DE60112159T2

DE60112159T2 - Nachweis magnetischer Teilchen

Info

Publication number: DE60112159T2
Application number: DE60112159T
Authority: DE
Inventors: Peter Frenchay Hawkins; Richard William Downend Luxton
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2000-04-10
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2021-04-10
Also published as: JP2002005892A; CN1208621C; MXPA01003640A; US7241630B2; BR0101432A; AU3136501A; ATE300743T1; DE60112159D1; CA2342023A1; AR027785A1; CN1317693A; US20010050555A1; CA2342023C; AU770502B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um die Anzahl magnetischer Teilchen in einer Probe zu bestimmen, zum Beispiel ein Verfahren, um die Anzahl magnetischer Teilchen zu bestimmen, wenn eine Immunanalyse durchgeführt wird.
Dieses Verfahren ermöglicht es, beschichtete paramagnetische Teilchen (PMPs; engl.: paramagnetic particles) als Markierungen zu verwenden und diese unter Verwendung eines neuartigen elektronischen Schaltkreisanordnungsaufbaus zu detektieren.
Die PMPs sind typischerweise 2,8 μm im Durchmesser und bestehen aus einem Kern aus paramagnetischem Material, das mit einer geeigneten Polymerschicht beschichtet ist, an der abhängig von der speziellen Anwendung des PMP Antikörper/Antigen-Schichten befestigt sind. Derzeit besteht die wesentliche Anwendung dieser Teilchen bei einer Probenseparation, Reinigung und als feste Phase für Immunanalysen.
Bei einer typischen Immunanalyse sind die PMPs mit Proteinen beschichtet, was es ermöglicht, dieser als Material mit fester Phase zu verwenden, auf dem eine Immunreaktion stattfindet. Die Immunreaktion wird unter Verwendung einer Markierung, wie zum Beispiel ein Enzym, ein fluoreszierendes oder chemoluminiszierendes Molekül, detektiert und quantifiziert. Die PMPs sind nicht dauerhaft magnetisiert, werden aber von Permanentmagneten angezogen, was einfache Waschvorgänge ermöglicht, weshalb ein Waschen der beschichteten PMPs keine Filterung oder Zentrifugation erfordert. Nach den Waschschritten wird die immobilisierte Markierung auf der Oberfläche der beschichteten PMPs unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens detektiert.
Die Verwendung ferromagnetischer Teilchen als Markierungen bei einer Immunanalyse ist in zwei Veröffentlichungen von Kriz et al. beschrieben worden. Diese sind "Advancements Toward Magneto Immunoassays" aus Biosensors and Bioelectronics 13 (1998), Seiten 817 bis 823 und "Magnetic Permeability Measurements In Bioanalysis and Biosensors" aus Analytical Chemistry 1996, 68, 1966 bis 1970. Bei diesen Verfahren werden die ferromagnetischen Teilchen jedoch durch eine einfache Messspule detektiert, die in einer Maxwell-Brücke angeordnet ist, um es zu ermöglichen, eine Messung der magnetischen Permeabilität einer Probe durchzuführen. Die magnetische Permeabilität wird dann als Angabe verwendet, um die Anzahl an Teilchen in der Substanz zu bestimmen.
US-A-5978694 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung, um in einer Probe eine Substanz zu detektieren, die auf ein angelegtes magnetisches Feld anspricht, wie zum Beispiel eine paramagnetische Substanz. Die Detektion wird erreicht, indem die Probe in einem angelegten, externen magnetischen Feld angeordnet wird und die Wirkung der Probe auf die Leistung einer Charakteristik ermittelt wird, wie zum Beispiel Widerstand, Leitfähigkeit, Induktivität, Kapazität und Wirkungsgrad des Leiters. Dies ist eine komplexe Vorrichtung, die einen Permanentmagneten oder einen Elektromagneten erforderlich macht, um das externe magnetische Feld bereit zu stellen, und es ist nicht vorgesehen, die Anzahl an Teilchen in der Probe zu bestimmen.
US-A-5922537 beschreibt die Verwendung von paramagnetischen Teilchen, die sich selektiv an eine Oberfläche anlagern, um die magnetischen Eigenschaften der Oberfläche zu beeinflussen.
US-A-4940939 beschreibt ein System, um die Zusammensetzung nicht metallischer Materialien zu überprüfen, zum Beispiel bei der Herstellung von Schleifmaterialien, Konstruktionsmaterialien etc., und verwendet ein Paar LC-Oszillatorschaltkreise und ermittelt die Phasendifferenz zwischen den zwei Schaltkreisen, von denen eine eine Schleifenposition in der Nähe der (magnetischen) Probe hat.
US-A-5528142 beschreibt ein Verfahren, um die Permeabilität der Leitfähigkeit eines leitenden Materials zu quantifizieren, wobei ein induktiver Schaltkreis verwendet wird und ein Frequenzunterschied überwacht wird.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren bereit, um die Anzahl von magnetischen Teilchen in einer Probe unter Verwendung eines abgestimmten Schaltkreises zu bestimmen, der eine Kapazität und eine Spule aufweist, wobei das Verfahren umfasst:

a. Bestimmen des Unterschieds in der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises, wenn die Probe in der Spule enthalten ist und wenn die Spule dies nicht ist;
b. Verwenden des Unterschieds in der Resonanzfrequenz, um die Anzahl magnetischer Teilchen zu bestimmen.

Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir eine Vorrichtung bereit, um die Konzentration magnetischer Teilchen in einer Probe zu bestimmen, wobei die Vorrichtung umfasst:

a. einen abgestimmten Schaltkreis mit einer Kapazität und einer Spule;
b. einen Treiber, der ein Steuersignal zum Ansteuern des abgestimmten Schaltkreises erzeugt;
c. einen Detektor, um die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises zu detektieren, wobei der Unterschied in der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises wenn die Probe in der Spule enthalten ist und wenn die Probe dies nicht ist, die Konzentration der PMPs angibt.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung bereit, um die Anzahl magnetischer Teilchen innerhalb einer Probe zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung nutzt den Umstand, dass das Vorhandensein magnetischer Teilchen, wie zum Beispiel paramagnetische, ferromagnetische Teilchen oder dergleichen, zu einer inhärenten Änderung der Permeabilität der Probe führt. Weil die Selbstinduktivität einer Spule von der Permeabilität des Materials in der Spule abhängt, wird das Anordnen einer Probe, die magnetische Teilchen enthält, in einer Spule zu einer Änderung der Induktivität der Spule führen. Die vorliegende Erfindung nutzt diesen Effekt zum Erhalt einer Angabe der Induktivität der Spule, indem die Resonanzfrequenz eines LC-Schaltkreises gemessen wird, der die Spule enthält. Die Resonanzfrequenz des Schaltkreises wird anders sein, wenn die Probe in der Spule angeordnet ist, verglichen damit, wenn die Probe aus der Spule entfernt wird. Dementsprechend ist es möglich, durch Messen der Änderung der Resonanzfrequenz des LC-Schaltkreises, die Anzahl magnetischer Teilchen in der Probe zu bestimmen. Ferner, indem die Spule als Zylinderspule, Ringspule oder Flachspule gewählt wird, trägt dies dazu bei, den toten Raum zwischen der Spule und der Probe zu minimieren, wodurch gewährleistet wird, dass ein optimales Signal erhalten wird.
Typischerweise umfasst der Schritt, den Unterschied der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schalterkreises zu bestimmen, die Probe in der Spule anzuordnen, die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises zu bestimmen, die Probe aus der Spule zu entfernen und die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises zu bestimmen. Es ist bevorzugt, die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises mit der vorhandenen Probe und dann mit der entfernten Probe zu bestimmen, um eine Langzeitänderung der Resonanzfrequenz der Spule zu berücksichtigen. Diese Langzeitänderungen werden typischerweise durch Temperaturänderungen in dem umgebenden Umfeld und andere derartige Faktoren verursacht. Weil diese Änderungen typischerweise von langer Zeitdauer sind, die über einige Stunden auftritt, wird dadurch, dass nachfolgende Messungen mit der vorhanden Probe und dann kurz danach mit der entfernten Probe durchgeführt werden, gewährleistet, dass jede Änderung der gemessenen Resonanzfrequenz nur auf das Vorhandensein und/oder Fehlen der Probe zurückzuführen ist. Dementsprechend trägt dies dazu bei, zu verhindern, dass die Änderung der inhärenten Resonanzfrequenz der Spule die Messungen beeinflussen. Es ist jedoch zu erkennen, dass, wenn ein ausreichend stabiler abgestimmter Schaltkreis bereitgestellt werden könnte, dann die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises ohne die Probe nur einmal gemessen werden müsste und dann für alle nachfolgenden Messungen verwendet wird.
Typischerweise umfasst der Schritt, die Resonanzfrequenz zu bestimmen, das Steuersignal an den abgestimmten Schaltkreis anzulegen, den Phasenunterschied zwischen dem Steuersignal und dem von dem abgestimmten Schaltkreis abgegriffenen Ausgangssignal zu messen und die Frequenz des angelegten Signals so lange einzustellen, bis kein Phasenunterschied zwischen dem angelegten Signal und dem Ausgangssignal vorliegt. Andere geeignete Verfahren können verwendet werden, aber dieses ermöglicht es in vorteilhafter Weise, den Schaltkreis unter Verwendung einer Rückkopplung so einzustellen, dass der Schaltkreis die Resonanzfrequenz automatisch lokalisiert.
Das Steuersignal weist typischerweise eine Frequenz oberhalb von 200 kHz auf und hat vorzugsweise im Spezielleren eine Frequenz oberhalb von 500 kHz. Dies ist dadurch begründet, dass eine gegebene Änderung der Induktivität einer Spule bei höheren Frequenzen zu einer größeren Änderung der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises führt. Dementsprechend erhöht ein Betrieb des Schaltkreises bei einer höheren Frequenz die Empfindlichkeit des Systems.
Typischerweise sind die verwendeten magnetischen Teilchen paramagnetische Teilchen, auch wenn ferromagnetische und andere magnetische Teilchen ebenfalls verwendet werden können.
Der Detektor, um die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises zu detektieren, kann einen Phasenkomparator umfassen, um den Phasenunterschied zwischen dem Steuersignal und einem von dem abgestimmten Schaltkreis erhaltenen Ausgangssignal zu bestimmen, wobei der Treiber, um das Steuersignal an den Schaltkreis anzulegen, einen spannungsgesteuerten Oszillator (VCO; engl.: Voltage Controlled Oscillator) umfasst. Diese Konfiguration der Vorrichtung ermöglicht es in vorteilhafter Weise, den Phasenkomparator unmittelbar mit dem spannungsgesteuerten Oszillator zu verbinden, so dass der VCO auf den Phasenkomparator anspricht, um die Frequenz des Steuersignals zu ändern, bis kein Phasenunterschied vorliegt.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung einen phasengeregelten Oszillatorschaltkreis. Dies ist insbesondere vorteilhaft, weil dies es, wie oben erwähnt, ermöglicht, die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises ohne Eingriff durch eine Person genau zu bestimmen. Dies ist ein automatischer Vorgang, der zu sehr genauen Ergebnissen führt.
Die Erfindung ist insbesondere zur Verwendung während einer Immunanalyse geeignet. Sie ist jedoch auch zur Verwendung mit anderen Typen von Proben, wie zum Beispiel Flaschen oder anderen Behältern, Markierungen etc. verwendbar.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer Bindungsanalyse bereit, wobei das Verfahren umfasst:

a. Immobilisieren einer Molekülschicht auf einem Substrat;
b. Bereitstellen einer Anzahl magnetischer Teilchen als Markierungen;
c. Durchführen einer Reaktion unter Verwendung der Molekülschicht, um wenigstens einige der magnetischen Teilchen an dem Substrat zu binden; und
d. Bestimmen der Anzahl magnetischer Teilchen, die an dem Substrat gebunden sind, indem der Unterschied in der Resonanzfrequenz eines abgestimmten Schaltkreises ermittelt wird, wenn das Substrat einem von der Spule erzeugten Magnetfeld ausgesetzt ist und wenn das Substrat dem von der Spule erzeugten Magnetfeld nicht ausgesetzt ist.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit, um eine Analyse unter Verwendung magnetischer Teilchen als Markierungen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem ein Substrat verwendet wird, an dem eine Schicht für die Analyse geeigneter Moleküle immobilisiert wurde. Diese Reaktion ist auf eine solche Weise ausgelegt, dass sich Bindungen zwischen der Beschichtung des magnetischen Teilchens und der immobilisierten Schicht auf dem Substrat bilden. Die Anzahl an Teilchen, die sich an das Substrat anlagern, hängt von der Konzentration zu messender Spezies ab. Indem die Änderung der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises gemessen wird, wenn das Substrat darin enthaltene ist und wenn das Substrat nicht in der Spule enthalten ist, ermöglicht dementsprechend die Anzahl magnetischer Teilchen, die an dem Substrat gebunden sind, zu bestimmen.
Typischerweise sind die magnetischen Teilchen an einer entsprechenden Anzahl zweiter Moleküle gebunden und wobei die Reaktion die zweiten Moleküle mit der Schicht der Moleküle so verbindet, dass die magnetischen Teilchen an dem Substrat gebunden werden. Alternativ können die magnetischen Teilchen so ausgelegt sein, dass sie unmittelbar mit den an dem Substrat gebundenen Molekülen reagieren.
Die Reaktion kann eine beliebige Form einer Reaktion sein, wie zum Beispiel eine DNS-Hybridisierungsreaktion. In diesem Fall würden die ersten und zweiten Moleküle Teile von DNS umfassen. Vorzugsweise ist die Bindungsanalyse jedoch eine Immunanalyse, wobei in diesem Fall die Molekülschicht eine Antikörper/Antigen-Schicht ist und die zweiten Moleküle Antigene oder Antikörper sind. Dementsprechend können die magnetischen Teilchen mit den Antigenen oder Antikörpern verbunden sein, die sich dann an die auf dem Substrat ausgebildete Antikörper/Antigen-Schicht anlagern.
Wenn die Proben auf einem Substrat bereitgestellt sind, ist es, wie oben erwähnt, bevorzugt, den toten Raum zwischen der Spule und der Probe zu minimieren. Daher ist der abgestimmte Schaltkreis vorzugsweise eine Zylinderspule, eine Ringspule oder eine Flachspule. In diesem Fall beinhaltet das Verfahren typischerweise, wenn die Spule eine Zylinderspule ist, die Probe dem Magnetfeld auszusetzen, indem sie in der Spule angeordnet wird. Ferner hat die Spule vorzugsweise einen ovalen Querschnitt, auch wenn ein rechteckiger Querschnitt verwendet werden kann. Alternativ können jedoch Flachspulen verwendet werden, wobei die Probe dem Magnetfeld ausgesetzt wird, indem die Probe benachbart zu der Spule angeordnet wird.
Es ist zu erkennen, dass der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung vorzugsweise implementiert werden kann, indem die ersten und zweiten Aspekte der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Dementsprechend kann die oben beschriebene elektronische Schalkreisanordnung verwendet werden, um eine Ausgabe zu erzeugen, die unmittelbar mit der Anzahl immobilisierter PMPs auf dem Streifen in Beziehung steht. Bei diesem Ansatz worden die PMP-Teilchen nun als Markierungen verwendet und separate fluoreszierende, radioaktive, chemoluminiszierende oder andere Markierungen werden nicht benötigt. Dies reduziert in beträchtlichem Ausmaß die Anzahl analytischer Schritte und beschleunigt die für eine Analyse benötigte Zeit. Ferner ist die elektronische Schaltkreisanordnung physikalisch klein genug, um die Entwicklung eines tragbaren Instruments zu ermöglichen.
Derzeitige analytische Immunanalysesysteme, die fluoreszierende oder vergleichbare Markierungen verwenden, benötigen teure spezialisierte Ausrichtungen, und es ist nicht praktikabel, diese als tragbare Systeme auszuführen. Die einzigen derzeit verfügbaren tragbaren Systeme verwenden eine Tauchstift-Technologie (engl.: dipstick technology) mit Farbmarkierungen. Diese werden hautsächlich für eine Überprüfung in der Nähe des Patienten verwendet, wie zum Beispiel ein Schwangerschaftstest, bei der das Ergebnis des Tests entweder nur positiv oder nur negativ sein kann. Diese sind im Allgemeinen nicht zur Verwendung bei Tests geeignet, bei denen die tatsächliche Konzentration eines Spezies ermittelt wird.
Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahe auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:
1A eine schematische Darstellung eines ersten Beispiels eines abgestimmten Schaltkreises ist;
1B eine schematische Darstellung eines zweiten Beispiels eines abgestimmten Schalkreises ist;
2 eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Oszillatorschaltkreises ist;
3 eine schematische Darstellung eines Schaltkreises gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
4 eine grafische Darstellung ist, die die Abnahme der Frequenz gegenüber der Konzentration von Teilchen zeigt, die für den Schaltkreis von 3 erhalten wird;
5 ein Schaltkreisdiagramm eines geeigneten Oszillators zur Verwendung bei dem Schaltkreis von 3 ist;
6 eine grafische Darstellung ist, die die Anzahl an detektierter PMPs gegenüber der Änderung der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises zeigt;
7 eine schematische Darstellung eines zweiten Beispiels einer Spule zur Verwendung in dem abgestimmten Schaltkreis von 3 ist;
8 eine grafische Darstellung ist, die die Anzahl detektierter PMPs gegenüber der Änderung der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises für die Spule von 7 zeigt;
9 eine schematische Darstellung eines dritten Beispiels einer Spule zur Verwendung in einem abgestimmten Schaltkreis von 3 ist; und
10 eine grafische Darstellung ist, die die Anzahl detektierter PMPs gegenüber der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises für die Spule von 9 zeigt;
11A und 11B Beispiele von zwei Konfigurationen mit Flachspulen zur Verwendung bei dem abgestimmten Schaltkreis von 3 sind;
12 eine grafische Darstellung ist, die die Anzahl detektierter PMPs gegenüber der Änderung der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises für die Spule von 7 zeigt; und
13 eine schematische Darstellung einer Immunanalysereaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
Bei einem Beispiel der vor liegenden Erfindung wird die Anzahl beschichteter paramagnetischer Teilchen auf einem Kunststoffstreifen bestimmt, indem der Streifen in einer Spule aus isoliertem Draht angeordnet und die Wirkung beobachtet wird, die deren Vorhandensein auf die Selbstinduktivität L der Spule hat. Die Annahme besteht darin, dass der einzige bedeutsame Beitrag zu Änderungen der Induktivität der Spule von der hohen magnetischen Permeabilität der Teilchen herrührt.
Die Selbstinduktivität einer gleichförmigen wendelförmigen Spule mit einer großen Anzahl an Windungen ist gegeben durch: L ≈ μμ0m2lA (1)

μ₀: = Permeabilität eines Vakuums (4π × 10^–7 H m^–1);
μ: = relative Permeabilität des Kerns;
m: = Anzahl der Windungen pro Längeneinheit;
l: = Länge; und
A: = Querschnittsfläche der Spule.

Wenn ein Kunststoffstreifen mit daran angebrachten n paramagnetischen Teilchen in der Spule angeordnet ist, ist der wirksame Wert von μ für die Spule ein Wert, der mit den individuellen Permeabilitäten des Kunststoffs in dem Streifen μ_ν, einer Restpufferlösung auf dem Kunststoffstreifen μ_S, den Teilchen μ_P und dem Luftraum in der Spule μ_a in Beziehung steht. Die Induktivität wird nun zu: L = {Cvμν + CAμA + CSμS + ncμP}μ0m2lA = {Cvμν + CAμA + CSμS}μ0m2lA + ncμPμ0n2lA (2)wobei:

C_v: = wirksamer Kunststoffanteil in dem Streifen;
C_S: = wirksamer Pufferanteil in dem Streifen;
C_A: = wirksamer Luftanteil in der Spule; und
c: = eine Konstante, die die Permeabilität einzelner Teilchen hinsichtlich des Beitrags betrifft, die sie an der Gesamtpermeabilität ausmachen.

Wenn die Teilchen sehr viel kleiner als das innere Volumen der Spule sind, ist das magnetische Feld, das jedes Teilchen umgibt, nicht gleichmäßig, aber weil die Teilchen alle die gleiche Form und Größe haben (2,8 μm im Durchmesser), tragen sie in gleicher Weise zu der gesamten wirksamen Permeabilität bei. Für alle Proben bei diesen Untersuchungen wiesen die Kunststoffstreifen den identischen Aufbau auf und das Volumen des Pufferlösungsrests kann als konstant angenommen werden. So sind alle Werte in dem ersten Term konstant oder vernachlässigbar klein und die Gleichung (1) kann umgeschrieben werden: L = L0 + kn (3)wobei: k = cμ_Pμ₀m²lA
= eine Konstante; und
L₀ = {C_vμ_ν + C_Aμ_A + C_Sμ_S}μ₀m²lA
= eine weitere Konstante, die der Induktivität der Spule entspricht, die einen Kunststoffstreifen nur mit dem Pufferlösungsrest und ohne Teilchen enthält.
Die Induktivität der Spule erhöht sich daher gleichmäßig mit der Anzahl an Teilchen auf dem Streifen. Um die Wirkung von n auf L zu maximieren und so die Empfindlichkeit des Detektionssystems zu verbessern, sollte L₀ so klein wie möglich und k so groß wie möglich sein. Den toten Raum in der Spule auf einem Minimum zu halten, indem die inneren Abmessungen der Spule verkleinert werden, so dass sie gerade groß genug sind, den Probenstreifen aufzunehmen, reduziert C_A und daher L₀. Dies gewährleistet auch, dass mehr des elektrischen Feldes in der Spule durch die Teilchen hindurchgeht, so dass C und damit k vergrößert werden.
Die Wirkung, die die Teilchen auf die Induktivität der Spule haben, wird ermittelt, indem der Streifen in eine Spule L eingebracht wird, die einen Resonanzschaltkreis mit einer parallelen Kapazität C bildet (1A).
Die Resonanzfrequenz des Schaltkreises von 1A ist gegeben durch: f = {2π(LC)1/2}–1 (4)
Aus den Gleichungen (3) und (4): f = {2πC1/2(L0 + kn)1/2}–1 = {2π(L0C)1/2}–1{1 + (k/L0)n}–1/2 f = f0{1 + (k/L0)n}–1/2 (5)wobei: f₀ = Resonanzfrequenz des Schaltkreises, der einen Kunststoffstreifen nur mit der restlichen Pufferlösung und ohne Teilchen enthält.
Erweitert man die Gleichung (5) unter Verwendung des Binominaltheorems: f = f0{1 – ½(k/L0)n + ....} f = f0{1 – ½(k/L0)n} ignoriere höhere Terme (6)
Die Gleichung (6) sagt voraus, dass die Oszillationsfrequenz des LC-abgestimmten Schaltkreises sich linear mit ansteigender Anzahl an paramagnetischer Teilchen, die auf dem Streifen vorhanden sind, abnehmen sollte.
Bei einem tatsächlichen LC-Schaltkreis, wie zum Beispiel in 1B gezeigt, weist die Spule einen inneren Widerstand R_L auf, die Kapazität einen Leckagewiderstand R_C, und es gibt eine Streukapazität C_L, die hautsächlich zwischen den einzelnen Windungen der Spule vorliegt. Für eine qualitativ hochwertige Kapazität ist R_C sehr groß und weist einen vernachlässigbaren Effekt auf die Leistung des Schaltkreises auf. Die Streukapazität hängt sehr stark von dem Aufbau der Spule ab und verkleinert die Resonanzfrequenz des Schaltkreises. Wenn die Spule einen steifen Aufbau hat, dann sollte C_L konstant bleiben, so dass ihr Vorhandensein im Großen und Ganzen ignoriert werden kann. Eine leichte Abnahme der Resonanzfrequenz wird üblicherweise beobachtet, wenn ein leerer Kunststoffstreifen in die Spule eingebracht wird, was einem Anstieg von C_L zugerechnet werden kann, weil der Kunststoffsstreifen eine höhere dielektrische Konstante als die Luft aufweist, die er verdrängt. Der innere Widerstand R_L weist wahrscheinlich die größte Wirkung auf, weil er die Resonanzfrequenz reduziert auf: f = {1 – (RL 2C/L)}1/2}{2πLC)1/2}–1 (7)
Für eine typische Spule mit L = 130 μH, C = 4,7 nF und R_L = 17 Ω besteht die Wirkung von R_L darin, die Resonanzfrequenz von f = 203,61 kHz (Gleichung 4) auf f = 202,54 kHz (Gleichung 7) zu reduzieren, d.h. die Resonanzfrequenz fällt um 1,07 kHz ab.
Die Resonanzfrequenz eines tatsächlichen LC-Schaltkreises ist sehr temperaturabhängig. Die Werte aller der in 1B gezeigten Komponenten ändern sich in gewissem Maß mit der Temperatur und tragen so zu dem Drift der Resonanzfrequenz mit der Temperatur bei. Die Spule aus dünnem Kupferdraht hergestellt, dessen Widerstand mit der Temperatur ansteigt.
Zusätzlich ändern sich die Abmessungen der Spule und die Kapazität des Kondensators C ebenfalls mit der Temperatur.
Die Oszillationsfrequenz eines LC-Schaltkreises und daher die Anzahl an Teilchen auf dem Kunststoffstreifen wird bestimmt, indem der LC-Schaltkreis verwendet wird, um die Oszillationsfrequenz eines Oszillatorschaltkreises zu steuern. Experimente zeigten, dass die Resonanzfrequenz typischerweise um nur wenige Hz abnimmt, wenn ein Kunststoffstreifen mit Teilchen darauf in einer Spule angeordnet wird, die mit etwa 250 kHz oszilliert. Der Oszillatorschaltkreis muss daher sehr stabil sein.
Herkömmliche Oszillatorschaltkreise, wie zum Beispiel der in 2 gezeigte Colpitts-Oszillator, haben sich als nicht stabil genug herausgestellt, um es zu ermöglichen, dass diese sehr geringen Änderungen der Frequenz zuverlässig gemessen werden können. Eine mögliche Erklärung für diese schlechte Leistung besteht darin, dass der Schaltkreis bei der durch Gleichung 7 angegebenen Frequenz oszilliert und so die Resonanzfrequenz durch den inneren Widerstand des LC-Schaltkreises beeinflusst wird. In dem in 2 gezeigten Schaltkreis beeinflusst auch die Eingangsimpedanz des Transistors TR1 die Resonanzfrequenz des LC-Schaltkreises und, weil dies ebenfalls temperaturabhängig ist, trägt es zu der Instabilität des Oszillators bei.
Ein vollständig neuer Ansatz war erforderlich, und es stellte sich heraus, dass der stabilste Oszillatorschaltkreis ein auf einem Phasenregelkreis (PLL; engl.: Phase-Look Loop) basierender ist, von dem ein Beispiel in 3 gezeigt ist.
Der in 3 gezeigte Schaltkreis umfasst einen spannungsgesteuerten Oszillator (VCO; engl.: Voltage Controlled Oscillator) 1, dessen Ausgang mit einem Frequenzmessgerät 2 und einem Phasendetektor 3 verbunden ist. Der Ausgang des spannungsgesteuerten Oszillators 1 ist auch über einen Widerstand 5 mit einem abgestimmten LC-Schaltkreis 4 verbunden, der, wie gezeigt, eine Spule L und eine Kapazität C aufweist. Der Phasendetektor 3, der ebenfalls mit dem Ausgang des VCO 1 verbunden ist, ist auch mit abgestimmten Schaltkreis 4 verbunden. Die Ausgabe des Phasendetektors 3 wird über einen Schleifenfilter 6 zu dem VCO 1 übertragen.
Bei Verwendung wird der VCO 1 verwendet, um ein Steuersignal zu erzeugen, das an den abgestimmten Schaltkreis 4 über den Widerstand 5 angelegt wird, was den abgestimmten Schaltkreis 4 dazu bringt, zu oszillieren.
Wenn der abgestimmte Schaltkreis 4 sich in Resonanz befindet, löschen sich die Potentialunterschiede über L und C einander aus, weil sie genau die gleiche Amplitude haben, aber um 180° (π rads) relativ zu einander phasenversetzt sind. Die Impedanz des LC-Schaltkreises bei Resonanz ist vollständig ohmisch (näherungsweise gleich R_L in 1B) und der in dem Schaltkreis fließende Strom ist in Phase mit der angelegten Spannung. Der Potentialunterschied über einem Widerstand in Reihe mit dem LC-Schaltkreis ist in Phase mit der angelegten Spannung, wenn sich der Schaltkreis in Resonanz befindet. Die Frequenz, bei der dies auftritt, ist durch die Gleichung (4) aber bei durch C + C_L ersetztem C angegeben. Diese Frequenz ist im Großen und Ganzen unabhängig von R_L (der wahrscheinlich einer der größten Beiträge hinsichtlich der Instabilität des LC-Schaltkreises ist).
Dementsprechend ist der Phasendetektor 3 mit dem Ausgang des VCO 1, um die Phase des Steuersignals zu bestimmen, und mit dem abgestimmten Schaltkreis 4 verbunden, um die Phase der Oszillation des abgestimmten Schaltkreises zu bestimmen. Der Phasendetektor 3 erzeugt dann ein den Unterschied in den Phasen der Oszillation angebendes Gleichstromsignal, das an den Schleifenfilter 6 ausgegeben wird. Der Schleifenfilter filtert das Signal, das dann zu dem spannungsgesteuerten Oszillator 1 zurück geführt wird.
Der VCO 1 wird so gesteuert, dass er beim Anlegen des Gleichstromfehlersignals seine Ausgangsfrequenz ändert, bis kein Phasenunterschied zwischen dem Steuersignal und der Oszillation des abgestimmten Schaltkreises vorliegt und dementsprechend kein Fehlersignal von dem Phasendetektor 3 ausgegeben wird.
Die Ausgangsfrequenz des VCO wird durch das Frequenzmessgerät gemessen. Dieser Schaltkreis sorgt für eine bedeutsam verbessernde Frequenzstabilität, und Frequenzänderungen von weniger als 1 Hz der Resonanzfrequenz von 200 bis 300 kHz können gemessen werden.
Ein tatsächlicher Schaltkreis für einen PLL-VCO 1 ist in 5 angegeben. IC1 ist ein VCO mit einer sinusförmigen Ausgabe, die über den Bereich von etwa 18 kΩ bis 38 kΩ variiert werden kann, wobei 10 kΩ als Voreinstellung verwendet wird. Die Ausgabe des VCO wird über einen 10 kΩ Widerstand dem LC-Schaltkreis zugeführt. OP1 ist ein Komparator, der aus der sinusförmigen Welle an dem Ausgang des VOC's eine Rechteckwelle gewinnt und IC2 steuert, ein D-Flip-Flop. Die sinuswellenförmige Spannung über dem LC-Schaltkreis wird über einen Pufferverstärker (OP2) mit hoher Eingangsimpedanz zu einem zweiten Komparator (OP3) und einem Flip-Flop (IC3) übertragen. Die Flip-Flops in Verbindung mit den NAND-Gattern (IC4) und die Dioden D1 und D4 bilden einen auf Flanken ansprechenden phasenempfindlichen Detektor für negative Phasenverschiebungen (Typ III). Das ±ve Gleichstromfehlersignal am Ausgang des PSD (engl.: phase sensitive detector) wird durch OP4 verstärkt, der ein Tiefpassfilter mit starker Verstärkung ist (f_3dB = 16 Hz). Um den Verriegelungsprozess nach dem Einschalten zu beschleunigen, wird das Fehlersignal durch die Dioden D3 und D4 auf etwa ±0,6 V begrenzt. Die Schleife wird geschlossen, indem das Gleichstromfehlersignal über einen Pufferverstärker (OP5) zu dem VCO zurück geführt wird.
Um den Schaltkreis einzustellen, ist es erforderlich, zuerst einen Näherungswert der Resonanzfrequenz des LC-Schaltkreises unter Verwendung der Gleichung (4) zu berechnen (dieser Wert muss in dem Ausgangsfrequenzbereich des VCO liegen). Die Voreinstellung wird nun angepasst, bis die Frequenz der Ausgabe von IC1 etwa der des berechneten Werts entspricht. Es gibt einen Anpassungsbereich der Voreinstellung, in dem eine geringe Änderung der Ausgangsfrequenz vorliegt. Dies zeigt, dass der PLL auf die Resonanzfrequenz des LC-Schaltkreises synchronisiert ist.
Die Leistung des in 3 gezeigten PLL-Schaltkreises wurde anfänglich untersucht, indem Proben verwendet wurden, die relativ große Anzahlen von PMPs in Suspension enthalten. Die Probe mit bekannten Konzentrationen an in Pufferlösungen suspendierten PMPs' (0, 1,03, 2,11, 4,19, 6,22 und 8,21 mg/ml) wurden verwendet. Die Proben waren in versiegelten zylindrischen Kunststoffflaschen, 30 mm im Durchmesser und 47 mm hoch, enthalten. Die Flaschen enthielten 20 ml Suspension. Die Flaschen wurden kräftig geschüttelt, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten, und dann in der an den Phasenregelschaltkreis (5) angeschlossenen Spule (50 Windungen von 24 lackierten SWG-Kupferdraht, Induktivität ≈ 75 μH) angeordnet und die Oszillationsfrequenz wurde gemessen. Die Probenflasche wurde nun entfernt und der Anstieg in der Frequenz vermerkt. Das Experiment wurde für alle Flaschen 10 mal wiederholt und der Unterschied bei den zwei abgelesenen Werten gegenüber der Konzentration an Teilchen in den Flaschen, wie in 4 gezeigt, aufgezeichnet.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass der Abfall der Resonanzfrequenz des abgestimmten LC-Schaltkreises unmittelbar mit der Anzahl an Teilchen in Suspension in der Flasche in Beziehung steht, wie dies durch Gleichung (6) vorhergesagt ist. Dieses Verfahren stellte sich als sehr zuverlässig heraus und es war möglich, die Konzentration an Teilchen in einer ungekannten Flasche mit einer Genauigkeit von mehr als 1% zu bestimmen.
Eine weitere wichtige Feststellung aus dieser Arbeit bestand darin, dass, auch wenn der Oszillatorschaltkreis eine gute Kurzzeitstabilität hinsichtlich der Oszillation aufwies, es weiterhin eine Langzeitfrequenzdrift gab, die hauptsächlich durch Änderungen der Induktivität in der Spule verursacht waren, wenn sich die Umgebungstemperatur ändert. Im Verlauf eines Tags könnten Änderungen der Raumtemperatur bewirken, dass die Grundlinienfrequenz um mehr als ±50 Hz abweicht. Es wurde jedoch festgestellt, dass dies nur eine geringe Auswirkung auf die Änderungen in der Frequenz hat, die erzeugt werden, wenn die Probe von der Spule entfernt wurde. Das folgende Messverfahren wurde daher angepasst, um diese Beobachtung zu nutzen:

• Führe die Probe in die Spule ein;
• Messe die Frequenz;
• Entferne die Probe schnell von der Spule; und
• Messe die Frequenz erneut und zeichne den Frequenzanstieg auf.

Vorausgesetzt, dass die Änderung der aufgezeichneten Frequenz größer als die Drift der Grundlinienfrequenz über den Messzeitraum ist, waren daher dann die erhaltenen Ergebnisse unabhängig von der Grundlinienfrequenz. Dieses Vorgehen beseitigt größtenteils jegliche Wirkungen der Temperatur auf die Ergebnisse. Eine ausgefeilte Temperatursteuerung der elektronischen Schaltkreisanordnung und der Spule ist daher nicht erforderlich, was ein wichtiger Gesichtspunkt bei einem tragbaren, batteriegetriebenen Instrument ist, bei dem ein temperaturgesteuertes Gehäuse eine relativ viel Leistung verbrauchen würde.
Die beste Gesamtleistung bei der Spule L in dem PLL-Schaltkreis von 3 und einer Probenflasche, die die paramagnetischen Teilchen (PMPs) enthält, wird erhalten, wenn die Spule L:

• innere Abmessungen aufweist, die gerade groß genug sind, um die Probe aufzunehmen, so dass der Anteil an totem Raum auf einem Minimum gehalten wird;
• steif ist; und
• zwischen etwa 200 bis 300 kHz in Resonanz tritt.

Das System kann verwendet werden, um Messungen einer Anzahl an PMPs, die an ein Substrat gebunden sind, durchzuführen, wie es zum Beispiel bei dem Verfahren zur Immunanalyse auftritt.
In diesem Fall wurde unter Verwendung des gleichen, wie zuvor beschriebenen Betriebsverfahrens ein Kunststoffstreifen mit einer unbekannten Anzahl an PMPs in der Spule angeordnet und die Oszillationsfrequenz des Schaltkreises wurde aufgezeichnet. Wenn der Streifen schnell von der Spule entfernt worden ist, wurde ein Anstieg der Frequenz beobachtet, der verwendet werden kann, um eine Angabe der Anzahl an PMPs auf dem Streifen zu bestimmen.
Eine Kalibrierung des Systems wurde dann durchgeführt, indem eine Anzahl an Substraten, die in diesem Fall solche Kunststoffstreifen waren, die bei einem Verfahren zu Immunanalyse verwendet werden würden, mit einer bekannten Anzahl an PMPs darauf hergestellt wurden. Diese wurden dann verwendet, um die Frequenzänderung zu bestimmen, die sich für eine vorgegebene Anzahl von Teilchen ergibt.
Die verwendeten Teilchen waren Dynal M-280, die einen Durchmesser von 2,8 μm haben. Die Konzentration an Teilchen in einer Probe wurde ermittelt, indem die Anzahl an Teilchen in einem bekannten Volumen gezählt wurde. Dies wurde unter Verwendung eines New-Neubauer-Hämocytometers erreicht, das kalibrierte, in einen Glasträger geätzte Quadrate mit bekannter Tiefe aufwies. In Kenntnis der Konzentration wurde die Anzahl an Teilchen, die auf den Kunststoffstreifen aufgebracht war, berechnet. Die Teilchen wurden auf dem Kunststoffstreifen getrocknet. Einige Standards mit Anzahlen an Teilchen im Bereich von 3,33 × 10⁶ bis 1,68 × 10⁵ wurden hergestellt und verwendet, um die Antwort des Instruments zu kalibrieren.
Die Antwort des PLL-Schaltkreises von 3 auf die standardisierten Kunststoffstreifen unter Verwendung einer grundlegenden Spulenkonfiguration wurde ermittelt. Das verwendete Verfahren war wie zuvor beschrieben. Ein Teststreifen mit einer bekannten Anzahl an PMPs darauf wurde in die Spule L eingebracht und die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises wurde gemessen. Die Probe wurde dann von der Spule L entfernt und die Resonanzfrequenz wurde erneut gemessen. Die Änderung der Resonanzfrequenz wurde aufgezeichnet. Das Experiment wurde zehnmal unter Verwendung des gleichen Teststreifens wiederholt. Das Experiment wurde unter Verwendung der anderen Teststreifen wiederholt. Die Ergebnisse sind in einer grafischen Darstellung der Anzahl an PMPs gegenüber der Änderung der Resonanzfrequenz gezeigt, wie in 6.
Die Ergebnisse sind auf logarithmischen Achsen mit einer optimalen geraden Linie aufgetragen, die unter Verwendung linearer Regression ermittelt wurde. Die Punkte zeigen den Mittelwert der Ablesewerte für jede Probe und die Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwerts dar. Der PLL-Schaltkreis wies eine gute lineare Antwort auf die ansteigende Anzahl an Teilchen auf den Teststreifen, wie durch Gleichung (6) vorhergesagt, mit einer Empfindlichkeit von 0,16 Hz/10⁵ Teilchen auf.
Einige der Streuungen der Ergebnisse können dem Umstand zugerechnet werden, dass die Proben nicht an exakt der gleichen Stelle auf allen Teststreifen abgeschieden waren und dass die Proben in der Spule nicht immer an genau der gleichen Stelle für jede Messung angeordnet wurden.
Um das System zu verbessern, wurden jedoch kleinere Spulen verwendet, um zu versuchen, den toten Raum innerhalb der Spulen zu verkleinern und so die Empfindlichkeit der Spule L in dem PLL-Schaltkreis von 3 zu erhöhen. Es wurde festgestellt, dass die optimale Spule eine Zylinderspule mit einer ovalen Querschnittsform ist, in die die bei dem Immunanalyseverfahren verwendete Probensubstrate gerade passen.
Diese können unter Verwendung des folgenden Verfahrens auf einfache Weise aufgebaut werden:

• Wickle 4–6 Schichten eines PTFE-Installateurgewindebands um einen freien Kunststoffstreifen;
• Wickle die Spule auf der Oberseite des PTFE-Bands;
• Beschichte die Spule mit einer dicken Schicht schnell verfestigendem Araldit;
• Lasse das Araldit hart werden;
• Ziehe vorsichtig an dem Kunststoffstreifen, um ihn aus der Spule zu entfernen; und
• Ziehe das PTFE-Band aus dem Inneren der Spule heraus.

Das Ergebnis ist eine starre Spule mit inneren Abmessungen, die gerade groß genug sind, um die Testsreifen aufzunehmen. Eine dünne Schicht Araldit kann auch auf die Innenseite der Spule aufgetragen sein, um den Draht vor einer unerwünschten Beschädigung zu schützen.
Die Induktivität einer Spule steigt mit dem wirksamen Querschnittsbereich der Spule und der Anzahl an Windungen in der Spule an. Eine Verkleinerung des Querschnittsbereichs der Spule bedeutet, dass die Anzahl an Windungen in der Spule ansteigen muss, um eine Spule mit der benötigten Induktivität herzustellen. Dementsprechend wird die Länge der Spule vorzugsweise gerade etwas größer als die Länge der Probe hergestellt. Dies bedeutet, dass der Draht sehr dünn sein muss, ansonsten wird eine sehr dicke Spule mit mehreren Schichten erzeugt.
Dementsprechend wurde, wie in 7 gezeigt, eine Spule L mit einem ovalen Querschnitt von 2,5 × 7 mm und einer Länge von 7 mm hergestellt. Die Spule wurde unter Verwendung des verfügbaren dünnsten lackierten Kupferdrahts (42 SWG) gewickelt. Vier Drahtschichten wurden verwendet und für die fertiggestellte Spule ergab sich L = 131 μH und R = 17,18 Ω. Die Spule trat bei 217 kHz mit einer Kapazität von C = 3,3 nF parallel dazu in Resonanz.
Die Spule wurde in dem PLL-Schaltkreis von 3 wie oben beschrieben überprüft. Die Ergebnisse sind in der grafischen Darstellung von 8 gezeigt.
Bei Verwendung mit dem PLL-Schaltkreis wies diese Spulenanordnung auch eine gute lineare Antwort mit einer verglichen mit dem vorherigen Spulenaufbau verbesserten Empfindlichkeit von etwa 0,4 Hz/10⁵ Teilchen auf dem Teststreifen auf. Die Fehlerbalken waren ebenfalls kleiner, was zeigt, dass der Schaltkreis im allgemeinen stabiler war. Die Empfindlichkeit dieser Spulenanordnung könnte weiter verbessert werden, indem die Spule kleiner hergestellt wird, so dass es noch weniger toten Raum zwischen der Spule und der Probe gibt. Kleinere Spulen würden einen noch dünneren Draht als den 42 SWG benötigen, der bei diesem Aufbau verwendet wurde. Spulen manuell genau zu wickeln, ist mit einem solchen dünnen Draht schwierig, so dass eine Art maschineller Wicklung erforderlich wäre.
Jüngste Beobachtungen weisen darauf hin, dass die bei dem Spulenaufbau verwendeten Komponenten eine niedrige dielektrische Konstante aufweisen sollten, um den Q-Wert des abgestimmten Schaltkreises 4 zu erhöhen.
Eine weitere Entwicklung des Spulenaufbaus ist in 9 gezeigt. Diese umfasst einen Ferrit-Ring 20, um den eine Wicklung 22 gewickelt ist. Ferrite sind elektrische Isolatoren, die sehr hohe magnetische Permeabilitäten aufweisen können und die bei sehr hohen Frequenzen arbeiten können. Dies bedeutet, dass eine Spule mit einem Ferritkern eine relativ geringe Anzahl an Windungen erfordert, um eine hohe Induktivität zu erreichen.
Der Ferritring 20 weist einen Spalt 21 auf, der eine Dicke von etwa 1 mm hat. Der Spalt zwischen den zwei Enden des Ferrits ist so klein, dass nur wenig des von der Spule erzeugten elektromagnetischen Felds verloren geht und es durch einen in dem Schlitz angeordneten Probenstreifen hindurch geht. Wie bei vorherigen Beispielen erhöht das Vorhandensein von paramagnetischen Teilchen in der Probe die Induktivität der Spulen und dementsprechend kann diese Konfiguration als die Spule L in dem abgestimmten Schaltkreis 4 verwendet werden. Es wurde erneut eine Überprüfung des Systems durchgeführt, wobei die Ergebnisse in der in 10 gezeigten grafischen Darstellung aufgetragen sind. In diesem Fall wies der Ring folgende Abmessungen auf: Außendurchmesser = 23,6 mm; Innendurchmesser = 13,4 mm und Höhe = 7,6 mm. Eine Spule mit 120 Windungen eines 40 SWG lackierten Kupferdrahts war auf den Ring gewickelt und mit einer dicken Schicht Araldit beschichtet (L = 880 μH, R = 4,6 Ω und f₀ = 206 kHz mit C = 680 pF).
Eine gute lineare Antwort auf die Anzahl an Teilchen wurde erreicht, wenn die Spule in dem PLL-Schaltkreis von 3 verwendet wurde. Die Empfindlichkeit der Spule betrug etwa 0,3 Hz/10⁵ Teilchen, was weniger empfindlich als die ovale Spulenkonstruktion von 7 ist. Die Leistung dieser Spulenanordnung könnte jedoch verbessert werden, indem ein Ferritmaterial verwendet wird, das besser an diese Anwendung angepasst ist und einen schmaleren Schlitz aufweist, der gerade breit genug ist, um die Proben aufzunehmen (etwa 0,25 mm).
Eine vollständig flache Spule die auf einer kreisförmigen oder quadratischen Spiralanordnung (11A und 11B) basiert, kann ebenfalls verwendet werden. Diese Auslegung weist gegenüber zuvor beschriebenen Anordnungen einige Vorteile auf. Die Spule kann in engem Kontakt mit der Probe angeordnet werden, wobei dadurch der tote Raum zwischen der Probe und der Spule reduziert wird, und reproduzierbare Spulen können unter Verwendung von photolithografischen oder vergleichbaren Verfahren in Masse hergestellt werden. Wenn zwei Spulen in Reihe angeschlossen und einander gegenüberliegend mit der Probe zwischen diesen angeordnet sind, dann würde das Vorhandensein paramagnetischer Teilchen in der Probe die Induktivität des Paars erhöhen.
Wie zuvor festgestellt, werden die Spulen im allgemeinen bei Frequenzen zwischen 200 bis 300 kHz betrieben. Durch Überprüfung wurde festgestellt, dass dies der beste Betriebsfrequenzbereich ist, wenn der Schaltkreis mit Flaschen verwendet wurde, die eine große Anzahl an PMPs suspendiert in wässriger Pufferlösung enthalten. Das Vorhandensein von Wasser macht die Schaltkreise jedoch weniger stabil, wenn sie bei höheren Frequenzen betrieben werden.
Es ist festgestellt worden, dass es besser ist, bei viel höheren Frequenzen zu arbeiten. 12 zeigt die Antwort des Schaltkreises mit der bei 529 kHz betriebenen ovalen Spule.
In diesem Fall wurde die Empfindlichkeit auf 1,2 Hz/10⁵ Teilchen verglichen mit 0,4 Hz/10⁵ Teilchen erhöht, wenn die Spule bei 217 kHz betrieben wurde. Dieses allgemeine Verfahren würde eine verbesserte Empfindlichkeit bei noch höheren Frequenzen demonstrieren. Der VCO-Schaltkreis von 5 ist jedoch nicht in der Lage, bei Frequenzen viel höher als 519 kHz aufgrund von Leistungseinschränkungen einiger der verwendeten Komponenten zu arbeiten. Um ihn bei höheren Frequenzen zu betreiben, ist es erforderlich, den Schaltkreis zu modifizieren, indem Komponenten verwendet werden, die bei diesen Frequenzen arbeiten können.
Um die praktische Verwendung des Detektors für paramagnetische Teilchen zu demonstrieren, wurden unter Verwendung von PMPs als Markierung ein Modellanalysesystem entwickelt. Dies basierte auf einer doppelten Antikörper-Sandwich-Analyse für Transferrin. Die Modellanalyse wurde so entwickelt, dass die Immunreaktion auf der Oberfläche eines Kunststofffilms auftrat und das Testgebiet auf einfache Weise in den Detektor eingebracht worden konnte. Die Markierung, die verwendet wurde, um den immobilisierten Immunkomplex zu detektieren, war ein PMP, das mit einem geeigneten Antikörper beschichtet war. Dies ist in 13 schematisch gezeigt.
Die Konzentration der unterschiedlichen Antikörperschichten wurde optimiert, um über den Arbeitstransferrinkonzentrationsbereich eine maximale Antwort zu erhalten. Eine Dosierungsantwort wurde für die Modellanalyse erzeugt, wobei die Anzahl an Teilchen sowohl durch manuelles Zählen unter Verwendung eines Mikroskops als auch unter Verwendung des Detektors quantifiziert wurde.
Frühere Ergebnisse zeigen, dass die oberen Bereiche der Transferrindosierungsantwortkurve (etwa 1,3 × 10⁵ Teilchen) in dem unteren Kalibrierungsbereich des magnetischen Detektors liegen und es eine gute Übereinstimmung zwischen der Anzahl an gebundenen PMPs auf dem Streifen, die durch manuelles Zählen bestimmt wurde, und der Anzahl gibt, die unter Verendung des magnetischen Detektors ermittelt wurde.

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Anzahl magnetischer Teilchen in einer Probe unter Verwendung eines abgestimmten Schaltkreises mit einer Kapazität (C) und einer Spule (L), wobei das Verfahren umfasst: a. Bestimmen des Unterschieds in der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises, wenn die Probe einem von der Spule (L) erzeugten Magnetfeld ausgesetzt ist und wenn die Probe dem von der Spule (L) erzeugten Magnetfeld nicht ausgesetzt ist; und b. Verwenden des Unterschieds in der Resonanzfrequenz, um die Anzahl magnetischer Teilchen in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Schritt (a) umfasst: i. Aussetzen der Probe dem von der Spule erzeugten Magnetfeld (L); ii. Bestimmen der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises; iii. Entfernen der Probe aus dem von der Spule erzeugten Magnetfeld (L); und iv. Bestimmen der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Schritt, die Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises zu bestimmen, umfasst: a. Anlegen eines Steuersignals an den abgestimmten Schaltkreis; b. Messen des Phasenunterschieds zwischen dem Steuersignal und einem von dem abgestimmten Schaltkreis erhaltenen Ausgangssignal; und c. Einstellen der Frequenz des angelegten Signals, bis kein Phasenunterschied zwischen dem angelegten Signal und dem Ausgangssignal vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Steuersignal eine Frequenz oberhalb von 200 kHz hat.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die magnetischen Teilchen PMPs umfassen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die Spule (L) eine Zylinderspule, eine Ringspule oder eine Flachspule ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem, wenn die Spule (L) eine Zylinderspule ist, das Verfahren, die Probe dem Magnetfeld auszusetzen, umfasst, die Probe innerhalb der Zylinderspule anzuordnen.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem, wenn die Spule (L) eine Flachspule ist, das Verfahren umfasst, die Probe benachbart zu der Flachspule anzuordnen.
Verfahren zum Durchführen einer Bindungsanalyse, wobei das Verfahren umfasst: a. Immobilisieren einer Molekülschicht auf einem Substrat; b. Bereitstellen einer Anzahl magnetischer Teilchen als Markierungen; c. Durchführen einer Reaktion unter Verwendung der Molekülschicht, um wenigstens einige der magnetischen Teilchen an dem Substrat zu binden; und d. Bestimmen der Anzahl an dem Substrat gebundener magnetischer Teilchen durch Bestimmen des Unterschieds in der Resonanzfrequenz eines abgestimmten Schaltkreises, wenn das Substrat einem von der Spule (L) erzeugten Magnetfeld ausgesetzt ist und wenn das Substrat dem von der Spule (L) erzeugten Magnetfeld nicht ausgesetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die magnetischen Teilchen an einer entsprechenden Anzahl zweiter Moleküle gebunden werden und bei dem die Reaktion zweite Moleküle mit der Molekülschicht verbindet, um die magnetischen Teilchen an dem Substrat zu binden.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem Bindungsanalyse ein Immunanalyse ist, die Molekularschicht eine Antikörper/Antigen-Schicht ist und die zweiten Moleküle Antigene oder Antikörper sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem das Substrat einen Kunststoffstreifen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem die Spule (L) eine Zylinderspule, eine Ringspule oder eine Flachspule ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem das Verfahren, die Anzahl magnetischer Teilchen zu bestimmen, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Vorrichtung zur Bestimmung der Anzahl magnetischer Teilchen in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfasst: a. einen abgestimmten Schaltkreis mit einer Kapazität (C) und einer Spule (L); b. einen Treiber (1), der ein Steuersignal zum Ansteuern des abgestimmten Schaltkreises erzeugt; und c. einen Detektor (2, 3) zum Detektieren der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises; dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied in der Resonanzfrequenz des abgestimmten Schaltkreises, wenn die Probe einem von der Spule (L) erzeugten Magnetfeld ausgesetzt ist und wenn die Probe dem von der Spule (L) erzeugten Magnetfeld nicht ausgesetzt ist, die Anzahl magnetischer Teilchen in der Probe angibt.
Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der der Detektor einen Phasenkomparator (3) umfasst, um den Phasenunterschied zwischen dem Steuersignal und einem von dem abgestimmten Schaltkreis erhaltenen Ausgangssignal zu bestimmen.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, bei der der Treiber einen spannungsgesteuerten Oszillator (1) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wenn von Anspruch 16 abhängig, bei der der spannungsgesteuerte Oszillator (1) auf den Phasenkomparator (3) anspricht, um die Frequenz des Steuersignals zu ändern, bis kein Phasenunterschied vorliegt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, bei der die Vorrichtung einen Phasenregelkreis-Oszillatorschaltkreis bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, bei dem die magnetischen Teilchen PMPs sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, bei der die Spule (L) eine Zylinderspule, eine Ringspule oder eine Flachspule ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der, wenn die Spule (L) eine auf einer im Wesentlichen flachen Oberfläche ausgebildete Flachspule ist, die Probe benachbart zu der Spule angeordnet ist, um die Probe dem Magnetfeld auszusetzen.
Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der, wenn die Spule (L) eine Zylinderspule ist, die Probe innerhalb der Spule angeordnet ist, um die Probe dem Magnetfeld auszusetzen.
Vorrichtung nach Anspruch 23, bei der die Zylinderspule einen ovalen Querschnitt hat.
Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der, wenn die Spule (L) eine Ringspule ist, die Probe in einem Spalt in dem Ring angeordnet ist, um die Probe dem Magnetfeld auszusetzen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 25, bei der das Steuersignal eine Frequenz oberhalb von 200 kHz hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, durchgeführt unter Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 26.