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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, insbesondere
auf einen Cholesterinsensor, der leicht einen spezifischen Bestandteil
in einer Probe mit einer hohen Geschwindigkeit und mit einer hohen
Genauigkeit quantifizieren kann.
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Stand der Technik
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Als
ein Beispiel für
herkömmliche
Biosensoren wird im Folgenden ein Glukosesensor beschrieben.
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Ein
allgemein bekanntes Verfahren für
die Quantifizierung von Glukose ist ein System unter Verwendung
einer Kombination von Glukoseoxidase mit einer Sauerstoffelektrode
oder einer Wasserstoffperoxidelektrode. Glukoseoxidase oxidiert
selektiv β-D-Glukose
als ein Substrat zu D-Glukono-δ-Lakton unter Verwendung
von Sauerstoff als ein Elektronenvermittler. Während dieses Reaktionsvorgangs
wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Hierbei wird Glukose
entweder durch Messung einer Menge des verbrauchten Sauerstoffs
unter Verwendung der Sauerstoffelektrode, oder durch Messung der
Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid unter Verwendung von z.B.
einer Platinelektrode gemessen.
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Jedoch
sind derartige wie vorher beschriebene Verfahren stark durch die
gelöste
Sauerstoffkonzentration im Falle eines bestimmten zu messenden Objekts
beeinflusst, oder sind unmöglich
bei Bedingungen, in denen kein Sauerstoff vorhanden ist. Folglich
wurde ein Glukosesensor von einem derartigen Typ entwickelt, der
als den Elektronenvermittler einen Metallkomplex oder eine organische
Verbindung, wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat und
ein Chinonderivat ohne Verwendung von Sauerstoff als dem Elektronenvermittler
verwendet (siehe japanische offengelegte Patentschrift Hei 2-062952).
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Für die Herstellung
dieses Biosensors wird ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode,
einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode auf einer isolierenden
Grundplatte z.B. durch Siebdruck gebildet, und dann wird eine Enzymreaktionsschicht einschließlich einem
hydrophilen Polymer, einer Oxidoreductase und einem Elektronenvermittler
auf dem Elektrodensystem gebildet. Falls notwendig, wird weiterhin
ein Puffer zu dieser Enzymreaktionsschicht gegeben.
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Wenn
eine Probenlösung
einschließlich
dem Substrat auf die Enzymreaktionsschicht dieses Sensors getropft
wird, wird die Enzymreaktionsschicht gelöst und das Enzym reagiert mit
dem Substrat, wodurch diese Reaktion die Reduktion des Elektronenvermittlers
verursacht. Die Konzentration des Substrats in der Probenlösung kann
durch einen Oxidationsstrom für
das elektrochemische Oxidieren des folglich reduzierten Elektronenvermittlers
nach dem Ende der Enzymreaktion bestimmt werden.
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Gemäß dieser
Art von Sensor wird die reduzierte Form des Elektronenvermittlers,
die infolge der Enzymreaktion gebildet wird, durch die Elektrode
oxidiert, und die Konzentration an Glukose kann durch den Oxidationsstrom
bestimmt werden.
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Im
Prinzip kann ein derartiger Biosensor für die Messung verschiedener
Substanzen durch Verwendung eines Enzyms verwendet werden, dessen Substrat
jeweils eine zu messende Substanz ist. Zum Beispiel kann ein Serumcholesterinspiegel,
welcher als ein diagnostischer Index bei verschiedenen medizinischen
Einrichtungen verwendet wird, unter Verwendung von Cholesterinoxidase
oder Cholesterindehydrogenase und Cholesterinesterase als Oxidoreductase
gemessen werden.
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Die
Enzymreaktion von Cholesterinesterase schreitet sehr langsam voran.
Durch Zugabe einer geeigneten oberflächenaktiven Substanz dazu kann Cholesterinesterase
in ihrer Aktivität
verstärkt
werden, wodurch die für
die Gesamtreaktion erforderliche Zeit verkürzt werden kann.
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Da
dies jedoch dazu führt,
dass das Reaktionssystem oberflächenaktive
Substanz enthält,
welche Hämocyten
negativ beeinflusst, war es unmöglich
Messungen unter Verwendung von Vollblut durchzuführen.
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Wie
vorher beschrieben, in dem Fall der Messung eines Cholesterinspiegels
in einem Blut, ist ein oberflächenaktiver
Stoff in dem Reaktionssystem enthalten, und der oberflächenaktive
Stoff beeinträchtigt
stark die Erythrozyten im Blut. Dies machte es für Sensoren, wie etwa Glukosesensoren,
unmöglich,
Vollblut an sich zu messen. Es wurde daher ein Vorschlag gemacht,
ein Filterelement in der Nähe
einer Öffnung
eines Probenzufuhrweges vorzusehen, um dazu nur Plasma des Bluts
zuzuführen,
wobei die Erythrozyten ausfiltriert wurden. Beispielen für ein derartiges
System werden in
US 5,609,749 ;
US 5,658,444 ;
JP 11344461 und
EP 0856586 offenbart. Jedoch ist die
Fließgeschwindigkeit
des filtrierten Plasmas in das Innere des Sensors gering und ungleichmäßig, so
dass der Ansprech- bzw. Reaktionswert schwankt, und oftmals werden
Blasen erzeugt, wenn das Plasma in den Sensor eintritt, wodurch
die Messung unmöglich
wurde.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen verbesserten Biosensor
zur Verfügung
zu stellen, der nicht die vorher beschriebenen Nachteile hat, und
es Blutplasma mit daraus filtrierten Hämocyten ermöglicht, schnell das Elektrodensystem
zu erreichen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen Cholesterinsensor
zur Verfügung
zu stellen, mit hoher Genauigkeit und welcher hervorragende Ansprecheigenschaften
hat, und welcher es ermöglicht
Vollblut als ein zu messendes Objekt zu verwenden.
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Offenbarung der Erfindung
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Ein
erfindungsgemäßer Biosensor
umfasst: eine isolierenden Grundplatte; ein Elektrodensystem mit
einer Messelektrode und eine Gegenelektrode vorgesehen auf der Grundplatte;
eine Reaktionsschicht mit wenigstens einer Oxidoreductase und einem
Elektronenvermittler; einen Probenlösungszufuhrweg einschließlich dem
Elektrodensystem und der Reaktionsschicht; eine Probenzufuhreinheit;
und ein Filter, vorgesehen zwischen der Probenzufuhreinheit und
dem Lösungszufuhrweg
für das
Ausfiltrieren von Hämocyten
aus einem Blut, wobei das Plasma des Bluts, aus dem die Hämocyten
durch das Filter ausfiltriert wurden, in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs
aufgrund eines Kapillarphänomens
eingesaugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter an seiner
Stromaufwärtsseite
eine Querschnittsfläche
(F1) größer als
die Querschnittsfläche
einer Öffnung
(S1) des Probenlösungszufuhrweg
hat.
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Das
hierbei verwendete Filter umfasst einen porösen Körper mit auf dreidimensionale
Art und Weise verbundenen Poren. Dieser poröse Körper bewegt Blut aufgrund der
Kapillarwirkung von der Probenzufuhreinheitsseite zu der Probenlösungszufuhrwegseite
und hat die Funktion des Ausfiltrierens von Hämocyten aufgrund des Unterschieds
in den Fließwiderständen zwischen
dem Plasma und den Hämocyten.
Für dieses
Filter zu verwendende Materialien sind Vliesstoffe, Filterpapiere
und andere poröse
Körper, welche
Fasern umfassen, bevorzugt hydrophile Fasern, wie etwa Glasfaser,
Cellulose und Zellstoff.
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Eine
Querschnittsfläche
des Filters an seiner Stromabwärtsseite
ist bevorzugt gleich oder größer als
die Querschnittsfläche
an seiner Stromabwärtsseite,
welche an der Öffnung
des Probenlösungszufuhrwegs
angeordnet ist.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 ist
eine vertikale Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Die 2 ist
eine Draufsicht des gleichen Sensors, wobei eine Reaktionsschicht,
ein Abstandskalter und eine Abdeckung entfernt wurden.
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Die 3 ist
eine schräge,
auseinandergezogene Ansicht des gleichen Sensors.
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Die 4 ist
eine vergrößerte Querschnittsansicht
eines Hauptteils des gleichen Sensors.
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Die 5 ist
eine schematische, vertikale Querschnittsansicht, die Beispiele
von Strukturen von Probenzufuhreinheiten für einen Sensor zeigen.
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Die 6 ist
eine schematische Draufsicht, die Beispiele von Modifikationen von
Filtern für
einen Sensor zeigt.
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Die 7 ist
eine schematische vertikale Querschnittsansicht, die Beispiele von
Modifikationen von Filtern für
einen Sensor zeigt.
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Die 8 ist
eine vertikale Querschnittsansicht eines Sensors gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Die 9 ist
eine schräge
auseinandergezogene Ansicht des gleichen Sensors.
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Die 10 ist
eine schematische, vertikale Querschnittsansicht, die Beispiele
von Modifikationen von Filtern für
einen Sensor zeigt.
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Die 11 ist
eine vertikale Querschnittsansicht eines Sensors gemäß eines
Vergleichsbeispiels.
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Die 12 ist
eine Draufsicht des gleichen Sensors.
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Die 13 ist
eine graphische Darstellung, die Ansprecheigenschaften eines Beispiels
der vorliegenden Erfindung und des Vergleichsbeispiels zeigt.
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Bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung
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Wie
vorher beschrieben dient die vorliegende Erfindung dazu, Hämocyten
eines Bluts, die störende
Substanzen sind unter Verwendung eines Filters zu entfernen, damit
das Blutplasma schnell in ein Elektrodensystem eines Sensors fließen kann.
Spezifischer wird ein Filter zwischen einer Probenzufuhreinheit
und einem Probenlösungszufuhrweg
vorgesehen, welcher ein Elektrodensystem und eine Reaktionsschicht
enthält,
wobei der Filter eine Funktion des Ausfiltrierens von Hämocyten
hat und eine Querschnittsfläche
einer Stromabwärtsseite
davon hat, welcher größer als
die Querschnittsfläche
einer Öffnung
des Probenlösungszufuhrweges
ist. Dadurch wird aufgrund des Kapillarphänomens das Blutplasma mit daraus
filtrierten Hämocyten
in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs
gesaugt.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform wird
der Probenlösungszufuhrweg
zwischen der Grundplatte und dem mit der Grundplatte kombinierten
Deckelelement ausgebildet.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist wenigstens ein Teil des Deckelelements, welches das Filter und
den Probenlösungszufuhrweg
abdeckt, transparent.
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Weiterhin
werden die folgenden Bedingungen bevorzugt erfüllt, um das Blutplasma mit
daraus abgetrennten Hämocyten
in das Elektrodensystem einzubringen:
- 1) Die
Querschnittsfläche
des Probenlösungszufuhrwegs
ist gleich oder kleiner als der Querschnitt der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs;
- 2) Die Querschnittsfläche
des Endteilbereichs des Filters an der Elektrodenseite ist gleich
oder kleiner als jener der Seite auf der die Probenlösung eingebacht
wird, d.h. die Seite stromaufwärts
davon; und
- 3) Der Filter wird durch einen Haltekörper gehalten, so dass er nicht
an der Expansion gehindert wird.
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Spezifischer
ist es am meisten bevorzugt, dass die Querschnittsflächen eines
Hohlteils und des Filters innerhalb des Sensors, wo die Probenlösung fließt, graduell
von der Stromaufwärtsseite
des Filters, welcher der Probenzufuhreinheit gegenüberliegt,
zu der Belüftungsseite
abnimmt, welche am Ende des Probenlösungszufuhrwegs offen ist.
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Beispiele
von Filtern mit geringen Querschnittsflächen an ihren vorderen Enden
zu der Elektrodenseite sind z.B. diejenigen mit einer konvexen, konischen
oder trapezartigen Form als Gesamtfilterform.
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Was
mit einer geringeren Querschnittsfläche an dem vorderen Ende eines
Filters gemeint ist, ist, dass ein Teil, welcher den vorderen Teilbereich
des Filters an der Elektrodenseite stützt, schmaler wird je näher er dem
Probenlösungszufuhrweg
kommt.
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Um
die Hämocyten
vollständig
zu entfernen, welche störende
Substanzen sind, ist es bevorzugt, dass es wenigstens einen Teil
des Filters gibt, wo das Filter ohne Kontakt mit einer filterhaltenden
Einheit innerhalb eines Bereichs ist, der sich von der Probenzufuhreinheit
zu dem Probenlösungszufuhrweg
erstreckt, nämlich
einen Teilbereich des Filters, an dem ein Raum die Oberfläche des
Filters umfasst, so dass die Probenlösung durch den Filter ohne
Ausnahme und Versagen durchtritt. Andererseits gibt es eine Möglichkeit,
dass einige Hämocyten
entlang der filterhaltenden Einheit laufen, ohne durch den Filter
zu treten und in das Elektrodensystem fließen können.
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Nun
lasst uns den Fall vergleichen, in dem das Filter stromabwärts eine
Querschnittsfläche
kleiner als die Querschnittsfläche
stromaufwärts
hat, mit dem Fall, wo der Filter eine gleiche Querschnittsfläche von
der Stromaufwärts-
zu der Stromabwärtsseite
hat. In dem ersten Fall ist die Hämocytenseparationsposition
näher zu
der Stromaufwärtsseite
verglichen mit dem letzteren Fall, wo die Hämocytenseparationsposition
näher zu
der Stromabwärtsseite
ist. Demgemäß können im
letzteren Fall einige Hämocyten
möglicherweise
in den Probenlösungszufuhrweg gelangen.
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Unter
Verwendung dieser Strukturen und Konfigurationen ist es möglich, störende Substanzen aus
der Probenlösung
zu entfernen und das Plasma kann schnell in das Innere des Sensors
fließen.
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In
Bezug auf die relative Position zwischen dem vorderen Ende des Filters
an der Elektrodenseite und den Elektroden, ist es bevorzugt, dass
das Filter nicht in Kontakt mit den Elektroden ist.
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In
Bezug auf eine Position, wo das Filterelement mit dem Biosensor
vom Elektrodentyp verbunden ist, ist es gewöhnlich gut, derartige Positionen
an der Öffnungsseite
des Probenlösungszufuhrwegs auszuwählen, aber
eine derartige Position kann zum Zwecke der Platzersparnis ebenfalls
an der Entlüftungsseite
gewählt
werden. In einem derartigen Fall dient die Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs
als eine Entlüftung.
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Die
filterhaltende Einheit, wie auch die Abdeckung und der Abstandskalter
ist bevorzugt transparent. Dies ist so, damit eine visuelle Überprüfung des Vorgangs
durchgeführt
werden kann, in welchem die Probenlösung unter Verwendung des Filters
filtriert wird, und des Vorgangs, in welchem die filtrierte Probenlösung in
das Innere des Probenlösungszufuhrwegs
aufgrund des Kapillarphänomens
gesaugt wird, wodurch bestätigt
werden kann, ob die Filtration erfolgreich durchgeführt wurde.
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Verwendbare
Elektronenvermittler sind Kaliumferricyanid und diejenigen ausgewählt aus
Redoxverbindungen mit einer Funktion Elektroden zu und von einer
Oxidoreductase, wie etwa Cholesterinoxidase, zu transferieren.
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Eine
zu verwendende Oxidoreductase ist ein Enzym, dessen Substrat eine
zu messende Zielsubstanz ist. Im Falle eines Sensors für die Messung
von Glucose als ein Zielobjekt, ist Glucoseoxidase zu verwenden.
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Cholesterinoxidase
oder Cholesterindehydrogenase, welches ein Enzym für die Katalyse
der Oxidationsreaktion von Cholesterin ist, und Cholesterinesterase,
welches ein Enzym für
die Katalyse eines Vorgangs der Umwandlung von Cholesterinester zu
Cholesterin sind, werden für
die Messung eines Cholesterinspiegels verwendet, der als ein diagnostischer
Index in Blutserum verwendet wird. Die Enzymreaktion der Cholesterinesterase
schreitet sehr langsam voran. Durch Zugabe eines geeigneten oberflächenaktiven
Stoffs dazu, kann Cholesterinesterase in ihrer Aktivität verstärkt werden,
wodurch es möglich ist,
die für
die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu verkürzen. Diese wird auf oder in
der Nähe
des Elektronensystems angeordnet. Im Fall eines Sensors mit einem
Deckelement, welches durch Kombination mit einer Grundplatte einen
Probenlösungszufuhrweg zwischen
dem Deckelement und der Grundplatte bildet, können sie ebenfalls an einem
Teilbereich exponiert zu dem Probenlösungszufuhrweg oder an einer Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs
vorgesehen werden. Wo immer eine derartige Position ist, ist es bevorzugt
dass eine Reaktionsreagenzschicht leicht durch eine eingebrachte
Probenlösung
gelöst
wird, um dadurch das Elektrodensystem zu erreichen. Um die Elektrode
zu schützen,
und um die Ablösung
einer gebildeten Reaktionsschicht zu unterdrücken, ist es bevorzugt, dass
eine hydrophile Polymerschicht in Kontakt mit der Oberfläche des
Elektrodensystems gebildet wird. Ferner ist es neben dem Elektrodensystem
bevorzugt, dass eine hydrophile Polymerschicht als eine Grundlage
für die
Bildung einer Reaktionsschicht gebildet wird, oder dass eine Reaktionsschicht,
als eine unterste Schicht, ein hydrophiles Polymer enthält.
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Eine
Schicht mit einem Elektronenvermittler wird bevorzugt von einem
oberflächenaktiven
Stoff getrennt, für
den Zweck der Erhöhung
der Löslichkeit davon.
Ferner ist sie bevorzugt getrennt von der Cholesterinesterase, welches
ein Enzym für
die Katalyse der Oxidationsreaktion und Cholesterin ist, für den Zweck
der Sicherung der Lagerungsstabilität.
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Im
Fall von Biosensoren zur Messung des Blutzuckerspiegels gibt es
ein Beispiel, in welchem eine Schicht, die ein Lipid enthält, gebildet
wird, um z.B. eine auf dem Elektrodensystem gebildete Schicht abzudecken,
für den
Zweck der Erleichterung des Einführens
der Probenlösung
zu der Reaktionsschicht (siehe z.B. Japanische offengelegte Patentveröffentlichung
Hei 2-062952). Ein erfindungsgemäßer Biosensor
enthält
einen oberflächenaktiven Stoff,
welcher eine Funktion ähnlich
zu der eines Lipids hat, so dass keine Lipidschicht benötigt wird.
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Verwendbare
hydrophile Polymere sind z.B. wasserlösliche Cellulosederivate, insbesondere Ethylcellulose,
Hydroxypropylcellulose und Carboxymethylcellulose als auch Polyvinylpyrrolidon,
Polyvinylalkohol, Gelatine, Polyacrylsäuren und ihre Salze, Stärke und
ihre Derivate, Polymere von Maleinsäureanydrid und ihre Salze,
Polyacrylamid, Methacrylharz und Poly-2-hydroxyethyl-methacrylat.
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Oberflächenaktive
Stoffe können
ausgewählt werden
aus n-Octyl-β-D-thioglucosid,
Polyethylenglycolmonododecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-maltosid,
Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycolat, Natriumtaurodeoxycholat,
N,N-bis(3-Dglycon-amidepropyl))deoxycholamid und Polyoxyethylen(10)octylphenylether.
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Verwendbare
Lipide sind Phospholipide, bevorzugt amphipathische Lipide, wie
etwa Lecithin, Phosphatydylcholin und Phosphatydylethanolamin.
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Als
Verfahren für
die Messung eines Oxidationsstroms gibt es ein Zwei-Elektronensystem
nur unter Verwendung einer Messeelektrode und einer Gegenelektrode,
und ein Drei-Elektrodensystem, welches zusätzlich eine Referenzelektrode
verwendet. Das Drei-Elektrodensystem ermöglicht genauere Messungen.
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Hiernach
wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit Bezug auf spezifische
Ausführungsformen
beschrieben.
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Die 1 ist
eine vertikale Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einer
Ausführungsform
und die 2 ist eine Draufsicht, wobei
seine Reaktionsschicht, der Abstandskalter und die Abdeckung entfernt
wurden, während
die 3 eine schräge
auseinandergezogene Sicht des Biosensors ist, wobei seine Reaktionsschicht
und das Filter entfernt wurden.
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Das
Bezugszeichen 1 bezeichnet eine isolierende Grundplatte
aus Polyethylenterephtalat. Diese Grundplatte 1 hat ein
linkes Halbelement 1a mit einer geringeren Dicke und ein
rechtes Halbelement 1b mit einer Dicke von etwa dem zweifachen
der Dicke des linken Halbelements. Auf dem dünneren Element 1a wird
eine Silberpaste gedruckt, um Leitungen 2, 3 und
eine Grundlage für
ein Elektrodensystem zu bilden. Ferner wird auf die Grundplatte 1 eine
elektrisch leitfähige
Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel gedruckt, um ein Elektrodensystem
mit einer Messelektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 zu
bilden. Ferner wird eine isolierende Schicht 6 durch Drucken einer
isolierenden Paste auf einen bestimmten Bereich gebildet. Die isolierende
Schicht 6 definiert so die konstant exponierten Teile der
Messelektrode 4 und der Gegenelektrode 5 und bedeckt
teilweise die Leitungen 2 und 3. An dem dickeren
Element 1b der Grundplatte 1 werden nach oben
offene Aussparungen 7 und 8 vorgesehen.
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Ein
mit der Grundplatte 1 zu kombinierender Abstandshalter 11 umfasst
ein flaches Plattenelement 11a in einer Größe das es
die isolierenden Schicht 6 auf der Grundplatte 1 im
Wesentlichen abdeckt, und ein etwa Uförmiges Element 11b mit
einer größeren Höhe für das Abdecken
eines peripheren Teils des Elements 1b der Grundplatte
und für
die Bildung eines Raumteils, um einen später beschriebenen Filter auf
der Grundplatte 1 zu enthalten. Das U-förmige Element 11b hat
an seinem linken Endteil 16 eine Abschrägung 16, die kontinuierlich
ihre Höhe vermindert,
um so die gleiche Höhe
wie die des flachen Plattenelements an einen Teilbereich davon zu haben,
der mit dem flachen Plattenelement 11a verbunden wird. Überdies
hat das U-förmige
Element 11b ein Pressteilbereichg 19, um den Filter
zu pressen, an einer Position oberhalb eines Teilbereichs entsprechend
zu einem Abtrennungsteilbereich 9 zwischen den Aussparungen 7 und 8 der
Grundplatte 1. Das flache Plattenelement 11a hat
einen Schlitz 12, welcher von der Oberseite zu der Unterseite
davon durchdringt, und welches zu der Seite des U-förmigen Elements
offen ist.
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Eine
Abdeckung 21 hat die Elemente 21a und 21b,
welche entsprechend das flache Plattenelement 11a und das
Element 11b des Abstandshalters 11 bedecken und
an dem Element 21 einen geneigten Teilbereich 26 haben,
welcher in Übereinstimmung
mit dem schrägen
Teilbereich 16 des Abstandshalters sich neigt. Die Abdeckung 21 hat
ferner eine Entlüftung 22,
die mit einem Ende des Schlitzes 12 der Grundplatte 1 zu
verbinden ist, und ein durchgehendes Loch 28 hat, das mit
der Aussparung 8 und dem offenen Teilbereich 18 an
der rechten Seite des Pressteilbereichs 19 des Abstandshalters 11 zu
verbinden ist.
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Ein
in der 1 gezeigter Biosensor wird hergestellt durch:
Bildung einer Reaktionsreagenzienschicht oder von Reaktionsreagenzienschichten auf
der Grundplatte 1 und/oder an der Seite der Abdeckung 11;
weiterhin Einsetzen eines Filters 20 auf die Grundplatte 1;
und Kombinieren des Abstandshalters 11 und der Abdeckung 21 mit
der Grundplatte 1. In der 1 bezeichnet
das Bezugszeichen 10 ein Elektrodensystem. Das Filter 20 ist
auf eine derartige Art und Weise fixiert, dass es an der Oberseite
und Unterseite an einem hinteren Ende davon durch den abtrennenden
Teilbereich 9 der Grundplatte 1 und dem Pressteilbereich 19 der
Abdeckung 21 eingefasst ist; und ebenfalls an dem vorderen
Ende davon durch den geneigten Teilbereich 26 der Abdeckung 21 bzw.
eines Teilbereichs der Grundplatte 1 eingefasst wird, wobei
der Teilbereich der Grundplatte benachbart zu einer Öffnung ihres
Probenlösungszuführweges
ist. Ferner liegt das Filter 20 an seinem vorderen Ende
dem Probenlösungszufuhrweg
gebildet durch den Schlitzteilbereich 12 des Abstandshalters 11 gegenüber.
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Das
derartig fixierte Filter 20 ist an seiner einfassenden
Oberfläche
oberhalb der Aussparung 7 der Grundplatte 1 weder
in Kontakt mit der Grundplatte noch mit dem Deckelement. Daher ist
der Punkt, dass es einen Teilbereich des Filters 20 gibt, welcher
ein Teilbereich ist, der nicht in Kontakt mit einer filterhaltenden
Einheit ist, nämlich
dass es einen Raumteilbereich gibt, welcher das Filter umfasst,
wodurch Hämocyten
daran gehindert werden entlang der filterhaltenden Einheit zu laufen,
ohne das Filter zu durchtreten, und in das Elektrodensystem zu fließen.
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In
Bezug auf die 1 und 2 bezeichnet F1
eine Querschnittsfläche
der Stromaufwärtsseite des
Filters 20, während
F2 die Querschnittsfläche
der Stromabwärtsseite
des Filters 20 bezeichnet, wobei die Stromabwärtsseite
an der Öffnung
des Probenlösungszufuhrwegs
angeordnet ist. Auf der anderen Seite bezeichnet S1 die Querschnittsfläche der Öffnung des
Probenlösungszufuhrwegs,
während
S2 die Querschnittsfläche
des Probenlösungszufuhrwegs
bezeichnet.
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Die
vorliegende Erfindung ist, eine Beziehung S1<F1 zu haben. Dadurch erreicht Blutplasma mit
daraus ausfiltrierten Hämocyten
schnell das Elektrodensystem. Ein bevorzugtes Verhältnis ist
S2≤F1, bevorzugter
F2≤F1.
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Um
einen Cholesterinspiegel in einem Blut unter Verwendung dieses Sensors
zu messen, wird ein Probenblut auf die Aussparung 8 der
Grundplatte 1 durch das durchtretende Loch 28 der
Abdeckung 21 gegeben. Das hier zugeführte Blut tritt in das Innere
des Filters 20 von seinem Endteilbereich. Die Penetrationsgeschwindigkeit
von der Hämocyten
des Bluts in das Filter 20 ist langsamer als die des Plasmas,
welches ein flüssiger
Bestandteil ist. Daher sickert das Plasma aus dem Ende an der Elektrodensystemseite
des Filters. Das derartig herausgesickerte Plasma füllt den
gesamten Probenlösungszufuhrweg
von der Nähe
des Elektronensystems zu der Entlüftung 22, während das
Reaktionsreagenz gelöst wird,
welches z.B. Enzyme enthält
und an einer Position getragen wird, um das Elektrodensystem oder eine
hintere Oberfläche
der Abdeckung gerade oberhalb der Position zu bedecken. Wenn die
Gesamtheit des Probenlösungszufuhrwegs
mit der Flüssigkeit gefüllt ist,
stoppt der Zufluss der Flüssigkeit
in das Filter 20. Ab diesem Augenblick erreichen die Hämocyten
den Endteilbereich an der Elektrodensystemseite des Filters 20 nicht,
und werden dann an ihren Positionen zurückgehalten. Demgemäss ist das
Filter 20 so gestaltet, um einen Unterschied in dem Fließwiderstand
zwischen dem Plasma und den Hämocyten zu
einem derartigen Ausmaß zu
ergeben, dass die Hämocyten
nicht die Stromabwärtsseite
des Filters erreichen, selbst nachdem das Plasma in einer derartigen
Menge um die Gesamtheit des Probenlösungszufuhrweges auszufüllen dadurch
getreten ist. Ein geeignetes erfindungsgemäßes Filter ist ein Tiefenfilter
mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 1 bis 7 μm.
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Nach
einem derartigen Hämocyten-Filtrationsvorgang
reagiert das durch das Plasma gelöste Reagenz chemisch mit einem
zu messenden Bestandteil im Plasma, wobei der Bestandteil z.B. Cholesterin
im Falle eines Cholesterinsensors ist. Nach Verstreichen einer bestimmten
Zeit danach kann der Bestandteil ins Plasma durch Messung eines
elektrischen Stromwertes auf der Grundlage einer Elektrodenreaktion
quantifiziert werden. Die 4 zeigt
ein Beispiel des Aufbaus der Reaktionsreagenzschicht in der Nähe des Elektrodensystems
am Probenlösungszufuhrweg.
Auf dem Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 werden eine
Schicht 30 eines Natriumsalzes der Carboxymethylcellulose
(hiernach einfach als CMC bezeichnet) welches ein hydrophiles polymer
ist, und eine Schicht 31a eines Reaktionsreagenz wie z.B.
einem Elektronenvermittler, gebildet. Ferner wird eine Schicht eines
oberflächenaktiven Stoffs 32 und
eine Reaktionsreagenzschicht 31b mit einer Oxidoreductase
an einer hinteren Oberfläche des
Deckelelements mit der Abdeckung 21 kombiniert mit dem
Abstandskalter 11 gebildet, wobei die hintere Oberfläche zu dem
Probenlösungszufuhrweg hin
exponiert ist.
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Die 5, 6 und 7 sind
schematische Zeichnungen, die Beispiele von Modifikationen des Sensors
zeigen.
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Die 5 zeigt
verschiedene Beispiele von Probenzufuhreinheiten. Die 5(a)
zeigt eine Struktur, bei welcher eine Probenzufuhreinheit 8 eine Aussparung
hat, um wie in der 1 eine Probenlösung aufzunehmen.
Die 5(b) zeigt ein Beispiel mit einer Probenzufuhreinheit 8,
die in einer Art und Weise strukturiert ist, dass das Filter 20 an
einer oberen Seite eines Endteilbereichs davon, einen exponierten
Teilbereich hat, an welchem eine Probenlösung zuzuführen ist. Die 5(c)
zeigt eine Struktur, das eine Oberseite eines Endteilbereichs davon
und die Endoberfläche
an der Stromabwärtsseite
des Filters 20 exponiert sind. Folglich kann eine Probe
nicht nur zu der Probenzufuhreinheit 8 zugegeben werden, sondern
ebenfalls an der Oberseite des Endteilbereichs des Filters 20.
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Die 6 ist
eine Draufsicht, die verschiedene Formen der Filter zeigt. Die 6(a)
zeigt ein Beispiel, in welchem das Filter die gleiche Breite von
der Stromaufwärtsseite
zu der Stromabwärtsseite
davon hat. Die 6(b) zeigt ein Beispiel, in
welchem das Filter ein Abschrägung
hat, um eine kontinuierlich abnehmende Breite von der Stromaufwärtsseite
zu der Stromabwärtsseite
zu haben, wobei dessen Form ungefähr trapezartig ist. Die 6(c)
zeigt ein Beispiel, in welchem seine Breite an einem Mittelpunkt so
geändert
ist, dass die Breite an der Stromaufwärtsseite größer als die an der Stromabwärtsseite ist.
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Die 7 zeigt
Beispiele von Filtern mit verschiedenen Querschnittformen. In den 7(a)
bis (c) werden derartige Abschrägungen
vorgesehen, um die Querschnitte der Stromaufwärtsseiten größer als
diejenigen der Stromabwärtsseiten
zu machen. In den 7(d) und (e) hat jede Stromaufwärtsseite
einen Querschnitt der gleich zu dem der Stromabwärtsseite ist.
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Wie
in den 1 und den 5 bis 7 vorher
gezeigt, ist der Schlitz 12, welcher den Probenlösungszufuhrweg
aufbaut, so gestaltet, um eine Querschnittsfläche zu haben, die senkrecht
zu der Fließrichtung
der Flüssigkeit
ist, in jedem Fall kleiner als die Querschnittsfläche des
Filters 20. Ferner hat das Filter 20 im Wesentlichen
eine gleichmäßige durchgängige Dichte.
Folglich ist erfindungsgemäß die Querschnittsfläche S2 des
Probenlösungszufuhrwegs
so gestaltet, um kleiner als die Querschnittsfläche F1 der Stromaufwärtsseite
des Filters 20 zu sein, wodurch das Blutplasma ohne daraus
filtrierte Hämocyten
schnell aufgrund des Kapillarphänomens
in den Probenlösungszufuhrweg
gesaugt wird. Durch Verkleinerung der Querschnittsfläche des
Filters an der Vorderseite davon wird ermöglicht, dass das Plasma schnell
in das Innere des Sensors fließt.
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Es
wird ebenfalls möglich,
dass das Plasma schnell in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs fließt in dem
Fall, dass jede in der 5 gezeigte Probenzufuhreinheit
mit jeder in der 6 gezeigten flachen Form des
Filters und/oder jeder in der 7 gezeigten
Querschnittsfläche
des Filters kombiniert wird.
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Gemäß jedem
derartigen, gezeigten Biosensor ist die Breite der Stromaufwärtsseite
eines Filters bevorzugt nicht größer als
5mm und die Dicke davon ist nicht größer als 2mm. Die Breite der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs
ist bevorzugt nicht größer als
2mm und die Dicke davon ist nicht größer als 200 μm.
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Die 8 ist
eine vertikale Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einer
anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, während
die 9 eine auseinandergezogene schräge Ansicht mit
einer davon entfernten Reagenzschicht ist.
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Auf
einer isolierenden Grundplatte 31 werden Leitungen 32 und 33,
eine Arbeitselektrode 34 und eine Gegenelektrode 35 verbunden
mit den entsprechenden Leitungen als auch eine isolierende Schicht 36 in
einer ähnlichen
Art und Weise zu dem Fall der 1 gebildet.
Mehrere Abstandskalter 41, 43, 45, 47 und 49 und
eine Abdeckung 53 werden auf dieser Grundplatte 31 zusammengesetzt.
Ein Filter 51 ist an einem Teilbereich mit durchgängigen Löchern 46, 48 und 50 zwischen
dem Abstandskalter 43 und der Abdeckung 53 eingesetzt.
Ein durchgängiges
Loch 53 der Abdeckung 52 bildet einen Probenlösungszufuhrweg
und die durchgängigen
Löcher 42 und
44,m vorgesehen in den Abstandshaltern 41 und 42 bilden
einen Probenlösungszufuhrweg.
Die durchgängigen
Löcher 46 und 50 der
Abstandskalter 45 und 49 sind größer im Durchmesser
als das Filter 51, so dass die durch die Bezugszeichen 55 und 56 bezeichneten
Räume um
das Filter 51 gebildet werden, um das Filter 51 zu
umfassen. Der Abstandskalter 47 ist teilweise in Kontakt
mit der äußeren Peripherie des
Filters 51, um das Filter zu positionieren. Abstandskalter 41 hat
ein paar Lüftungen
54, um eine terminale Seite des Endteilbereichs des Probenlösungszufuhrweges
zu der äußeren Atmosphäre freizulassen.
Folglich wird aufgrund des Kapillarphänomens eine Probenlösung in
das Filter 51 eingebracht und in den Probenlösungszufuhrweg
in einem Bereich der sich von dem durchgängigen Loch 53, welches
als eine Probenzufuhreinheit dient, zu dem Elektrodensystem erstreckt.
Die Bewegung der Probenlösung
hört auf,
wenn durch das Filter 51 filtriertes Plasma das Elektrodensystem
erreicht.
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Hierbei
ist jede Dicke der Abstandshalter 49 und 45, welche
die Höhe
der Räume 55 und 56 abgrenzt,
bevorzugt nicht geringer als 100 μm.
Der Abstandshalter 41 hat das durchgängige Loch 42, welches
als ein Ort dient, wo die Probenlösung mit dem Reagenz reagiert.
Die Dicke des Abstandshalters 41 ist bevorzugt nicht größer als
200 μm.
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In
diesem Beispiel wird eine CMC-Schicht 61 und eine Elektronenvermittlerschicht 62 auf
dem Elektrodensystem gebildet und eine Schicht 63 mit einem
Enzym und einem oberflächenaktiven
Stoff wird auf der hinteren Oberfläche des Abstandshalters 43 gebildet.
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Die 10 zeigt
Beispiele von Filtern in Sensoren von einem derartigen Typ, wie
er vorher beschrieben wird, wobei eine Probenlösung von einer Probenzufuhreinheit
vorgesehen an der Abdeckungsseite, in Richtung eines Elektrodensystems
in der Schwerkraftrichtung zugeführt
wird. Die 10(a) zeigt ein Beispiel unter
Verwendung eines Filters 51 mit einem gleichen Querschnittteilbereich an
sowohl der Stromaufwärtsseite
als auch der Stromabwärtsseite
davon in der gleichen Art und Weise wie in der 8,
wobei 10(b) ein Beispiel zeigt, das
an seiner Stromabwärtsseite
eine Querschnittsfläche
kleiner als die Querschnittsfläche
an seiner Stromaufwärtsseite
hat.
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Hiernach
wird ein Beispiel der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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Beispiel 1
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Verfahren
für die
Herstellung eines Cholesterinsensors wird im Folgenden beschrieben,
welcher eine in den 1 bis 4 gezeigte
Struktur hat, wobei: eine Reaktionsschicht 31a einen Elektronenvermittler
enthält;
eine Reaktionsschicht 31b eine Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase
und einen oberflächenaktiven
Stoff enthält;
und eine Schicht 32 einen oberflächenaktiven Stoff umfasst.
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Zunächst wurden
5 μl einer
wässrigen
Lösung
mit 0,5 Gew.-% Natriumsalz der Carboxylmethylcellulose auf ein Elektrodensystem
getropft und dann in einem Heißlufttrockner
bei 50°C
für 10
Minuten getrocknet, wobei eine CMC-Schicht 30 gebildet wurde.
Als nächstes
wurden 4 μl
einer wässrigen
Kaliumferricyanidlösung
(entsprechend 70 mM Kaliumferricyanid) auf die CMC-Schicht 30 getropft
und dann in einem Heißlufttrockner
bei 50°C
für 10
Minuten getrocknet, wobei eine Reaktionsschicht 31a mit Kaliumferricyanid
gebildet wurde.
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Eine
Ethanollösung
in einer Menge von 2 μl mit
2 Gew.-% Polyoxyethylen(10)octylphenlether (Triton X-100), welches
ein oberflächenaktiver
Stoff ist, wurde auf eine Aussparung, gebildet durch einen Schlitz
einer Abdeckung kombiniert mit einem Abstandshalter, getropft und
wurde bei Raumtemperatur für
3 Minuten getrocknet, wobei eine Schicht eines oberflächenaktiven
Stoffs 32 gebildet wurde. Der vorher beschriebene Schlitz
hatte eine Breite von 2mm und eine Länge von 4,5mm, während der
Abstandshalter eine Dicke von 100 μm hat.
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Polyoxyethylen(10)octylphenylether
(Triton X-100), welcher ein oberflächenaktiver Stoff ist, wurde
zu einer wässrigen
Lösung
mit darin gelöster
Cholesterinoxidase aus Nocardia (EC1.1.3.6, hiernach als ChOD bezeichnet)
und Cholesterinesterase aus Pseudomonas (EC.3.1.1.13, hiernach als
ChE bezeichnet) gegeben. Diese gemischte wässrige Lösung wurde in einer Menge von
1,5 μl auf
die Schicht des oberflächenaktiven
Stoffs 32 getropft und durch flüssigen Stickstoff bei -196°C gefroren
und dann in einem Kjedahl-Kolben gelagert und in einem Gefriertrockner über Nacht
getrocknet, wodurch eine Reaktionsschicht 31b gebildet
wurde, die 480 Einheiten (E)/ml Cholesterinoxidase, 1.200 E/ml Cholesterinesterase
und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven
Stoffs enthält.
Auf der derartig gebildeten Grundplatte 1 einen Sensor
wurde in einer in der 2 gezeigten Art und Weise ein
Glasfaserfilterpapier, das so geschnitten wurde, um eine trapezartige
Form zu haben mit einer oberen Seite von 2mm, einer unteren Seite
von 4mm und einer Höhe
von 3mm und einer Dicke von 600 μm
und einer mittleren Porengröße von 2,3 μm so vorgesehen,
um nicht in Kontakt mit einer Arbeitselektrode zu sein.
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Danach
wurde das vorgeschriebene Deckelelement auf der Grundplatte gebunden,
wodurch ein Cholesterinsensor wie in der 1 hergestellt
wurde.
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Vergleichsbeispiel 1
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Ein
zu dem des Beispiels 1 ähnlicher
Cholesterinsensor wurde zusammengesetzt, außer dass der hier eingesetzte
Sensor einen Filter 20' mit
derartigen Abmessungen hat, dass seine Breite 2mm ist, seine Länge 27mm
war und seine Dicke 100 μm
war wie in der 11 und der 12 gezeigt.
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Die
Cholesterinsensoren A und B gemäß dem Beispiel
1 bzw. dem Vergleichsbeispiel wurden jeweils mit 20 μl eines Vollblutes
als eine Probenlösung
versehen, welches in die Aussparung 8 der Grundplatte 1 durch
das durchgängige
Loch 28 der Abdeckung 21 gegeben wurde, wobei
das durchgängige
Loch ein Einlass für
die Probenlösung
ist. Zu einem Zeitpunkt 3 Minuten später wurde eine Pulsspannung
von +0,5 V in der Anodenrichtung an die Messelektrode mit der Gegenelektrode
als eine Referenz angelegt, wobei ein Wert eines fließenden elektrischen
Stroms zu einem Zeitpunkt 5 Sekunden nach der Pulsspannungsanlegung
zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode gemessen wurde.
Die Ergebnisse derartiger Messungen werden in der 13 gezeigt.
Jeder der beiden Filter in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 hatten
ein apparentes Volumen von etwa 5,4 mm3.
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Wie
aus der graphischen Darstellung ersichtlich kann mit einem erfindungsgemäßen Sensor
eine gute Linearität
zwischen den Cholesterinkonzentrationen und den Ansprechwerten erhalten
werden.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können Hämocyten
eines Bluts, welche störende
Substanzen durch ein Filter entfernt werden, und das Blut kann schnell
zu dem Elektrodensystem geführt
werden, um einen elektrochemischen Biosensor mit hervorragenden
Antworteigenschaften zur Verfügung
zu stellen.