DE60112276T2

DE60112276T2 - Elektrophoretische trennung von verbindungen

Info

Publication number: DE60112276T2
Application number: DE60112276T
Authority: DE
Inventors: D. Michel FAUPEL; H. Hubert GIRAULT; Frederic Reymond; Alexandra Ros; Stephane Joel ROSSIER
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2021-05-05
Also published as: GB0010957D0; AU6745501A; US20030104449A1; DE60112276D1; JP2003532894A; JP4754759B2; US7615354B2; EP1281073B1; EP1281073A1; AU2001267455B2; WO2001086279A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die elektrophoretische Trennung, Reinigung und Gewinnung von Verbindungen aus Lösung.
Allgemeiner Stand der Technik
Komplexe Gemische wie biologische Proben können bis zu 30.000 unterschiedliche Proteine enthalten, die für die weitere Analyse getrennt und identifiziert werden müssen. Bei der Proteomanalytik ist für die hochauflösende Trennung von komplexen Proteingemischen die Entwicklung von neuen Techniken erforderlich, die die Trennzeiten auf ein Minimum reduzieren, leicht handzuhaben sind, zu hoher Reinheit führen und die weitere Analyse der interessierenden Verbindung(en), die aus der Probe extrahiert wird/werden, ohne überflüssige zusätzliche Aufreinigungsschritte gestatten.
Bei der 2D-Gelelektrophorese handelt es sich um eine der Techniken, mittels welcher solche komplexen biologischen Proben getrennt werden können (Wilkins, M. R. et al., Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics; Springer, 1997). Bei der 2D-Gelelektrophorese werden die Proteine erst entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt durch eine isoelektrischen Fokussierung (IEF) getrennt. In einem zweiten Schritt werden die Proteine in Abhängigkeit ihres Molekulargewichts mittels einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Als Ergebnis erhält man ein Bild, in dem jeder sichtbare Fleck einem bestimmten Protein entspricht. Ist die weitere Analyse eines Proteins erwünscht, zum Beispiel die Analyse der Peptidzusammensetzung oder der biologischen Wirksamkeit, so muß das Protein erst aus der Gelmatrix extrahiert werden und kann erst dann mit der entsprechenden Methode analysiert werden, um zu der erwünschten Information zu gelangen.
Für die Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-2D-Gel sind Methoden entwickelt worden, wobei eine solche Methode darin besteht, daß man den Proteinfleck aus dem Gel herausschneidet und in einem nasschemischen Schritt extrahiert. Bei dieser Technik ist es sehr wahrscheinlich, daß das Protein während seiner Gewinnung denaturiert wird, modifiziert wird oder sogar verloren geht. Eine andere Technik ist das Elektroblotting, das sehr zeitaufwendig ist.
Sobald ein Protein aus dem Gel extrahiert ist, ist die effizienteste Analysetechnik die Massenspektrometrie. Mit dieser Technik kann man nicht nur die Peptidzusammensetzung von Proteinen analysieren, sondern auch die erhaltene Peptidkarte mit anderen Proteindaten, die von verschiedenen Bioinformatik-Institutionen in Datenbanken zusammengestellt werden, vergleichen. Bei der Massenspektroskopie (MS) ist die Reinheit einer Probe kritisch. Enthält eine Probe Verunreinigungen wie Salz, kann sie nicht direkt einer MS-Analyse unterzogen werden. Solch eine Probe müsste vor der MS-Analyse zum Beispiel durch Dialyse entsalzt werden. Eine weitere Möglichkeit, unerwünschte Verbindungen in der Probe zu vermeiden, besteht in der Verwendung der direkten Laser-Desorptionstechnik aus dem 2D-Gel (Ogorzalek Loo R. R., et al., Analytical Chemistry, 1996, 68, 1910–1917) oder eines Elektroblot-2D-Gel (Eckerskorn, C. et al., Analytical Chemistry, 1997, 69, 2888–2892; Strupat, K. et al., Analytical Chemistry, 1994, 66, 464–470). Alle diese zusätzlichen Aufreinigungsschritte verkomplizieren den Analysegang und sind zeitaufwendig.
Obwohl eine Trennung von Verbindungen in komplexen Gemischen mittels 2D-Gelelektrophorese möglich ist, besteht noch immer das Problem der zahlreichen Verunreinigungen, die mit den für die Analyse erwünschten Verbindungen verbleiben und deren Entfernung arbeitsaufwendig ist. Das Hauptproblem bei der 2D-Gelelektrophorese besteht darin, daß die interessierende Verbindung in einem Gel festgelegt ist und vor ihrer Analyse extrahiert und weiter aufgereinigt werden muß.
Ein weiteres Verfahren zur Trennung von komplexen biologischen Proben ist die isoelektrische Trennung, zum Beispiel mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) (Righetti, P. G., J. Biochem Biophys Methods, 1988, 16: 99–108). Bei der IEF handelt es sich um eine Elektrophoresetechnik, mit der Verbindungen innerhalb eines pH-Gradienten aufgrund ihrer Ladung getrennt werden können. Im allgemeinen gibt es zwei Haupttypen von Systemen der isoelektrischen Fokussierung: (i) trägerfreie gepufferte Systeme sowie (ii) immobilisierte gepufferte Systeme.
(i) trägerfreie gepufferte Systeme
Alle trägerfreien Systeme beruhen auf der Verwendung eines Puffers, üblicherweise Trägerampholyte oder isoelektrische Puffer wie Aminosäuren. So wurde zum Beispiel ein kontinuierliches trägerfreies Gerät von Soulet, N. et al. (Electrophoresis, 1998, 19, 1294–1299) gezeigt. Bei diesem Gerät wird in einer flachen Kammer ein pH-Gradient mit Trägerampholyten und im rechten Winkel zur Richtung des Trägerflusses ein Potentialgradient geschaffen. Die Probe wird kontinuierlich eingespritzt und am Ende des Geräts in Trennfraktionen aufgeteilt. Obwohl der pH-Gradient über mehrere Stunden stabil war, ließ sich keine vollständige Trennung von Rinderserumalbumin und alpha-Lactalbuminerzielen. Einige Hauptnachteile dieses Systems bestehen darin, daß es nicht zur Trennung von Verbindungen mit nahe beieinander liegenden pI-Werten fähig ist, dass für die Trennung mehrere Stunden benötigt werden, sowie darin, daß Trägerampholyte verwendet werden, die entfernt werden müssen, bevor eine weitere Analyse der gewünschten Verbindungen möglich ist.
Bei der isoelektrischen Split-Flow Thin (SPLITT) Fraktionierung wird kein pH-Gradient geschaffen, sondern das Trennungsprinzip beruht auf der Ladung, die Proteine je nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) in Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten aufweisen. An eine Durchflußzelle wird ein Potential angelegt, wobei man entsprechende Eingangs- und/oder Ausgangs-Splitter verwendet, um die Proteinfraktionen zu trennen. Zwei-Komponenten-Proteinmischungen sind erfolgreich getrennt worden (Fuh, C. B. und Giddings, J. C., Separation Science and Technology, 1997, 32, 2945–2967), dieses System weist jedoch einige Nachteile auf, wenn komplexe Proteinmischungen zu analysieren sind und wenn die isoelektrischen Punkte (pI) der Proteine sehr nahe beieinander liegen (pI-Unterschiede von weniger als 0,1 pH können mit diesem Verfahren nicht getrennt werden).
Viele umwälzende isoelektrische Systeme beruhen auf der physikalischen Trennung von Kompartimenten mit unterschiedlichen pH-Werten mittels Membranen oder Abschirmungen. Einige davon sind in der Literatur in einem Übersichtsartikel beschrieben (Bier, M. Electrophoresis, 1998, 19, 1057–1063; Krivankova, L. et al., Electrophoresis, 1998, 19, 1064–1074). Einer der häufigsten präparativen Ansätze für die umwälzende trägerfreie Elektrophorese ist das Rotofor-Gerät, das von BioRad vertrieben wird. In einem röhrenförmigen Gerät, wo Kompartimente durch ein Abtrennungsmaterial definiert sind, wird der pH-Gradient mit speziellen Ampholyten, den sogenannten Rotolyten, geschaffen. Schwerkraftprobleme bei der trägerfreien Elektrophorese werden durch ein Rotieren der Trennkompartimente gelöst. Dieses Gerät wurde erfolgreich im präparativen Maßstab angewandt. Eine Modifikation dieses Ansatzes ist das tangential arbeitende Elektrophoresegerät von Bier ( US 5540826 ). Hier werden die unterschiedlichen Kompartimente so angeordnet, daß eine Multi-Kanal-Anordnung von einer zweiten Multi-Kanal-Anordnung, die ein wenig durch eine einzelne Abtrennung verdrängt ist, getrennt ist. Ein elektrisches Feld wird im rechten Winkel zu den Kanälen angelegt, wodurch ein elektrophoretischer serpentinenartiger Pfad durch die Kanäle ermöglicht wird. Der pH-Wert in den Kanälen ist durch Ampholyte fixiert, und ein Umwälzen ist mit unabhängigen Eingangs- und Ausgangsöffnungen bei jedem Kanal möglich. Die Hauptnachteile dieses Systems sind, daß das Gerät eine komplizierte Multi-Kanal-Konstruktion aufweist, durch die die Lösung fließen muß, und daß die interessierende(n) Verbindung(en) in einer Ampholytenlösung verbleibt/verbleiben, die entfernt werden muß, bevor eine weitere Analyse der gewünschten Verbindung(en) möglich ist.
Bei den meisten Systemen mit gepufferter Lösung wird der Analyt mit einem Laufpuffer vermischt, und die Handhabung der Flüssigkeit erfolgt nach mehreren Strategien, um entweder die Lösung zu fraktionieren oder zu entsalzen oder um in einem nichtkonvektiven Medium und/oder einem Medium mit geringer Wasserdiffusion zu arbeiten. Alle diese Geräte für die isoelektrische Fokussierung weisen in Bezug auf die weitere Analyse der Verbindungen einen wesentlichen Nachteil auf. Sie enthalten alle eine gewisse Menge an unerwünschten Puffersubstanzen oder Ampholyten in der abgetrennten Endfraktion.
(ii) immobilisiertes Puffersystem
Bei den meisten immobilisierten Puffersystemen besteht ein wesentlicher Nachteil bei der weiteren Analyse der Verbindungen, da die abgetrennte Endfraktion in einem Gel oder einer Membran gefangen ist.
Es existiert ein von Righetti und Faupel (Righetti, P. G. et al. Journal of Chromatography, 1989, 475, 293–309) entwickeltes Gerät, das auf der unter der Bezeichung „segmentierte immobilisierte pH-Gradienten" bekannten Technik beruht. Das Gerät besteht aus Mehrfachkompartimenten, die durch isoelektrische Immobilin-Membranen abgetrennt, zwischen einem anodischen und einem kathodischen Reservoir eingeschlossen sind, wodurch die Proteine in einer ampholytenfreien Lösung gewonnen werden können. Dieses Gerät kann aus mehreren Kompartimenten, die durch mittels Membranen stabilisierte Immobilin-Gele getrennt sind, bestehen. Die Trennung von Fraktionen erfolgt dadurch, daß das Protein aufhört, in einem elektrischen Feld zwischen zwei Immobilin-Membranen zu wandern, wobei eine Membran einen pH-Wert, der höher als der pI-Wert des Proteins ist, und die andere einen pH-Wert, der darunter liegt, generiert. Dieses Gerät weist weitere Nachteile auf: die Verwendung von Mehrfachkompartimenten, multiplen immobilisierten Membranen und segmentierten pH-Gradienten.
Darstellung der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Gerät, ein Verfahren und ein Kit für die Trennung von geladenen und neutralen Verbindungen sowie für die Gewinnung dieser neutralen Verbindungen in einer Lösung, bei der es sich um eine ampholytenfreie Lösung oder eine pufferfreie Lösung handeln kann, bereitzustellen. In diesem Fachgebiet besteht ein Bedarf an einem Gerät, einem Verfahren und einem Kit für die Trennung von Verbindungen in komplexen Mischungen in Kombination mit einem effizienten Verfahren für die Gewinnung von interessierenden Verbindungen, so daß diese ohne die zusätzlichen zeitaufwendigen Schritte der Extraktion und Aufreinigung, die im Stand der Technik existieren, analysiert werden können, zum Beispiel mittels Massenspektrometrie. Die hier beschriebene Erfindung kann für die Trennung von biologischen oder chemischen Verbindungen in komplexen Mischungen verwendet werden.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Gerät für die elektrophoretische Trennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen in einer Analytenlösung gemäß Anspruch 1 bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die elektrophoretische Trennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen in einer Analytenlösung, sowie die Gewinnung von abgetrennten Fraktionen mittels des erfindungsgemäßen Geräts bereit. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß interessierende Verbindungen in Lösung, sogar in ampholytenfreier oder pufferfreier Lösung, gewonnen werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trennungs- und Aufreinigungsverfahren, das sich von den Elektrophoresetechniken des Stands der Technik grundlegend unterscheidet, da die Potentialdifferenz nicht in der Analytenlösung und auch nicht zwischen der Analytenlösung und dem chemischen Puffersystem angelegt wird. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Potentialdifferenz nur durch das chemische Puffersystem (oder einen Teil davon) angelegt, und zwar so, daß ein Teil des elektrischen Felds in die Kammer, die die aufzueinigende Lösung enthält, eindringt. Der Vorteil dieses neuen Verfahrens und seines Geräts im Vergleich zu den Methoden des Stands der Technik besteht darin, daß die Auflösung der Trennung erhöht wird, die Reinigungsgeschwindigkeit aufgrund der Wanderung in Lösung anstelle eines Gels oder einer Membran erhöht wird, und eine direkte Fraktionierung für die weitere Analyse ermöglicht wird. Die Verwendung von zusätzlichen Reinigungsschritten, die bei anderen Elektrophoresegeräten und -verfahren des Stands der Technik verwendet werden, bei denen üblicherweise Trägerampholyte oder isoelektrische Puffer für die Erzeugung eines pH-Gradienten in der Analytenlösung verwendet werden, ist nicht erforderlich.
Bei der vorliegenden Erfindung kann das chemische Puffersystem in Bezug auf den pH-Wert in seinem Teil, der mit der Analytenlösung in Kontakt steht, vorteilhaft kontrolliert werden. Wenn die interessierende(n) Verbindung(en) global bei dem kontrollierten pH-Wert neutral ist/sind, kann man die gewünschte(n) Verbindung(en) von der Mischung abtrennen. Wird ein elektrisches Feld durch das chemische Puffersystem angelegt, und zwar vorzugsweise im rechten Winkel zu der Analytenlösung, so kann man zwischen geladenen Verbindungen und Verbindungen, die bei diesem pH-Wert global neutral sind, unterscheiden. Es werden nämlich die neutralen Verbindungen in Kontakt mit dem Puffersystem in der Analytenlösung zurückgehalten, während die geladenen Verbindungen in das chemische Puffersystem wandern. Auf diese Weise können Verbindungen über den pI-Wert getrennt werden, und zwar dadurch, daß man den pH-Wert des chemischen Puffersystems kontrolliert.
Die vorliegende Erfindung gestattet daher die elektrophoretische Trennung und Aufreinigung von Verbindungen, die global neutral sind, von geladenen Substanzen direkt in einer Analytenlösung, die nicht gepuffert sein muß. In manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist das Gerät eine Kammer mit einem Zufluß und einem Abfluß, die mit einem hydraulischen Fließsystem in Verbindung sind, wobei die Analytenlösung durch diese Kammer fließen kann, auf. In weiteren Ausführungsformen weist das Gerät eine Kammer auf, bei der Zufluß und Abfluß miteinander vereinigt sind, so daß ein einfacher Vorratsbehälter entsteht, der mit der zu reinigenden Mischung beschickt werden kann und von dem die gereinigte Lösung abgezogen werden kann. In weiteren Ausführungsformen können erfindungsgemäße Geräte eine Mehrzahl von Kammern für die gleichzeitige und/oder parallel durchgeführte Reinigung enthalten. Vorzugsweise fließt der elektrische Strom im rechten Winkel zu der Flußrichtung der Analytenlösung.
Bei bevorzugten Ausführungsformen weist das chemische Puffersystem einen definierten pH-Wert und einen definierten pH-Bereich auf, der sich zum Beispiel dadurch erzeugen läßt, daß man kovalent gebundene Puffermoleküle, amphotere isoelektrische Membranen oder eine beliebige Kombination von diesen verwendet. Das chemische Puffersystem gewährleistet daher die Trennung von interessierenden Verbindungen aufgrund des isoelektrischen Punkts bei einem fixen pH-Wert oder einem pH-Gradienten. Es erlaubt die Trennung von Verbindungen mit unterschiedlichen pI-Werten, zum Beispiel von Verbindungen mit pI-Unterschieden von weniger als 0,1, Verbindungen mit pI-Unterschieden von weniger als 0,01 und Verbindungen mit pI-Unterschieden von bis zu 0,001, was je nach Wunsch unterschiedliche Reinigungsgrade gestattet.
Bei dem chemischen Puffersystem kann es sich zum Beispiel um ein Immobilingel, eine Flüssigkeit, die in einer Polymermatrix, einer Glasfritte, einer porösen Membran, einem Filter oder einer beliebigen Kombination davon verfestigt ist, handeln. Dieses chemische Puffersystem dient zur Kontrolle des pH-Werts in seinem Teil, der mit der Analytenlösung in Kontakt steht, wodurch zwischen geladenen Verbindungen und Verbindungen, die bei diesem pH-Wert global neutral sind, unterschieden werden kann. Dieses chemische Puffersystem läßt sich daher für die Abtrennung von einer oder mehreren interessierenden neutralen Verbindungen von einem Gemisch, das geladene Verbindungen enthält, verwenden.
Quer zu diesem chemischen Puffersystem wird ein elektrischer Strom angelegt, und die Form der Kammer ist derart, daß der elektrische Strom bis in diese Kammer hinein eindringt und so einen Wanderstrom der geladenen Verbindungen, die in der Lösung vorliegen, erzeugt. Die Reinigungsleistung und -geschwindigkeit hängen von der Tiefe, der Breite und Länge oder dem Durchmesser der Kammer ab, und deren Geometrie kann daher entsprechend den Anwendungen und durchzuführenden Versuchen gewählt werden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß aufgrund der durch die Wanderung der geladenen Verbindungen hervorgerufenen Trennung die interessierende Verbindung direkt innerhalb der Analytenlösung fraktioniert werden kann. Auf diese Weise verläuft die Trennung wesentlich rascher als bei fachbekannten Methoden, da die Wanderungsgeschwindigkeit in Lösung wesentlich rascher ist als in anderen üblicherweise im Stand der Technik verwendeten Medien, wie Gelen oder porösen Membranen, wo der hohe Widerstand die Wanderungsgeschwindigkeit drastisch reduziert.
In manchen Fällen können die wandernden geladenen Moleküle in das chemische Puffersystem eindringen und innerhalb dieses Systems weiter wandern. Diese Wanderung hat jedoch keinen Einfluß auf die Trennung innerhalb der Analytenlösung, und das chemische Puffersystem kann als Abfalltank angesehen werden. Bei manchen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, das Adsorbieren der neutralen Verbindungen an die Wand des chemischen Puffersystems zu verhindern. Bei manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung könnten Mittel vorgesehen werden, die eine direkte Adsorption verhindern, darunter zum Beispiel eine feine Membran, bei der es sich (zum Beispiel) um ein sehr wenig poröses Material handeln kann.
In manchen Fällen kann es auch von Vorteil sein, die geladenen Moleküle, die innerhalb des chemischen Puffersystems wandern, zu gewinnen. Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Gerät vorteilhaft mehrere Unterkammern enthalten.
Bei manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann man eine Analytenlösung innerhalb der Kammer von einem Zufluß zu einem Abfluß fließen lassen. Computersimulationsversuche zeigen, daß das durch das chemische Puffersystem angelegte elektrische Feld in die Durchflußkammer eindringt, wodurch eine Wanderung der geladenen Substanzen in der Analytenlösung stattfindet (siehe Beispiele). Die Computersimulation weist nach, daß, wenn das elektrische Feld direkt zwischen den Enden der die Analytenlösung enthaltenden Kammer angelegt wird, nur ein sehr kleiner Teil der Feldlinien in das chemische Puffersystem eindringt und so die geladenen Substanzen zur Wanderung innerhalb der Analytenlösung zwingt. Diese Art der Polarisierung ist in Verfahren des Stands der Technik verwendet worden (wie in der segmentierten Gelelektrophorese), um jedoch diese Defekte zu vermeiden, wird der Strom innerhalb des elektrischen Puffersystems dadurch verstärkt, daß man die Lösung so polarisiert, daß die Ionen durch das chemische Puffersystem hindurch gezwungen werden, welches dann als Septum oder Filter, das ein Netzwerk von Lösungskompartimenten trennt, verwendet wird. Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Trennungsprinzip verwendet, das sich vom Stand der Technik grundsätzlich unterscheidet, da die Potentialdifferenz an beiden Enden des chemischen Puffersystems angelegt wird, und zwar so, daß ein Teil des elektrischen Felds in die Kammer, die die zu reinigende Lösung enthält, eindringt.
Die vorliegende Erfindung weist den Vorteil auf, daß eine einzige Kammer für die Durchführung der erforderlichen Trennung ausreicht, obwohl mehrere Kammern (oder Unterkammern) gewünschtenfalls verwendet werden können, um gleichzeitige Trennungen bei verschiedenen gewünschten pH-Werten oder parallele Trennungen bei dem gleichen gewünschten pH-Wert in dem chemischen Puffersystem durchzuführen. Weiterhin besteht bezüglich der Anzahl, den Abmessungen oder der Form der Kammern, die für den jeweiligen Anwendungszweck ohne Beschränkung der Größe, des Volumens oder der Menge angepaßt werden können, keine Einschränkung. Die erfindungsgemäßen Geräte und Verfahren können daher leicht nach oben oder unten abgeändert werden. So ist es zum Beispiel möglich, im Analysemaßstab, jedoch auch im präparativen und Pilotmaßstab oder im Downstream-Verfahren zu arbeiten.
Bei manchen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Geräte auch Mittel für die Steuerung der Temperatur des Geräts und der Analytenlösung aufweisen, insbesondere dort, wo grosse Potentialunterschiede verwendet werden.
Bei manchen bevorzugten Ausführungsformen können erfindungsgemäße Geräte Mittel zur Verhinderung des Ausfallens der interessierenden neutralen Verbindung(en) aufweisen. Bei der Reinigung verarmt die Analytenlösung an Ionen, wodurch ihre Löslichkeit absinkt. Unter diesen Bedingungen kann die Verwendung einer nichtwäßrigen Analytenlösung oder des Einbaus eines Ultraschallgeräts in das erfindungsgemäße Gerät von Vorteil sein.
Beim Betrieb von erfindungsgemäßen Geräten wandern alle Verbindungen, die bei dem von dem chemischen Puffersystem etablierten pH-Wert geladen sind, zu den Enden der Kammer, und zwar entsprechend den Feldlinien, die von der Stellung der Elektroden, der Geometrie des gesamten Geräts und der Art der Analytenlösung und des chemischen Puffersystems abhängen. Es verbleiben nur diejenigen Verbindungen in der Analytenlösung, die bei dem von dem chemischen Puffersystem definierten pH-Wert neutral sind.
Mit der vorliegenden Erfindung können alle unerwünschten Ionen, darunter Salze, geladene Säuren oder Basen, Pufferbestandteile oder Ampholyte, rasch aus einer Lösung entfernt werden. So können zum Beispiel Proteine in einer trägerfreien Lösung gereinigt und zugleich für die weitere Analyse vorbereitet werden. Ähnlich kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, um eine neutrale Verbindung aus einem Überschuß von geladenen Nebenprodukten oder Salzen zu isolieren.
Außer der Isolation von neutralen Substanzen erleichtern die erfindungsgemäßen Geräte und Verfahren auch die Gewinnung von geladenen Substanzen, die im Betrieb in das chemische Puffersystem abgeladen werden. Ein wichtiger Aspekt in der Proteomanalytik besteht zum Beispiel darin, Zugang zu selten vorkommenden Proteinen zu haben, deren Identifikation häufig durch das Vorhandensein von hochkonzentrierten Proteinen gehemmt wird. So zum Beispiel verhindert das Vorhandensein von Albumin in vielen Zellextrakten den Nachweis von Proteinen, die in niedriger Konzentration vorliegen. Bei solchen Anwendungen kann die vorliegende Erfindung zum Beispiel dazu verwendet werden, um Albumin vom Rest der Analytenlösung abzutrennen, und zwar dadurch, daß man es in ein Gel mit einem immobilisierten pH-Gradienten (IPG-Gel) ablädt. Zu diesem Zweck muß der Teil des chemischen Puffersystems, der mit der Analytenlösung in Kontakt steht, einen pH-Bereich aufweisen, der denjenigen von Albumin oder einer beliebigen sonstigen Verbindung, die vom Rest der Analytenlösung abgetrennt werden muß, umfaßt. Auf diese Weise werden alle Verbindungen der Analytenlösung, die in diesem pH-Bereich geladen sind, bei Anlegen des elektrischen Felds in das IPG-Gel extrahiert und können innerhalb dieses Gels so lange wandern, wie sie geladen bleiben, oder bis zu dem Punkt, an dem der pH-Wert des Gels ihrem pI-Wert entspricht. In solchen Fällen sind die interessierenden Verbindungen nicht nur die neutralen Verbindung(en), die nach der elektrophoretischen Reinigung in der Analytenlösung verbleiben, sondern auch – manchmal sogar hauptsächlich – die geladenen Verbindungen, die extrahiert worden sind und die innerhalb des chemischen Puffersystems gewandert sind, da diese besser als im Stand der Technik bestimmt und identifiziert werden können.
Bei einer Art der Verwendung kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, um Verbindungen in dem chemischen Puffersystem anzureichern. Bei solchen Anwendungen wird die Analytenlösung in der Kammer so erneuert, daß frische Lösung der elektrophoretischen Trennung und Reinigung zugeführt wird. Auf diese Weise lassen sich Verbindungen, die in der Analytenlösung in niedriger Konzentration vorliegen, in dem chemischen Puffersystem anreichern, wodurch sie leichter nachgewiesen und identifiziert werden können. Für Identifikationszwecke kann es auch vorteilhaft sein, wenn das chemische Puffersystem mit Mitteln für die spezifische Identifikation einer Verbindung oder Verbindungsklasse kombiniert wird. Beim Betrieb solcher Mittel kann eine Verbindung oder eine Verbindungsklasse nachgewiesen werden, und zwar zum Beispiel durch die Emission von Licht, die Absorption von Licht (wie zum Beispiel beim Blotting), der Erzeugung eines elektrisch aktiven Produkts, spezifische Erkennung von Molekülen (wie zum Beispiel bei der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes oder bei einer Enzymreaktion), bei der ein nachweisbares Produkt erzeugt wird.
Bei manchen Ausführungsformen kann das Gerät so modifiziert werden, daß die Gewinnung von geladenen Verbindungen, die von der Analytenlösung in das chemische Puffersystem extrahiert worden sind, erleichtert wird. Für diesen Zweck kann die Kammer in Unterkammern geteilt sein, von denen mindestens eine die Analytenlösung enthält. Die anderen Unterkammern können für die Gewinnung der Verbindungen, die innerhalb des chemischen Puffersystems wandern, verwendet werden und enthalten vorzugsweise eine Pufferlösung zur Festlegung des pH-Werts. Da die geladenen Verbindungen in der Richtung des elektrischen Felds wandern und ein Teil dieses elektrischen Felds in jede Unterkammer eindringt, können die geladenen Verbindungen aus dem chemischen Puffersystem in die Unterkammern zurückextrahiert werden. Diese Wanderung dauert so lange, bis die wandernden Verbindungen einen pH-Bereich des chemischen Puffersystems oder einer Unterkammer erreichen, wo sie global neutral sind. Solch eine Anordnung zeigt einen weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung, nämlich die Möglichkeit, eine beliebige in Lösung befindliche Verbindung zu gewinnen, sogar nach der Wanderung innerhalb des chemischen Puffersystems. Dies ist in Bezug auf den Stand der Technik äußerst vorteilhaft, da es die weitere Analyse solcher gewonnenen Verbindungen wesentlich erleichtert.
Die erfindungsgemäßen Geräte und Verfahren weisen zumindest die folgenden Hauptvorteile auf: (i) hohe Wiederfindungsrate von interessierenden Verbindungen direkt in Lösung, (ii) hohes Auflösungsvermögen, je nach dem pH-Intervall über den isoelektrischen Punkt (pI) der erwünschten Verbindung, (iii) rasche Trennungsgeschwindigkeit dadurch, daß die geladenen Moleküle in Lösung und nicht durch dichtere Materialien wie Gele wandern, sowie (iv) die Trennung der gewünschten interessierenden Verbindung erfolgt direkt in eine ampholytenfreie oder pufferfreie Lösung, die bequem die weitere Analyse erleichtert, ohne daß weitreichende zusätzliche Aufreinigungsschritte wie Entsalzen erforderlich sind.
Die interessierende(n) Verbindung(en) ist bzw. sind vorzugsweise biologische Verbindungen, stärker bevorzugt organische Verbindungen und am stärksten bevorzugt Proteine, Proteinderivate, Proteinisoformen, Enzyme, Antigene, Antikörper, Peptide oder Nukleinsäuren, Lipide oder Kohlenhydrate.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Kit bereit, das das erfindungsgemäße Gerät mit Anweisungen für die elektrophoretische Trennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen in einer Analytenlösung sowie gegebenenfalls die Chemikalien, die mit der Analytenlösung zu vermischen oder zu verwenden sind, um die Aufreinigung der gewünschten Verbindung(en) zu verbessern, umfaßt. Mit solch einem Kit läßt sich die interessierende Verbindung bzw. lassen sich die interessierenden Verbindungen in Lösung gewinnen.
Bei der interessierenden Verbindung kann es sich um eine beliebige biologische oder chemische Verbindung handeln, die bei dem von dem chemischen Puffersystem, das mit der Analytenlösung in Kontakt steht, definierten pH-Wert bzw. pH-Intervall neutral ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der interessierenden Verbindung um eine ionisierbare biologische Verbindung wie ein Protein, ein Enzym, ein Peptid oder eine Verbindung, die einen Peptid- oder Proteinrest enthält, wie ein Glycoprotein, es kann sich jedoch auch um eine Nukleinsäure, ein komplexes Lipid oder ein komplexes Kohlenhydrat handeln. Es kann sich auch um eine beliebige Isoform eines Proteins oder um einen Antikörper wie einen monoklonalen Antikörper handeln.
Bei der geladenen Verbindung kann es sich um eine beliebige Verbindung handeln, die bei dem von dem chemischen Puffersystem, das mit der Analytenlösung in Kontakt steht, definierten pH-Wert bzw. pH-Intervall geladen ist. Bei der geladenen Verbindung kann es sich daher entweder um eine ionisierbare oder geladene Verbindung, vorzugsweise eine Säure, eine Base, einen Ampholyten oder eine dauerhaft geladene Verbindung wie zum Beispiel ein dissoziiertes Salz handeln. Die geladene Verbindung wird bei der erfindungsgemäßen elektrophoretischen Trennung von der Kammer in das chemische Puffersystem extrahiert. Sie kann jedoch wiederum aus dem Gel in eine Lösung extrahiert werden und kann die für den Versuchseinsteller interessante Verbindung sein.
Bei der Analytenlösung kann es sich um eine beliebige erfindungsgemäße Lösung handeln, die die interessierende(n) Verbindung(en) solubilisiert. Vorzugsweise handelt es sich um eine ampholytenfreie oder pufferfreie Lösung.
Der elektrische Strom kann mittels Elektroden, die von einer externen Stromquelle erzeugt werden, angelegt werden. Es kann jede Spannung, die von dem erfindungsgemäßen Gerät toleriert wird, verwendet werden (z.B. 10 bis 10000 Volt, vorzugsweise 100 bis 5000 Volt). Vorausgesetzt, daß die erzeugte Wärme durch entsprechende Kühlung abgeführt werden kann, können auch höhere Spannungen verwendet werden. Zusätzlich kann die Spannung so programmiert werden, daß eine beliebige Spannungssignalform, darunter Wechselstrom und Rechtecksignal, angelegt werden kann.
Die Kammer ist in Bezug auf die Anzahl der Unterkammern, Abmessungen oder Formen, die je nach dem Anwendungszweck des Geräts variiert werden können, nicht eingeschränkt. Die Kammer kann auch als Modul zusammen mit anderen Trennungs-, Aufreinigungs- oder Nachweiskomponenten verwendet werden. Die die Kammer umfassenden Teile können aus festen Kunststoffen wie Plexiglas durch maschinelle Bearbeitung hergestellt werden, aus einem thermoplastischen Harz geformt werden oder nach einem beliebigen anderen geeigneten Herstellungsverfahren produziert werden. Das Material sollte eine chemische Resistenz gegenüber der Analytenlösung, dem elektrischen Strom, schwachen Säuren und Basen, Oxidantien und so weiter aufweisen. Weiterhin kann es erwünscht sein, daß es visuell ganz oder zumindest teilweise durchsichtig ist. Die Kammer kann durch ein elektrisch isolierendes Substrat, das aus einem elektrisch isolierenden Material wie einer porösen Membran, einer porösen anorganischen Schicht, einem nichtleitenden Polymer (wie zum Beispiel Plexiglas) oder einem Netzwerk von elektrisch isolierenden Fasern besteht, gestützt werden. Die Kammer kann auch ein Mittel aufweisen, das eine korrekte Installation und Positionierung der Komponenten in der Kammer gewährleistet, wie zum Beispiel die Verwendung eines O-Rings, um zu gewährleisten, daß die Kammer strömungsdicht ist, um ein Aussickern der Analytenlösung zu verhindern, oder zum Beispiel Schrauben, um die Wände des Geräts zusammenzumontieren. Weiterhin besteht die Kammer aus einem beliebigen Material, das Spannungen aushält, wie beispielsweise Plexiglas.
Bei dem chemischen Puffersystem kann es sich um ein beliebiges System, durch das die Trennung der geladenen Verbindungen von der interessierenden Verbindung bzw. den interessierenden Verbindungen erleichtert werden kann, handeln. So kann es sich zum Beispiel bei dem chemischen Puffersystem um ein Gel, am besten ein Immobilin-Gel, ein in einer Polymermatrix verfestigtes Fluid, eine Glasfritte, eine poröse Membran, ein Filter oder eine beliebige Kombination davon handeln. Das chemische Puffersystem kann auch ein Mittel aufweisen, das das direkte Eindringen von geladenen und neutralen Verbindungen in diese Kammer stoppt, wie ein schwach adsorbierendes Material. Das chemische Puffersystem ist im besten Fall dünn, elektroosmosefrei und strömungsdicht.
Bei dem pH-Wert kann es sich um einen fixen pH-Wert oder einen pH-Gradienten handeln. Dies kann zum Beispiel mittels kovalent gebundenen Puffermolekülen, wie zum Beispiel Thiomorpholinderivaten oder Acrylamidderivaten, erzeugt werden. pH-Gradienten können durch amphotere isoelektrische immobilisierte pH-Membranen erzeugt werden, wobei diese Membranen sehr kurze pH-Gradienten aufweisen können, die nur ein sehr enges pH-Intervall abdecken. Idealerweise kann dieses pH-Intervall den Grenz-pH-Wert der zu trennenden und aufzureinigenden interessierenden Verbindung erreichen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann es möglich sein, Verbindungen mit einem pI-Unterschied von bis zu einer maximalen pI-Auflösung von 0,001 zu trennen.
Die hydraulische Strömung kann durch Mittel wie Druck, Ansaugen, Zentrifugalkräfte oder elektrische Mittel erzeugt werden. Die Richtung der hydraulischen Strömung befindet sich in beliebigem geeigneten Winkel in Bezug auf die Richtung des elektrischen Stroms, am besten rechtwinklig dazu. Die Strömung kann auf einmal erfolgen oder mittels Fluidumwälzungsschleifen umgewälzt werden. Außerdem kann die Strömung auf eine Mehrzahl von Kammern verteilt sein, von denen ein Ende mit einem einzelnen Zufluß oder Abfluß verbunden sein kann. Die außen befindlichen Stromkanäle können noch andere Komponenten beinhalten, wie Wärmeaustauscher, Tanks, die die Volumenkapazität jeder Umwälzungsschleife erweitern, sowie Meßfühler wie zum Beispiel einen pH-Fühler, einen Temperaturfühler und/oder einen Lichtabsorptionsfühler.
Die Erfindung wird im folgenden beispielhaft mit Bezug auf die beigelegten Abbildungen, die unten kurz beschrieben werden, genauer beschrieben.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1. Schematische Darstellung eines Trenngeräts, die das Aufreinigungskonzept veranschaulicht. Kammer 1, die die aufzureinigende Lösung enthält, weist einen Zufluß 2 und einen Abfluß 3, die an entgegen gesetzten Enden liegen, auf und wird von dem chemischen Puffersystem 4 bedeckt. Die Kathode 5 und die Anode 6 werden parallel in die Kammer eingeführt und stehen nur mit dem chemischen Puffersystem in Kontakt. Die schwarzen Pfeile zeigen das Eindringen von positiv geladenen Verbindungen (zur Kathode) oder von negativ geladenen Verbindungen (zur Anode) in das chemische Puffersystem, während die weißen Pfeile angeben, daß ein Lösungsstrom in der Kammer geführt werden kann.
2. Simulationsergebnisse für ein an die Gelmatrix angelegtes elektrisches Feld und seine Auswirkungen auf die Lösung für zwei Werte für die Leitfähigkeit σ des Gels und der Lösung.

A) I: Potentialverteilung in dem Gerät wenn σ(Gel) = σ(Lösung) II: Stromvektoren wenn σ(Gel) = σ(Lösung)
B) III: Potentialverteilung in dem Gerät wenn 10 σ(Gel) = σ(Lösung) IV: Stromvektoren wenn 10 σ(Gel) = 10 σ(Lösung)

3. Photographie eines Prototyps des Trennungsgeräts, die eine Anordnung ähnlich wie in 1 zeigt. Die Kammer 1 weist einen Zufluß 2 und einen Abfluß 3 auf, die mit Schläuchen verbunden sind, so daß die Analytenlösung durch das Gerät strömen kann. Bei dem chemischen Puffersystem 4 handelt es sich um ein IPG-Gel (IPG = immobilisierter pH-Gradient), das oberhalb der Kammer angeordnet ist. Das ganze Gerät befindet sich in einem zusammengeschraubten Plexiglasträger 8 und seine Funktionsfähigkeit wird durch einen O-Ring 7, der für eine dichte Abdichtung sorgt, gewährleistet. Die Kathode 5 und die Anode 6 werden nur mit dem IPG-Gel in Kontakt gebracht und zwar nahe des O-Rings. Diese Elektroden bestehen aus dünnen Platindrähten, so daß sie über den O-Ring geführt werden können, ohne daß dies zu irgendeiner Undichtigkeit in dem Gerät führt. Quillt das Gel im Gerät erneut an, so umgibt es die Elektroden vollständig und verhindert somit, daß die Analytenlösung die Elektroden berührt.
4. A) Photographie eines Immobilingels bei pH = 7 ± 0,14 pH-Einheiten nach Aufreinigung einer Lösung von IEF-Markern in Wasser in dem Trenngerät gemäß 3 bei einstündigem Anlegen eines elektrischen Felds mit 100 V. Die Wanderung des negativ geladenen Proteins Phycocyanin (Bande 9) zr Anode und der positiv geladenen Proteine wie Cytochrom c, Myoglobin und Hämoglobin (Bande 10) zr Kathode ist in diesem Versuch mit bloßem Auge sichtbar. B) Schematische Darstellung, die das Trennverfahren in dem IPG-Gel beschreibt. Der Pfeil gibt die Richtung des pH-Gradienten an (niedriger pH-Wert an der Anodenseite des Gels und hoher pH-Wert an der Kathodenseite des Gels). Während der Trennung ist eine Verbindung X mit einem pI-Wert, der dem pH-Wert des Teils des Gels, der in Kontakt mit der Analytenlösung steht, global neutral und wandert nicht. Eine Verbindung Y mit pI(Y) > pI(X) ist in dem pH-Bereich negativ geladen und wandert zur Anode, während eine Verbindung Z mit pI(Z) < pI(X) in diesem pH-Bereich positiv geladen ist und zur Kathode wandert. Die gepunkteten Pfeile geben die Wanderungs-richtung dieser verschiedenen Verbindungen an.
5. Aufreinigungsversuch mit einem Abschnitt von pH 4–5,5 einer Immobilin-„DryPlate"-Platte.

A) Elektropherogramm einer CIEF-Analyse von IEF-Standards, wie sie für den Versuch verwendet werden. Die Peaks 11 bis 21 entsprechen den Proteinen von Tabelle 1 unten.
C) Elektropherogramm der nach dem Versuch erhaltenen Lösung, das zeigt, daß nur die Peaks 11 und 12 nach der Reinigung stark intensiv bleiben.

6. Aufreinigung einer Mischung, die 5 unterschiedliche Proteine enthält, nämlich Trypsinhemmer (pI = 4,6, Peak Nummer 25), β-Lactoglobulin B (pI = 5,2, Peak Nummer 26), β-Lactoglobulin A (pI = 5,3, Peak Nummer 27), Pferde-Myoglobin (pI = 7,0, Peak Nummer 28) sowie Pferde-Cytochrom c (pI = 9,6, Peak Nummer 29).

A) CIEF-Analyse I) der zu reinigenden aufgetragenen Proteinmischung; II) der Proteinlösung nach dem Trennversuch mit einem Immobilin-Abschnitt mit einem pH-Bereich zwischen 5,06 bis 5,34.
B) Schema für das Trennprinzip des vorliegenden Versuchs in einem Trenngerät bei Verwendung eines Immobilin-Gels mit einem pH-Gradienten. Das interessierende Protein (im Schema mit A bezeichnet) weist einen pI-Wert zwischen den Extremwerten des pH-Gradienten, also im vorliegenden Fall zwischen pH 5 und 5,4, auf. Die in dem Schema mit B und C bezeichneten Proteine weisen einen pI-Wert von über 5,4 bzw. unter 5,0 auf, so daß sie in dem IPG-Gel positiv bzw. negativ geladen sind. Die gepunkteten Pfeile zeigen die Wanderungsrichtung dieser verschiedenen Proteine, während die durchgezogenen Pfeile die Richtung des pH-Gradienten zwischen dem Anodenende und dem Kathodenende des Gels (die jeweils durch ein positiv-Zeichen bzw. ein negativ-Zeichen angegeben sind) angeben. Bei Anlegen des elektrischen Felds wandern die Proteine des B- und des C-Typs in das Immobilin-Gel und werden so von den Proteinen des A-Typs getrennt.

7. Massenspektrum (auf der rechten Seite der Abbildung), das durch eine einmalige Einspritzung von 2 μl einer Lösung auf 80 μM Catechin und 20 μM Methylenblau erhalten wurde, unter gleichzeitiger Angabe (auf der linken Seite der Abbildung) der Entwicklung der relativen Häufigkeit der Massen-Peaks 290,5–291,5 (Kurve oben), des Massen-Peaks 285,5–286,5 (Kurve in der Mitte) sowie der Gesamthäufigkeit dieser beiden Peaks (Kurve unten) im Verlauf der Zeit.
8. Massenspektrum (auf der rechten Seite der Abbildung), das durch kontinuierliche Einspritzung einer gereinigten Lösung aus 80 μM Catechin und 20 μM Methylenblau erhalten wurde, unter gleichzeitiger Angabe (auf der linken Seite der Abbildung) der relativen Häufigkeit der Massen-Peaks 290,5–291-5 (Kurve oben), des Massen-Peaks 285,5–286,5 (Kurve in der Mitte) sowie der Gesamthäufigkeit dieser beiden Peaks (Kurve unten) im Verlauf der Zeit. Diese Ergebnisse werden durch On-Line-Nachweis der Analytenlösung, die zuvor (ohne Rückführung) durch die Kammer des elektrophoretischen Trenngeräts geströmt ist, erhalten (chemisches Puffersystem: IPG-Gel mit einem pH-Wert im Bereich von 6–6,15 in Kontakt mit der Analytenlösung; angelegtes elektrisches Potential: 300 V, Pumpleistung 1 ml/min).
9. Schematische Darstellung der Anlage für die elektrophoretische Trennung im statischen Betrieb in einem Gerät, bei dem die Zufluß- und Abflußenden vereinigt sind, so daß die Kammer 31 als Vorratsbehälter, der mit der Analytenlösung vor der Reinigung beschickt bzw. von dem diese nach der Reinigung abgezogen werden kann, verwendet wird. Die Analytenlösung steht nur mit dem chemischen Puffersystem 32 in Kontakt, und das elektrische Potential wird durch die Anode 33 und die Kathode 34, die in zwei Vorratsbehälter 35 und 36 eingeführt werden, angelegt. Der schwarze Pfeil bezeichnet die Richtung des in dem chemischen Puffersystem erzeugten pH-Gradienten.
10. Photographie eines IPG-Gels nach Aufreinigung einer wäßrigen Lösung, die 300 mM Methylenblau und 10 mM Phenolrot enthält, mit einem Gerät ähnlich wie in 9 dargestellt, sowie anschließende Bestimmung des zum Kathoden- bzw. Anodenvorratsbehälter gewanderten Methylenblaus (Fleck Nummer 39) und Phenolrots (Fleck Nummer 38). Die Abbildung zeigt außerdem, daß nach der elektrophoretischen Trennung in dem Gelabschnitt 37, der während der Aufreinigung mit der Analytenlösung in Kontakt gestanden ist, keine Farbe vorhanden ist.
11. Schematische Darstellung der Anlage, die für die elektrophoretische Trennung im statischen Betrieb mit On-Line-Nachweis unter Verwendung von zum Beispiel einem Elektrospray-Massenspektrometer verwendet werden kann. In diesem Beispiel sitzt das Gerät in einem Plastikträger 40, der die Kammer 41 in Kontakt mit dem chemischen Puffersystem 42 enthält. Die Kammer besteht aus einer Reihe von drei Unterkammern 40, bei denen die Zufluß- und Abflußenden vereinigt sind, so daß diese Unterkammern als Vorratsbehälter, die mit der Analytenlösung vor der Reinigung beschickt werden können, verwendet werden. Zwei zusätzliche Vorratsbehälter 43 und 44 werden zum Einführen der Elektroden, die dazu dienen, das für die Durchführung der elektrophoretischen Reinigung erforderliche elektrische Feld anzulegen, verwendet. Die Unterkammern enthalten weiterhin ein zusätzliches Verbindungssystem 45 (von denen nur eines dargestellt ist) für die Kopplung mit einem weiteren Gerät 47, das als zusätzlicher Trennschritt oder als Detektor dient. Die Abbildung zeigt, daß ein elektrisches Potential zwischen die Unterkammern (oder einer vorgegebenen Position in dem Verbindungssystem) und den Zufluß des Geräts 47 angelegt werden kann, um den hydrodynamischen Strom der gereinigten Lösungen zu kontrollieren und/oder um einen Elektrospray 46 zu erzeugen, wodurch die in der gereinigten Analyselösung vorliegenden interessierenden Verbindungen nachgewiesen werden können.
Genaue Beschreibung
Beispiel 1: Numerische Simulation der Verteilung des Wanderungsstroms innerhalb des erfindungsgemäßen Geräts
Um die Verteilung des Wanderungsstroms in dem erfindungsgemäßen Gerät zu verstehen, kann eine numerische Simulation mit Berechnung der finiten Elemente durchgeführt werden. Mit solchen Versuchen kann der Stromfluß durch das Reinigungsgerät vorhergesagt werden. Zu diesem Zweck zeigt 1 eine schematische Darstellung eines Beispiels eines Trennungsgeräts und erläutert das Reinigungskonzept. In diesem Beispiel besteht das Gerät aus einer Kammer 1, die die zu reinigende Lösung enthält, mit einem Zufluß 2 und einem Abfluß 3 an jedem Ende der Kammer, aus einem chemischen Puffersystem 4, das mit einem Teil der Kammer in Kontakt steht, sowie aus zwei Elektroden (einer Kathode 5 und einer Anode 6), die nur mit dem chemischen Puffersystem in Kontakt stehen und parallel zu der Kammer angeordnet sind. Die schwarzen Pfeile zeigen das Eindringen von positiv geladenen Verbindungen (zur Kathode) bzw. negativ geladenen Verbindungen (zur Anode) in das chemische Puffersystem, wenn ein elektrisches Feld zwischen den beiden Elektroden angelegt wird, während die weißen Pfeile zeigen, daß ein Lösungsstrom in der Kammer induziert werden kann.
Es wird ein Querschnitt des Geräts bestehend aus einem chemischen Puffersystem als Abdeckung eines Kanals simuliert, und der Wanderungsstrom wird an jedem Punkt dieses Schnitts berechnet. Es wurden zum Beispiel zwei verschiedene Fälle in dem Gerät simuliert, bei denen (i) die Leitfähigkeit σ in dem Gel und in der Lösung identisch ist (σ_Gel = σ_Lösung) sowie (ii) die Leitfähigkeit in dem Gel zehnmal niedriger als in der Lösung ist (10 σ_Gel = σ_Lösung). In beiden Fällen wird eine Berechnung an jedem Punkt der Struktur nach der Laplace'schen Gleichung: ∇(–σ∇U) = 0 (1)unter Verwendung der entsprechenden Bedingungen in einem zweidimensionalen System durchgeführt:
an der ersten Elektrode: U = 0,
an der zweiten Elektrode: U = 1,
sowie an der Isolierwand:
wobei U die Spannung (V) und σ die elektrische Leitfähigkeit (ohm^–1·m^–1) bedeuten.
Für die Potentialverteilung wird ein stationärer Algorithmus verwendet. Die Simulationen können mit einer im Handel erhältlichen Finite-Elemente-Software, nämlich Flux Expert^® (Simulog, Frankreich) auf einer Unix-Workstation (Silicon Graphics Indigo 2 Solid Impact 10000 mit 640 Mb RAM) durchgeführt werden.
Das Ziel dieser Simulationsversuche besteht darin, anzuzeigen, ob die geladenen Verbindungen in das chemische Puffersystem wandern oder nicht, sowie darin, den Einfluß der Leitfähigkeit σ auf die Wanderung bzw. anders ausgedrückt die Auswirkung der Pufferzusammensetzung in der zu reinigenden Lösung nachzuweisen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Im ersten Fall (2A) soll σ im chemischen Puffersystem und in der Analytenlösung gleich sein (σ_Gel = σ_Lösung). Zwischen den beiden Elektroden wird eine Potentialdifferenz angelegt, wodurch die Potentialverteilung vorhergesagt werden kann. Abbildung 2AI zeigt, daß die Potentialverteilung in der Lösung, die dem Abschnitt unter dem Gel entspricht, der Potentialverteilung in dem chemischen Puffersystem sehr ähnlich ist. In dem chemischen Puffersystem wird auch ein Potentialgradient erzeugt, der zu einer Vorwanderung der Proteine in der Lösung, und zwar in Abhängigkeit von ihrer Ladung, führen kann. Wie in Abbildung 2AII dargestellt, zeigen die Stromvektoren, daß der Strom ebenfalls durch die Lösung transportiert wird. Die Vektoren sind in der Mitte der Struktur ähnlich und führen zu einem gleichen Stromfluß. An der Grenzfläche zwischen dem chemischen Puffersystem und der Lösung wird deutlich gezeigt, daß ein Stromfluß von der Lösung zu dem chemischen Puffersystem stattfindet.
Im zweiten Fall (2B) ist die Leitfähigkeit der Lösung verstärkt. Sie wird als 10mal höher in der Analytenlösung als in dem Gel angenommen (10 σ_Gel = σ_Lösung). Das Ergebnis dieses Versuchs lautet, daß der Potentialgradient in der Lösung weniger wirksam ist (siehe Abbildung 2BIII), daß jedoch mehr Strom in der Lösung als in dem chemischen Puffersystem transportiert wird (siehe Abbildung 2BIV). Wie in dem ersten Fall kann auch nachgewiesen werden, daß ein Stromfluß von der Lösung zum chemischen Puffersystem stattfindet, wodurch die Proteine durch Migration von der Lösung in das chemische Puffersystem eindringen können.
Anhand dieser beiden Versuche läßt sich das Prinzip des erfindungsgemäßen Trennungs- und Reinigungsgeräts nachweisen. Auch dann, wenn das Potential nur an das chemische Puffersystem angelegt wird, wird durch dieses Potential auch die angrenzende Analytenlösung beeinflußt, und eine Wanderung der geladenen Verbindungen (zum Beispiel der Proteine) wird induziert. Die beiden Fälle unterscheiden sich nur aufgrund ihrer Wirksamkeit. In dem zweiten Fall wird eine höhere Leitfähigkeit, die zum Beispiel einer gepufferten Proteinlösung entspricht, betrachtet, was sicherlich für die Proteinstabilität und dann, wenn die Ladung mancher Proteine für einen isoelektrischen Trennungsversuch vorgewählt werden müssen, wünschenswerter ist. Andererseits ist es klar, daß in dem ersten Fall die Proteinwanderung und damit auch die Wirksamkeit des Reinigungsgeräts begünstigt wird, da beinahe 100% des Stroms von Proteinen in zum Beispiel einer nichtgepufferten Lösung (mit Wasser verdünnte Probe) getragen wird.
Beispiel 2: Elektrophoretische Trennung und Reinigung in einer ungepufferten Lösung
Für den Nachweis einer elektrophoretischen Trennung und Reinigung von verschiedenen Lösungen wurden die folgenden Versuchsbedingungen angewandt:
Reagenzien
Ein IEF-Proteinmarker-Standard ist von BioRad (Herkules, USA) erhältlich. Pferde-Cytochrom c, β-Lactoglobulin A und B, Trypsinhemmer und Pferde-Myoglobin sind von Sigma erhältlich. Immobilin-DryPlates, pH-Bereich (4,4–5,4 und 4–7, 11 cm) sind von Pharmacia Amersham erhältlich. Alle Reagenzien für die kapillar-isoelektrische Fokussierung (CIEF) sind von BioRad erhältlich.
Versuchsanordnung
Ein Plastikhalter kann so konstruiert werden, daß die zu reinigende Lösung durch das Gerät, das die Kammer, die mit dem chemischen Puffersystem (das im vorliegenden Fall ein Immobilin-Gel ist) in Kontakt ist, enthält, gepumpt werden kann. 2 zeigt ein Photo eines Prototyps des Trennungs- und Reinigungsgeräts mit solch einer Anordnung. Die Kammer 1 weist einen Zufluß 2 und einen Abfluß 3 auf, die mit Teflonschläuchen und einer Schlauchquetschpumpe (nicht gezeigt) verbunden sind, um die Analytenlösung durch das Gerät fließen zu lassen. Bei dem chemischen Puffersystem 4 handelt es sich um ein Gel mit immoblisiertem pH-Gradienten (IPG-Gel), das oberhalb der Kammer angeordnet ist. Das gesamte Gerät wird in einem zusammengeschraubten Plastikträger 8 gehalten; ein O-Ring 7, der dicht abschließt, sorgt dafür, daß es wasserdicht ist. Die Kathode 5 und die Anode 6 werden so angeordnet, daß sie nur mit dem IPG-Gel in Kontakt stehen, und zwar nahe bei dem O-Ring. Diese Elektroden bestehen aus dünnen Platindrähten, so daß sie oberhalb des O-Rings so eingebaut werden können, daß es zu keiner Undichtigkeit in dem Gerät kommt. Beim erneuten Quellen des Gels in dem Gerät umschließt das Gel die Elektroden vollständig und verhindert, daß die Analytenlösung die Elektroden berührt. Das erneute Quellen des Gels kann in 1 Stunde bis über Nacht in Wasser oder in dem Puffersystem, in dem der Reinigungsversuch durchgeführt werden kann, erreicht werden.
Reinigung
Die unterschiedlichen Proteinlösungen (Gesamtvolumen 1 ml) können dem Gerät mit der Membranquetschpumpe zugeführt werden. Vor dem Versuch kann die Lösung mindestens 2 Minuten lang umgewälzt werden und eine 100-μl-Probe kann für die CIEF entnommen werden. Dann kann mit einem Hochspannungs-Netzgerät (Spellmann, CZE1000, New York, USA) je nach Versuch eine konstante Spannung von 30–100 V angelegt werden. Stromstärke und Spannung können mit einem mittels Digital-PC betriebenen LabVIEW-5-Programm und einer Datenerfassungs-Schaltplatte (Lab PC+, National Instruments, USA) erfaßt werden.
Kapillar-isoelektrische Fokussierung (CIEF)
Für die CIEF-Analyse, bei der Kapillaren mit BioCap-XL-Beschichtung (ID 50 μm, BioRad) verwendet werden, kann ein Gerät des Typs Biofocus 3000 (BioRad, Hercules, USA) verwendet werden. Die Proteinproben können in Ampholyten (Bio-Lyte, BioRad) verdünnt und mit BioRad-IEF-Katholyt, -Anolyt und -Mobilisator untersucht werden. Falls erforderlich können die Proben vor der Verdünnung mit den Ampholyten mit 5-kDa-Filtern der Fa. Biomax (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA) ultrazentrifugiert werden, um eine ausreichende Proteinkonzentration für die CIEF-Analyse sicherzustellen.
Photographie
Digitalphotos der getrockneten Immobilin-Gele und des Geräts nach den Versuchen können mit einer Digitalkamera (Fuji MX-700, Fuji Photo Film, Tokio, Japan) aufgenommen und mit Adobe-Photoshop-Software behandelt werden.
Beispiel 2.1: Trennung von Proteinmarkern bei pH 7
Um die Proteinwanderung, wie sie bei der Simulation des ersten Falls von Beispiel 1, wo die Leitfähigkeit des Gels und der Lösung identisch sind, vorhergesagt wurde, nachzuweisen, kann ein Immobilin-Gel mit einem pH-Bereich zwischen 6,9–7,1 in einen Prototyp des erfindungsgemäßen Geräts eingebaut werden (siehe 3).
Tabelle 1. Proteine in der IEF-Marker-Standardlösung von BioRad mit ihrem entsprechenden pI-Wert und ihrer entsprechenden Farbe.
Eine Lösung der Protein-IEF-Marker in Wasser (Konzentration ungefähr 150 mg/ml, Proteinzusammensetzung siehe Tabelle 1) kann auf das Gerät gemäß 3 aufgetragen und mit einer Schlauchquetschpumpe bei einer konstanten Pumpenleistung (0,6 ml/min) durch dieses Gerät umgewälzt werden. Eine Photographie des Immobilin-Gels nach einstündiger Reinigung bei Anlegung eines elektrischen Potentials von 100 V ist in 4 dargestellt. Für diesen Versuch weist derjenige Teil des IPG-Gels, der mit der Analytenlösung in Kontakt steht, einen pH von 7 ± 0,14 auf. Diese Abbildung zeigt eine blaue Bande 9, die die Wanderung des blaugefärbten Proteins Phycocyanin zur Anode anzeigt, sowie eine braune Bande 10, die das zu der Kathode wandernde Cytochrom c, Myoglobin bzw. Hämoglobin anzeigt.
Die Proteine sind zu Banden, die einen elektrophoretischen Fokussierungsmechanismus nachweisen, konzentriert. Dies zeigt deutlich, daß eine Wanderung der Proteine von der Lösung in das Gel induziert wird, obwohl das elektrische Potential von Elektroden, die nur mit dem Gel in Kontakt stehen, angelegt wird. Dies bestätigt auch empirisch, daß die zuvor genannten Simulationsdaten mit dem Versuch übereinstimmen.
Beispiel 2.2: Aufreinigung von beta-Lactoglobulin B und Phycocyanin aus einer IEF-Markerlösung
In einem weiteren Versuch wird die Aufreinigung einer Lösung, die aus den IEF-Markerproteinen gemäß Tabelle 1 besteht, mit einem Gel im pH-Bereich 4–5,5, wobei der pH-Gradient parallel zu den Platinelektroden verläuft, gezeigt. Eine CIEF-Analyse wird vor und nach dem Aufreinigungsversuch (Pumpenleistung 0,6 ml/min, konstante Spannung = 50 V) durchgeführt. Wie in 5 dargestellt, ergibt der Vergleich der beiden Elektropherogramme, daß die Proteine der ursprünglichen Analytenlösung mit pI-Werten höher als 5,5 in das Gel gewandert sind, während beta-Lactoglobulin B und Phycocyanin (Peak 11 bzw. 12) noch nach der elektrophoretischen Reinigung in der Lösung verbleiben.
Ein einfacher Vergleich kann auch visuell durchgeführt werden. Die Lösung vor dem Versuch ist grün (Farbe der komplexen Lösung der IEF-Marker), während die Lösung nach der Reinigung blau ist (was der Farbe von Phycocyanin entspricht). Außerdem zeigt das Gel nur auf der Kathodenseite eine braune Färbung, was den positiv geladenen Proteinen, die zu dieser Seite wandern, entspricht.
In diesem Versuch wird nachgewiesen, daß eine Analytenlösung, die interessierende Verbindungen enthält, dadurch gereinigt werden kann, daß man mit einem erfindungsgemäßen Gerät und Verfahren geladene Verbindungen daraus entfernt.
Beispiel 2.3: Aufreinigung von beta-Lactoglobulinen A und B
Eine Proteinlösung, die aus fünf Proteinen mit bekannten isoelektrischen Punkten besteht (Trypsininhibitor (pI = 4,6), beta-Lactoglobulin A (pI = 5,3), beta-Lactoglobulin B (pI = 5,2), Pferde-Myoglobin (pI = 7,0), Cytochrom c (pI = 9,6), bei einer Konzentration von 200 μg/ml in Wasser, mit Ausnahme des Trypsinhemmers, der in einer Konzentration von 50 μg/ml in Wasser vorliegt), wird auf das Gerät gemäß 3 aufgetragen, welches ein mit Wasser rehydratisiertes Immobilin-Gel im pH-Bereich von 5 bis 5,4 enthält. Wie in dem Schema des Trennungsverfahrens gemäß 6B dargestellt, besteht das Ziel dieses Versuchs darin, die in Lösung befindlichen beta-Lactoglobuline A und B zu gewinnen. Zu diesem Zweck beruht die Reinigung auf dem folgenden Prinzip: Proteine mit 5,0 < pI < 5,4 sind entweder in dem Gel in der Nähe der Kathode negativ geladen und werden abgestoßen (pH im Gel > pI), wie dies durch die Proteine des Typs A in 6B veranschaulicht wird. An dem stärker sauren Gelende in der Nähe der Anode sind diese Proteine des Typs A positiv geladen (pH im Gel < pI) und werden wiederum abgestoßen. Auf diese Weise können sie nicht aus der Analytenlösung entfernt werden. Alle anderen Proteine mit pI > 5,4 sind positiv geladen und werden von der Kathode angezogen (Proteine des Typs B in 6B), während alle Proteine mit pI < 5,0 von der Anode angezogen werden (Proteine des Typs C in 6B). Diese letztgenannten beiden Verbindungstypen werden also bei der elektrophoretischen Trennung der Analytenlösung in das IPG-Gel extrahiert.
Die Elektropherogramme der Lösung der fünf oben genannten Proteine werden vor und nach der Reinigung untersucht, und die in den 6A I und II dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Proteine Trypsinhemmer, Pferde-Myoglobin und Pferde-Cytochrom c nach der Reinigung beinahe vollständig verschwunden sind, während die beiden beta-Lactoglobuline in der Lösung verbleiben. Dies ist ein eindeutiger Beweis für das auf der erfindungsgemäßen isoelektrischen Trennung beruhende Reinigungsprinzip.
Ein Vorteil des gemäß der vorliegenden Erfindung beanspruchten Geräts besteht darin, daß die aufzureinigenden Proteine in geringstmöglichem Kontakt mit der Immobilin-Matrix stehen, was mögliche Auswirkungen, die die Polyacrylamidmatrix auf die Proteine ausüben könnte, reduziert. Sie können für die weitere Analyse leicht in Lösung gewonnen werden. Es muß keine Extraktion mit Chemikalien durchgeführt werden, was die Einwirkung der Chemikalien auf das interessierende Protein auf ein Minimum beschränkt. Diese Tatsache führt auch zu einer kürzeren Aufreinigungszeit. Es konnte hier gezeigt werden, daß die Aufreinigung von Mengen im Mikrogrammbereich in 1 Stunde durchgeführt werden kann. Bei Verwendung eines Kühlgeräts oder einer unterschiedlichen Geometrie, die einen geringeren Stromfluß durch das Gerät gewährleistet, kann dies weiter verbessert werden. Somit wäre ein Anlegen eines höheren elektrischen Potentials möglich.
Beispiel 3: Elektrophoretische Trennung in gepufferter Lösung
Um die Simulation des zweiten Falls des Simulationsversuchs gemäß Beispiel 1, wo die Leitfähigkeit des Gels zehnmal niedriger ist als die Leitfähigkeit der Lösung, zu prüfen, wird die Proteinmarkerlösung gemäß Tabelle 1 auf einen gegebenen pH-Wert eingestellt. Für diesen Zweck wird ein Acetatpuffer (0,01 M) mit einem pH-Wert von 4,6 verwendet. Dieser pH-Wert entspricht dem pI-Wert von Phycocyanin, das in dem IEF-Marker-Standard vorliegt (siehe Tabelle 1). Der pH-Bereich des Gels schwankt zwischen 4,5–4,58 und 4,58–4,66. Bei diesen Versuchen wird die Stromstärke konstant auf 300 μA eingestellt, was die Obergrenze des Netzgeräts darstellt. Es wurde nachgewiesen, daß die Spannung nie 30 V übersteigt. Nachdem das elektrische Potential mehrere Stunden lang angelegt worden ist, ist nur sehr wenig Protein in dem Gel sichtbar (Ergebnisse nicht dargestellt). Diese Proteine sind sehr diffus und nicht wie bei oben genannten Versuchen zu einer Bande fokussiert. Außerdem findet eine verstärkte Blasenbildung statt, wodurch das Gel in dem Gerät etwas zerstört wird.
Aus diesen Versuchen geht eindeutig hervor, daß die Proteine wesentlich schlechter wandern, wenn die Probenlösung gepuffert ist. Es ist klar, daß durch die puffernden Ionen mehr Strom übertragen wird, wenn deren Konzentration im Vergleich zur Konzentration der Proteinmischung hoch ist. Im Gegensatz dazu wird der Strom hauptsächlich von den Proteinen selbst transportiert, wenn diese nur in Wasser vorliegen. Dies begünstigt die Proteinwanderung und daher die Trennleistung des Geräts. Obwohl Wasser nicht das günstigste Analytenlösungsmittel für Proteine darstellt, ist bei dem oben genannten Verfahren keine Zugabe von Pufferionen oder Ampholyten für die Verbesserung der isoelektrischen Trennung erforderlich. Aus praktischer Sicht erleichtert dies den Trennungsvorgang wesentlich.
Beispiel 4: Mit online-massenspektrometrischem Nachweis gekoppelte elektrophoretische Aufreinigung
Um die interessierende(n) Verbindung(en) online nachzuweisen, kann ein Gerät ähnlich wie in 3 dargestellt mit einem Massenspektrometer (LCQ-DUO, Finnigan) gekoppelt werden. Zu diesem Zweck kann eine Mischung von 80 μM Catechin und 20 μM Methylenblau mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min (mit einer Schlauchquetschpumpe der Fa. Ismatec) durch das Elektrophoresetrenngerät gepumpt werden. Das Gerät enthält ein chemisches Puffersystem, das aus einem IPG-Gel mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 besteht, so daß derjenige Teil des Gels, der mit der Kammer in Verbindung steht, einen pH-Bereich von 6–6,15 aufweist. Das Abflußende der Kammer ist über Schläuche mit dem Einspritzsystem eines LCQ-DUO-Massenspektrometers verbunden, um die Lösung online zu analysieren.
Catechin ist ein gut bekannter Massenmarker, der zwischen pH 6 und 6,15 neutral ist, während Methylenblau immer als Kation vorliegt. Fließt diese Mischung in das erfindungsgemäße Gerät, so wird beim Anlegen eines elektrischen Potentials (zum Beispiel 300 V) das Methylenblau aus der Analytenlösung extrahiert und dringt in das IPG-Gel ein. Auf diese Weise wird das Methylenblau aus der Lösung entfernt und das Catechin aufgereinigt. Dies geht aus den 7 und 8 hervor, die das Massenspektrum der Analytenlösung vor bzw. nach der elektrophoretischen Aufreinigung zeigen. Zu diesem Zweck wurden die Ergebnisse von 7 mit 1 μl der Ausgangs-Analytenlösung erzielt, die von einer Spritze in das Massenspektrometer im APCI-Modus (APCI = atmospheric pressure chemical ionisation) mit Stickstoff als Mantelgas unter den folgenden Arbeitsbedingungen mittels Elektrospray eingespritzt wurde: Spannungsquelle: 3,82 kV; Stromquelle: 5,4 mA; Verdampfertemperatur: 450°C; Mantelgas-Durchflußmenge: 79,9 psi; Kapillarspannung: 4,6 V und Kapillartemperatur: 200°C. Das erhaltene Spektrum weist zwei sehr stark ausgeprägte Peaks bei einem Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z-Verhältnis) von 286,3 bzw. 291 auf, was Methylenblau bzw. Catechin entspricht. Die Intensität des Peaks bei m/z = 291 beträgt nur ungefähr 60% der Peak-Intensität bei m/z = 286,3, was der höheren Methylenblaukonzentration in der Analytenlösung entspricht. Nach der elektrophoretischen Reinigung der Analytenlösung weist das Massenspektrum gemäß 8 eine ähnliche Form auf, die relative Größe der Peaks wird jedoch beinahe gleich (die Intensität des Peaks bei m/z = 291 beträgt 94% der Peakintensität bei m/z = 286,3). Der Versuch kann weitergeführt werden, und die Entwicklung der relativen Größe der beiden Peaks im Verlauf der Zeit zeigt, daß die Intensität des Peaks bei m/z = 291 ungefähr konstant bleibt, während die Peak-Intensität bei m/z = 286,3 innerhalb von weniger als zwei Minuten von 100% auf weniger als 40% abnimmt.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die Analytenlösung entsprechend der blauen Methylenblaubande, die in dem Gel in der Nähe der Kathode beobachtet werden kann, gereinigt worden ist. Die Länge der Kammer (ungefähr 3 cm) reicht nicht aus, um das Methylenblau vollständig aus der Analytenlösung zu entfernen, die Abmessung der Kammer, die Durchflußmenge der Analytenlösung, sowie der Wert des elektrischen Felds kann jedoch dahingehend optimiert werden, daß eine vollständige Aufreinigung erzielt werden kann.
Dieser Versuch zeigt deutlich, daß das erfindungsgemäße Gerät für einen Online-Nachweis der aufgereinigten Lösung mit einem Massenspektrometer gekoppelt werden kann. Auf diese Weise kann leicht eine weitere Auftrennung bzw. ein weiterer Nachweis der gereinigten Lösung durchgeführt werden. Bei gewissen Anwendungen können die aufgereinigten Fraktionen auch in einem anderen Träger für die weitere Analyse aufgefangen werden, wie zum Beispiel einer MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation)-Platte.
Beispiel 5: Elektrophoretische Reinigung von Isoformen
Um zu zeigen, daß Proteinisoformen getrennt und aufgereinigt werden können, ist N-Acetyl-Eglin C mittels DNA-Rekombinationstechniken erhältlich und enthält zwei Isoformen (eine im basischen pH-Bereich und eine im sauren pH-Bereich).
Eine wässrige Lösung von 1 mg/ml N-Acetyl-Eglin C kann in dem erfindungsgemäßen Gerät umgewälzt und 1 Stunde konstant bei 1000 Volt an einem Gel mit immobilisiertem pH-Gradienten bei pH 5,5 (dem pI-Wert von N-Acetyl Eglin C) laufengelassen werden.
Resultate, welche mit einem traditionellen CIF-Gerät (CIF = capillary isoelectric focusing, kapillare isoelektrische Fokussierung) (Biofocus, Bio-Rad) erzielt werden können, zeigen, daß die aufzureinigende Analytenlösung einen Peak nach 26,86 Min. (der der basischen Isoform mit pI 6,2 entspricht: 4,86%), einen Hauptpeak nach 29,56 Min. (der Eglin C entspricht: 90,18%) sowie einen Peak nach 31,52 Min. (der der sauren Isoform mit pI 5,2 entspricht: 4,94%) aufweist. Nach Trennung und Reinigung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren weist die gereinigte Lösung einen sehr kleinen Peak, der einer Spur der basischen Isoform bei 26,38 Min. entspricht und einen Peak bei 29,57 Min. (97,88%), der der Hauptkomponente N-Acetyl-Eglin C entspricht, auf. Es liegt kein Peak, der der sauren Isoform entspricht, vor, was die Abtrennung und Reinigung von der Isoform und die Anreicherung der Hauptkomponente belegt.
Beispiel 6: Elektrophoretische Aufreinigung in statischer Fahrweise
Für gewisse Anwendungen kann es vorteilhaft sein, die Analytenlösung ohne hydraulischen Fluß aufzureinigen. In diesen Fällen erfordert das erfindungsgemäße Gerät keine Kammer mit Zufluß- und Abflußenden, sondern nur einen Vorratsbehälter zum Beschicken mit der bzw. zum Abziehen der Analytenlösung.
Dies ist in 9 dargestellt, die eine schematische Darstellung der für die elektrophoretische Trennung in statischer Fahrweise verwendeten Anlage zeigt, wobei der Zufluß und der Abfluß vereinigt sind, sodaß die Kammer 31 als Vorratsbehälter dient, welcher vor der Reinigung mit der Analytenlösung beschickt bzw. aus dem die Analytenlösung nach der Reinigung abgezogen werden kann.
Die Analytenlösung steht nur mit dem chemischen Puffersystem 32 in Kontakt, und das elektrische Potential wird durch die Anode 33 und die Kathode 34, die in die zwei Vorratsbehälter 35 bzw. 36 eintauchen, angelegt. Der schwarze Pfeil gibt die Richtung des in dem chemischen Puffersystem erzeugten pH-Gradienten an.
Zum Nachweis der Trennung mit solch einem erfindungsgemäßen Gerät kann man ein Elektrophoresetrenngerät ähnlich wie in 9 dargestellt herstellen, das ein als chemisches Puffersystem dienendes IPG-Gel (IPG = immobilisierter pH-Gradient) sowie eine Kammer, welche drei Unterkammern beinhaltet, die aus kleinen Plastikschläuchen bestehen, welche oben auf dem IPG-Gel angebracht und in Richtung des pH-Gradienten angeordnet sind. Wie schematisch in 9 dargestellt kann die mittlere Unterkammer mit der Analytenlösung beschickt werden, während die beiden anderen Unterkammern mit Wasser gefüllt werden und jeweils eine Elektrode enthalten um so als Kathoden- bzw. Anodenvorratsbehälter zu dienen. Auf diese Weise stehen die Elektroden nicht direkt in Kontakt mit der Analytenlösung. Das elektrische Feld muß das IPG-Gel durchtrennen und ein Teil des elektrischen Felds dringt in die Unterkammer, die die zu reinigende Analytenlösung enthält, ein.
Um die Trennung und Aufreinigung einer Analytenlösung mittels solch einer Anordnung eines Elektrophoresegeräts zu beweisen, kann ein Immobilin-Gel (pH-Bereich 4–7) über Nacht bei Raumtemperatur in Wasser erneut quellen gelassen werden. Drei Plastiknäpfchen (Durchmesser 1 cm) mit Ausnehmungen (Durchmesser 0,8 cm), die unten offen sind, können auf das IPG-Gel auf die Linie mit pH 4,5, pH 5,5 bzw. pH 6 gelegt werden. Dann können einhundert μl einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von 300 μM Methylenblau und 10 mM Phenolrot in das mittlere Näpfchen, das mit dem Gel bei pH 6 in Kontakt steht, gegeben werden. In das rechte und linke Näpfchen, die jeweils mit Wasser gefüllt sind, können zwei Platinelektroden gesteckt werden.
Unter diesen Bedingungen sind beide Verbindungen über den gesamten von dem IPG-Gel vorgegebenen pH-Bereich geladen, da Methylenblau ein permanentes Kation ist und Phenolrot unter seinem pKa, der einen Wert von 7,81 aufweist, negativ geladen ist. Methylenblau weist eine blaue Färbung auf, während Phenolrot in seiner anionischen Form gelb ist, so daß die Extraktion von beiden Analyten aus der Analyten-Unterkammer in das IGP-Gel beim Anlegen eines elektrischen Potentials leicht identifiziert werden kann. Beim Anlegen einer konstanten Spannung (500 V) zwischen den beiden Platinelektroden mit einem Hochspannungs-Netzgerät (Landis & Gyr) sieht man nämlich, daß das Methylenblau zur Kathode wandert, während Phenolrot zur Anode wandert. Nachdem eine Stunde lang aufgereinigt wurde, wird mit einer numerischen Kamera (Camedia C-2020 Z – Olympus) ein Digitalphoto des Gels aufgenommen und mit Camedia-Software von Olympus entwickelt. Dieses Photo des IPG-Gels, das in 10 dargestellt ist, zeigt, daß die Reinigung vollständig ist, und zwar aufgrund der Tatsache, daß der Vorratsbehälter in der Mitte farblos ist (keine Farbe im Abschnitt 37 des Gels, der mit dem Analytenvorratsbehälter in Kontakt gestanden ist), während der Abschnitt des Gels unter dem Anodenvorratsbehälter gelb (Fleck 39 in 10) und derjenige unter dem Kathodenvorratsbehälter blau ist (Fleck 39 in 10).
Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Effizient des erfindungsgemäßen Verfahrens, auch dann, wenn in der aufzureinigenden Analytenlösung keine Strömung induziert wird. Es kann jedoch eine Schüttelbewegung in den Unterkammern oder im gesamten Gerät induziert werden, um die Konvektion zu verstärken. Da die Trennungseffizienz und -geschwindigkeit von der Wanderung der geladenen Verbindung in der Analytenlösung abhängt, kann es vorteilhaft sein, die Bildung von Konzentrationsgradienten zu vermeiden und so die Homogenität der Analytenlösung sicherzustellen. Für gewisse Anwendungen, wie die Proteinaufreinigung, kann es auch vorteilhaft sein, die Temperatur der Unterkammern zu steuern und Mittel zur Vermeidung von Niederschlagsbildung hinzuzufügen (zum Beispiel durch Behandeln der Unterkammern mit Ultraschall).
An dieser Stelle ist zu erwähnen, daß die Lösungen im Anoden- und Kathodenvorratsbehälter am Ende der Reinigung leicht gefärbt sein können. Dies zeigt an, daß ein Teil des Methylenblaus und ein Teil des Phenolrots aus dem IPG-Gel in den Anoden- bzw. Kathodenvorratsbehälter extrahiert worden sind, wodurch die Verbindungen, die aus der Analytenlösung in das chemische Puffersystem extrahiert worden sind, in Lösung gewonnen werden können. Dies kann für verschiedene Anwendungen nützlich sein und zeigt einen Grund, mehrere Unterkammern in dem Trenngerät anzuordnen, um verschiedene gereinigte Fraktionen auffangen zu können, wie dies in gewissen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angegeben ist.
Ein Beispiel für ein Aufreinigungsgerät, das mehrere Unterkammern enthält, ist in 11 dargestellt, bei der es sich um eine schematische Darstellung der Anordnung, die für die elektrophoretische Trennung bei statischer Fahrweise mit Online-Nachweis oder Kopplung mit einem weiteren Trennungsschritt verwendet werden kann, handelt. In dieser Darstellung wird das Gerät in einem Plastikträger 40, der die Kammer 41 in Kontakt mit dem chemischen Puffersystem 42 enthält, gehalten. Die Kammer besteht aus mehreren Unterkammern 41, bei denen Zufluß- und Abflußenden vereinigt sind, so daß diese Unterkammern als Vorratsbehälter, welche vor der Aufreinigung mit der Analytenlösung beschickt bzw. aus welchen die Analytenlösung nach der Aufreinigung abgezogen werden kann, verwendet werden. Es sind hier nur drei Unterkammern dargestellt, die Anzahl, Anordnung und Form dieser Unterkammern ist jedoch nicht beschränkt. Für das Einführen der Elektroden, die zum Anlegen des für die Durchführung der elektrophoretischen Reinigung erforderlichen elektrischen Felds dienen, werden zwei zusätzliche Vorratsbehälter 43 und 44 verwendet. Die Unterkammern enthalten auch ein zusätzliches Verbindungssystem 45 (nur eines gezeigt) zur Kopplung mit einem weiteren Gerät 47, das als zusätzlicher Reinigungsschritt oder als Detektor dient. Die Abbildung zeigt, daß zwischen den Unterkammern (oder einer vorgegebenen Position im Verbindungssystem) und dem Zufluß des Geräts 47 ein elektrisches Potential angelegt werden kann, um den hydrodynamischen Fluß der gereinigten Lösungen zu steuern und/oder um ein Elektrospray 46 zu erzeugen, wodurch interessierende Verbindungen, die in der gereinigten Analyselösung vorliegen, nachgewiesen werden können.
Schließlich erleichtert die Gewinnung der interessierenden Verbindung(en) in Lösung weitere Trennungs-, Reinigungs- und/oder Nachweisschritte wesentlich. Zu diesem Zweck können die Unterkammern der in den vorliegenden Versuchen beschriebenen Geräte eine Verbindung (wie zum Beispiel eine Öffnung, eine Rille, einen dichten Schlauch, eine Kapillare, einen dichten Mikrokanal oder ein beliebiges sonstiges Kopplungssystem) enthalten, mit dem die gereinigte Lösung online in ein anderes Nachweissystem eingebracht oder eingespritzt werden kann (siehe zum Beispiel 11). Solch ein System läßt sich mit einem traditionellen Flüssigkeitschromatographen veranschaulichen, der zum Beispiel dazu verwendet wird, um einen Zellextrakt, der nach dem erfindungsgemäßen Elektrophoreseverfahren gereinigt worden ist und der verschiedene interessierende Verbindungen, die einzeln identifiziert werden müssen, enthält, weiter aufzutrennen. Auf ähnliche Weise können Unterkammern des vorliegenden Geräts zum Beispiel direkt mit einem Massenspektrometer gekoppelt werden (wobei eine direkte Probenahme mittels Ansaugen oder mechanischem oder elektrokinetischem Pumpen erfolgt), wobei die interessierende(n) Verbindung(en) online identifiziert werden kann bzw. können.
Obwohl die obige Erfindung zum besseren Verständnis einigermaßen genau durch Abbildungen und Beispiele beschrieben worden ist, wird dem Fachmann angesichts der Lehren der vorliegenden Erfindung leicht klar werden, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der beigelegten Ansprüche abzuweichen.

Claims

Gerät für die elektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen in einer Analytenlösung, wobei das Gerät folgendes umfaßt: (a) eine Kammer, wobei ein Teil von mindestens einer Wand der Kammer aus einem chemischen Puffersystem besteht, wobei das chemische Puffersystem, das einen gewünschten pH-Wert oder pH-Gradienten in seinem Teil, der mit der Analytenlösung in Kontakt steht, definiert und wobei das chemische Puffersystem aus der Reihe immobiles Gel oder Flüssigkeit, die in einem der folgenden: Polymermatrix, Glasfritte, poröse Membran, Filter oder einer Kombination davon verfestigt ist, ausgewählt ist, (b) Mittel zur Erzeugung einer Potentialdifferenz durch dieses chemische Puffersystem hindurch, wodurch ein elektrisches Feld erzeugt wird, das sich entlang dem chemischen Puffersystem erstreckt und in die Analytenlösung eindringt, wobei die geladenen und neutralen Verbindungen dadurch, daß man die geladenen Verbindungen in das chemische Puffersystem extrahiert, differenziell aufgetrennt werden können; (c) Mittel zum Auffangen der Trennfraktionen, gewünschtenfalls in Lösung, wie eine ampholytenfreie oder pufferfreie Lösung; sowie (d) gegebenenfalls ein Mittel für den Wiedereinsatz der Trennfraktionen.
Gerät nach Anspruch 1, wobei die Kammer einen Zufluß und einen Ausfluß, die mit einem hydraulischen Fließsystem in Verbindung stehen, aufweist, wobei die Analytenlösung durch diese Kammer fließen kann.
Gerät nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Kammer nur einen Zufluß und mehrere Abflüsse aufweist, wodurch Fraktionen an unterschiedlichen Teilen des chemischen Puffersystems gewonnen werden können.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Richtung des elektrischen Stroms senkrecht zu der Flußrichtung der Analytenlösung ist.
Gerät nach Anspruch 1, wobei die Kammer einen Zufluß und einen Abfluß aufweist, die miteinander verschmolzen sind, so daß die Kammer ein Reservoir darstellt, das mit der Analytenlösung vor der Auftrennung und Aufreinigung beschickt werden kann und von dem die gereinigte Lösung abgezogen werden kann.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kammer aus einer Mehrzahl von Unterkammern besteht.
Gerät nach Anspruch 6, wobei diese Unterkammern miteinander in Verbindung stehen.
Gerät nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei mindestens eine Unterkammer nicht die zu reinigende Analytenlösung enthält.
Gerät nach Anspruch 8, wobei mindestens eine Unterkammer dazu verwendet wird, um in Lösung (eine) Verbindung(en), die aus der Analytenlösung extrahiert worden sind und innerhalb des chemischen Puffersystems gewandert sind, zu gewinnen.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mittel zur Erzeugung des elektrischen Stroms durch das chemische Puffersystem in dem chemischen Puffersystem integriert ist.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem chemischen Puffersystem um ein Wegwerfprodukt handelt.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der gewünschte pH-Wert oder pH-Gradient in dem chemischen Puffersystem unter Verwendung von kovalent gebundenen Puffermolekülen erzeugt wird.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das chemische Puffersystem die interessierende(n) Verbindung(en) bei einem definierten pH-Wert oder in einem definierten pH-Bereich isoelektrisch zu trennen vermag.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das chemische Puffersystem Verbindungen mit unterschiedlichen pI-Werten, wie Verbindungen mit pI-Unterschieden von weniger als 0,1, Verbindungen mit pI-Unterschieden von weniger als 0,01 und bis zu pI-Unterschieden von 0,001 zu trennen vermag und sich daher unterschiedliche Reinheitsgrade mit diesem chemischen Puffersystem erzielen lassen.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das chemische Puffersystem ein Mittel für die direkte Identifikation und/oder Quantifizierung einer Verbindung oder einer Verbindungsklasse, die von der Analytenlösung aus der Kammer heraus extrahiert worden ist bzw. sind, enthält.
Gerät nach Anspruch 15, wobei das Identifikations- und/oder Quantifizierungsmittel auf der Erzeugung von Licht, der Absorption von Licht, der Reaktion mit einem Blotting-Reagenz oder Marker, der Erzeugung einer elektroaktiven Spezies oder der spezifischen molekularen Erkennung von Verbindungen wie der Bildung eines Antigen-Antikörperkomplexes oder einer Enzymreaktion beruht.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiter ein Mittel aufweist, das die direkte Adsorption der neutralen Verbindungen an die Wand des chemischen Puffersystems verhindert, wobei dieses Mittel ein feines Membrantrennstück umfaßt.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiter ein Mittel zur Steuerung der Temperatur des Geräts und der Analytenlösung umfaßt.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin ein Kopplungsmittel umfaßt, mittels deren die aufgereinigte Analytenlösung und/oder die gewonnenen geladenen Verbindungen von dem Gerät zu anderen Trenn- und/oder Nachweissystemen geleitet werden können.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das in Multiplex-Form vorliegt, wodurch eine gleichzeitige und/oder parallele elektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen erlaubt.
Verfahren für die elektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen in einer Analytenlösung und Auffangen der Trennfraktionen mit dem Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Verbindungen in Lösung, gewünschtenfalls in einer ampholytenfreien oder pufferfreien Lösung, gewonnen werden können.
Verfahren nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei es sich bei den Verbindungen um biologische Verbindungen wie organische Verbindungen, zum Beispiel Proteine oder Proteinderivate oder -isoformen, handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Analytenlösung ein organisches Lösungsmittel enthält oder nichtwässrig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Gerät für die Beschickung des chemischen Puffersystems mit interessierenden Verbindungen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Analytenlösung in der Kammer erneuert wird, um interessierende Verbindungen in dem chemischen Puffersystem anzureichern.
Kit, das ein Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 20 mit Anweisungen für die elektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen in einer Analytenlösung umfaßt.
Kit nach Anspruch 27, wobei die Verbindungen in einer Lösung wie einer ampholytenfreien oder pufferfreien Lösung gewonnen werden können.
Kit nach Anspruch 27 oder 28, das bestimmte Chemikalien, die für die elektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung mit der Analytenlösung gemischt werden müssen, umfaßt.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 29, das bestimmte Chemikalien und/oder ein Trennsystem, die/das für die Herstellung der Analytenlösung vor der elektrophoretischen Auftrennung und Aufreinigung erforderlich sind/ist, umfaßt.
Kit nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem Trennsystem um eine Ausschlussmembran („cut-off membrane") und/oder ein Entsalzungssystem handelt.