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Diese
Erfindung bezieht sich auf eine Analyse von Mikroarrays. Insbesondere
bezieht sich die Erfindung auf ein Extrahieren von Signaldaten aus Mikroarraymerkmalen.
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Mikroarrays
von Biomolekülen,
z.B. DNA, RNA, cDNA, Polynukleotiden, Oligonukleotiden („Oligomeren"), Proteinen und
dergleichen sind hochmoderne biologische Hilfsmittel, die bei der
Untersuchung und Auswertung biologischer Prozesse, einschließlich Genexpression,
für analytische,
diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden. Mikroarrays
umfassen üblicherweise
eine Mehrzahl von Polymeren, z.B. Oligomeren, die in situ synthetisiert
oder vorsynthetisiert und auf ein Substrat in einem Arraymuster
aufgebracht werden. Mikroarrays von Oligomeren, die mittels einer
Festphasen-DNA-Synthese hergestellt werden, können Oligomerdichten aufweisen,
die an 106/Mikrometer2 heranreichen.
Gemäß der Verwendung
in dem vorliegenden Dokument werden die trägergebundenen Oligomere als „Sonden" bezeichnet, die
dahin gehend fungieren, eine Probe eines im Test befindlichen DNA-
oder RNA-Materials, die bei Hybridisierungsexperimenten als „Target" bezeichnet wird,
zu binden oder damit zu hybridisieren. Jedoch verwenden manche Forscher
auch die umgekehrten Definitionen, wobei sie die oberflächengebundenen
Oligonukleotide als Targets bezeichnen und die Lösungsprobe von Nukleinsäuren als
Sonden. Ferner binden manche Forscher die im Test befindliche Target-Probe
an das Mikroarraysubstrat und geben die Oligomersonden zum Zweck
einer Hybridisierung in Lösung.
Entweder das „Target" oder die „Sonden" kann bzw. können das
bzw. die sein, das bzw. die durch das bzw. die jeweils andere(n)
ausgewertet werden soll(en) (somit könnte(n) das eine oder die anderen ein
unbekanntes Gemisch aus Polynukleotiden sein, das durch ein Binden
mit dem bzw. den anderen ausgewertet soll). All diese Iterationen
fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erörterung. Lediglich der Einfachheit
halber ist hierin die Sonde das oberflächengebundene Oligonukleotid
einer bekannten Sequenz, und das Target ist der Anteil in einer mobilen
Phase (üblicherweise
Fluid), der durch die oberflächengebundenen
Sonden erfasst werden soll. Die Mehrzahl von Sonden und/oder Targets
in jeder Position in dem Array ist in der Technik als „Nukleinsäuremerkmal" bzw. „Merkmal" bekannt. Ein Merkmal
ist als Örtlichkeit
definiert, auf die eine große
Anzahl von Sonden und/oder Targets, die alle dieselbe Nukleotidsequenz
aufweisen, immobilisiert werden.
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Im
Gebrauch wird die Arrayoberfläche
mit einem oder mehreren Targets unter solchen Bedingungen in Berührung gebracht,
die eine spezifische, eine hohe Affinität aufweisende Bindung (d.h.
Hybridisierung) des Targets an eine oder mehrere der Sonden fördern. Die
Target-Nukleinsäuren
hybridisieren mit komplementären
Nukleinsäuren
der bekannten Oligonukleotidsondensequenzen, und somit können Informationen über die
Target-Proben erhalten werden. Die Targets sind üblicherweise mit einer optisch
erfassbaren Markierung, z.B. einer fluoreszierenden Kennzeichnung
oder einem Fluorophor, markiert, so dass die Targets nach einer
Hybridisierungsuntersuchung mit Abtastgeräten erfassbar sind. Die Targets können entweder
vor den, während
des oder sogar nach dem Hybridisierungsprotokoll markiert werden, je
nach dem gewählten
Markierungssystem, so dass sich der Fluorophor nur mit sondengebundenen
hybridisierten Targets assoziiert bzw. demselben zugeordnet ist.
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Nach
der Hybridisierung der Targets mit den Sondenmerkmalen wird das
Array anhand hinreichend bekannter Verfahren analysiert. Hybridisierte Arrays
werden oft unter Verwendung optischer Verfahren, z.B. mit einem
Abtast-Fluorometer, abgefragt. Eine fokussierte Lichtquelle (üblicherweise
ein Laser) wird über
das hybridisierte Array getastet, wodurch bewirkt wird, dass die
hybridisierten Bereiche ein optisches Signal, z.B. Fluoreszenz,
emittieren. Die Fluorophorspezifischen Fluoreszenzdaten werden während des
Abtastvorgangs gesammelt und gemessen, und anschließend wird
mittels geeigneter Algorithmen, Software und Computerhardware ein
Bild des Arrays rekonstruiert. Die erwarteten oder beabsichtigten
Positionen von Sondennukleinsäuremerkmalen
können
anschließend
mit den an diesen Positionen gemessenen Fluoreszenzintensitäten kombiniert werden,
um die Daten zu liefern, die dann dazu verwendet werden, Genexpressionsniveaus
oder die Nukleinsäuresequenz
der Target-Proben zu bestimmen. Der Vorgang des Sammelns von Daten
aus erwarteten Sondenpositionen wird als „Merkmalsextraktion" bezeichnet. Die
herkömmlichen
Instrumente und Verfahren der Merkmalsextraktion sind durch ihre
Abhängigkeit
von der erwarteten oder beabsichtigten Position der Sondenmerkmale
auf dem Substratarray, die der Genauigkeit der Mikroarrayproduktionsapparatur
unterliegt, eingeschränkt.
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Je
nach der Beschaffenheit der Target-Probe kann eine Hybridisierung
von Sondenmerkmalen an allen Sondenmerkmalspositionen auftreten
oder auch nicht, und sie tritt in unterschiedlichem Umfang an den
unterschiedlichen Sondenmerkmalspositionen auf. Ein allgemeines
Problem bei dem oben beschriebenen Merkmalsextraktionsvorgang ist
die Extraktion von Merkmalen, die auf Grund einer geringen oder
fehlenden Hybridisierung zu der Target-Probe an diesen Positionen
eine schwache oder geringe Fluoreszenzintensität aufweisen, wobei diese als „gedämpfte Merkmale" (engl.: „dim features") bezeichnet werden
(d.h. sie weisen bezüglich
eines Hintergrundes einen Kontrast einer geringen Intensität auf).
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Ein
Aspekt des Problems der Merkmalsextraktion ist die Position des
gedämpften
Merkmals. Wenn das gedämpfte
Merkmal nicht durch den Herstellungsprozess präzise auf dem Arraysubstrat
platziert wird (d.h. das Sondenmerkmal auf Grund des Herstellungsprozesses
fehlplatziert oder schlecht positioniert ist), zählt der Computer das gedämpfte Merkmal
nicht mit, und ungenaue Daten sind die Folge. Obwohl es gängige Praxis
ist, Orientierungsmarkierungen (engl.: fiduciary markings) auf dem
Arraysubstrat vorzusehen, mit denen die Herstellungsapparatur jeden
Herstellungsschritt ausrichtet, treten trotzdem noch Fehler bei
der Positionierung der Merkmale auf. Die Orientierungsmarkierungen
werden auch während
der Merkmalsextraktion verwendet. Die optische Abtastapparatur richtet
die Lichtquelle mit den Orientierungsarraymarkierungen aus, und
der Computer richtet seine vordefinierte Region zur Erfassung und
Analyse mit den Orientierungsmarkierungen auf der Substratoberfläche aus.
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Ein
weiterer Aspekt des Merkmalsextraktionsproblems tritt auf, wenn
das Sondenmerkmal, das nach der Hybridisierung ein schwaches Signal
erzeugt, aus irgendeinem Grund fehlgestaltet ist und der Computer
die unregelmäßige Form
nicht erfassen kann, was zu einer unrichtigen Bewertung des Hybridisierungsgrades
des Targets zu dem Sondenmerkmal führt. Die übliche Quelle fehlgestalteter Merkmale
ist der Herstellungsprozess. Häufige
Morphologien von fehlgestalteten Merkmalen sind ringförmige Merkmale
und fußballförmige Merkmale.
Andere, komplexere Morphologien wie z.B. Halbmonde sowie Defekte
auf Grund von Kratzern auf der Substratoberfläche werden ebenfalls beobachtet.
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Ein
weiterer Aspekt des Merkmalsextraktionsproblems tritt auf, wenn
der Durchmesser des Sondenmerkmals Schwankungen aufweist. Schwankungen
des Durchmessers eines Merkmals können sich aus Oberflächenchemieproblemen
auf der Oberfläche
des Substrats ergeben, z.B. Veränderungen der
Hydrophobie der Oberfläche.
Eine Oberflächenhydrophobie,
die höher
ist als erwartet, führt
dazu, dass das Merkmal einen geringeren Platzbedarf aufweist, da
das Merkmal auf der hydrophoberen Substratoberfläche tendenziell eher zu Tröpfchen zusammenläuft. Somit
kann das Merkmal an der richtigen Stelle positioniert sein und trotzdem
nur die Hälfte
bis zu drei Vierteln des erwarteten Durchmessers aufweisen (d.h.
der Fehler ist größer als
10 Prozent des Durchmessers). Wenn der Computer die interessierende
vordefinierte Region abtastet, sammelt er zusätzlich zu dem Merkmalssignal
Nicht-Sonden- Merkmalsdaten.
Das Merkmalssignal wird durch die zusätzlichen Daten beeinträchtigt.
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Die
Hauptschwierigkeit liegt in der Fähigkeit, mit einer gewissen
Sicherheit die tatsächliche
Position des Sondenmerkmals zu bestimmen, das zu dem schwachen Signal
führt,
um seine Erfassung durch die optischen Abtastgeräte zu gewährleisten. Ein gedämpftes Merkmal,
das sich in dem Arraymuster nicht konsequent auf dem Substrat befindet,
kann während
des Merkmalsextraktionsprozesses verfehlt werden, falls die Analysegeräte oder
die Bedienperson die wahrscheinlichen Positionen von inkonsequent
platzierten Merkmalen nicht kennen bzw. kennt. Somit liefert diese
Einschränkung
der herkömmlichen
Geräte
und des herkömmlichen
Verfahrens weniger genaue Ergebnisse, wenn die Fluoreszenzdaten
auf die Zusammensetzung der Target-Probe hin analysiert werden.
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Wie
oben erwähnt
wurde, nimmt die Dichte von Sonden auf einem Mikroarraychip ständig zu,
so dass gleichzeitig mehr Gene analysiert werden können und
somit Proben eingespart und Kosten verringert werden können. Ein
Erzielen von kleineren und kompakteren Arrays hängt stark von der Herstellungsapparatur
und der Herstellungsbearbeitung ab. Man sollte erkennen, dass, wenn
Sondenarrays für eine
Genanalyse dichter gepackt werden, sehr kleine Fehler bei der Sondenplatzierung
die Genauigkeit der Analyse der Hybridisierungsergebnisse schwerwiegender
beeinflussen.
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Das
Problem eines Lokalisierens von unkorrekt platzierten Sondenmerkmalen,
die nach der Hybridisierung zu schwachen Signalen führen, wird
mit abnehmender Merkmalsgröße besonders
schwierig, da die relative Bedeutung von Lokalisierungsfehlern zur
selben Zeit zunimmt, wie die Gesamtanzahl von Pixeln in dem Digitalarraybild,
die relevante Daten enthalten, abnimmt. Ein Extrahieren von Signaldaten aus
Mikroarraymerkmalen erfordert verschiedene Schemata einer Punktfindung
und Tendenzumkehr, um sowohl Positionsdefekte während der Herstellung als auch
Schwankungen zu kompensieren, die während der Hybridisierung (Blasen,
Fokusartefakte, Oberflächenschwankungen
usw.) und während
des Abtastens bzw. Scannens (Autofokus, Flachheit des Glases usw.)
auftreten.
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Verfahren
zum allgemeinen Lokalisieren von Merkmalen auf einem Substrat sind
in der US-Patentschrift Nr. 5,721,435 offenbart, die an Troll erteilt
und an die Anmelderin der vorliegenden Erfindung übertragen
ist. Die Verfahren von Troll umfassen eine Mehrzahl von Referenzmarkierungen
und Testpunkten auf einem Array, die, wenn sie optisch abgetastet werden,
allesamt Signale erzeugen, die erfasst und ausgewertet werden, um
die Position der Testpunkte zu bestimmen. Die Referenzmarkierungen
weisen optisch eindeutige Signaturen auf, um sie von den Signalen
von den Testpunkten zu unterscheiden. Die Referenzmarkierungen sind
in bekannten Entfernungen voneinander beabstandet und dienen dazu,
eine konstante Kalibrierung für
die Abtastapparatur zu liefern. Die Referenzmarkierungen sind üblicherweise Lasergeätzte oder
Metall-plattierte Ausrichtungsmarkierungen, die auf die Substratoberfläche geschrieben
sind. Dieses Verfahren der Merkmalslokalisierung wird üblicherweise
als „Koppeln" (engl.: „dead-reckoning") aus einem Gemisch
von Entwurfsparametern und physischen Orientierungspunkten bezeichnet.
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Ein
weiteres Verfahren zum allgemeinen Lokalisieren von Merkmalen, das
zum Lokalisieren von gedämpften
Merkmalen verwendet werden kann, ist eine Benutzer-assistierte Merkmalsextraktion
(„von Hand"). Obwohl diese Verfahren
allgemein gut bezüglich
dessen funktionieren, Merkmale auf einem Substrat ohne weitere Intervention
allgemein zu lokalisieren, sind sie nicht viel besser darin, gedämpfte Merkmale
zu lokalisieren, die durch die Herstellungsapparatur auf dem Substrat
falsch angebracht (d.h. nicht ordnungsgemäß platziert) sind. Ein Koppeln wird
sowohl durch unkompensierte systematische Lokalisierungsfehler als
auch durch zufällige
Lokalisierungsfehler beeinträchtigt.
Schließlich
ist eine Benutzer-assistierte Extraktion per definitionem subjektiv
und nicht automatisiert; sie ist also langsam, mühselig und anfällig für Fehler,
die durch eine Ermüdung des
Benutzers bewirkt werden.
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Somit
währe es
vorteilhaft, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum genauen Lokalisieren
von Sondenmerkmalen auf einem Mikroarray ungeachtet der Quantität und/oder
Qualität
des Target-spezifischen oder hybridisierten Sondensignals aufzuweisen.
Ferner wäre
es vorteilhaft, wenn die Vorrichtung und das Verfahren mit einer
herkömmlichen
Abtast- und Analyseapparatur verwendet werden könnten. Eine derartige Vorrichtung
und ein derartiges Verfahren wären
mit zunehmender Packungsdichte von Mikroarrays besonders sinnvoll.
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Die
US 6,077,674 offenbart ein
Verfahren zum Herstellen von Volle-Länge-Oligonukleotidarrays, das
die Reinigung von vorsynthetisierten Volle-Länge-Oligonukleotiden aus Oligonukleotiden
einer kürzeren
Länge und
anderen Verunreinigungen zur selben Zeit vorsieht, wie die Oligonukleotide
auf dem Array angeordnet werden. Ein synthetisiertes Gemisch, das
gewünschte
Volle-Länge-Oligonukleotide
und einige Sequenzen von Oligonukleotiden einer gekappten kürzeren Länge bzw.
von „fehlgeschlagenen" Oligonukleotiden
umfasst, wird mit einem Verknüpfungsmittel
zur Reaktion gebracht, um eine Verknüpfungsgruppe an dem freien
Ende der Volle-Länge-Oligonukleotide,
jedoch nicht der Kürzere-Länge-Oligonukleotide,
hinzuzufügen.
Das resultierende Gemisch wird auf ein Array aufgebracht, ohne dass
zuerst separat das Gemisch gereinigt wird, um die unerwünschten
Kürzere-Länge-Oligonukleotide zu beseitigen.
Nach der Aufbringung wird ungebundenes Material, das die Kürzere-Länge-Oligonukleotidsequenzen
und andere Verunreinigungen umfasst, beseitigt.
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Die
vorliegende Erfindung liefert eine Vorrichtung und ein Verfahren
zum genaueren Lokalisieren von Merkmalen auf ei nem Mikroarray. Die
Erfindung hängt
nicht von der Qualität
Target-spezifischer oder hybridisierter Sondensignale ab, um Merkmale zu
lokalisieren, und ist ohne weiteres bezüglich einer Verwendung mit
herkömmlicher
Abtast- und Analyseapparatur anpassbar.
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In
Bezug auf einen Aspekt der Erfindung ist eine Mikroarrayvorrichtung
mit einer verbesserten Merkmalserfassbarkeit vorgesehen, die eine
Kontrollsonde umfasst, die an einem Ende an einer Oberfläche eines
Mikroarraysubstrats in einem Arraymuster von Merkmalen auf dem Mikroarray
angelagert ist.
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Die
Kontrollsonde umfasst eine bekannte Sequenz von Nukleinsäuren. Kontrollsonden
sind in der Technik als Sonden einer spezifischen, bekannten Sequenz
von Nukleinsäuren
in einer bekannten Quantität
bekannt, die eine Hybridisierungsuntersuchung einer im Test befindlichen
Target-Probe nicht beeinträchtigen.
Im Gegensatz zu der herkömmlichen
Verwendung von Kontrollsonden nimmt die Kontrollsonde für die vorliegende
Erfindung auf dem Mikroarray keine wertvolle Fläche ein (d.h. zweckgebundene
Merkmale), sondern stattdessen wird die Kontrollsonde auf jedem
Merkmal des Mikroarrays zusammen mit einer jeweiligen Oligomertestsonde bestückt (nachstehend
beschrieben). Wenn die Kontrollsonde markiert ist, emittiert die
Kontrollmarkierung auf eine Anregung mit Licht hin, z.B. wenn sie mit
einer Mikroarray-Abtastvorrichtung
gescannt wird, ein spezifisches Signal. Das aus der Kontrollmarkierung
emittierte Signal ist von jeglichen anderen Signalen unterscheidbar,
die auf einem hybridisierten oder nicht-hybridisierten Mikroarray
von Oligomertestsonden verwendet werden können. Folglich ist die genaue
Position jedes einzelnen Merkmals in dem Mikroarray auf der Basis
des durch die markierte Kontrollsonde an jedem einzelnen Merkmal emittierten
Signals separat erfassbar. Das Signal von der markierten Kontrollsonde
wird vorteilhafterweise in einem separaten Kanal des Erfassungsabschnitts der
Abtastapparatur erfasst, um herkömmliche Hybridisierungssignale
und Erfassungskanäle
nicht zu beeinträchtigen.
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Die
Vorrichtung umfasst ferner eine Oligomertestsonde, die ebenfalls
an jedem Merkmal positioniert ist. Somit ist der Begriff „Merkmal" für die Zwecke
der Erfindung als Örtlichkeit
definiert, die sowohl eine Kontrollsonde als auch eine daran immobilisierte
Oligomertestsonde umfasst. Bei einem ersten Ausführungsbeispiel der Vorrichtung
ist die Oligomertestsonde an einem gegenüberliegenden Ende der Kontrollsonde
angelagert. Bei diesem Ausführungsbeispiel
wird die Kontrollsonde als Kontrollpfeiler bezeichnet. Der Kontrollpfeiler
wird zu einer Verlängerung
zwischen der Oberfläche
des Mikroarraysubstrats und der Oligomertestsonde. Bei diesem Ausführungsbeispiel
besteht zwischen der Kontrollpfeiler-Quantität und der Oligomertestsonde-Quantität vorteilhafterweise
eine Entsprechung von 1:1. Bei einem zweiten Ausführungsbeispiel
ist die Oligomertestsonde an der Substratoberfläche an jeder Merkmalsposition
angelagert. Bei diesem Ausführungsbeispiel
besteht zwischen Kontrollsonde-Quantität und Oligomertestsonde-Quantität keine
Korrelation von 1:1.
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Vorzugsweise
ist die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler und die Oligomertestsonde
jeweils mit einer Markierung assoziiert, nämlich einer Kontrollmarkierung
bzw. einer Testmarkierung. Die Kontrollmarkierung emittiert ein
Signal, das sich von einem durch die Testmarkierung emittierten
Signal unterscheidet, so dass die Signale durch die Abtastapparatur
unterscheidbar und getrennt erfassbar sind. Die Abtastapparatur
erfasst das Kontrollsignal in einem Kontrollerfassungskanal der
Abtastapparatur und erfasst das Testsignal vorzugsweise in einem
separaten Testerfassungskanal der Abtastvorrichung.
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Die
Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler kann direkt oder indirekt
mit einer Kontrollmarkierung assoziiert sein. Mit direkt assoziiert
ist gemeint, dass die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler eine
Kontrollmarkierung umfasst, die direkt an derselben bzw. demselben
angelagert (d.h. als Markierung direkt angebracht) ist. Wenn die
Kontrollmarkierung an jeder Merkmalsposition an der Kontrollsonde
bzw. dem Kontrollpfeiler angelagert oder mit derselben bzw. demselben
direkt assoziiert ist, so ist die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
vorteilhafterweise nützlich
für zerstörungsfreie
Qualitätskontrollauswertungen
des Arrays vor einem Hybridisierungsexperiment, sowohl vor als auch
nach einem Bestücken des
Mikroarrays mit Oligomertestsonden. Bei einer direkt markierten
Kontrollsonde oder einem direkt markierten Kontrollpfeiler ist es
möglich,
alle Merkmale abzutasten und zu erfassen, ohne jemals das Array
hybridisiert zu haben. Desgleichen kann die Oligomertestsonde direkt
mit einer Testmarkierung markiert sein.
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Mit
indirekt assoziiert ist gemeint, dass die Kontrollmarkierung an
einem komplementären,
kontrollspezifischen Target-Material angelagert oder mit demselben
assoziiert ist. Desgleichen ist die Testmarkierung an einer im Test
befindlichen Target-Probe angelagert oder einer solchen zugeordnet.
Die Merkmale an dem Mikroarray werden markiert (d.h. indirekt mit
einer jeweiligen Markierung assoziiert), wenn die markierten Kontroll-Targets
und die markierten Test-Targets
zu den Kontrollsonden oder bzw. -pfeilern bzw. Oligomertestsonden
an der Mikroarrayvorrichtung hybridisiert sind. Die markierten Kontroll-Targets
hybridisieren lediglich mit den Kontrollproben oder -pfeilern, und
die markierten Test-Targets hybridisieren lediglich mit den Oligomertestsonden.
Die markierten Kontroll-Targets werden vorzugsweise in Verbindung
mit (d.h. während
desselben Hybridisierungsschritts) der Hybridisierung des Test-Target-Materials zu Oligomertestsonden
hybridisiert. Wenn das hybridisierte Mikroarray abgetastet wird,
werden zumindest zwei unterschiedliche Signale aus jedem Merkmal
emittiert, wenn das Test-Target an einem jeweiligen Merkmal zu den
Oligomertestsonden zu den Oligomertestsonden hybridisiert ist. Die
Signale von der Kontrollmarkierung an jeder Merk malsposition werden
getrennt voneinander und getrennt von den Testmarkierungen an jeder
Merkmalsposition erfasst. Wenn die Kontrollmarkierung in demselben
Hybridisierungsschritt mit dem markierten Test-Target in die Kontrollsonde
oder den Kontrollpfeiler indirekt unter Verwendung eines markierten
Kontroll-Targets eingebracht wird, kann vorteilhafterweise jedes
Merkmal an dem Mikroarray für verschiedene
Signaltendenzen (global oder lokal) über das Array hinweg direkt
normiert werden.
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Bei
einer wieder anderen Art und Weise, die Kontrollsonde bzw. den Kontrollpfeiler
gemäß der Erfindung
zu markieren, wird die Kontrollsonde sowohl direkt markiert als
auch indirekt markiert, wie oben beschrieben ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel können vorteilhafterweise
sowohl eine zerstörungsfreie
Vorhybridisierungs-Qualitätskontrolle
als auch eine -Merkmalslokalisierung durchgeführt werden, indem bezüglich der
Signale von der Kontrollsondenmarkierung abgetastet wird, bevor
oder nachdem das Mikroarray mit Oligomertestsonden besetzt wird und/oder
vor einer Hybridisierung, sowie eine Nachhybridisierungs-Merkmalslokalisierung
und/oder -Extraktion mit einer Normierung von Hybridisierungsdaten,
wie oben beschrieben wurde, unter Verwendung der Signale von der
Kontroll-Target-Markierung.
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Die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird bei Hybridisierungsexperimenten
verwendet und ist besonders nützlich
beim Erfassen aller Merkmalspositionen, ungeachtet der Qualität des Signals
von hybridisierten Testsonden, ungeachtet der Qualität der Platzierung
der Oligomertestsonden und ungeachtet der Form des Merkmals. Die
in dem separaten Kontrollkanal gesammelten Signale werden dazu verwendet,
eine Merkmalslokalisierung zu unterstützen, insbesondere bei geringfügigen oder
gedämpften
Signalmerkmalen.
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Bei
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Mikroarrayvorrichtung
mit einer verbesserten Merkmalserfassbarkeit vorgesehen. Die Mikroarrayvorrichtung
umfasst eine Oligomertestsonde, die in einem Arraymuster von Merkmalen auf
einem Substrat angelagert ist, wie es herkömmlicherweise vorgesehen sein
kann. Gemäß diesem Aspekt
der Erfindung umfasst die Vorrichtung ferner eine Kontrollsequenz
von Nukleinsäuren,
die an einem Ende an einer Oberfläche des Substrats an jeder
Merkmalsposition angelagert sind. Die Kontrollsequenz ist mit einer
Kontrollmarkierung assoziiert, die, wenn sie durch ein Licht angeregt
wird, ein Kontrollsignal emittiert. Wenn es mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung
abgetastet wird, erzeugt jedes Merkmal das Kontrollsignal, wodurch
die Position jedes Merkmals identifiziert wird, ungeachtet dessen,
ob (und in welchem Umfang) die Oligomertestsonden während einer
Hybridisierungsuntersuchung mit einer im Test befindlichen Target-Probe hybridisiert werden.
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Bei
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zum Durchführen
einer zerstörungsfreien
Qualitätskontrollauswertung
an einem Mikroarray gemäß einem
der Ansprüche
1 bis 6 vorgesehen. Das Verfahren zum Durchführen umfasst folgende Schritte:
Abtasten
des Mikroarraysubstrats mit einem Licht, um jede markierte Kontrollsonde
anzuregen; und Erfassen des Kontrollsignals von der markierten Kontrollsonde
an jedem Merkmal und Auswerten von Daten, die über die erfassten Kontrollsequenzen
gesammelt wurden. Vorzugsweise umfasst das Verfahren zum Durchführen ferner
den Schritt des Lieferns einer Oligomertestsonde an jedes Merkmal.
Jedes Mikroarraysubstrat kann zweckmäßigerweise bezüglich der
genauen Position jedes Merkmals abgebildet sein. Alternativ dazu
kann die genaue Position jedes Merkmals an dem Mikroarraysubstrat
vor nachfolgenden Aufbringungen, z.B. dem nachfolgenden Schritt
des Bereitstellens der Oligomertestsonden, bestätigt oder modifiziert werden.
Diese Informationen könnten
in einem Instrumentarium, das nachstehend näher beschrieben wird, einem
Benutzer zur Verfügung
gestellt werden.
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Jedes
Merkmal an dem Mikroarray umfasst eine Kontrollsonde und eine Oligomertestsonde.
Ferner emittiert jedes Merkmal, je nach dem Ausführungsbeispiel, vor und/oder
nach einer Hybridisierungsuntersuchung das charakteristische Kontrollsignal,
wenn es belichtet wird. Das charakteristische Kontrollsignal wird
dazu verwendet, jedes Merkmal zu lokalisieren, ungeachtet der Qualität oder des
Umfangs der Hybridisierung zwischen Oligomertestsonden und einer
im Test befindlichen Target-Probe.
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Bei
einem Ausführungsbeispiel
des Verfahrens zum Herstellen umfasst der Schritt des Bereitstellens
der Oligomertestsonde ein Hinzufügen
der Oligomertestsonde zu einem gegenüberliegenden Ende der Kontrollsonde,
so dass die Kontrollsonde sich zwischen der Oberfläche des
Substrats und der Oligomertestsonde erstreckt. Bei diesem Ausführungsbeispiel
ist die Kontrollsonde ein Kontrollpfeiler. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel
des Verfahrens umfasst der Schritt des Bereitstellens der Oligomertestsonde
den Schritt des Hinzufügens
der Oligomertestsonde zu der Substratoberfläche an jeder Merkmalsposition.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
des Verfahrens zum Herstellen wird die Kontrollsonde an jedem Merkmal
als vorsynthetisiertes ganzes Oligonukleotid bereitgestellt, und
die Oligomertestsonde wird an jeder Merkmalsposition in situ synthestisiert.
Stärker
bevorzugt wird die Oligomertestsonde an dem gegenüberliegenden
Ende der vorsynthetisierten Kontrollsonde an jeder Merkmalsposition
in situ synthetisiert.
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Bei
einem wieder anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Instrumentarium
vorgesehen. Das Instrumentarium umfasst die Mikroarrayvorrichtung
der vorliegenden Erfindung, die mit Kontrollsonden und Oligomertestsonden
bestückt
ist, wie oben beschrieben, und Anweisungen über die Verwendung des Instrumentariums.
Bei einem Ausführungsbeispiel
des Instrumentariums sind die Kontrollsonden direkt mit einer Kontrollsondenmarkierung markiert.
Bei einem anderen Aus führungsbeispiel sind
die Kontrollsonden nicht direkt markiert. Das Instrumentarium umfasst
ferner ein komplementäres, kontrollspezifisches
Target-Material, das eine Kontroll-Target-Markierung aufweist, die
während
Hybridisierungsexperimenten verwendet werden soll, um an jedem Merkmal
emittierte experimentelle Hybridisierungssignale besser und präziser zu
lokalisieren. Das komplementäre,
kontrollspezifische Target kann mit der im Test befindlichen experimentellen
Target-Probe gemischt werden, um einen Hybridisierungsschritt durchzuführen, oder
das Kontroll-Target kann nach Ermessen eines Benutzers getrennt
von dem Test-Target,
das zu den Oligomertestsonden hybridisiert wird, zu den Kontrollsonden
hybridisiert werden. Dort, wo die Kontrollsonden direkt markiert sind,
kann das Instrumentarium ferner entweder Qualitätskontrollreferenzdaten umfassen,
um den Benutzer während
einer Merkmalsextraktion zu unterstützen, oder in dem Instrumentarium
können
Anweisungen darüber
enthalten sein, wie eine zerstörungsfreie
Qualitätskontrollauswertung
an dem Mikroarray ausgeführt
werden kann.
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Bei
einem Ausführungsbeispiel
umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Inberührungbringens
des Mikroarrays mit einer Hybridisierungslösung, die eine im Test befindliche
Target-Probe umfasst. Dort, wo die Kontrollmarkierung eine Kontrollsondenmarkierung
umfasst, die direkt an den Kontrollsonden assoziiert ist, und eine
separate Kontroll-Target-Markierung
umfasst, die durch Hybridisierung indirekt mit der Kontrollsonde
assoziiert ist, umfasst die Hybridisierungslösung ferner das markierte Kontroll-Target-Material. Während des
Abfrageschrittes kann jede Merkmalsposition vor einer Hybridisierung
identifiziert werden, indem das Kontrollsondensignal zu Qualitätskontrollzwecken
oder in Bezug auf Referenzdaten erfasst wird, und nach der Hybridisierung
können
die hybridisierten Oligomertestsonden lokalisiert werden, indem
die Testsignale von den hybridisierten Testsonden und die Kontroll-Target-Signale
von den hybridisierten Kontrollsonden erfasst werden. Die von den
erfassten Kontroll-Target-Signalen gesammelten Daten unter stützen ein
Normieren der Hybridisierungsdaten für die Test-Target-Proben. Das
Testsignal und vorzugsweise jedes des Kontrollsignals bzw. der Kontrollsignale
werden in separaten Kanälen
des Erfassungssystems der Mikroarray-Abtastvorrichtung separat erfasst.
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Die
vorliegende Erfindung liefert viele Vorteile, z.B. den Vorteil,
in der Lage zu sein, jedes Merkmal ungeachtet der Qualität oder Quantität der Test-Target-Signale
präzise
zu lokalisieren. Somit kann eine Merkmalsextraktion Merkmale potentiell viel
genauer und präziser
finden als mittels einer einfachen Gitteranpassung und eines Interpolierens
von Positionen von geringfügigen
Signalmerkmalen.
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Die
verschiedenen Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden
unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung, die in
Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen zu sehen ist, besser
verständlich,
wobei gleiche Bezugszeichen gleiche strukturelle Elemente bezeichnen
und wobei:
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1 eine
Teilseitenansicht der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
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2 eine
Teilseitenansicht eines Ausführungsbeispiels
der Vorrichtung der 1 veranschaulicht;
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3 eine
Teilseitenansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels der Vorrichtung
der 1 veranschaulicht;
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4 eine
perspektivische Teilansicht eines hybridisierten Mikroarrays unter
Verwendung der Vorrichtung der 2 veranschaulicht;
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5 eine
perspektivische Teilansicht eines hybridisierten Mikroarrays, das
die Vorrichtung der 3 verwendet, veranschaulicht;
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6 ein
Blockdiagramm eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
-
7 ein
Blockdiagramm eines weiteren Verfahrens der vorliegenden Erfindung
veranschaulicht; und
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8 ein
Blockdiagramm mehrerer Ausführungsbeispiele
des Verfahrens der 7 veranschaulicht.
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Definitionen
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Die
folgenden Begriffe sollen gemäß der Verwendung
in dem vorliegenden Dokument die folgenden allgemeinen Bedeutungen
aufweisen:
Polynukleotid – eine
Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nukleotid oder
ein Nukleinsäurepolymer
ist. Das Polynukleotid kann eine natürliche Verbindung oder eine
synthetische Verbindung sein. Im Kontext einer Untersuchung kann
das Polynukleotid kann von etwa 50 bis 5.000.000 oder mehr Nukleotide
aufweisen. Die größeren Polynukleotide liegen
allgemein im natürlichen
Zustand vor. In einem isolierten Zustand kann das Polynukleotid
etwa 30 bis 50.000 oder mehr Nukleotide, üblicherweise etwa 100 bis 20.000
Nukleotide, häufiger
500 bis 10.000 Nukleotide, aufweisen. Somit ist es offensichtlich, dass
eine Isolierung eines Polynukleotids aus dem natürlichen Zustand oft zu einer
Fragmentierung führt.
Die Polynukleotide umfassen Nukleinsäuren, und Fragmente derselben,
von jeglicher Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, einschließlich DNA,
doppelsträngig
oder einsträngig
(dsDNA und ssDNA) und RNA, einschließlich t-RNA, m-RNA, r-RNA,
Mitochondrien-DNA und -RNA, Chloroplast-DNA und -RNA, DNA/RNA-Hybride
oder Gemische derselben, Gene, Chromosomen, Plasmiden, der Genome
von biologischen Materialen wie z. B. Mikroorganismen, z. B. Bakterien,
Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Pil zen, Pflanzen, Tieren,
Menschen und dergleichen. Das Polynukleotid kann auch lediglich
eine untergeordnete Fraktion eines komplexen Gemisches wie z. B.
einer biologischen Probe sein. Ebenfalls enthalten sind Gene, z.
B. Hämoglobin-Gen für Sichelzellenanämie, Zystische-Fibrose-Gen,
Onkogene, cDNA und dergleichen.
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Polynukleotide
umfassen Analoga von in der Natur vorkommenden Polynukleotiden,
bei denen ein oder mehrere Nukleotide im Vergleich zu in der Natur vorkommenden
Nukleotiden modifiziert sind. Somit umfassen Polynukleotide Verbindungen,
die synthetisch hergestellt sind (z.B. PNA, wie sie in der US-Patentschrift
Nr. 5,948,902 und den darin erwähnten Referenzdokumenten
beschrieben ist, die in einer sequenzspezifischen Weise, die analog
zu der von zwei in der Natur vorkommenden Polynukleotiden ist, hybridisieren
kann.
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Das
Polynukleotid kann mittels Prozeduren, die in der Technik hinreichend
bekannt sind, aus verschiedenen biologischen Materialien gewonnen
werden. Wo es angebracht ist, kann das Polynukleotid gespalten werden,
um ein Fragment zu erhalten, das eine Targetnukleotidsequenz enthält, z. B.
durch Scheren oder durch eine Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease
oder anhand eines anderen Verfahrens einer stellenspezifischen chemischen Spaltung,
z. B. eines begrenzten RNase-Aufschlusses, um kleinere RNA-Fragmente
zu erzeugen.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung ist das Polynukleotid, oder ein aus dem
Polynukleotid gewonnenes gespaltenes Fragment, üblicherweise zumindest teilweise
denaturiert oder einsträngig, oder
es wird behandelt, damit es denaturiert oder einsträngig wird.
Derartige Behandlungen sind in der Technik hinreichend bekannt und
umfassen z. B. eine Wärme-
oder Alkalibehandlung oder einen enzymatischen Aufschluss eines
Stranges. Beispielsweise kann doppelsträngige DNA (dsDNA) über einen
Zeitraum von etwa 1 bis 10 Minuten bei 90–100°C erhitzt werden, um ein denatu riertes
Material zu erzeugen, wohingegen eine mittels einer Transkription
von einer dsDNA-Matrize erzeugte RNA bereits einsträngig ist.
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Oligonukleotid – ein Polynukleotid, üblicherweise
einsträngig, üblicherweise
ein synthetisches Polynukleotid, das jedoch auch ein natürlich vorkommendes
Polynukleotid sein kann. Das bzw. die Oligonukleotid(e) bestehen üblicherweise
aus einer Sequenz einer Länge
von zumindest 5 Nukleotiden, üblicherweise
10 bis 100 Nukleotiden, noch üblicher
20 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 10 bis 30 Nukleotiden, stärker bevorzugt
20 bis 30 Nukleotiden, und wünschenswerterweise
etwa 25 Nukleotiden.
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Zum
Herstellen eines Oligonukleotids können verschiedene Techniken
eingesetzt werden. Derartige Oligonukleotide können mittels biologischer Synthese
oder mittels chemischer Synthese erhalten werden. Für kurze
Oligonukleotide (bis zu etwa 100 Nukleotiden) ist die chemische
Synthese im Vergleich zur biologischen Synthese häufig wirtschaftlicher.
Zusätzlich
zur Wirtschaftlichkeit liefert die chemische Synthese eine zweckmäßige Art
und Weise, Verbindungen von niedriger relativer Molekülmasse und/oder
modifizierte Basen während
spezifischer Syntheseschritte zu integrieren. Ferner ist die chemische
Analyse sehr flexibel bei der Wahl der Länge und der Region einer Targetpolynukleotidbindungssequenz.
Das Oligonukleotid kann mittels standardmäßiger Verfahren synthetisiert
werden, z. B. mittels derjenigen, die bei kommerziellen automatisierten Nukleinsäuresynthetisierern
verwendet werden. Die chemische Synthese einer DNA auf einem geeignet modifizierten
Glas oder Harz kann zu einer kovalent an die Oberfläche gebundenen
DNA führen.
Dies kann Vorteile bezüglich
des Waschens und des Handhabens der Probe bieten. Bei längeren Sequenzen
können
standardmäßige Replikationsverfahren, die
in der Molekularbiologie eingesetzt werden, verwendet werden, z.B.
die Verwendung von M13 für eine
einsträngige
DNA, wie sie bei J. Messing (1983) Methods Enzymol. 101:20-78 beschrieben
ist.
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Eine
In-situ-Synthese von Oligonukleotid- oder Polynukleotidsonden auf
dem Substrat wird gemäß hinreichend
bekannter chemischer Prozesse durchgeführt, einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
einer sequentiellen Hinzufügung
von Nukleotid-Phosphoramiditen zu oberflächenverbundenen Hydroxylgruppen,
wie z.B. von T. Brown und Dorcas J. S. Brown in Oligonukleotides
and Analogues A Practical Approach, F. Eckstein, Herausgeber, Oxford
University Press, Oxford, S. 1–24
(1991), beschrieben. Eine indirekte Synthese kann gemäß biosynthetischen
Techniken (z.B. Polymerasekettenreaktion „PCR" – polymerase
chain reaction) durchgeführt
werden, wie bei Sambrook, J. et al., „Molecular Cloning, A Laboratory
Manual", 2. Ausgabe
1989, beschrieben.
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Andere
Verfahren der Oligonukleotid-Synthese umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf, eine Festphasen-Oligonukleotid-Synthese gemäß den Phosphotriester- und
Phosphodiester-Verfahren
(Narang, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90) und gemäß dem H-Phosphonat-Verfahren
(Garegg, P. J., et al., (1985) „Formation of internukleotidic
bonds via phosphonate intermediates", Chem. Scripta 25, 280–282; und
Froehler, B. C., et al., (1986a) „Synthesis of DNA via deoxynukleoside
H-phosphonate intermediates", Nukleic
Acid Res., 14, 5399–5407,
unter anderem) und eine Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al. (1981)
Tetrahedron Letters 22:1859–1862)
sowie Phosphoramidit-Techniken (Caruthers, M. H., et al., „Methods
in Enzymology," Vol.
154, S. 287–314 (1988)
und andere, die bei „Synthesis
and Applications of DNA and RNA," S.
A. Narang, Herausgeber, Academic Press, New York, 1987, und in den
dort enthaltenen Referenzdokumenten beschrieben sind, und Nicht-Phosphoramidit-Techniken.
Die chemische Synthese mittels eines photolithographischen Verfahrens
von räumlich
adressierbaren Arrays von an Glasoberflächen gebundenen Oligonukleotiden
wird von A. C. Pease, et al., Proc. Nat. Aca. Sci. USA (1994) 91:5022–5026, beschrieben.
Eine Oligoribonukleotid-Synthese, die eine Phagen-RNA-Polymerase
und Ribonukleosid-Triphosphate verwen det, wird von Milligan, J.
F., et al., (1987) „Oligoribonukleotide
synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates", Nucl. Acids Res.
15, 8783–8798,
beschrieben; und eine Verwendung von geschützten Ribonukleosid-Phosphoramiditen
und einer chemischen Synthese wird von Wu T., et al., (1989) „Prevention
of chain cleavage in the chemical synthesis of 2'-O-silylated oligoribonukleotides", Nucl. Acids Res.
17, 3501–3517,
unter anderen, beschrieben.
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Für die Zwecke
der Erfindung umfasst der Begriff „Oligonukleotid" den Begriff „Polynukleotid", wenn nichts anderes
angegeben ist.
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Oligomertestsonde – ein Oligonukleotid,
das dazu verwendet wird, sich an eine im Test befindliche Target-Probe
zu binden. Der Entwurf und die Herstellung der Oligonukleotidtestsonden
hängen
allgemein von der erforderlichen Sensitivität und Spezifität, der Abfolge
des Test-Targets und, in manchen Fällen, von der biologischen
Bedeutung bestimmter Abschnitte der Target-Polynukleotidsequenz
ab. Üblicherweise
unterschieden sich die bei einem Experiment verwendeten Oligomertestsonden
voneinander, um verschiedene Test-Target-Sequenzen oder verschiedene Teile
einer Test-Target-Sequenz
anzugehen.
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Test-Target
oder im Test befindliche Target-Probe – eine Probe, die eine Sequenz
von Nukleotiden umfasst, die üblicherweise
in einem Abschnitt oder in einer gesamten Polynukleotid-Testprobe
vorliegen, üblicherweise
ein zu charakterisierender Polynukleotid-Analyt. Die Identität der Target-Nukleotid-Sequenz
ist allgemein in einem Umfang bekannt, der ausreichend ist, um eine
Herstellung verschiedener Oligomertestsondensequenzen, die mit der Test-Target-Nukleotid-Sequenz
hybridisierbar sind, zu ermöglichen.
Das Test-Target weist eine oder mehrere unbekannte Charakteristika
auf, die unter Verwendung von Oligomertestsonden experimentell zu
ermitteln sind.
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Die
Test-Target-Sequenz enthält üblicherweise
von etwa 30 bis 5.000 oder mehr Nukleotide, vorzugsweise 50 bis
1.000 Nukleotide. Die Test-Target-Nukleotid-Sequenz ist allgemein
ein Teil eines größeren Moleküls, oder
sie kann im Wesentlichen das ganze Molekül sein, wie z.B. ein Polynukleotid, wie
oben beschrieben. Die minimale Anzahl von Nukleotiden in der Test-Target-Nukleotid-Sequenz
ist dahin gehend ausgewählt,
zu gewährleisten,
dass das Vorliegen eines Target-Polynukleotids
in einer Probe ein spezifischer Indikator des Vorliegens von Polynukleotid
in einer Probe ist. Die maximale Anzahl von Nukleotiden in der Test-Target-Nukleotid-Sequenz
wird normalerweise von mehreren Faktoren geregelt: der Länge des
Polynukleotids, von dem sie abgeleitet ist, der Tendenz eines derartigen
Polynukleotids, durch Scheren oder andere Prozesse während einer
Isolierung gebrochen zu werden, der Effizienz jeglicher Prozeduren,
die erforderlich ist, um die Probe auf eine Analyse (z.B. Transkription
einer DNA-Matrize in eine RNA) vorzubereiten, und der Effizienz
einer Erfassung und/oder Vervielfachung der Target-Nukleotid-Sequenz,
wo dies angebracht ist.
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Kontrollsonde
oder Kontrollsequenz – ein Oligonukleotid
oder Oligomer, das eine bekannte Sequenz von Nukleotiden in einer
bekannten Menge aufweist, von dem man statistisch weiß, dass
es eine Oligomertestsonde oder eine im Test befindliche Target-Probe
nicht hybridisiert oder dieselbe auf andere Weise beeinträchtigt.
Ein Kontrollpfeiler ist eine Kontrollsonde, die an einem Ende mit
einer Oligomertestsonde verbunden ist, während ein gegenüberliegendes
Ende an einer Oberfläche
eines Arraysubstrats angelagert oder immobilisiert ist. Die Kontrollsonde oder
der Kontrollpfeiler ist ein Standard oder eine Referenz, der bzw.
die zum Vergleich mit experimentellen Ergebnissen verwendet wird.
Die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler ist keine Oligomertestsonde und
fungiert auch nicht als solche, und hybridisiert somit nicht mit
einer Test-Target-Probe (und beeinflusst auch nicht die Hybridisierung
einer solchen).
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Kontrollspezifisches
Target oder Kontroll-Target – ein
Oligonukleotid, das eine bekannte Sequenz von Nukleotiden in einer
bekannten Menge aufweist, das zu einer Kontrollsonde oder einem
Kontrollpfeiler besonders oder auf spezifische Weise komplementär ist. Statistisch
weiß man,
dass das Kontroll-Target nicht mit einer Oligomertestsonde oder
einer im Test befindlichen Target-Probe hybridisiert oder eine solche
auf andere Weise beeinflusst. Das Kontroll-Target ist ein Standard
oder eine Referenz, der bzw. die bei Experimenten verwendet wird, die
die Kontrollsonde oder den Kontrollpfeiler umfassen. Die Charakteristika
des Kontroll-Targets
sind bekannt, und somit ist die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler
keine Test-Target-Probe und fungiert auch nicht als solche, und
hybridisiert nicht mit einer Oligomer-Test-Sonde (und beeinflusst
auch nicht die Hybridisierung einer solchen).
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Monomer – ein Angehöriger des
Satzes von kleinen Molekülen,
die aneinander gefügt
werden können,
um ein Polymer zu bilden. Gemäß der Verwendung
hierin bezieht sich Monomer auf einen beliebigen Angehörigen eines
Basissatzes für
eine Synthese eines Polymers. Das Monomer kann natürlich oder
synthetisch sein. In aufeinander folgenden Schritten bei der Synthese
eines Polymers können verschiedene
Monomere verwendet werden.
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Ferner
kann ein Monomer geschützte
Angehörige
umfassen, die nach einer Synthese modifiziert sind. Ein modifiziertes
Monomer ist ein in der Natur vorkommendes Monomer, das aus einer
natürlichen Quelle
erhalten oder synthetisch hergestellt wird, das chemisch modifiziert
ist, um eine oder mehrere Gruppen oder Bindungen, die in dem Monomer
enthalten sind, hinzuzufügen,
zu ersetzen, zu beseitigen oder auf andere Weise zu verändern.
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Nukleotid – die monomere
Einheit von Nukleotidsäurepolymeren,
d.h. DNA und RNA, ob aus einer natürlichen Quelle gewonnen oder
synthetisch hergestellt, die eine stickstoffhaltige heterozyklische Base
umfasst, die ein Derivat entweder eines Purins oder eines Pyrimidins,
ein Pentosezucker und ein Phosphat (oder eine Phosphorsäure) ist.
Wenn das Phosphat beseitigt ist, ist die verbleibende monomere Einheit
ein „Nukleosid". Somit ist ein Nukleotid
ein 5'-Phosphat des entsprechenden
Nukleosids. Wenn die stickstoffhaltige Base aus dem Nukleotid entfernt wird,
ist die verbleibende monomere Einheit ein „Phosphodiester". Für die Zwecke
der Erfindung umfasst „Nukleotid" sein entsprechendes
Nukleosid und seinen entsprechenden Phosphodiester, und „Oligonukleotid" umfasst sein entsprechendes
Oligonukleosid und seinen entsprechenden Oligophosphodiester, wenn
nichts anderes angegeben ist.
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Modifiziertes
Nukleotid – ein
modifiziertes Monomer in einem Nukleinsäurepolymer, das eine modifizierte
Base, Zucker und/oder Phosphatgruppe enthält. Das modifizierte Nukleotid
kann in der Natur vorkommen oder mittels einer chemischen Modifikation
eines Nukleotids entweder als Teil des Nukleinsäurepolymers oder vor der Integration
des modifizierten Nukleotids in das Nukleinsäurepolymer hergestellt werden.
Beispielsweise können
die oben erwähnten
Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids eingesetzt werden.
Bei einem anderen Lösungsansatz
kann ein modifiziertes Nukleotid erzeugt werden, indem ein modifiziertes
Nukleosidtriphosphat während
einer Vervielfachungsreaktion in die Polymerkette integriert wird.
Beispiele von modifizierten Nukleotiden umfassen, zur Veranschaulichung
und nicht als Einschränkung,
Dideoxynukleotide, Derivate oder Analoga, die biotinyliert, Amin-modifiziert,
alkyliert, Fluorophor-markiert und dergleichen sind, und umfassen
ferner Phosphorthioat, Phosphit, Ringatom-modifizierte Derivate
und so weiter.
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Hybridisierung
(Hybridisieren) oder Binden – im
Zusammenhang mit Nukleotid-Sequenzen werden diese Begriffe hierin
in der Bedeutung von miteinander assoziieren bzw. einander zugeordnet
sein austauschbar verwendet. Die Fähigkeit zweier Nukleotid-Sequenzen,
miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Grad der Komplementarität der beiden Nukleotid-Sequenzen,
die wiederum auf dem Anteil von passenden komplementären Nukleotid-Paaren beruht.
Je mehr Nukleotide in einer gegebenen Sequenz zu einer anderen Sequenz
komplementär sind,
desto strikter können
die Bedingungen für
eine Hybridisierung sein, und desto spezifischer ist die Bindung
der beiden Sequenzen. Eine erhöhte
Striktheit wird erzielt, indem die Temperatur erhöht wird, das
Verhältnis
von Hilfslösungsmitteln
erhöht
wird, die Salzkonzentration verringert wird und dergleichen. Hybridisierungslösungen und
Prozesse zur Hybridisierung sind bei J. Sambrook, E. F. Fritsch,
T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2. Ausgabe, 1989, Vol.
1–3, beschrieben.
Bedingungen für
eine Hybridisierung umfassen üblicherweise
(1) eine Lösung
mit hoher Ionenstärke,
(2) bei einer kontrollierten Temperatur und (3) in der Gegenwart
einer Träger-DNA
und von Reinigungsmitteln und zweiwertigen Kation-Chelatbildnern, die
allesamt in der Technik hinreichend bekannt sind.
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Komplementär – ein Begriff,
der auf die Affinität
bezogen ist, die ein biologisches Material bezüglich eines Bindens an ein
anderes biologisches Material, z.B. Angehörige eines spezifisches Bindungspaares,
wie nachstehend definiert wird, aufweist. In Bezug auf Nukleotidkomplemente
sind zwei Sequenzen komplementär,
wenn sich die Sequenz von einem in einem antiparallelen Sinn an
die Sequenz des anderen binden kann, wobei sich das 3'-Ende einer Sequenz
an das 5'-Ende der
anderen Sequenz bindet und jedes A, T(U), G und C einer Sequenz
dann mit einem T(U), A, C bzw. G der anderen Sequenz ausgerichtet
ist. Bei Nukleotidkomplementen ist auch eine nicht-standardmäßige Paarbildung
von Basen möglich, beispielsweise
können
die Sequenzen zueinander parallel sein und es kann eine Nicht-Watson-Crick-Basenpaarbildung
erfolgen. Beispiele der letzteren sind komplementäre G=U- oder U=G-Basenpaare
in RNA-Sequenzen oder komplementäre G=T-
oder T=G-Basenpaare in DNA-Sequenzen.
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Substrat
oder Oberfläche – ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches
Material. Die Oberfläche
eine beliebige einer Anzahl von Formen aufweisen, z.B. Streifen,
Platte, Scheibe, Stab, Partikel, einschließlich Kügelchen, und dergleichen. Das
Substrat kann hydrophob oder hydrophil oder in der Lage sein, hydrophob
oder hydrophil gemacht zu werden, und es umfasst anorganische Pulver
wie z.B. Siliziumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere
Materialien, insbesondere zellulosische Materialien, die von Zellulose
herrühren,
z.B. faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, chromatographisches
Papier usw.; synthetische oder modifizierte, in der Natur vorkommende
Polymere wie z.B. Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Poly(vinylchlorid),
Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen,
Polypropylen, Poly(4-methylbuten),
Polystyren, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat)
usw.; die entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Materialien
verwendet werden; Glas, das als Bioglass erhältlich ist, Keramik, Metalle
und dergleichen. Natürliche
oder synthetische Anordnungen wie z.B. Liposome, Phospholipidbläschen und
Zellen können
ebenfalls verwendet werden. Häufige
Substrate, die für
Arrays verwendet werden, sind Oberflächen-derivatisiertes Glas oder Siliziumdioxid
oder Polymermembranoberflächen, wie
sie bei Z. Guo et al. (oben erwähnt)
und U. Maskos, E. M. Southern, Nukleic Acids Res 20, 1679–84 (1992)
und E. M. Southern et al., Nukleic Acids Res 22, 1368–73 (1994),
beschrieben sind.
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Eine
Immobilisierung von Oligonukleotiden auf einem Substrat oder einer
Oberfläche
kann mittels hinreichend bekannter Techniken, die gewöhnlich in
der Literatur zu fin den sind, bewerkstelligt werden. Siehe z.B.
A. C. Pease, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:5022-5026 (1994);
Z. Guo, R. A. Guilfoyle, A. J. Thiel, R. Wang, L. M. Smith, Nukleic
Acids Res 22, 5456–65
(1994); und M. Schena, D. Shalon, R. W. Davis, P. 0. Brown, Science,
270, 467–70 (1995).
Aus den oben erwähnten
Referenzdokumenten sind Linker bekannt. Für die Zwecke der Erfindung
umfasst eine Substratoberfläche
eine Oberfläche,
die Linker oder andere Mittel zur Immobilisierung oder Anlagerung
von Oligonukleotiden umfasst, und ein Oligonukleotid, das an einer
Oberfläche
angelagert, zu einer solchen hinzugefügt oder an einer solchen vorgesehen
ist, umfasst eine Anlagerung an, eine Hinzufügung an oder ein Vorsehen an
einem Linker auf der Oberfläche.
Ebenfalls für
die Zwecke der Erfindung ist ein Linker keine Kontrollsonde und kein
Kontroll-Target.
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Markierung – ein Angehöriger eines
Signalerzeugungssystems. Üblicherweise
ist die Markierung ein Teil einer Target-Nukleotid-Sequenz oder einer Oligonukleotidsonde,
der entweder zu derselben konjugiert ist oder auf andere Weise an
dieselbe gebunden oder mit derselben assoziiert ist. Die Markierung
ist in der Lage, direkt oder indirekt erfasst zu werden. Markierungen
umfassen (i) Reportermoleküle,
die auf Grund eines Erzeugens eines Signals direkt erfasst werden
können,
(ii) spezifische Bindungspaarangehörige, die durch ein anschließendes Binden
an einen Verwandten (engl.: cognate), der ein Reportermolekül enthält, indirekt
erfasst werden können,
(iii) Oligonukleotid-Primer, die eine Matrize für eine Vervielfachung oder
eine Ligation liefern können,
oder (iv) eine spezifische Polynukleotidsequenz oder Erkennungssequenz,
die als Ligand agieren kann, z.B. für ein Repressor-Protein, wobei
der Oligonukleotid-Primer oder das Repressor-Protein in den letzten
zwei Fällen
ein Reportermolekül
aufweist oder in der Lage ist, ein solches aufzuweisen. Allgemein
kann jegliches Reportermolekül
verwendet werden, das erfassbar ist. Beispielsweise ist die Nukleinsäurebase
dahin gehend modifiziert, Biotin zu enthalten, das sich an Streptavidin
bindet, das zuvor kovalent an einen Fluorophoren gebunden wurde.
Direkte Markierungen sind von mehreren Herstellern im Handel erhältlich,
einschließlich
Boehringer-Mannheim und Amersham-Pharmacia Biotech. Boehringer-Mannheim
verkauft auch biotinylierte Nukleotide, und Amersham-Pharmacia Biotech
verkauft auch Streptavidin, das mit einer Vielzahl von Fluorophoren markiert
ist.
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Das
Reportermolekül
kann isotop oder nicht-isotop sein, ist üblicherweise nicht-isotop,
und kann ein Katalysator sein, z.B. ein Enzym, eine Polynukleotid-Codierung
für einen
Katalysator; ein Beschleuniger, ein Farbstoff, ein fluoreszierendes
Molekül,
ein Mittel zur Bewirkung einer Chemilumineszenz, ein Coenzym, ein
Enzymsubstrat, eine radioaktive Gruppe, ein kleines organisches
Molekül,
eine vervielfachbare Polynukleotidsequenz, ein Partikel wie z.B.
ein Latex- oder
Kohlenstoffpartikel, Metallsol, Kristallit, Liposom, Zelle usw.,
die bzw. der bzw. das ferner mit einem Farbstoff, Katalysator oder
einer anderen erfassbaren Gruppe markiert oder nicht markiert sein
kann, und dergleichen. Das Reportermolekül kann eine fluoreszierende
Gruppe wie z.B. ein Fluorescein, eine chemilumineszierende Gruppe wie
z.B. Luminol, ein Terbium-Chelatbildner wie z.B. N(hydroxyethyl)ethylendiamintriessigsäure, der
zu einer Erfassung durch eine verzögerte Fluoreszenz in der Lage
ist, und dergleichen sein.
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Die
Markierung kann ein erfassbares Signal entweder alleine oder zusammen
mit anderen Angehörigen
des Signalerzeugungssystems erzeugen. Wie oben erwähnt wurde,
kann ein Reportermolekül direkt
an eine Nukleotidsequenz gebunden sein oder kann daran gebunden
werden, indem es an einen Spezifisches-Bindungspaar-Angehörigen (sbp-Angehörigen, sbp
= specific binding pair) gebunden wird, der komplementär zu einem
sbp-Angehörigen ist,
der an eine Nukleotidsequenz gebunden ist. Beispiele bestimmter
Markierungen oder Reportermoleküle
und ihrer Erfassung finden sich in der US-Patentschrift Nr. 5,508,178. Wenn ein
Reportermolekül nicht an
eine Nukleotidsequenz konjugiert ist, kann das Reportermolekül auch an
einen sbp-Angehörigen
gebunden sein, der zu einem sbp-Angehörigen komplementär ist, der
an eine Nukleotidsequenz gebunden oder ein Teil einer Nukleotidsequenz
ist.
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Kontrollmarkierung – eine Markierung
gemäß der Definition
in dem vorliegenden Dokument, die mit einer Kontrollsonde und/oder
einem Kontroll-Target assoziiert ist. Wenn sie sowohl mit einer Kontrollsonde
als auch mit einem Kontroll-Target
assoziiert ist, umfasst die Kontrollmarkierung zwei Markierungen,
eine „Kontrollsondenmarkierung", die mit der Kontrollsonde
assoziiert ist, und eine getrennte „Kontroll-Target-Markierung", die mit dem Kontroll-Target assoziiert
ist. Wenn die Kontrollmarkierung mit Licht angeregt wird, emittiert
sie ein Signal, das als „Kontrollsignal" bezeichnet wird.
Die Kontrollprobenmarkierung und die Kontroll-Target-Markierung emittieren jeweils
ein unterschiedliches Kontrollsignal, das als „Kontrollsondensignal" und als „Kontroll-Target-Signal" bezeichnet wird.
Die Kontrollmarkierung ist eine standardmäßige oder Referenzmarkierung,
die bei Experimenten verwendet wird, die die Kontrollsonde umfassen.
Die von derselben emittierte(n) Kontrollmarkierung(en) und das von
derselben emittierte Kontrollsignal(e) sind von einer Testmarkierung
und ihrem Signal unterscheidbar.
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Testmarkierung – eine Markierung
gemäß der Definition
in dem vorliegenden Dokument, die mit einer Testsonde und/oder einem
Test-Target assoziiert ist. Wenn sie sowohl mit einer Testsonde
als auch mit einem Test-Target assoziiert ist, umfasst die Testmarkierung
zwei Markierungen, eine „Testsondenmarkierung", die mit der Testsonde
assoziiert ist, und eine getrennte „Test-Target-Markierung", die mit dem Test-Target
assoziiert ist. Wenn die Testmarkierung mit Licht angeregt wird,
emittiert sie ein Signal, das als „Testsignal" bezeichnet wird.
Die Testprobenmarkierung und die Test-Target-Markierung emittieren
jeweils ein unter schiedliches Testsignal, das als „Testsondensignal" und als „Test-Target-Signal" bezeichnet wird.
Die von derselben emittierte(n) Testmarkierung(en) und das von derselben
emittierte Testsignal(e) sind von der Kontrollmarkierung und ihrem
Signal unterscheidbar. Die Testmarkierung wird in Hybridisierungsuntersuchungen
verwendet, um die Testsonde und/oder die Test-Target-Probe zu lokalisieren und
zu charakterisieren.
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Signalerzeugungssystem – Das Signalerzeugungssystem
kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei zumindest eine
Komponente die Markierung ist. Das Signalerzeugungssystem erzeugt
ein Signal, das sich üblicherweise
auf das Vorliegen von oder die Menge eines Target-Polynukleotids
in einem Medium bezieht. Ein Signalerzeugungssystem kann in den
Oligonukleotidsonden integriert sein und bezieht sich auf das Vorliegen
von Sonden in einem Medium. Das Signalerzeugungssystem umfasst alle
Reagenzien, die erforderlich sind, um ein messbares Signal zu erzeugen.
Andere Komponenten des Signalerzeugungssystems können in der Entwicklerlösung enthalten
sein und können
Substrate, Verstärkungsmittel,
Aktivatoren, chemilumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren,
Fängersubstanzen,
Metallionen, spezifische Bindungssubstanzen, die zum Binden von
Signalerzeugungssubstanzen benötigt
werden, und dergleichen umfassen. Andere Komponenten des Signalerzeugungssystems
können
Coenzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren,
andere Enzyme und Katalysatoren und dergleichen sein. Das Signalerzeugungssystem
liefert ein Signal, das anhand externer Mittel, durch Verwendung
einer elektromagnetischen Strahlung, wünschenswerterweise mittels
einer optischen Untersuchung, erfassbar ist. Signalerzeugungssysteme,
die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind diejenigen,
die in der US-Patentschrift Nr. 5,508,178 umfassender beschrieben
sind.
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Angehöriger eines
spezifischen Bindungspaares („sbp-Angehöriger") – Eines
von zwei unterschiedlichen Molekülen, das
auf der Oberfläche
oder in einem Hohlraum eine Fläche
aufweist, die sich spezifisch an eine räumliche und polare Organisation des
anderen Moleküls
bindet und somit als komplementär
dazu definiert ist. Die Angehörigen
des spezifischen Bindungspaares werden als Verwandte oder als Ligand
und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese können Angehörige eines immunologischen Paares
wie z.B. Antigen/Antikörper
sein, oder sie können
Operator/Repressor, Nuklease/Nukleotid, Biotin/Avidin, Hormone/Hormonrezeptoren,
Nukleinsäureduplexe,
IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen sein.
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Kleines
organisches Molekül – eine Verbindung
einer relativen Molekülmasse
von weniger als 1.500, vorzugsweise 100 bis 1.000, stärker bevorzugt
300 bis 600, z.B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe,
Tetracyclin und andere Proteinbindungsmoleküle sowie Haptene usw. Das kleine organische
Molekül
kann ein Mittel zur Anlagerung einer Nukleotidsequenz an einer Markierung
oder einem Träger
liefern.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Vorrichtung und die vorliegenden Verfahren liefern neuartige
Techniken zum Erfassen im Wesentlichen aller Merkmalspositionen an
einem Mikroarray, ohne sich auf die Qualität oder Quantität einer
Hybridisierung zwischen Oligomertestsonden und einer im Test befindlichen
Target-Probe verlassen
zu müssen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine gleichzeitig anhängige Anmeldung,
Seriennr. 09/292,289 von Paul Wolber, die am 15. April 1999 eingereicht
wurde, mit dem Titel „APPARATUS,
SYSTEMS AND METHOD FOR LOCATING NUCLEIC ACIDS BOUND TO SURFACES".
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1–3 veranschaulichen
eine Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 100 umfasst
eine Kontrollsonde 101, die an einem Ende 102 an
einer Oberfläche 104 eines
Mikroarraysubstrats 105 in einem Arraymuster von Merkmalen 106 angelagert
ist. Die Kontrollsonde 101 umfasst eine bekannte Sequenz
von Nukleinsäuren,
die komplexer (oder diverser) als eine Poly-T- oder Poly-A-Sequenz
sein können.
Die Kontrollsonde 101 ist ein der Lage, mit lediglich einem
kontrollspezifischen Target-Material einer bekannten Nukleinsäuresequenz
zu hybridisieren, wie oben definiert. Vorzugsweise ist die Kontrollsonde
insofern eine positive Kontrollsonde, als sie helle Merkmale (d.h.
starke Signale) liefert, wenn sie abgetastet wird, z.B. die in Tabelle
1 aufgelisteten.
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Tabelle
1 listet lediglich zwei mögliche
Kontrollsondensequenzen auf, die bei der Erfindung funktionieren.
Die Liste ist lediglich veranschaulichend und soll den Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung nicht einschränken. In der Tat funktioniert bei
der Erfindung jegliche Kontrollsondensequenz, vorausgesetzt, dass
die Kontrollsonde
101 keine Sequenz aufweist, die der Sequenz
der Oligomertestsonde ähnlich
ist, so dass eine im Test befindliche Target-Probe statt mit ihrer
beabsichtigten komplementären
Oligomertestsonde mit er Kontrollsonde
101 hybridisieren
könnte.
Für die
vorliegende Erfindung kann die Kontrollsonde
101 beispielsweise
aus einer völlig
anderen Spezies (Pflanze gegenüber
Tier usw.) ausgewählt
werden, um jegliche Interaktion zwischen den Kontrollsonden und
der im Test befindlichen Target-Probe im Wesentlichen zu eliminieren oder
zu minimieren. Alternativ dazu ist die Kontrollsonde
101 dahin
gehend ausgewählt,
für ein
Kontroll-Target spezifisch zu sein, das dahin gehend ausgewählt wurde,
nicht mit der Oligomertestsonde und/oder der Test-Target-Probe zu
interagieren. Techniken zum Identifizieren von Kontrollsondensequenzen
für die
vorliegende Erfindung sind in der Technik hinreichend bekannt. Tabelle
1: Beispiele von Kontrollsondensequenzen
Name | Sequenz |
Pro25G | atcatcgtagctggtcagtgtatcc |
HCV48-24 | acaggggagtgatctatggtggagt |
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Die
Kontrollsonde 101 ist mit einer Kontrollmarkierung 107 assoziiert,
die auf eine Anregung mit Licht hin ein Kontrollsignal (nicht gezeigt)
emittiert. Das aus der Kontrollmarkierung 107 emittierte
Signal ist für
die Kontrollsonde spezifisch. Mit spezifisch ist gemeint, dass das
Signal von jeglichen anderen Signalen, die während eines optischen Abtastens
aus dem Mikroarray emittiert werden, unterscheidbar ist. Folglich
ist die genaue Position jedes einzelnen Merkmals 106 in
dem Mikroarray auf der Basis des durch die assoziierte Kontrollmarkierung 107 emittierten
Signals separat erfassbar. Das Kontrollsignal von der assoziierten
Kontrollmarkierung 107 ist vorteilhafterweise durch eine
(nicht gezeigte) Mikroarray-Abtastvorrichtung separat erfassbar,
vorzugsweise in einem separaten Erfassungskanal der Mikroarray-Abtastvorrichtung,
um andere Signale und ihre Erfassung durch die Abtastapparatur nicht
zu beeinflussen.
-
Die
gemäß der Erfindung
verwendeten Markierungen können
eine beliebige Markierung oder ein beliebiges Markierungssystem
sein, die bzw. das in der Technik bekannt ist, wie oben definiert. Überdies kann
für die
Erfindung jegliche in der Technik bekannte Markierungstechnik verwendet
werden. Für
die Erfindung ist wichtig, dass die für die verschiedenen Kontrollen
verwendeten Markierungen Signale emittieren, die sich voneinander
unterscheiden und die sich von den Markierungen und den jeweiligen
Signalen unterscheiden, die mit den Testsonden und Test-Target-Proben
assoziiert sind, wie oben definiert und nachstehend näher beschrieben
ist. Ferner ist es wichtig, dass jede Markierung ein Signal emittiert, das
in einem Spektralbereich liegt, der durch einen Erfassungskanal
der Abtastapparatur (d.h. Erfassungskanal und Signalfarbanpassung)
erfassbar ist. Beispiele von häu fig
verwendeten Markierungen, die für
die vorliegende Erfindung funktionieren, umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf, ,CY3- und CY5-Cyaninfarbstoffe, die von Amersham-Pharmacia Biotech
erhältlich
sind.
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Bei
einem Ausführungsbeispiel 100a der
in 1 veranschaulichten Vorrichtung 100 umfasst die
Kontrollsonde 101 die Kontrollmarkierung 107 (allgemein
durch den Pfeilkopf 107 in 1 veranschaulicht),
die an derselben angelagert oder direkt mit derselben assoziiert
ist. Das Ausführungsbeispiel 100a ist
nützlich
beim Durchführen
von zerstörungsfreien
Qualitätskontrollauswertungen
des Mikroarrays vor einem Durchführen
eines Hybridisierungsexperiments, bevor und/oder nachdem das Mikroarray mit
Oligomertestsonden 112 bestückt wird, nachstehend näher beschrieben. 1 veranschaulicht
ein Beispiel der Vorrichtung 100, bevor die Oligomertestsonden
auf das Substrat 105 gesetzt werden. Wie oben erwähnt wurde,
kann die zerstörungsfreie
Qualitätskontrollauswertung
auch durchgeführt
werden, nachdem die Oligomertestsonden hinzugefügt wurden, solange die Kontrollsonde 101 direkt
markiert ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel 100a können alle
Merkmale 106 an dem Mikroarray beim Abtasten erfasst werden,
indem das Kontrollsignal von der Kontrollmarkierung 107 erfasst
wird, um die Qualität des
Mikroarrays zu gewährleisten.
Eine zerstörungsfreie
Qualitätskontrollauswertung
ist besonders nützlich,
wenn die Mikroarrayvorrichtung 100 dazu verwendet wird,
extrem wertvolle im Test befindliche Target-Proben oder Test-Target-Proben in sehr kleinen Mengen
zu hybridisieren. Ein Mikroarray, das vor einer Hybridisierung verifiziert
wird, tendiert weniger dazu, die kostbare Test-Target-Probe zu vergeuden. Ferner
sieht dieses Ausführungsbeispiel 100a eine präzise Merkmalslokalisierung
während
einer Merkmalsextraktion nach einer Hybridisierung der Oligomertestsonden
vor, wie nachstehend näher
beschrieben wird. Überdies
erfordert dieses Ausführungsbeispiel 100a kein
Hybridisieren eines komplementären Kontroll-Targets
zu der Kontrollsonde, wie nachstehend näher beschrieben wird, und folglich
würde die ses
Ausführungsbeispiel
keine Informationen liefern, die notwendig sind, um auf die Hybridisierung
bezogene Daten zu normieren.
-
Die
Vorrichtung 100 umfasst ferner eine Oligomertestsonde 112,
die an jeder Merkmalsposition 106 des Mikroarraysubstrats 105 zusammen
mit der Kontrollsonde 101 angeordnet ist. 2 veranschaulicht
ein Ausführungsbeispiel 100b der
Vorrichtung 100, nachdem die Oligomertestsonden 112 angelagert
sind. Bei dem Ausführungsbeispiel 100b der 2 fungiert
die Kontrollsonde 101 als Kontrollpfeiler 101.
Die Oligomertestsonde 112 ist an einem gegenüberliegenden
Ende 103 des Kontrollpfeilers 101 angelagert,
so dass der Kontrollpfeiler 101 eine Verlängerung
zwischen der Oberfläche 104 des
Arraysubstrats 105 und der Oligomertestsonde 112 ist. Vorteilhafterweise
liefert die Vorrichtung 100b eine Entsprechung von 1:1
zwischen der Quantität
des Kontrollpfeilers 101 und der Quantität der Oligomertestsonde 112.
Der Kontrollpfeiler 101 verlängert die Oligomertestsonde 112 im
Wesentlichen weg von der Oberfläche 104,
was vorteilhafterweise auch die Signalintensität von Kurzes-Oligomer-Testsonden,
z.B. Oligomeren, die eine Länge
von etwa 25 Monomeren aufweisen, verstärken kann.
-
3 veranschaulicht
ein weiteres Ausführungsbeispiel 100c der
Vorrichtung 100, nachdem das Mikroarray mit den Oligomertestsonden 112 besetzt
wurde, wobei die Oligomertestsonde 112 zusammen mit der
Kontrollsonde 101 direkt zu der Oberfläche 104 des Substrats 105 in
jeder Merkmalsposition 106 hinzugefügt wird. Bei diesem Ausführungsbeispiel 100c ist
das gegenüberliegende
Ende 103 der Kontrollsonde 101 mit einer Abdeckung
versehen, um zu verhindern, dass sich die Oligomertestsonde 112 an
demselben anlagert. Somit umfasst jedes Merkmal 106 die
Kontrollsonde 101 und die Oligomertestsonden 112,
die jeweils separat an der Oberfläche 104 an jeder Merkmalsposition 106 angelagert
sind. Demgemäß besteht
bei dem Ausführungsbeispiel 100c keine
Korre lation von 1:1 zwischen der Quantität der Kontrollsonden 101 und
der Oligomertestsonden 112.
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Bei
beiden Ausführungsbeispielen 100b und 100c kann
die Vorrichtung 100 zu Zwecken einer zerstörungsfreien
Qualitätskontrolle
gemäß der Erfindung
ausgewertet werden, muss aber nicht. Dort, wo Qualitätskontrollauswertungen
gewünscht
sind, können
die Ausführungsbeispiele 100b und 100c das Ausführungsbeispiel 100a der
in 1 veranschaulichten Vorrichtung 100 umfassen,
bei dem die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler 101 direkt
mit einer Kontrollmarkierung 107 markiert ist. Überdies
sollte man beachten, dass die Oligomertestsonde 112 direkt
mit einer Testmarkierung markiert sein kann, die, wenn sie belichtet
wird, ein Testsignal 115 erzeugt, das sich von dem Kontrollsignal 108 unterscheidet. Die
direkt markierte Oligomertestsonde 112 kann gemäß der vorliegenden
Erfindung auch während
des Qualitätskontrollabtastens
des bestückten
Mikroarrays 100 an jedem Merkmal 106 erfasst werden.
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Bezüglich der
Ausführungsbeispiele 100b, 100c gemäß der Erfindung
umfasst jede Merkmalsposition 106 die Oligomertestsonde 112 und
die Kontrollsonde bzw. den Kontrollpfeiler 101. In der
Praxis liegt eine Mehrzahl von Merkmalen 106 vor, wobei
jedes Merkmal 106 an dem Mikroarray 105 üblicherweise
eine Mehrzahl derselben Kontrollsonden oder -pfeiler 101 und
eine Mehrzahl derselben Oligomertestsonden 112 aufweist,
mit denen es besetzt ist. Die Nukleinsäuresequenz der Kontrollsonde
bzw. des Kontrollpfeilers 101 kann an jedem Merkmal 106 vorteilhafterweise
dieselbe sein, oder zumindest ein Merkmal kann eine unterschiedliche
Kontrollsondensequenz aufweisen, mit der es besetzt ist. Die Oligomertestsonden 112 können identisch
sein oder sich von Merkmal 106 zu Merkmal 106 unterscheiden,
je nach dem durchzuführenden
Hybridisierungsexperiment. Die 1–3 veranschaulichen
lediglich der Einfachheit halber lediglich eine Kontrollsonde bzw.
einen Kontrollpfeiler 101 und lediglich eine Oligomertestsonde 112 an
jedem Merkmal 106 und lediglich zwei Merkmale 106.
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Gemäß der Erfindung
können
die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 und die Oligomertestsonden 112 mittels
einer beliebigen hinreichend bekannten Technik auf das Array aufgebracht
werden. Beispielsweise können
die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 in einem herkömmlichen DNA-Synthetisierer vorsynthetisiert
und als ganze Oligonukleotide oder cDNA mittels punktförmigen Auftragens
oder Tintenstrahlaufbringungstechniken, die in der Technik bekannt
sind, auf das Substrat 105 aufgebracht werden. Ferner können die
Oligomertestsonden 112 desgleichen vorsynthetisiert und
als ganze Oligonukleotide oder cDNA aufgebracht werden. Alternativ
dazu können
die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 und/oder die
Oligomertestsonden 112 unter Verwendung hinreichend bekannter
Techniken einer In-situ-Synthese
in situ auf dem Substrat synthetisiert werden. Bei einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel
werden die Kontrollsonden oder -pfeiler 101 vorsynthetisiert
und auf das Substrat 105 in dem Array von Merkmalen 106 aufgebracht,
und die Oligomertestsonden 112 werden in situ direkt an
das freie Ende 103 des Kontrollpfeilers 101 synthetisiert. Bei
dem Ausführungsbeispiel 100c der 3 können die
Kontrollsonden 101 an dem freien Ende 103 mit einer
Abdeckung versehen werden, um eine Anlagerung der Oligomertestsonden 112 an
demselben zu verhindern, vor allem wenn die Oligomertestsonden 112 anhand
einer In-situ-Synthese bereitgestellt werden.
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Als
Alternative zur direkten Markierung der Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 kann
die Kontrollmarkierung 107 bei den Ausführungsbeispielen 100b, 100c,
wie bei dem Ausführungsbeispiel 100a der
Vorrichtung 100, mittels Hybridisierung insofern indirekt
mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziiert
werden, als die Kontrollmarkierung 107 direkt an einem
komplementären
oder kontrollspezifischen Target-Material 109 angelagert oder mit
einem solchen assoziiert ist, das zum Zweck einer Hybridisierung
mit der Mikroarrayvorrichtung 100 in Berührung gebracht
wird. Desgleichen kann die Testmarkierung mittels Hybridisierung
insofern indirekt mit der Oligomertestsonde 112 assoziiert
sein, als die Testmarkierung vorzugsweise direkt an einer im Test
befindlichen Target-Probe angelagert oder mit einer solchen direkt
assoziiert ist. Nachdem die Kontrollsonden bzw. der Kontrollpfeiler 101 und
die Oligomertestsonde 112 zu dem Substrat 105 hinzugefügt wurden,
wird die Vorrichtung 100, die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 und
Oligomertestsonden 112 umfasst, mit einer Hybridisierungslösung in
Berührung
gebracht, üblicherweise
seitens eines Benutzers der Mikroarrayvorrichtung 100,
der eine im Test befindliche Target-Probe 113 aufweist.
Die Hybridisierungslösung
umfasst die markierte experimentelle Test-Target-Probe 113 und
vorzugsweise das markierte kontrollspezifische Target-Material 109. Die
Hybridisierungs-untersuchung wird vorzugsweise in einem Hybridisierungsschritt
durchgeführt.
Alternativ dazu kann das markierte kontrollspezifische Target 109 separat
von der Hybridisierung des markierten Test-Target-Materials 113 z.B.
entweder durch den Benutzer oder den Hersteller der Vorrichtung 100 zu
der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 hybridisiert
werden. Somit werden die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 und
die Oligomertestsonde 112 mittels einer Hybridisierung
indirekt mit den jeweiligen Kontroll- und Testmarkierungen 107 assoziiert.
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Die
bzw. der hybridisierte Kontrollsonde bzw. Kontrollpfeiler 110 emittiert
das Kontrollsignal, das in einem Erfassungskanal der Abtastapparatur,
der sich vorzugsweise von dem Kanal unterscheidet, der zum Erfassen
des Testsignals 115 von der hybridisierten Oligomertestsonde 120 verwendet
wird, separat erfassbar ist (d.h. auf denselben abgestimmt werden kann).
Die Kontrollsignaldaten, die von dem separaten Kanal erhalten werden,
können
mit Daten des Hybridisierungstestsignals 115 verwendet
werden, um ungeachtet der Qualität
oder Quantität
der Hybridisierungstestsignale 115 alle Merkmale 106 zu
lokalisieren. Dies ist besonders dort sinnvoll, wo die Quantität der Test-Target-Probe 113 so
gering ist, dass die Testsignale 115 von den hybridisierten
Testsonden 120 sehr schwach oder gedämpft sind und somit nicht ohne
weiteres anhand herkömmlicher
Verfahren erfassbar sind.
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Bei
einer alternativen Art und Weise, eine Kontrollmarkierung 107 mit
der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 zu assoziieren,
wird bei den Ausführungsbeispielen 100b, 100c die
Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 sowohl direkt
markiert als auch indirekt markiert, beides wie oben beschrieben. Bei
diesem alternativen Markierungsschema umfasst die Kontrollmarkierung 107 eine
Kontrollsondenmarkierung und eine Kontroll-Target-Markierung, und das
Kontrollsignal umfasst ein Kontrollsondensignal und ein Kontroll-Target-Signal. Das
Kontrollsondensignal ist an der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 angelagert
oder direkt mit derselben bzw. demselben assoziiert, wie bei dem
Ausführungsbeispiel 100a,
und die separate Kontroll-Target-Markierung
ist nach einer Hybridisierung indirekt mit der Kontrollsonde bzw.
dem Kontrollpfeiler 101 assoziiert, indem die Kontroll-Target-Markierung
an dem kontrollspezifischen Target 109 angelagert wird. Nachdem
die Oligomertestsonden 112 zu den Merkmalen 106 des
Mikroarraysubstrats 105 hinzugefügt wurden, wird die Mikroarrayvorrichtung 100 mit
einer Hybridisierungslösung
in Berührung
gebracht, wie oben beschrieben wurde. Die hybridisierte Kontrollsonde 110 emittiert
zwei unterscheidbare und separat erfassbare Kontrollsignale, wenn
sie optisch abgetastet wird. Desgleichen kann die Testmarkierung bei
einem Ausführungsbeispiel
eine Testsondenmarkierung, die direkt auf die Oligomertestsonde 112 aufmarkiert
ist, und eine Test-Target-Markierung, die auf die Test-Target-Probe 113 aufmarkiert
ist, umfassen. Nach der Hybridisierung emittiert die hybridisierte
Oligomertestsonde 120 zwei unterscheidbare und separat
erfassbare Testsignale 115a, 115b, die, wenn sie optisch
abgetastet werden, ebenfalls von den Kontrollsignalen 108a, 108b unterscheidbar
und separat erfassbar sind.
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Das
von der Kontrollsondenmarkierung emittierte Kontrollsondensignal
kann in einem Kanal erfasst werden, und das Kontroll-Target-Signal
von der Kontroll-Target-Markierung kann vorzugsweise in einem anderen,
separaten Kanal der Abtastvorrichtung erfasst werden, wobei beide
Kanäle
vorzugsweise von den Kanälen,
die zum Erfassen der Testsignale 115 von der hybridisierten
Testsonde 120 verwendet werden, unterschiedlich und getrennt
sind, um vollständig
von denselben unterscheidbar zu sein. Dort, wo die Kontrollmarkierungen
jeweils ein Kontrollsignal emittieren, ist eine Mikroarray-Abtastvorrichtung bevorzugt,
die eine erforderliche Anzahl getrennter Erfassungskanäle umfasst.
Vierkanal-Mikroarray-Abtastvorrichtungen
sind in der Technik bekannt und würden für das Ausführungsbeispiel der Erfindung von
dualen Steuersignalen 108a, 108b funktionieren. In
der Tat würde
ein Vierkanal-Abtastsystem die dualen Kontrollsignale und die dualen
Testsignale, wie sie bei einem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung vorgesehen sein können, beherbergen. Dort, wo
sowohl die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 als
auch das Kontroll-Target 109 markiert sind, sind vorteilhafterweise sowohl
eine zerstörungsfreie
Vorhybridisierungs-Qualitätskontrollauswertung
als auch eine -Merkmalslokalisierung möglich, indem das Kontrollsondensignal
von der Kontrollsondenmarkierung, wie bei dem Ausführungsbeispiel 100a mit
einer Mikroarray-Abtastvorrichtung
erfasst wird, sowie auch eine Nachhybridisierungs-Merkmalslokalisierung und/oder
-Extraktion mit einer Normierung von Hybridisierungsdaten, durch
Erfassen zumindest des Kontroll-Target-Signals von der Kontroll-Target-Markierung
und durch ein separates Erfassen der Testsignale.
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Jedoch
sollte man beachten, dass eine Vorhybridisierungs-Abtastung für eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollaus wertung
und eine Nachhybridisierungs-Abtastung zum Erhalten von Hybridisierungsuntersuchungsergebnissen
zu unterschiedlichen Zeiten und, wenn möglich, mit unterschiedlichen
Mikroarray-Abtastvorrichtungen durchgeführt werden würde. Eine
Vorhybridisierungs-Abtastung erfasst lediglich das Kontrollsignal
oder das Kontrollsondensignal von der direkt markierten Kontrollsonde
bzw. dem direkt markierten Kontrollpfeiler 101. Desgleichen
kann bei einem Ausführungsbeispiel
die Vorhybridisierungs-Abtastung auch lediglich das Testsignal oder
das Testsondensignal von der direkt markierten Oligomertestsonde 112 erfassen.
Dagegen erfasst die Nachhybridisierungs-Abtastung das Kontrollsignal
oder das Kontroll-Target-Signal von der indirekt markierten, hybridisierten
Kontrollsonde bzw. dem indirekt markierten, hybridisierten Kontrollpfeiler 110,
und könnte
auch dazu verwendet werden, das Kontrollsondensignal zu erfassen.
Desgleichen erfasst die Nachhybridisierungs-Abtastung auch das Testsignal
oder das Test-Target-Signal von der indirekt markierten, hybridisierten
Oligomertestsonde 120 und könnte auch dazu verwendet werden,
das Testsondensignal (falls vorhanden) zu erfassen.
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Die
Mikroarray-Abtastvorrichtung, die zum Abtasten der Mikroarrayvorrichtung 100 der
vorliegenden Erfindung bezüglich
Vor- oder Nachhybridisierungs-Abtastungen verwendet wird, muss keinen separaten
Erfassungskanal aufweisen, um jedes der verschiedenen Kontroll-
und Testsignale zu erfassen. Jedoch sollte die Mikroarray-Abtastvorrichtung
in der Lage sein, jedes der unterschiedlichen Signale separat zu
erfassen. Die für
die Erfindung nützliche
Mikroarray-Abtastvorrichtung
weist zwei oder mehrere separate Erfassungskanäle und vorzugsweise zumindest
vier separate Kanäle
auf. Ein Zweikanal-Mikroarray-Abtastsystem kann dazu verwendet werden,
die verschiedenen Kontrollsignale und Testsignale in separaten Abtastungen
in jedem Kanal separat zu erfassen, vorausgesetzt, dass etwaige
nachteilige Effekte, z.B. ein „Ausbleichen" der Markierungen 107,
berücksichtigt
werden können
und die zwei Erfassungskanäle
wechselweise eingesetzt oder der durch jeden Kanal erfasste Wellenlängenbereich
veränderbar
ist (z.B. mit Filtern), so dass jeder Kanal für jede Abtastung einen unterschiedlichen
Wellenlängenbereich
erfasst. Für
Fachleute ist ohne weiteres ersichtlich, wie eine Zweikanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung
zum separaten Erfassen von drei bis vier separaten (d.h. unterschiedliche
Wellenlängenbereiche aufweisenden)
Signalen zu verwenden ist, und der Schutzumfang der Erfindung ist
nicht durch das verwendete Mikroarray-Abtastsystem begrenzt.
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Ein
Beispiel der Verwendung der Mikroarrayvorrichtung 100 der
vorliegenden Erfindung ist ein hinreichend bekanntes standardmäßiges Rot/Grün-Experiment
(d.h. Zweifarben-Experiment). Ein
Hybridisierungsgemisch würde
hergestellt werden, das eine Referenz-Test-Target-Probe 113 und eine
experimentelle Test-Target-Probe umfasst. Allgemein werden für die Testmarkierungen
an der Referenz- und der experimentellen Test-Target-Probe zwei
fluoreszierende Farbstoffe, z.B. CY3 und CY5 (oben erwähnte hinreichend
bekannte Farbstoffe) verwendet, die rote bzw. grüne Signale erzeugen. Die Zweifarben-Experimente
werden dort eingesetzt, wo die Referenz-Test-Target-Probe 113 eine
unbehandelte Zell-Linie
sein könnte,
und die experimentelle Test-Target-Probe beispielsweise eine mit
Medikamenten behandelte Zell-Linie sein könnte. Ein Benutzer wäre an der
Differenz der Genexpression zwischen diesen beiden Proben interessiert.
Die standardmäßigen Rot/Grün-Experimente
können
paarweise durchgeführt
werden; die Farbstoffe werden zwischen der Testprobe 113 und
der Testreferenz in den Paaren vertauscht (d.h. Farbstofftauschexperimente),
und die Ergebnisse werden verglichen.
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Wenn
das typische Rot/Grün-Experiment
bei der Mikroarrayvorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, würde
ein dritter Farbstoff für die
Kontrollmarkierung 107 verwendet, um speziell das Kontroll-Target 109 zu
markieren, das zu der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 komplementär ist. Der
dritte Farbstoff 107 würde
das Kontrollsignal erzeugen, wenn er durch Licht angeregt wird,
das sich von den roten und grünen
Signalen unterscheidet. Das markierte Kontroll-Target 109 ist
in dem Hybridisierungsgemisch mit dem Referenz-Test-Target 113 und
dem experimentellen Test-Target enthalten. Alternativ dazu könnten ein dritter
und vierter Farbstoff beispielsweise für die Kontrollsondenmarkierung
und die Kontroll-Target-Markierung verwendet werden. Das Kontrollsignal
von dem dritten Farbstoff 107 oder die Kontrollsignale
von dem dritten und dem vierten Farbstoff würden sich von einander und
von den roten und grünen Signalen
von den CY3- und CY5-Farbstofftestmarkierungen
an den Test-Target-Proben unterschieden. Überdies eine Testmarkierung
entweder direkt an der Oligomertestsonde 112 oder an dem
Test-Target 113; eine Testmarkierung jeweils direkt sowohl
an der Oligomertestsonde 112 als auch dem Test-Target 113; oder
eine Testmarkierung direkt an unterschiedlichen Gruppen der Test-Target-Probe 113, 113' bzw. einer Abwandlung
oder Kombination derselben, fallen allesamt in den Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung.
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Die
hybridisierte Kontrollsonde bzw. der hybridisierte Kontrollpfeiler 110 emittiert
das Kontrollsignal, das die Kontrollmarkierung 107 angibt.
Die hybridisierte Testsonde 120 emittiert das Testsignal,
das die Testmarkierung angibt. Die Mikroarray-Abtastvorrichtung
erfasst separat jedes unterschiedliche Signal in jeglicher der Abwandlungen
oder Variationen, die oben für
die Kontrollsignale und die Testsignale beschrieben wurden. Das
Kontrollsignal wird separat erfasst, vorzugsweise in (einem) separaten
Kontrollerfassungskanal bzw. -kanälen, von dem Erfassungskanal
bzw. den Erfassungskanälen,
der bzw. die herkömmlicherweise
zur Erfassung des aus der hybridisierten Testsonde 120 emittierten
Signals verwendet wird bzw. werden.
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4 und 5 veranschaulichen
die Mikroarrayvorrichtung 100 nach einer Hybridisierung. 4 veranschaulicht
das Aus führungsbeispiel 100b der 2 nach
einer Hybridisierung. 5 veranschaulicht das Ausführungsbeispiel 100c der 3 nach
einer Hybridisierung. Das Kontroll-Target 109 ist als kurz
gestrichelte Linie neben der Kontrollsonde bzw, dem Kontrollpfeiler 101 (als
durchgezogene gerade Linie veranschaulicht) veranschaulicht, und
das Test-Target 113 ist als relativ länger gestrichelte Linie neben
der Oligomertestsonde 112 (als durchgezogene Wellenlinie
veranschaulicht) veranschaulicht. 4 und 5 veranschaulichen
der Einfachheit halber nicht die Kontrollmarkierung 107 oder
das Kontrollsignal 108. Alle Möglichkeiten, die Kontrollprobe
bzw. den Kontrollpfeiler 101 mit der oben beschriebenen
Kontrollmarkierung 107 zu markieren, sind auf 4 und 5 anwendbar.
Ebenfalls nicht in 4 und 5 gezeigt
ist, dass die hybridisierte Testsonde 120 mit der Testmarkierung markiert
ist, die das Testsignal emittiert. Vorzugsweise ist die Testmarkierung 114 an
der Test-Target-Probe 113 angelagert
oder mit derselben assoziiert, wie oben erwähnt wurde. Jedoch sind alle
Möglichkeiten des
Markierens der Oligomertestsonde 112 mit der Testmarkierung 114,
die oben beschrieben wurden, auf 4 und 5 anwendbar.
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Wenn
die Kontrollmarkierung 107 mittels einer Hybridisierung
zusammen mit dem markierten Test-Target 113 zu der Oligomertestsonde 112 indirekt
mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziiert
ist, können
die Hybridisierungsdaten für
jedes Merkmal 106 für
verschiedene Signaltendenzen (global oder lokal) über das
Array hinweg vorteilhafterweise direkt an dem Mikroarray 105 normiert werden.
Beispielsweise können
die typischen Signalgradienten, die auf Grund von Oligomertestsonden-Hybridisierungsanomalien
und/oder auf Grund von Abtastvorrichtungsfokussierungsproblemen über ein
Array hinweg vorliegen, kompensiert werden, da jedes Merkmal 106 ein
kontrollspezifisches Target-Signal als „Referenz" aufweist, das in dem separaten Kanal
der Abtastvorrichtung erfasst wird. Die Hybridisierungsdaten aus
diesem separaten Kon trollkanal können
mit den Hybridisierungsdaten von den herkömmlichen Testerfassungskanälen verglichen und
normiert werden.
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Alle
Ausführungsbeispiele
der oben beschriebenen Vorrichtung 100 können die
Position jedes Merkmals 106 an dem Array genau erfassen,
indem sie bezüglich
des Steuersignals von der kontrollspezifischen Markierung 107 in
einem anderen Kanal der Abtastapparatur, vorzugsweise unabhängig von den
Kanälen,
die herkömmlicherweise
zum Abtasten der Testsignale von den hybridisierten Oligomertestsonden 120 verwendet
werden, abtasten. Die vorliegende Erfindung sieht eine neuartige
Vorrichtung 100 und Verfahren für eine verbesserte Erfassbarkeit
von Merkmalen 106 vor, die vorzugsweise zusätzliche Farbkanäle, die
an einer Vierkanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung
zur Verfügung
stehen, in Verbindung mit einem Erzeugen einer Mikroarrayvorrichtung 100 von
Kontrollsonden- oder pfeilern 101 und Oligomertestsonden 112,
vorzugsweise an den Kontrollpfeilern 101, verwendet. Somit
ist die Position jedes Merkmals 106 ungeachtet der Qualität des Testsignals
von den hybridisierten Oligomertestsonden 120 bekannt.
Die zusätzlichen
Kontrollsignaldaten in dem separaten Kanal werden dazu verwendet,
eine Lokalisierung von Merkmalen 106 und eine Merkmalsextraktion
zu unterstützen,
besonders in Bezug auf ein geringfügiges oder gedämpftes Signal
von hybridisierten Oligomertestsonden 120. Ferner liefern
die zusätzlichen
Signaldaten ein Mittel zum Normieren jedes Merkmals 106 bezüglich seiner
extremen lokalen Hybridisierungs- und Abtastcharakteristika. Mit „extrem
lokal" ist gemeint,
dass der lokale Bereich jedes Merkmals 106 selbst in der
Analyse betrachtet wird, da jedes Merkmal 106 die Kontrollsonde
bzw. den Kontrollpfeiler 101 und die Oligomertestsonde 112 umfasst.
Vorteilhafterweise werden die Daten für das Merkmal 106 selbst
normiert, und werden nicht anhand irgend eines Mittelwerts über viele
separate zweckgebundene Kontrollmerkmale normiert, wie dies herkömmlicherweise
geschieht. Mit anderen Worten können
die Signalwerte bezüglich
der genauen Positi on des Merkmals sowie Variationen der präzisen Merkmals-Lokalhybridisierung
angepasst werden, statt eine weniger lokalisierte Abtastung (engl.: sampling)
von umgebendem Hintergrund oder anderen zweckgebundenen Merkmalskontrollsonden
zu verwenden, wie dies bei den herkömmlichen Analyseverfahren verwendet
wird.
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4 veranschaulicht
das bevorzugte Ausführungsbeispiel 100b der
Vorrichtung 100 der Erfindung nach einer Hybridisierung
mit einem Hybridisierungsgemisch, das kontrollspezifische Targets 109 einer
bekannten Zusammensetzung und das Test-Target-Material 113 umfasst.
Das in 4 veranschaulichte bevorzugte Ausführungsbeispiel 100b sieht
eine Korrelation von 1:1 zwischen der Quantität des Kontrollpfeilers 101 und
der Quantität
der Oligomertestsonden 112 vor. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der 4 sowie bei dem in 5 veranschaulichten
Ausführungsbeispiel 100c liefert das
Kontrollsignal 108 von der hybridisierten Kontrollsonde 110 Informationen über die
Position jedes Merkmals 106, während die separaten Testsignale von
den hybridisierten Testsonden 120 Informationen über die
Qualität
und Quantität
der Hybridisierung des Test-Targets 113 an die Testsonden 112 an
jedem Merkmal 106 liefern.
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6 veranschaulicht
ein Verfahren 200 zum Durchführen einer zerstörungsfreien
Qualitätskontrollauswertung
der Merkmale an einem Mikroarray. Das Mikroarray entspricht der
vorherigen Beschreibung und umfasst eine markierte Kontrollsonde 101 auf
einer Oberfläche 104 eines
Mikroarraysubstrats 105 an einer Merkmalsposition 106,
und die Kontrollmarkierung 107 für die Kontrollsonde 101 emittiert
ein Kontrollsignal, wenn sie belichtet wird. Das Verfahren zum Durchführen umfasst
ferner die Schritte des Abfragens 207 des bestückten Mikroarraysubstrats 105;
und des Auswertens 209 von Daten, die aus dem Abfrageschritt
gewonnen wurden. Der Schritt des Abfragens 207 umfasst
die Schritte des Abtastens 210 des Mikroarrays mit einem
Licht; und des Erfassens 220 des Kontrollsignals von der markierten
Kontroll sonde an jeder Merkmalsposition 106. Das Kontrollsignal
von der Kontrollsondenmarkierung 107 kann in einem Kontrollerfassungskanal eines
Abtastsystems erfasst werden. Dieses Verfahren 200 ist
besonders für
die zerstörungsfreien
Qualitätskontrollauswertungen
von Mikroarraysubstraten 105, bevor das Substrat 105 mit
Oligomertestsonden 112 besetzt wird, oder sogar nachdem
die Oligomertestsonden 112 hinzugefügt werden, jedoch bevor Hybridisierungsexperimente
durchgeführt
werden, nützlich.
Dort, wo die Oligomertestsonde 112 auf das Substrat 105 gesetzt
wird, würde
eine direkt markierte Oligomertestsonde 112 nach der Abfrage 207 sogar
noch mehr Qualitätskontrolldaten über das
bestückte
Mikroarraysubstrat 105 zur Auswertung 209 liefern.
Bei dem Schritt des Auswertens 209 können die aus der Qualitätskontrollabfrage
eingeholten Daten zum Modifizieren nachfolgender Aufbringungen verwendet
werden, z.B. Durchführen
einer Anpassung an die Ausrichtung der Aufbringungsapparatur, bevor
die Oligomertestsonden 112 hinzugefügt werden. Alternativ dazu
können
die während
der Abfrage eingeholten Qualitätskontrolldaten
an einen Benutzer der Mikroarrayvorrichtung 100, wie sie
oben definiert wurde, weitergeleitet werden, um den Benutzer bei der
Auswertung von Hybridisierungstestergebnissen zu unterstützen.
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7 veranschaulicht
ein alternatives Verfahren 300 zum Erfassen jedes Merkmals
an einem beanspruchten Mikroarray.
-
Wie
bei dem obigen Verfahren 200 umfasst das Verfahren 300 die
Schritte des Abfragens 207 des Mikroarrays 100 mit
einer Mikroarray-Abtastvorrichtung, um das Kontrollsignal zu erfassen,
und des Auswertens 209 von Daten, die von dem erfassten Kontrollsignal 108 gesammelt
wurden. Die Oligomertestsonde 112 ist mit einer Testmarkierung
assoziiert, die ein Testsignal emittiert, das sich von dem Kontrollsignal
unterscheidet. Wenn die Oligomertestsonde 112 mit der Testmarkierung
assoziiert wird, umfasst der Schritt des Abfragens 207 ein
Abtasten 210 des Mikroarrays 100 mit einem Licht,
um die Markierungen anzuregen, und ein Erfassen 220 des
Steuersignals, und umfasst ferner den Schritt des Erfassens 322 des
Testsignals von der Testmarkierung auf separate Weise, vorzugsweise
in einem von dem Kontrollkanal des Abtastsystems separaten Testerfassungskanal.
Das Verfahren 300 ist besonders nützlich bezüglich eines Erfassens aller
Merkmale auf dem Array ungeachtet der Qualität oder Quantität des Testsignals 115 an
jeder Merkmalsposition 106 durch ein Erfassen 220 des
Kontrollsignals 108 von der Kontrollsonde 101 an
jeder Merkmalsposition 106.
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8 veranschaulicht
den Schritt des Anlagerns 306 der Oligomertestsonden 112 an
den Merkmalspositionen 106; und ein indirektes Assoziieren der
Testmarkierung mittels Hybridisierung. Vor dem Schritt des Abfragens 207 umfasst
das Verfahren 300 ferner den Schritt des Inberührungbringens 307 des Mikroarrays 100 mit
einer Hybridisierungslösung,
die die Test- oder experimentelle Target-Probe 113 umfasst,
die die Testmarkierung umfasst. Jedoch können statt eines oder zusätzlich zu
einem Markieren der Test-Target-Probe 113 die Oligomertestsonden 112 direkt
markiert werden. Die Kontrollsignale 108, die von dem Kontrollerfassungskanal
gesammelt werden, und die Testsignale, die von dem separaten Testerfassungskanal
des Abtastsystems gesammelt werden, werden zusammen dazu verwendet,
die Merkmale, die hybridisierte Oligomertestsonden 120 enthalten,
auf der Basis der Positionen aller Merkmale 106 zu lokalisieren.
Das Verfahren 300 ist besonders nützlich bezüglich eines Erfassens aller
Merkmale ungeachtet der Qualität
und Quantität
der Hybridisierung an jedem Merkmal 106 und, was noch wichtiger
ist, ungeachtet der Stärke
des Targetspezifischen Testsignals an jedem Merkmal 106.
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Die
Oligomertestsonde ist vorzugsweise an ein gegenüberliegendes Ende 103 der
Kontrollsonde 101 angelagert, so dass die Kontrollsonde
als Kontrollpfeiler 101 agiert, der sich zwischen der Oberfläche 104 des
Substrats 105 und der Oligomertestsonde 112 erstreckt.
Wie oben erwähnt
wurde, liefert dies vorteilhafterweise eine Korrelation von 1:1
zwi schen der Quantität
und der Kontrollsonde und der Quantität der Oligomertestsonden in
jedem Merkmal. Alternativ dazu kann die Oligomertestsonde dadurch vorgesehen
sein 305, dass ein Ende der Oligomertestsonde an der Oberfläche 104 des
Mikroarraysubstrats 105 in jedem Merkmal 106 zusammen
mit der Kontrollsonde 101 angelagert wird 306.
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Bei
dem Verfahren 200 zum Durchführen einer zerstörungsfreien
Qualitätskontrollauswertung
eines Mikroarrays von Merkmalen, wie es in Anspruch 7 beansprucht
wird, kann das Array eine Kontrollsonde umfassen, die eine direkt
assoziierte Kontrollmarkierung aufweist. Jedoch kann die Kontrollsonde 101 bei
dem Verfahren gemäß Anspruch
8 auf eine von drei Arten markiert werden. Bei einer Art weist die Kontrollsonde
eine direkt assoziierte 303 Kontrollmarkierung 107 auf.
Alternativ dazu kann eine unmarkierte Kontrollsonde 101 an
der Oberfläche 104 des
Substrats 105 angelagert sein, und die Kontrollmarkierung 107 mittels
Hybridisierung 307 indirekt an der Kontrollsonde 101 angelagert
sein, wenn die Kontrollsonde 101 mit der oben erwähnten Hybridisierungslösung in
Berührung
gebracht wird, die ferner das komplementäre Kontroll-Target 109 umfasst, das
die Kontrollmarkierung 107 aufweist. Als weitere Alternative
kann eine Kontrollsonde 101, die sowohl eine direkt assoziierte 303 Kontrollsondenmarkierung
als auch eine Kontroll-Target-Markierung (304), die mittels
Hybridisierung 307 indirekt angelagert ist, aufweist, an
dem Substrat (105) angelagert sein. Wiederum werden die
Kontroll-Targets 109 vorzugsweise zur selben Zeit wie die
Test-Target-Probe 113 hybridisiert 307. Jedoch
können
die Kontroll-Targets 109 separat von dem Test-Target-Material 113 hybridisiert
werden. In diesem Fall umfasst die Kontrollmarkierung 107 eine
Kontrollsondenmarkierung, die ein Kontrollsondensignal emittiert,
und eine Kontroll-Target-Markierung, die ein unterschiedliches Kontroll-Target-Signal
emittiert. Überdies
umfasst der Schritt des Erfassens 220 vorzugsweise ferner
die Schritte des Erfassens 221a des Kontrollsondensignals 108a in
einem Kontrollkanal und des separaten Erfassens 221b des
Kontroll-Target-Signals vorzugsweise in einem separaten Kontrollkanal
des Abtastsystems. Dies ist besonders nützlich bezüglich eines Bereitstellens
der Kapazität
für eine
zerstörungsfreie Qualitätskontrollanalyse
vor der Hybridisierung 307, indem zuerst das Mikroarray 100 abgefragt
wird, bevor die Oligomertestsonde 112 indirekt mit der
Testmarkierung assoziiert wird. Die erste Abfrage wird dazu verwendet,
das Kontrollsignal von der Kontrollsondenmarkierung zu erfassen.
Ferner ist dies besonders nützlich
in Bezug darauf, eine nach der/einer Hybridisierung erfolgende Merkmalslokalisierung, Merkmalsextraktion,
Normierung der Hybridisierungsdaten und eine Hybridisierungs-/Abtast-Tendenzumkehr bereitzustellen,
indem anschließend das
Mikroarray 100 nach der Hybridisierung 307 abgefragt 207 wird
und das Kontrollsignal von der Kontroll-Target-Markierung 107b und
das Testsignal von der Testmarkierung separat erfasst werden. 8 veranschaulicht
das Verfahren 300, bei dem die alternativen Markierungsschritte 303, 304 der
Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 mittels gestrichelter
Pfeile veranschaulicht sind und die Erfassungsschritte 221a, 221b der
separaten Kontrollschritte 108a bzw. 108b mittels
gestrichelter Pfeile veranschaulicht sind.
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Ein
direktes Markieren
303 der Kontrollsonde
101 mit
einer Kontrollmarkierung
107 ist für das Verfahren
200 und
bei dem zuletzt beschriebenen alternativen Ausführungsbeispiel in dem Verfahren
300 bevorzugt,
da es die Gelegenheit bietet, eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollanalyse
des Mikroarrays unabhängig
von der Hybridisierung durchzuführen. Derartige
Qualitätskontrollinformationen
können
statt der oder genau auf dieselbe Weise wie die mittels einer Kamera
oder eines Sensors gewonnenen Qualitätskontrollinformationen verwendet
werden, die in der gleichzeitig anhängigen britischen Patentanmeldung
GB 2355716 mit dem Titel „POLYNUCLEOTIDE
ARRAY FABRICATION" und
in der gleichzeitig anhängigen
US-Patentanmeldung Seriennr. 09/558,532 mit dem Titel „ARRAY
FABRICATION WITH DROP DETECTION" verwendet werden. Selbstverständlich können die
mittels einer Kamera oder eines Sensors gewonnenen Informationen
in diesen Anmeldungen durch Arrayqualitätsinformationen (ob nominal
oder tatsächlich)
ersetzt werden, die anhand beliebiger Mittel gewonnen wurden. Für das Verfahren
200 ist
dann, wenn die Kontrollsonde bzw, der Kontrollpfeiler
101 direkt
markiert
303 ist, eine Hybridisierung mit einem Kontroll-Target
109 nicht notwendig,
um ein Kontrollsignal
108 zu erzeugen. Somit muss die direkt
markierte Kontrollsonde bzw. der direkt markierte Kontrollpfeiler
101 kein
komplementäres
Kontroll-Target
109 aufweisen, wie dies herkömmlicherweise
bereitgestellt wird. Jedoch wird die direkt markierte Kontrollsondensequenz
101 trotzdem
so gewählt,
dass sie als Kontrolle oder Referenz fungiert, die nicht mit der
im Test befindlichen Target-Probe hybridisiert oder dieselbe beeinträchtigt.
Im Gegensatz zu indirekt markierten Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern
101 werden überdies
direkt markierte Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler
101 für eine präzise Merkmalslokalisierung
während
einer Merkmalsextraktion nach einer Hybridisierung verwendet, ihre
Verwendung liefert jedoch keine auf die Hybridisierung bezogenen
Normierungsdaten.
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Bei
den alternativen Ausführungsbeispielen des
oben erwähnten
Verfahrens 300, bei denen die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 indirekt
mit der Kontrollmarkierung 107 assoziiert ist 304,
vorzugsweise mittels einer Hybridisierung 307, kann das markierte
Kontroll-Target 109 mit den Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 bevor,
nachdem oder vorzugsweise zur selben Zeit, wie die Test-Target-Probe 113 mit
den Oligomertestsonden hybridisiert wird 307, hybridisiert
werden, wodurch lediglich ein Hybridisierungsschritt 307 erforderlich
ist. Durch ein Hinzufügen 304 von
markierten Kontroll-Targets 109 zu dem Hybridisierungsgemisch
und durch ein Hybridisieren 307 der markierten Kontroll-Targets 109 zur selben
Zeit wie die markierte Test-Target-Probe 113 hybridisiert
wird 307, können
die Hybridisierungsdaten überdies
normiert werden.
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Nach
der Hybridisierung 307 und der Abfragung 207 können die
standardmäßigen Rot-
und Grün-Kanäle der Mikroarray-Abtastvorrichtung
zur Erfassung von Testsignalen wie bei einem typischen Experiment
(oben beschrieben) verwendet werden, während zumindest ein separater
Kontrollkanal dazu verwendet wird, lediglich kontrollbezogene Signale zu
erfassen. Dort, wo ein separates Kontrollsondensignal und ein separates
Kontroll-Target-Signal vorliegen, weist die Abtastvorrichtung vorzugsweise zwei
separate Kontrollkanäle
auf, um die Kontrollsignale 108a, 108b separat
zu erfassen. Eine Vierkanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung funktioniert
besonders gut bei dem Ausführungsbeispiel,
das zwei separate Kontrollsignale aufweist, und insbesondere bei
dem Ausführungsbeispiel,
bei dem zwei separate Kontrollsignale und zwei separate Testsignale
vorliegen. Wie oben erwähnt
wurde, funktioniert bei der Erfindung jedoch auch eine Zweikanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung.
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Nach
dem Schritt des Abtastens 210 erzeugt die Mikroarrayvorrichtung 100 ein
in dem Kontrollkanal bzw. den Kontrollkanälen erfasstes Signal für jedes
einzelne Merkmal 106 auf dem Arraysubstrat 105.
Vorteilhafterweise unterstützt
ein Kontrollsignal 108 für jedes Merkmal 106 die
Merkmalslokalisierung (besonders bei geringfügigen oder gedämpften Testsignalen
von Merkmalen), vielleicht noch wichtiger ist jedoch die Tatsache,
dass ein Kontrollsignal von einer hybridisierten Kontrollsonde 110 ein
Mittel zum Normieren jedes Merkmals 106 bezüglich seiner
extrem lokalen Hybridisierungs- und Abtastcharakteristika liefert.
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Die
Kontrollsonden können
bereitgestellt werden 201, 301, indem die Kontrollsonden 101 vorsynthetisiert
werden und das gesamte Oligomer/cDNA auf der Oberfläche 104 des
Substrats 105 in dem Arraymuster von Merkmalen 106 unter
Verwendung hinreichend bekannter Verfahren der Vorsynthese, Aufbringung
und Immobilisierung auf der Oberfläche aufgebracht oder immobilisiert 302 werden.
Alternativ dazu kön nen
die Kontrollsonden 101 bereitgestellt werden 201, 301,
indem die Kontrollsonden 101 unter Verwendung hinreichend
bekannter Techniken der In-situ-Synthese in situ auf dem Substrat 105 synthetisiert
werden. Desgleichen können
die Oligomertestsonden 112 bereitgestellt werden 305,
indem ganze Oligomere/cDNA vorsynthetisiert und aufgebracht oder
angelagert 306 werden, oder indem ansonsten die Oligomertestsonden 112 unter
Verwendung herkömmlicher
Verfahren in situ synthetisiert werden. Die Oligomertestsonden 112,
ob sie vorsynthetisiert oder in situ synthetisiert werden, können an der
Oberfläche 104 des
Substrats 105 angelagert werden oder können an dem gegenüberliegenden Ende 103 der
Kontrollsonde 101 in jeder Merkmalsposition 106 angelagert
werden. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Kontrollsonden 101 vorsynthetisiert
und als ganze Kontrollsonden 101 auf die Oberfläche 104 des
Mikroarraysubstrats 105 aufgebracht 302, und die
Oligomertestsonden 112 werden in situ synthetisiert, entweder
auf der Oberfläche 104 des
Substrats 105 oder, vorzugsweise, an dem gegenüberliegenden
Ende 103 der Kontrollsonde 101. Somit wird bei
dem stärker
bevorzugten Ausführungsbeispiel
des Verfahrens 400 zum Herstellen der Mikroarrayvorrichtung 100 gemäß Anspruch
13 das Mikroarray hergestellt, indem vorsynthetisierte Oligomere
(Kontrollsonden) an jeder Merkmalsposition aufgebracht werden, so
dass ein Ende der Oligomersequenz an dem Substrat 106 angelagert
wird, zusätzlich
zu einem Synthetisieren der Oligomertestsonden 107 in situ
an dem gegenüberliegenden
Ende 103 der vorsynthetisierten Kontrollsondensequenz.
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In
der Praxis können
die Konzentrationen der ganzen Oligomerkontrollen 101 gegenüber der
Konzentration der in situ-Oligomertestsonde 112 ohne übermäßiges Experimentieren
seitens Fachleuten ermittelt werden. Dieses stärker bevorzugte Ausführungsbeispiel
könnte
schneller hergestellt werden, da die vorsynthetisierte Kontrolle 101 durch
ein einziges Abfeuern einer dafür
vorgesehenen Tintenstrahldüse an
jedem Merkmal 106 aufgebracht werden könnte, wodurch die Anzahl der
Zyklen, die zum Synthetisieren des kombinierten Kontrollpfeilers 101 und
der in situ-Oligomertestsonde 112 benötigt werden, verringert wird.
Mit anderen Worten könnte
ein einziger Durchlauf der Tintenstrahlschreibvorrichtung Kontrollpfeiler 101 an
allen Merkmalen 106 aufbringen, und anschließende Durchläufe der
Tintenstrahlschreibvorrichtung könnten
dazu verwendet werden, genau die Oligomertestsonden 112 an
dem freien (keine Anlagerung aufweisenden) Ende 103 jedes Kontrollpfeilers 101 in
situ zu synthetisieren. Der Kontrollpfeiler 101 ist bei
diesem Ausführungsbeispiel
an dem freien, keine Anlagerung aufweisenden Ende 103 nicht „mit einer
Abdeckung versehen",
so dass die Oligomertestsonde 112 mittels einer In-situ-Synthese
zu dem nicht mit einer Abdeckung versehenen, freien Ende 103 hinzugefügt wird,
um die Herstellungsvorteile eines Aufbringens vorsynthetisierter Kontrollsonden 101 als
ersten Syntheseschritt bei der In-situ-Synthese der Oligomertestsonden 112 zu erlangen.
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Um
den oben erwähnten
Herstellungsvorteil noch stärker
zu betonen, erwäge
man beispielsweise, dass der Kontrollpfeiler 101 eine Sequenz
aus 15 Monomeren sei, und die Oligomertestsonde 112 eine Sequenz
aus 25 Monomeren sei. Eine Verwendung einer In-situ-Synthese sowohl
der Kontroll- als auch der Testsonden 101, 112 wäre äquivalent
dazu, ein Oligomer zu synthetisieren, das an jedem Merkmal 106 des
Mikroarraysubstrats 105 eine Sequenz von 40 Monomeren aufweist.
Gemäß dem stärker bevorzugten
Herstellungsverfahren 400 muss in dem Fall, dass der Kontrollpfeiler 101 einer
Sequenz aus 15 Monomeren als vorsynthetisierte Kontrollsequenz aufgebracht
wird, lediglich die Oligomertestsonde 112 einer Sequenz
aus 25 Monomeren an das Ende 103 des vorsynthetisierten
15-Monomer-Kontrollpfeilers 101 in situ synthetisiert werden.
Dieses stärker bevorzugte
Verfahren 400 ist das Äquivalent
(bezogen auf die Zeit und den Arbeitsaufwand) eines einfachen Herstellens
einer Sequenz aus 26 Monomeren an dem Array statt der 40-Monomer-Sequenz. Dies
stellt eine beträchtliche
Ersparnis bezüglich
der Zeit dar, die zum Herstellen der Mikroarrayvorrichtung 100 benötigt wird.
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Bezüglich eines
weiteren Aspekts der Erfindung ist ein Instrumentarium vorgesehen,
das die Mikroarrayvorrichtung 100 und Anweisungen zur Verwendung
der Vorrichtung 100 umfasst. Das Instrumentarium ist bezüglich eines
Auswertens einer Test-Target-Probe 113 nützlich.
Die Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung ist mit
Kontrollsonden oder -pfeilern 101 und Oligomertestsonden 112,
wie oben beschrieben, für
jegliche der Ausführungsbeispiele 100a, 100b, 100c bestückt. Bei
einem Ausführungsbeispiel
des Instrumentariums 500 sind die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 direkt
mit einer Kontrollmarkierung 107 markiert. Bei einem anderen
Ausführungsbeispiel
sind die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 nicht
direkt markiert. Der Benutzer legt fest, ob eine Fähigkeit
zu einer zerstörungsfreien
Qualitätskontrolle
oder tatsächliche
Qualitätskontrolldaten
für die
eingehäuste
Mikroarrayvorrichtung 100 vorgesehen sind. Wenn ein Qualitätstesten
festgelegt wird, werden direkt markierte Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 an
dem Mikroarray 100 vorgesehen.
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Das
Instrumentarium umfasst ferner ein kontrollspezifisches Target-Material 109,
das eine Kontrollmarkierung 107 aufweist. Das Kontroll-Target 109 ist
komplementär
zu der Sequenz von Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 und
wird während
Hybridisierungsexperimenten durch den Benutzer des Instrumentariums
benutzt. Die mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziierte
Kontrollmarkierung 107 verstärkt die Merkmalserfassbarkeit,
so dass der Benutzer experimentelle oder Testhybridisierungssignale,
die an jedem Merkmal 106 auf dem Mikroarray 100 emittiert
werden, besser und präziser lokalisieren
kann. Der Benutzer kann entweder das komplementäre, kontrollspezifische Target 109 mit der
in der Auswertung befindlichen experimentellen Target-Probe 113 des
Benutzers mischen und einen Hybridisierungsschritt 307 durchführen oder
separat des Kontroll- Target 109 zu
den Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 und das Test-Target 113 zu
den Oligomertestsonden 112 hybridisieren, je nach Ermessen
des Benutzers. Bei einer Mischung in einer Hybridisierungslösung und
einer gleichzeitigen Hybridisierung zu dem Mikroarray 100 liefert
das Instrumentarium dem Benutzer vorteilhafterweise die Fähigkeit,
die Hybridisierungsdaten unter Verwendung der Kontrollsignale 108 und
der Testsignale zu normieren. Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel
des Instrumentariums 500 können die Oligomertestsonden 112 auf
dem Mikroarray 100 als direkt mit einer Testsondenmarkierung 114 markiert
vorgesehen sein. Die bei dem Instrumentarium 500 enthaltenen Anweisungen
informieren den Benutzer über
das bei dem Instrumentarium verwendete Kontrollmarkierungssystem 107 und über die
jeweiligen Kontrollsignale 108 (oder den Spektralbereich),
die die Kontrollmarkierungen 107 erzeugen werden. Wenn
eine direkt markierte Oligomertestsonde 112 vorgesehen ist,
informieren die Anweisungen den Benutzer über den Spektralbereich des
aus der bereitgestellten Testmarkierung emittierten Testsignals.
Zum Zweck einer Unterscheidung von den Kontrollsignalen und dem
Testsignal (falls bereitgestellt) sollte der Benutzer eine Test-Target-Markierung
an der Test-Target-Probe 113 verwenden, die ein Test-Target-Signal erzeugt, das
separat von den durch die Kontrollmarkierungen 107 erzeugten
Kontrollsignalen und den durch die in dem Instrumentarium vorgesehene
Testmarkierung bereitgestellten Testsignalen erfasst werden kann.
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Die
Vorrichtung 100 der Erfindung wird dazu verwendet, Polynukleotid-
oder Oligonukleotid-Test-Target-Proben 113 auszuwerten.
Ein Benutzer bringt die Vorrichtung 100 mit einer oder
mehreren fluoreszierend markierten Test-Target-Proben 113 in Berührung, beispielsweise
in Hybridisierungs- oder
Bindungsuntersuchungen, und fragt die Arrayvorrichtung 100 im
Anschluss an ein derartiges Inberührungbringen unter Verwendung
hinreichend bekannter herkömmlicher
Verfahren ab 207. Die Abfrage führt zu einem Ergebnis. Informationen über die Test-Target-Probe(n) 113 können aus
den Ergebnissen der Abfrage erhalten werden. Eine Abfrage wird üblicherweise
durch eine geeignete Abtastvorrichtung, wie sie oben beschrieben
wurde, bewerkstelligt, die die Position und Intensität einer
Fluoreszenz (von Fluoreszenzsignalen) an jedem Merkmal 106 des
Arrays 100 lesen oder erfassen 220, 322 kann. Eine
derartige Abtastvorrichtung kann beispielsweise der von Hewlett-Packard,
Palo Alto, Kalifornien, erhältlichen
Abtastvorrichtung GENEARRAY ähneln. Ergebnisse
aus der Abfrage 207 können
verarbeitete Ergebnisse 209 sein, beispielsweise wie diejenigen, die
herkömmlicherweise
anhand eines Zurückweisens
eines Ablesewerts für
ein Merkmal, das unter einer vorbestimmten Schwelle liegt, und/oder
durch ein Ziehen von Schlussfolgerungen auf der Basis des aus dem
Array gelesenen Musters (z.B. ob eine bestimmte Target-Sequenz in der Probe
vorgelegen haben kann) erhalten werden, oder die Ergebnisse, die unter
Verwendung der verbesserten Merkmalserfassungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung
erhalten werden, derart, dass die Position jedes Merkmals 106 mit
beträchtlicher
Gewissheit bekannt ist und die bekannten Positionen mit den Positionen
von Testsignalen (ob gedämpft
oder hell), die aus hybridisierten Oligomertestsonden 120 erfasst
werden, verglichen werden.
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Gemäß der Verwendung
in dem vorliegenden Dokument bedeutet der Begriff „Benutzer" eine Einzelperson,
eine Firma oder eine andere Organisation, oder einen Angestellten,
einen Berater, einen unabhängigen
Vertragspartner, einen Funktionsträger, leitenden Angestellten
oder dergleichen dieser Firma oder Organisation, und umfasst einen
Agenten des Benutzers, der eine Mutter- oder Tochterorganisation
des Benutzers oder des Agenten, einen Lieferanten, einen Subunternehmer,
einen Kunden oder einen Verkäufer
des Benutzers oder des Agenten oder dergleichen umfasst, der bzw.
die direkt oder indirekt von der Verwendung der Vorrichtung 100 oder von
den Informationen, die unter Verwendung der Vorrichtung 100 der
vorliegenden Erfindung gewonnen werden, profitieren mag. Ferner
können
ein oder mehrere der Benutzer der Hersteller der Vorrichtung 100 sein
und immer noch in den Schutzumfang der Erfindung fallen. Ein Benutzer
kann die Hybridisierungsuntersuchung 307 durchführen, während ein weiterer
Benutzer die Abfragung 207 an einer von der Hybridisierungsposition
entfernten Position vornehmen kann. Die Ergebnisse der Abfragung 207 (verarbeitet 209 oder
nicht) können,
falls gewünscht,
zurück
an den zuerst erwähnten
Benutzer (z.B. mittels Kommunikation) oder an eine andere entfernte
Position, geleitet werden und dort zum Zweck einer weiteren Verwendung
durch den ersten oder zweiten Benutzer oder einen wieder anderen
Benutzer empfangen werden. Überdies
kann bzw. können
sich der bzw. die Benutzer in einer Position bzw. in Positionen befinden,
die von der Position, wo die Vorrichtung 100 hergestellt
wird, entfernt ist bzw. sind. Ein Benutzer kann die Ergebnisse oder
die aus den Ergebnissen gewonnenen Informationen an eine Position kommunizieren
oder weiterleiten, die von der Position des Benutzers entfernt ist,
und dies fällt
trotzdem in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Eine Position
ist „entfernt", wenn sie zumindest
eine andere Örtlichkeit,
einschließlich,
aber nicht ausschließlich,
eines anderen Raums in einem Gebäude,
eines anderen Gebäudes,
einer anderen Stadt, eines anderen Bundesstaates oder eines anderen Landes
ist, oder wenn die Örtlichkeit
beispielsweise zumindest eine, zumindest zehn oder zumindest hundert
Meilen entfernt ist. Ein „Kommunizieren" von Informationen
bedeutet ein Senden der diese Informationen darstellenden Daten
als elektrische Signale über
einen geeigneten Kommunikationskanal (beispielsweise ein privates
oder öffentliches
Netzwerk). Ein „Weiterleiten" von Informationen
bezieht sich auf jegliches Mittel, diese Informationen von einer Örtlichkeit
zur nächsten
zu befördern,
ob mittels eines physischen Transportierens dieser Informationen oder
auf andere Weise (wo dies möglich
ist), und umfasst zumindest im Fall von Daten ein physisches Transportieren
eines Mediums, das die Daten trägt, oder
ein Kommunizieren der Daten.
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Nachdem
der Benutzer das Instrumentarium empfängt, kann der Benutzer unter
Verwendung des Mikroarrays 100 und einer Hybridisierungslösung, die
die Test-Target-Probe 113 umfasst, eine Hybridisierungsuntersuchung 307 durchführen. Je
nach dem Ausführungsbeispiel
kann der Benutzer wählen, das
markierte Kontroll-Target 109 aus dem Instrumentarium in
die Hybridisierungslösung
aufzunehmen. Die hybridisierten Oligomertestsonden 120 an dem
Mikroarray 100 sind mit einer Testmarkierung 114 assoziiert,
die ein Testsignal emittiert, wenn sie durch ein Licht angeregt
wird, das sich von den Kontrollsignalen unterscheidet, die durch
die mit den Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101, 110 assoziierten
Kontrollmarkierungen 107 erzeugt werden. Die Testmarkierung
kann auf eine Aufforderung hin in das Instrumentarium aufgenommen
werden oder kann durch den Benutzer bereitgestellt werden. Nach
dem Hybridisierungsschritt 307 kann ein Benutzer das hybridisierte
Mikroarray 100 mit einer Mikroarrayabtastvorrichtung abfragen 207.
Bei dem Schritt des Abfragens 207 werden Testsignale erfasst 322,
und Daten, die in einem Testkanal der Mikroarrayabtastvorrichtung
gesammelt werden, und Kontrollsignale erfasst 220, und
Daten in einem Kontrollkanal der Abtastvorrichtung gesammelt. Die
Daten werden anschließend analysiert 209,
damit der Benutzer Charakteristika der Test-Target-Probe 113 bestimmt.
Nachdem die Daten gesammelt wurden, können alle oder ein Teil der
Daten an eine Örtlichkeit übertragen
werden, wo sie empfangen und möglicherweise
verwendet oder analysiert werden 209.
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Die
Vorrichtung 100 und die Verfahren 200, 300, 700 und
das die Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung enthaltende
Instrumentarium weisen zumindest die folgenden Vorteile auf. Wenn
die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 zur gleichen Zeit
bezüglich
eines bekannten Kontroll-Targets 109 hybridisiert
wird, wie die Testsonde 112 mit dem Test-Target 113 hybridisiert
wird, dann kann jedes Merkmal 106 vorteilhafterweise direkt
in Bezug auf verschiedene Signaltendenzen (global oder lokal) über das
Array hinweg normiert werden. Somit können Signalgradienten über das
Array hinweg, die auf Hybridisierungsanomalien o der Abtastvorrichtungsfokussierungsprobleme
zurückzuführen sind,
kompensiert werden, da jede Sonde oder jeder Pfeiler 101 ein „Referenz"-Kontrollsignal aufweist
(das separat erfassbar ist, vorzugsweise in einem anderen Kanal),
mit dem ein Vergleich und eine Normierung durchgeführt werden
kann.
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Ferner
sind alle Merkmalspositionen 106 für ein „Sondierungs-Target" (d.h. zum Hybridisieren
von Oligomertestsonden 112 mit den Test-Target-Proben 113)
verfügbar,
statt dass ein gewisser Prozentsatz der Merkmale 106 dafür reserviert
ist, lediglich als Kontrollmerkmale zu fungieren, wie dies bei manchen
herkömmlichen
Verfahren anzutreffen ist. Dies erhöht die Nutzkapazität des Mikroarrays 100.
Des Weiteren kann, wenn eine Kontrollsonde oder ein Kontrollpfeiler 101 direkt
mit einer Kontrollmarkierung 107 markiert wird, ein gewisser
Grad einer zerstörungsfreien
Qualitätskontrolle
vor einer Hybridisierung an einem Substrat 105 durchgeführt werden,
indem einfach in dem Kanal, der für das Kontrollsignal von der
markierten Kontrollsonde bzw. dem markierten Kontrollpfeiler 101 geeignet
ist, eine Abtastung durchgeführt
wird. Und nicht zuletzt kann eine Ganzes-Oligomer-Aufbringung der
Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 dazu verwendet
werden, den Herstellungsdurchsatz zu erhöhen.
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Somit
wurden mehrere Ausführungsbeispiele
einer neuartigen Mikroarrayvorrichtung 100 mit einer verbesserten
Merkmalserfassbarkeit, Verfahren 200, 300 einer
Merkmalserfassung an dem Mikroarray 100, eines Verfahrens
zum Herstellen des Mikroarrays 100 und eines Instrumentariums,
das die Mikroarrayvorrichtung 100 umfasst und für Hybridisierungsexperimente
oder -untersuchungen verwendet wird, beschrieben. Man sollte verstehen,
dass die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele
lediglich einen Teil der vielen spezifischen Ausführungsbeispiele,
die die Prinzipien der vorliegenden Erfindung darstellen, veranschaulichen.