DE60117984T2

DE60117984T2 - Zusammensetzung und verfahren zur reparatur und regenerierung von knorpel und anderen geweben

Info

Publication number: DE60117984T2
Application number: DE60117984T
Authority: DE
Inventors: D. Caroline Montreal HOEMANN; D. Michael Montreal BUSCHMANN; D. Marc Montreal McKEE
Original assignee: Biosyntech Canada Inc
Current assignee: Biosyntech Canada Inc
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-12-14
Also published as: IL153490A0; DE60117984T8; EP1294414B1; WO2002000272A2; US20110086008A1; ES2260241T3; NZ523763A; CA2412505A1; HK1055563A1; US20020082220A1; AU2001268882B2; PT1294414E; ZA200300597B; WO2002000272A3; EP1294414A2; KR100880622B1; CA2412505C; CY1106313T1; KR20030027904A; SG149679A1

Description

Hintergrund der Erfindung
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur Verbesserung der Reparatur und zur Regeneration von Knorpelgeweben und anderen Geweben einschließlich unter anderen Meniskus, Bändern, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgeweben, Abszessen, resezierten Tumoren und Geschwüren und ihre Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments für die Gewebereparatur.
(b) Beschreibung der Erfindung
1) Das Problem der Knorpelreparatur:
Knorpel: Struktur, Funktion, Entwicklung, Pathologie
Gelenkknorpel bedeckt die Enden von Knochen in echten Gelenken, um die Bewegungskräfte auf darunterliegende Knochenstrukturen zu verteilen und gleichzeitig für fast reibungslose Gelenkflächen zu sorgen. Diese Eigenschaften werden von der extrazellulären Matrix verliehen, die aus Collagen Typ II und anderen Collagen-Nebenkomponenten besteht und einen hohen Gehalt an dem Proteoglycan Aggrecan hat. Im Allgemeinen kann das fibrilläre Collagennetzwerk Zug- und Scherkräften widerstehen, während das hochgeladene Aggrecan Druck und der Strömung der interstitiellen Flüssigkeit widerstehen kann. Die Eigenschaften der geringen Reibung sind das Ergebnis einer speziellen molekularen Zusammensetzung der Gelenkfläche und der Synovialflüssigkeit sowie der Ausschwitzung von interstitieller Flüssigkeit während der Belastung der Gelenkfläche (Ateshian, 1997; Higaki et al., 1997; Schwartz und Hills, 1998).
Gelenkknorpel entsteht während der Entwicklung von langen Knochen nach der Kondensation von prächondrocytischen Mesenchymzellen und der Induktion eines Phänotypwechsels von vorwiegend Collagen Typ I zu Collagen Typ II und Aggrecan (Hall, 1983; Pechak et al., 1986). Knochen wird aus Knorpel gebildet, wenn Chondrocyten hypertrophieren und zur Expression von Collagen Typ X übergehen, was von einer Blutgefäßinvasion, Matrixverkalkung, dem Auftreten von Osteoblasten und Knochenmatrixproduktion begleitet ist. Beim Erwachsenen bleibt eine dünne Schicht Gelenkknorpel an den Enden von Knochen und wird von Chondrocyten durch die Synthese, den Zusammenbau und den Umsatz von extrazellulärer Matrix aufrechterhalten (Kuettner, 1992). Eine Gelenkknorpelkrankheit tritt auf, wenn Brüche aufgrund von physischem Trauma auftreten oder wenn eine allmählichere Erosion, wie sie für viele Formen der Arthritis charakteristisch ist, den subchondralen Knochen freilegt und dadurch symptomatische Gelenkschmerzen erzeugt (McCarthy und Koopman, 1993). Außer Gelenkknorpel bleiben beim Erwachsenen an mehreren Körperstellen Knorpelgewebe zurück, wie Ohren und Nase, Bereiche, die häufig rekonstitutiven Operationen unterzogen werden.
2) Knorpelreparatur: die natürliche Reaktion
Gelenkknorpel reagiert beim Erwachsenen nur eingeschränkt auf Verletzungen, hauptsächlich aufgrund fehlender Vaskularisierung und der Anwesenheit einer dichten proteoglycanreichen extrazellulären Matrix (Newman, 1998; Buckwalter und Mankin, 1997; Minas und Nehrer, 1997). Erstere hemmt das Auftreten von Entzündungszellen und pluripotenten Reparaturzellen, während letztere vorhandene Chondrocyten in einer Matrix einschließt, was einer Wanderung nicht förderlich ist. Läsionen, die in den subchondralen Knochen eindringen, erzeugen jedoch einen Kanal zum hochvaskulären Knochen, was die Bildung eines Fibringerinnsels ermöglicht, das Zellen, die aus Knochen und Knochenmark stammen, in der Läsion einschließt, was zu einem Granulationsgewebe führt. Die tieferen Teile des Granulationsgewebes rekonstituieren die subchondrale Knochenplatte, während sich der obere Teil in ein faserknorpelartigen Reparaturgewebe umwandelt. Dieses Gewebe kann zeitweilig das histologische Erscheinungsbild von Hyalinknorpel haben, wenn auch nicht dessen mechanische Eigenschaften (Wei et al., 1997), und ist daher nicht in der Lage, der lokalen mechanischen Umgebung zu widerstehen, was zum Auftreten von Degeneration vor dem Ende des ersten Jahres nach der Verletzung führt. Die natürliche Reaktion auf eine Reparatur im Gelenkknorpel von Erwachsenen besteht also darin, dass Läsionen in partieller Dicke keine Reparaturreaktion haben (außer Fließen von Knorpel und lokalisierter Chondrocytenklonierung), während Läsionen in voller Dicke mit Durchdringung bis zum Knochen eine beschränkte und unpassende Reaktion zeigen. Das Alter ist jedoch ein wichtiger Faktor, da Läsionen in voller Dicke beim unreifen Gelenkknorpel besser heilen als beim Erwachsenen (DePalma et al., 1966; Wei et al., 1997) und oberflächliche Einrisse im fetalen Gelenkknorpel in einem Monat vollständig heilen, ohne dass Gefäße oder aus dem Knochen stammende Zellen beteiligt sind (Namba et al., 1998).
3) Derzeitige Ansätze für eine unterstützte Knorpelreparatur
Derzeitige klinische Behandlungen von symptomatischen Knorpeldefekten beinhalten Techniken, die abzielen auf: 1) Entfernung von Oberflächenunregelmäßigkeiten durch Rasieren und Glätten; 2) Penetration des subchondralen Knochens durch Bohren, Frakturierung oder Abrasion, um die oben beschriebene natürliche Reparaturreaktion zu verstärken (d.h. die Familie der Knochenmark-Stimulationstechniken); 3) Gelenkneuausrichtung oder Osteotomie zur Verwendung des verbleibenden Knorpels für das Gelenk; 4) pharmakologische Modulation; 5) Gewebetransplantation; und 6) Zelltransplantation (Newman, 1998; Buckwalter und Mankin, 1997). Von den meisten dieser Verfahren wurde gezeigt, dass sie einen kurzzeitigen Nutzen bezüglich einer Reduktion der Symptome haben (Monate bis wenige Jahre), doch ist keines in der Lage, durchweg nach den ersten paar Jahren eine erfolgreiche Reparatur von Gelenkläsionen aufzuweisen. Die Knochenmark-Stimulationstechniken des Rasierens, Glättens, Bohrens, der Frakturierung und Abrasionsarthroplastie erlauben eine zeitweilige Linderung der Symptome, erzeugen jedoch ein subfunktionelles faserknorpelartiges Gewebe, das schließlich abgebaut wird. Die pharmakologische Modulation, bei der Defektstellen Wachstumsfaktoren zugeführt werden, kann die natürliche Reparatur verstärken, aber bisher noch unzureichend (Hunziker und Rosenberg, 1996; Sellers et al., 1997). Osteochondrale Allograft- und Autograft-Gewebetransplantate, die lebensfähige Chondrocyten enthalten, können eine erfolgreichere Reparatur bewirken, leiden jedoch unter schweren Einschränkungen bezüglich des Spenders (Mahomed et al., 1992; Outerbridge et al., 1995).
4) Knochenmarkstimulation
Die Familie der Knochenmark-Stimulationstechniken umfasst das Glätten, Rasieren, Bohren, Mikrofrakturierung und Abrasionsarthroplastie. Sie werden zur Zeit extensiv in der orthopädischen klinischen Praxis für die Behandlung von fokalen Läsionen von Gelenkknorpel verwendet, die die volle Dicke umfassen, d.h. den subchondralen Knochen erreichen, und von begrenzter Größe sind, typischerweise einer Fläche von weniger als 3 cm². Die Verwendung dieser Verfahren wurde von Pridie und anderen eingeleitet (Pridie, 1959; Insall, 1967; DePalma et al., 1966), die argumentierten, dass im Bereich einer Gelenkknorpelläsion ein Blutgerinnsel entstehen könnte, indem man die Grenzfläche zwischen Knorpel und Knochen verletzt und dadurch eine Blutung aus dem Knochen in den Knorpeldefekt, der gefäßlos ist, induziert. Dieses Hämatom könnte dann die klassische Kaskade von Wundheilungsereignissen einleiten, die bei Wunden von vaskularisierten Geweben zu einer erfolgreichen Heilung oder wenigstens Narbenbildung führt (Clark, 1996). Variationen der Pridie-Bohrtechnik wurden später vorgeschlagen, einschließlich der Abrasionsarthroplastie (Childers und Ellwood, 1979; Johnson, 1991) und der Mikrofrakturierung (Rodrigo et al., 1993; Steadman et al., 1997). Bei der Abrasionsarthroplastie werden motorisierte Instrumente verwendet, um abnormal dichten subchondralen Knochen wegzuschleifen und dadurch eine Blutversorgung im weicheren tieferen Knochen zu erreichen. Bei der Mikrofrakturierungstechnik wird eine Hacke oder Ahle verwendet, um die subchondrale Knochenplatte tief genug zu durchbohren (typischer weise 3–4 mm) und dadurch wiederum eine Gefäßversorgung zu erreichen und ein Blutgerinnsel innerhalb der Knorpelläsion zu schaffen. Ärzte, die die Mikrofrakturierungstechnik praktizieren, behaupten, eine höhere Erfolgsrate als beim Bohren zu beobachten, und zwar aufgrund des Fehlens von hitzeinduzierter Nekrose und einer geringeren biomechanischen Destabilisierung der subchondralen Knochenplatte mit zahlreichen kleineren Bruchlöchern anstelle von großen Lücken in der Platte, die durch Bohren entstehen (Steadman et al., 1998). Noch eine andere verwandte Technik zur Behandlung von fokalen Läsionen von Gelenkknorpel ist die Mosaikplastik oder osteochondrale Autograft-Transplantation (OATS), bei der Knorpel/Knochen-Zylinder von einem peripheren "nicht gebrauchten" Bereich eines Gelenks auf den stark belasteten Bereich, der die Knorpelläsion enthält, übertragen werden (Hangody et al., 1997).
Es gibt unter den Orthopäden keinen universellen Konsens darüber, welche Art von Gelenkknorpelläsion welche Art der Behandlung erhalten sollte. Außerdem fehlen rigorose wissenschaftliche Studien, die die Wirksamkeit dieser Behandlungen bei bestimmten Indikationen nachweisen. Die Wahl der Behandlung von Knorpelläsionen hängt also großenteils von der Ausbildung, den Neigungen und der persönlichen Erfahrung des behandelnden Arztes ab. Die Gründe für diesen fehlenden Konsens sind mannigfaltig, umfassen jedoch die Variabilität im Typ der behandelten Läsion und den variablen oder sogar unkontrollierbaren Erfolg bei der Bildung eines Blutgerinnsels "guter Qualität". Einige der Probleme, die mit der Bildung eines Blutgerinnsels guter Qualität mit diesen Verfahren verbunden sind, sind 1) die unkontrollierbare Natur der Blutung, die aus dem Knochen kommt und die die Knorpelläsion niemals ganz ausfüllt; 2) die durch Blutplättchen vermittelte Gerinnselkontraktion, die innerhalb von Minuten nach der Gerinnselbildung auftritt, reduziert die Größe des Gerinnsels und könnte ihn vom umgebenden Knorpel ablösen (Cohen et al., 1975); 3) die Verdünnung des Knochenbluts mit Synovialflüssigkeit oder zirkulierender Arthroskopieflüssigkeit; und 4) die fibrinolytische oder gerinnselauflösende Wirkung der Synovialflüssigkeit (Mankin, 1974). Einige dieser Probleme waren die Motivation hinter einigen Studien, bei denen ein Blutgerinnsel ex vivo gebildet und dann zurechtgeschnitten und in einen Meniskusdefekt (Arnoczky et al., 1988) oder einen osteo chondralen Defekt (Palette et al., 1992) gepackt wird. Dann erfolgte etwas ähnliches wie bei der klassischen Wundheilungskaskade, was die Heilung des Defekts unterstützt. Dieser Ansatz sorgte eindeutig für eine stärkere Ausfüllung des Defekts mit Reparaturgewebe, doch die Qualität des Reparaturgewebes war im Allgemeinen nicht annehmbar, da es vorwiegend faserig und mechanisch unzureichend war. Einige wahrscheinliche Gründe für ein weniger als befriedigendes Reparaturgewebe mit diesem Ansatz sind: 1) fortgesetzte blutplättchenvermittelte Gerinnselkontraktion; 2) fehlende Lebensfähigkeit einiger Blutkomponenten aufgrund einer extensiven ex-vivo-Manipulation; und 3) die Verfestigung des Gerinnsels ex vivo, was eine gute Anhaftung an alle Gewebeoberflächen, die den Knorpeldefekt umgeben, verhindert und die Ausfüllung des Defekts beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass derzeitige klinische Verfahren, die von Orthopäden zur Behandlung fokaler Läsionen von Gelenkknorpel praktiziert werden, meistens von der Bildung eines Blutgerinnsels innerhalb der Läsion abhängen. Die Fähigkeit zur Bildung eines Blutgerinnsels guter Qualität, das die Läsion ausfüllt und alle für die Wundheilung geeigneten Elemente (Blutplättchen, Monocyten, Fibrinnetzwerk usw.) in einem lebensfähigen Zustand enthält, liefert jedoch nicht reproduzierbare und häufig unbefriedigende Ergebnisse. Eine der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verbessert diese Situation, indem sie eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitstellt, um diese im Blut vorkommenden Wundheilungselemente in einer vollvolumigen nichtkontrahierenden Matrix an eine Gelenkknorpelläsion abzugeben.
5) Biomaterialien und Wachstumsfaktoren
Mehrere experimentelle Techniken wurden vorgeschlagen, um Knorpelläsionen mit Hilfe von Biomaterialien und Wachstumsfaktoren, manchmal jeweils allein, aber häufig auch in Kombination, zu reparieren. Die Analogie zu der oben beschriebenen Familie der Knochenmark-Stimulationstechniken ist klar. Das Fibringerüst des Blutgerinnsels könnte durch ein vorgefertigtes Biomaterialgerüst ersetzt werden, und die natürlichen mitogenen und chemotaktischen Faktoren im Blutgerinnsel könnten durch anwendergesteuerte Mengen und Spezies von löslichen Elementen, wie rekombinanten Wachstumsfaktoren, ersetzt werden. Beispiele für diesen Ansatz sind die Verwendung von Fibrinkleber zur Abgabe rekombinanter Proteine, wie insulinartiger Wachstumsfaktoren (Nixon et al., 1999) und transformierender Wachstumsfaktoren (Hunziker und Rosenberg, 1996). Andere biologische Substanzen wurden mit generischen Biomaterialien kombiniert, wie Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA), Collagenmatrices und Fibrinklebern einschließlich knochenmorphogenetischer Proteine (Sellers et al., 1997; Sellers, 2000; Zhang et al., Patent WO 00/44413, 2000), angiotensinartiger Peptide (Rodgers und Dizerega, Patent WO 00/02905, 2000) und Knochenextrakten, die eine Menge von Proteinen enthalten, die Knochenproteine oder BP genannt werden (Atkinson, Patent WO 00/48550, 2000). Bei dem letzteren Verfahren mussten mit BP getränkte Collagenschwämme mit Hilfe eines zusätzlichen Klebers auf Fibrin/Thrombin-Basis in dem Knorpeldefekt gehalten werden, wodurch eine ziemlich komplexe und schwierig zu reproduzierende Wundheilungsumgebung entstand. Eine Beschichtung des Biomaterials mit Fibronektin oder RGD-Peptiden zur Unterstützung der Zelladhäsion und der Zellmigration wurde durchgeführt (Breckke und Coutts, US-Patent 6,005,161, 1999). Bei einigen früheren Verfahren wurde mit begrenztem Erfolg eine Knochenmarkstimulation mit einer postoperativen Injektion von Wachstumshormon in den Synovialraum kombiniert (Dunn und Dunn, US-Patent 5,368,051, 1994). Es wurden auch spezifische Biomaterialzusammensetzungen vorgeschlagen, wie Gemische von Collagen, Chitosan und Glycoaminoglycanen (Collombel et al., US-Patent 5,166,187, 1992; Suh et al., Patent WO 99/47186, 1999), eine Paste aus zerkleinertem Knorpel und Knochen (Stone, US-Patent 6,110,209, 2000), ein mehrkomponentiges Konstrukt auf Collagenbasis (Pahcence et al., US-Patent 6,080,194, 2000) und ein härtbares, chemisch reaktives Harz auf Methacrylatbasis (Braden et al., US-Patent 5,468,787, 1995). Aufgrund ihrer Unfähigkeit, einige der folgenden Probleme zu überwinden, hat keiner dieser Ansätze die klinische Phase erreicht: 1) fehlende Retention und Adhärenz des Biomaterials im Knorpeldefekt; 2) fehlende nachhaltige Freisetzung von aktiven Formen dieser Moleküle in effektiven Konzentrationen über längere Zeiträume; 3) mehrfache und unkontrollierte biologische Aktivitäten der abgegebenen Moleküle; 4) Cytotoxizität der sauren Abbauprodukte von PGA und PLA; 5) unbrauchbare Abbaukinetik oder Immunogenität des Trägerbiomaterials; und 6) unerwünschte systemische oder ektopische Wirkungen (Verkalkung von Organen) der aktiven biologischen Substanzen. Für die erfolgreiche Ausführung dieser Ansätze ist noch die Lösung einiger oder aller dieser Probleme erforderlich.
6) Zelltransplantation
Techniken, die eine Zelltransplantation beinhalten, erregten in letzter Zeit viel Interesse aufgrund ihrer Fähigkeit, durch Einführung einer großen Zahl von autologen Chondrocyten (Grande et al., 1989; Brittberg et al., 1994 und 1996; Breinan et al., 1997), allogenen Chondrocyten (Chesterman und Smith, 1968; Bently und Greer, 1971; Green, 1977; Aston und Bently, 1986; Itay et al., 1987; Wakatini et al., 1989; Robinson et al. 1990; Freed et al., 1994; Noguchi et al., 1994; Hendrickson et al., 1994; Kandel et al., 1995; Sams und Nixon, 1995; Specchia et al., 1996; Frankel et al., 1997; Hyc et al. 1997; Kawamura et al., 1998), xenogenen Chondrocyten (Homminga et al., 1991), perichondrialen Zellen (Chu et al., 1995; Chu et al., 1997) oder autogenen und allogenen, von Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (Wakatini et al., 1994; Butnariu-Ephrat, 1996; Caplan et al., 1997; Nevo et al., 1998) in Gelenkdefekte nach ex-vivo-Kultivierung und Manipulation die Knorpelreparatur zu verstärken. Der Zelltransplantationsansatz besitzt insofern ein paar potentielle Vorteile gegenüber anderen Knorpelreparaturtechniken, als er 1) zusätzliche Knorpel- und Knochenverletzungen minimiert, 2) die Abhängigkeit von Spendern durch ex-vivo-Zellproduktion reduziert, 3) natürliche biologische Vorgänge der Knorpelentwicklung nachbilden konnte und 4) maßgeschneiderte Zelltypen liefern kann, die eine bessere Reparatur ausführen. Eine Technik, bei der autologe Chondrocyten verwendet werden, ist gemeinfrei und kommerziell erhältlich und wurde schon bei mehreren tausend US-amerikanischen und schwedischen Patienten verwendet (http.//www.genzyme.com). Bei dieser Technik werden Chondrocyten aus einer Knorpelbiopsie aus einem nichtbelasteten Bereich isoliert, während mehrerer Wochen vermehrt und durch Injektion unter einen genähten und mit Fibrin versiegelten periostealen Patch, der aus dem Schienbein des Patienten entnommen wurde, wieder in die Knorpelläsion eingeführt. Die Kenntnis ihrer Wirksamkeit wurde in Frage gestellt (Messner und Gillquist, 1996; Brittberg, 1997; Newman, 1998) und ist aufgrund des fehlenden Abschlusses einer von der FDA verlangten kontrollierten und randomisierten klinischen Studie unglücklicherweise nicht bekannt. Jüngere Tierstudien deuten darauf hin, dass die injizierten, kultivierten autologen Chondrocyten nur sehr wenig zu der beobachteten Heilung beitragen und dass das Ergebnis demjenigen ähnlich ist, das man bei Verwendung von Knochenmarkstimulation erhält (Breinan et al., 1997, und Breinan et al., 2000). So könnte auch bei diesem Verfahren die chirurgische Präparation des Defekts der Hauptfaktor sein, der die Reparatur induziert. Dennoch wurde aufgrund des enormen potentiellen Nutzens der Zelltransplantation in den letzten zwei Jahren eine große Zahl von Patenten erteilt, um Aspekte der autologen Chondrocytenverarbeitung (Tubo et al., US-Patent 5,723,331, 1998; Villeneuve, US-Patent 5,866,415, 1999) sowie die Verwendung und Präparation von Adipocyten (Mueller und Thaler, US-Patent 5,837,235, 1998; Halvorsen et al., Patent EP 1 077 253, 2001 ), hämatopoetischen Vorläufern (Peterson und Nousek-Goebl, US-Patent 6,200,606, 2001), amniotischen Membranzellen (Sackier, 1997), mesenchymalen Stammzellen (Caplan und Hayneeworth, US-Patent 5,811,094, 1996; Naughton und Naughton, US-Patent 5,785,964, 1998; Naughton und Willoughby, US-Patent 5,842,477, 1998; Grande und Lucas, US-Patent 5,906,934, 1999; Johnstone und Yoo, US-Patent 5,908,784, 1999) sowie allgemeine Techniken unter Verwendung von Chondrocyten/Fibroblasten und ihren Vorläufern, Epithelzellen, Adipocyten, Plazentazellen und Nabelschnurblutzellen (Purchio et al., US-Patent 5,902,741, 1999), alles zur Verwendung bei der Knorpelreparatur, zu schützen.
7) Das Problem der Zellabgabe
Die Zelltransplantation für die gestützte Knorpelreparatur beinhaltet notwendigerweise eine Technik zur Abgabe und Retention von lebensfähigen und funktionellen transplantierten Zellen an der Verletzungsstelle. Wenn Zellen ex vivo mit oder ohne eine Trägermatrix gezüchtet werden, können sie durch Pressen eingepasst werden, indem man ein Implantat herstellt, das geringfügig größer ist als der Defekt, und es hineindrückt (Aston und Bentley 1986; Wakatini et al., 1989; Freed et al., 1994; Chu et al., 1997; Frankel et al., 1997; Kawamura et al., 1998). Das Einpassen durch Pressen erfordert die Verwendung eines Gewebes, das ex vivo gebildet wird und somit für die geometrischen, physikalischen und biologischen Faktoren der Stelle, in die es implantiert wird, nicht optimiert ist. Das Einnähen oder Anheften des Implantats kann die Retention unterstützen (Sams und Nixon, 1995), obwohl bekannt ist, dass Nähte eine weitere Verletzung der Gelenkfläche darstellen, die einen weiteren Vorgang der begrenzten Reparatur induziert (Breinan et al., 1997). Biologische Kleber wurden mit begrenztem Erfolg ausprobiert (Kandel et al., 1995; Jurgenson et al., 1997). Wenn das Implantat einem Einpassen durch Pressen nicht zugänglich ist, wie bei kontrahierenden Collagengelen oder Fibringerinnseln, wird häufig ein eingenähtes Patch aus Periosteum oder einem anderen, ähnlichen Gewebe verwendet, um das implantierte Material innerhalb der Defektstelle zu halten (Grande et al., 1989; Brittberg et al., 1994; Grande et al., 1989; Brittberg et al., 1996; Breinan et al., 1997). Eine solche Technik kann aus der Fähigkeit des Periosteums, die Knorpelbildung zu stimulieren (O'Driscoll et al., 1988 und 1994), profitieren, leidet jedoch wiederum unter der Einführung von Nähten und der komplexen Natur der Operation, die das Ernten von Periosteum und eine Arthrotomie beinhaltet. Zellen wurden auch an tiefe Defekte mit voller Dicke abgegeben, wobei man eine viskose Hyaluronsäurelösung verwendet (Robinson et al, 1990; Butnariu-Ephrat, 1996). Wie bei den Zellquellen für die Knorpelreparatur gibt es mehrere vor kurzem veröffentlichte Patente für Abgabeträger bei der Knorpelreparatur, die von Gelmatrices (Griffith et al., 1998; Caplan et al., 1999) bis zu Nähten und Fasern (Vacanti et al., 1996; Vacanti und Langer, 1998a und 1998b) bis zu Vorrichtungen des Schraubentyps (Schwartz, 1998) und magnetischen Systemen (Halpern, 1997) reichen. Wenn man das obige zusammenfasst, sind die derzeitigen Zellabgabetechniken für die Knorpelreparatur eindeutig nicht optimal. Ein wünschenswerter Zellabgabeträger wäre eine mit Zellen beladene Polymerlösung, die fest wird, wenn sie in die Defektstelle injiziert wird, anhaftet und den Defekt ausfüllt und ein vorläufiges biologisch abbaubares Gerüst ergibt, das die richtige Zelldifferenzierung und die Synthese und den Zusammenbau einer dichten, mechanisch funktionellen extrazellulären Gelenkknorpelmatrix ermöglicht.
8) Reparatur anderer Gewebe einschließlich Meniskus, Bändern, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgeweben, Abszessen, resezierten Tumoren und Geschwüren
Die natürliche und unterstützte Reparatur von Muskelskelett- und anderen Geweben sind sehr weite Gebiete mit zahlreichen komplexen biologischen Prozessen und einer Vielzahl von Ansätzen, um den Reparaturvorgang zu beschleunigen (wie bei der Knochenreparatur), ihn bei Geweben, die eine geringe intrinsische Reparaturfähigkeit haben, zu unterstützen (wie bei der Knorpelreparatur) und die Narbenbildung zu reduzieren (wie bei Behandlungen von Verbrennungen) (Clark, 1996). Obwohl bei den beteiligten biologischen Elementen und Vorgängen bestimmt Unterschiede auftreten, sind die globalen Ereignisse bei der (nichtfetalen) Wundreparatur identisch. Dazu gehören die Bildung eines Blutgerinnsels an der Stelle der Gewebeschädigung, die Freisetzung von chemotaktischen und mitogenen Faktoren aus Blutplättchen, das Einfließen von Entzündungszellen und pluripotenten Reparaturzellen, die Vaskularisierung und schließlich die Lösung des Reparaturvorgangs durch Differenzierung von Reparaturzellen und Synthese von extrazellulären Matrixkomponenten. Bei einem erfolgreichen Reparaturergebnis führen die spezifische lokale Gewebeumgebung und die spezifische lokale Population von pluripotenten Reparaturzellen zur Bildung der richtigen Gewebeart, Knochen zum Ersetzen von Knochen, Haut zum Ersetzen von Haut usw. Bei der Ähnlichkeit der allgemeinen Elemente im Gewebereparaturvorgang ist es nicht überraschend, dass Ansätze zur Unterstützung der Reparatur in einem Gewebe auch einen gewissen Erfolg bei der Unterstützung der Reparatur in anderen Geweben haben könnten. Diese Möglichkeit wird viel wahrscheinlicher, wenn das Verfahren und die Zusammensetzung zur Unterstützung der Reparatur darauf beruhen, einen Aspekt der natürlichen Wundheilungskaskade zu verstärken, ohne wesentlich von dieser mehr oder weniger optimierten Abfolge von Ereignissen abzuweichen. In der vorliegenden Erfindung werden eine besondere Zusammensetzung und besonde re Verfahren vorgeschlagen, um ein effektiveres, adhäsives und nichtkontrahierendes Blutgerinnsel an der Stelle der Gewebereparatur zu erhalten. Beispiele und bevorzugte Ausführungsformen werden für die Knorpelreparatur gezeigt, eines der am schwierigsten zu reparierenden Gewebe. Die Anwendung der Zusammensetzung und des Verfahrens und ihrer Modifikationen unter Beibehaltung derselben Grundprinzipien zur Unterstützung der Reparatur von anderen Geweben einschließlich Meniskus, Bändern, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgeweben, Abszessen, resezierten Tumoren und Geschwüren sind für den Fachmann jedoch offensichtlich.
9) Verwendung von Chitosan in Pharmaka, bei der Wundheilung, Gewebereparatur und als Hämostatikum
Chitosan, das in erster Linie aus der alkalischen Deacetylierung von Chitin, einer natürlichen Komponente von Garnelen- und Krabbenschalen, resultiert, ist eine Familie von linearen Polysacchariden, die 1-4-verknüpfte Glucosamin- (vorwiegend) und N-Acetylglucosamin-Monomeren enthält (Austin et al. 1981). Chitosan und seine aminosubstituierten Derivate sind pH-abhängige, bioerodierbare und biokompatible kationische Polymere, die in der biomedizinischen Industrie für die Wundheilung und Knocheninduktion (Denuziere et al., 1998; Muzzarelli et al., 1993 und 1994), Wirkstoff- und Genabgabe (Carreno-Gomez und Duncan, 1997; Schipper et al., 1997; Lee et al., 1998; Bernkop-Schnurch und Pasta, 1998) sowie in Gerüsten für das Zellwachstum und die Zelleinkapselung (Yagi et al, 1997; Eser Elcin et al., 1998; Dillon et al., 1998; Koyano et al., 1998; Sechriest et al, 2000; Lahiji et al 2000; Suh et al., 2000) verwendet werden. Chitosan wird ein mukoadhäsives Polymer genannt (Bernkop-Schnurch und Krajicek, 1998), da es über ionische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Schleimschicht des gastrointestinalen Epithels anhaftet und dadurch die perorale Wirkstoffabgabe erleichtert. Der biologische Abbau von Chitosan erfolgt über seine Anfälligkeit für enzymatische Spaltung durch Chitinasen (Fukamizo und Brzezinski, 1997), Lysozyme (Sashiwa et al., 1990), Cellulasen (Yalpani und Pantaleone, 1994), Proteasen (Terbojevich et al., 1996) und Lipasen (Muzzarelli et al., 1995). Vor kurzem wurde gezeigt, dass Chondrocyten Chitotriosidase exprimieren können (Vasios et al., 1999), das humane Analogon von Chitosanase; seine physiologische Rolle liegt vielleicht im Abbau von Hyaluronan, einem linearen Polysaccharid, das eine gewisse Ähnlichkeit mit Chitosan besitzt, da es aus Disacchariden von N-Acetylglucosamin und Glucuronsäure besteht.
Chitosan in zahlreichen Zubereitungen allein und mit anderen Komponenten wurde in mehreren Berichten (Sall et al., 1987; Bartone und Adickes, 1988; Okamoto et al., 1995; Inui et al., 1995; Shigemasa und Minami, 1996; Ueno et al., 1999; Cho et al., 1999; Stone et al., 2000; Lee et al., 2000) und Erfindungen (Sparkes und Murray, US-Patent 4,572,906, 1986; Mosbey, US-Patent 4,956,350, 1990; Hansson et al., US-Patent 5,894,070, 1999; Gouda und Larm, US-Patent 5,902,798, 1999; Drohan et al., US-Patent 6,124,273, 2000; Jorgensen WO 98/22114, 1998) vorgeschlagen, um die Reparatur von Haut-, Augenhornhaut- und Hartgeweben zu stimulieren. Die Eigenschaften von Chitosan, die am häufigsten als günstig für den Wundreparaturvorgang genannt werden, sind seine biologische Abbaubarkeit, Adhäsionsvermögen, Verhinderung der Dehydratation und die Eigenschaft als Sperre gegenüber einer bakteriellen Invasion. Weitere Eigenschaften, die ebenfalls behauptet wurden, sind seine zellaktivierende und chemoattraktive Natur (Peluso et al., 1994; Shigemasa und Minami, 1996; Inui et al., 1995), seine hämostatische Aktivität (Malette et al., 1983; Malette und Quigley, US-Patent 4,532,134, 1985) und eine anscheinende Fähigkeit, Fibroplasie und Narbenbildung einzuschränken, indem es eine lockerere Art von Granulationsgewebe fördert (Bartone und Adickes, 1988; Stone et al., 2000). Obwohl ein allgemeiner Konsensus über die günstigen Wirkungen von Chitosan bei der Wundheilung zu erkennen ist, ist weder sein genauer Wirkungsmechanismus bekannt, noch die effektivste Methode seiner Anwendung, d.h. als Pulver, Suspension, Schwamm, Membran, festes Gel usw. Ein Teil des Grundes für die Unklarheit seines Wirkungsmechanismus könnte sein, dass in vielen früheren Studien Chitosan verwendet wurde, das chemisch nicht definiert (Acetylgehalt und -verteilung, Molekulargewicht) und von unbekannter Reinheit war. Das interessante hämostatische Potential von Chitosan hat auch zu seiner direkten Anwendung zum Reduzieren von Blutungen bei Implantaten und Wundstellen geführt (Malette et al., 1983; Malette und Quigley, US-Patent 4,532,134, 1985). In einigen Studien wird behauptet, dass die hämostatische Aktivität von Chitosan ausschließlich auf seine Fähigkeit zurückzuführen ist, rote Blutkörperchen zu agglutinieren (Rao und Sharma, 1997), während andere glauben, dass sein polykationischer Amincharakter Blutplättchen dazu aktivieren kann, Thrombin freizusetzen und die klassische Gerinnungskaskade einzuleiten, was zu seiner Verwendung als Hämostatikum in Kombination mit Fibrinogen und gereinigten autologen Blutplättchen führte (Cochrum et al., US-Patent 5,773,033, 1998). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist es wichtig festzustellen, dass es in diesen Berichten und Erfindungen völlig an jedem Beispiel fehlt, bei dem Blut mit Chitosan in Lösung gemischt und therapeutisch angewendet wurde, um die Gewebereparatur über die Bildung eines chitosanhaltigen Blutgerinnsels an der Reparaturstelle zu unterstützen.
Eine technische Schwierigkeit, die Chitosan häufig aufweist, ist seine geringe Löslichkeit bei physiologischem pH-Wert und physiologischer Ionenstärke, wodurch seine Verwendung im Lösungszustand eingeschränkt wird. Die Auflösung von Chitosan wird also typischerweise über die Protonierung von Amingruppen in sauren wässrigen Lösungen mit einem pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 5,6 erreicht. Solche Chitosanlösungen bleiben bis zu einem pH in der Nähe von 6,2 löslich, wo die Neutralisation der Amingruppen die elektrostatische Abstoßung zwischen den Ketten reduziert und es ermöglicht, dass anziehende Kräfte von Wasserstoffbrücken, hydrophoben und van-der-Waals-Wechselwirkungen eine Polymerfällung bei einem pH-Wert in der Nähe von 6,3 bis 6,4 verursachen. Eine frühere Erfindung (Chenite-Patent WO 99/07416; Chenite et al., 2000) hat gelehrt, dass das Zumischen eines zweibasigen Polyol-Phosphatsalzes (d.h. Glycerinphosphat) zu einer wässrigen Lösung von Chitosan den pH-Wert der Lösung erhöhen kann, während eine Fällung vermieden wird. In Gegenwart dieser besonderen Salze bleiben Chitosanlösungen mit erheblicher Konzentration (0,5–3%) und hohem Molekulargewicht (> mehrere hundert kDa) bei tiefer oder Raumtemperatur bei einem pH-Wert in einem physiologisch annehmbaren neutralen Bereich zwischen 6,8 und 7,2 während einer langen Zeit flüssig. Dieser Aspekt erleichtert das Mischen von Chitosan mit Zellen in einer Weise, die ihre Lebensfähigkeit aufrechterhält. Eine zusätzliche wichtige Eigen schaft besteht darin, dass solche wässrigen Lösungen von Chitosan/Polyolphosphat (C/PP) fest werden oder gelieren, wenn sie auf eine geeignete Temperatur erhitzt werden, die es ermöglicht, die gemischten Chitosan/Zell-Lösungen in Körperstellen zu injizieren, wo zum Beispiel bei Nackten Mäusen in subkutanen Hohlräumen Knorpelknötchen gebildet werden können (Chenite et al., 2000). Es ist wichtig, anzumerken, dass bei einigen anderen Studien Chitosan bei physiologischem pH-Wert in einem löslichen Zustand zurückgehalten wurde, aber diese Studien erforderten die Reduktion entweder der Chitosankonzentration (auf 0,1% in Lu et al., Biomaterials 1999) oder des Molekulargewichts und des Deacylierungsgrads von Chitosan (auf ca. 350 kD bzw. 50% in Cho et al., Biomaterials, 1999). Andere Studien haben ebenfalls gezeigt, dass Chitosan eine Mikroumgebung aufweist, die den Phänotyp von Chondrocyten und Osteoblasten unterstützt (Suh et al., 2000; Lahiji et al., 2000; Seichrist et al., 2000), doch beruhten diese Studien nicht auf flüssigem Chitosan in einer Form, die mit Zellen gemischt und injiziert werden konnte. Schließlich wurden N,N-Dicarboxylmethylchitosan-Schwämme mit BMP7 getränkt und in osteochondrale Defekte von Kaninchen eingefügt (Mattioli-Belmonte, 1999). Auch hier wurde ein verbessertes histochemisches und immunhistochemisches Ergebnis beobachtet, doch schienen die unvollständige Ausfüllung des Defekts mit Reparaturgewebe und eine erhebliche Schwierigkeit bei der Retention des Konstrukts innerhalb des Defekts unüberwindliche Probleme zu sein. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Probleme und stellt mehrere neue Lösungen für die Abgabe von Zusammensetzungen zur Reparatur von Knorpel- und anderen Geweben vor.
10) Zusammenfassung des Standes der Technik
Zusammenfassend zum Stand der Technik für die unterstützte Knorpelreparatur wäre zu sagen, dass viele Techniken zur Verbesserung der sehr begrenzten natürlichen Reparaturreaktion von Gelenkknorpel vorgeschlagen und experimentell getestet wurden. Einige dieser Techniken haben einen gewissen Grad der Akzeptanz in der klinischen Praxis erreicht, aber dies war hauptsächlich auf das Fehlen jedes praktikablen und eindeutig wirksamen Verfahrens zur Verbesserung der Reparaturreaktion gegenüber der Anwendung der Familie der Knochenmark- Stimulationstechniken zurückzuführen. Diese Erfindung betrifft und löst mehrere der Hauptprobleme bei der Verwendung von Zellen und Blutkomponenten zur Reparatur von Gelenkknorpel. Ein Haupthindernis bei der Entwicklung eines effektiven Knorpelreparaturverfahrens ist das Fehlen einer Zusammensetzung und eines Verfahrens zur Bereitstellung einer geeigneten makromolekularen Umgebung innerhalb des Raums, der ein Knorpelwachstum erfordert (Knorpeldefekt oder andere Stelle, die eine Expansion oder Rekonstruktion von Gewebe erfordert. Diese makromolekulare Umgebung oder Matrix sollte 1) mit aktiven biologischen Elementen (Zellen, Proteinen, Genen, Blut, Blutkomponenten) in flüssigem Zustand beladen werden können, 2) dann in die Defektstelle injiziert werden können, um den gesamten Defekt oder Bereich, der ein Knorpelwachstum erfordert, aufzufüllen, 3) eine primär nichtproteinartige Umgebung aufweisen, um die Zelladhäsion und zellvermittelte Kontraktion der Matrix zu beschränken; beides kann einen fibrocytischen zellulären (Fasergewebe erzeugenden) Phänotyp anstelle eines chondrocytischen zellulären (Knorpelgewebe erzeugenden) Phänotyps induzieren und auch die Matrix von den Wänden des Defekts ablösen; 4) zellkompatibel zu sein, physiologische pH-Werte und einen physiologischen osmotischen Druck zu besitzen und keine cytotoxischen Elemente zu enthalten; 5) abbaubar zu sein, aber eine ausreichend lange Zeit vorhanden zu sein, um es enthaltenen biologisch aktiven Elementen zu ermöglichen, ein Knorpelgewebe, das eine mechanische Belastung ohne Abbau tragen kann, vollständig zu rekonstituieren. Außerdem ist für den Fachmann offensichtlich, dass eine solche Kombination von Merkmalen mit minimalen Modifikationen auch auf die Reparatur anderer Gewebe, wie Meniskus, Bänder, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgewebe, Abszesse, resezierte Tumoren und Geschwüre, angewendet werden könnte.
Es wäre in hohem Maße wünschenswert, eine neue Zusammensetzung zur Verwendung bei der Reparatur und Regeneration von Knorpelgeweben zur Verfügung zu haben.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neue Zusammensetzung zur Verwendung bei der Reparatur und Regeneration von Knorpelgeweben bereitzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird also eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Reparatur, Regeneration, Rekonstruktion oder Expansion von Knorpel- oder anderen Geweben, wie Meniskus, Bänder, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgewebe, Abszesse, resezierte Tumoren und Geschwüre, bereitgestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch die Verwendung einer Polymerlösung beschrieben, die mit biologischen Elementen gemischt und in eine Körperstelle eingefügt oder injiziert werden, wo das Gemisch die Reparatur, Regeneration, Rekonstruktion oder Expansion von Geweben unterstützt. Zu den reparierten Geweben gehören zum Beispiel unter anderem Knorpel, Meniskus, Bänder, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgewebe, Abszesse, resezierte Tumoren und Geschwüre.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polymerzusammensetzung zur Verwendung bei der Reparatur eines Gewebes eines Patienten. Die Polymerzusammensetzung wird mit wenigstens Vollblut gemischt, wobei die Polymerzusammensetzung beim Mischen mit Vollblut ein Gemisch ergibt, wobei das Gemisch mit der Zeit oder beim Erwärmen in einen nichtflüssigen Zustand übergeht. Das Gemisch wird an der Stelle der Einführung zurückgehalten und haftet daran, um das Gewebe zu reparieren. Die Polymerzusammensetzung umfasst ein Polymer und wird in einem Puffer, der ein anorganisches oder organisches Salz enthält, gelöst oder suspendiert.
Das Polymer ist vorzugsweise ein modifiziertes oder natürliches Polysaccharid.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann in einem Verfahren zur Reparatur eines Gewebes eines Patienten verwendet werden, wobei das Verfahren den Schritt des Einführens einer temperaturabhängigen Polymergelzusammensetzung in das Gewebe umfasst, so dass die Zusammensetzung an dem Gewebe haftet und die Zellvermehrung zur Reparatur des Gewebes unterstützt.
Die Zusammensetzung umfasst Vollblut.
Ein Verfahren zur Reparatur eines Gewebes eines Patienten ist im Folgenden beschrieben, wobei das Verfahren den Schritt des. Einführens einer Polymerzusammensetzung in das Gewebe umfasst, wobei die Polymerzusammensetzung mit wenigstens einer Blutkomponente gemischt werden kann, wobei die Polymerzusammensetzung, wenn sie mit der Blutkomponente gemischt wird, zu einem Gemisch führt, wobei das Gemisch mit der Zeit oder beim Erwärmen in einen nichtflüssigen Zustand übergeht, wobei das Gemisch an der Stelle der Einführung zurückgehalten wird und daran haftet, um das Gewebe zu reparieren.
Das in der Erfindung verwendete Polymer kann ein modifiziertes oder natürliches Polysaccharid, wie Chitosan, Chitin, Hyaluronan, Glycosaminoglycan, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Heparin oder Heparinsulfat, sein.
Die Polymerzusammensetzung kann ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches Protein, wie lösliches Collagen oder lösliche Gelatine, oder eine Polyaminosäure, wie zum Beispiel ein Polylysin, umfassen.
Die Polymerzusammensetzung kann Polymilchsäure, Polyglycolsäure, synthetische Homo- und Blockcopolymere, die Carbonsäure-, Amino-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Phosphensäurefunktionen mit oder ohne zusätzliche Funktionen, wie zum Beispiel unter anderem Hydroxy, Thiol, Alkoxy, Aryloxy, Acyloxy und Aroyloxy, enthalten, umfassen.
Die Polymerzusammensetzung wird vorzugsweise anfangs in einem Puffer gelöst oder suspendiert, der anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kalium, Calcium-, Magnesiumphosphat, -sulfat und -carboxylat, enthält.
Die Polymerzusammensetzung kann in einem Puffer gelöst oder suspendiert werden, der ein organisches Salz, wie Glycerinphosphat, Fructosephosphat, Glucosephosphat, L-Serinphosphat, Adenosinphosphat, Glucosamin, Galactosamin, HEPES, PIPES und MES, enthält.
Die Polymerzusammensetzung hat vorzugsweise einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,8 und eine Osmolarität, die auf einen physiologischen Wert zwischen 250 mOsm/l und 600 mOsm/l eingestellt wird.
Bei dem Blut kann es sich zum Beispiel ohne Einschränkung um venöses Blut, arterielles Blut, Blut aus Knochen, Blut aus Knochenmark, Knochenmark, Nabelschnurblut oder Plazentablut handeln. Es kann außerdem Erythrocyten, Leukocyten, Monocyten, Blutplättchen, Fibrinogen, Thrombin oder erythrocytenfreies thrombocytenreiches Plasma umfassen.
Das Blut kann auch ein gerinnungshemmendes Mittel, wie Citrat, Heparin oder EDTA, enthalten. Das Blut kann aber im Gegenteil auch ein gerinnungsförderndes Mittel, wie Thrombin, Calcium, Collagen, Ellagsäure, Epinephrin, Adenosindiphosphat, Gewebefaktor, ein Phospholipid und einen Gerinnungsfaktor, wie Faktor VII, umfassen, so dass die Gerinnung/Verfestigung an der Stelle der Einführung verbessert wird.
Das Blut kann autolog oder nichtautolog sein.
Die Polymerzusammensetzung wird vorzugsweise in einem Verhältnis, das von 1:100 bis 100:1 variiert, in Bezug auf das Blut verwendet.
Die Polymerzusammensetzung und das Vollblut werden vorzugsweise unter Verwendung von Schallwellen, Rühren, Vortexmischen oder mehreren Durchläufen in Spritzen mechanisch vermischt.
Die Polymerzusammensetzung kann 1,5% (w/v) Chitosan umfassen.
Die Gewebe, die repariert oder regeneriert werden können, sind zum Beispiel unter anderem Knorpel, Meniskus, Bänder, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgewebe, Abszesse, resezierte Tumoren oder Geschwüre. In manchen Fällen kann die Stelle der Einführung in den Körper chirurgisch vorbereitet werden, um abnormale Gewebe zu entfernen. Ein solches Verfahren kann durch Stechen, Abrasion oder Bohren in benachbarte Gewebebereiche oder vaskularisierte Bereiche erfolgen, um Kanäle zu schaffen, durch die die Polymerzusammensetzung in die Stelle, die eine Reparatur erfordert, wandern kann.
Im Folgenden wird eine Chitosanlösung zur Verwendung bei der Zellabgabe zur Reparatur oder Regeneration eines Gewebes in vivo beschrieben, wobei die Chitosanlösung 0,5 bis 3% (w/v) Chitosan umfasst und so zubereitet wird, dass sie thermisch geliert, wobei die Lösung mit Zellen gemischt wird, bevor sie in ein zu reparierendes oder zu regenerierendes Gewebe injiziert wird. Die Lösung kann durch Zugabe von Phosphat, Glycerinphosphat oder Glucosamin, um nur ein paar Beispiele zu nennen, zum thermischen Gelieren induziert werden. Vorzugsweise hat die Chitosanlösung einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,8.
Die Zellen können zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus primären Zellen, kultivierten Zellen, selektierten Zellen, Blutplättchen, Stromazellen, Stammzellen und genetisch modifizierten Zellen besteht. Vorzugsweise werden die Zellen in einer Trägerlösung, wie einer Lösung, die Hyaluronsäure, Hydroxyethylcellulose, Collagen, Alginat oder ein wasserlösliches Polymer enthält, suspendiert.
Es wird auch eine gelierende Chitosanlösung zur Verwendung beim Kultivieren von Zellen in vitro beschrieben, wobei die Chitosanlösung 0,5 bis 3% (w/v) Chitosan umfasst und so zubereitet wird, dass thermisch geliert, wobei die Lösung mit Zellen gemischt wird, bevor sie in vitro kultiviert wird. Vorzugsweise enthält die Polymerzusammensetzung dieses Kulturmediums zwischen 0,01 und 10% (w/v) 20- bis 100%iges deacetyliertes Chitosan mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von 1 kDa bis 10 MDa sowie Blut.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der oben beschriebenen Polymerzusammensetzung der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Gewebereparatur.
Vorzugsweise ist das zu reparierende Gewebe aus der Gruppe ausgewählt, die aus Knorpel, Meniskus, Bändern, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgeweben, Abszessen, resezierten Tumoren und Geschwüren besteht, und vorzugsweise handelt es sich bei dem Gewebe um Knorpel.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung werden nun die folgenden Ausdrücke definiert.
Die Ausdrücke "Polymer" oder "Polymerlösung", die in der vorliegenden Anwendung dasselbe bedeuten, sollen ohne Einschränkung eine Polymerlösung, eine Polymersuspension, ein Polymerteilchen oder -pulver sowie eine Polymermicellensuspension bedeuten.
Wenn der Ausdruck "Reparatur" auf Knorpel und andere Gewebe angewendet wird, soll er ohne Einschränkung die Reparatur, Regeneration, Rekonstruktion, Rekonstitution oder Expansion von Geweben bedeuten.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die 1A bis 1F sind eine schematische Darstellung des Mischens von Polymerlösung mit Zellen und der in-vitro-Verfestigung und Kultur zum Knorpelwachstum;
die 2A bis 2C veranschaulichen die Lebensfähigkeit von Chondrocyten nach der Einkapselung und Kultur in einem Chitosan/Glycerinphosphat-Gel;
die 3A bis 3E veranschaulichen die Knorpelbildung innerhalb von Chitosan-Gel in vitro, gemessen anhand der Akkumulation von Glycosaminoglycan (GAG);
4 veranschaulicht eine RNase-Schutzanalyse von knorpelspezifischen mRNAs, die durch primäre Chondrocyten exprimiert werden, welche 0, 14 bzw. 20 Tage lang in Chitosan-Gel kultiviert wurden;
5 veranschaulicht eine Western-Blot-Analyse von knorpelspezifischen Proteinen, die durch primäre Chondrocyten exprimiert werden, welche 0, 14 bzw. 20 Tage lang in Chitosan-Gel kultiviert wurden;
6 veranschaulicht das mechanische Verhalten von Gelscheiben, die mit bzw. ohne Chondrocyten kultiviert wurden;
7 ist eine schematische Darstellung des Mischens von Polymer mit Zellen und der subkutanen Injektion in Mäuse;
die 8A und 8B veranschaulichen eine Toluidin-Blau-Histologie von Knorpel, der subkutan in Nackten Mäusen wachsen gelassen wurde;
9 veranschaulicht eine RNase-Schutzanalyse von knorpelspezifischen mRNAs, die in in-vivo-Implantaten von Chitosan-Gel mit oder ohne primäre Chondrocyten exprimiert werden;
10 veranschaulicht eine Western-Blot-Analyse von knorpelspezifischen Proteinen, die in vivo in Maus-Implantaten von Chitosan-Gel, das primäre Chondrocyten beherbergt, exprimiert werden;
11 veranschaulicht die mechanischen Eigenschaften von Knorpelimplantaten, die subkutan in Nackten Mäusen wachsen gelassen wurden;
die 12A und 12B veranschaulichen die Adhäsion einer thermisch gelierenden Chitosanlösung an nur den Knorpel betreffenden Defekten ex vivo in Schweine-Femoralkondylen von intakten Gelenken;
die 13A und 13B veranschaulichen die Einfüllung einer thermisch gelierenden Chitosanlösung in Knorpeldefekte bei Kaninchen und 24 Stunden Verweilzeit in vivo;
14 veranschaulicht die Retention einer thermisch gelierenden Chitosanlösung in Knorpeldefekten bei Kaninchen 24 Stunden nach der Injektion;
15A ist eine schematische Darstellung, die die Herstellung, das Mischen und die in-vitro-Verfestigung eines Blut/Polymer-Gemischs zeigt;
die 15B und 15C veranschaulichen die Verfestigung von flüssigem Blut/Polymer in vitro in einem Agarose-Napf (15B) oder einem aus Glas oder Kunststoff bestehenden Röhrchen (15C);
16 veranschaulicht die mittlere Verfestigungszeit eines Blut/Chitosan-Gemischs im Vergleich zu Blut allein bei Verwendung von Blut aus drei verschiedenen Spezies;
17A veranschaulicht eine Gerinnselkontraktion von Blut oder Blut/Polymer-Gemischen, gemessen anhand der Plasmafreisetzung mit der Zeit nach Ablagerung in einem Glasröhrchen;
die 17B und 17C veranschaulichen das physikalische Erscheinungsbild von festem Blut und Blut/Polymer-Gemischen 28 Stunden nach der Kontraktion in Glasröhrchen (17B) oder als frei quellende Scheiben, die in Agarose-Näpfe gegossen und in Tyrode-Puffer inkubiert wurden (17C);
18 veranschaulicht eine Beimischung von flüssigem Chitosan, aber keinen anderen flüssigen Polysaccharidlösungen, was die heparinvermittelte Gerinnungshemmung rückgängig macht;
die 19A bis 19C veranschaulichen die Histologie eines Blut/Polymer-Gemischs;
die 20A und 20B veranschaulichen die Lebensfähigkeit von Leukocyten und Blutplättchen nach dem Mischen mit einer Chitosanlösung;
21 veranschaulicht eine verlängerte Freisetzung von Blutproteinen aus einem in vitro gebildeten Blut/Polymer-Gemisch im Vergleich zu Blut allein;
die 22A bis 22C veranschaulichen die Herstellung, das Mischen und die Injektion eines Polymer/Blut-Gemischs zur Verbesserung der Heilung von Gelenkknorpeldefekten;
die 22D und 22E sind eine schematische Darstellung einer Therapie zur Heilung von humanem Gelenkknorpel;
die 23A und 23B veranschaulichen die verstärkte Chemotaxis von Reparaturzellen, die aus Knochenmark stammen und zum Knorpeldefekt wandern, 1 Woche nach der Abgabe des Blut/Polymer-Gemischs in einen Knorpeldefekt mit knochendurchdringenden Löchern; und
die 24A und 24B veranschaulichen das Wachstum von Hyalinknorpel in Defekten, die mit einem Blut/Polymer-Gemisch behandelt wurden, im Vergleich zum Wachstum von fibrotischem Gewebe in unbehandelten Defekten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wenn es mit Blut kombiniert wird, könnte das Polymer in einer wässrigen Lösung oder in einer wässrigen Suspension oder in einem teilchenförmigen Zustand vorliegen, wobei die wesentlichen Merkmale des Polymerpräparats darin bestehen, 1) dass es mit Blut mischbar ist, 2) dass das resultierende Gemisch injizierbar ist oder an oder in einer Körperstelle, die eine Gewebereparatur, -regeneration, -rekonstruktion oder -expansion benötigt, platziert werden kann und 3) dass das Gemisch eine günstige Wirkung auf die Reparatur, Regeneration, Rekonstruktion oder Expansion von Gewebe an der Platzierungsstelle hat.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist in Beispiel 5 gezeigt, wo eine Lösung des natürlichen Polysaccharids Chitosan in einer Konzentration von 1,5% (w/v) und in 0,135 M Dinatriumglycerinphosphat-Puffer bei pH = 6,8 verwendet wurde. Diese Lösung wurde in einem Verhältnis von 1 Teil Polymerlösung auf 3 Teile Blut mit peripherem Kaninchenblut gemischt. Dann wurde das Polymer/Blut-Gemisch in einen chirurgisch präparierten Gewebeknorpeldefekt in dem Kaninchen injiziert, wo es innerhalb von 5 Minuten fest wurde (22). Histologische Beobachtungen des Heilungsprozesses ergaben eine stimulierte Reparatur, die nach 6–8 Wochen zu Hyalinknorpel führte (24). Kontrolldefekte, die das Polymer/Blut-Gemisch nicht erhielten, waren unvollständig geheilt oder heilten mit nichtfunktionellem faserigem oder faserknorpeligem Gewebe (24). Dieses Beispiel zeigt, dass die Verwendung eines Polymer/Blut-Gemischs zu einer effektiveren Heilung und größeren Funktionalität von repariertem Gewebe führen kann als die einfache Einführung von Blut an der Wundstelle. Triviale Modifikationen dieser Erfindung sind dem Fachmann offensichtlich. Anstelle der Chitosanlösung können auch andere Polymere und andere Zubereitungen von Polymeren oder Polymergemischen verwendet werden, vorausgesetzt, die weisen die drei Merkmale auf, die im vorigen Abschnitt aufgezählt wurden. Und natürlich kann dieser Ansatz trivialerweise auch auf die Reparatur von anderen Geweben als Knorpel, wie Meniskus, Bändern, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgeweben, Abszessen, resezierten Tumoren und Geschwüren, angewendet werden. Anwendungen bei der Gewebeexpansion und -rekonstruktion liegen ebenfalls auf der Hand.
Wir stellen Beispiele und Beweise vor, um mögliche Wirkungsmechanismen dieser Erfindung zu vermitteln, einschließlich 1) der Hemmung der typischen blutplättchenvermittelten Kontraktion eines Blutgerinnsels durch Mischen von Blut mit dem Polymer vor der Verfestigung (17), 2) des resultierenden aufrechterhaltenen Gerüsts mit dem vollen Volumen und daher einer besseren Defektausfüllung zur Gewebereparatur (18), 3) der Anhaftung des fest gewordenen Polymer/Blut-Gemischs an den umgebenden Geweben (22A), 4) einer langsameren Freisetzung von chemotaktischen und mitogenen Proteinfaktoren aus dem Polymer/Blut-Gemisch als aus einem einfachen Blutgerinnsel (21), 5) der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit von Leukocyten und Blutplättchen in dem Polymer/Blut-Gemisch (20) und 6) der Bereitstellung einer Polysaccharidumgebung an der Reparaturstelle, die leichter zur Knorpelbildung führt als eine rein proteinhaltige Matrix (2 bis 6, 8 bis 10, 24). Es wird nachgewiesen, dass diese Phänomene in unseren Beispielen vorkommen. Durch ihren Nachweis wird jedoch nicht die Möglichkeit verworfen, dass auch andere wichtige Ereignisse stattfinden, wie solche, die die Kinetik des zellulären Abbaus des Polymers und die Bindung/Konzentration von endogenen Faktoren durch das Chitosan beinhalten.
Die Beispiele 1 und 2 beschreiben als Hintergrund der Erfindung eine thermisch gelierende Chitosanlösung, die verwendet wird, um primäre Chondrocyten an subkutane Bereiche in Mäusen oder in vitro an Kulturkammern abzugeben. In diesem Fall erfordert die Abwesenheit von Blutkomponenten eine Gelierungsfähigkeit seitens der Chitosanlösung allein, und diese Eigenschaft wird über eine besondere Herstellung der Chitosanlösung unter Verwendung von Glycerinphosphat und anderer ähnlicher Puffer erhalten. In diesen Beispielen weisen wir nach, dass die Polymerlösung mit Zellen gemischt und die Polymer/Zell-Lösung in vivo oder in vitro injiziert werden kann, woraufhin sie geliert, wobei die Funktionalität und Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhalten wird (1 bis 11). Die Zellen können in einem physiologischen Puffer oder einer anderen Zellträgersuspension, wie Cellulose in einem isotonischen Puffer, resuspendiert werden, bevor man sie mit der Chitosanlösung mischt. Wir zeigen Daten, die die Bildung von Knorpelgewebe in vitro (2–6) und in vivo (8–11) beweisen, wenn primäre Chondrocyten mit dieser Polymerlösung injiziert werden. Es können auch andere Zelltypen verwendet werden, und die Konzentrationen des Chitosans und des Puffers können verändert werden, wobei man zu demselben Ergebnis gelangt.
Beispiel 3 beschreibt die Verwendung von thermisch gelierendem Chitosan in vivo ohne Blut oder Zellen als Hintergrund der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung der Erfindung und nicht zur Einschränkung ihres Umfangs angegeben werden, leichter verständlich.
Beispiel 1
Mischen einer thermisch gelierenden Chitosanlösung mit primären Chondrocyten für das in-vitro-Wachstum von Knorpel
Chitosan (0,22 g, 85% deacetyliert) als HCl-Salz-Pulver wurde durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung in einer biologischen sterilen Werkbank sterilisiert und dann in 7,5 ml H₂O gelöst, was zu einem pH-Wert in der Nähe von 5,0 führte. D(+)-Glucosamin (0,215 g, MW 215,6) wurde in 10 ml 0,1 M NaOH gelöst und unter Verwendung eines Scheibenfilters mit einer Porengröße von 22 μm sterilfiltriert. Glycerinphosphat (0,8 g, MW 297 einschließlich 4,5 mol Wasser pro Mol Glycerinphosphat) wurde in 2,0 ml H₂O gelöst und unter Verwendung eines Scheibenfilters mit einer Porengröße von 22 μm sterilfiltriert. Unter Rühren bei einer Temperatur von 4 °C wurden 2,25 ml der Glucosaminlösung tropfenweise unter sterilen Bedingungen zu der Chitosanlösung gegeben. Dann wurde 1 ml der Glycerinphosphatlösung unter denselben Bedingungen hinzugefügt. Diese endgültige Lösung ist immer noch flüssig und bleibt auch längere Zeit (d.h. tagelang) flüssig, wenn die Temperatur niedrig gehalten wird, d.h. in der Nähe von 4 °C. Der pH-Wert dieser Lösung ist physiologisch bei 6,8, und die Osmolarität ist ebenfalls physiologisch bei etwa 376 mOsm/kg H₂O. Es ist von entscheidender Wichtigkeit, diese beiden Parameter innerhalb der Grenzen zu halten, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten. Diese Grenzen variieren mit dem Zelltyp, betragen aber im Allgemeinen 6,6 < pH < 7,8 und 250 mOsm/kg H₂O < Osmolarität < 450 mOsm/kg H₂O. Eine Lösung wird durch Auflösen von 150 mg Hydroxyethylcellulose (Fluka) und 6 ml DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) hergestellt und unter Verwendung eines Scheibenfilters mit einer Porengröße von 22 μm sterilfiltriert. Ein Zellkuchen wird in 2 ml Hydroxyethylcellulose-DMEM-Lösung resuspendiert und in die Chitosan-Glycerinphosphat-Lösung eingemischt. Als negative Kontrolle wurde eine Chitosanlösung hergestellt, die mit 2 ml Hydroxyethylcellulose-DMEM-Lösung ohne Zellen gemischt wurde. Wenn diese Lösung auf 37 °C erhitzt wird, verwandelt sie sich ähnlich wie die in einer früheren Erfindung (Chenite et al., Patent WO 99/07416) offenbarte thermisch gelierende Lösung in ein festes Hydrogel. Es ist sehr wichtig, dass diese frühere Erfindung nicht nachwies, dass die Lebensfähigkeit der Zellen während des gesamten Vorgangs des thermischen Gelierens in dieser Chitosanlösung aufrechterhalten wurde, und somit die Verwendung dieser Chitosanlösung für die Zellabgabe, Gewebereparatur und Geweberegeneration nicht ermöglichte.
Die obige Lösung im flüssigen Zustand bei 4 °C wurde mit enzymatisch isolierten primären Chondrocyten (Buschmann et al., 1992) gemischt und dann in eine Kunststoff-Kulturschale gegossen (1A bis 1F). In 1A wird ein Zellkuchen resuspendiert und bei 4 °C in die flüssige Chitosan-Gel-Lösung eingemischt (1B). In den 1C und 1D wird die flüssige Lösung in eine Gewebekultur-Petri-Schale gegossen und 30 Minuten lang bei 37 °C fest werden gelassen, und danach wird das feste Gel mit den Zellen mit DMEM gewaschen, und unter Verwendung einer Biopsiestanze wurden Scheiben ausgestanzt. In 1E werden Gitter mit einer Maschenweite von 1000 μm in 48-Napf-Platten gegeben. In 1F werden die Chitosan-Gel-Scheiben mit Zellen in einzelnen Näpfen in Kultur gebracht.
Ein Gel, das Zellen beherbergt, bildete sich nach 20 Minuten Inkubation bei 37 °C. Unter Verwendung einer Biopsiestanze wurden Scheiben mit 6 mm Durchmesser und 1 mm Dicke aus dem Gel ausgestanzt und bis zu 3 Wochen lang in Kultur gebracht. Die Scheiben wurden einzeln in 48-Napf-Gewebekulturplatten mit darunterliegenden sterilen Nylon-1000-μm-Gittern kultiviert, damit das Medium Zugang zu allen Oberflächen hat. Über 90% der eingekapselten Zellen waren unmittelbar nach der Einkapselung und während der gesamten Kulturzeit lebensfähig (2A bis 2C). Proben wurden in Calcein AM und Ethidium- Homodimer-1 inkubiert, um lebende (grün) und tote (rot) Zellen sichtbar zu machen. Frisch isolierte Chondrocyten (2A) wurden in dem Gel eingekapselt, fest werden gelassen und sofort (2B) oder nach 20 Tagen Kultur im Gel (2C) auf Lebensfähigkeit getestet. 2C zeigt Zellen mit einer typischen Chondrocytenmorphologie aus der Mitte des Gels.
Mehrere unterschiedliche Zelltypen zeigten denselben hohen Grad der Lebensfähigkeit nach Einkapselung und Zellkultur; dazu gehörten RAT-1, COS, 293T und entdifferenzierte Rindergelenk-Chondrocyten, was bestätigt, dass der Gelierungsvorgang die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhielt und daher verwendet werden könnte, um Zellen in vivo durch Injektion abzugeben. Die Anfärbung des Zellen enthaltenden Gels mit Toluidin-Blau nach 22 Tagen Kultur ergab einen metachromatischen Farbstoffring, der eingekapselte primäre Chondrocyten umgab, was den Aufbau von Proteoglycan oder GAG anzeigt, das zwischen nahe benachbarten Zellen zu verschmelzen begann (3D). Diese Bereiche ließen sich auch mit Antikörpern anfärben, die gegen Aggrecan, Typ-II-Collagen und Link-Protein erzeugt wurden. Es zeigte sich, dass die Chitosan-Gel-Matrix ebenfalls Toluidin-Blau bindet (3C). Diese Eigenschaft ermöglichte die Beobachtung der Gitterstruktur des Gels, nachdem man eine Aldehydfixierung anwendete. Interessanterweise enthielt der perizelluläre Ring von GAG, der um die Chondrocyten herum beobachtet wurde, nur wenig Chitosanmatrix, da letztere anscheinend durch von Chondrocyten produzierte Faktoren abgebaut wurde (3D). Primäre Kälberchondrocyten wurden in Chitosan-Gel in einer Menge von 2 × 10⁷ primären Chondrocyten pro ml eingekapselt und bis zu 20 tage lang als 6-mm-Scheiben kultiviert. Primäre Kälberchondrocyten wurden in 2% Agarose eingekapselt und kultiviert und parallel analysiert. Kulturen von tag 0 und Tag 20 wurden durch Anfertigen von Paraffinschnitten und Anfärben mit Toluidin-Blau für Agarose-Gel-Kulturen (3A und 3B) und Chitosan-Gel-Kulturen (3C und 3D) verarbeitet. Am Tag 0 werden die Zellkerne dunkelblau angefärbt (3A und 3C), während akkumuliertes perizelluläres GAG metachromatisch blauviolett angefärbt wird (3B und 3D, große Pfeile). Diese perizellulären Bereiche reagierten immunopositiv auf Aggrecan, Collagen (II) und Knorpel-Link-Protein. Bei einer 40fachen Vergrößerung in 3E zeigte die quantitative biochemische Analyse des am Tag 0, 14 und 20 der Kultur vorhandenen GAG unter Verwendung des DMMB-Assays eine ähnliche Akkumulation von GAG in Chitosan-Gel wie in Agarose-Gel.
Die RNA-Analyse von Typ-II-Collagen- und Aggrecan-mRNA, die von den eingekapselten Chondrocyten exprimiert wird, zeigte hohe Konzentrationen an den Tagen 14 und 22 der Kultur (4, Spur 4 und 5), die mit den Konzentrationen vergleichbar waren, die man bei Gelenk-Chondrocyten in Knorpel beobachtet (4, Spur 6). Ein Gemisch von ³²P-markierten Antisense-RNA-Sonden, die komplementär zu Rinder-Typ-II-Collagen, Aggrecan und GAPDH waren, wurde mit tRNA (Spur 1) oder Gesamt-RNA aus Rinderniere (Spur 2), aus primären Chondrocyten (10⁷/ml), die 0 Tage (Spur 3), 14 Tage (Spur 4) oder 20 Tage (Spur 5) in Chitosan-Gel kultiviert wurden, oder Gelenkknorpel von erwachsenen Rindern (Spur 6) hybridisiert. Die Proben wurden mit RNase A und T1 behandelt, dann einer Elektrophorese und Autoradiographie unterzogen. Die geschützten Banden, die die Anwesenheit von einzelnen Transcripten zeigen, sind angegeben. Die Beibehaltung des Chondrocyten-Phänotyps im Chitosan/Glycerinphosphat-Gel wird durch die fortgesetzte Expression von Aggrecan und Typ-II-Collagen gezeigt.
Die Western-Analyse von Proteinen, die von eingekapselten Zellen produziert werden, zeigte eine Akkumulation von Knorpelmatrix-Link-Protein zwischen 2 und 3 Wochen in Kultur (5). Die gesamten Proteine wurden extrahiert, durch SDS-PAGE aufgetrennt und einem Immunoblotting mit Antiseren unterzogen, die Vimentin, PCNA, das C-Propeptid von Typ-II-Collagen oder Knorpelmatrix-Link-Protein erkennen. Zu den analysierten Proben gehören Chitosan-Gel ohne Zellen (Spur 1), Rinderniere (Spur 2), zwei Parallelansätze von primären Chondrocyten (10⁷/ml), die in Chitosan-Gel kultiviert wurden, am Tag 0 (Spur 3 und 4), am Tag 14 (Spur 5 und 6) oder am Tag 20 (Spur 7 und 8), Gelenkknorpel von zwei Wochen alten Kälbern (Spur 9) oder Knorpel von erwachsenen Rindern (Spur 10). Die Ergebnisse zeigen die Akkumulation der knorpelspezifischen Proteine CP2 und Link am Tag 14 und 20 sowie die Persistenz der PCNA-Expression über Kulturtag 20 hinweg als Marker für die Zellvermehrung.
Scheiben, die primäre Rindergelenkchondrocyten enthalten, wurden am Tag 4 und 13 der Kultur mechanisch bewertet, wobei man Tests der Relaxation nach einaxialer Druckspannung verwendete. Durch Vergleich mit Kontroll-Gelen ohne Zellen wurde bereits am Tag 4 ein erheblicher zellabhängiger Grad der Versteifung beobachtet, der am Tag 13 noch viel dramatischer wurde (6). Scheiben (ca. 5 mm Durchmesser) von den Tagen 4, 13 und 19 der Kultur wurden im einaxialen Druckversuch mechanisch getestet, indem man fünf Durchgänge bis zu 10% der Scheibendicke (ca. 1,5 mm) während 10 Sekunden anwendete und diese Auslenkung während der anschließenden Spannungsrelaxation hielt (der 2. Durchgang von 10 bis 20% ist in der Graphik gezeigt). Die Gelscheiben ohne Zellen zeigten ein schwaches Verhalten, während zellbeladene Gele mit der Zeit in Kultur sichtlich steifer und stärker charakteristisch viskoelastisch wurden, wie Gelenkknorpel.
Durch Analysieren dieser Daten mit einem zusammengesetzten poroelastischen Modell (Soulhat et al., 1999) zeigte sich aufgrund der Anwesenheit von primären Chondrocyten in diesen Gelen während nur 13 Tagen Kultur in vitro eine Verdoppelung des Elastizitätsmoduls der nichtfibrillären Matrix (von 2,5 auf 5 kPa), eine Erhöhung des Elastizitätsmoduls der fibrillären Matrix auf das Fünffache (von 100 auf 500 kPa) sowie eine Reduktion der hydraulischen Permeabilität auf fast ein Hundertstel (von 5 × 10^–12 auf 0,08 × 10^–12 N·s/m⁴). Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse, dass das Chitosan-Gel zellverträglich und zellabbaubar ist, zur Aufrechterhaltung des Chondrocyten-Phänotyps führt und die Entwicklung einer neuen Knorpelmatrix mit einer erheblichen Erhöhung der mechanische Steifigkeit in vitro ermöglicht.
Beispiel 2
Mischen der thermisch gelierenden Chitosanlösung mit primaren Chondrocyten und subkutane Injektion zum Wachsenlassen von Knorpel in vivo
Um nachzuweisen dass dieses in-situ-Gelierungssystem in Tieren eingesetzt werden kann, wurden athymische Mäuse (CD1 nu/nu) dorsalen subkutanen Injektionen von 100 bis 300 μl des in Beispiel 1 beschriebenen Chitosan-Gels, das 10 Millionen Kälbergelenkchondrocyten pro ml enthielt, ausgesetzt (7). Ein Zellkuchen von primären Kälberchondrocyten wurde bei 4 °C mit flüssigem Chitosan-Gel gemischt, so dass man eine Konzentration von 1 bis 2 × 10⁷ Zellen/ml erreichte, und in flüssiger Form als subkutane dorsale 100-μl-Implantate in anästhetisierte Nackte Mäuse injiziert. Die in situ erfolgte Gelierung war 5 bis 10 Minuten nach der Injektion durch Abtasten zu erkennen.
Kontrollmäusen wurde in gleicher Weise nur Chitosan-Gel injiziert. Ein tastbares Gel bildete sich innerhalb von 10 Minuten nach der Injektion. Implantate wurden 21, 48 und 63 Tage nach der Injektion gewonnen. Anfärben mit Toluidin-Blau machte die Produktion von GAG-reicher extrazellulärer Matrix in großem Maßstab durch die Zellen enthaltenden Implantate sichtbar (8A). In Implantaten von Chitosan-Gel allein war keine GAG-Akkumulation zu erkennen (8B). Primäre Kälberchondrocyten in einer Menge von 2 × 10⁷ Zellen/ml flüssigem Chitosan-Gel wurden in flüssiger Form als subkutane dorsale 100-μl-Implantate in anästhetisierte Nackte Mäuse injiziert. Kontrollmäuse erhielten subkutane dorsale 100-μl-Implantate nur aus flüssigem Chitosan-Gel. 48 Tage nach der Injektion wurden die Implantate geerntet und für die Paraffinhistologie und das Anfärben mit Toluidin-Blau verarbeitet. Metachromatische violette Anfärbung macht die Akkumulation von GAG im Implantat mit Chondrocyten sichtbar (8A). Im Implantat mit nur Chitosan-Gel wird keine GAG-Akkumulation nachgewiesen (8B).
Die knorpelspezifische mRNA-Expression von Collagen Typ II und Aggrecan wurde am Tag 48 nach der Injektion in den in-vivo-Implantaten mit primären Chondrocyten nachgewiesen (9).
In Implantaten mit Chitosan-Gel allein wurde keine Expression von Typ-II-Collagen oder Aggrecan nachgewiesen (9). Ein Gemisch von ³²P-markierten Antisense-RNA-Sonden, die komplementär zu Rinder-Typ-II-Collagen, Aggrecan und GAPDH waren, wurde mit tRNA (Spur 1) oder Gesamt-RNA aus Rinderniere (Spur 2), in-vivo-Nacktmaus-Implantaten mit nur Chitosan-Gel ab Tag 48 (Spur 3) oder in-vivo-Implantaten von Chitosan-Gel mit primären Chondrocyten in einer Menge von 2 × 10⁷ Zellen/ml ab Tag 48 (Spur 4) oder Gelenkknorpel von erwachsenen Rindern (Spur 5) hybridisiert. Die Proben wurden mit RNase A und T1 behandelt, dann einer Elektrophorese und Autoradiographie unterzogen. Die geschützten Banden, die die Anwesenheit von einzelnen Transcripten zeigen, sind angegeben. Die Beibehaltung des Chondrocyten-Phänotyps im Chitosan/Glycerinphosphat-Gel in vivo wird durch die Expression von Aggrecan und Typ-II-Collagen gezeigt.
Knorpelspezifische Proteine wurden ab Tag 48 und 63 nach der Injektion in in-vivo-Implantaten mit primären Chondrocyten nachgewiesen (10). Bei Implantaten nur mit Chitosan-Gel wurden keine knorpelspezifischen Proteine nachgewiesen (10). Die gesamten Proteine wurden extrahiert, durch SDS-PAGE aufgetrennt und einem Immunoblotting mit Antiseren unterzogen, die Vimentin, PCNA, das C-Propeptid von Typ-II-Collagen oder Knorpelmatrix-Link-Protein erkennen. Zu den analysierten Proben gehören Chitosan-Gel ohne Zellen (Spur 1), Rinderniere (Spur 2), zwei unterschiedliche in-vivo-Nacktmaus-Implantate mit nur Chitosan-Gel an Tag 63 (Spur 3 und 4), von in-vivo-Implantaten von Chitosan-Gel mit 2 × 10⁷ Kälberchondrocyten pro ml Gel an Tag 48 (Spur 5) oder Tag 63 (Spur 6), Knorpel von zwei Wochen alten Kälbern (Spur 7) oder Knorpel von erwachsenen Rindern (Spur 8). Die Ergebnisse zeigen die Akkumulation der knorpelspezifischen extrazellulären Matrixproteine CP2 und Link nur in denjenigen Chitosan-Gel-Implantaten, die Chondrocyten trugen. Das Akronym PCNA bedeutet "Zellkernantigen proliferierender Zellen". CP bezieht sich auf Typ-2-Collagen-C-Propeptid, und Link bezieht sich auf Knorpel-Link-Protein.
Die in-vivo-Implantate ohne Zellen hatten eine pastöse Konsistenz, während die Implantate mit Zellen zu 3 bis 5 mm großen Scheiben ausgestanzt und mechanischen Tests unterzogen werden konnten, was eine hohe mechanische Steifigkeit ergab, die man bei einer in-vitro-Scheibe ohne Zellen nicht fand (11). Diese Daten zeigen an, dass Chondrocyten in situ durch Injektion mit der thermisch gelierenden Chitosanlösung als Träger abgegeben werden können. Die injizierten Chondrocyten bleiben lebensfähig und synthetisieren erhebliche Mengen einer proteoglycanreichen extrazellulären Matrix und bauen sie zusammen, wobei die Matrix mit der Zeit unter Bildung eines funktionellen Knorpelgewebes versteift. In 11 wurden primäre Kälberchondrocyten in einer Menge von 2 × 10⁷ Zellen/ml flüssigem Chitosan-Gel in flüssiger Form als subkutane dorsale 100-μl-Implantate in anästhetisierte Nackte Mäuse injiziert. Kontrollmäuse erhielten subkutane dorsale 100-μl-Implantate nur aus flüssigem Chitosan-Gel. 48 Tage nach der Injektion wurden die Implantate geerntet. Implantate mit nur Chitosan-Gel hatten eine pastöse Konsistenz und konnten nicht mechanisch getestet werden. Implantate mit primären Chondrocyten hatten das Aussehen von Knorpel, und eine 3 mm große Biopsie wurde aus der Mitte des Implantats ausgestanzt und im einaxialen Druckversuch unter Verwendung einer Kompression von 2,5% der Dicke mit einem Relaxationskriterium von 0,05 g/min getestet. Der Gleichgewichtsmodul bei 20% und 50% bleibender Druckverformung ist für das 48 Tage alte Implantat, das Zellen enthält, im Vergleich zu einer Kontrollscheibe gezeigt, die während einer Zeit von 42 Tagen in vitro gelassen wurde. Das in vivo wachsen gelassene, chondrocytenbeladene Gel hat während 48 Tagen aufgrund der Synthese und des Zusammenbaus einer funktionellen Knorpelmatrix eine erhebliche mechanische Steifigkeit entwickelt (8A).
Beispiel 3
Adhäsion einer thermisch gelierenden Chitosanlösung an Knorpel- und Knochenoberflächen
Einer der wichtigsten Vorteile dieser thermisch gelierenden Chitosan-Zubereitung für die Knorpelreparatur ist ihre Fähigkeit, sich an unregelmäßige Knorpeldefekte und andere unregelmäßig geformte Höhlen im Körper, die eine Gewebereparatur, -regeneration, -rekonstruktion oder -expansion benötigen, anzupassen und an diesen zu haften. Viele derzeitige Gewebereparaturverfahren in dieser Hinsicht drastisch unzureichend. Flüssiges Chitosan-Glycerinphosphat-Gel ohne Zellen wurde ex vivo an intrachondrale (nicht unter Knochenbeteiligung) Defekte bei Schweine-Femoralkondylen. Scheibenförmige Defekte im Gelenkknorpel wurden unter Verwendung einer Biopsiestanze (12A) erzeugt, und die in Beispiel 1 beschriebene Chitosanlösung wurde in diese Defekte injiziert und in einem Inkubator bei 37 °C fest werden gelassen. Die das Gelenk bildende Knorpeloberfläche wurde dagegengehalten, und simulierte Gelenkbewegungen wurden durchgeführt, und danach wurde beobachtet, dass das Gel in dem Knorpeldefekt blieb (12B). Das Gel blieb nicht nur im Defekt, sondern haftete auch an den umgebenden Knochen- und Knorpeloberflächen und kontrahierte sich nicht. In den 12A und 12B wurde flüssiges Chitosan-Gel in Knorpeldefekten mit 6 mm Durchmesser und in voller Dicke abgelagert (12A) und 30 Minuten lang in einem feucht gehaltenen Inkubator bei 37 °C fest werden gelassen. Dann wurde das Gelenk geschlossen, und die Gelenkbewegung wurde mehrere Minuten lang simuliert. Das Chitosan-Gel haftete nach der simulierten Gelenkbewegung an allen Defekten und wurde in diesen zurückgehalten (12B).
Die in-vivo-Füllung von intrachondralen Defekten wurde ebenfalls am Patellagleitlager von Kaninchen durchgeführt. Ein rechteckiger (4 mm × 5 mm) Defekt wurde erzeugt, indem man Knorpel mit einem mikrochirurgischen Messer bis herunter zur härteren verkalkten Knorpelschicht abrasierte. Mit Hilfe einer 16er Nadel wurden mehrere Mikrofrakturlöcher eingeführt. Die in Beispiel 1 beschriebene thermisch gelierende Chitosanlösung wurde in diesen Defekt injiziert und 5 Minuten lang fest werden gelassen (13A), und das Kniegelenk des Kaninchens wurde zugenäht. Das Kaninchen wurde frei umherlaufen gelassen, und am folgenden Tag wurde es getötet, und das behandelte Kniegelenk wurde für die histologische Analyse präpariert (13B). Ein lebendes Neuseeländisches Weißes Kaninchen wurde anästhetisiert, und ein nur den Knorpel betreffender Defekt von 3 × 4 mm wurde im Patella-Gleitlager des Oberschenkenknochens erzeugt. Mit einer 16er Nadel wurden mehrere Mikrofrakturlöcher eingeführt. Flüssiges, thermisch gelierendes Chitosan wurde in den Defekt gefüllt und 5 Minuten lang in situ gelieren gelassen (13A). Das Gelenk wurde geschlossen, und das Kaninchen wurde 24 Stunden lang mit uneingeschränkter Bewe gungsfreiheit sich erholen gelassen, bevor es getötet und das Gelenk seziert wurde (13B).
Die histologische Analyse (14) ergab die Retention dieses thermisch gelierenden Chitosan-Gels in der sehr dünnen Knorpelschicht des Kaninchens (nur etwa 0,8 mm dick). Das Gel haftete fest am umgebenden Knochen- und Knorpelgewebe, was die gute Retention beweist, wodurch seine Verwendung als injizierbaren, thermisch gelierenden Polymerabgabeträger für die Reparatur von Knorpel- und anderen Geweben ermöglicht wird. Das Gelenk und der Defekt, die in 13B gezeigt sind (gefüllt mit thermisch gelierendem Chitosan und 24 Stunden Verweilzeit in vivo), wurden fixiert, in LR-White-Kunstharz eingebettet, es wurden Schnitte angefertigt und mit Toluidin-Blau angefärbt. Ein Querschnitt des Defekts zeigt die Retention des Chitosan-Gels in situ sowie die Anhaftung an Knorpel- und Knochenoberflächen in dem Defekt.
Beispiel 4
Herstellung Mischung und in-vitro-Verfestigung eines Blut/Polymer-Gemischs
Mehrere unterschiedliche Mischverfahren wurden eingesetzt, um Blut mit einer wässrigen Polymerlösung zu mischen (15A). Blut und Polymer werden in einem Behälter miteinander gemischt, was zu einer homogenen flüssigen Mischung von Blut und Polymer führt.
Im Allgemeinen wurden 3 Volumina Blut mit 1 Volumen 1,5%igem Polysaccharid in einer isotonischen und isoosmolaren Lösung gemischt. Im Falle von Chitosan-Gel wurden 1,5% Chitosan in 70 mM HCl und 135 mM β-Glycerinphosphat gelöst. Bei dem ersten Blut/Polymer-Mischverfahren, Verfahren 1, wurde eine 1-cm³-Spritze mit 750 μl peripherem Vollblut gefüllt, und eine zweite 1-cm³-Spritze wurde mit 250 μl flüssiger Polymerlösung gefüllt. Die Spritzen wurden miteinander verbunden, und die beiden Phasen wurden durch 40maliges Vor- und Zurückpumpen miteinander gemischt, bis sie anscheinend homogen waren. Bei dem zweiten Mischverfahren wurden 625 μl flüssige Polymerlösung in einem 2,0-ml-Cryovial (Corning) mit mehreren Stahlkugeln von 3 mm bis 6 mm abgelegt. Das Cryovial wurde mit 1,875 ml Vollblut gefüllt, der Deckel wurde aufgeschraubt, und das Vial wurde 10 Sekunden lang kräftig geschüttelt. Beim dritten Mischverfahren wurden 2 ml flüssige Polymerlösung in einem sterilen 12-ml-Borosilikatglas-Vial (InterGlass, serologisches 5-cm³-Vial) abgelegt. Das Vial wurde mit einem Gummistopfen und Metallanquetscher verschlossen, und ein 25-ml-Luftvakuum wurde in dem Vial mit einer 10-ml-Spritze und 20er Nadel gezogen. Mit Hilfe der richtigen Phlebotomie-Techniken wurde peripheres Blut entweder aus einer Rattenarterie oder einer menschlichen oder Pferdevene in eine sterile 10-ml-Spritze gesaugt. Eine 20er Nadel wurde an der Spritze befestigt und durch den Gummistopfen des Vials hindurch eingeführt. 6 ml des peripheren Bluts wurde in das Vial gelassen. Das Vial wurde 10 Sekunden lang in einem Vortexmischer mit voller Geschwindigkeit gemischt. Nach einer dieser Mischtechniken wurde das resultierende Gemisch bei Raumtemperatur in ein 4-ml-Borosilikatglas-Vial, ein Kunststoff-Vial bei 37 °C oder einen Agarose-Napf (15B und 15C) oder ex vivo in einen Gelenkknorpeldefekt abgelegt. Als Kontrolle wurde dieselbe Behandlung nur mit peripherem Vollblut durchgeführt. Als weitere Kontrolle wurde ein Vacutainer-Vial mit EDTA-behandeltem Blut abgezapft, um die CBC- und Plättchenzahl zu messen. Alle getesteten Blutproben zeigten normale CBC- und Plättchenzahlen für die jeweiligen Spezies. Unabhängig von der Spezies wurde das hergestellte Blut/Polymer-Gemisch innerhalb von 2,5 bis 18 Minuten nach dem Mischen fest und haftete fest an den Wänden des Glas-Vials (16). Gemischtes peripheres Vollblut wurde im Allgemeinen langsamer fest als Blut/Chitosan-Gel (16). Getrennte Blutproben mit oder ohne flüssiges Chitosan-Gel wurden miteinander gemischt, und die Verfestigungszeit wurde anhand der Zeit in Minuten gemessen, die zwischen dem Mischen und dem Erreichen einer festen anhaftenden Masse im ursprünglichen Misch-Vial oder einem sekundären Gefäß verstrich.
Beim Testen von zusätzlichen Blut/Polymer-Lösungen einschließlich Blut/Hyaluronsäure, Blut/Hydroxyethylcellulose und Blut/Alginat zeigte sich, dass diese Gemische ebenfalls in einer Zeitspanne fest werden, die mit der von Blut allein vergleichbar ist (17A). Daraus wurde geschlossen, dass das Einmischen von flüssigem Chitosan-Gel in peripheres Vollblut die Gerinnselbildung beschleunigt und dass die Blut/Chitosan-Gel-Verfestigungszeit für die klinische Anwendung annehmbar ist. Die Kontraktion wurde an gemischtem frischem peripherem Kaninchenblut oder an Kaninchenblut, das mit PBS oder verschiedenen 1,5%igen Polysaccharidlösungen einschließlich Chitosan in Glycerinphosphatpuffer gemischt war, getestet. Frisches Blut ohne Mischen wurde ebenfalls analysiert. Ein Heparinblut/Chitosan in Glycerinphosphat-Puffergemisch wurde ebenfalls analysiert. Bei 37 °C wurden 500 μl jeder Probe in einem 4-ml-Glasröhrchen abgelegt. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde das gesamte ausgeschlossene Plasma aus jedem Röhrchen entfernt und gewogen, um das Ausmaß der Gerinnselkontraktion zu bestimmen. Alle Proben außer Blut/Chitosan-Glycerinphosphat-Gemischen kontrahierten zu 30–50% ihres ursprünglichen Volumens. Blut/Chitosan-Gemische kontrahierten nur minimal und erhielten ungefähr 90% ihres Anfangsvolumens aufrecht.
Zum Testen des Kontraktionsgrads von fest gewordenen Blut/Polymer-Gemischen relativ zu geronnenem Vollblut wurde ein Gerinnselkontraktionstest an einer Anordnung von Blut/Polymer-Proben unter Verwendung von mehreren Kontrollen durchgeführt (17A, 17B und 17C). Eine Gruppe von Kontrollen bestand aus nicht gerührtem peripherem Vollblut oder gerührtem peripherem Vollblut oder peripherem Vollblut, das 3:1 (v/v) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gerührt wurde. Diese Proben wurden mit experimentellen Proben verglichen, die 3 Volumina peripheres Vollblut enthielten, das mit 1 Volumen unterschiedlichen 1,5%igen Polysaccharidlösungen in PBS (Alginat, Hydroxyethylcellulose oder Hyaluronsäure) gerührt wurde. Eine weitere Probe bestand aus 3 Volumina peripherem Vollblut, das mit 1 Volumen Chitosan-Glycerinphosphat-Lösung gemischt wurde. In Abständen von bis zu 18 Stunden nach der Verfestigung wurde das ausgeschlossene Serum für jede Bedingung dreimal als Indikator für den Kontraktionsgrad gemessen. Proben mit peripherem Blut, ±PBS, kontrahierten auf 30% der ursprünglichen Masse (17A). Peripheres Blut, das mit den Polysacchariden Alginat, Hydroxyethylcellulose oder Hyaluronsäure gemischt war, kontrahierte auf 40 bis 50% der ursprünglichen Masse (17A). Die Blut/Chitosan-Gel-Proben zeigten eine vernachlässigbare Kontraktion mit einer Kontraktion auf 90% der ursprünglichen Masse (17A). Die heparinisierten Blut/Chitosan-Gel-Proben widerstanden ebenfalls der Kontraktion und kontrahierten auf 85% der ursprünglichen Masse (17A). Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass Blut/Chitosan-Gel der Kontraktion widersteht und für eine raumfüllendere Fibringerüstbildung innerhalb des Knorpeldefekts sorgt. In den 17B und 17C umfassen die gezeigten Proben Blut (1) oder gemischtes Blut (2), Blut/PBS (3), Blut/Chitosan in Glycerinphosphat (4), Heparin-Blut/Chitosan (5), Blut/Alginat (6), Blut/Hydroxyethylcellulose (7) und Blut/Hyaluronsäure (8).
Um zu testen, ob gerinnungsgehemmtes Blut verwendet werden könnte, um in situ fest werdende Blut/Polysaccharid-Implantate zu erzeugen, wurden 3 Volumina Blut, das mit 1,5 mM EDTA, 0,38% Citrat, Säure-0,38% Citrat-Dextrose oder mit Natriumheparin (Becton Dickinson) behandelt war, mit 1 Volumen Chitosan-Glycerinphosphat-Lösung gemischt. Chitosan-Glycerinphosphat-Lösung war in der Lage, die von Heparin (18), EDTA und Citrat vermittelte Gerinnungshemmung rückgängig zu machen. 1,5% Chitosan in Glycerinphosphatlösung oder drei unterschiedliche 1,5%ige Polysaccharidlösungen wurden in einem Verhältnis von 1 Volumen Polysaccharidlösung zu 3 Teilen peripherem Vollblut gemischt. 500 μl jeder Probe wurden in einem Borosilikatglasröhrchen abgelegt und dann 60 Minuten lang bei 37 °C fest werden gelassen. Die verschiedenen Polysaccharide umfassen Hyaluronsäure-PBS (1), Hydroxyethylcellulose-PBS (2), Alginat-PBS (3) und Chitosan-Glycerinphosphat (4). Als Kontrolle wurde Blut mit nur Heparin analysiert (5). Nach 60 Minuten wurden die Röhrchen horizontal hingelegt und photographisch dokumentiert. Nur das Gemisch aus Chitosan-Glycerinphosphat und heparinisiertem Blut wurde fest.
Andere Heparinblut/Polysaccharid-Gemische, bei denen Hydroxyethylcellulose, Alginat oder Hyaluronsäure verwendet wurde, wurden nicht fest (18). Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass unter Verwendung von gerinnungsgehemmtem Blut in situ fest werdende Blut/Chitosan-Implantate hergestellt werden können.
Histologische Schnitte von festen Blut/Polymer-Proben zeigten, dass die Gemische homogen waren, dass die roten Blutkörperchen nach dem Mischen oder Festwerden nicht hämolysierten und dass Blutplättchen aktiviert wurden und funktionell waren (was durch die Entstehung eines dichten Fibrinnetzwerks bewiesen wurde) (19A bis 19C). Ein fest gewordenes Gemisch von Blut/Chitosan wurde fixiert, in LR-White-Kunstharz eingebettet, es wurden Schnitte angefertigt und mit Toluidin-Blau angefärbt. In 19A ist bei 20facher Vergrößerung eine globale homogene Mischung zu erkennen. In 19B sind bei 100facher Vergrößerung miteinander gemischte Ansammlungen von roten Blutkörperchen und Chitosan-Hydropolymer zu erkennen. Bei 2000facher Vergrößerung (Rasterelektronenmikroskopie im ESEM-Modus) ist die Anwesenheit von Fibrinfasernetzwerk im gesamten Blut/Chitosan-Verbund zu erkennen.
Einige Leukocyten blieben nach dem Mischen und Festwerden mehrere Stunden lang lebensfähig (20). Peripheres Vollblut wurde mit Chitosan-Gel gemischt und fest werden gelassen. In 20A wurde das Gerinnsel 60 Minuten nach dem Festwerden einer Anfärbung auf Lebensfähigkeit mit Calcein AM/Ethidium-Homodimer-1 unterzogen, was lebende weiße Blutkörperchen (grüne Zellen, große Pfeile), lebende Blutplättchen (grüne Zellen, kleine Pfeile) und tote weiße Blutkörperchen (rote Zellkerne) erkennen ließ. In 20B wurde eine getrennte Probe 180 Minuten nach dem Festwerden fixiert, in LR-White eingebettet und einer Transmissionselektronenmikroskopie unterzogen. Aktive Phagocytose durch periphere Monocyten (Pfeilkopf), die die Lebensfähigkeit der Zellen widerspiegelt, ist in TEM-Aufnahmen 3 Stunden nach dem Mischen und Festwerden zu erkennen.
Eine Analyse der gesamten Serumproteine, die nach dem Festwerden entweder aus dem Blut oder aus dem Blut/Chitosan verloren gingen, wurde durchgeführt. Gleiche Volumina an Blut oder Blut/Chitosan-Gel wurden in Agarose-Näpfen fest werden gelassen. Die Scheiben wurden auf einzelne Näpfe einer 48-Napf-Platte, die 1 ml PBS enthielten, übertragen und 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Scheiben wurden nach 4, 5, 7 und 19 Stunden sukzessive in frische PBS-Lösung von 37 °C eingebracht. PBS-Waschflüssigkeiten wurden vor der Analyse leicht zentrifugiert, um alle Zellen zu entfernen. Nach 3 oder 19 Stunden in PBS wurden mehrere Scheiben für die Gesamtproteinbestimmung extrahiert. Die gesamten Proteine, die in den Scheiben oder PBS-Waschflüssigkeiten vorhanden waren, wurden durch SDS-PAGE und Gesamtprotein-Anfärbung mit Sypro Orange analysiert. Die Serumproteine wurden aus den Blut/Chitosan-Proben langsamer und nachhaltiger freigesetzt als aus den Blutproben (21). Diese Daten lassen vermuten, dass aus Blut und Blutplättchen stammende Proteine, die an der Wundheilung beteiligt sind, aus mit Blut/Chitosan gefüllten Defekten nachhaltiger und länger freigesetzt werden als aus mit Blutgerinnsel gefüllten Defekten. Feste Scheiben aus Blut/Chitosan-Gel oder nur Blut wurden aus 150 μl Anfangsflüssigkeitsvolumen erzeugt. Die resultierenden Scheiben wurden 3 Stunden lang in 1 ml PBS gewaschen und dann nacheinander nach 4, 5, 7 und 19 Stunden in insgesamt vier weitere 1-ml-PBS-Waschflüssigkeiten übertragen. Nach 3 oder 19 Stunden Waschen wurden repräsentative Scheiben mit GuCl extrahiert, um die gesamten zurückgehaltenen Proteine in Lösung zu bringen. Lösliche Proteine wurden aus gleichen Volumina an GuCl-Extrakten oder PBS-Waschflüssigkeiten ausgefällt, auf SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und unter Verwendung von Sypro Orange auf Gesamtproteine angefärbt. In den Blut/Polymer-Scheiben wurden über die gesamte Waschzeit von 19 Stunden vergleichsweise mehr Proteine zurückgehalten als in den Blutscheiben. Über die Waschzeit von 19 Stunden wurde bei Blut/Chitosan vergleichsweise eine langsamere und nachhaltigere Freisetzung von Serumproteinen in die PBS-Waschlösungen beobachtet als bei Blut.
Beispiel 5
Herstellung Mischung und Injektion eines Blut/Polymer-Gemischs zur Verbesserung der Heilung von Gelenkknorpeldefekten
Knorpeldefekte mit Perforationen bis zum subchondralen Knochen wurden mit einem Gemisch von peripherem Blut/Chitosan-Glycerinphosphat behandelt, das als Flüssigkeit abgegeben wurde, und das Gemisch wurde in situ fest werden gelassen (22A bis 22C). In 22A wurde ein Knorpeldefekt in voller Dicke von 3 × 4 mm im Patella-Gleitlager des Oberschenkelknochens eines erwachsenen (mehr als 7 Monate alten) Neuseeländischen Weißen Kaninchens erzeugt. Vier Mikrobohrlöcher mit einem Durchmesser von 1 mm wurden bis zum Knochen gebohrt, bis eine Blutung beobachtet wurde. In 22B wurde flüssiges Vollblut in einem Verhältnis von 3 Volumina Blut zu 1 Volumen Chitosan in Glycerinphosphatlösung gemischt und abgelagert, so dass der Defekt ausgefüllt wurde. In 22C schien das Blut/Chitosan-Implantat nach 5 Minuten in situ fest zu werden. Die Kapsel und die Haut wurden vernäht, und das Tier wurde mit uneingeschränkter Bewegungsfreiheit sich erholen gelassen.
Eine ähnliche Behandlung bei menschlichen Patienten ist in 22D schematisch dargestellt, wo präparierte Knorpeldefekte eine arthroskopische Injektion von flüssigem Blut/Polymer erhalten, die in situ fest wird. Alternativ dazu wird eine arthroskopische Injektion von flüssigem Polymer an der Defektstelle mit aus Knochen stammendem Blut gemischt (22E). In 22D wird das Blut des Patienten ex vivo mit dem Polymer gemischt und durch arthroskopische Injektion an einen präparierten Defekt abgegeben, oder (22E) das Polymer wird arthroskopisch oder während einer Operation am offenen Knie abgegeben und an der Defektstelle mit aus dem Defekt austretendem Blut des Patienten gemischt.
Als Proof-of-Concept-Studie wurden die Wirkungen einer Behandlung mit Blut/Chitosan-Gel bei Kaninchen getestet. Erwachsene Neuseeländische Weiße Kaninchen mit ausgereiftem Skelett (7 Monate und älter) wurden mit Xylazin-Ketamin und dann Isofluoren/Sauerstoff-Gas anästhetisiert. Das Patella-Gleitlager des Oberschenkenknochens wurde durch einen parapatellären Einschnitt und Wegschieben der Patella freigelegt. Ein Knorpeldefekt in voller Dicke von bis zu 4 × 5 mm im Patella-Gleitlager des Oberschenkenknochens wurde mit einem mikrochirurgischen Messer erzeugt. Vier 4 mm tiefe, bis zum Knochen vordringende Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm wurden entweder durch Mikrobohrer unter ständiger Berieselung mit PBS von 4 °C oder durch Punktion mit einer maßgefertigten Ahle und einem Hammer erzeugt. Der Defekt wurde mit PBS gespült, und je nach dem Grad der Blutung wurden bis zu 200 μl steriles Epinephrin (2 μg/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in die blutenden Löcher injiziert. Der Knorpeldefekt wurde mit einer sterilen PBS-getränkten Mullbinde bedeckt. Peripheres Kaninchenblut wurde mit einer Vacutainer^TM-Nadel und unbehandelten, silikonisierten Glas-4-cm³-Vacutainer^TM-Vials von Becton Dickinson aus der zentralen Arterie des Ohrs entnommen.
Bei einer Behandlung wurden 750 μl Blut in eine sterile 1-cm³-Spritze gesogen. Eine zweite Spritze, die 250 μl Chitosan-Glycerinphosphat-Lösung enthielt (1,5% Chitosan/70 mM HCl/135 mM β-Glycerinphosphat), wurde über ein steriles Kunststoffverbindungsstück mit der bluthaltigen Spritze verbunden. Die Spritzen wurden 40mal vor- und zurückgepumpt. Die Mischung wurde in eine Spritze gesogen, und eine 20er Nadel wurde daran befestigt. Nach dem Ausspülen der Hälfte der Mischung wurde ein Tropfen (etwa 25 μl) in dem Defekt abgelagert. In einer getrennten Behandlung wurden 2 ml Blut in ein Polypropylen-Cryovial-Röhrchen gegeben, das 667 μl 1,5% Chitosan/70 mM HCl/135 mM β-Glycerinphosphat und 6 sterile Edelstahlkügelchen mit 3,2 mm Durchmesser enthielt. Das Röhrchen wurde mit einem Deckel verschlossen und 10 Sekunden lang kräftig (etwa 40- bis 50mal) geschüttelt. Die resultierende flüssige Blut/Chitosan-Mischung wurde mit einer sterilen 1-cm³-Spritze aus dem Vial entnommen, und eine 20er Nadel wurde an der Spritze befestigt. Nach dem Ausspülen von 200 μl aus der Spritze wurde ein Tropfen (etwa 25 μl) abgelagert, so dass der Knorpeldefekt ausgefüllt wurde. Das Blut/Chitosan-Gemisch wurde 5 Minuten lang fest werden gelassen, und danach wurden die Kapsel und die Haut vernäht, und die Wunde wurde desinfiziert. Die Kaninchen wurden nach 1 Woche (n = 1, Männchen) oder nach 51 bzw. 56 Tagen (n = 2, 1 Männchen, 1 Weibchen) getötet. Die Gelenke wurden fixiert, entkalkt, in LR/White-Kunstharz eingebettet, es wurden Schnitte angefertigt und mit Toluidin-Blau angefärbt. Mit Blut/Chitosan behandelte Defekte zeigten nach 1 Woche Heilung eine große Zahl von chemotaktischen Zellen, die zu der mit Blut/Chitosan gefüllten Zone wanderten (23A). Unbehandelte Defekte zeigten eine relativ schwache chemotaktische Reaktion (23B) auf das Blutgerinnsel an der Oberseite des Defekts. Ein Knorpeldefekt mit Mikrobohrlöchern wurde in beiden Patella-Gleitlagern der Oberschenkenknochen eines erwachsenen Neuseeländischen Weißen Kaninchens erzeugt, wobei einer mit Blut/Chitosan-Gel gefüllt und der andere unbehandelt gelassen wurde. Eine Woche nach der Heilung wurden die Gelenke fixiert, in LR-White verarbeitet und mit Toluidin-Blau angefärbt. In einer Tiefe von 2 bis 3 mm unter der Oberfläche des Knorpels war eine große Zahl von Zellen zu erkennen, die zu dem mit Blut/Chitosan gefüllten Defekt wanderten (23A), während in demselben Bereich des unbehandelten Defekts weniger wandernde Zellen zu sehen waren (23B).
Nach 5 bis 8 Wochen Heilung war der mit Blut/Chitosan behandelte Defekt bei 2 Kaninchen (1 Männchen, 1 Weibchen) mit Hyalin-Reparaturgewebe gefüllt (24A). Dieses auf Blut/Chitosan basierende Reparaturgewebe hatte das Aussehen von GAG-reichem Hyalinknorpel-Reparaturgewebe. Das Reparaturgewebe aus unbehandelten oder nur mit Blut behandelten Mikrofrakturdefekten hatte das Aussehen von Faserknorpel (24B). Es gab keinen histologischen Nachweis von Blut/Chitosan oder Blutgerinnsel, das nach 3 Wochen oder später nach der Abgabe innerhalb der Defektstelle überdauerte. Ein Knorpeldefekt mit Mikrobohrlöchern wurde in beiden Patella-Gleitlagern der Oberschenkenknochen eines erwachsenen Neuseeländischen Weißen Kaninchens erzeugt, wobei einer mit Blut/Chitosan-Gel gefüllt und der andere unbehandelt gelassen wurde. 51 oder 56 Tage nach der Heilung wurden die Gelenke fixiert, in LR-White verarbeitet und mit Toluidin-Blau angefärbt. In 24A hatte Reparaturgewebe aus dem mit Blut/Chitosan behandelten Defekt das Aussehen von metachromatisch angefärbtem Hyalinknorpel, der an den Defektoberflächen haftete und den Defekt ausfüllte. In 24B hatte Reparaturgewebe aus dem unbehandelten Defekt das Aussehen von Faserknorpel, praktisch ohne metachromatische Anfärbung auf GAG und mit nur einer partiellen Ausfüllung des Defekts.
Während die Erfindung unter besonderer Bezugnahme auf die erläuterten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte man sich darüber im Klaren sein, dass dem Fachmann zahlreiche Modifikationen einfallen werden. Dementsprechend sollten die obige Beschreibung und die Begleitzeichnungen als beispielhaft für die Erfindung und nicht in einschränkendem Sinn angesehen werden. Zum Beispiel haben wir nachgewiesen, dass das Mischen von Chitosan in Lösung mit Blut die Bildung eines Polymer/Blut-Gerinnsels ermöglicht, das sich nicht wesentlich kontrahiert und eine verlangsamte Freisetzung von chemotaktischen und mitogenen Blutproteinen, eine Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit von Blutzellen und eine dramatisch verbesserte Reparatur von Gelenkknorpeldefekten zeigt. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die Chitosanlösung auch anders hergestellt und dasselbe Ergebnis erzielt werden könnte. Beispiele dafür sind: 1) eine veränderte Chitosankonzentration und ein verändertes Mischungsverhältnis mit Blut, 29 eine veränderte Wahl der wässrigen Lösung durch Änderung des Puffertyps und der Konzentration der Spezies, 3) eine wässrige Suspension von Chitosan-Aggregaten, 4) ein teilchenförmiges Chitosanpulver, kombiniert mit einer geeigneten Mischtechnik, so dass diese Teilchen über das gesamte Blut verteilt und teilweise darin gelöst werden. Es können auch andere Polymere verwendet werden, wie 1) ein anderes Polysaccharid, wie Hyaluronan, wenn seine gerinnungshemmende Wirkung dadurch überwunden wird, dass man es in einem prokoagulierenden Zustand zubereitet (wie durch Verwendung einer niedrigen Konzentration oder Kombinieren mit Thrombin), und 2) ein Proteinpolymer, wie Polylysin oder Collagen, könnte verwendet und ähnliche Wirkungen erzielt werden. Obwohl wir aufgrund von Immunogenitäts-, Toxizitäts- und Zelladhäsions-/Kontraktions-Effekten nicht glauben, dass diese letzteren Ansätze so erfolgreich sein werden wie unsere bevorzugte Ausführungsform, werden diese und andere Zubereitungen als Bestandteil der vorliegenden Erfindung angesehen, da sie die Merkmale des Polymerpräparats der vorliegenden Erfindung besitzen, nämlich 1) dass sie mit Blut oder ausgewählten Blutkomponenten mischbar sind, 2) dass das resultierende Gemisch injizierbar ist oder an oder in einer Körperstelle, die eine Gewebereparatur, -regeneration, -rekonstruktion oder -expansion benötigt, platziert werden kann und 3) dass das Gemisch eine günstige Wirkung auf die Reparatur, Regeneration, Rekonstruktion oder Expansion von Gewebe an der Platzierungsstelle hat.
Literatur

Arnoczky, S. P., R. F. Warren, and J. M. Spivak. 1988. Meniscal repair using an exogenous fibrin clot. An experimental study in dogs. J Bone Joint Surg Am 70, no. 8: 1209–17.
Aston, J. E., and G. Bentley. 1986. Repair of articular surfaces by allografts of articular and growth-plate cartilage. Journal of Bone & Joint Surgery-British Volume 68-B, no. 1: 29–35.
Ateshian, G. A. 1997. A theoretical formulation for boundary friction in articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering 119, no. 1: 81–86.
Austin, P. R., C. J. Brine, J. E. Castle, and J. P. Zikakis. 1981. Chitin: New facets of research. Science 212, no. 4496: 749–53.
Atkinson, B., inventor. 24 Aug. 2000. "Device and method for regeneration and repair of cartilage lesions." Sulzer Biologics, assignee. WO Patent 00/48550.
Bartone, F. F, E. D. Adickes, 1988, Chitosan: effects on wound healing in urogenital tissue: preliminary report: J Urol, v. 140, p. 1134–7.
Bentley, G., and R. B. Greer. 1971. Homotransplantation of isolated epiphyseal and articular cartilage chondrocytes into joint surfaces of rabbits. Nature 230: 385–8.
Bernkop-Schnurch, A., and M. Pasta. 1998. Intestinal peptide and protein delivery-novel bioadhesive drug-carrier matrix shielding from enzymatic attack. Journal of Pharmaceutical Sciences 87, no. 4: 430–434
Braden, M., S. Downes, M. P. Patel, and K. W. M. Davy, inventors. 21 Nov. 1995. "Biomaterials for tissue repair." U.S. Pat. No. 5,468,787.
Breinan, H. A., T. Minas, H. P. Hsu, S. Nehrer, C. B. Sledge, and M. Spector. 1997. Effect of cultured autologous chondrocytes on repair of chondral defects in a canine model. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 79, no. 10: 1439–51,
Breinan, H. A., S. D. Martin, H. P. Hsu, and M. Spector. 2000. Healing of canine articular cartilage defects treated with microfracture, a type-II collagen matrix, or cultured autologous chondrocytes. J Orthop Res 18, no. 5: 781–9.
Brekke, J. H., and R. D. Coutts, inventors. 21 Dec. 1999. "Method and device for reconstruction of articular cartilage." THM Biomedicals, assignee. U.S. Pat. No. 6,005,161.
Brittberg, M., A. Lindahl, G. Homminga, A. Nilsson, O. Isaksson, and L. Peterson. 1997. A critical analysis of cartilage repair. Acta Orthopaedica Scandinavica 68, no. 2: 186–91.
Brittberg, M., A. Lindahl, A. Nilsson, C. Ohlsson, O. Isaksson, and L. Peterson. 1994. Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation. N. Engl. J. Med. 331, no. 14: 889–95.
Brittberg, M., A. Nilsson, A. Lindahl, C. Ohlsson, and L. Peterson. 1996. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 326: 270–83.
Buckwalter, J. A., and H. J. Mankin. 1997. Articular cartilage 0.2. Degeneration and osteoarthrosis, repair, regeneration, and transplantation (review). Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 79A, no. 4: 612–32.
Buschmann, M. D., Y. A. Gluzband, A. J. Grodzinsky, J. H. Kimura, and E. B. Hunziker. 1992. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Research 10, no. 6: 745–58.
Butnariu-Ephrat, M., D. Robinson, D. G. Mendes, N. Halperin, and Z. Nevo. 1996. Resurfacing of goat articular cartilage by chondrocytes derived from bone marrow. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 330: 234–43.
Caplan, A. I., M. Elyaderani, Y. Mochizuki, S. Wakitani, and V. M. Goldberg. 1997. Principles of cartilage repair and regeneration. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 342: 254–69.
Caplan, A. I., D. J. Fink, and R. G. Young, inventors. 5 Jan. 1999. "Biomatrix for soft tissue regeneration." U.S. Pat. No. 5,855,619.
Caplan, A. I., and S. E. Naynesworth, inventors. 22 Sep. 1998. "Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations." U.S. Pat. No. 5,811,094.
Carreno-Gomez, B., and R. Duncan. 1997. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Intl J of Pharmaceutics 148: 231–40.
Chenite, A., C. Chaput, C. Combes, F. Jalal, A. Selmani. Temperature-controlled pH-dependent formation of ionic polysaccharide gels. WO Patent 99/07416.
Chenite, A., C. Chaput, D. Wang, C. Combes, M. D. Buschmann, C. D. Hoemann, J. C. Leroux, B. L. Atkinson, F. Binette, and A. Selmani. 2000. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ. Biomaterials 21, no. 21: 2155–61.
Chesterman, P. J., and A. U. Smith. 1968. Homotransplantation of articular cartilage and isolated chondrocytes. An experimental study in rabbits. Journal of Bone & Joint Surgery-British Volume 50, no. 1: 184–97.
Childers, J. C. Jr, and S. C. Ellwood. 1979. Partial chondrectomy and subchondral bone drilling for chondromalacia. Clin Orthop, no. 144: 114–20.
Cho, Y. W., Y. N. Cho, S. H. Chung, G. Yoo, S. W. Ko, 1999, Water-soluble chitin as a wound healing accelerator: Biomaterials, v. 20, p. 2139–45.
Chu, C. R., R. D. Coutts, M. Yoshioka, F. L. Harwood, A. Z. Monosov, and D. Amiel. 1995. Articular cartilage repair using allogeneic perichondrocyte-seeded biodegradable porous polylactic acid (PLA): a tissue-engineering study. Journal of Biomedical Materials Research 29, no. 9: 1147–54.
Chu, C. R., J. S. Dounchis, M. Yoshioka, R. L. Sah, R. D. Coutts, and D. Amiel. 1997. Osteochondral repair using perichondrial cells, A 1-year study in rabbits. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 340: 220–9.
Clark, Richard A. F. 1996. The molecular and cellular biology of wound repair. 2 ed. New York; Plenum.
Cochrum, K. C., H. R. Parker, and M. M. C. Chu, inventors. 30 Jun. 1998. "Fibrogen/Chitosan hemostatic agents." The Regents of the University of California, assignee. U.S. Pat. No. 5,773,033.
Cohen, I., J. Gabbay, T. Glaser, and A. Oplatka. 1975. "Fibrin-blood platelet interaction in a contracting clot." Br J Haematol 31, no. 1: 45–50.
Collombel, C., O. Damour, C. Gagnieu, F. Poisignon, C. Echinard, and J. Marichy, inventors. 24 Nov. 1992. "Biomaterials with a base of mixtures of collagen, chitosan and glycosaminoglycans process for preparing them and their application in human medicine." Centre National de la Recherche, assignee. U.S. Pat. No. 5,166,187.
Denuziere, A., D. Ferrier, O. Damour, and A. Domard. 1998. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes: biological properties. Biomaterials 19, no. 14: 1275–85.
Depalma, A. F., C. D. McKeever, and D. K. Subin. 1966. Process of repair of articular cartilage demonstrated by histology and autoradiography with tritiated thymidine. Clinical Orthopaedics & Related Research 48: 229–42.
Dillon, G. P., X. Yu, A. Sridharan, J. P. Ranieri, and R. V. Bellamkonda. 1998. The Influence of Physical Structure and Charge on neurite Extension in a 3D Hydrogel Scaffold. Journal of Biomaterials Science Polymer Edition 9, no. 10: 1049–69.
Drohan, W. N., M. J. MacPhee, S. I. Miekka, S. S. Manish, Clive Elson, and John R. Taylor, inventors. 26 Sep. 2000. "Chitin hydrogels, methods of their production and use." Inc. Chitogenics, The American National Red Cross, and Coalition for Hemophilia, assignees. U.S. Pat. No. 6,124,273.
Dunn, A. R., and S. L. Dunn, inventors. 29 Nov. 1994. "Method of regenerating articular cartilage." U.S. Pat. No: 5,368,051.
Eser, E. A., Y. M. Elcin, and G. D. Pappas. 1998. Neural Tissue Engineering; Adrenalin Chromaffin Cell Attachment and Viability on Chitosan Scaffolds.
Neurological Research 20: 648-54. Frankel, S. R., B. Toolan, D. Menche, M. I. Pitman, and J. M. Pachence. 1997. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair.
J. Bone Joint Surg. 79-B, no. 5: 831–36.
Freed, L. E., D. A. Grande, Z. Lingbin, J. Emmanual, J. C. Marquis, and R. Langer. 1994. Joint resurfacing using allograft chondrocytes and synthetic biodegradable polymer scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research 28, no. 8: 891–9.
Fukamizo, T., and R. Brzezinski. 1997. Chitosanase from streptomyces sp. Strain n174-a comparative review of its structure and function (review). Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire 75, no. 6: 687–96.
Gouda, I., and O. Larm, inventors. 11 May 1999. "Method of promoting dermal wound healing with chitosan and heparin or heparin sulfate." Medicarb, assignee. U.S. Pat. No. 5,902,798.
Grande, D. A., and P. A. Lucas, inventors. 25 May 1999. "Mesenchymal stem cells for cartilage repair." Morphogen Pharmaceuticals Inc., and North Shore University Hospital Research Corp., assignees. U.S. Pat. No. 5,906,934.
Grande, D. A., M. I. Pitman, L. Peterson, D. Menche, and M. Klein. 1989. The repair of experimentally produced defects in rabbit articular cartilage by autologous chondrocyte transplantation. J. Orthop. Res. 7, no. 2: 208–18.
Green, W. T. 1977. Articular cartilage repair. Behavior of rabbit chondrocytes during tissue culture and subsequent allografting. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 124: 237–50.
Griffith-Cima, L., A. Atala, C. A. Vacanti, and K. T. Paige, inventors. 20 Jan. 1998. "Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo." M.I.T., assignee. U.S. Pat. No. 5,709,854.
Halvorsen, Y-D. C., W. O. Wilkison, and J. Gimble, inventors. 21 Feb. 2001. "Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair." EP Patent 1,077,253
Hall, B. K. 1983. Cartilage. New York, N.Y.: Academic Press.
Halpern, A. A., inventor. 12 Aug. 1997. "Method for cartilage repair. "U.S. Pat. No. 5,655,546.
Hangody, L., G. Kish, Z. Karpati, I. Szerb, and I. Udvarhelyi. 1997. Arthroscopic autogenous osteochondral mosaicplasty for the treatment of femoral condylar articular defects. A preliminary report. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 5, no. 4: 262–7.
Hangody, L., G. Kish, Z. Karpati, I. Szerb, and R. Eberhardt. 1997. Treatment of osteochondritis dissecans of the talus: use of the mosaicplasty technique-a preliminary report. Foot Ankle Int 18, no. 10: 628–34
Hansson, H-A., G. Johasson-Ruden, and O. Larm, inventors. 13 Apr. 1999. "Hard Tissue stimulating agent." Astra Akiebolag, assignee. U.S. Pat. No. 5,894,070.
Hendrickson, D. A., A. J. Nixon, D. A. Grande, R. J. Todhunter, R. M. Minor, H. Erb, and G. Lust. 1994. Chondrocyte-fibrin matrix transplants for resurfacing extensive articular cartilage defects. Journal of Orthopaedic Research 12, no. 4: 485–97.
Higaki, H., T. Murakami, and Y. Nakanishi. 1997. Lubricating ability of langmuirblodgett films as boundary lubricating films on articular surfaces. JSME Interna tional Journal Series C-Mechanical Systems Machine Elements & Manufacturing 40, no. 4: 776–81.
Homminga, G. N., S. K. Bulstra, R. Kuijer, and A. J. van der Linden. 1991. Repair of sheep articular cartilage defects with a rabbit costal perichondrial graft. Acta Orthopaedica Scandinavica 62, no. 5.415-6.
Hunziker, E. B., and L. C. Rosenberg. 1996. Repair of partial-thickness defects in articular cartialge-cell recruitment from the synovial membrane. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 78A, no. 5: 721–33.
Hyc, A., J. Malejczyk, A. Osiecka, and S. Moskalewski. 1997. Immunological response against allogeneic chondrocytes transplanted into joint surface defects in rats. Cell Transplantation 6, no. 2: 119–24.
Insall, J. N. 1967. Intra-articular surgery for degenerative arthritis of the knee. A report of the work of the late K. H. Pridie. J Bone Joint Surg Br 49, no. 2: 211–28.
Inui, H., M. TsujLkubo, S. Hirano, 1995, Low molecular weight chitosan stimulation of mitogenic response to platelet-derived growth factor in vascular smooth muscle cells: Biosci Biotechnol Biochem, v. 59, p. 2111–4.
Itay, S., A. Abramovici, and Z. Nevo. 1987. Use of cultured embryonal chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects in chick articular cartilage. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 220: 284-303.
Johnson, L. L., 1991. Arthroscopic abrasion arthroplasty. In Operative arthroscopy. McGinty, J. B. (Ed.) et al., 341-60. New York: Raven.
Johnstone, B., and J. Yoo, inventors. 1 Jun. 1999. "In vitro chondrogenic induction of human mesenchymal stem cells." Case Western Reserve University, assignee. U.S. Pat. No. 5,908,784.
Jorgensen, T., J. Moss, and H. Nicolajsen, inventors. 28 May 1998. "A method for promoting tissue repair." Dumex-Alpharma, assignee. WO Patent 98/22114.
Jurgensen, K., D. Aeschlimann, V. Cavin, M. Genge, and E. B. Hunziker. 1997. A new biological glue for cartilage-cartilage interfaces-tissue transglutaminase. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 79A, no. 2: 185-93.
Kandel, R. A., H. Chen, J. Clark, and R. Renlund. 1995. Transplantation of cartilaginous tissue generated in vitro into articular joint defects. Art. Cells, Blood subs., and Immob. Biotech. 23, no. 5: 565-77.
Kawamura, S., S. Wakitani; T. Kimura, A. Maeda, A. I. Caplan, K. Shino, and T. Ochi. 1998. Articular cartilage repair. Rabbit experiments with a collagen gelbiomatrix and chondrocytes cultured in it. Acta Orthopaedics Scandinavica 69, no. 1: 56–62.
Koyano, T., N. Minoura, M. Nagura, and K. Kobayashi. 1998. Attachment and growth of cultures fibroblast cells on pva/chitosan-blended hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research 39, no. 3: 486–90.
Kuettner, K. E. 1992. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clin Biochem 25, no. 3: 155–63.
Lahiji, A, A Sohrabi, D S Hungerford, C G Frondoza, 2000, Chitosan supports the expression of extracellular matrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes: J Biomed Mater Res, v. 51, p. 586–95.
Lee, K. Y., I. C. Kwon, Y. H. Kim, W, H. Jo, and S. Y. Jeong. 1998. Preparation of chitosan self-aggregates as a gene delivery system. Journal of Controlled Release 51, no. 2–3: 213–20.
Lee, Y M, Y J Park, S J Lee, Y Ku, S B Han, S M Choi, P R Klokkevold, C P Chung, 2000, Tissue engineered bone formation using chitosan/tricalcium phosphate sponges: J Periodontol, v. 71, p. 410–7.
Lu, J. X., F. Prudhommeaux, A. Meunier, L. Sedel, and G. Guillemin. 1999. Effects of chitosan on rat knee cartilages. Biomaterials 20, no. 20: 1937–44.
Mahomed, M. N., R. J. Beaver, and A. E. Gross. 19.92. The long-term success of fresh, small fragment osteochondral allografts used for intraarticular posttraumatic defects in the knee joint. Orthopedics (Thorofare, N.J.) 15, no. 10: 1191–9.
Malette, W. G., H. J. Quigley, R. D. Gaines, N. D. Johnson, w, G. Rainer, 1983, Chitosan: a new hemostatic: Ann Thorac Surg, v. 36, p. 55–8.
Malette, W. G., and H. J. Quigley, inventors. 19 Jul. 1983. "Method of acheving hemostasis." U.S. Pat. No. 4,394,373.
Malette, W. G., and H. J. Quigley, inventors. 30 Jul. 1985. "Method of achieving hemostasis, inhibiting fibroplasia, and promoting tissue regeneration in tissue wound." U.S. Pat. No. 4,532,134.
Mankin, H. J. 1974. The reaction of articular cartilage to injury and osteoarthritis (first of two parts). N Engl J Med 291, no. 24: 1285–92. 1974. The reaction of articular cartilage to injury and osteoarthritis (second of two parts). N Engl J Med 291, no. 25: 1335–40.
Mattioli-Belmonte, M., A. Gigante, R. A. Muzzarelli, R. Politano, A. De Benedittis, N. Specchia, A. Buffa, G. Biagini, F. Greco, 1999, N,N-dicarboxymethyl chitosan as delivery agent for bone morphogenetic protein in the repair of articular cartilage: Med Biol Eng Comput, v. 37, p. 130–4.
McCarty, Daniel J, and William J Koopman. 1993. Arthritis and allied conditions. A textbook of rheumatology. Philadelphia: Lea and Febiger.
Messner, K., and J. Gillquist. 1996. Cartilage repair-a critical review (review). Acta Orthopaedica Scandinavica 67, no. 5: 523–29.
Minas, T., and S. Nehrer. 1997. Current concepts in the treatment of articular cartilage defects. (Review) (41 refs). Orthopedics (Thorofare, N.J.) 20, no. 6: 525–38.
Mosbey, D. T., inventor. 11 Sep. 1990. "Wound filling composition." Minnesota Mining and Manufacturing Company, assignee. U.S. Pat. No. 4,956,350.
Mueller, W., and T. Thaler, inventors. 17 Nov. 1998. "Process for regenerating bone and cartilage." Sulzer Medizinaltechnik A G., assignee. U.S. Pat. No. 5,837,235.
Muzzarelli, R. A. A., and G. Biagini. 1993. Role and fate of exogenous chitosans in human wound tissues. Chitin Enzymology: 187–96.
Muzzarelli, R. A. A., W. S. Xia, M. Tomasetti, and P. Ilari. 1995. Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation. Enzyme & Microbial Technology 17, no. 6: 541–45.
Muzzarelli, R. A., M. Mattioli-Belmonte, C. Tietz, R. Biagini, G. Perioli, M. A. Brunelli, M. Fini, R. Giardino, P. Ilari, and G. Biagini. 1994. Stimulatory effect on bone formation exerted by a modified chitosan. Biomaterials 15, no. 13: 1075–81.
Namba, R. S., M. Meuli, K. M. Sullivan, A. X. Le, and N. S. Adzick. 1998. Spontaneous repair of superficial defects in articular cartilage in a fetal lamb model. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 80A, no. 1: 4–10.
Naughton, C. K., and B. A. Naughton, inventors. 28 Jul. 1998. "Threedimensional genetically engineered cell and tissue culture system." U.S. Pat. No. 5,785,964.
Naughton, G. K., and J. Willoughby, inventors. 1 Dec. 1998. "Method for repairing cartilage." U.S. Pat. No. 5,842,477.
Nevo, Z., D. Robinson, S. Horowitz, A. Hasharoni, and A. Yayon. 1998. The manipulated mesenchymal stem cells in regenerated skeletal tissues. Cell Transplantation 7, no. 1: 63–70.
Newman, A. P. 1998. Articular cartilage repair. American Journal of Sports Medicine 26, no. 2: 309–24.
Nixon, A. J., L. A. Fortier, J. Williams, and H. Mohammed. 1999. Enhanced repair of extensive articular defects by insulin-like growth factor-1-laden fibrin composites. J Orthop Res 17, no. 4: 475–87.
Noguchi, T., M. Oka, M. Fujino, M. Neo, and T. Yamamuro. 1994. Repair of osteochondral defects with grafts of cultured chondrocytes. Comparison of allografts and isografts. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 302: 251–8.
O'Driscoll, S. W., F. W. Keeley, and R. B. Salter. 1988. Durability of regenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in major fullthickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. A follow-up report at one year. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 70, no. 4: 595–606.
O'Driscoll, S. W., A. D. Recklies, and A. R. Poole. 1994. Chondrogenesis in periosteal explants. An organ culture model for in vitro study. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 76, no. 7: 1042–51.
Okamoto, Y, K Shibazaki, S Minami, A Matsuhashi, S Tanioka, Y Shigemasa, 1995, Evaluation of chitin and chitosan on open would healing in dogs: J Vet Med Sci, v. 57, p. 851–4.
Outerbridge, H. K., A. R. Outerbridge, and R. E. Outerbridge. 1995. The use of a lateral patellar autologous graft for the repair of a large osteochondral defect in the knee. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 77, no. 1: 65–72.
Pachence, J. M., S. Frenkel, and D. Menche, inventors. 27 Jun. 2000. "Multistage collagen-based template or implant for use in the repair of cartialge lesions." Hospital for Joint Disease Orthopaedic institute, assignee. U.S. Pat. No. 6,080,194
Paletta, G. A., S. P. Arnoczky, and R. F. Warren. 1992. The repair of osteochondral defects using an exogenous fibrin clot. An experimental study in dogs. Am J Sports Med 20, no. 6: 725–31.
Pechak, D. G., M. J. Kujawa, and A. I. Caplan. 1986. Morphology of bone development and bone remodeling in embryonic chick limbs. Bone 7, no. 6: 459–72.
Peluso, G., O. Petillo, M. Ranieri, M. Santin, L. Ambrosio, D. Calabro, B. Avallone, G. Balsamo, 1994, Chitosan-mediated stimulation of macrophage function: Biomaterials, v. 15, p. 1215–20.
Peterson, D. R. and N. Nousek-Goebl. 13 Mar. 2001. "Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration". DePuy Orthopaedics, assignee. U.S. Pat. No. 6,200,606. Pridie, K. H., A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. 1959. In Proceedings of the British Orthopaedic Association. J. Bone and Joint Surg. 41-B: 618–619
Purchio, A. F., M. Zimber, N. Dunkelman, G. K. Naughton, and B. A. Naughton, inventors. 11 May 1999. "Three-dimensional cartilage cultures." Advanced Tissue Sciences Inc., assignee. U.S. Pat. No. 5,902,741.
Rao, S. B., C. P. Sharma, 1997, Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential: J Biomed Mater Res, v. 34, p. 21–8
Robinson, D., N. Halperin, and Z. Nevo. 1990. Regenerating hyaline cartilage in articular defects of old chickens using implants of embryonal chick chondrocytes embedded in a new natural delivery substance. Calcif. Tissue Int. 46, no. 4: 246–53.
Rodgers, K., and G. Dizerega, inventors. 20 Jan. 2000. "Methods for accelerating bone and cartilage growth and repair." University of Southern California, assignee. WO Patent 00/02905.
Rodrigo, J. J., J. R. Steadman, and J. P. Sillima. 1993. Osteoarticular injuries of the knee. Operative orthopaedics. Second edition ed., 2077–82.
Sackier, J. M., C. B. Wood, R. Krishnan, G. R. Wiggington, and D. M. H. Butler, inventors. 18 Mar. 1997. "Method of regenerating or replacing cartilage tissue using amniotic cells." Genethics Limited, assignee. U.S. Pat. No. 5,612,028
Sall, K. N., J. K. Kreter, R. H. Keates, 1987, The effect of chitosan on corneal wound healing: Ann Ophthalmol, v. 19, p. 31–3.
Sams, A. E., and A. J. Nixon. 1995. Chondrocyte-laden collagen scaffolds for resurfacing extensive articular cartilage defects. Osteoarthritis & Cartilage 3, no. 1: 47–59.
Sashiwa, H., H. Saimoto, Y. Shigemasa, R. Ogawa, and S. Tokura. 1990. Lysozyme susceptibility of partially deacetylated chitin. International Journal of Biological Macromolecules 12, no. 5: 295–6.
Schipper, N. G. M., S. Olsson, J. A. Hoogstraate, A. G. Deboer, K. M. Varum, and P. Artursson. 1997. Chitosans as absorption enhancers for poorly absorbable drugs 0.2. Mechanism of absorption enhancement. Pharmaceutical Research 14, no. 7: 923–29.
Schwartz, R. E., inventor. 12 May 1998. "Cartilage repair unit and method of assembling same." Matrix Biotechnologies Inc., assignee. U.S. Pat. No. 5,749,874.
Schwarz, I. M., and B. A. Hills. 1998. Surface-active phospholipid as the lubricating component of lubricin. British Journal of Rheumatology 37, no. 1: 21–26.
Sechriest, V. F., Y. J. Miao, C. Niyibizi, A. Westerhausen-Larson, H. W. Matthew, C. H. Evans, F. H. Fu, and J. K. Suh. 2000. GAG-augmented polysaccharide hydrogel: a novel biocompatible and biodegradable material to support chondrogenesis. J Biomed Mater Res 49, no. 4: 534–41.
Sellers, R. S., D. Peluso, and E. A. Morris. 1997. The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on the healing of full-thickness defects of articular cartilage. Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 79, no. 10: 1452–63.
Sellers, R. S., R. Zhang, S. S. Glasson, H. D. Kim, D. Peluso, D. A. D'Augusta, K. Beckwith, and E. A. Morris. 2000. Repair of articular cartilage defects one year after treatment with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2). J Bone Joint Surg Am 82, no. 2: 151–60.
Shigemasa, Y., and S. Minami. 1996. Applications of chitin and chitosan for biomaterials. Biotechnol Genet Eng Rev 13: 383–420.
Soulhat, J, M. D. Buschmann, and A. Shirazi-Adl. 1999. A fibril-network reinforced biphasic model of cartilage in unconfined compression. Journal of Biomechanical Engineering 121, no. 3: 340–7.
Sparkes, B. G., and D. G. Murray, inventors. 25 Feb. 1986. "Chitosan based wound dressing materials." Her Majesty the Queen in right of Canada, assignee. U.S. Pat. No. 4,572,906.
Specchia, N., A. Gigante, F. Falciglia, and F. Greco. 1996. Fetal chondral homografts in the repair of articular cartilage defects. Bulletin-Hospital for Joint Diseases 54, no. 4: 230–5.
Steadman, J. R., W. G. Rodkey, K. K. Briggs, and J. J. Rodrigo. 1998. The microfracture procedure: Rationale, technique, and clinical observations for treatment of articular cartilage defects. J. Sports Traumatol. Rel. Res. 20, no. 2: 61–70.
Stone, C. A., H. Wright, T. Clarke, R. Powell, V. S. Devaraj, 2000, Healing at skin graft donor sites dressed with chitosan: Br J Plast Surg, v. 53, p. 601–6.
Stone, K. R., inventor. 29 Aug. 2000. "Method and paste for articular cartilage transplatation." U.S. Pat. No. 6,110,209.
Suh, J., H. Matthew, P. Fu, and F. Fu, inventors. 23 Sep. 1999. "Chitosan-based composite materials containing glycosaminoglycan for cartilage repair." University of Pittburg, assignee. WO Patent 99/47186.
Suh, J. K., H. W. Matthew, 2000, Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review: Biomaterials, v. 21, p. 2589–98.
Terbojevich, M., A. Cosani, and R. A. A. Muzzarelli. 1996. Molecular parameters of chitosans depolymerized with the aid of papain. Carbohydrate Polymers 29, no. 1: 63–68.
Tubo, R. A., L. M. Barone, and C. A. Wrenn, inventors. 3 Mar. 1998. "Methods and compositions for the repair of articular cartilage defects in mammals." Genzyme Corp., assignee. U.S. Pat. No. 5,723,331.
Ueno, H., H. Yamada, I. Tanaka, N. Kaba, M. Matsuura, M. Okumura, T. Kadosawa, T. Fujinaga, 1999, Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wound in dogs: Biomaterials, v. 20, p. 1407–14.
Vacanti, J. P., and R. S. Langer, inventors. 23 June 1998a. "Preparation of threedimensional fibrous scaffold for attaching cells to produce vascularized tissue in vivo." U.S. Pat. No. 5,770,193.
Vacanti, J. P., and R. S. Langer, inventors. 23 Jun. 1998b. "Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo." U.S. Pat. No. 5,770,417.
Vacanti, J. P., C. A. Vacanti, and R. S. Langer, inventors. 7 Apr. 1998. "Biodegradable synthetic polymeric fibrous matrix containing chondrocyte for in vivo production of a cartilaginous structure." M.I.T., and Children's Medical Center Corp., assignees. U.S. Pat. No. 5,736,372.
Vasios, G. W., P. D. DiBenedetto, C. A. Preston, R. A. Tubo, and J. M. McPherson. 1999. Chitotriosidase is expressed in normal chondrocytes and is upregulated in chondrocytes derived from osteoarthritic cartilage. 45th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society.
Villeneuve, P. E., inventor. 2 Feb. 1999. "Materials for healing cartilage and bone defects." U.S. Pat. No. 5,866,415.
Wakitani, S., T. Kimura, A. Hirooka, T. Ochi, M. Yoneda, H. Owaki, K. Ono, and N. Yasui. 1989. Repair of rabbit articular surfaces with allografts of chondrocytes embedded in collagen gels. Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi-Journal of the Japanese Orthopaedic Association 63, no. 5: 529–38.
Wakitani, S., T. Goto, S. J. Pineda, R. G. Young, J. M. Mansour, A. I. Caplan, and V. M. Goldberg. 1994. Mesenchymal cell-based repair of large, full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am 76, no. 4: 579–92.
Wei, X., J. Gao, and K. Messner. 1997. Maturation-dependent repair of untreated osteochondral defects in the rabbit knee joint. Journal of Biomedical Materials Research 34, no. 1: 63–72.
Yagi, K., N. Michibayashi, N. Kurikawa, Y. Nakashima, T. Mizoguchi, A. Harada, S. Higashiyama, H. Muranaka, and M. Kawase. 1997. Effectiveness of fructosemodified chitosan as a scaffold for hepatocyte attachment. Biological & Pharmaceutical Bulletin 20, no. 12: 1290–4.
Yalpani, M., and D. Pantaleone. 1994. An examination of the unusual susceptibilities of aminoglycans to enzymatic hydrolysis. Carbohydrate Research 256, no. 1: 159–75.
Zhang, R., E. Morris, and D. Peluso, inventors. 3 Aug. 2000. "Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage." Inc. Genetics Institute, assignee. WO Patent 00/44413.

Claims

Polymerzusammensetzung zur Verwendung bei der Reparatur eines Gewebes eines Patienten, wobei die Polymerzusammensetzung mit wenigstens Vollblut gemischt ist, wobei die Polymerzusammensetzung beim Mischen mit Vollblut zu einem Gemisch führt, wobei das Gemisch mit der Zeit oder beim Erhitzen in einen nichtflüssigen Zustand übergeht, wobei das Gemisch an der Stelle der Einführung zurückgehalten wird und daran haftet, um das Gewebe zu reparieren, wobei die Polymerzusammensetzung ein Polymer umfasst und in einem Puffer, der ein anorganisches oder organisches Salz enthält, gelöst oder suspendiert ist.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer ein modifiziertes oder natürliches Polysaccharid ist.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das Polysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chitosan, Chitin, Hyaluronan, Glycosaminoglycan, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Heparin und Neparinsulfat besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerzusammensetzung ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches Protein oder eine Polyaminosäure umfasst.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei die Polyaminosäure ein Polylysin ist.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem natürlichen Protein um lösliches Collagen oder lösliche Gelatine handelt.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerzusammensetzung Polymilchsäure, Polyglycolsäure, synthetische Homo- und Blockcopolymere umfasst, die Carboxyl-, Amino-, Sulfon-, Phosphonfunktionen mit oder ohne zusätzliche Funktionen enthalten.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei die zusätzlichen Funktionen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxy, Thiol, Alkoxy, Aryloxy, Acyloxy und Aroyloxy besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das anorganische Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natrium-, Chlorid-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat- und Carboxylatsalzen besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerzusammensetzung in einem Puffer gelöst oder suspendiert ist, der ein organisches Salz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glycerinphosphat, Fructosephosphat, Glucosephosphat, L-Serinphosphat, Adenosinphosphat, Glucosamin, Galactosamin, HEPES, PIPES und MES besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Polymerzusammensetzung einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,8 hat.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Polymerlösung eine Osmolarität hat, die auf einen physiologischen Wert zwischen 250 mOsm/l und 600 mOsm/l eingestellt wird.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Blut aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus venösem Blut, arteriellem Blut, Blut aus Knochen, Blut aus Knochenmark, Nabelschnurblut und Placentablut besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Blut ein gerinnungshemmendes Mittel enthält.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei das Blut ein gerinnungshemmendes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Citrat, Heparin und EDTA besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Blut ein gerinnungsförderndes Mittel enthält, so dass die Gerinnung/Verfestigung an der Stelle der Einführung verbessert wird.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei das gerinnungsfördernde Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Thrombin, Calcium, Collagen, Ellagsäure, Epinephrin, Adenosindiphosphat, Gewebefaktor, einem Phospholipid und einem Gerinnungsfaktor besteht.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei dem Gerinnungsfaktor um Faktor VII handelt.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Blut autolog oder nichtautolog ist.
Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Volumen der Polymerzusammensetzung in einem Verhältnis zum Volumen des Bluts oder der Blutkomponente verwendet wird, das von 1:100 bis 100:1 variiert.
Polymerzusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 19, wobei die Polymerzusammensetzung und das Blut unter Verwendung von Schallwellen, Rühren, Vortexmischen oder mehrere Durchläufe in Spritzen mechanisch vermischt werden.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die Polymerzusammensetzung 1,5% (w/v) Chitosan umfasst.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Polymer um Chitosan handelt.
Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei der Puffer Glycerinphosphat umfasst.
Verwendung der Polymerzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Herstellung eines Medikaments für die Gewebereparatur.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei das Gewebe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Knorpel, Meniskus, Bändern, Sehnen, Knochen, Haut, Augenhornhaut, Periodontalgeweben, Abszessen, resezierten Tumoren und Geschwüren besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei es sich bei dem Gewebe um Knorpel handelt.