DE60131430T2

DE60131430T2 - Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion

Info

Publication number: DE60131430T2
Application number: DE60131430T
Authority: DE
Inventors: Dennis Potomac KLINMAN; Ken Columbia ISHII; Daniela Potomac VERTHELYI
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, US
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2021-01-13
Also published as: US20080069825A1; EP1322655A1; US7521063B2; ATE378348T1; EP1322655B1; US8232259B2; US20030144229A1; DE60131430D1; US7919477B2; WO2001051500A1; AU2001227889A1; US20110189267A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Induzierung einer Immunantwort unter Anwendung verschiedener CpG Sequenzen.
STAND DER TECHNIK
DNA ist ein komplexes Makromolekül, dessen immunologische Aktivitäten durch seine Grundzusammensetzung und Basismodifikationen sowie der Ausrichtung der Helix beeinflusst werden. Gewisse ungewöhnliche DNA Strukturen (z. B. Z-DNA) können, wenn an normale Mäuse verabreicht, bedeutsame Antikörper Antworten induzieren. Zusätzlich kann bakterielle DNA sowie eine bestimmte synthetische unmethylierte CpG Sequenz in murinen B-Zellen Proliferation und Immunglobulin (Ig) Produktion induzieren. Unmethylierte CpG Dinukleotide finden sich häufiger in den Genomen von Bakterien und Viren, als in Wirbellebewesen, und neuere Studien schlagen vor, dass die Immunerkennung dieser Motive zu der angeborenen Immunantwort des Wirtes beitragen kann. D. M. Klinman et al. „CpG Motifs Present in Bacterial DNA Rapidly Induce Lymphocytes to Secrete Interleukin 6, Interleukin 12 and Interferon γ, 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2879 (1996); A.-K. Yi et al., Rapid Immune Activation by CpG Motifs in Bacterial DNA, 157 J Immun. 5394 (1996); Hua Liang et al., Activation of Human B Cells by Phosphorothioate Oligodeoxynocleotides, 98 J. Clin. Invest. 1119 (1996); A. M. Krieg et al., CpG Motifs in Bacterial DNA Trigger Direct B-Cell Activation, 374 Nature 546 (1995).
In Mäusen induziert CpG DNA in fast allen (> 95%) B. Zellen Proliferation und erhöht die Sekretion von Immunglobulin. Diese B. Zellen Aktivierung durch CpG DNA ist T-Zellen unabhängig und Antigen-unspezifisch. Neben seinen direkten Auswirkungen auf B-Zellen aktiviert CpG DNA ebenso Monozyten, Fresszellen, und dendritische Zellen direkt, um eine Vielfalt von Cytokinen abzuschneiden. Diese Cytokine stimulieren natürliche Killerzellen (NK) zur Sezernierung von γ-Interferon (IFN-γ) und weisen eine lytische Aktivität auf. Diesbezügliche Beispiele können in den internationalen Patentanmeldungen WO 96/26204 , WO 96/02555 , WO 98/11211 , WO 98/18810 , WO 98/37919 , WO 98/40100 , WO 98/52,581 ; US Patentanmeldungen mit den Nummern 08/738,652 und US Patent Nummer 5,663,153 gefunden werden.
Obwohl bakterielle DNA und bestimmte CpG Sequenzen Antworten von menschlichen Zellen induzieren können (Z. K. Ballas et al., Induction of NK Activity in Murine and Human Cells by CpG Motifs in Oligodeoxynucleotides and Bacterial DNA, 157 J. Immunol. 1840 (1996), zeigen individuelle Subjekte erhebliche Heterogenität bei ihren Antworten auf verschiedene CpG Sequenzen. Tatsächlich sind CpG Sequenzen, die bei einigen Subjekten die Zellen stark stimulieren, bei Zellen von anderen Subjekten nahezu inaktiv. Diese verschiedenen Antworten machen es schwierig, wenn nicht unmöglich, bei allen Mitgliedern einer verschiedenartigen Bevölkerung eine therapeutische Immunantwort zu induzieren, indem eine einzelne CpG Sequenz angewendet wird, selbst wenn eine solche Sequenz wiederholt in einem verabreichten Oligonukleotid zum Ausdruck kommt.
Unter Berücksichtigung des Oben gesagten existiert die Notwendigkeit, verschiedene CpG Sequenzen zu identifizieren, die zusammen in der Lage sind, eine optimale Immunantwort in Zellen von allen Teilnehmern einer Zivilbevölkerung zu induzieren. Außerdem besteht ein Bedürfnis nach Methoden, die diese CpG Sequenzen für die Behandlung von Krankheiten benutzen. Die vorliegende Erfindung stellt solche CpG Sequenzen und Anwendungsmethoden bereit. Solche und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung, sowie zusätzliche Erfindungseigenschaften gehen aus der hier dargelegten Beschreibung der Erfindung offensichtlich hervor.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein im wesentlichen reines oder isoliertes Oligodesoxynukleotid (ODN) von wenigstens ungefähr 10 Nukleotiden bereit, bestehend aus multiplen CpG Sequenzen, wobei sich wenigstens eine der CpG Sequenzen von einer anderen der multiplen CpG Sequenzen unterscheidet. Die vorliegende Erfindung sieht ebenso einen ODN Abgabekomplex vor sowie eine pharmakologische Zusammensetzung, die aus einem ODN oder multiplen ODN besteht, sowie eine Methode der Induzierung einer Immunantwort durch die Verabreichung eines ODNs oder von multiplen ODN an einen Wirt. Die CpG Sequenzen, die gemäß der Erfindung angewendet werden, sind in Anspruch 1 definiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gründet sich auf die Entdeckung, dass verschiedene CpG Sequenzen, die entweder als multiple individuelle Oligodesoxynukleotide (ODN) formuliert sind, wobei jedes ein einzelnes CpG Motiv umfasst, oder als komplexe ODN bestehend aus multiplen CpG Sequenzen, eine erhöhte Immunantwort in einer breiten Bevölkerung hervorrufen.
Oligodesoxynukleotid
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige ODN bereit. Diese ODN besitzen wenigstens ungefähr 10 Nukleotide und umfassenden multiple (d. h. zwei oder multiple) CpG Sequenzen, wobei sich wenigstens eine der multiplen CpG Sequenzen von einer anderen der multiplen CpG Sequenzen unterscheidet. Eine „CpG Sequenz" oder ein „CpG Motiv" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die ein Cytosin aufweißt, gefolgt von einem Guanin, dass mit einem Phosphatverbund verkettet ist, in dem das Cytosin unmethyliert ist.
Wie in Anspruch 1 dargelegt, umfassen die ODN der vorliegenden Erfindung multiple CpG Sequenzen. Zusätzlich können CpG Sequenzen benutzt werden, die von der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus SEQ ID Nr: 1 bis SEQ ID Nr: 112.
Das ODN der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt im wesentlichen rein oder isoliert. „Im wesentlichen rein" bezieht sich auf ein ODN, das im wesentlichen frei von anderen Materialien ist, speziell von anderen Nukleinsäuren, Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten sowie anderen Materialien, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, wogegen „isoliert" sich auf ein ODN bezieht, das aus seinem natürlichen Umfeld oder Zustand entfernt wurde. Das ODN der vorliegenden Erfindung kann aus einer beliebigen geeigneten Anzahl von Nukleotiden bestehen. Zum Beispiel kann das ODN aus ungefähr 100 Nukleotiden oder weniger bestehen (z. B. aus ungefähr 10 bis 75 Nukleotiden) oder ungefähr 50 Nukleotiden oder weniger (z. B. ungefähr aus 10 bis 40 Nukleotiden).
Die ODNs, die eine humorale Immunantwort induzieren, wie z. B. solche, die – wie in Anspruch 1 dargelegt – eine Sequenz enthalten, enthalten bevorzugt eine Phosphat Rückgrat Modifikation und mehr bevorzugt ist die Phosphat-Rückgrat Modifikation eine Phosphorothioat-Rückgrat-Modifikation (d. h. einer der nicht überbrückenden Sauerstoffe wird mit Schwefel ersetzt, wie in der internationalen Patentanmeldung WO 95/26204 dargelegt). Damit das ODN eine zellvermittelte Immunantwort induzieren und ein Phosphordiester-Rückgrat enthalten kann, wurde das ODN vorzugsweise modifiziert, um eine Degradation zu verhindern.
Jedwede geeignete Modifikation kann in der vorliegenden Erfindung dazu benutzt werden, das ODN gegenüber in vivo Degradation, die zum Beispiel aus exo- oder endonukleotider Digestion herrührt, resistent zu machen. Die Modifikation beinhaltet bevorzugt eine Phosphorothioat-Modifikation. Die Phosphorothioat Modifizierungen können an beiden Termini auftreten, das heißt, die letzten zwei oder drei 5' und/oder 3' Nukleotide können mit Phosphorothioat Verbindungen gekoppelt werden. Das ODN kann ebenso dahingehend modifiziert werden, dass es eine sekundäre Struktur (wie zum Beispiel eine Stammhenkelstruktur) enthält, die gegenüber Degradation resistent ist. Eine weitere Modifizierung, die das ODN gegenüber einer Degradation weniger anfällig macht, ist die Einbeziehung von nicht traditionellen Basen, wie Inosin und Quesin, sowie Acethyl-, Thio-, und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Zytidin, Guanin, Thymin und Uridin. Andere modifizierte Nukleotide beinhalten nicht ionische DNA Analoge, wie Alkyl- oder Arylphosphonate (d. h., der geladene Phosphonat-Sauerstoff wird mit einer Alkyl- oder Arylgruppe ersetzt, wie im US Patent mit der Nummer 4,469,863 dargestellt), Phosphordiester und Alkyl-Phosphortriester (d. h., der geladene Sauerstoffteil wird alkylisiert, wie in US Patent Nummer 5,023,243 und dem europäischen Patent Nummer 0 092574 dargelegt.) ODN, die ein Diol wie z. B. Tetraethylenglykol oder Hexaethylenglykol an einem oder beiden Termini enthalten, haben bewiesen, dass sie gegen eine Degradation resistenter sind.
Oligodeoxynukleotid-Abgabekomplex
Der vorliegende erfindungsgemäße ODN Abgabekomplex kann multiple (das heißt, mehr als ein) im wesentlichen reines oder isoliertes ODN von wenigstens ungefähr 10 Nukleotiden, die eine CpG Sequenz beinhalten – wie in Anspruch 10 dargelegt – sowie ein Targeting-Mittel umfassen, wobei sich wenigstens eine der CpG Sequenzen von einer anderen der multiplen CpG Sequenzen unterscheidet. Deshalb kann der vorliegende erfindungsgemäße ODN Abgabekomplex multiple ODN enthalten, die wiederum eine einzelne CpG Sequenz mit wenigstens einer dieser multiplen ODN enthalten, bestehend aus einer CpG Sequenz, die sich von den CpG Sequenzen unterscheidet, bestehend aus einem anderen ODN innerhalb des Komplexes.
Außerdem kann der vorliegende erfindungsgemäße ODN Abgabekomplex ein einzelnes ODN oder multiple ODN enthalten, die multiple verschiedene CpG Sequenzen und ein Targeting-Mittel beinhalten. Deshalb kann der vorliegende erfindungsgemäße ODN Abgabekomplex aus entweder einem einzelnen ODN oder multiplen (das heißt, mehr als einem) ODN bestehen.
Jedes geeignete Targeting-Mittel (das heißt ein Molekül, das zu einer höheren Affinitätsbindung an eine Zielzelle führt) kann innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Geeignete Targeting-Mittel sind innerhalb des bekannten Stands der Technik vorhanden. Der ODN Abgabekomplex kann mit dem Targeting-Mittel durch eine Vielzahl von Verkupplungs- oder Querverbindungsmitteln, wie z. B. Protein A, Carbodiamid und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) Propionat (SPDP) assoziiert (wie z. B. ionisch oder kovalent damit verbunden oder darin eingekapselt) sein. Beispiele für ODN Abgabekomplexe beinhalten ODNs, die mit einem Sterol (wie z. B. Cholesterin), einem Lipid (wie zum Beispiel einem kationischen Lipid, Virosom oder Liposom) und einem Zielzellen-spezifischen Bindemittel (wie z. B. einem Liganten, der von dem Zielzellen-spezifischen Rezeptor erkannt wird) assoziiert sind. Bevorzugte Komplexe müssen in vivo ausreichend stabil sein, um ein wesentliches Entkoppeln vor der Vereinnahmung durch die Zielzelle zu verhindern; jedoch können diese Komplexe unter geeigneten Umständen so abspaltbar sein, dass das ODN in einer funktionalen Form abgegeben werden kann.
Pharmakologische Zusammensetzung
Die vorliegende erfindungsgemäße Zusammensetzung kann multiple im wesentlichen reine oder isolierte ODNs von mindestens ungefähr 10 Nukleotiden bestehend aus einer CpG Sequenz und einem pharmakologisch akzeptablen Träger enthalten, wobei sich mindestens eine der CpG Sequenzen von einer anderen der multiplen CpG Sequenzen unterscheidet. Deshalb kann die vorliegende erfindungsgemäße pharmakologische Zusammensetzung multiple ODNs enthalten, bestehend aus einer einzelnen CpG Sequenz, wobei mindestens eine dieser multiplen ODNs eine CpG Sequenz enthält, die sich von der CpG Sequenz unterscheidet, die in einem anderen ODN innerhalb der Zusammensetzung enthalten ist.
Außerdem kann die gegenwärtig erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein einzelnes ODN oder multiple ODN enthalten, die multiple verschiedene CpGs Sequenzen umfassen sowie einen pharmakologisch akzeptablen Träger. Deshalb kann die gegenwärtige erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung entweder ein einzelnes ODN oder multiple (das heißt mehr als ein) ODN umfassen.
Pharmakologisch akzeptable Träger (wie zum Beispiel physiologisch oder pharmazeutisch akzeptable Träger) sind dem Stand der Technik bekannt. Die vorliegende erfindungsgemäße pharmakologische Zusammensetzung ermöglicht den Gebrauch von einem oder multiplen vorliegenden erfindungsgemäßen ODN, sowohl in vivo als auch ex vivo. Eine solche Zusammensetzung kann zur Abgabe von aktiven Wirkstoffen an alle geeigneten Wirte geeignet sein, wie z. B. an einen Patienten zur medizinischen Verabreichung, und kann in einer Art und Weise hergestellt werden, die bereits bekannt ist, wie zum Beispiel durch Prozesse des konventionellem Mischens, Auflösens, Granulierens, Drageedrehens, Verreibens, Emulgierens, Verkapselns, Einschließens und Lyophilisierens.
Pharmakologische Zusammensetzungen zum Gebrauch im Einklang mit der vorliegenden Erfindung können in einer konventionellen Art und Weise formuliert werden, indem ein oder multiple pharmakologisch (z. B. physiologisch oder pharmazeutisch) akzeptable/r Träger benutzt wird/werden, bestehend aus Hilfsstoffen sowie wahlweisen Hilfsmitteln, die das Verarbeiten der aktiven Zusammensetzung zu Präparaten ermöglichen, die pharmazeutisch verwendet werden können. Die ordnungsgemäße Formulierung hängt vom gewählten Verabreichungsweg ab. Somit kann zum Zwecke der Injektion der Wirkstoff in einer wässrigen Lösung formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch verträglichen kompatiblen Puffern. Zum Zweck der Verabreichung durch die Schleimhaut können in der Formulierung Eindringmittel benutzt werden, die sich für die Barriere, die durchdrungen werden soll, eignen. Solche Eindringmittel sind dem Stand der Technik bekannt. Zur oralen Verabreichung kann der Wirkstoff mit Trägern kombiniert werden, die zum Einschluss in Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gelen, Sirup, Breien, Suspensionen und dergleichen geeignet sind. Zur Verabreichung durch Inhalieren wird der Wirkstoff praktischerweise in der Form einer Spraydarreichung bestehend aus Druckbehältern oder Zerstäubern geliefert, wobei ein geeignetes Treibmittel benutzt wird. Der Wirkstoff kann zur parenteralen Verabreichung durch Injektion formuliert werden, wie zum Beispiel durch Bolu-Injektion oder Tropfinfusion. Solche Zusammensetzungen können solche Formen als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsmittel wie suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel enthalten. Weitere pharmakologische Träger oder Vehikel sind dem Stand der Technik bekannt.
Methode zur Induzierung einer Immunantwort
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann die Verabreichung von multiplen im wesentlichen reinen oder isolierten ODN von mindestens ungefähr 10 Nukleotiden, bestehend aus einer CpG Sequenz an einen Wirt enthalten, um bei dem Wirt eine Immunantwort zu induzieren, wobei sich mindestens eine der CpGs Sequenzen von einer anderen der multiplen CpGs Sequenzen unterscheidet. Deshalb kann die vorliegende erfindungsgemäße Methode die Verabreichung einer Vielzahl von ODN an einen Wirt beinhalten, bestehend aus einer einzelnen CpG Sequenz, wobei mindestens eine dieser multiplen ODN eine CpG Sequenz enthält, die sich von den CpG Sequenzen unterscheidet, die in einem weiteren ODN enthalten sind, das einem Wirt verabreicht wird.
Außerdem kann die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort die Verabreichung eines einzelnen ODN oder multipler ODNs an einen Wirt beinhalten, wobei die ODNs aus multiplen verschiedenen CpG Sequenzen bestehen, um beim Wirt eine Immunantwort zu induzieren. Deshalb kann die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort die Verabreichung entweder eines einzelnen ODN oder multiplen (das heißt mehr als einem) ODN an einen Wirt enthalten, um beim Wirt eine Immunantwort hervorzurufen.
Die Verabreichung kann durch alle geeigneten Methoden geschehen. Zum Beispiel kann/können das ODN oder die ODNs in vivo oder ex vivo verabreicht werden. Vorzugsweise wird/werden das ODN oder die ODNs an ein Säugetier und speziell an einen Menschen in vivo dargereicht. Wahlweise kann/können das ODN oder die ODNs innerhalb eines größeren Nukleinsäuremoleküls, Proteins, Kohlenwasserstoffs oder Lipids enthalten oder damit konjugiert sein. Sobald dieses Molekül verabreicht wurde, müssen die CpG Sequenzen auf der Oberfläche offen gelegt werden, um eine Immunantwort zu induzieren. Beispiele von geeigneten Nukleinsäuremolekülen beinhalten Fusions- oder Chimär-Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenwasserstoffe und Lipide. Das ODN oder die ODN können ebenso zusammen mit einer anderer Nukleinsäure, einem anderen Protein, Kohlenwasserstoff oder Lipid verabreicht werden. Co-Verabreichung kann so aussehen, dass das ODN oder die ODN entweder zuvor oder im wesentlichen gleichzeitig oder nach der Verabreichung der anderen Nukleinsäure, des anderen Proteins, des anderen Kohlenwasserstoffs oder des anderen Lipids verabreicht werden. Vorzugsweise werden das ODN oder die ODN zur im wesentlichen selben Zeit wie die andere Nukleinsäure, das andere Protein, der andere Kohlenwasserstoff oder das andere Lipid verabreicht.
Nach der Verabreichung des ODN oder der ODN wird angenommen, ohne dass eine Bindung an eine bestimmte Theorie beabsichtigt wird, dass die ODN anfänglich mit Zellen reagiert, in denen Antigene vorhanden sind, (z. B. makrophage und dendritische Zellen). Diese Zellen setzen sodann Cytokine frei, die natürliche Killerzellen (NK) aktivieren. Im Wirt tritt sodann entweder eine durch Zellen vermittelte oder eine humorale Immunantwort auf.
Die durch Zellen vermittelte oder lokale Immunantwort wird durch T-Zellen produziert, die das Vorhandensein von eindringenden Pathogenen mittels eines Erkennungssystems entdecken können, das als T-Zellenantigenrezeptor bezeichnet wird. Nach der Entdeckung des Antigens dirigieren die T-Zellen die Freisetzung von multiplen T-Zellen Cytokinen, einschließlich IL-2, IL-3, IFN-γ, TNF-β, GM-CSF und hohe Mengen TNF-α sowie Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES. IL-2 ist ein T-Zellen Wachstumsfaktor, der die Produktion von zusätzlichen T-Zellen fördert, die in Bezug auf das spezielle Antigen sensitiv sind. Diese Produktion stellt ein Klon der T-Zellen dar. Die sensibilisierten T-Zellen verbinden sich mit Zellen, die das Antigen enthalten. T-Zellen führen eine Vielzahl an regulierenden und abwehrenden Funktionen aus und spielen eine zentrale Rolle bei Immunantworten. Einige T-Zellen antworten auf die Stimulierung zur Produktion einer durch Zellen vermittelten Immunantwort, indem sie als Killerzellen agieren und die eigenen Zellen des Wirts töten, wenn diese infiziert oder kanzerös sind und somit als fremd angesehen werden. Einige T-Zellen antworten, indem sie B-Zellen stimulieren, wohingegen andere T-Zellen durch das Unterdrücken einer Immunantwort antworten. Wenn eine durch Zellen vermittelte Immunantwort induziert wird, werden bevorzugt Nicht-B-Zellen aktiviert, mehr bevorzugt werden Cytokine produziert und am meisten bevorzugt wird IFN-γ produziert.
Die humorale oder systemische Immunantwort hängt von der Fähigkeit der B-Zellen ab, spezifische Antigene zu erkennen. Der Mechanismus, mittels derer die B-Zellen Antigene erkennen erfolgt durch spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der B-Zellen. Wenn sich ein Antigen an die Rezeptorenseite einer B-Zelle anheftet wird die B-Zelle zur Teilung stimuliert. Die Tochterzellen werden zu Plasmazellen, die zu den angehefteten Antigenen komplementäre Antikörper herstellen. Jede Plasmazelle produziert tausende Antikörpermoleküle pro Minute, die in die Blutkreislauf entlassen werden. Viele B-Zellen scheinen durch die Helfer T-Zellen und Unterdrücker T-Zellen reguliert zu werden und produzieren verschiedene Cytokine, z. B. IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF und geringe Mengen an TNF-α. Helfer T-Zellen stimulieren B-Zellen zur Produktion von Antikörpern gegen die Antigene, während die Unterdrücker T-Zellen die Produktion der Antikörper inhibieren. Einige B-Zellen sind jedoch T-Zellen unabhängig und benötigen keine Stimulierung durch die T-Zellen. Wenn eine humorale Immunantwort induziert wird, werden bevorzugt B-Zellen aktiviert, mehr bevorzugt wird IL-6 produziert und am meisten bevorzugt werden Antikörper produziert.
Außerdem ermöglicht die Induzierung einer bestimmten Art der Immunantwort möglicherweise eine Immunregulierung, weil die Regulierung nach oben durch eine bestimme Art der Immunantwort eventuell eine Regulierung nach unten bei einer anderen Art der Immunantwort verursacht. Diese Immunregulierung ermöglicht die Anpassung oder das Angleichen der Art der Immunantwort bei der Verabreichung von ODN.
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode der Induzierung einer Immunantwort kann zur Behandlung, Verhinderung oder Vorbeugung aller geeigneten allergischen Reaktionen verwendet werden. Wahlweise kann die vorliegende erfindungsgemäße Methode zusammen mit allen geeigneten Antiallergika verwendet werden. Eine Allergie bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf eine erworbene Hypersensitivität in Bezug auf eine Substanz (z. B. ein Allergen). Allergische Zustände beinhalten Ekzeme, allergische Rhinitis oder Coryza (allergischer Schnupfen), Heuschnupfen, Bronchialasthma, Utikaria (Nesselsucht), Nahrungsmittelallergien und sonstige atopische Zustände. Die Liste der Allergene ist umfangreich und beinhaltet Pollen, Insektengifte, tierische Hautschuppen, Staub, Pilzsporen und Arzneimittel (z. B. Penicillin). Beispiele für natürliche, tierische und pflanzliche Allergene finden sich in der Internationalen Patentanmeldung WO 98/18810 . Die vorliegende erfindungsgemäße Methode der Induzierung einer Immunantwort wird bevorzugt zur Behandlung von allergischem Asthma benutzt. Geeignete Antiallergika beinhalten diejenigen Substanzen, die zur Behandlung der verschiedenen, oben beschriebenen allergischen Zustände verabreicht werden, von denen sich Beispiele im Physicians' Desk Reference (1998) (Handbuch für Ärzte) finden lassen.
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann zur Behandlung aller geeigneten Krebserkrankungen benutzt werden. Wahlweise kann die vorliegende erfindungsgemäße Methode in Kombination mit allen geeigneten Antikrebsmitteln verwendet werden. Geeignete Krebserkrankungen beinhalten Gehirnkrebs, Lungenkrebs (z. B. kleine Zellen und nicht-keine Zellen), Eierstockkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs und Dickdarmkrebs, sowie Karzinome und Sarkome. Die vorliegende erfindungsgemäße Methode wird bevorzugt zur Behandlung eines soliden Tumorkrebses benutzt. Geeignete Antikrebsmittel beinhalten diejenigen Substanzen, die zur Behandlung der oben beschriebenen verschiedenen Zustände verabreicht werden, von denen sich Beispiele im Physicians' Desk Reference (1998) (Handbuch für Ärzte) finden lassen.
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann zur Verbesserung der Wirksamkeit aller geeigneten Impfstoffe benutzt werden. Geeignete Impfstoffe beinhalten diejenigen, die gegen Hepatitis A, B und C gerichtet sind, von denen sich Beispiele im Physicians' Desk Reference (1998) (Handbuch für Ärzte) finden lassen sowie DNA Impfstoffe, die gegen HIV und Malaria gerichtet sind. Siehe grundsätzlich D. Klinman et al., CpG Motifs as Immune Adjuvants, 17 Vaccine 19 (1999); M. J. McCluskie and H. L. Davis, CpG DNA is a Potent Enhancer of Systemic & Mucosal Immune response Against Hepatitis B Surfase Antigen with Intra-nasal Administration to Mice, 161 J. Immun. 4463 (1998).
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann zur Behandlung, Verhinderung oder Vorbeugung aller geeigneten Krankheiten benutzt werden, die mit dem Immunsystem zusammenhängen. Bevorzugte Krankheiten, die mit dem Immunsystem zusammenhängen, sind Autoimmunerstörungen und Immunsystem Defizienz, z. B. Lupus Erythematosus („roter Wolf") und Autoimmunkrankheiten wie z. B. rheumatoide Arthritis und Multiple Sklerose. Immunsystem Defizienzen beinhalten diejenigen Krankheiten und Störungen, bei denen das Immunsystem nicht zur normalen Kapazität arbeitet oder bei denen es hilfreich wäre, die Immunsystemantwort zu verstärken.
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann mit jeder geeigneten Antisinntherapie verwendet werden. Die vorliegende erfindungsgemäße Methode kann wahlweise in Kombination mit jeder geeigneten Antisinntherapie verwendet werden. Geeignete Antisinnmittel sind solche, die sich entweder mit der DNA oder RNA verbinden und deren Funktion durch Sperrung des Sequenzausdrucks blockieren, an den die Antisinnmittel gebunden sind. Siehe grundsätzlich H. Lonnberg et al., Towards Genomic drug Therapy with Antisense Oligonucleotides, 28 Ann. Med. 511 (1996); A. Alama et al., Antisense Oligonucleotides as Therapeutic Agents, 36 Pharmacol. Res. 171 (1997); K. J. Scanlon et al., Oligonucleotide-Mediated Modulation of Mammalian Gene Expressions, 9 FASER J. 1288 (1995): R. Oberbauer, Not Non-Sense but Antisense – Applications of Antisense Oligonucleotides in Different Fields of Medicine, 109 Wien Klien. Wochenschr. 40 (1997).
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann zur Behandlung, Verhinderung oder Vorbeugung aller geeigneten Infektionen benutzt werden. Die vorliegende erfindungsgemäße Methode kann wahlweise in Kombination mit jedem geeigneten Antiinfektionsmittel verwendet werden. Beispiele für Infektionen sind Tularämi (Hasenpest), Schistosomiasis, Tuberkulose, AIDS, Malaria und Leishmanniose. Beispiele für geeignete infektiöse Viren, Bakterien, Pilze und sonstige Organismen (z. B. Protista) finden sich in der Internationalen Patentanmeldung WO 98/18810 . Geeignete Antiinfektiöse Mittel beinhalten diejenigen Substanzen, die zur Behandlung von verschiedenen Zuständen verabreicht werden, die anderenorts beschrieben werden und von denen sich Beispiele im Physicians' Desk Reference (1998) (Handbuch für Ärzte) finden lassen.
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode zur Induzierung einer Immunantwort kann zur Behandlung, Verhinderung oder Vorbeugung der Symptome benutzt werden, die durch das Ausgesetztsein gegenüber Biokriegsführungsmitteln entstehen. Geeignete Biokriegsführungsmittel beinhalten die natürlich auftretenden biologischen Mittel, die in den Labors spezifisch modifiziert wurden. Die Modifizierung dieser Mittel hat diese oftmals derart verändert, dass keine bekannte Behandlung existiert. Beispiele umfassen Ebola, Anthrax (Milzbrand) und Listeria. Im Zuge der Vorbeugung der Symptome nach dem Ausgesetztsein heilt die Verwendung der vorliegenden erfindungsgemäßen ODNs den Patienten möglicherweise nicht, kann aber dessen Leben ausreichend verlängern, sodass andere Behandlungen angewendet werden können.
Die vorliegende erfindungsgemäße Methode wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele beschrieben. Diese Beispiele bezwecken lediglich die Illustration der Erfindung und bezwecken in keinster Weise die Begrenzung des Anwendungsbereichs der Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1
Das folgende Beispiel zeigt die unterschiedliche Immunantwort, die in vitro bei verschiedenen Spender nach der Verabreichung eines ODN induziert, bestehend aus einer einzelnen CpG Sequenz. Die Induzierung einer Immunantwort wurde anhand der Produktion von Cytokinen IL-6 und IFN-γ und Zellproliferation in menschlichen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC) gemessen, das von individuellen Spender isoliert wurde.

PBMC wurde isoliert, wie anderweitig beschrieben (Z. K. Ballas et al., 85 J. Allergy Clin. Immunol. 453 (1990); Z. K. Ballas und W. Rasmussen, 45 J. Immunol. 1039 (1990); Z. K. Ballas und W. Rasmussen, 150 J. Immunol. 17 (1993)). ODNs wurden auf einem DNA Synthesizer synthetisiert (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) wie anderweitig beschrieben (Beacage and Caruthers, Deoxynucleoside Phosphoramidites – A New Class of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis, 22 Tetrahedron Letters 1859 (1981)). In einigen ODNs wurden die normalen DNA Rückgrat Phosphordiesterase Kopplungen durch Phosphorothioate Verbindungen ersetzt, wie anderweitig beschrieben. (Agrawal et al., 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2620 (1997); Agrawal 14 TIB TECH 376 (1996)). Um die Degradation der ODNs zu reduzieren, enthielten diejenigen, die kein vollständiges phosphorothioates Rückgrat hatten, phosphorothioate Kopplungen an den 5' und 3' Enden. Zellen von anderen Spender wurden für ungefähr 72 Stunden mit verschiedenen ODNs inkubiert. IL-6 und IFN-γ Level wurden durch ELISA unter Benutzung von Anti-IL-6 und Anti-IFN-γ Antikörpern festgestellt, wie anderweitig beschrieben (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998). Zellproliferation wurde durch [³H] Thymidin Einlagerung festgelegt, wie anderweitig beschrieben (Liang et al., 98 J. Clin. Invest. unter 1121). IL-6 Level werden in Tabelle 1 dargelegt: Induzierung einer Immunantwort (IL-6); IFN-γ Level werden in Tabelle 5 dargelegt: Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ), und die Zellproliferation wird in Tabelle 6 dargelegt: Induzierung einer Immunantwort (Zellproliferation). TABELLE 1: Induzierung einer Immunantwort (IL-6)

	3	4	7	8	15	16	17	18	19	23	24	25	26	27
SEQ ID NO: 1	35	53	19	12	9	2	8	6	33	15	5	40	13	3
SEQ ID NO: 18	2	3	25	65	--	--	--	--	--	8	3	3	1	1
SEQ ID NO: 20	50	45	9	43	5	9	20	20	20	--	12	57	13	3
SEQ ID NO: 98	18	42	9	41	60	80	25	11	22	17	6	12	2	1
SEQ ID NO: 105	--	--	--	--	--	--	--	--	--	13	7	16	3	1

TABELLE 2: Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ)

	3	4	5	9	13	14	15	17
SEQ ID NO: 40	154	64	6	2	5	11	15	3
SEQ ID NO: 42	92	56	419	28	8	4	4	8
SEQ ID NO: 43	13	3	269	93	15	6	5	8
SEQ ID NO: 100	22	2	16	2	9	9	9	6
SEQ ID NO: 101	3	2	15	25	0	16	5	5
SEQ ID NO: 102	--	--	0	1	60	250	6	3
SEQ ID NO: 103	--	--	4	1	3	2	8	5
SEQ ID NO: 104	--	--	4	1	2	1	3	4

TABELLE 3: Induzierung einer Immunantwort (Zellproliferation)

	1	2	3	4	20	21	22
SEQ ID NO: 1	22	36	33	9	18	15	14
SEQ ID NO: 9	5	17	16	11	18	18	13
SEQ ID NO: 10	9	10	20	25	14	23	12
SEQ ID NO: 12	6	8	10	19	4	7	6
SEQ ID NO: 15	9	47	11	13	14	17	12
SEQ ID NO: 31	2	15	10	16	6	8	7
SEQ ID NO: 45	3	7	16	15	10	16	10
SEQ ID NO: 50	3	6	10	9	6	6	5
SEQ ID NO: 54	4	5	10	9	5	5	4

Die vorbezeichneten Daten demonstrieren die Induzierung einer Immunantwort auf ein ODN bestehend aus verschiedenen Sequenzen in menschlichem PBMC, das aus individuellen Spender isoliert wurde. Diese Daten demonstrieren insbesondere, dass eine einfache Sequenz eine unterschiedliche Immunantwort bei verschiedenen Spender induziert, wie dies durch ein z. B. in Tabelle 4 gezeigtes ODN dargelegt wird, bestehend aus IL-6 Level induziert durch SEQ ID Nr. 98 im Bereich von 2 bis 80; sowie in Tabelle 5 gezeigtes ODN, bestehend aus IFN-γ Level induziert durch SEQ ID Nr. 42, im Bereich von 4 bis 419, und in Tabelle 6 gezeigtes ODN bestehend aus Zellproliferation induziert durch SEQ ID Nr. 15 im Bereich 9 bis 47.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel zeigt die unterschiedliche Immunantwort, die in vitro bei verschiedenen Spendern induziert wird nachdem ein ODN verabreicht wird, bestehend aus einer einzelnen CpG Sequenz. Die Induzierung einer Immunantwort wurde anhand der Produktion von Cytokinen IL-6 und IFN-γ in menschlichem PBMC gemessen, das von individuellen Spender isoliert wurde und mit nicht stimuliertem PBMC derselben Spender verglichen.

Menschliches PBMC wurde isoliert, wie im Beispiel 1 beschrieben. ODNs wurden auf einem DNA Synthesizer synthetisiert (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), wie in Beispiel 1 beschrieben. In einigen ODNs wurden die normalen DNA Rückgrat Phosphordiesterase Kopplungen durch Phosphorothioate Verbindungen ersetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Um die Degradation der ODNs zu reduzieren, enthielten diejenigen, die kein vollständiges phosphorothioates Rückgrat hatten, phosphorothioate Kopplungen an den 5' und 3' Enden. Zellen wurden für ungefähr 72 Stunden mit verschiedenen ODNs inkubiert. IL-6 und IFN-γ Level wurden durch ELISA unter Benutzung von Anti-IL-6 und Anti-IFN-γ Antikörpern festgestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Prozentsatz an Spender, der durch die verschiedenen ODNs induziert wurde, ist für IL-6 mindestens 3-fach und für IFN-γ 5-fach und wird für IL-6 Level in Tabelle 4 dargelegt: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IL-6) sowie für IFN-γ Level in Tabelle 5: Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ). Außerdem wurde ein Profil für einige Spender erstellt, bei dem eine mehr als 10-fache Erhöhung durch „++" und eine mehr als 3-fache Verringerung für IL-6 und eine mehr als 5-fache Erhöhung für IFN-γ mit „+" dargestellt ist und alle Level unter diesem Wert mit „-„ dargestellt werden. Diese Profile werden in Tabelle 6 für IL-6 dargestellt: Heterogenität bei der Induzierung einer Immunantwort (IL-6) sowie für IFN-γ in Tabelle 7: Heterogenität bei der Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ). TABELLE 4: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IL-6)

	Prozent Induzierung	Anzahl der Spender
SEQ ID NO: 1	69%	26
SEQ ID NO: 109	67%	9
SEQ ID NO: 20	65%	34
SEQ ID NO: 7	49%	39
SEQ ID NO: 108	47%	38
SEQ ID NO: 98	44%	39
SEQ ID NO: 110	30%	10
SEQ ID NO: 111	26%	19
SEQ ID NO: 112	7%	29
		Anzahl der Spender

TABELLE 5: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ)

	Prozent Induzierung	Anzahl der Spender
SEQ ID NO: 43	93%	42
SEQ ID NO: 42	91%	23
SEQ ID NO: 106	87%	23
SEQ ID NO: 32	82%	17
SEQ ID NO: 40	79%	19
SEQ ID NO: 103	58%	12
SEQ ID NO: 102	57%	28
SEQ ID NO: 107	10%	31

	Prozent Induzierung	Anzahl der Spender
SEQ ID NO: 68	11%	19

TABELLE 6: Heterogenität bei der Induzierung einer Immunantwort (IL-6)

	1	2	3	4	5	6	7	8
SEQ ID NO: 20	--	++	+	+	+	+	++	++
SEQ ID NO: 7	-	+	+	--	++	+	++	+
SEQ ID NO: 1	-+	++	+	--	+	+	++	--

TABELLE 7: Heterogenität bei der Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ)

	1	2	3	4	5	6	7	8
SEQ ID NO: 40	+-	++	--	--	--	+	++	+
SEQ ID NO: 32	-	++	+	+	++	+	--	--
SEQ ID NO: 102	--	--	++	++	++	+	--	++

Die vorbezeichneten Daten demonstrieren die Induzierung einer Immunantwort auf ein ODN bestehend aus verschiedenen Sequenzen in menschlichem PBMC, das aus individuellen Spender isoliert wurde. Diese Daten demonstrieren insbesondere, dass eine einfache Sequenz eine unterschiedliche Immunantwort bei verschiedenen Spendern induziert, wie dies durch einen z. B. in Tabelle 4 dargestellten induzierten Prozentsatz von Spender verdeutlicht wird, der zwischen 7% und 69% lag, gemessen durch die IL-6 Produktion. In Tabelle 5 lag der Prozentsatz der induzierten Spender zwischen 11% und 93%, gemessen durch die IFN-γ Produktion. Weiterhin bestand wesentliche Heterogenität bei der Induzierung einer Immunantwort bei verschiedenen Spender, wie in Tabelle 6 und 7 demonstriert.
Beispiel 3
Das folgende Beispiel zeigt die in vitro Induzierung einer Immunantwort nachdem ein multiples ODN verabreicht wird, bestehend aus einer CpG Sequenz. Die Induzierung einer Immunantwort wurde anhand der Produktion von Cytokinen IL-6 und IFN-γ und der Zellproliferation in menschlichem PBMC gemessen, das von individuellen Spender isoliert wurde.

Menschliches PBMC wurde isoliert, wie im Beispiel 1 beschrieben. ODNs wurden auf einem DNA Synthesizer synthetisiert (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), wie in Beispiel 1 beschrieben. In einigen ODNs wurden die normalen DNA Rückgrat Phosphordiesterase Kopplungen durch Phosphorothioate Verbindungen ersetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Um die Degradation der ODNs zu reduzieren, enthielten diejenigen, die kein vollständiges phosphorothioates Rückgrat hatten, phosphorothioate Kopplungen an den 5' und 3' Enden. Zellen wurden für ungefähr 72 Stunden mit verschiedenen ODNs inkubiert. IL-6 und IFN-γ Level wurden durch ELISA unter Benutzung von Anti-IL-6 und Anti-IFN-γ Antikörpern festgestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Zellproliferation wurde durch [³H] Thymidine Inkorporation festgestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt: Induzierung einer Immunantwort auf multiple ODN. TABELLE 8: Induzierung einer Immunantwort auf multiple ODN

	IL-6 (ELISA)	IFN-γ (ELISA)	Proliferation ([³H]T)
Spender 1
SEQ ID NO: 1	12.0	2.3	13.0
SEQ ID NO: 43	7.0	9.0	1.6
SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 43	27	40.0	19.9
Spender 2
SEQ ID NO: 1	5.0	13.0	37.7
SEQ ID NO: 43	2.0	7.0	1.3
SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 43	9.0	33.0	68.6
Spender 3
SEQ ID NO: 1	10.0	8.0	13.1
SEQ ID NO: 43	1.0	12.0	1.3
SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 43	8.0	42.0	17.5

Die vorbezeichneten Daten demonstrieren die Induzierung einer Immunantwort nach der Verabreichung von multiplen ODN bestehend aus verschiedenen CpG Sequenzen in menschlichem PBMC, das von verschiedenen Spender isoliert wurde. Diese Daten demonstrieren insbesondere, dass multiple ODNs synergetisch eine Immunantwort induzieren, demonstriert z. B. durch die Erhöhung von 26,6% gemessen durch die Zellproliferation, 29,6% gemessen durch IL-6 Level und 71,7% gemessen durch IFN-γ Level nach Verabreichung einer Kombination von einem ODN bestehend aus SEQ ID Nr: 1 und einem ODN bestehend aus SEQ ID Nr: 43 an Spender 1 im Vergleich zu der kombinierten Immunantwort auf jedes getrennt verabreichte ODN.
Beispiel 4
Das folgende Beispiel zeigt die in vitro Induzierung einer Immunantwort nachdem ein multiples ODN verabreicht wird, bestehend aus einer CpG Sequenz. Die Induzierung einer Immunantwort wurde anhand der Produktion von Cytokinen IL-6 und IFN-γ in menschlichem PBMC gemessen, das von individuellen Spendern isoliert wurde und mit nicht stimuliertem PBMC desselben Spenders verglichen.

Menschliches PBMC wurde isoliert, wie im Beispiel 1 beschrieben. ODNs wurden auf einem DNA Synthesizer synthetisiert (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), wie in Beispiel 1 beschrieben. In einigen ODNs wurden die normalen DNA Rückgrat Phosphordiesterase Kopplungen durch Phosphorothioate Verbindungen ersetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Um die Degradation der ODNs zu reduzieren, enthielten diejenigen, die kein vollständiges phosphorothioates Rückgrat hatten, phosphorothioate Kopplungen an den 5' und 3' Enden. Zellen wurden für ungefähr 72 Stunden mit verschiedenen ODNs inkubiert. IL-6 und IFN-γ Level wurden durch ELISA unter Benutzung von Anti-IL-6 und Anti-IFN-γ Antikörpern festgestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Prozentsatz an Spender, der durch die verschiedenen multiplen ODNs induziert wurde, ist für IL-6 mindestens 3-fach und für IFN-γ 5-fach und wird für IL-6 Level in Tabelle 9 dargelegt: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IL-6) sowie für IFN-γ Level in Tabelle 10: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ). TABELLE 9: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IL-6) auf multiple ODN

	Prozent Induzierung	Anzahl der Spender
SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 108	100%	4
SEQ ID NO: 7 + SEQ ID NO: 20 + SEQ ID NO: 98	100%	2
SEQ ID NO: 20 + SEQ ID NO: 108 + SEQ ID NO: 98	100%	2
SEQ ID NO: 7 + SEQ ID NO: 20 + SEQ ID NO: 1	80%	5
SEQ ID NO: 20 + SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 108	80%	5
SEQ ID NO: 7 + SEQ ID NO: 20 + SEQ ID NO: 108	60%	10
SEQ ID NO: 7 + SEQ ID NO: 108 + SEQ ID NO: 98	38%	16

TABELLE 10: Prozent Induzierung einer Immunantwort (IFN-γ) auf multiple ODN

	Prozent Induzierung	Anzahl der Spender
SEQ ID NO: 43 + SEQ ID NO: 40 + SEQ ID NO: 106	100%	5
SEQ ID NO: 32 + SEQ ID NO: 40 + SEQ ID NO: 106	100%	5
SEQ ID NO: 43 + SEQ ID NO: 102 + SEQ ID NO: 106	89%	19
SEQ ID NO: 32 + SEQ ID NO: 40 + SEQ ID NO: 42	80%	5
SEQ ID NO: 32 + SEQ ID NO: 102 + SEQ ID NO: 106	40%	5
SEQ ID NO: 43 + SEQ ID NO: 40 + SEQ ID NO: 42	40%	5

Die vorbezeichneten Daten demonstrieren die Induzierung einer Immunantwort nach der Verabreichung von multiplen ODN bestehend aus verschiedenen CpG Sequenzen in menschlichem PBMC, das von verschiedenen Spender isoliert wurde. Diese Daten demonstrieren insbesondere, dass multiple ODNs synergetisch eine Immunantwort induzieren, wie z. B. durch Tabelle 9 demonstriert, wo der Induzierungsprozentsatz bei zwei der multiplen ODN auf 100% erhöht war, gemessen anhand der IL-6 Produktion. Dies wird ebenso in Tabelle 10 gezeigt, wo der Prozentsatz der Induzierung bei drei multiplen ODN auf 100% erhöht war, gemessen anhand der IFN-γ Produktion.
Beispiel 5
Das folgende Beispiel zeigt die in vitro Induzierung einer Immunantwort nachdem ein einfaches ODN verabreicht wird, bestehend aus multiplen verschiedenen CpG Sequenzen. Die Induzierung einer Immunantwort wurde anhand der Produktion von Cytokinen IL-6 und IFN-γ und der Zellproliferation in menschlichem PBMC gemessen, das von individuellen Spender isoliert wurde.

Menschliches PBMC wurde isoliert, wie im Beispiel 1 beschrieben. ODNs wurden auf einem DNA Synthesizer synthetisiert (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), wie in Beispiel 1 beschrieben. In einigen ODNs wurden die normalen DNA Rückgrat Phosphordiesterase Kopplungen durch Phosphorothioate Verbindungen ersetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Um die Degradation der ODNs zu reduzieren, enthielten diejenigen, die kein vollständiges phosphorothioates Rückgrat hatten, phosphorothioate Kopplungen an den 5' und 3' Enden. Zellen wurden für ungefähr 72 Stunden mit verschiedenen ODNs inkubiert. IL-6 und IFN-γ Level wurden durch ELISA unter Benutzung von Anti-IL-6 und Anti-IFN-γ Antikörpern festgestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Zellproliferation wurde durch [³H] Thymidine Inkorporation festgestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt: Induzierung einer Immunantwort auf ein einzelnes ODN bestehend aus multiplen verschiedenen CpG Sequenzen. TABELLE 11: Induzierung einer Immunantwort auf ein einzelnes ODN bestehend aus multiplen verschiedenen CpG Sequenzen

	IL-6 (ELISA)	IFN-γ (ELISA)	Proliferation ([³H]T)
Spender 1
SEQ ID NO: 1	5	3	18
SEQ ID NO: 43	3	4	3
SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 43	23	7	29
Spender 2
SEQ ID NO: 1	5	3	31
SEQ ID NO: 43	2	4	4
SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 43	15	6	57

Die vorbezeichneten Daten demonstrieren die Induzierung einer Immunantwort nach der Verabreichung eines einzelnen ODN bestehend aus multiplen verschiedenen CpG Sequenzen in menschlichem PBMC, das von verschiedenen Spender isoliert wurde. Diese Daten demonstrieren insbesondere, dass ein einzelnes ODN bestehend aus multiplen verschiedenen CpG Sequenzen synergetisch eine Immunantwort induziert, demonstriert z. B. durch die Erhöhung der IL-6 Level auf 65,2% bei Spender 1 und 53,3% bei Spender 2 nach Verabreichung eines einzelnen ODN bestehend aus SEQ ID Nr: 1 und SEQ ID Nr.: 43 im Vergleich zu der kombinierten Immunantwort auf ein einzelnes ODN bestehend aus entweder SEQ ID Nr: 1 oder SEQ ID Nr: 43 bei getrennter Verabreichung.

213 Künstliche Sequenz
223 Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA

Sequenzliste

Claims

Oligodesoxynukleotid (ODN), das mehrere CpG-Sequenzen umfaßt, wobei die ODN die CpG-sequenzen umfasst, die als SEQ ID NR: 43 und SEQ ID NR: 40 und SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 32 und SEQ ID NR: 40 und SEQ ID NR: 106 dargestellt werden.
ODN nach Anspruch 1, wobei das ODN eine Phosphat-Rückgrat-Modifikation aufweist.
ODN nach Anspruch 2, wobei die Phosphat-Rückgrat-Modifikation eine Phosphorthioat-Rückgrat-Modifikation ist.
ODN nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das ODN modifiziert ist, um einer Degradation vorzubeugen.
ODN nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das ODN 100 Nukleotide oder weniger umfaßt.
ODN nach Anspruch 5, wobei das ODN 50 Nukleotide oder weniger umfaßt.
ODN nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung beim Induzieren einer Immunantwort.
Verwendung des ODN nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Autoimmunkrankheit oder einer Immundefizienz.
Verwendung des ODN nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Krankheit durch Induzieren einer Immunantwort durch die Freisetzung von Cytokinen.
ODN-Abgabe-Komplex, umfassend: a. ein Oligodesoxynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird, ein zusätzliches Oligodesoxynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die als SEQ ID NR: 106 dargestellt wird, und ein weiteres Oligodesoxynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die entweder als SEQ ID NR: 32 oder SEQ ID NR: 43 dargestellt wird, wobei jedes Oligodesoxynukleotid weniger als 50 Nukleotide lang ist, b. ein Oligodesoxynukleotid, das Nukleotidsequenzen umfaßt, die als SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 106 und SEQ ID NR: 43 dargestellt werden; oder c. ein Oligodesoxynukleotid, das Nukleotidsequenzen umfaßt, die als SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 106 und SEQ ID NR: 32 dargestellt werden; und ein Targeting-Mittel.
Komplex nach Anspruch 10, wobei das Oligodesoxynukleotid eine Phosphat-Rückgrat-Modifikation aufweist.
Komplex nach Anspruch 11, wobei die Phosphat-Rückgrat-Modifikation eine Phosphorthioat-Rückgrat-Modifikation ist.
Komplex nach einem der Anspruchs 10 bis 12, wobei das Oligodesoxynukleotid modifiziert ist, um einer Degradation vorzubeugen.
Oligodesoxynukleotid-Abgabe-Komplex nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Targeting-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cholesterin, Virosom, Liposom, Lipid und ein an der Zielzelle spezifisch bindendes Mittel.
Komplex nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zur Verwendung beim Induzieren einer Immunantwort.
Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche ! 10 bis 14 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Autoimmunkrankheit oder einer Immundefizienz.
Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche 10 bis 14 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Krankheit durch Induzieren einer Immunantwort durch die Freisetzung von Cytokinen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend a) ein Oligodesoxynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird, ein zusätzliches OHgodesoxynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die als SEQ ID NR: 106 dargestellt wird, und ein weiteres Oligodesoxynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die entweder als SEQ ID NR: 32 oder SEQ ID NR: 43 dargestellt wird, wobei jedes Oligodesoxynukleotid weniger als 50 Nukleotide lang ist, b) ein Oligodesoxynukleotid, das Nukleotidsequenzen umfaßt, die als SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 106 und SEQ ID NR: 43 dargestellt werden; oder c) ein Oligodesoxynukleotid, das Nukleotidsequenzen umfaßt, die als SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 106 und SEQ ID NR: 32 dargestellt werden; d) und ein pharmazeutisch akzeptabler Carrier.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung beim induzieren einer Immunantwort.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Autoimmunkrankheit oder einer Immundefizienz.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Krankheit durch Induzieren einer Immunantwort durch die Freisetzung von Cytokinen.
Oligodesoxynukleotid, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 106 dargestellt wird, in Kombination mit einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird und einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 43 oder 32 dargestellt wird, zur Verwendung beim Induzieren einer Immunantwort.
Oligodesoxynukleotid, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird, in Kombination mit einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 106 dargestellt wird und einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 43 oder 32 dargestellt wird, zur Verwendung beim Induzieren einer Immunantwort.
ODN nach einem der Ansprüche 22 oder 23, wobei das ODN eine Phosphor-Rückgrat-Modifikation aufweist.
ODN nach Anspruch 24, wobei die Phosphat-Rückgrat-Modifikation eine fhosphorthioat-Rückgrat-Modifikation ist.
ODN nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das ODN modifiziert ist, um einer Degradation vorzubeugen.
ODN nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das ODN 100 Nukleotide oder weniger umfaßt.
ODN nach Anspruch 27, wobei das ODN 50 Nukleotide oder weniger umfaßt.
Verwendung eines Oligodesoxynukleotids (ODN), das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ 106 dargestellt wird, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Autoimmunkrankheit oder einer Immundefizienz, wobei das Medikament in Kombination mit einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird und einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 43 oder 32 dargestellt wird, verwendet wird.
Verwendung eines Oligodesoxynukleotids (ODN), das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Autoimmunkrankheit oder einer Immundefizienz, wobei das Medikament in Kombination mit einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 106 dargestellt wird und einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 43 oder 32 dargestellt wird, verwendet wird.
Verwendung eines Oligodesoxynukleotids (ODN), das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ 106 dargestellt wird, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Krankheit durch Induzieren einer Immunantwort durch die Freisetzung von Cytokinen, wobei das Medikament in Kombination mit einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 40 dargestellt wird und einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 43 oder 32 dargestellt wird, verwendet wird.
Verwendung eines Oligodesoxynukleotids (ODN), das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ 40 dargestellt wird, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Krankheit durch Induzieren einer Immunantwort durch die Freisetzung von Cytokinen, wobei das Medikament in Kombination mit einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 106 dargestellt wird und einem ODN, das die CpG-Sequenz enthält, die als SEQ ID NR: 43 oder 32 dargestellt wird, verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das ODN eine Phosphat-Rückgrat-Modifikation aufweist
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Phosphat-Rückgrat-Modifikation eine Phosphorthioat-Rückgrat-Modifikation ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 34, wobei das ODN modifiziert ist, um einer Degradation vorzubeugen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 35, wobei das ODN 100 Nukleotide oder weniger umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei das ODN 50 oder weniger Nukleotide umfaßt
Verwendung nach einem der Ansprüche 9, 17, 21 und 29 bis 37, wobei das Cytokin IFN-γ ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9, 16, 17, 20, 21, 29 bis 38, wobei das Medikament zum Behandeln, Vorbeugen oder Bessern einer allergischen Reaktion verwendet wird, und, wahlweise, zur Verabreichung in Kombination mit einem Antiallergikum geeignet ist,
Verwendung nach Anspruch 39, wobei die allergische Reaktion ein Ekzem, allergische Rhinitis oder allergischer Schnupfen, Heuschnupfen, Bronchialasthma, Urtikaria (Nesselsucht), Nahnmgsmittelallergien, ist.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei die allergische Reaktion durch ein Allergen hervorgerufen wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pollen, Insektengiften, tierischen Hautschuppen, Staub, Pilzsporen und Penicillinen.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei das Medikament verwendet wird, um allergisches Asthma zu behandeln.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9, 16, 17, 20, 21, 29 bis 38, wobei das Medikament zum Behandeln von Krebs ist, wahlweise in Kombination mit einem Antikrebsmittel.
Verwendung nach Anspruch 43, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebsarten von Hirn, Lunge, Eierstöcke, Brust, Prostata und Darm sowie Karzinomen und Sarkomen.
Verwendung nach Anspruch 43, wobei der Krebs ein solider Tumorkrebs ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9, 16, 17, 20, 21, 29 bis 38, wobei die Immundefizienz Lupus Erythematosus ist
Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9, 16, 17, 20, 21, 29 bis 38, wobei die Autoimmunkrankheit rheumatoide Arthritis oder Multiple Sklerose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9, 16, 17, 20, 21, 29 bis 38, wobei das Medikament zum Behandeln von Infektionen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tularämie, Schistosomiasis, Tuberkulose, AIDS, Malaria und Leishmanniose.
Verwendung nach Anspruch 48, wobei das Medikament geeignet ist in Kombination mit jedem Antiinfektivum verwendet zu werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9, 16, 17, 20, 21, 29 bis 38, wobei das Medikament zum Behandeln, Vorbeugen oder Bessern der Symptome ist, die sich durch Aussetzen einer Biowaffe bilden.
Verwendung nach Anspruch 50, wobei die Biowaffe ein biologisches Mittel ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ebola, Anthrax und Listeria.
ODN, Verwendung, Komplex oder Zusammensetzung nach Anspruch 40, wobei die Krankheit, die mit dem Immunsystem assoziiert wird, eine Autoimmunkrankheit ist.
ODN, Verwendung, Komplex oder Zusammensetzung nach Anspruch 40, wobei die Krankheit, die mit dem Immunsystem assoziiert wird, eine Immundefizienz ist.