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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die topische Verabreichung von Substanzen
in die Haut, insbesondere durch Zerreißung des stratum corneum und
Verabreichung der Substanz in die darunterliegende epidermale Schicht.
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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Die
Verabreichung von Substanzen in den Körper durch die Haut ist normalerweise
invasiv und erfolgt mit Nadeln und Spritzen in Form intradermaler (ID),
intramuskulärer
(IM) oder subkutaner (SK) Injektion. Diese Verfahren sind für den Patienten
schmerzhaft, erfordern das Können
eines geschulten Arztes und führen
oft zum Bluten. In jüngerer
Vergangenheit gab es Anstrengungen, diese Nachteile mittels Apparaturen
zu überwinden,
die das stratum corneum zerreißen
oder abschleifen (das stratum corneum ist die etwa 10–20 μm dünne äußere Schicht
aus verhornten Zellen, die als die äußere Sperrschicht der Haut dient),
und die gewünschte
Substanz auf die freiliegende Epidermis zu verabreichen. Die Substanz kann
dann durch die Epidermis zur Dermis, die Blutgefäße und Lymphgefäße enthält, diffundieren,
damit diese die Substanz absorbieren und im Körper verteilen. Für die topische
Verabreichung von Impfstoffen ist die Epidermis selbst ein besonders
geeignetes Ziel zur Verabreichung von Medikamenten, da sie reich
an Antigen-präsentierenden
Zellen ist. Im Vergleich dazu enthält die Dermis weniger Antigenpräsentierende
Zellen. Das stratum corneum und die Epidermis enthalten weder Nerven
noch Blutgefäße, so dass
dieses Verfahren den Vorteil hat, im wesentlichen schmerzfrei und
blutungsfrei zu sein und gleichzeitig Zugang zu den Hautschichten
zu gewähren,
die in der Lage sind, auf das Antigen zu reagieren.
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Aus
der britischen Patentschrift Nr. GB-A-2 125 280 ist eine chirurgische
Abschleifvorrichtung bekannt. Sie enthält einen planaren Basiswandabschnitt
mit zwei einander gegenüberliegenden
planaren Flächen
sowie einen Schaumstoffabschnitt von allgemein blockartiger Form,
der direkt an eine der planaren Flächen der Basiswand angehaftet ist,
wobei der Schaumstoffabschnitt aus einer Offenzellstruktur besteht.
Der als Formteil ausgebildete Bürstenabschnitt
weist eine Anordnung einzelner Borsten auf, die integral zur zweiten
Fläche
der planaren Basiswand geformt sind. Ein nichtverteiltes chirurgisches
Schleifmittel befindet sich in Tütchen und
wird in den Schaumstoffabschnitt abgegeben, nachdem das Tütchen mit
einem Kunststoff-Nagelreiniger angestochen wurde, und ein versiegelter
Beutel aus synthetischer Folie umschließt den Bürstenabschnitt, den planaren
Basiswandabschnitt, den Schaumstoffabschnitt und das Schleifmittel.
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Aus
US-Patentschrift Nr. US-A-5983136 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung
bekannt, womit ein fluides Agens in Körpergewebe eingeführt wird, indem
der Transport des fluiden Agens' in
die Dermis des Patienten bewirkt wird. Die Außenseite der Haut des Patienten
wird derart gegen eine Mehrzahl von Mikropenetratoren gezogen, dass
in der Epidermis Mikrofissuren entstehen und Fluid eingeführt werden kann,
das in die Dermis diffundiert oder in die Dermis eingesaugt wird.
Das Einsaugen erzeugt einen Druckgradienten in der Dermis, der zu
einer Fluidaufnahme durch das Dermalgewebe führt. Die Mikropenetratoren
werden so hergestellt, dass man eine Gruppierung von Vorsprüngen in
die Oberfläche
eines dünnen
Bleches stanzt, wodurch scharfe Kanten entstehen, die in die Epidermis
eindringen.
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Der
Stand der Technik kennt eine Vielzahl von Vorrichtungen zum Zerreißen des
stratum corneum, um dem Körper
Substanzen zuzuführen.
Ein Durchbruch durch das stratum corneum kann beispielsweise durch
einen Einstich geschehen, wie das US- Patent 5,679,647 an Carson und Mitarbeiter lehrt.
Dieses Patent lehrt, dass Zinken von geringem Durchmesser wie beispielsweise
jene, die man auf Vorrichtungen für Tuberkulinhauttests und Allergietests
findet, mit Polynukleotiden beschichtet und zum Verabreichen solchen
Materials in die Haut verwendet werden können. Bei dem Verfahren, bei
dem solche Vorrichtungen verwendet werden, wird die Haut mit den
Zinken eingestochen, was zu einer intrakutanen Injektion der aufgetragenen
Substanz führt.
Anders bei der vorliegenden Erfindung, wo unerwartet entdeckt wurde,
dass Substanzen, die auf die Oberfläche von Mikrovorsprüngen mit
geringem Durchmesser aufgetragen wurden, durch laterale Abrasion der
Hautoberfläche
wirksamer verabreicht werden, als es mit einem Einstich möglich ist.
US-Patentschrift 5,003,987; US-Patentschrift
5,879,326 und US-Patentschrift 3,964,482 lehren das Aufbrechen des
stratum corneum durch Abrasion, doch es ist wenig darüber bekannt,
wie man topische Applizierungsverfahren so optimiert, dass auf diesem
Weg eine effiziente und wirksame Abgabe erzielt wird. Eine solche
Optimierung ist besonders für
die topische Nukleinsäureverabreichung
interessant, insbesondere die topische Verabreichung von Impfstoffen und
Gentherapien auf Nukleinsäurebasis.
Das diesbezüglich
am häufigsten
vorgeschlagene Verfahren für
die topische Verabreichung ist das Abschleifen der Haut vor der
Impfstoffgabe. Jedoch wurde nun unerwartet festgestellt, dass die
Abgabe von Nukleinsäuren
und Peptiden oder Polypeptiden wie beispielsweise Allergenen wirksamer
und effizienter ist, wenn die Substanz gleichzeitig mit der Abrasion
verabreicht wird.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung für die topische Verabreichung
von Substanzen, insbesondere Nukleinsäuren, Aminosäuren, Aminosäurederivaten,
Peptiden oder Polypeptiden, zur Verfügung. Es wurde entdeckt, dass
Nukleinsäuren
eine verbesserte Gen-Expression aufweisen und eine verbesserte Immunreaktion
auf das exprimierte Protein zeigen, wenn sie bei gleichzeitiger
Abrasion des stratum corneum verabreicht werden. In ähnlicher
Weise erbringen Allergene, die bei gleichzeitiger Abrasion verabreicht
werden, eine kräftigere
Immunreaktion als herkömmliche
Allergentestverfahren.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 veranschaulicht
Grade der Gen-Expression, die mit den verschiedenen Nukleinsäureverabreichungsprotokollen,
die in Beispiel 1 getestet wurden, erreicht wurden.
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2 veranschaulicht
Grade der Gen-Expression, die durch Ändern der Anzahl der Abrasionen
gemäß Beschreibung
in Beispiel 2 erreicht wurden.
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3 veranschaulicht
Grade der Gen-Expression, die durch Ändern der Formulierung der
Nukleinsäure
und der Verabreichungsprotokolls gemäß Beschreibung in Beispiel
3 erreicht wurden.
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4 veranschaulicht
die Antikörperreaktion nach
der topischen Verabreichung von Plasmid-DNS gemäß Beschreibung in Beispiel
4.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Begriff "Abrasion" meint im Sinne der
Erfindung die Zerreißung
der äußeren Hautschichten, beispielsweise
durch Schaben oder Reiben, was zu einer Fläche mit zerrissenem stratum
corneum führt. Im
Gegensatz dazu führt
das "Einstechen" zu diskreten Löchern durch
das stratum corneum mit Flächen aus
nicht-zerrissenem stratum corneum zwischen den Löchern. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
werden Substanzen wie beispielsweise Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis
und Peptide oder Polypeptide bei gleichzeitiger Abrasion auf die
Haut aufgetragen, anstatt auf zuvor abgeschliffene Haut aufgetragen
zu werden. Das heißt,
die Substanz wird in die Haut eingeschliffen, anstatt passiv auf
die Haut aufgetragen zu werden, die zuvor abgeschliffen wurde. Die
Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
führt im
Vergleich zur post-abrasiven Applikation zu einer verbesserten Abgabe
und Reaktion.
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Die
Substanz kann in einer pharmazeutisch akzeptablen Form in die Haut
verabreicht werden, wobei aber eine Flüssigkeits- oder Gel-Formulierung bevorzugt ist.
Die Substanz kann auf die Haut aufgetragen werden, woraufhin eine
Abschleifvorrichtung über
die Haut und die Substanz hin und her bewegt oder gerieben wird.
Vorzugsweise wird mindestens so viel abgeschliffen, wie nötig ist,
um das gewünschte
Ergebnis zu erreichen. Der Durchschnittsfachmann weiß, wie er
das richtige Maß an
Abrasion für eine
gewählte
Substanz ermittelt. Die Substanz kann vor der Verabreichung auch
in Trockenform auf die abrasive Oberfläche der Verabreichungsvorrichtung aufgetragen
werden. Die rekonstituierende Flüssigkeit
ist in der Abrasionsvorrichtung enthalten und wird freigegeben,
um die Substanz aufzulösen,
während die
Vorrichtung zum Abschleifen auf die Haut appliziert wird. Es wurde
festgestellt, dass Nukleinsäurepräparate auch
in Form eines Gels auf die Abrasionsvorrichtung aufgebracht werden
können,
obgleich die Verbesserung der Gen-Expression nicht so erheblich ist
wie bei einigen anderen Ausführungsformen
der Erfindung.
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Zu
der Vorrichtung zum Verabreichen einer Substanz in die Haut gemäß der Erfindung
zählen beispielsweise
mikroelektromechanische (MEMS) Vorrichtungen mit Anordnungen aus
kurzen Mikronadeln oder Mikrovorsprüngen, sandpapierartige Vorrichtungen,
Schaber und dergleichen. Ein Reservoir bildet einen integralen Bestandteil
der Abrasionsvorrichtung und steht in strömungsmäßiger Verbindung mit der abrasiven
Oberfläche
der Vorrichtung, beispielsweise über
Kanäle,
die durch die Nadeln oder Vorsprünge
hindurch verlaufen, oder über
Kanäle, die
zwischen solchen Nadeln oder Vorsprüngen aus dem Reservoir austreten,
oder über
poröse
Materialien. Die rekonstituierende Flüssigkeit befindet sich in dem
Reservoir der Abrasionsvorrichtung und wird vor der Abrasion oder
zeitgleich mit der Abrasion auf die Hautoberfläche abgegeben. Die Abrasionsvorrichtung
kann des Weiteren Mittel zum Steuern der Abgaberate der rekonstituierenden
Flüssigkeit
oder zum Steuern der Menge der abgegebenen rekonstituierenden Flüssigkeit
enthalten.
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Bei
den Nukleinsäuren,
die in Verbindung mit der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden können, kann
es sich um RNS oder DNS handeln. Sie können in jeder physischen Form
vorliegen, die sich für
die topische Verabreichung und für
die Aufnahme und Expression durch Zellen eignet. Sie können in
einem viralen Vektor oder Liposom enthalten sein, oder sie können als
freies Polynukleotid, wie beispielsweise ein Plasmid, abgegeben
werden, was einschlägig
bekannt ist. Die Nukleinsäure
wird normalerweise in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung
formuliert, wie beispielsweise ein Fluid oder ein Gel, das mit der
Nukleinsäure
verträglich
ist. Pharmazeutisch akzeptable Peptid- und Polypeptidformulierungen
zur Verwendung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, einschließlich Formulierungen für Allergenzusammensetzungen,
sind ebenfalls einschlägig
bekannt.
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Es
wurde festgestellt, dass eine minimale Abrasion (nur ein einziger
Strich über
die Haut) genügt,
um eine verbesserte Nukleinsäureabgabe
an die Hautzellen zu erreichen. Die Menge der Nukleinsäureabgabe
und -expression steigt mit einer zunehmenden Anzahl der abrasiven
Striche über
die Haut weiter an. Sechs abrasive Striche oder mehr ergaben die
maximale Verbesserung der Nukleinsäureabgabe in unseren Versuchssystemen.
Obgleich alle abrasiven Striche über
die Haut in ein und derselben Richtung erfolgen können, wird
die Richtung während
der Abrasion vorzugsweise geändert.
Das heute am häufigsten
verwendete Protokoll für
die Verabreichung von Nukleinsäureimpfstoffen
ist die IM-Injektion, in der Regel mut zusätzlichen Reaktionsverstärkern, wenn
die Dosis gering ist. Die Art und Weise der Bestimmung der richtigen
Dosis des Nukleinsäureimpfstoffs,
die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zu verabreichen ist, gehört
zum Wissensstand des Durchschnittsfachmanns. Es gehört aber
zu den Vorteilen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, dass die Verabreichung
von Nukleinsäureimpfstoffen
sogar ohne Reaktionsverstärker
effizienter ist als die IM-Verabreichung, was durch die Grade an
Gen-Expression und Stimulation einer Immunreaktion bewiesen wird.
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Aminosäuren, Aminosäurederivate,
Peptide und Polypeptide, insbesondere Allergene, können ebenfalls
mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
topisch verabreicht werden. Allergene werden herkömmlicherweise
durch intrakutanen Einstich in die Haut mittels Vorrichtungen verabreicht,
die denen des Tuberkulin-Zinkeneinstichtests ähneln. Es wurde jedoch unerwarteterweise
festgestellt, dass durch gleichzeitige Abrasion und Verabreichung
eine stärkere
allergenische Reaktion erhalten werden kann. Dies sorgt für einen
sensibleren Test und hat den Vorteil, dass eine geringfügige oder
nicht wahrnehmbare Reaktion auf den herkömmlichen Allergentest mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
einfacher erkannt werden kann.
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BEISPIEL 1
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VERABREICHUNG
VON PLASMID-DNS MIT EINER MASSIVEN MIKRONADEL-ANORDNUNG
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Anästhesierten
BALB/c-Mäusen
wurde mittels IM-Injektion oder ID-Injektion mit einer standardmäßigen 30
g-Nadel und einer 1 cm3-Spritze oder topisch
mit einer 200 μm-Silicium-Mikronadel-Anordnung
Leuchtkäfer-Luciferase
kodierende Plasmid-DNS (35 μg)
verabreicht. Für
die DNS-Verabreichung mit der Mikronadel-Anordnung wurden zwei Protokolle
verwendet.
- 1) Gleichzeitige Abrasion und Verabreichung (ABRverab):
Mäuse wurden
am kaudalen Dorsum mit einer elektrischen Schermaschine geschoren und
anschließend
mit einer Skalpellklinge Nr. 10 von verbliebenem Fell befreit. Nun
wurde die DNS-Lösung
auf eine 1 cm2 große Fläche auf der Haut aufgetragen,
und die Mikronadel-Anordnung wurde mit dieser Lösung in Kontakt gebracht, aufgesetzt
und sechsmal seitlich in wechselnder Richtung über die Hautoberfläche bewegt
(dreimal Striche in jeder Richtung). Die DNS-Lösung wurde an der Luft trocknen
gelassen, und die Hautfläche
blieb unbedeckt, bis Hautbiopsien genommen wurden.
- 2) Präabrasion
(präABR):
Nach dem Scheren, wie oben beschrieben, wurde eine 1 cm2 große Hautfläche durch
seitliches Bewegen der Mikroanordnung über die Haut, und zwar sechsmal
in wechselnder Richtung (dreimal Striche in jeder Richtung), vor-geschliffen.
Nun wurde die DNS-Lösung über die
abgeschliffene Hautoberfläche
verteilt und wie oben an der Luft trocknen gelassen.
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Als
Kontrolle für
eine mögliche
DNS-Abgabe durch Haarfollikel oder Ritzungen, die durch das Scheren
entstanden waren, wurden Tiere wie oben geschoren, aber wurden nicht
mit der Mikroanordnung abgeschliffen (keineABR). Die DNS-Lösung wurde
topisch auf die 1 cm2 große Hautstelle
aufgetragen und an der Luft trocknen gelassen.
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In
allen Gruppen wurden 24 Stunden nach der DNS-Verabreichung Gewebeproben
entnommen. Gewebehomogenate wurden mittels eines Lumineszenz-Tests
auf Luciferase-Aktivität
analysiert. Alle Proben wurden auf Gesamtproteingehalt gemäß Bestimmung
durch einen standardmäßigen BCA-Proteintest
normalisiert. Die Daten wurden als Relative Lichteinheiten (RLE)
je mg Gesamtprotein ausgedrückt,
und die Ergebnisse sind in 1 zu sehen.
Jedes Symbol stellt die Reaktion einer einzelnen Maus dar. Es werden
die kumulativen Daten aus zwei separaten Versuchen dargestellt (n
= 6 für
jede Gruppe). Die erreichten Grade an Luciferase-Gen-Expression
nach ABRverab waren in der Größenordnung ähnlich denen
der IM- und ID-Nadelinjektionen und deutlich größer (p = 0,02) als bei topischer
Verabreichung auf vor-geschliffene oder ungeschliffene Haut.
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BEISPIEL 2
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KORRELATION
DER ABGABE MIT DER ANZAHL DER ABRASIVEN STRICHE
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Es
wurde Luciferase-Plasmid-DNS (35 μg) durch
ABRverab wie in Beispiel 1 beschrieben verabreicht, doch die Anzahl
der seitlichen Striche der Vorrichtung über die Hautoberfläche wurde
geändert (12-mal,
10-mal, 6-mal, 4-mal und 2-mal). Zusätzlich zum Aufbringen der DNS-Lösung auf
die Oberfläche geschorener,
aber ungeschliffener Haut wurde die Mikronadel-Anordnung wiederholt (sechsmal) gegen die
Haut gedrückt,
um eine Einstich-vermittelte Verabreichung zu simulieren. Die topische
Verabreichung der DNS-Lösung
ohne Abrasion (keineABR) wurde als Kontrolle für eine mögliche DNS-Abgabe durch Haarfollikel
oder Ritzungen aufgenommen. 24 Stunden nach dem Auftragen wurden
Hautbiopsien (1 cm2) genommen und wie in
Beispiel 1 auf Luciferase-Aktivität getestet.
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Die
Ergebnisse sind in 2 veranschaulicht. Jedes Symbol
stellt die Reaktion einer einzelnen Maus dar, und n = 3 für alle Gruppen,
außer "12-mal" und "6-mal", wo n = 5. Mit zunehmender
Anzahl der Striche der Mikronadel-Anordnung über die Hautoberfläche wurden
zunehmende Grade an Gen-Expression erreicht. Die mittleren Expressionsgrade
reichten von mehr als 1.000- bis 2.800-fach über den keineABR-Kontrollen
in Gruppen, die mit sechs oder mehr Abrasionen behandelt wurden.
Die mittleren Reaktionen nach vier, zwei oder einem Strich der Vorrichtung über die
Hautoberfläche
waren etwa, 300-, 200- bzw. 30-fach über dem Hintergrund. Die mittleren
Expressionsgrade in der "Einstich"-Gruppe waren nur
2-fach über
dem Hintergrund und unterschieden sich nicht wesentlich von den
keineABR-Kontrollen.
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Diese
Daten belegen, dass der Abrasionsprozess eine kritische Komponente
der topischen Verabreichung von DNS in die Haut ist. Durch Erhöhen der
Anzahl der abrasiven Striche der Abrasionsvorrichtung wurden höhere Gen-Expressionsgrade erreicht,
obgleich eine Gen-Expression auch schon nach einem einzigen Strich
festgestellt wurde. Des Weiteren steigerte laterales Reiben oder
Abschleifen der Haut deutlich die Nukleinsäureabgabe und die Gen-Expression
im Vergleich zu wiederholtem Drücken
der Mikronadel-Anordnung gegen die Haut ohne laterale Abrasion.
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BEISPIEL 3
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FORMULIERUNG
VON NUKLEINSÄUREIMPFSTOFFEN
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Es
wurde Luciferase-Plasmid (35 μg)
als eine flüssige
Formulierung durch ID-Injektion oder durch gleichzeitige Abrasion
und Verabreichung ("ABRverab
flüssig") mit sechs Strichen
der Mikronadel-Vorrichtung über
die Hautoberfläche,
wie in Beispiel 1 beschrieben, verabreicht. Des Weiteren wurde die
DNS zu einem Pulver lyophilisiert und auf die Oberfläche der
Mikronadel-Anordnung aufgetragen und durch gleichzeitige Abrasion
und Verabreichung entweder direkt als Pulver ("ABRverab Pulver") oder bei Rekonstitution in PBS-Puffer zum Zeitpunkt
der Applikation ("ABRverab
Pulver/Rekon") verabreicht. Die
Rekonstitution erfolgte dadurch, dass das pulverbeschichtete Array
in direkten Kontakt mit einem Tropfen PBS auf der Hautoberfläche gebracht
wurde, woraufhin gleichzeitig abgeschliffen und verabreicht wurde.
Mikronadel-Anordnungen wurden ebenfalls mit DNS beschichtet, die
in 0,5%-igem Agarose-Gel aufgelöst
und durch gleichzeitige Abrasion und Verabreichung, wie oben beschrieben,
verabreicht wurde ("ABRverab
Gel"). Topische
Applikation der flüssigen
Formulierung ohne Abrasion (keineABR) wurde als Kontrolle aufgenommen.
24 Stunden nach dem Auftragen wurden Hautbiopsien (1 cm2)
genommen und wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert.
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Die
Ergebnisse sind in 3 zu sehen. Jedes Symbol stellt
die Reaktion einer einzelnen Maus dar. Es werden die kumulativen
Daten von zwei separaten Versuchen gezeigt, wobei n = 6 für jede Gruppe.
Für die
Gruppen "ID-Injektion", "ABRverab flüssig" und "ABRverab Pulver/Rekon" wurden ähnliche Luciferase-Expressionsgrade
in der Haut festgestellt (etwa 20- bis 30-fach über keineABR). Obgleich weder
die direkte Verabreichung von Gel- noch pulverbeschichteter DNS
ohne Rekonstitution zu einer Gen-Expression führte, die statistisch über der
keineABR-Kontrolle lag, waren die Reaktionen nach der direkten Verabreichung
auf Gel-Basis etwa 2- bis 10-fach höher als die mittlere Kontroll-Reaktion.
Diese Ergebnisse belegen, dass die Rekonstitution einer Trockenform
des Impfstoffs zum Zeitpunkt der gleichzeitigen Abrasion und Verabreichung
zu Ergebnissen führt,
die mit der gleichzeitigen Abrasion und Verabreichung einer flüssigen Impfstoffformulierung
vergleichbar sind. Dies hat Vorteile für die kommerzielle Anwendung
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
da eine Abrasionsvorrichtung mit einem flüssigkeitsbefüllten Reservoir
mit dem Impfstoffpulver zur Rekonstitution des Impfstoffs, während er
durch Abrasion verabreicht wird, vor-beschichtet werden könnte.
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BEISPIEL 4
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ANTIKÖRPERREAKTION AUF DIE TOPISCHE VERABREICHUNG
VON PLASMID-DNS
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Anästhesierten
BALB/c-Mäusen
wurde mittels IM- oder ID-Injektion
mit einer standardmäßigen 30
g-Nadel und einer 1 cm3-Spritze oder topisch
mit einer massiven 200 μm-Silicium-Mikronadel-Anordnung
gemäß dem ABRverab-Protokoll
von Beispiel 1 das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HbsAG) kodierende
Plasmid-DNS verabreicht. Die Mäuse
erhielten insgesamt drei Immunisierungen von 100 μg je Dosis.
Zwei bis drei Wochen nach jeder Immunisierung wurden Serumproben
mittels ELISA auf HbsAG-Antikörper
(Gesamt-Ig) analysiert. Als Kontrolle für eine mögliche Abgabe durch Ritzungen
oder Haarfollikel wurde DNS topisch auf geschorene, aber ungeschliffene
(keineABR) Haut verabreicht. Die Daten stellen einen anti-HbsAg-Titer
dar, der definiert ist als die höchste
Verdünnung
einer Serumprobe mit Extinktionswerten mindestens dreimal über dem
Hintergrund (Serum von nativen, nichtimmunisierten Mäusen).
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Es
wurden insgesamt zehn Mäuse
je Gruppe analysiert. Die mittleren Titer sind in 4 als
Säulen dargestellt,
wobei die Reaktionen der einzelnen Mäuse als offene Symbole angezeigt
sind. Die Ergebnisse machen deutlich, dass das ABRverab-Protokoll starke
Serumantikörper-Reaktionen
in vivo erzeugen. Die Größenordnung
solcher Reaktionen war nach den Immunisierungen 2 und 3 deutlich
größer p < 0,05 als jene,
die entweder über
IM-Injektionen (der derzeitige Standard für die Verabreichung vom Impfstoffen
auf DNS-Basis) oder ID-Injektionen
hervorgerufen wurden. Des Weiteren waren die Reaktionen nach ABRverab
deutlich weniger variabel als jene, die auf beiden standardmäßigen Injektionswegen
auf Nadelbasis beobachtet wurden. Die mittleren Titer nach drei
Immunisierungen betrugen 12.160 für die ABRverab-Gruppe, im Vergleich
zu 820 nach IM-Injektion und 4.800 über ID-Injektion. Es ist festzustellen, dass
das ABRverab-Konzept der effektivste Verabreichungsweg nach zwei
Immunisierungen war. 100% (10 von 10) der per ABRverab behandelten Tiere
zeigten nach zwei Immunisierungen Serokonversion, im Vergleich zu
40% (4 von 10) per IM-Injektion und 50% (5 von 10) per ID-Injektion.
Keines der Tiere, die Plasmid-DNS topisch ohne Abrasion verabreicht
bekommen hatten, entwickelte eine erkennbare Antikörper-Reaktion.
Eine weitere Charakterisierung der Antikörper-Isotypen offenbarte, dass ABRverab
eine ähnliche
gemischte Reaktion hervorruft wie standardmäßige IM- und ID-Injektionen
auf Nadelbasis, die sowohl aus IgGl als auch IgG2a besteht. Diese
Ergebnisse unterscheiden sich von zuvor beschriebenen intradermalen
Impfungen mit der Gen-Kanone, wo die Antikörper-Reaktionen ausschließlich aus
IgGl ohne IgG2a bestanden (siehe beispielsweise McCluskie, M. J.
und Mitarbeiter, Molecular Medicine 5:287, 1999).
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BEISPIEL 5
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TOPISCHE VERABREICHUNG
VON ALLERGENEN
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Anästhesierten
Schweinen wurde Histamin-Dihydrochlorid (2,5 mg) mit einer massiven
200 μm-Silicium-Mikronadel-Anordnung
durch gleichzeitige Abrasion und Verabreichung auf die Haut, wie
in Beispiel 1 beschrieben, verabreicht (ABRverab; 4 Striche mit
der Vorrichtung über
die Hautoberfläche). Das
Histamin war entweder als Flüssigkeit
oder als lyophilisiertes Pulver formuliert, das auf die Oberfläche des
Mikroarray aufbeschichtet und zum Zeitpunkt der Applikation direkt
auf der Haut in Wasser rekonstituiert wurde. Zum Vergleich wurde
ein Tropfen Histaminlösung
auf die Hautoberfläche
aufgetragen, woraufhin sofort eine zinkenartige Vorrichtung mit
dieser Lösung
in Kontakt gebracht und zum Einstecken in die Haut benutzt wurde.
Diese zinkenartige Vorrichtung bestand aus sieben metallischen,
34 g wiegenden Nadeln von 1 mm Länge, ähnlich den handelsüblichen
Vorrichtungen, die bei Allergentests verwendet werden. Benachbarte
Hautbereiche wurden mit dem Mikroarray oder der zinkenartigen Einstichvorrichtung
ohne Histamin behandelt, um die Hautreaktionen infolge der Vorrichtungen
und nicht die Auswirkungen des Histamins zu beobachten. Als zusätzliche
Kontrollen dienten Hautstellen, die topisch mit Histamin ohne Abrasion
oder Einstiche behandelt wurden. Die Hautstellen wurden auf unmittelbare
Entzündungsreaktionen
beobachtet, beispielsweise Rötung,
Anschwellen und das Auftreten von Quaddeln und erythematösen Reaktionen.
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Es
wurden lebhafte Entzündungsreaktionen an
Hautstellen beobachtet, die über
die massive Mikronadel-Anordnung mit Histamin behandelt wurden. Es
wurden Erythema und Schwellungen (bis zu 2 mm erhöhtes Gewebe) über den
gesamten Bereich der mit Histamin behandelten Haut hinweg beobachtet, während Hautstellen,
die mit der Vorrichtung ohne Histamin behandelt wurden, nur eine
leichte Rötung entlang
des Abrasionspfades – gänzlich ohne Schwellungen – aufwiesen. Ähnlich intensive
Reaktionen wurden sowohl mit flüssigen
als auch mit rekonstituierten Pulver-Histaminformulierungen beobachtet.
Hautstellen, die mit der Histaminlösung unter Verwendung der zinkenartigen
Einstichvorrichtung behandelt wurden, wiesen ebenfalls schwere Erythema und
Schwellungen auf, obgleich die Reaktion lokal auf die Kontaktpunkte
der Zinken und die unmittelbare Umgebung beschränkt war. Hautstellen, die topisch
mit Histaminlösung
ohne Abrasion oder Einstich behandelt wurden, waren nicht entzündet und waren
optisch von normaler, unbehandelter Haut nicht zu unterscheiden.
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Histamin-Dihydrochlorid
wird vom Fachmann als ein Modellsystem zur Bewertung von Peptide-
und Polypeptid-Allergenen verwendet. Diese Ergebnisse besagen, dass
das beschriebene Protokoll der gleichzeitigen Abrasion und Verabreichung
effektiv für
die topische Verabreichung von Allergenen, bei denen es sich um
Aminosäuren
oder Aminosäurederivate
handelt, verwendet werden kann, und sagen ähnliche Ergebnisse für die Verabreichung
von Peptide- oder Polypeptid-Allergenen voraus. Zu den Vorteilen
der Allergenverabreichung durch Mikroabrasion im Vergleich zum Hauteinstich
gehört
beispielsweise die Verteilung der Substanz auf einen breiteren Hautoberflächenbereich,
wodurch die reaktogene Stelle im Vergleich zur lokalisierten Verteilung,
die mittels Einstich mit zinkenartigen Vorrichtungen erreicht wird, vergrößert wird.
Der vergrößerte Verteilungsbereich
in Verbindung mit einer besseren Zielausrichtung auf das hoch immun-stimulatorische epidermale
Gewebe kann die Sensibilität
von Allergentests im Vergleich zu den derzeitigen Hauteinstich-Testverfahren
mittels Zinken steigern. Außerdem
ist die Verabreichung mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung aller Wahrscheinlichkeit
nach weniger invasiv und sicherer als derzeitige Testverfahren,
weil das flachere epidermale Gewebe oberhalb der Kapillarbetten
und des peripheren Nervennetzes das Ziel ist.