DE60130797T2

DE60130797T2 - Verwendung von spezifischen erbb4 antagonisten zur behandlung von stenose

Info

Publication number: DE60130797T2
Application number: DE60130797T
Authority: DE
Inventors: Mary E. San Mateo GERRITSEN; Mark X. San Carlos SLIWKOWSKI
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-08-29
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2021-08-30
Also published as: WO2002018444A2; AU2001286918B2; US20060093603A1; US20100190964A1; US20020119148A1; WO2002018444A3; US7332579B2; ES2295202T3; AU8691801A; IL154495A0; DE60130797D1; JP2004507559A; CA2420062C; EP1351744B1; US20090068205A1; US20040052786A1; HK1059404A1; CA2420062A1; ATE374642T1; US20070092513A1

Description

Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Wege zur Steuerung übermäßiger Proliferation und/oder Migration von Glattmuskelzellen zur Behandlung von Stenose unter Verwendung von Antagonisten eines nativen ErbB4-Rezeptors, wie in den Ansprüchen definiert.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
1. ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen
Die Übertragung von Signalen, die Zellwachstum und -differenzierung steuern, ist teilweise durch Phosphorylierung verschiedener zellulärer Proteine gesteuert. Protein-Tyrosinkinasen sind Enzyme, die diesen Vorgang katalysieren. Von Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen wird angenommen, dass sie das Zellwachstum durch ligandstimulierte Tyrosin-Phosphorylierung intrazellulärer Substrate steuern.
HER4/Erb4 ist eine Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, die der ErbB-Familie angehört. Erhöhte ErbB4-Expression steht in enger Wechselbeziehung mit gewissen Karzinomen mit Epithel-Ursprung, unter anderem Brust-Adenokarzinomen (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1746–1750 [1993]; Plowman et al., Nature 366, 473–475 [1993]). Diagnostische Verfahren zur Detektion menschlicher neoplastischer Erkrankungen (insbesondere Brustkrebsarten), welche die ErbB4-Expression evaluieren, werden in der EP-Patentanmeldung Nr. 599.274 beschrieben.
Andere Mitglieder der ErbB-Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen umfassen: den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR), ErbB2 (HER2/neu) sowie ErbB3 (HER3). Das erbB1-Gen kodiert für den epidermalen 170-kDa-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), der ursächlich in menschliche Malignität verwickelt ist. Insbesondere wurde eine erhöhte Expression dieses Gens bei aggressiveren Karzinomen der Brust, Blase, Lunge und des Magens beobachtet (H. Modjtahedi und C. Dean, Int. J. Oncol. 4, 277–296 (1994)). HER4 dient bei Abwesenheit von HER2 als ein Vermittler mit antiproliferativer und differenzierender Antwort in menschlichen Brustkrebs-Zelllinien (Sartor et al., Mol. Cell Biol. 21, 4265–75 (2001)).
Das neu-Gen (auch erbB2 und HER2 genannt) kodiert für eine 185-kDa-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, die ursprünglich als das Produkt des transformierenden Gens aus Neuroblastomen chemisch behandelter Ratten identifiziert wurde. Eine Amplifikation und/oder Überexpression des menschlichen HER2-Gens korreliert mit einer schlechten Prognose bei Brust- und Eierstock-Krebsarten (D. J. Slamon et al., Science 235, 177–182 (1987); D. J. Slamon et al., Science 244, 707–712 (1989); sowie US-Patent Nr. 4.968.603 ). Eine Überexpression von HER2 (häufig, jedoch nicht einheitlich, aufgrund von Gen-Amplifikation) wurde auch bei anderen Karzinomen beobachtet, unter anderem bei Karzinomen des Magens, des Endometriums, der Speicheldrüsen, der Lungen, der Nieren, des Kolon, der Schilddrüse, des Pankreas und der Blase.
Ein weiteres, verwandtes Gen, genannt erbB3 oder HER3, wurde beschrieben. Siehe US-Patent Nr. 5.183.884 ; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9193–9197 (1989); EP-Patentanmeldung Nr. 444.961A1 ; sowie Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2900–2904 (1993). Kraus et al. (1989) entdeckten, dass merklich erhöhte Spiegel an erbB3-mRNA in gewissen menschlichen Mammatumorzelllinien vorhanden waren, was darauf hindeutet, dass erbB3, wie erbB1 und erbB2, eine Rolle in Fällen menschlicher Malignität spielen könnte. Sie zeigten ebenfalls, dass die EGF-abhängige Aktivierung der katalytischen ErbB3-Domäne eines chimären EGFR/ErbB3-Rezeptors zu einer proliferativen Antwort in transfizierten NIH-3T3-Zellen führte. Weiters zeigten diese Forscher, dass manche menschliche Mammatumorzelllinien eine signifikante Erhöhung der ErbB3-Tyrosinphosphorylierung im stationären Zustand zeigten, was weiter darauf hindeutet, dass dieser Rezeptor eine Rolle in Fällen menschlicher Malignität spielen kann. Die Rolle von erbB3 bei Krebs wurde bereits von anderen untersucht. Es wurde herausgefunden, dass es bei Krebsarten der Brust (Lemoine et al., Br. J. Cancer 66, 1116–1121 (1992)), des Ma gendarmtrakts (Poller et al., J. Pathol. 168, 275–280 (1992), Rajkumer et al., J. Pathol. 170, 271–278 (1993), sowie Sanidas et al., Int. J. Cancer 54, 935–940 (1993)) sowie bei Pankreas-Krebsarten (Lemoine et al., J. Pathol. 168, 269–273 (1992), und Friess et al., Clinical Cancer Research 1, 1413–1420 (1995)) überexprimiert wurde. ErbB3 ist unter der ErbB-Rezeptorfamilie dahingehend einzigartig, dass es wenig oder keine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität besitzt (Guy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8132–8136 (1994), sowie Kim et al., J. Biol. Chem. 269, 24747–55 (1994)).
Die ErbB-Rezeptoren sind allgemein in verschiedenen Kombinationen in Zellen zu finden, und von der Heterodimerisation wird angenommen, dass sie die Diversität zellulärer Antworten auf eine Reihe von ErbB-Liganden erhöht (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35, 115–132 (1995)). EGFR ist von sechs verschiedenen Liganden gebunden; Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF), transformierendem Wachstumsfaktor α (TGF-α), Amphiregulin, epidermalem Heparinbindungs-Wachstumsfaktor (HB-EGF), β-Cellulin und Epiregulin (Groenen et al., Growth Factors 11 235–257 (1994)). Eine Familie von Heregulin-Proteinen, die das Resultat einer alternativen Spleißung eines einzelnen Gens sind, sind Liganden für ErbB3 und ErbB4. Die Heregulin-Familie umfasst α-, β- und γ-Hereguline (Holmes et al., Science 256, 1205–1210 (1992); US-Patent Nr. 5.641.869 ; sowie Schaefer et al., Oncogene 15, 1385–1394 (1997)); neu-Differenzierungsfaktoren (NDFs), Gliawachstumsfaktoren (GGFs); acetylcholinrezeptorinduzierende Aktivität (ARIA); sowie den von sensorischen und Motorneuronen abstammenden Faktor (SMDF). Für einen Überblick siehe Groenen et al., Growth Factors 11, 235–257 (1994); G. Lemke, Molec. & Cell. Neurosci. 7, 247–262 (1996), sowie Lee et al., Pharm. Rev. 47, 51–85 (1995). Vor kurzem wurden drei zusätzliche ErbB-Liganden identifiziert; Neuregulin-2 (NRG-2), von dem berichtet wird, dass es entweder ErbB3 oder ErbB4 bindet (Chang et al., Nature 387, 509–512 (1997); sowie Carraway et al., Nature 387, 512–516 (1997)); Neuregulin-3, das ErbB4 bindet (Zhang et al., PNAS (USA) 94 (18), 9562–7 (1997)); sowie Neuregulin-4, das ErbB4 bindet (Harari et al., Oncogene 18, 2681–89 (1999)). HB-EGF, β-Cellulin und Epiregulin binden auch an ErbB4.
Während EGF und TGF ErbB2 nicht binden, stimuliert EGF EGFR und ErbB2, um ein Heterodimer zu bilden, das EGFR aktiviert und zu einer Transphosphorylierung von ErbB2 im Heterodimer führt. Die Dimerisation und/oder Transphosphorylierung scheinen die ErbB2-Tyrosinkinase zu aktivieren. Siehe Earp et al., 5.0. Auf gleiche Art und Weise wird bei der Co-Expression von ErbB3 mit ErbB2 ein aktiver Signalkomplex gebildet, und Antikörper, die gegen ErbB2 gerichtet sind, sind in der Lage, diesen Komplex zu zerstören (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269 (20), 14661–14665 (1994)). Zusätzlich dazu wird die Affinität von ErbB3 für Heregulin (HRG) bei Co-Expression mit ErbB2 auf einen Zustand höherer Affinität erhöht. Siehe auch Levi et al., Journal of Neuroscience 15, 1329–1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 1431–1435 (1995); sowie Lewis et al., Cancer Res. 56, 1457–1465 (1996), hinsichtlich des ErbB2-ErbB3-Proteinkomplexes. ErbB4 bildet, wie ErbB3, einen aktiven Signalkomplex mit ErbB2 (Carraway und Cantley, Cell 78, 5–8 (1994)).
Aufgrund der physiologischen Bedeutung dienten Mitglieder der ErbB-Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen oftmals als Ziel für die therapeutische Entwicklung. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9 (3), 1165–1172 (1989), beschreiben z. B. die Erzeugung einer Gruppe an Anti-ErbB2-Antikörpern, von denen einer, genannt 4D5, die zelluläre Proliferation um 56 % inhibierte. Eine rekombinante humanisierte Version des murinen Anti-ErbB2-Antikörpers 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb-HER2 oder HERCEPTIN^®; US-Patent Nr. 5.821.337 ) ist bei Patienten mit ErbB2-überexprimierenden metastatischen Brustkrebsarten, die eine umfassende vorhergehende Anti-Krebs-Therapie erhalten haben, klinisch aktiv (Balsega et al., J. Clin. Oncol. 14, 737–744 (1996)). HERCEPTIN^® erhielt die Vertriebs-Zustimmung der Food and Drug Administration am 25. September 1998 zur Behandlung von Patienten mit metastatischem Brustkrebs, deren Tumoren das ErbB2/HER2-Protein überexprimieren. Da HER2 zusätzlich zu Brustkrebs auch bei anderen Krebsarten überexprimiert wird, birgt HERCEPTIN^® auch großes Potential in der Behandlung solcher anderer Krebsarten.
2. Glattmuskelzellen-Proliferation
Glattmuskelzellen sind sehr wichtige Struktur- und Funktionskomponenten vieler hohler Durchgänge im Körper, unter anderem der Blutgefäße, des Gastrointestinaltrakts, der Atemwege (Trachea und Bronchien in den Lungenflügeln), des Harntraktsystems (Blase und Harnleiter) etc. Sie sind für die Elastizität verantwortlich, die für das normale Funktionieren dieser Organe so entscheidend erforderlich ist. Sie reagieren auf eine Reihe physiologischer Stimuli durch Konstriktion oder Dilatation, je nach Bedarf, z. B. zur Regulation des Durchflusses der in ihnen anzutreffenden Flüssigkeiten. Sie reagieren nicht nur auf chemische Stimuli, wie z. B. Wachstumsfaktoren und Zytokine, sondern auch auf physikalische Stimuli, wie z. B. Druck und Dehnung. Eine übermäßige Proliferation von Glattmuskelzellen führt in einer Reihe von Erkrankungen zu einer Verdickung der Wand und zu einer Verengung des Lumens der Organe, die als „Stenose" bekannt ist.
Eine Reihe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen sind in die Proliferation von Glattmuskelzellen verwickelt. Eine Kategorie solcher wichtiger Moleküle sind mit EGF verwandte Liganden. Es wurde z. B. von Glattmuskelzellen aus einer Reihe solcher Organe gezeigt, dass sie EGF-Rezeptoren besitzen, und manche von ihnen synthetisieren und sekretieren sogar EGF-Liganden, wie z. B. HB-EGF, wodurch eine autokrine Schleife aufgebaut wird. Verschiedene EGF-Liganden dienen als starke Mitogene und stimulieren die Proliferation von Glattmuskelzellen, was oftmals zu einer Verdickung der Wand und schließlich zu Stenose führt. Eine übermäßige Proliferation vaskulärer Glattmuskelzellen (VSMC) ist in die Pathologie von Gefäßstenose, Restenose, die aus Angioplastie oder chirurgischen Eingriffen oder Stent-Implantaten resultiert, Atherosklerose, Transplantat-Atherosklerose und Hypertonie involviert (beschrieben in Casterella und Teirstein, Cardiol. Rev. 7, 219–231 [1999]; Andres, Int. J. Mol. Med. 2, 81–89 [1998]; sowie Rosanio et al., Thromb. Haemost. 82 [Beilage 1], 164–170 [1999]). Die Verdickung von Blutgefäßen erhöht den Widerstand gegen den Blutfluss und führt schlussendlich zu Hypertonie. Weiters kann eine verringerte Blutzufuhr zum Gewebe auch zu Nekrose führen und eine Entzündungsreaktion induzie ren, die zu schweren Schäden führt. Ein Myokardinfarkt tritt z. B. als ein Resultat von Sauerstoffmangel und dem lokalen Tod von Herzmuskelgewebearten auf.
Infantile hypertrophe Pylorus-Stenose (IHPS), die eine funktionale Obstruktion des Pyloruskanals hervorruft, umfasst auch Hypertrophie und Hyperplasie der Pylorus-Glattmuskelzellen (Oue und Pur, Pediatr. Res. 45, 853–857 [1999]). Weiters sind EGF, EGF-Rezeptor und HB-EGF in die Pathogenese von Pylorus-Stenose involviert (Shima et al., Pediatr. Res. 47, 201–207 [2000]).
Auf ähnliche Art und Weise involviert die Wandverdickung der Harnblase, die als Reaktion auf obstruktive Syndrome auftritt, die den unteren Harntrakt betreffen, die Proliferation von Harnblasen-Glattmuskelzellen. Eine membrangebundene Vorläuferform von HB-EGF wird in Harnblasen-Glattmuskelzellen exprimiert, und HB-EGF ist ein starkes Mitogen für die Blasen-SMC-Proliferation (Freeeman et al., J. Clin. Invest. 99, 1028–1036 [1997]; Kaefer et al., J. Urol. 163, 580–584 [2000]; Borer et al., Lab Invest. 79, 1335–1345 [1999]).
Die obstruktiven Atemwegserkrankungen sind eine weitere Erkrankungsgruppe, denen eine Pathologie zugrunde liegt, welche die Glattmuskelzellen-Proliferation involviert. Ein Beispiel dieser Gruppe ist Asthma, das sich in einer Atemwegsentzündung und einer Bronchialverengung äußert. EGF ist in die pathologische Proliferation von Atemwegs-SMCs bei obstruktiven Erkrankungen der Luftwege involviert (Cerutis et al., Am. J. Physiol. 173, L10-15 [1997]; Cohen et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 16, 85–90 [1997]).
Die vorliegende Erfindung offenbart die Verwendung von ErbB4-Rezeptor-Antagonisten, wie in den Ansprüchen definiert, zur Steuerung der übermäßigen Migration und/oder Proliferation von Glattmuskelzellen zur Behandlung von Stenose.
WO 00/31048 A und WO 96/15128 A beschreiben Verbindungen, die Tyrosinkinasen inhibieren. Von diesen Verbindungen wird angenommen, dass sie in der Behandlung proliferativer Erkrankungen, unter anderem von Restenose, von Nutzen sind.
Bianco et al., Journal of Biological Chemistry, Band 274, Nr. 13, 8624–8629 (1999), und Chen et al., Journal of Biological Chemistry, Band 271, Nr. 13, 7620–7629 (1996), beschreiben Antikörper gegen ErbB4. Die therapeutische Verwendung der Antikörper wird nicht offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt betrifft die Erfindung Mittel zur Steuerung der übermäßigen Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen zur Behandlung von Stenose durch die Behandlung der Glattmuskelzellen mit einer wirksamen Menge eines Antagonisten eines nativen ErbB4-Rezeptors, wie in den Ansprüchen definiert. Die Steuerung liegt in der Prävention oder Inhibierung, unter anderem der vollständigen Inhibierung, der exzessiven Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen. In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Glattmuskelzellen um Harnblasen-Glattmuskelzellen und in einer anderen Ausführungsform um Glattmuskelzellen eines Atemwegs.
Die übermäßige Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen, wie z. B. vaskulären Glattmuskelzellen, kann zu Stenose, unter anderem zu Gefäßstenose und Restenose, führen. In einer Ausführungsform sind die Glattmuskelzellen menschlich. Die Stenose kann weiters durch übermäßige Proliferation oder Migration von Endothelzellen gekennzeichnet sein.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem ErbB4-Rezeptor-Antagonisten um ein Immunoadhäsin, wie in den Ansprüchen definiert. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich beim ErbB4-Rezeptor-Antagonisten um einen neutralisierenden Antikörper gegen einen nativen ErbB4-Rezeptor, wie in den Ansprüchen definiert.
Der Antagonist kann zur Verabreichung als Injektion oder als Infusion geeignet sein. Die Mittel zur Behandlung können auch verwendet werden, um Hypertonie zu reduzieren, die mit der Stenose assoziiert ist. Die Stenose kann Gefäßstenose sein, unter anderem Restenose, Pylorus-Stenose sowie eine Verdickung der Harnblasenwand oder Teil einer obstruktiven Erkrankung der Atemwege.
In einer Ausführungsform ist der Antagonist ein Immunoadhäsin, umfassend die extrazelluläre Region eines nativen menschlichen ErbB4-Rezeptors, wie in den Ansprüchen definiert. In einer anderen Ausführungsform ist der Antagonist ein neutralisierender Antikörper gegen einen nativen menschlichen ErbB4-Rezeptor, wie in den Ansprüchen definiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Mittel zur Behandlung von Stenose bei einem Säugetier-Patienten, wie z. B. einem Menschen, worin die Mittel in eine Zelle des Patienten unter Verwendung einer Nucleinsäure eingeführt werden, die für einen Antagonisten eines ErbB4-Rezeptors kodiert, wie in den Ansprüchen definiert. Die einzuführende Nucleinsäure kann in vivo oder ex vivo eingeführt werden, sowie mit der Hilfe eines Vektors, wie z. B. eines retroviralen Vektors oder eines lipidbasierten Anlieferungssystems. Das Mittel der vorliegenden Erfindung ist besonders für die Behandlung (unter anderem die Prävention) von Gefäßstenose und Restenose von Nutzen.
Der Antagonist kann ein Immunoadhäsin sein, wie in den Ansprüchen definiert. Der Antagonist kann auch ein neutralisierender Antikörper gegen einen nativen menschlichen ErbB4-Rezeptor sein, wie in den Ansprüchen definiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Mittel zur Behandlung von Hypertonie, die mit Gefäßstenose bei einem Patienten, bei dem es sich um ein Säugetier handelt, assoziiert ist.
In allen Aspekten umfassen ErbB4-Antagonisten Immunoadhäsine, umfassend eine extrazelluläre Domänensequenz eines nativen menschlichen ErbB4-Rezeptors, vorzugsweise an eine Sequenz einer konstanten Immunglobulin-Region fusioniert. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise jene einer konstanten Region einer Schwerkette eines IgG1-, IgG2- oder IgG3-Immunglobulins und kann zusätzlich dazu eine Immunglobulin-Leichtkettensequenz umfassen, die kovalent an das Fusionsmolekül gebunden ist, das die konstante Region der Immunglobulin-Schwerkette umfasst.
Eine weitere bevorzugte Klasse von ErbB4-Antagonisten umfasst neutralisierende Antikörper, die spezifisch an einen nativen ErbB4-Rezeptor binden, wie in den Ansprüchen definiert. Die Antikörper sind vorzugsweise menschlich oder humanisiert. In einer Ausführungsform binden die Antikörper im Wesentlichen dasselbe Epitop wie ein Antikörper, der von einem Hybridom produziert wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus HER4.10H1.1A1 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2828), HER4.1C6.A11 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2827) und HER4.8B1.2H2 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2825) besteht. Die Antikörper können auch Reste komplementätsbestimmender Regionen (CDR) aus einem Antikörper aufweisen, der von einem Hybridom produziert wurde, das aus der aus HER4.10H1.1A1 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2828), HER4.1C6.A11 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2827) und HER4.8B1.2H2 (ATCC-Zugriffsnr. PTA-2825) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Die Glattmuskelzellen können z. B. Pylorus- oder Harnblasen-Glattmuskelzellen sein oder Glattmuskelzellen eines Atemwegs. Es handelt sich bei den Glattmuskelzellen vorzugsweise um vaskuläre Glattmuskelzellen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Antikörpers, der ErbB4 mit hoher Affinität bindet, wie in den Ansprüchen definiert. Dieser Antikörper bindet vorzugsweise an ErbB4 mit einem Kd-Wert von weniger als 100 nM, noch bevorzugter mit einem Kd-Wert von weniger als 50 nM, noch bevorzugter mit einem Kd-Wert von weniger als 25 nM und insbesondere mit einem Kd-Wert von weniger als 10 nM. In einer Ausführungsform ist dieser Antikörper ein menschlicher Antikörper, und in einer anderen Ausführungsform handelt es sich um einen humanisierten Antikörper. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um ein Antikörper-Fragment.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der an ErbB4 bindet und die Heregulin-Bindung daran reduziert, wie in den Ansprüchen definiert. Dieser Antikörper kann ErbB4 mit hoher Affinität binden.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der an ErbB4 bindet und die Heregulin-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung daran reduziert, wie in den Ansprüchen definiert. Dieser Antikörper kann auch ErbB4 mit hoher Affinität binden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nucleotidsequenz von menschlichem ErbB4 (Seq.-ID Nr. 1).
2 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem ErbB4 (Seq.-ID Nr. 2).
3 zeigt die Nucleotidsequenz eines ErbB4-IgG-Immunoadhäsins (Seq.-ID Nr. 3).
4 zeigt die Aminosäuresequenz der extrazellulären ErbB4-Domäne (ErbB4-ECD), welche die Aminosäuren 26 bis 640 (Seq.-ID Nr. 4) der ErbB4-Aminosäuresequenz umfasst, die in 2 dargestellt wird (Seq.-ID Nr. 2).
5 zeigt die Wirkung von ErbB4-IgG-Immunoadhäsin auf die PDGF-stimulierte Proliferation menschlicher Aorta-Glattmuskelzellen.
6 zeigt die Wirkung von ErbB4-IgG-Immunoadhäsin auf die chemotaktische Reaktion menschlicher Aorta-Glattmuskelzellen auf Thrombin.
7 zeigt die Inhibierung der Heregulin-Bindung an HER4-Immunoadhäsin durch monoklonale Anti-HER4-Antikörper.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
A. Definitionen
Falls nicht anders definiert, so besitzen die hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung, den diese Erfindung betrifft, normalerweise aufgefasst wird. Siehe z. B. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Auflage, J. Wiley & Sons, New York, NY (1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor, NY (1989). Für Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke untenstehend definiert.
Falls nicht anders angegeben, bezieht sich der Ausdruck „ErbB" bei Verwendung hierin auf einen oder mehrere beliebige der Säugetier-ErbR-Rezeptoren (d. h. ErbB1-Rezeptor oder den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF); ErbB2- oder HER2-Rezeptor; ErbB3- oder HER3-Rezeptor; ErbB4- oder HER4-Rezeptor; sowie (ein) beliebige(s) andere(s) Mitglied(er) dieser Klasse-I-Tyrosinkinase-Familie, die in Zukunft identifiziert werden), und „erbB" bezieht sich auf die Säugetier-erbB-Gene, die für diese Rezeptoren kodieren.
Die Ausdrücke „ErbB4" und „HER4" werden synonym verwendet und beziehen sich auf ein Nativsequenz-ErbR-Rezeptor-Polypeptid wie offenbart, z. B. in der Europäischen Patentanmeldung ( EP) Nr. 599.274 ; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1746–1750 (1993); sowie Plowman et al., Nature 366, 473–475 (1993); sowie auf funktionale Derivate, unter anderem Aminosäuresequenzvarianten davon.
Ein „nativer" oder „Nativsequenz"-ErbB4- oder -HER4-Rezeptor besitzt die Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden ErbB4-Rezeptors in einer beliebigen Säugetier-Spezies (unter anderem Menschen), unabhängig von seinem Herstellungsmodus. Dementsprechend kann ein nativer oder Nativsequenz-ErbB4-Rezeptor aus der Natur isoliert werden, durch DNA-Rekombinationsverfahren produziert wer den, chemisch synthetisiert werden oder durch beliebige Kombinationen dieser oder ähnlicher Verfahren produziert werden. Native ErbB4-Rezeptoren umfassen spezifisch Polypeptide mit der Aminosäuresequenz natürlich vorkommender Allelvarianten, Isoformen oder gespleißter Varianten von ErbB4, die nach dem Stand der Technik bekannt sind oder im Folgenden entdeckt werden. Nativsequenz-ErbB4-Rezeptoren werden z. B. in EP 599.274 , s. o., sowie in den zwei Veröffentlichungen von Plowman et al., s. o., offenbart. Elenius et al., J. Biol. Chem. 272, 26761–26768 (1997), berichten über die Identifikation zweier alternativ gespleißter Isoformen von ErbB4, sowohl in Maus- als auch in menschlichen Geweben, die sich durch die Insertion von entweder 23 (HER4-JM-a) oder 13 (HER4-JM-b) alternativen Aminosäuren in der extrazellulären Juxtamembran-(JM-)Region unterscheiden. Elenius et al., Oncogene 18, 2607–2615 (1999), berichten über die Identifikation und Charakterisierung einer anderen natürlich auftretenden Isoform von ErbB4 (ErbB4-CYT-2 benannt), und zwar mit einer Deletion der Sequenz der zytoplasmatischen Domäne, die für die Aktivierung des intrazellulären P13-K-Signalübertragungswegs erforderlich ist. HER4-Isoformen werden auch in WO 99/19488 offenbart. Eine Nucleotidsequenz, die für ErbB4 kodiert, wird in 1 (Seq.-ID Nr. 1) dargestellt, und die korrespondierende abgeleitete Aminosäuresequenz wird in 2 dargestellt (Seq.-ID Nr. 2).
Der Ausdruck „extrazelluläre ErbB4-Domäne" oder „ErbB4-ECD" bezieht sich auf ein lösliches Fragment von ErbB4, umfassend die Aminosäuren, die zwischen der Signalsequenz und der ersten prognostizierten Transmembranregion positioniert sind. In einer Ausführungsform ist die „ErbB4-ECD" ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 26–640 (Seq-ID Nr. 4) der menschlichen ErbB4-Sequenz, die in 2 dargestellt ist (Seq.-ID Nr. 2).
Der Ausdruck „Säugetier" wird hierin verwendet, um ein beliebiges Tier zu bezeichnen, das als ein Säugetier klassifiziert ist, unter anderem und ohne Einschränkungen Menschen, domestizierte Tiere, landwirtschaftliche Nutztiere sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z. B. Schafe, Hunde, Pferde, Katzen, Kühe etc. Vorzugsweise ist das Säugetier hierin ein Mensch.
„Funktionale Derivate” umfassen Aminosäuresequenzvarianten sowie kovalente Derivate der nativen Polypeptide, solange sie eine qualitative biologische Aktivität der korrespondierenden nativen Polypeptide beibehalten. Aminosäuresequenzvarianten unterscheiden sich allgemein von einer Nativsequenz in der Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren innerhalb einer nativen Aminosäuresequenz. Deletionsvarianten umfassen Fragmente der nativen Polypeptide sowie Varianten mit N- und/oder C-terminalen Trunkierungen. Normalerweise besitzen Aminosäuresequenzvarianten zumindest etwa 70 % Homologie, vorzugsweise zumindest etwa 80 %, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Homologie, mit einem nativen Polypeptid.
„Homologie" wird als der Prozentsatz der Reste in der Aminosäuresequenzvariante definiert, die nach der Anordnung der Sequenzen und der Einführung von Lücken, falls notwendig, um den maximalen Prozentsatz der Homologie zu erreichen, identisch sind. Verfahren und Computerprogramme zur Anordnung sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Ein solches Computerprogramm ist „Align 2", Autor Genentech Inc., das mit Benutzerbeschreibungen im United States Copyright Office, Washington DC 20559, am 10. Dezember 1991 eingereicht wurde.
Ein ErbB-„Antagonist” ist ein Molekül, das eine ErbB-Effektorfunktion verhindert oder stört, z. B. ein Molekül, das die Bindung und/oder Aktivierung eines Nativsequenz-ErbB-Rezeptors durch einen Liganden verhindert oder stört und/oder stromab gelegene Wege, die vom Nativsequenz-ErbB-Rezeptor verwendet werden. Solche Moleküle können z. B. basierend auf ihrer Fähigkeit, die ErbB-Rezeptoraktivierung kompetitiv durch einen Liganden zu inhibieren, im Tyrosin-Phosphorylierungstest gescreent werden. Auf ähnliche Art und Weise ist ein Antagonist eines Nativsequenz-ErbB4-(HER4-)Rezeptors ein Molekül, das eine ErbB4-Effektorfunktion verhindert oder stört, z. B. ein Molekül, das die Brandung und/oder Aktivierung eines Nativsequenz-ErbB4-Rezeptors durch einen Liganden verhindert oder stört und/oder stromab gelegene Wege, die vom ErbB4-Rezeptor verwendet werden. Solche Moleküle können z. B. basierend auf ihrer Fähigkeit, die ErbB4-Rezeptor-Aktivierung durch einen Liganden kompetitiv zu inhibieren, im Tyrosin-Phosphorylierungstest gescreent werden. Bei spiele von ErbB4-Antagonisten umfassen ohne Einschränkung lösliche ErbB4-Rezeptoren (wie z. B. extrazelluläre Domänen (ECD) von Nativsequenz- und ErbB4-Varianten-Rezeptoren), neutralisierende Antikörper gegen Nativsequenz-ErbB4-Rezeptoren, neutralisierende Antikörper gegen Liganden von Nativsequenz-ErbB4-Rezeptoren (z. B. Anti-HB-EGF-Antikörper), ErbB4-Ig-Immunoadhäsine (unter anderem chimäre Heteroadhäsine) sowie kleine Moleküle.
Mit „ErbB4-Ligand" ist ein Polypeptid gemeint, das an den ErbB4-Rezeptor bindet und/oder diesen aktiviert. ErbB4-Liganden umfassen β-Cellulin, Epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3 und Hereguline.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck „Kontrolle" sowie grammatikalische Varianten davon verwendet, um sich auf die Prävention, die partielle oder die vollständige Inhibierung, Reduktion, Verspätung oder Verlangsamung eines unerwünschten Vorkommnisses zu beziehen, z. B. auf einen physiologischen Zustand, wie z. B. die übermäßige Proliferation und/oder Migration von Glattmuskelzellen und/oder anderen Zelttypen, z. B. Endothelzellen.
Der Ausdruck „übermäßige Proliferation und/oder Migration" bedeutet Proliferation und/oder Migration, die über das normale Ausmaß hinausgeht und, falls unbehandelt, zu der Entwicklung eines ungewollten physiologischen Zustands oder einer Erkrankung führt oder wahrscheinlich dazu führt, z. B. Stenose, unter anderem Gefäßstenose, Restenose und Pylorus-Stenose, Verdickung der Harnblasenwand sowie obstruktive Erkrankungen der Atemwege.
„Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die eine Behandlung benötigen, umfassen jene Individuen, bei denen die Erkrankung bereits ausgebrochen ist, sowie jene, die zu einem Ausbruch der Erkrankung neigen, sowie jene, bei denen die Erkrankung verhindert werden soll. Für Zwecke dieser Erfindung umfassen positive oder gewünschte klinische Resultate die Erleichterung von Symptomen, die Verringerung des Krankheitsausmaßes, eine Stabilisierung (d. h. keine Verschlechterung) des Krank heitszustands, eine Verzögerung oder Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung, eine Verbesserung oder Linderung des Erkrankungszustands sowie eine Remission (unabhängig davon, ob diese partiell oder vollständig ist), egal, ob detektierbar oder nicht detektierbar, sind jedoch nicht darauf beschränkt. „Behandlung" kann auch eine Verlängerung des Überlebens im Vergleich zu dem erwarteten Überleben bei Nichterhalt von Behandlung bedeuten. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen Individuen, die bereits unter der Erkrankung oder Störung leiden, sowie jene, die zu der Erkrankung oder Störung neigen, oder jene, bei denen die Erkrankung oder Störung vermieden werden soll.
Der Ausdruck „isoliertes" Molekül wird auf breiter Ebene als ein Molekül definiert, das identifiziert ist und von zumindest einem kontaminierendem Molekül getrennt ist, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle des Moleküls assoziiert ist. Das isolierte Molekül ist vorzugsweise frei von der Assoziierung mit allen Komponenten, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist.
Der Ausdruck „Immunoadhäsin" bezieht sich bei Verwendung hierin auf Antikörperartige Moleküle, welche die Bindungsdomäne eines Proteins, wie z. B. eine extrazelluläre Domäne (den Adhäsin-Abschnitt) eines Zelloberflächenrezeptors, mit den Effektorfunktionen einer konstanten Immunglobulindomäne kombinieren. Der Ausdruck „Immunoadhäsin" umfasst spezifisch Nativ- oder ErbB4-Varianten-Rezeptorsequenzen. Die Nucleinsäuresequenz eines ErbB4-IgG-Immunoadhäsins wird in 3 dargestellt (Seq.-ID Nr. 3). Immunoadhäsine können viele der wertvollen chemischen und biologischen Eigenschaften menschlicher Antikörper besitzen. Da Immunoadhäsine aus einer menschlichen Proteinsequenz mit einer gewünschten Spezifität konstruiert werden können, die an eine geeignete menschliche Immunglobulin-Gelenkssequenz und eine Sequenz einer konstanten Domäne (Fc) gebunden ist, kann die Bindungsspezifität von Interesse unter Verwendung ausschließlich menschlicher Komponenten erreicht werden. Solche Immunoadhäsine sind für den Patienten minimal immunogen und sind zur chronischen oder wiederholten Verwendung sicher. Der Ausdruck „isoliertes Immunoadhäsin" bezieht sich auf ein Immunoadhäsin, das aus einer Quelle gereinigt wurde oder mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt wurde und ausreichend frei von anderen Peptiden oder Proteinen ist.
Immunoadhäsine, von denen in der Literatur berichtet wurde, umfassen Fusionen des T-Zellen-Rezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); sowie Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin oder Homing-Rezeptor (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); sowie Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); sowie Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); Interferon-Rezeptor (Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992)); 4-1BB (Chalupny et al., PNAS USA 89, 10360–10364 (1992)) und IgE-Rezeptor (Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstract-Nr. 1448 (1991)).
Beispiele homomultimerer Immunoadhäsine, die zur therapeutischen Verwendung beschrieben wurden, umfassen das CD4-IgG-Immunoadhäsin zum Blockieren der Bindung von HIV an Zelloberflächen-CD4. Daten, die aus klinischen Phase-I-Tests erhalten wurden, in denen schwangeren Frauen CD4-IgG kurz vor der Geburt verabreicht wurde, zeigen, dass dieses Immunoadhäsin bei der Prävention der mütterlichfetalen Übertragung von HIV von Nutzen sein kann (Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 219–227 (1993)). Es wurde auch ein Immunoadhäsin entwickelt, das den Tumornekrosefaktor (TNF) bindet. TNF ist ein proinflammatorisches Zytokin, von dem gezeigt wurde, dass es ein Hauptvermittler von septischem Schock ist. Basierend auf einem Mausmodell von septischem Schock erwies sich ein TNF-Rezeptor-Immunoadhäsin vielversprechend als Kandidat zur klinischen Verwendung zur Behandlung von septischem Schock (A. Ashkenazi et al., PNAS USA 88, 10535–10539 (1991)). ENBREL^® (Etanercept), ein Immunoadhäsin, das eine TNF-Rezeptorse quenz umfasst, die an eine IgG-Fc-Region fusioniert ist, erhielt am 2. November 1998 die Genehmigung der Food and Drug Administration (FDA) der Vereinigten Staaten von Amerika zur Behandlung von Gelenkrheumatismus. Die neue, erweiterte Verwendung von ENBREL^® zur Behandlung von Gelenkrheumatismus erhielt vor kurzem am 6. Juni 2000 die Genehmigung der FDA. Für jüngste Informationen über TNF-Blocker, unter anderem ENBREL^®, siehe Lovell et al., N. Engl. J. Med. 342, 763–169 (2000), sowie das begleitende Editorial auf S. 810–811; weiters Weinblatt et al., N. Eng. J. Med. 340, 253–259 (1999), beschrieben in Maini und Taylor, Annu. Rev. Med. 51, 207–229 (2000). Immunoadhäsine besitzen auch nicht-therapeutische Verwendungen. Das L-Selectin-Rezeptor-Immunoadhäsin wurde z. B. als Reagens für die histochemische Färbung peripherer hochendothelialer Lymphknoten-Venolen (HEV) verwendet. Dieses Reagens wurde auch verwendet, um den L-Selectin-Liganden zu isolieren und zu beschreiben (Ashkenazi et al., s. o.).
Weisen die zwei Arme der Immunoadhäsinstruktur unterschiedliche Spezifitäten auf, so wird das Immunoadhäsin durch die Analogie zu bispezifischen Antikörpern „bispezifisches Immunoadhäsin" genannt. Dietsch et al., J. Immunol. Methods 162, 123 (1993), beschreiben solch ein bispezifisches Immunoadhäsin, das die extrazellulären Domänen der Adhäsionsmoleküle, E-Selectin und P-Selectin, kombiniert, wobei jedes dieser Selectine in der Natur in einem anderen Zelltyp exprimiert wird. Bindungsstudien zeigten, dass das so gebildete, bispezifische Immunglobulin-Fusionsprotein eine verbesserte Fähigkeit im Vergleich zu den monospezifischen Immunoadhäsinen, von denen es abstammte, besaß, an eine myeloische Zelllinie zu binden.
Der Ausdruck „Heteroadhäsin" wird synonym mit dem Ausdruck „chimäres Heteromultimer-Adhäsin" verwendet und bezieht sich auf einen Komplex chimärer Moleküle (Aminosäuresequenzen), in denen jedes chimäre Molekül einen biologisch aktiven Teil, wie z. B. die extrazelluläre Domäne eines jeden der heteromultimeren Rezeptormonomere, mit einer Multimerisationsdomäne kombiniert. Die „Multimerisationsdomäne" fördert die stabile Wechselwirkung der chimären Moleküle innerhalb des Heteromultimerkomplexes. Die Multimerisationsdomänen können durch eine Im munglobulinsequenz, einen Leucin-Zipper, eine hydrophobe Region, eine hydrophile Region oder ein freies Thiol, das eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen den chimären Molekülen des chimären Heteromultimers bildet, Wechselwirken. Die Multimerisationsdomäne kann eine konstante Immunglobulinregion umfassen. Zusätzlich dazu kann eine Multimerisationsregion gentechnisch verändert werden, so dass sterische Wechselwirkungen nicht nur eine stabile Wechselwirkung fördern, sondern weiters die Bildung von Heterodimeren gegenüber Homodimeren aus einem Gemisch an Monomeren fördern. „Protuberanzen" werden durch das Ersetzen kleiner Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Polypeptids mit größeren Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) konstruiert. Kompensatorische „Hohlräume" identischer oder ähnlicher Größe wie die Protuberanzen werden gegebenenfalls auf der Grenzfläche des zweiten Polypeptids durch das Ersetzen großer Aminosäureseitenketten mit kleineren (z. B. Alanin oder Threonin) kreiert. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise, jedoch nicht erforderlicherweise, eine konstante Immunglobulindomäne. Die Immunglobulingruppierung in den Chimären der vorliegenden Erfindung kann aus IgG₁-, IgG₂-, IgG₃- oder IgG₄-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, jedoch vorzugsweise IgG₁ oder IgG₃, erhalten werden.
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, welches das gesamte chimäre Heteroadhäsin oder ein Fragment davon umfasst, das an ein „Markierungs-Polypeptid" fusioniert ist. Das Markierungs-Polypeptid besitzt genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, dennoch kurz genug ist, so dass es die Aktivität des chimären Heteroadhäsins nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper dagegen im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit anderen Epitopen eingeht. Geeignete Markierungs-Polypeptide besitzen allgemein zumindest 6 Aminosäurereste und normalerweise zwischen etwa 8–50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 9–30 Reste). Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst ein chimäres Heteroadhäsin, das an eine Epitop-Markierung gebunden ist, wobei die Markierung verwendet wird, um das Adhäsin in einer Probe zu detektieren oder um das Adhäsin aus einer Probe zu gewinnen.
„Isoliertes/hochgradig gereinigtes/im Wesentlichen homogenes Immunoadhäsin", „isoliertes/hochgradig gereinigtes/im Wesentlichen homogenes Heteroadhäsin" sowie „isoliertes/hochgradig gereinigtes/im Wesentlichen homogenes chimäres Heteromultimer-Adhäsin” werden synonym verwendet und bedeuten das Adhäsin, das aus einer Quelle gereinigt wurde oder durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt wurde und bis zur Homogenität durch chromatographische Verfahren oder andere Reinigungsverfahren, wie z. B. SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung, im Wesentlichen frei von anderen Peptiden oder Proteinen ist. Homogenität bedeutet hier weniger als etwa 5 % Kontaminierung mit Proteinen anderer Quellen. Die chimären ErbB2/4-IgG-Heteroadhäsine der Erfindung binden mit ausreichend höherer Affinität im Verhältnis zu den Homodimeren, so dass die Verwendung eines Gemisches an Homodimeren und Heterodimeren auch als eine nützliche Ausführungsform der Erfindung angesehen wird. Die Ausdrücke „chimäres Heteromultimer-Adhäsin", „chimäres Heteroadhäsin" und „CHA" werden hierin synonym verwendet.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt spezifisch Antikörper ab, die native ErbB4-Rezeptoren erkennen. Ein Antikörper, der eine Bindung „hoher Affinität" zeigt, besitzt einen Kd-Wert von weniger als etwa 100 nM, vorzugsweise weniger als etwa 50, noch bevorzugter weniger als etwa 25, insbesondere weniger als etwa 10.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wurde, d. h. die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, sind mit Ausnahme möglicher, natürlich auftretender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch. Monoklonale Antikörper sind hochgradig spezifisch, da sie gegen eine einzelne Antigenstelle gerichtet sind. Weiters ist jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörper-Präparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen ver schiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen Hybrid- und rekombinante Antikörper, die durch Spleißen einer variablen (unter anderem hypervariablen) Domäne eines Anti-Chimär-Heteroadhäsin-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z. B. "humanisierte" Antikörper) oder einer Leichtkette mit einer Schwerkette oder einer Kette von einer Spezies mit einer Kette einer anderen Spezies oder Fusionen mit heterologen Proteinen produziert wurden, unabhängig von der Ursprungsspezies oder der Immunglobulin-Klassen- oder -Unterklassen-Benennung, sowie Antikörper-Fragmente (z. B. Fab, F(ab)₂ und Fv), solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 und Mage & Lamoyi, in: Monoclonal Antibody Produktion Techniques and Applications, 79–97, Marcel Dekker, Inc., New York (1987).)
Daher zeigt der Modifikator „monoklonal" das Wesen des Antikörpers als aus einer im Wesentlichen homogenen Population an Antikörpern erhalten und ist nicht als eine Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erfordernd auszulegen. Die in Einklang mit der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper können durch das Hybridom-Verfahren hergestellt werden, das zuerst von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden ( US-Patent Nr. 4.816.567 ). Die „monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagenbibliotheken isoliert werden, die z. B. unter Verwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Verfahren erzeugt wurden.
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher (z. B. muriner) Antikörper sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ oder andere Antigenbindungs-Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Humanisierte Antikörper sind größtenteils menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus den komplementätsbestimmenden Regio nen (CDRs) des Rezipienten-Antikörpers durch Reste aus den CDRs einer nicht-menschlichen Spezies (Donor-Antikörper), wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüst-Regions-(FR-)Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende, nicht-menschliche FR-Reste ersetzt. Weiters kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in den importierten CDR- oder FR-Sequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden gemacht, um die Leistung des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, bei denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Reste jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensus-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins.
„Muskelzellen" umfassen Skelett-, Herz- oder Glattmuskelgewebezellen. Dieser Ausdruck umfasst jene Zellen, die sich differenzieren, um spezialisiertere Muskelzellen (z. B. Myoblasten) zu bilden. Vaskuläre Glattmuskelzellen beziehen sich auf Glattmuskelzellen, die in einer mittleren elastischen Schicht, Media, von Blutgefäßen vorhanden sind.
Der Ausdruck „Stenose" bezieht sich auf eine Verengung oder Striktur eines hohlen Durchgangs (z. B. eines Ductus oder Kanals) im Körper. Der Ausdruck „Gefäßstenose" bezieht sich auf eine Okklusion oder Verengung von Blutgefäßen. Gefäßstenose resultiert oftmals aus Fettablagerungen (wie im Fall von Atherosklerose) oder einer übermäßigen Migration und Proliferation von vaskulären Glattmuskelzellen und Endothelzellen. Arterien sind für Stenose besonders anfällig. Der Ausdruck „Stenose" umfasst, wie hierin verwendet, spezifisch anfängliche Stenose und Restenose.
Der Ausdruck „Restenose" bezieht sich auf das Wiederauftreten von Stenose nach der Behandlung anfänglicher Stenose mit scheinbarem Erfolg. „Restenose" bezieht sich im Kontext von Gefäßstenose z. B. auf das Wiederauftreten von Gefäßstenose, nachdem diese mit scheinbarem Erfolg behandelt wurde, z. B. durch die Entfernung der Fettablagerungen durch Ballon-Angioplastie. Einer der zu Restenose beitragenden Faktoren ist intimale Hyperplasie. Der Ausdruck „intimale Hyperplasie", synonym mit „neointimaler Hyperplasie" und „Neointima-Bildung" verwendet, bezieht sich auf eine Verdickung der innersten Schicht der Blutgefäße, Intima, als Konsequenz übermäßiger Proliferation und Migration von vaskulären Glattmuskelzellen und Endothel-Zellen. Die verschiedenen Veränderungen, zu denen es während einer Restenose kommt, werden oftmals kollektiv als „Gefäßwand-Remodellierung" bezeichnet.
Die Ausdrücke „Ballon-Angioplastie" und „perkutane transluminale Coronarangioplastie" (PTCA) werden oftmals synonym verwendet und beziehen sich auf eine nicht-chirurgische, auf einem Katheter basierende Behandlung zur Entfernung von Plaque aus der Koronararterie. Stenose oder Restenose führt oftmals zu Hypertonie als Resultat eines erhöhten Widerstands gegenüber Blutfluss.
Der Ausdruck „Pylorus-Stenose" bezieht sich auf eine Verengung des Pylorus, der Passage am unteren Magenende, die sich in den Zwölffingerdarm öffnet.
Der Ausdruck „Hypertonie" bezieht sich auf abnormal hohen Blutdruck, d. h. über dem oberen Wert des normalen Bereichs.
Mit „neutralisierendem Antikörper" ist ein Antikörpermolekül gemeint, wie hierin definiert, das in der Lage ist, eine Effektorfunktion von ErbB-Rezeptoren zu blockieren oder signifikant zu reduzieren. Dementsprechend ist ein „neutralisierender" Anti-ErbB4-Antikörper in der Lage, eine Effektorfunktion, wie z. B. eine Ligandbindung und/oder Auslösung einer zellulären Antwort, von ErbB4 zu blockieren oder signifikant zu reduzieren. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung kann die Fähigkeit eines Anti-ErbB4-Antikörpers, die Bindung eines ErbB4-Liganden (Heregulin, HRG) an ErbB4 zu neutralisieren, beobachtet werden, z. B. durch Messen der Bindung von detektierbar markiertem HRG an gereinigten ErbB4 oder an eine Zelllinie, die ErbB4 in Gegenwart und bei Abwesenheit eines Kandidaten-Anti-ErbB4-Antikörpers exprimiert oder dafür modifiziert wurde. Solche Tests werden im unten stehenden Beispiel 4 beschrieben. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird die Fähigkeit der Anti-ErbB4-Antikörper, die Auslösung einer zellulären Antwort durch ErbB4 zu neutralisieren, vorzugsweise durch Beobachtung der Inhibierung der Tyrosin-Phosphorylierung von ErbB4 durch Heregulin (HRG) oder in einem Zellproliferationstest getestet. Repräsentative Tests werden unten stehend in Beispiel 4 offenbart. Eine „signifikante" Reduktion bedeutet zumindest etwa 60 % oder zumindest etwa 70 %, vorzugsweise zumindest etwa 75 %, noch bevorzugter zumindest etwa 80 %, noch bevorzugter zumindest etwa 85 %, noch bevorzugter zumindest etwa 90 %, noch bevorzugter zumindest etwa 95 %, noch bevorzugter zumindest etwa 99 %, Reduktion einer Effektorfunktion des Target-Antigens (z. B. ErbB4), wie z. B. der Ligand-(z. B. HRG-)Bindung und/oder Auslösung einer zellulären Antwort. Vorzugsweise sind die „neutralisierenden" Antikörper, wie hierin definiert, in der Lage, zumindest etwa 60 % oder zumindest etwa 70 %, vorzugsweise zumindest etwa 75 %, noch bevorzugter zumindest etwa 80 %, noch bevorzugter zumindest etwa 85 %, noch bevorzugter zumindest etwa 90 %, noch bevorzugter zumindest etwa 95 %, insbesondere zumindest etwa 99 %, der Tyrosin-Phosphorylierung von ErbB4 durch HRG zu neutralisieren, wie durch den in Beispiel 4 beschriebenen Test bestimmt wird.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der identifiziert und getrennt wurde und/oder aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für die Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) auf mehr als 95 Gew.-% Antikörper gereinigt, wie durch das Lowry-Verfahren bestimmt, und insbesondere auf mehr als 99 Gew.-%, (2) in einem Ausmaß gereinigt, das ausreicht, um zumindest 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz durch die Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung gereinigt. Isolierte Antikörper umfassen den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. isolierter Antikörper wird normalerweise jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck „Epitop" wird verwendet, um sich auf Bindungsstellen für (monoklonale oder polyklonale) Antikörper auf Protein-Antigenen zu beziehen.
Antikörper, die an ein spezifisches Epitop binden, können durch „Epitop-Kartierung" identifiziert werden. Es gibt viele Verfahren, die nach dem Stand der Technik zur Kartierung und Beschreibung der Position von Epitopen auf Proteinen bekannt sind, unter anderem das Auflösen der Kristallstruktur eines Antikörper-Antigen-Komplexes, Wettbewerbstests, Genfragment-Expressionstests und peptidbasierte Synthese-Tests, wie z. B. in Kapitel 11 von Harlow und Lane, Using Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York (1999), beschrieben. Wettbewerbstests werden unten stehend beschrieben. Entsprechend den Genfragment-Expressionstests wird der offene Leseraster, der für das Protein kodiert, fragmentiert, und zwar entweder nach dem Zufallsprinzip oder durch spezifische genetische Konstruktionen, und die Reaktivität der exprimierten Fragmente des Proteins mit dem zu testenden Antikörper wird bestimmt. Die Genfragmente können z. B. durch PCR hergestellt werden und anschließend transkribiert und in vitro in Gegenwart radioaktiver Aminosäuren in Protein translatiert werden. Die Bindung des Antikörpers an die radioaktiv markierten Proteinfragmente wird anschließend durch Immunpräzipitation und Gelelektrophorese bestimmt. Gewisse Epitope können auch unter Verwendung großer Bibliotheken an Zufalls-Peptidsequenzen identifiziert werden, die auf der Oberfläche von Phagen-Partikeln dargestellt werden (Phagenbibliotheken). Alternativ dazu kann eine definierte Bibliothek überlappender Peptidfragmente in einfachen Bindungstests auf die Bindung an den Test-Antikörper getestet werden. Der letztere Ansatz ist geeignet, um lineare Epitope von etwa 5 bis 15 Aminosäuren zu definieren.
Ein Antikörper bindet „im Wesentlichen dasselbe Epitop" als ein Referenzantikörper, wenn die zwei Antikörper identische oder sterisch überlappende Epitope erkennen.
Die am häufigsten verwendeten und schnellsten Verfahren zur Bestimmung, ob zwei Epitope an identische oder sterisch überlappende Epitope binden, sind Wettbewerbstests, die in allen möglichen verschiedenen Formaten konfiguriert sein können, entweder unter Verwendung von markiertem Antigen oder von markiertem Antikörper. Normalerweise ist das Antigen auf einer 96-Well-Platte immobilisiert, und die Fähigkeit von unmarkierten Antikörpern, die Bindung von markierten Antikörpern zu blockieren, wird unter Verwendung radioaktiver oder Enzymmarkierungen gemessen.
Der Ausdruck „Inhibieren eines ErbB4-(HER4-)Rezeptors" bezieht sich auf die Fähigkeit eines ErbB4-Antagonisten, die Aktivierung eines ErbB4-Rezeptors zu inhibieren oder zu verhindern, z. B. durch Blockieren der Bindung eines Liganden an den ErbB4-Rezeptor. Die „Aktivierung" eines ErbB4-Rezeptors bezieht sich auf die Rezeptor-Phosphorylierung, die unter Verwendung der Tyrosin-Phosphorylierungstests quantifiziert werden kann, sowie auf stromab gelegene Vorkommnisse, die eine Induktion der Signalübertragung durch den gebundenen Liganden darstellen. Die „Inhibierung" liegt in jedem beliebigen dieser Tests bei zumindest etwa 60 % oder zumindest etwa 70 %, vorzugsweise zumindest etwa 75 %, noch bevorzugter zumindest etwa 80 %, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % noch bevorzugter zumindest. etwa 90 %, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % und insbesondere bei zumindest etwa 99 %.
Der Ausdruck „Verringern des Überlebens einer Zelle" bezieht sich auf die Handlung des Verringerns der Lebensdauer einer Zelle im Verhältnis zu einer unbehandelten Zelle, die weder in vitro noch in vivo gegenüber einem ErbB4-Antagonisten ausgesetzt wurde. Der Ausdruck „verringerte Zeltproliferation" bezieht sich auf eine Verringerung der Anzahl an Zellen in einer Population, die entweder in vitro oder in vivo gegenüber einem ErbB4-Antagonisten ausgesetzt wurde, im Verhältnis zu einer unbehandelten Zelle.
„Biologische Aktivität" bezieht sich bei Verwendung zusammen mit einem ErbB4-Antagonisten auf die Fähigkeit eines ErbB4-Antagonisten, die übermäßige Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen zu steuern, wie in einem relevanten In- vitro- oder In-vivo-Test bestimmt wurde, umfassend die PDGF-stimulierten Glattmuskelzellenproliferations- sowie Migrationstests menschlicher Aorta-Glattmuskelzellen, die in den Beispielen hierin unten stehend beschrieben werden, Tiermodelle und menschliche klinische Versuche, unabhängig von den ihnen zu Grunde liegenden Mechanismen. Daher umfasst die biologische Aktivität eines ErbB4-Antagonisten ohne Einschränkung das Funktionieren als Inhibitor der Bindung eines Liganden oder der Aktivierung eines nativen ErbB4-Rezeptors und/oder die Inhibierung des Wachstums und/oder der Migration von Glattmuskelzellen, die einen ErbB4-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Der Ausdruck „Krankheitszustand" bezieht sich auf einen physiologischen Zustand einer Zelle oder eines ganzen Säugetiers, bei dem es zu einer Unterbrechung, einem Stillstand oder einer Störung zellulärer oder körperlicher Funktionssysteme oder Organe gekommen ist.
Der Ausdruck „wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge eines Arzneimittels, die wirksam ist, um eine Erkrankung, Störung oder ungewollte physiologische Zustände bei einem Säugetier zu behandeln (auch umfassend die Prävention). In der vorliegenden Erfindung kann eine „wirksame Menge" eines ErbB4-Antagonisten die Proliferation von Glattmuskelzellen reduzieren, verlangsamen oder verzögern; die Migration von Glattmuskelzellen reduzieren, verlangsamen oder verzögern; die Entwicklung von Stenose oder Restenose verhindern oder inhibieren (d. h. in gewissem Ausmaß verlangsamen und vorzugsweise zu einem Stillstand bringen); und/oder in einem gewissen Ausmaß eines oder mehrere der Symptome, die mit Stenose oder Restenose assoziiert sind, lindern, insbesondere die Entwicklung von erhöhtem Blutdruck, der mit Stenose oder Restenose assoziiert ist, verhindern oder inhibieren (d. h. in gewissem Ausmaß verlangsamen und vorzugsweise zu einem Stillstand bringen).
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in ein funktionales Verhältnis mit einer anderen Nucleinsäuresequenz platziert wird. DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader ist z. B. operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids be teiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Allgemein bedeutet „operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines sekretorischen Leaders, zusammenhängend und in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an passenden Restriktionsstellen erreicht. Falls solche Stellen nicht existieren, so werden die synthetischen Oligonucleotidadapter oder -linker in Einklang mit der herkömmlichen Praxis verwendet.
„Pharmazeutisch annehmbare" Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind jene, die in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für die Zelle oder das Säugetier, das diesen gegenüber ausgesetzt wird, nichttoxisch sind. Oftmals ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, unter anderem Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, unter anderem Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. Tween, Polyethylenglykol (PEG) und Pluronics.
B. Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Behandlung von Stenose durch Antagonisten nativer ErbB4-Rezeptoren, wie in den Ansprüchen definiert. Obwohl die Erfindung dahingehend nicht eingeschränkt ist, so ist der Antagonist in einer bevorzugten Ausführungsform ein Immunoadhäsin oder ein chimäres Heteromultimeradhäsin, wie in den Ansprüchen definiert. Immunoadhäsine (als Hybrid-Immunglobuline bezeichnet), unter an derem ihre Struktur und Herstellung, werden z. B. in WO 91/08298 sowie im US-Patent Nr. 5.428.130 und 5.116.964 beschrieben.
1. Produktion eines Immunoadhäsins oder eines chimären Heteromultimeradhäsins
Die unten stehende Beschreibung betrifft hauptsächlich die Herstellung von Immunoadhäsin durch das Züchten von Zellen, die mit einem Vektor, der Immunoadhäsin-Nucleinsäure enthielt, transformiert oder transfiziert wurden. Es wird natürlich in Betracht gezogen, dass Alternativverfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, verwendet werden können, um Immunoadhäsin herzustellen. Die Immunoadhäsinsequenz oder Teile davon kann/können z. B. durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z. B. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)]. Die In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung händischer Verfahren oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Die automatisierte Synthese kann z. B. unter Verwendung eines Applied-Biosystems-Peptid-Synthesegeräts (Foster City, CA) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers erzielt werden. Es können verschiedene Abschnitte des Immunoadhäsins getrennt chemisch synthetisiert werden und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Immunoadhäsin voller Länge herzustellen.
Nucleinsäure, die für einen Nativsequenz-ErbB4-Rezeptor kodiert, kann z. B. aus Zellen isoliert werden, von denen bekannt ist, dass sie den ErbB4-Rezeptor exprimieren, wie z. B. in EP 599.274 , s. o., und in den kollektiven Verweisen von Plowman et al., s. o., beschrieben, oder sie wird synthetisiert.
DNA, die für konstante Regionen von Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerketten kodiert, ist bekannt oder aus cDNA-Bibliotheken leicht erhältlich oder sie wird synthetisiert. Siehe z. B. Adams et al., Biochemistry 19, 2711–2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19, 2702–2710 (1980); Dolby et al, P. N. A. S. USA 77, 6027–6031 (1980); Rice et al., P. N. A. S. USA 79, 7862–7865 (1982); Falkner et al., Nature 298, 268–288 (1982); sowie Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239–256 (1984).
Ein Immunoadhäsin oder ein chimäres Heteroadhäsin, wie in den Ansprüchen definiert und wie in der Erfindung verwendet, wird vorzugsweise durch Expression in einer Wirtszelle hergestellt und daraus isoliert. Eine Wirtszelle wird allgemein mit der Nucleinsäure der Erfindung transformiert. Die Nucleinsäure wird vorzugsweise in einen Expressionsvektor inkorporiert. Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder zur Expression der Vektoren hierin sind prokaryotische Wirtszellen (wie z. B. E. coli, Stämme von Bacillus, Pseudomonas und anderen Bakterien), Hefe und andere eukaryotische Mikroben sowie höhere eukaryotische Zellen (wie z. B. Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen und andere Säugetierzellen). Die Zellen können auch in lebenden Tieren vorhanden sein (z. B. in Kühen, Ziegen oder Schafen). Insektenzellen können ebenfalls verwendet werden. Klonierungs- und Expressionsverfahren sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
Um die Expression eines Immunoadhäsins, wie z. B. eines chimären ErbB4-IgG-Moleküls zu erhalten, wird/werden ein oder mehrere Expressionsvektor(en) durch Transformation oder Transfektion in Wirtszellen eingeführt, und die resultierenden rekombinanten Wirtszellen werden in herkömmlichem Nährstoffmedium gezüchtet, soweit erforderlich zur Induktion von Promotoren, zur Selektion rekombinanter Zellen oder zur Amplifikation der ErbB4-IgG-DNA modifiziert. Allgemein sind Grundsätze, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von In-vitro-Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), zu finden.
(i) Konstruktion von Nucleinsäure, die für Immunoadhäsin kodiert
Bei der Herstellung der Immunoadhäsine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird vorzugsweise Nucleinsäure, die für eine extrazelluläre Domäne eines natürlichen Rezeptors kodiert, C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer konstanten Immunglobulin-Domänensequenz kodiert, es sind je doch auch N-terminale Fusionen möglich. Typischerweise behält das kodierte chimäre Polypeptid in solchen Fusionen zumindest funktional aktive Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen werden auch an den C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne gemacht oder unmittelbar N-terminal zur CH1 der Schwerkette oder der korrespondierenden Region der Leichtkette. Das resultierende DNA-Fusionskonstrukt wird in geeigneten Wirtszellen exprimiert.
Nucleinsäuremoleküle, die für Aminosäuresequenzvarianten von extrazellulären Nativsequenzdomänen (wie z. B. von ErbB4) und/oder die zur Herstellung des gewünschten Immunoadhäsins verwendeten Antikörpersequenzen kodieren, werden durch eine Reihe von Verfahren hergestellt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Isolation aus einer natürlichen Quelle (im Fall von natürlich auftretenden Aminosäuresequenzvarianten, wie z. B. jenen, die oben stehend in Zusammenhang mit ErbB4 erwähnt wurden) oder die Herstellung durch oligonucleotidvermittelte (oder ortsspezifische) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer zuvor hergestellten Variante oder einer Nicht-Varianten-Version von Nativsequenz-ErbB4.
Aminosäuresequenzvarianten einer nativen Sequenz der extrazellulären Domäne, die in dem chimären Heteroadhäsin inkludiert sind, werden durch Einführen geeigneter Nucleotidveränderungen in die native Sequenz der extrazellulären Domänen-DNA oder durch In-vitro-Synthese des gewünschten chimären Heteroadhäsin-Monomer-Polypeptids hergestellt. Solche Varianten umfassen z. B. Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Resten in der Aminosäuresequenz des Immunoadhäsins oder des chimären Heteroadhäsins.
Variationen in der Nativsequenz, wie oben stehend beschrieben, können unter Verwendung eines/einer beliebigen der Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die in Tabelle 1 dargelegt sind, erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nucleinsäure für ein chimäres Molekül, in dem die extrazelluläre ErbB4-Rezeptor-Domänensequenz an den N-Terminus des C-terminalen Abschnitts eines Antikörpers (insbesondere die Fc-Domäne) fusioniert ist, enthaltend die Effektorfunktionen eines Immungloblins, z. B. IgG1. Es ist möglich, die gesamte konstante Schwerketten-Region an die extrazelluläre ErbB4-Rezeptor-Domänensequenz zu fusionieren. Es wird jedoch stärker bevorzugt, wenn eine Sequenz, die in der Gelenkregion genau stromauf der Papain-Spaltstelle beginnt (die IgG-Fc chemisch definiert; Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Schwerkettenregion mit 114 angenommen wird [Kobet et al., s. o.], oder analoge Stellen anderer Immunglobuline), in der Fusion verwendet wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die extrazelluläre ErbB4-Rezeptor-Domänensequenz an die Gelenkregion und CH2- und CH3- oder CH1-, Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG1-, IgG2- oder IgG3-Schwerkette fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist nicht entscheidend, und die optimale Stelle kann durch Routineexperimente bestimmt werden.
Bei menschlichen Immunoadhäsinen wird die Verwendung von menschlichen IgG1- und IgG3-Immunglobulin-Sequenzen bevorzugt. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG1 ist, dass IgG1-Immunoadhäsine wirksam auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert eine Reinigung von IgG3 Protein G, ein Medium mit signifikant geringerer Vielseitigkeit. Andere Struktur- und funktionale Eigenschaften von Immunglobulinen sollten jedoch bei der Auswahl des Ig-Fusionspartners für eine bestimmte Immunoadhäsinkonstruktion in Betracht gezogen werden. Das IgG3-Gelenk ist z. B. länger und flexibler, so dass es größere „Adhäsin"-Domänen beherbergen kann, die bei Fusion an IgG1 sich gegebenenfalls nicht korrekt falten oder nicht korrekt funktionieren. Eine weitere Überlegung kann die Valenz betreffen; IgG-Immunoadhäsine sind zweiwertige Homodimere, wohingegen IgG-Subtypen wie IgA und IgM zu dimeren bzw. pentameren Strukturen der grundlegenden Ig-Homodimer-Einheit führen können.
Für ErbB4-Ig-Immunoadhäsine, die zur In-vivo-Anwendung kreiert wurden, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die in der Fc- Region spezifiziert werden, von Bedeutung. Obwohl IgG1, IgG2 und IgG4 alle eine In-vivo-Halbwertszeit von 21 Tagen besitzen, so unterscheiden sich ihre relativen Leistungsfähigkeiten bezüglich der Aktivierung des Komplementsystems voneinander. IgG4 aktiviert kein Komplement, und IgG2 ist signifikant schwächer bezüglich der Komplementaktivierung als IgG1. Weiters bindet IgG2 im Gegensatz zu IgG1 nicht an Fc-Rezeptoren auf mononuclearen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG3 für die Komplementaktivierung optimal Ist, liegt seine In-vivo-Halbwertszeit bei etwa einem Drittel der anderen IgG-Isotypen.
Eine weitere wichtige Überlegung für Immunoadhäsine, die zur Verwendung als menschliche Therapeutika kreiert wurden, ist die Anzahl allotypischer Varianten des bestimmten Isotyps. Allgemein werden IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. IgG1 besitzt z. B. nur vier serologisch definierte allotypische Stellen, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region positioniert sind; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht immunogen. Im Gegensatz dazu gibt es 12 serologisch definierte Allotypen in IgG3, von denen sich alle in der Fc-Region befinden; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) besitzen einen Allotyp, der nicht immunogen ist. Daher ist die potentielle Immunogenität eines IgG3-Immunoadhäsins größer als die eines IgG1-Immunoadhäsins.
Die cDNAs, die für die ErbB4-Rezeptorsequenz (z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz) kodieren, und die Ig-Teile des Immunoadhäsins werden im Tandem in einen Plasmidvektor insertiert, der die wirksame Expression in den ausgewählten Wirtszellen steuert. Zur Expression in Säugetierzellen können z. B. pRK5-basierte Vektoren [Schall et al., Cell 61, 361–370 (1990)] und CDM8-basierte Vektoren [Seed, Nature 329, 840 (1989)] verwendet werden. Die genaue Verbindungsstelle kann unter Verwendung oligonucleotidgesteuerter Deletionsmutagenese durch Entfernung der zusätzlichen Sequenzen zwischen den benannten Verbindungsstellen-Codons kreiert werden [Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989)]. Synthetische Oligonucleotide können verwendet werden, in denen jede Hälfte komplementär zu der Sequenz auf beiden Seiten der gewünschten Verbindungsstelle ist; Idealerweise handelt es sich dabei um 36- bis 48- mere. Alternativ dazu können PCR-Verfahren verwendet werden, um die zwei Teile des Moleküls im Rahmen mit einem geeigneten Vektor zu verbinden.
Obwohl die Gegenwart einer Immungloblin-Leichtkette in den Immunoadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, so kann eine Immungloblin-Leichtkette entweder in kovalenter Assoziierung mit einem trk-Rezeptorimmunglobulin-Schwerkettenfusionspolypeptid vorhanden sein oder direkt an die extrazelluläre trk-Rezeptor-Domäne fusioniert sein. In ersterem Fall wird DNA, die für eine Immunglobulin-Leichtkette kodiert, typischerweise mit der DNA co-exprimiert, die für das ErbB4-Rezeptorimmunglobulin-Schwerkettenfusionsprotein kodiert. Nach der Sekretion sind die Hybrid-Schwerkette und die Leichtkette kovalent assoziiert, um eine immunglobulinartige Struktur bereitzustellen, die zwei disulfidgebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Ein Verfahren, das für die Herstellung solcher Strukturen geeignet ist, wird z. B. in der US-Patentanmeldung Nr. 4.816.567 , ausgegeben am 28. März 1989, offenbart.
Ein weiterer bevorzugter Typ eines chimären ErbB4-Antagonisten hierin ist ein Fusionsprotein, das eine extrazelluläre Domäne, wie z. B. aus einem ErbB4-Monomer, umfasst, gebunden an ein heterologes Polypeptid, wie z. B. eine Multimerisationsdomäne. Solch eine Sequenz kann unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren konstruiert werden. Alternativ dazu kann das heterologe Polypeptid durch Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z. B. die Verwendung der heterobifunktionalen Vernetzungsreagenzien, kovalent an das extrazelluläre Domänen-Polypeptid gebunden werden. Beispiele für Kupplungsmittel umfassen N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionale Derivate von Imidoestern (wie z. B. Dimethyladipimidat-HCL), aktive Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie z. B. Glutaraldehyd), Bis-Azido-Verbindungen (wie z. B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivate (wie z. B. Bis(p-diazoniumbenozyl)ethylendiamin), Diisocyanate (wie z. B. Tolyen-2,6-diisocyanat) sowie bis-aktive Fluor-Verbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol).
In einer Ausführungsform umfasst ein chimäres Heteroadhäsin-Polypeptid eine Fusion eines Monomers des chimären Heteroadhäsins mit einem Markierungs-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Solche epitopmarkierten Formen des chimären Heteroadhäsins sind von Nutzen, da ihre Gegenwart unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid detektiert werden kann. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht ebenfalls eine leichte Reinigung des chimären Heteroadhäsins durch Affinitätsreinigung unter Verwendung des Anti-Markierungs-Antikörpers. Markierungs-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele umfassen das Grippe-HA-Markierungs-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dafür (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5 (12), 3610–3616 (1985)); sowie die Herpes-Simplex-Virus-Glycoprotein-D-(gD-)Markierung und deren Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)).
Eine andere Art kovalenter Modifikation eines chimären Heteromultimers umfasst die Bindung eines Monomer-Polypeptids des Heteromultimers an eines einer Reihe nicht-proteinhältiger Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyoxyalkylene, oder Copolymere von Polyethylenglykol und Polypropylenglykol. Ein chimäres Heteromultimer kann auch in Mikrokapseln, die z. B. durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflchenpolymerisation hergestellt werden (z. B. Hydroxymethylzellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacylat)-Mikrokapseln), in kolloidalen Arzneimittelanlieferungssystemen (z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokugeln, Mikroemulsionen, Nano-Partikel und Nano-Kapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Solche Verfahren werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Oslo (Hrsg.) (1980), offenbart.
(ii) Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit hierin beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren für die Immunoadhäsinproduktion transfiziert oder transformiert und in herkömmli chem Nährstoffmedium gezüchtet, das soweit erforderlich zur Induktion von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können vom Fachmann ohne übermäßige Versuche ausgewählt werden. Allgemein sind Grundlagen, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und Sambrook et al., s. o., zu finden.
Die Ausdrücke „Transformation" und „Transfektion" werden hierin synonym verwendet und beziehen sich auf das Verfahren der Einführung von DNA in eine Zelle. Nach der Transformation oder Transfektion kann sich die Nucleinsäure der Erfindung in das Wirtszellengenom integrieren oder sie kann als ein extrachromosomales Element existieren. Verfahren eukaryotischer Zelltransfektion und prokaryotischer Zelltransformation sind dem Fachmann bekannt, z. B. CaCl₂-, CaPO₄-Verfahren, liposomvermittelt sowie Elektroporation. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die sich für diese Zellen eignen. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, oder die Elektroporation wird allgemein für Prokaryoten verwendet. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transfektion gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), sowie in WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben. Bei Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Verfahren der Calciumphosphatpräzipitation von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen wurden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise entsprechend dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen verwendet werden, wie z. B. durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe z. B. Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), sowie Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryoten-Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, wie z. B. gramnegative oder grampositive Organismen, z. B. Enterobacteriaceae, wie z. B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z. B. der E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E.-coli-X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae, wie z. B. Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteaus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Stammwirt, da es sich dabei um einen häufig anzutreffenden Wirtsstamm für die rekombinante DNA-Produktfermentation handelt. Die Wirtszelle sekretiert minimale Mengen proteolytischer Enzyme. Stamm W3110 kann z. B. modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen durchzuführen, die für für den Wirt endogene Proteine kodieren, wobei Beispiele solcher Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; den E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; den E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; den E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r aufweist; den E.-coli-W3110-Stamm 40B4, wobei es sich um den Stamm 37D6 mit einer nicht-Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation handelt; sowie einen E.-coli-Stamm mit einer periplasmatischen Mutantenprotease, die im US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990, offenbart ist, umfassen. Alternativ dazu sind In-vitro-Verfahren des Klonierens, z. B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerase-Reaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren, die für Immunoadhäsine kodieren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter niederer eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 [1981]; EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991), wie z. B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2), 737–1742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 [1998]); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 [1979]); Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); sowie Fadenpilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991), sowie Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 [1983]; Tilburn et al., Gene 26, 205–221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 [1984]) sowie A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 [1985]). Methylotrophe Hefearten sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hefe, die zu Wachstum auf Methanol in der Lage ist und aus den Genera ausgewählt wurde, die aus Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula bestehen. Eine Liste spezifischer Spezies, die als Beispiel für diese Klasse an Hefearten dienen, sind in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem Immunoadhäsin stammen von multizellulären Organismen. Beispiele für Zellen von wirbellosen Organismen umfassen Insektenzellen, wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele nützlicher Säugetier-Wirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Spezifische Beispiele umfassen die Affennieren-Linie CV1, die durch SV40 transformiert wurde (COS-7, ATCC CRL1651); die menschliche Embryonal-Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, die zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungen-Zellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); sowie Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Auswahl der geeigneten Wirtszellen wird als nach dem Stand der Technik durchführbar angesehen.
Allgemein hängt die Auswahl einer Säugetier-Wirtszellenlinie zur Expression von ErbB4-Ig-Immunoadhäsinen hauptsächlich vom Expressionsvektor ab (siehe unten). Eine weitere Überlegung ist die erforderliche Proteinmenge. Oftmals können Mengen im Milligramm-Bereich durch vorübergehende Transfektionen hergestellt werden. Die adenovirus-EIA-transformierte menschliche 293-Embryonal-Nierenzelllinie kann z. B. vorübergehend mit pRK5-basierten Vektoren durch eine Modifikation des Calciumphosphatverfahrens transfiziert werden, um eine wirksame Immunoadhäsinexpression zu ermöglichen. CDM8-basierte Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextranverfahren zu transfizieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347-353 (1990)). Falls größere Proteinmengen gewünscht werden, so kann das Immunoadhäsin nach einer stabilen Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Beispielsweise kann ein pRK5-basierter Vektor in Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen in Gegenwart eines zusätzlichen Plasmids, das für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert und Resistenz gegen G418 verleiht, eingeführt werden. Klone, die gegen G418 resistent sind, können in Kultur selektiert werden; diese Klone werden in Gegenwart zunehmender Mengen an DHFR-Inhibitor Methotrexat wachsen gelassen; es werden Klone selektiert, in denen die Anzahl an Genkopien, die für die DHFR- und die Immunoadhäsin-Sequenzen kodieren, co-amplifiziert ist. Falls das Immunoadhäsin eine hydrophobe Leader-Sequenz an seinem N-Terminus enthält, so wird es wahrscheinlich weiterverarbeitet und von den transfizierten Zellen sekretiert. Die Expression von Immunoadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann nur einmal vorhandene, geeignete Wirtszellen erfordern; z. B. Komponenten, wie z. B. die Leichtkette oder J-Kette, kön nen von gewissen Myelom- oder Hybridom-Zeltwirten bereitgestellt werden [Gascoigne et al., s. o. (1987); Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)].
(iii) Selektion und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure, die für ein Immunoadhäsin kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einem replizierbaren Vektor insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren öffentlich erhältlich. Der Vektor kann z. B. die Form eines Plasmids, eines Cosmids, eines viralen Partikels oder eines Phagen aufweisen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine Reihe an Verfahren in den Vektor insertiert werden. Allgemein wird DNA unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, in (eine) geeignete Restriktions-Endonuclease-Stelle(n) insertiert. Vektorkomponenten umfassen allgemein, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere einer Signalsequenz, eines Replikationsstartpunkts, eines oder mehrerer Markergene, eines Enhancerelements, eines Promotors sowie einer Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, verwendet Standardligationsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Das Immunoadhäsin kann rekombinant nicht nur direkt hergestellt werden, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Allgemein kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der für das Immunoadhäsin kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die z. B. aus der Gruppe der alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader ausgewählt ist. Für die Hefesekretion kann es sich bei der Signalsequenz z. B. um den Hefe-Invertase-Leader, den α-Faktor-Leader (umfassend Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder den saure-Phosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamy lase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder um das in WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal handeln. Bei der Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, etwa Signalsequenzen sekretierter Polypeptide derselben oder verwandter Spezies, sowie virale sekretorische Leader.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Reihe an Bakterien, Hefearten und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Ursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen von Nutzen.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, wie z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetrazyklin, verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen ergänzen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z. B. das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodierende Gen.
Ein Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifikation von Zellen ermöglichen, die kompetent sind, um die immunoadhäsinkodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle bei Verwendung von Wildtyp-DHFR ist die CHO-Zelllinie, die bezüglich der DHFR-Aktivität defizient ist, hergestellt und vermehrt, wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefe-Plasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe bereit, dem die Fähigkeit, in Tryp tophan zu wachsen, fehlt, wie z. B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor, der operabel an die immunoadhäsinkodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Reihe potentieller Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] sowie Hybrid-Promotoren, wie z. B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die DNA, die für das Immunoadhäsin kodiert, gebunden ist.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefe-Wirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefe-Promotoren, bei denen es sich um induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil einer Transkription handelt, die durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit Stickstoffstoffwechsel assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefe-Expression werden weiters in EP 73.567 beschrieben.
Die Transkription von Immunoadhäsin aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird z. B. durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, wie z. B. dem Polyoma-Virus, dem Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), dem Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), dem Rinder-Papillomavirus, aus Retrovirus (wie z. B. Vogelsarkomvirus), dem Cytomegalievirus, dem Hepatitis-B-Virus und dem Simian-Virus 40 (SV40), erhalten werden; aus heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, oder aus Hitzeschock-Promotoren, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Die Transkription einer DNA, die für das Immunoadhäsin kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch das Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, normalerweise von 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Es sind nun viele Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zeltvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts (um 100–270), den frühen Cytomegalievirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts sowie Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur für das Immunoadhäsin kodierenden Sequenz gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder kernhältige Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die für die Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind leicht aus den 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im nicht-translatierten Abschnitt der mRNA, die für Immunoadhäsin kodiert, transkribiert werden.
Wieder andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Adaptierung an die Synthese von Immunoadhäsin in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46(1979); und EP 117.058 beschrieben.
(iv) Reinigung von Immunoadhäsin
Ein Immunoadhäsin oder ein chimäres Heteroadhäsin wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als ein sekretiertes Polypeptid gewonnen, obwohl es auch aus Wirtszell-Lysaten gewonnen werden kann. Als ein erster Schritt werden die Partikeltrümmer, entweder Wirtszellen oder lysierte Fragmente, entfernt, z. B. durch Zentrifugierung oder Ultrafiltration; gegebenenfalls kann das Protein mit einem im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilter konzentriert werden, gefolgt von einer Trennung des chimären Heteroadhäsins von anderen Unreinheiten durch ein oder mehrere Reinigungsverfahren, die aus Folgendem ausgewählt wurden: Fraktionierung auf einer Immunoaffinitätssäule; Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule; Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silica; Chromatographie auf Heparin-Sepharose; Chromatographie auf einem Kationenaustauschharz; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; sowie Gel-Filtration.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Reinigung von Immunoadhäsinen ist die Affinitätschromatographie. Die Auswahl des Affinitätsliganden hängt von der Spezies und dem Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die/der in der Chimäre verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunoadhäsine zu reinigen, die auf menschlichen IgG1-, IgG2- oder IgG4-Schwerketten basieren [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)]. Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches IgG3 empfohlen [Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)]. Die Matrize, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist in den meisten Fällen Agarose, es sind jedoch auch andere Matrizen erhältlich. Mechanisch stabile Matrizen, wie z. B. Glas mit definierter Porengröße oder Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen schnellere Durchflussgeschwindigkeiten und kürzere Verarbeitungszeiten als sie mit Agarose erhalten werden können. Die Bedingungen für die Bindung eines Immunoadhäsins an die Protein-A- oder -G-Affinitätssäule werden voll und ganz durch die Eigenschaften der Fc-Domäne bestimmt; d. h. durch ihre Spezies und ihren Isotyp. Allgemein tritt eine wirksame Bindung bei der Auswahl des korrekten Liganden direkt aus nicht-konditionierter Kulturflüssigkeit ein. Ein unterscheidendes Merkmal von Immunoadhäsinen ist, dass bei menschlichen IgG1-Molekülen die Bindungskapazität für Protein A im Verhältnis zu einem Antikörper desselben Fc-Typus etwas verringert ist. Gebundenes Immunoadhäsin kann entweder bei einem sauren pH (bei oder über 3,0) oder in einem neutralen pH-Puffer, enthaltend ein leicht chaotropes Salz, wirksam eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann zu einem Immunoadhäsinpräparat führen, das > 95 % rein ist.
Andere Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, können anstelle von oder zusätzlich zu einer Affinitätschromatographie auf Protein A oder G verwendet werden, um Immunoadhäsine zu reinigen. Immunoadhäsine verhalten sich ähnlich wie Antikörper in thiophiler Gelchromatographie [Hutchens und Porath, Anal. Biochem. 159, 117–226 (1986)] und immobilisierter Metallchelatchromatographie [Al-Mashikhi und Makai, J. Dairy Sci. 71, 1756–1763 (1988)]. Im Gegensatz zu Antikörpern wird ihr Verhalten auf Ionenaustauschsäulen jedoch nicht nur durch ihre isoelektrischen Punkte bestimmt, sondern auch durch einen Ladungsdipol, der in den Molekülen aufgrund ihrer chimären Struktur existieren kann.
Die Herstellung von epitopmarkiertem Immunoadhäsin, wie z. B. ErbB4-IgG, erleichtert die Reinigung unter Verwendung einer Immunoaffinitätssäule, die einen Antikörper gegen das Epitop enthält, um das Fusionspolypeptid zu adsorbieren. Immunoaffinitätssäulen, wie z. B. eine polyklonale Kaninchen-Anti-ErbB4-Säule, kann verwendet werden, um das ErbB4-IgG zu absorbieren, indem es an ein ErbB4-Immunepitop gebunden wird.
In manchen Ausführungsformen werden die ErbB4-Rezeptor-Immunglobulin-Chimären (Immunoadhäsine) als Monomere oder Hetero- oder Homo-Multimere angeordnet, insbesondere als Dimere oder Tetramere, und zwar im Wesentlichen, wie in WO 91/08298 veranschaulicht. Allgemein besitzen diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen. Eine grundlegende Vierketten-Struktur-Einheit ist jene Form, in der IgG, IgD und IgE vorliegen. Eine Vier-Einheit-Struktur wird in Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt; IgM existiert allgemein als ein Pentamer vier grundlegender Einheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin, und gelegentlich IgG-Globulin, können auch in multimerer Form in Serum existieren. Im Fall von Multimer kann jede Vierer-Einheit dieselbe oder eine andere sein.
Wie zuvor festgestellt können die Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung bispezifisch hergestellt werden, und sie können z. B. Bindungsregionen aus zwei verschiedenen ErbB-Rezeptoren umfassen, von denen zumindest einer ErbB4 ist. Daher können die Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung Bindungsspezifitäten für zwei verschiedene ErbB-Liganden aufweisen. Für bispezifische Moleküle sind trimere Moleküle, bestehend aus einer chimären Antikörper-Schwerkette in einem Arm und einem chimären Antikörper-Schwerketten-Leichtketten-Paar im anderen Arm der antikörperartigen Struktur, aufgrund einer leichten Reinigung von Vorteil. Im Gegensatz zu antikörperherstellenden Quadromen, die traditionellerweise für die Produktion bispezifischer Immunoadhäsine verwendet werden, die ein Gemisch aus zehn Tetrameren produzieren, erzeugen Zellen, die mit Nucleinsäure transfiziert sind, die für die drei Ketten einer trimeren Immunoadhäsinstruktur kodiert, ein Gemisch von nur drei Molekülen, und die Reinigung des gewünschten Produkts aus diesem Gemisch ist entsprechend einfacher.
(v) Charakterisierung von Immunoadhäsin
Allgemein besitzen die chimären ErbB4-Heteromultimere der Erfindung eine oder mehrere beliebige der folgenden Eigenschaften: (a) die Fähigkeit, mit einem natürlichen heteromultimeren Rezeptor um die Bindung an einen Liganden, wie z. B. HB-EGF, zu konkurrieren; (b) die Fähigkeit, ErbB2-IgG/ErbB4-IgG-Komplexe zu bilden; sowie (c) die Fähigkeit, die Aktivierung eines natürlichen heteromultimeren Rezeptors durch Abbau von Ligand aus der Umgebung des natürlichen Rezeptors zu inhi bieren, wodurch die Proliferation von Zellen, die den ErbB2- und den ErbB4-Rezeptor exprimieren, inhibiert wird.
Um auf Eigenschaft (a) zu screenen, kann die Fähigkeit des chimären ErbB4-Heteromultimer-Adhäsins, an einen Liganden zu binden, leicht in vitro bestimmt werden. Immunoadhäsin-Formen dieser Rezeptoren können z. B. erzeugt werden, und das ErbB2/4-Ig-Heteroimmunoadhäsin kann auf einer Festphase immobilisiert werden (z. B. auf Testplatten, die mit Ziegen-Anti-Mensch-Antikörper beschichtet sind). Die Fähigkeit eines Liganden, an das immobilisierte Immunoadhäsin zu binden, kann anschließend bestimmt werden. Für mehr Details siehe den ¹²⁵I-HRG-Bindungstest, der im unten stehenden Beispiel beschrieben wurde.
Bezüglich Eigenschaft (c) stellt der Tyrosinphosphorylierungstest, der MCF7-Zellen verwendet, ein Mittel zum Screening zur Aktivierung von ErbB4-Rezeptoren bereit. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann der KIRA-ELISA, der in WO 95/14930 beschrieben wird, verwendet werden, um die Fähigkeit eines chimären HER4-Heteroadhäsins, die Aktivierung eines HER4-Rezeptors zu inhibieren, qualitativ und quantitativ zu messen.
Die Fähigkeit eines Immunoadhäsins, eines chimären Heteroadhäsins, wie z. B. ErbB2/4-Ig, oder ein anderes Moleküls der vorliegenden Erfindung, die Proliferation einer Zelle zu inhibieren, die den ErbB2- und den ErbB4-Rezeptor exprimiert, wird durch Standardverfahren in einer Zellkultur leicht bestimmt. Nützliche Zellen für dieses Experiment umfassen MCF7- und SK-BR-3-Zellen, die aus ATCC- und Schwann-Zellen erhältlich sind (siehe z. B. Li et al., J. Neuroscience 16 (6), 2012–2019 (1996)). Diese Tumorzelllinien können in Zellkulturplatten ausplattiert werden, und es kann ihnen ermöglicht werden, sich daran anzuhaften. Der HRG-Ligand wird in Gegenwart und Abwesenheit eines potentiellen ErbB4-Antagonisten, wie z. B. eines chimären ErbB4-Heteroadhäsins, hinzugefügt. Monoschichten werden gewaschen und mit Kristallviolett gefärbt/fixiert, und die Inhibierung des Zellwachstums wird quantifiziert.
2. Antikörper-Herstellung
Eine weitere bevorzugte Klasse von ErbB4-Antagonisten umfasst neutralisierende Antikörper für diesen Rezeptor.
(i) Polyklonale Antikörper
Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier gezüchtet werden, z. B. durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls gewünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Es kann von Nutzen sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das bekanntermaßen in dem immunisierten Säugetier immunogen ist, wie z. B. Serumalbumin oder Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Beispiele für Adjuvantien, die verwendet werden können, umfassen vollständiges Freund-Adjuvans und MPL-TDM.
(ii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper können unter Verwendung des zuerst von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahrens herstellt werden oder unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden ( US-Patent Nr. 4.816.567 ).
Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z. B. ein Hamster oder ein Makake, wie hierin oben stehend beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden anschließend mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridom zelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden beimpft und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht-fusionierten Stamm-Myelomzellen inhibiert. Falls den Stamm-Myelomzellen z. B. das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), da diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen vermeiden.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirksam fusionieren, eine stabile, hochgradige Antikörper-Produktion durch die ausgewählten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium, wie z. B. HAT-Medium, empfindlich sind. Unter diesen sind bevorzugte Myelom-Zelllinien murine Myelom-Linien, wie z. B. jene, die von MOP-21- und MC.-11-Maus-Tumoren stammen, die beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, sowie SP-2- oder X63-Ag8-653-Zellen, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien wurden ebenfalls für die Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)).
Kulturmedium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf die Produktion monoklonaler Antikörper getestet, die gegen das Antigen gerichtet sind. Die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die von Hybridomzellen produziert wird, wird vorzugsweise durch Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. einen Radioimmuntest (RIA) oder einen enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmungstest (ELISA), bestimmt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z. B. durch die Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert werden, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Zellen durch Grenzwert-Verdünnungsverfahren subkloniert werden und durch Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z. B. DMEM oder RPMI-1640-Medium. Zusätzlich dazu können die Hybridomzellen in vivo als Ascites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden geeigneterweise vom Kulturmedium, der Ascites-Flüssigkeit oder dem Serum durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, getrennt.
DNA, die für die monoklonalen Antikörper kodiert, wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert (z. B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten der monoklonalen Antikörper kodieren). Die Hybridomzellen dienen als eine bevorzugte Quelle solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die anschließend in Wirtszellen, wie z. B. E.-coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulin-Protein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die DNA kann auch modifiziert werden, z. B. durch Ersetzen der kodierenden Sequenz für konstante menschliche Schwer- und Leichtketten-Domänen anstelle der homologen murinen Sequenzen, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984), oder durch kovalente Bindung der gesamten oder eines Teils der für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kodierenden Sequenz an die kodierende Immunglobulin-Sequenz. Auf diese Art und Weise werden „chimäre" oder „Hybrid"-Antikörper herge stellt, welche die Bindungsspezifität eines hierin enthaltenen monoklonalen Anti-ErbB4-Rezeptor-Antikörpers besitzen.
Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung durch solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide ersetzt, oder die variablen Domänen einer antigenkombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung werden durch die Nicht-Immunglobulin-Polypeptide ersetzt, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu schaffen, der eine antigenkombinierenden Stelle mit einer Spezifität für einen ErbB4-Rezeptor sowie eine andere antigenkombinierende Stelle mit einer Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder Hybrid-Antikörper können auch in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden, unter anderem jener, die Vernetzungsmittel umfassen. Immunotoxine können z. B. unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung hergestellt werden. Beispiele geeigneter Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Die rekombinante Produktion von Antikörpern wird unten stehend ausführlicher beschrieben.
(iii) Humanisierte Antikörper
Allgemein besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste, die in ihn aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oftmals als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne stammen. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durchgeführt werden, indem die korrespondierenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen substituiert werden.
Dementsprechend sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, s. o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert wurden.
Es ist wichtig, dass die Antikörper unter Beibehaltung einer hohen Affinität für das Antigen und anderer biologisch vorteilhafter Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren durch ein Analyseverfahren der Stammsequenzen und verschiedener konzeptueller, humanisierter Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der Stamm- und der humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind leicht erhältlich und sind dem Fachmann bekannt. Es sind Computerprogramme erhältlich, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und zeigen. Eine Inspektion dieser Darstellungen ermöglicht eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d. h. die Analyse der Reste, welche die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins, sein Antigen zu binden, beeinflussen. Auf diese Art und Weise können FR-Reste ausgewählt werden und aus der Konsensus- und Import-Sequenz kombiniert werden, so dass die gewünschte Antikörper-Eigenschaft, wie z. B. eine erhöhte Affinität für das/die Target-Antigen(e), erzielt wird. Allgemein sind die CDR-Reste direkt und in besonders hohem Ausmaß in die Beeinflussung der Antigenbindung involviert. Für weitere Details siehe US-Patent Nr. 5.821.337 .
(iv) Menschliche Antikörper
Menschliche monoklonale Antikörper können durch das Hybridomverfahren hergestellt werden. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien für die Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper wurden z. B. von Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), und Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), beschrieben.
Es ist nun möglich, transgene Tiere (z. B. Mäuse) zu produzieren, die nach der Immunisierung in der Lage sind, bei Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion ein Repertoire menschlicher Antikörper zu erzeugen. Es wurde z. B. beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Bindungsregion-(J_H-)Gens in chimären und Keimbahn-Mutanten-Mäusen zur vollständigen Inhibierung endogener Antikörperproduktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solche Keimbahn-Mutanten-Mäuse führt nach einer Antigen-Exposition zu der Produktion menschlicher Antikörper. Siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
Mendez et al., Nature Genetics 15, 146–156 (1997), haben das Verfahren weiter verbessert und eine Linie transgener Mäuse erzeugt, die als „Xenomaus II" bezeichnet wird, die, bei Exposition gegenüber einem Antigen, vollständig menschliche Antikörper mit hoher Affinität erzeugt. Dies wurde durch Keimbahn-Integration menschlicher Megabasen-Schwerketten- und -Leichtketten-Loci in Mäuse mit Deletion im endogenen J_H-Segment, wie oben stehend beschrieben, erreicht. Die Xenomaus II enthält 1.020 kb menschlichen Schwerketten-Locus, enthaltend etwa 66 V_H-Gene, vollständige D_H- und J_H-Regionen sowie drei verschiedene konstante Regionen (μ, δ und χ) und enthält auch 800 kb menschlichen κ-Locus, enthaltend 32 Vκ-Gene, Jκ-Segmente und Cκ-Gene. Die in diesen Mäusen produzierten Antikörper weisen in jeder Hinsicht eine starke Ähnlichkeit mit jenen auf, die bei Menschen anzutreffen sind, unter anderem betreffend die Gen-Neuanordnung, die Assemblierung und das Repertoire. Die menschlichen Antikörper werden vorzugsweise gegenüber endogenen Antikörpern exprimiert, und zwar aufgrund der Deletion im endogenen J_H-Segment, das die Gen-Neuanordnung in dem murinen Locus verhindert.
Alternativ dazu kann das Phagen-Display-Verfahren (McCafferty et al., Nature 348, 552–553 (1990)) zur In-vitro-Produktion menschlicher Antikörper und Antikörper-Fragmente aus variablen (V) Immunglobulin-Domänen-Genrepertoires von nicht immunisierten Spendern verwendet werden. Gemäß diesem Verfahren werden Antikörper-V-Domänen-Gene im Raster in entweder ein Haupt- oder ein Neben-Hüllprotein-Gen eines filamentösen Bakteriophagen, wie z. B. M13 oder fd, kloniert und als funktionale Antikörper-Fragmente auf der Oberfläche des Phagenpartikels dargestellt. Da das filamentöse Partikel eine einzelsträngige DNA-Kopie des Phagengenoms enthält, führen Selektionen, die auf den funktionalen Eigenschaften des Antikörpers basieren, auch zu einer Selektion des Gens, das für den Antikörper kodiert, der diese Eigenschaften aufweist. Daher imitiert der Phage manche der Eigenschaften der B-Zelle. Eine Phagen-Darstellung kann in einer Reihe von Formaten durchgeführt werden; für ihre Beschreibung siehe z. B. Johnson, Kevin S., und Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564–571 (1993). Es können mehrere Quellen an V-Gen-Segmenten für die Phagen-Darstellung verwendet werden. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), isolierten eine unterschiedliche Anordnung an Anti-Oxazolon-Antikörpern aus einer kleinen kombinatorischen Zufallsbibliothek an V-Genen, die aus der Milz von immunisierten Mäusen stammten. Ein Repertoire an V-Genen von nicht immunisierten menschlichen Spendern kann konstruiert werden, und es können Antikörper gegen eine unterschiedliche Anordnung an Antigenen (unter anderem Selbst-Antigene) im Wesentlichen nach den von Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), oder Griffiths et al., EMBO J. 12, 725–734 (1993), beschriebenen Verfahren isoliert werden. In einer natürlichen Immunantwort akkumulieren Antikörper-Gene Mutationen in einem hohen Ausmaß (somatische Hypermutation). Manche der eingeführten Veränderungen verleihen eine höhere Affinität, und B-Zellen mit einem Oberflächen-Immunglobulin mit hoher Affinität werden vorzugsweise repliziert und während des darauf folgenden Antigen-Immunitätstests differenziert. Dieser natürliche Vorgang kann durch Verwendung des als „Ketten-Shuffling" bekannten Verfahrens imitiert werden (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779–783 (1992)). In diesem Verfahren kann die Affinität „primärer" menschlicher Antikörper, die durch Phagen-Display erhalten wurde, durch sequentielles Ersetzen der Schwer- und Leichtketten-V-Region-Gene mit Repertoires natür lich vorkommender Varianten (Repertoires) von V-Domänen-Genen verbessert werden, die von nicht immunisierten Spendern erhalten wurden. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung von Antikörpern und Antikörper-Fragmenten mit Affinitäten im nM-Bereich. Eine Strategie zur Herstellung sehr großer Phagen-Antikörper-Repertoires (auch bekannt als „die Mutter aller Bibliotheken") wurde von Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993), beschrieben, und die Isolation eines menschlichen Antikörpers hoher Affinität direkt aus einer solchen großen Phagenbibliothek wird von Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245–3260 (1994), beschrieben. Gen-Shuffling kann auch verwendet werden, um menschliche Antikörper aus Nagetier-Antikörpern zu erhalten, wobei der menschliche Antikörper ähnliche Affinitäten und Spezifitäten wie der Ausgangs-Nagetier-Antikörper besitzt. Diesem Verfahren gemäß, das auch als „Epitop-Imprinting" bezeichnet wird, wird das Schwer- oder Leichtketten-V-Domänen-Gen von Nagetier-Antikörpern, das durch Phagen-Display-Verfahren erhalten wurde, durch ein Repertoire menschlicher V-Domänen-Gene ersetzt, wodurch Nagetier-Mensch-Chimären erzeugt werden. Die Selektion auf einem Antigen führt zu der Isolierung menschlicher variabler Domänen, die in der Lage sind, eine funktionale Antigen-Bindungsstelle wiederherzustellen, d. h. das Epitop steuert die Partnerwahl (führt das Imprinting durch). Wird das Verfahren wiederholt, um die verbleibende Nagetier-V-Domäne zu ersetzen, so wird ein menschlicher Antikörper erhalten (siehe PCT-Patentanmeldung WO 93/06213 , veröffentlicht am 1. April 1993). Im Gegensatz zur herkömmlichen Immunisierung von Nagetier-Antikörpern durch CDR-Transplantation stellt dieses Verfahren durch und durch menschliche Antikörper bereit, die keine Gerüst- oder CDR-Reste besitzen, die ursprünglich aus Nagetieren stammen.
(v) Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für den ErbB4-Rezeptor, um einen Antagonisten-Antikörper bereitzustellen, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für einen anderen Rezeptor oder eine andere Rezeptor-Untereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die zwei Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der Zufallsverteilung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch von 10 verschiedenen Antikörper-Molekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur besitzt. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die normalerweise durch Affinitätschromatographieschritte erfolgt, ist eher mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren werden in der PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 93/008829 (veröffentlicht am 13. Mai 1993) und in Traunecker et al., EMBO 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz sind variable Antikörper-Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) an konstante Immunglobulin-Domänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerketten-Domäne, die zumindest einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, wenn die erste konstante Schwerketten-Region (CH1), welche die für die Leichtkettenbindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls gewünscht, die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in separate Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies ermöglicht eine größere Flexibilität in der Anpassung der gegenseitigen Proportionen der drei Polypeptid-Fragmente in Ausführungsformen, in denen ungleiche Anteile der drei Polypeptidketten, die in der Konstruktion verwendet wurden, zur Bereitstellung der optimalen Erträge führen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Erträgen führt oder wenn die Verhältnisse nicht von besonderer Signifikanz sind. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (wodurch eine zweite Bindungsspezifität bereitgestellt wird) in dem anderen Arm. Es wurde herausgefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls einen leichten Weg zur Trennung bereitstellt.
Für weitere Details zur Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe z. B. Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
(vi) Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper bestehen aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern. Solche Antikörper wurden z. B. vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zeilen zu richten ( US-Patent Nr. 4.676.980 ), sowie zur Behandlung einer HIV-Infektion (PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 91/00360 und WO 92/200373 ; EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung eines beliebigen passenden Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und werden im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart, zusammen mit einer Reihe an Vernetzungsverfahren.
(vii) Antikörper-Fragmente
In gewissen Ausführungsformen handelt es sich beim ErbB4-Antagonisten-Antikörper (unter anderem murine, menschliche und humanisierte Antikörper sowie Antikörper-Varianten) um ein Antikörper-Fragment. Es wurden verschiedene Verfahren zur Produktion von Antikörper-Fragmenten entwickelt. Herkömmlicherweise wurden diese Fragmente durch proteolytischen Verdau intakter Antikörper erhalten (siehe z. B. Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24, 107–117 (1992), sowie Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Diese Fragmente können nun jedoch direkt durch rekombinante Wirtszellen produziert werden, Fab'-SH-Fragmente können z. B. direkt aus E. coli gewonnen werden und chemisch gekoppelt werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992)). In einer anderen Ausführungsform wird das F(ab')₂ unter Verwendung des Leucin-Zippers GCN4 gebildet, um die Assemblierung des F(ab')₂-Moleküls zu fördern. Einem anderen Ansatz zufolge können Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente direkt aus rekombinanter Wirtszellenkultur isoliert werden. Andere Verfahren für die Produktion von Antikörper-Fragmenten sind für den Fachmann ersichtlich.
(viii) Aminosäuresequenzvarianten von Antikörpern
Aminosäuresequenzvarianten der ErbB4-Antagonisten-Antikörper werden durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die ErbB4-Antagonisten-Antikörper-DNA oder durch Peptidsynthese hergestellt. Solche Varianten umfassen z. B. Deletionen von und/oder Insertionen in und/oder Substitutionen von Reste(n) innerhalb der Aminosäuresequenzen der ErbB4-Antagonisten-Antikörper der hierin gezeigten Beispiele. Jede Kombination an Deletion, Insertion und Substitution erfolgt, um das Endkonstrukt zu erhalten, vorausgesetzt, dass das Endkonstrukt die gewünschten Eigenschaften aufweist. Die Aminosäureveränderungen können auch posttranslationale Vorgänge des humanisierten ErbB4-Antagonisten-Antikörpers oder der ErbB4-Antagonisten-Antikörper-Variante verändern, wie z. B. das Verändern der Anzahl oder der Position von Glykosylierungsstellen.
Ein nützliches Verfahren zur Identifikation gewisser Reste oder Regionen des ErbB4-Rezeptor-Antikörpers, die bevorzugte Positionen für die Mutagenese sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie von Cunningham und Wells, Science, 244, 1081–1085 (1989), beschrieben. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Target-Resten identifiziert (z. B. geladene Reste, wie z. B. arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutral oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit ErbB4-Rezeptor-Antigen auszuführen. Jene Aminosäure-Positionen, die eine funktionale Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, werden anschließend durch Einführung weiterer oder anderer Varianten an den oder für die Substitutionsstellen weiterentwickelt. Daher muss das Wesen der Mutation per se nicht vorherbestimmt sein, während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist. Um die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu analysieren, wird Ala-Scanning- oder eine Zufalls-Mutagenese am Target-Codon oder in der Target-Region durchgeführt, und die exprimierten ErbB4-Antikörper-Varianten werden auf die gewünschte Aktivität gescreent.
Aminosäuresequenz-Insertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, die in der Länge von einem Rest bis zu Polypeptiden mit hundert oder mehr Resten reichen, sowie Intrasequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Beispiele terminaler Insertionen umfassen einen ErbB4-Antagonisten-Antikörper mit einem N-terminalen Methionyl-Rest oder den an eine Epitopmarkierung fusionierten Antikörper. Andere Insertionsvarianten des ErbB4-Antagonisten-Antikörper-Moleküls umfassen die Fusion eines Enzyms oder eines Polypeptids an den N- oder C-Terminus des ErbB4-Antagonisten-Antikörpers, was die Serum-Halbwertszeit des Antikörpers erhöht.

Eine andere Art der Variante ist eine Aminosäure-Substitutionsvariante. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im ErbB4-Antagonisten-Antikörper-Molekül entfernt sowie ein anderer Rest an dessen Stelle insertiert. Die Stellen von größtem Interesse für die Substitutionsmutagenese umfassen die hypervariablen Regionen, es werden jedoch auch FR-Änderungen in Betracht gezogen. Konservative Substitutionen werden in Tabelle 1 unter der Überschrift „bevorzugte Substitutionen" angeführt. Falls solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, so können mehr wesentliche Veränderungen, die in Tabelle 1 als „beispielhafte Substitutionen" bezeichnet werden oder wie unten stehend mit Verweis auf Aminosäureklassen weiter beschrieben, wird eingeführt werden und die Produkte gescreent werden. Tabelle 1

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitutionen	Bevorzugte Substitutionen
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gin (Q)	asn; glu	asn
Glu (B)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gin; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; Norleucin	leu
Leu (L)	norleucine; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gin; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	Tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	Trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	Ile; leu; met; phe; ala; Norleucin	leu

Wesentliche Modifikationen der biologischen Eigenschaften des Antikörpers werden durch Auswählen von Substitutionen erreicht, die sich signifikant in ihrer Wirkung auf den Erhalt (a) der Struktur der Polypeptid-Hauptkette im Substitutionsbereich, z. B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden basierend auf gemeinsamen Seitenketten-Eigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral-hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; sowie
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen bringen das Austauschen eines Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse mit sich.
Jeder nicht in den Erhalt der korrekten Konformation des ErbB4-Antagonisten-Antikörpers involvierte Cystein-Rest kann ebenfalls substituiert werden, allgemein durch Serin, um die oxidative Stabilität des Moleküls zu verbessern und um eine abnorme Vernetzung zu vermeiden. Umgekehrt kann eine/können Cystein-Bindung(en) zum Antikörper hinzugefügt werden, um seine Stabilität zu verbessern (besonders in Fällen, in denen es sich bei dem Antikörper um ein Antikörper-Fragment, wie z. B. ein Fv-Fragment, handelt).
Ein besonders bevorzugter Typ der Substitutions-Variante umfasst das Substituieren einer oder mehrerer Reste der hypervariablen Region eines Stamm-Antikörpers (z. B. eines humanisierten oder menschlichen Antikörpers). Allgemein besitzt/besitzen die zur weiteren Entwicklung ausgewählte(n) resultierende(n) Variante(n) verbesserte biologische Eigenschaften im Verhältnis zum Stamm-Antikörper, aus dem sie erzeugt wird/werden. Ein passender Weg zur Erzeugung solcher Substitutionsvarianten ist die Affinitätsreifung unter Verwendung eines Phagendisplays. Kurz gesagt, werden mehrere hypervariable Regionsstellen (z. B. 6–7 Stellen) mutiert, um alle möglichen Aminosubstitutionen an jeder Stelle zu erzeugen. Die so erzeugten Antikörper-Varianten werden auf eine einwertige Art und Weise aus filamentösen Phagenpartikeln als Fusionen an das Gen-III-Produkt von M13, das innerhalb eines jeden Partikels verpackt ist, dargestellt. Die Phagen-dargestellten Varianten werden anschließend auf ihre biologische Aktivität (z. B. Antagonisten-Aktivität) gescreent, wie hierin offenbart. Um hypervariable Kandidaten-Regionsstellen zur Modifikation zu identifizieren, kann eine Alanin-Scanning-Mutagenese durchgeführt werden, um hypervariable Regionsreste zu identifizieren, die signifikant zur Antigenbindung beitragen. Alternativ dazu oder zusätzlich dazu kann es von Vorteil sein, eine Kristallstruktur des Antigen-Antikörper-Komplexes zu analysieren, um Kontaktpunkte zwischen dem Antikörper und dem ErbB-Rezeptor zu identifizieren. Solche Kontaktreste und benachbarten Reste sind Kandidaten für eine Substitution gemäß den hierin beschriebenen Verfahren. Wurden solche Varianten einmal erzeugt, so wird die Gruppe an Varianten einem Screening unterzogen, wie hierin beschrieben, und Antikörper mit besseren Eigenschaften in einem oder mehreren relevanten Tests können zur weiteren Entwicklung ausgewählt werden.
Eine andere Art einer Aminosäure-Variante des Antikörpers verändert das ursprüngliche Glykosylierungsmuster des Antikörpers. Mit Verändern ist das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydrat-Gruppierungen gemeint, die in dem Antikörper zu finden sind, und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Antikörper nicht vorhanden sind.
Die Glykosylierung von Antikörpern ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Bindung der Kohlenhydrat-Gruppierung an die Seitenkette eines Asparagin-Rests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin sind, wenn X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, die Erkennungssequenzen für die enzymatische Bindung der Kohlenhydrat-Gruppierung an die Asparagin-Seitenkette. Daher führt die Gegenwart jeder dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid zu einer potentiellen Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Bindung einer der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, im häufigsten Fall Serin oder Threonin, obwohl auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden kann.
Die Addition von Glykosylierungsstellen zum Antikörper wird passenderweise durch Veränderung der Aminosäuresequenz erreicht, so dass diese eine oder mehrere der oben genannten Tripeptidsequenzen enthält (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Veränderung kann auch durch die Addition von, oder die Substitution durch, einem/einen oder mehreren/mehrere Serin- oder Threonin-Reste(n) zu/in der Sequenz des ursprünglichen Antikörpers erfolgen (für O-gebundene Glykosylierungsstellen).
Nucleinsäuremoleküle, die für Aminosäure-Sequenzvarianten der ErbB4-Antagonisten-Antikörper kodieren, werden durch eine Reihe an Verfahren hergestellt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle natürlich auftretender Aminosäure-Sequenzvarianten) oder die Herstellung durch oligonucleotidvermittelte (oder ortsspezifische) Mutagenese, PCR-Mutagenese sowie Kassetten-Mutagenese einer zuvor hergestellten Variante oder einer Nicht-Varianten-Version des ErbB4-Antagonisten-Antikörpes.
(ix) Andere Modifikationen von Antikörpern
Die hierin offenbarten ErbB4-Antagonisten-Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch Verfahren hergestellt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. von Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); sowie US-Patent Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben. Liposomen mit verbesserter Zirkulationszeit werden im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Verfahren der Umkehrphasenverdampfung mit einer Lipid-Zusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, erzeugt werden. Liposomen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können durch eine Disulfid-Austauschreaktion an die Liposomen konjugiert werden, wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie z. B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe z. B. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19), 1484 (1989).
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper kann auch in ADEPT durch Konjugieren des Antikörpers an ein prodrugaktivierendes Enzym verwendet werden, das eine Prodrug-Substanz (z. B. ein chemotherapeutisches Peptidyl-Mittel, siehe WO 81/01145 ) in ein aktives Anti-Krebs-Arzneimittel umwandelt. Siehe z. B. WO 88/07378 und US-Patent Nr. 4.975.278 .
Die Enzymkomponente des für ADEPT nützlichen Immunkonjugats umfasst ein beliebiges Enzym, das in der Lage ist, auf eine Prodrug-Substanz auf solch eine Art und Weise zu wirken, so dass diese in ihre aktivere, zytotoxische Form umgewandelt wird.
Enzyme, die in dieser Erfindung von Nutzen sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, alkalische Phosphatase, die zum Umwandeln phosphathältiger Prodrugs in freie Arzneimittel nützlich ist; Arylsulfatase, die zum Umwandeln sulfathältiger Prodrugs in freie Arzneimittel nützlich ist; Cytosindeaminase, die zum Umwandeln von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin in das Anti-Krebs-Arzneimittel 5-Fluoururacil nützlich ist; Proteasen, wie z. B. Serratia-Protease, Thermolysin, Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie z. B. Cathepsine B und L), die zum Umwandeln pepetidhältiger Prodrugs in freie Arzneimittel nützlich sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, die zum Umwandeln von Prodrugs, die D-Aminosäure-Substituenten enthalten, nützlich sind; kohlenhydratspaltende Enzyme, wie z. B. Galactosidase und Neuraminidase, die nützlich sind, um glykosylierte Prodrugs in freie Arzneimittel umzuwandeln; Lactamase, die zum Umwandeln von Arzneimitteln, die mit Lactamen derivatisiert wurden, in freie Arzneimittel nützlich ist; sowie Penicillin-Amidasen, wie z. B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, die zum Umwandeln von Arzneimitteln, die an ihren Amin-Stickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisiert wurden, in freie Arzneimittel nützlich sind. Alternativ dazu können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, nach dem Stand der Technik auch als „Abzyme" bekannt, verwendet werden, um die Prodrugs der Erfindung in freie aktive Arzneimittel umzuwandeln (siehe z. B. Massey, Nature 328, 457–458 (1987)). Antikörper-Abzym-Konjugate können, wie hierin beschrieben, für die Anlieferung des Abzyms zu einer Tumorzellpopulation hergestellt werden.
Die in dieser Erfindung verwendeten Enzyme können durch Verfahren, die nachdem Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z. B. die Verwendung der oben beschriebenen heterobifunktionalen Vernetzungsreagenzien, kovalent an die ErbB4-Antagonisten-Antikörper gebunden werden. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest die Antigenbindungsregion eines Antikörpers der Erfindung umfassen, die an zumindest einen funktional aktiven Abschnitt eines Enzyms der Erfindung gebunden ist, unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren konstruiert werden, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind (siehe z. B. Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984)).
In gewissen Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, ein Antikörper-Fragment anstelle eines intakten Antikörpers zu verwenden. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, das Antikörper-Fragment zu modifizieren, um seine Serum-Halbwertszeit zu erhöhen. Dies kann z. B. durch Inkorporation eines Salvage-Rezeptor-Bindungsepitops in das Antikörper-Fragment erreicht werden (z. B. durch Mutation der geeigneten Region im Antikörper-Fragment oder durch Inkorporation des Epitops in eine Peptidmarkierung, die anschließend an jedem Ende oder in der Mitte an das Antikörper-Fragment fusioniert wird, z. B. durch DNA- oder Peptid-Synthese). Siehe z. B. WO 96/32478 , veröffentlicht am 17. Oktober 1996.
Das Salvage-Rezeptor-Bindungsepitop stellt allgemein eine Region dar, in der ein oder mehrere beliebige(r) Aminosäure-Rest(e) aus einer oder zwei Schleifen einer Fc-Domäne an eine analoge Position des Antikörper-Fragments transferiert wird/werden. Noch weiter wird es bevorzugt, wenn drei oder mehr Reste aus einer oder zwei Schleifen der Fc-Domäne transferiert werden. Noch weiter wird es bevorzugt, wenn das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region (z. B. eines IgG) stammt und in die CH1-, CH3- oder V_H-Region, oder mehr als eine solche Region, des Antikörpers transferiert wird. Alternativ dazu wird das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region entnommen und in die C_L-Region oder die V_L-Region, oder beide, des Antikörper-Fragments transferiert.
Kovalente Modifikationen der ErbB4-Antagonisten-Antikörper sind auch im Umfang dieser Erfindung inkludiert. Sie können durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Antikörpers hergestellt werden, falls zutreffend. Andere Arten kovalenter Modifikationen des Antikörpers werden in das Molekül durch Umsetzen von Aminosäure-Resten des Antikörpers, auf die abgezielt wird, mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zu einer Reaktion mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten in der Lage ist, eingeführt. Beispiele kovalenter Modifikationen von Polypeptiden werden im US-Patent Nr. 5.534.615 , hierin spezifisch durch Verweis aufgenommen, beschrieben. Eine bevorzugte Art kovalenter Modifikation des Antikörpers umfasst das Binden des Antikörpers an eines einer Reihe nichtproteinhaltiger Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Po lypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die im US-Patent Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
3. Herstellung löslicher ErbB4-Rezeptoren
Lösliche ErbB4-Rezeptoren, wie z. B. eine extrazelluläre ErbB4-Domäne, kann durch Züchten von Zellen hergestellt werden, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der die kodierende Nucleinsäure enthält. Es wird natürlich in Betracht gezogen, dass Alternativverfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, verwendet werden können, um solche lösliche Rezeptoren herzustellen. Die lösliche Rezeptorsequenz oder Abschnitte davon kann/können z. B. durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden (siehe z. B. Stewart et al., s. o.; sowie Merrifield, s. o.). Die In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Verfahren oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Die automatisierte Synthese kann z. B. unter Verwendung eines Applied-Biosystems-Peptidsynthesegeräts (Foster City, CA) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers erzielt werden. Verschiedene Abschnitte des löslichen Rezeptors können getrennt chemisch synthetisiert werden und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um den löslichen Rezeptor voller Länge herzustellen.
Die rekombinante Produktion von löslichen ErbB4-Rezeptoren wird im Wesentlichen, wie hierin oben stehend beschrieben, in Zusammenhang mit Immunoadhäsinen durchgeführt.
Das passendste Verfahren für die großtechnische Produktion löslicher ErbB4-Rezeptoren besteht in der Spaltung von einem ErbB4-Ig-Immunoadhäsin. Die Strukturähnlichkeit zwischen Immunoadhäsinen und Antikörpern zeigte, dass es möglich sein könnte, Immunoadhäsine durch proteolytische Enzyme, wie z. B. Papain, zu spalten, um Fd-artige Fragmente zu erzeugen, die den „Adhäsin"-Abschnitt enthalten. Um einen allgemeineren Ansatz bezüglich der Spaltung von Immunoadhäsinen bereitzustellen, sind Proteasen zu verwenden, die für ihre Target-Sequenz hochgra dig spezifisch sind. Eine Protease, die zu diesem Zweck geeignet ist, ist eine gentechnisch veränderte Mutante von Subtilisin-BPN, welche die Sequenz AAHYTL erkennt und spaltet. Die Einführung dieser Target-Sequenz in die Träger-Gelenkregion eines ErbB4-IgG-Immunoadhäsins (z. B. IgG1) erleichtert die hochgradig spezifische Spaltung zwischen den Fc- und trk-Domänen. Das IgG1-Immunoadhäsin wird durch Protein-A-Chromatographie gereinigt und mit einer immobilisierten Form des Enzyms gespalten. Die Spaltung führt zu zwei Produkten; der Fc-Region und der ErbB4-Region, wobei es sich vorzugsweise um eine extrazelluläre ErbB4-Domäne handelt. Diese Fragmente können leicht durch eine zweite Passage über einer Protein-A-Säule getrennt werden, um das Fc beizubehalten und das gereinigte ErbB4-Fragment in den Durchflussfraktionen zu erhalten. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um durch Platzieren der spaltbaren Sequenz am unteren Gelenk einen dimeren ErbB4-Abschnitt zu erzeugen.
4. Therapeutische Zusammensetzungen und Verwendungen
Die Mitglieder der ErbB-Familie von Rezeptoren und korrespondierenden Liganden sind in die Proliferation von Glattmuskelzellen in verschiedenen Organen involviert. Dementsprechend kann ein ErbB4-Rezeptor-Antagonist für die Behandlung einer Reihe an „Erkrankungen oder Störungen" verwendet werden, die eine Proliferation von Glattmuskelzellen in einem Säugetier, wie z. B. einem Menschen, umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von ErbB4-Rezeptor-Antagonisten, wie in den Ansprüchen definiert, zur Behandlung von Stenose, wie z. B. von Gefäßstenose, von Resteonse, die auf Angioplastie oder chirurgische Eingriffe oder Stent-Implantate zurückzuführen ist, von Atherosklerose sowie von Hypertonie (beschrieben in Casterella und Teirstein, Cardiol. Rev. 7, 219–231 (1999); Andres, Int. J. Mol. Med. 2, 81–89 (1998); sowie Rosanio et al., Thromb. Haemost. 82 (Beilage 1), 164–170 (1999)). Es exisitiert eine komplexe Wechselwirkung verschiedener Zellen und freigesetzter Zytokine, die auf eine autokrine, parakrine oder juxtakrine Art und Weise reagieren, die zur Migration von VSMCs von ihrer normalen Position in Medium zu der verletzten Intima führen. Die migrierten VSMCs vermehren sich übermäßig und führen zu einer Verdickung der Intima, was zu Stenose oder der Okklusion von Blutgefäßen führt. Zusätzlich zu dem Problem erfolgt eine Plättchenaggregation und -ablagerung an der verletzten Stelle. α-Thrombin, eine multifunktionale Serin-Protease, wird an der Stelle der Gefäßverletzung konzentriert und stimuliert die VSMC-Proliferation. Nach der Aktivierung dieses Rezeptors produzieren und sekretieren VSMCs verschiedene autokrine Wachstumsfaktoren, unter anderem PDGF-AA, HB-EGF und TGF-β (beschrieben in Stouffer und Runge, Semin. Thromb. Hemost. 24, 145–150 (1998)).
Verschiedene Mitglieder der EGF-Familie spielen wichtige Rollen im normalen Wachstum und dem Erhalt von Blutgefäßen sowie bei pathologischen Zuständen. Der EGF-artige Heparinbindungs-Wachstumsfaktor (HB-EGF) ist z. B. ein starkes Mitogen und ein chemotaktischer Faktor für Fibroblasten sowie für VSMCs, jedoch nicht für Endothel-Zellen (beschrieben in Raab und Klagsbrun, Biochem. Biophys. Acta 1333, F179-199 (1997)). Der Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), ein starker angiogener Faktor, induziert die Expression von HB-EGF in Gefäßendothelzellen (Arkonac et al., J. Biol. Chem. 273, 4400–4405 (1998)). HB-EGF bindet an und aktiviert HERZ- und ErbB4-Rezeptoren, die eine Signalübertragungskaskade initiieren, die schlussendlich zu der Migration und Proliferation von Fibroblasten und VSMCs führt. HB-EGF stimuliert auch VSMCs zur Sekretion verschiedener Faktoren, die für Endothelzellen mitogen sind (Abramovitch et al., FEBS Lett. 425, 441–447 (1998)). Er induziert weiters auch eine chemotaktische Antwort in Endothelzellen. Auf eine ähnliche Art und Weise wird ein anderer Ligand, der EGF-Rezeptoren aktiviert, Epiregulin, von VSMCs sekretiert, die mit Angiotensin II, Endothelin-1 und Thrombin stimuliert wurden, und dient auch als ein starkes Mitogen für die Proliferation von VSMCs (Taylor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1633–1638 (1999)).
Gefäßstenose führt zu Hypertonie als Resultat eines erhöhten Widerstands gegenüber dem Blutfluss. Weiters kann eine verringerte Blutzufuhr zum Geewbe auch zu Nekrose führen und eine Entzündungsreaktion induzieren, die zu schweren Schäden führt. Ein Myokard-Infarkt tritt z. B. als ein Resultat von mangelndem Sauerstoff und dem lokalen Tod von Herzmuskelgewebe auf. Die perkutane transluminale koronare Angioplastie (PTCA), der Einfachheit halber als Ballon-Angioplastie bezeichnet, ist eine nicht-chirurgische, katheterbasierte Behandlungsmethode bei obstruktiver Erkrankung der Koronararterie. Bei diesem Verfahren wird ein Katheter in das Blutgefäß eingeführt, und ein Ballon wird an der Stelle der Plaque-Ablagerungen aufgeblasen, um die Plaque-Ablagerungen mechanisch zu dislozieren. Alternativ dazu wird ein Stent implantiert, um einen reibungslosen Blutfluss wiederherzustellen. Es kommt jedoch sogar innerhalb des implantierten Stents zur neointimalen Bildung, bekannt als „In-Stent-Restenose". Die Stent-Verwendung führt z. B. zu einer frühen Thrombus-Ablagerung und akuter Entzündung, zur Entwicklung von Granulationsgewebe und schlussendlich zur Proliferation von Glattmuskelzellen und zur extrazellulären Matrixsynthese (beschrieben von Virmani und Farb, Curr. Opin. Lipidol. 10, 499–506 (1999)). Ein chirurgischer Bypass-Eingriff wird nur in schwerwiegenden Fällen durchgeführt, um das betroffene Blutgefäß zu umgehen, und normalerweise nur, nachdem es im Rahmen mehrerer angioplastischer Interventionen nicht gelungen ist, den Blutfluss wiederherzustellen.
Obwohl die Ballon-Angioplastie auf breiter Ebene für die Behandlung von Stenose verwendet wurde, so ist ihr Langzeit-Erfolg doch durch Restenose eingeschränkt. Restenose bleibt als der einschränkende Faktor im Erhalt der Gefäßdurchgängigkeit nach einer PTCA erhalten, wobei sie bei 30–50 % der Patienten auftritt und zu signifikanter Morbidität sowie zu Kosten für den Gesundheitssektor führt. Die der Restenose zugrundeliegenden Mechanismen bestehen aus einer Kombination von Wirkungen der Gefäßrückstellung, der negativen Gefäßremodellierung, der Thrombusbildung und der neointimalen Hyperplasie. Es ist von Bedeutung, anzuführen, dass diese Vorkommnisse miteinander verbunden sind. Neointimale Hyperplasie wird z. B. durch Wachstumsfaktoren stimuliert, die von lokalen Thromben und dem verletzten Arteriensegment selbst freigesetzt werden und die Expression anderer wachstumsstimulierender Proteine verstärken, die zu akuten proliferativen und Entzündungsantworten führen. Eine Endothelverletzung induziert z. B. die Expression von EGF, EGF-artigen Faktoren und EGFR in VSMCs, die auf eine autokrine Art und Weise auf diese wirken, um ihre Proliferation zu stimulieren, was zu einer intimalen Verdickung und zu Restenose führt. Die Bildung der extrazellulären Matrix (ECM) und die Akkumulierung in der Gefäßwand ist eine weitere wichtige Komponente der Restenose-Verletzung, die sich nach der Ballon-Angioplastie entwickelt.
Es wurde eine Vielzahl pharmakologischer Versuche durchgeführt in einem Versuch, Restenose zu verhindern, die meisten zeigten jedoch wenige Vorteile. Frühe klinische Versuche bei der Prävention von Restenose unter Verwendung verschiedener Revaskularisationsvorrichtungen, Antiplättchen-Medikamente, Antithrombosemedikamente und entzündungshemmender Arzneimittel waren einheitlich negativ (beschrieben in Casterella und Teirstein, Cardiol. Rev. 7, 219–231 (1999); Andres, Int. J. Mol. Med. 2, 81–89 (1998); sowie Rosanio et al., Thromb. Haemost. 82 (Beilage 1), 164–170 (1999)). Trotz all der jüngst erzielten Fortschritte gibt es immer noch keine zufriedenstellende Behandlung für Stenose oder Prävention von Restenose nach einer Ballon-Angioplastie oder Stent-Implantation. Obwohl in kleinen randomisierten Versuchen eingeschränkte Erfolge erzielt wurden, bleibt Stenose und insbesondere Restenose ein bedeutendes klinisches Problem. Die vorliegende Erfindung offenbart die Verwendung von ErbB4-Rezeptor-Antagonisten zur Behandlung von Stenose oder Restenose durch Steuerung der Proliferation von Glattmuskelzellen.
Infantile hypertrophe Pylorus-Stenose (IHPS) ist eine relativ häufig auftretende Erkrankung, die hauptsächlich Säuglinge betrifft. Die zugrundeliegende Stenose führt zu einer funktionalen Obstruktion des Pylorus-Kanals. Dadurch ist die Magenentleerung der Milch schwer gestört. IHPS involviert Hypertrophie und Hyperplasie der Pylorus-Glattmuskelmasse und führt zu Pylorus-Stenose (Oue und Pur, Pediatr. Res. 45, 853–857 (1999)). Weiters wurde von einer erhöhten Expression von EGF, EGF-Rezeptor und HB-EGF in SMCs in zirkulären und längsgerichteten Pylorus-Muskeln bei IHPS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgeweben berichtet (Shima et al., Pediatr. Res. 47, 201–207 (2000)). Die hierin offenbarten Antagonisten von ErbB4 könnten in der Steuerung der Proliferation von Pylorus-Glattmuskelzellen Anwendung finden und daher in der Behandlung von Pylorus-Stenose.
Das kontraktile Wesen von Glattmuskelzellen und die Regulation ihrer Kontraktion durch verschiedene Faktoren spielen eine entscheidende Rolle im Harnsystem, umfassend Blase, Ureter und Urethra. Eine membrangebundene Vorläuferform von HB-EGF wird in Harnblasen-Glattmuskelzellen und -Epithelzellen exprimiert (Freeman et al., J. Clin. Invest. 99, 1028–1036 (1997); Kaefer et al., J. Urol. 163, 580–584 (2000)). Weiters inhibierte die Behandlung von Blasen-SMCs mit Diphtherietoxin, von dem bekannt ist, dass es membrangebundenen HB-EGF als Rezeptor verwendet, ihre Proliferation (Kaefer et al., ebenda). HB-EGF ist ein starkes Mitogen für die Blasen-SMC-Proliferation, und es agiert durch die Bindung an ErbB1-(HERZ-)Rezeptoren, die durch diese Zellen exprimiert werden, wodurch es als ein autokriner Wachstumsfaktor agiert (Borer et al., Lab Invest. 79, 1335–1345 (1999)). Die Autoren zeigten ebenfalls die Expression von ErbB2- und ErbB3-, jedoch nicht von ErbB4-Rezeptoren auf Blasen-SMCs. Diese Resultate werfen den Gedanken an die Möglichkeit auf, dass HB-EGF eine Rolle in der Blasenwand-Verdickung spielt, die als Antwort auf obstruktive Syndrome des unteren Harntrakts auftritt. Daher können ErbB4-Antagonisten der vorliegenden Erfindung, besonders ErbB4-Immunoadhäsin, bei der Kontrolle von Proliferation von Blasen-Glattmuskelzellen und dadurch in der Prävention oder der Behandlung von obstruktiven Harnwegserkrankungen von Nutzen sein.
Obstruktive Erkrankungen der Atemwege sind eine weitere Gruppe von Erkrankungen mit einer zugrundeliegenden Pathologie, welche die Proliferation von Glattmuskelzellen umfasst. Ein Beispiel dieser Gruppe ist Asthma, das sich in einer Entzündung der Atemwege und einer Bronchialverengung manifestiert. Von EGF wurde gezeigt, dass er die Proliferation menschlicher Atemwegs-SMCs stimuliert und wahrscheinlich einer der Faktoren ist, der in die pathologische Proliferation von Atemwegs-SMCs bei obstruktiven Atemwegserkrankungen involviert ist (Cerutis et al., Am. J. Physiol. 273, L10-15 (1997); Cohen et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 16, 85–90 (1997)). Dementsprechend können die ErbB4-Antagonisten der vorliegenden Erfindung zur Behandlung obstruktiver Atemwegserkrankungen verwendet werden.
Es gibt zwei Hauptansätze zur Einführung der Nucleinsäure (gegebenenfalls in einem Vektor enthalten) in die Zellen des Patienten; in vivo und ex vivo. Für die In- vivo-Anlieferung wird die Nucleinsäure dem Patienten direkt injiziiert, normalerweise an der Stelle, an der das chimäre Heteroadhäsin benötigt wird. Für die Ex-vivo-Behandlung werden die Zellen des Patienten entfernt, die Nucleinsäure wird in diese isolierten Zellen eingeführt, und die modifizierten Zellen werden dem Patienten entweder direkt oder z. B. eingeschlossen in poröse Membranen, die dem Patienten implantiert werden, verabreicht (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.892.538 und 5.283.187 ).
Es sind eine Reihe an Verfahren zur Einführung von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen erhältlich. Die Verfahren variieren in Abhängigkeit von der Tatsache, ob die Nucleinsäure in vitro in gezüchtete Zellen transferiert wird oder in vivo in die Zellen des geplanten Wirts transferiert wird. Verfahren, die sich für den In-vitro-Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen eignen, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren etc.
Ein häufig verwendeter Vektor zur Ex-vivo-Anlieferung des Gens ist ein Retrovirus. Die momentan bevorzugten In-vivo-Nucleinsäure-Transferverfahren umfassen die Transfektion mit viralen Vektoren (wie z. B. Adenovirus, Herpes-simplex-I-Virus oder adenoassoziiertem Virus) sowie lipidbasierte Systeme (nützliche Lipide zum lipidvermittelten Transfer des Gens sind z. B. DOTMA, DOPE und DC-Chol). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäure-Quelle mit einem Mittel zu versorgen, das auf die Target-Zellen abzielt, wie z. B. einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembran-Protein oder die Target-Zelle spezifisch ist, einem Liganden für einen Rezeptor auf der Target-Zelle etc. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die an ein Zelloberflächenmembran-Protein binden, das mit Endozytose assoziiert ist, zum Targeting und/oder zur Erleicherung der Aufnahme verwendet werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die einer Internalisierung im Stoffkreislauf unterzogen werden, sowie Proteine, die auf die intrazelluläre Lokalisierung abzielen und die intrazelluläre Halbwertszeit verbessern. Das Verfahren der rezeptorvermittelten Endozytose wird z. B. von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987); sowie von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben.
Für eine Beschreibung der momentan bekannten Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften siehe Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992). Siehe auch WO 93/25673 sowie die darin zitierten Verweise.
Therapeutische Formulierungen werden durch Mischen des ErbB4-Antagonisten mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren in Form von lyophilisiertem Kuchen oder wässrigen Lösungen auf die Lagerung vorbereitet (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)). Pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, unter anderem Ascorbinsäure; Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosacccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, unter anderem Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Ein Antikörper oder ein Immunoadhäsin, der/das in einer In-vivo-Verabreichung verwendet wird, muss steril sein. Dies wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht, und zwar vor oder nach der Lyophilisierung und Wiederherstellung. Die Formulierung wird normalerweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Zusammensetzungen werden normalerweise in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung platziert, z. B. einen Beutel oder eine Phiole für intravenöse Lösung mit einem Stöpsel, der von einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann.
Der Verabreichungsweg des Antikörpers, Immunoadhäsins oder des chimären Heteroadhäsins steht im Einklang mit bekannten Verfahren, z. B. Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intralesionalem Verabreichungsweg oder durch Systeme mit verzögerter Freisetzung, wie unten stehend beschrieben. Das Heteroadhäsin oder der Antikörper wird kontinuierlich durch Infusion oder Bolus-Injektion verabreicht.
Geeignete Beispiele für Präparate mit verzögerter Freisetzung umfassen semipermeable Matrizen fester hydrophober Polymere, die das Proten enthalten, wobei die Matrizen die Form von Formgegenständen vorliegen, z. B. Filme oder Mikrokapseln. Beispiele von Matrizen mit verzögerter Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 , EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s. o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. das Lupron-Depot (injiziierbare Mikrokugeln, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen), sowie Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
ErbB4-Antagonisten mit verzögerter Freisetzung umfassen auch liposomal eingeschlossenes Arzenimittel. Liposomen, die ErbB4-Antagonisten enthalten, werden durch per se bekannte Verfahren hergestellt: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008 ; US-Patent Nr. 4.485.045 und 4.544.545 ; sowie EP 102.324 . Normalerweise gehören die Liposomen dem kleinen (etwa 200-800 Angström), unilamellaren Typus an, in dem der Lipidgehalt höher als etwa 30 Mol.-% Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil zur optimalen Therapie angepasst wird. Besonders nützliche Liposomen können durch das Verfahren der Umkehrphasen-Verdampfung mit einer Lipidzusammensetzung erzeugt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) ent hält. Liposomen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu ergeben. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie z. B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe z. B. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19), 1484 (1989).
Der in der Erfindung verwendete und in den Ansprüchen definierte ErbB4-Antagonist kann verwendet werden, um ErbB4-Ligand zu binden und zu maskieren oder um den ErbB4-Rezeptor zu blockieren, wodurch die ErbB4-Aktivierung in der Zelle inhibiert wird, sowie um die Zellproliferation zu inhibieren. Der ErbB4-Antagonist der Erfindung kann einem Patienten zusammen mit einer anderen Therapie, wie z. B. einem chemotherapeutischen Mittel, verabreicht werden. Die Herstellung sowie Dosierungs-Zeitpläne für solche chemotherapeutischen Mittel können den Anweisungen des Herstellers gemäß angewandt werden oder wie vom Fachmann empirisch bestimmt. Die Herstellung sowie Dosierungs-Zeitpläne für solch eine Chemotherapie werden auch in Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann der Verabreichung des Antagonisten vorausgehen oder folgen oder gleichzeitig damit verabreicht werden.
Eine wirksame Menge des therapeutisch zu verwendenden Antagonisten hängt z. B. von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg sowie von der Erkrankung des Patienten ab. Dementsprechend ist es notwendig, dass der Therapeut die Dosierung titriert und den Verabreichungsweg je nach Notwendigkeit modifiziert, um die maximale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische Dosierung könnte von etwa 1 g/kg bis zu 100 mg/kg des Körpergewichts des Patienten reichen, vorzugsweise etwa 10 g/kg bis 10 mg/kg. Der Kliniker verabreicht typischerweise Antagonist, bis eine Dosierung erreicht wird, welche die gewünschte Wirkung zur Behandlung der oben genannten Erkrankungen erzielt.
5. Verfahren zur Identifikation von Molekülen, welche die Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen inhibieren oder verstärken
Es wird ein Screeningverfahren zur Identifikation von Molekülen offenbart, welche die Proliferation von Glattmuskelzellen inhibieren oder verstärken können. Ein Kandidatenmolekül wird z. B. mit einem Polypeptid inkubiert, das die extrazelluläre Domäne eines ErbB4-Rezeptors umfasst, gefolgt von der Addition zu einer Kultur von Glattmuskelzellen und der Bestimmung der Wirkung auf die Proliferation von Zellen. Der ErbB4-Rezeptor kann ein nativer ErbB4-Rezeptor sein, wie z. B. ein menschlicher ErbB4-Rezeptor, oder er kann ein Polypeptid mit einer Sequenzidentität von zumindest 85 % mit der Aminosäuresequenz des nativen ErbB4-Rezeptors sein. Die Zellproliferation kann auf eine Reihe von Wegen beobachtet und quantifiziert werden. Die Inkorporierung von ³H-Thymidin in DNA ist z. B. ein wohletabliertes Verfahren zur Beobachtung der zellulären DNA-Synthese, die ein Indikator für die Zellproliferation ist. Die Inkorporierung von ³H-Thymidin in DNA wird entweder mikroskopisch oder durch Zählen der Anzahl an Silberkörnern in einem Autoradiographen oder biochemisch durch Flüssigkeitszintillationsmessung beobachtet. Auf ähnliche Art und Weise kann die Inkorporierung von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) in zelluläre DNA entweder mikroskopisch oder immunologisch beobachtet werden. Beide Tests verwenden hochgradig spezifische monoklonale Antikörper, die in DNA inkorporiertes BrdU erkennen. In dem mikroskopischen Test werden die Zellen permeabilisiert, mit BrdU-spezifischen monoklonalen Antikörpern umgesetzt, gefolgt von markierten Sekundärantikörpern. Die Sekundärantikörper werden durch eine angebrachte Markierung, wie z. B. einen fluoreszierenden Farbstoff (Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas-Rot etc.) oder eine enzymatische Markierung (alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase etc.), detektiert. Ein geeignetes Substrat, das nach enzymatischer Wirkung ein unlösliches Produkt produziert, wird anschließend verwendet, um die enzymmarkierten Sekundärantikörper zu zeigen und zu quantifizieren. Ein enzymatischer Test beobachtet die Menge an BrdU-spezifischen, monoklonalen Antikörpern durch einen geeigneten Immuntest, wie z. B. ELISA. Die für BrdU-spezifischen, monoklonalen Antikörper sowie ELISA-Sets, die solche Antikörper enthalten, sind bei einer Reihe von Quellen, unter anderem Boehringer Mannheim, im Handel erhältlich.
Eine Durchflusszytometrie kann ebenfalls zur Beobachtung der Zellproliferation verwendet werden. In diesem Verfahren werden Zellen basierend auf dem Zellkern-DNA-Gehalt pro Zelle fraktioniert. Da der Zellkern-DNA-Gehalt unter den sich teilenden Zellen in Abhängigkeit von der Phase des Zellzyklus (2n in der G1-Phase, 4n in der G2+M-Phase und ein Zwischenwert in der S-Phase, worin n den Wert von haploidem Zellkern-DNA-Gehalt darstellt) variiert, kann die Zellproliferation unter Verwendung dieses Ansatzes durch Schätzung der Fraktion an Zellen in den S- und den G2+M-Phasen schnell beobachtet werden.
Da die ErbB4-abhängige Proliferation von Glattmuskelzellen den ligandvermittelten Signalübertragungsweg unter Verwendung von ErbB4-Rezeptor involviert, kann jeder Schritt in diesem Weg beobachtet werden und als Messwert der Zellproliferation verwendet werden. Ein solcher Schritt ist eine ligandinduzierte Tyrosinautophosphorylierung des ErbB4-Rezeptors, die durch den Kinaserezeptor-Aktivierungs-(KIRA-)Test beobachtet werden kann, wie in WO 95/14930 beschrieben. Dieser Test vom ELISA-Typ ist zur qualitativen oder quantitativen Messung der Kinaseaktivierung durch Messung der Autophosphorylierung der Kinasedomäne einer Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, wie z. B. ErbB4, geeignet. Das erste Teststadium umfasst die Phosphorylierung der Kinasedomäne des ErbB4-Rezeptors, der in der Zellmembran einer Glattmuskelzelle vorhanden ist. Typischerweise wird eine erste Festphase (z. B. ein Well einer ersten Testplatte) mit einer im Wesentlichen homogenen Population von Glattmuskelzellen beschichtet. Da es sich um adhärierende Zellen handelt, haften die Glattmuskelzellen auf natürliche Art und Weise an der ersten Festphase. Es können auch Glattmuskelzellen verwendet werden, die mit einem „Rezeptorkonstrukt" transfiziert wurden, das eine Fusion eines Kinaserezeptors und eines Flag-Polypeptids umfasst. Antikörper, die für das Flag-Polypeptid spezifisch sind, werden im ELISA-Teil des Tests verwendet, um den Rezeptor mit dem Flag-Peptid einzufangen. Ein Kandidatenmolekül und ein Polypeptid, das die extrazelluläre Domäne eines nativen ErbB4-Rezeptors umfasst, werden anschließend zu den Wells, die Glattmuskelzellen enthalten, hinzugefügt, gefolgt von der Beobachtung der Tyrosin-Autophosphorylierung des ErbB4-Rezeptors durch den KIRA-Test. Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von zumindest 85 % mit der Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des ErbB4-Rezeptors umfasst, kann in dem Test ebenfalls verwendet werden. Nach der Exposition werden die Glattmuskelzellen unter Verwendung eines Lysepuffers (der darin ein solubilisierendes Detergens enthält) und leichtem Rühren solubilisiert, wodurch Zelllysat freigesetzt wird, das ohne Notwendigkeit einer Konzentration oder Klärung des Zelllysats direkt dem ELISA-Teil des Tests unterzogen werden kann.
Das so hergestellte Zelllysat wird anschließend dem zweiten (ELISA-)Stadium des Tests unterzogen. Als ein erster Schritt im ELISA-Stadium wird eine zweite Festphase (normalerweise ein Well einer ELISA-Mikrotiter-Platte) mit einem Einfangmittel (oftmals ein Einfang-Antikörper) beschichtet, das spezifisch an den ErbB4-Rezeptor oder, im Fall eines Rezeptorkonstrukts, an das Flag-Polypeptid bindet. Das Beschichten der zweiten Festphase wird durchgeführt, so dass das Einfangmittel an der zweiten Festphase haftet. Das Einfangmittel ist allgemein ein monoklonaler Antikörper, es können jedoch auch polyklonale Antikörper verwendet werden. Das erhaltene Zelllysat wird anschließend gegenüber dem adhärierenden Einfangmittel ausgesetzt oder damit in Kontakt gebracht, so dass der Rezeptor oder das Rezeptorkonstrukt an der zweiten Festphase haftet (oder in ihr eingefangen wird). Ein Waschschritt wird anschließend ausgeführt, um ungebundenes Zelllysat zu entfernen, wodurch der gefangene Rezeptor oder das gefangene Rezeptorkonstrukt zurückbleiben. Anschließend wird der/das adhärierende oder der/das gefangene Rezeptor oder Rezeptorkonstrukt gegenüber einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper ausgesetzt, der phosphorylierte Tyrosin-Reste im Tyrosinkinase-Rezeptor identifiziert, oder mit diesem in Kontakt gebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (direkt oder indirekt) an ein Enzym konjugiert, das eine Farbveränderung eines nicht radioaktiven Farbreagens katalysiert. Dementsprechend kann die Phosphorylierung des Rezeptors durch eine darauf folgende Farbveränderung des Reagens gemessen werden. Das Enzym kann direkt an den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper gebunden werden, oder ein konjugierendes Molekül (z. B. Biotin) kann an den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper konjugiert werden, und das Enzym kann anschließend durch das konjugierende Molekül an den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper gebunden werden. Schließlich wird die Bindung des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers an den gefangenen Rezeptor oder das gefangene Rezeptorkonstrukt gemessen, z. B. durch eine Farbveränderung im Farbreagens. Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, die im Handel erhältlich sind, können für den Test verwendet werden.
Es wird ein Verfahren zum Screening von Molekülen offenbart, welche die Migration von Glattmuskelzellen inhibieren oder verstärken können. Eines der Formate verwendet kompartimentierte Chemotaxis-Zellkulturkammern, wie z. B. Neuroprobe-ChemoTX-Chemotaxiskammern, erhältlich bei Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD. Bei diesem Verfahren trennt ein poröser Filter Glattmuskelzellen in der oberen Kammer von einem Medium, das einen chemischen Lockstoff (z. B. Thrombin) enthält, in der unteren Kammer. Glattmuskelzellen werden mit einem Kandidatenmolekül und einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne eines ErbB4-Rezeptors, inkubiert. Am Ende der Inkubationszeitspanne werden die Filter gefärbt, und Glattmuskelzellen, die zum Boden des Filters migriert sind, werden unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops gezählt.
Eine herkömmliche Bibliothek oder eine kombinatorische Bibliothek chemischer Verbindungen kann zum Zweck des Screenings verwendet werden. Ein automatisierter Ansatz, der für hohen Durchsatz adaptiert wurde, kann für den Test ohne Schwierigkeiten verwendet werden. Die Screenigtests sind jedoch nicht nur auf kleine Moleküle eingeschränkt, es können sogar Makromoleküle, wie z. B. Antikörper, für das Screening verwendet werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Die Beispiele werden bereitgestellt, um für den Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung der Herstellung und Verwendung der Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung bereitzustellen, und dienen nicht der Einschränkung des Umfangs dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen. Es wurden Anstrengungen unternommen, um im Hinblick auf verwendete Zahlen Genauigkeit sicherzustellen (z. B. Mengen, Temperatur etc.), es sollten jedoch manch experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Falls nicht anders angegeben, so handelt es sich bei Teilen um Gewichtsteile, die Temperatur wird in °C angegeben, und der Druck liegt bei oder nahe dem Atmosphärendruck.
Beispiel 1: Konstruktion, Isolation und biochemische Charakterisierung von Immunoadhäsinen und chimären Heteromultimer-Immunoadhäsinen
Es wurde eine einzigartige Mlu-I-Stelle gentechnisch in ein Plasmid, das menschliche IgG-Schwerkette exprimiert (pDR, ein Geschenk von J. Ridgeway und P. Carter, Genentech, Inc.), an der Region, die für die Gelenkdomäne des Immunglobulins kodiert, eingeführt. Mlu-I-Stellen wurden gentechnisch ebenfalls in eine Reihe von ErbB4-Expressionsplasmiden eingeführt, und zwar an der Region, die für die ECD/TM-Verbindungsstellen dieser Rezeptoren kodiert. Alle Mutagenese-Schritte wurden unter Verwendung des Kunkel-Verfahrens durchgeführt (T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)). Die Mlu-I-Stellen wurden verwendet, um die geeigneten ErbB4-IgG-Fusionskonstrukte herzustellen. Die Fusionsverbindungsstelle der ErbB-IgG-Chimäre war: G⁸⁴⁰ _ErbB4-(TR)-DKTH²²⁴ _VH, wobei die Aminosäurenummerierung des ErbB4-Polypeptids in Plowman et al. (G. D. Plowman et al., PNAS USA 90, 1746–1750 (1993a)) beschrieben wird. Die konservierte TR-Sequenz stammt von der Mlu-I-Stelle ab. Die Sequenz der Fc-Region, die bei der Herstellung der Fusionskonstrukte erhalten wird, ist bei J. W. Ellison et al. (J. W. Ellison et al., NAR 10, 4071–4079 (1982)) zu finden. Die finalen Expressionskonstrukte befanden sich in einer Plasmidhauptkette vom pRK-Typ, in der die eukaryotische Expression von einem CMV-Promotor gesteuert wurde (Gorman et al., DNA Prot. Engl. Tech. 2, 3–10 (1990)).
Um das Protein für In-vitro-Experimente zu erhalten, wurden anhaftende HEK-293-Zellen (ATCC-Nr. CRL-1573) mit dem Expressionsplasmid unter Verwendung von Standard-Calciumphosphatverfahren (Gorman et al., s. o., und Huang et al., Nucleic Acids Res. 18, 937–947 (1990)) transfiziert. Serumhaltiges Medium wurde 15 Stunden nach der Transfektion durch serumfreies Medium ersetzt, und die transfizierten Zellen wurden 5–7 Tage lang inkubiert. Das resultierende konditionierte Medium wurde geerntet und durch Protein-A-Säulen geleitet (1-ml-Pharmacia-HiTrap). Gereinigte IgG-Fusionen wurden mit 0,1 M Zitronensäure (pH 4,2) in Röhrchen eluiert, die 1 M Tris, pH 9,0, enthielten. Die eluierten Proteine wurden anschließend gegen PBS dialysiert und unter Verwendung von Centri-Prep-30-Filtern (Amicon) konzentriert. Glycerin wurde in einer Endkonzentration von 25 % hinzugefügt, und das Material wurde bei –20°C gelagert. Materialkonzentrationen wurden mittels Fc-ELISA bestimmt.
¹²⁵I-HRG-Bindungstest
Die EGF-artige Domäne von HRG 1₍ _177–244 ₎ wurde in E. coli exprimiert, gereinigt und, wie zuvor beschrieben, radioiodiert (M. Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269, 14661–14665 (1994)). rHRG 1 voller Länge, das in Chinahamster-Eierstockzellen exprimiert wurde, wurde in Western-Blot-Analysen verwendet. Bindungstests wurden in sogenannten Nunc-Breakapart-Immunmodul-Platten durchgeführt. Die Platten-Wells wurden bei 4°C über Nacht mit 100 15 g/ml Ziegen-Anti-Mensch-Antikörper (Boehringer Mannheim) in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) beschichtet. Die Platten wurden zwei Mal mit 200 l Waschpuffer (PBS/0,05 % Tween-20) gespült, gefolgt von einer kurzen Inkubation mit 100 11 % BSA/PBS für eine Zeitspanne von 30 Minuten bei Raumtemperatur. Der Puffer wurde entfernt, und jeder Well wurde mit 100 l IgG-Fusionsprotein in 1 % BSA/PBS unter starker Side-to-Side-Rotation 1 Stunde lang inkubiert. Die Platten wurden drei Mal mit Waschpuffer gespült, und es wurde eine kompetitive Bindung durch das Hinzufügen verschiedener Mengen von kaltem Konkurrenten-HRG und ¹²⁵I-HRG 1 sowie durch Inkubieren mit starker Side-to-Side-Rotation für eine Zeitspanne von 2–3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt: Die Wells wurden schnell drei Mal mit Waschpuffer gespült, entwässert, und es wurden einzelne Wells unter Verwendung eines 100-Series-IsoData-Zählers gezählt. Es wurde eine Scatchard-Analyse unter Verwendung eines modifizierten Liganden-Programms durchgeführt (P. Munson und D. Robard, Analytical Biochemistry 107, 220–239 (1980)).
³H-Thymidin-Inkorporationstest
Es wurden tritiierte Thymidin-Inkorporationstests in einem 96-Well-Format durchgeführt. MCF7-Zellen wurden mit 10.000 Zellen/Well in 50:50-F12/DMEM (mit hohem Glucoseanteil), 0,1 % Fötalkälberserum (100 ml) ausplattiert. Es wurde den Zellen ermöglicht, sich für eine Zeitspanne von 3 Stunden zu setzen, wonach ErbB4-IgG-Fusionsproteine und/oder Heregulin zu den Wells hinzugefügt wurden (Endvolumen von 200 ml) und die Platten 15 Stunden lang in einem 37-°C-Gewebekultur-Inkubator inkubiert wurden. Tritiiertes Thymidin wurde zu den Wells hinzugefügt (20 ml an 1/20 verdünnter, tritiierter Thymidin-Stammlösung: Amersham TRA 120 B363, 1 mCi/ml), und die Platten wurden weitere 3 Stunden inkubiert. Tritiiertes Material wurde anschließend unter Verwendung eines Packard-Filtermate-196-Harvesters auf GF/C-Unifilter geerntet (96-Well-Format). Die Filter wurden unter Verwendung einer Packard-Topcount-Vorrichtung gezählt.
Beispiel 2: Wirkung von ErbB4-IgG-Immunoadhäsin auf die menschliche Aorta-Glattmuskelzellen-Proliferation
Menschliche Aorta-Glattmuskelzellen (Clonetics) wurden bei einer konfluenten Dichte von etwa 50 % (5000 Zellen/Well) in 96-Well-Gewebskulturplatten ausgesät und über Nacht in SM2-Medium (Clonetics) inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium auf M199, ergänzt mit ITS (1X), 2 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 26,5 mM NaHCO3, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin und 0,1 Vol.-% fötalem Rinderserum, geändert. Die Zellen wurden weiters für eine Zeitspanne von 16 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit entweder Her4-IgG (400 nM) oder Puffer 1 Stunde lang behandelt, gefolgt von einer Behandlung mit PDGF (100 ng/ml) für eine Zeitspanne von 40 Stunden. Kontrollzellen wurden unbehandelt belassen, um das Basisausmaß des Zellwachstums abzuschätzen. Ein aliquoter Anteil von BrdU (10 μl/Well einer 10-μM-Lösung aus 5-Brom-2'-desoxyuridin, hergestellt in PBS) wurde hinzugefügt, und die Zellen wurden für zusätzliche 2 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde durch Quantifizierung der BrdU-Inkorporation unter Verwendung eines BrdU-ELISA-Tests unter Berücksichtigung der Anweisungen des Herstellers für adhärente Zellen beobachtet (Zellproliferations-Set, Boerhinger Mannheim, Katalognr. 1 647 229).
Wie in 5 dargestellt, stimulierte PDGF das Wachstum von Aorta-Glattmuskelzellen, was in Einklang mit früheren Berichten steht (Ross et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 12, 155–169 (1990)). Die Vorbehandlung von Zellen mit ErbB4-IgG-Immunoadhäsin reduzierte das Ausmaß von PDGF-stimulierter Zellproliferation. Kontrollzellen, die mit Puffer anstelle von ErbB4-IgG behandelt wurden, zeigten keine signifikante Wirkung auf die Zeltproliferation. Diese Daten zeigen, dass zumindest ein Teil der mitotischen Antwort von Glattmuskelzellen durch die Aktivierung des ErbB4-Rezeptors vermittelt wird, und die Entfernung von Liganden, welche den ErbB4-Rezeptor mit dem ErbB4-Immunoadhäsin aktivieren würden, reduziert die Proliferation von Glattmuskelzellen als Reaktion auf PDGF.
Beispiel 3: Wirkung von ErbB4-IgG-Immunoadhäsin auf die menschliche Aorta-Glattmuskelzellen-Migration
Menschliche Aorta-Glattmuskelzellen wurden trypsinisiert und bei einer Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen pro ml in DME, enthaltend 10 % FBS, resuspendiert. Die Zellen wurden mit Her4-IgG (400 nM) oder Puffer 15 Minuten lang präinkubiert. Die unteren Wells der ChemoTX-Chemotaxis-Kammern (Neuroprobe Inc., Cat 116-8) wurden mit 300 μl einer Lösung aus 2 U/ml menschlichem Thrombin oder Puffer (PBS) als negativer Kontrolle gefüllt. Ein Filter wurde oben auf der Kammer angebracht, und die Glattmuskelzellen (puffer- oder ErbB4-behandelt) wurden zu den oberen Wells in einer Menge von 50 μl hinzugefügt. Die Platte und der Filter wurden mit dem durchsichtigen Kunststoffdeckel abgedeckt und 3 Stunden lang bei 37°C in feuchter Luft mit 5 % CO₂ inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Filter entfernt, und die oberen Seiten wurden mit einem Wattestäbchen abgewischt, um etwaige verbleibende Zellen zu entfernen. Die Filter wurden mit Dif-Quick-Färbungslösung gefärbt, und die Anzahl an Zellen, die zum Boden des Filters migrierte, wurde unter Verwendung eines Umkehrphasenmikroskops gezählt. Die Zählung ergab sechs Wells in jeder Gruppe und 40 Felder in jedem Well.
Wie in 6 dargestellt, wirkte Thrombin als chemotaktischer Stimulus und induzierte die Migration von Aorta-Glattmuskelzellen. ErbB4-IgG-Immunoadhäsin inhibierte die thrombinstimulierte Zellmigration. Diese Daten zeigen, dass zumindest ein Teil der Fähigkeit von Thrombin, die Migration von Glattmuskelzellen zu stimulieren, durch die Freisetzung von Ligand(en) für den ErbB4-Rezeptor vermittelt wird und dass die Entfernung dieser Liganden mit dem ErbB4-Immunoadhäsin die chemotaktische Antwort auf Thrombin reduziert.
Beispiel 4: Herstellung und Beschreibung von monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörpern Erzeugung von Anti-ErbB4-Mabs
Es wurde eine Gruppe von 34 murinen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch die extrazelluläre Domäne von ErbB4 binden, unter Verwendung des herkömmlichen Hybridomverfahrens hergestellt (Tabelle 2). Vollständige zelluläre RNA wurde aus MDA-MB-453-Zellen extrahiert und als eine Matrize in RT-PCR verwendet, um die kodierende Sequenz der menschlichen extrazellulären ErbB4-Domäne (ErbB4-ECD) zu erzeugen. Spezifische Oligonucleotide, die in den RT-PCR-Reaktionen verwendet wurden, wurden auf der Grundlage der ErbB4-DNA-Sequenz synthetisiert. Ein gDErbB4-ECD-Fusionsprotein wurde durch Ligation der kodierenden Sequenzen für die Aminosäuren 1–52 des Herpes-simplex-Virus-Typ-1-Glykoprotein-D an die Sequenzen, die für die Aminosäuren 26–640 von menschlichem ErbB4 kodieren, konstruiert. Die gDErbB4-ECD-cDNA wurde in den zytomegalievirusbasierten Expressionsvektor pRK5 insertiert. Dieses Konstrukt wurde unter Verwendung einer Standard-Calciumphosphat-Präzipitations-Arbeitsvorschrift vorübergehend in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen transfiziert.
Eine Affinitätssäule wurde durch Koppeln des monoklonalen Anti-gD-5B6 an CNBR-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) hergestellt. Der Überstand von gDErbB4-ECD-transfizierten 293-Zellen wurde 20- bis 40fach auf einer ym30-Membran konzentriert (Amicon, Beverly, MA) und auf das Affinitätsharz geladen. Die Säule wurde mit PBS gewaschen, und der Rezeptor wurde mit 100 mM Essigsäure/500 mM NaCl, pH 2,4, eluiert. Die ErbB4-ECD wurde einem Pufferaustausch in PBS unterzogen und konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde durch OD280 bestimmt.
Balb/c-Mäuse wurden in den Wochen 0, 1, 2 und 3 mit etwa 5 g ErbB4-ECD in RIBI-MPL+TDM+CWS-Emulsion (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) in den Ballen ihrer Hinterpfoten immunisiert. Die immunisierten Mäuse wurden mittels ELISA auf eine Antikörper-Antwort getestet. Die Mäuse mit den höchsten Titern erhielten während Woche 4 zusätzlich 5 g ErbB4-ECD in RIBI. Drei Tage später wurden die Lymphozyten aus den poplitealen und inguinalen Knoten mit der Maus-Myelomlinie X63-Ag8.653 fusioniert. Fusionierte Zellen wurden bei einer Dichte von 200.000 Zellen pro Well in 96-Well-Gewebskulturplatten ausplattiert, und die Hybridomselektion unter Verwendung von HAT-Medium-Ergänzung (Sigma, St. Louis, MO) begann einen Tag nach der Fusion. Beginnend an Tag 10 wurden die Hybridom-Überstände, wie unten stehend beschrieben, auf die Gegenwart von spezifischen ErbB4-Antikörpern unter Verwendung eines radioaktiven Einfangtests gescreent. Stabile antikörperproduzierende Klone wurden durch Grenzverdünnung erhalten, und große Mengen spezifischer Mabs wurden in Ascites hergestellt. Die Antikörper wurden auf Protein-A-Sepharose-Säulen (Fermentech, Inc., Edinburgh, Schottland) gereinigt und steril in PBS bei 4°C gelagert.
Im radioaktiven Einfangtest wurden Maxisorp-Breakapart-Module (Nunc, Roskilde, Dänemark) über Nacht bei 4°C mit 100 I an 2 g/ml Ziegen-Anti-Maus-IgG (Boehringer Mannheim) beschichtet. Die Platten wurden mit PBS/0,5 % Tween 20 (PEST) gewaschen, mit ELISA-Verdünnungsmittel (PBS/0,5 % BSA/0,05 % Tween 20) blockiert und mit monoklonalen Überständen 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und eine zusätzliche Stunde lang mit 40.000 Coutns/Well [¹²⁵I]ErbB4-ECD inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Menge an ErbB4, die an die Antikörper gebunden hatte, durch Zählen der Wells auf einem Wallac-1277-γMaster (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) bestimmt.
Die durch dieses Verfahren hergestellten 34 monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörper (Tabelle 2) besitzen eine hohe Affinität für den Rezeptor, zeigen eine Vielzahl an Isotypen und sind auf 18 verschiedene Epitope auf der ErbB4-ECD gerichtet. Isotypen der Antikörper wurden unter Verwendung eines Maus-MonoAb-ID/SP-Isotypisierungssets von Zymed (So. San Francisco, CA) den Anweisungen des Herstellers gemäß bestimmt.
Testen der Spezifität von Anti-ErbB4-Antikörpern
Die Spezifität der Mabs wurde in einem ELISA-Test durch das Messen ihrer Fähigkeit, immobilisierte extrazelluläre HER2-, HER3- und ErbB4-Domänen (Aminosäuren 1–645, 1–617 bzw. 1–640) zu binden, bestimmt. ECDs wurden auf ELISA-Platten in einer Konzentration von 1 g/ml beschichtet und mit biotinylierten Anti-ErbB4-Mabs inkubiert. Gebundene Mabs wurden unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) und des Substrats OPD (Sigma, St. Louis, MO) detektiert. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, waren beinahe alle der produzierten Antikörper hochgradig für ErbB4 spezifisch (durch eine „4" in der mit „Spezifität" markierten Spalte angezeigt). Vier der Antikörper zeigten eine gewisse Bindung an HER3 (durch eine „3" in der mit „Spezifität" markierten Spalte angezeigt).
Epitop-Kartierung und -Beschreibung
Das von jedem der monoklonalen Antikörper gebundene ErbB4-Epitop wurde durch eine kompetitive Bindungsanalyse bestimmt (Fendly et al., Cancer Research 50, 1550–1558 (1990)). Die Anti-ErbB4-Mabs wurden in ELISA-Verdünnungsmittel auf eine Konzentration von 25 g/ml verdünnt, und 50 I wurden zu einer ELISA-Platte hinzugefügt, die, wie oben stehend beschrieben, mit gDErbB4-ECD vorbeschichtet war. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert und mit PEST gewaschen. Verdünnungen von biotinylierten Anti-ErbB4-Antikörpern, die von 1:1.000 bis 1:10.000 reichten, wurden hergestellt, und 501 wurden zu der Testplatte hinzugefügt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen, und 50 I einer 1:5000-Verdünnung von Streptavidin-Peroxidase (Sigma) wurden hinzugefügt. Die Platten wurden unter Verwendung von OPD (Sigma) entwickelt. Die Anti-ErbB4-Mabs wurden basierend auf ihrer Fähigkeit, die Bindung der anderen um 50 % oder mehr im Vergleich zu einer irrelevanten Mab-Kontrolle zu blockieren, in Epitope gruppiert. Die relative Epitop-Kartierung identifizierte 17 unterschiedliche Epitope, die in Tabelle 2 als A–Q identifiziert werden.

Die Aktivitäten von neun repräsentativen Antikörpern wurden weiter untersucht. Tabelle 2: Zusammenfassende Tabelle von monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörpern

Mab	Isotyp	Epitop	Spezifität
4-1440	IgG2b, κ	B	4
4-1441	IgG1, κ	3	4
4-1459	IgG2a, κ	D	4
4-1460	IgG1, κ	C	4
4-1461	IgG2a, κ	E	4
4-1462	IgG1, κ	C	4
4-1463	IgG2a, κ	D	4
4-1464	IgG2b, κ	C	4
4-1465	IgG2a, κ	L	3, 4
4-1472	IgG2a, κ	M	4
4-1473	IgG2a, κ	F	4
4-1474	IgG2b, κ	G	4
4-1475	IgG2b, κ	P	4
4-1476	IgG2a, κ	κ	4
4-1477	IgG2a, κ	Q	4
4-1478	IgG2a, κ	I	4
4-1479	IgG2a, κ	D	4
4-1481	IgG2a, κ	H	3, 4
4-1482	IgG2b, κ	H	4
4-1483	IgG1, κ	R	3, 4
4-1484	IgG1, κ	E	4
4-1485	IgG2a, κ	F	4
4-1491	IgG2a, κ	G	4
4-1492	IgG2b, κ	A	4
4-1493	IgG2B, κ	A	4
4-1494	IgG2b, κ	B	4
4-1495	IgG2b, κ	A	4
4-1496	IgG1, κ	A	3, 4
4-1497	IgG1, κ	N	4
4-1498	IgG2b, κ	E	4
4-1535	IgG2b, κ	B	4
4-1536	IgG2b, κ	A	4
4-1537	IgG2b, κ	B	4
4-1543	IgG2a, κ	0	4

Bestimmung der Bindungsaffinität
Die relativen Affinitäten der Anti-ErbB4-Mabs wurden gemäß dem von Friguet et al., J. Immunol. Methods 77 (2), 305–19 (1985), beschriebenen Verfahren bestimmt. Verschiedene Konzentrationen der ErbB4-ECD (1,1 × 10^–7 M bis 1,08 × 10^–10 M) wurden mit einer konstanten Konzentration von Anti-ErbB4-Mab (2,08 × 10^–10 M) gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubierung wurden die ungebundenen Mabs durch das Hinzufügen von 100 I des Reaktionsgemisches im Duplikat zu Mikrotiterplatten (Nunc) getestet, die zuvor mit gDErbB4-ECD beschichtet wurden (100 l/Well in einer Konzentration von 1 g/ml in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, für eine Zeitspanne von 16 Stunden bei 4°C), und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PEST wurden die gebundenen Mabs durch das Hinzufügen von 100 l/Well einer 1:5000-Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-F(ab')₂-Peroxidase (Boehringer Mannheim) für eine Zeitspanne von einer Stunde bei Raumtemperatur detektiert. Die Platten wurden unter Verwendung von o-Phenylendiamindihydrochloridsubstrat (OPD, Sigma, St. Louis, MO) entwickelt und auf einem Plattenleser gelesen.
Die Mabs zeigten alle eine hohe Affinitätsbindung, wobei die Kd-Werte von 0,4 bis 12 nM reichten, wie in Tabelle 3 angeführt.
Nicht-reduzierender Immunoblot
Die Fähigkeit der Anti-ErbB4-Mabs, reduzierte und nicht-reduzierte ErbB4-ECD zu binden, wurde mittels Immunoblot-Analyse getestet. ErbB4-ECD wurde zu Tricin-Probenpuffer hinzugefügt, mit und ohne BME, und auf ein 10–20 % Novex-Tricingel aufgebracht (Novex, San Diego, CA). Das Gel wurde bei 100 V laufen gelassen und 60 Minuten lang bei 0,5 A einem Elektroblotting auf einer PVDF-Membran (Immobilon P) (Millipore, Redford, MA) unterzogen. Die Membran wurde mit PEST gewaschen und über Nacht mit PBS/0,5 % BSA/0,1 % Tween 20 blockiert und mit 1 g/ml monoklonalem Antikörper für eine Zeitspanne von 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde gewaschen und für eine zusätzliche Stunde mit einer 1:10.000-Verdünnung einer Ratten-Anti-Maus-IgG-Peroxidase (Boehringer Mannheim) inkubiert. Die Membran wurde gründlich gewaschen und unter Verwendung des Amersham-ECL-Chemilumineszenzsystems (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, III) entwickelt.
Keiner der Mabs war in der Lage, reduzierte ErbB4-ECD zu erkennen (Daten nicht angeführt), was darauf hindeutet, dass sie auf Konformationsepitope gerichtet sind. Mabs, die in Tabelle 3 als positiv identifiziert wurden, sind jene, die in der Lage sind, geringe Konzentrationen nicht-reduzierter ErbB4-ECD zu erkennen. Die Mabs 4-1459, 4-1460, 4-1461, 4-1462, 4-1492 und 4-1497 zeigten ein hohes Ausmaß an Immunoreaktivität und waren in der Lage, eine nicht-reduzierte ErbB4-ECD in Mengen von so wenig bis zu 0,3 ng zu binden.
Inhibierung der HRG-Bindung
Eine K562-Zelllinie, die keine EGFR-artigen Rezeptoren exprimiert, wurde zur weiteren Charakterisierung der monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörper verwendet. Eine K562-Zelllinie, die mit ErbB4 (1E10.1H4) transfiziert worden war, wurde hergestellt und in RPMI-1640 mit 2 mM L-Glutamin (GIBCO/BRL), 10 % FBS (Hyclone) und 800 g/ml Geneticin, G418 (Gibco/BRL), gezüchtet. Zumindest 20 Stunden vor dem Test wurde 1E10.1H4 mit 10 nm Phorbol-12-myristat,13-acetat (PMA, Calbiochem, La Jolla, CA) stimuliert. Die Anti-ErbB4-Mabs wurden auf ihre Fähigkeit, die Bindung von HRG an diese Zelllinie zu binden, evaluiert.
Vierfache Proben, die 1,0 × 10⁵ K562-ErbB4-Zellen enthielten, die in 200 l RPMI-1640 mit 10 mM HEPES und 0,1 % BSA (Bindungspuffer) resuspendiert waren, wurden über Nacht auf Eis mit 132 pM [¹²⁵1]HRG-1 (177–244) in Gegenwart von 100 nM Anti-ErbB4-Mabs inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung einer Multiscreen-Filtrierungsvorrichtung (Millipore) gesammelt und zwei Mal mit 200 l eiskaltem Bindungspuffer gewaschen. Zellassoziierte Counts wurden auf einem γ-Zahler gemessen. Der Prozentsatz der Bindung wurde gegen eine Kontrollprobe, die keine Mabs enthielt, errechnet. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Inkubation einer Probe in Gegenwart von 500 nM kaltem HRG-1 (177–244) bestimmt. Mabs wurden als positiv für die HRG-Blockierung angesehen, wenn sie 90 % oder mehr der Bindung blockierten. Wie in Tabelle 3 zu sehen ist, waren sechs der neun getesten Anti-ErbB4-Antikörper in der Lage, die ¹²⁵I-HRG-Bindung in diesem Stadium zu inhibieren. Mab 4-1461 inhibierte die Bindung um 7 %, und 1459 zeigte keine HRG-Blockierung. Der Anti-ErbB4-Mab 4-1497 zeigte keine Inhibierung der Bindung, sondern es stellte sich heraus, dass er die HRG-Bindung vielmehr um 26 % verstärkte.
Inhibierung der HRG-Bindung in menschlichen Brustkrebs-Zelllinien
Da eine Reihe der Anti-ErbB4-Mabs in der Lage waren, die Bindung von HRG an transfizierte K562-Zellen zu blockieren, wurde ihre Fähigkeit, die HRG-Bindung an mehrere menschliche Mammakarzinom-Zelllinien zu blockieren, getestet. Die Zelllinien MDA-MB-453, T47D und BT474 (ATCC, Rockville, MD) wurden in 24-Well-Gewebskulturplatten in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Well ausplattiert, und es wurde ihnen das Anhaften über Nacht ermöglicht. Die Anti-ErbB4-Mabs oder die Anti-HER2-Kontroll-Mabs 2C4 und 4D5 wurden in Ham-F-12- plus modifiziertem Dul becco-Eagle-Medium (1:1 (Vol./Vol.)) mit 10 mM HEPES und 0,1 % BSA (Bindungspuffer) auf eine Konzentration von 100 nM verdünnt und in dreifacher Ausfertigung zu den Platten hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten auf Eis wurden 1,5 X 10⁵ Counts von [¹²⁵I]HRG-1 (144–277) hinzugefügt. Die Platten wurden 4 h lang auf Eis inkubiert und zweimal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen. Die Zellen wurden mit 8 M Harnstoff/3 M Essigsäure solubilisiert, und zellassoziierte Counts wurden auf einem Wallac-1277-γMaster gemessen. Der Prozentsatz der Bindung wurde, wie oben stehend beschrieben, berechnet. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Inkubierung einer Probe in Gegenwart von 100 nM kaltem HRG-1 (144–277) bestimmt.
Keiner der Anti-ErbB4-Mabs führte zu einer signifkanten Inhibierung der ¹²⁵I-HRG-Bindung an die getesteten Karzinomlinien. Im Gegensatz dazu blockierten die Anti-HER2-Kontroll-Mabs 2C4 und 4D5 die Bindung um 84 % bzw. 29 % in MDA-MB-453-Zellen, um 70 % bzw. 48 % in T47D-Zellen und um 57 % bzw. 12 % in BT474-Zellen. Die nicht-markierte HRG-Kontrolle blockierte 99 % der Bindung in MDA-MB-453-Zellen, 98 % der Bindung in T47D-Zellen und 96 % der Bindung in BT474-Zellen bei einer Konzentration von 100 nM. Diese Daten zeigen, dass der ErbB4-Rezeptor in diesen Zelllinien eine geringe Rolle in der Vermittlung der HRG-Antworten spielen kann.
Inhibierung der Tyrosin-Phosphorylierung
Von Heregulinen wurde gezeigt, dass sie die Tyrosin-Phosphorylierung von ErbB4 induzierten. Es war daher von Interesse, zu bestimmen, ob die Anti-ErbB4-Mabs in der Lage waren, die HRGβ1₍ ₁₇₇_₂₄₄ ₎-stimulierte Phosphorylierung des Rezeptors in der K562-ErbB4-Zelllinie zu beeinflussen.
Die ErbB4-transfizierte K562-Zelllinie (1E10.1H4) wurde in RPMI-1640-Kulturmedium bis zu einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen auf serumfreies Medium ohne PMA (Testpuffer) geändert und bei 37°C für eine Zeit spanne von 2–6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit Testpuffer gewaschen, und Proben, die im Duplikat vorhanden waren und 2,5 × 10⁵ Zellen in Testpuffer mit 0,1 % BSA enthielten, wurden mit 25 μg Anti-ErbB4-Mabs oder einem Kontroll-Mab für eine Zeitspanne von 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine Probengruppe mit 15 mM HRG-1 (177–244) für eine Zeitspanne von 8 Minuten bei Raumtemperatur stimuliert. Die Überstände wurden entfernt, und die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 100°C in 100 l SDS-Probenpuffer, enthaltend 50 l/ml Mercaptoethanol, lysiert. Ein aliquoter Anteil von 30 I jeder Probe wurde in einem 4–12 % Polyacrylamidgel (Novex) einer Elektrophorese und auf einer PVDF-Membran (Millipore) einem Elektroblotting unterzogen. Die Membranen wurden mit 2 % BSA in trisgepufferter Salzlösung, enthaltend 0,05 % Tween-20, über Nacht bei 4°C blockiert und mit einer 1:1000-Verdünnung rekombinanter monoklonaler Anti-Phosphotyrosin-Peroxidase RC20H (Transduction Laborstories, Lexington, Kentucky) für eine Zeitspanne von 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Gebundener Anti-Phosphotyrosin-Ab wurde unter Verwendung des Amersham-ECL-Systems (Amersham Life Science Inc.) sichtbar gemacht und mittels Densitometrie quantifiziert.
Sechs der neun getesteten monoklonalen Antikörper inhibierten die Erzeugung eines HRG-induzierten Tyrosinphosphorylierungssignals (Tabelle 3). Die verbleibenden drei waren nicht inhibitorisch, und keiner der Anti-ErbB4-Mabs war in der Lage, die Phosphorylierung des ErbB4-Rezeptors zu stimulieren.
Immunhistochemie
Da Anti-ErbB4-Mabs als diagnostische Reagenzien von Nutzen sein könnten, wurde ihre Fähigkeit, gefrorene Zellpellets unter Verwendung immunzytochemischer Standard-Verfahren zu färben, untersucht. ErbB4-transfizierte K562-Zellen (1E10.1H4) und die menschlichen Brustkarzinomlinien MDA-MB-453, T47D und BT474 (ATCC, Rockville, MD) wurden pelletiert und in OCT-Verbindung gefroren (Miles Inc., Elkhart, IN). Die gefrorenen Pellets wurden auf einem Kryostat auf eine Dicke von 5 μm geschnitten, auf Objekträger aufgebracht, in kaltem Aceton (4°C) für eine Zeitspanne von 3–5 Minuten fixiert und luftgetrocknet. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde unter Verwendung einer Modifikation des Glucose-Oxidase-Verfahrens gequencht. Die Objektträger wurden mit PBS gespült, und die endogene Biotin-Aktivität der Zellen wurden unter Verwendung eines Vektor-Biotin-Blockierungssets (Vector, Burlingame, CA) blockiert. Endogene Immunglobulin-Bindungsstellen wurden mit 10 % normalem Pferdeserum (Vector) blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit 10 g/ml Anti-ErbB4-Mabs eine Stunde lang bei RT inkubiert, gefolgt von einer Inkubation von 30 Minuten mit einer 1:200-Verdünnung von biotinyliertem Pferde-Anti-Maus-IgG (Vector). Die Objektträger wurden mit ABC-Elite-Reagens (Vector) für eine Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert, und die ErbB4-Rezeptoren wurden unter Verwendung von DAB (Pierce, Rockford, IL) sichtbar gemacht. Mayer-Hämatoxylin (Rowley Biomedical Institute, Rowley, MA) wurde verwendet, um die Zellen gegenzufärben.

Viele der Anti-ErbB4-Mabs waren in der Lage, die ErbB4-transfizierten K562-Zellen mit variierender Intensität und geringer oder keiner Hintergrundfärbung zu färben (Tabelle 3). Die Zahlen stellen die Intensität der Färbung im Vergleich zu einer irrelevanten Kontrolle dar. Keiner der Mabs war in der Lage, die gefrorenen menschlichen Mammakarzinom-Zellen, die getestet wurden, zu färben (Daten nicht dargestellt). Tabelle 3: Zusammenfassende Tabelle der Aktivität monoklonaler Antikörper

Mab	Isotyp	Epitop	Kd(nM)	nicht-reduzierender Immunoblot	HRG – Blockierung	P-Tyr-Blockierung	Histochemie
4-1440	IgG2b, κ	B	1.9	–	+	+	3+
4-1459	IgG2a, κ	D	0.7	+	–	–	4+
4-1460	IgG1, κ	C	1.2	+	+	+	3+
4-1461	IgG2a, κ	E	2.3	+	–	–	4+
4-1462	IgG1, κ	C	0.4	+	+	+	2+
4-1464	IgG2b, κ	C	1.0	–	+	+	2+
4-1473	IgG2a, κ	F	6.0	–	+	+	2–3+
4-1492	IgG2b, κ	A	2.1	+	+	+	–
4-1497	IgG1, κ	N	12.0	+	–	–	–

FACS-Analyse
Um zu bestimmen, ob die Anti-ErbB4-Mabs an ErbB4 auf der Oberfläche von lebensfähigen Zellen binden konnten, wurde eine FACS-Analyse unter Verwendung der ErbB4-transfizierten K562-Zelllinie und der Mammakarzinom-Linien MDA-MB-453, T47D und BT-474 durchgeführt. Adhärierende Zellen wurden von Gewebskulturflaschen unter Verwendung von 10 mM EDTA in PBS getrennt, bei 1400 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und in PBS mit 1 % fötalem Rinderserum (FACS-Verdünnungsmittel) resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt, auf 10 Zellen/ml angepasst, und 0,1 ml der Zellen wurden mit 10 g/ml eines jeden Mab in 100 I FACS-Verdünnungsmittel 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden gewaschen, in 0,1 ml Verdünnungsmittel resuspendiert und mit 1 g FITC-konjugiertem F(ab')₂-Fragment von Ziegen-Anti-Maus-IgG (Boehringer Mannheim) 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, in 0,5 ml FACS-Verdünnungsmittel resuspendiert und unter Verwendung eines FACScan-Zellsortierers (Becton Dickinson, Mt. View, CA) analysiert. Die Daten wurden durch Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung sowie durch Propidiumiodidfluoreszenz sortiert, um Trümmer, Dubletts und tote Zellen auszuschließen.
Alle der Mabs banden an den ErbB4-Rezeptor auf der ErbB4-transfizierten K562-Zelllinie, die mit etwa 2 × 10⁵ Rezeptoren/Zelle exprimiert wird. Eine Zunahme der beobachteten zellulären Fluoreszenz der ErbB4-transfizierten K562-Zellen in einem 2- bis 50fachen Ausmaß wurde im Vergleich zu den Isotyp-Kontrollen beobachtet. Manche der schwächeren Bindungen können ein ErbB4-ECD-Epitop widerspiegeln, das auf den intakten Zellen maskiert ist. Im Gegensatz dazu zeigten die Anti-ErbB4-Antikörper 4-1440, 4-1464 und 4-1492, die auf der transfizierten Zelllinie die höchste Fluoreszenzintensität ergaben, eine minimale Bindung an die Brustkarzinomlinien MDA-MB-453, T47D und BT-474. Der positive Kontroll-Anti-HER2-Mab 2-2C4 zeigte eine Bindung an die Tumorlinien in Proportion zum Ausmaß der HER-2-Expression. Diese Resultate zeigen ein Ausmaß der ErbB4-Expression auf den MDA-MB-453-, T47D- und BT-474-Zellen, das unter der Nachweisgrenze dieses Tests liegt.
Inhibierung der Heregulin-Bindung an ErbB4-Immunoadhäsin
7 zeigt eine Verdrängungskurve der ¹²⁵I-HRG-Bindung an ein ErbB4-Immunoadhäsin, das auf Breakapart-Modulen unter Verwendung der angegebenen Konzentrationen der Anti-ErbB4-Mabs 4-1440, 4-1460 und 4-1464 eingefangen wurde. Maxisorp-Breakapart-Module (Nunc) wurden mit 100 I einer 1:200-Verdünnung von Ziegen-Anti-Mensch-Ig (Boheringer Mannheim) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit PEST gewaschen, mit ELISA-Verdünnungsmittel blockiert und mit 100 1200 ng/ml ErbB4-Immunoadhäsin 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und 50 l verdünnte Mabs (0,1 bis 100 nM Endverdünnung) sowie 50 l ¹²⁵I-HRG-1 (177–244), die auf eine Endkonzentration von 132 pM verdünnt wurden, wurden zu der Platte hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur wurden die Platten gewaschen, und die Menge an ¹²⁵I-HRG, die an den Rezeptor gebunden hatte, wurde durch Zählen der Wells auf einem Wallac-1277-γMaster bestimmt.
7 zeigt, dass die Mabs die Heregulin-Bindung an das Immunoadhäsin auf eine dosisabhängige Art und Weise inhibierten, und zwar mit ED₅₀-Werten, die von 0,7 bis 1,1 nM reichten. Dies zeigt, dass die Mabs ein hohes Ausmaß an Blockierfähigkeit besitzen.
Hinterlegung von Material

Die folgenden Hybridome wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC), hinterlegt:

Hybridom	ATCC-Hinterlegungsnr.	Hinterlegungsdatum
HER4.10H1.1A1	PTA-2828	19. Dezember 2000
HER4.1C6.A11	PTA-2829	19. Dezember 2000
HER4.3B9.2C9	PTA-2826	19. Dezember 2000
HER4.1A6.5B3	PTA-2827	19. Dezember 2000
HER4.8B1.2H2	PTA-2825	19. Dezember 2000

Jedes der hinterlegten Hybridome produziert einen der monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörper, die in Tabelle 2 identifiziert wurden. HER4.10H1.1A1 produziert mAb 4-1464, HER4.1C6.A11 produziert mAb 4-1440, HER4.3B9.2C9 produziert mAb 4-1460, HER4.1A6.5B3 produziert mAb 4-1492, und HER4.8B1.2H2 produziert mAb 4-1473.
Die Hinterlegung der Hybridome bei der ATCC erfolgte unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren sowie unter den darin enthaltenen Vorschriften (Budapester Vertrag). Dies stellt den Erhalt einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für eine Zeitspanne von 30 Jahren ab dem Hinterlegungsdatum sicher. Die Hinterlegung wird von der ATCC zu den Bedingungen des Budapester Vertrags erhältlich gemacht und unterliegt einer Übereinkunft zwischen Genentech, Inc., und der ATCC, wodurch nach Ausstellung des dazugehörigen US-Patents oder nach der Offenlegung einer beliebigen US- oder fremden Patenentanmeldung für die Öffentlichkeit, welche auch immer zuerst vorliegt, eine dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Hinterlegungskultur für die Öffentlichkeit sichergestellt wird und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für eine Person sichergestellt wird, die durch den Präsidenten des US-Patentamts bestimmt wird und dazu gemäß 35 U. S. C. § 122 sowie gemäß den diesbezüglichen Bestimmungen des Präsidenten (unter anderem 37 C. F. R. § 1.14 mit besonderem Verweis auf 886 DG 638) berechtigt ist.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Zucht unter geeigneten Bedingungen absterben sollte, verloren gehen sollte oder zerstört werden sollte, die Materialien nach Bekannmachung umgehend mit einem anderen desselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als Lizenz zur Durchführung der Erfindung in Verstoß der Rechte auszulegen, die unter der Autorität einer beliebigen Regierung in Einklang mit ihren Patentgesetzen erteilt wurden.
Die vorangehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend angesehen, um es dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang durch das hinterlegte Konstrukt nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Veranschaulichung gewisser Aspekte der Erfindung gedacht ist und sich alle Konstrukte, die der Definition in den Ansprüchen entsprechen, innerhalb des Umfangs dieser Erfindung befinden. Die Hinterlegung des Materials stellt hierin kein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unausreichend ist, um die Durchführung eines beliebigen Aspekts der Erfindung zu ermöglichen, unter anderem umfassend den besten Modus dieser, ebenso wenig ist sie als Einschränkung des Umfangs der Ansprüche auf die spezifischen Beschreibungen auszulegen, die sie darstellt. Tatsächlich werden für den Fachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben werden, aus der vorangehenden Beschreibung ersichtlich werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines für einen nativen ErbB4-Rezeptor spezifischen Antagonisten, wobei der Antagonist ein Immunoadhäsin umfasst, das die Sequenz einer extrazellulären Domäne eines nativen ErbB4-Rezeptors umfasst, der einen Liganden des Rezeptors bindet, oder eines neutralisierenden Antikörpers oder Fragments davon, der/das spezifisch einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Stenose.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament zur Behandlung von Stenose durch Prävention übermäßiger Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen dient.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament zur Behandlung von Stenose durch Inhibierung übermäßiger Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen dient.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Inhibierung völlige Inhibierung ist.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, worin die Glattmuskelzellen vaskuläre Glattmuskelzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Glattmuskelzellen Pylorus-Glattmuskelzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Glattmuskelzellen Harnblasen-Glattmuskelzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Glattmuskelzellen jene eines Atomwegs sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Stenose aus übermäßiger Proliferation oder Migration von Glattmuskelzellen resultiert.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Stenose aus übermäßiger Proliferation oder Migration von vaskulären Glattmuskelzellen resultiert.
Verwendung nach Anspruch 10, worin die vaskulären Glattmuskelzellen menschlich sind.
Verwendung nach Anspruch 10, worin die vaskulären Glattmuskelzellen menschliche Aorta-Glattmuskelzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin die Stenose eine Gefäßstenose ist.
Verwendung nach Anspruch 13, worin die Gefäßstenose weiters durch übermäßige Proliferation oder Migration von Endothelzellen gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die Stenose Restenose ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Immunoadhäsin die Sequenz einer extrazellulären Domäne eines nativen ErbB4-Rezeptors umfasst, der einen Liganden des Rezeptors bindet.
Verwendung nach Anspruch 16, worin der native ErbB4-Rezeptor menschlich ist.
Verwendung nach Anspruch 17, worin der native ErbB4-Rezeptor der ErbB4-Rezeptor der Seq.-ID Nr. 2 ist.
Verwendung nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, worin die Sequenz der extrazellulären Domäne des nativen menschlichen ErbB4-Rezeptors an eine Sequenz der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette fusioniert ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das Immunglobulin vom IgG-Isotyp ist.
Verwendung nach Anspruch 20, worin das Immunglobulin vom IgG1-, IgG2- oder IgG3-Isotyp ist.
Verwendung nach Anspruch 21, worin das Immunoadhäsin zumindest eine leichte Kette eines IgG-Immunglobulins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antagonist ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 23, worin der native ErbB4-Rezeptor der ErbB4-Rezeptor der Seq.-ID Nr. 2 ist.
Verwendung nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, worin der Antikörper ein neutralisierender Antikörper ist, der spezifisch einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 25, worin der Antikörper ein chimärer, humanisierter oder menschlicher Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 25, worin der Antikörper glykosyliert ist.
Verwendung nach Anspruch 25, worin der Antikörper im Wesentlichen das gleiche Epitop bindet wie ein Antikörper, der von einem Hybridom gebildet wird, das aus der aus HER4.10H1.1A1 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2828), HER4.1C6.A11 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2827) und HER4.8B1.2H2 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2825) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 25, worin der Antikörper Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) eines Antikörpers aufweist, der von einem Hybridom gebildet wird, das aus der aus HER4.10H1.1A1 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2828), HER4.1C6.A11 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2827) und HER4.8B1.2H2 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2825) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin der Antagonist wie in einem der Ansprüche 16 bis 29 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin der Antagonist für die Behandlung der Glattmuskelzellen einem Patienten als Injektion oder Infusion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Behandlung außerdem mit der Stenose assoziierte Hypertension reduziert.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Behandlung eine Prävention ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Stenose Pylorusstenose ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Stenose eine Verdickung der Harnblasenwand ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Stenose Teil einer obstruktiven Atemwegserkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antagonist eines ErbB4-Rezeptors für die Behandlung unter Verwendung einer für den ErbB4-Rezeptor-Antagonisten kodierenden Nucleinsäure in eine Zelle einzuführen ist.
Verwendung nach Anspruch 37, worin der Patient ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 38, worin der Antagonist wie in einem der Ansprüche 16–29 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 37, worin die Nucleinsäure in vivo einzuführen ist.
Verwendung nach Anspruch 37, worin die Nucleinsäure ex vivo einzuführen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antagonist einen Antikörper umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Antikörper umfasst, die von einem Hybridom gebildet werden, das aus der aus HER4.10H1.1A1 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2828), HER4.1C6.A11 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2829), HER4.3B9.2C9 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2826), HER4.1A6.5B3 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2827) und HER4.8B1.2H2 (ATCC-Zugangsnummer PTA-2825) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antagonist einen neutralisierenden Antikörper umfasst, der im Wesentlichen das gleiche Epitop von ErbB4 bindet, das von einem Antikörper gebunden wird, der aus der aus den monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörpern 4-1440, 4-1460, 4-1473, 4-1492 und 4-1464 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antagonist einen neutralisierenden Antikörper umfasst, der Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) eines Antikörpers aufweist, der aus der aus den monoklonalen Anti-ErbB4-Antikörpern 4-1440, 4-1460, 4-1473, 4-1492 und 4-1464 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antagonist einen neutralisierenden Antikörper umfasst, der mit hoher Affinität an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper mit einer Kd von weniger als 100 nM an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper mit einer Kd von weniger als 50 nM an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper mit einer Kd von weniger als 10 nM an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper ein menschlicher Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper ein Antikörperfragment ist.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet und die Heregulinbindung daran reduziert.
Verwendung nach Anspruch 45, worin der Antikörper an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet und Heregulin-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung davon reduziert.
Verwendung nach Anspruch 52–53, worin der Antikörper mit hoher Affinität an einen nativen ErbB4-Rezeptor bindet.