DE602004013438T2

DE602004013438T2 - Biosensorsystem

Info

Publication number: DE602004013438T2
Application number: DE602004013438T
Authority: DE
Inventors: Joachim Kasielke; Michael Marquant
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2004-03-13
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2024-03-14
Also published as: EP1613955B1; CA2521370C; ES2304608T3; WO2004090533A1; US20060108236A1; JP4381413B2; CA2521370A1; ATE393911T1; JP2006522923A; EP1467206A1; DE602004013438D1; EP1613955A1; US7638033B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein System und auf ein Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyten in einer Blutprobe. Derartige Systeme werden oft als Biosensorsysteme bezeichnet.
Die Konzentration eines medizinisch relevanten Analyten in Blut wird oft mittels eines elektrochemischen Tests bestimmt. Es wird eine hochspezifische Reaktion zwischen dem Analyten und einem Testreagenz, im allgemeinen einem Enzym, durchgeführt, durch die sich die Oxidationsstufe des Enzyms ändert. Die Geschwindigkeit, mit der diese Änderung stattfindet hängt von der Konzentration des Analyten ab. Sie wird mittels einer Ladungsübertragung auf eine feste Elektrode detektiert. Die Geschwindigkeit der Ladungsübertragung an der Elektrode wird bestimmt, in dem man eine Gleichspannung an diese anlegt und den dabei resultierenden Gleichstrom misst. Die Konzentration des Analyten wird aus dieser Strommessung abgeleitet.
Eine typische Reaktionsfolge eines derartigen elektrochemischen Tests ist in 1 dargestellt. Ein Enzym katalysiert eine Oxidation eines Analyten A, wobei ein Analytprodukt P gebildet wird. Gleichzeitig wird das Enzym reduziert von seiner oxidierten Form E_ox zu seiner reduzierten Form E_red. Durch diese hochspezifische enzymatische Reaktion wird ein Elektron von dem Analyt auf das Enzym übertragen. Das Enzym durchläuft einen Zyklus zurück in die oxidierte Form, wobei ein Elektron auf einen Mediator übertragen wird. Dadurch wird der Mediator von seiner oxidierten Form M_ox in seine reduzierte Form M_red überführt. Der Mediator wird durch Übertragung eines Elektrons an eine Festphasenelektrode EL reoxidiert.
Ein sehr wichtiges Beispiel für die Benutzung dieses Testprinzips sind Glucosetests, die vor allem zur Überwachung des Blutzuckerstatus von Diabetikern benötigt werden. Dies ist von größter medizinischer und kommerzieller Bedeutung, weil die Gesundheit von Diabetikern sehr stark davon abhängt, dass zuverlässige und auf einfache Weise generierte Daten ihres Blutglucosespiegels zur Verfügung stehen. Im allgemeinen werden Glucoseoxidase oder Glucosedehydrogenase als Enzyme für Glucosetests verwendet. Übliche Mediatoren sind Ferrocen, Ferrocyanid und Phenylendiamin.
Das wichtigste Anwendungsgebiet der Erfindung sind solche enzymatische amperometrische Tests, vor allem zur Bestimmung von Glucose. Die Erfindung kann jedoch in Verbindung mit jedem amperometrischen Test verwendet werden, der eine Reaktionssequenz einschließt, die folgende Redoxreaktionen umfasst:

A) Eine analytspezifische Redoxreaktion in homogener (flüssiger) Phase, durch die ein Produkt gebildet wird, das bei Anwendung einer geeigneten elektrischen Spannung an einer Festphasenelektrode oxidiert oder reduziert werden kann;
B) eine heterogene Elektrodenreaktion, durch die ein Elektron von dem Produkt der analytspezifischen Reaktion auf die Elektrode übertragen wird, oder von der Elektrode auf das Produkt.

Offensichtlich kann jede dieser Reaktionen eine Mehrzahl von Reaktionsstufen umfassen. Beispielsweise ist die in 1 dargestellte Bildung von M_red über eine Enzymreaktion eine zweistufige analytspezifische Reaktion. Der Mediator ist jedoch nur notwendig, wenn die direkte Übertragung des Enzyms auf die Festphasenelektrode zu langsam ist. Deswegen können – je nach Typ des Enzyms und der verwendeten Elektrode – auch Tests verwendet werden, bei denen kein Mediator eingesetzt wird. Andererseits kann die Erfindung auch in elektrochemischen Tests verwendet werden, die zusätzliche Reaktionsstufen umfassen.
Um die nachfolgende Beschreibung zu vereinfachen, beziehen wir uns im folgenden Text nur auf das Beispiel eines enzymatischen Tests, bei dem die Reaktion A (Vorwärtsreaktion") eine enzymatische Reaktion ist, die zur Bildung eines reduzierten Mediators führt, und bei dem die Reaktion B ("Rückwärtsreaktion") eine Reoxidation des Mediators durch Übertragung von Elektronen auf die Elektrode ist. Dies sollte allerdings nicht als Beschränkung der allgemeinen Anwendbarkeit der Erfindung verstanden werden.
Elektrochemische Tests werden in zahlreichen verschiedenen Ausführungsformen hergestellt, zu denen Elektroden gehören, die zum Eintauchen in die Probenflüssigkeit ausgebildet sind. Die Erfindung ist für verschiedenen derartige Testformate verwendbar, bezieht sich aber insbesondere auf Biosensorsysteme, die disposible (zur einmaligen Verwendung vorgesehene) Analyseelemente und ein Auswerteinstrument umfassen, welches spezifisch zur Auswertung der Analyseelemente des Systems ausgebildet ist. Normalerweise werden die Komponenten des Systems von dem gleichen Hersteller entwickelt und geliefert. Die Analyseelemente enthalten das für den jeweiligen Test erforderliche Reagenzsystem (hier als "Analysereagenz" bezeichnet) und mindestens zwei Elektronen. Das Auswerteinstrument des Systems weist im allgemeinen einen Halter zur Aufnahme eines Biosensors auf. Wenn der Biosensor in den Halter eingesetzt wird, wird ein elektrischer Kontakt zwischen den Elektroden des Biosensors und der Elektronik des Gerätes hergestellt.
Das Analysereagenz kann in einer porösen Matrix enthalten sein, die beispielsweise aus Papier oder einem porösen Kunststoffmaterial besteht, die sich in Kontakt mit den Elektroden befindet und der die Probenflüssigkeit zugeführt wird. In den letzen Jahren hat eine alternative Gestaltung der Analyseelemente zunehmend an Bedeutung gewonnen, bei der sich das Analysereagenz und die Elektroden in einem Kapillarraum befinden. Die Probenflüssigkeit wird einer Öffnung des Kapillarraums zugeführt und mittels Kapillarkräften in den Raum hineingesaugt. Gleichzeitig wird das Analysereagenz aufgelöst und mit der Probenflüssigkeit gemischt, wobei eine Reaktionsflüssigkeit gebildet wird. Bei Kontakt der Reaktionsflüssigkeit mit den Elektroden kann der Analyse-Detektionsstrom gemessen werden, der der Konzentration des Analyten in der Probenflüssigkeit entspricht. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Biosensorsysteme, die einen derartigen "Kapillar-Biosensor" einschließen.
Weitere Einzelheiten über solche Biosensorsysteme können der einschlägigen Literatur entnommen werden. Insbesondere ist in der WO 99/32881 ein Kapillar-Biosensor-System beschrieben und dieses Dokument enthält eine umfangreiche Liste früherer Publikationen, aus der eine erhebliche Menge zusätzlicher technischer Informationen entnommen werden kann.
Probleme werden durch Fehlerquellen verursacht, die das Ausgangssignal des Biosensors beeinflussen. Ein wichtiges Beispiel sind Schwankungen der Konzentration der roten Blutkörperchen, d. h. des Hämatokrit-Wertes, in Vollblut. Dieses Problem wird in folgender Publikation diskutiert:
Tang et al.: "Effects of Different Hematocrit Levels an Glucose Measurement with Handheld Meters for Point-of-Care Testing", Arch Pathol Lab Med, 2000, pp. 1135 to 1140.
Die Autoren weisen darauf hin, dass selbst mit der neuesten Biosensor-Technologie durch in der Praxis vorkommende Variationen des Hämatokrit-Wertes Fehler des Glucosewertes verursacht werden können, die in der Größenordnung von 20 bis 30% liegen. Es wird eine Anzahl verschiedener möglicher Mechanismen erwähnt, durch die diese Fehler verursacht sein können. Es wird darauf hingewiesen, dass Lösungen für dieses Problem dringend benötigt werden, jedoch werden keine Mittel beschrieben, durch die der Hämatokrit-Fehler kompensiert werden könnte.
Eine weitere wichtige Fehlerquelle sind Temperaturschwankungen. Amperometrische Tests sind generell in starkem Ausmaß von der Temperatur der Reaktionsflüssigkeit abhängig. Deswegen wird bei manchen Auswertesystemen die Temperatur der Reaktionsflüssigeit sorgfältig auf einen festen Wert geregelt. Bei anderen Systemen wird die Temperatur gemessen und eine Korrekturrechnung durchgeführt, um Temperaturschwankungen zu kompensieren.
Gemäß der oben erwähnten WO 99/32881 wird eine Wechselstrommessung durchgeführt, um eine Korrektur hinsichtlich des kombinierten Effektes der Probentemperatur und des Hämatokrit-Wertes zu erreichen. Zu diesem Zweck wird eine Wechselspannung in dem Frequenzbereich zwischen ungefähr 2 kHz und ungefähr 10 kHz an die Elektroden angelegt und es werden der Realteil und der Imaginärteil der Impedanz des aus dem Biosensor und der Probe bestehenden Systems bestimmt. Daraus werden der Absolutwert und der Phasenwinkel der Impedanz berechnet und es wird ein Korrekturfaktor aus einer Look-up Tabelle ausgelesen, die in dem Instrument gespeichert ist. Dieser Korrekturfaktor wird auf konventionell bestimmte Glucosewerte angewendet, um dadurch eine korrigierte Glucosekonzentration zu ermitteln.
Um eine sehr gute Genauigkeit der ermittelten Konzentration zu erreichen und gleichzeitig die Resultate sehr schnell zu bekommen, wird erfindungsgemäß ein Biosensorsystem für die elektrochemische Bestimmung eines Analyten in einer Probe vorgeschlagen, umfassend ein Analysereagenz und mindestens zwei Elektroden, wobei das Analysereagenz mit der Probe gemischt wird, um eine Reaktionsflüssigkeit zu bilden und die Reaktionsflüssigkeit die beiden Elektroden kontaktiert, um einen der Analytkonzentration in der Probenflüssigkeit entsprechenden Analyse-Detektionsstrom zu messen, der zwischen den Elektroden fließt, wenn an diese eine Gleichspannung angelegt wird, wobei der Analyse-Detektionsstrom für die Analytkonzentration in der Probe charakteristisch ist und dies auf eine in der Reaktionsflüssigkeit stattfindende Folge von Reaktionsschritten zurückzuführen ist, zu denen eine in der Reaktionsflüssigkeit stattfindende analytspezifische Reaktion gehört, sowie eine Elektrodenreaktion, welche einen Transfer von Elektronen durch eine Elektrodenoberfläche einschließt, und eine elektronische Schaltung, die eine Gleichspannungsquelle einschließt, um die erforderliche Gleichspannung an die Elektroden anzulegen und die eine Mess- und Auswerteelektronik einschließt, um eine Mehrzahl von Werten einer Kurve zu messen, die den Analyse-Detektionsstrom in Abhängigkeit von der Zeit beschreibt und um daraus mittels eines Auswertealgorithmus die Analytkonzentration zu ermitteln, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Gleichspannung während der analytspezifischen Reaktion an die Elektroden angelegt wird, so dass die analytspezifische Reaktion und die Elektrodenreaktion simultan stattfinden, wobei eine Kurve des Analyse-Detektionsstromes in Abhängigkeit von der Zeit resultiert, welche einen Abschnitt aufweist, in dem der Strom in Abhängigkeit von der Zeit (als Folge der Kinetik der analytspezifischen Reaktion und Kinetik der Elektrodenreaktion) ansteigt, der Analyse-Detektionsstrom zu mindestens zwei Zeitpunkten innerhalb des ansteigenden Abschnitts gemessen wird, und die Werte des Analyse-Detektionsstroms, die bei den mindestens zwei Messungen gewonnen werden, in dem Auswertealgorithmus dazu verwendet werden, Temperaturfehler zu kompensieren. Auch ein entsprechendes Verfahren wird vorgeschlagen.
Die Erfinder haben festgestellt, dass eine schnelle und genaue Fehlerkompensation erreicht werden kann, indem man Strom-Messwerte verwendet, die in einem sehr frühen Abschnitt der Analysereaktion gemessen wurden. Dies wird durch die nachfolgende Beschreibung in Verbindung mit den Kurven zusätzlich verdeutlicht. Es zeigen:
1 eine graphische Darstellung einer typischen Analysereaktionsfolge,
2 eine graphische Darstellung einer Gleichstrommessung in Abhängigkeit von der Zeit bei einem Test gemäß dem Stand der Technik,
3 eine graphische Darstellung einer Gleichstrommessung in Abhängigkeit von der Zeit bei einem erfindungsgemäßen Test,
4 eine graphische Darstellung, welche 3 entspricht, für die gleiche Analytkonzentration aber eine Mehrzahl unterschiedlicher Temperaturen und Hämatokrit-Werte in der Reaktionsflüssigkeit.
5 Eine graphische Darstellung entsprechend 4 aber mit einer normalisierten Zeitachse,
6 eine graphische Darstellung einer Wechselstrommessung in Abhängigkeit von der Zeit für die gleiche Analytkonzentration, aber eine Mehrzahl von verschiedenen Temperaturen und Hämatokrit-Werten der Reaktionsflüssigkeit,
7 eine graphische Darstellung, die 5 entspricht, aber mit einer linearen Transformation der Stromwerte,
8 die Komponenten eines typischen Biosensorsystems, auf das sich die Erfindung bezieht, in Aufsicht,
9 ein schematisches Diagramm von Teilen einer bevorzugten elektronischen Schaltung,
10 eine kombinierte Darstellung von Gleichstrommessungen und Wechselstrommessungen, die mit der Schaltung von 9 durchgeführt wurden.
1 wurde bereits beschrieben.
2 wurde dem US-Patent 5,243,516 entnommen und zeigt ein typisches Beispiel des zeitlichen Ablaufes bei Tests gemäß dem Stand der Technik. Nachdem ein Analyseelement in das Auswerteinstrument eingesteckt wurde wird eine Probendetektionsspannung an die Elektroden angelegt. Solange sich in einem Probenbereich des Analyseelementes keine Probe befindet, die die Elektroden überbrückt, fließt kein Strom. Sobald jedoch der Probenbereich gefüllt wird, wird eine Stromspitze CS gemessen, durch die angezeigt wird, dass ein Tropfen Probenflüssigkeit dem Analyseelement zudosiert wurde und die Elektroden überbrückt. Dieser Zeitpunkt wird bezeichnet als "Dose Detect" (DD). Nachdem die Stromspitze CS gemessen wurde, wird die Probendetektionsspannung von den Elektroden getrennt und es findet in einer Inkubationsperiode IP die analytspezifische Vorwärtsreaktion statt. Nachdem die Vorwärtsreaktion stattgefunden hat, wird eine Analysespannung, die für die Elektrodenreaktion (Rückwärtsreaktion) geeignet ist, an die Elektroden angelegt. In 2 sind typische Formen der resultierenden funktionalen Abhängigkeit I(t) des Stromes I gegen die Zeit für vier verschiedenen Werte der Glucosekonzentration dargestellt, wobei diese Werte in der Figur angegeben sind. Diese Kurven der Gleichstrommessung gegen die Zeit werden nachfolgend als "I(t)-Spuren" bezeichnet.
Wenn der Test im Rahmen der erforderlichen Testbedingungen abläuft, entspricht die Form der I(t)-Spuren (nach einer Anstiegszeit ST, in der die I(t)-Spuren hauptsächlich von den Besonderheiten der Messelektronik abhängen) einer charakteristischen Funktion, die proportional ist zu 1/√t. Eine Abweichung von dieser "Cottrell Stromkurve" ist ein Zeichen dafür, dass die erforderlichen Testbedingungen nicht eingehalten wurden. In dem US-Patent 5,243,516 wird vorgeschlagen, eine Mehrzahl von Strommessungen zu einer Mehrzahl von Messzeitpunkten durchzuführen, welche in der Zeitspanne liegen, in der die Rückwärtsreaktion stattfindet, und eine einfache mathematische Methode zu verwenden, um zu kontrollieren, ob die I(t)-Spuren, wie in 2 dargestellt, dem Cottrellstrom entsprechen. Falls dies nicht der Fall ist, wird eine Fehlfunktion des Systems angenommen und angezeigt.
3 zeigt die typische Form eine I(t)-Spur, die resultiert, wenn die Analysespannung (für die Elektrodenreaktion, "Rückwärtsreaktion", erforderliche Gleichspannung) nicht am Ende einer für die analytspezifische Vorwärtsreaktion erforderlichen Inkubationsperiode angelegt wird, sondern zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt (vorzugsweise bei "Dose Detect" oder innerhalb höchstens 500 Millisekunden, vorzugsweise höchstens 300 Millisekunden und besonders bevorzugt höchstens 100 Millisekunden danach). Zweckmäßigerweise wird keine spezielle Probendetektionsspannung verwendet, sondern die Analysespannung wird schon angelegt, bevor die Probe mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird.
Die in 3 dargestellter Form der I(t)-Spuren resultiert aus einer ziemlich komplizierten Kombination einer Mehrzahl von Einflussfaktoren. Sie hängt insbesondere von der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion ab, die ihrerseits nicht nur von der Konzentration des Analyten, sondern auch von einer Mehrzahl potentieller Störfaktoren abhängt, wie beispielsweise der Temperatur, der Diffusion der Recktanten (die ihrerseits beeinflusst wird von der Temperatur und der Gegenwart von Partikeln, insbesondere Blutkörperchen, in der Probe). Das bei der enzymatischen Reaktion erzeugte Produkt wird gleichzeitig durch die Elektrodenreaktion (Rückwärtsreaktion) verbraucht, die ebenfalls von einer Mehrzahl von Faktoren beeinflusst wird, hauptsächlich von der Konzentration des Reaktionsproduktes der enzymatischen Reaktion in der Nachbarschaft der Elektrodenoberfläche, wobei diese wiederum von den Diffusionsbedingungen in der Probenflüssigkeit abhängt. Jedenfalls ist es für die Erfindung charakteristisch, dass die I(t)-Spuren einen Anfangsabschnitt aufweisen, in welchem der Gleichstrom gegen die Zeit ansteigt. Dieser Abschnitt wird als Anstiegsabschnitt (Rising Section) RS bezeichnet.
Es ist darauf hinzuweisen, dass in der Praxis eine I(t)-Spur eine kompliziertere Form haben kann, die von Einzelheiten des Experiments abhängt. Insbesondere kann es sein, dass der Abschnitt der Spur nach dem Anlegen der Analysespannung nicht monoton ansteigt. Vielmehr kann ein Zwischenmaximum vorhanden sein, wie es in 3 als gestrichelte Linie dargestellt ist. Eine solche Form resultiert jedoch nicht aus der beschriebenen Reaktionssequenz sondern aus dem Einschaltverhalten (transient behaviour) des experimentellen Aufbaus, insbesondere der Messelektronik. Als Anstiegsabschnitt im Sinne der vorliegenden Erfindung wird der Abschnitt der I(t)-Spur verstanden, der dem Maximum M vorausgeht und eine Folge der Sequenz der Redoxreaktionen ist.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass trotz dieser komplizierten Situation Messungen des Analyse-Detektionsstroms, die zu einem Zeitpunkt innerhalb des Anstiegsabschnittes RS der I(t)-Spur (bevor diese das Maximum M erreicht) gemacht wurden, zur Verbesserung der Qualität des aus der Messung abgeleiteten analytischen Ergebnisses verwendet werden können. Insbesondere ist es durch Messung des Gleichstroms zu mindestens zwei Zeitpunkten innerhalb des Anstiegsabschnittes RS möglich, Fehler zu kompensieren, die durch Variationen der Temperatur der Reaktionsmischung verursacht wurden. Es ist auch möglich, die Analytkonzentration selbst aus Strommessungen innerhalb des Anstiegsabschnittes RS abzuleiten. Zusätzliche Fehlerkorrekturen, insbesondere zur Kompensation von Fehlern, die durch Schwankungen des Hämatokrit-Wertes der Probe verursacht werden, sind möglich, wenn zusätzlich Wechselstrommessungen innerhalb des Anstiegsabschnittes der I(t)-Spur durchgeführt werden. Besonders bevorzugt werden Messungen des Gleichstroms und Messungen des Wechselstroms simultan durchgeführt, d. h. die Messperioden, während deren die Gleichstrommessungen und die Wechselstrommessungen durchgeführt werden, überlappen zumindest teilweise.
Durch die Erfindung werden verbesserte Ergebnisse hinsichtlich der Durchführung analytischer Tests mit hoher Geschwindigkeit und sehr guter analytischer Qualität erreicht. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass Enzyme, die eine hohe Spezifität für den jeweiligen Analyten haben, in der Regel relativ langsam reagieren. Bei der Anwendung klassischer Methoden führt dies zu einer Verlängerung der Inkubationszeit und demzufolge der Zeit, die erforderlich ist, um das analytische Resultat zu erzeugen. Wenn hingegen Enzyme verwendet werden, die hinsichtlich einer kurzen Reaktionszeit optimiert sind, führt dies in der Regel zu einer Verminderung der Spezifität und folglich der Qualität des Tests. Die Erfindung ermöglicht es, beide Anforderungen (hohe Spezifität und schnelle Erzeugung des Testergebnisses) gleichzeitig zu erfüllen.
Die 4 bis 7 zeigen Ergebnisse von Experimenten, die im Zusammenhang mit der Erfindung durchgeführt wurden.
4 zeigt I(t)-Spuren wie in 3, d. h. für den Fall, dass die Analysespannung zum Zeitpunkt Dose Detect anliegt, für eine einzige Glucosekonzentration (500 mg/dl), aber für variierende Werte des Hämatokrit und der Temperatur der Reaktionsflüssigkeit. Die graphische Darstellung zeigt Kurven für drei Hämatokrit-Werte (20%, 45% und 70%) und drei Temperaturen (10°, 25° und 40°C). Die unterschiedlichen I(t)-Spuren unterscheiden sich durch die Benutzung unterschiedlicher Symbole, wie dies in der Spalte auf der rechten Seite der graphischen Darstellung erläutert wird. Die gleichen Symbole werden auch in den 5 und 6 verwendet. Die Daten wurden aus den originalen Strommessungen mittels einer Grundlinien-Korrektur abgeleitet: IBC(t) = Iorg(t) – Cx (t–1/2 × e0,1/t)
Darin bedeuten:

I_BC:: Grundlinien-korrigierter Strom
I_org:: Originalstrom
C:: Empirische Konstante

Durch diese Grundlinien-Korrektur werden Beiträge abgezogen, die durch elektrische Ladungsträger verursacht werden, die in der Probe vorhanden sind, aber nicht in Beziehung zur Glucosekonzentration stehen (t^–1/2-Term) sowie Beiträge, die durch einen Dämpfungseffekt der Elektronik (e^0,1/t -Term) verursacht werden.
Eine weitere Korrektur war in Anbetracht der Tatsache notwendig, dass es nicht möglich ist, Proben herzustellen, die hinsichtlich der Glucosekonzentration und hinsichtlich des Hämatokrit-Wertes exakt die gewünschten Werte einhalten. Vielmehr mussten die Proben hergestellt werden durch Verdünnen verfügbarer Vollblutproben und durch Zugabe von Glucose im erforderlichen Umfang. Dabei ergaben sich geringfügige Abweichungen von den in 4 angegebenen exakten Werten, die durch lineare Regression korrigiert wurden.
4 zeigt die folgenden Charakteristika:

– Jede Kurve schließt einen Anstiegsabschnitt ein, der im Wesentlichen zum Zeitpunkt Dose Detect (Zeitpunkt 0) beginnt und bis zu einem Maximum verläuft.
– Die Position des Maximums auf der Zeitachse hängt von der Temperatur ab. Je höher die Temperatur ist, desto früher tritt das Maximum auf (der Abfall der I(t)-Spur nach dem Maximum ist für die 10°C-Spuren nicht sichtbar, weil es nach der dargestellten maximalen Messzeit (5 sec) auftritt. Es ist jedoch möglich, für jede der Spuren ein Maximum elektronisch zu detektieren.
– Für jede Temperatur führt der Hämatokrit zu einer Verschiebung der I(t)-Spur: Ein Anstieg des Hämatokrit verursacht einen Abfall der gemessenen Stromwerte.

5 zeigt die gleichen Daten wie 4, aber mit einer Zeitskala, die gemäß tnorm = t/tmax normalisiert wurde. Darin bedeutet

t_max:: Zeitpunkt nach Dose Detect, zu dem das Maximum der entsprechenden I(t)-Spur auftritt.

6 zeigt die Ergebnisse von Wechselstrommessungen mit einer Frequenz von 2 kHz, wobei die Messwerte für die gleichen Proben wie in 4 gegen die Zeit aufgetragen sind. Die dargestellte Messgröße ist die Admittanz A (reziproke Größe zur Impedanz Z), gemessen in S (Ohm^–1). Die Kurven zeigen relativ starke anfängliche Schwankungen, die mit dem Übergangsverhalten der Messelektronik zusammenhängen. Nach höchsten zwei Sekunden wird jedoch ein stabiler Wert erreicht, der nur sehr langsam ansteigt, wobei dieser langsame Anstieg auf eine starke Dämpfung der für die Experimente verwendeten Elektronik zurückzuführen ist.
7 zeigt die gleichen Daten wie 5 aber nach einer Transformation der Stromwerte gemäß: Itf = Inorm × (1 + deltaZ × A)darin ist deltaZ berechnet gemäß: deltaZ = (Z–Zmed).
In der Gleichung bedeuten:

Z:: Impedanz zwischen den Elektroden bei einer Wechselstromspannung mit einer Frequenz von 2 kHz zu einem Messzeitpunkt nach den anfänglichen Z-Variationen (z. B. bei 3 sec in 6).
Z_med:: Median der Z-Werte zu diesem Zeitpunkt
A:: Empirisch bestimmter Gewichtungsfaktor, um ein optimales Übereinstimmen der in 7 dargestellten Kurven zu erreichen.

Insgesamt zeigen die 4 bis 7, dass die komplizierte Form der in 4 dargestellten I(t)-Spuren durch relativ einfache mathematische Schritte auf eine im Wesentlichen übereinstimmende Kurve reduziert werden kann, wie sie in 7 dargestellt ist. Mit anderen Worten können die in 4 dargestellten I(t)-Spuren, welche eine nichtlineare Abhängigkeit von der Temperatur und von dem Hämatokrit zeigen, durch eine geeignete Transformation der Zeitachse in I(t)-Spuren transformiert werden, die linear von diesen Störfaktoren abhängen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass – anders als im Stand der Technik angenommen – verlässliche Ergebnisse, einschließlich einer Korrektur solcher Störfaktoren wie Temperatur und Hämatokrit, aus amperometrischen Messungen abgeleitet werden können, bei denen die enzymatische Vorwärtsreaktion simultan mit der Elektrodenreaktion (Rückwärtsreaktion) stattfindet. Es ist nicht nur möglich, sondern sogar vorteilhaft, Strommesswerte aus dem Anstiegsabschnitt der I(t)-Spuren zu verwenden. Dies wiederum ermöglicht eine erhebliche Verminderung der für die Durchführung der Messung erforderlichen Zeit, weil es nicht notwendig ist, eine Inkubationsperiode einzuhalten, um zunächst die Vorwärtsreaktion ablaufen zu lassen, und weil es nicht einmal notwendig ist, zu warten, bis die Vorwärtsreaktion und die Rückwärtsreaktion einen stationären Zustand (bei dem der Mediator mit der gleichen Geschwindigkeit erzeugt wird, wie er verbraucht wird, d. h. seine Konzentration konstant ist) erreicht wird.
Ein einfacher Weg zur Durchführung einer Analyse einer Probe mit einer unbekannten Glucosekonzentration umfasst die folgenden Schritte:

– Es wird eine I(t)-Spur, wie in 3 dargestellt, gemessen.
– Es wird eine Grundlinien-Korrektur durchgeführt.
– t_max wird bestimmt.
– Es wird ein Stromwert zu einem Zeitpunkt gemessen, der einem vorherbestimmten Zeitpunkt auf der normalisierten Zeitachse (z. B. 0,7 × t_max) entspricht und dieser Stromwert wird für die weitere Auswertung verwendet.
– Dieser Stromwert wird auf der Basis einer Wechselstrommessung korrigiert.
– Der resultierende korrigierte Stromwert wird in eine Glucosekonzentration transformiert, wobei die Umrechnung auf einer Kalibration basiert, die für den gleichen Zeitpunkt auf der normalisierten Zeitachse (z. B. 0,7 × t_max) durchgeführt wurde.

Dies ist jedoch nur eine von mehreren Möglichkeiten, erfindungsgemäße Messungen auszuwerten. Die 4 bis 7 zeigen, dass die Form des Anstiegsabschnitts der I(t)-Spuren charakteristisch ist für die Kombination von Einflussfaktoren, welche sowohl eine "Varianz" (die Konzentration des Analyten, z. B. Glucose) umfassen, als auch eine Mehrzahl von "Kovarianzen" (Störfaktoren wie beispielsweise Temperatur und Hämatokrit). Deswegen können die Effekte der Kovarianzen abgetrennt und folglich eliminiert werden, indem man eine Mehrzahl von Gleichstrommesswerten in dem Anstiegsabschnitt der I(t)-Spuren misst und diese Werte in einem geeigneten Algorithmus verwendet.
Statt der beschriebenen mathematisch-analytischen Methode können für diesen Zweck beispielsweise numerische Methoden verwendet werden. Zu solchen numerischen Methoden gehören verschiedene Typen der multivariaten Analyse. Computerprogramme zur Durchführung derartiger Methoden sind kommerziell erhältlich. Sie umfassen im allgemeinen ein Training, welches durch den Hersteller des Biosensorsystems unter Verwendung einer Mehrzahl von Proben mit unterschiedlichen Hämatokrit-Werten und von Messungen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden muss. Die Ergebnisse eines solchen Trainings können dann in das Instrument einprogrammiert werden, um sie während der Analyse von Proben mit unbekannten Glucosewerten und Hämatokrit-Konzentrationen auf der Basis von Messungen bei beliebigen Temperaturen innerhalb des Temperaturbereiches, indem das Training durchgeführt wurde, zu verwenden.
Die Temperaturkorrektur kann im Prinzip auf nur zwei Werten in dem Anstiegsabschnitt der I(t)-Spur basieren. Es ist jedoch bevorzugt, in dem Korrekturalgorithmus eine Information über die Krümmung der I(t)-Spur zu verwenden. Zu diesem Zweck müssen mindestens drei Werte des Analyse-Detektionsstroms zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen werden.
Der Anstiegsabschnitt der I(t)-Spur zeigt eine starke Abhängigkeit von der Messtemperatur. Deshalb sind Werte der I(t)-Spur in diesem Abschnitt besonders wertvoll zur Kompensation von Temperaturfehlern. Im allgemeinen kann der Auswertealgorithmus zusätzlich Messdaten einschließen, die zu einem Zeitpunkt nach dem Maximum der I(t)-Spur gewonnen wurden. Derartige Daten können insbesondere hinsichtlich der Empfindlichkeit bezüglich Änderungen der Analytkonzentration und/oder bezüglich der Qualität der Hämatokrit-Korrektur wertvoll sein. Vorzugsweise wird jedoch die Messung der I(t)-Spur beendet, nachdem das Maximum der I(t)-Spur detektiert wurde. Dies ermöglicht besonders kurze Messzeiten, wenn die Temperatur verhältnismäßig hoch ist (wie beispielsweise Raumtemperatur) und deswegen das Maximum bereits kurze Zeit nach Dose Detect erreicht wird. Wenn andererseits eine Messung bei niedriger Temperatur durchgeführt werden muss (beispielsweise während einer Aktivität des Benutzers, die außer Haus stattfindet) wartet das Instrument bis das Maximum detektiert wurde und ermöglicht dadurch eine Messung mit hoher Genauigkeit, wobei die Messzeit etwas höher, aber dennoch so kurz wie möglich, ist.
Das in 8 dargestellte Biosensorsystem besteht aus disposiblen Analyseelementen 2 und einem Auswerteinstrument 3. Das Auswerteinstrument 3 hat einen Halter 4 zum Aufnehmen und Halten eines Analyseelementes 2. Wenn das Analyseelement 2 in das Auswerteinstrument 3 eingesetzt wird, wird eine elektrische Verbindung hergestellt durch das Zusammenwirken von an dem Analyseelement 2 vorgesehenen elektrischen Kontakten 6 mit entsprechenden (nicht dargestellten) Gegenkontakten des Instrumentes 3.
Das Analyseelement 2 hat eine Reaktionszone 7, die eine Probenzufuhröffnung 8 zum Zuführen eines Tropfens einer Blutprobe aufweist. Von dort erstreckt sich ein (nicht dargestellter) Kapillarraum zu zwei Elektroden 9, 10. Dort enthält der Kapillarraum ein (nicht dargestelltes) Analysereagenz. Die Dimensionen des Kapillarraums sind so gewählt, dass eine mit der Probenzuführöffnung 8 in Kontakt gebrachte Probenflüssigkeit leicht in ihn eindringt, das Analysereagenz löst und beide Elektroden 9 und 10 kontaktiert. Danach finden die beschriebenen Reaktions- und Auswerteschritte statt.
Um die notwendigen elektrischen Messungen durchzuführen und aus den Messwerten die in der Probe enthaltene Analytkonzentration zu ermitteln, enthält das Instrument 3 die erforderliche elektrische Schaltung. Hierzu gehören eine Gleichspannungsquelle, eine Wechselspannungsquelle, Messschaltungen für Gleichstrom- und Wechselstrommessungen und ein mikroprozessorkontrolliertes Auswertesystem, das den Betrieb des Instrumentes kontrolliert und die Schritte des Auswertealgorithmus durchführt, durch die die gewünschte Analytkonzentration aus den gemessenen elektrischen Daten abgeleitet wird. Sowohl hinsichtlich der Chemie und der Gestaltung des Analyseelementes als auch hinsichtlich der Elektronik des Instrumentes 3 ist das System weitgehend konventionell (mit Ausnahme spezieller Merkmale, die hier beschrieben werden). Deswegen ist keine detailliertere Beschreibung notwendig. Vielmehr können weitere Informationen, die von Interesse sein könnten, der entsprechenden Literatur, wie oben zitiert, entnommen werden.
9 ist eine schematische Darstellung der wesentlichen Merkmale einer Elektronik, die sich eignet, gleichzeitig eine Gleichspannung und eine Wechselspannung an die Elektroden eines Biosensors anzulegen und die resultierenden Gleich- und Wechselströme ohne gegenseitige Wechselwirkung zu messen.
Die notwendigen Gleich- und Wechselspannungen werden durch entsprechende Spannungsquellen 20 und 21 erzeugt und an einem Additionspunkt 23 summiert, der mit dem invertierenden Eingang eines Operationsverstärkers 24 verbunden ist, der als Spannungsfolger fungiert. Er liefert an seinem Ausgang eine niederomige Quelle der erforderlichen Gleich- und Wechselspannungen, die über einen Shunt-Widerstand 26 mit einer der Elektroden (nämlich der Elektrode 10) des Analyseelementes 2 verbunden ist. Um eine Überwachung des an der Elektrode 10 anliegenden Spannungssignals zu ermöglichen ist ein Überwachungsausgang 27 vorgesehen.
Der Shunt-Widerstand 26 ist Teil einer Wechselstrom-Messschaltung 25. Der durch den Shunt-Widerstand 26 fließende Strom wird mittels eines Differenzialverstärkers 29 gemessen, dessen Ausgangssignal proportional zu dem Spannungsabfall an dem Shunt-Widerstand 26 und somit zu dem durch diesen fließenden Strom ist. Mittels eines RMS-Moduls 30 (Gleichrichter-Integrator) an dem Ausgang 31 wird ein entsprechender RMS-Wert des Wechselstroms erzeugt, der zwischen den Elektroden 9 und 10 fließt.
Der zwischen den Elektroden 9 und 10 fließende Gleichstrom wird mittels einer separaten Strommessschaltung 32 gemessen, die von der Wechselstrommessschaltung 25 unabhängig ist. Sie umfasst einen weiteren Operationsverstärker 33, der als Strom-Spannungs-Wandler (I/V-Wandler) geschaltet ist und fungiert. Dabei wird das Wechselstromsignal mittel einer geeigneten Filteranordnung herausgefiltert, wobei diese (in der dargestellten Ausführungsform) zwei Kapazitäten 35, 36 umfasst, die parallel zu dem Eingang und parallel zu dem Rückkopplungswiderstand des I/V-Wandlers geschaltet sind. Somit ist der Gleichstromausgang 37 des I/V-Wandlers proportional zu dem Gleichstrom, der zwischen den Elektroden 9 und 10 fließt.
Alle Ausgangssignale 27, 31 und 37 werden digitalisiert und an ein Mikroprozessorsystem des Instrumentes übertragen, um wie beschrieben weiterverarbeitet zu werden.
10 zeigt Messungen, die mit einer Elektronik gemäß 9 gemacht wurden. Die dargestellten I(t)-Spuren beziehen sich auf eine Mehrzahl von verschiedenen Probenlösungen. Die entsprechende Gleichstromskala ist auf der linken Ordinate aufgetragen. Gleichzeitig zeigt 10 Impedanzwerte (rechte Ordinate), die mit einer Wechselstrommessung bestimmt wurden, wobei zwischen einer Mehrzahl unterschiedlicher Frequenzen, wie dargestellt, umgeschaltet wurde. Es wurden wiederum die gleichen Probenlösungen benutzt und entsprechende Messkurven sind mit den gleichen Symbolen markiert. Die Figur zeigt deutlich, dass die Wechselstrommessungen und die Gleichstrommessungen vollständig unabhängig sind. Das Gleichspannungssignal zeigt keine noch so geringe Variation an den Punkten, an denen die Wechselspannungsfrequenz umschaltet und eine entsprechende plötzliche Änderung des Wechselstroms detektiert wurde.

Claims

Biosensorsystem (1) zu elektrochemischen Bestimmungen eines Analyten in einer Probe, umfassend ein Analysereagenz und mindestens zwei Elektroden (9, 10), wobei das System so ausgebildet ist, dass – das Analysereagenz mit der Probe gemischt wird, um eine Reaktionsflüssigkeit zu bilden und – die Reaktionsflüssigkeit die beiden Elektroden kontaktiert, um einen Analyse-Detektionsstrom zu messen, der zwischen den Elektroden fließt, wenn an diese eine Gleichspannung angelegt wird, wobei der Analyse-Detektionsstrom für die Analytkonzentration in der Probe charakteristisch ist und dies auf eine in der Reaktionsflüssigkeit stattfindende Folge von Reaktionsschritten zurückzuführen ist, zu denen eine analytspezifische Reaktion gehört, sowie eine Elektrodenreaktion, welche einen Transfer von Elektronen durch eine Elektrodenoberfläche einschließt, und eine elektronische Schaltung, die eine Gleichspannungsquelle (20) einschließt, um die erforderliche Gleichspannung an die Elektroden anzulegen und die eine Mess- und Auswerteelektronik (25, 32) einschließt, um eine Mehrzahl von Werten einer Kurve zu messen, die den Analyse-Detektionsstrom in Abhängigkeit von der Zeit beschreibt und um daraus mittels eines Auswertealgorithmus die Analytkonzentration zu ermitteln, dadurch gekennzeichnet dass, die elektronische Schaltung dazu ausgebildet ist, – die Gleichspannung während der analytspezifischen Reaktion an die Elektroden anzulegen, so dass die analytspezifische Reaktion und die Elektrodenreaktion simultan stattfinden, wobei eine Kurve des Analyse-Detektionsstromes in Abhängigkeit von der Zeit resultiert, welche einen Abschnitt aufweist, in dem der Strom in Abhängigkeit von der Zeit ansteigt, – der Analyse-Detektionsstrom zu mindestens zwei Zeitpunkten innerhalb des ansteigenden Abschnitts gemessen wird, und – die Werte des Analyse-Detektionsstroms, die bei den mindestens zwei Messungen gewonnen werden, in dem Auswertealgorithmus dazu verwendet werden, Temperaturfehler zu kompensieren.
System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einschließt: Disposible Analyseelemente (2), die das Analysereagenz und die mindestens zwei Elektroden (9, 10) einschließen, und ein Auswerteinstrument (3), das dazu ausgebildet ist, die Analyseelemente (2) auszuwerten und das einen Halter (4) zur Aufnahme eines Analyseelementes (2) sowie elektrische Kontakte aufweist, durch die eine elektrische Verbindung mit einem in den Halter (4) eingesetzten Analyseelement (2) hergestellt wird, durch welche die Elektroden (9, 10) des Analyseelementes (2) mit der elektronischen Schaltung verbunden werden.
Biosensorsystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Analyseelement ein Element des Kapillartyps ist und einen Raum mit kapillaren Abmessungen aufweist, der die Elektroden (9, 10) und das Analysereagenz umfasst.
Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend die Verfahrensschritte: Mischen eines Analysereagenz mit der Probe zur Bildung einer Reaktionsflüssigkeit, kontaktieren der Reaktionsflüssigkeit mit einem Elektrodenpaar, messen einer Mehrzahl von Werten zu einer Mehrzahl von Messzeitpunkten von einer Kurve, die die Abhängigkeit eines Analyse-Detektionsstroms von der Zeit beschreibt, wobei der Analyse-Detektionsstrom zwischen den Elektroden fließt, wenn an diese eine Gleichspannung angelegt wird, der Analyse-Detektionsstrom für die Analytkonzentration in der Probe charakteristisch ist und dies auf eine in der Reaktionsflüssigkeit stattfindende Folge von Reaktionsschritten zurückzuführen ist, zu denen eine analytspezifische Reaktion gehört, sowie eine Elektrodenreaktion, welche einen Transfer von Elektroden durch eine Elektrodenoberfläche einschließt, und ermitteln einer Analysekonzentration mittels eines Auswertealgorithmus, in welchem die Mehrzahl von Werten des Analyse-Detektionsstroms verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Gleichspannung während der analytspezifischen Reaktion an die Elektroden angelegt wird, so dass die analytspezifische Reaktion und die Elektrodenreaktion simultan stattfinden, wobei eine Kurve des Analyse-Detektionsstromes in Abhängigkeit von der Zeit resultiert, welche einen Abschnitt aufweist, in dem der Strom in Abhängigkeit von der Zeit ansteigt und der Analyse-Detektionsstrom zu mindestens zwei Zeitpunkten innerhalb des ansteigenden Abschnitts gemessen wird und die aus diesen mindestens zwei Messungen resultierenden Werte des Analyse-Detektionsstoms in dem Auswertealgorithmus verwendet werden, um temperaturbedingte Messfehler zu kompensieren.
System nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyse-Detektionsstrom zu mindestens drei Zeitpunkten innerhalb des ansteigenden Abschnitts gemessen wird, um eine Information über die Form des ansteigenden Abschnitts zu erzeugen und dass die drei Werte des Analyse-Detektionsstroms, die aus den mindestens drei Messungen resultieren, in dem Auswertealgorithmus verwendet werden, um temperaturbedingte Messfehler zu kompensieren.
System nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass an die Elektroden eine Wechselspannung angelegt und der resultierende Wechselstrom gemessen wird, um Fehler zu kompensieren.
System oder Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung des Wechselstroms simultan mit der Messung des Analyse-Detektionsstroms in dem ansteigenden Abschnitt durchgeführt wird.
System oder Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Vollblut ist und die auf der Messung eines Wechselstroms basierende Fehlerkompensation eine Kompensation von Variationen des Hämatokritwertes in der Vollblut-Probe einschließt.
System nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Auswertealgorithmus, mittels dessen die Analytkonzentration aus Werten des Analyse-Detektionsstroms ermittelt wird, die Bestimmung eines Maximums der Kurve umfasst, die den Analyse-Detektionsstrom in Abhängigkeit von der Zeit beschreibt und dass in dem Auswertealgorithmus ein Wert der Kurve, die den Detektionsstrom in Abhängigkeit von der Zeit beschreibt, verwendet wird, welcher zu einem Zeitpunkt gemessen worden ist, der einem vorherbestimmten Verhältnis zu dem Zeitpunkt entspricht, zu dem das Maximum auftritt.
System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronische Schaltung zwei unabhängige Strommessschaltungen (25, 32) einschließt, um den Gleichstrom beziehungsweise den Wechselstrom zu messen.
System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine der Strommessschaltungen (25) in der Verbindungsleitung angeordnet ist, die zu einer der mindestens zwei Elektroden führt und die andere Strommessschaltung in der Verbindungsleitung angeordnet ist, die zu der anderen der mindestens zwei Elektroden führt.
System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselstrom-Messschaltung (25) einen Shunt-Widerstand einschließt, der an einen Differenzialverstärker angeschlossen ist.
System nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass die Gleichstrom-Messschaltung 32 einen Spannung-Zu-Strom-Wandler auf Basis eines Operationsverstärkers aufweist.