DE60120067T2

DE60120067T2 - Nachweis von mehreren Analyten in einer einzelnen Probe unter Verwendung eines diagnostischen Mehrgefäss-, Multianalyten-, Durchfluss-Testelementes

Info

Publication number: DE60120067T2
Application number: DE60120067T
Authority: DE
Inventors: Robert C. Phoenixville Fletcher; Alvydas J. Dayton Ozinskas; Kenneth G. Baltimore Kopher; John F. Phoenix Gill
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-09-24
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2021-09-25
Also published as: US7052831B2; DE60120067D1; US20020115062A1; EP1193499B1; EP1193499A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren zum Nachweisen und Unterscheiden von mehr als einem Analyten, die in einer einzigen Patientenprobe vorhanden sein können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit, der für solche Assays geeignet ist, und insbesondere auf ein Verfahren und einen Kit zum Nachweisen von und Unterscheiden zwischen Influenza A und Influenza B.
Diskussion des Hintergrunds
Influenza ist eine akute Viruserkrankung, die jahreszeitabhängig auftritt. Die Krankheit geht klassischerweise mit plötzlichem Fieber, Schüttelfrost, Kopf- und Muskelschmerzen und einem trockenen Husten einher. Die klinischen Manifestationen verschwinden gewöhnlich innerhalb von einer Woche wieder, wenn sich keine Komplikationen entwickeln.
Die Verbreitung der Influenza variiert von Jahr zu Jahr. Während der letzten drei Jahre lag die Verbreitung der Influenza in den USA im Bereich von etwa 28% bis etwa 34%. Influenza-A- und Influenza-B-Viren verursachen den größten Teil der klinisch signifikanten Krankheiten, wobei das Influenza-C-Virus nur für leichte, vorwiegend die oberen Atemwege betreffende Erkrankungen verantwortlich ist. Das Auftreten von Influenza B ist sporadischer als das von Influenza A. In der Grippesaison 1999-2000 in den USA hatten etwa 99,6% derjenigen, bei denen die Grippe diagnostiziert wurde, Influenza A, im Vergleich zu nur etwa 0,4%, bei denen Influenza B diagnostiziert wurde.
Patienten, bei denen eine Influenza vermutet wird, könnten von einer Behandlung mit antiviralen Mitteln profitieren. Amantadin (Symmetrel^®) und Rimantadin (Flumadin^®) stehen nur für die Prävention und Behandlung von Influenza A zur Verfügung. Zanamivir (Relenza^®) und Oseltamivir (Tamiflu^®) stehen für die Behandlung sowohl von Influenza A als auch von Influenza B zur Verfügung. Bei Erwachsenen kann die Therapie mit einem dieser Mittel die Schwere und Dauer der Krankheit reduzieren, wenn es innerhalb der ersten 48 Stunden nach Einsetzen der Krankheit verabreicht wird.
Eine Vielzahl von Assaysystemen, die sowohl schnell als auch empfindlich sind, wurde entwickelt, um eine in einer flüssigen Probe vorhandene Substanz, die im Allgemeinen als Analyt bezeichnet wird, nachzuweisen oder ihre Konzentration zu bestimmen. Herkömmliche Immunoassays beruhen auf der Bindung eines Antigens oder Haptens an einen spezifischen Antikörper und sind besonders nützlich, da sie einen hohen Grad an Spezifität und Empfindlichkeit aufweisen. Bei diesen Assays wird im Allgemeinen ein Reagens in markierter Form eingesetzt, wobei das markierte Reagens häufig als "Nachweisreagens" oder "Tracer" bezeichnet wird.
Verschiedene Methoden zur Markierung wurden entwickelt und werden in herkömmlichen Assaysystemen routinemäßig eingesetzt. Radioimmunoassay-Verfahren ("RIA"), bei denen Radioisotope als Marker verwendet werden, ergeben einen hohen Grad an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit und sind für die Automatisierung zur schnellen Verarbeitung einer großen Zahl von Proben geeignet. Ein Fluoroimmunoassay ("FIA"), bei dem Fluoreszenzfarbstoffe als Marker verwendet werden, ergibt einen direkten Nachweis des Markers durch Anregung des Farbstoffs mit Anregungsstrahlung einer geeigneten Wellenlänge und Nachweis der davon ausgehenden Fluoreszenz.
Enzyme werden häufig als Marker in Immunoassays verwendet. Bei einem herkömmlichen Enzymimmunoassay ("EIA") wird ein Enzym kovalent mit einer Komponente eines spezifischen Antigen-Antikörper-Bindungspaars konjugiert, und das resultierende Enzymkonjugat wird mit einem Substrat umgesetzt, wodurch ein Signal entsteht, das nachgewiesen und gemessen wird. Das Signal kann eine Farbänderung sein, die mit bloßem Auge oder durch eine spektrophotometrische Technik nachgewiesen wird, oder es kann sich um die Umwandlung des Substrats in ein Produkt handeln, das durch Fluoreszenz nachweisbar ist.
Ein zweckmäßiges Format für EIA ist der Festphasen-Immunoassay, bei dem eines der Assayreagentien auf einem festen Träger immobilisiert wird. Der feste Träger kann in Form eines Teststäbchens, der Innenwand eines Reagenzglases oder einer Küvette oder des Napfs einer Mikrotiterplatte vorliegen. Ein besonders gut geeigneter Festphasenträger ist eine mikroporöse Membran. Durchfluss-Assayvorrichtungen des im US-Patent Nr. 4,632,901 (Valkirs) offenbarten Typs, bei denen der Fluss durch Kapillarwirkung, die durch ein saugfähiges Kissen in Kontakt mit der Membran induziert wird, verstärkt wird, werden häufig eingesetzt.
Im Stand der Technik wurden zahlreiche Assays und Vorrichtungen beschrieben. Keiner bzw. keine davon befasst sich jedoch mit den Problemen, die von der vorliegenden Erfindung gelöst werden, sowie mit den unerwarteten und überraschenden Ergebnissen, die durch die vorliegende Erfindung erreicht werden.
Zum Beispiel offenbaren das US-Patent Nr. 5,747,274 und das US-Patent Nr. 5,710,008 (beide Jackowski et al.) ein Assayverfahren und eine Assayvorrichtung zur Bewertung, ob Schmerzen in der Brust bei einem Patienten vom Herzen herrühren, und zum Unterscheiden zwischen instabiler Angina pectoris und Myokardinfarkt als Ursache für die Brustschmerzen des Patienten. Die Vorrichtung weist jedoch nur eine gemeinsame Stelle zum Auftragen der Probe auf, d.h. sie enthält einen einzigen Napf. Nach ihrem Auftragen wandert die Probe außerdem durch Kapillarwirkung und tritt mit dem Detektorbereich und anschließend mit den Abfangbereich in Kontakt, so dass sie mit allen in der Vorrichtung vorhandenen Detektor- und Abfangantikörpern in Kontakt kommt.
Das US-Patent Nr. 5,208,143 (Henderson et al.) offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren für einen Festphasenimmunoassay für ein virales Antigen. Die Vorrichtung umfasst nur einen einzigen aufnehmenden Napf, in den die Probe und alle anderen Flüssigkeiten gegeben werden, während mit dem Verfahren die Anwesenheit nur eines einzigen viralen Antigens bestimmt wird. Wegen ihrer Ausgestaltung können die Vorrichtung und das Verfahren von Henderson et al. nicht leicht an den Nachweis von mehr als einem Antigen angepasst werden.
Khalil et al. offenbaren im US-Patent Nr. 5,006,309 eine Immunoassayvorrichtung mit zwei Näpfen. Die Vorrichtung ist so gestaltet, dass sie die Übertragung der Probe und des Reagensgemischs aus dem ersten Napf über eine Verbindungseinrichtung auf den zweiten Napf ermöglicht. Die Vorrichtung ermöglicht eine Verbindung zwischen den Näpfen und leidet daher unter denselben Nachteilen wie andere Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik.
Das US-Patent Nr. 4,981,786 (Dafforn et al.) offenbart eine Assayvorrichtung mit mehreren Anschlüssen. Die Vorrichtung umfasst zwar mehr als einen Napf, doch wird die Probe in einen ersten Napf eingeführt, und ein von der Probe verschiedenes flüssiges Reagens wird in einen zweiten Napf eingeführt. Außerdem wandern die Probe und das flüssige Reagens durch Kapillarwirkung entlang der Vorrichtung, so dass es eine Verbindung zwischen den Näpfen gibt. Diese Vorrichtung leidet daher unter denselben Nachteilen wie andere Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik.
Das US-Patent Nr. 4,977,078 (Niimura et al.) offenbart eine Immunoassayvorrichtung, die ein Plattensubstrat mit einer flachen Fläche, eine Menge von benachbarten Vorsprüngen, die aus der flachen Fläche herausragen, und eine Menge von Immunreaktionsbereichen, die durch Auftragen und Fixieren von Immunoassayreagentien auf und in die durch die benachbarten Vorsprünge definierten flachen Bereiche gebildet werden, umfasst. Diese Vorrichtung umfasst zwar eine Menge von Immunoassaybereichen, doch werden die Immunoassaybereiche nicht von Näpfen gebildet.
Die Assays und Vorrichtungen des Standes der Technik befriedigen nicht das Bedürfnis nach einem einfachen, reproduzierbaren und genauen Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit von zwei oder mehr Analyten in einer einzigen Patientenprobe und zum Unterscheiden zwischen diesen. Die Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik liefern auch keine Methode, um zwei nahe verwandte Proben nachzuweisen und zwischen diesen zu unterscheiden, während sie gleichzeitig gewährleisten, dass keine Kreuzreaktivität und/oder Kontaminierung auftritt, wie man sie bei Vorrichtungen beobachtet, bei denen eine Menge von Näpfen eingesetzt wird, die durch Kapillar- oder andere Wirkung miteinander in Verbindung stehen.
Außerdem wurden zwar Verfahren für die Diagnose von Influenza A oder Influenza B beschrieben, doch gibt es keine Verfahren oder Vorrichtungen, die den schnellen Nachweis von Influenza A und Influenza B in einer einzigen Patientenprobe und eine Unterscheidung zwischen diesen ermöglichen. Zu den Verfahren, die verwendet werden, um Influenza-A- und Influenza-B-Virusinfektionen zu diagnostizieren, gehören der schnelle Immunoassay, der direkte Proben-Immunofluoreszenzassay, die Reverse-Transcription-Polymerase-Kettenreaktion ("RT-PCR"), der serologische Assay und die Kulturisolierung mit Bestätigung. Immunofluoreszenzassays beinhalten das Anfärben von auf Objektträgern immobilisierten Proben mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur Beobachtung durch Fluoreszenzmikroskopie. Bei den Kulturverfahren wird eine anfängliche Virusisolierung in Zellkultur mit anschließender Hämadsorptionshemmungs-, Immunofluoreszenz- oder Neutralisationsassays zur Bestätigung der Anwesenheit des Influenzavirus eingesetzt.
Da sich die therapeutischen Optionen erweitert haben und Optionen zur Behandlung von Influenza B einschließen, wäre es vorteilhaft, schnell zwischen Influenza A und Influenza B unterscheiden zu können, um Ärzten eine Wahl zur gezielten antiviralen Intervention zu geben. Da nur Amantadin und Rimantadin Indikationen für eine Prophylaxe von Influenza A haben, wäre es außerdem vorteilhaft, zu bestimmen, ob Influenza A in einer besonderen Institution (z.B. einem Pflegeheim) oder Gemeinschaft eine symptomatische Krankheit verursacht, so dass geeignete Präventionsmaßnahmen in Bezug auf die betreffenden Individuen getroffen werden könnten. Es ist daher wichtig, nicht nur schnell zu bestimmen, ob eine Influenza vorliegt, sondern auch, welcher Typ von Influenzavirus vorhanden ist.
In Anbetracht der oben genannten Mängel, die den Verfahren des Standes der Technik anhaften, ist klar, dass ein Bedürfnis nach einem schnellen Immunoassaytest besteht, mit dem sich zwei oder mehr Analyten, insbesondere Influenza A und Influenza B, die in einer einzigen Patientenprobe vorhanden sein können, nachweisen lassen und zwischen diesen unterschieden werden kann.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, zwei oder mehr Analyten, die in einer einzigen Patientenprobe vorhanden sein können, nachzuweisen und zwischen diesen zu unterscheiden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Influenza-A- und Influenza-B-Virusantigene, die beide in einer einzigen Patientenprobe vorhanden sein können, nachzuweisen und zwischen diesen zu unterscheiden.
Um das obige und andere Ziele zu erreichen, und im Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung, wie sie hier verkörpert und allgemein beschrieben wird, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und einen Kit, mit denen sich in getrennten Näpfen zwei oder mehr Analyten in einer einzigen Probe nachweisen lassen und sich zwischen diesen unterscheiden lässt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um einen schnellen in-vitro-Enzymimmunoassay-Membrantest zum direkten und qualitativen Nachweis von Influenza-A- und/oder Influenza-B-Virusantigenen in Proben von symptomatischen Patienten. Der Test der vorliegenden Erfindung ist ein differenzierter Test und kann daher Influenza-A-Virusantigene in einem einzigen Test von Influenza-B-Virusantigenen unterscheiden.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, der eine diagnostische Durchflussvorrichtung mit zwei oder mehr Näpfen umfasst, wobei die Vorrichtung ein Vorrichtungsoberteil mit einer Mehrzahl von Näpfen, die nicht miteinander in Verbindung stehen, ein Vorrichtungsunterteil, ein absorbierendes Kissen zwischen dem Vorrichtungsoberteil und dem Vorrichtungsunterteil und eine Membran zwischen dem Vorrichtungsoberteil und dem absorbierenden Kissen umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen und Unterscheiden von zwei oder mehr Analyten, die in einer einzigen Patientenprobe vorhanden sein können. Die Membran ist der Ort der Analytenbindung und des Nachweises und der Differenzierung. Die Anwesenheit von zwei oder mehr Analyten in einer einzigen Probe kann durch Nachweis in getrennten Näpfen unterschieden werden, wobei man individuell unterschiedliche Nachweisreagentien verwendet, die an die Analyten binden, welche auf der Membran abgefangen sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Probe, die verarbeitet sein kann oder auch nicht, in jeden Napf gegeben. Der oder die in der Probe vorhandenen Analyten werden durch die Membran abgefangen. In die Näpfe werden Nachweisreagentien gegeben, und anschließend wird ein Substrat für die Farbentwicklung und den anschließenden visuellen Nachweis hinzugefügt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung gegenüber früheren diagnostischen Durchflusstestverfahren und -kits dar. Diese Verbesserung wird allgemein durch mehrere zugrundeliegende technische Prinzipien erreicht. Ein solches Prinzip besteht darin, dass eine einzige Patientenprobe, die mehr als einen Analyten enthalten kann, auf eine Mehrzahl von nicht miteinander in Verbindung stehenden Näpfen auf einer einzigen Testvorrichtung aufgeteilt wird, so dass wenigstens ein Analyt auf der Membran in wenigstens einem der Näpfe durch Fließen der Probe durch die Membran abgefangen wird. Ein weiteres ist die Zugabe und Bindung von einem oder mehreren individuell unterschiedlichen Nachweisreagentien in einer Weise, dass die Analyten voneinander unterschieden werden können. Die Bindung der Nachweisreagentien bildet nachweisbare Bereiche auf der Membranoberfläche.
Das obige und weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen besser aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen hervor, wenn sie in Verbindung mit den Zeichnungen und den beigefügten Ansprüchen betrachtet wird.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine perspektivische Ansicht der bevorzugten Assayvorrichtung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine perspektivische Draufsicht der Assayvorrichtung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, die den Filterstapel in gestrichelten Umrissen zeigt.
3 ist eine perspektivische Explosionsansicht der bevorzugten Assayvorrichtung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, die die Anordnung der Komponenten der Vorrichtung zeigt.
4 ist eine perspektivische Ansicht einer Durchflussreglereinheit, die als Teil der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
5 ist eine perspektivische Ansicht der bevorzugten Assayvorrichtung, die einen positiven Test auf Influenza A zeigt.
6 ist eine perspektivische Ansicht der bevorzugten Assayvorrichtung, die einen positiven Test auf Influenza B zeigt.
7 ist eine perspektivische Ansicht der bevorzugten Vorrichtung, die einen negativen Test sowohl auf Influenza A als auch auf Influenza B zeigt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Während diese Erfindung durch Ausführungsformen in vielen verschiedenen Formen verkörpert wird, werden hier im Einzelnen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, wobei man sich darüber im Klaren sein sollte, dass die vorliegende Offenbarung als beispielhaft für die Prinzipien der Erfindung anzusehen ist und die Erfindung nicht auf die erläuterten und beschriebenen Ausführungsformen einschränken soll. Der Fachmann kann zahlreiche Variationen vornehmen, ohne vom Wesen der Erfindung abzuweichen. Der Umfang der Erfindung bemisst sich nach den beigefügten Ansprüchen und ihren Äquivalenten.
Die Assayvorrichtung, die in dem Verfahren und Kit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird zuerst unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben. 1 zeigt die Vorrichtung 10, die ein Gehäuse 11 mit einem Basisteil 12 und einem Deckelteil 13 umfasst. Der Deckel 13 umfasst eine obere Wand 14 und eine im Wesentlichen vertikale Seitenwand 15. Eine Einfassung 16 ragt von der oberen Wand 14 aus nach oben. Die Einfassung 16 definiert eine Vertiefung 18, in der sich ein Einsatz 20 befindet, der vorzugsweise farbig ist. Der Einsatz 20 weist wenigstens zwei Öffnungen 22 und 24 auf, die mit wenigstens zwei Öffnungen 26 bzw. 28 im Deckel 13 ausgerichtet sind, so dass wenigstens zwei Näpfe in der Vorrichtung 10 entstehen.
2 zeigt einen Filterstapel 30 in gestrichelten Umrissen, der sich unter den Öffnungen 22 und 24 und den Öffnungen 26 und 28 befindet.
Einzelheiten des Basisteils 12 und des Filterstapels 30 sind in 3 deutlicher gezeigt. Der Basisteil 12 weist eine untere Wand 32 und eine im Wesentlichen vertikale Seitenwand auf, die durch einen im Wesentlichen horizontalen Boden 38 in einen unteren Abschnitt 34 und einen oberen Abschnitt 36 aufgeteilt ist. Die untere Wand 32 und die Seitenwandabschnitte 34 und 36 definieren zusammen eine Kammer 40, die den Filterstapel 30 aufnimmt.
Der obere Abschnitt 36 weist eine Mehrzahl von Vorsprüngen 42 auf, die von diesem ausgehend nach oben ragen. Die Vorsprünge 42 sind durch Zwischenräume 44 voneinander getrennt. Wenn die Vorrichtung 10 zusammengesetzt wird, wie es in 1 gezeigt ist, ruht die obere Wand 14 des Deckels 13 auf den oberen Flächen 46 der Vorsprünge 42, so dass der untere Rand 48 der Seitenwand 15 vorzugsweise leicht oberhalb des horizontalen Bodens 38 positioniert ist, wodurch eine Luftverbindung von der äußeren Umgebung über die Zwischenräume 44 zur Kammer 40 geschaffen wird.
Die Vorrichtung ist so aufzubauen, dass gewährleistet ist, dass es keine Verbindung zwischen den zwei oder mehr Näpfen gemäß irgendeiner Maßnahme oder irgendeines Mittels gibt.
Der Einsatz 20, der Basisteil 12 und der Deckel 13 können aus irgendeinem Kunststoff, wie Polyethylen, Polystyrol und Polypropylen, bestehen. Polypropylen ist am meisten bevorzugt. Der Einsatz 20 kann eine beliebige Farbe haben und hat vorzugsweise eine Farbe, die mit der Farbe, die sich auf den Testbereichen 56 und 58 entwickelt, wenn ein positiver Assay angezeigt wird, kontrastiert. Man sollte sich auch darüber im Klaren sein, dass die Vorrichtung 10 eine beliebige Form haben kann und nicht auf die in den Zeichnungen gezeigte Dreiecksform beschränkt ist.
Der Filterstapel 30 umfasst eine poröse Membran 50 mit einer oberen Fläche 52 und einer unteren Fläche 54. Die obere Fläche 52 umfasst vorzugsweise Testbereiche 56 und 58. Die Testbereiche 56 und 58 befinden sich jeweils unter den Öffnungen 22 und 24 des Einsatzes 20 und den Öffnungen 26 und 28 des Deckels 13. Die Testbereiche 56 und 58 können mit einem Bindemittel beschichtet sein, wie es im Folgenden beschrieben ist.
Die Membran 50 kann aus jedem Material bestehen, das leicht mit einer wässrigen Assaylösung benetzt werden kann. Die Membran 50 besteht vorzugsweise aus einem Material, das für die Bindung eines Assaybindungsreagens, wie eines Abfangantigens oder eines Abfangantikörpers, geeignet ist. Geeignete Materialien für die Membran 50 sind zum Beispiel Glas, Nylon und Cellulose. Bevorzugte Membranen können aus Nylon oder Nitrocellulose bestehen. Besonders bevorzugte Membranen sind von Pall Corporation, East Hills, New York, unter den Bezeichnungen Immunodyne^® und Biodyne^® A, B und C kommerziell erhältlich.
Die untere Oberfläche 54 der Membran 50 ist so positioniert, dass sie mit einem Kissen 60 aus absorbierendem Material in Kontakt steht, das eine obere Fläche 62 und eine untere Fläche 64 aufweist. Die untere Fläche 64 des Kissens 60 ruht auf der unteren Wand 32 des Basisteils 12. Während 3 das Kissen 60 so zeigt, dass es eine Mehrzahl von Elementen umfasst, ist offensichtlich, dass auch ein einziges Kissen mit geeigneter Dicke verwendet werden kann. Alternativ dazu kann die Mehrzahl von Elementen auch miteinander vernäht oder mit jedem anderen zweckmäßigen Mittel aneinander befestigt werden.
Das absorbierende Kissen 60 umfasst ein poröses Material mit einer Absorptionskapazität, die ausreicht, um im Wesentlichen alle Flüssigkeiten der Assayreagentien und alle Waschlösungen zu absorbieren. Das Kissen 60 dient auch dazu, die Kapillarwirkung einzuleiten, die die Assayflüssigkeiten durch die Testbereiche 56 und 58 saugt. Als solches kann das Kissen 60 vorzugsweise aus einem Cellulosematerial, wie zum Beispiel saugfähigem Cellulosepapier, gebildet sein. Geeignetes saugfähiges Cellulosepapier ist von Filtration Sciences, Mount Holly Springs, Pennsylvania, kommerziell erhältlich.
Falls gewünscht, kann der Filterstapel 30 noch zusätzliche Schichten (nicht gezeigt) umfassen, wie solche, die im US-Patent Nr. 5,073,340 (Covington et al.) und im US-Patent Nr. 5,185,127 (Vonk) beschrieben sind.
Wir beziehen uns nun auf 4. Vorrichtung 10 umfasst vorzugsweise eine Durchflussreglereinheit 70. Die Durchflussreglereinheit 70 ist ein geformter Einsatz, vorzugsweise aus Kunststoff, der wenigstens zwei Näpfe 72 und 74 aufweist. Die Zahl der Näpfe in der Durchflussreglereinheit ist gleich der Zahl der Näpfe in der Vorrichtung, so dass jeder Napf der Durchflussreglereinheit in einen der Näpfe der Vorrichtung passt, d.h. die Näpfe 72 und 74 passen in die Näpfe in Vorrichtung 10, die durch die Öffnungen 22 und 24 des Einsatzes 20 und die Öffnungen 26 und 28 des Deckels 13 gebildet werden. Die Unterseite jedes Napfes 72 und 74 weist eine Öffnung 76 bzw. 78 in Form zum Beispiel eines Dreiecks auf. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass die Form von jeder der Öffnungen 76 und 78 hier zwar als Dreieck beschrieben ist, doch dass jede Form annehmbar ist, solange die Öffnungen 76 und 78 kleiner sind als die Näpfe 72 und 74, so dass sie das Fließen der Probe durch die Testbereiche 56 und 58 regulieren. Die Öffnungen 76 und 78 berühren die obere Fläche der Membran 50, wenn die Durchflussreglereinheit 70 in die Vorrichtung 10 eingesetzt wird.
Die Vorrichtung 10 kann weiterhin sowohl interne positive als auch negative Verfahrenskontrollen enthalten. Vorzugsweise befindet sich auf der Membran, die sich in der Mitte eines der Näpfe befindet (im Folgenden als "A-Napf" oder "oberer Napf" bezeichnet), ein Kontrollpunkt mit rekombinanten Influenza-A(H1N1)-Antigenen. Ähnlich befindet sich vorzugsweise auf der Membran in der Mitte des anderen Napfes (im Folgenden der "B-Napf" oder "untere Napf") ein Kontrollpunkt mit rekombinanten Influenza-B(Lee-40)-Antigenen. Das Auftreten des kleinen Kontrollpunkts in der Mitte der Näpfe während des Tests ergibt eine interne positive Verfahrenskontrolle, die sowohl die immunologische Integrität der Vorrichtung und die richtige Reagensfunktion validiert als auch gewährleistet, dass das korrekte Testverfahren befolgt wurde. Der Membranbereich, der sowohl den Kontrollpunkt als auch den Bereich, der eine positive Reaktion anzeigt (wie später im Einzelnen beschrieben wird), umgibt, ist die interne negative Verfahrenskontrolle für die Testvorrichtung. Das Fehlen einer signifikanten Farbentwicklung in diesem Hintergrundbereich, die den Hinweis auf eine positive Reaktion oder den Kontrollpunkt überdecken würde, zeigt an, dass der Test korrekt durchgeführt wurde.
Wie oben erwähnt, kann die Membran mit einem Bindemittel für einen Analyten beschichtet sein. Wenn der Analyt ein Antigen ist, ist das auf die Membran aufzutragende Bindemittel im Allgemeinen ein spezifischer Antikörper, der häufig als "Abfangantikörper" bezeichnet wird. Wenn der Analyt ein Antikörper ist, kann das Bindemittel ein spezifisches Antigen sein, das als "Abfangantigen" bezeichnet wird. Es ist jedoch kein Bindemittel erforderlich, wenn der Analyt ein Influenza-A- und/oder Influenza-B-Virusantigen ist. In solchen Fällen, bei denen der Analyt ein Influenza-A- und/oder Influenza-B-Virusantigen ist, bindet das Antigen in Abwesenheit von Bindemittel unspezifisch an die Membran, wie im US-Patent Nr. 5,208,143 (Henderson et al.) beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in der Testvorrichtung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein Enzym-Immunmembran-Filterassay eingesetzt, um Influenza-A- und/oder Influenza-B-Antigene nachzuweisen, die aus geeigneten Proben von symptomatischen Patienten extrahiert wurden. Zu den geeigneten Proben gehören unter anderem Nasen-Rachen-Spülungen, Nasen-Rachen-Aspirat, Nasen-Rachen-Abstrich, Abstrich der unteren Nase, Rachenabstrich und bronchoalveoläre Lavage.
Allgemein gesagt wird gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Membran sowohl im A-Napf als auch im B-Napf der Probe ausgesetzt, von der man annimmt, das sie ein oder mehrere virale Antigene enthalten könnte. Vorzugsweise wird die Membran in den Näpfen in einem Durchflussformat während etwa 1 bis 15, vorzugsweise weniger als 5, Minuten bei einer Temperatur von etwa 15°C bis etwa 30°C, vorzugsweise bei oder etwa bei Umgebungstemperatur, mit der Probe inkubiert. Bei diesem Verfahren binden ein oder mehrere Antigene, die in der Probe vorhanden sind, an die Membran in den Näpfen. Die Antigenabwanderung ist bei dem Test der vorliegenden Erfindung kein Problem, da die Zielantigene Nucleoproteine sind, die typspezifisch und hochgradig konserviert sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Membran in jedem Napf, auf dem gemäß der obigen Beschreibung ein oder mehrere virale Antigen abgefangen sind, mit einem Nachweisreagens inkubiert. Insbesondere wird in jeden der Nachweisnäpfe ein individuell unterschiedliches Nachweisreagens gegeben. Das in jeden Napf gegebene Nachweisreagens umfasst vorzugsweise einen für das Antigen spezifischen Antikörper, der mit einem Marker konjugiert ist. Der Marker kann jeder herkömmliche Marker sein, der nach der Bindung des Nachweisreagens an das eine oder die mehreren Antigene, die auf der Membran abgefangen sind, ein Signal ergibt, das nachgewiesen werden kann. Dementsprechend kann der Marker ein radioaktives Atom oder ein Fluoreszenzfarbstoff sein, das bzw. der mit dem Antikörper konjugiert ist. Wenn der Marker ein radioaktives Element ist, besteht das Signal aus radioaktiven Zählereignissen. Ein typischer radioaktiver Marker ist zum Beispiel ¹²⁷I. Wenn der Marker ein Fluoreszenzfarbstoff ist, besteht das Signal aus einer Fluoreszenzemission, die nach der Anwendung von Anregungslicht einer geeigneten Wellenlänge auf den Farbstoff nachgewiesen wird. Ein typischer Fluoreszenzfarbstoff ist zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat ("FITC"). Die Konjugation von radioaktiven und fluoreszenten Markern mit Antikörpern ist herkömmlich, und für ein vollständiges Verständnis der Erfindung durch den Fachmann sind keine weiteren Einzelheiten zur Herstellung und Verwendung von radioaktiven Markern und Fluoreszenzmarkern im Immunoassay notwendig.
Vorzugsweise werden in der vorliegenden Erfindung Enzymkonjugate als Nachweisverfahren verwendet. Zu den geeigneten Enzymkonjugaten, die zum Nachweis verwendet werden können, gehören zum Beispiel Antikörper-Enzym-Konjugate und Enzym-Ligand-Konjugate. Am meisten bevorzugt erfolgt der Nachweis mittels Antikörper-Enzym-Konjugaten. Jedes Enzym, das mit dem Antikörper konjugiert werden kann und für das es ein Substrat gibt, das in ein farbiges Produkt umgewandelt werden kann, kann verwendet werden. Geeignete Enzyme sind zum Beispiel Cyclasen, Isomerasen, Peroxidasen und Hydrolasen, wie Peptidasen, Esterasen, Phosphatasen und Glycosidasen. Die Konjugation von Enzymen mit Antikörpern ist wohlbekannt und wird vom Fachmann vollständig verstanden. In einer Variation der vorliegenden Erfindung können auch andere Ligand-Konjugate verwendet werden, wie zum Beispiel Teilchen-Ligand-Konjugate; dazu gehören unter anderem kolloidale Metalle (d.h. Gold), Latex (d.h. Mikrokugeln aus Polystyrol) und Liposomen, Fluorophor-Ligand-Konjugate und andere Detektor-Ligand-Konjugate.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden individuell unterschiedliche Nachweisreagentien in jeden der Näpfe gegeben, die virales Antigen aufweisen, das in ihren Membranen abgefangen ist, so dass eine immunologische Bindung der Antigen- und Antikörperkomponente an die Membran induziert wird. Anschließend kann die Membran mit der daran gebundenen Antigen-Antikörper-Fraktion dann mit irgendeinem geeigneten Verfahren von der flüssigen Phase des Assaymediums abgetrennt werden, vorzugsweise dadurch, dass man die Flüssigkeit durch die Membran treten lässt. Das Fließen der Flüssigkeit durch die Membran kann durch die Schwerkraft erfolgen oder kann vorzugsweise durch Kapillarwirkung verstärkt werden, die durch das unter der Membran befindliche absorbierende Material verstärkt wird. Die Membran kann dann im Einklang mit herkömmlichen Immunoassayverfahren mit Waschlösungen behandelt werden. Die Membran kann anschließend mit einer Flüssigkeit wie Wasser, Kochsalzlösung oder Puffer, in der ein Enzymsubstrat gelöst ist, behandelt werden. Enzym in der gebundenen Fraktion wandelt das Substrat in ein Produkt um, das durch ein mit Farbe assoziiertes Signal nachweisbar ist. Bei dem nachgewiesenen Signal kann es sich um die Entwicklung oder das Verschwinden einer Farbe oder die Änderung von einer Farbe zu einer anderen handeln. Vorzugsweise ist das Substrat farblos, bis es vom Enzymmarker gespalten wird, wobei ein farbiges Produkt entsteht. Falls gewünscht, kann ein Reagens hinzugefügt werden, um die weitere Farbentwicklung abzubrechen. Die Zugabe eines solches Reagens sorgt für eine Zeit, während der Ergebnisse interpretiert werden können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird nun unter spezieller Bezugnahme auf Influenza A und Influenza B beschrieben; es gilt jedoch, dass das zur Zeit bevorzugte Verfahren zwar den Nachweis und die Unterscheidung von Influenza A und Influenza B umfasst, das Verfahren der vorliegenden Erfindung aber nicht darauf beschränkt ist.
In dieser bevorzugten Ausführungsform wird eine geeignete Atemwegsprobe von einem symptomatischen Individuum erhalten, von dem man annimmt, dass es Influenza A und/oder Influenza B haben könnte. Influenza-A- und/oder -B-Virusantigene können aus der Probe- extrahiert werden, indem man die Probe mit einem geeigneten Extraktionsmittel mischt. Dann wird eine Probe der extrahierten Probe auf jeden der Näpfe der Testvorrichtung verteilt. Die extrahierte Probe wird vorzugsweise tropfenweise in die Näpfe gegeben, wobei man einzelne Tropfen zwischen A- und B-Testnapf abwechselt, bis in jeden Napf der Testvorrichtung 4 Tropfen gegeben wurden. Vorzugsweise wird die Probe durch eine Filteranordnung in die Näpfe ausgestoßen, um Teilchen und feste Materialien zu entfernen, so dass die Probe vollständig absorbiert werden kann.
Während die Probe durch den Durchflussregler tritt, binden die in der Probe vorhandenen Influenza-A- und/oder -B-Antigene unspezifisch an die Membranoberfläche im A- und B-Napf. Vorzugsweise binden die in der Probe vorhandenen Antigene an die Membran in Form eines Dreiecks. Eine Dreiecksform ist zwar bevorzugt, doch sollte man sich darüber im Klaren sein, dass das Muster eine beliebige Form haben kann und nicht auf irgendeine bestimmte Form beschränkt ist.
Auf der Membran abgefangenes Antigen kann nachgewiesen werden, nachdem die Membran mit einem geeigneten Waschreagens gewaschen wurde. Anschließend wird ein Nachweisreagens, das enzymkonjugierte monoklonale Antikörper (2) enthält, die spezifisch für Influenza-A-Nucleoprotein-Antigen sind, zum oberen Napf oder A-Napf der Testvorrichtung gegeben. Ein Nachweisreagens, das enzymkonjugierte monoklonale Antikörper enthält, die spezifisch für Influenza-B-Nucleoprotein-Antigen sind, wird zum unteren Napf oder B-Napf der Testvorrichtung gegeben. Die Enzym-Antikörper-Konjugate binden nach ihrer Zugabe an die Membran in jedem der Näpfe an abgefangenes Antigen.
Der abgefangene Influenza-Antigen-Antikörper-Komplex kann durch eine enzymatische Farbentwicklung zum Beispiel in Form eines violetten Dreiecks visuell nachgewiesen werden. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass die Farbe nicht auf violett beschränkt ist und dass die Form nicht auf ein Dreieck beschränkt ist. Eine enzymatische Farbentwicklung in Form eines violetten Dreiecks auf der Membran entweder im oberen Napf oder im unteren Napf der Testvorrichtung zeigt einen positiven Test auf Influenza A bzw. auf Influenza B an. Ähnlich zeigt eine solche Farbentwicklung in beiden Näpfen einen positiven Test sowohl auf Influenza A als auch auf Influenza B an. Das Fehlen einer enzymatischen Farbentwicklung in Form eines violetten Dreiecks und die Bildung eines kleinen Kontrollpunkts zeigt nur einen negativen Test an. Die Gesamttestzeit ist kürzer als etwa 15 Minuten.
In 5 ist ein positiver Test auf Influenza A gezeigt. Wie man dort erkennt, erscheint ein Dreieck irgendeiner Intensität auf der Membran im A-Napf und zeigt an, dass Influenza-A-Antigen in der Probe vorhanden und nachweisbar ist. Der Hintergrundbereich, der das Dreieck umgibt, hat vorzugsweise eine hellgelbe bis hellviolette Farbe. Ein Kontrollpunkt sollte ebenfalls in der Mitte des Dreiecks sichtbar sein, wenn er nicht von einer intensiven positiven Reaktion verdeckt ist. 6 ist mit 5 identisch, außer dass 6 einen positiven Test auf Influenza B zeigt.
In 7 ist ein negativer Test auf Influenza A und Influenza B gezeigt. Wie man dort sieht, ist weder im A-Napf noch im B-Napf ein Dreieck sichtbar, was darauf hinweist, das keines der beiden Influenzaantigene in der Probe vorhanden und nachweisbar ist. Das Erscheinen eines Kontrollpunkts auf der Membran in jedem der Näpfe zeigt die richtige Durchführung der Testverfahren und das richtige Verhalten der Reagentien an.
Falls gewünscht, können für Zwecke der Qualitätskontrolle Kontrollreagentien anstelle von Patientenproben verwendet werden. Die Kontrollreagentien können als Mittel der zusätzlichen Qualitätskontrolle (d.h. zusätzlich zu der internen positiven und negativen Verfahrenskontrolle) verwendet werden, um eine positive oder negative Reaktion nachzuweisen. Es wird dasselbe Verfahren verwendet, wie es zuvor beschrieben wurde, außer dass Kontrolle A+/B– oder Kontrolle B+/A– und keine Patientenprobe mit dem Extraktionsreagens gemischt wird. Kontrolle A+/B– dient als positive Kontrolle für Influenza A sowie negative Kontrolle für Influenza B, während Kontrolle B+/A– als positive Kontrolle für Influenza B und als negative Kontrolle für Influenza A dient. Die Bildung zum Beispiel eines violetten Dreiecks auf der Membran im A-Napf der Vorrichtung, wenn Kontrolle A+/B– getestet wird, und auf der Membran im B-Napf der Vorrichtung, wenn Kontrolle B+/A– eingesetzt wird, zeigt weiterhin an, dass die antigenbindenden Eigenschaften der Membran funktionieren. Die Bildung von nur zum Beispiel einem violetten Kontrollpunkt im B-Napf der Vorrichtung, wenn Kontrolle A+/B– eingesetzt wird, ist ein geeignetes negatives Influenza-B-Kontrollergebnis, das eine richtige Funktion der Reagentien anzeigt und gewährleistet, dass das korrekte Testverfahren befolgt wurde. Ähnlich ist die Bildung von nur zum Beispiel einem violetten Kontrollpunkt im A-Napf der Vorrichtung, wenn Kontrolle B+/A– eingesetzt wird, ein geeignetes negatives Influenza-A-Kontrollergebnis.
Die Kontrollreagentien können auch verwendet werden, um eine geringe positive Reaktion nachzuweisen. Eine solche schwächere positive Reaktion kann durch Verdünnung beider Kontrollreagentien zusammen nachgewiesen werden.
Der Kit und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um die Anwesenheit des respiratorischen Syncytialvirus ("RSV") in einer einzigen Patientenprobe von Influenza zu unterscheiden.
Der Kit und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um mehr als einen Analyten in einem oder mehreren der Näpfe der Testvorrichtung nachzuweisen. Zwei oder mehr Analyten können in einem einzigen Napf durch Entwicklung beider Analyten in einem einzigen visuellen Zeichen, das auf der Membran der Testvorrichtung gebildet wird, durch Entwicklung von zwei oder mehr Zeichen in einem einzigen Napf der Testvorrichtung oder durch Entwicklung von zwei oder mehr Farben in einem einzigen Napf der Testvorrichtung nachgewiesen werden.
Zweckmäßigerweise kann der Kit der vorliegenden Erfindung eine Testvorrichtung enthalten, die in Kombination mit vorbestimmten Mengen verschiedener Reagentien zur Verwendung bei der Bestimmung eines oder mehrerer Analyten verpackt ist. Die Reagentien können zum Beispiel Extraktionsreagentien, Waschreagentien, Nachweisreagentien, Substratreagentien und Abbruchreagentien umfassen. Außerdem können auch andere Additive dabei sein, wie zum Beispiel Stabilisatoren, Puffer und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Reagentien des Kits ein Extraktionsreagens, wenigstens ein Waschreagens, ein erstes und ein zweites Nachweisreagens und ein Substratreagens. Das Extraktionsreagens umfasst vorzugsweise etwa 1,6% mukolytisches Mittel und etwa 7,4% Detergentien mit etwa 0,2% Natriumazid (Konservierungsstoff). Ein erstes Waschreagens umfasst etwa 50 mM Tris und Kaninchen-IgG mit etwa 0,2% Natriumazid. Zusätzliche Waschreagentien können ebenfalls dabei sein. Vorzugsweise umfasst ein zweites Waschreagens etwa 5% Butanol, etwa 2 M Harnstoff und etwa 100 mM Hepes mit etwa 0,2% Natriumazid, während ein drittes Reagens etwa 50 mM Tris und etwa 150 mM NaCl mit etwa 0,2% Natriumazid umfasst. Das erste Nachweisreagens umfasst vorzugsweise ein Konjugat von monoklonalen Maus-Anti-Influenza-A-Antikörpern (2) und Enzym mit etwa 0,2% Natriumazid. Das zweite Nachweisreagens umfasst vorzugsweise ein Konjugat von monoklonalen Maus-Anti-Influenza-B-Antikörpern und Enzym mit etwa 0,2% Natriumazid. Das Substratreagens umfasst vorzugsweise etwa 0,73 mM Chromogen. Der Kit kann weiterhin ein Abbruchreagens umfassen, bei dem es sich zum Beispiel um etwa 150 mM Zitronensäure handeln kann.
Zwei Kontrollreagentien können ebenfalls in dem Kit enthalten sein. Das erste Kontrollreagens umfasst vorzugsweise Influenza-A-Antigen mit etwa 0,1% Natriumazid, so dass es positiv auf Influenza A und negativ auf Influenza B reagiert. Das zweite Kontrollreagens, das positiv auf Influenza B und negativ auf Influenza A reagiert, umfasst vorzugsweise Influenza-B-Antigen mit etwa 0,1% Natriumazid.
Weitere Komponenten, die in dem Kit vorhanden sein können, sind Röhrchen für die Probenextraktion und Probenabgabe in die Testvorrichtung und Spitzen zum Filtrieren der Probe, während sie in die Testvorrichtung abgegeben wird. Zu den geeigneten Röhrchen und Spitzen gehören diejenigen, die unter dem Namen DispensTube^TM erhältlich sind.
Aufgrund der Geschwindigkeit und des Arbeitsflusses des Tests der vorliegenden Erfindung ist er als "STAT"-Influenza-A- und/oder -Influenza-B-Antigen-Nachweistest anwendbar, der schnell relevante Daten liefert, die die Diagnose der Influenza unterstützen. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Unterscheiden zwischen Influenza A und Influenza B kann die Gelegenheit einer größeren Selektivität der antiviralen Intervention bieten.
Beispiele
Analytische Studien
Analytische Empfindlichkeit
Die analytische Empfindlichkeit wurde mit Hilfe von 13 Influenzastämmen (7 Influenza-A-Stämmen und 6-Influenza-B-Stämmen) bewertet. Eine Verdünnungsreihe, die unter Verwendung von geeigneten Medium hergestellt wurde, wurde in dreifachen Parallelansätzen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung getestet. Die viralen Nachweisgrenzen wurden durch logistische Regressionsanalyse auf der Basis der Viruskonzentrationen und einer Interpretation der Testergebnisse berechnet.
Analytische Spezifität und Kreuzreaktivität
Die Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von 90 Mikroorganismen (58 Bakterien, 2 Hefen und 30 Viren) bewertet. Bakterien- und Hefeisolate wurden in Konzentrationen von etwa 10⁷ bis 10⁸ KBE/ml getestet. Eine Konzentration von > 108 CCU/ml wurde für M. pneumoniae verwendet. Virusisolate wurden in Titern von etwa 10⁴ bis 10¹⁰ TCID₅₀/ml getestet. Influenza C wurde in einem Titer von etwa 1,6 × 10¹⁰ CEID₅₀/ml getestet. Keiner der unten aufgeführten Mikroorganismen bzw. Viren lieferte ein positives Ergebnis in der Influenza-A- und -B-Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung.
Störende Substanzen
Die folgenden Substanzen wurden in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung getestet, und in dem Assay wurde für keine der Substanzen in den getesteten Konzentrationen eine Störung festgestellt: Vollblut (2%), 4 Nasensprays (25%), Acetylsalicylsäure (20 mg/ml), 3 Mundwässer (25%), Ibuprofen (10 mg/ml), Oseltamivir (0,5 mg/ml), Zanamivir (1 mg/ml), Chlorpheniraminmaleat (5 mg/ml), 4 Halstropfen (25%), Guaifenesin (20 mg/ml), Diphenhydramin-Hydrochlorid (5 mg/ml), Dextromethorphan-Hydrobromid (10 mg/ml), Pseudoephedrin-Hydrochlorid (20 mg/ml), Acetaminophen (216 mg/ml), Clemastinfumarat (0,35 mg/ml) und Phenylpropanolamin-Hydrochlorid (20 mg/ml).
Reaktivität und Spezifität von Influenza-A- und Influenza-B-Stämmen
Die Testvorrichtung und das Testverfahren der vorliegenden Erfindung wurden bewertet, um die Reaktivität sowohl gegenüber humanen als auch gegenüber nichthumanen Stämmen von Influenza A und Influenza B nachzuweisen, wobei eine Auswahl von 62 Influenzastämmen verwendet wurde. Alle Influenza-A-Stämme ergaben positive Ergebnisse auf Influenza A und negative Ergebnisse auf Influenza B. Alle Influenza-B-Stämme ergaben positive Ergebnisse auf Influenza B und negative Ergebnisse auf Influenza A. Alle bekannten Influenza-A-Hämagglutinin- und -Neuraminidase-Subtypen sind unten vertreten.

Claims

Kit zur Durchführung eines analytischen Tests zum Nachweis der Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten in einer biologischen Probe, wobei der Kit Folgendes umfasst: (a) eine analytische Testvorrichtung mit einer Mehrzahl von Näpfen, wobei die Näpfe nicht miteinander in Verbindung stehen und wobei jeder Napf Folgendes umfasst: einen Filterstapel (30), wobei der Filterstapel Folgendes umfasst: (i) eine poröse Membran (50) mit einer oberen Fläche und einer unteren Fläche; und (ii) ein absorbierendes Material (60); wobei die untere Fläche der porösen Membran (50) und das absorbierende Material (60) in physikalischem Kontakt und in Fluidverbindung miteinander stehen; (b) ein erstes Nachweisreagens, das einen ersten des einen oder der mehreren Analyten erkennen kann; (c) ein zweites Nachweisreagens, das einen zweiten des einen oder der mehreren Analyten erkennen kann; und (d) ein Reagens, das beim Nachweis des einen oder der mehreren Analyten ein Signal erzeugen kann.
Kit zur Durchführung eines analytischen Durchflusstests zum Nachweis der Anwesenheit von und zur Unterscheidung zwischen Influenza-A-Virus-Antigenen und Influenza-B-Virus-Antigenen in einer biologischen Probe, von der man annimmt, dass sie eines oder beide von Influenza-A-Virus-Antigenen und Influenza-B-Virus-Antigenen enthalten könnte, wobei der Kit Folgendes umfasst: (a) eine analytische Testvorrichtung mit einer Mehrzahl von Näpfen, wobei die Näpfe nicht miteinander in Verbindung stehen und wobei jeder Napf Folgendes umfasst: einen Filterstapel (30), wobei der Filterstapel Folgendes umfasst: (i) eine poröse Membran (50) mit einer oberen Fläche und einer unteren Fläche; und (ii) ein absorbierendes Material (60); wobei die untere Fläche der porösen Membran (50) und das absorbierende Material (60) in physikalischem Kontakt und in Fluidverbindung miteinander stehen; und wobei bei Kontakt einer flüssigen biologischen Probe, von der man annimmt, dass sie eines oder beide von Influenza-A-Virus-Antigenen und Influenza-B-Virus-Antigenen enthalten könnte, mit der porösen Membran (50) die Flüssigkeit durch die Membran (50) in das absorbierende Material (60) fließen kann, so dass wenigstens ein Teil der viralen Antigene, die in der flüssigen biologischen Probe vorhanden sind, an die poröse Membran (50) bindet; (b) ein erstes Nachweisreagens, das Influenza-A-Virus-Antigene erkennen kann; (c) ein zweites Nachweisreagens, das Influenza-B-Virus-Antigene erkennen kann; und (d) ein Reagens, das beim Nachweis von einem oder beiden von Influenza-A-Virus-Antigenen und Influenza-B-Virus-Antigenen ein Signal erzeugen kann.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Membran in jedem einer Mehrzahl von Näpfen einer analytischen Testvorrichtung, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, mit einer Probe, von der man annimmt, dass sie die Analyten enthalten könnte, wobei die Analyten nichtimmunologisch an die Membran binden; (b) Inkubieren der Membran mit wenigstens einem ersten Reagens, wobei das wenigstens eine erste Reagens wenigstens einen Antikörper umfasst, der für einen der Analyten spezifisch ist und einen daran konjugierten Marker aufweist, wodurch einer der Analyten an den wenigstens einen Antikörper bindet, wobei man eine an die Membran gebundene Fraktion erhält; (c) In-Kontakt-Bringen der Membran mit einem zweiten Reagens, das ein Signal erzeugen kann, um die Anwesenheit der gebundenen Fraktion nachzuweisen; und (d) Nachweisen der Analyten bei Erzeugung des Signals; wobei das wenigstens eine erste Reagens verschiedene Analyten erkennen kann.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von und zur Unterscheidung zwischen Influenza-A-Virus-Antigenen und Influenza-B-Virus-Antigenen, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen der Membran sowohl in einem ersten Napf als auch in einem zweiten Napf einer analytischen Testvorrichtung mit einer Mehrzahl von Näpfen, wie sie in Anspruch 2 definiert ist, mit einer Probe, von der man annimmt, dass sie die viralen Antigene von einem oder beiden von Influenza A und Influenza B enthalten könnte, wobei die viralen Antigene nichtimmunologisch an die Membran binden; (b) Inkubieren der Membran in dem ersten Napf mit einem ersten Reagens, das einen Antikörper umfasst, der für Influenza-A-Virus-Antigene spezifisch ist, wodurch die Influenza-A-Virus-Antigene, wenn sie vorhanden sind, an den Antikörper binden, wobei man eine an die Membran gebundene Fraktion erhält; (c) Inkubieren der Membran in dem zweiten Napf mit einem ersten Reagens, das einen Antikörper umfasst, der für Influenza-B-Virus-Antigene spezifisch ist, wodurch die Influenza-B-Virus-Antigene, wenn sie vorhanden sind, an den Antikörper binden, wobei man eine an die Membran gebundene Fraktion erhält; (d) In-Kontakt-Bringen der Membran in dem ersten und zweiten Napf mit einem zweiten Reagens, das beim Nachweis von einem oder beiden von Influenza-A- und Influenza-B-Virus-Antigenen ein Signal erzeugen kann; und (e) Nachweisen der Anwesenheit von einem oder beiden von Influenza A und/oder Influenza B bei Erzeugung des Signals.