis 5% Aceton)
eluiert wurde, um 5,1 g (84%) 9 zu ergeben.
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BEISPIEL 10 2-(Tol-2-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin
10
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Diese
Verbindung wurde im Wesentlichen durch das gleiche Verfahren, wie
dasjenige in Beispiel 9, unter Verwendung von 8 und Tol-2-ylboronsäure (Frontier
Scientific, Inc.) hergestellt.
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BEISPIEL 11 Synthese von
2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin 11
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin
9 hergestellt, um 11 zu ergeben.
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BEISPIEL 12 Synthese von
2-(Tol-2-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin 12
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 2-(Tol-2-yl)-1,3-dimethoxynaphthalin
10 hergestellt, um 12 zu ergeben.
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BEISPIEL 13 Synthese des
Farbstoffs 13
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Das
Keton 5b (250 mg, 0,45 mmol) und 2-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin
11 (109 mg, 0,45 mmol) wurden mit Methansulfonsäure (7 ml) gemischt und 1 Stunde
bei 100°C
gerührt.
Die Lösung
wurde auf Raumtemperatur abgekühlt
und sodann in Eiswasser (50 ml) geschüttet. Der Farbstoff wurde in
n-Butanol (50 ml × 2)
extrahiert und mit Wasser (20 ml × 2) gewaschen. Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Farbstoff wurde
durch Umkehrphasen-Silicagel-Chromatographie (50% Methanol) gereinigt, um
103 mg (30%) 13 (3)
zu ergeben.
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BEISPIEL 14 Synthese des
Farbstoffs 14
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 13
verwendet, unter Verwendung von 2-(Tol-2-yl)-1,3-dihydroxynaphthalin
12 und 5 hergestellt.
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BEISPIEL 15 Synthese des
Farbstoffs 15
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleichen Verfahren, wie in Beispiel 13
verwendet, unter Verwendung von 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin
(Benson et al., "Asymmetric
benzoxanthene dyes",
US-PS 5,840,999 , erteilt
am 24. November 1998) und 5 hergestellt.
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BEISPIEL 16 Synthese des
Farbstoffs 16
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2-(Tol-2-yl)-4-(pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol
4 (52 mg, 0,28 mmol), 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid (Menchen et al., "4,7-dichlorofluorescein
dyes as molecular probes",
US-PS 5,885,778 , erteilt
am 23. März 1999)
(36,5 mg, 14 mmol) und Methansulfonsäure (1 ml) wurden erhitzt und
bei 130–135°C zwei Stunden
gerührt.
Die Lösung
wurde auf Raumtemperatur abgekühlt
und sodann in Eiswasser (50 ml) geschüttet. Der Rohfarbstoff wurde
mit n-Butanol (50 ml × 2)
extrahiert und der Extrakt wurde mit Wasser (20 ml × 2) gewaschen. Das
Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck verdampft, um den Rohfarbstoff als
ein Gemisch von zwei Isomeren zu ergeben. Die Isomere wurden durch
präparative
Dünnschichtchromatographie
(Silicagel; Dichlormethan:Methanol: Essigsäure / 100:10:2 (v:v:v) als
mobile Phase) getrennt, um 24 mg (30%) des gewünschten, sich langsamer bewegenden
Isomers 16 zu ergeben.
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BEISPIEL 17 Synthese von
2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-3-yl)benzol 17
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2,4-Dimethoxyphenyl-4-ylboronsäure (0,9
g, 4,97 mmol, Frontier Scientific, Inc.), 3-Brompyridin (0,82 g,
5 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (Ph3P)4Pd0 (0,65 g, 0,56
mmol), N,N-Dimethylformamid (20 ml) und Triethylamin (2,1 ml) wurden
gemischt und bei 110–120°C 16 Stunden
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml eines 1:1-Gemisches aus Wasser
und Ethylacetat geschüttet
und die organische Phase wurde mit Wasser (50 ml × 2) und
Kochsalzlösung
(50 ml) gewaschen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt
durch Silicagel-Chromatographie (0% bis 10% Aceton in Dichlormethan)
gereinigt, um 0,45 g (42,5%) 17 zu ergeben.
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BEISPIEL 18 Synthese von
4-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol 18
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-3-yl)benzol
17 hergestellt, um 18 zu ergeben.
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BEISPIEL 19 Synthese des
Farbstoffs 19
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 4-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol
18 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 20 Synthese von
2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-2-yl)benzol 20
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 17
verwendet, unter Verwendung von 2,4-Dimethoxyphenyl-4-ylboronsäure und
2-Brompyridin hergestellt,
um 20 zu ergeben.
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BEISPIEL 21 Synthese von
2,3-Dihydroxy-4-(pyrid-2-yl)benzol 21
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 2,3-Dimethoxy-4-(pyrid-2-yl)benzol
20 hergestellt, um 21 zu ergeben.
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BEISPIEL 22 Synthese des
Farbstoffs 22
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 4-(Pyrid-3-yl)-1,3-dihydroxybenzol
21 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 23 Synthese von
1,3-Dimethoxy-4-(chinon-3-yl)benzol 23
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 17
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-4-ylboronsäure und
3-Bromchinolin hergestellt,
um 23 zu ergeben.
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BEISPIEL 24 Synthese von
1,3-Dihydroxy-4-(chinon-3-yl)benzol 24
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-4-(chinon-3-yl)benzol
23 hergestellt, um 24 zu ergeben.
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BEISPIEL 25 Synthese des
Farbstoffs 25
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-4-(chinon-3-yl)benzol
24 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 26 Synthese von
1,3-Dimethoxy-4-(chinon-2-yl)benzol 26
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 17
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-4-ylboronsäure und
2-Bromchinolin hergestellt,
um 26 zu ergeben.
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BEISPIEL 27 Synthese von
1,3-Dihydroxy-4-(chinon-2-yl)benzol 27
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-4-(chinon-2-yl)benzol
26 hergestellt, um 27 zu ergeben.
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BEISPIEL 28 Synthese des
Farbstoffs 28
-
Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-4-(chinon-2-yl)benzol
27 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 29 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)benzol 29
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure und
3-Brompyridin hergestellt,
um 29 zu ergeben.
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BEISPIEL 30 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-brombenzol 30
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 2
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)benzol
29 und N-Bromsuccinimid hergestellt, um 30 zu ergeben.
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BEISPIEL 31 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol 31
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-brombenzol
30 und Phenylboronsäure
hergestellt, um 31 zu ergeben.
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BEISPIEL 32 Synthese von
1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol 32
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol
31 hergestellt, um 32 zu ergeben.
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BEISPIEL 33 Synthese des
Farbstoffs 33
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-3-yl)-4-phenylbenzol
32 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 34 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol 34
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-brombenzol
2 und Phenylboronsäure
hergestellt, um 34 zu ergeben.
-
BEISPIEL 35 Synthese von
1,3-Dihydroxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol 35
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol
34 hergestellt, um 35 zu ergeben.,
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BEISPIEL 36 Synthese des
Farbstoffs 36
-
Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-2-(tol-2-yl)-4-phenylbenzol
35 und 2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 37 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)benzol 37
-
Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxyphen-2-ylboronsäure und
2-Brompyridin hergestellt, um 37 zu ergeben.
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BEISPIEL 38 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-brombenzol 38
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 2
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)benzol
37 und N-Bromsuccinimid hergestellt, um 38 zu ergeben.
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BEISPIEL 39 Synthese von
1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 39
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-brombenzol
38 und Naphth-2-ylboronsäure
hergestellt, um 39 zu ergeben.
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BEISPIEL 40 Synthese von
1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 40
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Diese
Verbindung wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4
verwendet, hergestellt, wobei 1,3-Dimethoxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol
39 demethyliert wurde, um 40 zu ergeben.
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BEISPIEL 41 Synthese des
Farbstoffs 41
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Dieser
Farbstoff wurde durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 16
verwendet, unter Verwendung von 1,3-Dihydroxy-2-(pyrid-2-yl)-4-(naphth-2-yl)benzol 40 und
2,5-Dichlortrimellithsäureanhydrid
hergestellt.
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BEISPIEL 42 Eigenschaften
der Farbstoffe
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Bestimmte
Eigenschaften einiger erfindungsgemäßer Fluorescein-Farbstoffe
wurden gemessen, siehe Tabelle 1.
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Alle
Veröffentlichungen
und Patentanmeldungen werden hierin durch eine Referenz in dem gleichen Ausmaß eingeschlossen,
als wenn für
jede einzelne Veröffentlichung
oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben wäre, dass
sie durch eine Referenz eingeschlossen ist.
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Obwohl
bestimmte Ausführungsformen
vorstehend genau beschrieben wurden, wird der Fachmann eindeutig
verstehen, dass viele Modifikationen in den bevorzugten Ausführungsformen
möglich
sind, ohne die Lehren davon zu verlassen. Alle solche Modifikationen
sollen von den nachstehenden Ansprüchen umfasst sein.