DE602004003288T2

DE602004003288T2 - Elektrochemischer Biosensor

Info

Publication number: DE602004003288T2
Application number: DE602004003288T
Authority: DE
Inventors: Gang 133000 Cui; Jae-Hyun Seongdong-ku 133-859 Yoo; Moon-Hwan Ojung-gu Buchon 421-190 Kim; Ju-Yong Suwon 442-190 Kim; Jung-Hee Seongbuk-gu 136-143 Uhm; Hakhyun Kangbuk-ku Nam; Geun-Sig 120-841 Cha
Original assignee: i Sens Inc
Current assignee: i Sens Inc
Priority date: 2003-06-09
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2024-01-24
Also published as: CN1573324A; KR100554649B1; KR20040105429A; EP1486778A2; EP1486778B1; JP4018082B2; US20050000808A1; CN1323293C; JP2005003679A; US7288174B2; EP1486778A3; ATE346161T1; DE602004003288D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft elektrochemische Biosensoren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung elektrochemische Biosensoren, die eine Reagenzschichtzusammensetzung enthalten, die zu einer drastisch verringerten Messabweichung führt, die auf den Hämatokritwert zurückzuführen ist. Die Reagenzschichtzusammensetzung enthält ein Enzym, einen Elektronentransfermediator, wasserlösliche Polymere, eine Fettsäure (Alkylkettenlänge: 4 bis 20 Kohlenstoffatome) und ein quartäres Ammoniumsalz. Es sind weiterhin verschiedene Arten von elektrochemischen Biosensoren für Probenvolumen im Submikrobereich offenbart, die sich für die Verwendung mit der Reagenzschichtzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eignen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die regelmäßige Überwachung des Blutzuckerspiegels wird für die Diagnose und zur Prophylaxe von Diabetes Mellitus benötigt. Sie wird einfach von Personen unter Verwendung von Streifenbiosensoren durchgeführt, die für Handlesegeräte gedacht sind. Viele im Handel erhältliche Biosensoren nutzen die folgende Reaktion zur Quantifizierung des Glucosespiegels in Vollblutproben: Glucose + GOD_FAD → Glukonsäure + GOD_FADH2 GOD_FADH2 + M_ox → GOD_FAD + M_red wobei GOD Glucoseoxidase, GOD_FAD und GOD_FADH2 ein oxidierter beziehungsweise reduzierter Zustand der Glucoseoxidase ist, und M_ox und M_red den oxidierten beziehungsweise reduzierten Elektronentransfermediator bezeichnet. Wie in der Reaktion dargestellt ist, wird Glucose durch Reduktion von GOD_FAD zu GOD_FADH2 zu Glukonsäure oxidiert. Die reduzierte Glucoseoxidase überträgt ein Elektron/Elektronen auf den Mediator M_ox und auf die Arbeitselektrode. Die Abfolge des Reaktionszyklus wird vom Anodenpotenzial gesteuert, das an der Arbeitselektrode angelegt wird, und es wird der Redoxstrom gemessen, der proportional zum Glucosewert ist.
Obwohl elektrochemische Biosensoren geeignet für die Überwachung und Kontrolle des Blutzuckerspiegels sind, wird ihre Genauigkeit stark von der Gegenwart verschiedener leicht oxidierbarer Spezies (z.B. Ascorbinsäure, Harnsäure, Paracetamol usw.) in Blutproben beeinträchtigt. Eine weitere erhebliche Messabweichung ergibt sich aus den zellulären Blutbestandteilen (Hämatokrit). Die Interferenz von oxidierbaren Spezies kann durch die Verwendung eines Elektronentransfermediators verringert werden, der ein geringeres Oxidationspotenzial als die Störsubstanzen in der Reagenzschicht aufweist. Es wurden jedoch bisher nur wenige praktische Lösungen zur Verringerung der Messabweichung aufgrund zellulärer Blutbestandteile vorgeschlagen. Sie lehren die Verwendung einer zusätzlichen Schicht für die Abtrennung zellulärer Blutbestandteile oder den Ausschluss von Erythrozyten ( JP 1134461 , JP 2000338076 und US 5658444 ), die auf der Reagenzschicht verteilt ist, eine druckbare Paste zur Abtrennung von Reagenz und Blut mit einem Füllstoff aus Siliziumdioxid ( US 6241862 B1 ), und ein chemometrisches Korrekturverfahren in Verbindung mit den zwei Anregungspotenzialen (WO 01/57510 A2). Die offenbarten Verfahren können jedoch nicht durch einfache Abgabe des Reagenzgemischs auf die Arbeitselektrode erfolgen und erfordern entweder zusätzliche Schritte im Herstellungsprozess oder einen hohen Reagenzverlust beim Drucken der Reagenzschicht.
In US 6,475,372 ist eine elektrochemische Vorrichtung und ein Verfahren zur Verwendung bei der Bestimmung der hämatokritkorrigierten Analytenkonzentration u.a. in Vollblut offenbart. In eine elektrochemische Zelle mit einer Arbeits- und einer Bezugselektrode wird eine Probe eingebracht. An die Zelle wird ein erstes elektrisches Potenzial angelegt und der entstehende Zellenstrom über eine Zeitdauer wird gemessen, um eine erste Stromtransiente über die Zeit zu bestimmen. Anschließend wird ein zweites elektrisches Potenzial entgegengesetzter Polarität angelegt und eine zweite Stromtransiente über die Zeit ermittelt. Die vorläufige Konzentration des Analyten wird anschließend anhand der ersten und/oder zweiten Stromtransienten über die Zeit berechnet. Diese vorläufige Konzentration des Analyten abzüglich eines Hintergrundwerts wird anschließend mit einem Hämatokrit-Korrekturfaktor multipliziert, um die Konzentration des Analyten in der Probe zu erhalten, wobei der Hämatokrit-Korrekturfaktor von der vorläufigen Konzentration des Analyten und der Variablen Gamma der elektrochemischen Zelle abhängt.
In WO 02/14535 ist ein Verfahren beschrieben, mit dem unter Verwendung eines benutzerfreundlichen Streifentests u.a. Glucose in Vollblut nachgewiesen werden kann, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das erforderliche Probenvolumen sehr gering ist, z.B. unter 200 nl und bis hinunter zu 50 nl. Die elektrochemischen Streifen, die für den Glucosenachweis in Vollblut verwendet werden, umfassen für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität von Reagenzien wie Enzymen auf dem Streifen eine Arbeits-, eine Bezugs- und eine Gegenelektrode oder eine Kombination daraus. Die Interferenz zellulärer Blutbestandteile kann durch Saponin, Digitonin oder andere auflösende Mittel verringert werden.
In EP 0735363 ist ein Biosensor offenbart, der ein elektrisch isolierendes Substrat mit mehreren Flächen umfasst, mehrere Elektrodensysteme, die auf mindestens zwei der mehreren Flächen des Substrats ausgebildet sind, wobei jedes Elektrodensystem eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode aufweist, und mehrere Reaktionsschichten, die auf mindestens zwei der mehreren Flächen des Substrats vorgesehen sind, wobei jede Reaktionsschicht eine Oxidoreduktase enthält. Wenn eine Blutprobe zuerst mit einem Elektrodenteilsystem in Berührung gebracht wird und sich die Reaktionsschicht auflöst, wird eine Veränderung der Impedanz zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode im Elektrodenteilsystem gemessen. Die Probe wird anschließend zum Elektrodenhauptsystem geführt und die Reaktionsschicht auf dem Elektrodenhauptsystem löst sich auf. Es wurde eine Impedanzänderung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode des Elektrodenhauptsystems gemessen. Der Einfluss des Hämatokrits wird aus den Messungen durch Berücksichtigung der zeitlichen Änderungen einer Impedanzänderung einer Elektrode des Teilsystems und einer Elektrode des Hauptsystems entfernt.
In der Medline-Datenbank, US National Library of Medicine (NLM), Bethesda, Maryland, USA, September 1986, wird von Kaler G. V. et al. in „Erythrocyte haemolysis by detergents – a mathematical model and analysis of the concentration and kinetic curves" (D4) ein mathematisches Modell der Erythrozytenlyse durch Detergenzien beschrieben, bei dem die Kinetik der Bindung des Detergens an die Plasmamembran berücksichtigt wird. Es wurden 5 Detergenzien getestet und es wurde festgestellt, dass Cetylpyridinium die höchste hämolytische Aktivität aufwies.
In EP 1182456 ist ein Biosensor offenbart, der Folgendes umfasst: (a) mindestens ein Substrat; (b) ein Elektrodensystem, das an einem Ende des Substrats ausgebildet ist und ein Sensormaterial aufweist; (c) einen Isolator auf Teilen der Elektrodenschicht, um das Elektrodensystem elektrisch von einem Anschluss zu trennen; (d) eine poröse Membran, die von der Fläche des Elektrodensystems bedeckt wird und eine Oxidase und einen Elektronentransfermediator aufweist; und (e) eine Schutzmembran mit derselben Größe wie die poröse Membran und/oder ein oberes Substrat, das mit einem Probeneinlass versehen ist. Im Glucosesensor kann die poröse Membran Proben chromatografisch durch die Poren der porösen Membran filtern und somit vorher zelluläre Blutbestandteile aus der Probe entfernen. Die zellulären Blutbestandteile können dann während der chromatografischen Bewegung der Proben nicht durch die Poren des Sensors gelangen. Die Ergebnisse werden nicht durch die störende Beeinflussung der Adsorption zellulärer Blutbestandteile an Elektrodenflächen beeinträchtigt. Eine starke, vom Hämatokritwert abhängige Abweichung kann zu einer falschen Beurteilung durch diejenigen führen, die ihren Blutzuckerspiegel regelmäßig mit Einwegbiosensorstreifen überwachen, was sogar zu ihrem Tod führen kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Reagenzschichtzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die zur Herstellung der Einwegbiosensoren mit drastisch verringerter, vom Hämatokritwert abhängiger Abweichung verwendet werden können. Die Reagenzschichtzusammensetzungen dieser Erfindung können tropfenweise direkt auf die Arbeitselektrode von Biosensorstreifen gegeben werden, wodurch sich die Herstellbarkeit in der Massenfertigung erheblich verbessert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, verschiedene Ausgestaltungen von Biosensoren bereitzustellen, die eine bessere elektroanalytische Leistungsfähigkeit bewirken, wenn sie mit den vorliegenden Reagenzschichtzusammensetzungen hergestellt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Anwendung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist am besten anhand der zugehörigen Zeichnungen zu verstehen, in denen für die gleichen und entsprechenden Teile gleiche Bezugszeichen verwendet werden. Es zeigen:
1 eine perspektivische Explosionsdarstellung, in der ein elektrochemischer Biosensor mit einem Probeneinführbestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt ist;
2 eine perspektivische Explosionsdarstellung, in der ein Biosensor mit umgekehrten Elektroden dargestellt ist, der in Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist;
3 eine perspektivische Explosionsdarstellung, in der ein umgekehrter elektrochemischer Biosensor mit einem Probeneinführbestandteil und einer Elektrode zur Bestimmung der Fluidität gemäß der vorliegende Erfindung dargestellt ist;
4 die grafische Darstellung, in der der Einfluss verschiedener Störsubstanzen auf einen umgekehrten Glucosesensor dargestellt ist: (a) Glucose; (b) Glucose + Paracetamol (660 μM); (c) Glucose + Ascorbinsäure (570 μM); (d) Glucose + Harnsäure (916 μM)
5 eine grafische Darstellung, in der eine Kalibrationskurve eines umgekehrten Glucosesensors für die Empfindlichkeit gegenüber Glucosestandardlösungen dargestellt ist; und
6 eine grafische Darstellung, in der dynamische Kurven eines umgekehrten Glucosesensors dargestellt sind, die mit einem chronoamperometrischen Verfahren für Glucosestandardlösungen gewonnen wurden.
7 eine grafische Darstellung, in der das Verhältnis zwischen der Probenfluidität (in Abhängigkeit von der Zeit) und dem Hämatokritwert dargestellt ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der elektrochemische Biosensor der vorliegenden Erfindung umfasst: a) ein unteres und ein oberes Substrat; b) eine Arbeitselektrode und eine Bezugselektrode (oder Gegenelektrode), die jeweils entweder an dem unteren Substrat oder dem oberen Substrat ausgebildet sind; c) eine Reaktionsschicht, die ein Enzym, einen Elektronentransfermediator, wasserlösliche Polymere, eine Fettsäure oder ihr Salz und ein quartäres Ammoniumsalz enthält und über der Arbeitselektrode ausgebildet ist; und d) eine Zwischenlage, die zwischen dem unteren und dem oberen Substrat ausgebildet ist, wobei die Zwischenlage mit einer Ausschnittsstruktur einer Probeneinführöffnung, einem Luftaustrittskanal und einem Leerraum an der Kreuzungsstelle von Probeneinführöffnung und Luftaustrittskanal versehen ist.
Der elektrochemische Biosensorstreifen der vorliegenden Erfindung kann weiterhin umfassen: a) ein unteres und ein oberes Substrat (üblicherweise Polymerfilme), auf denen mittels Siebdruck oder durch Abscheidung leitender Stoffe (z.B. Kohlenstoff- oder Metallpasten, Metalldampf und leitende Polymere) Arbeitselektroden und Hilfselektroden (Gegen- oder Bezugselektroden) aufgebracht sind; b) ein T-förmiger Probenahmekanal, der zwischen den beiden Substraten eingeschlossen wird, getrennt durch eine doppelseitig klebende Zwischen lage; c) eine Reagenzschicht, die für eine wesentlich geringere vom Hämatokritwert abhängige Abweichung sorgt.
Die Elektrodensysteme können auf demselben Grundsubstrat oder sowohl auf dem unteren als auch auf dem oberen Substrat hergestellt werden: d.h. (1) eine Arbeitselektrode und eine Hilfselektrode (oder eine Bezugselektrode), die auf demselben Grundsubstrat ausgebildet sind; und (2) eine Arbeitselektrode und eine Hilfselektrode, die auf dem Grund- beziehungsweise Decksubstrat ausgebildet und so angeordnet sind, dass sie einander zugewandt sind (umgekehrte Elektroden: siehe E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, Vol. 37, S. 1378, 1965; K. B. Oldham in „Microelectrodes: Theory and Applications", Kluwer Academic Publishers, 1991). Auf dem Grundsubstrat kann hinter der Arbeitselektrode eine zusätzliche Elektrode für die Messung der Fluidität von Vollblutproben vorgesehen sein. Da zelluläre Blutbestandteile die Fluidität und elektrische Leitfähigkeit von Blut verändern, ändert sich die Probenahmedauer durch einen Kapillarkanal von Biosensorstreifen proportional zum Hämatokritwert in Vollblutproben. Diese Veränderungen der Fluidität von Blutproben können zur Korrektur der vom Hämatokritwert abhängigen Abweichung bei Blutzuckermessungen verwendet werden.
Mit dem T-förmigen Probenahmekanal kann eine Blutprobe von der Spitze der Biosensorstreifen aus schnell, genau und zweckmäßig eingebracht werden. Der Probeneinführkanal umfasst eine Probeneinführöffnung, einen Luftaustrittskanal und einen Leerraum, wobei die Probeneinführöffnung den Luftaustrittskanal unter dem Ende der Öffnung kreuzt, wodurch ein Leerraum an der Kreuzungsstelle entsteht. Der Leerraum trägt dazu bei, ein konstantes und genaues Probenvolumen für die Messung innerhalb der Öffnung zu halten, und überschüssiges Probenmaterial durch den Luftaustrittskanal abzuführen, und kann ferner dazu verwendet werden, eine Elektrode zur Bestimmung der Fluidität einzusetzen.
Die Reagenzschicht der vorliegenden Erfindung wird auf der Arbeitselektrode des Biosensorstreifens ausgebildet, indem einfach eine Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung abgegeben wird, die ein Enzym (z.B. Glucoseoxidase, Lactatoxidase usw.), einen Elektronentransfermediator, wasserlösliche Polymere (z.B. Celluloseacetat, Polyvinylalkohol, Polypyrrol usw.) und ein Mittel zur Herabsetzung der störenden Beeinflussung durch zelluläre Blutbestandteile (Fettsäuren mit einer Alkylkette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen) und ein lipophiles quartäres Ammoniumsalz enthält.
Der Biosensor der vorliegenden Erfindung umfasst ferner ein Sichtfenster am oberen Substrat, das über dem Leerraum angeordnet ist. Das Sichtfenster kann durch einen Teil des oberen Substrats für den Füllstand der Probe die Elektrode zur Bestimmung der Fluidität auf dem unteren Substrat zeigen.
Mit Bezug auf 1 umfasst ein elektrochemischer Biosensor eine Zwischenlage 200 und ein unteres Substrat 400 und ein oberes Substrat 300 zur Ausbildung der elektrochemischen Sensoren und des Probeneinführkanals. In einem Ende der Zwischenlage 200 sind eine Probeneinführöffnung 101, ein Luftaustrittskanal 102 und ein Leerraum 103 ausgebildet. Es sei anzumerken, dass die Probeneinführöffnung 101, ein schmaler Kanal, der in der Mitte des Streifens ausgebildet ist, mit dem Luftaustrittskanal 102 annähernd senkrecht etwas unter dem Ende des Kanals in Form einer Öffnung in Verbindung steht, sodass hinter dem Verbindungspunkt der Leerraum 103 entsteht. Insgesamt betrachtet, stellen die Probeneinführöffnung 101, der Luftaustrittskanal 102 und der Leerraum 103 einen Probeneinführbestandteil 100 dar.
Die Probeneinführöffnung 101 ist ein Durchgang, durch den die Probe in den Biosensor eingeführt werden kann, und der Luftaustrittskanal 102 ist ein Luftdurchlass. Aufgrund der Kapillarwirkung wird eine zu testende Probe in den Probeneinführbestandteil 100 eingebracht und tritt Luft durch den Luftaustrittskanal 102 aus.
Der Leerraum 103 stellt die unbesetzte Stelle dar und vermindert das Phänomen der Ausbildung von Luftblasen, zu der es häufig am Verbindungspunkt zwischen der Probeneinführöffnung 101 und dem Luftaustrittskanal 102 kommt. Das Phänomen der Ausbildung von Luftblasen führt zu ungenauen Messungen, sodass der Leerraum 103 eine genaue und reproduzierbare Probenahme gewährleistet.
Das Verhältnis zwischen der Breite des Luftaustrittskanals 102 und der Probeneinführöffnung 101 (das Verhältnis der Breite des Luftaustrittskanals 102 zu der der Probeneinführöffnung 101) ist nicht größer als 1:2. Der am meisten bevorzugte Bereich liegt zwischen 1:5 und 1:2. Mit einem Verhältnis von unter 1:2 wird sichergestellt, dass bei minimaler Überfüllung durch den Luftaustrittskanal 102 eine genaue Probenmenge in der Probeneinführöffnung 101 aufgenommen wird.
In 1 ist der Verbindungswinkel (φ) zwischen der Probeneinführöffnung 101 und dem Luftaustrittskanal 102 als 90° dargestellt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann dieser Winkel jedoch in einem Bereich von etwa 45° bis zu etwa 135°, vorzugsweise von etwa 75° bis zu etwa 105° verändert werden.
Wie ebenfalls in 1 dargestellt ist, geht der Leerraum 103 von der Probeneinführöffnung 101 aus über den Verbindungspunkt hinaus. Um eine exakte Probenmenge ohne Blasenbildung zu gewährleisten, ist eine hydrophile Behandlung der Probeneinführöffnung 101 einschließlich des Leerraums 103 erwünscht.
Der Probeneinführbestandteil 100 der vorliegenden Erfindung weist ein Fassungsvermögen zum Einbringen von 0,1 bis 3,0 μl einer Probe auf. Bevorzugter beträgt dieses Fassungsvermögen 0,1 bis 1,0 μl; am bevorzugtesten beträgt das Fassungsvermögen 0,3 bis 0,7 μl. Proben von unter 0,1 μl sind zu gering für eine genaue Messung innerhalb des Fehlerbereichs des gegenwärtigen Biosensors. Proben von über 3,0 μl sind unterdessen zu groß. Bei bevorzugten Ausführungsformen wurden akkurate Messungen mit Proben von nur 0,5 μl gewonnen.
Durch Andrücken eines organischen Polymerfilms, der aus Polyester, Polyvinylchlorid oder Polycarbonat besteht, könnte die Zwischenlage 200 zwischen dem unteren und dem oberen Substrat eingebracht werden. Sie könnte hergestellt werden, indem eine doppelseitige Klebefolie aus einem organischen Polymer angedrückt oder das Muster, das in 1 dargestellt ist, im Siebdruckverfahren mit einer Klebstoffschicht aufgebracht wird.
Das Arbeitsprinzip des Probeneinführbestandteils 100 wird im Folgenden ausführlich beschrieben.
Zuerst wird die Probe durch die Kapillarwirkung in die Probeneinführöffnung 101 eingebracht, und die Probeneinführöffnung 101 füllt sich mit der Probe bis zum Leerraum 103, sobald die Probe mit dem Eingang der Probeneinführöffnung 101 in Berührung kommt. Überschüssiges Probenmaterial wird dann weiter zum Luftaustrittskanal 102 transportiert. Hier kann durch Einstellung des Verhältnisses zwischen der Breite des Luftaustrittskanal 102 und der der Probeneinführöffnung 101 auf unter 1:2 die Überfüllung mit Probenmaterial minimiert werden, und durch den hydrophilen Leerraum 103 wird das Phänomen der Ausbildung von Luftblasen vermieden, zu der es am Verbindungspunkt zwischen der Probeneinführöffnung 101 und dem Luftaustrittskanal 102 kommt.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung füllt sich der Probeneinführbestandteil 100 bei einem Probenfassungsvermögen von 0,5 μl in etwa 200 bis 2000 ms, je nach Hämatokritwert, Probenlagerbedingungen und Art des verwendeten gerinnungshemmenden Mittels. Frische Blutproben füllen den Probenahmekanal für 0,5 μl in Abhängigkeit vom Hämatokritwert normalerweise in etwa 200 bis 800 ms.
Der Probeneinführbestandteil 100 der vorliegenden Erfindung kann bei verschiedenen Arten von Biosensoren angewendet werden, einschließlich einem Flachbiosensor (dessen Elektroden nur auf dem unteren Substrat ausgebildet sind), einem umgekehrten Biosensor (dessen Arbeits- und Gegenelektrode separat auf dem unteren und dem oberen Substrat ausgebildet sind), einem Flachbiosensor auf Basis der Differenzstrommessung, einem umgekehrten Biosensor auf Basis der Differenzstrommessung oder einem umgekehrten Biosensor mit einer Elektrode zur Bestimmung der Fluidität.
2 veranschaulicht einen umgekehrten Biosensor mit einem Probeneinführbestandteil 100, der durch ein unteres Substrat 400 gekennzeichnet ist, auf das eine Arbeitselektrode 104 und ein Elektrodenkontakt 106 aufgedruckt sind, und eine Oxidase und ein Elektronentransfermediator auf der Arbeitselektrode 104 immobilisiert sind; eine Probeneinführzwischenlage 200 mit dem Probeneinführbestandteil 100; und das obere Substrat 300, auf dessen Unterseite eine Bezugselektrode 105 und ein Elektrodenkontakt 106 aufgedruckt sind. Der Probeneinführbestandteil 100 kann wie dargestellt ausgebildet sein, jedoch wird der vorliegenden Erfindung entsprochen, solange die Probeneinführöffnung 101 mit dem Luftaustrittskanal 102 in Verbindung steht und der Leerraum 103 am Verbindungspunkt ausgebildet ist; die Struktur des Leerraums 103 kann auch wie vorstehend aufgeführt abgeändert sein.
Die Herstellung des umgekehrten Biosensors mit dem Probeneinführbestandteil 100 kann auf dieselbe Weise wie bei dem Flachbiosensor mit dem Probeneinführbestandteil 100 erfolgen. Wie in 3 dargestellt ist, ist ein umgekehrter Biosensor mit der Möglichkeit zur Bestimmung der Probenfluidität veranschaulicht, der durch das untere Substrat 400 gekennzeichnet ist, auf das eine Arbeitselektrode 104, ein Elektrodenkontakt 106, eine Elektrode zur Bestimmung der Fluidität 107 und die Biosensoridentifizierungselektrode 108 aufgedruckt sind, und eine Oxidase und ein Elektronentransfermediator auf der Arbeitselektrode 104 immobilisiert sind; eine Probeneinführzwischenlage 200 mit dem Probeneinführbestandteil 100; und ein oberes Substrat 300, auf dessen Unterseite eine Bezugselektrode 105 und ein Elektrodenkontakt 106 aufgedruckt sind. Es ist festzuhalten, dass die Bezugselektrode auf dem gesamten oberen Substrat aufgedruckt sein kann, mit Ausnahme des Bereichs für das Sichtfenster 301 für den Füllstand der Probe und für das Warenzeichen des Streifens, wodurch sich eine elegantere Erscheinung ergibt. Der Probeneinführbestandteil 100 kann wie dargestellt ausgebildet sein, jedoch wird der vorliegenden Erfindung entsprochen, solange die Probeneinführöffnung 101 mit dem Luftaustrittskanal 102 in Verbindung steht und der Leerraum 103 am Verbindungspunkt ausgebildet ist; die Struktur des Leerraums 103 kann auch wie vorstehend aufgeführt abgeändert sein. Die Fluidität einer Probe wird in Abhängigkeit von der Probeneinfüllgeschwindigkeit zwischen dem ersten Berührungspunkt mit der Elektrode 105 nahe dem Probeneinführeingang und der Elektrode zur Bestimmung der Fluidität 107 ermittelt, die sich entweder am Leerraum 103 oder am Luftaustrittskanal 102 befindet.
Das untere und das obere Substrat zur Verwendung in den zuvor beschriebenen Biosensoren können aus Keramik, Glas oder Polymerwerkstoffen bestehen, mit Bevorzugung eines organischen Polymers von Polyester, Polyvinylchlorid oder Polycarbonat. Die Herstellung der Elektroden wie der Bezugselektroden, Arbeitselektroden und Hilfselektroden kann unter Verwendung eines leitfähigen Materials erfolgen, z.B. Silber-Epoxid, Silber/Silberchlorid, Kohlenstoff, Redoxpaaren oder einer modifizierten leitfähigen Kohlenstoffpaste, die ein Harz als Bindemittel enthält. Aus diesen Stoffen können die Bezugs-, die Gegen- und die Arbeitselektrode im Siebdruckverfahren, mit einem Aufdampfverfahren mit anschließendem Ätzen oder durch Ankleben eines leitfähigen Streifens hergestellt werden.
Die zuvor beschriebenen Biosensoren mit dem Probeneinführbestandteil 100 besitzen mehrere Vorteile.

(1) Das Phänomen der Ausbildung von Luftblasen, zu der es am Verbindungspunkt zwischen der Probeneinführöffnung und dem Luftaustrittskanal kommt, wird unterbunden, während die Probe schnell in den Biosensor eingeführt wird.
(2) Da der Probeneinführbestandteil 100 vom schmalen Eingang und dem Luftaustrittskanal umschlossen wird, halten die Biosensoren der vorliegenden Erfindung bei minimaler Verdampfung eine gleichmäßige Probenkonzentration aufrecht, wodurch die analytische Reproduzierbarkeit verbessert wird. Außerdem ist die Probe bei der vorliegenden Erfindung besser aufgenommen als bei anderen Arten von Probeneinführanordnungen, wenn die Streifen in Geräte eingepasst und daraus entnommen werden, wodurch die Möglichkeit von Verunreinigungen erheblich verringert wird.
(3) Die Biosensoren, die mit dem Probeneinführbestandteil 100 ausgestattet sind, in dem die Probeneinführöffnung und der Luftaustrittskanal ungefähr senkrecht miteinander in Verbindung stehen, können eine vorher festgelegte Menge entnommenen Bluts schnell einbringen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit verbessern.
(4) Mit der vorliegenden Erfindung kann Blut einfacher durch die Spitze des Biosensors entnommen werden, wenn sie mit Körperteilen in Berührung gebracht wird.

Die Reagenzschicht wird auf der Arbeitselektrode ausgebildet, indem einfach ein Tropfen (etwa 300 bis 500 nl) der Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung abgegeben wird. Die Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung enthält ein Enzym (Oxidase, Esterase oder Dehydrogenase) für den Zielanalyten, einen Elektronentransfermediator, verschiedene wasserlösliche Polymere und Mittel zur Herabsetzung des störenden Einflusses zellulärer Blutbestandteile.
Für das Biosensorsystem für die Messung des Blutzuckers kann Glucoseoxidase oder Glucosedehydrogenase verwendet werden. Es sollte sich hierbei verstehen, dass die vorliegende Erfindung, auch wenn sie für Biosensoren zur Analyse des Blutzuckerspiegels beschrieben ist, entsprechende Enzyme und Elektronentransfermediatoren in das Elektrodensystem einbringen kann, so dass verschiedene Proben quantitativ analysiert werden können, einschließlich Biomaterialien wie Metabolite, z.B. Cholesterin, Lactat, Creatinin, Proteine, Wasserstoffperoxid, Alkohole, Aminosäuren und Enzyme, z.B. GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase) und GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase), Umweltstoffe, Stoffe in Landwirtschaft und Industrie sowie Lebensmittelinhaltsstoffe. Beispielsweise können Cholesterin, Lactat, Glutamat, Wasserstoffperoxid und Alkohol unter Verwendung von Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Cholesterinoxidase, Glutamatoxidase, Meerrettichperoxidase beziehungsweise Alkoholoxidase quantitativ analysiert werden.
Der Elektronentransfermediator, der für die Arbeitselektrode vorgesehen ist, kann Ferrocen oder seine Abkömmlinge, Chinon oder seine Abkömmlinge, organische Leitsalze oder Viologen verwenden. Vorzugsweise ist der Elektronentransfermediator eine Verbindung mit gemischter Valenz, die Redoxpaare bilden kann, einschließlich Hexaaminruthenium(III)-chlorid, Kaliumferricyanid, Kaliumferrocyanid, Dimethylferrocen, Ferricinium, Ferrocenmonocarbonsäure, 7,7,8,8-Tetracyanochinodimethan, Tetrathiafulvalen, Nickelocen, N-Methylacridinium, Tetrathiatetracen, N-Methylphenazinium, Hydrochinon, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, 2-Methoxy-4-allylphenol, 4-Aminoantipyrin, Dimethylanilin, 4-Aminoantipyren, 4-Methoxynaphthol, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat], o-Dianisidin, o-Toluidin, 2,4-Dichlorphenol, 4-Aminophenazon, Benzidin und Berliner Blau. Von diesen ist für das vorgeschlagene Biosensorsystem Hexaaminruthenium(III)-chlorid ein bevorzugter Elektronentransfermediator, da er verschiedene Bedingungen erfüllt: (1) sowohl der oxidierte als auch der reduzierte Zustand in wässriger Lösung ist stabil und reversibel; (2) der reduzierte Elektronentransfermediator ist reaktionsunfähig gegenüber Sauerstoff; (3) sein Realpotenzial ist niedrig genug, um den Einfluss von Störsubstanzen wie Ascorbinsäure, Harnsäure und Paracetamol zu minimieren; (4) die Oxidation des reduzierten Elektronentransfermediators ist nicht pH-empfindlich und (5) er reagiert nicht mit elektrochemisch störenden Substanzen wie Ascorbinsäure, Paracetamol und Harnsäure.
Wasserlösliche Moleküle (0,1 bis 10 Gew.-% der festen Komponenten vor dem Auflösen in physiologischem Phosphatpuffer, pH 6,5) werden aus wasserlöslichen Polymeren ausgewählt, wobei die Gruppe aus Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Perfluorsulfonat, Hydroxyethylcellulose (HEC), Hydroxypropylcellulose (HPC), Carboxymethylcellulose (CMC), Celluloseacetat, Polyamid usw. besteht. Die wasserlöslichen Moleküle werden der Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung zugesetzt, um zum Dispergieren oder Stabilisieren des Enzyms beizutragen. PVP und HPC werden für die Herstellung der Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Eine Fettsäure mit einer linearen Alkylkette von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen kann in Wasser oder einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst und in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-% aller festen Komponenten der Reagenzlösung zugesetzt werden. Die Verwendung einer gesättigten Fettsäure oder ihres Salzes mit einer Alkylkette von 6 bis 12 Kohlenstoffatomen wird bevorzugt: dazu gehören Hexansäure, Heptansäure, Octansäure, Nonansäure, Decansäure, Undecansäure und Dodecansäure. Die Zugabe einer Fettsäure trägt in großem Maße dazu bei, die vom Hämatokritwert abhängige Abweichung zu verringern. Andererseits neigt die Fettsäure dazu, den linearen dynamischen Bereich eines Biosensors zu verkürzen, insbesondere im Bereich hoher Konzentrationen.
Mit dem quartären Ammoniumsalz wie den Halogenidverbindungen von Dodecyltrimethylammonium, Tetradecyltrimethylammonium, Hexadecyltrimethylammonium, Octadecyltrimethylammonium, Tetrahexylammonium usw. und der Fettsäure wird das Problem beseitigt, während gleichzeitig die vom Hämatokritwert abhängige Abweichung wesentlich verringert wird. Die quartären Ammoniumsalze werden der Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung in einer Menge von 0,1 bis 30 Gew.-% aller Komponenten zugesetzt.
Mit den folgenden Beispielen, die die vorliegende Erfindung veranschaulichen sollen, jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung ausgelegt werden sollen, kann die vorliegende Erfindung besser verstanden werden.
Beispiel 1: Herstellung der Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung ohne Fettsäure
Ein Gemisch aus 30 mg Hexaaminruthenium(III)-chlorid (41,6 Gew.-%), 1 mg Carboxymethylcellulose (1,4 Gew.-%), 1 mg Triton X-100 (1,4 Gew.-%) und 40 mg Glucoseoxidase (55,6 Gew.-%) wurde in 1 ml physiologischer Phosphatpufferlösung (pH 6,5) (pH 6,4) gelöst und filtriert, um Teilchen zu entfernen, die in der Lösung geblieben waren. Die Reagenzlösung wurde in die Spritze eines pneumatischen Dosiergeräts (EFD XL100) gegeben.
Beispiel 2: Herstellung der Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung mit Fettsäure
Ein Gemisch aus 30 mg Hexaaminruthenium(III)-chlorid (23,6 Gew.-%), 1 mg Carboxymethylcellulose (0,8 Gew.-%), 5 mg Polyvinylpyrrolidon (4 Gew.-%), 1 mg Triton X-100 (0,8 Gew.-%), 20 mg Dodecansäure (15,7 Gew.-%), 30 mg Tetradecyltrimethylammoniumbromid (23,6 Gew.-%) und 40 mg Glucoseoxidase (31,5 Gew.-%) wurde in 1 ml physiologischer Phosphatpufferlösung (pH 6,4) gelöst und filtriert, um Teilchen zu entfernen, die in der Lösung geblieben waren. Die Reagenzlösung wurde in die Spritze eines pneumatischen Dosiergeräts (EFD XL100) gegeben.
Beispiel 3: Herstellung eines umgekehrten Biosensors mit zwei Elektroden
Wie in 2 dargestellt ist, wurden eine Arbeitselektrode 104 und ein Elektrodenkontakt 106 mit einer leitfähigen Kohlenstoffpaste im Siebdruckverfahren hergestellt und fünf Minuten lang bei 140°C getrocknet. Anschließend wurde an einem Ende des Elektrodenkontakts 106 mit der Silberpaste im Siebdruckverfahren ein Anschluss hergestellt. Das obere Substrat mit der aufgedruckten Elektrode als Bezugselektrode (Hilfselektrode) 105 wurde im Siebdruck verfahren mit Kohlenstoffpaste versehen und getrocknet. Schließlich wurde der Biosensor so hergestellt, dass das Ende der Bezugselektrode 105 im Siebdruckverfahren mit Silberpaste versehen wurde und so den Anschluss darstellte.
Die Zwischenlage 200 zum Einführen der Probe, die die Probeneinführöffnung 101, den Luftaustrittskanal 102 und den Leerraum 103 umfasst, wurde durch Aufdrücken eines doppelseitigen Bands aus Polyester auf dem unteren Substrat platziert. Das Verhältnis zwischen der Breite des Luftaustrittskanals 102 und der der Probeneinführöffnung 101 betrug 2:1 und die Gesamtmenge des entnommenen Bluts im Probeneinführbestandteil 100 wurde auf 0,5 μl eingestellt.
Die Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung von Beispiel 1 oder Beispiel 2 wurde auf die Arbeitselektrode 104 aufgetragen und dreißig Minuten bei 45°C trocknen gelassen.
Die Fertigstellung des Biosensors, der in 2 dargestellt ist, erfolgte durch Aufdrücken des oberen Substrats 300 auf die Zwischenlage 200 zum Einführen der Probe, um eine Verbindung mit dem Anschluss des unteren Substrats 400 herzustellen, auf das das Reagenz aufgebracht wurde.
Beispiel 4: Herstellung eines Biosensors mit einer Elektrode zur Bestimmung der Fluidität
Der Biosensor mit einer Elektrode zur Bestimmung der Fluidität 107 war der umgekehrte Biosensor, der auf dieselbe Weise hergestellt wurde, wie in Beispiel 3 dargestellt ist, mit der Ausnahme, dass die Gegenelektrode über das gesamte obere Substrat gedruckt wurde (3). Die Spitze der Elektrode zur Bestimmung der Fluidität wurde am Leerraum 103 des Probeneinführbestandteils platziert.
Die Lösung der Reagenzschichtzusammensetzung von Beispiel 1 oder Beispiel 2 wurde auf die Arbeitselektrode 104 aufgetragen und dreißig Minuten bei 45°C trocknen gelassen.
Die Fertigstellung des Biosensors, der in 2 dargestellt ist, erfolgte durch Aufdrücken des oberen Substrats 300 auf die Zwischenlage 200 zum Einführen der Probe, um eine Verbindung mit dem Anschluss des unteren Substrats 400 herzustellen, auf das das Reagenz aufgebracht wurde.
<Versuchsbeispiel 1> Einfluss von Störsubstanzen auf einen umgekehrten Glucosesensor
Der Einfluss von Störsubstanzen wie Ascorbinsäure, Paracetamol oder Harnsäure auf einen umgekehrten Glucosesensor, der so hergestellt wurde, wie in Beispiel 3 dargestellt ist, wurde mit dem folgenden Experiment gemessen. Das mittlere Volumen des Glucosesensors betrug 0,5 μl.
Insbesondere wurden die Gesamtreaktionsströme für (a) Standardlösungen mit Phosphatpuffer (pH 6,4) (pH 7,4) und 177 mg/dl Glucose, (b) eine Phosphatpufferlösung mit 177 mg/dl Glucose + 660 μM Paracetamol, (c) eine Phosphatpufferlösung mit 177 mg/dl Glucose + 570 μM Ascorbinsäure beziehungsweise (d) eine Phosphatpufferlösung mit 177 mg/dl Glucose + 916 μM Harnsäure gemessen. Die Ströme wurden gemessen, indem die chronoamperometrische Reaktion 5 Sekunden nach Anlegen des Potenzials von +0,2 V an die Arbeitselektrode 104 (gegen die Bezugselektrode) abgelesen wurde. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
4 zeigt, dass die Sensoren bei einem angelegten Potenzial von +0,2 V unerheblich von der Gegenwart von Störsubstanzen beeinflusst werden.
<Versuchsbeispiel 2> Kalibrationskurve eines umgekehrten Glucosesensors für Glucosestandardlösungen
Der umgekehrte Glucosesensor, der in Beispiel 3 hergestellt wurde, wurde mit Glucosestandardlösungen auf die Empfindlichkeit hin untersucht.
Insbesondere wurden Stromwerte bei jeder Konzentration 0, 50, 150, 300, 450 oder 600 mg/dl zehnmal im elektrischen Feld eines angelegten Potenzials von 0,2 V in Bezug auf die Bezugselektrode gemessen. Die Probenmenge, die am Probeneinführbestandteil eingesetzt wurde, betrug 0,5 μl, und die Füllzeit betrug nicht über 200 ms. Die Messungen wurden 2 Sekunden nach Einbringen der Probe durchgeführt, indem drei Sekunden lang 0,2 V angelegt wurden, und die Stromwerte in 5 Sekunden abgelesen wurden. Die so gewonnene Kalibrationskurve ist in 5 dargestellt.
Die so gewonnenen dynamischen Kurven sind in 6 dargestellt, wobei die einzelnen Kurven Glucosekonzentrationen von 0 mg/dl (Kurve a), 50 mg/dl (Kurve b), 150 mg/dl (Kurve c), 300 mg/dl (Kurve d), 450 mg/dl (Kurve e) und 600 mg/dl (Kurve f) zeigen. Wie in 5 dargestellt ist, betrug der Anstieg 0,093 [μA/(mg/dl)] und der Korrelationskoeffizient 0,997. Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass der elektrochemische Biosensor eine ausgezeichnete lineare Empfindlichkeit aufwies (5).
<Versuchsbeispiel 3> Messung der Blutfluidität und Korrektur der hämatokritbedingten Abweichung
Der Biosensor, der mit einer Elektrode zur Bestimmung der Fluidität ausgestattet ist, wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Ein Potenzial von 200 mV wurde an der Arbeitselektrode 104 und der Elektrode zur Bestimmung der Fluidität 107 (gegen die Bezugselektrode 105) angelegt. Werden Blutproben durch die Probeneinführöffnung 101 eingebracht, wird eine plötzliche Stromänderung nachgewiesen und die Zeitmessung beginnt. Sobald die Probe den Leerraum 103 erreicht, wird der zweite Stromstoß nachgewiesen und der Zeitraum zwischen dem ersten und dem zweiten Stromstoß wird aufgezeichnet. Das Verhältnis zwischen der Probeneinführzeit und dem Hämatokritwert ist in 7 dargestellt. Der Versuch wurde mit Vollblut durchgeführt, das mit Natriumfluorid behandelt wurde, 180 mg/dl Glucose enthielt und unterschiedliche Hämatokritwerte aufwies.
Die Ausgleichungsgleichung wurde mit dem vorstehenden Ergebnis erhalten.
[mathematische Formel 1]

Y = –72,23 + 0,58691 X – 0,00084073 X2 – 1,1211 × 10–6 X3 + 5,7521 × 10–9 X4 – 9,1172 × 10–12 X5,wobei Y der Hämatokritwert ist, der anhand der Probenfülldauer X geschätzt wurde, die mit der Elektrode zur Bestimmung der Fluidität gemessen wurde.

Tabelle 1 zeigt den Hämatokritwert, der anhand der Geschwindigkeit der Probenfülldauer geschätzt wurde. Tabelle 1. Hämatokritwert, der anhand der Probenfülldauer bei dem Biosensor geschätzt wurde, der in Beispiel 4 hergestellt wurde.
In einem separaten Versuch wurden mit dem Vollblut bei verschiedenen Hämatokritwerten Kalibrationskurven erhalten und das Verhältnis zwischen dem Hämatokritwert und der Steigung der Reaktion wurde in eine Formel gebracht (Tabelle 2). Tabelle 2. Kalibrationskurven bei verschiedenen Hämatokritwerten
Die auf diese Weise abgeleiteten Korrekturfaktoren wurden zur Neukalibrierung des gemessenen Glucosewerts in Bezug auf das Vollblut mit einem Hämatokritwert von 40% verwendet, was zu den Biosensoren führt, die vom Hämatokrit unabhängige Glucosekonzentrationen liefern. Das Messgerät erfasst zunächst die Geschwindigkeit der Probeneinführung und bestimmt den Hämatokritwert in der Blutprobe, sucht die Tabelle mit den entsprechenden Kalibrationskurven und bestimmt den Glucosewert aus den gemessenen Strömen. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse des Versuchs, der wie dargestellt durchgeführt wurde. Tabelle 3. Glucosekonzentration in Vollblut; Probeneinführgeschwindigkeit (gemessen mit der Elektrode zur Bestimmung der Fluidität) und Kalibrationskurve in Tabelle 2 wurden zur Bestimmung des Glucosewerts im Vollblut verwendet
Die Elektrode zur Bestimmung der Fluidität unterscheidet auch Blutproben mit ungewöhnlicher Fluidität, d. h. Proben mit zu hohem oder zu geringem Hämatokritwert sowie die fehlerhafte Einführung von Blutproben durch Entstehung von Luftblasen. In diesen Fällen kann eine Messeinrichtung so programmiert werden, dass sie für die Messung eine Warnmeldung oder einen Fehlercode ausgibt.
<Versuchsbeispiel 4> Verringerter störender Einfluss des Hämatokritwerts durch fettsäurehaltige Reagenzschicht
Biosensorstreifen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Mit Heparin behandelte Vollblutproben wurden zentrifugiert, um das Plasma und die zellulären Bestandteile abzutrennen, und erneut gemischt, um Blutproben mit drei verschiedenen Hämatokritwerten (20, 40 und 60%) zu erhalten. Die Auswirkung des Hämatokritwerts auf die Glucosemessung wurde bei drei verschiedenen Glucosekonzentrationen mit den Biosensoren beurteilt, die mit der Reagenzschicht von Beispiel 1 und Beispiel 2 hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und 5 aufgeführt. Es ist offenkundig, dass die Auswirkung des Hämatokrits bei den Biosensoren, die mit der Reagenz von Beispiel 2 hergestellt wurden, merklich geringer ist, wodurch ein relativer Fehler bei einem Hämatokritwert von 40% vorliegt, der innerhalb des klinisch akzeptablen Bereichs liegt. Tabelle 4. Auswirkung des Hämatokrits auf Glucosemessung mit den Biosensoren, die mit der Reagenzschicht von Beispiel 1 hergestellt wurden

* % Abweichung in Bezug auf Hämatokritwert von 40% = {(Glucosewert mit Biosensor/Glucosewert mit YSI)/(Glucosewert mit Biosensor bei Hämatokritwert von 40%/Glucosewert mit YSI bei Hämatokritwert von 40%) – 1} × 100

Die Ergebnisse, die in Tabelle 5 zusammengefasst sind, zeigen, dass der Biosensor auf Basis der Reagenzien von Beispiel 2 wesentlich geringere Störreaktionen auf unterschiedliche Hämatokritwerte (von 20% bis 60%) aufweist, deren Messabweichungen in Bezug auf einen Hämatokritwert von 40% unter 10% liegen.

Claims

Elektrochemischer Biosensor zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass der elektrochemische Biosensor Folgendes umfasst: ein unteres Substrat; ein oberes Substrat; eine Arbeitselektrode und eine Bezugselektrode (oder Gegenelektrode), die jeweils entweder an dem unteren Substrat oder dem oberen Substrat ausgebildet sind; eine Reaktionsschicht, die ein Enzym, einen Elektronentransfermediator, wasserlösliche Polymere, eine Fettsäure oder ihr Salz und ein quartäres Ammoniumsalz enthält und über der Arbeitselektrode ausgebildet ist; und eine Zwischenlage, die zwischen dem unteren und dem oberen Substrat ausgebildet ist, wobei die Zwischenlage mit einer Ausschnittstruktur einer Probeneinführöffnung, einem Luftaustrittskanal und einem Leerraum an der Kreuzungsstelle von Probeneinführöffnung und Luftaustrittskanal versehen ist.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Arbeitselektrode und die Bezugselektrode an demselben Substrat ausgebildet sind.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Arbeitselektrode und die Bezugselektrode an den verschiedenen Substraten ausgebildet sind.
Biosensor nach Anspruch 1, ferner umfassend an dem unteren Substrat eine Elektrode zur Bestimmung der Fluidität.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Fettsäure oder ihr Salz eine Alkylkette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen aufweist und in einem Bereich von 0,1 bis 20 Gew.-% aller Komponenten zugesetzt wird.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Fettsäure aus der Gruppe bestehend aus gesättigter Fettsäure, Hexansäure, Heptansäure, Octansäure, Nonansäure, Decansäure, Undecansäure, Dodecansäure, Tridecansäure, Tetradecansäure, Pentadecansäure, Hexadecansäure, Heptadecansäure, Octadecansäure, Nonadecansäure und Eicosansäure ausgewählt wird.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Fettsäure die Wirkung der Reduzierung der sich aus den Hämatokriten ergebenden Messabweichung zur Folge hat.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Reaktionsschicht quartäres Ammoniumsalz zu 0,1–30 Gew.-% aller Komponenten enthält.
Biosensor nach Anspruch 8, wobei das quartäre Ammoniumsalz aus der Gruppe bestehend aus Halogenidverbindungen von Dodecyltrimethylammonium, Tetradecyltrimethylammonium, Hexadecyltrimethylammonium, Octadecyltrimethylammonium und Tetrahexylammonium ausgewählt wird.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase, Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Lactatoxidase, Ascorbinsäureoxidase, Alkoholoxidase, Alkoholdehydrogenase und Bilirubinoxidase ausgewählt wird.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei der Elektronentransfermediator aus der Gruppe bestehend aus Hexaaminruthenium(III)-chlorid, Kaliumferricyanid, Kaliumferrocyanid, Dimethylferrocen, Ferricinium, Ferrocenmonocarbonsäure, 7,7,8,8-Tetracyanochinodimethan, Tetrathiafulvalen, Nickelocen, N-Methylacridinium, Tetrathiatetracen, N-Methylphenazinium, Hydrochinon, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, 2-Methoxy-4-allylphenol, 4-Aminoantipyrin, Dimethylanilin, 4-Aminoantipyren, 4-Methoxynaphthol, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat], o-Dianisidin, o-Toluidin, 2,4-Dichlorphenol, 4-Aminophenazon, Benzidin und Berliner Blau ausgewählt wird.
Biosensor nach Anspruch 11, wobei der Elektronentransfermediator Hexaaminruthenium(III)-chlorid ist.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die wasserlöslichen Polymere zum Dispergieren und Stabilisieren des Enzyms verwendet werden und aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Perfluorsulfonat, Hydroxyethylcellulose (HEC), Hydroxypropylcellulose (HPC), Carboxymethylcellulose (CMC), Celluloseacetat, Dextran und Polyamid ausgewählt werden.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis zwischen der Breite des Luftaustrittskanals und der der Probeneinführöffnung nicht größer als 1:2 ist.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Probeneinführöffnung ein Fassungsvermögen zur Aufnahme von 0,1–1,0 μl flüssiger Probe aufweist.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Probeneinführöffnung den Luftaustrittskanal in einem Winkel von 75–105° kreuzt und der Leerraum von der Kreuzungsstelle zum Öffnungsende ausgebildet ist.
Biosensor nach Anspruch 4, wobei die Elektrode zur Bestimmung der Fluidität zur Korrektur der vom Hämatokritwert abhängigen Messabweichung verwendet wird.
Biosensor nach Anspruch 1, ferner umfassend ein Sichtfenster am oberen Substrat, das über dem Leerraum angeordnet ist.