DE60102359T2

DE60102359T2 - Verfahren und zusammensetzung für organ- und gewebekonservierung sowie für hypothermischen blutersatz

Info

Publication number: DE60102359T2
Application number: DE60102359T
Authority: DE
Inventors: J. Michael TAYLOR
Original assignee: Organ Recovery Systems Inc
Current assignee: Organ Recovery Systems Inc
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2021-01-25
Also published as: DE60102359D1; CA2398614A1; US6492103B1; US6994954B2; EP1257169A1; AU2001231095B2; JP2003520859A; US20030118980A1; WO2001054495A9; WO2001054495A1; AU3109501A; EP1257169B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Organkonservierung und den hypothermischen Blutersatz. Diese Erfindung betrifft insbesondere Zusammensetzungen, Verfahren und Systeme zur Organ- und Gewebekonservierung und/oder zum hypothermischen Blutersatz.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Hypothermie ist die Grundlage aller nützlichen Verfahren zur Organ- und Gewebekonservierung und es hat sich gezeigt, dass diese am effektivsten durch ein direktes Steuern der extrazellulären Umgebung von Zellen und ein indirektes Steuern der intrazellulären Umgebung von Zellen während des Aussetzens an Kälte angewendet wird. Das Regeln der extrazellulären Umgebung von Zellen, um die Konservierung zu optimieren, basiert auf verschiedenen Strategien die entweder statische Kaltlagerung (oder Spülkonservierung) oder kontinuierliche Perfusion bei niedriger Temperatur einschließen. Diese verschiedenen Strategien benötigen unterschiedliche Ansätze der interventionellen Steuerung der extrazellulären Umgebung, um die Konservierung zu optimieren, und daher unterschiedliche Designelemente für die zum Bewirken dieser Strategie verwendeten Lösungen.
Im Prinzip basiert die kalte Spüllagerung oder Konservierung auf der Prämisse, dass eine Reduktion der Temperatur nahe an den aber nicht unter den Eispunkt (0°C) der Notwendigkeit vorbeugt, den Stoffwechsel in einem bedeutsamen Ausmaß zu unterstützen, und dass die korrekte Verteilung von Wasser und Ionen zwischen den intrazellulären und den extrazellulären Bereichen durch physikalische eher als durch stoffwechselbasierende Mittel erhalten werden kann. Während des Zeitraums, in dem die Stoffwechselpumpen deaktiviert sind, ist die treibende Kraft des transmembranen Ionenflusses der Unterschied im Ionengleichgewicht zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulären Fluid. Die treibende Kraft für die Wasseraufnahme (Zellenschwellen) sind die impermeanten intrazellulären Anionen. Somit können Veränderungen durch Manipulieren der extrazellulären Umgebung, um chemische Potentialgradienten aufzuheben, verhindert oder vermieden werden. Auf dieser Basis wurde eine Vielzahl von Spül- oder Organauswaschlösungen entwickelt und für die Kaltlagerung untersucht. Diese Lösungen werden, auf Grund ihrer Ähnlichkeit zu intrazellulärem Fluid in einiger Hinsicht, häufig als „intrazelluläre" Lösungen bezeichnet.
Die Hauptdesignelemente dieser „intrazellulären" Spüllösungen waren, das ionische Gleichgewicht (besonders der monovalenten Kationen) einzustellen und die Osmolalität durch Einschließen eines impermeanten gelösten Stoffs zu erhöhen, um den intrazellulären osmotischen Druck auszugleichen, der für die Wasseraufnahme verantwortlich ist. Der wichtigste Faktor der Effektivität von Kaltspüllösungen könnte jedoch das Verhindern von zellulären Ödemen durch das Einschließen von impermeanten, gelösten Stoffen sein, da festgestellt wurde, dass ionische Ungleichgewichte, insbesondere Kaliumverlust, einfach und schnell reversibel sind.
Vor 1988 war die Standardlösung zur klinischen Konservierung der Bauchhöhlenorgane, hauptsächlich der Niere, die Collins Lösung, die hauptsächlich aus Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, und Glucose besteht. In den letzten Jahren wurde diese jedoch entweder durch eine modifizierte Version, die „EuroCollins" genannt wird und in der das Magnesiumsulfat weggelassen wird, oder häufiger durch die University of Wisconsin Lösung (UW Lösung) abgelöst, in der ein Großteil der Phosphatanionen durch Lactobionat ersetzt wurde und in der die Glucose durch Raffinose ersetzt wurde. Diese größeren Moleküle bieten einen besseren Schutz gegen die negativen Effekte des Zellenanschwellens während der hypothermischen Lagerung. Die Auswahl der Lösungen für die Herzkonservierung wurde stark von den vorhergehenden Erfahrungen von Herzchirurgen mit kardioplegen Lösungen in der offenen Herzchirurgie beeinflusst. In diesem Fall war das Hauptziel, ein schnelles Einstellen des Herzschlags zu erreichen, und die Lösungen wurden mehr im Hinblick darauf als im Hinblick auf den Schutz der Zellen während der Lagerung konzipiert. Insbesondere deuteten frühere Studien an, dass die sehr hohen Kaliumlevel (> 100 mM), die in Organkonservierungslösung gefunden werden, für das Herz schädlich sein könnten. Tatsächlich war die am häufigsten verwendete Lösung St. Thomas's (Plegisol) mit einem Kaliumgehalt von nur 16 mM.
Die Auswahl der Lösung für die Kardioplegie und die Herzmuskelkonservierung bleibt umstritten und ist stark unterschiedlich. während sich die UW-Lösung zum Industriestandard für Niere, Leber und Pancreas entwickelt hat wurde für die Herzkonservierung kein solcher Standard übernommen. Die Entwicklung der Vielzahl von Konservierungslösungen zur Organlagerung hat außerdem die Notwendigkeit einer sorgfältigen Optimie rung im Hinblick auf die speziellen Charakteristika der zu konservierenden Gewebe hervorgehoben.
Die Beachtung der biophysikalischen Eigenschaften von „intrazellulären" Spüllösungen, um passive Diffusionsprozesse zu begrenzen, hat unfraglich zur Entwicklung von Techniken geführt, die die Basis für die klinische Organkonservierung während der letzten 30 Jahre geschaffen haben. Es wurde jedoch erkannt, dass eine weitere Optimierung der Kaltspüllösungen durch Einbeziehung von biochemischen und pharmakologischen Komponenten erreicht werden kann, die effektiv sind, den schädlichen Effekten von Ischämie und Reperfusionsverletzungen entgegenzuwirken. Zu einem begrenzten Grad wurde dieser Ansatz in das Design der University of Wisconsin Organkonservierungslösung (UW-Lösung, vermarktet als „Viaspan^TM"; DuPont) einbezogen, die die am weitesten verbreitete Lösung zur Kaltspülkonservierung von Nieren, Lebern und Pancreaten ist. Mit der nötigen Rücksicht auf die Effekte von Ischämie, Sauerstoffmangel, Hypothermie und Reperfusionsverletzung auf Zellen, gekoppelt mit der bewiesenen Effektivität von verschiedenen existierenden Organkonserservierungslösungen, hat sich ein allgemeiner Konsens über die wichtigsten Charakteristika im Design von hypothermischen Lagerlösungen entwickelt. Diese schließen Folgendes ein, nämlich Minimieren des hypothermisch erzeugten Zellenanschwellens; Verhindern der Expansion des interstitionalen Raums (besonders wichtig während der Perfusion); Begrenzen von ionischen Ungleichgewichten; Verhindern von intrazellulärer Azidose; Verhindern von Verletzungen durch freie Radikale und Bereitstellen von Substraten zur Regeneration von hochenergetischen Phosphatverbindungen während der Reperfusion.
Bei der kontinuierlichen hypothermischen Perfusionskonservierung, sind die zuvor aufgelisteten wünschenswerten Eigenschaften von hypothermischen Lösungen auch auf das Steuern der extrazellulären Umgebung mittels von kontinuierlichen Perfusionstechniken anwendbar. Im Gegensatz zur statischen Kaltlagerung wird die kontinuierliche Perfusion im Allgemeinen bei etwa 10°C gehalten und basiert auf einem anderen Prinzip: es wird allgemein angenommen, dass ein moderater Grad an Abkühlen den Stoffwechselbedarf vermindert, aber dass eine kontinuierliche Perfusion notwendig ist, um den unterdrückten Stoffwechsel zu unterstützen und um katabolische Produkte zu entfernen. Da angenommen wird, dass eine ausreichende Stoffwechselaktivität verbleibt, um aktiv ein fast normales Zellvolumen und ionische Gradienten zu regulieren, sind die Perfusate im Allgemeinen azelluläre, isotonische, stark sauerstoffangereicherte Lösungen, die eine Zusammensetzung aufweisen, die eher Plasma als intrazellulärem Fluid ähnelt. Solche Perfusate werden deshalb als „extrazelluläre" Lösungen bezeichnet und werden mit einem Druck durch das Gefäßbett eines Organs durchgespült, der ausreicht um eine gleichförmige Gewebeverteilung zu erreichen (typischerweise 40–60 mm Quecksilber). Um diesen angewendeten hydrostatischen Druck auszugleichen und interstitiale Ödeme zu vermeiden, werden onkotische Mittel wie Albumin oder synthetische makromolekulare Kolloide in die Perfusate aufgenommen. Die Substratversorgung des verbleibenden Stoffwechsels bei –10°C ist ebenfalls eine wichtige Erwägung und es wurde in mehreren Organen gezeigt, dass hochenergetische Adeninnukleotide während der hypothermischen Perfusionskonservierung synthetisiert werden können.
Zusätzlich zum Hauptziel des Unterstützen des Stoffwechsels schafft die kontinuierliche Perfusion weitere Vorteile gegenüber der Spülkonservierung. Diese schließt das Auswaschen von angesammeltem Lactat und Protonen ein, wodurch die Stoffwechselblockierung der Glykolyse aufgehoben wird; es wird davon ausgegangen, dass dies besonders für Organe förderlich ist, die vorher eine warme Ischämie erlitten haben. Die Perfusion erleichtert außerdem das Entfernen von Erythrozyten aus der Mikrozirkulation und hilft dabei, die Gefäßdurchgängigkeit während längerer Lagerung aufrechtzuerhalten. Es wurde gezeigt, dass kontinuierliche Perfusion die beste Möglichkeit zum Erreichen von längerer hypothermischer Konservierung (z.B. 3–7 Tage für Nieren) schafft, jedoch können Bedenken wegen Schäden am Gefässendothelium während längerer Perfusion ein begrenzender Faktor sein.
Obwohl experimentell nachgewiesen wurde, dass sich der Zellstoffwechsel bei niederen Temperaturen wie 10°C fortsetzt und dass Adeninnukleotide während der hypothermischen Konservierung wieder synthetisiert werden können, wenn die geeigneten Substrate bereitgestellt werden, wird davon ausgegangen, dass es unwahrscheinlich ist, dass dieser Stoffwechsellevel Transmembranbewegungen von Ionen und Wasser verhindern kann, wobei dies hauptsächlich auf die Temperaturanfälligkeit der aktiven Pumpen zurückzuführen ist. Einige Verfechter der kontinuierlichen Perfusion haben daher das Perfusat durch Erhöhen sowohl der K⁺-Konzentration als auch der Osmolalität dementsprechend modifiziert. In ähnlicher Weise kann davon ausgegangen werde, dass Modifikationen der Kaltspüllösungen einige der identifizierten Grenzen dieses Ansatzes umgehen können. So kann z.B. auf das Fehlen der Unterstützung des Stoffwechsels während der Eislagerung durch Folgendes eingegangen werden, nämlich Anheben der Lagertemperatur, Aufnehmen von biochemischen Substraten und Anheben der Sauerstoffspannung, um die Adeninnukleotidwiederversorgung zu fördern. Auch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln wie Inhibitoren der 5'-Nukleotidase (z.B. Allopurinol) wurden als Mittel zum Vermeiden von Adeninnukleotidarmut genannt.
Im Hinblick auf die spezifischen Anforderungen der Zellen in Abhängigkeit der Temperatur ist es nicht notwendig, das Aufnehmen von spezifischen sauerstofftragenden Molekülen bei Temperaturen unter –10°C zu bedenken, da einwandfrei nachgewiesen wurde, dass bei solchen niedrigen Temperaturen die Stoffwechselaktivität ausreichend unterdrückt ist, so dass der O₂-Bedarf durch gelöstes O₂ in der wässrigen Lösung, ohne Bedarf an Hämoglobin oder synthetischen, O₂-tragenden Molekülen gedeckt werden kann.
Eine optimale Steuerung der intrazellulären und extrazellulären Umgebung von Zellen während der Hypothermie hängt von der Interaktion von einer Reihe von Faktoren ab, die Folgendes einschließen, nämlich Temperatur, Sauerstoffspannung, Säuregrad, osmotischer Druck und chemische Zusammensetzung des Perfusionsfluides oder der Auswaschlösung.
Es wurde jetzt erkannt, dass die aufeinander folgenden Phasen der Transplantationsprozedur, nämlich Organbeschaffung, Lagerung, Transport, Reimplantation und Reperfusion, unterschiedliche Anforderungen für eine optimale Konservierung in den verschiedenen Stufen stellen. Dies wird durch Anzeichen illustriert, dass die Herzkonservierung mit der „intrazellulä ren" Lösung, EuroCollins, verbessert wurde, wenn das Herz anfänglich mit einer „extrazellulären" kardioplegischen Lösung zum Stillstand gebracht und anschließend vor der Reperfusion damit gespült wurde. Es ist daher unwahrscheinlich, dass irgendeine einzelne Formulierung einer Konservierungslösung optimalen Schutz während allen Prozessstufen einer Transplantationsprozedur oder den interventionellen Stufen von komplexen Operationen schafft.
Das Interesse an allgemeinen oder universellen Gewebekonservierungstechniken wird exemplarisch durch den Bedarf nach Verfahren zum Schützen von mehreren lebenswichtigen Organen und selbst des ganzen Körpers für Anwendungen in der modernen Chirurgie dargestellt. Multiple Organentnahme zur Transplantation kann durch eine hypothermische Perfusion des gesamten Leichnams oder von Spenderorganblöcken optimiert werden, die mehrere Organe aufweisen, um Verletzungen durch warme Ischämie zu minimieren. Die größte Herausforderung ist möglicherweise der Schutz des gesamten Körpers gegenüber den Auswirkungen globaler Ischämie in Zeiträumen des Kreislauf- und/oder Herzstillstands zur „unblutigen" Chirurgie.
Chirurgen haben Fertigkeiten entwickelt, die es ermöglichen sehr komplexe, korrektive und lebensrettende Operationen, insbesondere am Herzen und am Gehirn, durchzuführen. Viele dieser komplizierten und zeitaufwendigen Prozeduren weisen einen inhärenten Bedarf nach einem temporären Stopp des Blutflusses auf und benötigen den Schutz des Patienten gegen die schädlichen Auswirkungen von Ischämie und Sauerstoffmangel. Obwohl Hypothermie routinemäßig als zusätzliche schützende Modalität für chirurgische Prozeduren verwendet wird, die einen Zeitraum von Herzstillstand erfordern, gibt es einschränkende Zeitbeschränkungen (< 1 Stunde bei Temperaturen normalerweise nicht unter 18°C) des sicheren Intervalls von kalter Ischämie, wenn neurologische Folgeerscheinungen vermieden werden sollen. Es ist anerkannt, dass das Gelegenheitsfenster für einen sicheren chirurgischen Eingriff durch Verwenden eines größeren Grades von hypothermischer Stoffwechselunterdrückung vergrößert werden könnte, aber dies wird, hauptsächlich auf Grund der Effekte von tiefer Hypothermie auf das Blut, unannehmbar gefährlich, was zu Koagulopathien und irreversibler mikrovaskularer Verstopfung führt.
Die US-Patente 5,643,712, 5,699,793, 5,843,024 für Brasile und 5,599,659, 5,702,881 für Brasile et al., die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin eingeschlossen sind, beschreiben separate Reanimations- und Konservierungslösungen für Gewebe und Organe. Die Brasile Patente offenbaren Verfahren bei denen einige Ausführungsformen der Zusammensetzung dieser Erfindung angewendet werden können. Die Brasile Patente offenbaren außerdem Zusammensetzungen die in den Verfahren und Kits dieser Erfindung verwendet werden können.
Das US-Patent 5,130,230 für Segall et al. offenbart ein Verfahren zum Durchführen einer unblutigen, hypothermischen Prozedur, das eine Vielzahl von Lösungen verwendet, die systematisch auf ein Subjekt oder einen Patienten angewendet werden. Die internationale Anmeldung WO 86/00812 offenbart ein Arzneimittel zum Verhindern und Behandeln von ischämischen Zellschäden, das Folgendes aufweist, nämlich zumindest einen Plasmavolumenexpander, zumindest einen Hydroxylradikalfänger, zumindest ein Magnesiumsalz und zumindest eine calciumblockierende orga nische Verbindung; und einen Kit der all die Bestandteile des Arzneimittels einzeln oder in jeglicher Kombination aufweist. Das US-Patent 5,552,267 für Stern et al. offenbart ein Verfahren zum Konservieren eines Organs das eine Lösung verwendet, die ausdrücklich die Verwendung von Natriumionen, Chloridionen und Calciumionen vermeidet.
Der vorliegende Erfinder hat experimentelle Ansätze untersucht, die eine Technik des unblutigen Blutersatzes einsetzen, wobei azelluläre synthetische Lösungen verwendet werden, die dazu konzipiert sind, das Herz, das Gehirn und die inneren Organe während mehrerer Stunden blutloser Perfusion zu schützen. Das Konzept des Verwendens von ultratiefer Hypothermie (< 10°C) und eines kompletten Blutersatzes ist aus mehreren Gründen ansprechend und basiert auf einer Vielzahl von Faktoren. Erstens kann eine tiefere Hypothermie eine effektivere Unterdrückung des Stoffwechsels schaffen, wodurch die Toleranz gegenüber Ischämie erhöht wird und der Sauerstoffbedarf auf Level minimiert wird, die in ausreichender Weise in einer kalten wässrigen Lösung geliefert werden können, ohne dass ein Bedarf an speziellen sauerstofftragenden Molekülen besteht. Zweitens mildert eine vollständige Exsanguination eine Komplikation ab, die mit der erhöhten Viskosität, Koagulopathien und Erythrozytenverklumpungen von gekühltem Blut zusammenhängt. Drittens kann ein vaskuläres Reinigen schädliche katabolische Produkte und gebildete Elemente entfernen, die in den Ischämie- und den Reperfusionsverletzungskaskaden teilnehmen. Ein vierter Vorteil ist, dass die vollständige Exsanguination die Möglichkeit bietet, die vaskulären und extrazellulären Bereiche direkt mit Fluiden zu beaufschlagen, die dazu konzipiert sind, unter den Bedingungen ultratiefer Hypothermie schützend zu sein. So können zum Beispiel gelöste Stoffe zugegeben werden, um das ionische und osmotische Gleichgewicht auf zellulärem und auf Gewebelevel beizubehalten; biochemische und pharmakologische Zusatzstoffe können helfen, die Gewebeintegrität in einer Vielzahl von Wegen zu erhalten, einschließlich eines effizienten vaskulären Säuberns, der Membranstabilisierung, des Fangens von freien Radikalen und des Bereitstellens von Substraten für die Regeneration von hochenergetischen Verbindungen während des Wiedererwärmens und der Wiederperfusion. Im Wesentlichen sind dies die Prinzipien, die in größerem oder kleinerem Maße im Design der verschiedenen Lösungen ausgebildet sind, die für eine ex vivo Organkonservierung verwendet werden. In dieser Erfindung wurden ähnliche Prinzipien im Design von neuen hypothermischen Blutersatzstoffen angenommen.
Die zur Untersuchung dieses Ansatzes verwendete Arbeitshypothese war, dass eine azelluläre Lösung dazu konzipiert werden kann, als universelle Gewebekonservierungslösung zu wirken, und zwar während mehrerer Stunden eines hypothermischen Gesamtkörperauswaschens, das Herzstillstand, mit oder ohne Kreislaufstillstand, mit sich bringt. Unter dieser Hypothese haben Taylor et al. zwei Lösungen formuliert und untersucht, die als Hypothermosol^TM-purge (HTS-P) und Hypothermosol^TM-maintenance (HTS-M) bezeichnet wurden und die verschiedene Anforderungen während des unblutigen Verfahrens erfüllen. Einige Aspekte dieser Lösungen sind in den US-Patenten 5,405,742 und 5,514,536 für Taylor beschrieben, die beide in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind. Die Taylor Patente offenbaren Verfahren in denen einige Ausführungsformen der Zusammensetzung dieser Erfindung angewendet werden können. Die Taylor Patente offenbaren außerdem Zusammensetzun gen, die in den Verfahren und Kits dieser Erfindung verwendet werden können. Die Hauptlösung (HTS-M) ist eine hyperkalämische „intrazelluläre" Lösung, die spezifisch dazu konzipiert wurde, die zelluläre Integrität während des hypothermischen Intervalls bei niedrigster Temperatur „aufrechtzuerhalten". Die zweite Lösung ist dazu konzipiert, sowohl während des Abkühlens als auch während des Erwärmens als Schnittstelle zwischen dem Blut und der HTS-M Aufrechterhaltungslösung zu wirken. Diese Begleitlösung ist daher eine „extrazelluläre" Spüllösung, die dazu konzipiert ist, beim Reinigen des Kreislaufes von Blut während des Abkühlens zu helfen, da das Entfernen der Erythrozyten aus der Mikrovaskulatur ein wichtiges Ziel während der ultratiefen Hypothermie ist. Die „Reinigungs"-lösung ist auch dazu konzipiert, das System (Gefäßsystem und CPB Kreislauf) während des Erwärmens von der hyperkalämischen HTS-M Lösung zu reinigen und möglicherweise dabei zu helfen, angesammelte Toxine und Stoffwechselnebenprodukte auszuspülen, die bei der Reperfusion oxidativen Stress und Verletzungen durch freie Radikale fördern könnten.
Basierend auf den Prinzipien, die sich aus Konservierungsstudien von isolierten Organen entwickelt haben, wurde ein Versuch unternommen, einige der wichtigen Charakteristika in die Formulierung von Hypothermosol^TM-Lösungen einzuarbeiten, und, wo immer möglich, wurden Bestandteile ausgewählt, die multiple Rollen erfüllen können. Diese Strategie maximiert die inhärenten Qualitäten der Lösungen, die durch das Design als universelle Gewebekonservierungslösungen unausweichlich ein Hybrid von anderen hypothermischen Perfusaten und Lagermedien sind.
Die Zusammensetzungen der Hypothermosol^TM-Blutersatzmittel und das Grundprinzip ihrer Formulierung wurden in den US-Patenten 5,405,742 und 5,514,536 für Taylor et al., die beide durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin eingeschlossen sind, diskutiert. Es hat sich gezeigt, dass diese Lösungen das Gehirn, das Herz und die inneren Organe während 3,5 Stunden Herzstillstand und globaler Ischämie in einem blutfreien Hundemodell während einer kontrollierten tiefen Hypothermie bei < 10°C schützen. Die erfolgreiche Anwendung dieser Technik auf den Menschen würde eine mehr als dreifache Verlängerung der derzeitigen Beschränkung von < 1 Stunde für einen „sicheren" Stillstand ohne ein hohes Risiko von neurologischen Komplikationen schaffen. Dieser neue Ansatz für die unblutige Chirurgie würde das Gelegenheitsfenster für einen chirurgischen Eingriff in einer Vielzahl zur Zeit nicht operierbaren Fällen hauptsächlich auf den Gebieten der Herzkreislaufchirurgie, der Neurochirurgie und der Notfalltraumachirurgie deutlich verbreitern.
Seit Kurzem wird die Hypothermosol^TM-Erhaltungslösung für die hypothermische in vitro Konservierung einer Vielzahl von Geweben und Organen einschließlich isolierter Herzen, fötalem Rückenmark und künstlich hergestellter Haut verwendet.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Konzept eines vereinheitlichten Lösungssystems zum Herstellen von multiplen Lösungen, die für die verschiedenen Stufen in Prozeduren des Organ- oder Gewebebeschaffens-Konservierens-Transplantierens und/oder von unblutigen chirurgischen Prozeduren konzipiert und optimiert sind.
Während die bekannten Systeme, einschließlich der in den zuvor diskutierten Brasile- und Taylor-Patenten gelehrten, völlig unterschiedliche Zusammensetzungen für verschiedene Stufen von Prozeduren zur Organbeschaffung, Konservierung und Transplantation benötigten, schafft die vorliegende Erfindung eine oder zwei (oder wahlweise mehr) Basiszusammensetzungen und eine Anzahl von verschiedenen Zusatzstoffen, die zu der einen oder den mehreren Basiszusammensetzungen zugegeben werden können, um spezifische Zusammensetzungen herzustellen, die für spezifische Stufen in Prozeduren zur Organ- oder Gewebebeschaffung, Konservierung und Transplantation oder unblutigen chirurgischen Prozeduren nützlich sind. In Ausführungsformen können die Basis und die Zusatzstoffe in unterschiedlichen Behältern in einer einzigen Verpackung oder Kit gelagert werden. Außerdem werden spezifische verbesserte Basiszusammensetzungen geschaffen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Lebensfähigkeitsindex für MDCK Zellen nach einem Lagerintervall;
2 zeigt die vergleichende Lebensfähigkeit von A10 Zellen nach einem Lagerintervall von einem Tag;
3 zeigt die vergleichende Lebensfähigkeit von CPAE Zellen nach einem Lagerintervall von einem Tag;
4 zeigt die vergleichende Lebensfähigkeit von A10 Zellen nach einem Lagerintervall von 3 Tagen;
5 zeigt die vergleichende Lebensfähigkeit von CPAE Zellen nach einem Lagerintervall von 3 Tagen;
6 zeigt die vergleichende Lebensfähigkeit von A10 Zellen während eines Zeitraums von 6 Tagen nach einem hypothermischen Lagerintervall von 3 Tagen;
7 zeigt die vergleichende Lebensfähigkeit von CPAE Zellen während eines Zeitraums von 6 Tagen nach einem hypothermischen Lagerintervall von 3 Tagen;
8 zeigt eine lichtmikroskopische Histologie von Jugularvenensegmenten nach einem Zeitraum von kalter Ischämie in DMEM Kulturmedium;
9 zeigt eine lichtmikroskopische Histologie von Jugularvenensegmenten nach einem Zeitraum von kalter Ischämie in „I-Base-HK" Konservierungslösung in Übereinstimmung mit der Erfindung;
10 zeigt interne renale Widerstandsmessungen für bei –9°C durchspülte Hundenieren;
11 zeigt arterielle Flussgeschwindigkeiten für bei 9°C durchspülte Hundenieren;
12 zeigt den inneren renalen Widerstand der in vivo für konservierte Nieren gemessen wurde, die nach 20 Stunden Maschinenperfusionskonservierung ektopisch transplantiert wurden;
13 zeigt den mittleren arteriellen Fluss der in vivo für konservierte Nieren gemessen wurde, die nach 20 Stunden Maschinenperfusionskonservierung ektopisch transplantiert wurden; und
14 zeigt biochemische Indikatoren (Kreatinin und BUN) der Nierenfunktion für Schweinenieren, die nach einem Minimum von 20 Stunden Kaltlagerkonservierung transplantiert wurden.
15 und 16 zeigen vergleichende Lebensfähigkeiten von mit DMSO kryokonservierten Zellen, die entweder in der neuen phosphatfreien intrazellulären Basisvehikellösung mit hoher Kaliumkonzentration (HK-CV) oder EuroCollins-Lösung hergestellt wurden. Die Daten stellen den Durchschnitt (±SEM) von 4 Wiederholungszellchargen dar.
Detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Diese Erfindung schafft ein vereinheitlichtes Lösungssystem zum Herstellen multipler Lösungen, die für verschiedene Stufen in Prozeduren zur Organ und/oder Gewebebeschaffung, Konservierung und Transplantation und/oder für unblutign chirurgische Prozeduren konzipiert und optimiert sind.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine oder zwei Basiszusammensetzungen und eine Anzahl von verschiedenen Zusatzstoffen bereit, die zu der (den) Basiszusammensetzungen) zugegeben werden können, um spezifische Zusammensetzungen herzustellen, die für spezifische Stufen in Prozeduren zur Organbeschaffung, Konservierung und Transplanta tion und/oder bei unblutigen chirurgischen Prozeduren nützlich sind. In Ausführungsformen können die Basis und die Zusatzstoffe in getrennten Behältern in einer einzelnen Verpackung oder Kit gelagert werden.
Eine Basisformulierung weist ein Design auf, das die biophysikalischen und minimalen biochemischen Bestandteile berücksichtigt, die für alle oder eine gewünschte Untermenge an Anwendungen standardisiert werden können. Diese vereinheitlichte Basislösung kann dann als Träger für eine Reihe von Zusatzstoff-„Cocktails" verwendet werden, um ein System von Lösungen abzuleiten, die für verschiedene Bedürfnisse optimiert sind.
In Ausführungsformen der Reihe von Lösungen des vereinheitlichten Lösungssystems können Lösungen für die warme ischämische Zeit-Organkonservierung zum Beispiel Folgendes einschließen, nämlich eine hypothermische Spül-/Reinigungslösung, eine hypothermische Perfusat-/Erhaltungslösung, eine „normothermie" Perfusat-/Rettungslösung und/oder eine Prä-Reimplantationsspül-/Ausspüllösung.
Beispielhafte Ausführungsformen der Serie des vereinheitlichten Lösungssystems können zum Beispiel die folgenden Basislösungen einschließen:
Intrazelluläre Basislösung des vereinheitlichten Lösungssystems: Minimalanforderungen für die Kaltlagerung einschließlich Kryokonservierungslösung. Eine beispielhafte Formulierung einer solchen Lösung als bevorzugtes Ausführungsbeispiel ist in Tabelle 2 gegeben.
Extrazelluläre Basislösung des vereinheitlichten Lösungssystems: plasmaähnliche Elektrolyte als Basis für sauerstofftragende Moleküle und andere Substrate, die für eine optimierte „normotherme" Perfusion notwendig sind.
Beispielhafte Ausführungsformen der Serie des vereinheitlichten Lösungssystems können zum Beispiel die folgenden Lösungen aus Basis plus Zusatzstoff aufweisen:
Reinigung = extrazelluläre Basis plus Reinigungszusatzstoff („Cocktail"), hauptsächlich dazu konzipiert, das Gefäßsystem in Vorbereitung für die Konservierung von Blut zu reinigen.
Erhaltung = intrazelluläre Basis plus Zellschutzzusatzstoff („Cocktail"), konzipiert, um die zelluläre Stabilität während der Kaltlagerung zu schützen und aufrechtzuerhalten. Idealerweise trifft dieses sowohl auf statische Kaltlagerung als auch auf kalte Maschinenperfusion zu.
Rettung = extrazelluläre Basis plus Rettungszusatzstoff („Cocktail") für die nah-normotherme Perfusion.
Spülung = extrazelluläre Basis plus Spülzusatzstoff („Cocktail"), dazu konzipiert, vor der Reimplantation unerwünschte Konservierungsmoleküle wegzuspülen. Diese kann eine von der Reinigungslösung unterschiedliche Rolle spielen, die dazu konzipiert ist, vor der Konservierungsphase Erythrozyten und andere Blutbestandteile zu entfernen.
Kryo = konzentrierte intrazelluläre Basis plus durchdringende oder nichtdurchdringende Kälteschutzzusatzstoffe zur Konservierung von Zellen oder Geweben unter Null. Für die Kryoausführungsform wird die intrazelluläre Basis im Vergleich zu ihrer Verwendung allein und mit den meisten anderen Additiven, vorzugsweise auf 3–4 mal ihrer Stärke, konzentriert. Dies erleichtert ihre Kombination mit zugesetzten Kälteschutzverbindungen.
Beispiele einiger erläuternder Zusatzstoffe, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet werden können, sind in Tabelle 3 aufgelistet, es können jedoch viele andere Additive verwendet werden.
Beispielhafte Lösungen für ein klinisches Organkonservierungsprogramm sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1. Strategie zum Design von Lösungen für ein klinisches Organkonservierungsprogramm
Tabelle 2. Formulierung einer intrazellulären Basis des vereinheitlichten Lösungssystems (hohe Kaliumkonzentration)
Es wurde gegenüber dem Stand der Technik einschließlich Hypothermosol^TM eine beträchtliche Anzahl von Verbesserungen bezüglich der Kombinationen der Bestandteile und deren jeweiligen Konzentrationen in das Design der Zusammensetzungen und Systeme der Erfindung eingearbeitet.
Basierend auf den Prinzipien, die sich aus den Konservierungsstudien an isolierten Organen über die letzten Jahrzehnte entwickelt haben, hat sich eine Liste wünschenswerter Eigenschaften einer hypothermischen Blutersatzlösung, wie zuvor diskutiert, ergeben. Wie zuvor umrissen, haben sich die strategischen Designs von zur Organkonservierung verwendeten Lösungen abhängig von deren letztendgültiger Verwendung entweder als Spüllösung zur statischen Organlagerung oder als Perfusate für die kontinuierliche oder intermittierende Perfusion des Organs unterschieden. Als einzigartiger Ansatz wurde das vereinheitlichte Lösungssystem dieser Erfindung im Hinblick darauf formuliert, universelle Lösungen zu entwickeln, die sowohl für hypothermische statische Lagerung von Geweben und Organen als auch für die Maschinenperfusionskonservierung verwendet werden kön nen. Es wurde der Versuch unternommen, die Hauptcharakteristika von effektiven, hypothermischen Lösungen in der Formulierung der Basislösung zu kombinieren, und wo immer möglich wurden Bestandteile ausgewählt, die multiple Rollen erfüllen können. Zum Beispiel kann eine extrazelluläre Basislösung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung mit verschiedenen unterschiedlichen Zusatzstoffen kombiniert werden, um Reinigungslösungen, Organrettungslösungen, Präimplantationsspülungen und dergleichen zu bilden. Diese Strategie maximiert die inhärenten Qualitäten der Lösung, die durch das Design als universelle Gewebekonservierungslösungen unausweichlicher Weise ein verbesserter Hybrid von anderen hypothermischen Perfusaten und Lagermedien ist.
Hervorragende Designmerkmale für wünschenswerte Basislösungen sind nachstehend beschrieben. Es wird außerdem für solche Eigenschaften Bezug auf das US-Patent 5,405,742 genommen, das durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit hierin eingeschlossen ist.
Eine fundamentale biophysikalische Eigenschaft ist es, die optimale Konzentration von Ionen und Kolloiden bereitzustellen, um während der Hypothermie das ionische und osmotische Gleichgewicht in dem Organ oder dem Körpergewebe aufrechtzuerhalten. Insbesondere wird oder werden ein oder mehrere wirksame impermeante(s) Anion(en) eingeschlossen, um das Chlorid im extrazellulärem Raum teilweise zu ersetzen und ein osmotisches Zellenanschwellen zu verhindern (d.h. um die in den Zellen fixierten Ionen auszugleichen, die für den onkotischen Druck verantwortlich sind, der zur osmotischen Zellenanschwellen und ggf. zur Lyse während der Ischämie und der Hypothermie führt). Eine Anzahl von Anionen, einschließlich Citrat, Glycerophosphat, Gluconat und Lactobionat oder anionischer Formen von Aminosulfonsäuren wie HEPES (N-2-(Hydroxyethylpiperazin)-N-2-ethansulfonsäure), TES (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure), MOPS (3-(N-Morpholin)propansulfonsäure), TAPSO (3-3-N-tris(Hydroxymethyl)methylaminohydroxypropansulfonsäure) und DIPSO (2-3-N-bis(Hydroxyethyl)amino-2-hydroxypropansulfonsäure) können geeignete Kandidaten sein. Lactobionat (FW=358) wurde in vielen in den letzten Jahren entwickelten Lösungen ausschließlich als das Hauptimpermeant verwendet; diese schließen zum Beispiel Viaspan^TM, Hypdthermosol, Celsior, Cardiosol und Churchill's Lösung ein. Lactobionat ist außerdem als starker Calcium- und Eisenchelator bekannt und kann daher dazu beitragen, Zellverletzungen auf Grund von Calciumeinfluss und auf Grund der Bildung von freien Radikalen zu minimieren.
Bei der Organperfusion lehren jedoch Belzer und Southard (Organ Preservation, Annual Review of Medicine 1994; 46:235-247) gegen das Verwenden von Lactobionat in einer Perfusionslösung insbesondere für Nieren. Belzer und Southard haben außerdem die Wichtigkeit von Lactobionat als kritischer Bestandteil der UW Lösung erklärt, der nicht erfolgreich durch ein anderes Anion wie Gluconat ersetzt werden kann. Belzer und Southard lehren daher unterschiedliche und exklusive Rollen für Lactobionat und Gluconat in Organkonservierungslösungen, die jeweils statische Kaltlagerungs- oder Perfusionsansätze verwenden. Belzer lehrt außerdem weg von einem kombinierten Ansatz, der versucht, das Beste von einfacher Spüllagerung und kontinuierlicher Perfusion aufzunehmen, und zwar auf Grund von „spektakulär schlechten Ergebnissen" (siehe „Organ Preservation: Basic and Applied Aspects", Hrsg. D.E. Pegg et al., 1982, S. 339).
Die osmotischen Bestandteile dieser Erfindung können durch das Einschließen von Saccharose und Mannitol ergänzt werden, wobei Letzteres auch Eigenschaften als Hydroxylradikalfänger aufweist und den Vaskularwiderstand durch Induzieren einer Prostaglandin vermittelte Vasodilatation reduziert, was ein zusätzliche Vorteil sein kann.
Ein makromolekulares onkotisches Mittel ist ein wichtiger Bestandteil eines Blutersatzperfusats, um dabei zu helfen, den onkotischen Druck gleich dem von Blutplasma zu halten. Jedes onkotische Mittel, das ausreichend groß ist, um sein Entweichen aus dem Blutkreislauf durch Durchtreten durch die Fenestration des Kapillarbetts zu verhindern oder zu begrenzen, kann in Betracht gezogen werden. Beispiele von annehmbaren kolloidalen osmotischen Mitteln schließen Folgendes ein, nämlich Blutplasma; Expander wie Humanserumalbumin; Hetastarch oder Hydroxyethylstärke (HES), ein künstliches Kolloid, das aus wachsähnlicher Stärke entstanden ist und fast vollständig aus Amylopektin besteht, wobei Hydroxyethylethergruppen in die α-1-4 verbundenen Glucoseeinheiten eingeführt wurden, ein Gelatinepolypeptid; Polyethylenglykol; und Polysaccharidpolymere aus D-Glucose, wie zum Beispiel Dextrane. Ein bevorzugtes onkotisches Mittel um den hydrostatischen Druck der Perfusion auszugleichen und dabei zu helfen interstitiale Ödeme zu verhindern ist Dextran-40 (durchschnittliches Molekulargewicht = 40,000 Daltons). Es war seit langem bekannt, dass Dextran durch Verhindern des Verklumpens der roten Blutkörperchen und durch Erhöhen des intravaskulären osmotischen Drucks und durch Vermindern des vaskulären Widerstandes die Effizienz des Entfernens von Erythrozyten aus dem Mikrogefäßsystem von gekühlten Organen verbessern kann. Dextran findet klinisch breite Anwendung als Plasmaexpander und wird einfach und schnell durch die Nieren ausgeschieden. Es gibt außerdem zahlreiche neue Hinweise darauf, dass Dextran-40 ein effektives und gut toleriertes Kolloid in modernen Kaltlagerlösungen zur Organkonservierung ist.
Die Retention des Kolloids im vaskulären Raum ist ein wichtiger Gesichtspunkt zum Erreichen einer idealen onkotischen Unterstützung, und im Zusammenhang mit der Perfusioin von isolierten Organen über mehrere Tage können andere Kolloide gegenüber Dextran-40 bevorzugt werden. Für die Ganzkörperperfusion im Bereich von 3 Stunden kann jedoch die relative Permeabilität von verschiedenen Kolloiden weniger wichtig als andere Qualitäten sein und nicht antigenes Dextran 40 von klinischer Qualitätsstufe ist auf Grund der zuvor umrissenen Gründe bevorzugt. Jedes Dextran, das während der hypothermischen Prozedur in den interstitialen Raum eindringen sollte, wird nach der Rückkehr zu physiologischen Bedingungen auch einfach daraus eluiert. Ein weiterer möglicher Vorteil der Verwendung von Dextran ist, dass die Viskosität des Blutersatzes nicht so hoch sein wird wie mit anderen Kolliden, wie HES. Dies ist auch eine wichtige Erwägung unter rheologischen Gesichtspunkten bei einer Ganzkörper- oder auch nur bei einer Cerebralperfusion. Obwohl die hierin beschriebene bevorzugte Ausführungsform zu aller erst die Nierenkonservierung betrifft, ist die universelle Designstrategie des vereinheitlichten Lösungssystems für ausgedehnte hypothermische Anwendungen einschließlich einer Ganzkörperauswaschung gedacht.
Das Ionengleichgewicht, insbesondere die Na⁺/K⁺ und Ca²⁺/Mg²⁺ Verhältnisse, werden vorzugsweise so eingestellt, dass der passive Diffusionsaustausch bei niedrigen Temperaturen, wenn die Ionenpumpen deaktiviert sind, begrenzt wird. In der bevor zugten Ausführungsform mit hoher Kaliumkonzentration der zuvor beschriebenen vereinheitlichten Lösung, sind die Konzentrationen der monovalenten Kationen Na⁺ und K⁺ in etwa equimolar, um ihren passiven Transmembranaustausch zu begrenzen. In einer alternativen Ausführungsform des vereinheitlichten Lösungssystems mit niedriger Kaliumkonzentration wird das Gleichgewicht von Na/K im Hinblick auf die Bedenken wegen eines toxischen Effekts der hohen K⁺-Konzentration im Herz auf 125/25 verändert. Die Konzentration wird hoch genug gehalten, um einen kardioplegischen Effekt der Lösung beizubehalten. Im Bereich der Kardioplegie und der Herzmuskelkonservierung gibt es gute Hinweise auf ein verbessertes Überleben unter Verwendung von erhöhten Konzentrationen von Magnesium und sehr niedrigen Mengen, die aber nicht Null sind, von Calcium, um das mutmaßliche Calciumparadox zu vermeiden. Etwas Glucose ist in diesen hypothermischen Lösungen als Substrat eingeschlossen, aber die Konzentration ist niedrig, um eine exogene Überladung während der Hypothermie zu verhindern. Dies kann durch anaerobe Glykolyse die Lactatproduktion und die intrazelluläre Azidose potenzieren.
Azidose ist eine besondere Gefahr während der Hypothermie und besondere Aufmerksamkeit wurde dem Einschluss eines pH-Puffers geschenkt, der unter den bei niedrigen Temperaturen vorherrschenden nicht-physiologischen Bedingungen effektiv ist. HEPES wird als einer der am häufigsten verwendeten biokompatiblen Aminosulfonsäurepuffer bevorzugt, von denen gezeigt wurde, dass sie bei niedrigen Temperaturen überlegene Pufferkapazitäten aufweisen, und die als Hauptbestandteil in anderen hypothermischen Gewebekonservierungsmedien eingeschlossen wurden. Synthetische zwitterionsche Puffer wie HEPES, tragen außerdem auf Grund ihres Molekulargewichts (HEPES=238 Daltons) zur osmotischen Unterstützung in den extrazellulären Bereichen bei. Adenosin ist ein facettenreiches Molekül und kann in die hypothermischen Blutersatzmittel nicht nur als Substrat für die Regeneration von ATP während des Wiedererwärmens, sondern auch als vasoaktiver Bestandteil eingeschlossen werden, um durch Vasodilatation ein effektives vaskuläres Spülen zu erleichtern. Glutathion kann sowohl als zelluläres Antioxidans und als Hydroxylradikalfänger, als auch als Cofaktor für die Glutathionperoxidase eingeschlossen werden, die den Stoffwechsel von Lipidperoxiden und Wasserstoffperoxid ermöglicht.
Perfusionsvorrichtungen und Verfahren, mit denen Ausführungsformen dieser Erfindung verwendet werden können, sind in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Ser. No. 09/162,128 beschrieben, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
Beispielhafte wässrige Formulierungen sowohl von intrazellulären als auch von extrazellulären Basislösungen sind nachstehend erläutert. Die Formulierungen können im Wesentlichen etwa die aufgelisteten Mengen enthalten.
Beispielhafte intrazelluläre Basislösungen
Ionische Bestandteile

40–80 mM Na⁺;
50–90 mM K⁺;
0,01–0,1 mM Ca⁺ ⁺;
5–25 mM Mg⁺;
20–40 mM Cl^–;

pH Puffer

1–5 mM 2_ZP0₄ ^–;
3–7 mM HCO₃ ^–;
25–50 mM HEPES;

Impermeanten

25–50 mM Lactobionat;
10 mM-1M Saccharose;
15–30 mM Mannitol;
1–10 mM Glucose;
50–100 mM Gluconat;

Kolloide

6 % Dextran 40;

Pharmakologische Bestandteile

0,1–2 mM Adenosin; und
1–5 mM Glutathion

Beispielhafte intrazelluläre Basislösung mit hoher Kaliumkonzentration
Ionische Bestandteile

62,5 mM Na⁺;
70,0 mM K⁺;
0,05 mM Ca⁺⁺;
15,0 mM Mg⁺⁺;
30,1 mM Cl^–;

pH Puffer

2,5 mM H₂PO₄ ^–;
5,0 mM HCO₃ ^–;
35,0 mM HEPES;

Impermeanten

30,0 mM Lactobionat
15,0 mM Saccharose;
25,0 mM Mannitol;
5,0 mM Glucose;
70,0 mM Gluconat;

Kolloide

6 % Dextran 40;

Pharmakologische Bestandteile

2,0 mM Adenosin, und
3,0 mM Glutathion.

Diese beispielhafte intrazelluläre Basislösung weist eine Osmolalität (mOsm/Kg) von 350, einen pH von etwa 7,6 und eine [K⁺] [Cl^–] von etwa 2100 auf.
Beispielhafte intrazelluläre Basislösung mit niedriger Kaliumkonzentration
Ionische Bestandteile

100–150 mM Na⁺;
15–40 mM K⁺; 0,01–0,1 mM Ca⁺⁺;
5–25 mM Mg⁺⁺;
20–40 mM Cl^–;

pH Puffer

1–5 mM H₂PO₄ ^–;
3–7 mM HCO₃ ^–;
25–50 mM HEPES;

Impermeanten

Kolloide

6% Dextran 40;

Pharmakologische Bestandteile

0,1–2 mM Adenosin; und
1–5 mM Glutathion

Beispielhafte intrazelluläre Lösung mit niedriger Kaliumkonzentration
Ionische Bestandteile

125 mM Na⁺;
25,0 mM K⁺;
0,05 mM Ca⁺⁺;
15,0 mM Mg⁺⁺;
30,1 mM Cl^–;

pH Puffer

2,5 mM H₂PO₄ ^–;
5,0 mM HCO₃ ^–;
35,0 mM HEPES;

Impermeanten

30,0 mM Lactobionat;
15,0 mM Saccharose;
25,0 mM Mannitol;
5,0 mM Glucose;
70,0 mM Gluconat;

Kolloide

6% Dextran 40;

Pharmakologische Bestandteile

2,0 mM Adenosin; und
3,0 mM Glutathion

Beispielhafte extrazelluläre Basislösung
Ionische Bestandteile

120–160 mM Na⁺;
3–9 mM K⁺;
1–3 mM Ca⁺⁺;
1–10 mM Mg⁺⁺;
100–150 mM Cl^–;
1–10 mM (SO₄)^2–;

pH Puffer

1–3 mM H₂PO₄ ^–;
20–30 mM HCO₃ ^–;
5–15 mM HEPES;

Impermeanten

5–10 mM Glucose;

Kolloide

6% Dextran 40;

Pharmakologische Bestandteile

0,1–2 mM Adenosin; und
1–5 mM Glutathion

Beispielhafte extrazelluläre Basislösung
Ionische Bestandteile

141,2 mM Na⁺;
6,0 mM K⁺;
1,5 mM Ca⁺⁺;
5,0 mM Mg⁺⁺;
122,0 mM Cl^–;
1,0 mM (SO₄)^2–;

pH Puffer

1,2 mM H₂PO₄ ^–;
25,0 mM HCO₃ ^–;
25,0 mM HEPES;

Impermeanten

5,0 mM Glucose;

Kolloide

6% Dextran 40;

Pharmakalogische Bestandteile

1,0 mM Adenosin; und
3,0 mM Glutathion.

Diese beispielhafte extrazelluläre Basislösung weist eine Osmolalität (mOsm/Kg) von 315, einen pH von etwa 7,5 und ein [K⁺] [Cl^–] von etwa 732 auf.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Hypothermische Konservierung von Gewebekulturzellen
Es wurden Vorabexperimente unternommen, um die Lebensfähigkeit von Zellen nach hypothermischer Exposition bei 4°C in der exemplarischen Ausführungsform der Erfindung mit hoher Kaliumkonzentration und in anderen Lagermedien zu untersuchen. Diese Experimente wurden unter Verwendung einer Hundenierenzelllinie (MDCK) durchgeführt, da dies eine vergleichbare Referenz mit vorhergehenden Arbeiten bei der Entwicklung von hypothermischen Lösungen schuf . Die Zellen wurden mit 1 × 10⁴ Zellen/Well in Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) zur Kultivierung bei 37°C ausplattiert. Am nächsten Tag wurde die Platte auf Eis verbracht und das DMEM Medium wurde wie in 1 spezifiziert mit 100μl einer der vier in diesem Experiment untersuchten Lagerlösungen ersetzt. Jede Platte wurde entweder für einen oder fünf Tage bei 4°C gehalten. Nach der Lagerung wurde die Vehikellösung entfernt und, in Vorbereitung für die Untersuchung der Lebensfähigkeit unter Verwendung von Alamar Blue, wobei es sich um einen nicht toxischen Indikator der mitochondrialen oxidativen Phosphorylation handelt und das somit direkt den Stoffwechselstatus der Zelle misst, mit DMEM Kulturmedium ersetzt.
Aus den in 1 zusammengefassten Daten wird ersichtlich, dass nach 24 Stunden Exposition bei 4°C der Lebensfähigkeitsindex für Zellen, die in Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) gelagert wurden, etwa so niedrig wie die „keine-Zellen" Basislinienkontrolle war, was anzeigt, dass Standard-DMEM-Kulturmedium während dieses Zeitraums der hypothermischen Lagerung keinen Schutz verleiht. Die Antwort der in EuroCollins (EC) gelagerten Zellen war geringfügig besser, aber im Vergleich mit den Indizes für die in zwei „intrazellulären" Lösungen (die beispielhafte Ausführungsform der Erfindung mit hoher Kaliumkonzentration und Viaspan^TM) gelagerten Zellen deutlich unterlegen. Wir schließen, dass „intrazelluläre" Lösungen, wie die der Erfindung und Viaspan^TM, während hypothermischer Exposition im Vergleich entweder mit Standardkulturmedium oder mit EuroCollins Organkonservierungslösung überlegenen Zellschutz bieten. Die neue Lösung dieser Erfindung bietet außerdem, auf Basis dieser Vorabstudie, zumindest den gleichen Schutz wie andere etablierte hypothermische Lösungen einschließlich des Industriestandards für Organe, Viaspan^TM. Diese Experimente wurden erweitert, um, wie nachstehend beschrieben, eine 24 Stunden Lagerung von Schweinenieren einzuschließen.
Diese Studien wurden erweitert, um zwei zusätzliche Zelltypen in vitro einzuschließen, wobei die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung von Alamar Blue zu verschiedenen Zeitpunkten im Anschluss an die hypothermische Lagerung untersucht wurde. Die vaskuläre Glattmuskelzelllinie (A10) und eine endotheliale Rinderlungenzelllinie (CPAE) wurden in diesen Experimenten verwendet. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10° Zellen/Well in Standardzellkulturmedium ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Platten auf Eis verbracht und das Medium wurde mit 100μl der verschiedenen Lagerlösungen ersetzt (siehe 2–5).
Die Platten wurden entweder für einen oder drei Tage bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Im Anschluss an die Lagerung wurden die Platten wiederum auf Eis verbracht und die Lagerlösungen wurden zur Messung der Zelllebensfähigkeit mit Alamar Blue durch Medium ersetzt. Die Lebensfähigkeit wurde zu zwei Zeitpunkten, entweder direkt nach der Exposition (2–5) oder für sechs aufeinanderfolgende Tage nach der Exposition bei 4°C (6 und 7) gemessen.
Die vergleichende Lebensfähigkeit der Zellen am Ende jedes Lagerintervalls ist in 2–5 dargestellt. Die Lebensfähigkeit beider Zelltypen nach 24 Stunden hypothermischer Lagerung in UHK war gleich oder besser als in Viaspan^TM (2–5). Nach drei Tagen bei 4°C demonstrierte UHK für A10 Zellen eine bessere Lebensfähigkeit als Viaspan^TM und eine ähnliche Lebensfähigkeit für CPAE (4 und 5). Im Vergleich dazu zeigten die anderen Lösungen DMEM, EC und Belzer's MPS (Maschinenperfusionslösung) alle nach drei Tagen der Lagerung einen unterlegenen Schutz. Die Lebensfähigkeitsindizes waren für die A10 Zellen nicht größer als die Hintergrundlevel (keine Zellen), sowohl nach einem, als auch nach drei Tagen hypothermischer Lagerung. In EC Lösung zeigten CPAE Zellen nach einem Tag hypothermischer Lagerung eine gewisse Lebensfähigkeit, aber nach drei Tagen ging die Lebensfähigkeit in EC auf Hintergrundlevel zurück. DMEM und die Belzer Lösung lagen beide für die CPAE Zellen nach einem und nach drei Tagen hypothermischer Lagerung auf dem Hintergrundlevel.
Das Messen der Zelllebensfähigkeit direkt nach der Niedertemperaturlagerung gibt nicht notwendiger Weise einen guten Hinweis auf das Zellüberleben. Mit der Zeit können die Zellen weitere Veränderungen erfahren, einschließlich der Reparatur von subletalen Verletzungen oder Zelltod durch die Vorgänge der Apoptose und Nekrose. Was auch immer das letztendgültige Schicksal der hypothermisch exponierten Zellen sein mag, benötigen die Prozesse Zeit zur vollen Manifestation, und die Überlebenskurven während den Tagen im Anschluss an die Rückkehr zu physiologischen Temperaturen sind informativ über den wahren Zustand der Lebensfähigkeit. Im Licht dieser Bedingungen untersuchten wir die posthypothermische Lebensfähigkeit während sechs aufeinanderfolgenden Tagen der Kultivierung bei 37°C weiter (6 und 7). Eine solche Untersuchung war möglich, da Alamar Blue für Zellen nicht toxisch ist und als nicht zerstöreririscher Lebensfähigkeitsassay wiederholt auf die gleiche Zellcharge angewendet werden kann.
6 und 7 veranschaulichen, dass im Allgemeinen das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration („HK") die gleiche oder eine bessere Konservierung als die anderen Lösungen bereitstellte. Beide „intrazelluläre" Lösungen, Viaspan^TM und das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration erwiesen sich im Vergleich mit anderen Lösungen als überlegen. Nach drei Tagen hypothermischer Lagerung waren nur die CPAE Zellen, die im Viaspan^TM oder dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration gelagert wurden, und nur die in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration gehaltenen A10 Zellen in der Lage, sich in der Kultur fortzupflanzen.
Diese und ähnliche Beobachtungen zeigen, dass das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration gegenüber allgemein verwendeten Lösungen, die für die hypothermische Lagerung von Geweben und Organen verwendet werden, zumindest gleich oder überlegen ist.
BEISPIEL 2: Vergleichende Kryokonservierung von Zellen unter Verwendung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der beispielhaften intrazellulären High-K Basislösung.
Das gleiche System, das zuvor für die Zellen in Mikrotiterplatten beschrieben wurde, wurde verwendet, um ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der beispielhaften intrazellulären High-K Basislösung als neue Trägerlösung für Kälteschutzzusatzstoffe (CPA) zu untersuchen. Spezifisch wurde eine phosphatfreie Formulierung der neuen High-K Lösung hergestellt, um die bekannte Prezipitation von divalenten Phosphatkationen in Anwesenheit des Kälteschutzmittels DMSO bei niedrigen Temperaturen zu vermeiden. Das Zellüberleben wurde nach Einfrieren und Auftauen in Anwesenheit einer Reihe von DMSO Konzentrationen verglichen, die entweder in der neuen phosphatfreien HK-Kälteschutzvehikellösung (HK-CV) oder EuroCollins Medium hergestellt wurden. EuroCollins ist eine Organkonservierungslösung, die auf dem Gebiet der Kryobiologie ebenfalls als Vehikellösung für Kälteschutzmittel verwendet wurde.
Zellen wurden mit 2 × 10° Zellen/Well ausplattiert und nach Inkubation über Nacht wurde das reguläre Kulturmedium mit den experimentellen CPA Mischungen ersetzt, wobei das folgende Protokoll verwendet wurde: die Platten wurden mit einer kontrollierten Geschwindigkeit (1°C pro Minute) auf –80°C abgekühlt und dann über Nacht bei –135°C gelagert. Die Platten wurden dann unter Verwendung eines Erwärmungsprotokolls mit zwei Schritten aufgetaut und die CPA wurde, unter Verwendung von Mannitol als osmotischem Puffer, verdünnt. Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Alamar Blue Assays auf zelluläre Stoffwechselaktivität bei 37°C hin bewertet. Die 15 und 16 zeigen die vergleichende Lebensfähigkeit von zwei Zelltypen nach Kryokonservierung in den jeweiligen Medien. Die Daten zeigen, dass das optimale Überleben der beiden Zelltypen unter Verwendung von 1–2 molaren DMSO erreicht wurde, aber dass die prozentuale Lebensfähigkeit, die auf unbehandelte Zellen normalisiert wurde, für die in der neuen intrazellulären HK Basisvehikellösung konservierten, im Vergleich mit EuroCollins Medium, merklich höher war. Dies war sowohl für die A10 Glattmuskelzellen als auch für die endothelialen Rinderhornhaut (BCE) Zellen konsistent.
BEISPIEL 3: Strukturelle Integrität von hypothermisch gelagerten Venen
Die hypothermische Lagerung von ganzen Organen, die mit einer Konservierungslösung gespült oder durchspült wurden, ist in der klinischen Transplantation allgemeine Praxis. Dieses Verfahren belässt die endothelialen vaskulären Zellen während des Zeitraums der kalten Ischämie in direkter Berührung mit dem Konservierungsmedium. Die Auswirkung der Lagerbedingungen auf die Integrität des vaskulären Endotheliums ist daher von äußerster Wichtigkeit für die Qualität der Konservierung von intakten Organen.
Es wurde eine Pilotstudie durchgeführt, um die mikroskopischen Veränderungen in der Gewebemorphologie zu vergleichen, wenn entnommene Blutgefäße in der Beispielslösung für hypothermische Konservierung mit hoher Kaliumkonzentration eingetaucht und transportiert wurden, und zwar im Vergleich mit Dubecco's Minimum Essential Medium (DMEM), wobei es sich um ein verbreitetes Kulturmedium handelt, das dazu verwendet wird, Gewebe ex vivo zu inkubieren und zu transportieren. Für drei separate Experimente wurden frische Jugularvenen aus Kaninchen entnommen (mit einem Verfahren das wir extensiv verwendet haben) und entweder in vorgekühltes DMEM oder das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration eingetaucht. Beide Lösungen wurden auf Eis gehalten. Die Gewebeproben wurden dann in das Labor transportiert, wo die Blutgefäße zum Fixieren und Weiterverarbeiten für die Histopathologie in Abschnitte geschnitten wurden. Die Gesamtzeit der kalten Ischämie in diesen Experimenten war relativ kurz, nämlich 34,5 ± 9,5 Minuten für die in DMEM transportierten Proben und 37 ± 4 Minuten für die Proben in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration.
Das in DMEM auf Eis eingetauchte und transportierte Gewebe zeigte, wie in 8 gezeigt, mikroskopische Veränderungen in der Tunika Intima und der Tunika Media. Die Intima war intakt, es gab aber eine extreme Vakuolisierung (angezeigt durch die Pfeile) der unterliegenden Basallamina, was wiederum die Extrusion von Endothelialzellen in das Lumen verursachte und ein „aufgerundetes" Aussehen ergab. Abgesehen von dieser Vakuolisierung wiesen die endothelialen Zellen ein fast normales Aussehen auf. Die Glattmuskelzellen (SM) wiesen ein etwas geschrumpftes Aussehen mit unregelmäßigen Konturen auf. Die Tunika Adventitia war im Wesentlichen normal. Das Lumen L ist ebenfalls dargestellt.
Im Gegensatz dazu zeigten die Jugularvenen, die in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration transportiert wurden, im Vergleich mit der DMEM Gruppe, wie in 9 dargestellt, wenige, wenn überhaupt irgendwelche histologischen Veränderungen. Die Tunika Intima war intakt und es gab wenig Hinweise auf eine Vakuolisierung der darunterliegenden Basalmembran. Die Glattmuskelzellen (SM) erschienen nicht geschrumpft und befanden sich in einer normalen horizontalen Orientierung.
Diese Vorabexperimente demonstrieren, dass die kalte Ischämie in den in Kulturmedium gelagerten Venen innerhalb von weniger als einer Stunde zu mikroskopischen Veränderungen führt. Im Gegensatz dazu zeigen die in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration gelagerten Venen diese mikroskopischen Veränderungen nicht. Dies sind wichtige Beobachtungen, da historisch geschlossen wurde, dass selbst für eine Kurzzeitlagerung Salzlösung nicht das beste Konservierungsfluid ist. Außerdem haben mehrere Studien gezeigt, wie sensitiv die Endothelialschicht gegenüber Handhabung ist. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass kalte Konservierung nach nur 3 Stunden Kaltlagerung zu schweren Veränderungen der Endothelialzellen und deren merklichen Ablösen führte. Viele andere Studien haben jedoch mor phologische und funktionelle Beschädigungen von endothelialen Zellen dokumentiert, die durch Kaltlagerung in autologem Ganzblut, normaler Salzlösung und Ringer's Laktat induziert wurden. Eine neue Studie hat die „Goldstandard" Organkonservierungslösung Viaspan^TM für die Lagerung von Hundevenen mit autologem Vollblut und normaler Salzlösung verglichen. Die Studie zeigte, dass die intimale Hyperplasie und die vaskuläre Physiologie nach der Implantation in mit Viaspan^TM behandelten Venentransplantaten und frischen unbehandelten Kontrollen ähnlich war. Im Gegensatz dazu zeigten die beiden anderen Behandlungsgruppen statistisch signifikante Veränderungen. Andere haben jedoch berichtet, dass Lösungen vom hyperkalemischen Typ (von denen Viaspan^TM ein Beispiel ist) Thrombophlebitis und verminderte fibrinolytische Aktivität des Venenendotheliums verursachen können. Wie zuvor diskutiert, gibt es dokumentierte Befürchtungen wegen schädlicher Auswirkungen von sehr hohen Kaliumleveln (> 100 mM) auf das Herz, wie sie in vielen Organkonservierungslösungen gefunden werden.
BEISPIEL 4: Vergleichende Organkonservierungsstudien unter Verwendung des Beispiels mit hoher Kaliumkonzentration
A. Vergleich der neuen High-K (HK) Lösung mit Belzer Maschinenperfusionslösung
Eine neue intrazelluläre Basislösung mit hoher Kaliumkonzentration wurde mit einer etablierten Lösung (Belzer Maschinenperfusionslösung [MPS]) während kontinuierlicher 18–20 Stunden Perfusionskonservierung von, nach einer Stunde warmer Ischmie, beschafften Hundenieren verglichen. Im Anschluss an die Beschaffung aus erwachsenen Mischlingshunden (n–5) wurden beide Nieren mit Viaspanlösung gespült und vor Beginn der Perfusion für etwa zwei Stunden bei 4°C gelagert. Die Perfusion wurde unter Verwendung eines multiplen Organwiedergewinnungsperfusionsprototyps mit zwei unabhängigen Kreisläufen durchgeführt. Eine Niere wurde mit der neuen intrazellulären Basislösung mit hoher Kaliumkonzentration durchspült und die gegenüberliegende Niere wurde mit Belzer WS durchspült, beide bei etwa 9°C und einem geregelten Druck von 35–40 mmHg. Nach 18–20 Stunden Perfusion wurden die Nieren ektopisch transplantiert, wobei ein Hundekarotis Modell verwendet wurde.
Die 10 und 11 zeigen, dass der mittlere arterielle Durchfluss für die mit der neuen Lösung durchspülten Nieren im Vergleich mit MPS zu jedem Zeitpunkt höher war und die vaskuläre Wiederstandskurve für die Nierengruppe der neuen Lösung niedriger war. Im Allgemeinen waren diese physiologischen Parameter während der in vitro Perfusion in beiden Gruppen ähnlich. Am Ende von einer Stunde in vivo, zeigten die mit der neuen Lösung durchspülten Nieren jedoch höhere arterielle Flussgeschwindigkeiten (p < 0,5) und niederere interne renale Wiederstände (p < 0,5), als die mit Belzer WS (6) durchspülten Nieren.
Die Ergebnisse deuten an, dass die neue Lösung für die Perfusionskonservierung von Nieren eine überlegene Alternative zu Belzer MPS sein könnte.
B. Vergleich der neuen High-K Lösung mit Viaspanlösung in einem Schweinemodell
Die Effektivität einer neuen intrazellulären Basislösung mit hoher Kaliumkonzentration, die die minimalen theoretischen Anforderungen für die Organkaltlagerung erfüllt, wurde in einem etablierten Schweinenierentransplantationsmodell mit kommerziellem Viaspan verglichen. Diese in vivo Studien wurden unter Verwendung eines autologen Schweinemodells durchgeführt, in dem eine Niere entfernt, gespült und vor der Reimplantation entweder mit der neuen Lösung mit hoher Kaliumkonzentration (n=5) oder Viaspan (n=5) für zumindest 20 Stunden gelagert wurde. Die gegenüberliegende nicht operierte Niere wurde 5–7 Tage später entfernt und die Leistung der konservierten Niere wurde durch die Bewertung von BUN, Kreatinin und der Histopathologie bestimmt. 14 zeigt biochemische Indikatoren (Kreatinin und BUN) der Nierenfunktion für Schweinenieren die nach einem Minimum von 20 Stunden Kaltlagerungskonservierung entweder in der neuen intrazellulären Basislösung mit hoher Kaliumkonzentration oder Viaspan transplantiert wurden und zeigt, dass zwischen den zwei Gruppen in allen Bewertungskriteria keine statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet wurden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese vorklinischen Resultate andeuten, dass die Basisformulierung der neuen Lösung mit hoher Kaliumkonzentration während den klinisch relevanten Zeiträumen der Nierenlagerung eine hypothermische Nierenzellenkonservierung bereitstellt, die zumindest äquivalent zu der des etablierten Standards Viaspan ist.

Claims

Verfahren zum Beschaffen, Konservieren, Transplantieren und/oder zur unblutigen Chirurgie eines Organs oder eines Gewebes, das die folgenden Schritte aufweist, nämlich: (a) Bereitstellen einer Basiselektrolytlösung, die Folgendes aufweist, nämlich: 40–80 mM Na⁺; 50–90 mM K⁺; Ca²⁺; Mg²⁺ , Cl^–; H₂PO₄ ^–; HCO₃ ^–; HEPES; Lactobionat; Saccharose; Mannitol; Glucose; Gluconat; Dextran 40; Adenosin; und optional Glutathion; (b) Mischen eines ersten Teils der Basislösung mit einem ersten Zusatzstoff, um eine erste gemischte Lösung herzustellen; (c) In-Berührung-Bringen der ersten gemischten Lösung mit einem Organ oder einem Gewebe während zumindest einer Stufe des Beschaffens, Konservierens, Transplantierens oder der unblutigen Chirurgie dieses Organs oder dieses Gewebes; (d) Mischen eines zweiten Teils der Basislösung mit einem zweiten anderen Zusatzstoff um eine zweite andere gemischten Lösung herzustellen; und (e) In-Berührung-Bringen der zweiten gemischten Lösung mit einem Organ oder einem Gewebe während zumindest einer Stufe des Beschaffens, Konservierens, Transplantierens oder der unblutigen Chirurgie dieses Organs oder dieses Gewebes.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Basislösung Folgendes aufweist, nämlich: 40–80 mM Na⁺; 50–90 mM K⁺; 0,01–0,1 mM Ca²⁺; 5–25 mM Mg² ⁺; 20–40 mM Cl^–; 1–5 mM H₂PO₄ ^–; 3–7 mM HCO₃ ^–; 25–50 mM HEPES; 25–50 mM Lactobionat; 10 mM-1 M Saccharose; 15–30 mM Mannitol; 1–10 mM Glucose; 50–100 mM Gluconat; 6 % Dextran 40; 0,1–2 mM Adenosin; und optional 1–5 mM Glutathion.
Verfahren zum Beschaffen, Konservieren, Transplantieren und/oder zur unblutigen Chirurgie eines Organs oder eines Gewebes, das die folgenden Schritte aufweist, nämlich: (a) Bereitstellen einer Basiselektrolytlösung, die Folgendes aufweist, nämlich: 120–160 mM Na⁺; 3–9 mM K⁺; 1–3 mM Ca²⁺; 1–10 mM Mg² ⁺; 122–150 mM Cl^–; 1–10 mM (SO₄)^2–; 1–3 mM H₂PO₄ ^–; 20–30 mM HCO₃ ^–; 5–15 mM HEPES; 5–10 mM Glucose; 6 % Dextran 40; 0,1–2 mM Adenosin; und optional 1–5 mM Glutathion; (b) Mischen eines ersten Teils der Basislösung mit einem ersten Zusatzstoff, um eine erste gemischte Lösung herzustellen; (c) In-Berührung-Bringen der ersten gemischten Lösung mit einem Organ oder einem Gewebe während zumindest einer Stufe des Beschaffens, Konservierens, Transplantierens oder der unblutigen Chirurgie dieses Organs oder dieses Gewebes; (d) Mischen eines zweiten Teils der Basislösung mit einem zweiten anderen Zusatzstoff, um eine zweite andere gemischte Lösung herzustellen; und (e) In-Berührung-Bringen der zweiten gemischten Lösung mit einem Organ oder einem Gewebe während zumindest einer Stufe des Beschaffens, Konservierens, Transplantierens oder der unblutigen Chirurgie dieses Organs oder dieses Gewebes.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Organ oder das Gewebe isoliert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei sich das Organ oder das Gewebe in einem Leichnam befindet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei sich das Organ oder das Gewebe in einem lebenden Patienten befindet.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Patient einer unblutiger Chirurgie unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Basislösung kein Glutathion enthält; und das weiterhin den Schritt aufweist, nämlich Zugeben von Glutathion zu der Basislösung oder zu der gemischten Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Organ oder das Gewebe aus Schritt (c) und das Organ oder das Gewebe aus Schritt (e) das gleiche Organ oder das gleiche Gewebe sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Organ oder das Gewebe aus Schritt (c) und das Organ oder das Gewebe aus Schritt (e) unterschiedliche Organe oder Gewebe sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei zumindest einer der Schritte des In-Berührung-Bringens das Reinigen der Blutgefäße des Organs oder des Gewebes von Blut als Vorbereitung für das Konservieren aufweist; und wobei der Zusatzstoff des zumindest einen der Schritte des In-Berührung-Bringens aus der Basislösung eine Reinigungslösung bildet.
verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei zumindest einer der Schritte des In-Berührung-Bringens das Schützen und Erhalten der zellulären Stabilität während der Kaltlagerung des Organs oder des Gewebes beinhaltet; und wobei der Zusatzstoff des zumindest einen der Schritte des In-Berührung-Bringens ein vor Kälteschäden schützender Zusatzstoff ist, der aus der Basislösung eine Erhaltungslösung bildet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei zumindest einer der Schritte des In-Berührung-Bringens das Wiederherstellen der Lebensfähigkeit des Organs oder des Gewebes durch fast normotherme Perfusion beinhaltet; und wobei der Zusatzstoff des zumindest einen der Schritte des In-Berührung-Bringens ein Rettungszusatzstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei zumindest einer der Schritte des In-Berührung-Bringens das Wegspülen von unerwünschten Molekülen von dem Organ oder dem Gewebe beinhaltet; und wobei der Zusatzstoff des zumindest einen der Schritte des In-Berührung-Bringens ein Spülzusatzstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die unerwünschten Moleküle Moleküle der Konservierungslösung sind, und wobei dem zumindest einen Schritt des In-Berührung-Bringens die Reimplantation des Organs oder des Gewebes folgt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die unerwünschten Moleküle Erythrozyten und andere Blutbestandteile sind, und wobei dem zumindest einen der Schritte des In-Berührung-Bringens ein Konservierungsvorgang folgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei zumindest eine Stufe von Schritt (c) die Cryokonservierung des Organs oder des Gewebes durch ein Abkühlen auf unter Null aufweist; und wobei der erste Zusatzstoff ein vor Kälteschäden schützender Zusatzstoff ist.
Lösung zum Beschaffen, Konservieren, Transplantieren und/oder zur unblutigen Chirurgie eines Organs und/oder eines Gewebes, die Folgendes aufweist, nämlich: 40–80 mM Na⁺; 50–90 mM K⁺; 0,01–0,1 mM Ca²⁺; 5–25 mM Mg² ⁺; 20–40 mM Cl^–; 1–5 mM H₂PO₄ ^–; 3–7 mM HCO₃ ^–; 25–50 mM HEPES; 25–50 mM Lactobionat; 10 mM-1 M Saccharose; 15–30 mM Mannitol; 1–10 mM Glucose; 50–100 mM Gluconat; 6 % Dextran 40; 0,1–2 mM Adenosin; und optional 1–5 mM Glutathion
Lösung zum Beschaffen, Konservieren, Transplantieren und/oder zur unblutigen Chirurgie eines Organs und/oder eines Gewebes, die Folgendes aufweist, nämlich: 120–160 mM Na⁺; 3–9 mM K⁺; 1–3 mM Ca²⁺; 1–10 mM Mg² ⁺; 122–150 mM Cl^–; 1–10 mM (SO₄)^2–; 1–3 mM H₂PO₄ ^–; 20–30 mM HCO₃ ^–; 5–15 mM HEPES; 5–10 mM Glucose; 6 % Dextran 40; 0,1–2 mM Adenosin; und optional 1–5 mM Glutathion.
Lösung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Lösung ferner 1–5 mM Glutathion aufweist.
Lösung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Lösung ferner etwa 3,0 mM Glutathion aufweist.
Lösung nach Anspruch 18, wobei die Lösung eine Osmolalität (mOsm/kg) von etwa 350, einen pH-Wert von etwa 7,6 und ein [K][Cl^–] von etwa 2100 aufweist.
Lösung nach Anspruch 19, wobei die Lösung eine Osmolalität (mOsm/kg) von etwa 315, einen pH-Wert von etwa 7,5 und ein [K⁺] [Cl^–] von etwa 732 aufweist.
Lösungskit, der eine verkaufsfähige Packung aufweist, die Folgendes enthält, nämlich: 1) zumindest einen ersten Behälter, der zumindest eine Basiselektrolytlösung enthält, wobei die Lösung Folgendes aufweist, nämlich 40–80 mM Na⁺; 50–90 mM K⁺; Ca²⁺; Mg²⁺; Cl^–; H₂PO₄ ^–; HCO₃ ^–; HEPES; Lactobionat; Saccharose; Mannitol; Glucose; Gluconat; Dextran 40; und Adenosin; und 2) zumindest zwei zweite Behälter, die jeweils unterschiedliche Zusatzstoffe enthalten, zum Umwandeln der Basislösung in verschiedene gemischte Lösungen zur Verwendung in verschiedenen Stufen des Beschaffens, Konservierens oder Transplantierens eines Organs oder eines Gewebes.
Kit nach Anspruch 24, wobei die Basislösung Folgendes aufweist, nämlich: 40–80 mM Na⁺; 50–90 mM K⁺; 0,01–0,1 mM Ca² ⁺; 5–25 mM Mg² ⁺; 20–40 mM Cl^–; 1–5 mM H₂PO₄ ^–; 3–7 mM HCO₃ ^–; 25–50 mM HEPES; 25–50 mM Lactobionat; 10 mM-1 M Saccharose 15–30 mM Mannitol; 1–10 mM Glucose; 50–100 mM Gluconat; 6 % Dextran 40; 0,1–2 mM Adenosin; und optional 1–5 mM Glutathion.
Lösungskit, der eine verkaufsfähige Verpackung aufweist, die Folgendes enthält, nämlich: 1) zumindest einen ersten Behälter, der zumindest eine Basiselektrolytlösung enthält, wobei die Lösung Folgendes aufweist, nämlich: 120–160 mM Na⁺; 3–9 mM K⁺; 1–3 mM Ca² ⁺; 1–10 mM Mg² ⁺; 122–150 mM Cl^–; 1–10 mM (SO₄)^2–; 1–3 mM H₂PO₄ ^–; 20–30 mM HCO₃ ^–; 5–15 mM HEPES; 5–10 mM Glucose; 6 % Dextran 40; und 0,1–2 mM Adenosin; und 2) zumindest zwei zweite Behälter, die jeweils unterschiedliche Zusatzstoffe enthalten, zum Umwandeln der Basislösung in verschiedene gemischte Lösungen zur Verwendung in verschiedenen Stufen des Beschaffens, Konservierens oder Transplantierens eines Organs oder eines Gewebes.
Kit nach Anspruch 24, 25 oder 26, wobei die Basislösung weiterhin 1–5 mM Glutathion aufweist oder wobei der Kit weiterhin einen Behälter aufweist, der eine Menge Glutathion enthält, die, wenn sie zu der Basislösung zugegeben wird, eine Basislösung herstellt, die 1–5 mM Glutathion aufweist.
Kit nach Anspruch 24, 25 oder 26, wobei die Basislösung weiterhin etwa 3,0 mM Glutathion aufweist oder wobei der Kit weiterhin einen Behälter aufweist, der eine Menge Glutathion enthält, die, wenn sie zu der Basislösung zugegeben wird, eine Basislösung herstellt, die etwa 3,0 mM Glutathion aufweist.
Der Kit nach Anspruch 25, wobei die Basislösung eine Osmolalität (mOsm/kg) von etwa 350, einen pH-Wert von etwa 7,6 und ein [K][Cl^–] von etwa 2100 aufweist.
Kit nach Anspruch 26, wobei die Basislösung eine Osmolalität (mOsm/kg) von etwa 315, einen pH-Wert von etwa 7,5 und ein [K][Cl^–] von etwa 732 aufweist.
Kit nach Anspruch 24 oder 26, wobei zumindest ein solcher Zusatzstoff ein Reinigungszusatzstoff zum Reinigen eines Organs oder eines Gewebes von Blut ist.
Kit nach Anspruch 24 oder 26, wobei zumindest ein solcher Zusatzstoff ein Zusatzstoff zum Schutz vor Kälteschäden ist.
Kit nach Anspruch 24 oder 26, wobei zumindest ein solcher Zusatzstoff ein Rettungszusatzstoff ist.
Kit nach Anspruch 24 oder 26, wobei zumindest ein solcher Zusatzstoff ein Spülzusatzstoff zum Wegspülen von ungewollten Konservierungsmolekülen von einem Organ oder einem Gewebe ist.