DE60131903T2

DE60131903T2 - Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna

Info

Publication number: DE60131903T2
Application number: DE60131903T
Authority: DE
Inventors: Thomas D. San Francisco WILLIS; Paul Los Altos HARDENBOL; Manheesh Menlo Park JAIN; Viktor Cupertino STOLC; Mostafa Palo Alto RONAGHI; Ronald W. Palo Alto Davis
Original assignee: NIOR UNIVERSITY; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2021-10-25
Also published as: US20070178479A1; CA2426824A1; WO2002057491A2; US20060275789A1; ATE380883T1; JP2004528016A; US20050026180A1; WO2002057491A3; US20120065091A1; JP4287652B2; US20100330619A1; US7993880B2; US8383348B2; EP1366192A2; US20070264642A1; US20040101835A1; US20060252060A1; EP1366192B8; US7700323B2; US6858412B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue Verfahren zum Multiplexieren von Nukleinsäurereaktionen, einschließlich Amplifikation, Nachweis und Gentypisierung. Die Erfindung beruht auf der Verwendung von Präzyklus-Sonden, welche in Gegenwart der entsprechenden Zielnukleinsäuren zirkularisiert, geschnitten und dann amplifiziert werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krankheiten des Menschen entstehen aus einer komplexen Wechselwirkung von DNA-Polymorphismen oder -Mutationen und Umweltfaktoren. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) sind kürzlich als potentielle wirkungsvolle Methode für die genetische Typisierung identifiziert worden, und von ihnen wird vorhergesagt, die Mikrosatelliten-Wiederholungs-Analyse als Standard für genetische Assoziations-, Kopplungs- und Kartierungsuntersuchungen abzulösen.
Das hauptsächliche Ziel in der Humangenetik besteht darin, die Beziehung zwischen DNA-Sequenzvariation und phänotypischer Variation zu ermitteln. Für diese Untersuchungen sind molekulare Polymorphismen für herkömmliche meiotische Kartierung, Feinstruktur-Kartierung und Haplotyp-Analysen unverzichtbar. Mit der beabsichtigten Sequenzierung eines humanen Referenz-Genoms und Identifizierung aller menschlichen Gene wird jedoch erwartet, dass Untersuchungen von komplexen genetischen Krankheiten effizienter sind, wenn man alle humanen Gene hinsichtlich funktioneller Varianten durch Assoziations- und Kopplungs-Ungleichgewicht-Untersuchungen systematisch durchsuchen könnte. Dies erfordert die Entwicklung von Technologie und Verfahren für die systematische Ermittlung von genetischer Variation in humaner DNA, in erster Linie der Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), welche die häufigsten sind.
Es sind mehrere unterschiedliche Typen von Polymorphismen berichtet worden. Ein Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) bedeutet eine Variation in der DNA-Sequenz, welche die Länge eines Restriktionsfragmentes verändert, wie beschrieben in Rotstein et al., Am. J. Hum. Genet. 32, 314–331 (1980). Der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus kann eine Restriktionsstelle erzeugen oder deletieren, wodurch die Länge des Restriktionsfragmentes verändert wird. RFLPs sind weithin in genetischen Analysen an Menschen und Tieren eingesetzt worden (siehe WO 90/13668 ; WO 90/11369 ; Donis-Keller, Cell 51, 319–337 (1987); Lander et al., Genetics 121, 85–99 (1989)). Wenn ein vererbbares Merkmal mit einem besonderen RFLP in Zusammenhang gebracht werden kann, kann das Vorhandensein des RFLP in einem Individuum verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, mit welcher das Tier ebenfalls das Merkmal aufzeigen wird.
Andere Polymorphismen nehmen die Form von kurzen Tandem-Wiederholungen (Short Tandem Repeats, STRs) ein, welche tandemartige Di-, Tri- und Tetranukleotid-Wiederholungsmotive einschließen. Diese Tandem-Wiederholungen werden ebenfalls als "Variable-Anzahl-Tandem-Repetition" (VNTR, variable number tandem repeat)-Polymorphismen bezeichnet. VNTRs sind bei der Identitäts- und Vaterschaftsanalyse ( U.S.-Pat. Nr. 5 075 217 ; Armour et al., FEBS Lett. 307, 113–115 (1992); Horn et al., WO 91/14003 ; Jeffreys, EP 370 719 ) und in einer großen Anzahl von genetischen Kartierungsuntersuchungen verwendet worden.
Andere Polymorphismen nehmen die Form von Einzelnukleotidvariationen zwischen Individuen der gleichen Art ein. Solche Polymorphismen sind bei weitem häufiger als RFLPs, STRs und VNTRs. Einige Einzelnukleotidpolymorphismen treten in Protein-codierenden Sequenzen auf, wobei in diesem Fall eine der polymorphen Formen zur Expression eines defekten oder anderweitig abweichenden Proteins führen kann. Andere Einzelnukleotidpolymorphismen treten in nicht-codierenden Regionen auf. Einige dieser Polymorphismen können auch zu einer defekten oder abweichenden Proteinexpression führen (z. B. als Ergebnis von fehlerhaftem Spleissen). Andere Einzelnukleotidpolymorphismen weisen keine phänotypischen Auswirkungen auf. Einzelnukleotidpolymorphismen treten mit größerer Häufigkeit und gleichmäßiger über das Genom verteilt auf als andere Formen von Polymorphismus. Die größere Häufigkeit und Gleichmäßigkeit von Einzelnukleotidpolymorphismen bedeutet, dass eine größere Wahrscheinlichkeit besteht, dass ein derartiger Polymorphismus in enger[er] Nachbarschaft zu einem genetischen Locus von Interesse vorgefunden werden wird, als dies für andere Polymorphismen der Fall ist. Das Vorhandensein von SNPs kann zum Beispiel mit einer bestimmten Population, einem Krankheitszustand oder einer Neigung für einen Krankheitszustand gekoppelt sein.
Im Allgemeinen können Polymorphismen mit der Anfälligkeit, eine bestimmte Krankheit oder ein bestimmtes Leiden zu entwickeln, assoziiert sein. Das Vorhandensein von Polymorphismen, welche eine Änderung in der Proteinstruktur verursachen, korreliert mit größerer Wahrscheinlichkeit mit der Möglichkeit der Entwicklung eines bestimmten Types oder "Merkmals". Somit ist dies in hohem Maße erwünscht zur Einrichtung von Verfahren, welche die rasche und kostengünstige Genotypisierung von Subjekten gestatten. Die frühe Identifizierung von Allelen, welche mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit der Ausprägung eines Leidens gekoppelt sind, wird eine frühe Intervention und Prävention der Entwicklung der Krankheit erlauben.
Pharmakogenomics besteht in der Untersuchung der Beziehung zwischen dem Genotyp eines Individuums und der Antwortreaktion dieses Individuums auf eine(n) fremde(n) Verbindung oder Arzneistoff. Unterschiede im Metabolismus von Therapeutika können zu starker Toxizität oder Therapieversagen durch Veränderung der Beziehung zwischen der Dosis und der Blutkonzentration des pharmakologisch wirksamen Arzneimittels führen. Daher kann ein Arzt oder Kliniker die Anwendung der in relevanten Pharmakogenomics-Untersuchungen erhaltenen Erkenntnisse für die Bestimmung des Arzneimitteltyps und der Dosierung und/oder des Therapieplans der Behandlung in Erwägung ziehen.
Pharmakogenomics beschäftigt sich mit klinisch signifikanten erblichen Variationen in der Antwortreaktion auf Arzneimittel aufgrund veränderter Arzneistoffanfälligkeit und abnormaler Wirkung in den betroffenen Personen; siehe zum Beispiel Eichelbaum, M., et al., (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10–11): 983–985, und Linder, M. W., et al., (1997) Clin. Chem. 43(2): 254–266. Im allgemeinen können zwei Typen von pharmakogenetischen Zuständen unterschieden werden. Genetische Zustände, die als ein Einzelfaktor übertragen werden, welcher die Weise ändert, auf welche Arzneimittel auf den Körper wirken (veränderte Arzneimittelwirkung), oder genetische Zustände, die als Einzelfaktoren übertragen werden, welche die Weise ändern, auf welche der Körper auf Arzneimittel einwirkt (veränderter Arzneimittel-Metabolismus). Diese pharmakogenetischen Zustände können entweder als seltene genetische Defekte oder als natürlich vorkommende Polymorphismen auftreten. Zum Beispiel ist Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Defizienz (G6PD) eine häufige vererbte Enzymopathie, in welcher die hauptsächliche klinische Komplikation die Hämolyse nach der Aufnahme von Oxidationsmittelarzneistoffen (Anti-Malaria-Mittel, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofarane) und dem Verzehr von Fava-Bohnen ist. Daher wäre es in hohem Maße wünschenswert, rasche und kostengünstige Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines Subjekts einzurichten, so dass die beste Behandlung vorausgesagt werden kann.
Somit besteht ein beträchtlicher Bedarf für die Nukleotidsequenz-Identifizierung (z. B. SNPs) mit hohem Durchsatz und bei sehr geringen Kosten in Regionen von bekannter Sequenz, um Allele von polymorphen Genen, z. B. SNPs, zu identifizieren. Es sind derzeitig viele Verfahren verfügbar, um Polymorphismen, z. B. SNPs, zu screenen. Eine typische Genotypisierungs-Strategie beinhaltet drei grundlegende Schritte. Der erste Schritt besteht aus der Amplifizierung der Ziel-DNA, was notwendig ist, da ein humanes Genom 3 × 10⁹ Basenpaare DNA enthält, und den meisten Assays sowohl die Empfindlichkeit als auch die Selektivität fehlt, um eine kleine Anzahl an Basen, insbesondere eine einzelne Base, aus einem so komplexen Gemisch exakt nachzuweisen. Als ein Ergebnis beruhen die meisten derzeitig angewandten Strategien darauf, zuerst eine Region von mehreren hundert Basen, einschließlich der zu screenenden polymorphen Region, unter Anwendung von PCR zu amplifizieren. Diese Reaktion erfordert 2 einmalige Primer für jede amplifizierte Region ("Amplikon"). Sobald die Komplexität verringert worden ist, besteht der zweite Schritt in den derzeitig angewandten Verfahren aus der differentiellen Markierung der Allele, so dass man in der Lage ist, den Gentyp zu identifizieren. Dieser Schritt beinhaltet das Anheften irgendeines identifizierbaren Markers (z. B. fluoreszente Markierung, Massen-Tag bzw. -Anhängsel, etc.) auf eine Weise, die spezifisch für die zu testende Base ist. Der dritte Schritt in derzeitig angewandten Verfahren besteht aus dem Nachweisen des Allels zur Bestimmung der Genotypen der Individuen. Nachweismechanismen schließen Fluoreszenzsignale, die Polarisierung eines Fluoreszenzsignals, Massenspektrometrie zum Identifizieren von Massen-Anhängseln etc. ein.
Empfindlichkeits-, d. h. Nachweisgrenzen bleiben ein bedeutendes Hindernis in Nukleinsäure-Nachweissystemen, und eine Vielfalt von Techniken ist entwickelt worden, um dieses Problem zu lösen. Kurz gesagt können diese Techniken entweder als Zielamplifikation oder Signalamplifikation klassifiziert werden. Zielamplifikation beinhaltet die Amplifikation (d. h. Replikation) der nachzuweisenden Zielsequenz, was zu einer signifikanten Erhöhung der Anzahl von Zielmolekülen führt. Zielamplifikationsstrategien schließen die Polymerasekettenreaktion (PCR), Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) und die Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) ein.
Alternativ dazu verwenden andere Techniken, anstatt das Ziel zu amplifizieren, das Ziel als eine Matrize, um eine Signaling-Sonde zu replizieren, wobei gestattet wird, dass eine kleine Anzahl von Zielmolekülen zu einer großen Anzahl von Signaling-Sonden führt, welche dann nachgewiesen werden können. Signalamplifikationsstrategien schließen die Ligasekettenreaktion (LCR), die "Cycling-Probe"-Technologie (CPT), invasive Spaltungstechniken, wie Invader^TM-Technologie, Q-Beta-Replikase(QβR)-Technologie und die Verwendung von "Verstärkungssonden", wie "verzweigter DNA" ein, welche dazu führen, dass mehrere Markierungssonden an eine einzelne Zielsequenz binden.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist weithin verwendet und beschrieben und beinhaltet die Verwendung von Primerverlängerung, kombiniert mit thermischem Zyklieren, um eine Zielsequenz zu amplifizieren; siehe U.S.-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202 und "PCR Essential Data", J. W. Wiley & Sons, Hrsg.: C. R. Newton, 1995. Darüber hinaus gibt es eine Anzahl von Variationen der PCR, welche ebenfalls in der Erfindung Anwendung finden, einschließlich, unter anderen, "quantitativer kompetitiver PCR" oder "QC-PCR", "arbiträr geprimter PCR" oder "AP-PCR", "Immuno-PCR", "Alu-PCR", "PCR-Einzelstrang-Konformationspolymorphismus" oder "PCR-SSCP", allelischer PCR (siehe Newton et al., Nucl. Acid Res. 17: 2503 (1989)); "Reverse-Transkriptase-PCR" oder "RT-PCR", "Biotin-Einfang-PCR", "Vectorette-PCR", "Pfannenstiel-PCR" und "PCR-Select-cDNA-Subtraktion".
Die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) wird allgemein in Walker et al., in Molecular Methods for Virus Delection, Academic Press, Inc., 1995, und den U.S.-Patenten Nr. 5 455 166 und 5 130 238 beschrieben. Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) wird allgemein im U.S.-Patent Nr. 5 409 818 und "Profiting from Gene-based Diagnostics", CTB International Publishing Inc., N. J., 1996, beschrieben, welche beide hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
"Cycling-Probe"-Technologie (CPT) ist ein Nukleinsäurenachweissystem, basierend auf Signal- oder Sondenamplifikation anstatt von Zielamplifikation, wie es in Polymerasekettenreaktionen (PCR) durchgeführt wird. Die Cycling-Probe-Technologie beruht auf einem molaren Überschuß von markierter Sonde, welche eine spaltbare Bindung von RNA enthält. Nach der Hybridisierung der Sonde an das Ziel enthält das resultierende Hybrid einen Bereich von RNA:DNA. Dieser Bereich von RNA:DNA-Duplex wird von RNAseH erkannt, und die RNA wird herausgeschnitten, was zur Spaltung der Sonde führt. Die Sonde besteht nun aus zwei kleineren Sequenzen, welche freigesetzt werden können, wodurch das Ziel für wiederholte Runden der Reaktion intakt belassen wird. Die nicht-umgesetzte Sonde wird entfernt und die Markierung wird dann detektiert. CPT wird allgemein in den U.S.-Patenten Nr. 5 011 769 , 5 403 711 , 5 660 988 und 4 876 187 und den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 95/05480 , WO 95/1416 und WO 95/00667 beschrieben.
Der Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA; manchmal bezeichnet als Ligationskettenreaktion (LCR)) beinhaltet die Ligation von mindestens zwei kleineren Sonden zu einer einzelnen langen Sonde unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize für die Ligase; siehe im allgemeinen U.S.-Patente Nr. 5 185 243 , 5 679 524 und 5 573 907 ; EP 0 320 308 B1 ; EP 0 336 731 B1 ; EP 0 439 182 B1 ; WO 90/01069 ; WO 89/12696 ; und WO 89/09835 .
Die Invader^TM-Technologie basiert auf strukturspezifischen Polymerasen, welche Nukleinsäuren in einer stellenspezifischen Weise spalten. Es werden zwei Sonden verwendet: eine "Invader"-Sonde und eine "Signaling"-Sonde, welche benachbart, mit einer nicht-komplementären Überlappung, an eine Zielsequenz hybridisieren. Das Enzym spaltet an der Überlappung aufgrund seiner Erkennung des "Schwanzes" und setzt den "Schwanz" mit einer Markierung frei. Diese kann dann nachgewiesen werden. Die Invader^TM-Technologie wird in den U.S.-Patenten Nr. 5846717 ; 5 614 402 ; 5 719 028 ; 5 541 311 ; und 5 843 669 beschrieben.
Keines der derzeitig verwendeten Verfahren ist besonders gut für einen sehr hohen Durchsatz bei geringem Kostenaufwand geeignet. Einer der Hauptnachteile der verfügbaren Verfahren besteht darin, dass sie auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Erzeugung einer relativ einfachen DNA-Matrize für Polymorphismusanalyse (d. h. Genotypisierung) beruhen. Diese Reaktion wird nicht einfach multiplexiert, was impliziert, dass jeder Assay zum Identifizieren eines jeweiligen Polymorphismus eine separate Reaktion benötigt. Dies macht jedweden Hochdurchsatz-Assay schwerfällig und kostspielig, da Millionen von Reaktionen durchgeführt werden müssen, um die erforderliche Anzahl an Polymorphism(en) zu screenen. Daher besteht ein Bedarf nach einem Verfahren, welches gestattet, dass tausende von polymorphen Regionen, z. B. SNPs, in einem einzelnen Reaktionsgefäß analysiert und quantifiziert werden, wodurch der Durchsatz in großem Maße erhöht und die Kosten der Analyse gesenkt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß den oben skizzierten Zielen, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, in einer Probe bereit. Das Verfahren umfasst das Hybridisieren der Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden. Die Präzyklussonde umfasst: eine erste das Ziel erkennende bzw. Targeting-Domäne, eine zweite das Ziel erkennende Domäne, mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle und eine Schnittstelle. Die erste und zweite das Ziel erkennenden Domänen hybridisieren mit den ersten und zweiten Zieldomänen. Der erste Hybridisierungskomplex wird mit einer Ligase in Kontakt gebracht, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden, und die geschlossene ringförmige Sonde wird an der Schnittstelle geschnitten, um eine geschnittene Sonde zu bilden. Die geschnittene Sonde wird amplifiziert, um eine Vielzahl von Amplikons zu bilden, und die Amplikons werden nachgewiesen, um das Vorhandensein der Zielsequenz in der besagten Probe nachzuweisen. Die Präzyklus-Sonde kann gegebenenfalls eine zweite universellen Primer bindende Stelle umfassen, und der zweite Schritt des Inkontaktbringens umfasst ferner das Inkontaktbringen der geschnittenen Sonde mit einem zweiten universellen Primer. Die Schnittstelle liegt gegebenenfalls zwischen den ersten und zweiten universellen Primer bindenden Stellen.
Darüber hinaus kann die Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen den ersten und zweiten Zieldomänen umfassen. Das Verfahren umfasst ferner den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des ersten Hybridisierungskomplexes mit einem kettenverlängernden Enzym und mindestens einem Abfrage-NTP vor der Bildung der geschlossenen ringförmigen Sonde. Alternativ dazu umfasst das Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit mindestens einem Fugenoligonukleotid vor der Bildung der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde, wobei besagtes Fugenoligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die völlig komplementär zu besagter Fugendomäne ist, wobei der Nachweis der besagten Amplikons die besagte Fugendomäne identifiziert.
In einem weiteren Aspekt umfasst das Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Verdauens von jedweden linearen Präzyklus-Sonden vor dem Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde.
In einem weiteren Aspekt umfasst das Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Abbauens von jedweden dNTPs vor dem Zugeben der Abfrage-dNTPs.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung Verfahren zum Nachweisen einer Zielsequenz in einer Probe vor, wobei besagte Zielsequenz eine erste und zweite Zieldomäne und eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst, wobei besagtes Verfahren umfasst:

a) Hybridisieren von mindestens einer aus einer Mehrzahl von Präzyklus-Sonden mit besagter Zielsequenz, um eine Mehrzahl von ersten Hybridisierungskomplexen zu bilden, wobei die besagten Präzyklus-Sonden jeweils umfassen:
i) eine erste das Ziel erkennende Domäne;
ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne;
iii) eine Nachweis-Domäne;
iv) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle;
v) eine Schnittstelle; und
vi) eine Barcode-Sequenz; wobei die besagte Mehrzahl erster und zweiter das Ziel erkennender Domänen zu der besagten Mehrzahl erster und zweiter Zieldomänen komplementär ist, und die Fugendomäne mit mindestens einer der besagten Mehrzahl von Nachweisdomänen hybridisieren wird;
b) Inkontaktbringen der besagten Mehrzahl erster Hybridisierungskomplexe mit einer Ligase, um eine Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden zu bilden;
c) Schneiden der besagten Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden an den besagten Schnittstellen, um eine Mehrzahl geschnittener Sonden zu bilden;
d) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonden, um Amplikons zu bilden; und
e) Nachweis des Vorliegens der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Mehrzahl von Zielsequenzen in der besagten Probe nachzuweisen.

In einem zusätzlichen Aspekt sieht die Erfindung Verfahren zum Nachweis einer Mehrzahl von Zielsequenzen in einer Probe vor, wobei jede der besagten Mehrzahl von Zielsequenzen erste und zweite Zieldomänen umfasst, wobei besagtes Verfahren umfasst:

a) Hybridisieren der besagten Mehrzahl von Zielsequenzen mit einer Mehrzahl von Präzyklus-Sonden, um eine Mehrzahl von ersten Hybridisierungskomplexen zu bilden, wobei jede der besagten Präzyklus-Sonden umfasst:
i) eine erste das Ziel erkennende Domäne;
ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne;
iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle;
iv) eine Schnittstelle; und
v) eine Barcode-Sequenz; wobei die besagte Mehrzahl erster und zweiter das Ziel erkennender Domänen mit der besagten Mehrzahl erster und zweiter Zieldomänen hybridisiert;
b) Inkontaktbringen der besagten Mehrzahl erster Hybridisierungskomplexe mit einer Ligase, um eine Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden zu bilden;
c) Schneiden der besagten Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden an den besagten Schnittstellen, um eine Mehrzahl geschnittener Sonden zu bilden;
d) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonden, um Amplikons zu bilden; und
e) Nachweis des Vorliegens der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Mehrzahl von Zielsequenzen in der besagten Probe nachzuweisen.

In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung Verfahren zur Identifizierung der Base an einer Nachweisposition in einer Zielsequenz vor, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, welche durch eine Fugendomäne getrennt sind, wobei die besagte Fugendomäne die besagte Nachweisposition umfasst, wobei besagtes Verfahren umfasst:

a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei die besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine 5' gelegene erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine 3' gelegene zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; und iv) eine Schnittstelle; wobei die besagten ersten und zweiten das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren;
b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Polymerase und mindestens einem Abfrage-dNTP, um eine verlängerte Präzyklus-Sonde zu bilden;
c) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes, der die besagte verlängerte Präzyklus-Sonde und die besagte Zielsequenz umfasst, mit einer Ligase, um eine geschlossene ringfärmige Sonde zu bilden;
d) Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde an der besagten Schnittstelle, um eine geschnittene Sonde zu bilden;
e) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde, um eine Mehrzahl von Amplikons zu bilden;
f) Nachweis des Vorliegens der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Zielsequenz in der besagten Probe nachzuweisen.

In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung Verfahren zum Amplifizieren einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, in einer Probe vor, wobei besagtes Verfahren umfasst:

a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; und iv) eine Schnittstelle; wobei die besagten ersten und zweiten das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren;
b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Ligase, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden;
c) Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde an der besagten Schnittstelle, um eine geschnittene Sonde zu bilden; und
d) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde.

In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, in einer Probe vor, wobei besagtes Verfahren umfasst:

a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei die besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne; und iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; wobei die besagten ersten und zweiten das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren;
b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Ligase, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden;
c) Inkontaktbringen der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde mit mindestens einem ersten universellen Primer, einem kettenverlängernden Enzym und NTPs, um ein verlängertes Produkt zu bilden;
d) Amplifizieren des besagten verlängerten Produktes, um Amplikons zu bilden; und
e) Nachweis der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Zielsequenz in der besagten Probe nachzuweisen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist ein Diagramm einer bevorzugten Ausführungsform einer Präzyklus-Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend erste und zweite das Ziel erkennende Domänen, einen ersten universellen Primer, eine Schnittstelle, einen zweiten optionalen bzw. wahlfreien Primer, einen wahlfreien Barcode und eine wahlfreie Restriktionsstelle.
Die 2A–2H zeigen einen bevorzugten Assay der Erfindung unter Verwendung einer anstoßenden ("fugenfreien") Präzyklus-Sonde. Die 2A zeigt die Bildung eines Hybridisierungskomplexes, worin die das Ziel erkennenden Domänen der Präzyklus-Sonde an die Zieldomänen der Zielsequenz hybridisieren, wobei die 5'- und 3'-Termini der gebundenen Sonde aneinandergrenzen gelassen werden. Im Falle von Genotypisierungs-Reaktionen kann entweder das 5'- oder 3'-Ende der Präzyklus-Sonde eine Abfrage-Position umfassen, und eine Mehrzahl von Präzyklus-Sonden, jeweils umfassend eine unterschiedliche Base an der Abfrage-Position und eine unterschiedliche Barcode-Sequenz, kann verwendet werden. Die 2B zeigt die Ver wendung einer Ligase, um die Präzyklus-Sonde zu zirkularisieren, um einen geschlossenen Ring zu bilden. Gegebenenfalls (nicht gezeigt) können die verbleibenden linearen Präzyklus-Sonden und/oder die Zielsequenz entfernt, abgebaut oder anderweitig dazu unfähig gemacht werden, amplifiziert zu werden. Die 2C zeigt das Schneiden an der Schnittstelle, wobei die Zielsequenz noch vorhanden ist. Die 2D–2G zeigen die bevorzugte PCR-Amplifikationsreaktion, umfassend das Anlagern bzw. Annealen des ersten universellen Primers (2D), die Verlängerung des ersten Primers (2E), das Annealen der zweiten und ersten Primer (2F) und die Verlängerung der Primer (2G). Gegebenenfalls kann die Verwendung eines Restriktionsenzyms die Barcode- und zweiten universellen Primer bindenden Sequenzen, welche markiert sein können, wie hierin angegeben, freisetzen.
Die 3A–3D zeigen verschiedene Ausführungsformen der Fugen-Präzyklus-Sonden der vorliegenden Erfindung. 3A zeigt eine Einzelnukleotid-Fugen-Präzyklus-Sonde, wobei die Fugenposition der SNP-Nachweisposition in der Zielsequenz entspricht. Nach Zugabe des korrekten NTP und eines kettenverlängernden Enzyms, gefolgt von Ligation mit einer Ligase, schreitet das Verfahren wie in 2 voran. Die 3B zeigt eine Mehrfachnukleotid-Fugen-Präzyklus-Sonde, welche mit NTPs unter Verwendung eines kettenverlängernden Enzyms aufgefüllt werden kann. Die 3C zeigt die Verwendung eines Fugenoligonukleotids, um die Fuge der Präzyklus-Sonde aufzufüllen, wobei eine Ligation an beiden Enden des Fugenoligos auftritt. Die 3D zeigt eine "Klappen-Fugen"-Präzyklus-Sonde. Alle von diesen können in dem in 2 gezeigten allgemeinen Verfahren verwendet werden.
Die 4 zeigt eine Variation an den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung. In dieser Ausführungsform, welche mit jedweder der anstoßenden oder Fugen-Präzyklus-Sonden angewandt werden kann, flankieren die universellen Primer die Barcode-Sequenz. Diese Ausführungsform kann eine Vielfalt von Formen einnehmen; in einer Ausführungsform wird die Präzyklus-Sonde mit der Zielsequenz hybridisiert, Fugen werden aufgefüllt, wie erforderlich, und die Präzyklus-Sonden werden ligiert, um geschlossene ringförmige Sonden zu bilden. In dieser Ausführungsform ist es bedeutend, dass jedwede nicht-zirkularisierten Sonden entfernt werden. Die universellen Primer werden zugegeben, und die Barcode-Sequenz wird amplifiziert. Dies kann entweder mit einer geschlossenen ringförmigen Sonde durchgeführt werden, oder die Sonden können wahlfrei an einer oder mehreren Positionen geschnitten werden.
Die 5A–5K zeigen die "Zwei-Schritt"-Ausführungsform der Erfindung, beginnend mit einer anstoßenden Präzyklus-Sonde, obwohl es vom Fachmann auf dem Gebiet richtig eingeschätzt werden wird, dass jedwede der Fugensonden ebenso gut verwendet werden kann. Die 5A zeigt die Präzyklus-Sonde. Die 5B zeigt die Bildung eines Hybridisierungskomplexes, wobei die das Ziel erkennenden Domänen der Präzyklus-Sonde mit den Zieldomänen der Zielsequenz hybridisieren, wobei die 5'- und 3'-Termini aneinandergrenzen gelassen werden. Im Falle von Genotypisierungs-Reaktionen kann entweder das 5'- oder 3'-Ende der Präzyklus-Sonde eine Abfrage-Position umfassen, und eine Mehrzahl von Präzyklus-Sonden, jeweils umfassend eine andere Base an der Abfrage-Position und eine unterschiedliche Barcode-Sequenz, kann verwendet werden. Die 5C zeigt die Verwendung einer Ligase, um die Präzyklus-Sonde zu zirkularisieren, um einen geschlossenen Ring zu bilden. Gegebenenfalls (nicht gezeigt) können die verbleibenden linearen Präzyklus-Sonden und/oder die Zielsequenz entfernt, abgebaut oder anderweitig dazu unfähig gemacht werden, amplifiziert zu werden. Die 5D zeigt das Annealing des ersten Primers, gefolgt von Verlängerung unter Verwendung von NTPs und einem kettenverlängernden Enzym (5E).
Die 5F zeigt das Schneiden an den Schnittstellen, welches alle Sonden zu einer Amplifikation unfähig macht. Die 5G–5J zeigen die bevorzugte PCR-Amplifikationsreaktion des in 5E erzeugten verlängerten Produkts, umfassend das Annealen des zweiten universellen Primers (5G), die Verlängerung des Primers (5H), das Annealen der zweiten und ersten Primer (5I) und die Verlängerung der Primer (5J). Gegebenenfalls kann die Verwendung eines Restriktionsenzyms die Barcode- und zweiten universellen Primer bindenden Sequenzen freisetzen, welche markiert sein können, wie hierin angegeben (5K).
Die 6A–6D zeigen ein Diagramm eines Verfahrens vom "Ligase"-Typ der Erfindung an zwei Allelen eines Gens, wobei ein Allel ein A an der SNP-Nachweisposition aufweist, während das andere Allel ein T an dieser Position aufweist.
Die 7 ist ein Diagramm eines Verfahrens vom "Ligase/Polymerase"-Typ der Erfindung an Allelen eines Gens, wobei ein Allel ein A an der SNP-Position aufweist, während das andere Allel ein T an dieser Position aufweist.
Die 8 ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Feststellen, ob ein Subjekt hinsichtlich einer Insertionsmutation homozygot oder heterozygot ist, repräsentiert.
AUFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf neue Verfahren zur Multiplexierung von Amplifikations-, Nachweis- und Genotypisierungs-Reaktionen, im Besonderen Polymerasekettenreaktions(PCR)-Reaktionen, obwohl, wie hierin beschrieben, eine Vielfalt an Amplifikationstechniken angewandt werden kann. Der Fachmann auf dem Gebiet wird davon ausgehen, dass es eine breite Vielfalt von Konfigurationen und Assays gibt, welche eingesetzt werden können; im Allgemeinen kann die Erfindung wie folgend beschrieben werden, und wird in den Figuren im Allgemeinen dargestellt. Es gibt zwei allgemeine Methodiken: ein "Ein-Stufen"- und ein "Zwei-Stufen"-Verfahren.
Das "Ein-Stufen"-Verfahren kann im Allgemeinen wie folgend beschrieben werden. Eine Präzyklus-Sonde wird zu einer Zielsequenz aus einer Probe, welche eine erste und eine zweite Zieldomäne enthält, zugegeben, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Wie nachstehend vollständiger geschildert, können diese Zieldomänen in der Zielsequenz direkt aneinandergrenzend sein oder können durch eine Fuge von einem oder mehreren Nukleotiden getrennt sein. Die Präzyklus-Sonde umfasst erste und zweite das Ziel erkennende Domänen an ihren Termini, welche im Wesentlichen komplementär zu den Zieldomänen der Zielsequenz sind. Die Präzyklus-Sonde umfasst eine oder gegebenenfalls mehrere universellen Primer bindende Stellen, getrennt durch eine Schnittstelle, und eine Barcode-Sequenz. Wenn es keine Fuge zwischen den Zieldomänen der Zielsequenz gibt, und die 5'- und 3'-Nukleotide der Präzyklus-Sonde völlig komplementär zu den entsprechenden Basen an der Grenzstelle der Zieldomänen sind, dann sind die 5'- und 3'-Nukleotide der Präzyklus-Sonde aneinander "anstoßend" und können miteinander unter Verwendung einer Ligase ligiert werden, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden. Das 5'- und 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls werden als aneinander "anstoßend" bezeichnet, wenn sie in ausreichend nahem Kontakt stehen, um die Bildung einer kovalenten Bindung, in Gegenwart von Ligase und angemessenen Bedingungen, zu gestatten.
Dieses Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die zwei das Ziel erkennenden Domänen einer Präzyklus-Sonde präferenziell miteinander ligiert werden können, wenn sie so mit einem Zielstrang hybridisiert sind, dass sie anstoßen, und wenn eine perfekte Komplementarität an den zwei Basen, welche miteinander ligiert werden, existiert. Eine perfekte Komplementarität an den Termini gestattet die Bildung eines Ligationssubstrats, so dass die zwei Termini unter Bildung einer geschlossenen ringförmigen Sonde miteinander ligiert werden können. Wenn diese Komplementarität nicht vorliegt, wird kein Ligationssubstrat gebildet, und die Sonden werden nicht zu einem nennenswerten Ausmaß miteinander ligiert.
Sobald die Präzyklus-Sonden ligiert worden sind, werden die unligierten Präzyklus-Sonden und/oder Zielsequenzen wahlfrei entfernt oder inaktiviert. Die geschlossene ringförmige Sonde wird dann durch Schneiden an der Schnittstelle linearisiert, was zu einer geschnittenen Sonde führt, welche die universellen Primer bindenden Stellen an den neuen Termini der gespaltenen Sonde umfasst. Die Zugabe von universellen Primer, einem kettenverlängernden Enzym, wie einer Polymerase, und NTPs fährt zur Amplifikation der geschnittenen Sonde, um Amplikons zu bilden. Diese Amplikons können auf einer Vielfalt an Arten nachgewiesen werden. In dem Fall, wo Barcode-Sequenzen verwendet werden, können die Amplikons, welche die Barcodes enthalten, dann zum Beispiel zu universellen Biochip-Arrays zugegeben werden, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist, obwohl der Fachmann auf dem Gebiet davon ausgehen wird, dass eine Reihe von anderen Nachweisverfahren, einschließlich Lösungsphasen-Assays, durchgeführt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es eine Fuge zwischen den Zieldomänen der Zielsequenz. Im Falle einer Genotypisierungs-Reaktion gibt es eine Einzelnukleotid-Fuge, welche die Nachweisposition, z. B. die SNP-Position, umfasst. Das Zugeben eines einzelnen Typs an dNTP und einer Polymerase zu dem Hybridisierungskomplex [führt zum] "Auffüllen" der Fuge, wenn das dNTP perfekt komplementär zu der Nachweisposition-Base ist. Die dNTPs werden gegebenenfalls entfernt, und die Ligase wird zugegeben, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden. Das Schneiden, die Amplifikation und der Nachweis gehen wie oben geschildert vor sich.
Alternativ dazu kann eine Fuge von mehr als einem Nukleotid zwischen den Zieldomänen vorliegen. In diesem Fall, wie es nachstehend vollständiger angegeben wird, kann entweder eine Mehrzahl von dNTPs, ein "Fugenoligonukleotid", wie allgemein in der 3C abgebildet, oder eine Präzyklus-Sonde mit einer "Klappe", wie allgemein in der 3D abgebildet, verwendet werden, um die Reaktion zu bewerkstelligen.
Das "Zwei-Stufen"-Verfahren ist ähnlich zu dem oben geschilderten Verfahren. In dieser Ausführungsform wird jedoch, nachdem die Präzyklus-Sonde zirkularisiert worden ist, ein einzelner universeller Primer in Gegenwart einer Polymerase und von dNTPs zugegeben, so dass eine neue lineare Kopie der geschlossenen Sonde, mit neuen Termini, produziert wird. Diese linearisierte geschlossene Sonde wird dann amplifiziert, wie es nachstehend vollständiger beschrieben wird. Das "Zwei-Stufen"-Verfahren ist besonders vorteilhaft zum Reduzieren von unerwünschten Hintergrundsignalen, welche aus anschließenden Amplifikationsreaktionen entstehen. Dies kann durch Entwurf der Schnittstellen in den Präzyklus-Sonden bewerkstelligt werden, welche, wenn sie geschnitten sind, jedwede Amplifikation irgendeiner Sonde verhindern werden. Zusätzliche Vorgehensweisen zur Hintergrundverringerung können ebenfalls in die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung eingebunden werden und werden hierin ausführlicher erörtert.
Die Verfahren der Erfindung sind besonders vorteilhaft bei der Verringerung von Problemen, die mit Kreuzhybridisierungen und Wechselwirkungen zwischen mehreren Sonden assoziiert sind, welche zu unerwünschter Hintergrundamplifikation führen können. Durch Zirkularisieren der Präzyklus-Sonden und Behandeln der Reaktionen mit Exonuklease, werden lineare Nukleinsäuren abgebaut und können somit nicht an Amplifikationsreaktionen teilnehmen. Dies erlaubt dem Verfahren der Erfindung robuster und multiplexierbarer als andere Amplifikationsverfahren, welche auf linearen Sonden beruhen, zu sein.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Genotypisieren von Zielnukleinsäuresequenzen in einer Probe vor. Im Allgemeinen betreffen die hierin beschriebenen Genotypisierungs-Verfahren den Nachweis von Nukleotidsubstitutionen, obwohl es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, dass Deletionen, Insertionen, Inversionen etc. ebenfalls nachgewiesen werden können.
Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann die Probenlösung jedwede Anzahl von Bestandteilen umfassen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Körperflüssigkeiten (einschließlich, ohne Einschränkung darauf, Blut, Urin, Serum, Lymphe, Speichel, anale und vaginale Sekretionen, Schweiß und Samen) oder feste Gewebeproben von praktisch jedwedem Organismus, wobei Säuger-Proben bevorzugt und humane Proben besonders bevorzugt sind; Umweltproben (einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Luft, Landwirtschafts-, Wasser- und Bodenproben); Proben aus Mitteln der biologischen Kriegsführung; Forschungsproben; gereinigte Proben, wie gereinigte oder unreine genomische DNA, RNA, Proteine etc.; Rohproben (Bakterien, Virus, genomische DNA, mRNA etc.). Der Fachmama auf dem Gebiet wird davon ausgehen, dass praktisch jedwede experimentelle Manipulation an der Probe ausgeführt worden sein kann.
Es gibt keine Einschränkung hinsichtlich der Quelle der Matrizennukleinsäure: sie kann aus einem Eukaryot, z. B. aus einem Säuger, wie Mensch, Maus, Schaf oder Rind, oder aus einer Pflanze stammen; sie kann aus einem Prokaryot, z. B. Bakterien, oder Protozoen stammen; und sie kann auch aus einem Virus stammen.
Nukleinsäureproben können aus einem Individuum der Spezies, welche analysiert werden soll, entweder unter Verwendung "invasiver" oder "nicht-invasiver" Probenentnahmemethoden erhalten werden. Eine Probenentnahmemethode wird als "invasiv" bezeichnet, wenn sie das Absammeln von Nukleinsäuren aus dem Inneren von Haut oder Organen eines Tieres beinhaltet (einschließlich insbesondere eines mausartigen, eines menschenartigen, eines schafartigen, eines pferdeartigen, eines rinderartigen, eines schweineartigen, eines hundeartigen oder eines katzenartigen Tiers). Beispiele von invasiven Verfahren schließen Blutentnahme, Samenentnahme, Nadelbiopsie, Pleura-Aspiration, Nabelschnur-Biopsie etc. ein. Beispiele solcher Verfahren werden von Kim, C. H., et al., (J. Virol. 66: 3879–3882 (1992)); Biswas, B., et al. (Annals NY Acad. Sci. 590: 582–583 (1990)); Biswas, B., et al. (J. Clin. Microbiol. 29: 2228–2233 (1991)) erörtert.
Im Gegensatz dazu ist eine "nicht-invasive" Probenentnahmemethode eine solche, in welcher die Nukleinsäuremoleküle von einer inneren oder äußeren Oberfläche des Tiers gewonnen werden. Beispiele solcher "nicht-invasiver" Probenentnahmemethoden schließen "Abstreichen", Sammeln von Tränen, Speichel, Urin, Fäkalmaterial, Schweiß oder Perspiration, Haaren etc. ein. Wie hierin verwendet, bezeichnet "Abstreichen" das Inkontaktbringen eines Applikators/Kollektors ("Tupfer"), enthaltend oder umfassend ein Adsorbens-Material, mit einer Oberfläche auf eine Weise, die ausreicht, um lebende Zellen, Oberflächen-Zelltrümmer und/oder tote oder abgeworfene Zellen oder Zelltrümmer zu sammeln. Ein solches Absammeln kann durch Abstrich von nasalen, oralen, rektalen, vaginalen oder Ohren-Öffnungen, durch Kontaktieren der Haut oder Tränengänge, durch Sammeln von Haarfollikeln etc. bewerkstelligt werden.
Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäureproben sind im Fachgebiet bekannt und werden von dem Typ der isolierten Nukleinsäure abhängen. Wenn es sich bei der Nukleinsäure um RNA handelt, muss darauf geachtet werden, RNA-Abbau zu vermeiden, z. B. durch Einschließen von RNAsin. Genomische DNA kann zum Beispiel aus menschlichen Zellen präpariert werden, wie z. B. im U.S.-Patent Nr. 6 027 889 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung sieht Zusammensetzungen und Verfahren zum Genotypisieren und/oder Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von Zielnukleinsäuresequenzen in einer Probe vor. Mit "Nukleinsäure" oder "Oligonukleotid" oder grammatikalischen Äquivalenten hierin werden mindestens zwei Nukleotide, welche miteinander kovalent verbunden sind, gemeint. Eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung wird im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen enthalten, obwohl in manchen Fällen, wie nachstehend angegeben, wie etwa beim Entwurf von Sonden, Nukleinsäureanaloge, welche alternative Grundgerüste aufweisen können, umfassend zum Beispiel Phosphoramid-(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10): 1925 (1993) und Bezugsstellen darin; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzi et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 (1986)), Phosphorthioat-(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); und U.S.-Patent Nr. 5 644 048 ), Phosphordithioat-(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), O-Methylphosphoramidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) sowie Peptid-Nukleinsäuregrundgerüste und -Bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996), welche alle durch den Bezug darauf einbezogen sind) eingeschlossen werden. Andere Analog-Nukleinsäuren schließen diejenigen mit positiven Grundgerüsten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995)), nicht-ionischen Grundgerüsten ( U.S.-Patente Nr. 5 386 023 , 5 637 684 , 5 602 240 , 5 216 141 und 4 469 863 ; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg.: Y. S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Grundgerüste, einschließlich denjenigen, beschrieben in den U.S.-Patenten Nr. 5 235 033 und 5 034 506 , und Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg.: Y. S. Sanghui und P. Dan Cook, ein. Nukleinsäuren, welche einen oder mehrere carbocyclische Zucker enthalten, sind ebenfalls innerhalb der Definition von Nukleinsäuren eingeschlossen (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) S. 169–176). Mehrere Nukleinsäureanaloge werden in Rawis, C & E News, 2. Juni 1997, Seite 35, beschrieben. Diese Modifikationen des Ribose-Phosphat-Grundgerüsts können vorgenommen werden, um die Zufügung von Markierungen zu erleichtern oder um die Stabilität und Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen.
Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, können alle diese Nukleinsäureanaloge Anwendung in der vorliegenden Erfindung finden. Darüber hinaus können Mischungen von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren und Analogen hergestellt werden. Alternativ dazu können Mischungen von unterschiedlichen Nukleinsäureanalogen und Mischungen von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren und Analogen hergestellt werden.
Die Nukleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig, wie angegeben, sein oder Bereiche von beidem, doppelsträngiger oder einzelsträngiger Sequenz, enthalten. Die Nukleinsäure kann DNA, sowohl genomisch als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid sein, wobei die Nukleinsäure jedwede Kombination von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und jedwede Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xathanin, Hypoxathanin, Isocytosin, Isoguanin etc., enthält. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Nukleinsäuresonden, die einen gewissen Anteil an Uracil umfassen, wie es nachstehend vollständiger geschildert wird. Eine Ausführungsform verwendet Isocytosin und Isoguanin in Nukleinsäuren, die ausgelegt sind, um zu anderen Sonden, anstatt zu Zielsequenzen, komplementär zu sein, da dies die nicht-spezifische Hybridisierung verringert, wie es im Allgemeinen beschrieben wird im U.S.-Patent Nr. 5 681 702 . Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "Nukleosid" Nukleotide, wie auch Nukleosid- und Nukleotidanaloge und modifizierte Nukleoside, wie markierte Nukleoside ein. Darüber hinaus schließt "Nukleosid" nicht-natürlich vorkommende analoge Strukturen ein. So werden beispielsweise die einzelnen Einheiten einer Peptid-Nukleinsäure, jeweils enthaltend eine Base, hierin als ein Nukleosid bezeichnet. In ähnlicher Weise schließt der Begriff "Nukleotid" (hierin manchmal abgekürzt als "NTP") sowohl Ribonukleinsäure als auch Desoxyribonukleinsäure ein (hierin manchmal abgekürzt als "dNTP") ein. Während viele nachstehende Beschreibungen den Begriff "dNTP" verwenden, sollte es bemerkt werden, dass in vielen Fällen, abhängig von der Matrize und dem Enzym, NTPs substituiert werden können.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung richten sich auf den Nachweis von Zielsequenzen. Der Begriff "Zielsequenz" oder "Zielnukleinsäure" oder grammatikalische Äquivalente bezeichnen hierin eine Nukleinsäuresequenz auf einem Einzelstrang von Nukleinsäure. Die Zielsequenz kann ein Bereich eines Gens, einer regulatorischen Sequenz, genomischer DNA, cDNA, RNA, einschließlich mRNA oder rRNA oder sonstigen, sein. Wie hierin angegeben, kann die Zielsequenz eine Zielsequenz aus einer Probe oder ein sekundäres Ziel, wie ein Produkt einer Genotypisierungs- oder Amplifikationsreaktion, wie eine ligierte zirkularisierte Sonde, ein Amplikon aus einer Amplifikationsreaktion, wie PCR, etc. sein. So wird zum Beispiel eine Zielsequenz aus einer Probe amplifiziert, um ein sekundäres Ziel (Amplikon) herzustellen, welches nachgewiesen wird. Alternativ dazu, wie nachstehend vollständiger angegeben, ist das, was amplifiziert wird, die Sondensequenz, obwohl dies nicht allgemein bevorzugt wird. Die Zielse quenz kann von jedweder Länge sein, wobei es sich versteht, dass längere Sequenzen spezifischer sind. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann die Komplementaritäts-Zielsequenz viele Formen einnehmen. Sie kann zum Beispiel innerhalb einer größeren Nukleinsäuresequenz enthalten sein, d. h. unter anderem der Gesamtheit oder einem Teil eines Gens oder einer mRNA, einem Restriktionsfragment von einem Plasmid oder genomischer DNA. Wie es nachstehend vollständiger angegeben wird, werden Sonden hergestellt, um mit Zielsequenzen zu hybridisieren, um die Gegenwart, Sequenz oder Menge einer Zielsequenz in einer Probe zu bestimmen. Allgemein gesprochen wird dieser Begriff vom Fachmann auf dem Gebiet verstanden werden. Bevorzugte Zielsequenzen liegen im Bereich von etwa 20 bis etwa 1000000 hinsichtlich der Größe, weiter bevorzugt von etwa 50 bis etwa 10000, wobei von etwa 40 bis etwa 50000 am stärksten bevorzugt wird.
Falls erforderlich wird die Zielsequenz unter Anwendung bekannter Techniken hergestellt. Zum Beispiel kann die Probe behandelt werden, um die Zellen unter Verwendung von bekannten Lysepuffern, Schallbehandlung, Elektroporation etc. zu lysieren, wobei eine Reinigung und Amplifikation wie nachstehend angegeben nach Bedarf stattfindet, wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird. Darüber hinaus können die hierin angegebenen Reaktionen auf einer Vielzahl von Wegen bewerkstelligt werden, wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird. Komponenten der Reaktion können gleichzeitig oder sequenziell, in beliebiger Reihenfolge zugegeben werden, wobei bevorzugte Ausführungsformen nachstehend angegeben sind. Darüber hinaus kann die Reaktion eine Vielzahl anderer Reagenzien einschließen, welche in den Assays eingeschlossen werden können. Diese schließen Reagenzien wie Salze, Puffer, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergenzien etc. ein, welche verwendet werden können, um eine optimale Hybridisierung und Detektion zu erleichtern und/oder nicht-spezifische oder Hintergrund-Wechselwirkungen zu verringern. Des Weiteren können Reagenzien, welche anderweitig die Effizienz des Assays verbessern, wie Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren, antimikrobielle Agenzien etc., abhängig von den Proben-Herstellungsverfahren und der Reinheit des Ziels verwendet werden.
Darüber hinaus werden, in den meisten Ausführungsformen, doppelsträngige Zielnukleinsäuren denaturiert, um sie einzelsträngig zu machen, so dass eine Hybridisierung der Primer und anderer Sonden der Erfindung gestattet wird. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet einen Wärmeschritt, im Allgemeinen durch Erhöhen der Temperatur der Reaktion auf etwa 95°C, obwohl pH-Änderungen und andere Techniken ebenfalls angewandt werden können.
Weiterhin kann in einigen Fällen, zum Beispiel wenn genomische DNA verwendet werden soll, selbige eingefangen werden, wie etwa durch Anwendung von Präzipitations- oder Größenausschlusstechniken. Alternativ dazu kann DNA prozessiert werden, um Fragmente gleichmäßiger Länge zu ergeben, wobei im Fachgebiet allgemein bekannte Techniken eingesetzt werden, wie z. B. hydrodynamische Scherung oder Restriktionsendonukleasen.
Die Zielsequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen mindestens eine erste und eine zweite Zieldomäne. Zieldomänen sind Abschnitte der Zielsequenz. Im Allgemeinen kann jede Zieldomäne jedwede Länge aufweisen, wobei es sich versteht, dass längere Sequenzen spezifischer sind. Die geeignete Länge der Zieldomänen in einer Sonde wird von Faktoren, einschließlich des GC-Gehalts der Regionen und ihrer Sekundärstruktur, abhängen. Die Überlegungen sind ähnlich zu denjenigen, welche zum Identifizieren einer passenden Sequenz zur Verwendung als Primer angewandt werden, und werden nachstehend weiter beschrieben. Die Länge der Sonde und der GC-Gehalt werden die Tm des Hybrids bestimmen und daher die Hybridisierungsbedingungen, welche zum Erhalten einer spezifischen Hybridisierung der Sonde an die Matrizennukleinsäure notwendig sind. Diese Faktoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und können ebenfalls in Assays getestet werden. Eine umfassende Richtlinie hinsichtlich der Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen (1993), "Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology – hybridization with nucleic acid grobes". Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen ausgewählt, um etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei definierter/m Ionenstärke und pH zu sein. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter/m Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Hochstringente Bedingungen werden gewählt, um gleich dem Tm-Punkt für eine jeweilige Sonde zu sein. Manchmal wird der Begriff "Td" verwendet, um die Temperatur zu definieren, bei welcher mindestens die Hälfte der Sonde von einer perfekt passenden Zielnukleinsäure dissoziiert. In jedem Fall steht eine Vielzahl von Schätzungstechniken zum Abschätzen der Tm oder Td zur Verfügung und wird allgemein in Tijssen, siehe oben, beschrieben. Typischerweise schätzt man von G-C-Basenpaaren in einem Duplex bzw. Doppelstrang, etwa 3°C zur Tm beizusteuern, während man von A-T-Basenpaaren schätzt, etwa 2°C beizusteuern, bis zu einem theoretischen Maximum von etwa 80–100°C. Allerdings sind weiterentwickelte Modelle der Tm und Td verfügbar und angemessen, in welchen G-C-Stacking-Wechselwirkungen, Lösungsmitteleffekte, die gewünschte Assaytemperatur und dergleichen berücksichtigt werden. Zum Beispiel können Sonden entworfen werden, um eine Dissoziationstemperatur (Td) von ungefähr 60°C aufzuweisen, wobei die folgende Formel angewandt wird: Td = (((((3 × #GC) + (2 × #AT)) × 37) – 562)/#bp) – 5; worin #GC, #AT und #bp die Anzahl von Guanin-Cytosin-Basenpaaren, die Anzahl von Adenin-Thymin-Basenpaaren bzw. die Anzahl der insgesamten Hasenpaare sind, welche am Annealen der Sonde an die Matrizen-DNA beteiligt sind.
Der Stabilitätsunterschied zwischen einem perfekt gepaarten Duplex und einem fehlgepaarten Duplex, insbesondere wenn die Fehlpaarung lediglich eine einzelne Base ist, kann ziemlich gering sein, entsprechend einem Unterschied in der Tm zwischen den beiden von so wenig wie 0,5 Grad; siehe Tibanyenda, N., et al., Eur. J. Biochem. 139: 19 (1984), und Ebel, S., et al., Biochem. 31: 12083 (1992). Noch bedeutender versteht es sich, dass mit Zunahme der Länge der Homologieregion die Auswirkung einer Einzelbasen-Fehlpaarung auf die gesamte Duplexstabilität ab nimmt. Wenn es eine Wahrscheinlichkeit gibt, dass Fehlpaarungen zwischen der Sonde und den Zieldomänen vorliegen werden, kann es daher ratsam sein, eine längere das Ziel erkennende Domäne in der Sonde einzuschließen.
Somit können die Spezifität und Selektivität der Sonde angepasst werden, indem man geeignete Längen für die das Ziel erkennenden Domänen und passende Hybridisierungsbedingungen wählt. Wenn es sich bei der Matrizen-Nukleinsäure um genomische DNA, z. B. genomische Säuger-DNA, handelt, muss die Selektivität der das Ziel erkennenden Domänen hoch genug sein, um die korrekte Base in 3 × 10⁹ zu identifizieren, damit eine Weiterverarbeitung direkt aus genomischer DNA gestattet wird. In Situationen, bei welchen ein Teil der genomischen DNA zuerst aus dem Rest der DNA isoliert wird, z. B. durch Trennen eines oder mehrerer Chromosomen vom Rest der Chromosomen, ist die Selektivität oder Spezifität der Sonde jedoch weniger bedeutungsvoll.
Die Länge der Sonde, und daher die Hybridisierungsbedingungen, werden auch davon abhängen, ob eine einzelne Sonde an die Matrizen-Nukleinsäure hybridisiert wird, oder mehrere Sonden. Wenn mehrere Sonden verwendet werden, und wenn alle der Sonden gleichzeitig mit der Matrizen-Nukleinsäure hybridisiert werden sollen, dann ist es wünschenswert, die das Ziel erkennenden Domänen der verschiedenen Sonden so zu entwerfen, dass deren Tm und/oder Td ähnlich ist, so dass alle der Sonden spezifisch mit der Matrizen-Nukleinsäure hybridisieren werden. Diese Bedingungen können vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden, wobei die oben erörterten Faktoren, ebenso wie diejenigen, welche im Zusammenhang mit den Primern beschrieben sind, berücksichtigt werden.
Auf Grund der Länge der Präzyklus-Sonden wird es jedoch bevorzugt, dass jede Zieldomäne hinsichtlich der Größe in einem Bereich von etwa 5 Basen bis etwa 100 Basen liegt, wobei etwa 5 bis etwa 40 besonders bevorzugt sind. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, können die Zieldomänen die gleiche Länge oder unterschiedliche Längen aufweisen und können im großen Maße unterschiedliche Tm's aufweisen. Mit den Begriffen "erste" und "zweite" wird nicht gemeint, eine Orientierung der Sequenzen im Hinblick auf die 5'-3'-Orientierung der Zielsequenz zuzuweisen. Unter Voraussetzung einer 5'-3'-Orientierung der komplementären Zielsequenz kann die erste Zieldomäne zum Beispiel entweder 5' gelegen zur zweiten Domäne oder 3' gelegen zur zweiten Domäne angeordnet sein.
Wie hierin angegeben, können die Zieldomänen benachbart (d. h. angrenzend) oder getrennt, d. h. durch eine "Fuge" getrennt, sein. Falls getrennt, können die Zieldomänen von einem einzelnen Nukleotid oder einer Mehrzahl von Nukleotiden getrennt sein, wobei 1 bis etwa 2000 bevorzugt sind, und 1 bis etwa 500 besonders bevorzugt werden, obwohl der Fachmann auf dem Gebiet davon ausgehen wird, dass in einigen Ausführungsformen längere Fugen Anwendung finden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform, z. B. für Genotypisierungs-Reaktionen, wie es nachstehend vollständiger angegeben ist, umfasst die Zielsequenz eine Position, für welche Sequenzinformation gewünscht wird, welche hierin im Allgemeinen als die "Nachweisposition" bezeichnet wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nachweisposition ein Einzelnukleotid, obwohl sie in alternativen Ausführungsformen eine Mehrzahl von Nukleotiden umfassen kann, entweder miteinander fortlaufend oder durch ein oder mehrere Nukleotide voneinander getrennt. Mit "Mehrzahl", wie hierin verwendet, sind mindestens zwei gemeint. Wie hierin verwendet, wird die Base, welche mit der Nachweispositions-Base in einem Ziel eine Basenpaarung eingeht, als die "Abfrage-Position" bezeichnet. In dem Fall, worin eine Einzelnukleotid-Fuge verwendet wird, wird das NTP, welches eine perfekte Komplementarität zu der Nachweisposition aufweist, "Abfrage-NTP" genannt.
In diesem Zusammenhang sollte es bemerkt werden, dass "Fehlpaarung" ein relativer Begriff ist und damit gemeint wird, einen Unterschied in der Identität einer Base an einer besonderen Position, welche hierin als "Nachweisposition" bezeichnet wird, zwischen zwei Sequenzen anzugeben. Im Allgemeinen werden Sequenzen, welche von Wildtypsequenzen abweichen, als Fehlpaarungen bezeichnet. Allerdings, und besonders im Fall von SNPs, kann das, was einen "Wildtyp" ausmacht, schwierig zu bestimmen sein, da relativ häufig mehrere Allele in der Population zu beobachten sind, und "Fehlpaarung" in diesem Zusammenhang daher die künstliche Annahme einer Sequenz als dem Standard erfordert. Für die Zwecke dieser Erfindung werden Sequenzen daher hierin als "perfekte Paarung" und "Fehlpaarung" bezeichnet. Auf "Fehlpaarungen" wird manchmal ebenfalls als "allelische Varianten" Bezug genommen. Der Begriff "Allel", der hierin austauschbar mit "allelische Variante" verwendet wird, bezieht sich auf alternative Formen von einem Gen oder Abschnitten davon. Allele besetzen den gleichen Locus oder die gleiche Position auf homologen Chromosomen. Wenn ein Subjekt zwei identische Allele eines Gens aufweist, sagt man, dass das Subjekt hinsichtlich des Gens oder Allels homozygot ist. Wenn ein Subjekt zwei unterschiedliche Allele eines Gens aufweist, sagt man, dass das Subjekt hinsichtlich des Gens heterozygot ist. Allele eines spezifischen Gens können sich voneinander in einem einzelnen Nukleotid oder mehreren Nukleotiden unterscheiden und können Substitutionen, Deletionen und Insertionen von Nukleotiden einschließen. Ein Allel eines Gens kann auch eine Form eines Gens sein, welche eine Mutation enthält. Der Begriff "allelische Variante einer polymorphen Region eines Gens" bezieht sich auf eine Region eines Gens, an welcher, in anderen Individuen der gleichen Art, eine von mehreren Nukleotidsequenzen in dieser Region des Gens vorgefunden wird.
Die vorliegende Erfindung stellt Präzyklus-Sonden bereit, welche mit der Zielsequenz, wie hierin beschrieben, hybridisieren. Im Allgemeinen werden die Sonden der vorliegenden Erfindung entworfen, um komplementär zu einer Zielsequenz zu sein (entweder der Zielsequenz der Probe oder zu anderen Sondensequenzen, zum Beispiel universellen Primern und Barcodes, wie es hierin beschrieben wird), so dass die Hybridisierung des Ziels und der Sonden der vorliegenden Erfindung stattfindet. Diese Komplementarität muss nicht perfekt sein; es kann jedwede Anzahl von Hasenpaaren-Fehlpaarungen geben, welche die Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und den einzelsträngigen Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung stören wird. Wenn jedoch die Anzahl an Mutationen so groß ist, dass keine Hybridisierung, selbst unter den am wenigsten stringenten Hybridisierungsbedingungen, auftreten kann, ist die Sequenz nicht eine komplementäre Zielsequenz. Somit wird mit "im Wesentlichen komplementär" hierin gemeint, dass die Sonden ausreichend komplementär zu den Zielsequenzen sind, um unter den gewählten Reaktionsbedingungen zu hybridisieren.
Eine Vielfalt an Hybridisierungsbedingungen kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, einschließlich Bedingungen von hoher, mäßiger und geringer Stringenz; siehe zum Beispiel Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe 1989, und Short Protocols in Molecular Biology, Hrsg.: Ausubel et al., welche hierin zum Bezug einbezogen sind. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Richtlinie hinsichtlich der Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5–10°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei definierter Ionenstärke und definiertem pH sind. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, definiertem pH und definierter Nukleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der zum Ziel komplementären Sonden mit der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (da die Zielsequenzen im Überschuss vorhanden sind, sind bei der Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen werden diejenigen sein, bei welchen die Salzkonzentration geringer als etwa 1,0 M Natriumion, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 ist, und die Temperatur mindestens etwa 30°C, für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide), und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z. B. größer als 50 Nukleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von Helixdestabilisierenden Mitteln, wie Formamid, erzielt werden. Die Hybridisierungsbedingungen können ebenfalls variieren, wenn ein nicht-ionisches Grundgerüst, d. h. PNA, verwendet wird, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Darüber hinaus können Vernetzungsmittel nach der Zielbindung zugegeben werden, um die zwei Stränge des Hybridisierungskomplexes zu vernetzen, d. h. kovalent zu binden.
Somit werden die Assays im Allgemeinen unter Stringenzbedingungen durchgeführt, welche die Bildung des Hybridisierungskomplexes nur in Gegenwart von Ziel gestatten. Die Stringenz kann gesteuert werden durch Änderung eines Stufen-Parameters, welcher eine thermodynamische Variable ist, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Temperatur, Formamid konzentration, Salzkonzentration, Konzentration an chaotropem Salz, pH-Wert, Konzentration an organischem Lösungsmittel, etc. Alternativ dazu kann auch ein Einzelstrang-bindendes Protein verwendet werden, um die Spezifität zu erhöhen.
Diese Parameter können auch angewandt werden, um die nicht-spezifische Bindung zu steuern, wie es im Allgemeinen in U.S.-Patent Nr. 5 681 697 geschildert wird. Daher kann es wünschenswert sein, bestimmte Schritte bei höheren Stringenzbedingungen durchzuführen, um nicht-spezifische Bindung zu reduzieren.
Der Entwurf, die Herstellung und Anwendung der Präzyklus-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung werden nun ausführlich beschrieben werden. Wie oben skizzenartig angegeben und hierin vollständiger erläutert, umfassen die Präzyklus-Sonden der vorliegenden Erfindung mindestens erste und zweite das Ziel erkennende Domänen und mindestens eine universellen Primer bindende Stelle oder Sequenz. Gegebenenfalls können die Präzyklus-Sonden ferner eine oder mehrere Schnittstellen, Barcode-Sequenzen, eine oder mehrere Restriktionsstellen und/oder Markierungssequenzen umfassen.
Eine "universellen Primer bindende" bzw. "universelle" Priming-Stelle ist eine Stelle, mit welcher ein universeller Primer hybridisieren wird. Im Allgemeinen bezieht sich "universell" auf die Verwendung eines einzigen Primers oder Satzes an Primern für eine Mehrzahl von Amplifikationsreaktionen. Beim Nachweis oder Genotypisieren von 100 unterschiedlichen Zielsequenzen können beispielsweise alle Präzyklus-Sonden die identischen universellen Primer bindenden Sequenzen gemeinsam haben, was die Multiplex-Amplifikation der 100 unterschiedlichen Sonden unter Verwendung eines einzigen Satzes an Primer gestattet. Dies gestattet eine einfache Synthese (z. B. wird nur ein Satz an Primer hergestellt), was zu verminderten Kosten führt, sowie Vorteile in der Kinetik der Hybridisierung. Am bedeutsamsten vereinfacht die Verwendung solcher Primer in großem Maße die Multiplexierung dahingehend, dass nur zwei Primer benötigt werden, um eine Mehrzahl von Sonden zu amplifizieren.
Es sollte ebenfalls bemerkt werden, dass "Sätze" von universellen Primer bindenden Sequenzen/Primer verwendet werden können. Zum Beispiel kann es, in hochmultiplexierten Reaktionen, nützlich sein, mehrere Sätze von universellen Sequenzen anstatt einem einzelnen Satz zu verwenden; zum Beispiel können 100 unterschiedliche Präzyklus-Sonden die gleichen Primer bindenden Sequenzen aufweisen, und die zweiten 100 einen unterschiedlichen Satz, etc.
Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, können die Präzyklus-Sonden der Erfindung eine Vielzahl von Konfigurationen einnehmen. Zur Vorbereitung können die Präzyklus-Sonden entworfen werden, wobei die 5'- und 3'-Termini der das Ziel erkennenden Domänen an benachbarte Nukleotide in der Zielsequenz, oder mit Fugen, hybridisieren, wie es nachstehend vollständiger dargelegt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Präzyklus-Sonde zwei das Ziel erkennende Domänen, welche aneinandergrenzend (d. h. ohne irgendwelche Fugennukleotide) mit den Zieldomänen der Zielsequenz hybridisieren; dies wird hierin manchmal als eine "anstoßende" Präzyklus-Sonde bezeichnet. Diese Ausführungsform findet Verwendung in beiden, auf Nachweis und/oder Genotypisierung gerichteten Anwendungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die anstoßende Präzyklus-Sonde eher für den Nachweis von Zielsequenzen als für Genotypisierung verwendet. In dieser Ausführungsform enthält die Zielsequenz keine besondere Nachweisposition. Daher sind anstoßende Präzyklus-Sonden entworfen, wobei sie 5'- und 3'-Termini aufweisen, welche, mit perfekter Komplementarität, mit den direkt aneinandergrenzenden Zieldomänen der Zielsequenz hybridisieren, so dass die 5'- und 3'-Termini anstoßend sein werden, wenn die Sonde mit dem Ziel hybridisiert wird. Nur wenn perfekte Komplementarität an den 5'- und 3'-Termini existiert, werden die zwei Enden der anstoßenden Präzyklus-Sonde in Gegenwart einer Ligase ligiert, wie nachstehend angegeben, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden, welche dann weiter behandelt werden kann, wie es nachstehend geschildert wird. Selbstverständlich wird der Fachmann auf dem Gebiet davon ausgehen, dass die Sonde umso wahrscheinlicher ligiert werden wird, je weiter irgendeine nicht-komplementäre Sequenz von der Stelle der Ligation [entfernt] liegt.
In einer alternativen Ausführungsform wird eine anstoßende Präzyklus-Sonde für die Genotypisierung einer Nachweisposition in der Zielsequenz verwendet. In dieser Ausführungsform umfasst mindestens eine der anstoßenden Präzyklus-Sonden eine Abfrage-Base entweder am 3'- oder 5'-Terminus der Präzyklus-Sonde, z. B. ein Nukleotid, welches perfekte Komplementarität zur Nachweisposition der Zielsequenz besitzt. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann entweder die 3'- oder 5'-Position verwendet werden, da Ligasen nicht ligieren werden, es sei denn eine perfekte Basenpaarung zwischen beiden Termini besteht. Diese Ausführungsform wird in 3A im Allgemeinen abgebildet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Mehrzahl von anstoßenden Präzyklus-Sonden verwendet. In einer solchen Ausführungsform umfasst jede anstoßende Präzyklus-Sonde eine unterschiedliche Barcode-Sequenz, wie es nachstehend vollständiger beschrieben wird. Wenn zum Beispiel die SNP-Position biallelisch ist, z. B. zwei unterschiedliche Basen enthält, werden zwei anstoßende Präzyklus-Sonden verwendet, jede mit einer anderen Abfrage-Base und einem unterschiedlichen Barcode. Nur wenn perfekte Komplementarität zwischen der Abfrage-Base und der Nachweisposition vorliegt, wird eine Ligation stattfinden. In dieser Ausführungsform dient die Barcode-Sequenz als ein Typ von "Markierung" oder "Tag", der identifiziert, welche Base an der Abfrage-Position vorhanden war. Alternativ dazu werden zwei anstoßende Präzyklus-Sonden verwendet, welche eine unterschiedliche Abfrage-Base aber den gleichen Barcode aufweisen. In dieser Ausführungsform werden die Sonden in separaten Reaktionsmischungen verwendet und werden einzeln weiterbearbeitet und wie hierin beschrieben nachgewiesen, so dass nur die Sonde mit perfekter Komplementarität zwischen der Abfrage-Base und der Nachweisposition unter Bildung einer zirkularisierten Sonde zum Nachweis ligiert werden wird. Die letztgenannte Ausführungsform kann z. B. zur Unterscheidung zwischen hauptsächlichen und nebensächlichen Allelen eines Gens von Interesse verwendet werden.
Die Präzyklus-Sonden der vorliegenden Erfindung können auch nicht-anstoßende, das Ziel erkennende Domänen umfassen, welche nicht aneinander angrenzend auf der Zielsequenz hybridisieren, d. h. die entsprechenden Zieldomänen der Zielsequenz sind durch eine Fugendomäne getrennt, die ein oder mehrere Nukleotide umfasst. Diese Sonden können auch in Anwendungen, welche sich auf Nachweis, Amplifikation und/oder Genotypisierung richten, verwendet werden.
In einer solchen Ausführungsform umfasst die Präzyklus-Sonde zwei das Ziel erkennende Domänen, welche mit zwei Zieldomänen in einer Zielsequenz hybridisieren, die durch eine Einzelnukleotid-Fugendomäne getrennt sind (eine Einzelnukleotid-Fugenposition). Wiederum findet diese Ausführungsform in Anwendungen, die auf beides, Nachweis und/oder Genotypisierung, gerichtet sind, Verwendung, wobei letztere bevorzugt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Einzelfugen-Präzyklus-Sonde für die Gentypisierung von Zielsequenz verwendet. In dieser Ausführungsform schließt die Zielsequenz eine besondere Nachweisposition in der Fugendomäne ein, und Präzyklus-Sonden sind entworfen, wobei sie das Ziel erkennende Domänen aufweisen, die mit perfekter Komplementarität an die durch das Einzelnukleotid getrennten Zieldomänen der Zielsequenz hybridisieren. In dieser Ausführungsform werden eine Polymerase und eine Spezies von dNTP zugegeben. Wenn das dNTP ein Abfrage-dNTP ist, z. B. eine perfekte Komplementarität zum Nachweispositions-Nukleotid aufweist, wird die Polymerase die Präzyklus-Sonde verlängern und eine Ligationsstruktur bilden. Das Zugeben einer Ligase, wie hierin angegeben, führt dann zu einer zirkularisierten Sonde.
In dieser Genotypisierungs-Ausführungsform muss eine Mehrzahl von getrennten Reaktionen vorliegen; das heißt, wenn das Allel biallelisch ist, werden mindestens zwei Reaktionen ausgeführt, jede mit einem anderen dNTP. In ähnlicher Weise werden triallelische Positionen mit mindestens drei Reaktionen ausgeführt, etc. Jede Reaktionsmischung kann separat bearbeitet und nachgewiesen (z. B. zu einem Array bzw. einer Feldanordnung zugefügt) werden, oder sie können vereinigt werden, nach der Zirkularisierung und Entfernung der Extra-dNTPs, und gemeinsam verarbeitet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können alle vier dNTP-Reaktionen gleichzeitig in getrennten Reaktionsmischungen ausgeführt werden, jede mit einem anderen dNTP, um die Komplementarität eines Allels zu identifizieren, und/oder um ein Maß des Eigenhintergrunds zu liefern.
Alternativ dazu wird ein Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass man die Einzelfugen-Präzyklus-Sonde auch für Nachweis und/oder Amplifikation einfach verwenden kann durch gleichzeitiges Zugeben aller vier dNTPs in die gleiche Reaktionsmischung, zusammen mit einer Polymerase, welche die dNTPs mit perfekter Komplementarität zur Nachweisposition, für die anschließende Ligation und Amplifikation der Sonde, anfügt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Präzyklus-Sonde zwei das Ziel erkennende Domänen, welche mit zwei Zieldomänen hybridisieren, die durch eine Fugendomäne getrennt sind, die eine Mehrzahl von Nukleotiden umfasst (eine "Oligofugen"-Sonde). Wie oben, findet diese Ausführungsform entweder in Nachweis-, Amplifikations- oder Genotypisierungs-Reaktionen Verwendung und kann entweder auf Sonden mit einer "Klappen-Fuge" oder auf einem oder mehreren zusätzlichen Oligonukleotiden, die hierin manchmal als "Fugenoligonukleotide" oder "dazwischenliegende Oligonukleotide" bezeichnet werden, beruhen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Oligofugen-Präzyklus-Sonde in Amplifikationsreaktionen verwendet. In dieser Ausführungsform, wie es allgemein in der 3B abgebildet ist, schreitet die Reaktion unter Verwendung einer Polymerase und von dNTPs, in Gegenwart einer Ligase, voran, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden. Die geschlossene ringförmige Sonde wird dann geschnitten und amplifiziert, wie es hierin angegeben wird. Der Fachmann auf dem Gebiet wird davon ausgehen, dass man, durch Einbinden desselben Primers oder derselben Primer in jeder einer Mehrzahl von Sonden gegen eine Mehrzahl von unterschiedlichen Zielsequenzen, mehrere Ziele von Interesse in einem einzigen Reaktionsgefäß gleichzeitig amplifizieren kann.
In einer anderen Ausführungsform wird die Mehrnukleotidfugen-Sonde mit einem oder mehreren Fugenoligonukleotiden verwendet. In dieser Ausführungsform, wie sie allgemein in 3C abgebildet wird, wird, anstatt die Fuge enzymatisch aufzufüllen, ein im Wesentlichen komplementäres Fugenoligonukleotid verwendet, welches dann auf jedem Ende ligiert wird, wie es hierin angegeben ist. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann diese Ausführungsform ebenfalls auf der Verwendung einer Mehrzahl von Fugenoligonukleotiden beruhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oligofugen-Sonde in Genotypisierungs-Reaktionen verwendet. In dieser Ausführungsform liegt die Nachweisposition in der "Mitte" (z. B. an irgendeiner Position, intern zur Fuge) der Fuge, und eine "Klappen-Fugen"-Präzyklus-Sonde wird verwendet. Diese Ausführungsform ist allgemein in der 3D abgebildet. Anders als die anderen hier angegebenen Reaktionen, beruht diese Ausführungsform auf herkömmlichen Hybridisierungsverfahren, welche die Variation von Stringenzbedingungen (Temperatur, Pufferbedingungen etc.) verwenden, um Nukleotide an der Nachweisposition zu unterscheiden. Daher wird die Reaktion unter Bedingungen durchgeführt, welche eine Ligation nur erlauben, wenn die Abfrage-Base perfekt komplementär zu der Nachweisbase ist. Das heißt, da alle anderen Parameter gleich sind, wird eine perfekt komplementäre Sonde bei irgendeiner besonderen Temperatur stabiler sein und vermutlich eine langsamere Ablösegeschwindigkeit (off rate) aufweisen als eine Sonde, welche eine Fehlpaarung umfasst. Durch Verwenden unterschiedlicher Sonden, jede mit einer anderen Base an der Abfrage-Position, wird demgemäß die Identifizierung der Base an der Nachweisposition aufgeklärt. Wie oben angegeben, können identische oder verschiedene Barcodes in die Sonden für einen anschließenden Nachweis jeweils in getrennten oder den gleichen Reaktionsmischungen eingebunden werden. Die Unterschiede können durch Verwenden verschiedener Temperaturen verstärkt werden. Es sollte ebenfalls bemerkt werden, dass in dieser Ausführungsform die Länge der Fuge und die Position der Abfrage-Base berücksichtigt werden sollten, solange Fugen mit entfernt vom Terminus gelegenen Abfrage-Basen noch hybridisieren und das Stattfinden einer Ligation erlauben können.
Alternativ dazu kann derselbe Typ an Reaktion unter Verwendung von einem oder mehreren Fugenoligonukleotiden stattfinden, wie in der 3C abgebildet. In dieser Ausführungsform wird, wenn die Abfrage-Position intern hinsichtlich des Fugenoligonukleotids liegt, eine herkömmliche Stringenzkontrolle durchgeführt. Alternativ dazu kann die Abfrage-Position entweder am 5'- oder 3'-Terminus (oder beiden, im Falle dass zwei SNP-Nachweispositionen nahe beieinander liegen) des Fugenoligonukleotids vorliegen. Diese Ausführungsform kann in dem Fall Verwendung finden, in welchem die Zieldomänen aufgrund von Spezifitätsbedenken lang sein müssen; im Allgemeinen bestehen jedoch umso mehr Qualitätskontrollen-Probleme bei der Synthese, je länger die Präzyklus-Sonde ist.
In ähnlicher Weise können Genotypisierungs-Reaktionen mit einer Mehrzahl von Fugenoligonukleotiden durchgeführt werden, erneut entweder mit internen Abfrage-Positionen oder Abfrage-Positionen an einem oder mehreren Termini der Fugenoligonukleotide.
Alle der vorangehenden Ausführungsformen der beanspruchten Erfindung werden von einer Verringerung von Hintergrundsignalen während der anschließenden Amplifikationsreaktionen profitieren. Wie es hierin ausführlicher beschrieben wird, kann man irgendwelche nicht-umgesetzten Sonden und/oder Zielsequenzen auf eine Vielzahl von Wegen für eine Amplifikation nicht-verfügbar machen. Bevorzugte Ausführungsformen schließen z. B. die Zugabe von Exonuklease nach der Ligation, um verbleibende lineare Nukleinsäuren abzubauen, und/oder die Einbindung von geeigneten Markierungen (z. B. Biotin), um eine Abtrennung und Entfernung von entweder nicht-umgesetzter Sonde oder dem zirkularisierten Sonde:Ziel-Komplex zu gestatten, insbesondere wenn der Letztere genomische DNA umfasst, ein. Zusätzliche Verringerungsschritte werden ebenfalls in Betracht gezogen und werden nachstehend ausführlicher erörtert, einschließlich z. B. Kettenverlängerung der zirkularisierten Sonde für eine weitere Analyse des verlängerten Produkts.
Wie es allgemein in den Figuren abgebildet und hierin beschrieben wird, gibt es eine Vielzahl von unterschiedlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, einschließlich eines "Ein-Stufen"- und eines "Zwei-Stufen"-Verfahrens, welche nach der Ligation der Präzyklus-Sonde angewandt werden können.
In dem "Ein-Stufen"-Verfahren wird die geschlossene ringförmige Sonde geschnitten und direkt amplifiziert. In dem "Zwei-Stufen"-Verfahren wird die geschlossene ringförmige Sonde zuerst unter Verwendung einer einzelnen universellen Primer bindenden Stelle kopiert, um ein verlängertes Produkt der geschlossenen ringförmigen Sonde herzustellen. Die geschlossene ringförmige Sonde wird dann zusammen mit der Zielsequenz und jedweden nicht-zirkularisierten Präzyklus-Sonden entfernt. Dieses Verlängerungsprodukt oder "Zweitstrang" wird nun amplifiziert, wobei die hierin angegebenen Techniken verwendet werden. Diese Ausführungsform wird allgemein in den 5A–5I abgebildet.
Wie nachstehend angegeben, gibt es eine große Vielzahl von Amplifikationsverfahren, welche angewandt werden können, die entweder eine einzelne universellen Primer bindende Stelle oder zwei Primer bindende Stellen erfordern. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikationsreaktion die PCR-Reaktion, und die Präzyklus-Sonde umfasst zwei universelle Primer, einen in jeder Orientierung, zur Verwendung in PCR-Reaktionen. Das heißt, wie es im Fachgebiet bekannt ist, die Orientierung von Primer ist derartig, dass eine exponentielle Amplifikation gestattet wird, sodass die erste universellen Primer bindende Sequenz in der "Sinn"-Orientierung vorliegt und die zweite universellen Primer bindende Sequenz in der "Antisinn"-Orientierung vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die universellen Primer orientiert sein, wie es allgemein in den 1–3 abgebildet ist, so dass nach der Ligation und dem anschließenden Schneiden eine PCR-Amplifikation der dazwischenliegenden das Ziel erkennenden Domänen und eines wahlfreien Barcodes erhalten werden kann. Diese Ausführungsform wird besonders z. B. für die Amplifikation der Zielsequenz(en) bevorzugt. Alternativ dazu können die Primer orientiert sein, wobei sie einen Barcode flankieren, wie es allgemein in der 4 abgebildet ist, so dass nur der Barcode und Primer in anschließenden PCR-Reaktionen exponentiell amplifiziert werden können. Darüber hinaus können die resultierenden Amplikons auch durch Einbinden von Schnittstellen verkürzt werden, wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
Im Allgemeinen weisen die universellen Primer bindenden Sequenzen/Primer jeweils eine Länge im Bereich von etwa 12 bis etwa 40 auf, wobei etwa 15 bis etwa 25 bevorzugt wird. Geeignete universellen Primer bindende Sequenzen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, diejenigen ein, welche spezifisch hierin veranschaulicht werden.
Andere Amplifikationsreaktionen, welche nachstehend angegeben werden, können ebenfalls eine oder mehrere universellen Primer bindende Sequenzen erfordern.
Zusätzlich zu den das Ziel erkennenden Domänen und den universellen Primer bindenden Stellen umfassen die Präzyklus-Sonden vorzugsweise mindestens eine erste Schnittstelle. Bevorzugte Schnittstellen sind diejenigen, welche das Schneiden von Nukleinsäuren an spezifischen Stellen gestatten. Geeignete Schnittstellen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den Einbau von Uracil oder anderen Ribosenukleotiden, Restriktionsendonukleasestellen etc. ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Schnittstelle eine Uracil-Base. Dies gestattet die Verwendung von Uracil-N-Glykosylase, einem Enzym, welches die Uracil-Base entfernt, während die Ribose intakt gelassen wird. Diese Behandlung, kombiniert mit der Veränderung des pH-Werts (zum Alkalischen) durch Erwärmen, oder Inkontaktbringen der Stelle mit einer apurinischen Endonuklease, welche basische Nukleoside schneidet, gestattet ein hochspezifisches Schneiden der geschlossenen ringförmigen Sonde.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Restriktionsendonukleasestelle verwendet, vorzugsweise eine solche, die selten vorkommt. Wie es vom Fachmann auf dem Gebiet richtig eingeschätzt werden wird, kann dies das Hinzufügen eines zweiten Strangs von Nukleinsäure zum Hybridisieren mit der Restriktionsstelle erfordern, da viele Restriktionsendonukleasen doppelsträngige Nukleinsäuren benötigen, auf welche sie einwirken. In einer Ausführungsform kann die Restriktionsstelle Teil der Primersequenz sein, so dass das Annalen des Primers die Restriktionsstelle doppelsträngig machen und das Schneiden gestatten wird.
Wenn zwei Primer bindende Stellen verwendet werden, liegt die Schnittstelle vorzugsweise zwischen den zwei Primer bindenden Stellen, so dass nach dem Schneiden eine lineare Sonde mit den Primer bindenden Stellen an den Termini erzeugt wird, wobei die Amplifikation von allem, was dazwischen liegt, gestattet wird.
In manchen Ausführungsformen wird mehr als eine Schnittstelle eingeschlossen. In dieser Ausführungsform, wie sie allgemein in der 5F abgebildet ist, gibt es eine Mehrzahl von Schnittstellen in der Präzyklus-Sonde. Dies kann wegen einer Vielzahl von Gründen ausgeführt werden. In einer Ausführungsform können mehrere Schnittstellen verwendet werden, um jedwede Sonde unfähig zur Amplifikation zu machen. Dies kann angewandt werden, um unerwünschte PCR-Hintergründe zu unterdrücken, wie es hierin im Zwei-Stufen-Verfahren erörtert ist. In einer anderen Ausführungsform sind, durch Abschneiden von Teilen der Präzyklus-Sonde, die erforderten Komponenten für die Amplifikation geringer. Zum Beispiel müssen, durch Schneiden an der Grenzstelle der Zieldomänen und der anderen Komponenten der Sonde, lediglich der Barcode und die universellen Primer amplifiziert werden. Ein weiterer Vorteil des Anordnens der Schnittstelle an anderen Orten als zwischen den zwei Primer besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um fälschliche Amplifikation zu verhindern, insbesondere in dem oben beschriebenen Zwei-Stufen-Verfahren.
Zusätzlich zu den das Ziel erkennenden Domänen, Schnittstelle(n) und universellen Primer bindenden Stellen können die Präzyklus-Sonden der Erfindung ferner eine Barcode-Sequenz umfassen. Die Begriffe "Barcodes", "Adapter", "Tags" und "Zipcodes" sind alle benutzt worden, um künstliche Sequenzen zu beschreiben, welche an Amplikons hinzugefügt werden, um die Auftrennung von Nukleinsäurefragment-Pools zu gestatten. Eine bevorzugte Form von Barcodes sind Hybridisierungs-Barcodes. In dieser Ausführungsform werden Barcodes so gewählt, dass die Hybridisierung mit den komplementären Einfangsonden auf einer Oberfläche eines Arrays gestattet werden. Barcodes dienen als einmalige Identifikatoren der Sonde. Im Allgemeinen werden Sätze von Barcodes und entsprechende Einfangsonden entwickelt, um Kreuzhybridisierung sowohl miteinander als auch mit anderen Komponenten der Reaktionsmischungen zu minimieren, einschließlich den Zielsequenzen und Sequenzen auf den größeren Nukleinsäuresequenzen außerhalb der Zielsequenzen (z. B. Sequenzen innerhalb von genomischer DNA). Andere Formen von Barcodes sind Massen-Tags, welche unter Verwendung von Massenspektroskopie abgetrennt werden können, elektrophoretische Tags, welche basierend auf der elektrophoretischen Mobilität abgetrennt werden können, etc.
Im Allgemeinen können sowohl Barcodes als auch universellen Primier bindende Sequenzen/Primer auf vielfältige Weise gewählt werden, um Kreuzhybridisierung zu vermeiden, wodurch eine Kompetition zwischen individuellen Primern und einer Zielnukleinsäure verhindert und die Duplexbildung der Primer in Lösung sowie eine mögliche Konkatenatbildung der Primer während der PCR verhindert wird. Wenn es mehr als eine konstante Region in dem Primer gibt, werden die konstanten Regionen des Primers so gewählt, dass sie nicht selbst-hybridisieren oder Haarnadelstrukturen bilden.
Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass es eine Vielzahl von möglichen Wegen zur Durchführung der oben genannten Selektionsschritte gibt, und dass Variationen an den Schritten angemessen sind. Am typischsten werden die Selektionsschritte unter Verwendung einfacher Computerprogramme durchgeführt, um die Selektion wie oben dargestellt durchzuführen; allerdings werden alle Schritte gegebenenfalls manuell durchgeführt. Ein verfügbares Computerprogramm für die Primerauswahl ist das MacVector^TM-Programm von Kodak.
Darüber hinaus können die entworfenen Primer mit bekannten Sequenzen in der Matrizen-Nukleinsäure verglichen werden, um nicht-spezifische Hybridisierung der Primer an die Matrizen-Nukleinsäure zu vermeiden. Zum Beispiel können Primer zur Verwendung beim Nachweis von Nukleotiden in humaner genomischer DNA gegen humane GenBank-Sequenzen "geblastet" werden, z. B. beim National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Es gibt zahlreiche Algorithmen, welche zum Vergleichen von Sequenzen, wie Sondensequenzen, mit Matrizen-DNA-Sequenzen und Sonden- und Primer-Sequenzen verwendet werden können. Diese Algorithmen schließen Sequencher, GCG und die HGS-Iris-Software ein. Jedwede Software, welche Sequenz alignieren und Regionen von Homologie aufspüren kann, kann verwendet werden, oder die Sequenzen können manuell verglichen werden.
Ein Barcode zum Nachweis in der Array-Hybridisierung, z. B. hochdichten Arrays, ist vorzugsweise etwa 20 Nukleotide lang, und wird z. B. in Shoemaker et al., (1996) Nature Genetics 14: 450, beschrieben. Barcode-Sequenzen sollten maximal unterschiedlich sein, aber dennoch ähnliche Hybridisierungseigenschaften beibehalten, um die gleichzeitige Analyse auf Hochdichte-Oligonukleotid-Arrays zu erleichtern. Wie in Shoemaker et al., siehe oben, beschrieben, kann ein Algorithmus verwendet werden, um Sätze von Tausenden (über 9000) maximal unterschiedenen 20mer-Barcode-Sequenzen zu selektieren, von welchen vorausgesagt wird, ähnliche Schmelztemperaturen, keine Sekundärstrukturen und keine umfassende Ähnlichkeit zwischen beliebigen zwei Sequenzen (mehr als 5 Fehlpaarungen) aufzuweisen. Darüber hinaus sind Hybridisierungen empfindlich und in der Lage, kleine Unterschiede im Hybridisierungssignal nachzuweisen. Zum Beispiel wurde, wie in Shoemaker et al., siehe oben, weiter beschrieben, eine zweifache Änderung in der Konzentration in Gegenwart einer Hybridisierungsmischung mit 120 Oligonukleotiden nachgewiesen.
Die Verwendung von Barcodes gestattet die Anwendung von "universellen Arrays", z. B. können Arrays mit einem Satz von Einfangsonden angefertigt werden, welche in einer breiten Vielfalt von Anwendungen eingesetzt werden können. Die Verwendung von Barcode-Sequenzen, welche die Anwendung von universellen Arrays gestatten, ist in beschränkten Zusammenhängen beschrieben worden; siehe zum Beispiel Chee et al., Nucl. Acid Res. 19: 3301 (1991); Shoemaker et al., Nature Genetics 14: 450 (1998); Barany, F. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193; EP 0 799 897 A1 ; WO 97/31256 .
Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, wird die Länge der Barcode-Sequenzen variieren, abhängig von der gewünschten "Festigkeit" der Bindung und der gewünschten Anzahl von unterschiedlichen Barcodes. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Länge der Barcode-Sequenzen im Bereich von etwa 6 bis etwa 500 Basenpaaren, wobei etwa 8 bis etwa 100 bevorzugt sind, und etwa 10 bis etwa 25 besonders bevorzugt sind.
In einer Ausführungsform werden Nukleinsäure-Barcodes verwendet, aber nicht ihre Hybridisierungseigenschaften. Vielmehr können Barcodes mit verschiedener Länge verwendet werden, wobei alternativ dazu die Sequenz des Barcodes verändert wird, was zu unterschiedlichen Molekulargewichten führt. Was in dieser Ausführungsform bedeutsam ist, ist dass jeder Barcode ein verschiedenes Molekulargewicht besitzt. Die Barcodes werden vom Rest des Amplikons abge schnitten, wie hierin beschrieben, und einer Massenspektroskopie-Analyse oder anderen Techniken, welche auf unterschiedlichen Molekulargewichten zur Abtrennung beruhen, wie Gelelektrophorese, unterzogen.
Bevorzugte Barcode-Sequenzen (und somit ihre entsprechenden komplementären Einfangsonden-Sequenzen) sind in den Beispielen abgebildet und schließen diejenigen ein, welche komplementär zum GenFlex-Chip von Affymetrix sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Präzyklus-Sonden auch weitere Elemente umfassen. Wie es hierin angegeben ist, kann auch eine Markierungssequenz verwendet werden. Eine Markierungssequenz besitzt substanzielle Komplementarität zu einer Markierungssonde, welche Markierungen umfasst, die den Amplikons hinzugefügt werden können, um sie zu markieren, wie es nachstehend vollständiger dargestellt wird. Wiederum wird es bevorzugt, "universelle" Markierungssequenzen, oder Sätze von Sequenzen, zu verwenden, um das erforderliche Ausmaß an Sequenzsynthese zu minimieren und die Multiplexierung unter Verwendung mehrerer Sonden und/oder mehrerer Ziele zu vereinfachen.
Folglich sieht die Erfindung Präzyklus-Sonden vor, umfassend eine Anzahl von Komponenten, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Ziel erkennende Domänen, universellen Primer bindende Stelle(n), Schnittstelle(n), Barcode-Sequenzen und Markierungssequenzen. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, können diese Präzyklus-Sonden (und die hierin dargestellten Primer und Einfangsonden) auf vielen Wegen hergestellt werden. Sie können chemisch synthetisiert werden, z. B. gemäß dem Festphasen-Phosphoramidit-Triester-Verfahren, welches von Beaucage und Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22(20): 1859–1862, beschrieben wurde, z. B. unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers, wie in Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12: 6159–6168, beschrieben. Oligonukleotide können auch maßgeschneidert angefertigt und über eine Vielzahl kommerzieller Quellen, die dem Fachmann bekannt sind, bestellt werden. Die Reinigung von Oligonukleotiden, falls notwendig, wird typischerweise entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC durchgeführt, wie beschrieben in Pearson and Regnier (1983), J. Chrom. 255: 137–149. Die Sequenz der synthetischen Oligonukleotide kann unter Verwendung des chemischen Abbauverfahrens von Maxam und Gilbert (1980) in Grossman und Moldave (Hrsg.), Academic Press, NY, Methods in Enzymology 65: 499–560, bestätigt werden. Maßgeschneiderte Oligos können auch leicht über eine Vielzahl kommerzieller Quellen, die dem Fachmann bekannt sind, bestellt werden.
Falls Sonden durch synthetische Verfahren hergestellt werden, kann es notwendig sein, das 5'-Ende der Sonde zu phosphorylieren, da Oligonukleotid-Synthesizer üblicherweise keine Oligonukleotide herstellen, welche ein Phosphat an ihrem 5'-Ende aufweisen. Die Abwesenheit eines Phosphats am 5'-Ende der Sonde würde ansonsten die Ligation der 5'- und 3'-Enden der Sonde verhindern. Die Phosphorylierung kann gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden, z. B. unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase, wie z. B. beschrieben in U.S. 5 593 840 .
Sonden und Primer können auch durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, wie durch Einschließen der Sonde in einem Plasmid, welches in einer Wirtszelle, z. B. Bakterien, repliziert, amplifiziert und durch im Fachgebiet bekannte Verfahren isoliert werden kann. Die Sonde kann dann aus dem Plasmid unter Verwendung eines Restriktionsenzyms herausgeschnitten werden, welches um die Sonde herum schneidet. Alternativ dazu können große Mengen an Sonde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern hergestellt werden, welche komplementär zu den 5'- und 3'-Enden der Sonde sind. Die Sonde kann dann weiter gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren gereinigt werden.
Sonden können in einem Schritt hergestellt werden, z. B. durch synthetisches Synthetisieren der gesamten Sonde. Alternativ dazu können Sonden in mindestens zwei Teilen synthetisiert und durch Verknüpfungs- bzw. Linker-Oligonukleotide miteinander verknüpft werden. Zum Beispiel können zwei Teile einer Präzyklus-Sonde synthetisiert werden und können durch Verwenden eines Verbrückungs-Oligonukleotids miteinander verknüpft werden, welches Sequenzen enthält, die komplementär zu Teil A und Teil B der Sonde sind. Dies wird im Beispiel 7 weiter beschrieben. Das Verbrückungs-Oligonukleotid ist vorzugsweise mindestens etwa 20 bis etwa 50 Nukleotide lang, z. B. zwischen 30 und 40 Nukleotide. Das Verbrückungs-Oligonukleotid umfasst vorzugsweise mindestens etwa 10, weiter bevorzugt mindestens etwa 15 oder 20 Nukleotide, welche komplementär zu jedem von Teil A und Teil B der Sonde sind. Die Kriterien, die beim Entwurf von Verbrückungs-Oligonukleotiden zu berücksichtigen sind, sind die gleichen wie diejenigen, welche am Entwurf eines Primers für die Hybridisierung an eine jeweilige Sequenz beteiligt sind, wie oben beschrieben. Die Ligation in Gegenwart des Verbrückungs-Oligonukleotids kann durch reguläre Ligationsverfahren durchgeführt werden.
Die Verfahren der Erfindung gehen mit der Zugabe der Präzyklus-Sonden zur Zielsequenz vor sich. Die das Ziel erkennenden Domänen der Präzyklus-Sonden hybridisieren mit den Zieldomänen der Zielsequenz. Wenn Fugen vorkommen, schreitet die Reaktion mit der Zugabe von einem oder mehreren NTPs und einem kettenverlängernden Enzym voran (oder einem Fugenoligo, wie hierin beschrieben) voran. Mit "kettenverlängerndes Enzym" ist hierin ein Enzym gemeint, welches eine Sequenz durch die Addition von NTPs verlängern wird. Wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist, gibt es eine große Vielzahl von geeigneten kettenverlängernden Enzymen, von welchen Polymerasen (sowohl RNA als auch DNA, abhängig von der Zusammensetzung der Zielsequenz und der Präzyklus-Sonde) bevorzugt werden. Bevorzugte Polymerasen sind diejenigen, denen eine Strangverdrängungsaktivität fehlt, so dass sie in der Lage sein werden, lediglich die notwendigen Basen an dem Ende der Sonde zu addieren, ohne die Sonde weiter zu verlängern, um Nukleotide einzuschließen, welche komplementär zu einer das Ziel erkennenden Do mäne sind, und somit die Zirkularisierung zu verhindern. Geeignete Polymerasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, sowohl DNA- als auch RNA-Polymerasen, einschließlich des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I, SEQUENASE 1.0 und SEQUENASE 2.0 (U.S. Biochemical), T5-DNA-Polymerase und Phi29-DNA-Polymerase und verschiedenen RNA-Polymerasen, wie etwa aus Thermus sp. oder Q-Beta-Replikase aus Bakteriophage, ein. Auch SP6-, T3-, T4- und T7-RNA-Polymerasen können, unter anderen, verwendet werden.
Noch stärker bevorzugte Polymerasen sind diejenigen, welchen im Wesentlichen eine 5'-nach-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt, so dass gewährleistet ist, dass die Sonde nicht über das 5'-Ende der Sonde hinaus verlängert werden wird. Beispielhafte Enzyme, denen 5'-nach-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt, schließen das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase und das Stoffel-Fragment von DNAPTaq-Polymerase ein. Zum Beispiel fehlt dem Stoffel-Fragment von Taq-DNA-Polymerase die 5'-nach-3'-Exonuklease-Aktivität auf Grund von genetischen Manipulationen, welche zur Erzeugung eines verkürzten Proteins führen, dem die N-terminalen 289 Aminosäuren fehlen (Siehe z. B. Lawyer et al., J. Biol. Chem., 264: 6427–6437 [1989]; und Lawyer et al., PCR Meth. Appl., 2: 275–287 [1993]). Analoge Mutanten-Polymerasen sind für aus T. maritima abgeleitete Polymerasen, Tsps17, TZ05, Tth und Taf erzeugt worden.
Noch stärker bevorzugte Polymerasen sind diejenigen, welchen eine 3'-nach-5'-Exonuklease-Aktivität fehlt, welche üblicherweise als Proof-Reading- bzw. Korrekturlese-Aktivität bezeichnet wird, und welche Basen entfernt, die am 3'-Ende eines Primer-Matrize-Duplex fehlgepaart sind. Obwohl das Vorliegen von 3'-nach-5'-Exonuklease-Aktivität eine erhöhte Genauigkeit im synthetisierten Strang vorsieht, baut die in thermostabilen DNA-Polymerasen wie Tma (einschließlich Mutantenformen von Tma, denen 5'-nach-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt) gefundene 3'-nach-5'-Exonuklease-Aktivität auch einzelsträngige DNA, wie die in der PCR verwendeten Primer, einzelsträngige Matrizen sowie einzelsträngige PCR-Produkte, ab. Die Integrität des 3'-Endes eines in einem Primerverlängerungsverfahren verwendeten Oligonukleotidprimers ist kritisch, da es dieser Terminus ist, von welchem die Kettenverlängerung des wachsenden Strangs beginnt. Ein Abbau des 3'-Endes führt zu einem verkürzten Oligonukleotid, was seinerseits zu einem Verlust an Spezifität in der Priming- bzw. Primer-Eindungs-Reaktion führt (d. h. je kürzer der Primer, desto wahrscheinlicher wird es, dass ein ungewolltes oder nicht-spezifisches Priming auftreten wird.
Noch stärker bevorzugte Polymerasen sind thermostabile Polymerasen. Für die Zwecke dieser Erfindung wird ein wärmebeständiges Enzym als jedwedes Enzym definiert, welches den Großteil seiner Aktivität nach einer Stunde bei 40°C unter Optimalbedingungen beibehält. Beispiele für thermostabile Polymerasen, denen sowohl 5'-nach-3'-Exonuklease als auch 3'-nach-5'-Exonuklease fehlt, schließen das Stoffel-Fragment von Taq-DNA-Polymerase ein. Dieser Polymerase fehlt die 5'-nach-3'-Exonuklease-Aktivität auf Grund von genetischer Manipulation, und es ist keine 3'-nach-5'-Aktivität vorhanden, da der Taq-Polymerase die 3'-nach-5'-Exonuklease- Aktivität natürlicherweise fehlt. Die Tth-DNA-Polymerase ist aus Thermus thermophilus abgeleitet und ist von Epicentre Technologies, Molecular Biology Resource Inc., oder Perkin-Elmer Corp. erhältlich. Andere nützliche DNA-Polymerasen, denen 3'-Exonuklease-Aktivität fehlt, schließen Vent[R](exo-), erhältlich von New England Biolabs, Inc. (gereinigt aus Stämmen von E. coli, welche ein DNA-Polymerase-Gen aus dem Archaebakterium Thermococcus litoralis tragen) und Hot-Tub-DNA-Polymerase, welche aus Thermus flavus abgeleitet und von Amersham Corporation erhältlich ist, ein.
Andere bevorzugte Enzyme, welche thermostabil und frei von 5'-nach-3'-Exonuklease-Aktivität und von 3'-nach-5'-Exonuklease-Aktivität sind, schließen AmpliTaq Gold ein. Weitere DNA-Polymerasen, welche zumindest im Wesentlichen äquivalent sind, können verwendet werden, wie sonstige N-terminal verkürzte Thermus-aquaticus(Taq)-DNA-Polymerase I. Die Polymerasen mit dem Namen KlenTaq I und KlenTaq LA sind für diesen Zweck durchaus geeignet. Selbstverständlich kann auch jedwede andere Polymerase mit diesen Merkmalen gemäß der Erfindung verwendet werden.
Die Bedingungen zur Durchführung der Addition von einem oder mehreren Nukleotiden am 3'-Ende der Sonde werden von dem verwendeten jeweiligen Enzym abhängen und werden den Bedingungen folgen, welche von dem Hersteller der verwendeten Enzyme empfohlen werden.
Die Nukleotide werden vorzugsweise zu einer Endkonzentration von etwa 0,01 μM bis etwa 100 μM, und vorzugsweise etwa 0,1 μM bis 10 μM in der Reaktion zugegeben. Die Konzentration an zuzusetzender Ligase wird im folgenden Abschnitt beschrieben. Bevorzugte Mengen an Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment schließen 0,05 U/μl ein. Ein typisches Reaktionsvolumen beträgt etwa 10 bis 20 μl. Bevorzugte Mengen an Matrize und Sonden-DNA werden ebenfalls im nachfolgenden Abschnitt beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Matrizen-Nukleinsäuren und Sonde(n) in einer Reaktionsmischung zusammen mit einer Ligase, Ligasepuffer und Polymerase vereinigt. Die Matrize und Sonde(n) werden dann z. B. durch Inkubation bei 95°C während etwa 5 bis 10 Minuten denaturiert und danach annealt, z. B. durch Senken der Temperatur der Reaktion. Wie oben beschrieben, werden die Annealing-Bedingungen von der Tm der Homologieregionen abhängen. Die Polymerisation und Ligation erfolgen dann durch Zugeben von Nukleotiden, gefolgt von Inkubation z. B. während etwa 10 Minuten bei 65°C. Alternativ dazu werden die Nukleinsäuren zuerst zusammen in Abwesenheit von Enzymen inkubiert, denaturiert und annealt, und dann werden die Enzyme zugegeben und die Reaktionen werden, während z. B. etwa 10 Minuten bei 65°C, weiter inkubiert.
Um die Hintergrundsignale zu verringern, welche aus der Anheftung und Ligation eines nicht-komplementären Nukleotids resultieren, könnte man, anstatt ein einzelnes dNTP zur Polymerisa tionsreaktion zuzugeben, ein dNTP zusammen mit den anderen drei ddNTPs zusetzen. Diese ddNTPs werden keine Ligation gestatten, aber werden die Reaktion gegenüber geringen Mengen an kontaminierendem Nukleotid unempfindlich machen.
Hintergrundsignale können auch aus dem Vorhandensein des "korrekten" Nukleotids in der Reaktion auf Grund der Gegenwart von Nukleotiden in Reagenzien und dessen Anheftung an die Sonde resultieren. Eine Kontamination von Reagenzien mit Nukleotiden kann durch Behandlung der Reagenzien mit einem Enzym, welches freie Nukleotide abbaut, verringert werden. Bevorzugte Enzyme schließen Apyrase und Phosphatasen ein, wobei das Erstgenannte besonders bevorzugt wird. Wie in den Beispielen beschrieben, wird Apyrase üblicherweise vor der Zugabe des einen oder der mehreren dNTPs zu der Reaktion gegeben, etwa bei einer Konzentration von 0,5 mU/μl in einer typischen Reaktion von etwa 20 μl. Im Allgemeinen werden die Reaktionen dann bei 20°C während einigen Minuten bis zu 30 Minuten inkubiert. Das Enzym wird dann durch Inkubation der Reaktion während etwa 5 bis 10 Minuten bei 95°C denaturiert. Alternativ dazu können alkalische Phosphatasen verwendet werden, wie etwa alkalische Phosphatase aus Krabben.
Die Ligation der 3'- und 5'-Enden der Sonde(n) kann unter Verwendung eines Enzyms oder chemisch durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Ligation enzymatisch unter Verwendung einer Ligase in einem Standardprotokoll durchgeführt. Viele Ligasen sind bekannt und sind zur Verwendung in der Erfindung geeignet, z. B. Lehman, Science, 186: 790–797 (1974); Engler et al., DNA Ligases, Seite 3–30, in Boyer (Hrsg.), The Enzymes, Band 15B (Academic Press, New York, 1982); und dergleichen. Bevorzugte Ligasen schließen T4-DNA-Ligase, T7-DNA-Ligase, E. coli-DNA-Ligase, Taq-Ligase, Pfu-Ligase und Tth-Ligase ein. Protokolle für deren Verwendung sind allgemein bekannt, z. B. Sambrook et al. (oben zitiert); Barany, PCR Methods and Applications, 1: 5–16 (1991); Marsh et al., Strategies, 5: 73–76 (1992); und dergleichen. Im Allgemeinen erfordern Ligasen, dass eine 5'-Phosphatgruppe für die Ligation an das 3'-Hydroxyl eines anstoßenden Strangs vorhanden ist. Bevorzugte Ligasen schließen thermostabile oder (thermophile) Ligasen, wie pfu-Ligase, Tth-Ligase, Taq-Ligase und Ampligase-DNA-Ligase (Epicentre Technologies, Madison, Wis.) ein. Ampligase besitzt eine geringe Glattenden-Ligationsaktivität.
Die bevorzugte Ligase ist eine solche, welche die geringste Aktivität zur Fehlpaarungs-Ligation und Ligation über die Fuge aufweist. Die Spezifität der Ligase kann durch Substituieren der spezifischeren NAD⁺-abhängigen Ligasen, wie E. coli-Ligase und (thermostabiler) Taq-Ligase für die weniger spezifische T4-DNA-Ligase erhöht werden. Die Verwendung von NAD-Analogen in der Ligationsreaktion erhöht die Spezifität der Ligationsreaktion weiter; siehe das U.S.-Patent Nr. 5 508 179 von Wallace et al.
Die Bedingungen zur Durchführung der Ligation werden von der besonderen verwendeten Ligase abhängen und werden im Allgemeinen den Empfehlungen des Herstellers folgen. Zum Beispiel sind bevorzugte Ampligase-Konzentrationen etwa 0,0001 bis etwa 0,001 U/μl und vorzugsweise etwa 0,0005 U/μl. Bevorzugte Konzentrationen von Sonden-Nukleinsäuren betragen etwa 0,001 bis etwa 0,01 Picomol/μl und noch stärker bevorzugt etwa 0,015 Picomol/μl. Bevorzugte Konzentrationen an Matrizen-Nukleinsäuren schließen etwa 1 Zeptomol/μl bis etwa 1 Attomol/μl, am stärksten bevorzugt etwa 5 Zeptomol/μl ein. Eine typische Reaktion wird in insgesamt etwa 20 μl durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Matrizen-Nukleinsäuren und Sonde(n) in einer Reaktionsmischung zusammen mit einer Ligase und Ligasepuffer vereinigt. Die Matrize und die Sonde(n) werden dann z. B. durch Inkubation bei 95°C während etwa 5 bis 10 Minuten denaturiert und danach annealt, z. B. durch Senken der Temperatur der Reaktion. Die Annealing-Bedingungen werden von der Tm der Homologieregionen, wie andernorts hierin beschrieben, abhängen. Das Annealing kann durch Verlangsamen der Senkung der Temperatur von 95°C herab auf etwa die Tm oder mehrere Grad unterhalb der Tm durchgeführt werden. Alternativ dazu kann das Annealing durchgeführt werden durch Inkubieren der Reaktion bei einer Temperatur einige Grad unter der Tm während z. B. etwa 10 bis etwa 60 Minuten. Zum Beispiel kann der Annealing-Schritt etwa 15 Minuten lang durchgeführt werden. Die Ligation kann dann durch Inkubation der Reaktionen während etwa 10 Minuten bei 65°C durchgeführt werden.
Alternativ dazu werden die Nukleinsäuren denaturiert und in Abwesenheit der Ligase annealt, und die Ligase wird zu den annealten Nukleinsäuren zugegeben und dann z. B. während etwa 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Diese Ausführungsform wird für nicht-wärmestabile Ligasen bevorzugt.
Wie früher erwähnt, können nicht umgesetzte Sonden zu Hintergrund aus unerwünschter nicht-spezifischer Amplifikation beitragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird veranlasst, jegliche nicht umgesetzten Präzyklus-Sonden und/oder Zielsequenzen für eine Amplifikation nicht [mehr] verfügbar sind. Dies kann auf vielen Wegen durchgeführt werden, wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird. In einer Ausführungsform werden Exonukleasen zugegeben, welche jedwede linearen Nukleinsäuren abbauen werden, wobei die geschlossenen ringförmigen Sonden übrig gelassen werden. Geeignete 3'-Exonukleasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, exo I, exo III, exo VII, exo V und Polymerasen, da viele Polymerasen eine hervorragende Exonuklease-Aktivität aufweisen, etc., ein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann terminale Transferase verwendet werden, um Nukleotide, umfassend Abtrennungsmarkierungen, wie Biotin, an jedwede linearen Moleküle anzufügen, und dann wird die Mischung durch ein Streptavidin-System laufen gelassen, um jedwede linearen Nukleinsäuren zu entfernen, wobei lediglich die geschlossenen ringförmigen Sonden übrig gelassen werden. Wenn zum Beispiel genomische DNA als das Ziel verwendet wird, kann diese unter Anwendung einer Vielzahl von Techniken biotinyliert werden, und die Präzyklus-Sonden können zugegeben und zirkularisiert werden. Da die zirkularisierten Sonden auf der genomischen DNA katenatartig verknüpft werden, können die linearen nicht-umgesetzten Präzyklus-Sonden fortgewaschen werden. Die geschlossenen ringförmigen Sonden können dann so gespalten werden, dass sie von der genomischen DNA entfernt, abgesammelt und amplifiziert werden. In ähnlicher Weise kann terminale Transferase verwendet werden, um kettenterminierende Nukleotide anzufügen, um eine Kettenverlängerung und/oder Amplifikation zu verhindern. Geeignete kettenterminierende Nukleotide schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Didesoxytriphosphatnukleotide (ddNTPs), halogenierte dNTPs und Acyclo-Nukleotide (NEN) ein. Diese letztgenannten kettenterminierenden Nukleotidanaloge sind besonders gute Substrate für "Deep vent (exo^–)" und Thermosequenase.
Darüber hinaus können bekannte auf Größe basierende Trennungstechniken angewandt werden, um die genomische DNA mit der assoziierten geschlossenen ringförmigen Sonde und die linearen Sonden zu trennen.
Weiterhin ist es wichtig anzumerken, dass es einen PCR-Hintergrund geben kann, welcher aus der Polymerase-Kettenverlängerung des 3'-Endes der Sonde entlang der Matrize resultieren kann. Dieser Hintergrund kann verringert werden, um hohe Anreicherungsspiegel der spezifisch ligierten Sonden zu erhalten. Im Folgenden werden Beispiele für PCR-Hintergrund-Unterdrückungstechniken angegeben. Diese Techniken können auf der Eliminierung der Ursprungssonde und/oder der Matrizen-Nukleinsäuren beruhen.
In einer Ausführungsform des "Zwei-Stufen"-Verfahrens wird, nach Ligieren der Sonden, ein biotinylierter Primer eingebracht, welcher komplementär zum ersten Sonden-Primer ist. Eine kettenverlängernde Polymerisationsreaktion wird dann ausgeführt, welche entweder zu einem Volllängen-Sonden-Komplement (im Falle der ligierten Sonden) oder einer verkürzten Sonde führt, der die zweite Primerstelle fehlt (im Falle der nicht-ligierten Sonden) (siehe z. B. 1). Dieses Produkt kann dann auf magnetischen Streptavidin-Kügelchen eingefangen werden, und die Matrize und die ursprünglichen Sonden können fortgewaschen werden. Die PCR kann dann unter Verwendung dieses "sauberen" Produkts durchgeführt werden. Weil den nicht-ligierten Sondenprodukten die zweite Primerstelle fehlen wird, werden sie nicht amplifizieren. Zahlreiche Beispiele einer solchen Reaktion sind in den Beispielen angegeben. Biotinylierte Sonden können auf einem Oligonukleotidsynthesizer synthetisiert werden.
In einer anderen Ausführungsform lässt man die Sonde eine Uracilbase zwischen der ersten Primersequenz und der ersten Homologiesequenz enthalten. Nach einer "Run-off"-Reaktion, wie oben beschrieben (das Zwei-Stufen-Verfahren), kann Uracil-N-Glykosylase verwendet werden, um einen Strangschnitt auf allen ursprünglichen Sonden einzubringen, was jedwede PCR unterbricht. Nur die Volllängen-Verlängerungsprodukte werden amplifizieren.
In noch einer anderen Ausführungsform kann, anstatt der Verlängerungsreaktion, wie oben beschrieben, eine "rollender Kreis"-Polymerisationsreaktion durchgeführt werden. Auf diese Weise können viele konkatenatartig verknüpfte Kopien der ligierten Sonden hergestellt werden, was die Konzentration der ligierten Sonden relativ zu den nicht-ligierten Sonden effektiv erhöht und zu einem geringeren Spiegel an amplifizierter nicht-ligierter Sonde führt. Diese Technik wird z. B. im Beispiel 2 und im U.S.-Patent Nr. 5 854 033 von Lizardi et al. beschrieben.
Noch andere Verfahren zum Verringern von Hintergrundamplifikation, d. h. nicht-spezifischer Amplifikation, beinhalten die Verwendung einer Exonuklease, um jedwede nicht-ligierte Sonde abzubauen. Vor der Amplifikation muss jedwede Exonuklease aus der Reaktionsmischung eliminiert werden, z. B. durch Hitzedenaturieren der Nuklease.
Sobald eine geschlossene ringförmige Sonde gebildet ist, kann sie einem von zwei Schicksalen, wie hierin beschrieben, folgen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedwede verbleibenden linearen Sonden, Sequenzen und Primer entfernt, und die geschlossene ringförmige Sonde wird gespalten, wie hierin angegeben, und amplifiziert, wie es nachstehend angegeben wird, um Amplikons zu bilden (das "Ein-Stufen"-Verfahren). Alternativ dazu wird eine lineare Kopie der geschlossenen Sonde hergestellt, und es ist diese lineare Kopie (umfassend neue Termini), welche in den Amplifikationsreaktionen verwendet wird.
Sobald gespalten, können die linearisierten geschnittenen Sonden dann amplifiziert werden. Allerdings ist es in den Genotypisierungs-"Fugen"-Ausführungsformen nützlich, jedwede dNTPs vor der Zugabe des Abfrage-dNTPs zuerst zu entfernen oder abzubauen. Dies kann auf vielen Wegen erfolgen, wie hierin angegeben, im Allgemeinen durch die Zugabe von Nukleotid abbauenden Enzymen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Apyrase, wie hierin erwähnt.
Sobald sie geschnitten sind, können die linearisierten geschnittenen Sonden dann amplifiziert werden. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, gibt es eine große Vielzahl von geeigneten Amplifikationstechniken, welche angewandt werden können, um die Amplikons der Erfindung zu bilden, welche dann im Allgemeinen durch die Anwendung von Arrays nachgewiesen werden, wie es nachstehend vollständiger angegeben ist. Geeignete Amplifikationsverfahren schließen sowohl Zielamplifikation als auch Signalamplifikation ein und schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligationskettenreaktion (manchmal bezeichnet als Oligonukleotid-Ligase-Amplifikation OLA), "Cycling Probe"-Technologie (CPT), Strangverdrängungs-Assay (SDA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) und invasive Spal tungs-Technologie ein. Alle diese Verfahren erfordern eine Primer-Nukleinsäure (einschließlich Nukleinsäureanalogen), welche an eine Zielsequenz hybridisiert wird, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden, und ein Enzym wird zugegeben, welches auf irgendeine Weise den Primer modifiziert, um einen modifizierten Primer zu bilden. Zum Beispiel erfordert PCR im Allgemeinen zwei Primer, dNTPs und eine DNA-Polymerase; LCR erfordert zwei Primer, welche benachbart an die Zielsequenz hybridisieren, und eine Ligase; CPT erfordert einen schneidbaren Primer und ein schneidendes Enzym; invasive Spaltung erfordert zwei Primer und ein schneidendes Enzym; etc. Somit wird, im Allgemeinen, eine geschnittene Sonde zu einer Reaktionsmischung zugegeben, welche die notwendigen Amplifikationskomponenten umfasst, und Amplikons werden gebildet.
Im Allgemeinen umfasst das Amplikon eine nachweisbare Markierung, wie eine fluoreszente Markierung, welche entweder von dem Enzym eingebaut wird oder auf dem ursprünglichen Primer vorhanden ist. Nach Bedarf werden die nicht-umgesetzten Primer auf vielen Wegen entfernt, wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird. Der Hybridisierungskomplex wird dann disassoziiert und das Amplikon wird nachgewiesen und gegebenenfalls durch einen Array quantifiziert. In einigen Fällen dient das erste Amplikon als Zielsequenz für eine sekundäre Reaktion, welche dann eine Anzahl von zweiten Amplikons herstellt, die nachgewiesen werden können, wie es hierin angegeben wird.
Folglich beginnt die Reaktion mit der Zugabe einer Primer-Nukleinsäure zu der Zielsequenz, welche einen Hybridisierungskomplex bildet. Sobald der Hybridisierungskomplex zwischen dem Primer und der Zielsequenz gebildet worden ist, wird ein Enzym, manchmal bezeichnet als ein "Amplifikationsenzym" verwendet, um den Primer zu modifizieren. Wie für alle hierin angegebenen Verfahren, können die Enzyme an jedem Punkt während des Assays zugegeben werden, entweder vor, während oder nach der Zugabe der Primer. Die Identität des Enzyms wird von der verwendeten Amplifikationstechnik abhängen, wie es nachstehend vollständiger angegeben wird. In ähnlicher Weise wird die Modifikation von der Amplifikationstechnik abhängen, wie nachstehend angegeben.
Sobald das Enzym den Primer unter Bildung eines Amplikons modifiziert hat, wird der Hybridisierungskomplex disassoziiert. In einem Aspekt erfolgt die Dissoziation durch Modifikation der Assaybedingungen. In einem anderen Aspekt hybridisiert der modifizierte Primer nicht länger mit der Zielnukleinsäure und dissoziiert. Einer oder beide dieser Aspekte können in Signal- und Zielamplifikationsreaktionen, wie nachstehend beschrieben, zur Anwendung kommen. Im Allgemeinen werden die Amplifkationsschritte während einer Zeitperiode wiederholt, um eine gewisse Anzahl von Zyklen zu erlauben, abhängig von der Anzahl der Kopien der ursprünglichen Zielsequenz und der Empfindlichkeit des Nachweises, wobei die Zyklen im Bereich von 1 bis Tausenden liegen, wobei 10 bis 100 Zyklen bevorzugt sind und 15 bis 50 Zyklen speziell bevorzugt sind. In bestimmten Ausführungsformen, falls man z. B. wünscht, eine spezifische Sequenz zu quantifizieren, kann es wünschenswert sein, mehrere parallele Amplifikationsreaktionen, jeweils unter Verwendung einer anderen Anzahl an Zyklen, durchzuführen, sodass in mindestens einem Satz von Reaktionen die Amplifikationsreaktion in der exponentiellen Phase sein wird und daher eine direkte Korrelation zwischen dem Spiegel an amplifiziertem Produkt und der Anzahl an Ursprungs-Sequenzen liefern wird.
Nach einer geeigneten Zeit der Amplifikation werden nicht-umgesetzte Primer, falls erforderlich, auf eine Vielzahl von Weisen entfernt, wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, und der Hybridisierungskomplex wird disassoziiert. Im Allgemeinen umfasst das Amplikon eine nachweisbare Markierung, wie eine fluoreszierende Markierung, welche entweder durch das Enzym eingebaut oder auf dem ursprünglichen Primer vorhanden ist, und das Amplikon wird zu einem Array gegeben, wie nachstehend geschildert. Der Nachweis erfolgt über das Nachweisen der Markierung als Anzeige der Gegenwart, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, wie es nachstehend vollständiger geschildert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikation eine Zielamplifikation. Zielamplifikation beinhaltet die Amplifikation (Replikation) der nachzuweisenden Zielsequenz, so dass die Anzahl von Kopien der Zielsequenz erhöht wird. Geeignete Zielamplifikations-Techniken schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Polymerasekettenreaktion (PCR), Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) und Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielamplifikations-Technik PCR. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird weithin verwendet und beschrieben, und beinhaltet die Anwendung einer Primerverlängerung, kombiniert mit Wärmezyklieren, um eine Zielsequenz zu amplifizieren; siehe die U.S.-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202 , und "PCR Essential Data", J. W. Wiley & Sons, Hrsg.: C. R. Newton, 1995, welche alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind. Darüber hinaus gibt es eine Anzahl von Variationen der PCR, welche ebenfalls in der Erfindung Anwendung finden, einschließlich, unter anderen, "quantitativer kompetitiver PCR" oder "QC-PCR", "arbiträr geprimter PCR" oder "AP-PCR", "Immun-PCR", "Alu-PCR", "PCR-Einzelstrang-Konformationspolymorphismus" oder "PCR-SSCP", "Reverse-Transkriptase-PCR" oder "RT-PCR", "Biotin-Einfang-PCR", "Vectorette-PCR", "Pfannenstiel-PCR" und "PCR-Select-cDNA-Subtraktion", "allel-spezifischer PCR".
Im Allgemeinen kann PCR in Kürze wie folgend beschrieben werden. Eine doppelsträngige Zielnukleinsäure wird denaturiert, im Allgemeinen durch Erhöhen der Temperatur, und dann in Gegenwart eines Überschusses eines PCR-Primers abgekühlt, welcher dann an den ersten Zielstrang hybridisiert. Eine DNA-Polymerase wirkt dann, um den Primer mit dNTPs zu verlängern, was zur Synthese eines neuen Strangs unter Bildung eines Hybridisierungskomplexes führt. Die Probe wird dann erneut erwärmt, um den Hybridisierungskomplex zu disassoziieren, und das Verfahren wird wiederholt. Durch Verwenden eines zweiten PCR-Primers für den komplementären Zielstrang, findet eine rasche und exponentielle Amplifikation statt. Somit handelt es sich bei den PCR-Schritten um Denaturierung, Annealing und Kettenverlängerung. Die Einzelheiten der PCR sind allgemein bekannt und beinhalten die Anwendung einer thermostabilen Polymerase, wie Taq I-Polymerase, und eines thermischen Kreislaufs bzw. Zyklierens.
Folglich erfordert die PCR-Reaktion mindestens einen PCR-Primer, eine Polymerase und einen Satz von dNTPs. Wie hierin geschildert, können die Primer die Markierung umfassen, oder eines oder mehrere der dNTPs können eine Markierung umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielamplifikationstechnik SDA. Strangverdrängungsamplifikation (SDA) wird im Allgemeinen beschrieben in Walker et al., in Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995, sowie den U.S.-Patenten Nr. 5 455 166 und 5 130 238 , welche alle hiermit in ihrer Gesamtheit durch den Bezug darauf ausdrücklich einbezogen werden.
Im Allgemeinen kann SDA wie folgend beschrieben werden. Eine einzelsträngige Zielnukleinsäure, üblicherweise eine DNA-Zielsequenz, wird mit einem SDA-Primer in Kontakt gebracht. Ein "SDA-Primer" besitzt im Allgemeinen eine Länge von 25–100 Nukleotiden, wobei SDA-Primer von ungefähr 35 Nukleotiden bevorzugt werden. Ein SDA-Primer ist im Wesentlichen komplementär zu einer Region am 3'-Ende der Zielsequenz, und der Primer besitzt eine Sequenz an seinem 5'-Ende (außerhalb der Region, welche komplementär zum Ziel ist), welche eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease ist, welche hierin manchmal als ein "Nicking-Enzym" oder eine "Nicking-Endonuklease" bezeichnet wird, wie nachstehend geschildert. Der SDA-Primer hybridisiert dann mit der Zielsequenz. Die SDA-Reaktionsmischung enthält auch eine Polymerase (eine "SDA-Polymerase", wie nachstehend geschildert) und eine Mischung von allen vier Desoxynukleosid-Triphosphaten (ebenfalls bezeichnet als Desoxynukleotide oder dNTPs, d. h. dATP, dTTP, dCTP und dGTP), von denen mindestens eine Spezies ein substituiertes oder modifiziertes dNTP ist; somit wird der SDA-Primer modifiziert, d. h. verlängert, um einen modifizierten Primer zu bilden, der hierin manchmal als "neu synthetisierter Strang" bezeichnet wird. Das substituierte dNTP ist so modifiziert, dass es ein Schneiden in dem Strang, der das substituierte dNTP enthält, inhibieren wird aber das Schneiden auf dem anderen Strang nicht hemmen wird. Beispiele von geeigneten substituierten dNTPs schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat), 5-Methyldesoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat und 7-Desaza-2'-desoxyguanosin-5'triphosphat ein. Darüber hinaus kann die Substitution des dNTPs nach dem Einbau in einen neu synthetisierten Strang stattfinden; zum Beispiel kann eine Methylase verwendet werden, um Methylgruppen an den synthetisierten Strang anzufügen. Darüber hinaus kann, wenn alle Nukleotide substituiert sind, die Polymerase eine 5'→3'-Exonukleaseaktivität aufweisen. Wenn jedoch we niger als alle Nukleotide substituiert sind, fehlt der Polymerase vorzugsweise eine 5'→3'-Exonukleaseaktivität.
Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann das Erkennungsstelle/Endonuklease-Paar ein Beliebiges aus einer großen Vielfalt bekannter Kombinationen sein. Die Endonuklease wird gewählt, um einen Strang entweder an der Erkennungsstelle oder entweder 3' oder 5' davon gelegen zu schneiden, ohne die komplementäre Sequenz zu schneiden, entweder weil das Enzym nur einen Strang schneidet oder aufgrund des Einbaus der substituierten Nukleotide. Geeignete Erkennungsstelle/Endonuklease-Paare sind im Fachgebiet allgemein bekannt; geeignete Endonukleasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, HincII, HindII, AvaI, Fnu4HI, TthIIII, NclI, BstXI, BamHI, etc. ein. Eine Aufstellung, welche geeignete Enzyme und ihre jeweiligen Erkennungsstellen und das modifizierte, zu verwendende, dNTP angibt, findet sich im U.S.-Patent Nr. 5 455 166 , welches hiermit als Bezugsstelle ausdrücklich einbezogen wird.
Sobald er "genickt" wurde bzw. ihm ein Einzelstrangbruch zugefügt wurde, wird eine Polymerase (eine "SDA-Polymerase") verwendet, um den neu genickten Strang, 5'→3', zu verlängern, wodurch ein anderer neu synthetisierter Strang erzeugt wird. Die gewählte Polymerase sollte in der Lage sein, die 5'→3'-Polymerisation an der Nick- bzw. Einzelstrangbruch-Stelle zu initiieren, sollte des Weiteren den polymerisierten Strang stromabwärts des Nick verdrängen und sollte frei von 5'→3'-Exonukleaseaktivität sein (dies kann weiterhin durch die Zugabe eines Blockierungsmittels bewerkstelligt werden). Somit schließen geeignete Polymerasen bei SDA, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, SEQUENASE 1.0 und SEQUENASE 2.0 (U.S. Biochemical), T5-DNA-Polymerase und Phi29-DNA-Polymerase ein.
Folglich benötigt die SDA-Reaktion, in keiner besonderen Reihenfolge, einen SDA-Primer, eine SDA-Polymerase, eine "Nicking"-Endonuklease und dNTPs, von denen mindestens eine Spezies modifiziert ist.
Im Allgemeinen erfordert die SDA kein Thermozyklieren. Die Temperatur der Reaktion wird im Allgemeinen eingestellt, um hoch genug zu sein, um eine nicht-spezifische Hybridisierung zu verhindern, aber niedrig genug, um eine spezifische Hybridisierung zu erlauben; d. h. im Allgemein etwa 37°C bis etwa 42°C, abhängig von den Enzymen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie für den Großteil der hier beschriebenen Amplifikationstechniken, kann eine zweite Amplifikationsreaktion unter Verwendung der komplementären Zielsequenz ausgeführt werden, was zu einer wesentlichen Erhöhung der Amplifikation während einer vorgegebenen Zeitperiode führt. D. h., eine zweite Primer-Nukleinsäure wird an eine zweite Zielsequenz hybridisiert, welche im Wesentlichen komplementär zu der ersten Zielsequenz ist, um einen zweiten Hybridisierungskomplex zu bilden. Die Zugabe des Enzyms, gefolgt von der Disassoziation des zweiten Hybridisierungskomplexes, führt zur Erzeugung einer Anzahl von neu synthetisierten Zweitsträngen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielamplifikations-Technik die Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA). NASBA wird allgemein beschrieben im U.S.-Patent Nr. 5 409 818 ; Sooknanan et al., Nucleic Acid Sequence-Based Amplifikation, Kapitel 12 (S. 261–285) von "Molecular Methods for Virus Detection", Academic Press, 1995; und "Profiting from Gene-based Diagnostics", CTB International Publishing Inc., N. J., 1996, welche alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind. NASBA ist sehr ähnlich sowohl zu TMA als auch QBR. Die Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) wird allgemein in den U.S.-Patenten Nr. 5 399 491 , 5 888 779 , 5 705 365 , 5 710 029 beschrieben, welche alle als Bezugsstellen einbezogen sind. Der Hauptunterschied zwischen NASBA und TMA besteht darin, dass NASBA die Zugabe von RNAse H verwendet, um den RNA-Abbau zu bewirken, und TMA auf die inhärenten RNAse-Aktivität der reversen Transkriptase angewiesen ist.
Im Allgemeinen können diese Techniken wie folgend beschrieben werden. Eine einzelsträngige Zielnukleinsäure, üblicherweise eine RNA-Zielsequenz (hierin manchmal bezeichnet als "die erste Zielsequenz" oder "die erste Matrize", welche die geschnittene ringförmige Sonde ist), wird mit einem ersten Primer in Kontakt gebracht, der hierin allgemein als ein "NASBA-Primer" bezeichnet wird (obwohl "TMA-Primer" ebenfalls geeignet ist). Das Beginnen mit einer DNA-Zielsequenz wird nachstehend beschrieben. Diese Primer weisen im Allgemeinen eine Länge von 25–100 Nukleotiden auf, wobei NASBA-Primer von ungefähr 50–75 Nukleotiden bevorzugt sind. Der erste Primer ist vorzugsweise ein DNA-Primer, welcher an seinem 3' -Ende eine Sequenz aufweist, welche im Wesentlichen komplementär zum 3'-Ende der ersten Matrize ist. Der erste Primer besitzt des Weiteren einen RNA-Polymerase-Promotor an seinem 5'-Ende (oder seinem Komplement (Antisinn) abhängig von der Konfiguration des Systems). Der erste Primer wird dann mit der ersten Matrize hybridisiert, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden. Die Reaktionsmischung schließt auch ein Reverse-Transkriptase-Enzym (eine "NASBA"-Reverse-Transkriptase) und eine Mischung der vier dNTPs ein, sodass der erste NASBA-Primer modifiziert, d. h. verlängert, wird, um einen ersten modifizierten Primer zu bilden, umfassend einen Hybridisierungskomplex von RNA (der ersten Matrize) und DNA (dem neu synthetisierten Strang).
Mit "reverse Transkriptase" oder "RNA-gesteuerte DNA-Polymerase" wird hierin ein Enzym gemeint, das zum Synthetisieren von DNA von einem DNA-Primer und einer RNA-Matrize aus in der Lage ist. Geeignete RNA-gesteuerte DNA-Polymerasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Vogel-Myeloblastose-Virus-Reverse-Transkriptase ("AMV-RT") und die Moloney-Maus-Leukämie-Virus-RT ein. Wenn es sich bei der Amplifikationsreaktion um TMA handelt, umfasst das Reverse-Transkriptase-Enzym ferner eine RNA-abbauende Aktivität, wie nachstehend geschildert.
Zusätzlich zu den oben aufgezählten Komponenten schließt die NASBA-Reaktion des Weiteren ein RNA-abbauendes Enzym ein, welches hierin manchmal als Ribonuklease bezeichnet wird, das RNA von einem RNA:DNA-Hybrid hydrolysieren wird, ohne einzel- oder doppelsträngige RNA oder DNA zu hydrolysieren. Geeignete Ribonukleasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, RNase H aus E. coli und Kälberthymus ein.
Die Ribonukleaseaktivität baut die erste RNA-Matrize in dem Hybridisierungskomplex ab, was zu einer Disassoziation des Hybridisierungskomplexes führt, wobei ein erster einzelstränginger, neu synthetisierter DNA-Strang übrig bleibt, der hierin manchmal als "die zweite Matrize" bezeichnet wird.
Zusätzlich dazu schließt die NASBA-Reaktion auch einen zweiten NASBA-Primer ein, der im Allgemeinen DNA umfasst (obwohl wie für alle Sonden hierin, einschließlich Primern, auch Nukleinsäureanaloge verwendet werden können). Dieser zweite NASBA-Primer besitzt eine Sequenz an seinem 3'-Ende, welche im Wesentlichen komplementär zum 3'-Ende der zweiten Matrize ist, und enthält ebenfalls eine Antisinn-Sequenz für einen funktionellen Promotor und die Antisinn-Sequenz einer Transkriptions-Initiationsstelle. Somit enthält diese Primersequenz, wenn sie als eine Matrize für die Synthese der dritten DNA-Matrize verwendet wird, ausreichend Information, um die spezifische und effiziente Bindung einer RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription an der gewünschten Stelle zu gestatten. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden eine(n) solche(n) Antisinn-Promotor und Transkriptions-Initiationsstelle, welche diejenigen der T7-RNA-Polymerase sind, obwohl andere RNA-Polymerase-Promotoren und Initiationsstellen ebenfalls verwendet werden können, wie nachstehend geschildert.
Der zweite Primer hybridisiert mit der zweiten Matrize, und eine DNA-Polymerase, welche ebenfalls als eine "DNA-gesteuerte DNA-Polymerase" bezeichnet wird, die ebenfalls in der Reaktion vorhanden ist, synthetisiert eine dritte Matrize (einen zweiten, neu synthetisierten DNA-Strang), was zu einem zweiten Hybridisierungskomplex fährt, der zwei neu synthetisierte DNA-Stränge umfasst.
Letztendlich führt der Einschluss einer RNA-Polymerase und der erforderlichen vier Ribonukleosidtriphosphate (Ribonukleotide oder NTPs) zur Synthese eines RNA-Strangs (einem dritten neu synthetisierten Strang, welcher im Wesentlichen der gleiche ist, wie die erste Matrize). Die RNA-Polymerase, welche hierin manchmal als eine "DNA-gesteuerte RNA-Polymerase" bezeichnet wird, erkennt den Promotor und initiiert die RNA-Synthese spezifisch an der Initiationsstelle. Darüber hinaus synthetisiert die RNA-Polymerase vorzugsweise mehrere Kopien von RNA pro DNA-Doppelstrang. Bevorzugte RNA-Polymerasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T7-RNA-Polymerase und andere Bakteriophagen-RNA-Polymerasen, einschließlich denjenigen von Phage T3, Phage ΦII, Salmonella-Phage sp6 oder Pseudomonas-Phage gh-1, ein.
In einigen Ausführungsformen werden TMA und NASBA mit Start-DNA-Zielsequenzen verwendet. In dieser Ausführungsform ist es notwendig, den ersten Primer, umfassend den RNA-Polymerase-Promotor, und ein DNA-Polymerase-Enzym zu verwenden, um ein doppelsträngiges DNA-Hybrid mit dem neu synthetisierten Strang, welches die Promotorsequenz umfasst, zu erzeugen. Das Hybrid wird dann denaturiert und der zweite Primer wird zugegeben.
Demgemäß erfordert die NASBA-Reaktion, in keiner besonderen Reihenfolge, einen ersten NASBA-Primer, einen zweiten NASBA-Primer, umfassend eine Antisinn-Sequenz eines RNA-Polymerase-Promotors, eine RNA-Polymerase, welche den Promotor erkennt, eine reverse Transkriptase, eine DNA-Polymerase, ein RNA-abbauendes Enzym, NTPs und dNTPs, zusätzlich zu den nachstehend geschilderten Nachweiskomponenten.
Diese Komponenten führen zu einer einzelnen Start-RNA-Matrize, unter Erzeugung eines einzelnen DNA-Duplex; da dieser DNA-Duplex jedoch zur Erzeugung von mehreren RNA-Strängen führt, welche dann verwendet werden können, um die Reaktion erneut zu initiieren, geht die Amplifikation rasch vonstatten.
Demgemäß erfordert die TMA-Reaktion, in keiner besonderen Reihenfolge, einen ersten TMA-Primer, einen zweiten TMA-Primer, umfassend eine Antisinn-Sequenz eines RNA-Polymerase-Promotors, eine RNA-Polymerase, welche den Promotor erkennt, eine reverse Transkriptase mit RNA-abbauender Aktivität, eine DNA-Polymerase, NTPs und dNTPs, zusätzlich zu den unten geschilderten Nachweiskomponenten.
Diese Komponenten führen zu einer einzelnen Start-RNA-Matrize, unter Erzeugung eines einzelnen DNA-Duplex; da dieser DNA-Duplex jedoch zur Erzeugung von mehreren RNA-Strängen führt, welche dann verwendet werden können, um die Reaktion erneut zu initiieren, geht die Amplifikation rasch vonstatten.
Auf diese Weise wird eine Anzahl von sekundären Zielmolekülen (z. B. Amplikons) hergestellt. Wie es nachstehend vollständiger geschildert wird, können diese Reaktionen (d. h. die Produkte dieser Reaktionen) auf vielen Wegen nachgewiesen werden.
In Ausführungsformen, in welchen die nicht-umgesetzten linearen Sonden entfernt werden, besteht eine Alternative zur Zielamplifikation in der Signalamplifikation, basierend auf Wechselwirkungen mit einer spezifischen Sondensequenz, wie einer Barcode-Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikationstechnik die Signalamplifikation. Signalamplifika tion beinhaltet die Verwendung einer begrenzten Anzahl von Zielmolekülen als Matrizen, um entweder mehrere "Signaling"- bzw. Signalisierungs-Sonden zu erzeugen oder die Verwendung mehrerer Signalisierungs-Sonden zu gestatten. Die Signalamplifikations-Strategien schließen die OLA-, CPT-, QβR- und invasive Spaltungs-Technologie ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Einzelbasen-Verlängerung (SBE bzw. "Single Base Extension", manchmal bezeichnet als "Mini-Sequenzieren") für die Amplifikation verwendet. Kurz gesagt ist SBE eine Technik, welche einen Verlängerungsprimer verwendet, der an die Zielnukleinsäure hybridisiert, in diesem Fall an wenigstens die Barcode-Sequenz. Eine Polymerase (im Allgemeinen eine DNA-Polymerase) wird verwendet, um das 3'-Ende des Primers mit einem Nukleotidanalog, markiert mittels einer Nachweismarkierung, wie hierin beschrieben, zu verlängern. Basierend auf der Genauigkeit des Enzyms wird ein Nukleotid nur in den Verlängerungsprimer eingebaut, wenn es komplementär zu der angrenzenden Base im Zielstrang ist. Im Allgemeinen kann das Nukleotid so derivatisiert sein, dass keine weiteren Verlängerungen stattfinden können, sodass nur ein Einzelnukleotid angefügt wird. Für Amplifikationsreaktionen muss dies jedoch nicht notwendig sein. Sobald das markierte Nukleotid zugesetzt wird, verläuft der Nachweis der Markierung wie hierin geschildert; siehe im Allgemeinen Sylvanen et al., Genomics 8: 684–692 (1990); U.S.-Patente Nr. 5 846 710 und 5 888 819 ; Pastinen et al., Genomics Res. 7(6): 606–614 (1997).
Die Reaktion wird durch Einbringen des Assay-Komplexes, umfassend die geschnittene ringförmige Sonde, in eine Lösung initiiert, welche ein erstes Nukleotid, häufig ein Nukleotidanalog umfasst. Mit "Nukleotidanalog" in diesem Zusammenhang wird hierin ein Desoxynukleosidtriphosphat gemeint (ebenfalls bezeichnet als Desoxynukleotide oder dNTPs, d. h. dATP, dTTP, dCTP und dGTP), welches ferner derivatisiert ist, um kettenabbrechend zu sein. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann jedwede Anzahl von Nukleotidanalogen verwendet werden, solange ein Polymeraseenzym noch das Nukleotid an der Abfrage-Position einbauen wird. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden die Didesoxytriphosphatnukleotide (ddNTPs). Im Allgemeinen wird ein Satz von Nukleotiden, umfassend ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, verwendet, von denen mindestens eines, und vorzugsweise alle vier, eine Markierung einschließt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Nukleotidanaloge eine nachweisbare Markierung, welche entweder eine primäre oder sekundäre nachweisbare Markierung sein kann, wie es nachstehend geschildert wird. Allerdings ist der enzymatische Einbau von Nukleotiden, welche Fluorophore umfassen, unter vielen Bedingungen gering; folglich verwenden bevorzugte Ausführungsformen sekundäre nachweisbare Markierungen.
Zusätzlich zu einem ersten Nukleotid umfasst die Lösung auch ein kettenverlängerndes Enzym, im Allgemeinen eine DNA-Polymerase. Geeignete DNA-Polymerasen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, SEQUENASE 1.0 und SEQUENASE 2.0 (U.S. Biochemical), T5-DNA-Polymerase und Phi29-DNA-Polymerase ein. Wenn das NTP komplementär zu der Base der Nachweisposition der Zielsequenz ist, welche zum Verlängerungsprimer benachbart ist, wird das kettenverlängernde Enzym selbiges an den Verlängerungsprimer anfügen. Somit wird der Verlängerungsprimer modifiziert, d. h. verlängert, um einen modifizierten Primer zu bilden, der hierin manchmal als "neu synthetisierter Strang" bezeichnet wird.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass, außer die Zielnukleinsäure liegt in ausreichender Konzentration vor, die Menge an nicht verlängertem Primer in der Reaktion den resultierenden verlängerten-markierten Primer in großem Maße übersteigt. Der Überschuss an nicht verlängertem Primer konkurriert mit dem Nachweis des markierten Primers in den hierin beschriebenen Assays. Folglich verwenden, wenn SBE angewandt wird, bevorzugte Ausführungsformen Verfahren für die Entfernung von nicht verlängerten Primer, wie es hierin geschildert wird.
Ein Verfahren, um diese Einschränkung zu überwinden, ist die Thermokreislauf-Minisequenzierung, in welcher wiederholte Zyklen aus Annealing, Primerverlängerung und Hitzedenaturierung unter Verwendung eines Thermozyklers und einer thermostabilen Polymerase die Amplifikation der Verlängerungssonde gestatten, was zur Akkumulation von verlängerten Primern führt. Wenn sich die Konzentration an ursprünglichem unverlängerten Primer zur Zielnukleinsäure zum Beispiel auf 100:1 beläuft und 100 Thermozyklen und Verlängerungen durchgeführt werden, wird eine Mehrheit des Primers verlängert werden.
Daher benötigt die SBE-Reaktion, in keiner besonderen Reihenfolge, einen Verlängerungsprimer, eine Polymerase und dNTPs, von den mindestens eines markiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Signalamplifikations-Technik OLA. OLA, welche als Ligationskettenreaktion (LCR) bezeichnet wird, wenn zweisträngige Substrate verwendet werden, beinhaltet die Ligation von zwei kleineren Sonden zu einer einzelnen langen Sonde unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize. Bei der LCR wird das ligierte Sondenprodukt die vorherrschende Matrize, wenn die Reaktion fortschreitet. Das Verfahren kann auf zwei verschiedene Weisen durchgeführt werden; in einer ersten Ausführungsform wird nur ein Strang einer Zielsequenz als Matrize für die Ligation verwendet; alternativ dazu können beide Stränge verwendet werden. Siehe im Allgemeinen die U.S.-Patente Nr. 5 185 243 , 5 679 524 und 5 573 907 ; EP 0 320 308 B1 ; EP 0 336 731 B1 ; EP 0 439 182 B1 ; WO 90/01069 ; WO 89/12696 ; WO 97/31256 und WO 89/09835 , und U.S.-Seriennummern 60/078 102 und 60/073 011 .
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die geschnittene ringförmige Sonde eine erste Zieldomäne und eine zweite Zieldomäne, welche benachbart und fortlaufend sind, und sollte die Barcode-Sequenz überspannen. Eine erste OLA-Primer- und eine zweite OLA-Primer-Nukleinsäure werden zugegeben, welche im Wesentlichen komplementär zu ihrer jeweiligen Zieldomäne sind und somit mit den Zieldomänen hybridisieren werden. Diese Zieldomänen können direkt benachbart, d. h. fortlaufend, oder durch eine Anzahl von Nukleotiden getrennt sein. Wenn sie nicht-fortlaufend sind, werden Nukleotide zusammen mit Mitteln zum Verknüpfen von Nukleotiden, wie einer Polymerase, welche die Nukleotide an einen der Primer anfügen wird, zugesetzt. Die zwei OLA-Primer werden dann kovalent verknüpft, zum Beispiel unter Verwendung eines Ligase-Enzyms, wie es im Fachgebiet bekannt ist, um einen modifizierten Primer zu bilden. Dies bildet einen ersten Hybridisierungskomplex, welcher die ligierte Sonde und die Zielsequenz umfasst. Dieser Hybridisierungskomplex wird dann denaturiert (disassoziiert), und das Verfahren wird wiederholt, um einen Pool von ligierten Sonden zu erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die OLA für zwei Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz durchgeführt. Die Zielsequenz wird denaturiert, und zwei Sätze von Sonden werden zugegeben: Ein Satz, wie oben geschildert, für einen Strang des Ziels, und ein separater Satz (d. h. dritte und vierte Primer-Sonden-Nukleinsäuren) für den anderen Strang des Ziels. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die ersten und dritten Sonden hybridisieren, und die zweiten und vierten Sonden werden hybridisieren, so dass eine Amplifikation stattfinden kann. D. h., wenn die ersten und zweiten Sonden angeheftet worden sind, kann die ligierte Sonde nun als eine Matrize, zusätzlich zur zweiten Zielsequenz, verwendet werden, für die Anheftung der dritten und vierten Sonden. In ähnlicher Weise werden die ligierten dritten und vierten Sonden als eine Matrize für die Anheftung der ersten und zweiten Sonden dienen, zusätzlich zum ersten Zielstrang. Auf diese Weise kann eine exponentielle, statt nur einer linearen, Amplifikation erfolgen.
Erneut, wie oben geschildert, kann der Nachweis der LCR-Reaktion, in dem Fall, worin einer oder beide der Primer mindestens eine nachweisbare Markierung umfassen, ebenfalls direkt oder indirekt unter Anwendung von Sandwich-Assays durch die Verwendung von zusätzlichen Sonden stattfinden; d. h., die ligierten Sonden können als Zielsequenzen dienen, und der Nachweis kann Amplifikationssonden, Einfangsonden, Einfang-Verlängerungs-Sonden, Markierungs-Sonden und Markierungs-Verlängerungssonden etc. anwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Signalamplifikations-Technik um die invasive Spaltungstechnologie, welche in einer Anzahl von Patenten und Patentanmeldungen, einschließlich den U.S.-Patenten Nr. 5 846 717 ; 5 614 402 ; 5 719 028 ; 5 541 311 und 5 843 669 , beschrieben wird. Die invasive Spaltungstechnologie basiert auf strukturspezifischen Nukleasen, welche Nukleinsäuren auf stellenspezifische Weise schneiden. Zwei Sonden werden verwendet: eine "Invader"-Sonde und eine "Signalling"-Sonde, welche benachbart, mit Überlappung, an eine Zielsequenz hybridisieren. Für die Fehlpaarungs-Unterscheidung verlässt sich die Invader-Technologie auf die Komplementarität an der Überlappungsposition, wo das Schneiden stattfindet. Das Enzym schneidet an der Überlappung und setzt den "Schwanz" frei, welcher markiert sein kann, oder nicht. Dieser kann dann nachgewiesen werden.
Im Allgemeinen kann die invasive Spaltungstechnologie wie folgend beschrieben werden. Eine geschnittene ringförmige Sonde wird von zwei unterschiedlichen Sonden erkannt. Eine erste Sonde, welche hierin allgemein als eine "Invader"-Sonde bezeichnet wird, ist im Wesentlichen komplementär zu einem ersten Bereich der geschnittenen ringförmigen Sonde. In dieser Ausführungsform ist ein Barcode nicht notwendig, da der erste Bereich der geschnittenen ringförmigen Sonde eine zielspezifische Domäne einschließen kann. Eine zweite Sonde, welche allgemein hierin als eine "Signalsonde" bezeichnet wird, ist teilweise komplementär zu einer Zieldomäne der geschnittenen ringförmigen Sonde; das 3'-Ende des Signal-Oligonukleotids ist im Wesentlichen komplementär zu der geschnittenen ringförmigen Sonde, während das 5'-Ende nicht-komplementär ist und vorzugsweise einen einzelsträngigen "Schwanz" oder "Arm" bildet. Das nicht-komplementäre Ende der zweiten Sonde umfasst vorzugsweise eine "generische" oder "einmalige" Sequenz, z. B. eine Barcode-Sequenz, welche verwendet wird, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielnukleinsäure anzuzeigen, wie es nachstehend beschrieben ist. Die Barcode-Sequenz der zweiten Sonde umfasst vorzugsweise mindestens eine nachweisbare Markierung, obwohl, wie hierin geschildert, da diese Nachweissequenz als Zielsequenz für eine Einfangsonde wirken kann, auch Sandwich-Konfigurationen unter Verwendung von Markierungssonden, wie hierin beschrieben, ausgeführt werden können.
Die Hybridisierung der ersten und zweiten Oligonukleotide nahe oder angrenzend zueinander auf der Zielnukleinsäure bildet eine Anzahl von Strukturen. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet sich eine gegabelte Spaltungsstruktur und ist ein Substrat für eine Nuklease, welche die Nachweissequenz von dem Signal-Oligonukleotid abspaltet. Die Stelle des Schneidens wird durch den Abstand oder die Überlappung zwischen dem 3'-Ende des Invader-Oligonukleotids und der stromabwärts gelegenen Gabel des Signal-Oligonukleotids gesteuert. Deshalb wird kein Oligonukleotid einer Spaltung unterworfen, wenn es mit der Zielnukleinsäure fehlerhaft ausgerichtet oder wenn es nicht mit ihr gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nuklease, welche die gegabelte Spaltungsstruktur erkennt und die Freisetzung des Schwanzes katalysiert, thermostabil, wodurch das Thermozyklieren der Spaltungsreaktion gestattet wird, falls gewünscht. Bevorzugte Nukleasen, abgeleitet aus thermostabilen DNA-Polymerasen, welche modifiziert worden sind, um eine reduzierte synthetische Aktivität aufzuweisen, welche eine unerwünschte Nebenreaktion während der Spaltung ist, werden in den U.S.-Patenten Nr. 5 719 028 und 5 843 669 beschrieben, die hierin ausdrücklich zur Bezugnahme einbezogen werden. Die synthetische Aktivität der DNA-Polymerase wird auf einen Spiegel verringert, bei welchem sie nicht den Nachweis der Spaltungsreaktion und den Nachweis des freigesetzten Schwanzes stört. Vorzugsweise besitzt die DNA-Polymerase keine nachweisbare Polymeraseaktivität. Beispiele von Nukleasen sind diejenigen, welche aus Thermus aquaticus, Thermus flavus oder Thermus thermophilus abgeleitet sind.
In einer anderen Ausführungsform sind thermostabile strukturspezifische Nukleasen Flap-Endonukleasen (FENs), ausgewählt aus FEN-1 oder FEN-2 "like" (z. B. die XPG- und RAD2-Nukleasen) aus Archaebakterien-Spezies, zum Beispiel FEN-1 aus Methanococcus jannaschii, Pyrococcus furiosis, Pyrococcus woesei und Archaeoglobus fulgidus ( U.S.-Patent Nr. 5 843 669 , und Lyamichev et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 292–297; welche beide hierin ausdrücklich als Bezugsstelle einbezogen werden).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nuklease AfuFEN1- oder PfuFEN1-Nuklease. Um eine gegabelte Struktur zu schneiden, benötigen diese Nukleasen mindestens ein überlappendes Nukleotid zwischen der Signal- und Invasiv-Sonde, um das 5'-Ende der Signalsonde zu erkennen und zu spalten. Um das Schneiden zu bewirken, wird von dem 3'-terminalen Nukleotid des Invader-Oligonukleotids nicht gefordert, komplementär zur Zielnukleinsäure zu sein. Im Gegensatz dazu verhindert die Fehlpaarung der Signal-Sonde eine Base stromaufwärts der Schnittstelle die Erzeugung der Überlappung und das Schneiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Signalamplifikations-Technik CPT. Die CPT-Technologie wird in einer Anzahl von Patenten und Patentanmeldungen beschrieben, einschließlich den U.S.-Patenten Nr. 5 011 769 , 5 403 711 , 5 660 988 und 4 876 187 , und den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 95/05480 , WO 95/1416 und WO 95/00667 und der U.S. S.N. 09/014 304 .
Im Allgemeinen kann CPT wie folgend beschrieben werden. Ein CPT-Primer (hierin manchmal ebenfalls bezeichnet als ein "spaltbarer Primer") umfasst zwei Sondensequenzen, welche von einer spaltbaren Bindung getrennt werden. Der CPT-Primer ist im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz und wird daher mit ihr hybridisieren, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Die spaltbare Bindung wird geschnitten, ohne die Zielsequenz zu schneiden, was dazu führt, dass die zwei Sondensequenzen getrennt werden. Die zwei Sondensequenzen können somit leichter von dem Ziel disassoziiert werden, und die Reaktion kann beliebig oftmalig wiederholt werden. Im Allgemeinen umfasst eine erste Sondensequenz (z. B. ein Ende des Primers) ein Einfang-Anhängsel, wie Biotin, und die andere (die zweite Sondensequenz) mindestens eine Markierung. Nach Vervollständigung der Reaktion wird der Bindungspartner des Einfangs-Anhängsels (z. B. Streptavidin) verwendet, um alle nicht-umgesetzten Sonden und die gespaltenen ersten Sondensequenzen zu entfernen, wobei die zweite Sondensequenz übrig gelassen wird, welche zum Beispiel durch Bindung an einen Array nachgewiesen werden kann. In der vorliegenden Erfindung sind die CPT-Primer und Präzyklus-Sonden so konstruiert, dass es die Barcode-Sequenz ist, welche als die zweite Sondensequenz dient.
Mit "spaltbare Bindung" wird hierin eine Bindung innerhalb der spaltbaren Sonde gemeint, welche geschnitten werden kann, wenn die Sonde Teil eines Hybridisierungskomplexes ist, d. h. wenn ein doppelsträngiger Komplex gebildet wird. Es ist wichtig, dass die schneidbare Bindung nur die schneidbare Sonde spaltet und nicht die Sequenz, an welche sie hybridisiert ist (d. h. entweder die Zielsequenz oder eine Sondensequenz), so dass die Zielsequenz in der Reaktion für die Amplifikation des Signals wiederverwendet werden kann. Wie hierin verwendet, ist die spaltbare Bindung jedwede verbindende chemische Struktur, welche zwei Sondensequenzen verknüpft, und welche in der Lage ist, selektiv geschnitten zu werden, ohne Schneiden entweder der Sondensequenzen oder der Sequenz, an welcher die spaltbare Sonde hybridisiert ist. Die spaltbare Bindung kann eine Einzelbindung oder eine Mehrfacheinheit-Sequenz sein. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann eine Anzahl von möglichen spaltbaren Bindungen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die spaltbare Bindung RNA. Dieses System, welches, wie oben geschildert, früher beschrieben wurde, basiert auf der Tatsache, dass bestimmte Doppelstrang-Nukleasen, insbesondere Ribonukleasen, RNA-Nukleoside aus einem RNA:DNA-Hybridisierungskomplex nicken oder herausschneiden werden. Von besonderer Verwendung in dieser Ausführungsform ist RNAseH, Exo III und reverse Transkriptase.
CPT kann enzymatisch oder chemisch durchgeführt werden. Das heißt, zusätzlich zu RNAseH gibt es mehrere andere Spaltungs-Agentien, welche nützlich zum Schneiden der spaltbaren Bindungen von RNA (oder einer anderen Nukleinsäure) sind. Zum Beispiel wurde über mehrere chemische Nukleasen berichtet; siehe zum Beispiel Sigman et al., Annu. Rev. Biochem. 1990, 59, 207–236; Sigman et al., Chem. Rev. 1993, 93, 2295–2316, Bashkin et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 5125–5132; und Sigman et al., Nucleic Acids and Molecular Biology, Band 3. F. Eckstein und D. M. J. Lilley (Hrsg.), Springer-Verlag, Heidelberg 1989, S. 13–27.
Der erste Schritt des CPT-Verfahrens erfordert das Hybridisieren eines primären spaltbaren Primers (ebenfalls bezeichnet als eine primäre spaltbare Sonde) mit dem Ziel. Dies wird vorzugsweise bei einer Temperatur durchgeführt, welche sowohl die Bindung der Längeren primären Sonde als auch die Disassoziation der kürzeren geschnittenen Bereiche der primären Sonde gestattet, wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird.
Im Allgemeinen werden die spaltbaren Sonden in einem molaren Überschuss gegenüber ihren Zielen eingebracht, wobei Verhältnisse von spaltbarer Sonde:Ziel von mindestens etwa 100:1 bevorzugt werden, von mindestens etwa 1000:1 besonders bevorzugt werden, und von mindestens etwa 10000:1 speziell bevorzugt werden. In manchen Ausführungsformen wird der Überschuss von Sonde:Ziel viel größer sein. Darüber hinaus können Verhältnisse, wie diese, für alle hierin geschilderten Amplifikationstechniken verwendet werden.
Sobald der Hybridisierungskomplex zwischen der primären spaltbaren Sonde und dem Ziel gebildet worden ist, wird der Komplex Spaltungsbedingungen unterzogen. Es wird davon ausgegangen, dass dies von der Zusammensetzung der spaltbaren Sonde abhängt; wenn diese RNA ist, wird RNAseH eingebracht. Es sollte bemerkt werden, dass unter gewissen Umständen, wie es im Allgemeinen geschildert wird in WO 95/00666 und WO 95/0067 , die Verwendung eines Doppelstrang-Bindungsagens, wie RNAseH, erlauben kann, dass die Reaktion sogar bei Temperaturen über der Tm des Hybridisierungskomplexes aus primärer Sonde:Ziel voranschreitet. Folglich kann entweder zuerst die Zugabe der spaltbaren Sonde zum Ziel, und danach die Einbringung von Spaltungs-Agens oder Spaltungsbedingungen erfolgen, oder die Sonden können in Gegenwart von Spaltungs-Agens oder -bedingungen zugegeben werden.
Die Spaltungsbedingungen führen zur Trennung der zwei (oder mehreren) Sondensequenzen der primären spaltbaren Sonde. Als ein Ergebnis werden die kürzeren Sondensequenzen nicht länger mit der Zielsequenz hybridisiert bleiben, und somit wird der Hybridisierungskomplex disassoziieren, wobei die Zielsequenz intakt gelassen wird.
Die optimale Temperatur zur Durchführung der CPT-Reaktionen beträgt im Allgemeinen etwa 5°C bis etwa 25°C unter den Schmelztemperaturen des Sonde:Ziel-Hybridisierungskomplexes. Dies gewährt eine schnelle Geschwindigkeit der Hybridisierung und ein hohes Ausmaß an Spezifität für die Zielsequenz. Die Tm von jedwedem besonderen Hybridisierungskomplex hängt von der Salzkonzentration, dem G-C-Gehalt und der Länge des Komplexes ab, wie es im Fachgebiet bekannt und hierin beschrieben ist.
Die Schritte werden wiederholt, wobei man zulässt, dass die Reaktion während einer Zeitperiode voranschreitet. Die Reaktion wird üblicherweise während etwa 15 Minuten bis etwa 1 Stunde durchgeführt. Im Allgemeinen wird jedes Molekül der Zielsequenz in dieser Periode zwischen 100- und 1000-Mal umgesetzt, abhängig von der Länge und Sequenz der Sonde, den spezifischen Reaktionsbedingungen und dem Spaltungsverfahren. Zum Beispiel werden für jede in der Testprobe vorhandene Kopie der Zielsequenz 100 bis 1000 Moleküle durch RNAseH geschnitten. Höhere Spiegel der Amplifikation können erhalten werden, indem man zulässt, dass die Reaktion länger ablauft, oder unter Verwendung von sekundären, tertiären oder quarternären Sonden, wie es hierin geschildert wird.
Nach Vervollständigen der Reaktion, was allgemein durch die Zeit oder das Ausmaß des Schneidens bestimmt wird, müssen die ungeschnittenen spaltbaren Sonden vor dem Nachweis entfernt oder neutralisiert werden, so dass die ungeschnittene Sonde nicht an eine Nachweissonde bindet, was falsche positive Signale verursachen würde. Der Fachmann auf dem Gebiet wird davon ausgehen, dass dies auf vielen Wegen durchgeführt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Abtrennung durch die Verwendung von Kügelchen erleichtert, welche die primäre Sonde enthalten. Wenn die spaltbaren Sonden an Kügelchen angeheftet werden, führt die Entfernung der Kügelchen durch Filtration, Zentrifugation, Anwenden eines magnetischen Feldes, elektrostatische Wechselwirkungen für geladene Kügelchen, Adhäsion, etc. somit zur Entfernung der ungeschnittenen Sonden.
Nach dem Entfernen der ungeschnittenen Sonde, wie erforderlich, verläuft der Nachweis durch das Zugeben der geschnittenen Sondensequenzen zu den Array-Zusammensetzungen, wie es nachstehend geschildert ist. Im Allgemeinen wird die geschnittene Sonde an eine Einfangsonde, entweder direkt oder indirekt, gebunden und die Markierung wird nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden keine Sonden höherer Ordnung verwendet, und der Nachweis basiert auf den Sondensequenz(en) des primären Primers. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens eine und vorzugsweise mehrere sekundäre Sonden (hierin ebenfalls bezeichnet als sekundäre Primer) verwendet; die sekundären Sonden hybridisieren an die Domänen der Spaltungssonden; etc.
Somit benötigt CPT, wiederum in keiner besonderen Reihenfolge, einen ersten CPT-Primer, umfassend eine erste Sondensequenz, eine spaltbare Bindung und eine zweite Sondensequenz; und ein Spaltungs-Agens.
Auf diese Weise führt CPT zur Erzeugung einer großen Menge an geschnittenen Primer, welche dann nachgewiesen werden können, wie es untenstehend geschildert wird.
In allen hierin beschriebenen Amplifikationsverfahren werden Markierungen verwendet. Im Allgemeinen kann entweder ein direkter oder indirekter Nachweis der Zielprodukte (z. B. Amplikons) durchgeführt werden. Der "direkte" Nachweis, wie in diesem Zusammenhang verwendet, wie auch für die anderen hier geschilderten Reaktionen, erfordert den Einbau einer Markierung, in diesem Falle einer nachweisbaren Markierung, vorzugsweise einer optischen Markierung, wie einem Fluorophor, in das Amplikon, wobei der Nachweis wie untenstehend geschildert abläuft. In dieser Ausführungsform können die Markierung(en) auf vielen Wegen eingebaut werden: (1) Die Primer umfassen die Markierung(en), zum Beispiel angeheftet an die Base, eine Ribose, ein Phosphat oder die analogen Strukturen in einem Nukleinsäureanalog; (2) Es werden modifizierte Nukleoside verwendet, welche entweder an der Base oder der Ribose (oder analogen Strukturen in einem Nukleinsäureanalog) mit den Markierung(en) modifiziert sind; diese Markierungsmodifizierten Nukleoside werden dann in die Triphosphatform umgewandelt und werden durch ein kettenverlängerndes Enzym, wie eine Polymerase, in einen neu synthetisierten Strang eingebaut; (3) Es werden modifizierte Nukleotide verwendet, welche eine funktionelle Gruppe umfassen, die verwendet werden kann (post-enzymatische Reaktion), um eine nachweisbare Markierung anzufügen; (4) Es werden modifizierte Primer verwendet, welche eine funktionelle Gruppe umfassen, die verwendet werden kann, um eine nachweisbare Markierung in einer ähnlichen Weise anzufügen; oder (5) eine Markierungssonde, welche direkt markiert ist und an einen Bereich des Amplikons hybridisiert, kann verwendet werden. Jedes dieser Verfahren führt zu einem nachweisbaren Amplikon.
Somit umfassen die modifizierten Stränge eine Nachweismarkierung. Mit "Nachweismarkierung" oder "nachweisbare Markierung" wird hierin eine Einheit gemeint, welche einen Nachweis zulässt. Hierbei kann es sich um eine primäre Markierung oder eine sekundäre Markierung handeln. Folglich können Nachweismarkierungen primäre Markierungen (d. h. direkt nachweisbar) oder sekundäre Markierungen (indirekt nachweisbar) sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nachweismarkierung eine primäre Markierung. Eine primäre Markierung ist eine solche, welche direkt durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Methoden nachgewiesen werden kann. Verwendbare Markierungen in der vorliegenden Erfindung schließen spektrale Markierungen, wie fluoreszierende Farbstoffe (z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Texas-Rot, Rhodamin, Dixogenin, Biotin und dergleichen), radioaktive Markierungen (z. B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ³³P etc.), Enzyme (z. B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase etc.), spektrale kalorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder gefärbte Kügelchen von Glas oder Kunststoff (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex etc.); magnetische, elektrische, thermische Markierungen; und Massen-Anhängsel ein. Markierungen können auch Enzyme (Meerrettichperoxidase etc.) und magnetische Teilchen einschließen. Bevorzugte Markierungen schließen Chromophore oder Phosphore ein, sind aber vorzugsweise fluoreszierende Farbstoffe. Geeignete Farbstoffe zur Verwendung in der Erfindung schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, fluoreszente Einheiten, welche in die Markierungen der Erfindung eingebunden sind, ein, wobei diese allgemein bekannt sind, einschließlich Texas-Rot, Dixogenin, Biotin, 1- und 2-Aminonaphthalen, p,p'-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridin-Salze, 9-Aminoacridine, p,p'-Diaminobenzophenonimine, Anthracene, Oxacarbocyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bis-benzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3-aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sternphenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycoumarin, Phenoxazin, Calicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane und Flavin. Individuelle fluoreszente Verbindungen, welche Funktionalitäten zur Verknüpfung an ein Element aufweisen, das erwünschtermaßen in einer Gerätschaft oder einem Assay der Erfindung nachgewiesen wird, oder welche modifiziert werden können, um solche Funktionalitäten einzubinden, schließen z. B. Dansylchlorid; Fluoresceine, wie 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthydrol; Rhodaminisothiocyanat, N-Phenyl-1-amino-8-sulfonatonaphthalen; N-Phenyl-2-amino-6-sulfonatonaphthalen; 4-Acetamido-4-isothiocyanato-stilben-2,2'-disulfonsäure; Pyren-3-sulfonsäure; 2-Toluidinonaphthalen-6-sulfonat; N-Phenyl-N-methyl-2-amino[n]aphthalen-6-sulfonat; Ethidiumbromid; Stebrin; Auromin-0,2-(9'-anthroyl)palmitat; Dansylphosphatidylethanolamin; N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin; N,N'-Dihexyloxacarbocyanin; Merocyanin, 4-(3'-Pyrenyl)stearat; d-3-Aminodesoxyequilenin; 12-(9'-Anthroyl)stearat; 2-Methylanthracen; 9-Vinyl anthracen; 2,2'(Vinylen-p-phenylen)bisbenzoxazol; p-Bis(2-methyl-5-phenyl-oxazolyl))benzen; 6-Dimethylamino-1,2-benzophenazin; Retinol; Bis(3'-aminopyridinium)-1,10-decandiyldiiodid; Sulfonaphthylhydrazon von Hellibrienin; Chlortetracyclin; N-(7-Dimethylamino-4-methyl-2-oxo-3-chromenyl)maleimid; N-(p-(2-Benzimidazolyl)phenyl)maleimid; N-(4-Fluoranthyl)maleimid; Bis(homovanillinsäure); Resazarin; 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol; Merocyanin 540; Resorufin; Bengalrosa; 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon, fluoreszierende Lanthanidkomplexe, einschließlich denjenigen von Europium und Terpium, Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin, Erythrosin, Coumarin, Methylcoumarine, Quantum-Dots (ebenfalls bezeichnet als "Nanokristalle": siehe U.S.-S.N. 09/315 584 ), Pyren, Malachit-Grün, Stilben, Luzifer-Gelb, Cascade Blue^TM, Texas-Rot, Cy-Farbstoffe (Cy3, Cy5 etc.), Alexa-Farbstoffe, Phycoerythin, Bodipy und andere ein, beschrieben in der 6. Ausgabe des "Molecular Probes Handbook" von Richard P. Haugland, welches hierin ausdrücklich als Bezugsstelle einbezogen ist. Andere Markierungen werden in der U.S.S.N. 60/242 901 beschrieben, welche am 24. Oktober 2000 eingereicht wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine sekundäre nachweisbare Markierung verwendet. Eine sekundäre Markierung ist eine solche, welche indirekt nachgewiesen wird; zum Beispiel kann eine sekundäre Markierung für den Nachweis mit einer primären Markierung binden oder reagieren, kann auf ein weiteres Produkt einwirken, um eine primäre Markierung zu erzeugen (z. B. Enzyme), oder kann die Abtrennung der Verbindung, welche die sekundäre Markierung umfasst, von nicht-markierten Material erlauben, etc. Sekundäre Markierungen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, eines von einem Bindungspartner-Paar; chemisch modifizierbare Einheiten, Nukleaseinhibitoren, Enzyme wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatasen, Luciferasen etc. ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Markierung ein Bindungspartner-Paar. Zum Beispiel kann die Markierung ein Hapten oder Antigen sein, welches seinen Bindungspartner binden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Bindungspartner an einen festen Träger gebunden sein, um die Trennung von verlängerten und nicht-verlängerten Primern zu gestatten. Zum Beispiel schließen geeignete Bindungspartner-Paare, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, ein: Antigene (wie Proteine (einschließlich Peptiden)) und Antikörper (einschließlich Fragmenten davon (FAbs etc.)); Proteine und kleine Moleküle, einschließlich Biotin/Streptavidin; Enzyme und Substrate oder Inhibitoren; andere Protein-Protein-wechselwirkende Paare; Rezeptor-Liganden; und Kohlenhydrate und ihre Bindungspartner. Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindungsproteinpaare sind ebenfalls nützlich. Im Allgemeinen wird der kleinere [Teil] des Paares an das NTP zum Einbauen in den Primer gebunden. Bevorzugte Bindungspartner-Paare schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Biotin (oder Iminobiotin) und Streptavidin, Digeoxinin [Digoxigenin] und Abs bzw. Antikörper, und Prolinx^TM-Reagenzien (siehe www.prolinxinc.com/ie4/home.hmtl) ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Bindungspartner-Paar eine primäre Nachweismarkierung (zum Beispiel angeheftet an das NTP und deshalb an das Amplikon) und einen Antikörper, welcher spezifisch an die primäre Nachweismarkierung binden wird. Mit "spezifisch binden" wird hierin gemeint, dass die Partner mit einer ausreichenden Spezifität binden, um zwischen dem Paar und anderen Komponenten oder Kontaminanten des Systems zu unterscheiden. Die Bindung sollte ausreichend sein, um unter den Bedingungen des Assays gebunden zu bleiben, einschließlich Waschschritten zum Entfernen von nicht-spezifischer Bindung. In einigen Ausführungsformen werden die Dissoziationskonstanten des Paars geringer als etwa 10^–4–10^–6 M^–1 sein, wobei geringer als etwa 10^–5 bis 10^–9 M^–1 bevorzugt sind, und weniger als etwa 10^–7–10^–9 M^–1 besonders bevorzugt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Markierung eine chemisch modifizierbare Einheit. In dieser Ausführungsform werden Markierungen, welche reaktive funktionelle Gruppen umfassen, in die Nukleinsäure eingebunden. Die funktionelle Gruppe kann dann anschließend mit einer primären Markierung markiert werden. Geeignete funktionelle Gruppen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Aminogruppen, Carboxygruppen, Maleimidgruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen ein, wobei Aminogruppen und Thiolgruppen besonders bevorzugt werden. Zum Beispiel können primäre Markierungen, welche Aminogruppen enthalten, an sekundäre Markierungen, welche Aminogruppen umfassen, angeheftet werden, zum Beispiel unter Verwendung von Linker, wie sie im Fachgebiet bekannt sind; zum Beispiel homo- oder heterobifunktionellen Linker, wie sie allgemein bekannt sind (siehe 1994-Katalog von Pierce Chemical Company, technischer Abschnitt über Vernetzungsmittel, Seite 155–200).
In einer Ausführungsform ist die Markierung ein Massenanhängsel, wie es nachstehend vollständiger geschildert wird.
Falls zutreffend, werden die Amplikons, welche die Barcodes der Erfindung umfassen, sobald sie markiert sind, nachgewiesen. Alle der Verfahren und Zusammensetzungen hierin werden für Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Bestimmen der Base an der Nachweisposition einer Zielnukleinsäure entworfen bzw. herangezogen, und zwar im Allgemeinen dadurch, dass man Unterscheidungs-Reaktionen abhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit einer Fehlpaarung stattfinden lässt. Die Reaktionsprodukte werden im Allgemeinen auf Arrays nachgewiesen, wie es hierin geschildert wird, obwohl eine Anzahl von anderen Nachweisverfahren angewandt werden kann.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die nützlich beim Nachweis von Nukleinsäuren sind. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, können die Zusammensetzungen der Erfindung eine große Vielfalt von Konfigurationen einnehmen, wie es allgemein in den Figuren geschildert wird. Wie es vollständiger nachstehend geschildert wird, funktionieren bevorzugte Systeme der Erfindung wie folgend. Ein Ampli kon wird (durch Hybridisierung) an eine Array-Stelle angeheftet. Diese Anheftung ist allgemein eine direkte Hybridisierung zwischen einem Barcode auf dem Amplikon und einer entsprechenden Einfangsonde, obwohl das System in manchen Fällen auf indirekten "Sandwich"-Komplexen beruhen kann, wobei Einfang-Verlängerer-Sonden verwendet werden, wie es im Fachgebiet bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zielsequenz (z. B. das Amplikon) selbst die Markierungen. Alternativ dazu wird eine Markierungssonde zugegeben, welche an eine Markierungssequenz auf dem Amplikon hybridisieren wird, wobei ein Assaykomplex gebildet wird. Die Einfangsonden des Arrays sind im Wesentlichen (und vorzugsweise perfekt) komplementär zu den Barcode-Sequenzen.
Die Begriffe Längenbestimmung, Auftrennung-nach-Länge-Assay und Auftrennung-nach-Länge-Assaymedium werden kollektiv herangezogen, um ein Verfahren und dessen verwandte Gerätschaft zu bezeichnen, welches die Trennung von DNA-Fragmenten auf der Grundlage der Länge, Größe, Masse oder irgendeiner anderen physikalischen Eigenschaft erzielt. Dies schließt im allgemeinen Flüssigkeitschromatographie, Elektrophorese und direkte Massenspektrometrie; im genaueren Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Kapillarelektrophorese oder Gelelektrophorese bzw. MALDI-TOF MS ein.
Falls das Anhängsel ein Hybridisierungs-Anhängsel ist, um eine hohe Spezifität beizubehalten, wird die Hybridisierung normalerweise unter den stringentesten Bedingungen durchgeführt, welche durch verschiedene Kombinationen aus Temperatur, Salzen, Detergentien, Lösungsmitteln, chaotropen Mitteln und Denaturierungsmitteln erzielt werden. Solche Bedingungen werden hierin im Zusammenhang der Homologieregionen und Primer weiter beschrieben.
Mehrfachproben-Nukleinsäurehybridisierungs-Analyse ist an einer Vielzahl von Formaten mit Filtern und festen Trägern durchgeführt worden (siehe G. A. Beltz et al., in Methods in Enzymology, Band 100, Teil B; R. Wu, L. Grossmam, K. Moldave, Hrsg., Academic Press, New York, Kapitel 19, S. 266–308, 1985). Ein Format, die sogenannte "Dot blot"-Hybridisierung, beinhaltet die nicht-kovalente Anheftung von Ziel-DNAs an einen Filter, welche anschließend mit (einer) Radioisotop-markierten Sonde(n) hybridisiert werden. Die "Dot blot"-Hybridisierung erlangte eine weit verbreitete Anwendung, und es sind viele Versionen entwickelt worden (siehe M. L. M. Anderson und B. D. Young, in Nucleic Acid Hybridization – A Practical Approach, B. D. Harnes und S. J. Higgins, Hrsg., IRL Press, Washington D. C., Kapitel 4, S. 73–111, 1985). Die "Dot blot"-Hybridisierung ist für die Mehrfachanalyse von genomischen Mutationen (D. Nanibhushan und D. Rabin, in EPA 0228075 , 8. Juli 1987) und für den Nachweis von überlappenden Klonen und die Konstruktion von genomischen Karten (G. A. Evans, im U.S.-Patent Nr. 5 219 726 , 15. Juni 1993) weiter entwickelt worden.
Ein anderes Format, die sogenannte "Sandwich"-Hybridisierung, beinhaltet das kovalente Anheften von Oligonukleotidsonden an einen festen Träger und deren Verwendung zum Einfangen und Nachweisen mehrerer Nukleinsäureziele (M. Ranki et al., Gene, 21, S. 77–85, 1983; A. M. Palva, T. M. Ranki und H. E. Soderlund, in der GB-Patentanmeldung GB 2156074A , 2. Oktober 1985; T. M. Ranki und H. E. Soderlund im U.S.-Patent Nr. 4 563 419 , 7. Januar 1986; A. D. B. Malcolm und J. A. Langdale, in PCT WO 86/03782 , 3. Juli 1986; Y. Stabinsky, im U.S.-Patent Nr. 4 751 177 , 14. Januar 1988, T. H. Adams et al., in PCT WO 90/01564 , 22. Februar 1990; R. B. Wallace et al., 6 Nucleic Acid Res. 11, S. 3543, 1979; und B. J. Connor et al, 80 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, S. 278–282, 1983). Multiplexversionen dieser Formate werden als "Reverse Dot-Blots" bezeichnet.
In einer anderen Vorgehensweise der Matrixhybridisierung verwendeten Beattie et al., in "The 1992 San Diego Conference: Genetic Recognition", November 1992, ein Mikrorobotersystem, um Mikrotröpfchen, welche spezifische DNA-Sequenzen enthalten, in einzelne mikrofabrizierte Probenvertiefungen auf einem Glassubstrat abzuscheiden. Die Hybridisierung in jeder Probenvertiefung wird durch Abfragen von Miniaturelektroden-Test-Haltevorrichtungen nachgewiesen, welche jede einzelne Mikrovertiefung mit einem elektrischen Wechselstrom(AC)-Feld umgeben.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie zu Hochdurchsatz-Screening-Fähigkeiten führt. In den hierin beschriebenen Assays können von einigen wenigen bis zu Millionen an unterschiedlichen Tags, welche z. B. SNPs identifizieren, gleichzeitig identifiziert werden. Zum Beispiel können, unter Anwendung einfacher Dot-Blot-Hybridisierungsverfahren, Membranen mit Tausenden von immobilisierten Sonden für das Screening gegen Tags erzeugt werden. Die nachstehend beschriebenen Festphasentechniken können angepasst werden, um buchstäblich Millionen von unterschiedlichen immobilisierten Nukleinsäuren pro Quadratzoll aufzuweisen. In ähnlicher Weise können sehr große Sätze von amplifizierten DNAs, z. B. Tags, auf Membranen immobilisiert werden, und zwar für das gleichzeitige Screening gegen eine oder mehrere Sequenz(en).
In einer Ausführungsform wird die Identität der Amplifikationsprodukte durch Nachweisen der Molekulargewichte des Amplifikationsproduktes oder eines Fragmentes davon bestimmt, wie durch Chromatographie oder Massenspektroskopie.
Zum Beispiel kann das Bruttomolekulargewicht eines Amplifikationsproduktes oder eines einzelnen Fragments davon nachgewiesen werden. Wie oben dargestellt, besitzt jedes Mitglied einer Sondenbibliothek (d. h. alle der Sonden in der Reaktion) eine einzigartige Molekulargewichts-Markierung basierend auf der jeweiligen Sequenz des Tags. Zum Beispiel kann Massenspektrometrie eine hohe Nachweisempfindlichkeit und Genauigkeit von Massenmessungen bereitstellen, welche zwischen Sonden unterscheiden können, die sich, obgleich von identischer Länge, hinsichtlich der Sequenz um nur eine Base unterscheiden. Somit können komplexe Bibliotheken durch Berechnen des Gesamtmolekulargewichts von jedem Amplifikationsprodukt, das nachgewiesen werden soll, durch Variieren des G/C/A/T-Gehaltes in der Tag-Sequenz konstruiert wer den. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen schließt die im Nachweis befindliche Nukleinsäuresequenz, als ihre einzige variable Sequenz, die Tag-Sequenz und nicht die Matrizen-Homologieregionen ein. Solche Fragmente können beispielsweise erzeugt werden durch Einschließen von Restriktionsstellen, welche die Tag-Sequenz flankieren, oder durch Wählen der PCR-Primer, so dass nur die Tag-Sequenz die einzige variable Region des kovalent geschlossenen ringförmigen Produktes ist, welches in den Amplifikationsprodukten eingeschlossen wird. Angesichts dessen müssen in denjenigen Ausführungsformen, worin das nachzuweisende Amplifikationsprodukt auch die Matrizen-Homologieregion(en) einschließt, die Berechnung und der Entwurf der Tag-Sequenzen ebenfalls die Variabilität in den THRs bzw. Matrizen-Homologieregionen einschließen, um Produkte herzustellen, welche ein einmaliges Molekulargewicht aufweisen, so dass sie voneinander durch Massenspektroskopie oder andere Nachweismethoden nach Wahl unterscheidbar sind.
Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass sehr einfache Algorithmen angewandt werden können, um die Molekulargewichte für jeden Vertreter einer Bibliothek zu berechnen, durch Variieren der Sequenz des Tags, wobei die Sequenzen der Matrizen-Humologieregionen berücksichtigt werden, falls notwendig. Die Molekulargewichtskomplexität des Tag kann erhöht werden, indem man gestattet, dass die Sonden sowohl hinsichtlich der Länge als auch der Sequenz variieren.
In bestimmten Fällen kann die Bibliothek durch chromatographische Techniken vor dem Nachweis durch Massenspektroskopie entflochten werden. Zum Beispiel kann die Mischung, vor dem Einbringen einer Probe in das Spektrometer, zuerst wenigstens halb aufgereinigt werden. Auftrennungsvorgehensweisen auf Basis der Größe (z. B. Gelfiltration), Löslichkeit (z. B. isoelektrische Präzipitation) oder der elektrischen Ladung (z. B. Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Ionenaustauschchromatographie) können angewandt werden, um eine Mischung von Amplimeren aufzutrennen. Ein bevorzugtes Trennungsvorgehen ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).
In bestimmten Ausführungsformen kann das Amplifikationsprodukt eine integrierte Massenmarkierung für Multiplex-Sequenzierung einschließen. Multiplexierung durch Massenmodifikation wird in diesem Fall durch Massen-Modifizieren des Nukleinsäureprimers, z. B. auf der Ebene der Zucker- oder Basen-Einheit, erreicht. Solche Ausführungsformen sind am praktischsten, wenn Amplifikationsprodukte eher nach dem Amplifikationsschritt als davor für den Nachweis vermischt werden sollen.
Geeignete Messenspektrometrie-Techniken zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen DNA-Analysen der vorliegenden Erfindung ein, einschließlich Kollisions-induzierter Dissoziations(CID)-Fragmentierungsanalyse (z. B. CID im Zusammenhang mit einer MS/MS-Konfiguration, siehe Schram, K. (1990) "Mass Spectrometry of Nucleid Acid Components", in Biomedical Applications of Mass Spectrometry 34: 203–287; und Crain, P. (1990) Mass Spectrometry Reviews 9: 505–554); Beschuss mit schnellen Atomen (FAB-Massenspektrometrie) und Plasmadesorption (PD-Massenspektrometrie), siehe Koster et al. (1987) Biomedical Environmental Mass Spectrometry 14: 111–116; und Elektrospray/Ionenspray(ES)- und Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations(MALDI)-Massenspektrometrie (siehe Fenn et al. (1984), J. Phys. Chem. 88: 4451–4459, Smith et al. (1990) Anal. Chem. 62: 882–889, und Ardrey, B. (1992) Spectroscopy Europe 4: 10–18). MALDI-Massenspektrometrie ist für solche Analysen besonders gut geeignet, wenn eine Flugzeit (Time-of-flight, TOF)-Konfiguration als Massenanalysator verwendet wird (MALDI-TOF); siehe die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/33000 , veröffentlicht am 12. September 1997, siehe auch Huth-Fehre et al. (1992), Rapid Communications Mass Spectrometry 6: 209–213, und Williams et al. (1990), Rapid Communications in Mass Spectrometry 4: 348–351.
Geeignete Massenspektrometrie-Techniken zur Anwendung in den Massen-Tag-Analysen der vorliegenden Erfindung beinhalten Kollisions-induzierte Dissoziations(CID)-Fragmentierungsanalyse (z. B. CID im Zusammenhang mit einer MS/MS-Konfiguration, siehe Schram, K. (1990) "Mass Spectrometry of Nucleid Acid Components", in Biomedical Applications of Mass Spectrometry 34: 203–287; und Crain, P. (1990) Mass Spectrometry Reviews 9: 505–554); Beschuss mit schnellen Atomen (FAB-Massenspektrometrie) und Plasmadesorption (PD-Massenspektrometrie), siehe Koster et al. (1987) Biomedical Environmental Mass Spectrometry 14: 111–116; und Elektrospray/Ionenspray(ES)- und Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations(MALDI)-Massenspektrometrie (siehe Fenn et al. (1984), J. Phys. Chem. 88: 4451–4459, Smith et al. (1990) Anal. Chem. 62: 882–889, und Ardrey, B. (1992) Spectroscopy Europe 4: 10–18). MALDI-Massenspektrometrie ist für solche Analysen besonders gut geeignet, wenn eine Flugzeit (Time-of-flight, TOF)-Konfiguration als ein Massenanalysator verwendet wird (MALDI-TOF). Siehe die internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/33000 , veröffentlicht am 12. September 1997, siehe auch Huth-Fehre et al. (1992), Rapid Communications Mass Spectrometry 6: 209–213, und Williams et al. (1990), Rapid Communications in Mass Spectrometry 4: 348–351.
In dieser Hinsicht ist eine Anzahl von Massen-Tags, geeignet zur Verwendung mit Nukleinsäuren, bekannt (siehe U.S.-Patent Nr. 5 003 059 von Brennan, und U.S.-Patent Nr. 5 547 835 von Koster), einschließlich Massen-Tags, welche von der Nukleinsäure abschneidbar sind (siehe internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/27331 ).
In noch einer anderen Ausführungsform können verschiedene Tag-Sequenzen konkatenatartig verknüpft und durch herkömmliche Sequenzierungstechniken sequenziert werden, z. B. die Techniken nach Sanger oder Maxim-Gilbert. Zur weiteren Veranschaulichung können die Amplifikationsprodukte erzeugt werden, um Restriktionsstellen einzuschließen, welche die Tag-Sequenz flankieren. Somit kann das Amplifikationsprodukt durch die Formel Linker-TAG- Linker repräsentiert werden. Nach der Behandlung der Amplifikationsprodukte mit den Restriktionsenzymen werden Linker-TAG-Linker-Fragmente unter Bildung von konkatenatartig verknüpften Nukleinmolekülen ligiert. Zum Beispiel können 5'- und 3'-Linker eine BamH1- bzw. BglII-Stelle tragen, so dass kompatible klebrige Enden hergestellt werden. Im veranschaulichten Beispiel wird, durch Ausführen der Ligation in Gegenwart von BamH1 und BglII, das resultierende Konkatemer dazu führen, dass die Restriktionsfragmente in einem Kopf an-Schwanz-Format verknüpft werden, vermittels des erneuten Verdaus von BamHI/BamHI- und BglII/BglII-Ligationsprodukten, aber nicht der BamHI/BglII-Ligationsprodukte (welche nicht eine Sequenz erzeugen, die von einem der beiden Restriktionsenzyme erkannt wird).
Die Kontatemer-Arrays können, vorzugsweise als 2–3 kb große Fragmente, isoliert und in einen Amplifikationsvektor ligiert werden. Die amplifizierten Arrays können dann ohne Weiteres sequenziert werden, wobei die Grenzstelle von Restriktionsenzymen die Grenzen von einer Tag-Sequenz zur nächsten markieren.
In einer anderen Ausführungsform werden die Hybridisierungs-Tags auf einem mikroformatierten Multiplex oder Matrix-Vorrichtungen (z. B. DNA-Chips) nachgewiesen (siehe M. Barinaga, 253 Science, S. 1489, 1991; W. Rains, 10 Bio/Technology, S. 757–758, 1992). Diese Verfahren heften üblicherweise spezifische DNA-Sequenzen an sehr kleine spezifische Flächen auf einem festen Träger, wie Mikrovertiefungen eines DNA-Chips. In einer Variante ist die Erfindung an Festphasen-Arrays für den schnellen und spezifischen Nachweis von mehreren polymorphen Nukleotiden, z. B. SNPs, angepasst. Typischerweise wird ein Oligonukleotid an einen festen Träger verknüpft, und eine Tag-Nukleinsäure wird an das Oligonukleotid hybridisiert. Entweder das Oligonukleotid oder das Tag, oder beides, können markiert sein, typischerweise mit einem Fluorophor. Falls das Tag markiert ist, wird die Hybridisierung durch Nachweisen von gebundener Fluoreszenz nachgewiesen. Falls das Oligonukleotid markiert ist, wird die Hybridisierung typischerweise durch Ablöschen der Markierung nachgewiesen. Falls sowohl das Oligonukleotid als auch das Tag markiert sind, wird der Nachweis der Hybridisierung typischerweise durch Überwachen einer Farbverschiebung durchgeführt, welche aus der räumlichen Nähe der zwei gebundenen Markierungen resultiert. Eine Vielzahl von Markierungsstrategien, Markierungen und dergleichen, insbesondere für fluoreszenzbasierende Anwendungen, sind obenstehend beschrieben.
In einer Ausführungsform wird ein Array von Oligonukleotiden auf einem festen Träger synthetisiert. Beispielhafte feste Träger schließen Glas, Kunststoff, Polymere, Metalle, Metalloide, Keramika, organische Stoffe etc. ein. Unter Verwendung der Chip-Maskierungstechnologien und von photoprotektiver Chemie ist es möglich, geordnete Arrays von Nukleinsäuresonden zu erzeugen. Diese Arrays, welche z. B. als "DNA-Chips" oder als "Very Large Scale Immobilized Polymer"-Arrays ("VLSIPS^TM"-Arrays) bekannt sind, können Millionen von definierten Sonden regionen auf einem Substrat einschließen, welches eine Fläche von etwa 1 cm² bis mehreren cm² aufweist, wodurch Sätze von einigen wenigen bis zu Millionen an Sonden eingebunden werden.
Die Konstruktion und Anwendung von Festphasen-Nukleinsäurearrays zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren ist in der Literatur allgemein beschrieben; siehe Fodor et al. (1991) Science, 251: 767–777; Sheldon et al. (1993) Clinical Chemistry 39 (4): 718–719; Kozal et al (1996) Nature Medicine 2(7): 753–759, und Hubbell, U.S.-Patent Nr. 5 571 639 ; siehe auch Pinkel et al. PCT/US95/16155 ( WO 96/17958 ). Kurz gesagt, ermöglicht eine kombinatorische Strategie die Synthese von Arrays, welche eine große Anzahl an Sonden enthalten, unter Verwendung einer minimalen Zahl an synthetischen Schritten. Es ist zum Beispiel möglich, alle denkbaren DNA-8mer-Oligonukleotide (48.- oder 65.536 mögliche Kombinationen) unter Verwendung von nur 32 chemischen synthetischen Schritten zu synthetisieren und anzuheften. Im Allgemeinen sehen VLSIPS^TM-Vorgehensweisen ein Verfahren zur Herstellung von 4n unterschiedlichen Oligonukleotidsonden auf einem Array unter Anwendung von nur 4n synthetischen Schritten vor.
Licht-gesteuerte kombinatorische Synthese von Oligonukleotid-Arrays auf einer Glasoberfläche wird durchgeführt mit automatisierter Phosphoramidit-Chemie und Chip-Maskierungstechniken, ähnlich zu Photoresist-Technologien in der Computerchip-Industrie. Typischerweise wird eine Glasoberfläche mit einem Silanreagenz derivatisiert, das eine funktionelle Gruppe enthält, z. B. eine Hydroxyl- oder Amingruppe, blockiert von einer photolabilen Schutzgruppe. Die Photolyse durch eine photolithografische Maske wird selektiv angewandt, um funktionelle Gruppen zu belichten, welche dann bereit sind, um mit eintretenden 5'-photogeschützten Nukleosidphosphoramiditen zu reagieren. Die Phosphoramidite reagieren nur mit denjenigen Stellen, welche beleuchtet werden (und somit durch Entfernung der photolabilen Schutzgruppe exponiert werden). Somit addieren sich die Phosphoramidite nur an diejenigen Flächen, welche aus dem vorangehenden Schritt selektiv exponiert bzw. belichtet wurden. Diese Schritte werden wiederholt, bis der gewünschte Array von Sequenzen auf der festen Oberfläche synthetisiert worden ist.
Es ist auch ein mit 96 Vertiefungen ausgestatteter automatisierter Multiplex-Oligonukleotid-Synthesizer (A.M.O.S.) entwickelt worden, und er ist in der Lage, Tausende von Oligonukleotiden herzustellen (Lashkari et al. (1995) PNAS 93: 7912). Die existierende licht-gesteuerte Synthesetechnologie kann Hochdichte-Arrays erzeugen, welche über 65.000 Oligonukleotide enthalten (Lipshutz et al. (1995) Bio Tech. 19: 442).
Die kombinatorische Synthese von verschiedenen Oligonukleotidanalogen an unterschiedlichen Stellen auf dem Array wird durch das Muster der Beleuchtung während der Synthese und die Reihenfolge der Zugabe von Kopplungsreagenzien bestimmt. Die Überwachung der Hybridisierung von Zielnukleinsäuren an den Array wird typischerweise mit Fluoreszenzmikroskopen oder Laserscanning-Mikroskopen durchgeführt. Zusätzlich dazu, in der Lage zu sein, Sondenarrays unter Einsatz verfügbarer Techniken zu entwerfen, zu bauen und anzuwenden, ist der Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls in der Lage, maßgeschneidert angefertigte Arrays und Array-Ablesevorrichtungen von Herstellern zu bestellen, welche auf die Array-Produktion spezialisiert sind. Zum Beispiel stellt Affymetrix Corp., in Santa Clara, Calif., DNA-VLSIP[^TM]TM-Arrays her.
Es ist davon auszugehen, dass der Oligonukleotid-Entwurf von der beabsichtigten Anwendung beeinflusst wird. Falls zum Beispiel mehrere Oligonukleotid-Tag-Wechselwirkungen in einem einzelnen Assay nachzuweisen sind, z. B. auf einem einzelnen DNA-Chip, ist es wünschenswert, dass ähnliche Schmelztemperaturen für alle Sonden vorliegen. Folglich wird die Länge der Sonden so eingestellt, dass die Schmelztemperaturen für alle der Sonden auf dem Array sehr ähnlich sind (es ist davon auszugehen, dass unterschiedliche Längen für unterschiedliche Sonden benötigt werden können, um eine jeweilige T[m] zu erzielen, falls unterschiedliche Sonden unterschiedlichen GC-Gehalt besitzen). Obwohl die Schmelztemperatur eine Haupterwägung beim Sondenentwurf ist, werden ggf. andere Faktoren verwendet, um die Sondenkonstruktion weiter anzupassen, wie das Selektieren gegen Primer-Selbstkomplementarität und dergleichen. Die "aktive" Natur der Vorrichtungen liefert eine unabhängige elektronische Kontrolle über alle Aspekte der Hybridisierungsreaktion (oder einer beliebigen anderen Affinitätsreaktion), welche an jeder spezifischen Mikroörtlichkeit stattfindet. Diese Vorrichtungen stellen einen neuen Mechanismus zur Beeinflussung von Hybridisierungsreaktionen bereit, welcher elektronische Stringenzkontrolle (ESC) genannt wird. Für DNA-Hybridisierungsreaktionen, welche unterschiedliche Stringenzbedingungen erfordern, überwindet die ESC die inhärente Beschränkung von herkömmlichen Array-Technologien. Die aktiven Vorrichtungen dieser Erfindung können elektronisch "unterschiedliche Stringenzbedingungen" an jeder Mikro-Örtlichkeit herstellen. Somit können alle Hybridisierungen in optimaler Weise in der selben Hauptlösung durchgeführt werden. Diese Arrays werden im U.S.-Patent Nr. 6 051 380 von Sosnowski et al. beschrieben.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung Array-Zusammensetzungen vor, welche mindestens ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die einzelne Stellen umfasst. Mit "Array" oder "Biochip" wird hierin eine Mehrzahl von Nukleinsäuren in einem Array-Format gemeint; die Größe des Arrays wird von der Zusammensetzung und Endanwendung des Arrays abhängen. Nukleinsäure-Arrays sind im Fachgebiet bekannt und können auf mehrere Weisen klassifiziert werden; sowohl geordnete Arrays (z. B. das Vermögen, Chemie-Arten an diskreten Stellen aufzulösen) als auch statistische Arrays (z. B. Kügelchen-Arrays) sind eingeschlossen. Geordnete Arrays schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, diejenigen, welche unter Anwendung von Photolithographie-Techniken (Affymetrix GeneChip^TM), Spotting-Techniken (Synteni und andere), Aufdrucktechniken (Hewlett Packard und Rosetta) hergestellt werden, Elektrodenarrays, dreidimensionale "Gel-Pad"-Arrays etc., ein. Flüssigarrays können ebenfalls verwendet werden.
Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, wird die Größe des Arrays variieren. Arrays mit etwa 2 unterschiedlichen Einfangsonden bis zu vielen Millionen können hergestellt werden, wobei sehr große Arrays möglich sind. Bevorzugte Arrays liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 100 bis etwa 100 000 verschiedenen Einfangsonden, wobei die Array-Dichten demgemäß variieren.
Im Allgemeinen umfassen die Arrays ein Substrat mit assoziierten Einfangsonden. Mit "Substrat" oder "fester Träger" oder anderen grammatikalischen Äquivalenten wird hierin jedwedes Material gemeint, welches modifiziert werden kann, um diskrete individuelle Stellen zu enthalten, die geeignet für die Anheftung oder Assoziation von Einfangsonden sind, und welches wenigstens einem Nachweisverfahren zuführbar ist. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, ist die Anzahl der möglichen Substrate sehr groß. Mögliche Substrate schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (einschließlich Acryl, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethanen, Teflon etc.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrozellulose, Harze, Siliciumdioxid oder Siliciumdioxid-basierende Materialien, einschließlich Silicium [Silikon] und modifiziertem Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Gläser, Kunststoffe, optische Faserbündel und eine Vielzahl anderer Polymere ein. Im Allgemeinen gestatten die Substrate den optischen Nachweis und fluoreszieren nicht nennenswert von selbst.
Verfahren zum Zugeben, Waschen und Nachweisen der Amplikons auf dem Array sind allgemein bekannt.
Somit können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Forschungs-, klinischen, Qualitätskontroll- oder Feldversuch-Umgebungen angewandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet die vorliegende Erfindung Anwendung bei der Quantifizierung von PCR-Reaktionen. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Quantifizieren der Anzahl von einer oder mehreren spezifischen Sequenzen in einer Probe von Nukleinsäuren bereit. Das Verfahren kann ähnlich zu jedweden der oben beschriebenen Verfahren sein, solange das nachgewiesene Produkt in Proportionen vorhanden ist, welche direkt mit der Menge der ursprünglichen Matrizensequenz korreliert sind. Dies ist z. B. der Fall, wo das Verfahren einen Hybridisierungsschritt an die Matrizen-DNA, die Zirkularisierung der Sonde, die Verlängerung der Primer und den Nachweis des verlängerten Produktes beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner einen Amplifikationsschritt, wobei die Amplifikationsreaktion eine kontrollierte Amplifikation ist. Dies ist z. B. der Fall, wenn PCR-Amplifikation angewandt und die PCR-Reaktion während der exponentiellen Phase gestoppt wird. Die Menge an amplifizierten Produkt in dieser Situation wird direkt proportional zur Menge der ursprünglichen Sequenz in der Nukleinsäureprobe sein. Somit werden, in einer bevorzug ten Ausführungsform, mehrere Amplifikationsreaktionen parallel durchgeführt, wobei eine unterschiedliche Anzahl von Amplifikationszyklen in jeder von ihnen verwendet werden. Dies wird gewährleisten, dass mindestens eine der Reaktionen in der exponentiellen Phase angehalten worden sein wird.
In Verfahren zum Quantifizieren der Anzahl einer spezifischen Sequenz in einer Probe, kann es auch in bestimmten Situationen wünschenswert sein, eine Markernukleinsäure einzuschließen. Die Markernukleinsäure kann der Reaktion während der Hybridisierungs-Stufe oder an irgendeiner Stufe danach zugegeben werden, und kann den gleichen Reaktionen unterzogen werden oder nicht. Alternativ dazu wird die Marker-DNA lediglich verwendet, um die Menge an amplifizierten Produkt am Ende des Amplifikationsschrittes zu bestimmen.
Die Verfahren zur Genotypisierung und diejenigen zur Quantifizierung können gleichzeitig angewandt werden, solange die Verfahren so gesteuert werden, dass die Menge an amplifiziertem Produkt direkt mit der Menge der ursprünglichen Sequenz in der Proben-Nukleinsäure korreliert ist.
Nukleinsäurevariationen (d. h. genetische Variationen), welche gemäß dem Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden sollen, schließen Variationen in einem oder mehreren aufeinanderfolgenden oder nicht-aufeinanderfolgenden Nukleotiden in einer Nukleinsäureprobe ein. Diese Variationen können auf einem einzelnen Nukleinsäuremolekül, z. B. einem Chromosom, oder auf mehreren Nukleinsäuremolekülen vorhanden sein. Die Erfindung ist insbesondere für die Bestimmung der Identität von Allelen von variablen genomischen Regionen anwendbar (hierin ebenfalls bezeichnet als "allelische Varianten einer polymorphen Region"), z. B. polymorphen Regionen, in Situationen, bei welchen es früher nachgewiesen worden ist, dass verschiedene Individuen eines von mehreren möglichen Allelen aufweisen können (im Gegensatz zur Ermittlung einer neuen variablen Region). Im Allgemeinen können die Verfahren der Erfindung Nukleotidinsertionen, -deletionen, -substitutionen, chromosomale Translokationen und andere genetische Schäden oder Variationen nachweisen.
Beispielhafte variable Regionen schließen SNPs ein. Bestimmte SNPs weisen zwei Allele auf, andere besitzen drei Allele und noch andere besitzen vier Allele. Das Vorhandensein von SNPs kann zum Beispiel kennzeichnend für eine bestimmte Population, einen Krankheitszustand oder eine Neigung für einen Krankheitszustand sein.
Andere variable Regionen schließen mehr als ein Nukleotid ein und können polymorphe Regionen, "Simple"-Sequenz-Repetitionen (SSRs), kurze Tandem-Repetitionen (STRs) und Mikrosatelliten-Repetitionen (MRs) sein.
In einer anderen Ausführungsform gestatten die Verfahren der Erfindung den Nachweis und die Identifikation von Mikroorganismen, z. B. Pathogenen, welche Säuger infizieren. Somit kann die Erfindung z. B. angewandt werden, um den jeweiligen Stamm eines Virus zu identifizieren, der ein humanes Subjekt infiziert, z. B., unter anderen, den besonderen Stamm von humanem Immunschwäche-Virus oder Papillomvirus (HPV). Stämme von Mikroorganismen unterscheiden sich häufig in einigen wenigen Nukleotiden voneinander, wohingegen der Rest ihrer Genome identisch ist. Somit können Sonden hergestellt werden, um die konservierten Regionen zu erkennen und um die jeweiligen variablen Nukleotid(e) zu identifizieren.
Zum Beispiel kann eine breite Vielzahl von Infektionskrankheiten durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Typischerweise werden diese durch bakterielle, virale, parasitäre und pilzliche infektiöse Agenzien verursacht. Die Resistenz von verschiedenen infektiösen Agenzien gegenüber Arzneistoffen kann ebenfalls unter Verwendung der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
Bakterielle infektiöse Agenzien, welche durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen werden können, schließen Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Pseudomonas, Listeria monocytogenes, Myobacterium tuberculosis, Mycobacterium aviumintracellulare, Yersinia, Francisella, Pasteurella, Brucella, Clostridia, Bordetella Pertussis, Bacteroides, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, B-hämolytischen Strep., Corynebakterien, Legionella, Mycoplasma, Ureaplasma, Chlamydia, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitides, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Helicobacter pylori, Treponema Palladium, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Rickettsia-Pathogene, Nocardia und Acitnomycetes ein.
Pilzliche infektiöse Agenzien, welche durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen werden können, schließen Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immites, Paracoccidioides brasiliensis, Candida albicans, Aspergillus fumigautus, Phycomycetes (Rhizopus), Sporothrix schenckii, Chromomycosis und Maduromycosis ein.
Virale infektiöse Agenzien, welche durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen werden können, schließen humanes Immunschwäche-Virus, humanes T-Zell-lymphozytotrophes Virus, Hepatitisviren (z. B. Hepatitis-B-Virus und Hepatitis-C-Virus), Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, humane Papillomviren, Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Adenoviren, Coronaviren, Rhabdoviren, Polioviren, Togaviren, Bunyaviren, Arenaviren, Rubellaviren und Reoviren ein.
Parasitische Agenzien, welche durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen werden können, schließen Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Onchoverva volvulus, Leishmania, Trypanosoma spp., Schistosoma spp., Entamoeba histolytica, Cryptosporidum, Giardia spp., Trichimonas spp., Balatidium coli, Wuchereria bancrofti, Toxoplasma spp., Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Dracunculus medinesis, Trematoden, Diphyllobothrium latum, Taenia spp., Pneumocystis carinii und Necator americanis ein.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls nützlich für den Nachweis von Arzneistoffresistenz durch infektiöse Agenzien. Zum Beispiel können Vancomycin-resistenter Enterococcus faecium, Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus, Penicillin-resistenter Streptococcus pneumoniae, mehrfach-arzneimittelresistenter Mycobacterium tuberculosis und AZT-resistentes humanes Immunschwäche-Virus alle mit der vorliegenden Erfindung identifiziert werden.
Auch genetische Krankheiten können durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Dies kann durch pränatales oder postnatales Screening hinsichtlich chromosomalen und genetischen Abweichungen und hinsichtlich genetischer Krankheiten durchgeführt werden. Beispiele von nachweisbaren genetischen Krankheiten schließen ein: 21-Hydroxylase-Defizienz, cystische Fibrose, Fragiles-X-Syndrom, Turner-Syndrom, Duchenne-Muskeldystrophie, Down-Syndrom oder andere Trisomien, Herzerkrankung, Einzelgen-Erkrankungen, HLA-Typisierung, Phenylketonurie, Sichelzellanämie, Tay-Sachs-Krankheit, Thalassämie, Klinefelter-Syndrom, Huntington-Krankheit, Autoimmunkrankheiten, Lipidosis, Fettleibigkeits-Defekte, Hämophilie, angeborene Fehler des Stoffwechsels und Diabetes.
Krebsarten, welche durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können, beinhalten im Allgemeinen Onkogene, Tumorsuppressorgene, oder Gene, welche an DNA-Amplifikation, -Replikation, -Rekombination oder -Reparatur beteiligt sind. Beispiele für diese schließen ein: BRCA1-Gen, p53-Gen, APC-Gen, Her2/Neu-Amplifikation, Bcr/Ab1, K-ras-Gen und humane Papillomviren-Typen 16 und 18. Verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung können angewandt werden, um Amplifikationen, große Deletionen sowie Punktmutationen und kleine Deletionen/Insertionen der obenstehenden Gene in den folgenden üblichen Krebsarten des Menschen zu identifizieren: Leukämie, Dickdarmkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hirntumoren, Tumoren des Zentralnervensystems, Blasentumoren, Melanome, Leberkrebs, Osteosarkom und andere Knochenkrebsarten, Hoden- und Eierstock-Karzinome, Kopf- und Halstumoren und Cervix-Neoplasmen.
Auf dem Feld der Umweltüberwachung kann die vorliegende Erfindung zum Nachweis, Identifizieren und Überwachen von pathogenen und indigenen Mikroorganismen in natürlichen und konstruierten Ökosystemen und Mikrokosmen verwendet werden, wie in kommunalen Abwasser-Reinigungssystemen und Wasserreservoirs oder in verschmutzten Gegenden, welche einer Bioremediation unterzogen werden. Es ist ebenfalls möglich, Plasmide nachzuweisen, welche Gene enthalten, die Xenobiotika metabolisieren können, um spezifische Zielmikroorganismen in Populationsdynamik-Untersuchungen zu überwachen, um genetisch modifizierte Mikroorganis men in der Umwelt und in industriellen Anlagen entweder nachzuweisen, zu identifizieren oder zu überwachen.
Die vorliegende Erfindung kann auch in einer Vielzahl von forensischen Gebieten angewandt werden, einschließlich zur Personenidentifizierung für Militärpersonal und Verbrechensaufklärung, Vaterschaftstests und Familienverwandtschaftsanalyse, HLA-Kompatibilitätstypisierung und beim Screening von Blut, Sperma oder Transplantationsorganen hinsichtlich Kontamination.
In der Nahrungsmittel- und Futterindustrie findet die vorliegende Erfindung eine große Vielzahl von Anwendungen. Sie kann zum Beispiel zur Identifizierung und Charakterisierung von Produktionsorganismen angewandt werden, wie Hefe zur Produktion von Bier, Wein, Käse, Joghurt, Brot, etc. Ein anderes Anwendungsgebiet besteht in Hinsicht auf die Qualitätskontrolle und Zertifizierung von Produkten und Verfahren (z. B. Viehzucht, Pasteurisierung und Fleischverarbeitung) in Bezug auf Kontaminanten. Andere Anwendungen beinhalten die Charakterisierung von Pflanzen, Knollen und Samen für Züchtungszwecke, die Identifizierung der Gegenwart von pflanzenspezifischen Pathogenen und den Nachweis und die Identifizierung von tiermedizinischen Infektionen und in Tierzuchtprogrammen.
Die folgenden Beispiele dienen zur vollständigeren Beschreibung der Art der Anwendung der oben beschriebenen Erfindung sowie zur Darstellung der besten Formen, welche zur Ausführung verschiedener Aspekte der Erfindung in Betracht gezogen werden. Es versteht sich, dass diese Beispiele keineswegs dazu dienen, den gültigen Umfang dieser Erfindung einzuschränken, sondern vielmehr zu Zwecken der Veranschaulichung dargelegt sind.
BEISPIELE
Beispiel 1: Unterscheidung von zwei Matrizen, welche sich um ein einziges Nukleotid unterscheiden
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, zwei Nukleinsäuren, welche um ein einziges Nukleotid abweichen, durch ein Verfahren zu unterscheiden, in welchem eine Oligonukleotidsonde vor der PCR-Amplifikation mit der Nukleinsäure hybridisiert wird.
Es wurden acht Reaktionen parallel durchgeführt, in welchen eine von zwei Matrizen-DNAs, die sich voneinander um ein einziges Nukleotid unterscheiden (hierin bezeichnet als "SNP"), mit oder ohne einer von zwei Oligonukleotidsonden inkubiert wurde. Die verschiedenen Kombinationen sind in der Tabelle 1 dargestellt. Die Matrizen-DNA S7 ist eine 600 bp lange doppelsträngige DNA, amplifiziert aus dem S. cerevisiae-Stamm S288C, welche die Nukleotidsequenz 5' ATCTCGGGATATCAGACTTAGCGGCACCGTCCTCACCG 3' (SEQ. ID. Nr.: 10):1 einschließt, und die Matrizen-DNA Y7 ist eine 600 bp lange doppelsträngige DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm YJM789, welche die Nukleotidsequenz 5'-ATCTCGGGATATCAGACTTAGCGGTACCGTCCYCACCG-3' (SEQ. ID. Nr.: 11) einschließt. Die zwei Matrizen-DNAs sind mit Ausnahme des unterstrichenen Nukleotids identisch. Die Oligonukleotidsonde "S" (ebenfalls bezeichnet als Y2:L:S288C) besitzt die Nukleotidsequenz
5'CCGCTAAGTCTGATATCCCGAGAT/GTCCACGAGGTCTCTAGTC/GACCTGCAGCGTACG/CGGACCTCAAGTGAAGTACA/CGGTGAGGACGGT/G 3' (SEQ. ID. Nr.: 12); und die Oligonukleotidsonde "Y" (ebenfalls bezeichnet als Y2:L:yjm789) besitzt die Nukleotidsequenz
5'CCGCTAAGTCTGATATCCCGAGAT/GTCCACGAGGTCTCTAGTC/GACCTGCAGCGTACG/CGGACCTCAAGTGAAGTACA/CGGTGAGGACGGT/A 3' (SEQ. ID. Nr.: 13). Der "/" in den Sondensequenzen gibt die verschiedenen Teile der Sonde an: Homologie 1/Primer 1/Primer 2/Barcode/Homologie 2/SNP. Die Oligonukleotidsonde Y ist identisch zur Sonde S, außer dass die am meisten 3' gelegene Base komplementär zu dem SNP-Nukleotid in der Matrizen-DNA Y7 ist. Tabelle 1: Inhalt der verschiedenen Reaktionen

Reaktion 1 2 3 4 5 6 7 8

Sonde S Y keine S Y keine S Y

Matrize S7 S7 S7 Y7 Y7 Y7 keine keine
Ein Ligase-Mix wurde hergestellt durch Kombinieren (pro Reaktion) von: 8 μl 5 × Tth-Ligasepuffer (von Marsh Biomedical, Rochester, New York); 0,32 μl Tth-Ligase (von Marsh Biomedical, Rochester, New York) und 29,7 μl Wasser. Zu den 38 μl Ligase-Mix wurde 1 μl Matrizen-DNA bei 10 pMol/μl zugegeben. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 55°C inkubiert, um die Matrizen-DNA und die Sonde zu hybridisieren und die 3'- und 5'-Enden der Oligonukleotidsonde zu ligieren. Zu 12,5 μl dieser Reaktion wurden dann 37,5 μl PCR-Mix zugegeben, welcher durch Mischen (pro Reaktion) von 5 μl 10 × Taq Gold-Puffer (von PE Biosystems, Foster City, CA); 6 μl dNTPs bei 1,25 mM; 0,2 μl AmpliTaq Gold DNA-Polymerase bei 5 U/μl (von PE Biosystems, Foster City, CA), 1 μl von Primer p1BAR bei 10 pMol/μl; 1 μl Primer P2 bei 10 pMol/μl; und 24,3 μl Wasser hergestellt worden war. Der Primer p1Bar besitzt die Nukleotidsequenz 5'-GACTAGAGACCTCGTGGAC-3' (SEQ. ID. Nr.: 1), und der Primer P2 besitzt die Nukleotidsequenz 5'-GACCTGCAGCGTACG-3' (SEQ. ID. Nr.: 2). Die Reaktionen wurden dann 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um die Matrizen-DNA zu denaturieren, gefolgt von 14 Zyklen von 95°C während 20 Sekunden; 57°C (sinkend um 0,5 Grad pro Zyklus) während 1 Minute; gefolgt von 16 Zyklen von 95°C während 20 Sekunden; 50°C während 45 Sekunden, gefolgt von Inkubation bei 4°C.
20 μl von jedem der Amplifikationsprodukte wurden dann einer Elektrophorese auf einem 2% (w/v) Agarosegel unterzogen, und die Amplifikationsprodukte wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid und UV-Licht sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein einer Bande von etwa 100 Nukleotiden in den Spuren, welche die Reaktionsprodukte enthalten, in denen die Sonde das komplementäre SNP-Nukleotid zu demjenigen, welches in der Matrizen-DNA vorhanden ist, enthält, aber nicht in den anderen Spuren. Somit identifiziert die Sonde S den SNP auf der Matrizen-DNA S7, und die Sonde Y identifiziert den SNP auf der Matrizen-DNA Y7. Kein Produkt wird aus einer Reaktionsmischung amplifiziert, welche Matrizen-DNA S7 und Sonde Y oder Matrizen-DNA Y7 und Sonde S enthält.
Somit demonstriert dieses Beispiel die Identifizierung eines SNP unter Anwendung eines Verfahrens, das Hybridisierung, Ligation und dann PCR-Amplifikation beinhaltet.
Beispiel 2: Identifizierung eines SNP durch "Fugen-Auffüllen"
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleotides, z. B. eines SNP, umfassend das Zugeben einer Oligonukleotidsonde in vier Reaktionen, die eine Polymerase, eine Ligase und eines der vier Nukleotide enthalten.

Vier verschiedene SNPs wurden in Singleplex-Reaktionen getestet. Sechzehn Reaktionen wurden parallel ausgeführt, in welchen jede der vier DNA-Matrizen mit einer von vier Sonden inkubiert wurde. In diesem Beispiel waren die Matrizen-DNAs 36 bis 42 Basen lage Oligonukleotide aus S. cerevisiae. Die verschiedenen Kombinationen sind in der Tabelle 2 dargestellt. Die Nukleotidsequenzen der Matrizen und Sonden waren wie folgend (Die Struktur der Sonden ist angezeigt als: Homologie 1/Primer 1/Primer 2/Barcode/(+/– DraI)/Homologie 2): Matrizen-DNA Y1:TOS:T:

Matrizen-DNA Y2:TO S:C:

Matrizen-DNA Y3:TO S:A:

Matrizen-DNA Y5:TO S:G:

Sonde Y1:PL:119:31 (ebenfalls bezeichnet als SNP1):

Sonde Y2:PL:C:119:55 (ebenfalls bezeichnet als SNP2):

Sonde Y3:PL:C:119:131 (ebenfalls bezeichnet als SNP3):

Sonde Y5:PL:119:167 (ebenfalls bezeichnet als SNP5):

Tabelle 2: Inhalt der unterschiedlichen Reaktionen

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonde	Y1:PL119:31	Y1:PL119:31	Y1:PL119:31	Y1:PL119:31	Y2:PL:C119:56	Y2:PL:C119:55	Y2:PL:C119:55	Y2:PL:C119:5
Matrize	Y1:TO S:T	Y1:TO S:T	Y1:TO S:T	Y1:TO S:T	Y2:TO S:C	Y2:TO S:C	Y2:TO S:C	Y2:TO S:C
dNTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP

Reaktion	9	10	11	12	13	14	15	16
Sonde	Y3:PL119:131	Y3:PL119:131	Y3:PL119:131	Y3:PL119:131	Y5:PL:119:167	Y5:PL:119:167	Y5:PL:119:167	Y5:PL:119:167
Matrize	Y3:TO S:A	Y3:TO S:A	Y3:TO S:A	Y3:TO S:A	Y5:TO S:G	Y5:TO S:G	Y5:TO S:G	Y5:TO S:G
dNTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP

Ein DNA-Mix wurde hergestellt durch Mischen von (je Reaktion) 2 μl pfu-Ligasepuffer (von Stratagene, San Diego, CA); 0,1 μl Matrizen-Oligonukleotid bei 400 fmol/μl; 0,4 μl Sonden-Oligo (ebenfalls bezeichnet als "Barcode-Oligo") bei 10 pmol/μl; und 17,5 μl Wasser. Die DNA wurde durch Inkubieren dieser Reaktionen bei 95°C während 5 Minuten denaturiert. Die Nukleinsäuren wurden dann durch Inkubieren der Reaktionen bei 65°C während einer Stunde annealt. Die letztendliche Matrizenmenge betrug 40 Femtomol/Reaktion und diejenige des Sondeno ligonukleotids betrug 4 Picomol/Reaktion. Zu jeder Reaktion wurden 20 μl vorgewärmter (1 Minute bei 65°C) Polymerase/Ligase/dNTP-Mix zugegeben. Dieser Mix wurde hergestellt durch Vereinigen (je Reaktion) von 2 μl 10 × pfu-Ligasepuffer (von Stratagene, San Diego, CA); 2 μl von einem dNTP bei 1 mM; 0,05 μl Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment (von PE Biosystems, Foster City, CA) bei 10 U/μl; 1 μl pfu-Ligase (von Stratagene, San Diego, CA) bei 4 U/μl; und 14,95 μl Wasser. Die 40-μl-Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert.
Die Matrizen-DNA wurde dann einer "rollender Kreis"-Amplifikation wie folgend unterzogen. 4 μl der oben genannten Reaktionen wurden zu 32 μl RCA-Mix zugegeben, der 10 Minuten lang bei 65°C vorgewärmt worden war. RCA-Mix wurde hergestellt durch Vereinigen (je Reaktion) von 4 μl 10 × Vent-Puffer (von New England Biolabs, Beverly, MA); 2 μl DMSO; 6,4 μl Vent-DNA-Pol.Exo- bei 2 U/μl (NEB); 0,36 μl RCA-Primer bei 100 pmol/μl; 0,93 μl T4-Gen32-Protein bei 1,7 mg/ml (USB); 0,4 ml MgSO₄ bei 100 mM und 17,91 μl Wasser. Die Nukleotidsequenz des RCA-Primers enthält an ihrem 5'-Ende das Komplement eines Abschnitts der Sequenz von Primer 2, gefolgt von der Sequenz von Primer 1 und besitzt die Nukleotidsequenz 5'-GTCGTTTTACAGACTAGAGACCTCGTGGAC-3' (SEQ. ID. Nr.: 22). Die Reaktionen wurden dann 3 Minuten lang bei 92°C deinkubiert (Hitzedenaturierung), wonach 4 μl vorgewärmter dNTP-Mix mit 4 mM von allen vier Nukleotiden zugegeben wurde, und die Reaktionen wurden bei 65,5°C während 4,5 Stunden weiter inkubiert. Diese Amplifikation führt zur Synthese eines langen Stranges, der an seinem 5'-Ende den RCA-Primer aufweist, woran sich der Rest von Primer 2-Primer 1-HR1-HR2-Tag-Primer 2-[Primer 1-HR1-HR2-Tag-Primer 2-]_n anschließt.
Für den PCT-Amplifikationsschritt wurden zwei Reaktionen für jede der Matrize/Sonde-Kombinationen durch Vereinigen von jeweils 1 μl der oben genannten Reaktionen mit 19 μl PCR-Mix durchgeführt, welcher (je Reaktion) 2 μl 10 × Taq-Gold-Puffer (von PE Biosystems, Foster City, CA); 0,75 μl dNTPs bei 4,0 mM; 0,15 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl (PE); 0,16 μl P1bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 0,16 μl M13-Primer (d. h. Primer 2) bei 100 pmol/μl; 2 μl MgCl₂ bei 25 mM und 13,78 μl Wasser enthielt. Die Nukleotidsequenz des M13-Primers ist 5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3' (SEQ. ID. Nr.: 3). Die PCR-Reaktionen wurden fünf Minuten lang bei 95°C denaturiert und dann entweder 15 oder 25 Zyklen von 20 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 50°C unterzogen.
20 μl von jeder der Reaktionen wurden dann einer Gelelektrophorese in 2%iger Agarose unterzogen, und die Produkte wurde sichtbar gemacht, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigen, dass in einer von jeder der vier Reaktionen, welche jeweils ein unterschiedliches dNTP enthalten, Amplifikationsprodukt mit dem dNTP erhalten wird, welches komplementär zu dem SNP in der DNA ist. Zum Beispiel wurde mehr Amplifikationsprodukt in der Reaktion nachgewiesen, in welcher dATP zu der Sonde, die ein Thymidin als SNP-Nukleotid enthält, zugegeben wurde, verglichen mit Reaktionen, in welchen dCTP, dGTP oder dTTP zugegeben wurde.
Somit verdeutlicht dieses Beispiel ein Verfahren zum Identifizieren eines Nukleotides in einer Nukleinsäure, welches die Hybridisierung einer Sonde an die Nukleinsäure, Fugen-Auffüllung durch Zugeben eines spezifischen dNTP durch Polymerisation und Ligation, Verlängerung eines Primers, Ligation, PCR-Amplifikation und den Nachweis von amplifizierten Produkt(en) umfasst.
Beispiel 3: Hintergrundunterdrückung durch Einfangen der "Run-off"-Produkte unter Verwendung von Biotin-Streptavidin
Dieses Experiment ist eine Verdeutlichung eines Biotin-Einfang-Reinigungsverfahrens, das verwendet wird, um den Hintergrund zu unterdrücken, welcher aus Elongationsereignissen entsteht, die durch nichtligierte Oligo-Sonde während einer PCR-Amplifikation geprimt werden. Ein biotinylierter Primer wird verwendet, um eine erste Kopie der ligierten Sonde herzustellen. Diese Kopie wird mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen eingefangen, während alle anderen Moleküle fortgewaschen werden. Die eingefangene Kopie wird dann in einer PCR-Reaktion amplifiziert.
Die Matrizen-DNAs und Sonden waren identisch zu denjenigen, welche im Beispiel 1 verwendet wurden: Die zwei verwendeten Matrizen-DNAs waren die 600 bp großen Amplikons mit der Bezeichnung S7 und Y7, umfassend SEQ. ID. Nr.: 10 bzw. 11, welche sich voneinander in einem einzelnen Nukleotid unterscheiden; und die zwei Sonden S und Y, welche die SEQ. ID. Nr.: 12 bzw. 13 aufweisen.
Die verschiedenen Kombinationen aus Matrize und Sonden sind in der Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Komponenten der Reaktionsmischungen

Reaktion 1 2 3 4 5 6 7 8

Sonde S-Allel S-Allel S-Allel S-Allel Y-Allel Y-Allel Y-Allel Y-Allel

Matrize Y7 S7 S7 keine Y7 Y7 S7 keine

Sonstiges keine Ligase keine Ligase
Zwei Barcodeoligo-Mixe wurden hergestellt (einer für jedes Barcode-Oligo) durch Mischen von 20 μl 5 × Tth-Ligasepuffer, 15 μl Barcode-Oligonukleotid S oder Y bei 10 pmol/μl; und 62,5 μl Wasser, und 19,5 μl dieses Mix wurden zu 8 Strip-Röhrchen zugegeben. In jedes Strip-Röhrchen wurde 0,5 μl der jeweiligen PCR-Matrize S7 oder Y7 bei 0,04 μg/μl zugesetzt. Die letztendliche Menge an Barcode und Matrize betrug 30 Picomol bzw. 40 Femtomol je Reaktion.
21,5 μl Ligase-Mix, welcher durch Mischen von 36 μl 5 × Tth-Ligasepuffer und 135 μl Wasser hergestellt worden war, wurde zu den Strip-Röhrchen 3 und 6 (Reaktionen ohne Ligase) zugegeben. 3,5 μl Tth-Ligase (50 U/μl, Marsch Bio.) wurden zu dem übrigen Ligase-Mix zugegeben und 21 μl dieses Mix wurden in die restlichen Röhrchen zugesetzt. Die Röhrchen wurden 1 Minute lang bei 65°C erwärmt, und 20 μl von jedem Röhrchen wurden in jedes der Strip-Röhrchen, welche die DNAs enthielten, gegeben. Das Volumen jeder Reaktion belief sich auf 40 μl.
Der biotinylierte P1Bar-Primer ist identisch zum P1bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1), außer dass er mit einem 5'-Biotin synthetisiert wurde.
Für die "rollende" Amplifikation wurde ein Kettenverlängerungsmix (RCA-Mix) hergestellt durch Vereinigen (für 20 Reaktionen) von 40 μl 10 × Vent-Puffer; 20 μl DMSO; 64 μl Vent-DNA-Polymerase exo- bei 2 U/μl (NEB); 3,6 μl P1bar-Biotin-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 9,3 μl T4-Gen32-Protein bei 1,7 mg/ml; 4 μl MgSO₄ bei 100 mM; jeweils 40 μl der vier dNTPs bei 4 mM; und 179,2 μl Wasser, wodurch man ein Endvolumen von 360 μl erhielt. 18 μl RCA-Mix, welcher 1 Minute lang bei 65°C vorgewärmt worden war, wurden zu 2 μl der oben genannten Reaktionen zugegeben und 2,5 Minuten lang bei 65°C inkubiert. Dies führt dazu, dass 8 Röhrchen, jeweils mit Taq- und Vent-verlängertem Biotin-P1bar-Primer, vorliegen.
Das biotinylierte "Run-off"-Produkt wurde unter Verwendung von Ausgangsvorrat-Dynabeads (10 μg/μl) isoliert. Diese Kügelchen können bis zu 20 pmol biotinyliertes Oligo unter Verwendung von 10 μl des Ausgangsvorrats einfangen. 20 μl von den 40 μl wurden aus jedem Reaktionsröhrchen entnommen und wie folgend mit Dynal-Beads eingefangen: Die Ausgangsvorrat-Kügelchen wurden zuerst dreimal mit 2 M NaCl-Puffer (unter Verwendung des gleichen Volumens an Puffer wie Probe) gewaschen; gleiche Volumina an Probe und gewaschenen Kügelchen wurden vereinigt, um einen letztendlichen 1 M NaCl-Mix zu erhalten; dieser Mix wurde bei 43°C 15 Minuten lang bei 1400 U/min zentrifugiert; die Kügelchen wurden zweimal mit 100 μl 2 M NaCl-Puffer und dann einmal mit 100 μl doppelt-destilliertem Wasser (anstattdessen durch vorsichtiges Klopfen, nicht durch Pipettieren) gewaschen; die Kügelchen wurden in 50 μl an 50 mM NaOH resuspendiert und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubiert; der Überstand (welcher mit 5 μl 0,5 M HCl neutralisiert werden kann) wurde entfernt; und die Kügelchen wurden in dem ursprünglichen Probenvolumen (z. B. 20 μl) unter Verwendung von 1 × TE resuspendiert.
Ein PCR-Mix wurde durch Mischen von 48 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 18 μl dNTPs bei 4,0 mM; 3,84 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 3,84 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 48 μl von MgCl₂ bei 25 mM und 330,7 μl Wasser hergestellt, um insgesamt 456 μl zu erhalten. 1,0 μl der Kügelchen-Aufschlämmungsreaktion wurden zu 19 μl PCR-Mix zugegeben; fünf Minuten lang bei 95°C denaturiert; und 30 oder 40 Zyklen PCR wie folgend unterzogen: 20 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C.
20 μl jeder Reaktion wurden dann einer Elektrophorese in 2%iger Agarose unterzogen, und die Banden wurden sichtbar gemacht, wie es in den vorangehenden Beispielen beschrieben wurde. Die Ergebnisse weisen daraufhin, dass mehr Amplifikationsprodukt in Reaktionen erhalten wurde, in welchen die Sonde perfekt zur Matrizen-DNA passt und Ligase eingeschlossen wird, d. h. in den Reaktionen 2 und 5. Darüber hinaus gestattet die Isolierung des "Run-off"-Produkts auf den Kügelchen eine sauberere bzw. fehlerfreiere Amplifikation.
Beispiel 4: Hintergrundunterdrückung durch Verdau der Sonde mit Uracil-N-Glykosylase vor der Amplifikation
Ein anderes Verfahren zum Unterdrücken von Hintergrund, welcher als ein Ergebnis der Verlängerung von nicht-ligierter Oligonukleotidsonde während der PCR entsteht, besteht darin, die nicht-ligierte Sonde mit Uracil-N-Glykosylase vor der PCR-Amplifikation zu verdauen. Der Verdau der nicht-ligierten Oligonukleotidsonde mit Uracil-N-Glykosylase (ebenfalls bezeichnet als "UNG") zerbricht die Sonde in drei Fragmente, welche die Erzeugung von PCR-Hintergrund-Amplikons nicht länger Primen können.
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren unter Anwendung des Vergleichens von Uracil-N-Glykosylase als einer und Biotin-Isolierung von "Run-off"-Produkt [als der anderen] Aufreinigungsmethode.
Die Matrizen-DNA und Sonden waren die gleichen wie diejenigen, welche in Beispiel 3 verwendet wurden (man bemerke, dass diese Oligonukleotide mit U-Basen an den angegebenen Stellen synthetisiert wurden), und die verschiedenen Kombinationen waren ebenfalls die gleichen (Tabelle 3). In diesem Beispiel wurde pfu-Ligase anstatt von Tth-Ligase verwendet.
Zwei Barcode-Oligo-Mixe wurden hergestellt (einer für jedes Barcode-Oligo) durch Mischen von 10 μl 5 × Tth-Ligasepuffer, 15 μl Barcode-Oligonukleotid S (SEQ. ID. Nr.: 12) oder Y (SEQ. ID. Nr.: 13) bei 10 pmol/μl und 72,5 μl Wasser. 19,5 μl dieses Mix wurden zu acht Strip-Röhrchen zugesetzt. In jedes Strip-Röhrchen wurden 0,5 μl der jeweiligen PCR-Matrize S7 oder Y7 bei 0,40 μg/μl zugegeben. Die letztendliche Menge von Barcode und Matrize betrug 30 Picomol bzw. 40 Femtomol pro Reaktion.
Die Reaktionsmischungen (enthaltend die DNAs) wurden fünf Minuten lang bei 95°C denaturiert und 15 Minuten lang bei 65°C annealed. 23,75 μl Ligase-Mix, hergestellt durch Vereinigen von 24 μl an 10 × pfu-Ligasepuffer und 204 μl Wasser, wurden in die Strip-Röhrchen 3 und 6 zugegeben. 10 μl pfu-Ligase bei 4 U/μl (Stratagene) wurden zu dem restlichen Mix von 204,25 μl zugesetzt. In jedes Röhrchen (außer Röhrchen 3 und 6) wurden 20 μl Ligase-Mix, welcher 1 Minute lang bei 65°C vorgewärmt worden war, zugegeben, und die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert (Ligationsreaktionen). Das letztendliche Reaktionsvolumen betrug 40 μl.
2 μl der Ligationsreaktionen wurden zu 18 μl des Verlängerungs-Mix zugegeben, welcher hergestellt worden war durch Vereinigen von 40 μl an 10 × Taq-Gold-Puffer; 15 μl dNTPs bei jeweils 4 mM; 3 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl (P. E.); 3,2 μl Biotin-RCAP1Bar-Primer (5'-GTCGTTTTACAGACTAGAGACCTCGTGGAC-3', SEQ. ID. Nr.: 28) bei 100 pmol/μl (gleich wie in Beispiel 3); 40 μl MgCl₂ bei 25 mM und 258,8 μl Wasser, um ein Endvolumen von 360 μl PCR-Reaktionsmischung zu erhalten. Die Reaktionen wurden dann 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um das ligierte Produkt zu denaturieren sowie Taq-Gold zu akitivieren. Ein Satz von Reaktionen wurde dann 2 Minuten lang bei 65°C inkubiert, und ein anderer Satz von Reaktionen wurde [...]Ein Satz von Reaktionen wurde dann 15 Minuten lang bei 65°C zum "Run-off" inkubiert, und ein anderer Satz von Reaktionen wurde nicht bei 65°C inkubiert (keine "Run-off"-Kontrolle). Dies führte zu 2 × 8 Röhrchen mit Taq-verlängertem Biotin-RCA-Primer. Der RCA-Biotin-Primer enthält Sequenz, angehängt an das 5'-Ende des P1-Primers, und wurde verwendet, um den Abstand zwischen den Primer bindenden Sequenzen und den Kügelchen zu vergrößern, in dem Fall, dass das Kügelchen die PCR-Reaktion sterisch behindert.
Zwei PCR-Mixe wurden wie im Beispiel 3 beschrieben mit und ohne Zugabe von 1 μl pro Reaktion an Uracil-N-Glykosylase (PE Biosystems, Foster City, CA) hergestellt. 1,0 μl der Verlängerungsreaktionen wurde zu 19 μl PCR-Mix zugegeben; fünf Minuten lang bei 95°C denaturiert und 25 Zyklen PCR wie folgend unterzogen: 20 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 64°C. Als Kontrolle wurde auch 1 μl einer 1:10-Verdünnung der Ligationsreaktion (keine Kettenverlängerung) zu 19 μl PCR-Mix zugegeben, fünf Minuten lang bei 95°C denaturiert und 25 Zyklen PCR wie folgend unterzogen: 20 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 64°C.
20 μl jeder Reaktion wurden dann einer Elektrophorese in 2%iger Agarose unterzogen, und die Banden wurden sichtbar gemacht, wie es in den vorangehenden Beispielen beschreiben ist. Die Ergebnisse zeigen, dass in den Kontrollen ohne Verlängerung, sämtlicher Hintergrund durch UNG-Verdau der Sonde eliminiert ist (Spuren 1, 3, 4, 6, 7, 8). Darüber hinaus zeigt diese Kontrolle, dass das spezifische Signal (Spuren 2 und 5) ebenfalls eliminiert war, ohne den Verlängerungsschritt, wodurch bestätigt wurde, dass die ursprüngliche Sonde durch UNG abgebaut wird und dass eine Kettenverlängerung für das Signal erfordert wird. Die Kettenverlängerungs-Experimente zeigen, dass UNG den Hintergrund (Spuren 1, 3, 4, 6, 7, 8) aber nicht das spezifische Signal (Spuren 2 und 5) eliminiert.
Beispiel 5: Hintergrundunterdrückung durch Verwenden von Apyrase
Eine andere Quelle für Hintergrundsignal stammt aus kontaminierenden Nukleotiden in verschiedenen Reagenzien, wie Ligase- und Matrize-Präparationen. Diese kontaminierenden Nukleotide erzeugen ein Signal im Polymerase-Ligase-Schritt, selbst wenn das zugegebene Nukleotid nicht komplementär zu dem getesteten SNP ist. Um diese Hintergrundquelle zu eliminieren wurde Apyrase, ein Enzym, welches Nukleotide abbaut, zu allen Reagenzien bei der Zusammenstellung der Reaktion zugesetzt. Kontaminierende Nukleotide wurden in einer Inkubation bei 20°C, vor dem DNA-Denaturierungsschritt, abgebaut. Die Apyrase wurde während der Denaturierungs- und Eliminierungs-Schritte hitzeinaktiviert, so dass das später hinzugefügte spezifische Nukleotid nicht abgebaut wird.

Die verschiedenen durchgeführten Reaktionen sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4: Komponenten der verschiedenen Reaktionen

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonde	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2
Matrize	Y7	Y7	Y7	Y7	S7	S7	S7	S7
dXTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP
Sonstiges	Apyrase +	Apyrase +	Apyrase +	Apyrase +	Apyrase +	Apyrase +	Apyrase +	Apyrase +

Reaktion	9	10	11	12	13	14	15	16
Sonde	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2	SNP2
Matrize	S7	S7	S7	S7		S7	S7	S7
dXTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dGTP	dGTP	dTTP
Sonstiges	Apyrase –	Apyrase –	Apyrase –	Apyrase –	Apyrase + Matrize	Apyrase + Pol/Lig-	Apyrase + Pol/Lig-	Apyrase + dXTP-

Drei Matrize/Barcode-Mixe wurden durch Beimischen, in jedem, von 6 μl 10 × pfu-Ampligase-Puffer; 1,8 μl Barcode-Oligo (mit der in SEQ. ID. Nr.: 19 dargestellten Sequenz); 3 μl PCR-Matrize (entweder S7, SEQ. ID. Nr.: 10, Y7, SEQ. ID. Nr.: 11 oder Wasser; diese Matrizen sind die gleichen, wie diejenigen, die in Beispiel 1 verwendet werden) und 49,2 μl Wasser hergestellt, wodurch man ein Endvolumen von 60 μl erhält. 12 μl von jedem [Ansatz] wurden in die Röhrchen verteilt.

12 μl Ligase-Mix wurden in 16 Strip-Röhrchen aliquotiert. Der Mix wurde für die verschiedenen Reaktionen, wie in der Tabelle 5 beschrieben, hergestellt, und die Ligaseverdünnung wurde durch Mischen von 5 μl 10 × Ampligase-Puffer mit 44,33 μl Wasser und 0,67 μl Ampligase bei 5 U/μl hergestellt, was zu einer Lösung führte, die 0,067 U/μl Ampligase enthielt. Tabelle 5: Herstellung von Ligase-Mixen

Ligase-Mix	jeweils	Reaktion 1–8, 13, 16 (× 16)	Reaktion 9–12 (× 8)	Reaktion 14 und 15 (× 4)
10 × Ampligase-Puffer	1,0 μl	16,0 μl	8,0 μl	4,0 μl
Ampligase-Verdünnung	0,125 [μl]	2,0 μl	1,0 μl	N/A
Taq-DNA-Pol.-Stoffel-Frag., 10 U/μl	0,05 μl	0,8 μl	0,4 μl	N/A
Apyrase 50 mU/μl	0,2 μl	3,2 μl	N/A	0,8 μl
H₂O		106 μl	54,6 μl	27,2 μl
insgesamt	8,0 μl	128,0 μl	64,0 μl	32,0 μl

Die Barcode/Matrize-Mischungen wurden 5 Minuten lang bei 95°C denaturiert und 15 Minuten lang bei 65°C annealt. 8 μl große Ligase-Mixe wurden zu den annealten DNA-Mischungen zugegeben. Diese wurden dann 2 Minuten lang bei 20°C inkubiert. Die Barcode/Matrize-Mischungen wurden dann 5 Minuten lang bei 95°C denaturiert und 15 Minuten lang bei 65°C annealt. Die Temperatur wurde auf 65°C angehoben, und 2 μl dXTP (1 mM) wurden zu den passenden Röhrchen zugesetzt, wonach sie 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert wurden. Das letztendliche Reaktionsvolumen betrug 20 μl. Die letztendliche Enzym-Ligasekonzentration betrug 0,00042 Units/μl in der Ligationsreaktion (insgesamt 0,0084 Units), die letztendliche Barcode-Konzentration betrug 0,015 Picomol/μl und die Matrizen-Endkonzentration betrug ungefähr 2 Femtomol/μl [Diese Abfolge von Schritten bitte bestätigen oder anzweifeln].
2 μl jeder Ligationsreaktion wurden zu 18 μl PCR-Verlängerungs-Mix zugegeben, der durch Vereinigen von 85 μl von 4 × E/U-Puffer (4 × Taq Gold-Puffer; 3,2 Picomol je Mikroliter P1bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1); 10 mM MgCl₂; 0,6 mM dNTPs); 2,55 μl AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase (P. E. Biosystems, Foster City, CA) bei 5 U/μl und 218,5 μl Wasser hergestellt wurde, wodurch man ein Endvolumen von 306 μl erhält. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um das ligierte Produkt zu denaturieren sowie Taq Gold zu aktivieren. Die Reaktionen wurden dann zwei Minuten lang bei 65°C zum "Run-off" inkubiert.
Die UNG-Säuberung und die Amplifikation wurden wie folgend durchgeführt. Zu jeder Reaktion (20 μl) wurden 20 μl UNG/PCR-Mix zugegeben. Dieser Mix wurde hergestellt durch Kombinieren von 85 μl 4 × E/U-Puffer; 2,55 μl AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase (P. E.) bei 5 U/μl; 17 μl UNG (1 Unit/μl, PE Biosystems, Foster City, CA); 5,44 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl und 230 μl Wasser, wodurch man ein Endvolumen von 340 μl erhielt. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert und dann fünf Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert. Die PCR wurde während 33 Zyklen wie folgend durchgeführt: 20 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C.
Die Amplifikationsprodukte wurden auf die gleiche Weise wie in den vorherigen Beispielen analysiert. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Vorhandensein von Apyrase in den Reaktionen die Hintergrundamplifikation in starkem Maße verringert. Diese lässt sich z. B. durch Vergleichen der ersten vier Spuren 3 und 4 ersehen, in welchen die Abwesenheit von Apyrase in einem Röhrchen mit dCTP (Nukleotid, welches nicht komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA ist) zu einer Bande führt, wohingegen die Gegenwart von Apyrase in der gleichen Reaktion keine Bande produziert. Im Vergleich, in den ersten zwei Spuren, welche Reaktionen repräsentieren, die mit dATP durchgeführt wurden (das Nukleotid, welches komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA ist), beeinflusst die Gegenwart oder Abwesenheit von Apyrase das beobachtete Signal nicht, wodurch gezeigt wird, dass das Signal spezifisch ist und nicht aus einer Hintergrundamplifikation resultiert. Somit kann die Anwendung von Apyrase die Hintergrundamplifikation verringern.
Beispiel 6: Nachweis von zwei SNPs in einer einzelnen Reaktion
Dieses Beispiel beschreibt ein Beispiel einer Reaktion, in welcher zwei SNPs gleichzeitig nachgewiesen wurden. Die Hintergrundreduktionsmethoden unter Verwendung von Apyrase und Uracil-N-Glykosylase-Verdau und/oder Biotin-Einfang von Verlängerungsprodukten wurden eingeschlossen.

Die Kombinationen von Matrize und Sonde waren wie in der Tabelle 6 gezeigt. Die DNA-Matrizen waren 600 bp große DNA-Fragmente, welche aus S. cerevisiae amplifiziert worden waren. Die Matrize S7 (SEQ. ID. Nr.: 10) wird in Beispiel 1 beschrieben. Die Matrize S37 ist eine 600 bp lange doppelsträngige DNA, welche aus dem S. cerevisiae-Stamm S288C amplifiziert worden war, welche die Nukleotidsequenz 5'-CCAGTCCCTTGAGTTCGCGAATAGTAATTTTGGTGATACCTG-3' (SEQ. ID. Nr.: 179) einschließt. Die Barcode-Oligonukleotide sind SNP2 (SEQ. ID. Nr.: 19) und SNP5 (SEQ. ID. Nr.: 21). Tabelle 6: Komponenten der Reaktionen

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonde	SNP 2	SNP 2	SNP 5	SNP 5	SNP 2 SNP 5	SNP 2 SNP 5	SNP 2 SNP 5	SNP 2 SNP 5
Matrize	S-7	S-7	S-37	S-37	S-7 S-37	S-7 S-37	S-7 S-37	S-7 S-37
dXTP	dCTP	dGTP	dCTP	dGTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP

DNA-Matrize/Sonde-Reaktionsmischungen wurden hergestellt, wie in Tabelle 7 dargestellt. Der Enzym-Mix, welcher in der Tabelle aufgeführt ist, wurde hergestellt durch Mischen von 154,3 μl Wasser; 22 μl 10 × Ampligasepuffer; 2,2 μl Apyrase bei 50 mU/μl; 1,38 μl Ampligase-Verdünnung (5 μl 10 × Ampligasepuffer; 44,33 μl Wasser und 0,67 μl Ampligase bei 5 U/μl); und 0,55 μl Taq-DNA-Pol.-Stoffel-Fragment bei 10 U/μl. Tabelle 7: Komponenten von DNA-Enzym-Mix

DNA/Enzym-Mix	Mix 1 & 2 (× 2,5)	Mix 3 & 4 (× 2,5)	Mix 5–8 (× 5)
Enzym-Mix	41,0 μl	41,0 μl	82,0 μl
Matrize S-7	1,25 μl (S7)		2,5 μl (S7)
Matrize S-37		1,25 μl (S37)	2,5 μl (S37)
SNP2 1 pmol/μl	0,75 μl (SNP2)		1,5 μl (SNP2)
SNP5 1 pmol/μl		0,75 μl (SNP5)	1,5 μl (SNP5)

insgesamt	45,0 μl	45,0 μl	90,0 μl

18 μl des Mix wurden in Strip-Röhrchen verteilt. Die potentiell kontaminierenden Nukleotide bzw. dXTPs wurden durch Inkubation der Reaktionen während 4 Minuten bei 20°C abgebaut. Die Reaktionen wurden dann 5 Minuten lang bei 95°C erwärmt und durch Inkubation während 15 Minuten bei 65°C annealt. 2 μl der jeweiligen dXTPs, 0,1 mM, welche in Tabelle 6 dargestellt sind, wurden zu den Reaktionen gegeben, und die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert (Ligationsreaktionen). In der Ligationsreaktion (20 μl) belief sich die Barcode-Endkonzentration auf 0,015 Picomol/μl, und die Matrize betrug ungefähr 2 Femtomol/μl. Die Ligase-Endkonzentration war 0,00042 Units/μl in der Ligationsreaktion (insgesamt 0,0084 Units).
6 μl der Ligationsreaktionen wurden zu 54 μl Verlängerungs-Mix zugegeben, welcher 1 Minute lang bei 95°C vorgewärmt worden war. Der Verlängerungs-Mix wurde durch Vereinigen von 54 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 4,05 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 64,8 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 54 μl MgCl₂ bei 25 mM; 4,32 μl P1BAR (SEQ. ID. Nr.: 1)-Biotin-Primer bei 100 pmol/μl und 101,61 μl Wasser hergestellt.
Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um die ligierten Produkte zu denaturieren sowie Taq-Gold zu aktivieren, und danach 2 Minuten lang bei einem Gradienten von 55°C bis 79°C zum "Run-off" inkubiert. Die Reaktionen wurden dann auf 4°C abgekühlt.
Es wurden drei Aufreinigungen durchgeführt: UNG-Säuberung, eine Niedrigstringenz-Biotin-Säuberung (3 Waschschritte) und eine Biotin-Säuberung von erhöhter Stringenz (6 Waschschritte). 20 μl jeder Reaktion wurden einem Einfang auf Dynal-Kügelchen unterzogen. Die Ausgangsvorrats-Kügelchen wurden dreimal mit 2 M NaCl-Puffer unter Verwendung des gleichen Volumens an Puffer wie demjenigen der Probe gewaschen. Zu 25 μl der Kügelchen wurden 75 μl 1 M NaCl zugegeben. 20 μl Probe wurden mit 80 μl Kügelchen in NaCl gemischt, um den letztendlichen 1 M NaCl-Mix zu erhalten, und es wurde 15 Minuten lang bei 43°C inkubiert, wobei alle fünf Minuten auf- und ab-pipetiert wurde. Die Kügelchen wurden dann drei- oder sechsmal in 200 μl 0,5 M NaCl/0,5 M NaOH-Puffer gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt mit 200 μl 0,5 M NaCl in TE. Die Kügelchen wurden in 200 μl von 100 mM NaCl, TE, 0,25% DMSO, 0,01% Triton, resuspendiert und 15–20 Minuten lang bei 70°C erwärmt. Dies setzt nicht-spezifisch an den Kügelchen gebundenes Produkt frei. Die Kügelchen wurden dann erneut mit 200 μl TE gewaschen. Die Kügelchen wurden in dem ursprünglichen Probenvolumen (z. B. 20 μl) unter Verwendung von 1 × TE resuspendiert.
Eine Amplifikation des gereinigten Verlängerungsproduktes wurde durch Mischen von 20 μl des Verlängerungsprodukts mit 20 μl UNG/PCR-Mix durchgeführt, welcher hergestellt worden war durch Vereinigen von 18 μl 10 × TaqAQ Gold-Puffer; 1,35 μl AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 21,6 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 18 μl MgCl₂ bei 25 mM; 1,44 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1!) bei 100 pmol/μl; 1,44 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 9 μl UNG bei 1 Unit/μl; und 109,17 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, fünf Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 14 PCR-Zyklen unterzogen, einschließend 20 Sekunden Denaturierung bei 95°C; 1 Minute Annealing bei 63°C; und 10 Sekunden Kettenverlängerung bei 72°C; gefolgt von 20 Zyklen von 20 Sekunden bei 95°C; 45 Sekunden bei 56°C und 10 Sekunden bei 72°C. Die Reaktionen wurden weitere 10 Sekunden lang bei 72°C und danach bei 4°C inkubiert.
Die Reaktionsprodukte wurden auf die gleiche Weise wie im vorangehenden Beispiel analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass, wie erwartet, ein stärkeres Amplifikationssignal in den Spuren 2, 3, 6 und 7 (welche Reaktionen entsprechen, einschließend dNTPs, welche komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA sind) im Verhältnis zu den anderen Spuren erhalten wurden. Da die Spuren 6 und 7 die zwei Matrizen-DNAs und die gleichen zwei Sonden umfassen, und da die Reaktionen mit Ausnahme der Zugabe von dCTP in einer Reaktion und dGTP in der anderen Reaktion, identisch waren, zeigen diese Ergebnisse, dass zwei unterschiedliche SNPs unter Verwendung [in] der selben Reaktion identifiziert werden können, wenn die zwei dNTPs in der selben Reaktion(en) eingeschlossen werden.
Die amplifizierten Produkte aus den Reaktionen 6 und 7 wurden ebenfalls einem DraI-Restriktionsverdau unterzogen, welcher zwischen der Tag-Sequenz und den Homologieregion-THR2's schneidet. Weil die zwei verschiedenen Sonden unterschiedliche Längen der Homologieregionen aufweisen, ist es offensichtlich, dass es möglich [ist] auf einem hoch auflösenden Gen zu identifizieren, welches die Sonde ist, die in jeder Reaktion amplifiziert wurde. Die Sonde 5 bestand aus 109 Basen, wohingegen die Sonde 2 aus 104 Basen bestand.
Folglich wurde 1 μl Dra I-Enzym zu 20 μl PCR-Produkt der Reaktionen 6 und 7 zugegeben und eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigen, dass das in Reaktion 6 beobachtete Amplifikationsprodukt, wie erwartet, der Sonde SNP2 entspricht, wohingegen jenes, das in der Reaktion 7 beobachtet wurde, der Sonde SNP7 entspricht. Diese Ergebnisse liefern eine weitere Unterstützung für das Multiplexieren.
Beispiel 7: Verwendung von zweiteiligen Sonden anstatt einer einteiligen Sonde
Alle oben beschriebenen Sondenoligonukleotide wurden als ein Einzelmolekül synthetisiert. Dieses Beispiel zeigt die funktionelle Verwendung einer zweiteiligen, ligierten, Oligonukleotidsonde. Diese Sonden wurden durch Ligieren eines 40-Basen-Oligonukleotids an ein 60-Basen-Oligonukleotid unter Verwendung eines Brückenoligonukleotides, welches allen Sonden gemeinsam ist, konstruiert.

Die Matrize/Sonde-Kombinationen sind in der Tabelle 8 dargestellt. Die Matrize S37 und die Sonde SNP5 (SEQ. ID. NR.: 21) waren wie im vorangehenden Beispiel beschrieben beschaffen. SNP5 wurde in Beispiel 2 beschrieben (SEQ. ID. Nr.: 21). Die SNP5-2-Teile-Sonde wurde durch Ligieren von Teil A, umfassend die Matrizenhomologieregion 1 und die Primer-1-Homologieregion, mit dem Teil B, umfassend die Primer-2-Homologieregion, die Barcode-Sequenz, DraI und die Matrizenhomologieregion 2, konstruiert. Die zwei Teile wurden enzymatisch mit einem Verbrückungsoligonukleotid ligiert, welches die Sequenz 5'-ACTGGCCGTCGTTTTACA/GACTAGAGACCTCGTGGAC-3' (SEQ. ID. Nr.: 226) aufweist; das "/" zeigt die Abschnitte an, welche zu Teil A bzw. Teil B komplementär sind. Die Ligation wurde wie folgend durchgeführt: 10 Picomol jeweils von SNP5-Teil A, SNP5-Teil B und dem Verbrückungsoligonukleotid wurden mit 5 Units Ampligase in 1 × Ampligasepuffer eine Stunde lang bei 60°C inkubiert. Die Sonden enthalten eine Uracilbase zwischen der Primer-2-Homologieregion und der Barcode-Sequenz. Tabelle 8: Komponenten der Reaktionen

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonde	SNP5 Syn 3	SNP5 Syn 3	SNP5 Syn 3	SNP5 Syn 3	SNP5 2-teilig	SNP5 2-teilig	SNP5 2-teilig	SNP5 2-teilig
Matrize	S-37	S-37	S-37	S-37	S-37	S-37	S-37	S-37
dXTP	d-ATP	dCTP	dGTP	dTTP	d-ATP	dCTP	dGTP	dTTP

Ein Enzymmix wurde hergestellt durch Vereinigen von 148,3 μl Wasser, 20 μl pfu-Ampligase-Puffer; 5 μl Matrize S37 bei 0,04....μg/μl; 2 μl Apyrase bei 50 mU/μl; 1,25 μl Ampligase-Verdünnung (5 μl 10 × Ampligasepuffer, 44,33 μl Wasser; und 0,67 μl Ampligase bei 5 U/μl); und 0,5 μl Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment bei 10 U/μl. DNA-Enzym-Mixe wurden durch Vereinigen von 79,7 μl Enzym-Mix mit 1,35 μl jeder Sonde bei 1 pmol/μl hergestellt. In der Ligationsreaktion (20 μl) belief sich die Barcode-Endkonzentration auf 0,015 Picomol/μl, die Matrize betrug ungefähr 2 Femtomol/μl. Die letztendliche Ligasekonzentratione war 0,00042 Units/μl in der Ligationsreaktion (insgesamt 0,0084 Units).
18 μl wurden in Strip-Röhrchen aliquotiert. Die potentiell kontaminierenden dXTP-Nukleotide wurden durch Inkubation bei 20°C während vier Minuten abgebaut. Die DNA wird dann durch Inkubation während fünf Minuten bei 95°C denaturiert und durch Inkubation während 15 Minuten bei 65°C annealt. 2 μl der jeweiligen dXTPs bei ...0,1 mM... wurden zu den entsprechenden Reaktionen zugegeben und 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert (Ligationsreaktion).
2 μl der Ligationsreaktionen wurden zu 18 μl Verlängerungsmix, der auf 95°C vorgewärmt worden war, zugegeben. Der Verlängerungsmix wurde hergestellt durch Vereinigen von 45 μl 4 × E/U-Puffer (beschrieben in Beispiel 5); 1,35 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl und 115,65 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um das ligierte Produkt zu denaturieren sowie Taq Gold zu aktivieren. Die Reaktionen wurden zwei Minuten lang zum "Run-off" inkubiert, und dann auf 4°C gebracht (kettenverlängernde Reaktion).
UNG-Säuberung und Amplifikation wurden durchgeführt durch Mischen von 20 μl Verlängerungsreaktion mit 20 μl UNG/PCR-Mix, hergestellt durch Vermischen von 85 μl 4 × E/U-Puffer; 2,55 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 17 μl UNG bei 1 Unit/μl; 5,44 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl und 230 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert; 10 Minuten lang bei 95°C denaturiert; 14 PCR-Zyklen von 20 Sekunden bei 95°C, 1 Minute bei 69,6°C (jeden Zyklus um 0,4° absinkend) und 10 Sekunden bei 72°C unterzogen; gefolgt von 20 PCR-Zyklen von 20 Sekunden bei 95°C; 45 Sekunden bei 64°C; und 10 Sekunden bei 72°C. Die Reaktionen wurden dann 10 Sekunden lang bei 72°C inkubiert und danach bei 4°C belassen bzw. eingeweicht.
Die Reaktionsprodukte wurden auf die gleiche Weise wie in den vorangehenden Beispielen analysiert. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine Amplifikation nur in den Spuren 2 und 6 beobachtet wurde, welche beide das dGTP enthielten, bei welchem es sich um das Nukleotid handelt, das komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA ist. Darüber hinaus waren die Banden in den zwei Reaktionen ähnlich, was anzeigt, dass 2-teilige Sonden ebenso funktionell wie eine einteilige Sonde sind.
Beispiel 8: Nachweis eines SNP inmitten von genomischer S. cerevisiae-DNA
Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis eines SNP innerhalb einer genomischen S. cerevisiae-DNA-Matrize unter Anwendung des Polymerase/Ligase-Verfahrens, mit einer zweiteiligen Sonde, und von Apyrase und UNG zur Verringerung der Hintergrundsamplifikation.
Die in diesem Beispiel verwendete PCR-Matrizen-DNA war entweder genomische S. cerevisiae-DNA (bezeichnet als genomische Matrize) allein, oder enthaltend variierende Konzentrationen der Matrizen-DNA S37 (SEQ. ID. Nr.: 179, beschrieben in den vorangehenden Beispielen), welche in genomischer S. cerevisiae-DNA (bezeichnet als genomische Matrize) verdünnt war. Um die verschiedenen Verdünnungen von S37 genomischer DNA zu erhalten, tdie Hefe. Die in diesem Beispiel verwendete Sonde war SNP5 (SEQ. ID. Nr.: 21). Sonden-DNA wurde zuerst auf 0,3 pmol/μl verdünnt, woraus 4 Aliquots von 19 μl hergestellt wurden. 1 μl S37-DNA wurde in das erste Röhrchen zugegeben, vermischt, 1 μl dieser Verdünnung wurde in das nächste Röhrchen zugesetzt, usw., so dass die PCR-Matrize S37 durch die Sonde/genomische DNA seriell verdünnt wird. In den Reaktionen 7 und 8 wird keine PCR-Matrize zugegeben, und lediglich genomische DNA-Matrize ist vorhanden.
Die verschiedenen Kombinationen von Sonde und Matrizen-DNA sind in der Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9: Komponenten der Reaktionen

Reaktion 1 2 3 4 5 6 7 8

Sonde SNP5 SNP5 SNP5 SNP5 SNP5 SNP5 SNP5 SNP5

Matrize S37/10 S37/10 S37/200 S37/200 S37/4000 S37/4000

genomische Matrize + + + + + + + +

dXTP C G C G C G C G
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Matrize und die Sonden-DNAs vereinigt und mit 100 ng genomischer Hefe-DNA, Apyrase, Ampligase und Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment während 4 Minuten bei 20°C inkubiert, um die potentiell kontaminierenden dXTP-Nukleotide abzubauen. Die Reaktionen wurden dann durch Inkubation bei 95°C denaturiert und durch rampenartiges Hinabführen auf 65°C über etwa 30 Minuten hinweg annealt, und danach 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert.
2 μl jeder Reaktion wurden zu 18 μl "Run-off"-Mix zugegeben, welcher hergestellt wurde durch Vereinigen (pro Reaktion) von 2 μl 10 × Taq Gold-Puffer; 0,75 μl dNTPs bei jeweils 4 mM; 0,15 μl AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 0,16 μl P1-bar-Biotinprimer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 2 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 12,94 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert, und "Run-off"-Produkte wurden durch Inkubation während zwei Minuten bei 60°C erhalten. Während die Reaktionen noch bei 60°C waren, wurden 20 μl der Reaktionen in einen UNG-PCR-Mix überführt, der hergestellt wurde durch Vereinigen von 2 μl 10 × Taq-Gold-Puffer, 0,75 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 0,3 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 100 pmol/μl; 1 μl UNG; 0,32 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 2 μl MgCl₂ bei 25 mM und 13,31 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, 5 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und jeweils 14 und 30 Amplifikationszyklen von 20 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C unterzogen.
Die Amplifikationsprodukte wurden wie oben beschrieben analysiert. Die Ergenisse zeigen die Gegenwart eines amplifizierten Produktes in jeder Spur, die eine Reaktion mit einem dCTP enthielt (das Nukleotid, das komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA ist), aber nicht in Spuren, die eine Reaktion mit einem dGTP enthielten. Somit war die Identifizierung des SNP sogar in einer Matrizen-DNA, welche stark mit Hefe-DNA verdünnt war, deutlich. Darüber hinaus wurde auch eine starke Bande in den Spuren 7 beobachtet, welche lediglich genomische Matrize und keine S37-Matrize enthielten, aber nicht in der Spur 8, welche dGTP enthielt. Daher zeigt dieses Beispiel in klarer Weise, dass ein SNP in einer einmaligen Sequenz in genomischer DNA identifiziert werden kann.
In den Spuren 7 und 8, ohne zugesetzte PCR-Matrize, ist die einzige vorhandene Matrize genomische Matrize, was verdeutlicht, dass ein SNP aus genomischer DNA nachgewiesen werden kann.
Beispiel 9: Nachweis von fünf SNPs in der gleichen Reaktion
Dieses Beispiel verdeutlicht die Identifizierung von fünf SNPs in Matrizen-DNA in einer einzigen Reaktion, wobei das Ligase/Polymerase-Verfahren, zweiteilige Sonden und die Apyrase, Biotin-Isolierung des Verlängerungsproduktes und die UNG-Hintergrundverringerungs-Verfahren angewandt werden.
Die Matrizen-DNAs waren eine Mischung von 600 Basenpaare großen PCR-Matrizen, welche aus S. cerevisiae amplifiziert wurden; S-7 (SEQ. ID. Nr.: 10), 26, enthaltend die Sequenz 5'-ACATTTAGATCTGCAGTTTCTAATATGAATTCAGTGGAAAAT-3' (SEQ. ID. Nr.: 238), 30, enthaltend die Sequenz 5'-GATCAAATGCGACCATATTCATCAAACTTATAGGCG-3' (SEQ.

ID. Nr.: 167) und 37, enthaltend beide Sequenzen 5'-TACTGTACCCATTTTTTTGTCGCTTAAGGTTTCGCGT-3' (SEQ. ID. Nr.: 5) als auch SEQ. ID. Nr.: 17 (S37)9.. Die verwendeten Sonden waren die SNPs 1, 2, 3 und 5, welche vorangehend z. B. im Beispiel 2 beschrieben wurden. SNP4 (Y4:PL:C:119:159) besitzt die Nukleotidsequenz
5'ACAAAAAAATGGGTACAGTATAA/UGTCCACGAGGTCTCTAGTC//TGTAAAACGACGGCCAGT/UGGTAGTACGGTGCTCTTACA/TTTAAA/ACGCGAAACCTTAAG 3' (SEQ. ID. Nr.: 23, stellvertretend für Homolgie 1/Primer 1/Primer 2/Barcode/DraI/Homologie 2; U ist Uracil). Die verschiedenen Kombinationen von Matrizen-DNA und Sonden sind in der Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10: Komponenten jeder Reaktion

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonde	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5	SNPs 1, 2, 3, 4, 5
Matrize	S-7,26, 30,37	S-7,26, 30,37	S-7,26, 30,37	S-7,25, 30,37	S-7,26, 30,37	S-7,26, 30,37	S-7,26, 30,37	S-7,26, 30,37
dXTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP

Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, werden die Matrize und Sonden-DNAs vereinigt und mit Apyrase, Ampligase und Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment vier Minuten lang bei 20°C inkubiert, um die dXTPs abzubauen. Der Enzym-Mix wurde hergestellt durch Vereinigen von 109,1 μl Wasser, 18 μl 10 × pfu-Ampligase-Puffer; 2,7 μl jedes Barcode-Oligos; 4,5 μl jeder Matrizen-DNA; 1,8 μl Apyrase bei 50 mU/μl; 1,125 μl Ampligase-Verdünnung (5 μl Ampligase-Puffer; 44,33 Wasser und 0,67 μl Ampligase 5 U/μl); und 0,45 μl Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment bei 10 U/μl. 18 μl der Mischung wurden in Strip-Röhrchen überführt, welche 4 Minuten lang bei 20°C inkubiert wurden, um potentielle kontaminierende Nukleotide abzubauen. Die Reaktionen wurden dann durch 5 Minuten lange Inkubation bei 95°C denaturiert und 15 Minuten lang bei 65°C annealt. 2 μl des jeweiligen dXTP wurde zugegeben, und die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert. In der Ligationsreaktion (20 μl) betrug die Barcode-Sonde-Endkonzentration 0,015 Picomol/μl und die Matrizen-Konzentration belief sich auf ungefähr 2 Femtomol/μl. Die Ligase-Endkonzentration betrug 0,00042 Units/μl in der Ligationsreaktion (insgesamt 0,0084 Units).
2 μl jeder Reaktion wurden zu 18 μl "Run-off"-Mix zugegeben, vorgewärmt auf 95°C, welcher hergestellt worden war durch Vereinigen von 34 μl 10 × Taq Gold-Puffer; 40,8 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 2,25 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 2,72 μl P1Bar-Biotin-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 34 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 306 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert, und "Run-off"-Produkte wurden durch Inkubation während 2 Minuten bei 60°C erhalten. Die Reaktionen wurden dann auf 4°C gebracht.
Eine Biotin-Säuberung wurde wie im Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Kügelchen wie beschrieben gewaschen und in zwei Volumen 2 M NaCl resuspendiert. 20 μl jeder Reaktion wurden zu 20 μl Kügelchen zugegeben, um einen 1 M NaCl-Mix zu erhalten. Der Mix wurde 15 Minuten lang bei 43°C inkubiert, wobei alle fünf Minuten auf und ab pipetiert wurde. Die Kügelchen wurden dann sechsmal in 200 μl 0,5 M NaCl/0,5 M NaOH-Puffer gewaschen, woran sich ein Waschschritt mit 200 μl 0,5 M NaCl in TE anschloss. Die Kügelchen wurden in 200 μl 100 mM NaCl, TE, 0,25% DMSO, 0,01% Triton, resuspendiert und 15–20 Minuten lang bei 70°C erwärmt. Dies setzt nicht-spezifisch an die Kügelchen gebundenes Produkt frei. Die Kügelchen wurden dann erneut mit 200 μl TE gewaschen. Die Kügelchen wurden im ursprünglichen Probenvolumen (z. B. 20 μl) unter Verwendung von 1 × TE resuspendiert.
20 μl der Reaktionen wurden in einen UNG-PCR-Mix überführt, welcher durch Vereinigen von 18 μl 10 × Taq Gold-Puffer; 21,6 μl dNPTs bei jeweils 1,25 mM; 1,35 μl AmplTaq Gold-DNA-Polymerase bei 100 pmol/μl; 1,44 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 9 μl UNG; 2,88 μl M13-Biotin-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 18 μl MgCl₂ bei 25 mM und 107,9 μl Wasser hergestellt worden war. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, während fünf Minuten bei 95°C hitzedenaturiert und 14 Amplifikationszyklen von 20 Sekunden bei 95°C; eine Minute bei 69,6°C (sinkend um 0,4°C bei jedem Zyklus); und 10 Sekunden bei 72°C und 20 Amplifikationszyklen von 45 Sekunden bei 64°C und 10 Sekunden bei 72°C, unterzogen. Die Reaktionen werden dann 10 Sekunden lang bei 72°C inkubiert und bei 4°C weiter inkubiert.
Die amplifizierten Produkte wurden durch Gelelektrophorese analysiert, und das Ergebnis zeigt, dass ein Amplifikationsprodukt für jedes Nukleotid beobachtet wird, wie erwartet (A, C, G, T in den Spuren 1, 2, 3 bzw. 4). Die fünf getesteten SNPs wiesen die folgenden Nukleotid-Paarungen (matches) auf: SNP1: dATP; SNP2: dGTP; SNP3: dTTP; und sowohl SNP4 als auch SNP5: dCTP. Deshalb werden verschiedene SNPs in jeder Spur amplifiziert, obwohl dies nicht durch Gelelektrophorese unterschieden werden kann.

Dann wurden die amplifizierten Produkte weiter durch Hybridisierung jeder multiplexierten Reaktion mit einem DNS-Chip analysiert. Jede dXTP-Reaktion (multiplexiert an 5 Sonden) wurde mit einem separaten Chip hybridisiert. In jedem Fall bestand die Hybridisierungsmischung aus Folgendem: 2,0 μl der oben genannten PCR-Reaktion, 0,5 μl eines Kontroll(Grenz)-Oligos bei 0,7 fm/μl, 2,9 μl M13-Komplement-Oligo bei 10 pm/μl (zehnfacher Überschuss gegenüber dem M13-Primer der PCR-Reaktion), was in 6 × SSPE-T-Puffer (6 × SSPE-Puffer mit 0,005% Triton) auf 160 μl gebracht wurde. Diese Mischung wurde 2 Minuten lang bei 95°C denaturiert und dann, inkubiert, 5 Minuten lang auf Eis gestellt. Die Lösung wurde auf einem DNA-Chip aufgetragen und 4 Stunden lang bei 42°C hybridisiert. Nach dieser Periode wurde der Chip fünfmal mit 6 × SSPE-T gewaschen und für die Fluoreszenzmarkierung mit Folgendem beladen: 0,5 μl Streptavidin R-Phycoerythrin-Konjugat (1 mg/ml), 10 μl BSA (20 mg/ml), was in SSPE-T-Puffer auf 160 μl gebracht wurde. Der Chip wurde 10 Minuten lang bei 42°C inkubiert. Hiernach wurde der Chip erneut fünfmal mit SSPE-T-Puffer gewaschen und auf einen Laser-Fluoreszenzscanner für die Analyse der multiplexierten Reaktionsprodukte aufgebracht. Das Signal an jeder der fünf Sonden-Einrichtungen von Interesse wurde über die 8×8 Pixel pro Einrichtung gemittelt, der Hintergrund wurde abgezogen, und dann wurde unter Heranziehung der durchschnittlichen Signalintensität der Kontroll(Grenz)-Einrichtungen ein Normierung vorgenommen. Dies normierte in effektiver Weise den Unterschied in der Hybridisierungseffizienz auf den vier verschiedenen Chips. Die Tabelle 11 zeigt die normierte Signalintensität aus vier Hybridisierungen, eine für jedes Nukleotid. Das Signal:Rauschen-Verhältnis entspricht dem [Verhältnis von] normierten Signal am erwarteten Nukleotid zu dem höchsten normierten Signal an den anderen drei Nukleotiden. Tabelle 11: Normierte Signalintensität aus DNA-Chip-Hybridisierung

	A-Signal	C-Signal	G-Signal	T-Signal	Basen-Nennung	Signal:Rauschen
Sonde 1	1,5	0,01	0,02	0,03	korrekt	50:1
Sonde 2	0,2	0,04	1,3	0,16	korrekt	6,5:1
Sonde 3	0,06	0	0	0,56	korrekt	9:1
Sonde 4	0,03	0,14	0,02	0,01	korrekt	5:1
Sonde 5	0,24	0,48	0,18	0,27	korrekt	2:1

Die Ergebnisse der Hybridisierung der DNA-Chips sind nicht gezeigt, allerdings wurden drei getrennte Hybridisierungen durchgeführt. Die Reaktion, zu welcher dATP zugegeben wurden, war in grün gefärbt. Die Reaktion, zu welcher dCTP zugegeben wurden, war blau. Die Reaktion, zu welcher dGTP zugegeben erfolgte in rot. Die Allel-Abrufe bzw. -Nennungen werden durch die Farbe des Flecks an der gegebenen SNP-Tag-Lokalisierung gezeigt: SNP 1:A; SNP2:G und SNP5:C.
Somit zeigt dieses Beispiel, dass Multiplexierung mit dem Verfahren der Erfindung möglich ist, und dass die unterschiedlichen SNPs leicht durch Hybridisierung an DNA-Chips identifiziert werden könne.
Beispiel 10: Multiplexierung mit genomischer S. cerevisiae-DNA
Dieses Beispiel zeigt die Multiplexierung auf genomischer Hefe-DNA unter Verwendung von Fugen-Modularsynthese und Apyrase und UNG zur Reduzierung des Hintergrundes.
Die Matrizen-DNA aus S. cerevisiae (genomische S96-DNA bei 197 ng/μl [was ist S96-DNA? Wir testeten zwei Stämme von Hefe S96 und YJM, in allen Beispielen wurde S96 verwendet]) wurde mit einer oder mehreren SNP-Sonden inkubiert, wie es in der Tabelle 12 dargestellt wird.
Die Sequenzen der zweiteiligen Sonden sind in den vorhergehenden Beispielen angegeben. Tabelle 12: Komponenten der Reaktionen

Reaktion 1 2 3 4 5 6 7 8

Sonde SNP 1 SNP 1 SNP 1 SNP 1 SNP 2 SNP 2 SNP 2 SNP 2

dXTP dATP dCTP dGTP dTTP dATP dCTP dGTP dTTP

Reaktion 9 10 11 12 13 14 15 16

Sonde SNP 3 SNP 3 SNP 3 SNP 3 SNP 4 SNP 4 SNP 4 SNP 4

dXTP dATP dCTP dGTP dTTP dATP dCTP dGTP dTTP

Reaktion 17 18 19 20 21 22 23 24

Sonde SNP 5 SNP 5 SNP 5 SNP 5 alle 5 Sonden alle 5 Sonden alle 5 Sonden alle 5 Sonden

dXTP dATP dCTP dGTP dTTP dATP dCTP dGTP dTTP
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 9 beschrieben ausgeführt. Kurz gesagt, wurden die Matrize und Sonden-DNAs vereinigt und mit Apyrase, Ampligase und Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment während 4 Minuten bei 20°C inkubiert, um die dXTPs abzubauen. Ein Enzym-Mix wurde hergestellt durch Vereinigen von 409,95 μl Wasser, 60 μl 10 × pfu-Ampligase-Puffer; 15,3 μl Matrizen-DNA bei 197 ng/μl; 6 μl Apyrase bei 50 mU/μl; 0,75 μl Ampligase; und 3 μl Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment bei 10 U/μl. 18 μl wurden in Strip-Röhrchen überführt. Der letztendliche Mix wurde hergestellt durch Kombinieren (für fünf Reaktionen) von 74,25 μl Enzym-Mix; 1,35 μl jeder Barcode-Oligosonde und TE, falls notwendig, um ein Volumen von 81 μl zu erhalten.
Die Reaktionen wurden dann durch Inkubation bei 95°C denaturiert und 15 Minuten lang bei 65°C annealt. 2 μl des jeweiligen dXTP bei 0,1 mM wurden zugegeben, und die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert. In der Ligationsreaktion (20 μl) belief sich die Barcode-Sonden-Endkonzentration auf 0,015 Picomol/μl.
3 μl jeder Reaktion wurden zu 27 μl "Run-off"-Mix zugegeben, welcher durch Vereinigen von 78 μl 10 × Taq Gold-Puffer; 93,6 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 5,85 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 6,24 μl P1bar-Biotin-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 78 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 440,31 μl Wasser hergestellt worden war. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert (und hinsichtlich Taq aktiviert), und "Run-off"-Produkte wurden durch 2 Minuten lange Inkubation bei 60°C erhalten. Die Reaktionen wurden dann durch Inkubation bei 4°C abgekühlt.
20 μl der Reaktionen wurden in einen UNG/PCR-Mix überführt, der hergestellt worden war durch Vereinigen von 78 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 93,6 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 78 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase; 39 μl UNG; 12,48 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 6,24 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 78 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 466,83 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, 10 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 14 Amplifikationszyklen von 20 Sekunden bei 95°C; 1 Minute bei 69,6°C (bei jedem Zyklus um 0,4°C absinkend), gefolgt von 30 Amplifikationszyklen von 20 Sekunden bei 95°C; 45 Sekunden bei 64°C und 10 Sekunden bei 72°C, unterzogen. Die Reaktionen wurden dann 10 Sekunden lang bei 72°C inkubiert und danach bei 4°C belassen.
Die Amplifikationsprodukte wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Gegenwart von Amplifikationsprodukten in Reaktionen, in welchen das dNTP, welches zugegeben wurde, komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA ist. Zum Beispiel zeigt die Spur 7 eine Reaktion mit SNP2-Sonde und dGTP, welches das Nukleotid ist, das komplementär zum SNP in der Matrizen-DNA an dieser Stelle ist. In ähnlicher Weise zeigt die Spur 18 ein Amplifikationsprodukt, welches aus der Zugabe von dCTP resultiert, welches das komplementäre Nukleotid zu SNP5 in Matrizen-DNA ist. In den Reaktionen 22, 23 und 24 sind ebenfalls Banden deutlich sichtbar, was anzeigt, dass eine Amplifikation in multiplexierten Reaktionen stattfindet.
Die dCTP- und die dGTP-Nukleotid-Reaktionen wurden auch durch Hybridisierung mit DNA-Chips analysiert. Die Hybridisierungsbedingungen waren ähnlich zu denjenigen in Beispiel 9, außer dass 20 μl der PCR-Reaktion in dem Hybridisierungs-Mix verwendet wurden und der Chip 12 Stunden lang hybridisiert wurde. Die Tabelle 13 zeigt die normierte Signalintensität aus den zwei Hybridisierungen. Das Signal:Rauschen-Verhältnis entspricht dem normierten Signal an dem erwarteten Nukleotid zu dem normierten Signal an dem anderen Nukleotid. Tabelle 13: Normierte Signalintensität aus der DNA-Chip-Hybridisierung

C-Signal G-Signal Basen-Nennung Signal:Rauschen

Sonde 2 0,13 0,39 korrekt 3:1

Sonde 4 0,16 0,08 korrekt 2:1

Sonde 5 0,13 0,05 korrekt 2,5:1
Beispiel 11: Nachweis von SNPs in DNA von sehr hoher Komplexität
Um die Komplexität und Menge von DNA, benötigt zum Genotypisieren von humaner DNA, nachzuahmen, aber dennoch die derzeitigen Hefe-spezifischen Sonden zu verwenden, wurde S. cerevisiae-DNA mit Kalbsthymus-DNA in einem äquimolaren Verhältnis gemischt oder weiter verdünnt, und dann wurde die SNP-Genotypisierungs-Reaktion durchgeführt. Kalbsthymus-DNA ist Säuger-DNA und enthält ungefähr die gleiche Komplexizität in Basenpaaren, wie es bei humaner DNA der Fall ist.

Die Reaktionen sind in der Tabelle 143 dargestellt. Genomische Hefe-DNA (200 ng/μl) wurde seriell in Kalbsthymus (100 ng/μl) wie folgend verdünnt. 1 μl Hefe-S96 wurde mit 19 μl Kalbsthymus (Verdünnung 1) gemischt. 2 μl der Verdünnung 1 wurden in 18 μl Kalbsthymus gemischt (Verdünnung 2). 2 μl der Verdünnung 2 wurden in 18 μl Kalbsthymus gemischt (Verdünnung 3). Tabelle 143: Komponenten der Reaktionen

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonde	SNP5	SNP5	SNP5	SNP5	SNP5	SNP5	SNP5	SNP5
Hefe S96, genomisch, ungeschnitten	100 ng	100 ng	10 ng	10 ng	1 ng	1 ng	0,1 ng	0,1 ng
Kalbsthymus	100 ng	100 ng	100 ng	100 ng	100 ng	100 ng	100 ng	100 ng
dXTP	C	G	C	G	C	G	C	G

Ein Enzymmix, enthaltend die Matrize und Sonden-DNAs wurde hergestellt durch Vereinigen (pro Reaktion) von 4,875; 11,875; 13,875; oder 14,575 μl Wasser; 2 μl 10 × pfu-Ampligase- Puffer; 0,3 μl Barcode-Oligo; 10, 3, 1 oder 0,3 μl genomische Hefeverdünnung; 0,2 μl Apyrase bei 50 mU/μl; 0,125 μl Ampligase; und 0,5 μl Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment bei 10 U/μl. 18 μl wurden in Strip-Röhrchen überführt. dXTPs, bzw. potentiell kontaminierende Nukleotide, wurden durch Inkubation während 20 Minuten bei 4°C abgebaut. Die Reaktionen wurden dann durch Inkubation bei 95°C während 5 Minuten denaturiert und rampenartig auf 65°C heruntergebracht. 2 μl dXTP bei 100 μM-Verdünnung wurde zugesetzt, und die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert.
Für einen Taq-"Run-off", wurden 2 μl Ligationsmischung zu 18 μl Run-Off-Mix zugegeben und 10 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert. Der Runoff-Mix wurde hergestellt durch Kombinieren (je Reaktion) von 2 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 0,75 μl dNTPs bei jeweils 4 mM; 0,15 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 0,16 μl P1bar-Biotin-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 10 pmol/μl; 2 μl MgCl₂ bei 25 mM; 1 μl UNG; und 13,78 μl Wasser. Die Reaktionen wurden hitzedenaturiert (und Taq-aktiviert) während 10 Minuten bei 95°C, und Runoff-Produkte wurden durch Inkubation während 2 Minuten bei 60°C erhalten.
Nach dem "Runoff" wurden, während die Mischung noch bei 60°C vorliegt, 20 μl der Verlängerungsreaktion in einen UNG/PCR-Mix überführt, hergestellt durch Kombinieren (pro Reaktion) von 2 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 0,75 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 0,15 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 Units/μl; 1 μl UNG; 0,16 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 0,16 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 2 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 13,78 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, 5 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 35 Amplifikationszyklen von 20 Sekunden bei 95°C; 45 Sekunden bei 64°C; und 10 Sekunden bei 72°C unterzogen. Die Reaktionen werden dann 10 Sekunden lang bei 72°C inkubiert und dann bei 4°C belassen.
Die Amplifikationsprodukte wurden durch Gelelektrophorese, wie beschrieben in den vorstehenden Beispielen, analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Gegenwart eines Amplifikationsprodukts in allen Spuren, bei welchen Reaktionen in Gegenwart von dCTP ausgeführt wurden, dem Nukleotid, welches komplementär zum SNP in der Matrizen-Nukleinsäure ist. Dies verdeutlicht, dass, sogar in Gegenwart von mehreren Milliarden Basenpaaren DNA, ein SNP durch dieses Verfahren nachgewiesen werden kann.
Beispiel 12: Amplifikation von SNPs in humaner DNA
Dieses Beispiel verdeutlicht die Anwendung des Systems, um SNPs in humaner genomischer DNA zu identifizieren. Dieses Beispiel wendete das Polymerase/Ligase-Verfahren mit zweiteiligen synthetisierten Sonden und die Apyrase- und UNG-Hintergrundverringerungs-Verfahren an.
Zwei DNA-Proben wurden aus einem nordeuropäischen Spender und einem indischen Spender erhalten. Die Proben wurden nach zwei Markern im humanen ATM-Gen, GenBank-Zugangsnummer HSU82828, gescreent. Dieses Gen enthält viele Polymorphismen, einschließlich zweier SNPs: einem an der Base 46611 (Intron 17; G nach A: 34.107) und dem zweiten an 60136 (Intron 22; T nach C: 35107). Die zum Nachweisen des SNP an der Base 46611 entworfene Sonde wurde hergestellt durch Ligieren von zwei Oligonukleotiden unter Verwendung eines Verbrückungsoligonukleotides, wie oben beschrieben, um eine Sonde herzustellen, aufweisend die Nukleotidsequenz 5'-AGAATAATTGTTTTTATTTCTTTGAAC/UGTCCACGAGGTCTCTAGTC/TGTAAAACGACGGCCAGT/UATGCGTACCCTCGACTGAG/TTTAAA/TAGAGAAAACACTGTCTGCC-3' (SEQ. ID. Nr.: 264), repräsentiert als Homologie1/Primer1/Primer2/Barcode/DraI/Homologie 2 ("U" gibt Uracilbasen an). Die Sonde zum Nachweisen des zweiten SNP wurde ebenfalls durch Ligieren von zwei Oligonukleotiden unter Verwendung eines Verbrückungsoligonukleotides konstruiert, wodurch eine Sonde hergestellt wird, aufweisend die Nukleotidsequenz 5'-AATAACCTTTCAGTGAGTTTTGAC/UGTCCACGAGGTCTCTAGTC/TGTAAAACGACGGCCAGT/UACTGTCACCGGAGTCTGAG/TTTAAA/GACATATTGGAAGTAACTTA-3' (SEQ. ID. Nr.: 275).

Die Zusammensetzungen der Reaktionen sind in der Tabelle 145 angegeben. Tabelle 154: Komponenten der Reaktionen

Reaktion	1	2	3	4	5	6	7	8
Sonden-Oligo	ATM46611	ATM46611	ATM46611	ATM46611	ATM60136	ATM60136	ATM60136	ATM60136
genomische Matrize	NE	NE	NE	NE	NE	NE	NE	NE
dXTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP

Reaktion	9	10	11	12	13	14	15	16
Sonden-Oligo	ATM46611	ATM46611	ATM46611	ATM46611	ATM60136	ATM60136	ATM60136	ATM60136
genomische Matrize	EI	EI	EI	EI	EI	EI	EI	EI
dXTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP	dATP	dCTP	dGTP	dTTP

NE steht für Nordeuropäer und EI steht für Indisch.

Ein Enzym-Mix, enthaltend die Matrize und Sonden-DNAs wurde hergestellt durch Vereinigen von 232,7 μl Wasser; 40 μl 10 × pfu-Ampligase-Puffer; 4 μl Apyrase bei bei 50 mU/μl; 2,5 μl Ampligase; und 0,5 μl Taq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment bei 10 U/μl. Vier Enzym/DNA-Mischungen wurden hergestellt durch Vereinigen von 65,07 μl Enzymmix; 13,5 μl Matrizen-DNA; und 0,54 μl Sonden-DNA. 18 μl wurden in Strip-Röhrchen überführt. Potentiell kontaminierende dXTPs bzw. Nukleotide wurden durch 20 Minuten lange Inkubation bei 4°C abgebaut. Die Reaktionen wurden dann durch Inkubation bei 95°C während 5 Minuten denaturiert und während etwa 15 Minuten rampenartig auf 65°C heruntergebracht. Zwei μl dXTP bei 100 μM? Verdünnung wurden zugegeben, und die Reaktionen wurden bei 58 [°C] während 10 Minuten inkubiert.
Für Taq-"Run-Off" wurden 2 μl Ligationsmix zu 18 μl "Run-Off"-Mix zugegeben, vorgewärmt auf 95°C, welcher durch Vereinigen von 34 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 12,75 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 2,55 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 U/μl; 2,72 μl P1bar-Biotin-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 10 pmol/μl; 34 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 220 μl Wasser hergestellt worden war. Die Reaktionen wurden hitzedenaturiert (und hinsichtlich Taq aktiviert) während 10 Minuten bei 95°C, und "Run-Off"-Produkte wurden durch 2 Minuten lange Inkubation bei 60°C erhalten, und dann wurde bei 4°C gekühlt.
20 μl der Verlängerungsreaktion wurden in einen UNG/PCR-Mix überführt, welcher hergestellt worden war durch Vereinigen von 34 μl 10 × Taq-Gold-Puffer; 12,75 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM; 2,55 μl AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 Units/μl; 17 μl UNG bei 1 Unit/μl; 2,72 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: 3) bei 100 pmol/μl; 2,72 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: 1) bei 100 pmol/μl; 34 μl MgCl₂ bei 25 mM; und 234,26 μl Wasser. Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, 10 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 35 Amplifikationszyklen von 20 Sekunden bei 95°C; 45 Sekunden bei 64°C; und 10 Sekunden bei 72°C unterzogen. Die Reaktionen werden dann 10 Sekunden lang bei 72°C inkubiert und dann bei 4°C belassen.
Die Amplifikationsprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert, wie es in früheren Beispielen beschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein eines Amplifikationsprodukts in den Spuren 3 und 11 für den ATM46611-SNP, was anzeigt, dass beide genomischen DNAs für diesen SNP homozygot G sind. Amplifikationsprodukte in der Spur 6, aber nicht 8, für den nordeuropäischen Spender zeigen, dass diese genomische DNA homozygot für C für den ATM60136-SNP ist, während die ostindische genomische DNA heterozygot für C und T aufgrund des Vorhandenseins von Produkten in den Spuren 14 bzw. 16 ist.
Beispiel 13: Erhöhung des Signals aufgrund von Freisetzung von ligierter ringförmiger Sonde von genomischer DNA unter Verwendung von Uracil-N-Glykosylase-Verdau.
Weil es für Polymerasen schwierig ist, eine geprimte ringfömige Sonde zu kopieren, während sie um lange DNA-Matrizen herum zirkularisiert ist, wird das Signal verbessert, wenn die ligierte Sonde von der genomischen DNA-Matrize freigegeben wird, was einen freien Zugang zu der ligierten Sonde durch Primer und Polymerase erlaubt. In diesem Beispiel wird dies durch die Depyrimidierung der ligierten zirkularisierten Sonde mittels Uracil-N-Glykosylase (ebenfalls bezeichnet als UNG), gefolgt von Hitzeschneiden der abasischen Stelle durch Hitze erreicht, was die ligierte Sonde linearisiert, welche dann von der genomischen DNA-Matrize [ab] hitzedenaturiert werden kann.
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Vergleichen von Sonden, welche die UNG-Zielbase Uracil (dUTP oder einfach U) enthalten (Sonden A9U und A10U) bzw. nicht enthalten (A9 und A10), in einer Reaktion, die das verdauende Enzym Uracil-N-Glykosylase enthält, oder nicht.
Die verwendete Matrizen-DNA war gereinigte humane genomische DNA, und die verwendeten Sonden besitzen die Nukleotidsequenz 5' A9
A10
A9
A10
Ein Einzelnukleotidfugen-Auffüll-Reaktionsmix wurde durch Mischen von 48 μl 10 × Ampligase-Reaktionspuffer (Epicentre), 0,6 μl Apyrase von 500 Milliunits/μl (Sigma), 2,4 μl Taq-Polymerase-Stoffel-Fragment, 10 Units/μl (ABI), 0,6 μl Ampligase-Enzym von 5 Units/μl (Epicentre), 24 μl humaner genomischer DNA von 100 ng/μl und 345 μl Wasser hergestellt. 44,75 μl dieses Reaktionsmix wurden zu 0,25 μl jeder Sonde (1,25 Femtomol/μl) zugegeben, wovon 9 μl in jede von vier Positionen in einer Reaktionsplatte, eine für jedes Nukleotid, pipettiert wurden.
Die Reaktionsmischungen (enthaltend die DNAs) wurden 4 Minuten lang bei 20°C inkubiert, 5 Minuten lang bei 95°C denaturiert und 15 Minuten lang bei 55°C annealt. In jedes Röhrchen wurde 1 μl 1,25 mikromolares Desoxynukleotid (Pharmacia) zugegeben (wie angegeben in der Tabelle XX), und die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 55°C inkubiert. An diesem Punkt sind die Sonden um die genomische DNA herum zirkularisiert worden, wenn das korrekte Nukleotid zugegeben worden war. Die Reaktionsmischung wurde dann 2 Minuten lang bei 95°C inkubiert und dann auf 37°C gebracht. In jede Vertiefung wurden 25 μl Uracil-N-Glykosylase-Mix zugegeben, welcher aus 2,5 μl 10 × Taq-Gold-Puffer (ABI), 1,6 μl 25 mM MgCl₂, Wasser und 10 μl UNG bestand (falls in der Tabelle XX angegeben). Die Reaktionen wurden 20 Minuten lang bei 37°C für die Depyimidierung und dann 10 Minuten lang bei 95°C zum Zerbrechen der abasischen Stelle inkubiert.
Tabelle XX: Komponenten der verschiedenen Reaktionen:
Ligierte Sonden-Produkte wurden durch Zugeben von 25 μl eines Amplifikations-Mixes, bestehend aus 2,5 μl 10 × Taq Gold-Puffer (ABI), 1,6 μl 25 mM MgCl₂, 2,24 μl dNTPs bei jeweils 1,25 mM, 0,08 μl M13-Primer (SEQ. ID. Nr.: XX) bei 197 pmol/μl, 0,09 μl P1Bar-Primer (SEQ. ID. Nr.: XX) bei 186 pmol/μl, 0,4 μl Amplitaq-Gold-DNA-Polymerase bei 5 Units/μl (ABI) und Wasser, und Thermozyklieren der Mischung während 20 Sekunden bei 95°C, 45 Sekunden bei 64°C und 10 Sekunden bei 72°C während 31 Zyklen amplifiziert.
20 μl jeder Reaktion wurden dann einer Elektrophorese in 4%iger Agarose unterzogen, und die Banden wurden, wie in den früheren Beispielen beschrieben, sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Signal, welches eine Bande ist, die bei 100 Basenpaaren wandernd, wie verglichen mit der links aufgetragenen DNA-Leiter, beobachtet wird, in großem Maße in Reaktionen mit Sonden erhöht ist, welche ein Uracil enthalten und mit Uracil-N-Glykosylase inkubiert worden waren. Dies zeigt, dass sowohl das Enzym als auch sein Ziel-Uracil auf der Sonde notwendig sind, um die zirkularisierte Sonde von der genomischen DNA-Matrize freizusetzen und eine effiziente Amplifikation zu erlauben.

Claims

Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, in einer Probe, wobei das besagte Verfahren umfasst: a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; und iv) eine Schnittstelle; wobei die besagte erste und zweite das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren; b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Ligase, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden; c) Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde an besagter Schnittstelle, um eine geschnittene Sonde zu bilden; d) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde, um eine Vielzahl von Amplikons zu bilden; und e) Nachweis der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Zielsequenz in der besagten Probe nachzuweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das besagte Amplifizieren durch Inkontaktbringen der besagten geschnittenen Sonde mit: a) mindestens einem ersten universellen Primer; b) einem kettenverlängernden Enzym; und c) NTPs erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das besagte kettenverlängernde Enzym eine Polymerase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die besagte Präzyklus-Sonde außerdem eine zweite universellen Primer bindende Stelle umfasst und ein zweiter Schritt des Inkontaktbringens das Inkontaktbringen der besagten geschnittenen Sonde mit einem zweiten universellen Primer umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die besagte Schnittstelle zwischen besagten ersten und zweiten universellen Primer bindenden Stellen liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einem kettenverlängernden Enzym und mindestens einem Abfrage-NTP vor der Bildung der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit mindestens einem Fugenoligonukleotid vor der Bildung der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde umfasst, wobei besagtes Fugenoligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die völlig komplementär zu besagter Fugendomäne ist, wobei der Nachweis der besagten Amplikons die besagte Fugendomäne identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst und die besagte Präzyklus-Sonde außerdem eine am weitesten 3' oder 5' gelegene Nachweisdomäne umfasst, welche eine oder mehrere Nukleinsäuren umfasst, die völlig komplementär zu besagter Fugendomäne sind, wobei der Nachweis der besagten Amplikons die besagte Fugendomäne identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die besagte Nachweisdomäne mit der besagten zweiten das Ziel erkennenden Domäne verbunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die besagte Fugendomäne aus einem bis etwa 1000 Nukleotiden besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die besagte Fugendomäne aus einem single nucleotide polymorphism in der besagten Zielsequenz besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das den zusätzlichen Schritt des Verdaus jeglicher linearer Präzyklus-Sonden vor dem Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, das außerdem den Abbau jeglicher NTPs vor der Zugabe der besagten Abfrage-NTPs umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei der besagte Abbau mit Apyrase erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Schnittstelle ein Uracil ist und das besagte Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde das Inkontaktbringen der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde mit Uracil-N-Glykosylase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Schnittstelle eine Restriktionsstelle ist und das besagte Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde das Inkontaktbringen der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde mit einem Restriktionsenzym umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 4, wobei der besagte erste universelle Primer markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 4, wobei mindestens eines der besagten NTPs markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Markierung des besagten universellen Primers Biotin umfasst und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt der Abtrennung biotinylierter Amplikons vor dem besagten Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis einer Mehrzahl von Zielsequenzen in einer Probe, wobei jede der besagten Mehrzahl von Zielsequenzen erste und zweite Zieldomänen umfasst, wobei besagtes Verfahren umfasst: a) Hybridisieren von besagter Mehrzahl von Zielsequenzen mit einer Mehrzahl von Präzyklus-Sonden, um eine Mehrzahl von ersten Hybridisierungskomplexen zu bilden, wobei jede der besagten Präzyklus-Sonden umfasst: i) eine erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; iv) eine Schnittstelle; und v) eine Barcode-Sequenz; wobei die besagte Mehrzahl erster und zweiter das Ziel erkennender Domänen mit der besagten Mehrzahl erster und zweiter Zieldomänen hybridisiert; b) Inkontaktbringen der besagten Mehrzahl erster Hybridisierungskomplexe mit einer Ligase, um eine Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden zu bilden; c) Schneiden der besagten Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden an den besagten Schnittstellen, um eine Mehrzahl geschnittener Sonden zu bilden; d) Amplifizieren der besagten Mehrzahl geschnittener Sonden, um Amplikons zu bilden; und e) Nachweis des Vorliegens der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Mehrzahl von Zielsequenzen in der besagten Probe nachzuweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das besagte Amplifizieren durch Inkontaktbringen der besagten Mehrzahl geschnittener Sonden mit: a) mindestens einem ersten universellen Primer; b) einem kettenverlängernden Enzym; und c) NTPs erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das besagte kettenverlängernde Enzym eine Polymerase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die besagte Mehrzahl von Präzyklus-Sonden jeweils außerdem eine zweite universellen Primer bindende Stelle umfasst und ein zweiter Schritt des Inkontaktbringens das Inkontaktbringen der besagten Mehrzahl geschnittener Sonden mit einem zweiten universellen Primer umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die besagte Schnittstelle zwischen besagten ersten und zweiten universellen Primer bindenden Stellen liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die besagte Mehrzahl von Zielsequenzen jeweils außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst, und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens der besagten Mehrzahl erster Hybridisierungskomplexe mit einer Polymerase und mindestens einem NTP vor dem Inkontaktbringen der besagten Mehrzahl von Hybridisierungskomplexen mit der besagten Ligase, um eine Mehrzahl von besagten geschlossenen ringförmigen Sonden zu bilden, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die besagte Mehrzahl von Zielsequenzen jeweils außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst, und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens der besagten Mehrzahl erster Hybridisierungskomplexe mit mindestens einem Fugenoligonukleotid vor der Bildung der besagten Mehrzahl geschlossener ringförmiger Sonden umfasst, wobei das besagte Fugenoligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die komplementär zu mindestens einer der besagten Mehrzahl von Fugendomänen ist, wobei der Nachweis der besagten Amplikons die besagte Fugendomänen identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die besagte Mehrzahl von Zielsequenzen jeweils außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst, und wobei die besagte Mehrzahl von Präzyklus-Sonden jeweils einen einzigartigen Barcode umfasst und außerdem einen Nachweisbereich umfasst, welcher eine oder mehrere Nukleinsäuren umfasst, die komplementär zu mindestens einer der besagten Fugendomänen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung der Base an einer Nachweisposition in einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, welche durch eine Fugendomäne getrennt sind, wobei die besagte Fugendomäne die besagte Nachweisposition umfasst, wobei besagtes Verfahren umfasst: a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei die besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine 5' gelegene erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine 3' gelegene zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; und iv) eine Schnittstelle; wobei die besagten ersten und zweiten das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren; b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Polymerase und mindestens einem Abfrage-NTP, um eine verlängerte Präzyklus-Sonde zu bilden; c) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes, der die besagte verlängerte Präzyklus-Sonde und die besagte Zielsequenz umfasst, mit einer Ligase, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden; d) Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde an der besagten Schnittstelle, um eine geschnittene Sonde zu bilden; e) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde, um eine Mehrzahl von Amplikons zu bilden; f) Nachweis des Vorliegens der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Zielsequenz in der besagten Probe nachzuweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 28, das außerdem den Abbau jeglicher NTPs vor der Zugabe des besagten Abfrage-NTPs umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei der besagte Abbau mit Apyrase erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Amplifizieren einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, in einer Probe, wobei besagtes Verfahren umfasst: a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei die besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; und iv) eine Schnittstelle; wobei die besagten ersten und zweiten das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren; b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Ligase, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden; c) Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde an der besagten Schnittstelle, um eine geschnittene Sonde zu bilden; und d) Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst, und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Polymerase und mindestens einem NTP vor dem Inkontaktbringen des besagten Komplexes mit der besagten Ligase, um die besagte geschlossene ringförmige Sonde zu bilden, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 31, das den zusätzlichen Schritt des Verdaus jeglicher linearer Präzyklus-Sonden vor dem Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis einer Zielsequenz, die eine erste und eine zweite Zieldomäne umfasst, in einer Probe, wobei besagtes Verfahren umfasst: a) Hybridisieren der besagten Zielsequenz mit einer Präzyklus-Sonde, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden, wobei die besagte Präzyklus-Sonde umfasst: i) eine erste das Ziel erkennende Domäne; ii) eine zweite das Ziel erkennende Domäne; iii) mindestens eine erste universellen Primer bindende Stelle; und iv) mindestens eine Schnittstelle; wobei die besagten ersten und zweiten das Ziel erkennenden Domänen mit besagten ersten und zweiten Zieldomänen hybridisieren; b) Inkontaktbringen des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einer Ligase, um eine geschlossene ringförmige Sonde zu bilden; c) Inkontaktbringen der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde mit mindestens einem ersten universellen Primer, einem kettenverlängernden Enzym und NTPs, um ein verlängertes Produkt zu bilden; d) Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde; e) Amplifizieren des besagten verlängerten Produkts, um Amplikons zu bilden; und f) Nachweis der besagten Amplikons, um das Vorliegen der besagten Zielsequenz in der besagten Probe nachzuweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei das besagte Amplifizieren durch Inkontaktbringen des besagten verlängerten Produkts mit: a) mindestens einem ersten universellen Primer; b) einem kettenverlängernden Enzym; und c) NTPs erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit einem kettenverlängernden Enzym und mindestens einem Abfrage-NTP vor der Bildung der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens des besagten ersten Hybridisierungskomplexes mit mindestens einem Fugenoligonukleotid vor der Bildung der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde umfasst, wobei das besagte Fugenoligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die völlig komplementär zu der besagten Fugendomäne ist, wobei der Nachweis der besagten Amplikons die besagte Fugendomäne identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die besagte Zielsequenz außerdem eine Fugendomäne zwischen besagten ersten und zweiten Zieldomänen umfasst und die besagte Präzyklus-Sonde außerdem eine am weitesten 3' oder 5' gelegene Nachweisdomäne umfasst, welche eine oder mehrere Nukleinsäuren umfasst, die völlig komplementär zu der besagten Fugendomäne sind, wobei der Nachweis der besagten Amplikons die besagte Fugendomäne identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die besagte mindestens eine Schnittstelle Uracil umfasst und das Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde das Inkontaktbringen der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde mit Uracil-N-Glycosylase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die besagte Schnittstelle eine Restriktionsstelle ist und das Schneiden der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde das Inkontaktbringen der besagten geschlossenen ringförmigen Sonde mit einem Restriktionsenzym umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Markierung des besagten markierten universellen Primers Biotin umfasst und besagtes Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt der Abtrennung biotinylierter Amplikons vor dem Amplifizieren der besagten geschnittenen Sonde umfasst.