DE60107468T2

DE60107468T2 - Nucleinsäure-isolation

Info

Publication number: DE60107468T2
Application number: DE60107468T
Authority: DE
Inventors: John Matthew BAKER
Original assignee: DNA Research Innovations Ltd
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2021-12-15
Also published as: US20070231892A1; DE60107468D1; US20130338245A1; DK1345952T3; US6914137B2; WO2002048164A2; CA2432075A1; US20010018513A1; ATE283275T1; AU2002216203A1; WO2002048164A3; ES2233560T3; EP1345952A2; EP1473299A3; US20120196944A1; US20120197009A1; EP1345952B1; JP4868697B2; JP2004521881A; EP1473299A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus Proben und bei der Durchführung dieser Verfahren nützliche Produkte, insbesondere zur Extraktion von Nucleinsäure aus biologischen Proben, wie z.B. Blut.
Hintergrund der Erfindung
Es besteht ein großer Bedarf an DNA-Analysen für eine Auswahl an Verwendungszwecken, und dies hat zu einem Bedarf an schnellen, sicheren Hochdurchsatz-Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DNA und anderen Nucleinsäuren geführt.
Proben für die Verwendung zur DNA-Identifizierung oder Analyse können aus einer großen Auswahl an Quellen, wie z.B. biologischem Material, entnommen werden, wie z.B. aus Tier- und Pflanzenzellen, Fäkalien, Gewebe usw. Außerdem können Proben aus Bodenmaterial, Lebensmitteln, Wasser usw. entnommen werden.
Bestehende Verfahren zur DNA-Extraktion umfassen die Verwendung von Phenol/Chloroform, Aussalzen, die Verwendung von chaotropen Salzen und Silicaharzen, die Verwendung von Ionenaustauschchromatographie und die Verwendung magnetischer Kügelchen. Verfahren werden in den US-Patenten Nr. 5.057.426, 4.923978, EP-Patenten Nr. 512.767 A1 und EP-515.484B und WO 95/13368, WO 97/10331 und WO 96/18731 beschrieben. Diese Patente und Patentanmeldungen offenbaren Verfahren der Adsorption von Nucleinsäuren an einen festen Träger und die anschließende Isolierung der Nucleinsäuren. Die früher verwendeten Verfahren verwenden irgendeine Art von Lösungsmittel, um die Nucleinsäuren zu isolieren, und diese Lösungsmittel sind häufig entflammbar, brennbar oder toxisch.
Die EP 0.707.077A2 beschreibt ein synthetisches, wasserlösliches Polymer, um Nucleinsäuren bei saurem pH zu präzipitieren und bei alkalischem pH freizusetzen.
Die Wiederauflösung der Nucleinsäuren wird bei Extremwerten von pH, Temperatur und/oder hohen Salzkonzentrationen durchgeführt, wo die Nucleinsäuren, insbesondere RNA, denaturiert, abgebaut werden können oder eine weitere Reinigung oder weitere Einstellungen vor der Lagerung und Analyse erfordern.
WO 96/09116 offenbart Mischharze zur Gewinnung einer Zielverbindung, insbesondere eines Proteins, aus wässriger Lösung bei hoher oder niedriger Ionenstärke unter Verwendung von pH-Änderungen. Die Harze haben beim pH der Bindung der Zielverbindung einen hydrophoben Charakter und einen hydrophilen und/oder elektrostatischen Charakter beim pH der Desorption der Zielverbindung.
Blut ist eine der häufigsten Probenquellen für die DNA-Analyse, da Blutproben routinemäßig aus zahlreichen Gründen entnommen werden. Die Automatisierung erwies sich jedoch wegen der viskosen und proteinartigen Natur von Blut unter Verwendung bekannter DNA-Extraktionsverfahren als schwierig zu erzielen, und zwar aufgrund der Schwierigkeiten der Handhabung großer Volumina, die relativ kleine DNA-Mengen enthalten. Bisher konnte die Nucleinsäureextraktion nur durch Verwendung gefährlicher Chemikalien und langsamer Verarbeitungszeiten teilweise automatisiert werden.
WO 99/29703 offenbart die Verwendung von Ladungswechselmaterialien zur Nucleinsäurereinigung, wobei die Nucleinsäure in einer Probe an einen festen Träger bei niedrigem pH (z.B. pH 6) gebunden und die Nucleinsäure bei einem höheren pH (z.B. pH 8) freigesetzt wird. Die Anmeldung zeigt beispielhaft die Verwendung von Festphasen, die Histidin- oder Polyhistidin-Gruppen inkorporieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein gesprochen neue Materialien und Bedingungen zur Extraktion oder Reinigung von Nucleinsäure, welche die anfängliche, in WO 99/29703 offenbarte, Arbeit fortsetzen und verbessern.
Der Erfinder hat nunmehr ein verbessertes Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und anderen Biomolekülen aus Blut und anderen biologischen Materialien und anderen Nucleinsäure enthaltenden Proben entwickelt.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus biologischem Material bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kontaktieren des biologischen Materials mit einer Festphase, die fähig ist, die Biomoleküle bei einem ersten pH an sich zu binden, und das anschließende Extrahieren der an die Festphase gebundenen Biomoleküle durch Elution unter Verwendung eines Elutionslösungsmittels bei einem zweiten pH umfasst.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäure aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe wie in den Ansprüchen dargelegt bereitgestellt.
Im Allgemeinen besitzt die Festphase eine positive Gesamtladung, d.h. dass die Summe aller positiven und negativen Ladungen an der Festphase als Ganzes positiv ist. Es ist jedoch möglich (obgleich nicht bevorzugt), dass die Festphase als Ganzes negativ geladen ist, jedoch Bereiche vorwiegend positiver Ladung aufweist, an welche die Nucleinsäure binden kann. Derartige Festphasen liegen im Schutzumfang der Erfindung.
Die Änderung der Ladung der Festphase wird hierin als „Ladungswechsel" bezeichnet und wird durch die Verwendung eines „Ladungswechselmaterials" in der oder als Festphase erzielt.
Das Ladungswechselmaterial umfasst eine ionisierbare Gruppe, welche die Ladung gemäß den Umgebungsbedingungen ändert. Das Ladungswechselmaterial wird so gewählt, dass der pKa der ionisierbaren Gruppe für die Bedingungen geeignet ist, unter denen die Bindung der Nucleinsäure an die Festphase und die Freisetzung der Nucleinsäure von der Festphase erwünscht ist. Im Allgemeinen wird die Nucleinsäure bei einem pH an das Ladungswechselmaterial gebunden, der unter dem pKa liegt oder annähernd dem pKa entspricht, wenn das Ladungswechselmaterial positiv geladen ist, und wird bei einem höheren pH (üblicherweise über dem pKa) freigesetzt, wenn das Ladungswechselmaterial schwächer positiv geladen, neutral oder negativ geladen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft im Spezielleren die Verwendung von Ladungswechselmaterialien, welche das Auftreten der Bindung und/oder Freisetzung (insbesondere Freisetzung) der Nucleinsäure unter schonenden Bedingungen von Temperatur und/oder pH und/oder Ionenstärke ermöglichen.
Im Allgemeinen wird das Ladungswechselmaterial die Ladung aufgrund einer Änderung der Ladung an einer positiv ionisierbaren Gruppe von positiv zu schwächer positiv oder neutral ändern, wenn der pH in einem Bereich erhöht wird; der den pKa der positiv ionisierbaren Gruppe umspannt oder dem pKa nahe kommt. Dies kann außerdem mit einer Änderung der Ladung einer negativ ionisierbaren Gruppe von neutral oder schwächer negativ zu negativ kombiniert werden.
Für positiv ionisierbare Gruppen beträgt der pKa vorzugsweise zumindest ungefähr 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 oder 6,5 und/oder höchstens ungefähr 8,5, 8,0, 7,5 oder 7,0. Ein insbesondere bevorzugter pKa für eine positiv geladene ionisierbare Gruppe liegt zwischen ungefähr 5 und 8; noch bevorzugter ist ein pKa zwischen ungefähr 6,0 und 7,0, bevorzugter zwischen ungefähr 6,5 und 7,0. Der pKa für eine negativ ionisierbare Gruppe liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 3 und 7, noch bevorzugter zwischen ungefähr 4 und 6, und entspricht weiters vorzugsweise ungefähr dem pH, bei dem die Bindung der Nucleinsäure erwünscht ist.
Materialien, die mehr als einen pKa-Wert aufweisen (die z.B. verschiedene ionisierbare Gruppen aufweisen), oder Kombinationen von Materialien, die verschiedene pKa-Werte aufweisen, können ebenfalls zur Verwendung als Ladungswechselmaterialien gemäß der Erfindung unter der Voraussetzung geeignet sein, dass das/die Materialien) bei einem ersten (niedrigeren) pH eine positive Ladung aufweist/auf weisen und dass die Ladung bei einem höheren pH schwächer positiv, neutral oder negativ ist.
Im Allgemeinen wird ein Ladungswechsel durch Ändern des pH von einem Wert unter dem pKa zu einem Wert über dem pKa der oder einer ionisierbaren Gruppe erzielt. Jedoch versteht sich, dass, wenn der pH derselbe wie der pKa-Wert einer bestimmten ionisierbaren Gruppe ist, 50 % der einzelnen ionisierbaren Gruppe geladen und 50 % neutral sein werden. Daher können Ladungswechselwirkungen auch durch Ändern des pH in einem Bereich erzielt werden, der nahe dem pKa einer ionisierbaren Gruppe liegt, diesen aber nicht umspannt. Beispielsweise werden beim pKa einer negativ ionisierbaren Gruppe, wie z.B. einer Carboxylgruppe (pKa typischerweise um 4), 50 % derartiger Gruppen in der ionisierten Form (z.B. COO^–) und 50 % in der neutralen Form (z.B. COOH) vorliegen. So wie sich der pH erhöht, wird sich ein ansteigender Anteil der Gruppen in der negativen Form befinden.
Vorzugsweise wird der Bindungsschritt bei einem pH unter dem pKa der ionisierbaren Gruppe oder (obgleich dies nicht bevorzugt ist) innerhalb ungefähr 1 pH-Einheit über dem pKa durchgeführt. Im Allgemeinen wird der Freisetzungsschritt bei einem pH über dem pKa der ionisierbaren Gruppe, vorzugsweise bei einem pH zwischen ungefähr 1 bis 3 pH-Einheiten über dem pKa, durchgeführt.
Verfahren nach dem Stand der Technik, wie z.B. die in EP 707.077 offenbarten, verwenden häufig einen hohen pH zur Freisetzung der Nucleinsäure, beispielsweise unter Verwendung starker Basen, wie z.B. NaOH. Ein derartig hoher pH kann die Depurinierung von Nucleinsäuren verursachen, was zu den Problemen der mangelhaften Replikation führen kann, welche die anschließende Verwendung der Nucleinsäure, z.B. bei Nachweis- und/oder Amplifikationstechniken, wie z.B. Southern- oder Northern-Blotting oder PCR, behindert.
Die Verwendung starker Basen, oder schwacher Basen in Kombination mit Erwärmung, wiederum wie in EP 707.077 , kann außerdem den Abbau von DNA (insbe sondere bei pH-Werten von 10 oder darüber) und die Denaturierung doppelsträngiger DNA bewirken (d.h. eine zumindest partielle, irreversible DNA-Umwandlung von der doppelsträngigen Form zur einzelsträngigen Form), was zu einer mangelhaften spezifischen Bindung bei der PCR führen kann.
Die geeignete Wahl des/von pKa-Werts/en gemäß der Erfindung ermöglicht, dass der Schritt der DNA-Freisetzung von der Festphase im Gegensatz zum Stand der Technik unter schonenden Bedingungen durchgeführt werden kann. Wie hierin verwendet, werden unter dem Ausdruck „schonende Bedingungen" im Allgemeinen Bedingungen verstanden, unter denen Nucleinsäure nicht denaturiert und/oder nicht abgebaut und/oder nicht depuriniert wird, und/oder Bedingungen, die im Wesentlichen physiologisch sind.
Vorzugsweise wird der Freisetzungsschritt bei einem pH von nicht mehr als ungefähr pH 10,5, bevorzugter nicht mehr als ungefähr pH 10,0, 9,8, 9,6, 9,4, 9,2, 9,0, 8,9, 8,8, 8,7, 8,6 oder 8,5 durchgeführt. In Abhängigkeit vom/von den pKa(s) des Ladungswechselmaterials kann der Freisetzungsschritt sogar bei niedrigeren pH-Werten, wie z.B. 8,0, 7,5 oder 7,0, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der Freisetzungsschritt im Wesentlichen in Abwesenheit von NaOH durchgeführt, vorzugsweise außerdem im Wesentlichen in Abwesenheit anderer Alkalimetallhydroxide, bevorzugter im Wesentlichen in Abwesenheit starker Mineralbasen. Im Wesentlichen in Abwesenheit bedeutet, dass die Konzentration weniger als 25 mM, vorzugsweise weniger als 20 mM, bevorzugter weniger als 15 mM oder 10 mM, beträgt.
Die gewünschte pH-Änderung kann durch Verändern der Ionenstärke der Lösung und/oder der Temperatur erzielt werden, da der pH von beiden dieser Faktoren abhängig ist. Jedoch sind weder hohe Temperatur noch hohe Ionenstärke mit den gewünschten schonenden Bedingungen kompatibel, und demgemäß wird die pH-Änderung vorzugsweise nicht durch große Änderungen der Ionenstärke oder Temperatur erzielt. Darüber hinaus erhöht eine Erhöhung der Ionenstärke die Konkurrenz geladener Spezies mit der Nucleinsäure um die Bindung an die Festphase und kann so die Freisetzung der Nucleinsäure fördern. Geringe Änderungen der Ionenstärke sind daher annehmbar und können in Verbindung mit der Änderung des pH verwendet werden, um die Nucleinsäure freizusetzen, vorzugsweise innerhalb der unten angegebenen Grenzwerte und Bereiche.
Vorzugsweise ist die Temperatur, bei der der Freisetzungsschritt durchgeführt wird, nicht höher als ungefähr 70 °C, bevorzugter nicht höher als ungefähr 65 °C, 60 °C, 55 °C, 50 °C, 45 °C oder 40 °C. Bevorzugter gelten derartige Temperaturen für den gesamten Prozess. Der Freisetzungsschritt oder der gesamte Prozess kann sogar bei niedrigeren Temperaturen, wie z.B. 35 °C, 30 °C oder 25 °C, durchgeführt werden.
Darüber hinaus erfolgt der Freisetzungsschritt vorzugsweise unter Bedingungen niedriger Ionenstärke, geeigneterweise bei weniger als 1 M oder 500 mM, vorzugsweise weniger als 400 mM, 300 mM, 200 mM, 100 mM, 75 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM oder 15 mM. Sie kann sogar unter 10 mM liegen. Die Ionenstärke kann zumindest ungefähr 5 mM, vorzugsweise zumindest ungefähr 10 mM, betragen. Bevorzugter gelten diese Ionenstärken auch für den Bindungsschritt.
Die PCR ist auf den pH und die Gegenwart geladener Verunreinigungen empfindlich. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen wird der Freisetzungsschritt unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt, die zur Lagerung der Nucleinsäure geeignet sind (wie z.B. im Handel erhältliche Lagerungspuffer, z.B. 10 mM Tris-HCl, pH 8,0–8,5, gegebenenfalls in Gegenwart von 1 mM EDTA), oder unter Verwendung von Reagenzien, die zur Verwendung in einem Verfahren geeignet sind, dem die Nucleinsäure zu unterziehen ist (wie z.B. ein PCR-Puffer, z.B. 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8,5).
Herkömmliche, früher bekannte Nucleinsäure-Extraktionsverfahren erfordern einen Schritt der Verdünnung des Nucleinsäure enthaltenden Elutionsprodukts, um die Lösung beispielsweise für die PCR geeignet zu machen. Vorzugsweise vermeidet die vorliegende Erfindung im Wesentlichen die Verdünnung der freigesetzten Nucleinsäure.
Vorzugsweise erfolgt der Schritt der DNA-Bindung unter schonenden Bedingungen, geeigneterweise bei einem pH von nicht weniger als 3,0, vorzugsweise nicht weniger als 3,5, 4,0, 4,5 oder 5,0. Frühere Verfahren haben hohe Konzentrationen an chaotropen Mitteln, wie z.B. 8 M Guanidin, verwendet. Derartige Bedingungen sind bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung, bei der der Bindungsschritt vorzugsweise in Lösung mit einer Gesamtkonzentration von 1 M oder weniger erfolgt, möglicherweise nicht notwendig. Bevorzugtere Temperaturen und Ionenstärken sind jene, die oben für den Freisetzungsschritt dargelegt sind.
Die Verwendung derartiger schonender Bedingungen zur Freisetzung von Nucleinsäuren ist insbesondere für die Extraktion kleiner Mengen an Nucleinsäure nützlich, da die extrahierte DNA oder RNA ohne weitere Reinigungsschritte (z.B. Schritte, die durch die Verwendung hoher Ionenkonzentrationen bei Verfahren des Stands der Technik erforderlich sind) und ohne die Notwendigkeit der Verdünnung hoher Ionenstärke (wie es bei Verfahren des Stands der Technik der Fall ist, die eine hohe Ionenstärke zur Elution der Nucleinsäure verwenden) direkt einem Reaktions- oder Lagerungsröhrchen zugegeben werden kann. Daher kann der Verlust an Nucleinsäure durch Wechseln des Behälters, unvollständige Gewinnung während Reinigungsschritten, Abbau oder Denaturierung und Verdünnung kleiner Nucleinsäuremengen vermieden werden. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn eine Nucleinsäure von Interesse in einer Probe in niedriger Kopiezahl vorliegt (oder erwarteterweise vorliegt), wie z.B. bei bestimmten Nachweis- und/oder Amplifikationsverfahren.
Allgemein gesprochen umfassen bevorzugte chemische Spezies zur Verwendung als Ladungswechselmaterialien gemäß der Erfindung ein positiv ionisierbares Stickstoffatom und zumindest eine, jedoch vorzugsweise mehr als eine, elektronegative Gruppe (wie z.B. eine Hydroxylgruppe) oder Doppelbindung (z.B. C=C-Doppelbindung), die dem Stickstoffatom ausreichend nahe ist, um dessen pKa zu erniedrigen.
Es ist gefunden worden, dass derartige Moleküle dazu neigen, geeignete pKa-Werte zur Extraktion von Nucleinsäure unter schonenden Bedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung aufzuweisen. Vorzugsweise ist zumindest eine (jedoch bevorzugter mehr als eine) elektronegative Gruppe vom ionisierbaren Stickstoff durch nicht mehr als zwei Atome (üblicherweise Kohlenstoffatome) getrennt. Hydroxylgruppen sind insbesondere bevorzugte elektronegative Gruppen (insbesondere wenn mehrere Hydroxylgruppen vorliegen, z.B. in Polyhydroxylaminen, wie z.B. Tris (C(CH₂OH)₃-NH₂) oder Bis-Tris (siehe unten)), da sie (1) den pKa des Stickstoffatoms (z.B. Amingruppe, z.B. von ungefähr 10 oder 11) auf einen geeigneten Wert um den Neutralwert (d.h. auf einen pKa von ungefähr 7) erniedrigen, (2) ermöglichen, dass die Spezies über den pKa hinaus löslich/hydrophil bleibt, wenn das Stickstoffatom der Amingruppe seine positive Ladung verliert, (3) eine Stelle zur kovalenten Bindung an ein festes Substrat, z.B. ein polycarboxyliertes Polymer (wie z.B. Polyacrylsäure), ermöglichen und (4) bei pH-Werten ungeladen sind, die für den Freisetzungsschritt geeignet sind und bei denen Verfahren wie die PCR durchgeführt werden (üblicherweise pH 8,5); die Gegenwart geladener Spezies kann besonders die PCR stören. Speziell bevorzugt sind chemische Spezies, die ein ionisierbares Stickstoffatom und zumindest 2, 3, 4, 5 oder 6 Hydroxylgruppen aufweisen. Weitere Beispiele polyhydroxylierter Amine sind Dialkoholamin-Reagenzien, wie z.B. Diethanolamin. In einer der Ausführungsformen können auf diesen Verbindungen basierende Silan-Reagenzien verwendet werden, um [HO-(CH₂)_n]₂-N-(CH₂)_m-Gruppierungen an eine Festphase zu binden, wobei n und m von 1 bis 10 gewählt sind. Ein Beispiel davon, unter Verwendung von 3-Bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan, wird unten bereitgestellt.
Viele standardmäßige, schwach basische Puffer sind ideale chemische Spezies, um die ionisierbaren Gruppen von Ladungswechselmaterialien bereitzustellen, da sie pKa-Werte nahe dem Neutralpunkt (d.h. 7) aufweisen.
Zur Verwendung als Ladungswechselmaterial können chemische Spezies, die ionisierbare Gruppen umfassen, an feste Träger (z.B. Kügelchen, Teilchen, Röhrchen, Näpfe, Sonden, Messstreifen, Pipettenspitzen, Objektträger, Fasern, Membranen, Papiere, Zellulosen, Agarosen, Glas oder Kunststoffe) in monomerer oder polymerer Form über Adsorption, ionische oder kovalente Wechselwirkungen oder durch kovalente Befestigung an ein Polymergerüst immobilisiert werden, das seinerseits an den festen Träger gebunden wird. Alternativ dazu können sie in feste, unlösliche Formen (mit oder ohne Befestigung an ein Polymergerüst) inkorporiert werden, die von Natur aus eine Ladungsumschalung aufweisen, z.B. Kügelchen, Teilchen, Röhrchen, Näpfe, Sonden, Messstreifen, Pipettenspitzen, Objektträger, Fasern, Membranen oder Kunststoffe.
Festphasenmaterialien, insbesondere Kügelchen und Teilchen, können magnetisierbar, magnetisch oder paramagnetisch sein. Dies kann bei der Entfernung der Festphase aus einer die freigesetzte Nucleinsäure enthaltenden Lösung vor der weiteren Verarbeitung oder Lagerung der Nucleinsäure hilfreich sein.
Vorzugsweise sind die schwach basischen Puffer biologische Puffer, d.h. Puffer aus der Klasse von Puffern, die üblicherweise in biologischen Pufferlösungen verwendet werden. Beispiele biologischer Puffer finden sich in handelsüblichen Chemikalienkatalogen, wie z.B. im Sigma-Katalog.
Die Auswaschung (d.h. der Transfer von der Festphase in die Lösung der Flüssigphase) der chemischen Spezies, die zur Bereitstellung der ionisierbaren Gruppen in Ionentauscherharzen verwendet werden, ist gewissermaßen ein nahezu unvermeidbares Phänomen, insbesondere wenn die Spezies durch Adsorption an der Festphase befestigt werden. Eine derartige Auswaschung verursacht eine Verunreinigung des resultierenden Produkts, was zu erheblichen Problemen führen kann, insbesondere wenn die Verwendung des resultierenden Produkts in der PCR beabsichtigt ist (und insbesondere wenn die Spezies geladen sind). Die Verwendung biologischer Puffer zur Bereitstellung der ionisierbaren Gruppen in Ladungswechselmaterialen kann dieses Problem vermeiden, da die Auswaschung derartiger Puffer in die Flüssigphase im Allgemeinen weder die Nucleinsäure noch jegliche Downstream- Prozesse, wie z.B. PCR, denen sie möglicherweise unterzogen wird, signifikant beeinträchtigt. In der Tat werden viele biologische Puffer routinemäßig in PCR-Puffern, Lagerungspuffern und anderen Pufferlösungen verwendet.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform findet der Freisetzungsschritt in einer Pufferlösung statt, die denselben biologischen Puffer verwendet, der im, als oder am Ladungswechselmaterial verwendet wird.
Beispiele geeigneter biologischer Puffer zur Verwendung bei Ladungswechselmaterialien gemäß der Erfindung und ihre pKa-Werte sind die folgenden:
Aminomethylpropandiol ✝ (AMP), pKa 8,8;
N,N-Bis-2-hydroxyethylglycin ✝ (BICINE), pKa 8,3;
Bis-2-hydroxyethyliminotrishydroxyhydroxymethylmethan
(BIS-TRIS), pKa 6,5;
1,3-Bistrishydroxymethylmethylaminopropan
(BIS-TRIS-Propan), pKa 6,8;
N-Trishydroxymethylmethylglycin ✝ (TRICIN), pKa 8,1; und
Trishydroxymethylaminomethan ✝ (TRIS), pKa 8,1;
Triethanolamin-Dimere**, -Oligomere** und -Polymere**; und
Di/Tri/Oligo-Aminosäuren**, beispielsweise Gly-Gly, pKa 8,2; und Ser-Ser, Gly-Gly-Gly und Ser-Gly, letzteres mit drei pKa-Werten im Bereich von 7–9.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die oben mit einem Sternchen (*) markierten Puffer nicht als biologische Puffer zum Zwecke der Erfindung betrachtet (ob sie in irgendwelchen Katalogen als solche gezeichnet sind oder nicht). In einer bevorzugteren Ausführungsform werden jene, die mit zwei Sternchen (**) markiert sind, ebenfalls nicht als biologische Puffer betrachtet. Bevorzugte biologische Puffer sind mit einem Kreuzzeichen (✝) markiert, bevorzugtere Puffer sind mit zwei Kreuzzeichen markiert (✝✝), noch bevorzugtere Puffer sind mit einem Doppelkreuz (
) markiert, und insbesondere bevorzugte Puffer sind mit zwei Doppelkreuzen (
) markiert.
Diese und andere chemische Spezies, die ionisierbare Gruppen umfassen, können unter Verwendung kovalenter, ionischer oder adsorptiver Wechselwirkungen als Monomere auf eine Festphase beschichtet werden. Außerdem oder alternativ dazu können sie in polymerer Form (vorzugsweise nach Kondensationspolymerisation) auf derartige Festphasenträger beschichtet werden, beispielsweise durch Adsorption an eine negativ geladene Oberfläche (z.B. eine Oberfläche mit exponierten COOH- oder SO₃-Gruppen) oder durch kovalente Bindung. Außerdem oder alternativ dazu können die chemischen Spezies, die ionisierbare Gruppen enthalten, an ein Polymer gebunden werden (siehe unten), das dann z.B. durch Adsorption oder kovalente Bindung an einen festen Träger gebunden wird.
Vorzugsweise werden die chemischen Spezies oder Polymergerüste über eine Hydroxylgruppe oder eine andere Gruppe kovalent an den festen Träger gekoppelt, so dass die ionische Gruppe mit dem gewünschten pKa-Wert (üblicherweise, jedoch nicht eingeschränkt auf ein Stickstoffatom) fähig bleibt, Nucleinsäure zu binden und freizusetzen.
Biologische Puffer und andere chemische Spezies, die positiv ionisierbare Gruppen umfassen, können in Verbindung mit einer chemischen Spezies verwendet werden, die eine negativ ionisierbare Gruppe enthält, die einen geeigneten pKa-Wert vorzugsweise in den oben beschriebenen Bereichen aufweist. Zum Beispiel kann ein biologischer Puffer (mit einem oder mehreren positiv geladenen ionisierbaren Stickstoffatomen) an einem Polymer oder anderen Festphasenmaterial befestigt werden, das selbst nach der Bindung des biologischen Puffers exponierte Carboxygruppen aufweist. Ein derartiges Material könnte Nucleinsäuren bei einem niedrigen pH binden, wenn wenige der Carboxygruppen negativ geladen sind (d.h. wenige in der COO^–-Form, die meisten in der COOH-Form vorliegen) und die meisten der ionisierbaren Stickstoffatome positiv geladen sind. Bei höherem pH ist die negative Ladung stärker (d.h. ein größerer Anteil von Carboxygruppen befindet sich in der COO^–-Form) und/oder die positive Landung schwächer, und die Nucleinsäure wird von der Festphase abgestoßen.
Ionisierbare Gruppen enthaltende chemische Spezies (wie z.B. die oben aufgezählten biologischen Puffer) können unter Verwendung bekannter Chemie an ein Polymergerüst gebunden werden. Beispielsweise kann eine chemische Spezies, die eine Hydroxylgruppe enthält, unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie an das carboxylierte Polymergerüst gebunden werden. Andere chemische Reaktionen können vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung unter Verwendung anderer Polymergerüste (z.B. auf Basis von Polyethylenglykol (PEG) oder Kohlenhydraten) unter Verwendung einer Reihe von standardmäßigen chemischen Kopplungsreaktionen eingesetzt werden (siehe z.B. Immobilised Affinity Ligand Techniques, G.T. Hermanson, A.K. Mallia und P.K. Smith, Academic Press Inc., San Diego, CA (1992), ISBN 0123423309, die hierin als Ganzes durch Verweis aufgenommen ist).
Alternativ dazu können die chemischen Spezies, die ionisierbare Gruppen enthalten, ohne ein Polymergerüst polymerisiert werden, und zwar unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, beispielsweise Reagenzien, die über eine Hydroxylgruppe koppeln (z.B. Carbonyldiimidazol, Butandioldiglycidylether, Dialdehyde, Diisothiocyanate). Polymere können auch durch einfache chemische Kondensationsreaktionen gebildet werden, um polymere Aminosäuren mit dem geeigneten pKa, z.B. Gly-Gly, zu erzeugen.
Vorzugsweise beeinflusst eine derartige Immobilisierung, Befestigung und/oder Polymerisation der chemischen Spezies, welche die ionisierbare Gruppen enthält, nicht den pKa der ionisierbaren Gruppe oder belässt ihn in den gewünschten, oben angegebenen Bereichen. Beispielsweise wird im Allgemeinen bevorzugt, die chemische Spezies nicht über ein positiv ionisierbares Stickstoffatom zu koppeln oder zu polymerisieren (beispielsweise im Gegensatz zur WO 97/2982). Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung ist es insbesondere bevorzugt, die chemische Spezies über eine Hydroxylgruppe zu binden und/oder zu polymerisieren.
Ein bevorzugtes polymeres Material ist ein Dimer oder Oligomer von Bis-Tris oder ein Material, das durch Bindung mehrerer Bis-Tris-Moleküle an ein Polyacrylsäurege rüst gebildet wird, z.B. durch Reaktion von Bis-Tris-Monomer mit Polyacrylsäure unter Verwendung von 1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC). Das Polymer kann dann leicht unter Verwendung von Dialyse gegen ein geeignetes Reagens oder Wasser von den Reaktionspartnern getrennt werden. Vorzugsweise hat die Polyacrylsäure ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 500 und 5 Millionen oder mehr. Bevorzugter hat sie ein Molekulargewicht zwischen 100.000 und 500.000.
Die Beschaffenheit der resultierenden Bis-Tris/Polyacrylsäure hängt üblicherweise vom Verhältnis der gekoppelten Komponenten ab, da das Polymer in Abhängigkeit vom Verhältnis der Acrylsäuregruppen, die mit Bis-Tris modifiziert werden, unterschiedliche Eigenschaften aufweisen wird; beispielsweise ist es wünschenswert, dass manche Carboxygruppen unmodifiziert bleiben, da deren Gegenwart die Bindung von Bis-Tris an Nucleinsäure bei niedrigem pH nicht verhindern (insbesondere wenn Bis-Tris im Überschuss vorliegt), ihre negative Ladung jedoch bei höheren pHs die Freisetzung der Nucleinsäure fördern wird. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung liegt das Molverhältnis von Bis-Tris:Carboxygruppen (vor der Bindung) vorzugsweise zwischen 5:1 und 1:5, bevorzugter zwischen 3:1 und 1:3, noch bevorzugter zwischen 2:1 und 1:2, noch bevorzugter zwischen 1,5:1 und 1:1,5 und insbesondere bevorzugt bei ungefähr 1:1.
Die Gegenwart hoher Restladung (d.h. dass geladene Spezies in der Lösung zusammen mit der extrahierten Nucleinsäure vorliegen) kann die Analyse von Nucleinsäuren mittels PCR negativ beeinflussen oder die Bindung von Primern, dNTPs oder Polymerase an die Nucleinsäure oder die Maskierung der Mg²⁺-Ionen stören, die für die PCR essentiell sind. Es ist insbesondere bevorzugt, eine positive Restladung zu vermeiden.
Bevorzugte Materialien zur Verwendung in der Erfindung, wie z.B. die oben beschriebenen biologischen Puffer, besitzen eine minimale positive Restladung (vorzugsweise minimale Restladung) beim pH, bei dem die Nucleinsäure freigesetzt wird, und/oder bei pH-Werten von 8 bis 8,5, wodurch die Störung oder Hemmung von Downstream-Prozessen unwahrscheinlich wird.
Die Patentanmeldung PCT/GB00/02211 (WO 99/29703) desselben Erfinders offenbart ein Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus biologischem Material, wobei das Verfahren das Kontaktieren des biologischen Materials mit einer Festphase, die Histidin oder ein Polyhistidin inkorporiert, das zur Bindung von Nucleinsäuren bei niedrigem pH neigt, sowie das anschließende Extrahieren der an die Festphase gebundenen Biomoleküle durch Elution unter Verwendung eines Elutionslösungsmittels umfasst, das dann die gebundenen Nucleinsäuren freisetzt, wenn der pH erhöht wird.
Weitere Beispiele von Ladungswechselmolekülen für die Nucleinsäurereinigung basieren auf Detergenzien oder Tensiden mit einem hydrophoben Abschnitt und einen hydrophilen Abschnitt, der eine positiv ionisierbare Gruppe mit einem geeigneten pKa umfasst, z.B. Decylmethylimidazol oder Dodecyl-Bis-Tris. Diese Detergenzien/Tenside können an Oberflächen adsorbiert werden, z.B. an Kunststoff über ihre hydrophoben Abschnitte, wobei die hydrophilen (ionisierbaren) Abschnitte zum Einfangen der Nucleinsäure verwendet werden können.
Eine weitere Familie geeigneter Materialien zum Einfangen und zur einfachen Freisetzung von Nucleinsäuren sind Kohlenhydrate, z.B. Glucosamin, Polyglucosamin (einschließlich Chitosane), Kanamycine und seine Derivate, d.h. Strukturen auf Basis von Zuckerringen, die ein oder mehrere Stickstoffatome enthalten, die von Hydroxylgruppen umgeben sind, die ebenfalls weitere Gruppen, wie z.B. Acetat- oder Sulfatgruppen, enthalten können, um für einen geeigneten pKa zur Bindung und Freisetzung von Nucleinsäure zu sorgen.
Noch eine weitere Gruppe von Materialien, die Elemente mit geeigneten pKa-Werten aufweist, sind heterozyklische Stickstoff-enthaltende Verbindungen. Derartige Verbindungen können aromatisch oder aliphatisch sein oder können Monomere, Oligo mere oder Polymere sein, wie z.B. Morpholin-, Pyrrol-, Pyrrolidin-, Pyridin-, Pyridinol-, Pyridon-, Pyrrolin-, Pyrazol-, Pyridazin-, Pyrazin-, Piperidon-, Piperidin- oder Piperazin-enthaltende Verbindungen, z.B. Polyvinylpyrrolidon. Derartige Verbindungen können durch elektronegative Gruppen substituiert sein, um den/die pKa-Werte) des/der ionisierbaren Stickstoffatoms/e in einen annehmbaren, z.B. oben definierten, Bereich zu bringen. Jedoch ist dies bei manchen Verbindungen möglicherweise nicht notwendig, da sich der pKa bereits in einem derartigen Bereich befindet.
Noch eine weitere Gruppe von Festphasen zur Bindung von Nucleinsäuren weisen Oberflächenamingruppen und insbesondere Amingruppen auf, die nicht Polyamine sind. Diese Monoamingruppen können durch die Formel -NR₁R₂ dargestellt werden, wobei R₁ und R₂ Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl sind. Obgleich diese Materialien typischerweise pKa-Werte aufweisen, die höher als jene von Materialien sind, die in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, können sie bei der Nucleinsäure-Extraktion eingesetzt werden, wobei sie gegebenenfalls mit negativ geladenen Spezies eingesetzt werden, wie sie hierin zur Modifizierung des Gesamt-pKa der Festphase beschrieben sind.
Bevorzugte Materialien zur Verwendung gemäß der Erfindung sind hydrophil und umfassen beispielsweise Ladungswechselmaterialien, die wasserlöslich sind (oder die chemische Spezies umfassen, die vor der Immobilisierung oder Polymerisation wasserlöslich sind).
Wenn einmal eine geeignete Festphase hergestellt worden ist, die ein Ladungswechselmaterial umfasst, kann ein wiederholtes Einfangen und Freisetzen von Nucleinsäuren durchgeführt werden, indem der pH auf oder ab reguliert wird. Daher können sequenzielle Reaktionen oder Analysen an den Nucleinsäuren unter Verwendung derselben Festphase vorgenommen werden. Beispielsweise kann DNA aus einer biologischen Probe unter Verwendung eines PCR-Röhrchens, das eine Ladungswechselmaterial umfasst, isoliert werden. Im Anschluss an die PCR kann dann das amplifizierte DNA-Produkt aus den Pufferbestandteilen oder Primern durch Einstellen des pH im selben Röhrchen isoliert werden.
Insbesondere bevorzugte Festphasenmaterialien sind nichtporös. Poröse Materialien werden üblicherweise zur Isolierung von Proteinen verwendet, die in den Poren des Trägers eingeschlossen werden können. Jedoch neigen Nucleinsäuren dazu, zu groß zu sein, um in die Poren von üblicherweise verwendeten derartigen Trägern einzudringen, wodurch möglicherweise Verunreinigungen in die Poren eingeschlossen werden.
Das Verfahren kann verwendet werden, um einzelsträngige RNA oder DNA aufgrund der unterschiedlichen Ladungsdichten an einzel- und doppelsträngigen Molekülen durch geeignete Manipulation des pH oder der Salzkonzentration von doppelsträngiger DNA zu trennen. Typischerweise werden einzelsträngige Moleküle bei einem niedrigeren pH als doppelsträngige Moleküle von der Bindung an der Festphase freigesetzt.
Unter manchen Umständen, beispielsweise zur Konstruktion von Gen-Chips und zur Herstellung von Sonden, kann es wünschenswert sein, einzelsträngige DNA zu erzeugen. Die Manipulation von pH und/oder Ionenstärke kann die Reinigung und Freisetzung einzelsträngiger Nucleinsäure unterstützen. Das Verfahren der Erfindung kann einen vorherigen Schritt der Umsetzung doppelsträngiger Nucleinsäure in der Probe zur einzelsträngigen Nucleinsäure umfassen (vorzugsweise unter Verwendung einer starken Base, z.B. 100 mM NaOH, oder einer schwächeren Base bei hoher Temperatur, z.B. 60–100 °C). Das Festphasenmaterial wird dann vorzugsweise gleichzeitig mit einem Puffer zugegeben, der den pH der Proben auf einen pH zur Bindung einzelsträngiger Nucleinsäure ändert (typischerweise ein pH von 4–7).
Die hierin beschriebenen Materialien können außerdem eingesetzt werden, um Nucleinsäuren in der Flüssigphase einzufangen, wobei die Bindung eine vernetztes Gitter liefert, das groß genug ist, um von der Flüssigphase, z.B. durch Filtration oder Zentrifugation, getrennt zu werden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäure aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren der Probe mit einem Ladungswechselmaterial bei einem ersten pH, bei dem das Ladungswechselmaterial eine positive Ladung aufweist und negativ geladene Nucleinsäure binden wird; und die anschließende Freisetzung der Nucleinsäure bei einem zweiten, höheren pH, bei dem die Ladung neutral, negativ oder weniger positiv als der erste pH ist, worin das Ladungswechselmaterial beim ersten pH löslich ist und worin die Kombination des Ladungswechselmaterials und der gebundenen Nucleinsäure beim oder über dem ersten pH und unter dem zweiten pH unlöslich ist.
Bevorzugte Kennzeichen des Verfahrens sind oben dargelegt mit der Ausnahme, dass das Ladungswechselmaterial als ein Festphasenmaterial ausgebildet, daran immobilisiert oder gebunden wird.
Üblicherweise sind die Ladungswechselmaterialien beim zweiten pH löslich und bleiben mit der Nucleinsäure bei der Freisetzung der Nucleinsäure in Lösung; die Verwendung eines schwach basischen Puffers (gegebenenfalls an ein lösliches Gerüst, z.B. Polyacrylsäure, gebunden) als Ladungswechselmaterial kann die Probleme der Verunreinigung wie oben beschrieben vermeiden.
Die Verfahren der Erfindung umfassen vorzugsweise einen oder mehrere Waschschritte zwischen den Bindungs- und Freisetzungsschritten. (Ein) solche(r) (a) Waschschritte) wird/werden im Allgemeinen beim ersten pH oder einem pH über dem ersten pH, jedoch unter dem zweiten pH durchgeführt, so dass die Nucleinsäure während des/der Waschschritts/e im Wesentlichen nicht freigesetzt wird.
Wie früher angedeutet worden ist, sind die Verfahren der Erfindung insbesondere zur Extraktion von Nucleinsäure zweckdienlich, wenn sie dann gelagert oder weiter verarbeitet wird (z.B. mittels PCR), insbesondere wenn das Ladungswechselmaterial beispielsweise in Form eines Röhrchens oder Napfs vorliegt, in dem eine solche Lagerung und/oder Verarbeitung stattfindet. Um Bedenken auszuräumen, wird jedoch betont, dass der Freisetzungsschritt und jegliche anschließenden Lagerungs- und Verarbeitungsschritte nicht als getrennte Schritte ausgeführt werden müssen, sondern zusammenfallen können, wenn die Lagerung oder Verarbeitung bei einem pH stattfindet, bei dem die Freisetzung der Nucleinsäure stattfindet. Beispielsweise umfasst das Verfahren der Erfindung das Binden einer Nucleinsäure an ein Ladungswechselmaterial, das auf ein PCR-Röhrchen beschichtet ist oder anderweitig durch ein PCR-Röhrchen bereitgestellt wird, das Waschen der gebundenen Nucleinsäure und den anschließenden Beginn der PCR-Reaktion ohne einen gesonderten Freisetzungsschritt unter Verwendung eines Puffers, der die Freisetzung der Nucleinsäure bewirkt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Ladungswechselmaterialien zur Verwendung bei den Verfahren der vorangehenden, in den Ansprüchen dargelegten Aspekte bereit. Sie umfasst weiters die Verwendung derartiger Ladungswechselmaterialien in derartigen Verfahren. Alle bevorzugten Eigenschaften der oben im Zusammenhang mit den Verfahren beschriebenen Ladungswechselmaterialien gelten gleichermaßen und unabhängig vom vorliegenden Aspekt der Erfindung (d.h. dass bevorzugte Kombinationen oder Eigenschaften in Bezug auf diesen Aspekt von den bevorzugten Kombinationen in Bezug auf die Verfahrensaspekte verschieden sein können).
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Behälter (vorzugsweise ein PCR- oder Lagerungsröhrchen oder einen Napf oder eine Pipettenspitze) bereit, der mit einem Ladungswechselmaterial beschichtet ist, ein Ladungswechselmaterial umfasst oder aus einem Ladungswechselmaterial gebildet ist, wobei das Ladungswechselmaterial vorzugsweise einen biologischen Puffer umfasst.
Die folgende Beschreibung betrifft insbesondere die Extraktion von Nucleinsäure aus Blut, gilt jedoch auch für die Extraktion von Nucleinsäure aus beliebigen flüssigen Proben, insbesondere biologischen Proben oder Proben, die im Zuge von Labortechniken, wie z.B. PCR, hergestellt werden.
Das Verfahren ist insbesondere zweckdienlich, wenn die biologische Probe Blut ist, jedoch kann das Verfahren für eine Reihe von Anwendungen und Substanzen, wie z.B. für die Plasmidisolation und Pflanzen-DNA-Extraktion, verwendet werden
Vorzugsweise werden die Zellen im Blut lysiert, um Nucleinsäuren freizusetzen, und es können bekannte Lysemittel und Verfahren verwendet werden, wie z.B. das Kontaktieren mit ionischen und nichtionischen Detergenzien, hypotonischen Lösungen von Salzen, Proteasen, chaotropen Mitteln, Lösungsmitteln unter Verwendung von pH-Änderungen oder Wärme. Ein Verfahren der Lyse von Zellen zur Nucleinsäure-Isolierung wird in WO 96/00228 beschrieben.
Wenn das biologische Material aus Blut besteht, können die Proben gegebenenfalls mit Wasser oder einem anderen Verdünner verdünnt werden, um sie leichter manipulieren und verarbeiten zu können.
Es können Verdünnungen von bis zu 10-mal verwendet werden, und im Allgemeinen kann eine höhere Verdünnung besser sein, wobei es eine Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass sie eine niedrige Verdünnung von Blut ermöglicht.
Die Festphase, mit der das Blut kontaktiert wird, kann aus einem Material gebildet sein, das eine natürliche Affinität für Nucleinsäuren hat, oder kann aus einem Material gebildet sein, dessen Oberfläche mit einem Mittel behandelt ist, das die Bindung von Nucleinsäuren daran bewirkt oder seine Affinität für Nucleinsäuren erhöht. Geeignete Materialien umfassen Controlled-pore-Glas, Polysaccharide (Agarose oder Cellulose), andere Typen von Silikat/Glas, keramische Materialien, poröse Kunststoffmaterialien, wie z.B. poröse Kunststoffkappen, als einzelner Formteil oder als Einsatz in ein Standardröhrchen, Polystyrolkügelchen, paramagnetische Kügelchen usw. Die Größe und Porosität ist nicht entscheidend und kann für bestimmte Anwendungen variieren und ausgewählt werden.
Geeignete Mittel zur Behandlung der Oberfläche der Festphase oder für ihre Derivatisierung umfassen ihre Behandlung mit einer Substanz, die eine Ladung, z.B. eine positive Ladung, an der Oberfläche oder an einer hydrophilen oder hydrophoben Oberfläche der Festphase einführen kann, z.B. Hydroxylgruppen, Nitratgruppen, autoreaktive Gruppen, Farbstoffe und andere aromatische Verbindungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Festphase bei einem bestimmten pH die gegenüber Verunreinigungen in der Blutprobe bevorzugte Bindung von DNA an die Festphase bewirken und wird die Freisetzung der gebundenen Nucleinsäure ermöglichen, wenn sie mit einem Elutionsmittel bei einem anderen pH kontaktiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Kunststoffform ein Bindungsmittel, z.B. in einem Napf oder in einer Platte, aufnehmen, so dass das Bindungsmittel in die Oberfläche inkorporiert wird, wobei die Probe dann mit der Oberfläche kontaktiert wird, so dass die Bindung der Nucleinsäuren an die Oberfläche bewirkt wird. Die Blutprobe wird dann entfernt und die Oberfläche mit einem Elutionsmittel behandelt, um die gebundenen Nucleinsäuren freizusetzen. Wenn die Oberfläche Teil eines Napfs in einer Platte mit mehreren Näpfen ist, kann das Gesamtsystem leicht für rasche Probennahme- und Extraktionstechniken im großen Maßstab adaptiert werden.
Bindungsmittel, die verwendet werden können, umfassen ladungswechselbare Ionentauscherharze unter Verwendung einer positiv geladenen Festphase, die durch Ändern des pH über ihren pKa hinaus umgekehrt oder neutral gemacht werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Kunststoffoberfläche modifiziert werden, um funktionelle Gruppen zu umfassen. Der Kunststoff kann ein beliebiger Kunststoff sein, der zur Kontaktierung von Proben verwendet wird, z.B. Polypropylen. Die funktionellen Gruppen können positiv oder negativ geladen sein, um die Nucleinsäuren in der richtigen Pufferlösung zu binden.
Alternativ dazu können die funktionellen Gruppen chemische Gruppen sein, die fähig sind, kovalent an andere Liganden oder Polymere zu koppeln.
Wenn der Kunststoff in einer Kunststoffform, z.B. in einem Napf in einer Platte oder als Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Röhrchen, verwendet wird, können die Oberflächeneigenschaften des Kunststoffs in geeigneter Weise zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, indem die geeigneten Chemikalien in die Formherstellungsverbindung, z.B. wie bei einer Spritzgussverbindung, aufgenommen oder dieser zugesetzt werden.
Wenn dies bei einem PCR-Röhrchen oder bei einer Platte mit tiefen Näpfen verwendet wird, können die Röhrchen oder Näpfe dazu verwendet werden, um kleine Mengen an DNA oder RNA zu isolieren oder zu immobilisieren, wodurch ein reines Templat für eine anschließende PCR oder andere genetische Analyse und Manipulation erzeugt wird.
Wenn der Kunststoff Polypropylen ist, z.B. in Form eines dünnwandigen PCR-Röhrchens, kann die Polypropylenoberfläche modifiziert werden, indem die Oberfläche mit einem Oxidationsmittel, wie z.B. Kaliumpermanganat und Schwefelsäure, oxidiert wird, um eine carboxylierte Oberfläche (COOH-Gruppen) zu erzeugen. Dieses Röhrchen kann dann verwendet werden, um die Isolierung von DNA aus Lösungen oder aus Rohproben, z.B. Blut, zu verbessern. Durch Einstellung von pH, Dielektrizitätskonstante, Löslichkeit oder Ionenstärke kann die DNA oder RNA an den Wänden des Röhrchens immobilisiert und durch Waschen von Verunreinigungen befreit werden, womit sie für PCR und andere analytische Techniken bereit ist.
Die Carboxygruppen können durch kovalentes Koppeln an anionische Gruppen, wie z.B. Imidazol oder Polyhistidin, oder jegliche starke oder schwache Ionentauscher weiter modifiziert werden, um die Bindung von Nucleinsäuren durch eine Ladungswechselwirkung zu ermöglichen. Dieses Röhrchen könnte dann verwendet werden, um die Isolierung von DNA aus Lösungen oder aus Rohproben, z.B. aus Blut, zu verbessern. Wiederum kann durch Einstellung von pH, Dielektrizitätskonstante oder Ionenstärke die DNA oder RNA an den Wänden des Röhrchens immobilisiert und durch Waschen von Verunreinigungen befreit werden, womit sie für PCR und andere analytische Techniken bereit ist.
Die Nucleinsäuren können mit einem Puffer niedrigen Salzgehalts eluiert werden, so dass sie für PCR und andere Analysen bereit sind.
Die Festphase kann mit einer Blutprobe kontaktiert werden, indem sie mit der Festphase in einem Misch/Rühr-Gerät vermischt wird, indem die Blutprobe über die Festphase geschickt wird, oder es kann die Festphase paramagnetisch sein und durch ein Magnetfeld manipuliert werden. Obgleich die Erfindung insbesondere für die Trennung oder Isolierung von Nucleinsäuren aus Blut geeignet ist, kann sie mit einer Reihe von Biomolekülen verwendet werden, insbesondere mit jenen, die eine Entfernung von Zellwandtrümmern oder unlöslichen Teilchen erfordern.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befindet sich die Festphase in Granulatform in einer Säule, und die Blutprobe wird anhand eines Druckunterschieds in die Säule gesogen, der an die Säule angelegt wird; die Blutprobe wird mit Luft aufgesogen, wobei das granuläre feste Material zu einem Fließbett wird, wodurch die Vermischungs- und Kontaktierungsgeschwindigkeiten erhöht werden und die Verstopfung minimiert wird.
Das Verfahren der Erfindung ist zur Verwendung in einem Multi-Napf-Format geeignet, wenn eine Reihe von Extraktionen aus verschiedenen Proben im Wesentlichen gleichzeitig stattfinden kann, und dies wird die Automatisierung des Extraktionsvor gangs erleichtern, was eine rasche Hochdurchsatz-Extraktion ermöglicht, und wird die Durchführung kombinatorischer Chemie ermöglichen. Dies wird einen Hochdurchsatz in einer Standard-Napf-Anordnung, z.B. einer Acht-mal-Zwölf-Anordnung, ermöglichen, so dass eine große Anzahl an Probentypen automatisch zur selben Zeit behandelt werden können.
Ausführliche Beschreibung
Die Erfindung wird nun in ihren verschiedenen Aspekten ausschließlich beispielhaft ausführlich beschrieben.
Beispiel 1: Magnetische Bis-Tris-Festphasenkügelchen
200 mg carboxylierte magnetische Teilchen von 1 μm wurden in einem Einschrittverfahren mit 100 mg Bis-Tris und 100 mg des Carbodiimids EDC in 50 mM Imidazol-Puffer bei pH 6,0 zur Reaktion gebracht. Nach Inkubation über Nacht wurden die magnetischen Teilchen gewaschen und verwendet, um Plasmid-DNA zu isolieren.
Ein alkalisches Lyse-Verfahren wurde verwendet, um ein geklärtes Bakterienlysat von 5 ml herzustellen, um einen Überstand zu erzeugen, der das Plasmid in 0,5 M Kaliumacetat, pH 5, enthält. Zum Überstand wurden 2,5 mg magnetische Teilchen zugegeben und für 1 Minute vermischt. Nach magnetischer Trennung und Waschen mit Wasser bei pH 5 wurde die reine Plasmid-DNA in 200 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert.
Die magnetischen Kügelchen wurden außerdem verwendet, um DNA direkt aus Gesamtblut unter Verwendung eines auf Detergens basierenden, Proteinase K enthaltenden Verdauungsreagens zu extrahieren.
Beispiel 2: Tricin auf magnetischen Festphasenkügelchen
50 mg carboxylierte magnetische Teilchen von 1 μm wurden in einem Einschrittverfahren mit 50 mg Tricin und 100 mg des Carbodiimids EDC in 50 mM Imidazol-Puffer, pH 6,0, zur Reaktion gebracht. Nach Inkubation über Nacht wurden die magnetischen Teilchen gewaschen und zur Isolierung von Plasmid-DNA verwendet. Eine alkalisches Lyse-Verfahren wurde verwendet, um ein geklärtes Bakterienlysat von 5 ml herzustellen, um einen Überstand zu erzeugen, der das Plasmid in 0,5 M Kaliumacetat, pH 5, enthält. Zum Überstand wurden 2,5 mg magnetische Teilchen zugegeben und für 1 Minute vermischt. Nach magnetischer Trennung und Waschen mit Wasser bei pH5 wurden die reinen Nucleinsäuren in 200 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert.
Beispiel 3: Bis-Tris-Festphasen-Polystyrolkügelchen
1 Gramm carboxylierte Polystyrolteilchen von 60 μm wurden in einem Einschrittverfahren mit 50 mg Tricin und 500 mg des Carbodiimids EDC in 50 mM Imidazol-Puffer, pH 6,0, zur Reaktion gebracht. Nach Inkubation über Nacht wurden die Teilchen gewaschen und verwendet, um Plasmid-Nucleinsäuren wie oben beschrieben zu isolieren.
Beispiel 4: Bis-Tris-Polymer
Bis-Tris-Monomer wurde zu einem Polymer umgesetzt, indem 160 mg Polyacrylsäure mit einem Molekulargewicht von 240.000, 1,6 g Bis-Tris und 1,6 g EDC in 50 mM Imidazol, pH 6,0, zusammen vermischt wurden. Nach Inkubation über Nacht wurde das Gemisch in Wasser dialysiert. Das gereinigte Polymer wurde dann auf magnetische COOH-Kügelchen beschichtet oder in der Flüssigphase verwendet, um genomische DNA aus Blut zu binden. Ein 5-ml-Blutprobe wurde zentrifugiert, um die Kerne und WBC-Population zu erhalten, und das resultierende Pellet mit 1 % SDS verdaut. Nach Präzipitation mit Kaliumacetat wurde der geklärte Überstand entweder mit 25 mg magnetischem Bis-Tris oder ungefähr 250 μg Poly-Bis-Tris als Flüssigkeit vermischt. In beiden Fällen konnte die eingefangene DNA getrennt, in Wasser gewaschen und dann wieder in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, in einer reinen Form aufgelöst werden.
Beispiel 5: Unlösliches Tris-HCl-Polymer
In diesem Beispiel wurde ein unlösliches Polymer mit inhärenten Ladungswechseleigenschaften hergestellt, indem 80 mg Polyacrylsäure mit 800 mg Tris-HCl und 800 mg EDC in 50 mM Imidazol, pH 6, vermischt wurden. Das unlösliche Präzipitat wurde verwendet, um DNA einzufangen und sie auf eine ähnliche Weise freizusetzen, wie sie im Beispiel 4 für genomische DNA beschrieben wird.
Beispiel 6: Immobilisiertes Poly-Bis-Tris an Pipettenspitzen
Eine wie im Beispiel 2 hergestellte Lösung von Poly-Bis-Tris mit 1 mg/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8, wurde bei 60 °C für 8 Stunden mit zwanzig 200-μl-Polypropylen-Pipettenspitzen inkubiert. Die Spitzen wurde gespült und verwendet, um ungefähr 150 ng Plasmid-DNA aus einem geklärten Bakterienlysat durch zehnmaliges Auf- und Abpumpen einzufangen. Nach einem kurzen Waschen mit Wasser, pH 5, wurde die DNA in 50 μl 10 mM Tris, pH 8,5, eluiert.
Beispiel 7: Immobilisiertes Poly-Bis-Tris an PCR-Röhrchen
Eine wie im Beispiel 2 hergestellte Lösung von Poly-Bis-Tris mit 1 mg/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8, wurde bei 60 °C für 8 Stunden in einer 200-μl-PCR-Platte von 8×12 Röhrchen inkubiert. Nach dem Spülen wurden die Röhrchen verwendet, um genomische DNA aus einer gemäß Beispiel 4 hergestellten Probe zu binden. Ungefähr 50 ng DNA konnten anschließend je Röhrchen unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert werden.
Beispiel 8: Polyglucosamine
10 mg niedermolekulares Chitosan wurden in angesäuertem Wasser und anschließend in 50 mM Imidazol, pH 5,5, gelöst, und dies wurde mit 100 mg magnetischen Carboxy-Kügelchen von 1 μm und mit 20 mg des Carbodiimids EDC in 50 mM Imidazol, pH 5,5, vermischt. Nach Inkubation über Nacht wurden die Kügelchen gewaschen und in 10 mM MES, pH 5, resuspendiert. Um genomische DNA zu binden, wurden 2 mg magnetische Kügelchen zum Überstand zugegeben, der mit vorher im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und die DNA nach magnetischer Trennung unter Verwendung von 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, eluiert.
Beispiel 9: Magnetische Carboxylgruppen-Kügelchen und Bis-Tris
Ein früher beschriebenes Mischladungspolymer von COOH und Bis-Tris wurde an magnetische COOH-Kügelchen gebunden, indem 100 mg Kügelchen mit 10 mg Polymer und 20 mg EDC in 0,1 M Imidazol bei pH 6,0 gegeben wurden. Die Kügelchen zeigten eine signifikante Bindung gereinigter DNA bei pH 5 und Freisetzung in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
Beispiel 10: Polyacrylsäure und Poly-Bis-Tris
Ein unlösliches Polymer von Poly-Bis-Tris wurde in situ innerhalb einer porösen Kunststoffkappe durch Vermischen von Polyacrylsäure mit Bis-Tris im Verhältnis 1:10 in 0,1 M Imidazol-Puffer, pH 5,5, gebildet. Dann wurde EDC in einem 10fachen Überschuss zu Polyacrylsäure zugegeben, um das Polymer zu bilden. Dieses wurde in 16 mM Kaliumacetat, pH 4, gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und die Kappe dann verwendet, um DNA aus einem Verdau weißer Blutzellen mit 7 M Harnstoff bei pH 5 zu binden. Die DNA konnte von der Kappe durch Erhöhen des pH auf 8,5, unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl eluiert werden.
Beispiel 11: Mit Bis-Tris derivatisierte magnetische Kügelchen
Ein geklärter Lysat-Überstand aus einer pUC19-Plasmide enthaltenden E.-coli-Kultur wurde unter Verwendung standardmäßiger Lyse-Reagenzien hergestellt. Ungefähr 50 μl des geklärten Überstands bei pH 4 wurden mit 0,25 mg mit magnetischen Kügelchen vermischt, die mit Bis-Tris derivatisiert waren, um die Plasmid-DNA zu binden. Nach dem Auswaschen der Verunreinigungen mit Wasser wurden die Kügelchen mit DNA in einer PCR-Reaktion in ein PCR-Röhrchen gemischt und zur Amplifikation unter Verwendung geeigneter Primer in einen Thermocycler transferiert. Nach der PCR wurde der pH unter Verwendung von Kaliumacetat auf 4 eingestellt und das PCR-Produkt an dieselben magnetischen Kügelchen gebunden. Die Kügelchen wurden mit Wasser gewaschen und das reine PCR-Produkt in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, für die Analyse an einem Gel und durch Sequenzierung eluiert. Die Endergebnisse zeigten, dass die Kügelchen das Plasmid reinigen, dann die PCR in Gegenwart der Kügelchen ermöglichen und schließlich das PCR-Produkt durch Wiederbindung und Elution des zur Detektion und weiteren Manipulation bereiten PCR-Produkts aufreinigen konnten.
Beispiel 12: Mikrotiterplatte unter Verwendung von Poly-Bis-Tris
Eine carboxylierte Mikrotiterplatte wurde durch Plasmabehandlung hergestellt und mit einer Lösung von Poly-Bis-Tris bei 0,5 mg/ml in 10 mM Kaliumacetat, pH 5, gewaschen. Nach dem Auswaschen ungebundenen Materials wurde eine Lösung von Blut zugegeben, die in 10 mM Ammoniumcarbonat/Bicarbonat, pH 7, mit 1 % Tween20 10fach verdünnt war. Nach 30 Minuten Inkubationszeit war die DNA an den Wänden der Näpfe immobilisiert, und die Verunreinigungen wurden mit Wasser ausgewaschen. Die DNA wurde dann durch Vermischen mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, gewonnen.
Beispiel 13: Plastikspitze unter Verwendung von Poly-Bis-Tris
Eine Lösung menschlicher DNA mit 50 μg/ml in 200 mM Kaliumacetatpuffer, pH 5, wurde mit einem gleichen Volumen Isopropanol vermischt. Das resultierende Präzipitat wurde unter Verwendung einer mit Poly-Bis-Tris beschichteten COOH-Kunststoffspitze getrennt. Nach Entfernung der gesamten Abfallflüssigkeit wurde das Präzipitat wieder in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, aufgelöst.
Beispiel 14: Sinterscheibe mit Poly-Bis-Tris
Einige der mit Bis-Tris modifizierten magnetischen Kügelchen wurden an der Luft getrocknet und dann unter Verwendung von Pistill und Mörser zerrieben. Dieses Pulver wurde mit einigen Kunststoffkörnchen vermischt und in eine ungefähr 3 mm starke Sinterscheibe mit einem Durchmesser von 6 mm formuliert. Die Scheibe konnte dann verwendet werden, um DNA aus einer Lösung von Kälberthymus-DNA mit 50 μg/ml, pH 4, unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, zur Gewinnung der DNA zu binden und zu eluieren.
Beispiel 15: Polyhydroxylierte Amine an Silica
1 Gramm Silica-Teilchen von ungefähr 60 μm wurde mit 10 Gew.-% 3-Bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan in Aceton bei 60 °C für 18 Stunden behandelt. Die modifizierten Teilchen wurden in Aceton und dann in Wasser gewaschen und zur Bindung von Kälberthymus-DNA mit 50 μg/ml in 10 mM Kaliumacetat, pH 4, verwendet. Die DNA wurde anschließend bei pH 10 in 10 mM Tris-HCl freigesetzt.
Beispiel 16: Unterschiedliche Bindung unter Verwendung magnetischer Kügelchen mit Bis-Tris
Die unterschiedliche Bindung von RNA und DNA aus E. coli wurde nachgewiesen, indem geklärte Bakterienlysate unter Verwendung standardmäßiger alkalischer Lyse- Reagenzien hergestellt und Ammoniumacetat von 0 bis 500 mM Endkonzentration zugegeben wurden. Ungefähr 0,5 mg magnetischer Bis-Tris-Kügelchen wurden den Gemischen zugegeben, um die Nucleinsäure zu binden. Nach dem Waschen in Wasser wurden die Kügelchen in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert. Die Gel-Ergebnisse zeigten, dass das Erhöhen der Salzkonzentration die Menge der an die Kügelchen gebundenen RNA im Vergleich zu DNA verminderte, was durch Messen des Verhältnisses von dsDNA zur einzelsträngigen DNA/RNA unter Verwendung von UV bei 360 nm und Pico-Green-Bindung bestätigt wurde.
Beispiel 17: Filter mit Poly-Bis-Tris
Ein Glasfaserpapierfilter mit 3 Mikrometern wurde in einem Überschuss von Poly-Bis-Tris bei 0,5 mg/ml in 10 mM Kaliumacetat, pH 4, getränkt und für 3 Tage luftgetrocknet. Ein 50-μg-Tropfen DNA wurde auf das Filter aufgegeben und das Filter wiederum getrocknet, so dass es gelagert und archiviert werden kann. Um die DNA zu gewinnen, wurde das Filter in Wasser gewaschen und in 2 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, für 10 Minuten getränkt, und die resultierende UV-Absorption bei 260 nm zeigte eine Gewinnung von 80 % der DNA an.
Beispiel 18: Magnetische Kügelchen mit Bis-Tris
Ein Bukkalzellenabstrich wurde verwendet, um eine Probe zu erlangen, und in Verdauungspuffer gegeben, der 1 ml 20 mM Ammoniumbicarbonat, 1 % Tween 20 und Proteinase K mit 200 μg/ml bei pH 7 enthielt. Nach 20 Minuten bei 50 °C wurde die Flüssigkeit auf ein neues Röhrchen übertragen, das Kaliumacetat, pH 4, und 1 mg magnetische Bis-Tris-Kügelchen enthielt. Nach einer kurzen Inkubation wurden die Kügelchen mit einem Magneten getrennt und mit Wasser gewaschen. Die DNA oder RNA wurde unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert und an einem Gel sichtbar gemacht und mittels PCR getestet.
Beispiel 19: Magnetische Kügelchen mit Poly-Bis-Tris
Eine 50-μl-Blutprobe wurde mit einem 20fachen Überschuss an 0,01 % SDS, 10 mM Tris-HCl, pH 7, verdünnt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein mit Poly-Bis-Tris beschichtetes magnetisches Kügelchen wurde verwendet, um die DNA einzufangen, und nach dem Waschen mit Wasser wurde sie unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,4, eluiert.
Beispiel 20: Magnetisches Kügelchen mit Carboxylgruppen und Bis-Tris
Ein magnetisches Kügelchen wurde mit COOH- sowie Bis-Tris-Liganden hergestellt, die durch Bindung von Kongorot- und Neutralrot-Farbstoffen bestimmt wurden. 60 μg/ml gereinigte genomische DNA in Acetatpuffer bei pH 4 wurden mit 1 mg Kügelchen vermischt und der anschließende Komplex von gebundenem Material gewaschen und die DNA dann durch Eluieren mit 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, gewonnen. Dies wurde mit einer Plasmidextraktion aus pUC19 enthaltendem E. coli wiederholt und reines Plasmid im Tris-Elutionspuffer wie vorher beschrieben freigesetzt.
Beispiel 21: Silica-Teilchen mit Carboxylgruppen und Bis-Tris
1 Gramm Silica-Teilchen von ungefähr 60 Mikrometern Durchmesser mit Oberflächen-COOH-Gruppen wurde mit 1 Gramm Bis-Tris in 20 ml 0,1 M Imidazol, pH 6, und 200 mg EDC vermischt. Die modifizierten Teilchen wurden gewaschen und verwendet, um pUC19-Plasmid aus einem unter Verwendung alkalischer Lyse-Reagenzien geklärten Lysat zu binden und zu eluieren.
Beispiel 22: Silica-Teilchen mit Oberflächen-Amingruppen und Polyacrylsäure
1 Gramm Silica-Teilchen von ungefähr 60 Mikrometern Durchmesser mit Oberflächen-Amingruppen wurde mit 1 Gramm Polyacrylsäure Mr 240 K und 20 ml 0,1 M Imidazol, pH 6, und 200 mg EDC vermischt. Die modifizierten Poly-COOH-Teilchen wurden gewaschen und mit 1 Gramm Bis-Tris in 20 ml 0,1 M Imidazol, pH 6, und 400 mg ECD vermischt. Die modifizierten Teilchen wurden verwendet, um pUC19-Plasmid aus einem unter Verwendung alkalischer Lyse-Reagenzien geklärten Lysat zu binden und zu eluieren.
Beispiel 23: Unterschiedliche Bindung unter Verwendung magnetischer Bis-Tris-Kügelchen
Die unterschiedliche Bindung und Elution von RNA und DNA aus einem Plasmid-Präparat wurde nachgewiesen, indem der pH für die Bindung nahe dem pKa der magnetischen Bis-Tris-Kügelchen eingestellt wurde. Alkalische Lyse-Reagenzien wurden unter Verwendung von Acetat-Präzipitationspuffern bei pH 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 hergestellt, so dass der End-pH für die Plasmid-Bindung nach der Neutralisation zwischen 4 und 6 lag. Durch Messen der einzelsträngigen RNA und doppelsträngigen DNA nach Elution von den Kügelchen wurde ein Schätzwert der relativen Verhältnisse von beiden berechnet. In diesem Fall wurde gefunden, dass die RNA-Bindung oder Elution ziemlich konstant blieb, während die DNA-Bindung oder Elution sich mit ansteigendem pH verminderte.
Beispiel 24: PCR-Aufreinigung mit magnetischen Kügelchen mit Bis-Tris Eine PCR-Aufreinigungsreaktion wurde demonstriert, indem eine 600-bp- und 1,5-kb-PCR-Reaktion für pUC19 unter Verwendung von 40 μl zur Reinigung bereitet wurde. Zu den 40 μl der PCR-Reaktion wurden 500 μl von ungefähr 0,5 M Acetatpuffer, pH 4, und 0,25 mg magnetischer Bis-Tris-Kügelchen zugegeben. Die Kügelchen banden das PCR-Produkt und wurden durch Waschen mit Wasser gereinigt und in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert.
Beispiel 25: CMC-Polymer und Bis-Tris-Kügelchen
Ein Carboxymethylcellulosepolymer der Güteklasse 9H4F wurde verwendet, um eine 1%ige Lösung in Wasser herzustellen. Das Gemisch wurde dann tropfenweise einer Lösung von 1 M Calciumchlorid zugegeben, um einen polyelektrolytischen Komplex mit Oberflächen-COOH-Gruppen zu bilden. Die resultierenden Kügelchen wurden dann zu Bis-Tris-Kügelchen umgesetzt, indem ein Überschuss an Bis-Tris und EDC in einem Imidazol-Puffer, pH 6, verwendet wurde. Die Kügelchen zeigten eine Bindung und Freisetzung reiner DNA unter Verwendung von pH 4- bzw. pH 8,5-Puffern.
Beispiel 26: Unlösliches Bis-Tris
Eine unlösliche Form von Poly-Bis-Tris wurde durch Vermischen von 160 mg Polyacrylsäure Mr 240 K mit 1,6 g Bis-Tris in 50 ml 0,1 M Imidazol bei pH 5,0 mit 1,6 g EDC hergestellt. Das präzipitierte Polymer wurde durch Zentrifugation gesammelt, und die kleinen Teilchen zeigten eine Bindung und Freisetzung von DNA bei pH 4 bzw. pH 9.
Beispiel 27: Magnetische Kügelchen mit Bis-Tris
Um zu testen, ob Oligonucleotide an modifizierte magnetische Kügelchen binden konnten, wurde 1 mg Bis-Tris-Kügelchen mit 10 μg pUC19-PCR-Primern in 10 mM Kaliumacetat, pH 4, vermischt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Kügelchen mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert, und die UV-Messung zeigte eine Gewinnung von 5 μg DNA an. Ein 1 %iges Gel, das Sybr-Green-Farbstoff enthielt, zeigte ebenfalls eine starke Bande niedrigmolekularer DNA.
Beispiel 28: DNA-Analyse
In allen vorherigen Beispielen wurde extrahierte DNA durch eines oder mehrere von Folgendem analysiert:

(1) Ultraviolett- (UV-) Analyse bei 260 nm und 280 nm, um ein Maß der Nucleinsäurekonzentration bereitzustellen;
(2) Gelelektrophorese unter Verwendung von 1 % Agarose in TBE-Puffer, betrieben bei 60 V für 20 Minuten gegen ein handelsübliches DNA-Präparat als Kontrolle, mit Ethidiumbromid-Färbung zur Messung der Molekülgröße und um einen Schätzwert der Menge der Nucleinsäure bereitzustellen; oder
(3) PCR unter Verwendung von für Actin oder andere ubiquitäre Gene spezifischen Primern, um die Unversehrtheit der Nucleinsäure zu testen.

Die Ergebnisse sind als (1) direkte Ablesungen vom Gerät; und (2) und (3) als Gel Fotografien dargestellt.
In allen Fällen demonstrierten die Beispiele eine wirksame Extraktion von Nucleinsäure, die nicht signifikant geschädigt war.

Claims

Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäure aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren der Probe bei einem ersten pH mit einem Material, in dem chemische Spezies auf einer festen Phase immobilisiert sind, wobei die chemischen Spezies ein positiv ionisierbares Stickstoffatom und zumindest zwei Hydroxylgruppen aufweisen, worin zumindest eine der Hydroxylgruppen durch nicht mehr als zwei Atome vom ionisierbaren Stickstoff getrennt ist, worin das Material beim ersten pH eine positive Ladung aufweist, sodass Nucleinsäure an das Material gebunden wird; und Freisetzen der Nucleinsäure bei einem zweiten, höheren pH, bei dem die Ladung des Materials negativ, neutral oder schwächer positiv ist, worin das positiv ionisierbare Stickstoffatom einen pKa zwischen 4,5 und 8,5 aufweist und die Freisetzung der Nucleinsäure unter schonenden Bedingungen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin mehrere der chemischen Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellen, durch kovalente oder ionische Bindung oder Adsorption getrennt auf einer festen Phase immobilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin mehrere der chemischen Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellen, getrennt an ein Polymer gebunden werden, wobei das Polymer durch kovalente oder ionische Bindung oder Adsorption auf einer festen Phase immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die chemischen Spezies kovalent an ein carboxyliertes Polymer gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin das Polymer Polyacrylsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemischen Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellen, – gegebenenfalls mithilfe von Vernetzern – polymerisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Polymer durch kovalente oder ionische Bindung oder Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die chemische Spezies, welche die ionisierbare Gruppe bereitstellt, aus Aminomethylpropandiol (AMP), N,N-Bis-2-hydroxyethylglycin (BICINE), Bis-2-hydroxyethyliminotrishydroxymethylmethan (Bis-Tris), 1,3-Bistrishydroxymethylmethylaminopropan (Bis-Tris-Propan), N-Trishydroxymethylmethylglycin (TRICINE) oder Trishydroxymethylaminomethan (Tris) ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die chemische Spezies ein Dialkoholamin-Reagens oder ein Kohlenhydrat ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Dialkoholamin Diethanolamin ist oder das Kohlenhydrat Glucosamin, Polyglucosamin, Chitosan oder Kanamycin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die chemische Spezies durch die allgemeine Formel [HO-(CH₂)_n]₂-N-(CH₂)_m dargestellt ist, worin n und m ganze Zahlen zwischen 1 und 10 sind, und unter Verwendung eines Silanreagens an die feste Phase gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die chemische Spezies 3-Bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die chemische Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellt, ein Dimer oder Oligomer von Bis-Tris ist oder mehrere Bis-Tris-Moleküle an ein Polyacrylsäure-Rückgrat gebunden umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die feste Phase aus der aus Kügelchen, Teilchen, Röhrchen, Wells, Sonden, Pegelstäben, Pipettenspitzen, Objektträgern, Fasern, Membranen, Papier, Glas und Kunststoff bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die feste Phase aus Magnetkügelchen oder paramagnetischen Kügelchen besteht.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die schonenden Bedingungen solche Bedingungen sind, bei denen die Nucleinsäure nicht denaturiert wird und/oder nicht abgebaut wird und/oder nicht depuriniert wird, und/oder im Wesentlichen physiologische Bedingungen sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Freisetzungsschritt bei einem pH von nicht mehr als 10,5, vorzugsweise nicht mehr als 9,0, stattfindet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Freisetzungsschritt bei einer Ionenstärke von nicht mehr als 500 mM, vorzugsweise nicht mehr als 100 mM, stattfindet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Freisetzungsschritt bei einer Temperatur von nicht mehr als 70 °C, vorzugsweise nicht mehr als 50 °C, stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der Freisetzungsschritt bei etwa Raumtemperatur stattfindet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Freisetzungsschritt das Eluieren der Nucleinsäure mit einer Pufferlösung umfasst, die sich für die Lagerung oder Weiterverarbeitung der freigesetzten Nucleinsäure eignet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Pufferlösung eine Pufferlösung ist, die sich für PCR eignet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der pKa der positiv ionisierbaren Gruppe zwischen 5,0 und 8,0 liegt.
Verfahren nach Anspruch 23, worin der pKa der positiv ionisierbaren Gruppe zwischen 6,0 und 7,0 liegt.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Material eine schwache Base umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Extrahieren von Nucleinsäure aus Verunreinigungen in der Probe, indem die Probe mit einem Material in Kontakt gebracht wird, das eine ionisierbare Gruppe umfasst, worin das Material bei einem ersten pH eine positive Ladung aufweist, sodass Nucleinsäure an das Material gebunden wird; (b) Freisetzen der Nucleinsäure bei einem zweiten, höheren pH, bei dem die Ladung des Materials negativ, neutral oder schwächer positiv ist; (c) Amplifizieren von Zielnucleinsäure in der Probe in einer PCR-Reaktion; (d) Einstellen der Probe auf einen niedrigeren pH nach der PCR-Reaktion, damit sich die amplifizierte Nucleinsäure an das Material bindet.
Verfahren nach Anspruch 26, das außerdem den anfänglichen Schritt des Lysierens einer Probe von Zellen umfasst, um Nucleinsäure freizusetzen und die in Schritt (a) behandelte Probe bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, das außerdem das Waschen des Materials nach Schritt (a) umfasst, um in der Probe enthaltene Verunreinigungen zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 28, worin der Waschschritt bei einem niedrigeren pH als dem zweiten pH durchgeführt wird, sodass die Nucleinsäure im Wesentlichen nicht vom Material freigesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, worin der Freisetzungsschritt (b) durchgeführt wird, indem der pH der Probe so eingestellt wird, dass er mit PCR kompatibel ist, oder indem ein PCR-Puffer zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, worin der PCR-Puffer 10 mM TrisHCl, 50 mM KCl mit pH 8,5 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, worin die amplifizierte Nucleinsäure in Schritt (d) von Pufferbestandteilen und Primern isoliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 32, das außerdem das Lagern der Nucleinsäureprobe nach Schritt (a) oder (d) und/oder das Durchführen einer weiteren Manipulation umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33, das außerdem das Freisetzen der Nucleinsäureprobe vom Material nach Schritt (d) und/oder das Durchführen einer weiteren Manipulation umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, worin das Material ein PCR-Röhrchen oder Kügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Kügelchen Magnetkügelchen oder paramagnetische Kügelchen sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Material eine ionisierbare Gruppe mit einem pKa-Wert umfasst, wobei der pKa-Wert zwischen dem ersten und zweiten pH oder innerhalb von 1,0 pH-Einheiten, vorzugsweise innerhalb von 0,5 pH-Einheiten, unter dem ersten pH liegt.
Verfahren nach Anspruch 37, worin der zweite pH innerhalb von 3 pH-Einheiten, vorzugsweise innerhalb von 2 pH-Einheiten, um den pKa-Wert liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Verfahren zum Abtrennen einsträngiger Nucleinsäure von doppelsträngiger Nucleinsäure dient.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Verfahren zum Extrahieren einsträngiger Nucleinsäure dient, wobei das Verfahren einen vorangehenden Schritt des Überführens von doppelsträngiger Nucleinsäure in einsträngige Nucleinsäure umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Material ein Festphasenmaterial ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Bindeschritt in einer Lösung stattfindet, die eine Konzentration von 1 M oder weniger aufweist.
Festphasenprodukt zur Verwendung in einem Verfahren, bei dem das Produkt reversibel in einer Probe vorhandene Nucleinsäure bindet, wobei das Produkt chemische Spezies umfasst, die auf einer festen Phase immobilisiert sind, wobei die chemischen Spezies ein positiv ionisierbares Stickstoffatom mit einem pKa zwischen 4,5 und 8,5 und zumindest zwei Hydroxylgruppen aufweisen, worin zumindest eine der Hydroxylgruppen durch nicht mehr als zwei Atome vom ionisierbaren Stickstoff getrennt ist, worin die chemische Spezies, welche die ionisierbare Gruppe bereitstellt, aus Aminomethylpropandiol (AMP), N,N-Bis-2-hydroxyethylglycin (BICINE), Bis-2-hy droxyethyliminotrishydroxymethylmethan (Bis-Tris), 1,3-Bistrishydroxymethylmethylaminopropan (Bis-Tris-Propan), N-Trishydroxymethylmethylglycin (TRICINE) oder Trishydroxymethylaminomethan (Tris) ausgewählt ist und worin die ionisierbaren Gruppen bei einem ersten pH, bei dem die ionisierbaren Gruppen positiv geladen sind, zur Bindung von in einer Probe vorhandener Nucleinsäure fähig sind und bei einem zweiten, höheren pH, bei dem die Ladung auf den ionisierbaren Gruppen negativ, neutral oder schwächer positiv ist, zur Freisetzung der Nucleinsäure fähig sind und die Freisetzung der Nucleinsäure unter schonenden Bedingungen erfolgt.
Festphasenprodukt nach Anspruch 43, worin mehrere der chemischen Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellen, durch kovalente oder ionische Bindung oder Adsorption getrennt auf einer festen Phase immobilisiert sind.
Festphasenprodukt nach Anspruch 44, worin mehrere der chemischen Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellen, getrennt an ein Polymer gebunden sind, wobei das Polymer durch kovalente oder ionische Bindung oder Adsorption auf einer festen Phase immobilisiert ist.
Festphasenprodukt nach Anspruch 45, worin die chemischen Spezies kovalent an ein carboxyliertes Polymer gebunden sind.
Festphasenprodukt nach Anspruch 45 oder 46, worin das Polymer Polyacrylsäure ist.
Festphasenprodukt nach Anspruch 43, worin die chemischen Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellen, – gegebenenfalls mithilfe von Vernetzern – polymerisiert sind.
Festphasenprodukt nach Anspruch 48, worin das Polymer durch kovalente oder ionische Bindung oder Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Festphasenprodukt nach einem der Ansprüche 43 bis 49, worin die chemische Spezies, welche die ionisierbaren Gruppen bereitstellt, ein Dimer oder Oligomer von Bis-Tris ist oder mehrere Bis-Tris-Moleküle an ein Polyacrylsäure-Rückgrat gebunden umfasst.
Produkt nach einem der Ansprüche 43 bis 50, worin die feste Phase aus der aus Kügelchen, Teilchen, Röhrchen, Wells, Sonden, Pegelstäben, Pipettenspitzen, Objektträgern, Fasern, Membranen, Papier, Glas und Kunststoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Produkt nach Anspruch 51, worin die feste Phase aus Magnetkügelchen oder paramagnetischen Kügelchen besteht.