DE60127238T2

DE60127238T2 - Verfahren zur Detektion pathogener Organismen

Info

Publication number: DE60127238T2
Application number: DE60127238T
Authority: DE
Inventors: Björn Herrmann; Leif Kirsebom; Pelle C/O Leif Kirsebom Stolt
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-01-10
Filing date: 2001-01-10
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2021-01-11
Also published as: MXPA02006588A; JP5214083B2; NO20023311D0; HUP0301009A2; CA2397176A1; ATE356884T1; EP1254258A1; US20030134295A1; RU2002121510A; EE200200378A; ES2283391T3; DE60127238T3; AU2721701A; CN1394235A; SK9582002A3; EP1254258B1; IL150670A0; JP2003519494A; NO20023311L; SE0000061D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion pathogener Organismen, wobei das Verfahren die Unterscheidung zwischen Arten umfasst. Das Verfahren ist insbesondere geeignet zur Bestimmung und Diagnose einer Infektion durch pathogene Organismen, die schwer und/oder mühsam mit konventionellen Verfahren zu bestimmen sind. Das Verfahren beruht auf der Analyse spezifischer variabler Regionen des RNase P RNA-Gens.
Hintergrund der Erfindung
RNase P ist ein Enzym, das in allen lebenden Zellen vorhanden ist. Es katalysiert die Abspaltung von 5'-Leader-Sequenzen aus tRNA-Vorläufermolekülen. In Bakterien besteht RNase P aus einem RNA-Molekül mit einer Länge von einigen 400 nt (11,28) und einem kleinen (ca. 120 aa) Protein (33). Bei Bakterien zeigte sich, dass die RNA-Einheit als effizienter Katalysator in vitro fungiert (12); RNase P ist deshalb zumindest in diesen Organismen ein Ribozym (ein RNA-Molekül, das chemische Reaktionen katalysiert). Bakterielle RNase P Rnas wurden in zwei Hauptstrukturklassen unterteilt. Typ A ist die üblichste Strukturklasse und Typ B wird in den G+C-Gramm-positiv armen Bakterien gefunden (50). Die Sekundärstruktur von RNase P RNA wurde für viele Bakterienlinien charakterisiert und ein Unterschied in den Helices liefert nützliche phylogenitische Information (51).
Die RNase P RNA-Gensequenzen sind zwischen Bakteriengruppen nicht sehr gut konserviert (5), aber innerhalb einer Klasse können die Gene ziemlich ähnlich sein. Mehrere Hundert RNase P RNA-Sequenzen sind in der RNase P RNA-Datenbank ((http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/RnaseP/home.html) enthalten.
Die Reihe Chlamydiales ist eine Gruppe obligatorisch intrazellulärer Bakterien, die unikalen Entwicklungszyklus und Pathogenität aufweisen. Sie sind für Menschen und eine große Vielzahl von Tieren Parasiten. Arten in der Chlamydiaceae-Familie wurden jüngst in zwei Gattungen, Chlamydia und Chlamydophila, die neun Arten enthalten (43) umklassifiziert. Zusätzlich gehören neue Familien nun zu Chlamydiales, und sie umfassen Parachlamydiaceae und Simkaniaceae (43). Die typenspezifische Art von Parachlamydiaceae ist Parachlamydia acanthamoebae, ein Symbiont der Amöben Acanthamoeba castellani, und ein gelegentliches Pathogen für Leute, die diese Amöben (34) erwerben. Simkania negevansis ist die typenspezifische Art von Simkaniaceae und verursacht, wie viele andere Chlamydien, eine Infektion des Menschen (56, 57, 61).
Es wurde kürzlich gezeigt, dass die RNase P RNA-Gene in der Gattung Chlamydia sich in den Arten ausreichend unterscheiden, um als diagnostisches Mittel verwendet zu werden (13); das Gen ist somit potentiell für eine Stammdifferenzierung brauchbar. Die Unterschiede zwischen Sequenzen geben auch Hinweise darauf, welche Teile des Moleküls für die katalytische Wirksamkeit wichtig sind, was mutationelle und strukturelle Untersuchungen vervollständigt.
Eine andere wichtige Familie von Pathogenen, bei denen schnelle und empfindliche Diagnosemethoden lebenswichtig sind, sind die Mycobakterien. Traditionelle diagnostische Methoden stützen sich auf die Demonstration von säurebeständigen Bazillen in klinischen Proben nach Kultivierung. Dies ist verlässlich, aber zeitaufwendig, da langsam wachsende Arten, wie z.B. Mycobacterium tuberculosis, sechs bis acht Wochen brauchen können, um eine ausreichend große Population zu bilden. In den letzten paar Jahren wurden viele Detektionsassays auf PCR-Basis entwickelt, z.B. auf Basis des hsp60-Gens (16) oder der variablen durchsetzenden Region zwischen den 165- und 23S-rNA-Genen (15, 24, 30), und dieser Trend hält an.
Die RNase P RNA-Gensequenz von M. tuberculosis ist bekannt (6), sowie die von M. bovis BCG und M. leprae. Die M. bovis-Sequenz ist identisch mit der von M. tuberculosis, während zu M. leprae Unterschiede bestehen. Die Regionen im RNase P RNA-Gen, die durch andere Mittel als für die katalytische Aktivität wichtig festgestellt wurden, wurden unter den Mycobakterien fast vollständig konserviert. Die enge Verwandtschaft zwischen mikrobiellen Gattungen, wie z.B. Mycobakterien, haben eine Unterscheidung zwischen Arten der gleichen Gattung sehr schwierig oder unmöglich gemacht.
US-Patent Nr. 5 574 145 beschreibt ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Arten unter Verwendung variabler Regionen im Genom. Es wird jedoch nicht die Verwendung der P3- oder P19-Regionen erwähnt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst das Problem der Unterscheidung zwischen Arten innerhalb der gleichen Gattung, wie z.B. von Mycobakterien und Chlamydien. Außerdem löst die vorliegende Erfindung das Problem der Bestimmung von Pathogenen, die mit konventionellen Verfahren schwierig und/oder mühsam zu bestimmen sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip für die Diagnose einer Infektion durch irgendeine Art eines pathogenen Organismus verwendet werden.
Die Pathogene umfassen somit Archaebakterien und Eubakterien. Die letzteren enthalten als ihre Hauptgruppen Gleitbakterien (gliding bacteria), Spirocheten, starre Bakterien (rigid bacteria) und Mykoplasma. Starre Bakterien umfassen Actinomyceten und einfache einzellige Bakterien. Die letztere Gruppe besteht aus obligatorischen Intrazellular-Parasiten und frei lebenden Bakterien. Unter den frei lebenden Varianten gibt es (1) gramm-positive Bakterien, in welcher Gruppe sich (a) Cocci, (b) nicht-sporenbildende Stäbchen, (c) sporenbildende Stäbchen, die weiter in obligatorische Aeroben und obligatorische Anaeroben unterteilt werden können, befinden; und (2) gramm-negative Bakterien, unter denen sich (a) Cocci, (b) nicht-enterische Stäbchen mit Spiralformen und geraden Stäbchen und (c) enterische Stäbchen mit fakultativen Anaeroben, obligatorischen Aeroben und obligatorischen Anaeroben befinden. Für spezifische Bakterienarten siehe ferner Medical Microbiology (Brooks et al., Hg., 19. Ausflage (1991), Prentice-Hall International, USA).
Die Pathogene umfassen auch Pilze, einschließlich pathogener Hefen und Schimmel. Beispiele sind Apergillus, Candida, Absidia, Mucor, Rhizopus, Cryptococcus, Hisoplasma, Blastomyces, Coccidiodes, Paracoccidiodes, Sporotrichosis, Chromoblastomycosis, Macetoma, Microsporum, Trichophyton und Epidermophyton.
Andere Pathogene, die diagnostiziert werden können, können unter den Protozoen und Algen aufgefunden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich auch zur Bestimmung nicht-pathogener Bakterien verwendet werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Bakterien besonders interessant: Bakterien von Phylum II – Grünbakterien; Phylum III – Deinobakterien (Thermus/Deinococcus); Phylum IV – Spirocheten; Phylum VI – gramm-negative Anaeroben und Gleitbakterien (Bakteroiden/Flavobakterium); Phylum VIII – Chlamydia; Phylum IX – gramm-positive mit den drei Linien; Linie A ("Gramm-Negative"), Familie B (G+C-reiche Bakterien), Familie C (G+C-arme Bakterien); Phylum X – Cyanobakterien; Phylum XI – Proteobakterien mit den fünf Familien alpha, beta, gamma, delta und "E".
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben Unterschiede im RNase P RNA-Gen bestimmt, die ausreichen, um eine Artenbestimmung zu ermöglichen.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion pathogener Organismen, einschließlich einer Unterscheidung von Arten, umfassend die Verwendung der P3- und/oder P19-hypervariablen Region(en) des RNase P RNA-Gens als diagnostisches Analysenziel.
Der Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens kann z.B. die Diagnose einer durch pathogene Bakterien verursachten Infektion oder die epidemische Untersuchung der Verbreitung von arzneimittelbeständigen Bakterien sein.
Vorzugsweise wird die Region (werden die Regionen) amplifiziert, wie z.B. durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und sequenziert oder auf andere Weise zur Artenspezifizierung einem Fingerprinting unterzogen, wie z.B. durch Heteroduplexanalyse, Größenbestimmung, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Schmelzpunktbestimmung usw.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Bakterien, einschließlich einer Unterscheidung von Arten, umfassend die Amplifizierung von Nucleinsäuren hypervariabler Region(en) des RNase P RNA-Gens aus den Pathogenen; Ausbilden eines Heteroduplex mit einer verwandten Nucleinsäure; und die Analyse davon.
Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Verfahren, das eine Heteroduplexanalyse einbezieht, umfasst eine Amplifizierungsreaktion, eine Hybridisierungsstufe und eine nicht-denaturierende Gelelektrophoreseanalyse. Das gesamte Verfahren kann in weniger als 24 Stunden durchgeführt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nun näher in Bezug auf zwei nicht-beschränkende Beispiele beschrieben.
BEISPIEL 1: MYCOBAKTERIEN
MATERIALIEN UND METHODEN
Bakterienstämme. In dieser Untersuchung verwendete Mycobakterien sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgelistet. Klinische Stämme wurden bereits durch 16S RNA-Gensequenzierung in den entsprechenden Instituten ihres Ursprungs typisiert. Die RNase P RNA-Sequenzen von M. tuberculosis, M. bovis BCG und M. leprae wurden aus der GenBank-Sequenzdatenbank abgefragt.
Tabelle 1
PCR-Amplifizierung der RNase P RNA-Gene
Auf der Basis der publizierten Sequenzen von M. tuberculosis und M. leprae (GenBank Accession Nr. Z70692 bzw. L78818) wurde ein Primerpaar entworfen, das nahe der Enden des Gens hybridisierte. Der Forward-Primer tbf (5' CGGATGAGTTGGCTGGGCGG 3', SEQ ID NO: 1) und der Reverse-Primer tbr (5' CTTGGCCTGTAAGCCGGATT 3', SEQ ID NO: 2) zeigen beide einen Mismatch zu der M. leprae-Sequenz. Unter Verwendung dieses Primerpaars konnte das RNase P-Gen aller getesteten Mycobakterien amplifiziert werden. Die meisten Umsetzungen wurden an unbehandelten Mycobakterien an Kulturen durchgeführt, ohne vorherige Isolierung und Reinigung von chromosomaler DNA. PCR wurde in 50 μl- Reaktionen in einem Rapidcycler Capillary PCR-Apparat (Idaho Teehnology, Idaho Falls, USA) mit den folgenden Parametern durchgeführt: 94°C, 10''; 50°C 10''; 72°C 125''.
Sequenzieren. PCR-Produkte wurden über 1 %-Agarosegelen zur Entfernung der Primer gereinigt. Ca. 1/20 der gereinigten DNA wurde für eine automatische Sequenzierung mit den gleichen Primern, die in der Amplifizierungsreaktion verwendet wurden, verwendet. Das Sequenzieren wurde an einem Applied Biosystems Modell 310 Capillary Sequencer durchgeführt.
Heteroduplexanalyse. Für die Heteroduplexanalyse der RNase P P3-Schleifenregion wurde DNA mit den Oligonucleotiden tbf und 280r (5' CTTGCTTGCCCTCCCTTTGCC 3', SEQ ID NO: 3) amplifiziert (50 μl-Reaktionen), was ein Produkt von ca. 250 bp ergab. Die Produkte wurden gelgereinigt und ca. 1/10 der Produkte in jeder Analyse verwendet. DNA wurde mit gleichen Mengen DNA von M. tuberculosis gemischt, auf 95°C 1 Minute lang erhitzt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Produkte wurden auf 10% nicht-naturierenden Polyacrylamid-Gelen bei 15 mA während 14 Stunden getrennt. Banden wurden durch Silberanfärben sichtbar gemacht.
Silberanfärben von DNA-Gelen. Die Gele wurden in 10% Ethanol 5 Minuten lang fixiert und in 1 % Salpetersäure 5 Minuten inkubiert. Das Anfärben wurde mit einer 1 mg/ml-Lösung von Silbernitrat während 30 Minuten durchgeführt. Die Banden wurden in einer Natriumcarbonat/Formaldehyd-Lösung (15 g wasserfreies Natriumcarbonat und 300 μl 37%-Formaldehyd in 500 ml Wasser) entwickelt, bis sie deutlich sichtbar waren. Die Reaktion wurde mit 10% Essigsäure gestoppt.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse von Beispiel 1 werden nachstehend in Verbindung mit den anliegenden Zeichnungen, 1–5, angegeben:
1 Sequenzzuordnung der RNase P RNA-Gene aus Mycobakterien. Die Bindestriche zeigen Sequenzidentitäten an; Sternchen markieren Basen, die in einer Sequenz fehlen. Die Sequenz von M. tuberculosis wird als SEQ ID NO: 11 angegeben.
2 Sekundärstruktur von M. tuberculosis-RNase P RNA, SEQ ID NO: 12. Die unter den Mycobakteriellen Arten abweichenden Regionen sind gekennzeichnet. Kleine variable Regionen werden nicht dargestellt.
3 Sequenzzuordnung des RNase P RNA-Gens von M. gastri (identische Sequenz aus zwei verschiedenen Stämmen) und sechs Stämmen von M. kansasii. Für die M. gastri-Sequenz unikale Basen sind fett gekennzeichnet. Die Sequenz von M. kansasii 12748 ist als SEQ ID NO: 13 angegeben.
4A Heteroduplexanalyse der ersten 280 bp aus RNase P RNA-Genregionen verschiedener Mycobakterien. DNA aus verschieden Mycobakteriellen Arten wurde mit M. tuberculosis-DNA hybridisiert, und die resultierenden Duplexe auf einem 10% Polyacrylamid-Gel getrennt. Spur 1, Kontroll-DNA von M. tuberculosis; Spur 2 M. avium; Spur 3 M. intracellulare; Spur 4 M. malmoense; Spur 5 M. celatum; Spur 6 M. kansasii; Spur 7 M. vaccae; Spur 8 M. xenopii.
4B Heteroduplexanalyse von DNA, amplifiziert aus klinischen Proben von Bakterien, die als entweder M. intracellulare oder M. avium angenommen wurden. Spur 1, Kontroll-DNA aus M. tuberculosis; Spuren 2, 3, 6 DNA aus vermutetem M. avium; Spuren 4, 5, 7 DNA aus vermutetem M. intracellulare; Spur 8 Kontroll-DNA aus M. avium; Spur 9: Kontroll-DNA aus M. intracellulare.
5 vorgeschlagene Struktur für die P18-Schleife von RNase P aus Mycobakterien, basierend auf Sequenzvariationen innerhalb der Gattung. Die Sequenzen sind von A) M. tuberculosis; SEQ ID NO: 18B; B) M. smegmatis; SEQ ID NO: 19; C) M. marinum; SEQ ID NO: 20.
Bei den PCR-Amplifizierungen des RNase P RNA-Gens aus Mycobakterien unter Verwendung der O1igonucleotide tbf und tbr ergab jede Reaktion ein einziges Fragment im Bereich von 387 (M. celatum) bis 428 (M. tuberculosis) bp, abhängig von den Mycobakteriellen Arten.
Unter Verwendung dieser Oligonucleotide war es möglich, die RNase P RNA-Gene aus allen getesteten Mycobakterien zu amplifizieren unter Verwendung unbehandelter Zellen aus Plattenkulturen. Es war keine vorhergehende Reinigung chromosomaler DNA notwendig.
Eine Zuordnung der Sequenzen (1) zeigt sehr gut konservierte Nucleotidsequenzen entlang des meisten Teils des Gens, mit der Ausnahme von drei großen Regionen, wo die Ähnlichkeiten zusammenbrechen und keine adäquate Zuordnung möglich ist. Die Gesamtähnlichkeit der Gene betrug zwischen 80 und 85%. Dies ist jedoch keine sehr informative Zahl, da die Ähnlichkeit innerhalb der gut konservierten Regionen nahe 100% ist, während die unterschiedlichen Regionen zu unterschiedlich sind, um überhaupt zugeordnet zu werden.
Wenn die unterschiedlichen Regionen in einer zweidimensionalen Darstellung des RNase P RNA-Moleküls lokalisiert werden (2), ist es auffallend, dass die meisten der Unterschiede in Regionen fallen, die zu den Enden von Stamm-Schleifen-Strukturen gehören. Die Hauptsächlichen unterschiedlichen Regionen sind die P3-, P16- und P19-Schleifen. Zusätzlich gibt es eine Deletion in der P12-Schleife in M. smegamatis und M. fortuitum, die mehrere ungepaarte Nucleotide dieser Schleife umfassen. Die Hauptunterschiede von Arten liegen innerhalb der P3- und P19-Schleifen.
Alle analysierten Arten wiesen spezifische RNase P RNA-Gensequenzen auf. Mehrere eng verwandte Arten konnten auf der Basis der RNase P RNA-Sequenzen unterschieden werden. Die Mitglieder des MAI-Komplexes M. avium und M. intracellulare unterschieden sich in mehreren Positionen, einschließlich einer Deletion in der P19-Schleife in M. avium (2). Die sehr nahe verwandten (Unterarten) M. paratuberculosis und M. avium waren auf der Basis von RNase P RNA-Gensequenzen nicht unterscheidbar.
Soweit unsere Analyse innerhalb einer Art durchgeführt wurde, sind die Sequenzen identisch. Wir sequenzierten klinische Proben aller Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti und M. tuberculosis ssp asiaticum), ohne irgendwelche Abweichungen von der publizierten M. tuberculosis-Sequenz (6) festzustellen. Mitglieder dieser Gruppe konnten deshalb auf der Basis von Unterschieden im RNase P RNA-Gen nicht unterschieden werden.
Für einige Arten wurde die Möglichkeit von Sequenzunterschieden zwischen verschiedenen Serovars von Mycobakterien untersucht. Im Falle von M. avium und M. intracellulare wurde das RNase P RNA-Gen aus fünf klinischen Isolaten (Tier) von M. avium und fünf M. intracellulare (Mensch) amplifiziert und sequenziert. Es konnten keine Unterschiede zwischen Serovaren festgestellt werden.
Die einzige Art, bei der hetrogene RNase P RNA-Gensequenzen zwischen verschiedenen Serovaren beobachtet wurden, war M. kansasii (3). Die Unterschiede waren hauptsächlich C-zu-T-Transitionen. Zwei Stämme von M. gastri wurden ebenfalls sequenziert, aber in dieser Art waren die Gensequenzen zwischen Isolaten identisch. In vier Positionen unterschieden sich alle RNase P RNA-Gensequenzen von M. kansasii-Stämmen von solchen von M. gastri. Drei dieser Unterschiede waren C-zu-T-Transitionen, während der vierte eine C-zu-A-Transversion war.
Die in den P3- und P19-Schleifen aufgefundene Unterscheidung von Arten wurde als groß genug angesehen für einen Versuch einer einfachen diagnostischen Anwendung durch Heteroduplexanalyse. Die hypervariable P3-Region wurde für diese Analyse ausgewählt und unter Verwendung der tbf- und 280r-Oligonucleotide amplifiziert. Jede PCR-Reaktion ergab einzelne Banden von ca. 250 bp. Die Region von M. tuberculosis wurde als Standard verwendet und wurde in gleichen Mengen mit den Produkten aus verschiedenen Arten gemischt. Nach Trennen der Fragmente auf nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen wurden die Banden mit Silber angefärbt. Es waren deutliche Unterschiede in den Heteroduplexmustern zwischen allen getesteten Arten vorhanden (4A).
Diese Analyse wurde ferner auf klinische Proben (aus dem Swedish Institute of Infectious Disease Control) angewendet, die vorher typisiert wurden oder nicht. Das resultierende Gel (4B) der Proben in den Spuren 2, 3 und 6 kann M. avium zugeschrieben werden (vergleiche mit Spur 8), während die Proben 4, 5 und 7 M. intracellulare zu sein scheinen (vergleiche mit Spur 9). In jedem Fall bestätigte das Sequenzieren des RNase P RNA-Gens die aus der Heteroduplexanalyse erhaltenen Ergebnisse.
DISKUSSION
Verglichen mit dem Fall von Clamydia sind die RNase P-Gene aus Mycobakterien besser unter den Arten konserviert, mit Gesamtähnlichkeiten von 80 bis 85%. Dieser Gesamtwert ist jedoch irreführend, da die meisten Unterschiede in spezifischen Regionen zusammenfallen, wo die Variierbarkeit von einem Grad ist, der eine unzweifelhafte Zuordnung unmöglich macht. Alle Mycobakteriellen RNase P RNAs zeigen eine P15- bis P17-Region des Clamydia und Cyanobakterien-Typs (13, 31), was bei der nahen Verwandtschaft der Organismen kaum überraschend ist.
Alle untersuchten Arten wiesen ihre eigenen auffälligen Sequenz-Charakteristika auf. Innerhalb einer Art wurden keine Unterschiede gesehen, ausgenommen für M. kansasii, einer Art, die aus anderen Gründen als heterogen beschrieben wurde (1, 14, 32). Obwohl mehrere der Variantenpositionen zwischen M. kansasii und M. gastri geteilt wurden, sind genügend M. kansasii-spezifische Basen im Gen, um eine Unterscheidung von nahe verwandtem M. gastri durch Mikrosequenzierung oder Heteroduplexanalyse zu ermöglichen. M. kansasii ist eine wesentliche Ursache von Lungenkrankheit aus nicht-tuberkulösen Mycobakterien.
Die Kombination sehr gut konservierter Regionen und hypervariabler Stellen in der RNase P RNA-Gensequenz ermöglicht ein schnelles Typisieren unbekannter Mycobakterieller Proben. Oligonucleotide hybridisieren mit perfekter oder nahezu perfekter Übereinstimmung mit konservierten Regionen, was eine verlässliche Amplifizierung der dazwischen liegenden variablen Teile ermöglicht.
Der M. avium-Komplex (MAI), der M. avium und M. intracellulare umfasst, ist eine hauptsächliche opportunistische Infektion bei AIDS-Patienten (21, 22). Eine Unterscheidung zwischen den Mitgliedern dieses Komplexes erfordert molekulare Methoden, und unsere Heteroduplexanalyse von PCR-Produkten aus dem RNase P RNA-Gen ist eine rasche und ziemlich wenig teure Alternative zu derzeitigen Methoden (7, 8, 10, 18, 19, 23, 27, 29).
Sequenzvarianten im RNase P RNA-Gen zwischen Arten können ebenfalls Hinweise auf die molekulare Struktur der RNA sein. Im Fall der Mycobakterien (2) waren fast alle Varianten in den Sequenzen in ungepaarten Regionen oder in Strukturen, die für eine katalytische Aktivität in vitro unwesentlich erscheinen.
In zwei Arten, M. smegmatis und M. fortuitum, sind die Basen 160 bis 164, die dem Ende der P12-Schleife entsprechen (2), in der RNase P RNA-Gensequenz nicht vorhanden. Der P12-Schleife fehlt das Gen von einigen anderen Organismen, wie z.B. Mycoplasma fermentans (4, 25), und scheint deshalb nicht für die Ribozym-Aktivität erforderlich zu sein.
Die Zuordnung stützt auch aus anderen Experimenten gezogene Schlussfolgerungen über die RNase P-Struktur. Angenommene wichtige Regionen, wie z.B. das Strukturprinzip bp 75 bis 85 und paarende nt 409 bis 417 (2), werden in allen analysierten Mycobakteriellen Arten konserviert. Mit aller Wahrscheinlichkeit sind diese zwei Regionen gepaart, da passende Sequenzen und Organismen gut konserviert sind. Die variabelsten Regionen unter Mycobakteriellen Arten waren die P3- bzw. P19-Schleifen. Die P19-Struktur ist für eine RNase P-Aktivität in vitro nicht erforderlich (25), und es gibt eine beträchtliche Variabilität in der P3-Schleife unter den Organismen, aber ihre Rolle in vivo ist unklar.
Die angenommene Struktur von M. tuberculosis-RNase P RNA könnte mit Hilfe von Sequenzvariationen zwischen Arten noch verbessert werden. Eine Struktur, von der angenommen wird, dass sie wichtig ist, ist die P18-Stamm-Schleife (die Region nt 330 bis 351), die in Escherichia coli- und Clamydia-RNase P RNAs einen gut konservierten Stamm aufweist. Die angenommene Mycobakterielle Struktur weist eine wesentlich geringer überzeugende Stamm-Struktur auf. (Siehe 2, die auf der alten Strukturvorhersage basiert.) In M. smegmatis und M. marinum sind jedoch Variationen von der Konsensus-Sequenz vorhanden (1). Eine geringfügig verschiedene Stamm-Schleifen-Struktur würde für diese Wechsel passen, während eine sekundäre Konsensus-Struktur intakt gehalten wird, und erlaubt gleichzeitig ein überzeugenderes Basenpaar-Muster (5). Dies stärkt auch das Argument für die Bedeutung dieser Stamm-Schleife für die RNase P-Funktion.
BEISPIEL 2: CHLAMYDIA
MATERIALIEN UND METHODEN
Bakterienstämme. DNA analysierter Organismen wurde durch eine Standard-Proteinase K-Behandlung von in einer Zellkultur gewachsenen Organismen freigesetzt und Phenol-extrahiert oder wurde als gereinigte DNA-Präparate bereitgestellt (Tabelle 2).
Tabelle 2. Stämme, Ursprungswirt, Referenzen, Quellen und Accession-Nummern
PCR-Amplifizierung und DNA-Sequenzbestimmung. Das rnpB-Gen in Arten von Chlamydiaceae wurde mit dem Primerpaar BH1-BH2, das auf der Basis der C. trachomatis-Sequenz (13) gestaltet war, mittels PCR amplifiziert (Tabelle 3).
Die Reaktionsmischung enthielt 0,2 μM jedes Primer, 200 μM dNTP, 1,5 μM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 15% Glycerin und 2 E Taq-Polymerase. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 7 Zyklen mit 45 s bei 94°C, 45 s bei 42°C, 1 Minute bei 72°C, gefolgt von 35 Zyklen, worin die Annealing-Temperatur auf 58°C erhöht wurde. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich alle im Text erwähnten PCR-Produkte auf die Verwendung des Primerpaars BH1-BH2, das 82% des Gens voller Länge amplifizierte. Um die 5'-flankierende Region aus Artenstämmen der neun Chlamydiaceae-Arten auszubilden, verwendeten wir das Primerpaar JB1-JB2, das aus der vollständigen RNase P RNA-Gensequenz von C. trachomatis (freundlicherweise von Dr. J. Brown zur Verfügung gestellt) erhalten wurde. Die Amplifizierungsbedingungen waren die gleichen wie für das BH1-BH2-Primerpaar beschrieben, mit der Ausnahme, dass Glycerin weggelassen wurde und Annealing-Temperaturen 53 bzw. 58°C betrugen. Zur Amplifizierung von S. negevansis und P. acanthamoebae wurde der BH1-Primer durch BM1 ersetzt, der hoch konservierte Nucleotide, wie vorstehend beschrieben (13), umfasste, aber kein Sequenzieren des 5'-Endes von rnpB ermöglichte. Die resultierenden PCR-Produkte wurden unter Verwendung einer Terminator-markierten Zyklussequenzierungschemie sequenziert und die Sequenzreaktionen wurden auf einem 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer) analysiert. Die Sequenzen wurden EMBL überreicht und alle in der Tabelle 2 aufgelisteten Accession-Nummern sind aus der vorliegenden Untersuchung.
Sequenzzuordnung und phylogenetische Analyse. Die Sequenzzuordnung erforderte ein sekundäres Struktur-Modellieren jedes RNase P RNA-Moleküls, das unter Verwendung von Vergleichssequenzanalysen manuell durchgeführt wurde. Die vorhergesagten Strukturen wurden danach im Zuordnungsverfahren als Hilfe zur Identifizierung von Schleifen- und Stamm-Regionen verwendet. Die Zuordnung wurde zur Untersuchung der molekularen Phylogenese verwendet. Die berechnete Distanzmatrix wurde für Mehrfach-Basenänderungen an einzelnen Stellen durch das Ein-Parametermodell von Jukes & Cantor (1969) (55) korrigiert. Diese Matrix wurde nachfolgend verwendet, um einen phylogenetischen Baum zu berechnen, unter Verwendung des Neighbor-Joining-Programms (77), bereitgestellt unter dem Namen NEIGHBOR im Phylogenetic Inference Package, PHYLIP Version 3.51c (44). Unter Verwendung des DNAPARS-Programm wurden maximal spärliche Bäume abgeleitet. Das SEQBOOT-Programm wurde verwendet, um die Bäume auf der Basis von Neighbor-Joining und eine maximale Spärlichkeit durch 1000-maliges Wiederabfragen der Datensätze einzugeben. Die Konstruktion des maximalen Wahrscheinlichkeitsbaumes wurde mit dem DNAML-Programm unter Verwendung des F84-Modells der molekula ren Evolution unter Anwendung empirischer Basenfrequenzen, globaler Umordnung und der Durcheinander-Option (Jumble-Option) durchgeführt.
Herstellung von RNase P RNA und Substraten. Um die rnpB-katalytische Aktivität zu testen, wurde C. trrachomatis rnpB voller Länge PCR-amplifiziert, hinter einem T7-Promotor geklont und auf die tRNA-Vorläuferspaltung untersucht. Wir konstruierten einen PCR-Primer, der zum 5'-Ende (5' TTTGAATTCGAAATTAATACGACTCACTATAGCGAACTAATCGGAAGAGTA; SEQ ID NO: 9) passt. Unterstrichene Reste passen zu C. trachomatis rnpB, während der verbleibende Teil des Primers dem T7-Promotor entspricht. Wir konstruierten einen Primer, der das 3'-Ende (5' TTTAAGCTTGGATGGTACCTTGGAAAAGCTCGGAAGAGCGAGTAA; SEQ ID NO: 9) komplementiert. Unterstrichene Reste sind komplementär zu C. trachomatis rnpB und die nicht markierten Reste wurden eingebaut, um das resultierende Plasmid mit Fokl spalten zu können. Das PCR-amplifizierte C. trachomatis rnpB wurde mit EcoRI und HindIII geschnitten und in pUC 19 eingeführt, das mit den gleichen Enzymen geschnitten wurde. Das rekombinante Plasmid wurde im Escherichia coli-Stamm DH5a nach Standardprotokollen transformiert.
Die E. coli-RNase P RNA, die C. trachomatis-RNase P RNA und Vorläufer tRNA ^TyrSu3 wurden unter Verwendung der T7-DNA-abhängigen RNA-Polymerase, wie andernorts beschrieben (59 und die darin enthaltenen Referenzen) gebildet.
RNase P RNA-Assay. Die RNase P RNA-Aktivität wurde bei 37°C in unserem Standardreaktionspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5% (Gew./Vol.) PEG 6000, 100 mM NH₄Cl (oder 1 M NH₄Cl, wie angegeben) und 100 mM MgCL₂) wie vorstehend beschrieben (59 und die darin enthaltenen Referenzen) überwacht, und die Endkonzentration an C. trachomatis-RNase P RNA betrug ≈ 2,4 pMol·ml^–1 und von Vorläufer tRNA ^TyrSu3 ≈ 0,052 pMol·ml^–1.
Nucleotidsequenz-Accession-Nummern. Repräsentative Nucleotidsequenzen von geprüften Arten wurden an EMBL überreicht. Die Accession-Nummern sind in Tabelle 2 aufgelistet.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse aus Beispiel 2 werden nachstehend im Zusammenhang mit den anliegenden Zeichnungen, 6 bis 8, diskutiert:
6: DNA-Sequenzvergleich von rnpB der 9 Chlamydiaceae-Arten, P. acanthamoebae und S. negevensis. Die Punkte zeigen die Identität mit der C. trachomatis A/Har-13^T-Sequenz (SEQ ID NO: 14) an und Bindestriche zeigen Lücken in der Zuordnung an. Die hypervariablen Regionen P3, P12, P17 und P19 sind angezeigt. Die Nummerierung entspricht Brown (39).
7: Abgeleitet sekundäre Strukturen von RNase P RNA in C. psittaci (SEQ ID NO: 15), P. acanthamoebae (SEQ ID NO: 17) und S. negevensis (SEQ ID NO: 16). Die Nucleotiden in den Primer-Sequenzen sind in Kleinbuchstaben, m bedeutet eine Adenin-Cytosin-Mischung und r bedeutet eine A denin-Guanin-Mischung an dieser Position. N bedeutet orientierende Nucleotide in den flankierenden Regionen des Primers auf der Basis der minimalen Konsensus-bakteriellen RNase P RNA (39).
8: Neighbour-Joining-Baum auf der Basis von rnpB, der die Verwandtschaft unter den Mitgliedern der Familie Chlamydiaceae zeigt. P. acanthamoebae, Stamm Bn₉ ^T und S. negevensis, Stamm Z^T wurden als Outgruppen gewählt wurden. Die Sparsamkeit und ML-Analysen ergaben eine identische Verzweigungsordnung. Zwei Taxien verzweigten sich jedoch im ML-Baum geringfügig verschieden, und dieser Knoten ist mit einem Sternchen bezeichnet. Eingegebene Werte an den Knoten wurden von 1000 Wiederabfragen des Datensatzes unter Verwendungen von Neighbor-Joining und maximaler Sparsamkeit erhalten. Der Skalenmaßstab zeigt 5 Substitutionen pro 100 Nucleotide.
Vergleich von rnpB-Sequenzen
Aus 60 Chlamydial-Stämmen wurden PCR-Produkte erhalten, die 82% des rnpB-Gens voller Länge enthielten. Die Produkte von P. acanthamoebae-Stamm Bn₉ ^T und Berg₁₇ waren 313 Basen lang, und ihre Sequenzen waren identisch. Die Sequenz des 299-bp-Produkts des Z^T-Stamms von S. negevensis war 68,9% ähnlich zur P. acanthamoebae-Sequenz. Die Chlamydiaceae-PCR-Produkte waren zwischen 63,8% und 69,3% ähnlich zu den aus P. acanthamoebae und S. negevensis erhältlichen Sequenzen. Die rnpB-Sequenzen von Chlamydia und Chlamydophila, die die 2 Gattungen in den Chlamydiaceae sind, waren 75,9% bis 83,3% ähnlich. Die zu Chlamydia gehörenden 18 Stämme waren > 89,9% ähnlich; die zu Chlamydophila gehörenden 38 Stämme waren > 84,8% ähnlich. Die 14 C. trachomatis-Sequenzen unterschieden sich nur durch eine einzige Basensubstitution in LGV-Biovar im Vergleich zum Trachoma-Biovar. Die 2 Chlamydia suis-Stämme unterschieden sich nur durch zwei Nucleotid-Positionen. Die 6 Chlamydia pecorum-Stämme waren identisch oder unterschieden sich nur 1 oder 2 Basen. Sequenzen waren identisch innerhalb der Arten für 10 Chlamydia psittaci-Stämme (ausgenommen Stamm M56, siehe unten), 10 Chlamydia pneumoniae-TWAR-Biovar-Sequenzen, 9 Chlamydia abortus-Sequenzen, 3 Chlamydia felis-Sequenzen und 2 Chlamyida muridarum-Sequenzen.
Durch PCR unter Verwendung der Primer JB1 und JB2 wurden aus einer Untergruppe von 14 Stämmen, die alle 9 Chlamydiaceae-Arten umfassten, Gensegmente mit nahezu voller Länge (98% des rnpB-Gens) gebildet. Der Vergleich dieser Sequenzen verringerte die Ähnlichkeit zwischen Arten (inter-species) um so viel wie 2,6%, weil sie die variable P3-Region enthielten. Der Unterschied in rnpB war groß genug, um klar Artengruppierungen in den Chlamydiaceae zu unterscheiden. Zum Unterschied von ompA-Genprodukten, die sich bis zu 50% unterscheiden, und ribosomalen RNA-Genen, die um < 10% unterschiedlich sind, erlaubt dieser Unterschied den Entwurf von Gattungs- und Gruppen-spezifischen PCR-Sonden.
Die Stämme MoPn^T (Maus) und SFPD (Hamster) der Art C. muridarum ergab, dass sie sich in ihren MOMP-Gensequenzen (85) unterschieden. Im Gegensatz dazu waren die rnpB-Gene in den zwei C. muridarum-Stämmen identisch, so wie dies auch in den ribosomalen 16S/23S-intergenen Spacern und 23S-Domäne-1-Segmenten gefunden wurde (42). Das einem Evolutionsdruck an der Oberfläche ausgesetzte Protein war klar größer als an den in den Translationsprozess verwickelten Genen.
Zweiundzwanzig Stämme, die bis vor kurzem als C. psittaci klassifiziert wurden, wurden nun in C. psittaci, C. abortus, C. felis und C. caviae unterteilt. Unsere Untersuchung trennte die Stämme in die 4 Artengruppen durch rnpB-Gensequenz-Unterschiede von bis zu 6,7% (die Daten sind nicht gezeigt). Diese Arten wurden aus Wirtsgruppen entfernten Ursprungs isoliert, und sie verursachen ein breites Spektrum von Erkrankungen (Tabelle 2). Nur der C. psittaci-Stamm M56 stand in Konflikt mit seiner Klassifizierung als C. psittaci, und PCR dieses Stammes ergab eine rnpB-Sequenz, die zu den in dieser Untersuchung analysierten Katzensequenzen passte. Die M56-Historie ergab einen gewissen Einblick, warum dies aufgetreten sein konnte. M56 wurde 1961 aus einer Bisamratte in Kanada isoliert (79), dann gelagert und vom USDA National Animal Disease Center in Ames, Iowa, USA, an ATCC gegeben. In der Zellkultur wuchs das ATCC-Präparat von M56 als M56-Serotyp in einer Zelllinie und als Katzen-Serotyp in einer anderen (Andersen, unveröffentlicht). Fukushi & Hirai (1989) (46) berichteten über einen aus ATCC erhaltenen Katzen-Serotyp von M56. PCR aus M56, kultiviert bei NADC am 8/1/90 in den Dotterbeuteln embryonaler Eier, ergab C. psittaci-vogelähnliche ribosomale und Hauptaußenmembran-Protein-Gensequenzen voller Länge (42). In der derzeitigen Untersuchung verwendete M56-DNA war ein Aliquot der 1997-Untersuchung (Tabelle 2). Im Hinblick auf diese Historie legt unsere rnpB-Analyse nahe, dass M56-Kulturen während der 1960-iger Jahre mit Katzen-Chlamydiae verunreinigt war, und das nicht verunreinigte Isolate nicht länger erhältlich sein dürften.
Sekundäre Strukturen der RNase P RNA
Die Zuordnung der aus den neun Chlamydiaceae-Arten abgeleiteten Sequenzen des rnpB-Gens zeigte vier in getrennten Stammschleifen lokalisierte hypervariable Regionen in den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen mit P3, P12, P17 und P19 bezeichnet (7).
Die P15-Schleife (siehe 7) ist von Interesse, da sie in den meisten bakteriellen RNase P RNA-Molekülen eine GGU-Struktur beherbergt, die mit tRNA-Vorläufern durch Basenpaarung mit der 3'-terminalen RCCA-Struktur der tRNA in Wechselwirkung tritt (60). Die Abwesenheit dieser Sequenzstruktur aus allen Mitgliedern der Chlamydiales ist auffallend, und in allen neun Chlamydiaceae-Arten (Positionen 291 bis 294 in C. psittaci, 7), außer in C. pneumoniae (GAAA) und C. felis (ACAA) ist eine ATAA-Ausbuchtung zu sehen. Eine verschiedene Struktur in der P15-Region von Chlamydiaceae-Arten ist außerdem dadurch erklärbar, dass keines der identifizierten tRNA-Gene die 3'-terminale CCA-Sequenz kodieren (80).
Interessant ist es, dass die P15-Region in P. acanthamoebae eine Purin-reiche Ausbuchtung, die eine GGU-Struktur aufweist, enthält. Dies könnte darauf hinweisen, dass diese RNase P RNAs mit der 3'-terminalen RCCA-Sequenz wie E. coli-RNase P RNA in Wechselwirkung tritt, unter der Voraussetzung, dass die CCA-Sequenz in den tRNA-Genen in diesen Arten kodiert wird. Im Gegensatz dazu ist die P15-Schleifenstruktur von aus S. negevensis abgeleiteter RNase P RNA ähnlich zu der in den meisten Cyanobakterien beobachteten (87) und beinhaltet in der P15-Schleife so wie von Thermus thermophilus abgeleitete RNase P RNA- eine GGAU-Struktur (53). Es wurde angenommen, dass diese Schleife der RNase P RNA in T. thermophilus eine Bindungsstelle mit hoher Affinität für das 3'-Ende des tRNA-Vorläufers enthält (52), und dass dies deshalb auch für S. negevensis gelten könnte.
Die RNase P RNA in Chlamydiaceae-Arten beherbergt eine P18-Helix, während bei P. acanthamoebae und S. negevensis dieses Element fehlen dürfte. Es wurde früher gezeigt, dass die P18-Helix ohne Verlust der katalytischen Aktivität deletiert werden kann, was darauf hinweist, dass sie nicht direkt in der Katalyse verwickelt ist (49). Die P18-Helix ist, wenn vorhanden, mit einer phylogenetisch konservierten GNRA-tetra-Schleife assoziiert, die in ihrem vermuteten Rezeptor in P8 andockt (das G83C93-Basenpaar in C. psittaci; 2 (38, 62)). Die bakteriellen RNase P RNAs, denen die P18-Helix fehlt, weisen außerdem eine ausgedehnte P8-Helix auf, und es wurde angenommen, dass dies den Verlust von P18 kompensiert (38). Da weder C. acanthamoebae noch S. negevensis ausgedehntes P8 oder ein scheinbares P18 mit einer GNRA-tetra-Schleife aufweisen, bilden die Nucleotide in der P18-Region vielleicht ein alternatives Strukturelement, das mit P8 in Wechselwirkung tritt.
Zwischen der GNRA-tetra-Schleife in der P14-Helix und dem P8-Stamm wurde auch eine Wechselwirkung über einen weiten Bereich vermutet (38, 62). Dies wird durch unsere derzeitigen Daten in allen neun Arten von Chlamydiaceae (das U82A94-Basenpaar und G201 in C. psittaci, 7) und durch die Gegenwart eines A in der P14-Schleife und des GC-Basenpaars in P8 in P. acanthamoebae und S. negevensis (2) gestützt. Unter der Voraussetzung dieser Wechselwirkung ist es überraschend, dass in den drei Serovars L1 bis L3 von C. trachomatis das G205-Nucleotid (entsprechend G201 in C. psittaci in 7) durch ein A substituiert ist, aber ohne einer entsprechenden Basenpaarverschiebung in der P8-Helix.
In der minimal übereinstimmenden bakteriellen RNase P RNA weisen bestimmte Positionen 100% konservierte Nucleotid-Basen auf (39). Unsere Daten zeigten, dass das gut konservierte Cytosin in Position 60 in allen überprüften Arten der Chlamydophila-Gattung (7) durch ein Uracil ersetzt wurde, während für die Chlamydia-Gattung keine Veränderung beobachtet wurde. Dies bildet, abhängig vom Rest in Position 376 (die Bezifferung bezeiht sich auf C. psittaci), entweder ein UG-Wobble-Basenpaar oder ein UA-Basenpaar. Die Region der von diesen Arten abgeleiteten RNase P RNA konnte mit den in der vorliegenden Untersuchung verwendeten Primern nicht beobachtet werden.
Spaltung von tRNA-Vorläufern durch C. trachomatis-RNase P RNA
Bakterielle RNase P RNA ist in Abwesenheit der RNase P-Proteineinheit (33, und die darin enthaltenen Referenzen) katalytisch aktiv. Um zu untersuchen, ob Chlamydia-RNase P RNA allein dazu fähig ist, ihr Substrat zu spalten, bildeten wird C. trachomatis-RNase P RNA und analysierten das Spaltungsmuster unter Verwendung des E. coli-tRNA ^TyrSu3(pSu3)-Vorläufers als Substrat. Diese RNase P RNA war tatsächlich dazu fähig, Psu3 an der erwarteten Position nur unter Verwendung von NH₄Cl bei hoher Konzentration zu spalten, wie unter Methoden beschrieben. Dies steht im Einklang mit einer früheren Beobachtung der Spaltung durch C. trachomatis-RNase P RNA (51). Zusammen mit den strukturellen Beobachtungen zeigt dies, dass RNase P RNA keine P15-interne Schleife (oder eine P15-Haarnadelschleife) für die katalytische Aktivität benötigt. Wir weisen jedoch darauf hin, dass das Ausmaß der Spaltung durch C. trachomatis-RNase P RNA im Vergleich zur Spaltung durch E. coli-RNase P RNA beträchtlich verringert war.
Phylogenese der Familie Chlamydiaceae
Die Sekundärstrukturen der Helices P15, P16, P17, P18 und P19 waren für die Mitglieder von Chlamydiaceae die am schwierigsten aufzulösenden Regionen. Zwei dieser Regionen, nämlich P17 und P19, wurden deshalb aus dem endgültigen Datensatz, der für die phylogenetischen Überlegungen verwendet wurde, entfernt. Dies war in der hohen Nucleotid-Variabilität in der P17-Szene begründet, und die scheinbare Abwesenheit der Helix P19 im rnpB-Gen von P. acanthamoebae (6 & 7). Auch die zweifelhaft zugeordneten Positionen 94, 150, 151, 153, 286 und 298 (gemäß der Bezifferung des rnpB-Gens von C. trachomatis in 6) wurden vor der phylogenetischen Analyse entfernt. Aus der endgültigen Anordnung wurden Lückenpositionen, mit Ausnahme der Enden des 5'-Endes, im allgemeinen nicht ausgelassen, da die Positionen 1 bis 68 für S. negevensis und P. acanthamoebae nicht bestimmt wurden. Die korrigierte endgültige Zuordnung umfasste deshalb 271 Positionen.
Zur Berechnung der evolutionären Stämme zur Aufdeckung der phylogenetischen Verwandtschaft unter den Arten der Familie Chlamydiaceae wurden verschiedene Algorithmen verwendet. Unter Verwendung von Distanzmatrix und auf Buchstaben basierenden Methoden wurden virtuell identische Baumtopologien erhalten. Ein unter Verwendung von Neighbor-Joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) abgeleiteter repräsentativer phylogenetischer Baum ist in 3 dargestellt. Die Stabilität der Verzweigungsordnung wurde statistisch durch die Bestimmung von Eingabe-Prozentwerten ermittelt. Diese durch NJ und maximale Sparsamkeit erhaltenen Werte sind an den Knotenpunkten angegeben. Die durch den maximalen Wahrscheinlichkeitsbaum (ML) gestützte Verzweigungsordnung wurde auch jedem Verzweigungspunkt in 3 zugefügt. Zwei Taxien verzweigten in durch ML konstruierten Dendrogramm etwas verschieden, und der aktuelle Knotenpunkt, der diese Instabilität zeigt, wurde mit einem Sternchen versehen. Unter alleiniger Verwendung von rnpB-Daten aus den zu Chlamydophila und Chlamydia gehörenden Arten, aber unter Ausdehnen des Datensatzes, um die Nucleotid-Information des 5'-Endes zu umfassen, wurden auch zu den in 3 dargestellten identische Baumtopologien erhalten. Die Reihenfolge der Verzweigung in diesem Teil des Baumes wurde deshalb nicht gelöst.
Der Baum in 8 zeigt, dass die Gattungen Chlamydophila und Chlamydia leicht von einander unterschieden werden können durch Vergleich der rnpB-Gensequenzen. Diese Erkenntnis stimmt mit den kürzlich veröffentlichten Phylogenesen auf der Basis von 165- und 23S-ribosomalen RNA-Genen voller Länge und mit ihren intergenen Spacer-Regionen überein (42, 43, 73). Dies steht jedoch in Konflikt mit dem aus dem 16S-rRNA-Gen durch Pettersson et al. (1997) angegebenen Ergebnissen. Eine plausible Erklärung ist es, dass die 16S-rRNA-Untersuchung auf der Basis von nur 4/5 der Nucleotid-Information voller Länge dieser Gene basiert, und dass einige der zum Vergleich verwendeten Sequenzen ziemlich entfernt verwandt waren. Einige phylogenetische Information wurde deshalb im endgültigen Datensatz verloren. In einer nachfolgenden 16S-rRNA-Analyse unter Verwendung der fast vollständigen 16S-rRNA-Gensequenzen und nur eng verwandten als Outgruppen war eine begrenzte Wechselbeziehung mit anderen Verzweigungsordnungen vorhanden. Es kann deshalb daraus geschlossen werden, dass die 16S-rRNA-Gene bei der Beschreibung der evolutionären Verwandtschaft der Mitglieder der Chlamydiaceae-Familie eine geringe Auflösung ergeben.
Die Analyse des rnpB-Gens zeigte, dass eine chlamydiale Phylogenese nicht vollständig auf Genen beruhen muss, für die nur eine schwache Verzweigungsstütze vorhanden ist. Während 16S-rRNA-Analysen zahlreiche lange Verzweigungen mit anliegenden Clustern zeigen, weist die rnpB-Analyse gleichmäßig verteilte Sequenzunterschiede auf, die chlamydiale Gruppen auf dem Niveau Familie, Gattung und Art unterscheiden. Die Sequenzvielseitigkeit des rnpB-Gens in den Arten der Ordnung Chlamydiales macht es möglich, dieses Gen zur Unterscheidung von chlamydialen Arten zu verwenden. Darüber hinaus ergibt diese Spezifität eine funktionelle Isolierung jeder Gruppierung, die mit den artspezifischen ökologischen Nischen, wie beschrieben, übereinstimmen (70). Die Konservierung ist ebenfalls mit früher identifizierten Gruppierungen übereinstimmend. Die in einer so grundlegenden Funktion, wie dem tRNA-Processing, aufgefundene Spezifität legt es nahe, dass Artengruppierungen in Chlamydiaceae sehr lange Zeit evolutionär isoliert waren. Die angegebenen phylogenetischen Analysen stützen die Revision der Klassifizierung der Chlamydiaceae-Familie, wie früher beschrieben (43).
Zusammenfassend wurde die Sequenz des RNase P RNA-Gens (rnpB) für 60 Stämme bestimmt, die alle neun Arten in der Chlamydiaceae-Familie und für die verwandten Chlamydiales-Arten, Parachlamydia acanthamoebae und Simkania negevensis, repräsentieren. Diese Sequenzen wurden verwendet, um auf evolutionäre Verwandtschaften unter den Chlamydiaceae zu schließen. Die Analyse trennte Chlamydophila und Chlamydia in zwei Familien, wobei Chlamydiophila drei getrennte Cluster bildet: die Chlamydophila pneumoniae-Stämme, die Chlamydophila percorum-Stämme und ein drittes Cluster, umfassend die Arten Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae und Chlamydophila felis. Die Chlamydia-Linie von Abkommen enthielt zwei Cluster, wobei die Chlamydia suis-Stämme von den Stämmen von Chlamydia trachomatis und Chlamydia muridarum klar getrennt sind. Diese Analyse zeigte, dass die rnpB-Sequenz und -Struktur deutliche Marker für Arten der Chlamydiaceae sind. Wir zeigten ebenfalls, dass die von C. trachomatis abgeleitete RNase P RNA dazu fähig ist, einen tRNA-Vorläufer in Abwesenheit eines Proteins zu spalten. Unsere Erkenntnisse werden in Bezug auf die Struktur von Chlamydia RNase P RNA diskutiert.
REFERENZEN

1. Abed, Y., C. Bollet, und P. De Micco 1995. Demonstration of Mycobacterium kansasii species heterogeniety by the amplification of the 16S-23S spacer region. J. M. Microbiol. 43: 156–158
2. Alcaide F., I. Richter, C. Bernasconi, B. Springer, C. Hagenau, R. Schulze-Robbecke, E. Tortoli, R. Martin, E.C. Böttger, und A. Telenti. 1997. Heterogeneity and clonality among isolates of Mycobacterium kansasii: Implications for epidemiological and pathogenicity studies. J. Clin. Microbiol. 35: 1959–1964
3. Bascunana C.R. und K. Belak K. 1996. Detection and identification of mycobacteria in formalinfixed, paraffin-embedded tissues by nested PCR and restriction enzyme analysis. J. Clin.. Microbiol. 10: 2351–2355.
4. Brännvall, M., J. G. Mattsson, S.G. Svärd S.G., und L.A. Kirsebom. 1998. RNase P RNA structure and cleavage reflect the primary structure of tRNA genes. J. Mol. Biol. 283: 771–83
5. Brown, J.W. und N.R. Pace. 1992. Ribonuclease P RNA and protein subunits from bacteria. Nucleic Acids Res. 20: 1451–1456.
6. Cole S.T., R. Brosch, J. Parkhill, T. Garnier, C. Churcher, D. Harris, S.V. Gordon, K. Eiglmeier, S. Gas, C.E. 3rd Barry, F. Tekaia, K. Badcock, D. Basham., D. Brown, T. Chillingworth, R. Connor, R., Davies, K. Devlin, T. Feltwell, S. Gentles, N. Hamlin, S. Holroyd, T. Hornsby, K. Jagels, B.G. Barrell, et al., 1998. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537–44.
7. Crawford J.T. 1994. Development of rapid techniques for identification of M. avium infections. Res. Microbiol. 145: 177–181.
8. Devallois A., M. Picardeau, K.S. Goh, C. Sola, V. Vincent, und N. Rastogi. 1996. Comparative evaluation of PCR and commercial DNA probes for detection and identification to species level of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. J. Clin. Microbiol. 34: 2756–2759.
9. Devallois A., M. Picardeau, C.N. Paramasivan, V. Vincent, und N. Rastogi. 1997 Molecular characterization of Mycobacterium avium complex isolates giving discordant results in AccuProbe tests by PCR-restriction enzyme analysis, 168 rRNA gene sequencing, and DT1-DT6 PCR. J. Clin. Microbiol. 35: 2767–2772.
10. Frothingham, R., und R.H. Wilson. 1994. Molecular phylogeny of the Mycobacterium avium complex demonstrates clinically meaningful divisions. J. Infect. Dis. 169: 305–312.
11. Gardiner K. und N.R. Pace. 1980. RNase P of Bacillus subtilis has an RNA component. J. Biol. Chem. 255: 7507–7509
12. Guerrier-Takada, C., K. Gardiner, T.L. Marsh, N.R. Pace, und S. Altman. 1983. The RNA moiety of RNase P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849–857
13. Herrmann B., O. Wingvist, J.G. Mattsson, und L.A. Kirsebom LA. 1996. Differentiation of Chlamydia spp. by sequence determination and restriction endonuclease cleavage of RNase P RNA genes. J. Clin. Microbiol. 34: 1897–1902.
14. Iinuma Y., S. Ichiyama, Y. Hasegawa, K. Shimokata, S. Kawahara, und T. Matsushima. 1997. Large-restriction-fragment analysis of Mycobacterium kansasii genomic DNA and its application in molecular typing. J. Clin. Microbiol. 35: 596–599
15. Ji-e Y., K.E. Kempsell, M.J. Colston, und R.A. Cox. 1994. Nucleotide sequences of the spacer-1, spacer-2 and trailer regions of the rrn operons and secondary structures of precursor 23S rRNAs and precursor 5S rRNAs of slow-growing mycobacteria Microbiology 140: 1763–1773.
16. Kapur V., L.-L. Li, M.R. Hamrick, B.B. Plikaytis, T.M. Shinnick, A. Telenti, Jr W.R. Jacobs, A. Banerjee, S. Cole, K.Y. Yuen, J.E. Clarridge III, B.N. Kreiswirth, und J.M. Musser. 1995. Rapid Mycobacterium species assignment and unambiguous identification of mutations associated with antimicrobial resistance in Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing. Arch. Pathol. Lab. Med. 119: 131–138.
17. Kole R., M.F. Baer, B.C. Stark, und S. Altman. 1980. E. coli RNase P has a required RNA component in vivo. Cell 19: 881–887
18. Kulski J.K., C. Khinsoe, T. Pryce, und K. Christiansen. 1995. Use of a multiplex PCR to detect and identify Mycobacterium avium and M. intracellulare in blood culture fluids of AIDS patients. J. Clin. Microbiol. 33: 668–674.
19. Nishimori K., M. Eguchi, Y. Nakaoka, Y. Onodera, T. Ito, und K. Tanaka. 1995. Distribution of IS901 in strains of Mycobacterium avium complex from swine by using 18901-detecting primers that discriminate between M. avium and Mycobacterium intracellulare. J. Clin. Microbiol. 8: 2102–2106.
20. Picardeau M., G. Prod'hom, L. Raskine, M.P. LePennec, und V. Vincent. 1997. Genotypic characterization of five subspecies of Mycobacterium Kansasii. J. Clin. Microbiol. 35: 25–32.
21. Rastogi N., W.W. Barrow, J.O. Falkinham III, C.O. Thoen, J.T. Crawford, B.T. Mangura, L.B. Reichman, L.B. Heifets, B. Dautzenberg, L.S. Young, L.E. Bermudez, C.D. Inderlied, A.E. Suzuki, J.M. Inamine, P.R.J. Gangadharam, M.V. Reddy, M. Denis, H. Shiratsuchi, J.L. Johnson, J.J. Ellner, J.T. Belisle, und P.J. Brennan. 1994. 11th Forum in Microbiology, "Laboratory and clinical aspects of the Mycobacterium avium epidemic: contributing factors associated with variability of drug susceptibility and immune responsiveness, and the multifaceted nature of pathogenicity". Res. Microbiol. 145: 167–261.
22. Rastogi, N.J., J.J. McFadden, M.L. Gourgeon, L. Montagnier, F.M. Collins, C.R. Horsburgh, R.J. Coker, T.J. Hellyer, I.N. Brown, J.N. Weber, I.M. Orme, D. Chatterjee, J.D.A. Van Embden, D. Van Soolingen, P.M. Small, P.W.M. Hermans, S.E. Hoffner, G. Källenius, S B. Svenson, R.S. Wallis, J.J. Ellner, H. Shuatsuchi, G.A.W. Rook, A. Vyakarnam, D.M. Yajko, L.S. Young, L.E.M. Bermudez, C.B. Inderlied, Z.M. Kunze, F. Portaels, und V. Labrousse. 1992. 8th Forum in Microbiology, "Mycobacteria and AIDS: epidemiological and genetic markers, virulence factors and interactions with the immune system." Res Microbiol. 143: 357–440.
23. Richter E., S. Niemann, S. Rusch-Gerdes, und S. Hoffner. 1999 Identification of Mycobacterium kansasii by using a DNA probe (AccuProbe) and molecuiar techniques. J. Clin. Microbiol. 37: 964–970
24. Roth A., M. Fischer, M.E. Hamid, S. Michalke, W. Ludwig, und H. Mauch. 1998 Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J. Clin. Microbiol. 36: 139–147.
25. Siegel, R.W., A.B. Banta, E.S. Haas, J.W. Brown, und N.R. Pace. 1996. Mycoplasma fermentans simplifies our view of the catalytic core of ribonuclease P RNA. RNA 2: 452–62.
26. Snapper, S.B., R.E. Melton, S. Mustafa, T. Kieser, und Jacobs WR Jr. 1990. Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis. Mol. Microbiol 4: 1911–1919
27. Sritharan V., J.V. Iralu, und R.H. Barker Jr. 1995. Specificity of diagnostic PCR amplification for M. avium using the probe pMAV22. 1Y101. Cell. Probes 9: 71–74.
28. Stark, B.C., R. Kole, E.J. Bowman, und S. Altman. 1978. Ribonuclease P: an enzyme with an essential RNA component. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3717–3721
29. Telenti, A.F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E.C. Böttger, und T. Bodmer. 1993. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol. 31: 175–178.
30. Van der Giessen, J.W.B., R.M. Haring, und B.A.M. Van der Zeijst. 1994. Comparison of the 23S ribosomal RNA genes and the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes of the closely related Mycobacterium avium and Mycobacterium paratuberculosis and the fast-growing Mycobacterium phlei. Microbiology. 140: 1103–1108.
31. Vioque A. 1992. Analysis of the gene encoding the RNA subunit of ribonuclease P from cyanobacteria. Nucleic Acids Res. 20: 6331–37
32. Woolford A.J., R.G. Hewinson, M. Woodward, und J.W. Dale 1997. Sequence heterogeneity of an mpb70 gene analogue in Mycobacterium kansasii. FEMS Microbiol. Lett. 148: 43–48)
33. Altman, S. & Kirsebom, L.A. (1999).. Ribonuclease P. In The RNA world: Second edition (Gesteland, R.F., Cech, T. & Atkins, J.F., eds.), S. 351–380. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York.
34. Amann, R., Springer, N., Schonhuber, W., Ludwig, W., Schmid, E.N., Muller, K.D., Michel R. (1997). Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl Environ Microbiol 63, 115–121.
35. Andersen, A.A. & Van Deusen, R.A. (1988). Production and partial characterization of monoclonal antibodies to four Chlamydia psittaci isolates. Infect Immun 56, 2075–2079.
36. Baker, J.A. (1942). A virus obtained from a pneumonia of cats and its possible relation to the cause of atypical pneumonia in man. Science 96, 475–476.
37. Black, C.M., Tharpe, J.A. & Russen, H. (1992). Distinguishing Chlamydia species by restriction analysis of the major outer membrane protein gene. Mol Cell Probes 6, 395–400.
38. Brown, J.W., Nolan, J.M., Haas, E.S., Rubio, M.-A.T., Major, F., Pace, N. (1996). Comparative analysis of ribonuclease P RNA using gene sequences from natural microbial populations reveals tertiary structural elements. Proc Natl Acad Sci 93, 301–3006.
39. Brown, J. W. (1998). The Ribonuclease P Database. Nucl Acids Res 26, 351–352.
40. Cello, R.M. (1967). Ocular infections with PLT (Bedsonia) group agents. Am J Ophthalmol 63, 1270–1273.
41. Chirgwin, K., Roblin, P.M. & Hammerschlag, M.R. (1989). In vitra susceptibilities of Chlamydia pneumoniae (Chlamydia sp. strain TWAR). Antimicrob Agents Chemother 33, 1634–1635.
42. Everett, K.D. & Andersen, A.A. (1997). The ribosomal intergenic spacer and domain I of the 23S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp. Int J Syst Bacteriol, 47, 461–473.
43. Everett, K.D.E., Bush R.M. & Andersen, A.A. (1999). Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol 49, 415–440.
44. Felsenstein, J. (1993). PHYLIP (Phylogeny inference package) (version 3.51c). Vom Autor vertrieben. University of Washington, Seattle, Department of Genetics.
45. Francis, T., Jr., & Magill, T.P. (1938). An unidentified virus producing acute meningitis and pneumonia in experimental animals. J Exp Med 68, 147–160.
46. Fukushi, H. & Hirai, K. (1989). Genetic diversity of avian and mammalian Chlamydia psittaci strains and relation to host origin. J Bacteriol 171, 2850–2855.
47. Golub, O.J. & Wagner, J.C. (1947). Studies on the interference phenomenon with certain members of the psittacosis-lyrnphogranuloma group of viruses. J Immunol, 59, 59–70.
48. Grayston, J.T., Kuo, C.-C., Campbell, L.A. & Wang, S.P. (1989). Chlamydia pneumoniae sp nov für Chlamydia sp strain TWAR. Int J Syst Bacteriol, 39, 88–90.
49. Haas, E.S., Brown, J.W., Pitulle, C. & Pace, N.R. (1994). Further perspective on the catalytic core and secondary structure of ribonuclease P RNA. Proc Natl Acad Sci 91, 2527–2531.
50. Haas, E.S., Banta, A.B., Harris, J.K., Pace, N.R. & Brown, J.W. (1996). Structure and evolution of ribonuclease P RNA in Gram-positive bacteria. Nucl Acids Res 24, 4175–4782.
51. Haas, E.S. & Brown, J.W. (1998). Evolutionary variation in bacterial RNase P RNAs. Nucl Acids Res 26, 4093–4099.
52. Hardt, W-D., Schlegl, J., Erdmann, V.A. & Hartmann, R.K. (1995). Kinetics and thermodynamics of the RNase P RNA cleavage reaction: Analysis of tRNA 3'-end variants. J Mol Biol 247, 161–172.
53. Hartmann, R.K. & Erdmann, V.A. (1991). Analysis of the gene encoding the RNA subunit of ribonuclease P from T. thermophilus HB8. Nucl Acids Res 19, 5957–5964.
54. Illner, V.F. (1960). Zur Frage der Übertragung des Ornithosevirus durch das Ei. Monatsh Veterinaermed 17, 116–117.
55. Jukes, T. & Cantor, C.R. (1969). Evolution of protein molecules. In Mammalian protein metabolism, S. 21–132. Herausgegeben von H.N. Munro, New York: Academic Press.
56. Kahane, S., Metzer, E. & Friedman, M.G. (1995). Evidence that the novel microorganism 'Z' may belong to a new genus in the family Chlamydiaceae. FEMS Microbiol Lett 126, 203–207.
57. Kahane, S., Greenberg, D., Friedman, M.G., Haikin, H., & Dagan, R. (1998). High prevalence of "Simkania Z," a novel chlamydia-like bacterium, in infants with acute bronchiolitis. J Infect Dis 177, 1425–1429.
58. Kaltenboeck, B., Kousoulas, K.G. & Storz, J. (1993). Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species. J Bacteriol 175, 487–502.
59. Kirsebom & Svärd (1992). The kinetics and specificity of cleavage by RNase P is mainly dependent on the structure of the amino acid acceptor stem. Nucl Acids Res 20, 425–432.
60. Kirsebom, L.A. & Svärd, S.G. (1994). Base pairing between Escherichia coli RNase P RNA and its substrate. EMBO J 13, 4870–4876.
61. Lieberman, D., Kahane, S., Lieberman, D., & Friedman, M.G. (1997). Pneumonia with serological evidence of acute infection with the chlamydia-like microorganism "Z". Am. J. Respir. Grit. Care. Med. 156, 578–82.
62. Massire, C., Jaeger, L. & Westhof, E. (1998). D erivation of the three-dimensional architecture of bacterial ribonuclease P RNAs from comparative sequence analysis. J Mol Biol 279, 773–793.
63. McNutt, S.H. & Waller, E.F. (1940). Sporadic bovine enccephalomyclitis (Buss disease). Cornell Vet 30, 437–448.
64. Murray, E.S. (1964). Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a member of the psittacosis-lymphogranuloma-trachoma group. J Infect Dis 114, 1–12.
65. Nigg, C. (1942). Unidentified virus which produces pneumonia and systemic infection in mice. Science 95. 49–50.
66. Page, L.A. (1959). Experimental ornithosis in turkeys. Avian Dis. 3, 51–66.
67. Page, L.A. (1967). Comparison of "pathotypes" among Chlamydial (psittacosis) strains recovered from diseased birds and mammals. Bull Wild Dis Assoc, 2, 166–175.
68. Page, L.A. & Bankowski, R.A. (1960). Factors affecting the production and detection of ornithosis antibodies in infected turkeys. Am J Vet Res., 21, 971–978.
69. Page, L.A. & Cutlip, R.C. (1968). Chlamydial polyarthritis in Iowa lambs. Iowa Vet 39. 10–18.
70. Palys, T., Nakamura, L.K. & Cohan, F.M. (1997). Discovery and classification of ecological diversity in the bacterial world: the role of DNA sequence data. Int J Syst Bacteriol 47, 1145–1156.
71. Perez-Martinez, J.A. & Storz, J. (1985). Antigenic diversity of Chlamydia psittaci of mammalian origin determined by microimmunofluorescence. Infect Immun 5, 905–910.
72. Pettersson, B., Andersson, A., Leitner, T., Olsvik, O., Uhlén, M., Storey, C., Black, C.M. (1997). Evolutionary relationships among members of the genus Chlamydia based on 16S ribosomal DNA analysis. J Bacteriol 179, 4195–4205.
73. Pudjiatmoko, Fukushi, H., Ochiai, Y., Yamaguchi, T. & Hirai, K. (1997). Phylogenetic analysis of the genus Chlamydia based on 16S rRNA gene sequences. Int J Syst Bactenol 47, 425–431.
74. Richmond S.J., Sterling, P., Ashley, C.R. (198.2). Virus infecting the reticulate bodies of an avian strain of Chlamydia psittaci. FEMS Microbiol. Letters, 14, 31–36.
75. Rogers, D.G., Andersen, A.A., Hogg, A., Nielsen, D.L. & Huebert, M.A. (1993). Conjunctivitis and keratoconjunctivitis associated with chlamydiae in swine. J Am Vet Med Assoc 203, 1321–1323.
76. Rodolakis, A., Bernard, F. & Lautier, F. (1989). Mouse models for evaluation of virulence of Chlamydia psittaci isolated from ruminants. Res Ver Sci 46, 34–39.
77. Saitou, N. & Nei, M. (1987). The neighbor joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4, 406–425.
78. Schachter, J. & Meyer, K.F. (1969). Lymphogranuloma venereum. II. Characterization of same recently isolated strains. J Bacteriol 99, 636–638.
79. Spalatin, J., Fraser, C.E.O., Connell, R.P. & Berman, D.T. (1966). Agents of psittacosis-lymphogranulomavenereum group isolated from muskrats and snowshoe hares in Saskatchewan. Can J Camp Med Ver Sci 30, 225–420.
80. Stephens, R.S., KaIman, S., Fenner, C., Davis, R. (1998) Chlamydia Genome Project.
81. Stills, H.F.J., Fox, J.G., Paster, B.J. & pewhirst, F.E. (1991). A "new" Chlamydia sp. strain SFPD isolated tram transmissible proliferative ileitis in hamsters. Microbiol Ecol Health Dis 4, 599.
82. Vioque, A. (1997). The RNase P RNA from cyanobacteria: short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences are present within the RNase P RNA gene in heterocyst-forming cyanobacteria. Nucl Acids Res 25, 3471–3477.
83. Wang, S.-P. & Grayston, J.T. (1962). Classification of trachoma virus strains by protection of mice from toxic death. J Immunol 90, 849–856.
84. Wills, J.M., Gruffydd-Jones, T.J., Jones T, Richmond, S., Paul, I.D. (1984). Isolation of Chlamydia psittaci from cases of conjunctivitis in a colony of cats. Ver Rec 114, 344–346.
85. Zhang, Y.X., Fox, J.G., Ho, Y., Zhang, L., Stills, H.J. & Smith, T.F. (1993). Comparison of the major outer-membrane protein (MOMP) gene of mouse pneumonitis (MoPn) and hamster SFPD strains of Chlamydia trachomatis with other Chlamydia strains. Mol Biol Evol 10, 1327–42.

SEQUENZPROTOKOLL ( EP 01901634.4 )

Claims

Verfahren zur Unterscheidung von Arten pathogener Organismen, umfassend das Analysieren der P3 und/oder P19 hypervariablen Region(en) des RNase P RNA Gens.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das eine Nukleinsäureamplifizierung umfasst und wobei die Nukleinsäure zur Identifizierung einer Art sequenziert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das eine Nukleinsäureamplifizierung umfasst und wobei die Nukleinsäure zur Identifikation einer Art einem Finger Printing unterzogen wird zum Beispiel mittels RFLP, Heteroduplexanalyse, Größenbestimmung oder Schmelzpunktbestimmung.
Verfahren zur Detektion pathogener Organismen einschließlich einer Unterscheidung von Arten der Organismen, umfassend einen Schritt zur Unterscheidung von Arten gemäß Anspruch 1, wobei das Analysieren eine Amplifizierung von Nukleinsäuren der hypervariabler Region(en) P3 und/oder P19 des RNase P RNA Gens der Pathogene, die Ausbildung. eines Heteroduplex mit einer verwandten Nukleinsäure, und die Analyse desselben umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pathogene Mycobakterien oder Chlamydien sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, umfassend die Unterscheidung von Mitgliedern des M. avium Komplexes.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, umfassend die Unterscheidung zwischen M. gastri und M. kansasii.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Pathogene Chlamydien sind und die Primer zur Amplifizierung JB1 (SEQ ID NO: 7) und JB2 (SEQ ID NO: 8) sind.