DE60125312T2 - Mikroarray - Google Patents

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/112499—Automated chemical analysis with sample on test slide

Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf eine Analyse von Mikroarrays. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Extrahieren von Signaldaten aus Mikroarraymerkmalen.
  • Mikroarrays von Biomolekülen, z.B. DNA, RNA, cDNA, Polynukleotiden, Oligonukleotiden („Oligomeren"), Proteinen und dergleichen sind hochmoderne biologische Hilfsmittel, die bei der Untersuchung und Auswertung biologischer Prozesse, einschließlich Genexpression, für analytische, diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden. Mikroarrays umfassen üblicherweise eine Mehrzahl von Polymeren, z.B. Oligomeren, die in situ synthetisiert oder vorsynthetisiert und auf ein Substrat in einem Arraymuster aufgebracht werden. Mikroarrays von Oligomeren, die mittels einer Festphasen-DNA-Synthese hergestellt werden, können Oligomerdichten aufweisen, die an 106/Mikrometer2 heranreichen. Gemäß der Verwendung in dem vorliegenden Dokument werden die trägergebundenen Oligomere als „Sonden" bezeichnet, die dahin gehend fungieren, eine Probe eines im Test befindlichen DNA- oder RNA-Materials, die bei Hybridisierungsexperimenten als „Target" bezeichnet wird, zu binden oder damit zu hybridisieren. Jedoch verwenden manche Forscher auch die umgekehrten Definitionen, wobei sie die oberflächengebundenen Oligonukleotide als Targets bezeichnen und die Lösungsprobe von Nukleinsäuren als Sonden. Ferner binden manche Forscher die im Test befindliche Target-Probe an das Mikroarraysubstrat und geben die Oligomersonden zum Zweck einer Hybridisierung in Lösung. Entweder das „Target" oder die „Sonden" kann bzw. können das bzw. die sein, das bzw. die durch das bzw. die jeweils andere(n) ausgewertet werden soll(en) (somit könnte(n) das eine oder die anderen ein unbekanntes Gemisch aus Polynukleotiden sein, das durch ein Binden mit dem bzw. den anderen ausgewertet soll). All diese Iterationen fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erörterung. Lediglich der Einfachheit halber ist hierin die Sonde das oberflächengebundene Oligonukleotid einer bekannten Sequenz, und das Target ist der Anteil in einer mobilen Phase (üblicherweise Fluid), der durch die oberflächengebundenen Sonden erfasst werden soll. Die Mehrzahl von Sonden und/oder Targets in jeder Position in dem Array ist in der Technik als „Nukleinsäuremerkmal" bzw. „Merkmal" bekannt. Ein Merkmal ist als Örtlichkeit definiert, auf die eine große Anzahl von Sonden und/oder Targets, die alle dieselbe Nukleotidsequenz aufweisen, immobilisiert werden.
  • Im Gebrauch wird die Arrayoberfläche mit einem oder mehreren Targets unter solchen Bedingungen in Berührung gebracht, die eine spezifische, eine hohe Affinität aufweisende Bindung (d.h. Hybridisierung) des Targets an eine oder mehrere der Sonden fördern. Die Target-Nukleinsäuren hybridisieren mit komplementären Nukleinsäuren der bekannten Oligonukleotidsondensequenzen, und somit können Informationen über die Target-Proben erhalten werden. Die Targets sind üblicherweise mit einer optisch erfassbaren Markierung, z.B. einer fluoreszierenden Kennzeichnung oder einem Fluorophor, markiert, so dass die Targets nach einer Hybridisierungsuntersuchung mit Abtastgeräten erfassbar sind. Die Targets können entweder vor den, während des oder sogar nach dem Hybridisierungsprotokoll markiert werden, je nach dem gewählten Markierungssystem, so dass sich der Fluorophor nur mit sondengebundenen hybridisierten Targets assoziiert bzw. demselben zugeordnet ist.
  • Nach der Hybridisierung der Targets mit den Sondenmerkmalen wird das Array anhand hinreichend bekannter Verfahren analysiert. Hybridisierte Arrays werden oft unter Verwendung optischer Verfahren, z.B. mit einem Abtast-Fluorometer, abgefragt. Eine fokussierte Lichtquelle (üblicherweise ein Laser) wird über das hybridisierte Array getastet, wodurch bewirkt wird, dass die hybridisierten Bereiche ein optisches Signal, z.B. Fluoreszenz, emittieren. Die Fluorophorspezifischen Fluoreszenzdaten werden während des Abtastvorgangs gesammelt und gemessen, und anschließend wird mittels geeigneter Algorithmen, Software und Computerhardware ein Bild des Arrays rekonstruiert. Die erwarteten oder beabsichtigten Positionen von Sondennukleinsäuremerkmalen können anschließend mit den an diesen Positionen gemessenen Fluoreszenzintensitäten kombiniert werden, um die Daten zu liefern, die dann dazu verwendet werden, Genexpressionsniveaus oder die Nukleinsäuresequenz der Target-Proben zu bestimmen. Der Vorgang des Sammelns von Daten aus erwarteten Sondenpositionen wird als „Merkmalsextraktion" bezeichnet. Die herkömmlichen Instrumente und Verfahren der Merkmalsextraktion sind durch ihre Abhängigkeit von der erwarteten oder beabsichtigten Position der Sondenmerkmale auf dem Substratarray, die der Genauigkeit der Mikroarrayproduktionsapparatur unterliegt, eingeschränkt.
  • Je nach der Beschaffenheit der Target-Probe kann eine Hybridisierung von Sondenmerkmalen an allen Sondenmerkmalspositionen auftreten oder auch nicht, und sie tritt in unterschiedlichem Umfang an den unterschiedlichen Sondenmerkmalspositionen auf. Ein allgemeines Problem bei dem oben beschriebenen Merkmalsextraktionsvorgang ist die Extraktion von Merkmalen, die auf Grund einer geringen oder fehlenden Hybridisierung zu der Target-Probe an diesen Positionen eine schwache oder geringe Fluoreszenzintensität aufweisen, wobei diese als „gedämpfte Merkmale" (engl.: „dim features") bezeichnet werden (d.h. sie weisen bezüglich eines Hintergrundes einen Kontrast einer geringen Intensität auf).
  • Ein Aspekt des Problems der Merkmalsextraktion ist die Position des gedämpften Merkmals. Wenn das gedämpfte Merkmal nicht durch den Herstellungsprozess präzise auf dem Arraysubstrat platziert wird (d.h. das Sondenmerkmal auf Grund des Herstellungsprozesses fehlplatziert oder schlecht positioniert ist), zählt der Computer das gedämpfte Merkmal nicht mit, und ungenaue Daten sind die Folge. Obwohl es gängige Praxis ist, Orientierungsmarkierungen (engl.: fiduciary markings) auf dem Arraysubstrat vorzusehen, mit denen die Herstellungsapparatur jeden Herstellungsschritt ausrichtet, treten trotzdem noch Fehler bei der Positionierung der Merkmale auf. Die Orientierungsmarkierungen werden auch während der Merkmalsextraktion verwendet. Die optische Abtastapparatur richtet die Lichtquelle mit den Orientierungsarraymarkierungen aus, und der Computer richtet seine vordefinierte Region zur Erfassung und Analyse mit den Orientierungsmarkierungen auf der Substratoberfläche aus.
  • Ein weiterer Aspekt des Merkmalsextraktionsproblems tritt auf, wenn das Sondenmerkmal, das nach der Hybridisierung ein schwaches Signal erzeugt, aus irgendeinem Grund fehlgestaltet ist und der Computer die unregelmäßige Form nicht erfassen kann, was zu einer unrichtigen Bewertung des Hybridisierungsgrades des Targets zu dem Sondenmerkmal führt. Die übliche Quelle fehlgestalteter Merkmale ist der Herstellungsprozess. Häufige Morphologien von fehlgestalteten Merkmalen sind ringförmige Merkmale und fußballförmige Merkmale. Andere, komplexere Morphologien wie z.B. Halbmonde sowie Defekte auf Grund von Kratzern auf der Substratoberfläche werden ebenfalls beobachtet.
  • Ein weiterer Aspekt des Merkmalsextraktionsproblems tritt auf, wenn der Durchmesser des Sondenmerkmals Schwankungen aufweist. Schwankungen des Durchmessers eines Merkmals können sich aus Oberflächenchemieproblemen auf der Oberfläche des Substrats ergeben, z.B. Veränderungen der Hydrophobie der Oberfläche. Eine Oberflächenhydrophobie, die höher ist als erwartet, führt dazu, dass das Merkmal einen geringeren Platzbedarf aufweist, da das Merkmal auf der hydrophoberen Substratoberfläche tendenziell eher zu Tröpfchen zusammenläuft. Somit kann das Merkmal an der richtigen Stelle positioniert sein und trotzdem nur die Hälfte bis zu drei Vierteln des erwarteten Durchmessers aufweisen (d.h. der Fehler ist größer als 10 Prozent des Durchmessers). Wenn der Computer die interessierende vordefinierte Region abtastet, sammelt er zusätzlich zu dem Merkmalssignal Nicht-Sonden- Merkmalsdaten. Das Merkmalssignal wird durch die zusätzlichen Daten beeinträchtigt.
  • Die Hauptschwierigkeit liegt in der Fähigkeit, mit einer gewissen Sicherheit die tatsächliche Position des Sondenmerkmals zu bestimmen, das zu dem schwachen Signal führt, um seine Erfassung durch die optischen Abtastgeräte zu gewährleisten. Ein gedämpftes Merkmal, das sich in dem Arraymuster nicht konsequent auf dem Substrat befindet, kann während des Merkmalsextraktionsprozesses verfehlt werden, falls die Analysegeräte oder die Bedienperson die wahrscheinlichen Positionen von inkonsequent platzierten Merkmalen nicht kennen bzw. kennt. Somit liefert diese Einschränkung der herkömmlichen Geräte und des herkömmlichen Verfahrens weniger genaue Ergebnisse, wenn die Fluoreszenzdaten auf die Zusammensetzung der Target-Probe hin analysiert werden.
  • Wie oben erwähnt wurde, nimmt die Dichte von Sonden auf einem Mikroarraychip ständig zu, so dass gleichzeitig mehr Gene analysiert werden können und somit Proben eingespart und Kosten verringert werden können. Ein Erzielen von kleineren und kompakteren Arrays hängt stark von der Herstellungsapparatur und der Herstellungsbearbeitung ab. Man sollte erkennen, dass, wenn Sondenarrays für eine Genanalyse dichter gepackt werden, sehr kleine Fehler bei der Sondenplatzierung die Genauigkeit der Analyse der Hybridisierungsergebnisse schwerwiegender beeinflussen.
  • Das Problem eines Lokalisierens von unkorrekt platzierten Sondenmerkmalen, die nach der Hybridisierung zu schwachen Signalen führen, wird mit abnehmender Merkmalsgröße besonders schwierig, da die relative Bedeutung von Lokalisierungsfehlern zur selben Zeit zunimmt, wie die Gesamtanzahl von Pixeln in dem Digitalarraybild, die relevante Daten enthalten, abnimmt. Ein Extrahieren von Signaldaten aus Mikroarraymerkmalen erfordert verschiedene Schemata einer Punktfindung und Tendenzumkehr, um sowohl Positionsdefekte während der Herstellung als auch Schwankungen zu kompensieren, die während der Hybridisierung (Blasen, Fokusartefakte, Oberflächenschwankungen usw.) und während des Abtastens bzw. Scannens (Autofokus, Flachheit des Glases usw.) auftreten.
  • Verfahren zum allgemeinen Lokalisieren von Merkmalen auf einem Substrat sind in der US-Patentschrift Nr. 5,721,435 offenbart, die an Troll erteilt und an die Anmelderin der vorliegenden Erfindung übertragen ist. Die Verfahren von Troll umfassen eine Mehrzahl von Referenzmarkierungen und Testpunkten auf einem Array, die, wenn sie optisch abgetastet werden, allesamt Signale erzeugen, die erfasst und ausgewertet werden, um die Position der Testpunkte zu bestimmen. Die Referenzmarkierungen weisen optisch eindeutige Signaturen auf, um sie von den Signalen von den Testpunkten zu unterscheiden. Die Referenzmarkierungen sind in bekannten Entfernungen voneinander beabstandet und dienen dazu, eine konstante Kalibrierung für die Abtastapparatur zu liefern. Die Referenzmarkierungen sind üblicherweise Lasergeätzte oder Metall-plattierte Ausrichtungsmarkierungen, die auf die Substratoberfläche geschrieben sind. Dieses Verfahren der Merkmalslokalisierung wird üblicherweise als „Koppeln" (engl.: „dead-reckoning") aus einem Gemisch von Entwurfsparametern und physischen Orientierungspunkten bezeichnet.
  • Ein weiteres Verfahren zum allgemeinen Lokalisieren von Merkmalen, das zum Lokalisieren von gedämpften Merkmalen verwendet werden kann, ist eine Benutzer-assistierte Merkmalsextraktion („von Hand"). Obwohl diese Verfahren allgemein gut bezüglich dessen funktionieren, Merkmale auf einem Substrat ohne weitere Intervention allgemein zu lokalisieren, sind sie nicht viel besser darin, gedämpfte Merkmale zu lokalisieren, die durch die Herstellungsapparatur auf dem Substrat falsch angebracht (d.h. nicht ordnungsgemäß platziert) sind. Ein Koppeln wird sowohl durch unkompensierte systematische Lokalisierungsfehler als auch durch zufällige Lokalisierungsfehler beeinträchtigt. Schließlich ist eine Benutzer-assistierte Extraktion per definitionem subjektiv und nicht automatisiert; sie ist also langsam, mühselig und anfällig für Fehler, die durch eine Ermüdung des Benutzers bewirkt werden.
  • Somit währe es vorteilhaft, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum genauen Lokalisieren von Sondenmerkmalen auf einem Mikroarray ungeachtet der Quantität und/oder Qualität des Target-spezifischen oder hybridisierten Sondensignals aufzuweisen. Ferner wäre es vorteilhaft, wenn die Vorrichtung und das Verfahren mit einer herkömmlichen Abtast- und Analyseapparatur verwendet werden könnten. Eine derartige Vorrichtung und ein derartiges Verfahren wären mit zunehmender Packungsdichte von Mikroarrays besonders sinnvoll.
  • Die US 6,077,674 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Volle-Länge-Oligonukleotidarrays, das die Reinigung von vorsynthetisierten Volle-Länge-Oligonukleotiden aus Oligonukleotiden einer kürzeren Länge und anderen Verunreinigungen zur selben Zeit vorsieht, wie die Oligonukleotide auf dem Array angeordnet werden. Ein synthetisiertes Gemisch, das gewünschte Volle-Länge-Oligonukleotide und einige Sequenzen von Oligonukleotiden einer gekappten kürzeren Länge bzw. von „fehlgeschlagenen" Oligonukleotiden umfasst, wird mit einem Verknüpfungsmittel zur Reaktion gebracht, um eine Verknüpfungsgruppe an dem freien Ende der Volle-Länge-Oligonukleotide, jedoch nicht der Kürzere-Länge-Oligonukleotide, hinzuzufügen. Das resultierende Gemisch wird auf ein Array aufgebracht, ohne dass zuerst separat das Gemisch gereinigt wird, um die unerwünschten Kürzere-Länge-Oligonukleotide zu beseitigen. Nach der Aufbringung wird ungebundenes Material, das die Kürzere-Länge-Oligonukleotidsequenzen und andere Verunreinigungen umfasst, beseitigt.
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Vorrichtung und ein Verfahren zum genaueren Lokalisieren von Merkmalen auf ei nem Mikroarray. Die Erfindung hängt nicht von der Qualität Target-spezifischer oder hybridisierter Sondensignale ab, um Merkmale zu lokalisieren, und ist ohne weiteres bezüglich einer Verwendung mit herkömmlicher Abtast- und Analyseapparatur anpassbar.
  • In Bezug auf einen Aspekt der Erfindung ist eine Mikroarrayvorrichtung mit einer verbesserten Merkmalserfassbarkeit vorgesehen, die eine Kontrollsonde umfasst, die an einem Ende an einer Oberfläche eines Mikroarraysubstrats in einem Arraymuster von Merkmalen auf dem Mikroarray angelagert ist.
  • Die Kontrollsonde umfasst eine bekannte Sequenz von Nukleinsäuren. Kontrollsonden sind in der Technik als Sonden einer spezifischen, bekannten Sequenz von Nukleinsäuren in einer bekannten Quantität bekannt, die eine Hybridisierungsuntersuchung einer im Test befindlichen Target-Probe nicht beeinträchtigen. Im Gegensatz zu der herkömmlichen Verwendung von Kontrollsonden nimmt die Kontrollsonde für die vorliegende Erfindung auf dem Mikroarray keine wertvolle Fläche ein (d.h. zweckgebundene Merkmale), sondern stattdessen wird die Kontrollsonde auf jedem Merkmal des Mikroarrays zusammen mit einer jeweiligen Oligomertestsonde bestückt (nachstehend beschrieben). Wenn die Kontrollsonde markiert ist, emittiert die Kontrollmarkierung auf eine Anregung mit Licht hin, z.B. wenn sie mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung gescannt wird, ein spezifisches Signal. Das aus der Kontrollmarkierung emittierte Signal ist von jeglichen anderen Signalen unterscheidbar, die auf einem hybridisierten oder nicht-hybridisierten Mikroarray von Oligomertestsonden verwendet werden können. Folglich ist die genaue Position jedes einzelnen Merkmals in dem Mikroarray auf der Basis des durch die markierte Kontrollsonde an jedem einzelnen Merkmal emittierten Signals separat erfassbar. Das Signal von der markierten Kontrollsonde wird vorteilhafterweise in einem separaten Kanal des Erfassungsabschnitts der Abtastapparatur erfasst, um herkömmliche Hybridisierungssignale und Erfassungskanäle nicht zu beeinträchtigen.
  • Die Vorrichtung umfasst ferner eine Oligomertestsonde, die ebenfalls an jedem Merkmal positioniert ist. Somit ist der Begriff „Merkmal" für die Zwecke der Erfindung als Örtlichkeit definiert, die sowohl eine Kontrollsonde als auch eine daran immobilisierte Oligomertestsonde umfasst. Bei einem ersten Ausführungsbeispiel der Vorrichtung ist die Oligomertestsonde an einem gegenüberliegenden Ende der Kontrollsonde angelagert. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die Kontrollsonde als Kontrollpfeiler bezeichnet. Der Kontrollpfeiler wird zu einer Verlängerung zwischen der Oberfläche des Mikroarraysubstrats und der Oligomertestsonde. Bei diesem Ausführungsbeispiel besteht zwischen der Kontrollpfeiler-Quantität und der Oligomertestsonde-Quantität vorteilhafterweise eine Entsprechung von 1:1. Bei einem zweiten Ausführungsbeispiel ist die Oligomertestsonde an der Substratoberfläche an jeder Merkmalsposition angelagert. Bei diesem Ausführungsbeispiel besteht zwischen Kontrollsonde-Quantität und Oligomertestsonde-Quantität keine Korrelation von 1:1.
  • Vorzugsweise ist die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler und die Oligomertestsonde jeweils mit einer Markierung assoziiert, nämlich einer Kontrollmarkierung bzw. einer Testmarkierung. Die Kontrollmarkierung emittiert ein Signal, das sich von einem durch die Testmarkierung emittierten Signal unterscheidet, so dass die Signale durch die Abtastapparatur unterscheidbar und getrennt erfassbar sind. Die Abtastapparatur erfasst das Kontrollsignal in einem Kontrollerfassungskanal der Abtastapparatur und erfasst das Testsignal vorzugsweise in einem separaten Testerfassungskanal der Abtastvorrichung.
  • Die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler kann direkt oder indirekt mit einer Kontrollmarkierung assoziiert sein. Mit direkt assoziiert ist gemeint, dass die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler eine Kontrollmarkierung umfasst, die direkt an derselben bzw. demselben angelagert (d.h. als Markierung direkt angebracht) ist. Wenn die Kontrollmarkierung an jeder Merkmalsposition an der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler angelagert oder mit derselben bzw. demselben direkt assoziiert ist, so ist die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise nützlich für zerstörungsfreie Qualitätskontrollauswertungen des Arrays vor einem Hybridisierungsexperiment, sowohl vor als auch nach einem Bestücken des Mikroarrays mit Oligomertestsonden. Bei einer direkt markierten Kontrollsonde oder einem direkt markierten Kontrollpfeiler ist es möglich, alle Merkmale abzutasten und zu erfassen, ohne jemals das Array hybridisiert zu haben. Desgleichen kann die Oligomertestsonde direkt mit einer Testmarkierung markiert sein.
  • Mit indirekt assoziiert ist gemeint, dass die Kontrollmarkierung an einem komplementären, kontrollspezifischen Target-Material angelagert oder mit demselben assoziiert ist. Desgleichen ist die Testmarkierung an einer im Test befindlichen Target-Probe angelagert oder einer solchen zugeordnet. Die Merkmale an dem Mikroarray werden markiert (d.h. indirekt mit einer jeweiligen Markierung assoziiert), wenn die markierten Kontroll-Targets und die markierten Test-Targets zu den Kontrollsonden oder bzw. -pfeilern bzw. Oligomertestsonden an der Mikroarrayvorrichtung hybridisiert sind. Die markierten Kontroll-Targets hybridisieren lediglich mit den Kontrollproben oder -pfeilern, und die markierten Test-Targets hybridisieren lediglich mit den Oligomertestsonden. Die markierten Kontroll-Targets werden vorzugsweise in Verbindung mit (d.h. während desselben Hybridisierungsschritts) der Hybridisierung des Test-Target-Materials zu Oligomertestsonden hybridisiert. Wenn das hybridisierte Mikroarray abgetastet wird, werden zumindest zwei unterschiedliche Signale aus jedem Merkmal emittiert, wenn das Test-Target an einem jeweiligen Merkmal zu den Oligomertestsonden zu den Oligomertestsonden hybridisiert ist. Die Signale von der Kontrollmarkierung an jeder Merk malsposition werden getrennt voneinander und getrennt von den Testmarkierungen an jeder Merkmalsposition erfasst. Wenn die Kontrollmarkierung in demselben Hybridisierungsschritt mit dem markierten Test-Target in die Kontrollsonde oder den Kontrollpfeiler indirekt unter Verwendung eines markierten Kontroll-Targets eingebracht wird, kann vorteilhafterweise jedes Merkmal an dem Mikroarray für verschiedene Signaltendenzen (global oder lokal) über das Array hinweg direkt normiert werden.
  • Bei einer wieder anderen Art und Weise, die Kontrollsonde bzw. den Kontrollpfeiler gemäß der Erfindung zu markieren, wird die Kontrollsonde sowohl direkt markiert als auch indirekt markiert, wie oben beschrieben ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel können vorteilhafterweise sowohl eine zerstörungsfreie Vorhybridisierungs-Qualitätskontrolle als auch eine -Merkmalslokalisierung durchgeführt werden, indem bezüglich der Signale von der Kontrollsondenmarkierung abgetastet wird, bevor oder nachdem das Mikroarray mit Oligomertestsonden besetzt wird und/oder vor einer Hybridisierung, sowie eine Nachhybridisierungs-Merkmalslokalisierung und/oder -Extraktion mit einer Normierung von Hybridisierungsdaten, wie oben beschrieben wurde, unter Verwendung der Signale von der Kontroll-Target-Markierung.
  • Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird bei Hybridisierungsexperimenten verwendet und ist besonders nützlich beim Erfassen aller Merkmalspositionen, ungeachtet der Qualität des Signals von hybridisierten Testsonden, ungeachtet der Qualität der Platzierung der Oligomertestsonden und ungeachtet der Form des Merkmals. Die in dem separaten Kontrollkanal gesammelten Signale werden dazu verwendet, eine Merkmalslokalisierung zu unterstützen, insbesondere bei geringfügigen oder gedämpften Signalmerkmalen.
  • Bei einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Mikroarrayvorrichtung mit einer verbesserten Merkmalserfassbarkeit vorgesehen. Die Mikroarrayvorrichtung umfasst eine Oligomertestsonde, die in einem Arraymuster von Merkmalen auf einem Substrat angelagert ist, wie es herkömmlicherweise vorgesehen sein kann. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfasst die Vorrichtung ferner eine Kontrollsequenz von Nukleinsäuren, die an einem Ende an einer Oberfläche des Substrats an jeder Merkmalsposition angelagert sind. Die Kontrollsequenz ist mit einer Kontrollmarkierung assoziiert, die, wenn sie durch ein Licht angeregt wird, ein Kontrollsignal emittiert. Wenn es mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung abgetastet wird, erzeugt jedes Merkmal das Kontrollsignal, wodurch die Position jedes Merkmals identifiziert wird, ungeachtet dessen, ob (und in welchem Umfang) die Oligomertestsonden während einer Hybridisierungsuntersuchung mit einer im Test befindlichen Target-Probe hybridisiert werden.
  • Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchführen einer zerstörungsfreien Qualitätskontrollauswertung an einem Mikroarray gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 vorgesehen. Das Verfahren zum Durchführen umfasst folgende Schritte:
    Abtasten des Mikroarraysubstrats mit einem Licht, um jede markierte Kontrollsonde anzuregen; und Erfassen des Kontrollsignals von der markierten Kontrollsonde an jedem Merkmal und Auswerten von Daten, die über die erfassten Kontrollsequenzen gesammelt wurden. Vorzugsweise umfasst das Verfahren zum Durchführen ferner den Schritt des Lieferns einer Oligomertestsonde an jedes Merkmal. Jedes Mikroarraysubstrat kann zweckmäßigerweise bezüglich der genauen Position jedes Merkmals abgebildet sein. Alternativ dazu kann die genaue Position jedes Merkmals an dem Mikroarraysubstrat vor nachfolgenden Aufbringungen, z.B. dem nachfolgenden Schritt des Bereitstellens der Oligomertestsonden, bestätigt oder modifiziert werden. Diese Informationen könnten in einem Instrumentarium, das nachstehend näher beschrieben wird, einem Benutzer zur Verfügung gestellt werden.
  • Jedes Merkmal an dem Mikroarray umfasst eine Kontrollsonde und eine Oligomertestsonde. Ferner emittiert jedes Merkmal, je nach dem Ausführungsbeispiel, vor und/oder nach einer Hybridisierungsuntersuchung das charakteristische Kontrollsignal, wenn es belichtet wird. Das charakteristische Kontrollsignal wird dazu verwendet, jedes Merkmal zu lokalisieren, ungeachtet der Qualität oder des Umfangs der Hybridisierung zwischen Oligomertestsonden und einer im Test befindlichen Target-Probe.
  • Bei einem Ausführungsbeispiel des Verfahrens zum Herstellen umfasst der Schritt des Bereitstellens der Oligomertestsonde ein Hinzufügen der Oligomertestsonde zu einem gegenüberliegenden Ende der Kontrollsonde, so dass die Kontrollsonde sich zwischen der Oberfläche des Substrats und der Oligomertestsonde erstreckt. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Kontrollsonde ein Kontrollpfeiler. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel des Verfahrens umfasst der Schritt des Bereitstellens der Oligomertestsonde den Schritt des Hinzufügens der Oligomertestsonde zu der Substratoberfläche an jeder Merkmalsposition. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens zum Herstellen wird die Kontrollsonde an jedem Merkmal als vorsynthetisiertes ganzes Oligonukleotid bereitgestellt, und die Oligomertestsonde wird an jeder Merkmalsposition in situ synthestisiert. Stärker bevorzugt wird die Oligomertestsonde an dem gegenüberliegenden Ende der vorsynthetisierten Kontrollsonde an jeder Merkmalsposition in situ synthetisiert.
  • Bei einem wieder anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Instrumentarium vorgesehen. Das Instrumentarium umfasst die Mikroarrayvorrichtung der vorliegenden Erfindung, die mit Kontrollsonden und Oligomertestsonden bestückt ist, wie oben beschrieben, und Anweisungen über die Verwendung des Instrumentariums. Bei einem Ausführungsbeispiel des Instrumentariums sind die Kontrollsonden direkt mit einer Kontrollsondenmarkierung markiert. Bei einem anderen Aus führungsbeispiel sind die Kontrollsonden nicht direkt markiert. Das Instrumentarium umfasst ferner ein komplementäres, kontrollspezifisches Target-Material, das eine Kontroll-Target-Markierung aufweist, die während Hybridisierungsexperimenten verwendet werden soll, um an jedem Merkmal emittierte experimentelle Hybridisierungssignale besser und präziser zu lokalisieren. Das komplementäre, kontrollspezifische Target kann mit der im Test befindlichen experimentellen Target-Probe gemischt werden, um einen Hybridisierungsschritt durchzuführen, oder das Kontroll-Target kann nach Ermessen eines Benutzers getrennt von dem Test-Target, das zu den Oligomertestsonden hybridisiert wird, zu den Kontrollsonden hybridisiert werden. Dort, wo die Kontrollsonden direkt markiert sind, kann das Instrumentarium ferner entweder Qualitätskontrollreferenzdaten umfassen, um den Benutzer während einer Merkmalsextraktion zu unterstützen, oder in dem Instrumentarium können Anweisungen darüber enthalten sein, wie eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollauswertung an dem Mikroarray ausgeführt werden kann.
  • Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Inberührungbringens des Mikroarrays mit einer Hybridisierungslösung, die eine im Test befindliche Target-Probe umfasst. Dort, wo die Kontrollmarkierung eine Kontrollsondenmarkierung umfasst, die direkt an den Kontrollsonden assoziiert ist, und eine separate Kontroll-Target-Markierung umfasst, die durch Hybridisierung indirekt mit der Kontrollsonde assoziiert ist, umfasst die Hybridisierungslösung ferner das markierte Kontroll-Target-Material. Während des Abfrageschrittes kann jede Merkmalsposition vor einer Hybridisierung identifiziert werden, indem das Kontrollsondensignal zu Qualitätskontrollzwecken oder in Bezug auf Referenzdaten erfasst wird, und nach der Hybridisierung können die hybridisierten Oligomertestsonden lokalisiert werden, indem die Testsignale von den hybridisierten Testsonden und die Kontroll-Target-Signale von den hybridisierten Kontrollsonden erfasst werden. Die von den erfassten Kontroll-Target-Signalen gesammelten Daten unter stützen ein Normieren der Hybridisierungsdaten für die Test-Target-Proben. Das Testsignal und vorzugsweise jedes des Kontrollsignals bzw. der Kontrollsignale werden in separaten Kanälen des Erfassungssystems der Mikroarray-Abtastvorrichtung separat erfasst.
  • Die vorliegende Erfindung liefert viele Vorteile, z.B. den Vorteil, in der Lage zu sein, jedes Merkmal ungeachtet der Qualität oder Quantität der Test-Target-Signale präzise zu lokalisieren. Somit kann eine Merkmalsextraktion Merkmale potentiell viel genauer und präziser finden als mittels einer einfachen Gitteranpassung und eines Interpolierens von Positionen von geringfügigen Signalmerkmalen.
  • Die verschiedenen Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung, die in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen zu sehen ist, besser verständlich, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche strukturelle Elemente bezeichnen und wobei:
  • 1 eine Teilseitenansicht der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
  • 2 eine Teilseitenansicht eines Ausführungsbeispiels der Vorrichtung der 1 veranschaulicht;
  • 3 eine Teilseitenansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels der Vorrichtung der 1 veranschaulicht;
  • 4 eine perspektivische Teilansicht eines hybridisierten Mikroarrays unter Verwendung der Vorrichtung der 2 veranschaulicht;
  • 5 eine perspektivische Teilansicht eines hybridisierten Mikroarrays, das die Vorrichtung der 3 verwendet, veranschaulicht;
  • 6 ein Blockdiagramm eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
  • 7 ein Blockdiagramm eines weiteren Verfahrens der vorliegenden Erfindung veranschaulicht; und
  • 8 ein Blockdiagramm mehrerer Ausführungsbeispiele des Verfahrens der 7 veranschaulicht.
  • Definitionen
  • Die folgenden Begriffe sollen gemäß der Verwendung in dem vorliegenden Dokument die folgenden allgemeinen Bedeutungen aufweisen:
    Polynukleotid – eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nukleotid oder ein Nukleinsäurepolymer ist. Das Polynukleotid kann eine natürliche Verbindung oder eine synthetische Verbindung sein. Im Kontext einer Untersuchung kann das Polynukleotid kann von etwa 50 bis 5.000.000 oder mehr Nukleotide aufweisen. Die größeren Polynukleotide liegen allgemein im natürlichen Zustand vor. In einem isolierten Zustand kann das Polynukleotid etwa 30 bis 50.000 oder mehr Nukleotide, üblicherweise etwa 100 bis 20.000 Nukleotide, häufiger 500 bis 10.000 Nukleotide, aufweisen. Somit ist es offensichtlich, dass eine Isolierung eines Polynukleotids aus dem natürlichen Zustand oft zu einer Fragmentierung führt. Die Polynukleotide umfassen Nukleinsäuren, und Fragmente derselben, von jeglicher Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, einschließlich DNA, doppelsträngig oder einsträngig (dsDNA und ssDNA) und RNA, einschließlich t-RNA, m-RNA, r-RNA, Mitochondrien-DNA und -RNA, Chloroplast-DNA und -RNA, DNA/RNA-Hybride oder Gemische derselben, Gene, Chromosomen, Plasmiden, der Genome von biologischen Materialen wie z. B. Mikroorganismen, z. B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Pil zen, Pflanzen, Tieren, Menschen und dergleichen. Das Polynukleotid kann auch lediglich eine untergeordnete Fraktion eines komplexen Gemisches wie z. B. einer biologischen Probe sein. Ebenfalls enthalten sind Gene, z. B. Hämoglobin-Gen für Sichelzellenanämie, Zystische-Fibrose-Gen, Onkogene, cDNA und dergleichen.
  • Polynukleotide umfassen Analoga von in der Natur vorkommenden Polynukleotiden, bei denen ein oder mehrere Nukleotide im Vergleich zu in der Natur vorkommenden Nukleotiden modifiziert sind. Somit umfassen Polynukleotide Verbindungen, die synthetisch hergestellt sind (z.B. PNA, wie sie in der US-Patentschrift Nr. 5,948,902 und den darin erwähnten Referenzdokumenten beschrieben ist, die in einer sequenzspezifischen Weise, die analog zu der von zwei in der Natur vorkommenden Polynukleotiden ist, hybridisieren kann.
  • Das Polynukleotid kann mittels Prozeduren, die in der Technik hinreichend bekannt sind, aus verschiedenen biologischen Materialien gewonnen werden. Wo es angebracht ist, kann das Polynukleotid gespalten werden, um ein Fragment zu erhalten, das eine Targetnukleotidsequenz enthält, z. B. durch Scheren oder durch eine Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease oder anhand eines anderen Verfahrens einer stellenspezifischen chemischen Spaltung, z. B. eines begrenzten RNase-Aufschlusses, um kleinere RNA-Fragmente zu erzeugen.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist das Polynukleotid, oder ein aus dem Polynukleotid gewonnenes gespaltenes Fragment, üblicherweise zumindest teilweise denaturiert oder einsträngig, oder es wird behandelt, damit es denaturiert oder einsträngig wird. Derartige Behandlungen sind in der Technik hinreichend bekannt und umfassen z. B. eine Wärme- oder Alkalibehandlung oder einen enzymatischen Aufschluss eines Stranges. Beispielsweise kann doppelsträngige DNA (dsDNA) über einen Zeitraum von etwa 1 bis 10 Minuten bei 90–100°C erhitzt werden, um ein denatu riertes Material zu erzeugen, wohingegen eine mittels einer Transkription von einer dsDNA-Matrize erzeugte RNA bereits einsträngig ist.
  • Oligonukleotid – ein Polynukleotid, üblicherweise einsträngig, üblicherweise ein synthetisches Polynukleotid, das jedoch auch ein natürlich vorkommendes Polynukleotid sein kann. Das bzw. die Oligonukleotid(e) bestehen üblicherweise aus einer Sequenz einer Länge von zumindest 5 Nukleotiden, üblicherweise 10 bis 100 Nukleotiden, noch üblicher 20 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 10 bis 30 Nukleotiden, stärker bevorzugt 20 bis 30 Nukleotiden, und wünschenswerterweise etwa 25 Nukleotiden.
  • Zum Herstellen eines Oligonukleotids können verschiedene Techniken eingesetzt werden. Derartige Oligonukleotide können mittels biologischer Synthese oder mittels chemischer Synthese erhalten werden. Für kurze Oligonukleotide (bis zu etwa 100 Nukleotiden) ist die chemische Synthese im Vergleich zur biologischen Synthese häufig wirtschaftlicher. Zusätzlich zur Wirtschaftlichkeit liefert die chemische Synthese eine zweckmäßige Art und Weise, Verbindungen von niedriger relativer Molekülmasse und/oder modifizierte Basen während spezifischer Syntheseschritte zu integrieren. Ferner ist die chemische Analyse sehr flexibel bei der Wahl der Länge und der Region einer Targetpolynukleotidbindungssequenz. Das Oligonukleotid kann mittels standardmäßiger Verfahren synthetisiert werden, z. B. mittels derjenigen, die bei kommerziellen automatisierten Nukleinsäuresynthetisierern verwendet werden. Die chemische Synthese einer DNA auf einem geeignet modifizierten Glas oder Harz kann zu einer kovalent an die Oberfläche gebundenen DNA führen. Dies kann Vorteile bezüglich des Waschens und des Handhabens der Probe bieten. Bei längeren Sequenzen können standardmäßige Replikationsverfahren, die in der Molekularbiologie eingesetzt werden, verwendet werden, z.B. die Verwendung von M13 für eine einsträngige DNA, wie sie bei J. Messing (1983) Methods Enzymol. 101:20-78 beschrieben ist.
  • Eine In-situ-Synthese von Oligonukleotid- oder Polynukleotidsonden auf dem Substrat wird gemäß hinreichend bekannter chemischer Prozesse durchgeführt, einschließlich, aber nicht ausschließlich, einer sequentiellen Hinzufügung von Nukleotid-Phosphoramiditen zu oberflächenverbundenen Hydroxylgruppen, wie z.B. von T. Brown und Dorcas J. S. Brown in Oligonukleotides and Analogues A Practical Approach, F. Eckstein, Herausgeber, Oxford University Press, Oxford, S. 1–24 (1991), beschrieben. Eine indirekte Synthese kann gemäß biosynthetischen Techniken (z.B. Polymerasekettenreaktion „PCR" – polymerase chain reaction) durchgeführt werden, wie bei Sambrook, J. et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausgabe 1989, beschrieben.
  • Andere Verfahren der Oligonukleotid-Synthese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, eine Festphasen-Oligonukleotid-Synthese gemäß den Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfahren (Narang, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90) und gemäß dem H-Phosphonat-Verfahren (Garegg, P. J., et al., (1985) „Formation of internukleotidic bonds via phosphonate intermediates", Chem. Scripta 25, 280–282; und Froehler, B. C., et al., (1986a) „Synthesis of DNA via deoxynukleoside H-phosphonate intermediates", Nukleic Acid Res., 14, 5399–5407, unter anderem) und eine Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859–1862) sowie Phosphoramidit-Techniken (Caruthers, M. H., et al., „Methods in Enzymology," Vol. 154, S. 287–314 (1988) und andere, die bei „Synthesis and Applications of DNA and RNA," S. A. Narang, Herausgeber, Academic Press, New York, 1987, und in den dort enthaltenen Referenzdokumenten beschrieben sind, und Nicht-Phosphoramidit-Techniken. Die chemische Synthese mittels eines photolithographischen Verfahrens von räumlich adressierbaren Arrays von an Glasoberflächen gebundenen Oligonukleotiden wird von A. C. Pease, et al., Proc. Nat. Aca. Sci. USA (1994) 91:5022–5026, beschrieben. Eine Oligoribonukleotid-Synthese, die eine Phagen-RNA-Polymerase und Ribonukleosid-Triphosphate verwen det, wird von Milligan, J. F., et al., (1987) „Oligoribonukleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates", Nucl. Acids Res. 15, 8783–8798, beschrieben; und eine Verwendung von geschützten Ribonukleosid-Phosphoramiditen und einer chemischen Synthese wird von Wu T., et al., (1989) „Prevention of chain cleavage in the chemical synthesis of 2'-O-silylated oligoribonukleotides", Nucl. Acids Res. 17, 3501–3517, unter anderen, beschrieben.
  • Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Begriff „Oligonukleotid" den Begriff „Polynukleotid", wenn nichts anderes angegeben ist.
  • Oligomertestsonde – ein Oligonukleotid, das dazu verwendet wird, sich an eine im Test befindliche Target-Probe zu binden. Der Entwurf und die Herstellung der Oligonukleotidtestsonden hängen allgemein von der erforderlichen Sensitivität und Spezifität, der Abfolge des Test-Targets und, in manchen Fällen, von der biologischen Bedeutung bestimmter Abschnitte der Target-Polynukleotidsequenz ab. Üblicherweise unterschieden sich die bei einem Experiment verwendeten Oligomertestsonden voneinander, um verschiedene Test-Target-Sequenzen oder verschiedene Teile einer Test-Target-Sequenz anzugehen.
  • Test-Target oder im Test befindliche Target-Probe – eine Probe, die eine Sequenz von Nukleotiden umfasst, die üblicherweise in einem Abschnitt oder in einer gesamten Polynukleotid-Testprobe vorliegen, üblicherweise ein zu charakterisierender Polynukleotid-Analyt. Die Identität der Target-Nukleotid-Sequenz ist allgemein in einem Umfang bekannt, der ausreichend ist, um eine Herstellung verschiedener Oligomertestsondensequenzen, die mit der Test-Target-Nukleotid-Sequenz hybridisierbar sind, zu ermöglichen. Das Test-Target weist eine oder mehrere unbekannte Charakteristika auf, die unter Verwendung von Oligomertestsonden experimentell zu ermitteln sind.
  • Die Test-Target-Sequenz enthält üblicherweise von etwa 30 bis 5.000 oder mehr Nukleotide, vorzugsweise 50 bis 1.000 Nukleotide. Die Test-Target-Nukleotid-Sequenz ist allgemein ein Teil eines größeren Moleküls, oder sie kann im Wesentlichen das ganze Molekül sein, wie z.B. ein Polynukleotid, wie oben beschrieben. Die minimale Anzahl von Nukleotiden in der Test-Target-Nukleotid-Sequenz ist dahin gehend ausgewählt, zu gewährleisten, dass das Vorliegen eines Target-Polynukleotids in einer Probe ein spezifischer Indikator des Vorliegens von Polynukleotid in einer Probe ist. Die maximale Anzahl von Nukleotiden in der Test-Target-Nukleotid-Sequenz wird normalerweise von mehreren Faktoren geregelt: der Länge des Polynukleotids, von dem sie abgeleitet ist, der Tendenz eines derartigen Polynukleotids, durch Scheren oder andere Prozesse während einer Isolierung gebrochen zu werden, der Effizienz jeglicher Prozeduren, die erforderlich ist, um die Probe auf eine Analyse (z.B. Transkription einer DNA-Matrize in eine RNA) vorzubereiten, und der Effizienz einer Erfassung und/oder Vervielfachung der Target-Nukleotid-Sequenz, wo dies angebracht ist.
  • Kontrollsonde oder Kontrollsequenz – ein Oligonukleotid oder Oligomer, das eine bekannte Sequenz von Nukleotiden in einer bekannten Menge aufweist, von dem man statistisch weiß, dass es eine Oligomertestsonde oder eine im Test befindliche Target-Probe nicht hybridisiert oder dieselbe auf andere Weise beeinträchtigt. Ein Kontrollpfeiler ist eine Kontrollsonde, die an einem Ende mit einer Oligomertestsonde verbunden ist, während ein gegenüberliegendes Ende an einer Oberfläche eines Arraysubstrats angelagert oder immobilisiert ist. Die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler ist ein Standard oder eine Referenz, der bzw. die zum Vergleich mit experimentellen Ergebnissen verwendet wird. Die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler ist keine Oligomertestsonde und fungiert auch nicht als solche, und hybridisiert somit nicht mit einer Test-Target-Probe (und beeinflusst auch nicht die Hybridisierung einer solchen).
  • Kontrollspezifisches Target oder Kontroll-Target – ein Oligonukleotid, das eine bekannte Sequenz von Nukleotiden in einer bekannten Menge aufweist, das zu einer Kontrollsonde oder einem Kontrollpfeiler besonders oder auf spezifische Weise komplementär ist. Statistisch weiß man, dass das Kontroll-Target nicht mit einer Oligomertestsonde oder einer im Test befindlichen Target-Probe hybridisiert oder eine solche auf andere Weise beeinflusst. Das Kontroll-Target ist ein Standard oder eine Referenz, der bzw. die bei Experimenten verwendet wird, die die Kontrollsonde oder den Kontrollpfeiler umfassen. Die Charakteristika des Kontroll-Targets sind bekannt, und somit ist die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler keine Test-Target-Probe und fungiert auch nicht als solche, und hybridisiert nicht mit einer Oligomer-Test-Sonde (und beeinflusst auch nicht die Hybridisierung einer solchen).
  • Monomer – ein Angehöriger des Satzes von kleinen Molekülen, die aneinander gefügt werden können, um ein Polymer zu bilden. Gemäß der Verwendung hierin bezieht sich Monomer auf einen beliebigen Angehörigen eines Basissatzes für eine Synthese eines Polymers. Das Monomer kann natürlich oder synthetisch sein. In aufeinander folgenden Schritten bei der Synthese eines Polymers können verschiedene Monomere verwendet werden.
  • Ferner kann ein Monomer geschützte Angehörige umfassen, die nach einer Synthese modifiziert sind. Ein modifiziertes Monomer ist ein in der Natur vorkommendes Monomer, das aus einer natürlichen Quelle erhalten oder synthetisch hergestellt wird, das chemisch modifiziert ist, um eine oder mehrere Gruppen oder Bindungen, die in dem Monomer enthalten sind, hinzuzufügen, zu ersetzen, zu beseitigen oder auf andere Weise zu verändern.
  • Nukleotid – die monomere Einheit von Nukleotidsäurepolymeren, d.h. DNA und RNA, ob aus einer natürlichen Quelle gewonnen oder synthetisch hergestellt, die eine stickstoffhaltige heterozyklische Base umfasst, die ein Derivat entweder eines Purins oder eines Pyrimidins, ein Pentosezucker und ein Phosphat (oder eine Phosphorsäure) ist. Wenn das Phosphat beseitigt ist, ist die verbleibende monomere Einheit ein „Nukleosid". Somit ist ein Nukleotid ein 5'-Phosphat des entsprechenden Nukleosids. Wenn die stickstoffhaltige Base aus dem Nukleotid entfernt wird, ist die verbleibende monomere Einheit ein „Phosphodiester". Für die Zwecke der Erfindung umfasst „Nukleotid" sein entsprechendes Nukleosid und seinen entsprechenden Phosphodiester, und „Oligonukleotid" umfasst sein entsprechendes Oligonukleosid und seinen entsprechenden Oligophosphodiester, wenn nichts anderes angegeben ist.
  • Modifiziertes Nukleotid – ein modifiziertes Monomer in einem Nukleinsäurepolymer, das eine modifizierte Base, Zucker und/oder Phosphatgruppe enthält. Das modifizierte Nukleotid kann in der Natur vorkommen oder mittels einer chemischen Modifikation eines Nukleotids entweder als Teil des Nukleinsäurepolymers oder vor der Integration des modifizierten Nukleotids in das Nukleinsäurepolymer hergestellt werden. Beispielsweise können die oben erwähnten Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids eingesetzt werden. Bei einem anderen Lösungsansatz kann ein modifiziertes Nukleotid erzeugt werden, indem ein modifiziertes Nukleosidtriphosphat während einer Vervielfachungsreaktion in die Polymerkette integriert wird. Beispiele von modifizierten Nukleotiden umfassen, zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung, Dideoxynukleotide, Derivate oder Analoga, die biotinyliert, Amin-modifiziert, alkyliert, Fluorophor-markiert und dergleichen sind, und umfassen ferner Phosphorthioat, Phosphit, Ringatom-modifizierte Derivate und so weiter.
  • Hybridisierung (Hybridisieren) oder Binden – im Zusammenhang mit Nukleotid-Sequenzen werden diese Begriffe hierin in der Bedeutung von miteinander assoziieren bzw. einander zugeordnet sein austauschbar verwendet. Die Fähigkeit zweier Nukleotid-Sequenzen, miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Grad der Komplementarität der beiden Nukleotid-Sequenzen, die wiederum auf dem Anteil von passenden komplementären Nukleotid-Paaren beruht. Je mehr Nukleotide in einer gegebenen Sequenz zu einer anderen Sequenz komplementär sind, desto strikter können die Bedingungen für eine Hybridisierung sein, und desto spezifischer ist die Bindung der beiden Sequenzen. Eine erhöhte Striktheit wird erzielt, indem die Temperatur erhöht wird, das Verhältnis von Hilfslösungsmitteln erhöht wird, die Salzkonzentration verringert wird und dergleichen. Hybridisierungslösungen und Prozesse zur Hybridisierung sind bei J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2. Ausgabe, 1989, Vol. 1–3, beschrieben. Bedingungen für eine Hybridisierung umfassen üblicherweise (1) eine Lösung mit hoher Ionenstärke, (2) bei einer kontrollierten Temperatur und (3) in der Gegenwart einer Träger-DNA und von Reinigungsmitteln und zweiwertigen Kation-Chelatbildnern, die allesamt in der Technik hinreichend bekannt sind.
  • Komplementär – ein Begriff, der auf die Affinität bezogen ist, die ein biologisches Material bezüglich eines Bindens an ein anderes biologisches Material, z.B. Angehörige eines spezifisches Bindungspaares, wie nachstehend definiert wird, aufweist. In Bezug auf Nukleotidkomplemente sind zwei Sequenzen komplementär, wenn sich die Sequenz von einem in einem antiparallelen Sinn an die Sequenz des anderen binden kann, wobei sich das 3'-Ende einer Sequenz an das 5'-Ende der anderen Sequenz bindet und jedes A, T(U), G und C einer Sequenz dann mit einem T(U), A, C bzw. G der anderen Sequenz ausgerichtet ist. Bei Nukleotidkomplementen ist auch eine nicht-standardmäßige Paarbildung von Basen möglich, beispielsweise können die Sequenzen zueinander parallel sein und es kann eine Nicht-Watson-Crick-Basenpaarbildung erfolgen. Beispiele der letzteren sind komplementäre G=U- oder U=G-Basenpaare in RNA-Sequenzen oder komplementäre G=T- oder T=G-Basenpaare in DNA-Sequenzen.
  • Substrat oder Oberfläche – ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches Material. Die Oberfläche eine beliebige einer Anzahl von Formen aufweisen, z.B. Streifen, Platte, Scheibe, Stab, Partikel, einschließlich Kügelchen, und dergleichen. Das Substrat kann hydrophob oder hydrophil oder in der Lage sein, hydrophob oder hydrophil gemacht zu werden, und es umfasst anorganische Pulver wie z.B. Siliziumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere zellulosische Materialien, die von Zellulose herrühren, z.B. faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, chromatographisches Papier usw.; synthetische oder modifizierte, in der Natur vorkommende Polymere wie z.B. Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyren, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) usw.; die entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet werden; Glas, das als Bioglass erhältlich ist, Keramik, Metalle und dergleichen. Natürliche oder synthetische Anordnungen wie z.B. Liposome, Phospholipidbläschen und Zellen können ebenfalls verwendet werden. Häufige Substrate, die für Arrays verwendet werden, sind Oberflächen-derivatisiertes Glas oder Siliziumdioxid oder Polymermembranoberflächen, wie sie bei Z. Guo et al. (oben erwähnt) und U. Maskos, E. M. Southern, Nukleic Acids Res 20, 1679–84 (1992) und E. M. Southern et al., Nukleic Acids Res 22, 1368–73 (1994), beschrieben sind.
  • Eine Immobilisierung von Oligonukleotiden auf einem Substrat oder einer Oberfläche kann mittels hinreichend bekannter Techniken, die gewöhnlich in der Literatur zu fin den sind, bewerkstelligt werden. Siehe z.B. A. C. Pease, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:5022-5026 (1994); Z. Guo, R. A. Guilfoyle, A. J. Thiel, R. Wang, L. M. Smith, Nukleic Acids Res 22, 5456–65 (1994); und M. Schena, D. Shalon, R. W. Davis, P. 0. Brown, Science, 270, 467–70 (1995). Aus den oben erwähnten Referenzdokumenten sind Linker bekannt. Für die Zwecke der Erfindung umfasst eine Substratoberfläche eine Oberfläche, die Linker oder andere Mittel zur Immobilisierung oder Anlagerung von Oligonukleotiden umfasst, und ein Oligonukleotid, das an einer Oberfläche angelagert, zu einer solchen hinzugefügt oder an einer solchen vorgesehen ist, umfasst eine Anlagerung an, eine Hinzufügung an oder ein Vorsehen an einem Linker auf der Oberfläche. Ebenfalls für die Zwecke der Erfindung ist ein Linker keine Kontrollsonde und kein Kontroll-Target.
  • Markierung – ein Angehöriger eines Signalerzeugungssystems. Üblicherweise ist die Markierung ein Teil einer Target-Nukleotid-Sequenz oder einer Oligonukleotidsonde, der entweder zu derselben konjugiert ist oder auf andere Weise an dieselbe gebunden oder mit derselben assoziiert ist. Die Markierung ist in der Lage, direkt oder indirekt erfasst zu werden. Markierungen umfassen (i) Reportermoleküle, die auf Grund eines Erzeugens eines Signals direkt erfasst werden können, (ii) spezifische Bindungspaarangehörige, die durch ein anschließendes Binden an einen Verwandten (engl.: cognate), der ein Reportermolekül enthält, indirekt erfasst werden können, (iii) Oligonukleotid-Primer, die eine Matrize für eine Vervielfachung oder eine Ligation liefern können, oder (iv) eine spezifische Polynukleotidsequenz oder Erkennungssequenz, die als Ligand agieren kann, z.B. für ein Repressor-Protein, wobei der Oligonukleotid-Primer oder das Repressor-Protein in den letzten zwei Fällen ein Reportermolekül aufweist oder in der Lage ist, ein solches aufzuweisen. Allgemein kann jegliches Reportermolekül verwendet werden, das erfassbar ist. Beispielsweise ist die Nukleinsäurebase dahin gehend modifiziert, Biotin zu enthalten, das sich an Streptavidin bindet, das zuvor kovalent an einen Fluorophoren gebunden wurde. Direkte Markierungen sind von mehreren Herstellern im Handel erhältlich, einschließlich Boehringer-Mannheim und Amersham-Pharmacia Biotech. Boehringer-Mannheim verkauft auch biotinylierte Nukleotide, und Amersham-Pharmacia Biotech verkauft auch Streptavidin, das mit einer Vielzahl von Fluorophoren markiert ist.
  • Das Reportermolekül kann isotop oder nicht-isotop sein, ist üblicherweise nicht-isotop, und kann ein Katalysator sein, z.B. ein Enzym, eine Polynukleotid-Codierung für einen Katalysator; ein Beschleuniger, ein Farbstoff, ein fluoreszierendes Molekül, ein Mittel zur Bewirkung einer Chemilumineszenz, ein Coenzym, ein Enzymsubstrat, eine radioaktive Gruppe, ein kleines organisches Molekül, eine vervielfachbare Polynukleotidsequenz, ein Partikel wie z.B. ein Latex- oder Kohlenstoffpartikel, Metallsol, Kristallit, Liposom, Zelle usw., die bzw. der bzw. das ferner mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen erfassbaren Gruppe markiert oder nicht markiert sein kann, und dergleichen. Das Reportermolekül kann eine fluoreszierende Gruppe wie z.B. ein Fluorescein, eine chemilumineszierende Gruppe wie z.B. Luminol, ein Terbium-Chelatbildner wie z.B. N(hydroxyethyl)ethylendiamintriessigsäure, der zu einer Erfassung durch eine verzögerte Fluoreszenz in der Lage ist, und dergleichen sein.
  • Die Markierung kann ein erfassbares Signal entweder alleine oder zusammen mit anderen Angehörigen des Signalerzeugungssystems erzeugen. Wie oben erwähnt wurde, kann ein Reportermolekül direkt an eine Nukleotidsequenz gebunden sein oder kann daran gebunden werden, indem es an einen Spezifisches-Bindungspaar-Angehörigen (sbp-Angehörigen, sbp = specific binding pair) gebunden wird, der komplementär zu einem sbp-Angehörigen ist, der an eine Nukleotidsequenz gebunden ist. Beispiele bestimmter Markierungen oder Reportermoleküle und ihrer Erfassung finden sich in der US-Patentschrift Nr. 5,508,178. Wenn ein Reportermolekül nicht an eine Nukleotidsequenz konjugiert ist, kann das Reportermolekül auch an einen sbp-Angehörigen gebunden sein, der zu einem sbp-Angehörigen komplementär ist, der an eine Nukleotidsequenz gebunden oder ein Teil einer Nukleotidsequenz ist.
  • Kontrollmarkierung – eine Markierung gemäß der Definition in dem vorliegenden Dokument, die mit einer Kontrollsonde und/oder einem Kontroll-Target assoziiert ist. Wenn sie sowohl mit einer Kontrollsonde als auch mit einem Kontroll-Target assoziiert ist, umfasst die Kontrollmarkierung zwei Markierungen, eine „Kontrollsondenmarkierung", die mit der Kontrollsonde assoziiert ist, und eine getrennte „Kontroll-Target-Markierung", die mit dem Kontroll-Target assoziiert ist. Wenn die Kontrollmarkierung mit Licht angeregt wird, emittiert sie ein Signal, das als „Kontrollsignal" bezeichnet wird. Die Kontrollprobenmarkierung und die Kontroll-Target-Markierung emittieren jeweils ein unterschiedliches Kontrollsignal, das als „Kontrollsondensignal" und als „Kontroll-Target-Signal" bezeichnet wird. Die Kontrollmarkierung ist eine standardmäßige oder Referenzmarkierung, die bei Experimenten verwendet wird, die die Kontrollsonde umfassen. Die von derselben emittierte(n) Kontrollmarkierung(en) und das von derselben emittierte Kontrollsignal(e) sind von einer Testmarkierung und ihrem Signal unterscheidbar.
  • Testmarkierung – eine Markierung gemäß der Definition in dem vorliegenden Dokument, die mit einer Testsonde und/oder einem Test-Target assoziiert ist. Wenn sie sowohl mit einer Testsonde als auch mit einem Test-Target assoziiert ist, umfasst die Testmarkierung zwei Markierungen, eine „Testsondenmarkierung", die mit der Testsonde assoziiert ist, und eine getrennte „Test-Target-Markierung", die mit dem Test-Target assoziiert ist. Wenn die Testmarkierung mit Licht angeregt wird, emittiert sie ein Signal, das als „Testsignal" bezeichnet wird. Die Testprobenmarkierung und die Test-Target-Markierung emittieren jeweils ein unter schiedliches Testsignal, das als „Testsondensignal" und als „Test-Target-Signal" bezeichnet wird. Die von derselben emittierte(n) Testmarkierung(en) und das von derselben emittierte Testsignal(e) sind von der Kontrollmarkierung und ihrem Signal unterscheidbar. Die Testmarkierung wird in Hybridisierungsuntersuchungen verwendet, um die Testsonde und/oder die Test-Target-Probe zu lokalisieren und zu charakterisieren.
  • Signalerzeugungssystem – Das Signalerzeugungssystem kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei zumindest eine Komponente die Markierung ist. Das Signalerzeugungssystem erzeugt ein Signal, das sich üblicherweise auf das Vorliegen von oder die Menge eines Target-Polynukleotids in einem Medium bezieht. Ein Signalerzeugungssystem kann in den Oligonukleotidsonden integriert sein und bezieht sich auf das Vorliegen von Sonden in einem Medium. Das Signalerzeugungssystem umfasst alle Reagenzien, die erforderlich sind, um ein messbares Signal zu erzeugen. Andere Komponenten des Signalerzeugungssystems können in der Entwicklerlösung enthalten sein und können Substrate, Verstärkungsmittel, Aktivatoren, chemilumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Fängersubstanzen, Metallionen, spezifische Bindungssubstanzen, die zum Binden von Signalerzeugungssubstanzen benötigt werden, und dergleichen umfassen. Andere Komponenten des Signalerzeugungssystems können Coenzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dergleichen sein. Das Signalerzeugungssystem liefert ein Signal, das anhand externer Mittel, durch Verwendung einer elektromagnetischen Strahlung, wünschenswerterweise mittels einer optischen Untersuchung, erfassbar ist. Signalerzeugungssysteme, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind diejenigen, die in der US-Patentschrift Nr. 5,508,178 umfassender beschrieben sind.
  • Angehöriger eines spezifischen Bindungspaares („sbp-Angehöriger") – Eines von zwei unterschiedlichen Molekülen, das auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum eine Fläche aufweist, die sich spezifisch an eine räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und somit als komplementär dazu definiert ist. Die Angehörigen des spezifischen Bindungspaares werden als Verwandte oder als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese können Angehörige eines immunologischen Paares wie z.B. Antigen/Antikörper sein, oder sie können Operator/Repressor, Nuklease/Nukleotid, Biotin/Avidin, Hormone/Hormonrezeptoren, Nukleinsäureduplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen sein.
  • Kleines organisches Molekül – eine Verbindung einer relativen Molekülmasse von weniger als 1.500, vorzugsweise 100 bis 1.000, stärker bevorzugt 300 bis 600, z.B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere Proteinbindungsmoleküle sowie Haptene usw. Das kleine organische Molekül kann ein Mittel zur Anlagerung einer Nukleotidsequenz an einer Markierung oder einem Träger liefern.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Vorrichtung und die vorliegenden Verfahren liefern neuartige Techniken zum Erfassen im Wesentlichen aller Merkmalspositionen an einem Mikroarray, ohne sich auf die Qualität oder Quantität einer Hybridisierung zwischen Oligomertestsonden und einer im Test befindlichen Target-Probe verlassen zu müssen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine gleichzeitig anhängige Anmeldung, Seriennr. 09/292,289 von Paul Wolber, die am 15. April 1999 eingereicht wurde, mit dem Titel „APPARATUS, SYSTEMS AND METHOD FOR LOCATING NUCLEIC ACIDS BOUND TO SURFACES".
  • 1–3 veranschaulichen eine Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 100 umfasst eine Kontrollsonde 101, die an einem Ende 102 an einer Oberfläche 104 eines Mikroarraysubstrats 105 in einem Arraymuster von Merkmalen 106 angelagert ist. Die Kontrollsonde 101 umfasst eine bekannte Sequenz von Nukleinsäuren, die komplexer (oder diverser) als eine Poly-T- oder Poly-A-Sequenz sein können. Die Kontrollsonde 101 ist ein der Lage, mit lediglich einem kontrollspezifischen Target-Material einer bekannten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, wie oben definiert. Vorzugsweise ist die Kontrollsonde insofern eine positive Kontrollsonde, als sie helle Merkmale (d.h. starke Signale) liefert, wenn sie abgetastet wird, z.B. die in Tabelle 1 aufgelisteten.
  • Tabelle 1 listet lediglich zwei mögliche Kontrollsondensequenzen auf, die bei der Erfindung funktionieren. Die Liste ist lediglich veranschaulichend und soll den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken. In der Tat funktioniert bei der Erfindung jegliche Kontrollsondensequenz, vorausgesetzt, dass die Kontrollsonde 101 keine Sequenz aufweist, die der Sequenz der Oligomertestsonde ähnlich ist, so dass eine im Test befindliche Target-Probe statt mit ihrer beabsichtigten komplementären Oligomertestsonde mit er Kontrollsonde 101 hybridisieren könnte. Für die vorliegende Erfindung kann die Kontrollsonde 101 beispielsweise aus einer völlig anderen Spezies (Pflanze gegenüber Tier usw.) ausgewählt werden, um jegliche Interaktion zwischen den Kontrollsonden und der im Test befindlichen Target-Probe im Wesentlichen zu eliminieren oder zu minimieren. Alternativ dazu ist die Kontrollsonde 101 dahin gehend ausgewählt, für ein Kontroll-Target spezifisch zu sein, das dahin gehend ausgewählt wurde, nicht mit der Oligomertestsonde und/oder der Test-Target-Probe zu interagieren. Techniken zum Identifizieren von Kontrollsondensequenzen für die vorliegende Erfindung sind in der Technik hinreichend bekannt. Tabelle 1: Beispiele von Kontrollsondensequenzen
    Name Sequenz
    Pro25G atcatcgtagctggtcagtgtatcc
    HCV48-24 acaggggagtgatctatggtggagt
  • Die Kontrollsonde 101 ist mit einer Kontrollmarkierung 107 assoziiert, die auf eine Anregung mit Licht hin ein Kontrollsignal (nicht gezeigt) emittiert. Das aus der Kontrollmarkierung 107 emittierte Signal ist für die Kontrollsonde spezifisch. Mit spezifisch ist gemeint, dass das Signal von jeglichen anderen Signalen, die während eines optischen Abtastens aus dem Mikroarray emittiert werden, unterscheidbar ist. Folglich ist die genaue Position jedes einzelnen Merkmals 106 in dem Mikroarray auf der Basis des durch die assoziierte Kontrollmarkierung 107 emittierten Signals separat erfassbar. Das Kontrollsignal von der assoziierten Kontrollmarkierung 107 ist vorteilhafterweise durch eine (nicht gezeigte) Mikroarray-Abtastvorrichtung separat erfassbar, vorzugsweise in einem separaten Erfassungskanal der Mikroarray-Abtastvorrichtung, um andere Signale und ihre Erfassung durch die Abtastapparatur nicht zu beeinflussen.
  • Die gemäß der Erfindung verwendeten Markierungen können eine beliebige Markierung oder ein beliebiges Markierungssystem sein, die bzw. das in der Technik bekannt ist, wie oben definiert. Überdies kann für die Erfindung jegliche in der Technik bekannte Markierungstechnik verwendet werden. Für die Erfindung ist wichtig, dass die für die verschiedenen Kontrollen verwendeten Markierungen Signale emittieren, die sich voneinander unterscheiden und die sich von den Markierungen und den jeweiligen Signalen unterscheiden, die mit den Testsonden und Test-Target-Proben assoziiert sind, wie oben definiert und nachstehend näher beschrieben ist. Ferner ist es wichtig, dass jede Markierung ein Signal emittiert, das in einem Spektralbereich liegt, der durch einen Erfassungskanal der Abtastapparatur (d.h. Erfassungskanal und Signalfarbanpassung) erfassbar ist. Beispiele von häu fig verwendeten Markierungen, die für die vorliegende Erfindung funktionieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, ,CY3- und CY5-Cyaninfarbstoffe, die von Amersham-Pharmacia Biotech erhältlich sind.
  • Bei einem Ausführungsbeispiel 100a der in 1 veranschaulichten Vorrichtung 100 umfasst die Kontrollsonde 101 die Kontrollmarkierung 107 (allgemein durch den Pfeilkopf 107 in 1 veranschaulicht), die an derselben angelagert oder direkt mit derselben assoziiert ist. Das Ausführungsbeispiel 100a ist nützlich beim Durchführen von zerstörungsfreien Qualitätskontrollauswertungen des Mikroarrays vor einem Durchführen eines Hybridisierungsexperiments, bevor und/oder nachdem das Mikroarray mit Oligomertestsonden 112 bestückt wird, nachstehend näher beschrieben. 1 veranschaulicht ein Beispiel der Vorrichtung 100, bevor die Oligomertestsonden auf das Substrat 105 gesetzt werden. Wie oben erwähnt wurde, kann die zerstörungsfreie Qualitätskontrollauswertung auch durchgeführt werden, nachdem die Oligomertestsonden hinzugefügt wurden, solange die Kontrollsonde 101 direkt markiert ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel 100a können alle Merkmale 106 an dem Mikroarray beim Abtasten erfasst werden, indem das Kontrollsignal von der Kontrollmarkierung 107 erfasst wird, um die Qualität des Mikroarrays zu gewährleisten. Eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollauswertung ist besonders nützlich, wenn die Mikroarrayvorrichtung 100 dazu verwendet wird, extrem wertvolle im Test befindliche Target-Proben oder Test-Target-Proben in sehr kleinen Mengen zu hybridisieren. Ein Mikroarray, das vor einer Hybridisierung verifiziert wird, tendiert weniger dazu, die kostbare Test-Target-Probe zu vergeuden. Ferner sieht dieses Ausführungsbeispiel 100a eine präzise Merkmalslokalisierung während einer Merkmalsextraktion nach einer Hybridisierung der Oligomertestsonden vor, wie nachstehend näher beschrieben wird. Überdies erfordert dieses Ausführungsbeispiel 100a kein Hybridisieren eines komplementären Kontroll-Targets zu der Kontrollsonde, wie nachstehend näher beschrieben wird, und folglich würde die ses Ausführungsbeispiel keine Informationen liefern, die notwendig sind, um auf die Hybridisierung bezogene Daten zu normieren.
  • Die Vorrichtung 100 umfasst ferner eine Oligomertestsonde 112, die an jeder Merkmalsposition 106 des Mikroarraysubstrats 105 zusammen mit der Kontrollsonde 101 angeordnet ist. 2 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel 100b der Vorrichtung 100, nachdem die Oligomertestsonden 112 angelagert sind. Bei dem Ausführungsbeispiel 100b der 2 fungiert die Kontrollsonde 101 als Kontrollpfeiler 101. Die Oligomertestsonde 112 ist an einem gegenüberliegenden Ende 103 des Kontrollpfeilers 101 angelagert, so dass der Kontrollpfeiler 101 eine Verlängerung zwischen der Oberfläche 104 des Arraysubstrats 105 und der Oligomertestsonde 112 ist. Vorteilhafterweise liefert die Vorrichtung 100b eine Entsprechung von 1:1 zwischen der Quantität des Kontrollpfeilers 101 und der Quantität der Oligomertestsonde 112. Der Kontrollpfeiler 101 verlängert die Oligomertestsonde 112 im Wesentlichen weg von der Oberfläche 104, was vorteilhafterweise auch die Signalintensität von Kurzes-Oligomer-Testsonden, z.B. Oligomeren, die eine Länge von etwa 25 Monomeren aufweisen, verstärken kann.
  • 3 veranschaulicht ein weiteres Ausführungsbeispiel 100c der Vorrichtung 100, nachdem das Mikroarray mit den Oligomertestsonden 112 besetzt wurde, wobei die Oligomertestsonde 112 zusammen mit der Kontrollsonde 101 direkt zu der Oberfläche 104 des Substrats 105 in jeder Merkmalsposition 106 hinzugefügt wird. Bei diesem Ausführungsbeispiel 100c ist das gegenüberliegende Ende 103 der Kontrollsonde 101 mit einer Abdeckung versehen, um zu verhindern, dass sich die Oligomertestsonde 112 an demselben anlagert. Somit umfasst jedes Merkmal 106 die Kontrollsonde 101 und die Oligomertestsonden 112, die jeweils separat an der Oberfläche 104 an jeder Merkmalsposition 106 angelagert sind. Demgemäß besteht bei dem Ausführungsbeispiel 100c keine Korre lation von 1:1 zwischen der Quantität der Kontrollsonden 101 und der Oligomertestsonden 112.
  • Bei beiden Ausführungsbeispielen 100b und 100c kann die Vorrichtung 100 zu Zwecken einer zerstörungsfreien Qualitätskontrolle gemäß der Erfindung ausgewertet werden, muss aber nicht. Dort, wo Qualitätskontrollauswertungen gewünscht sind, können die Ausführungsbeispiele 100b und 100c das Ausführungsbeispiel 100a der in 1 veranschaulichten Vorrichtung 100 umfassen, bei dem die Kontrollsonde oder der Kontrollpfeiler 101 direkt mit einer Kontrollmarkierung 107 markiert ist. Überdies sollte man beachten, dass die Oligomertestsonde 112 direkt mit einer Testmarkierung markiert sein kann, die, wenn sie belichtet wird, ein Testsignal 115 erzeugt, das sich von dem Kontrollsignal 108 unterscheidet. Die direkt markierte Oligomertestsonde 112 kann gemäß der vorliegenden Erfindung auch während des Qualitätskontrollabtastens des bestückten Mikroarrays 100 an jedem Merkmal 106 erfasst werden.
  • Bezüglich der Ausführungsbeispiele 100b, 100c gemäß der Erfindung umfasst jede Merkmalsposition 106 die Oligomertestsonde 112 und die Kontrollsonde bzw. den Kontrollpfeiler 101. In der Praxis liegt eine Mehrzahl von Merkmalen 106 vor, wobei jedes Merkmal 106 an dem Mikroarray 105 üblicherweise eine Mehrzahl derselben Kontrollsonden oder -pfeiler 101 und eine Mehrzahl derselben Oligomertestsonden 112 aufweist, mit denen es besetzt ist. Die Nukleinsäuresequenz der Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 kann an jedem Merkmal 106 vorteilhafterweise dieselbe sein, oder zumindest ein Merkmal kann eine unterschiedliche Kontrollsondensequenz aufweisen, mit der es besetzt ist. Die Oligomertestsonden 112 können identisch sein oder sich von Merkmal 106 zu Merkmal 106 unterscheiden, je nach dem durchzuführenden Hybridisierungsexperiment. Die 1–3 veranschaulichen lediglich der Einfachheit halber lediglich eine Kontrollsonde bzw. einen Kontrollpfeiler 101 und lediglich eine Oligomertestsonde 112 an jedem Merkmal 106 und lediglich zwei Merkmale 106.
  • Gemäß der Erfindung können die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 und die Oligomertestsonden 112 mittels einer beliebigen hinreichend bekannten Technik auf das Array aufgebracht werden. Beispielsweise können die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 in einem herkömmlichen DNA-Synthetisierer vorsynthetisiert und als ganze Oligonukleotide oder cDNA mittels punktförmigen Auftragens oder Tintenstrahlaufbringungstechniken, die in der Technik bekannt sind, auf das Substrat 105 aufgebracht werden. Ferner können die Oligomertestsonden 112 desgleichen vorsynthetisiert und als ganze Oligonukleotide oder cDNA aufgebracht werden. Alternativ dazu können die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 und/oder die Oligomertestsonden 112 unter Verwendung hinreichend bekannter Techniken einer In-situ-Synthese in situ auf dem Substrat synthetisiert werden. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Kontrollsonden oder -pfeiler 101 vorsynthetisiert und auf das Substrat 105 in dem Array von Merkmalen 106 aufgebracht, und die Oligomertestsonden 112 werden in situ direkt an das freie Ende 103 des Kontrollpfeilers 101 synthetisiert. Bei dem Ausführungsbeispiel 100c der 3 können die Kontrollsonden 101 an dem freien Ende 103 mit einer Abdeckung versehen werden, um eine Anlagerung der Oligomertestsonden 112 an demselben zu verhindern, vor allem wenn die Oligomertestsonden 112 anhand einer In-situ-Synthese bereitgestellt werden.
  • Als Alternative zur direkten Markierung der Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 kann die Kontrollmarkierung 107 bei den Ausführungsbeispielen 100b, 100c, wie bei dem Ausführungsbeispiel 100a der Vorrichtung 100, mittels Hybridisierung insofern indirekt mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziiert werden, als die Kontrollmarkierung 107 direkt an einem komplementären oder kontrollspezifischen Target-Material 109 angelagert oder mit einem solchen assoziiert ist, das zum Zweck einer Hybridisierung mit der Mikroarrayvorrichtung 100 in Berührung gebracht wird. Desgleichen kann die Testmarkierung mittels Hybridisierung insofern indirekt mit der Oligomertestsonde 112 assoziiert sein, als die Testmarkierung vorzugsweise direkt an einer im Test befindlichen Target-Probe angelagert oder mit einer solchen direkt assoziiert ist. Nachdem die Kontrollsonden bzw. der Kontrollpfeiler 101 und die Oligomertestsonde 112 zu dem Substrat 105 hinzugefügt wurden, wird die Vorrichtung 100, die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 und Oligomertestsonden 112 umfasst, mit einer Hybridisierungslösung in Berührung gebracht, üblicherweise seitens eines Benutzers der Mikroarrayvorrichtung 100, der eine im Test befindliche Target-Probe 113 aufweist. Die Hybridisierungslösung umfasst die markierte experimentelle Test-Target-Probe 113 und vorzugsweise das markierte kontrollspezifische Target-Material 109. Die Hybridisierungs-untersuchung wird vorzugsweise in einem Hybridisierungsschritt durchgeführt. Alternativ dazu kann das markierte kontrollspezifische Target 109 separat von der Hybridisierung des markierten Test-Target-Materials 113 z.B. entweder durch den Benutzer oder den Hersteller der Vorrichtung 100 zu der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 hybridisiert werden. Somit werden die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 und die Oligomertestsonde 112 mittels einer Hybridisierung indirekt mit den jeweiligen Kontroll- und Testmarkierungen 107 assoziiert.
  • Die bzw. der hybridisierte Kontrollsonde bzw. Kontrollpfeiler 110 emittiert das Kontrollsignal, das in einem Erfassungskanal der Abtastapparatur, der sich vorzugsweise von dem Kanal unterscheidet, der zum Erfassen des Testsignals 115 von der hybridisierten Oligomertestsonde 120 verwendet wird, separat erfassbar ist (d.h. auf denselben abgestimmt werden kann). Die Kontrollsignaldaten, die von dem separaten Kanal erhalten werden, können mit Daten des Hybridisierungstestsignals 115 verwendet werden, um ungeachtet der Qualität oder Quantität der Hybridisierungstestsignale 115 alle Merkmale 106 zu lokalisieren. Dies ist besonders dort sinnvoll, wo die Quantität der Test-Target-Probe 113 so gering ist, dass die Testsignale 115 von den hybridisierten Testsonden 120 sehr schwach oder gedämpft sind und somit nicht ohne weiteres anhand herkömmlicher Verfahren erfassbar sind.
  • Bei einer alternativen Art und Weise, eine Kontrollmarkierung 107 mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 zu assoziieren, wird bei den Ausführungsbeispielen 100b, 100c die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 sowohl direkt markiert als auch indirekt markiert, beides wie oben beschrieben. Bei diesem alternativen Markierungsschema umfasst die Kontrollmarkierung 107 eine Kontrollsondenmarkierung und eine Kontroll-Target-Markierung, und das Kontrollsignal umfasst ein Kontrollsondensignal und ein Kontroll-Target-Signal. Das Kontrollsondensignal ist an der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 angelagert oder direkt mit derselben bzw. demselben assoziiert, wie bei dem Ausführungsbeispiel 100a, und die separate Kontroll-Target-Markierung ist nach einer Hybridisierung indirekt mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziiert, indem die Kontroll-Target-Markierung an dem kontrollspezifischen Target 109 angelagert wird. Nachdem die Oligomertestsonden 112 zu den Merkmalen 106 des Mikroarraysubstrats 105 hinzugefügt wurden, wird die Mikroarrayvorrichtung 100 mit einer Hybridisierungslösung in Berührung gebracht, wie oben beschrieben wurde. Die hybridisierte Kontrollsonde 110 emittiert zwei unterscheidbare und separat erfassbare Kontrollsignale, wenn sie optisch abgetastet wird. Desgleichen kann die Testmarkierung bei einem Ausführungsbeispiel eine Testsondenmarkierung, die direkt auf die Oligomertestsonde 112 aufmarkiert ist, und eine Test-Target-Markierung, die auf die Test-Target-Probe 113 aufmarkiert ist, umfassen. Nach der Hybridisierung emittiert die hybridisierte Oligomertestsonde 120 zwei unterscheidbare und separat erfassbare Testsignale 115a, 115b, die, wenn sie optisch abgetastet werden, ebenfalls von den Kontrollsignalen 108a, 108b unterscheidbar und separat erfassbar sind.
  • Das von der Kontrollsondenmarkierung emittierte Kontrollsondensignal kann in einem Kanal erfasst werden, und das Kontroll-Target-Signal von der Kontroll-Target-Markierung kann vorzugsweise in einem anderen, separaten Kanal der Abtastvorrichtung erfasst werden, wobei beide Kanäle vorzugsweise von den Kanälen, die zum Erfassen der Testsignale 115 von der hybridisierten Testsonde 120 verwendet werden, unterschiedlich und getrennt sind, um vollständig von denselben unterscheidbar zu sein. Dort, wo die Kontrollmarkierungen jeweils ein Kontrollsignal emittieren, ist eine Mikroarray-Abtastvorrichtung bevorzugt, die eine erforderliche Anzahl getrennter Erfassungskanäle umfasst. Vierkanal-Mikroarray-Abtastvorrichtungen sind in der Technik bekannt und würden für das Ausführungsbeispiel der Erfindung von dualen Steuersignalen 108a, 108b funktionieren. In der Tat würde ein Vierkanal-Abtastsystem die dualen Kontrollsignale und die dualen Testsignale, wie sie bei einem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vorgesehen sein können, beherbergen. Dort, wo sowohl die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 als auch das Kontroll-Target 109 markiert sind, sind vorteilhafterweise sowohl eine zerstörungsfreie Vorhybridisierungs-Qualitätskontrollauswertung als auch eine -Merkmalslokalisierung möglich, indem das Kontrollsondensignal von der Kontrollsondenmarkierung, wie bei dem Ausführungsbeispiel 100a mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung erfasst wird, sowie auch eine Nachhybridisierungs-Merkmalslokalisierung und/oder -Extraktion mit einer Normierung von Hybridisierungsdaten, durch Erfassen zumindest des Kontroll-Target-Signals von der Kontroll-Target-Markierung und durch ein separates Erfassen der Testsignale.
  • Jedoch sollte man beachten, dass eine Vorhybridisierungs-Abtastung für eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollaus wertung und eine Nachhybridisierungs-Abtastung zum Erhalten von Hybridisierungsuntersuchungsergebnissen zu unterschiedlichen Zeiten und, wenn möglich, mit unterschiedlichen Mikroarray-Abtastvorrichtungen durchgeführt werden würde. Eine Vorhybridisierungs-Abtastung erfasst lediglich das Kontrollsignal oder das Kontrollsondensignal von der direkt markierten Kontrollsonde bzw. dem direkt markierten Kontrollpfeiler 101. Desgleichen kann bei einem Ausführungsbeispiel die Vorhybridisierungs-Abtastung auch lediglich das Testsignal oder das Testsondensignal von der direkt markierten Oligomertestsonde 112 erfassen. Dagegen erfasst die Nachhybridisierungs-Abtastung das Kontrollsignal oder das Kontroll-Target-Signal von der indirekt markierten, hybridisierten Kontrollsonde bzw. dem indirekt markierten, hybridisierten Kontrollpfeiler 110, und könnte auch dazu verwendet werden, das Kontrollsondensignal zu erfassen. Desgleichen erfasst die Nachhybridisierungs-Abtastung auch das Testsignal oder das Test-Target-Signal von der indirekt markierten, hybridisierten Oligomertestsonde 120 und könnte auch dazu verwendet werden, das Testsondensignal (falls vorhanden) zu erfassen.
  • Die Mikroarray-Abtastvorrichtung, die zum Abtasten der Mikroarrayvorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung bezüglich Vor- oder Nachhybridisierungs-Abtastungen verwendet wird, muss keinen separaten Erfassungskanal aufweisen, um jedes der verschiedenen Kontroll- und Testsignale zu erfassen. Jedoch sollte die Mikroarray-Abtastvorrichtung in der Lage sein, jedes der unterschiedlichen Signale separat zu erfassen. Die für die Erfindung nützliche Mikroarray-Abtastvorrichtung weist zwei oder mehrere separate Erfassungskanäle und vorzugsweise zumindest vier separate Kanäle auf. Ein Zweikanal-Mikroarray-Abtastsystem kann dazu verwendet werden, die verschiedenen Kontrollsignale und Testsignale in separaten Abtastungen in jedem Kanal separat zu erfassen, vorausgesetzt, dass etwaige nachteilige Effekte, z.B. ein „Ausbleichen" der Markierungen 107, berücksichtigt werden können und die zwei Erfassungskanäle wechselweise eingesetzt oder der durch jeden Kanal erfasste Wellenlängenbereich veränderbar ist (z.B. mit Filtern), so dass jeder Kanal für jede Abtastung einen unterschiedlichen Wellenlängenbereich erfasst. Für Fachleute ist ohne weiteres ersichtlich, wie eine Zweikanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung zum separaten Erfassen von drei bis vier separaten (d.h. unterschiedliche Wellenlängenbereiche aufweisenden) Signalen zu verwenden ist, und der Schutzumfang der Erfindung ist nicht durch das verwendete Mikroarray-Abtastsystem begrenzt.
  • Ein Beispiel der Verwendung der Mikroarrayvorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung ist ein hinreichend bekanntes standardmäßiges Rot/Grün-Experiment (d.h. Zweifarben-Experiment). Ein Hybridisierungsgemisch würde hergestellt werden, das eine Referenz-Test-Target-Probe 113 und eine experimentelle Test-Target-Probe umfasst. Allgemein werden für die Testmarkierungen an der Referenz- und der experimentellen Test-Target-Probe zwei fluoreszierende Farbstoffe, z.B. CY3 und CY5 (oben erwähnte hinreichend bekannte Farbstoffe) verwendet, die rote bzw. grüne Signale erzeugen. Die Zweifarben-Experimente werden dort eingesetzt, wo die Referenz-Test-Target-Probe 113 eine unbehandelte Zell-Linie sein könnte, und die experimentelle Test-Target-Probe beispielsweise eine mit Medikamenten behandelte Zell-Linie sein könnte. Ein Benutzer wäre an der Differenz der Genexpression zwischen diesen beiden Proben interessiert. Die standardmäßigen Rot/Grün-Experimente können paarweise durchgeführt werden; die Farbstoffe werden zwischen der Testprobe 113 und der Testreferenz in den Paaren vertauscht (d.h. Farbstofftauschexperimente), und die Ergebnisse werden verglichen.
  • Wenn das typische Rot/Grün-Experiment bei der Mikroarrayvorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung verwendet wird, würde ein dritter Farbstoff für die Kontrollmarkierung 107 verwendet, um speziell das Kontroll-Target 109 zu markieren, das zu der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 komplementär ist. Der dritte Farbstoff 107 würde das Kontrollsignal erzeugen, wenn er durch Licht angeregt wird, das sich von den roten und grünen Signalen unterscheidet. Das markierte Kontroll-Target 109 ist in dem Hybridisierungsgemisch mit dem Referenz-Test-Target 113 und dem experimentellen Test-Target enthalten. Alternativ dazu könnten ein dritter und vierter Farbstoff beispielsweise für die Kontrollsondenmarkierung und die Kontroll-Target-Markierung verwendet werden. Das Kontrollsignal von dem dritten Farbstoff 107 oder die Kontrollsignale von dem dritten und dem vierten Farbstoff würden sich von einander und von den roten und grünen Signalen von den CY3- und CY5-Farbstofftestmarkierungen an den Test-Target-Proben unterschieden. Überdies eine Testmarkierung entweder direkt an der Oligomertestsonde 112 oder an dem Test-Target 113; eine Testmarkierung jeweils direkt sowohl an der Oligomertestsonde 112 als auch dem Test-Target 113; oder eine Testmarkierung direkt an unterschiedlichen Gruppen der Test-Target-Probe 113, 113' bzw. einer Abwandlung oder Kombination derselben, fallen allesamt in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
  • Die hybridisierte Kontrollsonde bzw. der hybridisierte Kontrollpfeiler 110 emittiert das Kontrollsignal, das die Kontrollmarkierung 107 angibt. Die hybridisierte Testsonde 120 emittiert das Testsignal, das die Testmarkierung angibt. Die Mikroarray-Abtastvorrichtung erfasst separat jedes unterschiedliche Signal in jeglicher der Abwandlungen oder Variationen, die oben für die Kontrollsignale und die Testsignale beschrieben wurden. Das Kontrollsignal wird separat erfasst, vorzugsweise in (einem) separaten Kontrollerfassungskanal bzw. -kanälen, von dem Erfassungskanal bzw. den Erfassungskanälen, der bzw. die herkömmlicherweise zur Erfassung des aus der hybridisierten Testsonde 120 emittierten Signals verwendet wird bzw. werden.
  • 4 und 5 veranschaulichen die Mikroarrayvorrichtung 100 nach einer Hybridisierung. 4 veranschaulicht das Aus führungsbeispiel 100b der 2 nach einer Hybridisierung. 5 veranschaulicht das Ausführungsbeispiel 100c der 3 nach einer Hybridisierung. Das Kontroll-Target 109 ist als kurz gestrichelte Linie neben der Kontrollsonde bzw, dem Kontrollpfeiler 101 (als durchgezogene gerade Linie veranschaulicht) veranschaulicht, und das Test-Target 113 ist als relativ länger gestrichelte Linie neben der Oligomertestsonde 112 (als durchgezogene Wellenlinie veranschaulicht) veranschaulicht. 4 und 5 veranschaulichen der Einfachheit halber nicht die Kontrollmarkierung 107 oder das Kontrollsignal 108. Alle Möglichkeiten, die Kontrollprobe bzw. den Kontrollpfeiler 101 mit der oben beschriebenen Kontrollmarkierung 107 zu markieren, sind auf 4 und 5 anwendbar. Ebenfalls nicht in 4 und 5 gezeigt ist, dass die hybridisierte Testsonde 120 mit der Testmarkierung markiert ist, die das Testsignal emittiert. Vorzugsweise ist die Testmarkierung 114 an der Test-Target-Probe 113 angelagert oder mit derselben assoziiert, wie oben erwähnt wurde. Jedoch sind alle Möglichkeiten des Markierens der Oligomertestsonde 112 mit der Testmarkierung 114, die oben beschrieben wurden, auf 4 und 5 anwendbar.
  • Wenn die Kontrollmarkierung 107 mittels einer Hybridisierung zusammen mit dem markierten Test-Target 113 zu der Oligomertestsonde 112 indirekt mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziiert ist, können die Hybridisierungsdaten für jedes Merkmal 106 für verschiedene Signaltendenzen (global oder lokal) über das Array hinweg vorteilhafterweise direkt an dem Mikroarray 105 normiert werden. Beispielsweise können die typischen Signalgradienten, die auf Grund von Oligomertestsonden-Hybridisierungsanomalien und/oder auf Grund von Abtastvorrichtungsfokussierungsproblemen über ein Array hinweg vorliegen, kompensiert werden, da jedes Merkmal 106 ein kontrollspezifisches Target-Signal als „Referenz" aufweist, das in dem separaten Kanal der Abtastvorrichtung erfasst wird. Die Hybridisierungsdaten aus diesem separaten Kon trollkanal können mit den Hybridisierungsdaten von den herkömmlichen Testerfassungskanälen verglichen und normiert werden.
  • Alle Ausführungsbeispiele der oben beschriebenen Vorrichtung 100 können die Position jedes Merkmals 106 an dem Array genau erfassen, indem sie bezüglich des Steuersignals von der kontrollspezifischen Markierung 107 in einem anderen Kanal der Abtastapparatur, vorzugsweise unabhängig von den Kanälen, die herkömmlicherweise zum Abtasten der Testsignale von den hybridisierten Oligomertestsonden 120 verwendet werden, abtasten. Die vorliegende Erfindung sieht eine neuartige Vorrichtung 100 und Verfahren für eine verbesserte Erfassbarkeit von Merkmalen 106 vor, die vorzugsweise zusätzliche Farbkanäle, die an einer Vierkanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung zur Verfügung stehen, in Verbindung mit einem Erzeugen einer Mikroarrayvorrichtung 100 von Kontrollsonden- oder pfeilern 101 und Oligomertestsonden 112, vorzugsweise an den Kontrollpfeilern 101, verwendet. Somit ist die Position jedes Merkmals 106 ungeachtet der Qualität des Testsignals von den hybridisierten Oligomertestsonden 120 bekannt. Die zusätzlichen Kontrollsignaldaten in dem separaten Kanal werden dazu verwendet, eine Lokalisierung von Merkmalen 106 und eine Merkmalsextraktion zu unterstützen, besonders in Bezug auf ein geringfügiges oder gedämpftes Signal von hybridisierten Oligomertestsonden 120. Ferner liefern die zusätzlichen Signaldaten ein Mittel zum Normieren jedes Merkmals 106 bezüglich seiner extremen lokalen Hybridisierungs- und Abtastcharakteristika. Mit „extrem lokal" ist gemeint, dass der lokale Bereich jedes Merkmals 106 selbst in der Analyse betrachtet wird, da jedes Merkmal 106 die Kontrollsonde bzw. den Kontrollpfeiler 101 und die Oligomertestsonde 112 umfasst. Vorteilhafterweise werden die Daten für das Merkmal 106 selbst normiert, und werden nicht anhand irgend eines Mittelwerts über viele separate zweckgebundene Kontrollmerkmale normiert, wie dies herkömmlicherweise geschieht. Mit anderen Worten können die Signalwerte bezüglich der genauen Positi on des Merkmals sowie Variationen der präzisen Merkmals-Lokalhybridisierung angepasst werden, statt eine weniger lokalisierte Abtastung (engl.: sampling) von umgebendem Hintergrund oder anderen zweckgebundenen Merkmalskontrollsonden zu verwenden, wie dies bei den herkömmlichen Analyseverfahren verwendet wird.
  • 4 veranschaulicht das bevorzugte Ausführungsbeispiel 100b der Vorrichtung 100 der Erfindung nach einer Hybridisierung mit einem Hybridisierungsgemisch, das kontrollspezifische Targets 109 einer bekannten Zusammensetzung und das Test-Target-Material 113 umfasst. Das in 4 veranschaulichte bevorzugte Ausführungsbeispiel 100b sieht eine Korrelation von 1:1 zwischen der Quantität des Kontrollpfeilers 101 und der Quantität der Oligomertestsonden 112 vor. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel der 4 sowie bei dem in 5 veranschaulichten Ausführungsbeispiel 100c liefert das Kontrollsignal 108 von der hybridisierten Kontrollsonde 110 Informationen über die Position jedes Merkmals 106, während die separaten Testsignale von den hybridisierten Testsonden 120 Informationen über die Qualität und Quantität der Hybridisierung des Test-Targets 113 an die Testsonden 112 an jedem Merkmal 106 liefern.
  • 6 veranschaulicht ein Verfahren 200 zum Durchführen einer zerstörungsfreien Qualitätskontrollauswertung der Merkmale an einem Mikroarray. Das Mikroarray entspricht der vorherigen Beschreibung und umfasst eine markierte Kontrollsonde 101 auf einer Oberfläche 104 eines Mikroarraysubstrats 105 an einer Merkmalsposition 106, und die Kontrollmarkierung 107 für die Kontrollsonde 101 emittiert ein Kontrollsignal, wenn sie belichtet wird. Das Verfahren zum Durchführen umfasst ferner die Schritte des Abfragens 207 des bestückten Mikroarraysubstrats 105; und des Auswertens 209 von Daten, die aus dem Abfrageschritt gewonnen wurden. Der Schritt des Abfragens 207 umfasst die Schritte des Abtastens 210 des Mikroarrays mit einem Licht; und des Erfassens 220 des Kontrollsignals von der markierten Kontroll sonde an jeder Merkmalsposition 106. Das Kontrollsignal von der Kontrollsondenmarkierung 107 kann in einem Kontrollerfassungskanal eines Abtastsystems erfasst werden. Dieses Verfahren 200 ist besonders für die zerstörungsfreien Qualitätskontrollauswertungen von Mikroarraysubstraten 105, bevor das Substrat 105 mit Oligomertestsonden 112 besetzt wird, oder sogar nachdem die Oligomertestsonden 112 hinzugefügt werden, jedoch bevor Hybridisierungsexperimente durchgeführt werden, nützlich. Dort, wo die Oligomertestsonde 112 auf das Substrat 105 gesetzt wird, würde eine direkt markierte Oligomertestsonde 112 nach der Abfrage 207 sogar noch mehr Qualitätskontrolldaten über das bestückte Mikroarraysubstrat 105 zur Auswertung 209 liefern. Bei dem Schritt des Auswertens 209 können die aus der Qualitätskontrollabfrage eingeholten Daten zum Modifizieren nachfolgender Aufbringungen verwendet werden, z.B. Durchführen einer Anpassung an die Ausrichtung der Aufbringungsapparatur, bevor die Oligomertestsonden 112 hinzugefügt werden. Alternativ dazu können die während der Abfrage eingeholten Qualitätskontrolldaten an einen Benutzer der Mikroarrayvorrichtung 100, wie sie oben definiert wurde, weitergeleitet werden, um den Benutzer bei der Auswertung von Hybridisierungstestergebnissen zu unterstützen.
  • 7 veranschaulicht ein alternatives Verfahren 300 zum Erfassen jedes Merkmals an einem beanspruchten Mikroarray.
  • Wie bei dem obigen Verfahren 200 umfasst das Verfahren 300 die Schritte des Abfragens 207 des Mikroarrays 100 mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung, um das Kontrollsignal zu erfassen, und des Auswertens 209 von Daten, die von dem erfassten Kontrollsignal 108 gesammelt wurden. Die Oligomertestsonde 112 ist mit einer Testmarkierung assoziiert, die ein Testsignal emittiert, das sich von dem Kontrollsignal unterscheidet. Wenn die Oligomertestsonde 112 mit der Testmarkierung assoziiert wird, umfasst der Schritt des Abfragens 207 ein Abtasten 210 des Mikroarrays 100 mit einem Licht, um die Markierungen anzuregen, und ein Erfassen 220 des Steuersignals, und umfasst ferner den Schritt des Erfassens 322 des Testsignals von der Testmarkierung auf separate Weise, vorzugsweise in einem von dem Kontrollkanal des Abtastsystems separaten Testerfassungskanal. Das Verfahren 300 ist besonders nützlich bezüglich eines Erfassens aller Merkmale auf dem Array ungeachtet der Qualität oder Quantität des Testsignals 115 an jeder Merkmalsposition 106 durch ein Erfassen 220 des Kontrollsignals 108 von der Kontrollsonde 101 an jeder Merkmalsposition 106.
  • 8 veranschaulicht den Schritt des Anlagerns 306 der Oligomertestsonden 112 an den Merkmalspositionen 106; und ein indirektes Assoziieren der Testmarkierung mittels Hybridisierung. Vor dem Schritt des Abfragens 207 umfasst das Verfahren 300 ferner den Schritt des Inberührungbringens 307 des Mikroarrays 100 mit einer Hybridisierungslösung, die die Test- oder experimentelle Target-Probe 113 umfasst, die die Testmarkierung umfasst. Jedoch können statt eines oder zusätzlich zu einem Markieren der Test-Target-Probe 113 die Oligomertestsonden 112 direkt markiert werden. Die Kontrollsignale 108, die von dem Kontrollerfassungskanal gesammelt werden, und die Testsignale, die von dem separaten Testerfassungskanal des Abtastsystems gesammelt werden, werden zusammen dazu verwendet, die Merkmale, die hybridisierte Oligomertestsonden 120 enthalten, auf der Basis der Positionen aller Merkmale 106 zu lokalisieren. Das Verfahren 300 ist besonders nützlich bezüglich eines Erfassens aller Merkmale ungeachtet der Qualität und Quantität der Hybridisierung an jedem Merkmal 106 und, was noch wichtiger ist, ungeachtet der Stärke des Targetspezifischen Testsignals an jedem Merkmal 106.
  • Die Oligomertestsonde ist vorzugsweise an ein gegenüberliegendes Ende 103 der Kontrollsonde 101 angelagert, so dass die Kontrollsonde als Kontrollpfeiler 101 agiert, der sich zwischen der Oberfläche 104 des Substrats 105 und der Oligomertestsonde 112 erstreckt. Wie oben erwähnt wurde, liefert dies vorteilhafterweise eine Korrelation von 1:1 zwi schen der Quantität und der Kontrollsonde und der Quantität der Oligomertestsonden in jedem Merkmal. Alternativ dazu kann die Oligomertestsonde dadurch vorgesehen sein 305, dass ein Ende der Oligomertestsonde an der Oberfläche 104 des Mikroarraysubstrats 105 in jedem Merkmal 106 zusammen mit der Kontrollsonde 101 angelagert wird 306.
  • Bei dem Verfahren 200 zum Durchführen einer zerstörungsfreien Qualitätskontrollauswertung eines Mikroarrays von Merkmalen, wie es in Anspruch 7 beansprucht wird, kann das Array eine Kontrollsonde umfassen, die eine direkt assoziierte Kontrollmarkierung aufweist. Jedoch kann die Kontrollsonde 101 bei dem Verfahren gemäß Anspruch 8 auf eine von drei Arten markiert werden. Bei einer Art weist die Kontrollsonde eine direkt assoziierte 303 Kontrollmarkierung 107 auf. Alternativ dazu kann eine unmarkierte Kontrollsonde 101 an der Oberfläche 104 des Substrats 105 angelagert sein, und die Kontrollmarkierung 107 mittels Hybridisierung 307 indirekt an der Kontrollsonde 101 angelagert sein, wenn die Kontrollsonde 101 mit der oben erwähnten Hybridisierungslösung in Berührung gebracht wird, die ferner das komplementäre Kontroll-Target 109 umfasst, das die Kontrollmarkierung 107 aufweist. Als weitere Alternative kann eine Kontrollsonde 101, die sowohl eine direkt assoziierte 303 Kontrollsondenmarkierung als auch eine Kontroll-Target-Markierung (304), die mittels Hybridisierung 307 indirekt angelagert ist, aufweist, an dem Substrat (105) angelagert sein. Wiederum werden die Kontroll-Targets 109 vorzugsweise zur selben Zeit wie die Test-Target-Probe 113 hybridisiert 307. Jedoch können die Kontroll-Targets 109 separat von dem Test-Target-Material 113 hybridisiert werden. In diesem Fall umfasst die Kontrollmarkierung 107 eine Kontrollsondenmarkierung, die ein Kontrollsondensignal emittiert, und eine Kontroll-Target-Markierung, die ein unterschiedliches Kontroll-Target-Signal emittiert. Überdies umfasst der Schritt des Erfassens 220 vorzugsweise ferner die Schritte des Erfassens 221a des Kontrollsondensignals 108a in einem Kontrollkanal und des separaten Erfassens 221b des Kontroll-Target-Signals vorzugsweise in einem separaten Kontrollkanal des Abtastsystems. Dies ist besonders nützlich bezüglich eines Bereitstellens der Kapazität für eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollanalyse vor der Hybridisierung 307, indem zuerst das Mikroarray 100 abgefragt wird, bevor die Oligomertestsonde 112 indirekt mit der Testmarkierung assoziiert wird. Die erste Abfrage wird dazu verwendet, das Kontrollsignal von der Kontrollsondenmarkierung zu erfassen. Ferner ist dies besonders nützlich in Bezug darauf, eine nach der/einer Hybridisierung erfolgende Merkmalslokalisierung, Merkmalsextraktion, Normierung der Hybridisierungsdaten und eine Hybridisierungs-/Abtast-Tendenzumkehr bereitzustellen, indem anschließend das Mikroarray 100 nach der Hybridisierung 307 abgefragt 207 wird und das Kontrollsignal von der Kontroll-Target-Markierung 107b und das Testsignal von der Testmarkierung separat erfasst werden. 8 veranschaulicht das Verfahren 300, bei dem die alternativen Markierungsschritte 303, 304 der Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 mittels gestrichelter Pfeile veranschaulicht sind und die Erfassungsschritte 221a, 221b der separaten Kontrollschritte 108a bzw. 108b mittels gestrichelter Pfeile veranschaulicht sind.
  • Ein direktes Markieren 303 der Kontrollsonde 101 mit einer Kontrollmarkierung 107 ist für das Verfahren 200 und bei dem zuletzt beschriebenen alternativen Ausführungsbeispiel in dem Verfahren 300 bevorzugt, da es die Gelegenheit bietet, eine zerstörungsfreie Qualitätskontrollanalyse des Mikroarrays unabhängig von der Hybridisierung durchzuführen. Derartige Qualitätskontrollinformationen können statt der oder genau auf dieselbe Weise wie die mittels einer Kamera oder eines Sensors gewonnenen Qualitätskontrollinformationen verwendet werden, die in der gleichzeitig anhängigen britischen Patentanmeldung GB 2355716 mit dem Titel „POLYNUCLEOTIDE ARRAY FABRICATION" und in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Seriennr. 09/558,532 mit dem Titel „ARRAY FABRICATION WITH DROP DETECTION" verwendet werden. Selbstverständlich können die mittels einer Kamera oder eines Sensors gewonnenen Informationen in diesen Anmeldungen durch Arrayqualitätsinformationen (ob nominal oder tatsächlich) ersetzt werden, die anhand beliebiger Mittel gewonnen wurden. Für das Verfahren 200 ist dann, wenn die Kontrollsonde bzw, der Kontrollpfeiler 101 direkt markiert 303 ist, eine Hybridisierung mit einem Kontroll-Target 109 nicht notwendig, um ein Kontrollsignal 108 zu erzeugen. Somit muss die direkt markierte Kontrollsonde bzw. der direkt markierte Kontrollpfeiler 101 kein komplementäres Kontroll-Target 109 aufweisen, wie dies herkömmlicherweise bereitgestellt wird. Jedoch wird die direkt markierte Kontrollsondensequenz 101 trotzdem so gewählt, dass sie als Kontrolle oder Referenz fungiert, die nicht mit der im Test befindlichen Target-Probe hybridisiert oder dieselbe beeinträchtigt. Im Gegensatz zu indirekt markierten Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 werden überdies direkt markierte Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 für eine präzise Merkmalslokalisierung während einer Merkmalsextraktion nach einer Hybridisierung verwendet, ihre Verwendung liefert jedoch keine auf die Hybridisierung bezogenen Normierungsdaten.
  • Bei den alternativen Ausführungsbeispielen des oben erwähnten Verfahrens 300, bei denen die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 indirekt mit der Kontrollmarkierung 107 assoziiert ist 304, vorzugsweise mittels einer Hybridisierung 307, kann das markierte Kontroll-Target 109 mit den Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 bevor, nachdem oder vorzugsweise zur selben Zeit, wie die Test-Target-Probe 113 mit den Oligomertestsonden hybridisiert wird 307, hybridisiert werden, wodurch lediglich ein Hybridisierungsschritt 307 erforderlich ist. Durch ein Hinzufügen 304 von markierten Kontroll-Targets 109 zu dem Hybridisierungsgemisch und durch ein Hybridisieren 307 der markierten Kontroll-Targets 109 zur selben Zeit wie die markierte Test-Target-Probe 113 hybridisiert wird 307, können die Hybridisierungsdaten überdies normiert werden.
  • Nach der Hybridisierung 307 und der Abfragung 207 können die standardmäßigen Rot- und Grün-Kanäle der Mikroarray-Abtastvorrichtung zur Erfassung von Testsignalen wie bei einem typischen Experiment (oben beschrieben) verwendet werden, während zumindest ein separater Kontrollkanal dazu verwendet wird, lediglich kontrollbezogene Signale zu erfassen. Dort, wo ein separates Kontrollsondensignal und ein separates Kontroll-Target-Signal vorliegen, weist die Abtastvorrichtung vorzugsweise zwei separate Kontrollkanäle auf, um die Kontrollsignale 108a, 108b separat zu erfassen. Eine Vierkanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung funktioniert besonders gut bei dem Ausführungsbeispiel, das zwei separate Kontrollsignale aufweist, und insbesondere bei dem Ausführungsbeispiel, bei dem zwei separate Kontrollsignale und zwei separate Testsignale vorliegen. Wie oben erwähnt wurde, funktioniert bei der Erfindung jedoch auch eine Zweikanal-Mikroarray-Abtastvorrichtung.
  • Nach dem Schritt des Abtastens 210 erzeugt die Mikroarrayvorrichtung 100 ein in dem Kontrollkanal bzw. den Kontrollkanälen erfasstes Signal für jedes einzelne Merkmal 106 auf dem Arraysubstrat 105. Vorteilhafterweise unterstützt ein Kontrollsignal 108 für jedes Merkmal 106 die Merkmalslokalisierung (besonders bei geringfügigen oder gedämpften Testsignalen von Merkmalen), vielleicht noch wichtiger ist jedoch die Tatsache, dass ein Kontrollsignal von einer hybridisierten Kontrollsonde 110 ein Mittel zum Normieren jedes Merkmals 106 bezüglich seiner extrem lokalen Hybridisierungs- und Abtastcharakteristika liefert.
  • Die Kontrollsonden können bereitgestellt werden 201, 301, indem die Kontrollsonden 101 vorsynthetisiert werden und das gesamte Oligomer/cDNA auf der Oberfläche 104 des Substrats 105 in dem Arraymuster von Merkmalen 106 unter Verwendung hinreichend bekannter Verfahren der Vorsynthese, Aufbringung und Immobilisierung auf der Oberfläche aufgebracht oder immobilisiert 302 werden. Alternativ dazu kön nen die Kontrollsonden 101 bereitgestellt werden 201, 301, indem die Kontrollsonden 101 unter Verwendung hinreichend bekannter Techniken der In-situ-Synthese in situ auf dem Substrat 105 synthetisiert werden. Desgleichen können die Oligomertestsonden 112 bereitgestellt werden 305, indem ganze Oligomere/cDNA vorsynthetisiert und aufgebracht oder angelagert 306 werden, oder indem ansonsten die Oligomertestsonden 112 unter Verwendung herkömmlicher Verfahren in situ synthetisiert werden. Die Oligomertestsonden 112, ob sie vorsynthetisiert oder in situ synthetisiert werden, können an der Oberfläche 104 des Substrats 105 angelagert werden oder können an dem gegenüberliegenden Ende 103 der Kontrollsonde 101 in jeder Merkmalsposition 106 angelagert werden. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Kontrollsonden 101 vorsynthetisiert und als ganze Kontrollsonden 101 auf die Oberfläche 104 des Mikroarraysubstrats 105 aufgebracht 302, und die Oligomertestsonden 112 werden in situ synthetisiert, entweder auf der Oberfläche 104 des Substrats 105 oder, vorzugsweise, an dem gegenüberliegenden Ende 103 der Kontrollsonde 101. Somit wird bei dem stärker bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens 400 zum Herstellen der Mikroarrayvorrichtung 100 gemäß Anspruch 13 das Mikroarray hergestellt, indem vorsynthetisierte Oligomere (Kontrollsonden) an jeder Merkmalsposition aufgebracht werden, so dass ein Ende der Oligomersequenz an dem Substrat 106 angelagert wird, zusätzlich zu einem Synthetisieren der Oligomertestsonden 107 in situ an dem gegenüberliegenden Ende 103 der vorsynthetisierten Kontrollsondensequenz.
  • In der Praxis können die Konzentrationen der ganzen Oligomerkontrollen 101 gegenüber der Konzentration der in situ-Oligomertestsonde 112 ohne übermäßiges Experimentieren seitens Fachleuten ermittelt werden. Dieses stärker bevorzugte Ausführungsbeispiel könnte schneller hergestellt werden, da die vorsynthetisierte Kontrolle 101 durch ein einziges Abfeuern einer dafür vorgesehenen Tintenstrahldüse an jedem Merkmal 106 aufgebracht werden könnte, wodurch die Anzahl der Zyklen, die zum Synthetisieren des kombinierten Kontrollpfeilers 101 und der in situ-Oligomertestsonde 112 benötigt werden, verringert wird. Mit anderen Worten könnte ein einziger Durchlauf der Tintenstrahlschreibvorrichtung Kontrollpfeiler 101 an allen Merkmalen 106 aufbringen, und anschließende Durchläufe der Tintenstrahlschreibvorrichtung könnten dazu verwendet werden, genau die Oligomertestsonden 112 an dem freien (keine Anlagerung aufweisenden) Ende 103 jedes Kontrollpfeilers 101 in situ zu synthetisieren. Der Kontrollpfeiler 101 ist bei diesem Ausführungsbeispiel an dem freien, keine Anlagerung aufweisenden Ende 103 nicht „mit einer Abdeckung versehen", so dass die Oligomertestsonde 112 mittels einer In-situ-Synthese zu dem nicht mit einer Abdeckung versehenen, freien Ende 103 hinzugefügt wird, um die Herstellungsvorteile eines Aufbringens vorsynthetisierter Kontrollsonden 101 als ersten Syntheseschritt bei der In-situ-Synthese der Oligomertestsonden 112 zu erlangen.
  • Um den oben erwähnten Herstellungsvorteil noch stärker zu betonen, erwäge man beispielsweise, dass der Kontrollpfeiler 101 eine Sequenz aus 15 Monomeren sei, und die Oligomertestsonde 112 eine Sequenz aus 25 Monomeren sei. Eine Verwendung einer In-situ-Synthese sowohl der Kontroll- als auch der Testsonden 101, 112 wäre äquivalent dazu, ein Oligomer zu synthetisieren, das an jedem Merkmal 106 des Mikroarraysubstrats 105 eine Sequenz von 40 Monomeren aufweist. Gemäß dem stärker bevorzugten Herstellungsverfahren 400 muss in dem Fall, dass der Kontrollpfeiler 101 einer Sequenz aus 15 Monomeren als vorsynthetisierte Kontrollsequenz aufgebracht wird, lediglich die Oligomertestsonde 112 einer Sequenz aus 25 Monomeren an das Ende 103 des vorsynthetisierten 15-Monomer-Kontrollpfeilers 101 in situ synthetisiert werden. Dieses stärker bevorzugte Verfahren 400 ist das Äquivalent (bezogen auf die Zeit und den Arbeitsaufwand) eines einfachen Herstellens einer Sequenz aus 26 Monomeren an dem Array statt der 40-Monomer-Sequenz. Dies stellt eine beträchtliche Ersparnis bezüglich der Zeit dar, die zum Herstellen der Mikroarrayvorrichtung 100 benötigt wird.
  • Bezüglich eines weiteren Aspekts der Erfindung ist ein Instrumentarium vorgesehen, das die Mikroarrayvorrichtung 100 und Anweisungen zur Verwendung der Vorrichtung 100 umfasst. Das Instrumentarium ist bezüglich eines Auswertens einer Test-Target-Probe 113 nützlich. Die Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung ist mit Kontrollsonden oder -pfeilern 101 und Oligomertestsonden 112, wie oben beschrieben, für jegliche der Ausführungsbeispiele 100a, 100b, 100c bestückt. Bei einem Ausführungsbeispiel des Instrumentariums 500 sind die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 direkt mit einer Kontrollmarkierung 107 markiert. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel sind die Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 nicht direkt markiert. Der Benutzer legt fest, ob eine Fähigkeit zu einer zerstörungsfreien Qualitätskontrolle oder tatsächliche Qualitätskontrolldaten für die eingehäuste Mikroarrayvorrichtung 100 vorgesehen sind. Wenn ein Qualitätstesten festgelegt wird, werden direkt markierte Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeiler 101 an dem Mikroarray 100 vorgesehen.
  • Das Instrumentarium umfasst ferner ein kontrollspezifisches Target-Material 109, das eine Kontrollmarkierung 107 aufweist. Das Kontroll-Target 109 ist komplementär zu der Sequenz von Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 und wird während Hybridisierungsexperimenten durch den Benutzer des Instrumentariums benutzt. Die mit der Kontrollsonde bzw. dem Kontrollpfeiler 101 assoziierte Kontrollmarkierung 107 verstärkt die Merkmalserfassbarkeit, so dass der Benutzer experimentelle oder Testhybridisierungssignale, die an jedem Merkmal 106 auf dem Mikroarray 100 emittiert werden, besser und präziser lokalisieren kann. Der Benutzer kann entweder das komplementäre, kontrollspezifische Target 109 mit der in der Auswertung befindlichen experimentellen Target-Probe 113 des Benutzers mischen und einen Hybridisierungsschritt 307 durchführen oder separat des Kontroll- Target 109 zu den Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101 und das Test-Target 113 zu den Oligomertestsonden 112 hybridisieren, je nach Ermessen des Benutzers. Bei einer Mischung in einer Hybridisierungslösung und einer gleichzeitigen Hybridisierung zu dem Mikroarray 100 liefert das Instrumentarium dem Benutzer vorteilhafterweise die Fähigkeit, die Hybridisierungsdaten unter Verwendung der Kontrollsignale 108 und der Testsignale zu normieren. Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel des Instrumentariums 500 können die Oligomertestsonden 112 auf dem Mikroarray 100 als direkt mit einer Testsondenmarkierung 114 markiert vorgesehen sein. Die bei dem Instrumentarium 500 enthaltenen Anweisungen informieren den Benutzer über das bei dem Instrumentarium verwendete Kontrollmarkierungssystem 107 und über die jeweiligen Kontrollsignale 108 (oder den Spektralbereich), die die Kontrollmarkierungen 107 erzeugen werden. Wenn eine direkt markierte Oligomertestsonde 112 vorgesehen ist, informieren die Anweisungen den Benutzer über den Spektralbereich des aus der bereitgestellten Testmarkierung emittierten Testsignals. Zum Zweck einer Unterscheidung von den Kontrollsignalen und dem Testsignal (falls bereitgestellt) sollte der Benutzer eine Test-Target-Markierung an der Test-Target-Probe 113 verwenden, die ein Test-Target-Signal erzeugt, das separat von den durch die Kontrollmarkierungen 107 erzeugten Kontrollsignalen und den durch die in dem Instrumentarium vorgesehene Testmarkierung bereitgestellten Testsignalen erfasst werden kann.
  • Die Vorrichtung 100 der Erfindung wird dazu verwendet, Polynukleotid- oder Oligonukleotid-Test-Target-Proben 113 auszuwerten. Ein Benutzer bringt die Vorrichtung 100 mit einer oder mehreren fluoreszierend markierten Test-Target-Proben 113 in Berührung, beispielsweise in Hybridisierungs- oder Bindungsuntersuchungen, und fragt die Arrayvorrichtung 100 im Anschluss an ein derartiges Inberührungbringen unter Verwendung hinreichend bekannter herkömmlicher Verfahren ab 207. Die Abfrage führt zu einem Ergebnis. Informationen über die Test-Target-Probe(n) 113 können aus den Ergebnissen der Abfrage erhalten werden. Eine Abfrage wird üblicherweise durch eine geeignete Abtastvorrichtung, wie sie oben beschrieben wurde, bewerkstelligt, die die Position und Intensität einer Fluoreszenz (von Fluoreszenzsignalen) an jedem Merkmal 106 des Arrays 100 lesen oder erfassen 220, 322 kann. Eine derartige Abtastvorrichtung kann beispielsweise der von Hewlett-Packard, Palo Alto, Kalifornien, erhältlichen Abtastvorrichtung GENEARRAY ähneln. Ergebnisse aus der Abfrage 207 können verarbeitete Ergebnisse 209 sein, beispielsweise wie diejenigen, die herkömmlicherweise anhand eines Zurückweisens eines Ablesewerts für ein Merkmal, das unter einer vorbestimmten Schwelle liegt, und/oder durch ein Ziehen von Schlussfolgerungen auf der Basis des aus dem Array gelesenen Musters (z.B. ob eine bestimmte Target-Sequenz in der Probe vorgelegen haben kann) erhalten werden, oder die Ergebnisse, die unter Verwendung der verbesserten Merkmalserfassungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung erhalten werden, derart, dass die Position jedes Merkmals 106 mit beträchtlicher Gewissheit bekannt ist und die bekannten Positionen mit den Positionen von Testsignalen (ob gedämpft oder hell), die aus hybridisierten Oligomertestsonden 120 erfasst werden, verglichen werden.
  • Gemäß der Verwendung in dem vorliegenden Dokument bedeutet der Begriff „Benutzer" eine Einzelperson, eine Firma oder eine andere Organisation, oder einen Angestellten, einen Berater, einen unabhängigen Vertragspartner, einen Funktionsträger, leitenden Angestellten oder dergleichen dieser Firma oder Organisation, und umfasst einen Agenten des Benutzers, der eine Mutter- oder Tochterorganisation des Benutzers oder des Agenten, einen Lieferanten, einen Subunternehmer, einen Kunden oder einen Verkäufer des Benutzers oder des Agenten oder dergleichen umfasst, der bzw. die direkt oder indirekt von der Verwendung der Vorrichtung 100 oder von den Informationen, die unter Verwendung der Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, profitieren mag. Ferner können ein oder mehrere der Benutzer der Hersteller der Vorrichtung 100 sein und immer noch in den Schutzumfang der Erfindung fallen. Ein Benutzer kann die Hybridisierungsuntersuchung 307 durchführen, während ein weiterer Benutzer die Abfragung 207 an einer von der Hybridisierungsposition entfernten Position vornehmen kann. Die Ergebnisse der Abfragung 207 (verarbeitet 209 oder nicht) können, falls gewünscht, zurück an den zuerst erwähnten Benutzer (z.B. mittels Kommunikation) oder an eine andere entfernte Position, geleitet werden und dort zum Zweck einer weiteren Verwendung durch den ersten oder zweiten Benutzer oder einen wieder anderen Benutzer empfangen werden. Überdies kann bzw. können sich der bzw. die Benutzer in einer Position bzw. in Positionen befinden, die von der Position, wo die Vorrichtung 100 hergestellt wird, entfernt ist bzw. sind. Ein Benutzer kann die Ergebnisse oder die aus den Ergebnissen gewonnenen Informationen an eine Position kommunizieren oder weiterleiten, die von der Position des Benutzers entfernt ist, und dies fällt trotzdem in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Eine Position ist „entfernt", wenn sie zumindest eine andere Örtlichkeit, einschließlich, aber nicht ausschließlich, eines anderen Raums in einem Gebäude, eines anderen Gebäudes, einer anderen Stadt, eines anderen Bundesstaates oder eines anderen Landes ist, oder wenn die Örtlichkeit beispielsweise zumindest eine, zumindest zehn oder zumindest hundert Meilen entfernt ist. Ein „Kommunizieren" von Informationen bedeutet ein Senden der diese Informationen darstellenden Daten als elektrische Signale über einen geeigneten Kommunikationskanal (beispielsweise ein privates oder öffentliches Netzwerk). Ein „Weiterleiten" von Informationen bezieht sich auf jegliches Mittel, diese Informationen von einer Örtlichkeit zur nächsten zu befördern, ob mittels eines physischen Transportierens dieser Informationen oder auf andere Weise (wo dies möglich ist), und umfasst zumindest im Fall von Daten ein physisches Transportieren eines Mediums, das die Daten trägt, oder ein Kommunizieren der Daten.
  • Nachdem der Benutzer das Instrumentarium empfängt, kann der Benutzer unter Verwendung des Mikroarrays 100 und einer Hybridisierungslösung, die die Test-Target-Probe 113 umfasst, eine Hybridisierungsuntersuchung 307 durchführen. Je nach dem Ausführungsbeispiel kann der Benutzer wählen, das markierte Kontroll-Target 109 aus dem Instrumentarium in die Hybridisierungslösung aufzunehmen. Die hybridisierten Oligomertestsonden 120 an dem Mikroarray 100 sind mit einer Testmarkierung 114 assoziiert, die ein Testsignal emittiert, wenn sie durch ein Licht angeregt wird, das sich von den Kontrollsignalen unterscheidet, die durch die mit den Kontrollsonden bzw. Kontrollpfeilern 101, 110 assoziierten Kontrollmarkierungen 107 erzeugt werden. Die Testmarkierung kann auf eine Aufforderung hin in das Instrumentarium aufgenommen werden oder kann durch den Benutzer bereitgestellt werden. Nach dem Hybridisierungsschritt 307 kann ein Benutzer das hybridisierte Mikroarray 100 mit einer Mikroarrayabtastvorrichtung abfragen 207. Bei dem Schritt des Abfragens 207 werden Testsignale erfasst 322, und Daten, die in einem Testkanal der Mikroarrayabtastvorrichtung gesammelt werden, und Kontrollsignale erfasst 220, und Daten in einem Kontrollkanal der Abtastvorrichtung gesammelt. Die Daten werden anschließend analysiert 209, damit der Benutzer Charakteristika der Test-Target-Probe 113 bestimmt. Nachdem die Daten gesammelt wurden, können alle oder ein Teil der Daten an eine Örtlichkeit übertragen werden, wo sie empfangen und möglicherweise verwendet oder analysiert werden 209.
  • Die Vorrichtung 100 und die Verfahren 200, 300, 700 und das die Vorrichtung 100 der vorliegenden Erfindung enthaltende Instrumentarium weisen zumindest die folgenden Vorteile auf. Wenn die Kontrollsonde bzw. der Kontrollpfeiler 101 zur gleichen Zeit bezüglich eines bekannten Kontroll-Targets 109 hybridisiert wird, wie die Testsonde 112 mit dem Test-Target 113 hybridisiert wird, dann kann jedes Merkmal 106 vorteilhafterweise direkt in Bezug auf verschiedene Signaltendenzen (global oder lokal) über das Array hinweg normiert werden. Somit können Signalgradienten über das Array hinweg, die auf Hybridisierungsanomalien o der Abtastvorrichtungsfokussierungsprobleme zurückzuführen sind, kompensiert werden, da jede Sonde oder jeder Pfeiler 101 ein „Referenz"-Kontrollsignal aufweist (das separat erfassbar ist, vorzugsweise in einem anderen Kanal), mit dem ein Vergleich und eine Normierung durchgeführt werden kann.
  • Ferner sind alle Merkmalspositionen 106 für ein „Sondierungs-Target" (d.h. zum Hybridisieren von Oligomertestsonden 112 mit den Test-Target-Proben 113) verfügbar, statt dass ein gewisser Prozentsatz der Merkmale 106 dafür reserviert ist, lediglich als Kontrollmerkmale zu fungieren, wie dies bei manchen herkömmlichen Verfahren anzutreffen ist. Dies erhöht die Nutzkapazität des Mikroarrays 100. Des Weiteren kann, wenn eine Kontrollsonde oder ein Kontrollpfeiler 101 direkt mit einer Kontrollmarkierung 107 markiert wird, ein gewisser Grad einer zerstörungsfreien Qualitätskontrolle vor einer Hybridisierung an einem Substrat 105 durchgeführt werden, indem einfach in dem Kanal, der für das Kontrollsignal von der markierten Kontrollsonde bzw. dem markierten Kontrollpfeiler 101 geeignet ist, eine Abtastung durchgeführt wird. Und nicht zuletzt kann eine Ganzes-Oligomer-Aufbringung der Kontrollsonde bzw. des Kontrollpfeilers 101 dazu verwendet werden, den Herstellungsdurchsatz zu erhöhen.
  • Somit wurden mehrere Ausführungsbeispiele einer neuartigen Mikroarrayvorrichtung 100 mit einer verbesserten Merkmalserfassbarkeit, Verfahren 200, 300 einer Merkmalserfassung an dem Mikroarray 100, eines Verfahrens zum Herstellen des Mikroarrays 100 und eines Instrumentariums, das die Mikroarrayvorrichtung 100 umfasst und für Hybridisierungsexperimente oder -untersuchungen verwendet wird, beschrieben. Man sollte verstehen, dass die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich einen Teil der vielen spezifischen Ausführungsbeispiele, die die Prinzipien der vorliegenden Erfindung darstellen, veranschaulichen.

Claims (15)

  1. Ein Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c), das folgende Merkmale aufweist: ein Arraymuster aus Merkmalspositionen (106); eine Kontrollsonde (101), die eine Kontrollsequenz von Nukleinsäuren umfasst, wobei ein Ende (102) der Kontrollsequenz an einer Merkmalsposition (106) auf einer Oberfläche (104) eines Mikroarraysubstrats (105) angelagert ist; eine Oligomertestsonde (112), die eine sich von der Kontrollsequenz unterscheidende Sequenz von Nukleinsäuren umfasst und die an der Merkmalsposition (106) angelagert ist, derart, dass jede Merkmalsposition (106) eine Kontrollsonde (101) und eine Oligomertestsonde (112) umfasst; und eine Kontrollmarkierung (107), wobei die Kontrollmarkierung direkt und/oder über eine Target-Sequenz, die zu der Sonde komplementär ist, an einer Kontrollsonde angelagert ist, wobei jede Kontrollmarkierung, wenn sie belichtet wird, in der Lage ist, ein Kontrollsignal zu emittieren, wobei das Kontrollsignal bezüglich der Kontrollsonde (101) eindeutig ist.
  2. Das Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c) gemäß Anspruch 1, bei dem die Kontrollmarkierung (107) direkt an der Kontrollsonde (101) angelagert ist.
  3. Das Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c) gemäß Anspruch 1 oder 2, das eine Testmarkierung umfasst, die direkt oder mittels einer zu der Sonde komplementären Target- Sequenz an der Oligomertestsonde (101) angelagert ist, wobei sich die Testmarkierung von der Kontrollmarkierung unterscheidet und, wenn sie belichtet wird, in der Lage ist, ein Testsignal zu emittieren, derart, dass sich das Testsignal von dem Kontrollsignal unterscheidet und separat von demselben erfassbar ist.
  4. Das Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Kontrollmarkierung (107) an einem Kontroll-Target-Material (109) angelagert ist, das zu der Kontrollsonde (101) komplementär ist, wobei das Kontroll-Target-Material zu der Kontrollsonde hybridisiert ist.
  5. Das Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c) gemäß Anspruch 3, bei dem die Testmarkierung an einer Test-Target-Probe (113) angelagert ist, die zu der Oligomertestsonde (112) komplementär ist, wobei die Test-Target-Probe zu der Oligomertestsonde hybridisiert ist.
  6. Das Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Oligomertestsonde (112) an dem Ende (103) der Kontrollsequenz, das dem an dem Substrat angelagerten Ende gegenüberliegt, angelagert ist, so dass sich die Kontrollsonde (101) zwischen der Oligomertestsonde (112) und der Oberfläche (104) des Substrats (105) erstreckt.
  7. Ein Verfahren (200) zum Durchführen einer zerstörungsfreien Qualitätskontrollauswertung, das folgende Schritte umfasst: Abtasten (210) eines Mikroarrays gemäß Anspruch 3 oder 5 mit einem Licht, um die Kontrollmarkierung (107) anzuregen, an jedem Merkmal (106); Erfassen (220, 221a) des Kontrollsignals an jedem Merkmal (106); und Auswerten (209) von Daten, die über die erfassten Kontrollsignale gesammelt wurden.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, das folgende Schritte umfasst: Inberührungbringen des Mikroarrays (100, 100a, 100b, 100c) mit einer Hybridisierungslösung, die eine markierte Test-Target-Probe (113) und ein markiertes kontrollspezifisches Target-Material (109) umfasst, so dass die Test-Target-Probe zu der Testsonde (120) hybridisiert wird und das kontrollspezifische Target-Material zu der Kontrollsonde (110) hybridisiert wird; Abtasten (210) des Mikroarrays (100, 100a, 100b, 100c) mit einem Licht, um die Kontrollmarkierung (107) und die Testmarkierung anzuregen; Erfassen (220, 221a, 221b) des Kontrollsignals von der hybridisierten Kontrollsonde (110) an jeder Merkmalsposition (106); separates Erfassen (322) der Testsignale von den hybridisierten Testsonden (120) an einem oder mehreren Merkmalen (106); und Verwenden der erfassten Kontrollsignale als Referenzdaten, die mit den separat erfassten Testsignalen normiert werden sollen, um die hybridisierten Testsonden (120) ungeachtet der Qualität oder Quantität des erfassten Testsignals auf dem Mikroarray (100, 100a, 100b, 100c) zu lokalisieren.
  9. Ein Verfahren zum Herstellen eines Mikroarrays (100, 100a, 100b, 100c), wobei das Mikroarray ein Mikroar raysubstrat (105) aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Anlagern einer Kontrollsonde (101), die eine Kontrollsequenz von Nukleinsäuren umfasst, über ein Ende der Kontrollsequenz an einer Merkmalsposition auf einer Oberfläche des Mikroarraysubstrats, Anlagern einer Kontrollmarkierung (107), die, wenn sie durch ein Licht angeregt wird, in der Lage ist, ein Kontrollsignal an die Kontrollsonde oder an eine zu der Sonde komplementäre Target-Sequenz zu emittieren und die Target-Sequenz zu der Sonde zu hybridisieren; wobei das Kontrollsignal bezüglich der Kontrollsonde eindeutig ist, und Anlagern einer Oligomertestsonde (112) an jeder Merkmalsposition, wobei die Oligomertestsonde eine Sequenz von Nukleinsäuren umfasst, die sich derart von der Kontrollsequenz unterscheidet, dass jedes Merkmal die Kontrollsonde und Oligomertestsonde umfasst.
  10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem die Kontrollmarkierung (107) direkt an der Kontrollsonde (101) angelagert ist.
  11. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem die Kontrollmarkierung (107) mittels Hybridisierung an der Kontrollsonde (101) angelagert wird, wenn sie mit einem kontrollspezifischen Target-Material (109), das die Kontrollmarkierung umfasst, in Berührung gebracht wird.
  12. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, 10 oder 11, das folgende Schritte umfasst: Anlagern der Kontrollmarkierung an der Kontrollsonde (101) und Anlagern einer Testmarkierung an der Oligo mertestsonde (112) durch Hybridisierung bei einem Inberührungbringen mit einem Hybridisierungsgemisch, wobei das Gemisch eine zu der Oligomertestsonde komplementäre markierte Test-Target-Probe (113) und ein zu der Kontrollsonde komplementäres markiertes kontrollspezifisches Target-Material (109) umfasst, wobei das markierte Kontroll-Target-Material die Kontrollmarkierung umfasst und die markierte Test-Target-Probe die Testmarkierung umfasst und wobei sich die Testmarkierung von der Kontrollmarkierung unterscheidet.
  13. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, das folgende Schritte umfasst: Vorsynthetisieren der Kontrollsonde (101); Anlagern eines Endes (102) der vorsynthetisierten Kontrollsondensequenz (101) an der Oberfläche (104) des Substrats (105) an jeder Merkmalsposition (106); und Synthetisieren der Oligomertestsonde (112) in situ auf dem gegenüberliegenden Ende (103) der vorsynthetisierten Kontrollsondensequenz (101).
  14. Ein Instrumentarium zum Auswerten einer Probe einer Test-Target-Nukleinsäuresequenz, das folgende Merkmale aufweist: eine Vorrichtung, die ein Mikroarraysubstrat (105) umfasst; eine Kontrollsonde (101), die eine Kontrollsequenz von Nukleinsäuren umfasst, die an einem Ende an dem Substrat an einer Merkmalsposition (106) auf einer Oberfläche (104) des Substrats angelagert sind; und eine Oligomertestsonde, die eine sich von der Kontrollsequenz unterscheidende Sequenz von Nukleinsäuren um fasst und die an jeder Merkmalsposition angelagert ist, ein zu der Kontrollsonde komplementäres kontrollspezifisches Target-Material (109), wobei das Kontroll-Target eine Kontroll-Target-Markierung (107) umfasst, die, wenn sie belichtet wird, in der Lage ist, ein Kontroll-Target-Signal zu emittieren, wobei das Signal bezüglich der Kontrollsonde eindeutig ist; und Anweisungen zur Verwendung der Vorrichtung und des kontrollspezifischen Target-Materials.
  15. Das Instrumentarium gemäß Anspruch 14, bei dem die Kontrollsonde (101) eine Kontrollsondenmarkierung (107) umfasst, die in der Lage ist, ein Kontrollsondensignal zu emittieren, wobei sich das Kontrollsondensignal von dem Kontroll-Target-Signal unterscheidet.
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