DE60203176T2

DE60203176T2 - Fraktionierung von proteinhaltigen mischungen

Info

Publication number: DE60203176T2
Application number: DE60203176T
Authority: DE
Inventors: Otto Allan LIHME; Bendix Marie Hansen; Vaarst Inga ANDERSEN; Aae Morten OLANDER
Original assignee: Upfront Chromatography AS
Current assignee: Upfront Chromatography AS
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2022-06-01
Also published as: WO2002096215A1; EP1584242A1; AU2002316806B2; DK1401289T3; DK2272378T3; EP1552752A2; ATE290323T1; DK1552752T3; NZ530152A; EP1401289B1; US7812138B2; US7956166B2; US20080182979A1; EP1401289A1; ATE455468T1; EP2272378B1; EP2272378A1; DE60203176D1; DK1584242T3; EP1584242B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein industrielles Herstellungsverfahren und ein Verfahren zur Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen, insbesondere von Proteinen in Milch- und Molkeprodukten sowie von anderen von Milch abgeleiteten Rohmaterialien. Die Wahl des Adsorbens ermöglicht eine Trennung von Proteinen von großen Flüssigkeitsvolumina im industriellen Maßstab.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Milch ist eines der am gründlichsten erforschten Lebensmittel der Geschichte. Zahllose wissenschaftliche Schriften dokumentieren die Zusammensetzung von Milch und beschreiben die biologischen Funktionen in dieser komplexen biologischen Ressource. Aus Proteinen, Peptiden, Enzymen und anderen biomolekularen Substanzen besteht eine Haupt- und sehr wichtige Fraktion in der Milch und man nimmt an, dass sie für viele der spezifischen Funktionen verantwortlich sind, welche von einer Mutter an ihr Neugeborenes zusätzlich zu Grundnährstoffen weitergegeben werden.
Während der letzten zwei Jahrzehnte lag ein wesentlicher Fokus auf der Verwendung von Rindermolkeproteinen. Heute sind mehrere Rindermolkeproteinkonzentrate (WPC) und Rindermolkeproteinisolierungsprodukte (WPI) Standardprodukte, welche durch verschiedene Membranfiltrationstechniken sowie Ionenaustausch-Adsorptionsverfahren erhalten werden. Eine weitere Verwendung der Rindermolke hinsichtlich der Fraktionierung der Proteine in einzelne Proteinfraktionen, wie β-Lactoglobulin, α-Lactalbumin, Immunglobuline, Lactoperoxidase und Lactoferrin, wird durch chromatographische Festbett-Trenntechniken möglich gemacht. Proteinprodukte von chromatographischen Trenntechnologien sind im Allgemeinen durch ihren niedrigen bis Nullfettgehalt gekennzeichnet und sind für einen großen Bereich von Verwendungen z.B. in Lebensmittel, Futter, funktionellen Lebensmitteln und Gesundheitsvorsorgeprodukten nützlich.
Seit den ersten Markteinführungen von WPC- und WPI-Produkten und kürzlich der ersten gereinigten Einzelproteinprodukten (z.B. Lactoferrin und Lactoperoxidase) hat sich ein immer größer werdender Bedarf für noch ausgefeiltere und noch effizientere und kosteneffektivere Herstellungsverfahren entwickelt.
Unter den verschiedenen industriellen chromatographischen Trenntechniken, welche sich in den letzten Jahren entwickelt haben, wurde die Expandiertes Bett-Adsorption (EBA) erfolgreich in bestimmten Gebieten der Biotechnologieindustrie eingeführt. EBA ist ein Typ von Fließbett-Adsorption, wobei der Level von Rückmischung bei einem Minimum gehalten wird. Verglichen mit anderen chromatographischen Trenntechnologien bietet EBA einen wesentlichen Vorteil, da es direkt mit nicht geklärter Zuführung verwendet werden kann.
Während EBA wird dem Adsorbensbett ermöglicht, in der Säule, wenn ein Flüssigkeitsfluss aufgebracht wird, zu expandieren (siehe 1). Eine Expansion/Fluidisierung des Bettes erfolgt oft in einer Säule, welche an jedem ihrer Enden mit einer Netzstruktur versehen ist, welche die Querschnittsfläche der Säule abdeckt, oder mit einigen anderen durchlöcherten Vorrichtungen, welche in dem Fluss keine Turbulenz hervorrufen. Siehe zum Beispiel WO-A-9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden). Die gleiche Wirkung wurde auch bei einem System beobachtet, welches einen gerührten Einlassfluss verwendet WO-A-9200799, (UpFront Chromatography A/S). Zusätzlich sind wahrscheinlich auch andere Verteilvorrichtungen verwendbar.
Im Stadium des expandierten Bettes resultiert der Abstand zwischen den Adsorbens-Teilchen in einer freien Passage von teilchenförmigen Verunreinigungen im Zuführungsstrom. Dazu im Gegensatz arbeiten herkömmliche Festbette als Tiefenfilter, welche verstopfen können, was in einem erhöhten Rückdruck resultiert, wenn die Zuführung nicht gründlich geklärt ist. Da sich kein wesentlicher Druck in einer EBA-Säule aufbaut, ist es möglich, EBA anzuwenden ohne die Einschränkungen bei der Größe und Flussrate, welche normalerweise mit Festbett-Säulen einhergehen.
Ein EBA-Verfahren ist durch ein sehr eingeschränktes Rückmischen der Flüssigkeit in der Säule charakterisiert, im Gegensatz zu bekannten turbulenten Fließbetten, welche typischerweise für chemische Umsetzungen verwendet werden. Rückmischen in einem Bett wird oft als Axialdispersion (,Gefäßdispersionszahl') gemessen, siehe Levenspiel, „Chemical Reaction Engineering", 2. Ausgabe, John Wiley & Sons (1972).
Die Adsorbens-Medien, welche bei einem EBA-Verfahren verwendet werden, müssen eine höhere Dichte als das Zuführungsgut aufweisen, um während dem Betrieb akzeptable Flussraten bereit zu stellen. Wenn die Dichte zu niedrig ist, werden die Medien im Säulenausfluss verloren gehen. Im Allgemeinen können EBA-Adsorbens-Teilchen entweder nicht-permeabel für die Flüssigkeit gestaltet werden, wobei in diesem Fall die verfügbare Oberfläche pro Einheitsvolumen klein ist; oder die Teilchen können permeabel für die Flüssigkeit gestaltet werden, wobei in diesem Fall das gewählte Material die richtige Dichte per se aufweisen muss. Unglücklicherweise weisen die interessantesten Materialien für viele Verwendungen, z.B. Materialien wie natürliche und synthetische Polysaccharide wie Agar, Alginate, Carrageenane, Agarose, Dextran, modifizierte Stärken und Cellulose; synthetische organische Polymere und Copolymere, welche typischerweise auf Acrylmonomeren basieren, die für chromatographische Reinigung von Proteinen in Festbett-Säulen verwendet werden, per se nicht die geeignete Dichte auf. Deshalb werden diese Materialien nicht ohne weiteres bei EBA verwendet.
Jedoch können bestimmte Typen von organischen Polymeren und bestimmte Typen von auf Kieselsäure basierenden Materialien hergestellt werden, um Trägerteilchen mit geeigneter Dichte bereit zu stellen, aber es kann sein, dass solche Träger nicht gleichzeitig geeignete Adsorbentien sind, z.B. für Proteinreinigungsverfahren, wo solche Materialien eine geringe Permeabilität, nicht-spezifische Wechselwirkungen bereitstellen und gebundene Proteine denaturieren können. Weiter kann es bei solchen Polymeren schwierig und teuer sein, Derivatisierungsschemata für Affinitätschromatographiemedien zu gestalten. Zusätzlich wurden bestimmte Typen von permeablen Kieselsäure-Teilchen für EBA verwendet. Jedoch sind die Eigenschaften dieser Materialien weit von einem Optimum entfernt. So sind die Materialien bei einem pH-Wert von über 7 instabil, fragil gegenüber Scherkräften und stellen nicht-spezifische Wechselwirkungen bereit. Zusätzlich haben feste Silikatmaterialien eine maximale Dichte von ungefähr 2,5 g/ml.
Die Dichte der Adsorbens-Medien kann durch einen inerten Kern mit hoher Dichte, der in die Polymerphase eingebracht ist (Verbundmedien, Konglomerate siehe z.B. WO-A-9200799), kontrolliert werden. Kernmaterialien mit hoher Dichte werden typischerweise ausgewählt aus Materialien hoher Dichte wie Glas, Quarz oder Schwermetallen entweder in der Form einer Legierung wie Edelstahl oder eines Oxides (z.B. Zirkoniumoxid) oder eines anderen Metallsalzes (z.B. Wolframcarbid). Das Kernmaterial kann auch Metallbereiche (z.B. Tantal) umfassen. Das Kernmaterial der Teilchen kann in Größe und Gestalt variieren. Typische Größen liegen innerhalb von 5 bis 80 Mikrometern.
Als ein Ergebnis der Optimierung der Charakteristika der Adsorbens-Medien (Größenverteilung) werden bei EBA in der Säule Pfropfenströmungsbedingungen mit sehr geringem Rückmischen erhalten. Das Pfropfenströmungsverhalten ist entscheidend, um eine effiziente Adsorption zu erhalten.
Heute werden mehrere wichtige Biopharmazeutika unter Verwendung der EBA-Technologie hergestellt. Jedoch basieren bisher noch keine kommerziellen Verfahren für Milch- und Molkefraktionierung auf EBA. Dies ist größtenteils der Fall aufgrund des großen Maßstabs des Verfahrens, der für Milch- und Molkefraktionierung erforderlich ist, was typischerweise extrem hohe Volumina an Rohmaterial einbezieht, welche pro Tag zu behandeln sind (z.B. mehrere m³/Stunde), was eine extrem hohe Effizienz und Produktivität des EBA-Systems erfordert. Momentane Verfahren sind in der Praxis nicht in der Lage, den Leistungslevel für diese und bestimmte andere Rohmaterialien zu erreichen.
Ein Hauptlieferant für EBA-Adsorbentien und EBA-Säulen ist UpFront Chromatography A/S, Dänemark. Diese Produkte werden unter dem Warenzeichen FastLine (siehe z.B. WO 92/00799, UpFront Chromatography A/S, Dänemark) angeboten, welches eine große Anzahl von Füllstoffen und Polymermaterialien einschließt, die kombiniert werden können, um Verbund-Beads (Konglomerate) herzustellen, welche für eine Adsorption bei EBA beabsichtigt sind.
Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden vertreibt StreamLine, welches durchlässige Agarose-Beads mit Quarz-Teilchen als Füllstoffmaterialien verwendet (WO-A-9218237, Pharmacia Biotech AB). Ein anderer Lieferant ist Bioprocessing Ltd. (Durham, England), deren durchlässige Glas-Beads (Prosep0) für Chromatographie an expandierten Betten verwendet werden können (Beyzavi et al., Genetic Engineering News, 1. März 1994, 17).
WO 97/17132 (Amersham Pharmacia Biotech) offenbart eine Population von Beads mit einer Dichte von größer als 1 g/cm³ und umfassend eine polymere Grundmatrix, in welche ein teilchenförmiger Füllstoff eingebracht ist. Die Beads sind dadurch gekennzeichnet, dass die Füllstoffteilchen eine Dichte von größer als 3 g/cm³ aufweisen und dass die Dichte und/oder die Größe der Beads innerhalb von vorbestimmten Dichte- und Größenbereichen verteilt sind. Besonders wichtige Füllstoffteilchen sind jene, welche abgerundete Gestalten aufweisen, zum Beispiel Kugeln, Ellipsoide oder Aggregate/Agglomerate davon. Die Bead-Population kann insbesondere bei Adsorptionsverfahren in Fließbetten, mit dem Vorzug für stabile expandierte Betten verwendet werden.
WO 00/57982 offenbart ein teilchenförmiges Material mit einer Dichte von mindestens 2,5 g/ml, wobei die Teilchen des teilchenförmigen Materials einen mittleren Durchmesser von 5 bis 75 μm aufweisen und die Teilchen des teilchenförmigen Materials im Wesentlichen aus einer polymeren Grundmatrix, z.B. einem Polysaccharid wie Agarose, und einem nicht-durchlässigen Kernmaterial, z.B. Stahl und Titan, aufgebaut sind, wobei das Kernmaterial eine Dichte von mindestens 3,0 g/ml aufweist, die polymere Grundmatrix Seitengruppen einschließt, welche bei einem pH-Wert von 4,0 positiv geladen sind oder welche Affinitätsliganden für ein Biomolekül sind. Mögliche Seitengruppen schließen Polyethylenimin (PEI), Diethylaminoethyl (DEAE) und quartäres Aminoethyl (QAE) ein. Die Materialien sind in expandiertes Bett- oder Fließbett-Chromatographieverfahren nützlich, insbesondere für die Reinigung von Biomakromolekülen wie Plasmid-DNA, chromosomale DNA, RNA, virale DNA, Bakterien und Viren.
WO-A-8603136 (Graves und Burns; University Patents Inc.) offenbart Beads, welche magnetische Füllstoffteilchen enthalten, und ihre Verwendung in Fließbetten, die durch ein extern angelegtes magnetisches Feld stabilisiert werden. Siehe auch Burns et al., Biotechnol. Bioengin. 27 (1985) 137–145.
WO-A1-9833572 (Amersham Pharmacia Biotech) offenbart ein Verfahren zur Adsorption einer Substanz aus einer flüssigen Probe an einem Fließbett oder gerührten Suspension, wobei die verwendeten Beads eine Grundmatrix umfassen und eine Struktur mit einer Affinität zu der Substanz aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur kovalent an die Grundmatrix über einen Abstandhalter gebunden ist. Populationen von Beads, bei welchen die Beads einen Füllstoff, der in eine Grundmatrix eingebracht ist, und einen Abstandhalter enthalten, werden auch beschrieben.
Bei Chromatographie an Festbetten wurde früher vorgeschlagen, durchlässige Beads zu verwenden, wobei deren Poren vollständig oder teilweise mit hydrophilen Gelen gefüllt waren, welche Affinitätsliganden trugen, wie Ionenaustauschgruppen. Ein Beispiel ist Macrosorb-K, welches ein makrodurchlässiges Kieselgur ist, das mit Agarose gefüllt wurde, welches selbst derivatisiert wurde, damit es DEAE- oder CM-Ionenaustauschgruppen aufweist (Macrosorb-KAX.DEAE beziehungsweise Macrosorb KAX.CM (GB-A-1,586,364, Miles). Dieser letzte Materialientyp wurde auch bei Fließbett-Chromatographie verwendet (Bite et al., In: Verrall et al., Separations for Biotechnology (1987), Ellis Horwood LTD, Kapitel 13, 193–199).
US 4,976,865 (Sanchez, et al., CNRS) lehrt Fließbette und die Verwendung von segmentierten Säulen zur Nachahmung der Mehrschritt-Adsorption, welche sowohl in Fest- als auch in stabilisierten expandierten Betten stattfindet, zur Isolierung von Molkeverbindungen. Die im experimentellen Teil verwendeten Beads sind Kieselsäure-Teilchen (Spherosil, Dichte = 1,4 g/ml, mittlere Teilchengröße = 225 μm), die beschichtet wurden. Die lineare Flussrate, welche im experimentellen Teil implementiert wurde, ist 1,3 × 10^–3 m/s (was gleichbedeutend mit 468 cm/Stunde ist). Die experimentellen Teile offenbaren die Verwendung dieses Typs von Fließbett-Adsorption zur Trennung von biologischen Makromolekülen von Molke. Es gibt keine Offenbarung von jedweden Flussraten und/oder Bindekapazitäten, welche mit Adsorbentien erhalten werden können, die eine mittlere Teilchengröße von weniger als 225 μm aufweisen.
US 5,986,063 lehrt ein Verfahren zur Isolierung der Proteine β-Lactoglobulin und α-Lactalbumin aus Molke mit einem einzelnen Kationenaustauscher.
Immunglobuline – oder Antikörper – stellen eine sehr wichtige Klasse von Proteinen dar, welche in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten von Säugern, Vögeln und Fisch vorhanden sind, wobei sie als Schutzstoffe des Tieres gegen Substanzen, Bakterien und Virus, welche für das Tier eine Herausforderung darstellen, fungieren. Immunglobuline sind typischerweise in Tierblut, Milch und Speichelflüssigkeit sowie in anderen Körperflüssigkeiten und -sekreten vorhanden.
Alle vorstehend erwähnten Verwendungen von Immunglobulinen erfordern eine Art von Isolierung des Antikörpers aus dem rohen Rohmaterial, aber jede Art von Verwendung hat ihre eigenen stark variierenden Anforderungen in Bezug auf die Endreinheit und die zulässigen Kosten des Antikörperprodukts.
Im Allgemeinen besteht ein sehr großer Bereich von unterschiedlichen, für die Isolierung von Immunglobulinen verfügbaren Verfahren, welche zu einem sehr großen Bereich an Endreinheiten, Ausbeuten und Kosten des Produktes führen.
Herkömmliche Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen basieren auf der selektiven reversiblen Fällung der Proteinfraktion, welche die Immunglobuline umfasst, während andere Gruppen von Proteinen in der Lösung verbleiben. Typische Fällungsmittel sind Ethanol, Polyethylenglycol, lyotrope (anti-chaotrope) Salze wie Ammoniumsulfat und Kaliumphosphat und Caprylsäure.
Typischerweise führen diese Fällungsverfahren zu sehr unreinen Produkten, während sie gleichzeitig zeitaufwändig und umständlich sind. Darüber hinaus macht es die Zugabe des Fällungsmittels zu dem Rohmaterial schwierig, den Überstand für andere Zwecke zu verwenden, und sie verursacht ein Entsorgungsproblem. Dies ist besonders in Bezug auf die Reinigung von Immunglobulinen aus zum Beispiel Molke im Großmaßstab relevant.
Ionenaustauschchromatographie ist ein anderes bekanntes Verfahren zur Proteinfraktionierung, welches häufig zur Isolierung von Immunglobulinen verwendet wird. Jedoch ist dieses Verfahren wegen der Einschränkungen bei der Ionenstärke und dem pH-Wert, welche zur Sicherstellung einer effizienten Bindung des Antikörpers notwendig sind, zusammen mit den variierenden isoelektrischen Punkten der unterschiedlichen Immunglobuline nicht allgemein verwendbar.
Protein A- und Protein G-Affinitätschromatographie sind sehr populäre und weit verbreitete Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Immunglobulinen, insbesondere zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern, hauptsächlich aufgrund der Einfachheit der Verwendung und der hohen erhaltenen Reinheit. Obwohl sie populär sind, wird jedoch anerkannt, dass Protein A und Protein G mehrere Probleme für den Verwender aufweisen, unter welchen die folgenden sind: sehr hohe Kosten, variable Bindeeffizienz von unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern (insbesondere Maus-IgG₁), Übergehen von Protein A/Protein G in das Produkt und niedrige Stabilität der Matrix in typischen Reinigungslösungen, z.B. 1 M Natriumhydroxid. Jeder dieser Nachteile hat seine spezielle Konsequenz bei der einzelnen Verwendung, welche zwischen unwesentlichen bis zu sehr ernsthaften und untragbaren Konsequenzen variiert.
Hydrophobe Chromatographie ist auch ein häufig beschriebenes Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen, z.B. in „Application Note 210, BioProcess Media", veröffentlicht von Pharmacia LKB Biotechnology, 1991. In dieser Veröffentlichung wird ein Stand der Technik-Produkt „Phenyl Sepharose High Performance" für den Zweck der Reinigung von monoklonalen Antikörpern von Zellkulturüberständen beschrieben. Wie bei anderen bisher verwendeten hydrophoben Matrizes ist es notwendig, lyotrope Salze zu dem Rohmaterial zu geben, um die Immunglobuline zu einer effizienten Bindung zu veranlassen. Der gebundene Antikörper wird aus der Matrix durch Erniedrigen der Konzentration des lyotropen Salzes in einem kontinuierlichen oder schrittweisen Gradienten freigesetzt. Es wird empfohlen, die hydrophobe Chromatographie mit einem weiteren Schritt zu kombinieren, wenn das Ziel ein hochreines Produkt ist.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist die Notwendigkeit, ein lyotropes Salz zu dem Rohmaterial zu geben, da dies ein Entsorgungsproblem und dabei erhöhte Kosten für den Verwender im Großmaßstab verursacht. Die Zugabe von lyotropen Salzen zu den Rohmaterialien würde in vielen Fällen die Verwendungen im Großmaßstab verhindern, da das Salz in Kombination mit dem Problem der Entsorgung von mehreren tausend Litern Abfall jedwede ökonomisch machbare Verwendung des an Immunglobulin erschöpften Rohmaterials verhindern würde.
Thiophile Adsorptionschromatographie wurde von J. Porath 1985 (J. Porath et al.; FEBS Letters, Bd. 185, S. 306, 1985) als ein neues chromatographisches Adsorptionsprinzip für die Isolierung von Immunglobulinen eingeführt. Porath beschreibt die Technologie, wobei Divinylsulfon-aktivierte Agarose in Kombination mit unterschiedlichen Liganden, welche einen freien Mercapto-Rest umfassen, eine spezifische Bindung für Immunglobuline in der Gegenwart von 0,5 M Kaliumsulfat, d.h. eines lyotropen Salzes, zeigt. Es wurde postuliert, dass der Sulfonrest von dem Vinylsulfon-Spacer und der resultierende Thioether in dem Liganden eine strukturelle Notwendigkeit waren, um die beschriebene Spezifität und Kapazität für das Binden von Antikörpern zu erhalten. Später wurde jedoch gezeigt, dass der Thioether mit Stickstoff oder Sauerstoff ersetzt werden konnte, wenn der Ligand weiter einen aromatischen Rest umfasste (K. L. Knudsen et al., Analytical Biochemistry, Bd. 201, S. 170, 1992).
Obwohl die für thiophile Chromatographie beschriebenen Matrizes im Allgemeinen eine gute Leistung zeigen, weisen sie auch einen Hauptnachteil auf, der darin liegt, dass es notwendig ist, lyotrope Salze zu dem Rohmaterial zu geben, um eine effiziente Bindung des Immunglobulins sicher zu stellen, was aufgrund der vorstehend erörterten Gründe ein Problem ist.
Andere thiophile, an Epoxy-aktivierte Agarose gekuppelte Liganden werden in (J. Porath et al., Makromol. Chem., Makromol. Symp., Bd. 17, S. 359, 1988) und (A. Schwarz et al., Journal of Chromatography B, Bd. 664, S. 83–88, 1995) offenbart, z.B. 2-Mercaptopyridin, 2-Mercaptopyrimidin und 2-Mercaptothiazolin. Jedoch weisen alle diese Affinitätsmatrizes noch unzulängliche Affinitätskonstanten auf, um eine effiziente Bindung des Antikörpers ohne Zugabe von lyotropen Salzen sicher zu stellen.
Um die vorstehend erwähnten Probleme und Nachteile zu vermeiden, entwickelten die Forscher der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Fraktionierung, Reinigung und Isolierung von mindestens einem Protein aus einem Protein enthaltendem Gemisch im Großmaßstab. Dieses Verfahren kann für industrielle Verwendung verwendet werden, es kann sehr große Volumina von einem Protein enthaltenden Gemisch handhaben, es ist schnell und es stellt ein hoch gereinigtes Protein bereit.
Die Forscher der vorliegenden Erfindung fanden auch, dass es möglich ist, die Fraktionierung, Reinigung und Isolierung von Proteinen ohne die Verwendung von lyotropen Salzen durchzuführen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß betrifft eine allgemeine erfindungsgemäße Ausführungsform ein Verfahren zur Fraktionierung von großen Volumina von Protein enthaltenden Lösungen unter Verwendung eines Adsorbens, welches, trotz eines kleinen Teilchendurchmessers und einer sehr hohen Dichte, eine hohe Bindekapazität für das gewünschte Protein aufweist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Fraktionierung von Proteinen aus Rohmaterialien im Industriemaßstab unter Verwendung von EBA-Methodik durch Auswahl von EBA-Adsorbentien. Wie dargelegt wurde, wird diese Aufgabe mindestens teilweise durch die Bereitstellung eines EBA-Verfahrens unter Verwendung eines speziellen Adsorbens erreicht, welches gemäß seinem Teilchendurchmesser und seiner Teilchendichte ausgewählt wird. Dies ermöglicht ein EBA-Verfahren bei linearen Flussraten von über mindestens 200 cm/Stunde effizient zu betreiben.
So betrifft eine primäre erfindungsgemäße Ausführungsform ein Verfahren zur Fraktionierung eines Protein enthaltenden Gemisches, wobei das Protein enthaltende Gemisch ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Milch, von Milch abgeleiteten Produkten, von Milch abgeleiteten Rohmaterialien, von Gemüse abgeleiteten Produkten, von Gemüse abgeleiteten Extrakten, von Früchten abgeleiteten Produkten, von Früchten abgeleiteten Extrakten, von Fisch abgeleiteten Produkten und von Fisch abgeleiteten Extrakten, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes des Gemisches; b) Aufbringen des Gemisches auf eine Adsorptionssäule mit einem Adsorbens, wobei das Adsorbens ein Teilchen mit mindestens einem nicht-durchlässigen Kern mit hoher Dichte, umgeben von durchlässigem Material, umfasst, wobei das Adsorbens eine Teilchendichte von mindestens 1,5 g/ml und eine mittlere Teilchengröße von höchstens 150 μm aufweist; c) gegebenenfalls Waschen der Säule; d) Eluieren von mindestens einem Protein vom Adsorbens.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: zeigt eine Veranschaulichung der Expansion des Adsorbens-Bettes durch einen Aufwärtsstrom der Flüssigkeit, verglichen mit einem herkömmlichen Festbett.
2: zeigt ein Fließbilddiagramm eines erfindungsgemäßen EBA-Verfahrens.
3: zeigt eine modulare Molkeproteinfraktionierungsvorrichtung, welche in Schritt I Lactoferrin und Lactoperoxidase und in Schritt II Rinderserumalbumin, β-Lactoglobulin und Immunglobulin einfängt.
4: zeigt ein mikroskopisches Bild eines Edelstahl/Agarose-EBA-Adsorbens-Teilchens.
5: zeigt ein SDS-PAGE, welches die Reinheit von Lactoferrin und Lactoperoxidase veranschaulicht. Spur 1 veranschaulicht die Molke, Spur 2 veranschaulicht die Waschflüssigkeit, Spur 3 veranschaulicht das LP-Eluat und Spur 4 veranschaulicht das LF-Eluat.
6: zeigt ein SDS-PAGE, welches die Elutionsprofile von Molkeproteinen als eine Funktion des Bindungs-pH-Werts veranschaulicht. Spur 1 veranschaulicht den molekularen Marker, Spur 2 veranschaulicht das Eluat 1 bei einem pH-Wert von 4, Spur 3 veranschaulicht das Eluat 2 bei einem pH-Wert von 4, Spur 4 veranschaulicht das Eluat 1 bei einem pH-Wert von 4,5, Spur 5 veranschaulicht das Eluat 2 bei einem pH-Wert von 4,5, Spur 6 veranschaulicht das Eluat 1 bei einem pH-Wert von 5, Spur 7 veranschaulicht das Eluat 2 bei einem pH-Wert von 5, Spur 8 veranschaulicht den Molekulargewichtsmarker, Spur 9 veranschaulicht das Eluat 1 bei einem pH-Wert von 5,5, Spur 10 veranschaulicht das Eluat 2 bei einem pH-Wert von 5,5, Spur 11 veranschaulicht das Eluat 1 bei einem pH-Wert von 6 und Spur 12 veranschaulicht das Eluat 2 bei einem pH-Wert von 6.
7: zeigt ein SDS-PAGE, welches die Reinheit von BSA/β-LG- und IgG-Fraktionen zeigt. Spur 1 veranschaulicht Molke (erschöpft an LF und LP), Spur 2 veranschaulicht die Waschflüssigkeit mit 2,5 mg/ml Caprylsäure, pH-Wert 6 und Spur 3 veranschaulicht das Eluat, welches mit 20 mM NaOH (170 ml) eluiert wurde.
8: zeigt ein SDS-PAGE, welches die Ergebnisse zeigt, die durch das aufeinanderfolgende Waschen/Eluieren von β-LG und BSA und die Endelution von IgG erhalten wurden. Spur 1 veranschaulicht die Waschflüssigkeit mit 50 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,5, Spur 2 veranschaulicht die Waschflüssigkeit mit 2,5 mg/ml Caprylsäure, pH-Wert 6 und Spur 3 veranschaulicht das Eluat, welches mit 20 mM NaOH eluiert wurde.
9: zeigt ein Mikroskopiebild von kugelförmigen UpFront-Wolframcarbid-8-Agarose-Teilchen. Die mittlere Teilchengröße beträgt 59 μm und die Dichte beträgt 3,3 g/ml.
10: zeigt die Expansionskurve für drei unterschiedliche Wolframcarbid-8-Agarose-Teilchen. A) Dichte 2,4 g/ml und mittlere Teilchengröße 56 μm, B) Dichte 3,3 g/ml und mittlere Teilchengröße 59 μm und C) Dichte 3,2 g/ml und mittlere Teilchengröße 90 μm.
11: zeigt die Teilchenverteilung von Wolframcarbid-8-Agarose-Teilchen mit einer Dichte von 2,4 g/ml und einer mittleren Teilchengröße von 56 μm und 552 Teilchen wurden gemessen.
12: zeigt die Teilchenverteilung von Wolframcarbid-8-Agarose-Teilchen mit einer Dichte von 3,3 g/ml und einer mittleren Teilchengröße von 59 μm und 602 Teilchen wurden gemessen.
13: zeigt die Teilchenverteilung von Wolframcarbid-8-Agarose-Teilchen mit einer Dichte von 3,2 g/ml und einer mittleren Teilchengröße von 90 μm und 283 Teilchen wurden gemessen.
14: zeigt ein Mikroskopiebild von kugelförmigen UpFront-Wolframcarbid-25-Agarose-Teilchen. Die mittlere Teilchengröße beträgt 77 μm und die Dichte beträgt 3,7 g/ml.
15: zeigt die Expansionskurve an UpFront-Wolframcarbid-25-Agarose mit einer mittleren Teilchengröße von 77 μm und einer Dichte von 3,7 g/ml.
16: zeigt die Teilchenverteilung von UpFront-Wolframcarbid-25-Agarose-Teilchen mit einer Dichte von 3,7 g/ml und einer mittleren Teilchengröße von 77 μm und 332 Teilchen wurden gemessen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Fraktionierung eines Protein enthaltenden Gemisches durch Verwendung einer equilibrierten Adsorbens-Säule, die Adsorbentien enthält, welche Teilchen mit kleiner Größe und einer großen Dichte umfassen, bereit. Diese Wahl von Größe und Dichte ermöglicht eine erhöhte Flussrate und macht die Handhabung von großen Volumina bei der Fraktionierung von Protein enthaltenden Gemischen im industriellen Maßstab und das Erhalten von hochreinen Proteinen möglich.
Protein enthaltendes Gemisch
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf Fraktionierungsverfahren im industriellen oder Großmaßstab ausgerichtet, wo große Volumina gehandhabt werden müssen. Geeigneterweise ist das Protein enthaltende Gemisch ausgewählt aus der Gruppe umfassend Milch und von Milch abgeleitete Produkte wie Molke und andere von Milch abgeleitete Rohmaterialien, von Gemüse abgeleitete Produkte und Extrakte, von Früchten abgeleitete Produkte und Extrakte, von Fisch abgeleitete Produkte und Extrakte. Typischerweise ist das Protein enthaltende Gemisch ein von Milch abgeleitetes Produkt, bevorzugt ausgewählt aus Milch und Molke.
Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Ausdruck „Protein enthaltendes Gemisch" ein Gemisch mit biologischem Ursprung, welches mindestens ein Protein oder eine biomolekulare Substanz umfasst, welche in einem industriellen oder Großmaßstab fraktioniert, teilweise oder vollständig gereinigt oder isoliert werden müssen. Typische Gemische schließen Milch, entrahmte Milch, Molke und andere von Milch abgeleitete Rohmaterialien, von Gemüse abgeleitete Produkte und Extrakte, von Früchten abgeleitete Produkte und Extrakte, von Fisch abgeleitete Produkte und Extrakte ein.
Der Grad, bis zu welchem eine Fraktionierung bei jedwedem besonderen Milcherzeugnis verwendet werden kann, hängt von der bestehenden Ausbeutung der Molke ab. Wenn eine Herstellung von WPC läuft, ist es möglich, kleinere Proteinfraktionen zu extrahieren und noch ein angemessenes WPC für einen vorhandenen Markt zu erhalten. Es kann sogar möglich sein, ein oder mehrere der Molkehauptproteine mit niedriger Ausbeute ohne eine Gefährdung eines vorhandenen WPC-Marktes zu extrahieren. In Situationen ohne Einschränkungen ist es möglich, Mehrfachproteinprodukte aus dem Molkestrom zu erhalten.
pH-Wert-Einstellung
In der Milcherzeugnisindustrie wird die Verfahrensintegration von EBA für Molkeproteinfraktionierung typischerweise in einer Käseproduktionsvorrichtung sofort nach der Entfernung von Feinanteilen und Molkerahm vorgenommen. Die Molke kann eine Einstellung des pH-Wertes (abhängig vom Protein von Interesse), der Ligandenchemie und des Typs der Molke erfordern.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Protein enthaltende Gemisch vor dem Aufbringen auf die Adsorbens-Säule auf einen pH-Wert eingestellt, der das Einfangen des Proteins oder der Proteine, welche zu isolieren sind, ermöglicht. Dieser pH-Wert kann auf einen pH-Wert eingestellt werden, der aus dem gesamten pH-Wert-Bereich ausgewählt ist, bevorzugt von pH-Wert 2 bis 13, stärker bevorzugt von pH-Wert 3 bis 11.
Adsorbens-Säule
Die Adsorbens-Säule, welche verwendet wird, kann von jedweder Art sein, welche entweder für EBA (Expandiertes Bett-Adsorption) oder für Festbett-Adsorption oder eine Kombination davon geeignet ist. Die Adsorbens-Säule kann in entweder einem Chargensystem oder in einem kontinuierlichen System verwendet werden. Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Ausdruck „Adsorbens-Säule" jedwede Behälterart, welche mit mindestens einem Einlass und mindestens einem Auslass für die Aufbringung des Gemisches auf die Säule und darauffolgend zur Eluierung des Proteins bereitgestellt werden kann.
Die Tatsache, dass die EBA-Technologie im Allgemeinen mit nicht-geklärten Rohmaterialien effizient arbeiten kann, macht sie für eine Implementierung der Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Milch und Molke attraktiv. Verglichen mit Verfahren, welche auf Festbett-Adsorptionstechniken basieren, kann EBA ein robustes Verfahren bereitstellen, welches weniger Schritte umfasst und so in erhöhten Ausbeuten und einer verbesserten Verfahrensökonomie resultiert. Aufgrund der Expansion des Adsorbens-Bettes während der Durchführung eines EBA-Verfahrens können EBA-Säulen weiter bis zum industriellen Maßstab vergrößert werden ohne jedwede wesentlichen Überlegungen hinsichtlich erhöhter Rückdrucke oder Abbrechen des Verfahrens aufgrund von Verstopfen des Systems, was oft ein Problem ist, wenn Festbett-Säulen verwendet werden. Jedoch berücksichtigt der gegenwärtige Stand der Technik in der EBA-Technologie die speziellen Probleme, welche mit der Behandlung von sehr großen Volumina von Rohmaterialien, wie Milch und Molke, wobei aber nicht auf diese eingeschränkt wird, in Zusammenhang stehen, nicht in angemessener Weise.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Milch, entrahmter Milch, Molke und anderen von Milch abgeleiteten Rohmaterialien bereit zu stellen, welches auf der Adsorption an jedwedem Typ von Festphasenmaterial von jedweder Gestalt und jedwedem Format basiert, einschließlich Festbett-Adsorption, Chargenadsorption, suspendiertes Bett-Adsorption, EBA und auf Membran basierende Adsorption, charakterisiert durch die Verwendung von selektiver Ligandchemie, welche die spezifische Bindung und die darauffolgende Elution von im Wesentlichen nur einer biomolekularen Substanz oder alternativ eine Rest-spezifische Bindung von einigen biomolekularen Substanzen, gefolgt von selektiver und aufeinanderfolgender Elution von einer oder mehreren Substanzen von dem Adsorbens ermöglicht.
Allgemeine Expansions-Bett-Adsorptions-Technologie ist dem Fachmann bekannt und das erfindungsgemäße Verfahren kann an die Verfahren, welche zum Beispiel in WO 92/00799, WO 92/18237, WO 97/17132, WO 00/57982 und WO 98/33572 beschrieben sind, angepasst werden.
Adsorbens
Wie angegeben, ist es eine Gesamtaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Vollmilch, entrahmter Milch, Molke und anderen von Milch abgeleiteten Rohmaterialien bereit zu stellen, wobei das Verfahren auf der Verwendung der EBA-Methodik basiert und die EBA-Adsorbentien die Anforderungen für eine Implementierung von effizienten EBA-Verfahren zur Isolierung und Fraktionierung von solchen biomolekularen Substanzen in einem industriellen Maßstab erfüllen. Ein anfänglicher aber optionaler Schritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bezieht typischerweise die Equilibrierung des Adsorbens ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Equilibrierungsflüssigkeit Wasser wie Leitungswasser, demineralisiertes Wasser, Wasser, welches durch Umkehrosmose hergestellt wurde, oder destilliertes Wasser.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck „Adsorbens" auf das gesamte Bett, welches in der Adsorbens-Säule vorhanden ist, und der Ausdruck „Adsorbens-Teilchen" wird austauschbar mit dem Ausdruck „Teilchen" verwendet und betrifft einzelne Teilchen, aus welchen das Adsorbens besteht.
Die Flussrate, die Größe der Teilchen und die Dichte der Teilchen haben alle Einfluss auf die Expansion des Flüssigkeitsbettes und es ist wichtig, den Grad der Expansion in einer Weise zu kontrollieren, so dass die Teilchen in der Säule gehalten werden. Der Grad der Expansion kann als H/H0 bestimmt werden, wobei H0 die Höhe des Bettes bei der Festbett-Betriebsweise und H die Höhe des Bettes bei der expandierten Betriebsweise ist. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt der Grad der Expansion H/H0 im Bereich von 1,0 bis 20, wie 1,0 bis 10, z.B. 1,0 bis 6, wie 1,2 bis 5, z.B. 1,5 bis 4 wie 4 bis 6, wie 3 bis 5, z.B. 3 bis 4 wie 4 bis 6. In einer anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beträgt der Grad der Expansion H/H0 mindestens 1,0, wie mindestens 1,5, z.B. mindestens 2, wie mindestens 2,5, z.B. mindestens 3, wie mindestens 3,5, z.B. mindestens 4, wie mindestens 4,5, z.B. mindestens 5, wie mindestens 5,5, z.B. mindestens 6, wie mindestens 10, z.B. mindestens 20.
Man fand, dass die Dichte des EBA-Adsorbens-Teilchens für die verwendbaren Flussraten im Verhältnis zum maximalen Grad der Expansion des Adsorbens-Bettes, welcher in einer typischen EBA-Säule möglich ist (z.B. H/H0 maximal 3 bis 5), sehr wesentlich ist und dass sie mindestens 1,3 g/ml sein muss, stärker bevorzugt mindestens 1,5 g/ml, noch stärker bevorzugt mindestens 1,8 g/ml, noch stärker bevorzugt mindestens 2,0 g/ml, am stärksten bevorzugt mindestens 2,3 g/ml, um eine hohe Produktivität des Verfahrens zu ermöglichen.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das Adsorbens-Teilchen eine mittlere Teilchengröße von höchstens 150 μm, insbesondere von höchstens 120 μm, stärker besonders von höchstens 100 μm, noch stärker besonders von höchstens 90 μm, noch stärker besonders von höchstens 80 μm, noch stärker besonders von höchstens 70 μm auf. Typischerweise weist das Adsorbens-Teilchen eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 40 bis 150 μm, wie 40 bis 120 μm, z.B. 40 bis 100, wie 40 bis 75, z.B. 40 bis 50 μm auf.
In einer Kombination von bevorzugten Ausführungsformen, wobei der mittlere Teilchendurchmesser 120 μm oder niedriger ist, ist die Teilchendichte mindestens 1,6 g/ml, stärker bevorzugt mindestens 1,9 g/ml. Wenn der mittlere Teilchendurchmesser niedriger als 90 μm ist, muss die Dichte mindestens 1,8 g/ml oder stärker bevorzugt mindestens 2,0 g/ml sein. Wenn der mittlere Teilchendurchmesser niedriger als 75 μm ist, muss die Dichte mindestens 2,0 g/ml, stärker bevorzugt mindestens 2,3 g/ml und am stärksten bevorzugt mindestens 2,5 g/ml sein.
Die hohe Dichte des Adsorbens-Teilchens wird zu einem großen Teil durch einen Einschluss eines bestimmten Anteils eines dichten nicht-durchlässigen Kernmaterials, bevorzugt mit einer Dichte von mindestens 4,0 g/ml, wie mindestens 5,0, erreicht. Typischerweise weist das nicht-durchlässige Kernmaterial eine Dichte im Bereich von etwa 4,0 bis 25 g/ml, wie etwa 4,0 bis 20 g/ml, z.B. etwa 4,0 bis 15 g/ml, wie 12 bis 19 g/ml, z.B. 14 bis 18 g/ml, wie etwa 6,0 bis 15,0 g/ml, z.B. etwa 6,0 bis 10 g/ml auf.
Anschließend wird das Protein enthaltende Gemisch geladen und die biomolekulare(n) Substanz(en) von Interesse wird/werden typischerweise unter Druck adsorbiert. Teilchenförmiges Material und lösliche Verunreinigungen werden gegebenenfalls von der Säule während dem Waschen entfernt.
Die Fraktionierung kann so durch Aufbringen des Protein enthaltenden Gemisches auf die Adsorbens-Säule bei einer linearen Flussrate von mindestens 3 cm/min, wie mindestens 5 cm/min, z.B. mindestens 8 cm/min, wie mindestens 10 cm/min z.B. 20 cm/min effizient durchgeführt werden. Typischerweise wird die Flussrate aus dem Bereich von 5 bis 50 cm/min, wie aus dem Bereich von 5 bis 15 cm/min, z.B. aus dem Bereich von 10 bis 30 cm/min, wie aus dem Bereich von 25 bis 50 cm/min ausgewählt. Diese erhöhten Flussraten sind zum großen Teil aufgrund der kleinen Teilchengröße des Adsorbens möglich.
Insbesondere mit Bezug auf Ausführungsformen, wobei das Gemisch Milch oder von Milch abgeleitetes Material wie Milch oder Molke ist, wird folglich die Aufbringung des Rohgemisches auf die Adsorbens-Säule mit einer linearen Flussrate von mindestens 200 cm/Stunde, wie mindestens 300 cm/Stunde, stärker bevorzugt mindestens 400 cm/Stunde, wie mindestens 500 oder 600 cm/Stunde, wie mindestens 900 cm/Stunde stattfinden.
Wenn das Protein enthaltende Gemisch auf die Adsorbens-Säule gegeben wird, kann das Verhältnis zwischen dem in der Säule vorhandenen Adsorbens-Teilchen und dem Protein enthaltenden Gemisch optimiert werden, um eine hohe Kapazität der Adsorbens-Säule zu erhalten und um eine hohe Reinheit des/der zu isolierenden Proteins oder Proteine zu erhalten. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das in der Säule vorhandene Adsorbens relativ zu dem Protein enthaltenden Gemisch, welches auf die Säule zu laden ist, in einem Verhältnis von mindestens 1:1000, wie mindestens 1:800, z.B. mindestens 1:600, wie mindestens 1:400, z.B. mindestens 1:300, wie mindestens 1:200, z.B. mindestens 1:100, wie mindestens 1:50, z.B. mindestens 1:30, wie mindestens 1:15, z.B. 1:10, wie 1:5, gemessen auf einer Volumen/Volumen-Basis, bereitgestellt.
Mehrere Parameter haben einen Einfluss auf die Flussrate, welche in einem EBA-Verfahren implementiert werden kann. Die Fluidisierungseigenschaften der Adsorbens-Teilchen (welche mit Hilfe des Stokes-Gesetzes beschrieben werden können) bestimmen, welche Flussraten verwendet werden können, um das Adsorbens zu expandieren und es noch in der Säule zu halten. Die Hauptfaktoren, welche dies beeinflussen, sind der Durchmesser und die Dichte der Adsorbens-Teilchen in Kombination mit der Viskosität der durch die Säule fließenden Flüssigkeit. Jedoch sind die Bindungs- und Massentransferkinetiken, welche für eine spezielle Verwendung relevant sind, genauso wichtig, um eine optimale Effizienz und Produktivität des EBA-Verfahrens sicher zu stellen. Zum Beispiel kann es möglich sein, eine EBA-Säule laufen zu lassen, welche ein bestimmtes EBA-Adsorbens bei sehr hohen Flussraten bezogen auf die physikalischen Fluidisierungs- und Expansionseigenschaften enthält, während die verwendete hohe Flussrate in einer schlechten und ineffizienten Adsorption (d.h. einer niedrigen dynamischen Kapazität) resultiert, aufgrund der Tatsache, dass die zu bindenden Zielmoleküle nicht in oder aus den Adsorbens-Teilchen diffundieren können, um diese Flussrate zu erreichen (d.h. die Massentransferkinetiken sind der einschränkende Faktor).
Folglich liegt bei einer Kombination von besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen, wo die verwendete lineare Flussrate während dem Aufbringen des Rohmaterials bei über 300 cm/Stunde liegt, der mittlere Teilchendurchmesser unter 150 μm. Typischerweise liegt bei Ausführungsformen, wo das Fraktionierungsverfahren bei einer verwendeten linearen Flussrate von über 500 cm/min durchgeführt wird, der mittlere Teilchendurchmesser unter 120 μm, bevorzugt unter 90 μm. Typischerweise liegt bei Ausführungsformen, wo das Fraktionierungsverfahren bei einer verwendeten linearen Flussrate von über 600 cm/Stunde durchgeführt wird, der mittlere Teilchendurchmesser bevorzugt unter 85 μm, stärker bevorzugt unter 75 μm.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das Adsorbens-Teilchen eine Dichte von mindestens 1,5 g/ml, wie mindestens 1,8 g/ml, z.B. mindestens 2,0 g/ml, wie mindestens 2,5 g/ml, wie mindestens 2,6 g/ml, z.B. mindestens 3,0 g/ml, wie mindestens 3,5 g/ml, z.B. mindestens 4,0 g/ml, wie mindestens 5 g/ml, z.B. mindestens 7 g/ml, wie mindestens 10 g/ml, z.B. mindestens 15 g/ml auf.
Mit der Dichte eines Adsorbens-Teilchens ist beabsichtigt, die Dichte des Adsorbens in seinem vollständig solvatisierten (z.B. hydratisierten) Zustand im Gegensatz zu der Dichte eines getrockneten Adsorbens zu beschreiben.
Das erfindungsgemäß verwendete Adsorbens-Teilchen muss mindestens teilweise für die zu isolierende biomolekulare Substanz permeabel sein, um eine wesentliche Bindekapazität im Gegensatz zu nicht-permeablen Teilchen, welche das Zielmolekül nur auf ihrer Oberfläche binden können, was in einer relativ niedrigen Bindekapazität resultiert, sicher zu stellen. Das Adsorbens-Teilchen kann aus einer Reihe von unterschiedlichen Strukturen, Zusammensetzungen und Gestalten bestehen.
Folglich können die Adsorbens-Teilchen aus einer Anzahl von chemisch derivatisierten durchlässigen Materialien mit der notwendigen Dichte und Bindekapazität bestehen, um bei den gegebenen Flussraten per se zu arbeiten. Die Teilchen sind entweder vom Konglomerattyp wie in WO 92/00799 beschrieben mit mindestens zwei nicht-durchlässigen Kernen, welche von einem durchlässigen Material umgeben sind, oder vom Pelliculartyp mit einem einzelnen nicht-durchlässigen Kern, welcher von einem durchlässigen Material umgeben ist.
Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Ausdruck „Konglomerattyp" ein Teilchen eines teilchenförmigen Materials, welches Beads von Kernmaterial von unterschiedlichen Typen und Größen umfasst, zusammengehalten durch die polymere Grundmatrix, z.B. ein Kernteilchen, welches aus zwei oder mehr Teilchen mit hoher Dichte besteht, welche durch umgebende Agarose (polymere Grundmatrix) zusammengehalten werden.
Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Ausdruck „Pelliculartyp" einen Verbund von Teilchen, wobei jedes Teilchen aus nur einem Kernmaterial mit hoher Dichte besteht, welches mit einer Schicht der durchlässigen polymeren Grundmatrix überzogen ist, z.B. ein Edelstahl-Bead mit hoher Dichte, welches mit Agarose überzogen ist.
Demgemäß betrifft der Ausdruck „mindestens ein nicht-durchlässiger Kern mit hoher Dichte" entweder einen Pellicularkern, welcher ein einzelnes nicht-durchlässiges Teilchen mit hoher Dichte umfasst, oder er betrifft einen Konglomeratkern, welcher mehr als ein nicht-durchlässiges Teilchen mit hoher Dichte umfasst.
Das Adsorbens-Teilchen, wie angegeben, umfasst einen nicht-durchlässigen Kern mit hoher Dichte mit einem durchlässigen Material, welches den Kern umgibt, und das durchlässige Material umfasst gegebenenfalls einen Liganden an seiner äußeren Oberfläche.
Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Ausdruck „Kern" das/die nicht-durchlässige(n) Kernteilchen, welche(s) in dem Adsorbens-Teilchen vorhanden ist/sind. Das Kernteilchen oder die Kernteilchen können in dem durchlässigen Material zufällig verteilt sein und es/sie ist/sind nicht auf eine Lokalisierung im Zentrum des Adsorbens-Teilchens eingeschränkt.
Der nicht-durchlässige Kern macht typischerweise höchstens 50% des Gesamtvolumens des Adsorbens-Teilchens aus, wie höchstens 40%, bevorzugt höchstens 30%.
Beispiele von geeigneten nicht-durchlässigen Kernmaterialien sind anorganische Verbindungen, Metalle, Schwermetalle, elementare Nichtmetalle, Metalloxide, Nichtmetalloxide, Metallsalze und Metalllegierungen, usw., solange die vorstehenden Dichtekriterien erfüllt werden. Beispiele von solchen Kernmaterialien sind Metallsilikate, Metallborosilikate; Keramiken einschließlich Titandiborid, Titancarbid, Zirkoniumdiborid, Zirkoniumcarbid, Wolframcarbid, Siliziumcarbid, Aluminiumnitrid, Siliziumnitrid, Titannitrid, Yttriumoxid, Siliziummetall-Pulver und Molybdändisilid; Metalloxide und -sulfide, einschließlich Magnesium-, Aluminium-, Titan-, Vanadium-, Chrom-, Zirkonium-, Hafnium-, Mangan-, Eisen-, Cobalt-, Nickel-, Kupfer- und Silberoxid; Nichtmetalloxide; Metallsalze, einschließlich Bariumsulfat; metallische Elemente, einschließlich Wolfram, Zirkonium, Titan, Hafnium, Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Cobalt, Nickel, Indium, Kupfer, Silber, Gold, Palladium, Platin, Ruthenium, Osmium, Rhodium und Iridium, und Legierungen von metallischen Elementen, wie Legierungen, welche zwischen den metallischen Elementen gebildet werden, z.B. Edelstahl; kristalline und amorphe Formen von Kohlenstoff, einschließlich Graphit, Kohleschwarz und Aktivkohle. Bevorzugte nicht-durchlässige Kernmaterialien sind Wolframcarbamid-, Wolfram-, Stahl- und Titan-Beads wie Edelstahl-Beads.
Das durchlässige Material ist eine polymere Grundmatrix, welche als ein Mittel zum Bedecken und Zusammenhalten von mehrfachen (oder einem einzelnen) Kernmaterialien und als ein Mittel zum Binden des adsorbierenden Liganden verwendet wird.
Die polymere Grundmatrix kann aus bestimmten Typen von natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren ausgesucht werden, welche typischerweise ausgewählt sind aus i) natürlichen und synthetischen Polysacchariden und anderen auf Kohlenhydraten basierenden Polymeren, einschließlich Agar, Alginat, Carrageenan, Guar Gum, Gummiarabikum, Ghattiharz, Tragant, Karaya-Gummi, Johannisbrotharz, Xanthanlösung, Agarosen, Cellulosen, Pectinen, Mucinen, Dextranen, Stärken, Heparinen, Chitosanen, Hydroxystärken, Hydroxypropylstärken, Carboxymethylstärken, Hydroxyethylcellulosen, Hydroxypropylcellulosen und Carboxymethylcellulosen; ii) synthetischen organischen Polymeren und Monomeren, welche in Polymeren resultieren, einschließlich Acrylpolymeren, Polyamiden, Polyimiden, Polyestern, Polyethern, polymeren Vinylverbindungen, Polyalkenen, und substituierten Derivaten davon, sowie Copolymeren, welche mehr als eine solche Polymerfunktion umfassen, und substituierten Derivaten davon; und iii) Gemischen davon.
Eine bevorzugte Gruppe von polymeren Grundmatrizes sind Polysaccharide wie Agarose.
Von einem Blickwinkel der Produktivität ist es wichtig, dass das Adsorbens in der Lage ist, eine große Menge der biomolekularen Substanz pro Volumeneinheit des Adsorbens zu binden. So fanden wir, dass es bevorzugt ist, Adsorbentien mit einer polymeren Phase (d.h. das permeable Grundgerüst, wo der Ligand positioniert ist und woran die wirkliche Adsorption stattfindet) zu verwenden, welche mindestens 50% des Adsorbens-Teilchenvolumens ausmacht, bevorzugt mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80% und am stärksten bevorzugt mindestens 90% des Volumens der Adsorbens-Teilchen.
Die Forscher der vorliegenden Erfindung fanden, dass es notwendig ist, den mittleren Teilchendurchmesser des Adsorbens-Teilchens zu minimieren, um eine effiziente Adsorption bei hohen Flussraten sicher zu stellen. Folglich hat in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform das Adsorbens-Teilchen eine Teilchengröße von höchstens 150 μm, typischerweise eine Teilchengröße im Bereich von etwa 40 μm bis 150 μm. Das Adsorbens-Teilchen hat typischerweise eine mittlere Teilchengröße von höchstens 120 μm, insbesondere von höchstens 100 μm, stärker bevorzugt von höchstens 90 μm, 80 μm oder 75 μm, am stärksten bevorzugt von etwa 70 μm.
Die Teilchengrößenanalyse, welche durchgeführt wurde und auf welche überall in der Beschreibung und in den Beispielen Bezug genommen wird, basiert auf einer computergesteuerten Bildanalyse der Bead-Population, wobei die Anzahl der Teilchen von jedwedem gegebenen Teilchendurchmesser im Verhältnis zur Gesamtanzahl der Teilchen, welche bei der speziellen Messung analysiert wurden, angegeben ist (typischerweise wird die Gesamtanzahl der analysierten Teilchen im Bereich von 250 bis 500 Teilchen liegen). Diese Teilchengrößendaten können über eine mathematische Routineumwandlung der Daten, wobei das Volumen von jedem Bead berechnet und mit dem Gesamtvolumen, welches von allen bei der Messung gezählten Beads beansprucht wird, ins Verhältnis gesetzt wird, in das Volumenprozent, welches jede Teilchengröße darstellt, überführt werden.
Die erfindungsgemäße Teilchengrößenverteilung ist bevorzugt so definiert, dass mehr als 90% der Teilchen zwischen 20 und 500% des mittleren Teilchendurchmessers, stärker bevorzugt zwischen 50 und 200% des mittleren Teilchendurchmessers, am stärksten bevorzugt zwischen 50 und 150% des mittleren Teilchendurchmessers gefunden werden.
Eine bevorzugte Gestalt eines einzelnen Adsorbens-Teilchens ist im Wesentlichen kugelförmig. Die Gesamtgestalt der Teilchen ist jedoch normalerweise nicht sehr kritisch, so dass die Teilchen andere Typen von abgerundeten Gestalten, z.B. Ellipsoid-, Tropfen- und Bohnenformen, aufweisen können. Jedoch ist für bestimmte Verwendungen (z.B. wenn die Teilchen in einem Fließbett-Aufbau verwendet werden) bevorzugt, dass mindestens 95% der Teilchen im Wesentlichen kugelförmig sind.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen teilchenförmigen Materials kann durch verschiedene per se bekannte Verfahren durchgeführt werden (z.B. durch herkömmliche Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, siehe z.B. EP 0 538 350 B1 oder WO 97/17132). Zum Beispiel durch Blockpolymerisation von Monomeren; Suspensionspolymerisation von Monomeren; Block- oder Suspensiongelierung von Gel bildenden Materialien, z.B. durch Erwärmen und Kühlen (z.B. von Agarose) oder durch die Zugabe von „Gelierungskatalysatoren" (z.B. Zugeben eines geeigneten Metallions zu Alginaten oder Carrageenanen); Block- oder Suspensionvernetzen von geeigneten löslichen Materialien (z.B. Vernetzen von Dextranen, Cellulosen oder Stärken oder Gelatinen oder anderen organischen Polymeren mit z.B. Epichlorhydrin oder Divinylsulfon); Bildung von Kieselsäurepolymeren durch Ansäuern von Kieselsäurelösungen (z.B. Block- oder Suspensionslösungen); gemischte Verfahren z.B. Polymerisation und Gelierung; Sprühverfahren; und Fließbett-Beschichten von Dichte kontrollierenden Teilchen; Kühlen von Emulsionen von Dichte kontrollierenden Teilchen, welche in polymeren Grundmatrizes suspendiert sind, in erwärmten Öllösungsmitteln; oder durch Suspendieren von Dichte kontrollierenden Teilchen und aktiver Substanz in einer geeigneten Monomer- oder Copolymerlösung, gefolgt von Polymerisation.
In einer besonders geeigneten Ausführungsform, welche im Allgemeinen für die Herstellung des erfindungsgemäßen teilchenförmigen Materials verwendet wird, wird ein teilchenförmiges Material, welches Agarose als die polymere Grundmatrix und Stahl-Beads als das Kernmaterial umfasst, durch Erwärmen eines Gemisches von Agarose in Wasser (auf etwa 95°C), Zugeben der Stahl-Beads zu dem Gemisch und Überführen des Gemisches in ein heißes Öl (z.B. Pflanzenöle), Emulgieren des Gemisches durch starkes Rühren (gegebenenfalls mit Zugabe eines herkömmlichen emulgierenden Mittels) und Kühlen des Gemisches erhalten. Der Fachmann wird erkennen, dass die Teilchengröße (d.h. die Menge an polymerer Grundmatrix (hier: Agarose), welche in jedes Teilchen eingebracht wird) durch Variieren der Geschwindigkeit der Mischvorrichtung und des Kühlvorgangs angepasst werden kann. Nach der primären Herstellung einer Teilchenzubereitung kann die Teilchengrößenverteilung typischerweise weiter durch Sieben und/oder Fließbett-Ausschlämmen definiert werden.
Die durchlässige Matrix, wie Polymeragarose, wird typischerweise mit einer Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, welche hier als der Ligand bezeichnet wird, derivatisiert und das Adsorbens umfasst einen Liganden mit Affinität zu Proteinen. Der Ligand macht die adsorbierende Funktion der Adsorbens-Medien aus oder in das polymere Gerüst des Adsorbens-Teilchens ist per se eine Bindungsfunktion aufgenommen. Bekannte Ligandenchemikalien wie Kationenaustauscher, z.B. Sulfonsäure, stellten sich als effiziente Werkzeuge zur Reinigung von Molkeproteinen wie Lactoferrin und Lactoperoxidase heraus. Diese Proteine sind positiv geladen, sogar bei einem neutralen pH-Wert, und eine selektive Wechselwirkung mit einem Kationenaustauscher kann erhalten werden. Andere Proteine erfordern eine ausgefeiltere Bindungswechselwirkung mit dem Liganden, um eine selektive Adsorption zu erhalten.
Solche Affinitätsliganden, wie die zur Ladung befähigten Einheiten, können durch dem Fachmann bekannte Verfahren an die Grundmatrix gekoppelt werden, z.B. wie in „Immobilized Affinity Ligand Techniques" von Hermanson et al., Academic Press, Inc., San Diego, 1992 beschrieben. In Fällen, wo die polymere Grundmatrix nicht die Eigenschaften aufweist, als eine aktive Substanz zu fungieren, kann die polymere Grundmatrix (oder Matrizes, wo ein Gemisch von Polymeren verwendet wird) in den Verfahren von Aktivierung oder Derivatisierung derivatisiert werden, damit sie als eine aktive Substanz fungiert. So können Materialien, welche Hydroxyl-, Amino-, Amid-, Carboxyl- oder Thiolreste umfassen, unter Verwendung von verschiedenen aktivierenden Chemikalien, z.B. Chemikalien wie Bromcyan, Divinylsulfon, Epichlorhydrin, Bisepoxyrane, Dibrompropanol, Glutardialdehyd, Carbodiimide, Anhydride, Hydrazine, Periodate, Benzochinone, Triazine, Tosylate, Tresylate und Diazoniumionen, aktiviert oder derivatisiert werden.
Speziell bevorzugte Verfahren zur chemischen Derivatisierung und spezifische Liganden, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, sind in WO 98/08603 beschrieben.
Es wurde gefunden, dass die Ligandkonzentration auf dem Adsorbens sehr wesentlich ist, um eine optimale Adsorptionsstärke und Produktivität des Adsorbens sicher zu stellen. So trägt in einer geeigneten Ausführungsform das Adsorbens Liganden für die Adsorption der biomolekularen Substanzen in einer Konzentration von mindestens 20 nM, wie mindestens 30 mM oder mindestens 40 mM, bevorzugt mindestens 50 mM und am stärksten bevorzugt mindestens 60 mM.
Eine Untergruppe von Adsorbentien kann in Bezug auf ihre Bindekapazität zu Rinderserumalbumin (BSA) charakterisiert werden. Diese Untergruppe von Adsorbentien ist typischerweise jene, welche einen Liganden umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus i) Liganden, welche aromatische oder heteroaromatische Reste (Reste) der folgenden Typen als funktionelle Gruppen umfassen: Benzoesäuren wie 2-Aminobenzoesäuren, 3-Aminobenzoesäuren, 4-Aminobenzoesäuren, 2-Mercaptobenzoesäuren, 4-Amino-2-chlorbenzoesäure, 2-Amino-5-chlorbenzoesäure, 2-Amino-4-chlorbenzoesäure, 4-Aminosalicylsäuren, 5-Aminosalicylsäuren, 3,4-Diaminobenzoesäuren, 3,5-Diaminobenzoesäure, 5-Aminoisophthalsäure, 4-Aminophthalsäure; Zimtsäuren wie Hydroxyzimtsäuren; Nicotinsäuren wie 2-Mercaptonicotinsäuren; Naphthoesäuren wie 2-Hydroxy-1-naphthoesäure; Chinoline wie 2-Mercaptochinolin; Tetrazolessigsäuren wie 5-Mercapto-1-tetrazolessigsäure; Thiadiazole wie 2-Mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol; Benzimidazole wie 2-Aminobenzimidazol, 2-Mercaptobenzimidazol und 2-Mercapto-5-nitrobenzimidazol; Benzothiazole wie 2-Aminobenzothiazol, 2-Amino-6-nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercapto-6-ethoxybenzothiazol; Benzoxazole wie 2-Mercaptobenzoxazol; Thiophenole wie Thiophenol und 2-Aminothiophenol; 2-(4-Aminophenylthio)essigsäure; aromatische oder heteroaromatische Sulfonsäuren and Phosphonsäuren, wie 1-Amino-2-naphthol-4-sulfonsäure und Phenole wie 2-Amino-4-nitrophenol. Es sollte berücksichtigt werden, dass der Fall, wo M Agarose ist, SP1 von Vinylsulfon abgeleitet ist und L 4-Aminobenzoesäure ist, speziell in Bezug auf die erfindungsgemäßen Festphasenmatrizes ausgenommen ist, vgl. WO 92/16292, am stärksten bevorzugt Aminobenzoesäuren wie 2-Aminobenzoesäure, 2-Mercaptobenzoesäure, 3-Aminobenzoesäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Amino-2-chlorbenzoesäure, 2-Amino-5-chlorbenzoesäure, 2-Amino-4-chlorbenzoesärue, 4-Aminosalicylsäuren, 5-Aminosalicylsäuren, 3,4-Diaminobenzoesäuren, 3,5-Diaminobenzoesäure, 5-5-Aminoisophthalsäure, 4-Aminophthalsäure; ii) Liganden, welche 2-Hydroxyzimtsäuren, 3-Hydroxyzimtsäure und 4-Hydroxyzimtsäure umfassen, iii) Liganden, welche einen Carbonsäure- und einen Aminorest als Substituenten umfassen wie 2-Aminonicotinsäure, 2-Mercaptonicotinsäure, 6-Aminonicotinsäure und 2-Amino-4-hydroxypyrimidincarbonsäure, iv) Ligand, welcher Reste umfasst, die sich von einem Benzolring ableiten, der mit einem heteroaromatischen Ringsystem kondensiert ist, z.B. ein Ligand ausgewählt aus Benzimidazolen wie 2-Mercaptobenzimidazol und 2-Mercapto-5-nitrobenzimidazol; Benzothiazole wie 2-Amino-6-nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercapto-6-ethoxybenzothiazol; Benzoxazole wie 2-Mercaptobenzoxazol; und v) Liganden, welche aus der Gruppe von Thiophenolen ausgewählt sind wie Thiophenol und 2-Aminothiophenol.
Innerhalb der Ausführungsform, wobei der Ligand aus der Gruppe i) bis v) ausgewählt ist, weisen die Adsorbentien typischerweise eine dynamische Bindekapazität von mindestens 10 g biomolekulare Substanz pro Liter, stärker bevorzugt von mindestens 20 g pro Liter, noch stärker bevorzugt von mindestens 30 g pro Liter auf, wenn gemäß den in der relevanten Verwendung verwendeten Verfahrensbedingungen getestet wird. Die Bindekapazität des Adsorbens kann in Bezug auf ihre Bindekapazität zu Rinderserumalbumin (BSA) bestimmt werden. Die Bindekapazität ist typischerweise so, dass gemäß Testverfahren A mindestens 10 g/l BSA bindet.
Das Verfahren A ist ein Verfahren, welches zur Bestimmung der Rinderalbumin-Bindekapazität von ausgewählten Adsorbentien verwendet wird, wobei es aus dem folgenden Verfahren besteht:
Rinderserumalbumin-Lösung pH-Wert 4,0 (BSA pH 4,0): Gereinigtes Rinderserumalbumin (A 7906, Sigma, USA) wird in einer Endkonzentration von 2 mg/ml in 20 mM Natriumcitrat pH-Wert 4,0 gelöst. Die Adsorbentien werden mit 50 Volumenteilen 20 mM Natriumcitrat pH-Wert 4,0 gewaschen und auf einem Saugfilter dräniert.
Eine Probe von 1,0 ml durch Saugen dräniertes Adsorbens wird in ein 50 ml-Testrohr gegeben, gefolgt von der Zugabe von 30 ml BSA, pH-Wert 4,0.
Das Testrohr wird dann mit einem Stopfen verschlossen und die Suspension wird auf einer Rollmischvorrichtung für 2 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) inkubiert. Das Testrohr wird dann für 5 min bei 2000 UpM zentrifugiert, um das Adsorbens vollständig abzusetzen. Der Überstand wird dann von dem Adsorbens durch Pipettieren in ein getrenntes Testrohr, wobei die Übertragung von jedweden Adsorbens-Teilchen vermieden wird, isoliert und durch einen kleinen nicht-adsorbierenden 0,2 μm-Filter (Millipore, USA) filtriert. Danach wird eine Bestimmung der Konzentration von nicht-gebundenem BSA in dem Überstand durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 280 nm an einem Spektrophotometer durchgeführt.
Die Menge des an das Adsorbens gebundenen BSA wird dann gemäß der folgenden Formel berechnet: mg BSA gebunden pro ml durch Saugen dräniertes Adsorbens = (1 – (OD des Testüberstandes/OD der BSA-Ausgangslösung)) × 60 mg BSA/ml Adsorbens.
Waschen
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Waschflüssigkeit Wasser z.B. Leitungswasser, demineralisiertes Wasser, Wasser, welches durch Umkehrosmose hergestellt wurde, oder destilliertes Wasser.
In einer besonders interessanten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Wasch- und Elutionsschritt in einem Schritt kombiniert, wobei ein und dieselbe Flüssigkeit verwendet wird, um die Verunreinigungen auszuwaschen sowie darauffolgend das Produkt zu eluieren.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Flussrate, welche für die mit einbezogenen Waschschritte verwendet wird, aus den Bereichen ausgewählt, welche vorher für die Aufbringung des Protein enthaltenden Gemisches auf die Adsorbens-Säule dargelegt wurden.
Elution
Die biomolekularen Substanzen von Interesse werden von dem Adsorbens-Medium durch Verwendung eines Elutionspuffers, welcher eine im Allgemeinen klare und konzentrierte Lösung des Produkts hergestellt, freigesetzt.
Um das/die zu eluierende(n) Protein oder Proteine zu erhalten, kann die Elution nach jedwedem Verfahren durchgeführt werden, welches herkömmlicherweise beschrieben wird und auf dem Fachgebiet bekannt ist.
In einer alternativen und gut geeigneten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Elution des adsorbierten Proteins mit einer Lösung durchgeführt, welche typischerweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verdünnter Base, verdünnter Säure und Wasser. In der Ausführungsform, wobei der Eluierungs- oder Waschschritt mit einer solchen Lösung durchgeführt wird, wird die Lösung so verdünnt, dass die Menge an Salz und anderen nicht gewünschten Substanzen, welche in dem eluierten Produkt vorhanden sind, minimiert wird.
So weist in einer bevorzugten Ausführungsform die verdünnte Säure oder Base, welche für die Elution der biomolekularen Substanz verwendet werden, eine Salzkonzentration von weniger als 50 mM, bevorzugt von weniger als 30 mM, noch stärker bevorzugt von weniger als 20 mM auf. Die Bestimmung der Salzkonzentration wird direkt an der Eluatfraktion, welche das/die zu isolierende(n) Protein oder Proteine enthält, ohne zusätzliche Verdünnung der Eluatfraktion durchgeführt. Im Allgemeinen können billige und nicht-toxische Säuren und Basen verwendet werden. Speziell bevorzugt sind die Basen Natriumhydroxid (NaOH), Kaliumhydroxid (KOH), Calciumhydroxid (Ca(OH)₂), Ammoniumhydroxid (NH₄OH).
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Flussrate, welche für den Elutionsschritt oder die mit einbezogenen Schritte verwendet wird, aus den Bereichen ausgewählt, welche vorher für die Aufbringung des Protein enthaltenden Gemisches auf die Adsorbens-Säule dargelegt wurden.
Das Produkt
In einigen Fällen werden mehr als ein Molekül von Interesse an dem Adsorbens adsorbiert und eine darauffolgende Elution kann durchgeführt werden, um die Anzahl der Produkte zu erhöhen, d.h. ein Protein wird von dem Adsorbens in einer Weise freigesetzt, so dass das zweite Protein adsorbiert bleibt. Darauffolgend wird das zweite Protein unter veränderten Bedingungen, wie einem alternativen Eluenten, freigesetzt.
Im vorliegenden Zusammenhang werden der Ausdruck „Protein" und der Ausdruck „biomolekulare Substanz" austauschbar verwendet und sie betreffen eine Verbindung mit biologischem Ursprung, welche mindestens zwei Aminosäuren umfasst, wie Peptid, Polypeptid, Lipoprotein, Lipopolypeptid, Glycopeptid, Glycoprotein, Enzym, Antikörper und Immunglobulin.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das aus dem Protein enthaltenden Gemisch isolierte Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lactoperoxidase, Lactoferrin, Rinderserumalbumin, β-Lactoglobulin, Immunglobulin, α-Lactalbumin und Glycomacropeptid.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht Eluate mit hoher Proteinreinheit. Mindestens eine Fraktion an isoliertem Protein umfasst 70% w/w des Gesamtproteins, stärker bevorzugt mindestens 80% des Gesamtproteins und am stärksten bevorzugt mindestens 90% w/w des Gesamtproteins.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beträgt die Reinheit des zu isolierenden Proteins, welche in dem Eluat gemessen wird, mindestens 65%, wie mindestens 75%, z.B. mindestens 85%, wie mindestens 90%, z.B. mindestens 95% wie mindestens 98%, z.B. 100%.
Die Eluatfraktion, welche das Proteinprodukt enthält, muss weiter verarbeitet werden, um ein pulverisiertes Produkt zu erhalten. Eine kleine Ultrafiltrationseinheit konzentriert das Produkt vor dem Trocknen von einer verdünnten Proteinlösung zu einem Proteinkonzentrat. Die Wahl der Trocknungstechnik hängt von der Wärmeempfindlichkeit des speziellen Proteins ab.
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen
Eine geeignete erfindungsgemäße Ausführungsform des EBA-Verfahrens zur Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Milch und Molke kann in der 3 und den folgenden Schritten zusammengefasst werden: Equilibrierung (gegebenenfalls), Aufbringung von von Milch abgeleitetem Rohmaterial, Waschung (gegebenenfalls) und Elution. Vor dem Starten des nächsten Verfahrenscyclus kann das Adsorbens wieder equilibriert und/oder in einer bestimmten Häufigkeit regeneriert werden. Während des gesamten Verfahrens wird das Adsorbens durch einen Aufwärtsstrom der Flüssigkeit in der Säule expandiert, d.h. die Flussrichtung wird während eines Verfahrenscyclus nicht umgekehrt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Adsorbens mehr als eine Population von Teilchen, wobei jede Population von Teilchen unterschiedliche Dichten aufweist, d.h. das Adsorbens kann ein Gemisch von zwei Teilchenzubereitungen mit unterschiedlichen Teilchengrößenverteilungen und unterschiedlichen Dichten sein. Bevorzugt wird in einem Adsorbens-Gemisch von zwei getrennten Populationen die Population von Teilchen mit der niedrigsten mittleren Teilchengröße eine höhere Dichte aufweisen als die Population von Teilchen mit der höchsten mittleren Teilchengröße. Als ein nicht einschränkendes Beispiel kann eine Adsorbens-Zubereitung aus einem Gemisch von zwei Populationen von Teilchen A und B bestehen, wobei die Teilchenpopulation A eine mittlere Teilchengröße von 100 μm und eine Dichte von 2,5 g/ml aufweist, während die Teilchenpopulation B eine mittlere Teilchengröße von 50 μm und eine Dichte von 4 g/ml aufweist. Es zeigte sich, dass eine solche gemischte Population von Adsorbens-Teilchen überraschenderweise eine hohe dynamische Bindekapazität (d.h. hohe Bindeeffizienz) bei Flussraten von über 10 cm/min (d.h. hohe Produktivität) aufweist, während noch auf einen Grad von unter H/H0 = 5,0 oder sogar unter H/H0 = 3,0 expandiert war.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Milch, entrahmter Milch, Molke und anderen von Milch abgeleiteten Rohmaterialien basierend auf der Adsorption an jedwedem Typ von Festphasenmaterial von jedweder/jedwedem Gestalt und Format, einschließlich Festbett-Adsorption, Chargenadsorption, suspendiertes Bett-Adsorption, EBA und auf Membran basierende Adsorption, charakterisiert durch die Verwendung von speziellen Verfahrensbedingungen, welche die Elution der gebundenen Substanzen von dem Adsorbens ermöglichen, so dass die Salzendkonzentration in dem Eluat unter 50 mM Salz gehalten wird, bereit zu stellen.
Adsorptionsverfahren werden normalerweise im Allgemeinen durch die Verwendung von einem Adsorptionsschritt, welcher in einem oder mehreren isolierten Produkten resultiert, offenbart. Obwohl die technologische Möglichkeit der Verwendung von mehrfachen aufeinanderfolgenden Adsorptionsschritten an z.B. menschlichem Serum bekannt ist, wurden keine solche modularen Verfahrensfließschemata für die industrielle Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Milch oder von Milch abgeleiteten Rohmaterialien vorgeschlagen oder verwirklicht. Jedoch ist ein solches modulares Verfahrenskonzept in der Milchindustrie noch nicht bekannt und das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Milchindustrie besonders zugänglich und hoch attraktiv, da ein Bedarf besteht, die Herstellung von einem Produkt von anderen Produkten zu entkoppeln, um eine maximale Flexibilität im Herstellungsaufbau zu erhalten und um dabei in der Lage zu sein, auf schwankende Marktbedürfnisse zu reagieren und die Möglichkeit zu haben, die nicht gebundene Fraktion in einer flexibleren Weise zu verwenden (z.B. für die Herstellung von WPC- oder WPI-Produkten).
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein modulares Verfahren zur Isolierung und Fraktionierung von biomolekularen Substanzen aus Milch, entrahmter Milch, Molke und anderen von Milch abgeleiteten Rohmaterialien basierend auf der Adsorption an jedwedem Typ von Festphasenmaterial von jedweder/jedwedem Gestalt und Format, einschließlich Festbett-Adsorption, Chargenadsorption, suspendiertes Bett-Adsorption, EBA und auf Membran basierende Adsorption, charakterisiert durch die Verwendung von zwei oder mehreren aufeinanderfolgenden aber unabhängig arbeitenden Adsorptionsschritten, bereit zu stellen, welches zwei oder mehr gereinigte biomolekulare Substanzen in Mengen gemäß dem einzelnen und aktuellen Bedarf für jede Substanz bereitstellt.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren, welches sich durch ein modulares Verfahrenskonzept für eine optimale Marktanpassung und eine Ausweitung des Fraktionierungsschemas auszeichnet.
Ein geeignete erfindungsgemäße Ausführungsform des modularen Verfahrens ist in 2 beispielhaft dargestellt, welche sich für veranschaulichende Zwecke auf eine Molkeproteinfraktionierungsvorrichtung bezieht: Lactoferrin und Lactoperoxidase können an Säule I adsorbiert werden. Der Durchlauf von Schritt I enthält die verbleibenden Molkeproteine und Schritt II fängt die Immunglobulinfraktion von dem Durchlauf ein. Folglich enthält der Durchlauf von Schritt II den Hauptanteil der Molkeproteine, welche weiter bei der WPC- oder WPI-Herstellung verwendet werden können. Die pH-Wert abhängige Bindungschemie in Schritt II ermöglicht auch die Extraktion von Rinderalbumin und β-Lactoglobulin.
In jedem Schritt kann die Anzahl und die Größe der parallel verbundenen Säulen angepasst werden, um eine optimale Marktanpassung zu erhalten. Auch ist eine Ausweitung einer Fraktionierungsvorrichtung möglich, so dass neue Proteine von Interesse isoliert werden können. Dies wird durch das Hinzufügen eines weiteren Säulensets mit der passenden Ligandchemie für eine weitere selektive Proteinextraktion aus der Durchlauffraktion erreicht.
Bei dem modularen Verfahren umfasst mindestens ein Adsorbens ein polymeres Material.
Es ist eine besondere Aufgabe dieser Erfindung, ein modulares Verfahren zur Herstellung von gereinigter Lactoperoxidase, Lactoferrin, β-Lactoglobulin, Rinderalbumin, Immunglobulin G, α-Lactalbumin und Glycomacropeptid aus Milch, entrahmter Milch, Molke und anderen von Milch abgeleiteten Rohmaterialien bereit zu stellen, wobei das Verfahren mindestens zwei aufeinanderfolgende Adsorptionsschritte umfasst, wobei der erste Adsorptionsschritt gereinigte Lactoperoxidase und Lactoferrin bereitstellt und der zweite Adsorptionsschritt beta-Lactoglobulin, Albumin und Immunglobulin G in einer oder mehreren Fraktionen bereitstellt.
Das modulare Verfahren umfasst zwei oder mehr modulare Einheiten, welche typischerweise in Reihe verbunden sind.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Immunglobulin G, Lactoferrin und Lactoperoxidase in einem Adsorptionsschritt bereit zu stellen.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das Gemisch mindestens 2 Proteine und die Fraktionierung der mindestens 2 Proteine wird unter Verwendung eines expandiertes Adsorbens-Bettes oder Adsorbens-Festbettes oder Kombinationen davon durchgeführt.
Die Fraktionierung wird mit mindestens 2 Adsorbentien durchgeführt, wobei jedes in einer modularen Einheit platziert ist.
Die Schritte der Fraktionierung der Proteine aus dem Gemisch umfassen die Schritte:

i) gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes in dem Gemisch;
ii) gegebenenfalls Equilibrieren des Adsorbens;
ii) Aufbringen der Lösung auf die Adsorbentien;
iii) gegebenenfalls Waschen mit einer Flüssigkeit;
iv) Eluieren der adsorbierten Proteine mit einem oder mehreren Eluenten, welche aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus verdünnte Säure, verdünnte Base und Wasser;
vi) Isolieren von mindestens einem Proteingemisch, umfassend ein einzelnes Protein oder verschiedene Proteine.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform bezieht das modulare Verfahren die Inline-Isolierung von mindestens einem der Proteine, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Lactoperoxidase, Lactoferrin, Rinderalbumin, β-Lactoglobulin, Immunglobulin, α-Lactalbumin und Glycomacropeptid oder Gemischen davon, aus einer Lösung ein, wobei die Lösung mindestens eines der vorstehend erwähnten Proteine umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

i) gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes der Lösung;
ii) Aufbringen der Lösung auf eine gegebenenfalls equilibrierte Adsorptionssäule, welche ein Adsorbens umfasst, wobei das Adsorbens ein Teilchen mit mindestens einem nicht-durchlässigen Kern mit hoher Dichte, umgeben von einem durchlässigen Material, umfasst und das Adsorbens eine Teilchendichte von mindestens 1,5 g/ml und eine mittlere Teilchengröße von höchstens 150 μm aufweist;
iii) gegebenenfalls Waschen mit einer Flüssigkeit;
iv) Eluieren von mindestens einem Protein von jeder modularen Einheit unter Verwendung von einem oder mehreren wässrigen Eluenten und wobei die Endkonzentration des Salzes in dem Eluat unter 50 mM gehalten wird.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Pfropfenströmung in der in der Säule vorhandenen Adsorbens-Schicht bereitgestellt. Diese Pfropfenströmung wird durch Bereitstellen einer Schicht von inerten Glas-Beads in der Säule etabliert und in der gerührten Zone oder im Bereich des Einlasses der Säule positioniert.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Verwendungen für isolierte Proteinprodukte bereit zu stellen, welche durch ein jedwedes der erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren hergestellt werden.
Die Forscher fanden, dass das bevorzugte Verfahren zur Einbringung von schwer zu handhabenden Rohmaterialien in eine Säule das durch relativ große Öffnungen ist. Die Flüssigkeitsverteilung in FastLine-Säulen basiert auf einem Rotationssprinkler-Prinzip. Ein Einlassventil für das Rohmaterial ist unter der Basis der Säule lokalisiert und das Rohmaterial tritt in die Säule durch Löcher mit großen Durchmessern (3 mm) in den hohlen Armen des Sprinklers ein. Wenn das Verfahren läuft, dreht sich der Sprinkler sanft, wobei eine schwungvolle Bewegung entlang des gesamten Querschnitts der Säule hervorgerufen wird.
Aufgrund des sanften Rührvorgangs des Sprinklers wird die gemischte Zone in dem expandierten Bett auf eine enge Zone eingeschränkt, welche am Boden der Säule lokalisiert ist, und es wird ein Pfropfenströmungsverhalten ohne Rückmischen im oberen Teil der Säule erhalten.
Die Säule kann die FastLine^®-Säule für EBA von UpFront sein, welche in der ebenfalls anhängigen Anmeldung Nr. PCT/DK01/00332 offenbart ist.
Andere Typen von Fließbett-Säulen wurden in WO 92/00799, WO 92/18237 und WO 99/65586 beschrieben.
Die folgenden Beispiele und Zeichnungen werden die Erfindung weiter veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Charakteristika eines EBA-Adsorbens.
Dieses Beispiel beschreibt die Merkmale des Adsorbens von UpFront Chromatography, welches in den Beispielen 2 bis 19 verwendet wird.
Der Ausdruck „UpFront Edelstahl-Agarose" betrifft Adsorbens-Teilchen, welche durch ein Emulgierverfahren wie konzeptionell in der Beschreibung beschrieben hergestellt werden. Sie umfassen ein Kernmaterial, welches aus Edelstahl-Beads (1-PSR 2, Anval, Schweden) mit einer Größe im Bereich von 22 bis 44 μm bestehen. Eine Schicht von Agarose (4% Agarose) umgibt das/die Edelstahlkern-Bead(s). Die Adsorbens-Teilchenpopulation wird gesiebt, um eine Teilchengrößenverteilung im Bereich von 30 bis 120 μm (siehe 4) zu erhalten. Der mittlere Teilchendurchmesser wurde durch eine mikroskopische Untersuchung kombiniert mit Bildverarbeitung als 65 μm bestimmt.
Die Teilchenpopulation des Adsorbens umfasst sowohl Verbundteilchen mit einer Pellicularstruktur (d.h. ein Stahl-Bead eingebettet in die polymere Agarose-Phase) als auch Konglomerat-Teilchen mit mehr als einem Stahl-Bead in der Agarose-Phase. Durch das folgende Verfahren wurde die Dichte der Adsorbens-Teilchen als 2,3 g/ml bestimmt:
Eine Probe des „UpFront Edelstahl-Agarose"-Adsorbens wurde vorsichtig auf einem Saugfilter gewaschen und danach durch sanftes Saugen in 5 Minuten von dem interstitiellen Wasser dräniert. Danach wurden 30,0 Gramm des feuchten aber durch Saugen dränierten Adsorbens in einen Messzylinder eingewogen, gefolgt von der Zugabe von 50,0 ml Wasser. Nach gründlichem Mischen der Adsorbens-Teilchen mit dem zugegebenen Wasser wurde das Gesamtvolumen (Vt) der resultierenden Suspension an dem Messzylinder abgelesen. Die Dichte der Adsorbens-Teilchen wurde dann gemäß der folgenden Formel berechnet: d = 30/(Vt – 50) g/ml.
Der Volumenanteil der Adsorbens-Teilchen, welcher die Agarose-Phase ausmacht, kann durch die Annahme einer ungefähren Dichte der Edelstahl-Beads von 8,0 g/ml und der Dichte der Agarose-Phase von 1,0 g/ml abgeschätzt werden. Bei diesen Annahmen beträgt der Volumenanteil der Adsorbens-Teilchen, welcher die Agarose-Phase ausmacht, ungefähr 81% v/v.
Beispiel 2.
Epoxy-Aktivierung und Vernetzen der „UpFront Edelstahl-Agarose" mit einer Polyepoxy-Verbindung.
Das in Beispiel 1 beschriebene Adsorbens „UpFront Edelstahl-Agarose" wurde durch die Verwendung einer polymeren Epoxy-Verbindung „GE 100", HS Code 2910 90 00, CAS-Nr.: 90529-77-4/25038-04-4 von RASCHIG GmbH, Ludwigshafen, Deutschland, folgend dem nachstehenden Verfahren chemisch aktiviert und vernetzt:
25 l feuchte aber durch Saugen dränierte „UpFront Edelstahl-Agarose" wurde mit 20 l demineralisiertem Wasser, 10 kg Natriumsulfat (wasserfrei), 2,5 l 32,5%ige (w/w) Natriumhydroxid und 1,25 l „GE 100" gemischt. Die Suspension wurde gründlich bei Raumtemperatur für 1 Stunde gemischt. Zu dieser Zeit wurden weitere 1,25 l „GE 100" zu der gerührten Suspension gegeben, gefolgt von Mischen bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde. Die Zugabe von 1,25 l „GE 100", gefolgt von Mischen für eine Stunde wurde weitere drei Male wiederholt, so dass zu der Suspension insgesamt 5 × 1,25 l „GE 100" gegeben wurden.
Nach der Umsetzung mit „GE 100" wurde das Adsorbens mit 250 l heißem (40°C) Wasser auf einem Saugfilter und 250 l Wasser mit Raumtemperatur gewaschen.
Beispiel 3.
Herstellung eines Sulfonsäure-Ionenaustauschers mit Butansulton.
Das in Beispiel 2 hergestellte mit „GE 100" aktivierte und vernetzte Adsorbens wurde weiter mit Butansulton umgesetzt, um einen Kationenaustauscher herzustellen, welcher Sulfonsäuregruppen umfasst.
25 l mit „GE 100" umgesetzte „UpFront Edelstahl-Agarose" von Beispiel 2 wurde auf einem Saugfilter mit 50 l 32,5%iger w/w Natriumhydroxid gewaschen, gefolgt von Dränieren durch sanftes Saugen. Der stark basische Adsorbens-Kuchen wurde in einen ummantelten und thermostatisierten Reaktionstank überführt und 15 l deionisiertes Wasser wurden zugegeben. Das Adsorbens wurde in der wässrigen Phase durch sanftes Rühren suspendiert und die Suspension wurde dann auf 70°C erwärmt.
Zu der Suspension wurde dann 1 kg Natriumdodecylsulfat gegeben, das unter sanftem Rühren gelöst wurde. Während das Rühren aufrecht erhalten wurde und die Temperatur nahe bei 70°C gehalten wurde, wurde 1,4-Butansulton, Code 13671, CAS-Nr.: 1633-83-6, ORGANICA, Wolfen, Deutschland in 8 Portionen von jeweils 1,56 l Butansulton zugegeben. Zwischen jeder Zugabe des Butansultons ermöglichte man eine Umsetzung der Suspension unter Rühren für 20 min. Nach der letzten Zugabe von Butansulton wurde die Adsorbens-Suspension für weitere 20 min gerührt.
Nach der Umsetzung mit Butansulton wurde das Adsorbens auf einem Saugfilter wieder mit 500 l Wasser gewaschen, gefolgt von Waschen in einer expandiertes Bett-Säule (⌀ = 30 cm) mit weiteren 500 l Wasser unter Verwendung einer linearen Flussrate von 15 cm/min. Das gewaschene Adsorbens, welches nun Kationenaustausch-Sulfonsäuregruppen umfasste, wurde dann dräniert und in 20% Ethanol gelagert. Die Gehalte an Sulfonsäuregruppen, welche kovalent an die Agarose-Phase des Adsorbens gekuppelt sind, wurden durch Säure-Base-Titration als 125 Millimol pro Liter feuchtes aber dräniertes Adsorbens bestimmt.
Beispiel 4.
Epichlorhydrin-Aktivierung der „UpFront Edelstahl-Agarose"
30 l von in Beispiel 1 beschriebener „UpFront Edelstahl-Agarose" wurden mit demineralisiertem Wasser gewaschen und auf einem Saugfilter dräniert. Der Adsorbens-Kuchen wurde dann in einen ummantelten und thermostatisierten Reaktionstank überführt und 24 l deionisiertes Wasser wurden zugegeben. Das Adsorbens wurde in der wässrigen Phase durch sanftes Rühren suspendiert und die Suspension wurde dann auf 40°C erwärmt. Danach wurden 3 l 32,5%ige w/w Natriumhydroxid und 3,8 l Epichlorhydrin zugegeben, worauf die Suspension bei 40°C für 2 Stunden gerührt wurde. Nach der Umsetzung mit Epichlorhydrin wurde das Adsorbens mit 500 l deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur gewaschen.
Der Gehalt an Epoxygruppen wurde durch Titration mit Thiosulfat entsprechend 35 Millimol pro Liter feuchtes aber dräniertes Adsorbens bestimmt.
Das Epoxy-aktivierte Adsorbens wurde dann weiter mit einem Liganden wie in Beispiel 5 beschrieben umgesetzt.
Beispiel 5.
Kuppeln von 2-Mercaptobenzoesäure an Epoxy-aktiviertes Adsorbens.
Das gemäß Beispiel 4 hergestellte Epichlorhydrin-aktivierte Adsorbens wurde weiter mit dem Liganden 2-Mercaptobenzoesäure durch das folgende Verfahren umgesetzt. Zu einem Liter durch Saugen dräniertes Epoxy-aktiviertes Adsorbens wurde 1 Liter einer Lösung von 100 g/l 2-Mercaptobenzoesäure, welche mit 5 M Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11 titriert worden war, gegeben. Die Adsorbens-Suspension wurde dann sanft für 18 Stunden bei Raumtemperatur gemischt, gefolgt von Waschen mit 20 Litern deionisiertem Wasser.
Die Menge von 2-Mercaptobenzosesäure, welche kovalent an das Adsorbens gekuppelt ist, wurde durch Säure-Base-Titration als 31 Millimol pro Liter feuchtes aber dräniertes Adsorbens bestimmt.
Beispiel 6.
Kuppeln von 2-Mercaptonicotinsäure.
Das gemäß Beispiel 4 hergestellte Epichlorhydrin-aktivierte Adsorbens wurde weiter mit dem Liganden 2-Mercaptonicotinsäure durch Folgen dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren umgesetzt.
Die Ligandkonzentration wurde als 32 Millimol pro Liter dräniertes Adsorbens bestimmt.
Beispiel 7.
EBA an Süßmolke zur Isolierung und Reinigung von Lactoperoxidase und Lactoferrin
Eine EBA-Säule (Durchmesser = 2 cm), FastLine 20, Katalognr. 7020-0000, UpFront Chromatography A/S, Dänemark wurde auf einem Magnetrührer platziert und 15 ml demineralisiertes Wasser wurden in die Säule gegeben. Feste Glas-Beads 150 bis 250 μm (K. Høyer Christensen, Dänemark) wurden in die Säule gegeben, bis ein Festbett mit einer Höhe von 10 cm erreicht war, gefolgt von der Zugabe eines in Beispiel 3 hergestellten Festbettes des Sulfonsäure-Kationenaustauschers mit einer Höhe von 10 cm (31 ml). Die festen Glas-Beads wurden zugegeben, damit sie als eine Schicht von inerten Beads fungieren, welche in der gerührten Zone am Boden der Säule während dem Verfahren positioniert sind. Dies kann im Allgemeinen in einer effizienteren Ausbeutung des Adsorbens resultieren, da im Vergleich mit einem Aufbau ohne zugegebene Glas-Beads am Boden der Säule ein höherer Anteil des Adsorbens dann über der gerührten Zone positioniert sein wird (in der Pfropfenströmungszone mit minimalem Rückmischen).
Die Säule wurde mit einem UV-Monitor (Amersham Pharmacia Biotec AB, Schweden, optische Einheit UV-1) und einer Aufzeichnungsvorrichtung (Pharmacia Schweden, Pharmacia/LKB Rek. 1) verbunden. Der Magnetrührer (Janke & Künhel BMBH & Co., IKA MAG REO) wurde gestartet und die Säule wurde für 15 Minuten mit Leitungswasser unter Verwendung eines linearen Flusses von 10 cm/min gewaschen. Eine frische Probe von nicht pasteurisierter Rindersüßmolke (von der Herstellung von Mozarella-Käse) wurde mit 1 M NaOH (Merck, Katalognr. 1.06498) auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und dann wurden 6,2 l Molke unter Verwendung eines lineares Flusses von 7,5 cm/Minute auf die Säule geladen (Adsorbens:Molke-Verhältnis 1:200).
Als die gesamte Molke geladen war, wurde die Säule mit Leitungswasser (Leitfähigkeit 0,65 mS/cm) gewaschen, bis die UV-Basislinie an der Aufzeichnungsvorrichtung erreicht war (2,0 AUFS). Der Grad der Expansion des Adsorbens (H/H0, d.h. die Höhe des expandierten Bettes bei einer gegebenen Flussrate im Verhältnis zur Höhe des Festbettes bei einem Fluss von null) wurde während dem Experiment visuell aufgezeichnet.
Lactoperoxidase (LP), welche an das Adsorbens gebunden wurde, wurde dann mit 25 mM K₂HPO₄ (Merck, Katalognr. 1.05101), 0,3 M NaCl (Baker, Katalognr. 0319), welche mit HCl (Merck, Katalognr. 1.00316) auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt worden war, eluiert. Der eluierte LP-Peak wurde gemäß dem aufgezeichneten UV-Signal gesammelt. Lactoferrin (LF), welches auch zusammen mit LP an das Adsorbens gebunden wurde, wurde mit 20 mM NaOH (Merck, Katalognr. 1.06498) eluiert und der LP-Peak wurde gemäß dem aufgezeichneten UV-Signal gesammelt. Nach der Elution wurde der pH-Wert in dem LF-Eluat mit 1 M HCl (Merck, Katalognr. 1.00316) auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 eingestellt.
Die Ausbeute an LP und LF wurde durch Messen der optischen Dichte, OD 280 nm, der Eluate an einem Spectronic, Cecil CE2041, UV-Spektrophotometer bestimmt.
Die Ausbeute an LP und LF in den Eluaten wurde dann unter Verwendung der folgenden Extinktionskoeffizienten für die zwei Proteine berechnet:
Lactoperoxidase E_{280,1mg/ml,1cm} = 1,2
Lactoferrin E_{280,1mg/ml,1cm} = 1,0
Diesem folgend kann die Ausbeute an mg LP und mg LF pro Liter geladene Molke berechnet werden.
Die Reinheit der Eluate wurde durch SDS-Polyacrylamidelektrophorese unter Verwendung von vorgefertigten Gelen bestimmt: SDS Page 4 bis 20% Tris-Glycin Gel 1,0 mm Katalognr. 345-0033 BioRad, Laufpuffer Katalognr. EC2675 Invitrogen und Probenpuffer Katalognr. EC2676, Invitrogen. Die Eluate und das rohe Molkerohmaterial wurden 1 + 1 mit dem nicht reduzierenden Probepuffer verdünnt und auf einem Wasserbad bei 100°C für 5 Minuten erwärmt. 20 μl von jeder Probe wurden auf das Gel geladen. Die Elektrophoreseapparatur, BioRad, wurde an die Stromversorgung angeschlossen und die Spannung wurde auf 200 Volt gesetzt. Der Strom wurde abgeschaltet, als der blaue Marker den untersten Teil des Gels erreichte. Das SDS-Gel wurde mit einem Colloid Blue Staining Kit LC6025, Invitrogen für 18 Stunden auf einem Schütteltisch angefärbt und in Wasser entfärbt.
Trockenes Material in den Eluaten wurde durch Gefriertrocknen bestimmt (Hetosicc, Heto Holten Dänemark). Vor dem Gefriertrocknen wurden die Eluate gegen demineralisiertes Wasser bei 4°C in einem Verhältnis von 1 Volumenteil Eluat zu 100 Volumenteilen Wasser dialysiert. 4 Wasserwechsel wurden über 2 Tage durchgeführt, bevor das Eluat gefriergetrocknet wurde.
Nach beendeter Dialyse wurde die Leitfähigkeit gemessen (Crison-Leitfähigkeitsmessgerät 525) und 50 ml des dialysierten Eluats wurden über Nacht gefriergetrocknet. Das trockene Material wurde durch Wiegen des Rückstandes bestimmt. Ergebnisse: Expansion der Matrix (einschl. inerten Glas-Beads) bei einem linearen Fluss von 7,5 cm/min
Höhe des Festbettes H₀ = 20 cm Ausbeuten von LF und LP

Messung der OD 280 nm: Peak 1 (LP) 0,785 Peak 2 (LF) 2,080

Volumen der Eluate: Peak 1 (LP) 250 ml Peak 2 (LF) 200 ml

Gesamtausbeute an LP und LF:

Ausbeute an LP und LP pro Liter geladener Molke:
Gefriertrocknen der Eluate:

Leitfähigkeit nach beendeter Dialyse LP-Eluat 20 μS LF-Eluat 16 μS

Ausbeute, bestimmt als Trockenmaterial: LP 32 mg/l geladene Molke LF 63 mg/l geladene Molke
Wie gesehen werden kann, besteht eine gute Übereinstimmung zwischen der spektrophotometrischen Bestimmung der Ausbeuten und den Ausbeuten, welche durch Messen des Trockenmaterials in jedem Eluat bestimmt wurden.
Reinheit des eluierten LP und LF:
Die Reinheit der eluierten Proteine wurde durch SDS-PAGE bestimmt. Wie aus 5 ersichtlich ist, wurden die eluierten LP und LF sehr effizient isoliert und gereinigt.
Drei Experimente wurden durchgeführt, welche als A, B und C markiert wurden. Drei FastLine 20-Säulen wurden mit inerten Glas-Beads und aktivem Sulfonsäure-Ionenaustauscher geladen. Jede FastLine 20-Säule wurde mit 10 cm inerten Glas-Beads und mit 5 cm Höhe an in Beispiel 3 hergestelltem Festbett von Sulfonsäure-Kationenaustauscher gepackt.
Unter Verwendung von 1 M NaOH wurde für die Säule A die nicht pasteurisierte Süßmolke (von der Herstellung von Mozarella-Käse) auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, für die Säule B wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und für die Säule C wurde die Molke auf 7,5 eingestellt.
Die Experimente veranschaulichen die Wirkung eines variierenden pH-Werts auf die Ausbeute und Reinheit der/des isolierten Lactoperoxidase und Lactoferrins. Die Süßmolke wurde bei einer linearen Flussrate von 7,5 cm/min in einem Verhältnis zwischen Adsorbens und Molke von 1:200 auf die Säule geladen (Materialien und Aufbau siehe Beispiel 7).
Ergebnisse: Ausbeute aus der Messung der OD 280 nm der Eluate:
Bestimmung der Reinheit durch SDS-PAGE
Beispiel 9.
EBA an Süßmolke. Variation der Flussrate.
Vier Experimente wurden durchgeführt, welche als A, B, C und D markiert wurden. Die Experimente veranschaulichen die Wirkung einer Variierung der Flussrate während dem Laden der Molke auf die Ausbeute und die Reinheit der/des isolierten Lactoperoxidase und Lactoferrins.
Vier Säulen wurden gepackt. Jede FastLine 20-Säule wurde mit 10 cm Glas-Beads und mit 5 cm Höhe an in Beispiel 3 hergestelltem Festbett von Sulfonsäure-Kationenaustauscher gepackt.
Nicht pasteurisierte Süßmolke (von der Herstellung von Mozarella-Käse), welche auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt worden war, wurde auf die Säule in einem Verhältnis von 1:200 geladen und man ließ 4 unterschiedliche Säulen mit unterschiedlichem linearen Fluss laufen (Materialien und Aufbau siehe Beispiel 7).
Ergebnisse: Ausbeute aus der Messung der OD 280 nm der Eluate:
Bestimmung der Reinheit durch SDS-PAGE
Beispiel 10.
EBA an Süßmolke. Variation des Adsorbens:Molke-Verhältnisses.
Drei Experimente wurden durchgeführt, welche als A, B und C markiert wurden. Die Experimente veranschaulichen die Wirkung einer Variierung des Verhältnisses zwischen der Menge an Adsorbens und der Menge an geladener Molke auf die Ausbeute und die Reinheit der/des isolierten Lactoperoxidase und Lactoferrins.
Drei FastLine 20-Säulen wurden gepackt. Jede FastLine 20-Säule wurde mit 10 cm Glas-Beads und mit 5 cm Höhe an in Beispiel 3 hergestelltem Festbett von Sulfonsäure-Kationenaustauscher gepackt.
Die nicht pasteurisierte Süßmolke (von der Herstellung von Mozarella-Käse) wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und auf die Säule mit einem linearen Fluss von 7,5 cm/min geladen. Säule A, B und C wurde mit Molke in unterschiedlichem Verhältnis zwischen Matrix und Molke geladen (Materialien und Aufbau siehe Beispiel 7).
Ergebnisse: Ausbeute aus der Messung der OD 280 nm der Eluate:
Bestimmung der Reinheit durch SDS-PAGE
Beispiel 11.
EBA an Süßmolke. Variation der Ladungstemperatur.
Drei Experimente wurden durchgeführt, welche als A, B und C markiert wurden. Die Experimente veranschaulichen die Wirkung einer Variierung der Temperatur während dem Laden der Molke auf die Ausbeute und die Reinheit der/des isolierten Lactoperoxidase und Lactoferrins.
Drei FastLine 20-Säulen wurden gepackt. Jede FastLine 20-Säule wurde mit 5 cm Höhe an in Beispiel 3 hergestelltem Festbett von Sulfonsäure-Kationenaustauscher gepackt (d.h. bei diesen Experimenten wurden keine inerten Glas-Beads zugegeben).
Die nicht pasteurisierte Süßmolke (von der Herstellung von Danbo-Käse) wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und auf die Säule A bei +4°C, die Säule B bei 22°C und die Säule C bei 50°C geladen. Die Molke wurde mit einer linearen Flussrate von 7,5 cm/min und in einem Verhältnis zwischen Matrix und Molke von 1:300 geladen. Die Expansion der Matrix wurde während dem Lauf gemessen (Materialien und Aufbau siehe Beispiel 7).
Ergebnisse: Ausbeute aus der Messung der OD 280 nm der Eluate:
Bestimmung der Reinheit durch SDS-PAGE
Bestimmung der Expansion während dem Lauf
Beispiel 12.
EBA an entrahmter Milch.
Dieses Experiment veranschaulicht die erfindungsgemäße Verwendung von EBA unter Verwendung von entrahmter Milch als Rohmaterial.
Eine FastLine 20-Säule wurde mit 10 cm inerten Glas-Beads und mit 5 cm Höhe an in Beispiel 3 hergestelltem Festbett von Sulfonsäure-Kationenaustauscher gepackt. Entrahmte Milch (bei ihrem natürlichen pH-Wert von 6,7) wurde bei einem linearen Fluss von 10 cm/min und in einem Verhältnis zwischen Matrix und entrahmter Milch von 1:200 auf die Säule geladen. Die Expansion des Adsorbens wurde während dem Lauf gemessen (Materialien und Aufbau siehe Beispiel 7).
Ergebnisse: Ausbeute aus der Messung der OD 280 nm der Eluate:
Bestimmung der Reinheit durch SDS-PAGE
Bestimmung der Expansion während dem Lauf
Beispiel 13.
Festbett-Isolierung von Immunglobulinen aus Molke: Bindung von IgG an 2-Mercaptobenzoesäure-Harz, abhängig vom pH-Wert der Molke, welche auf das Adsorbens geladen wird.
Rinder-IgG kann durch die Verwendung von dem in Beispiel 5 beschriebenen Adsorbens, welches mit dem Liganden 2-Mercaptobenzoesäure gekuppelt wurde, aus saurer oder Süßmolke isoliert werden.
Fünf Festbett-Säulen (Durchmesser = 0,5 cm), welche jeweils 1 ml Adsorbens enthielten, wurden mit 5 ml demineralisiertem Wasser equilibriert. Saure Molke wurde auf jeweils einen pH-Wert von 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 beziehungsweise 6,0 eingestellt und auf die Säulen geladen. 20 ml Molke mit einem gegebenen pH-Wert wurde auf jede Säule geladen.
Die nicht gebundenen Proteine wurden jeweils mit 10 mM Natriumcitrat pH-Wert 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 beziehungsweise 6,0, entsprechend dem pH-Wert des Rohmaterials, welcher für die besondere Säule verwendet wurde, ausgewaschen. 7 ml Waschpuffer wurden für jede Säule verwendet.
Alle Säulen wurden mit 5 ml 20 mM Tris pH-Wert 9,5, gefolgt von 5 ml 20 mM Kaliumphosphat, 1 M Natriumchlorid pH-Wert 12,0 eluiert.
Die während dem gesamten Verfahren verwendete Flussrate betrug 300 cm/h.
Die Eluate wurden durch SDS-PAGE analysiert, um die qualitative Zusammensetzung der gebundenen Proteine zu bestimmen. SDS-PAGE: 4 bis 20% Gradientengel von Novex (USA). Nicht reduziert und Coomassie-gefärbt.
Ergebnisse:
Das in 6 gezeigte SDS-PAGE veranschaulicht den Gehalt an Proteinen in den zwei aus der Säule erhaltenen Eluaten.
Die SDS-PAGEs zeigen, dass, wenn der pH-Wert in der auf die Säule geladenen Molke erhöht wird, die Bindekapazität von IgG erniedrigt wird. Die Reinheit des IgG steigt, wenn der pH-Wert in der geladenen Molke erhöht wird. Die optimale Bindekapazität von IgG ist ungefähr ein pH-Wert von 5,0.
Beispiel 14.
EBA. Isolierung von Immunglobulinen aus Molke, von welcher bereits Lactoferrin und Lactoperoxidase adsorbiert wurde.
Eine EBA-Säule mit 2 cm Durchmesser, FastLine 20, von UpFront Chromatography A/S (Katalognr.: 7020-0000) wurde mit einer Höhe von 10 cm Festbett von inerten Glas-Beads und mit 15 cm (47,1 ml) des in Beispiel 5 beschriebenen Adsorbens, welches mit dem Liganden 2-Mercaptobenzoesäure gekuppelt worden war, geladen. Die Glas-Beads (150 bis 250 μm, Dichte 2,5 g/ml) wurden als ein Füllstoff am Boden der Säule, wo der Rührer sich dreht, verwendet. Die gemischte Zone, welche durch den Magneten verursacht wird, ist in der Glas-Beadschicht aufgebaut, was in einer perfekten Pfropfenströmung durch das aktive Adsorbens resultiert.
Die Säule wurde mit 236 ml demineralisiertem Wasser equilibriert. In Süßmolke, welche an Lactoferrin und Lactoperoxidase erschöpft war, d.h. welche ein in Beispiel 7 beschriebenes Kationenaustauschersäulen-Verfahren durchlaufen hat, wurde der pH-Wert mit 1 M HCl auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Auf die Säule wurden 942 ml der pH-Wert eingestellten Molke geladen, d.h. ein Adsorbens:Molke-Verhältnis von 1:20. Die Flussrate während dem gesamten Verfahren betrug 450 cm/h = 1,4 l/h.
Nach dem Laden der Molke wurden nicht gebundene Proteine mit 530 ml demineralisiertem Wasser ausgewaschen.
Nach dem Auswaschen nicht gebundener Proteine mit demineralisiertem Wasser wurde die Säule mit 2,5 mg/ml Caprylsäure pH-Wert 6,0 gewaschen. Volumen der Waschflüssigkeit mit 2,5 mg/ml Caprylsäure pH-Wert 6,0: 471 ml.
Das gebundene IgG wurde dann mit 20 mM NaOH eluiert. Das Rohmaterial, die Waschfraktion mit Caprylsäure und das Eluat wurden durch SDS-PAGE analysiert. SDS-PAGE: 4 bis 20% Gradientengel von Novex (USA). Nicht reduziert und Coomassie-gefärbt. 25 μl Probe in jeder Vertiefung.
Ergebnisse:
Das in 7 gezeigte SDS-PAGE veranschaulicht den Gehalt an Proteinen in dem Rohmaterial, der Waschfraktion mit Caprylsäure und in dem Eluat.
Wie aus der Figur ersichtlich ist, besteht die Waschfraktion mit Caprylsäure aus einer gereinigten Lösung von beta-Lactoglobulin (β-LG) und Rinderalbumin (BSA). Es ist kein alpha-Lactalbumin in dieser Fraktion vorhanden. Es ist weiter sichtlich, dass die Eluatfraktion aus einem hoch-gereinigten IgG besteht, welches nur geringe Verunreinigungen von anderen Milchprotein-Komponenten enthält (geschätzte Reinheit > 85%).
Beispiel 15.
EBA-Isolierung von Immunglobulinen aus Molke und Gewinnung von reinem β-Lactoglobulin:
Wie in Beispiel 14 veranschaulicht, bindet das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellte Adsorbens, welches mit dem Liganden 2-Mercaptobenzoesäure gekuppelt wurde, bei einem pH-Wert von 4,9 auch BSA und beta-Lactoglobulin (β-LG). Dieses Experiment veranschaulicht, dass es möglich ist, mit bestimmten Waschpuffern eine Fraktion von reinem β-LG, eine Fraktion, welche sowohl β-LG als auch BSA umfasst, und eine Elutionsfraktion, welche hauptsächlich IgG enthält, zu erhalten.
Ein Experiment wurde gemäß Beispiel 14 mit den folgenden Modifizierungen durchgeführt: Nach dem Auswaschen von nicht gebundenen Proteinen mit demineralisiertem Wasser wurde die Säule weiter mit 50 mM Natriumacetat pH-Wert 5,5 gewaschen. Volumen an Waschflüssigkeit mit Natriumacetat: 471 ml. Die Säule wurde dann weiter mit 2,5 mg/ml Caprylsäure pH-Wert 6,0 gewaschen.
Volumen der Waschflüssigkeit mit Caprylsäure: 330 ml.
Das IgG wurde schließlich mit 20 mM NaOH eluiert.
Alle Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. SDS-PAGE: 4 bis 20% Gradientengel von Novex (USA). Nicht reduziert und Coomassie-gefärbt. 25 μl Probe in jeder Vertiefung.
Ergebnisse:
Das in 8 gezeigte SDS-PAGE veranschaulicht den Gehalt an Proteinen in den zwei Waschflüssigkeiten und dem Eluat.
Das SDS-PAGE zeigt, dass Waschen mit 50 mM Natriumacetat pH-Wert 5,5 in einer Fraktion resultiert, welche reines β-LG enthält (Spur Nr. 1). Eine Waschung mit 2,5 mg/ml Caprylsäure pH-Wert 6,0 resultiert in einer Fraktion, welche BSA und β-LG (Spur Nr. 2) enthält. Das Eluat (235 ml) enthält ein hoch gereinigtes IgG (geschätzte Reinheit > 65%).
Beispiel 16.
EBA-Isolierung von Immunglobulinen aus Molke: Kapazität und Ausbeute bei unterschiedlichen Adsorbens:Molke-Verhältnissen.
Das Adsorbens:Molke-Verhältnis (Liter an Molke, welche pro Liter Adsorbens geladen wurden) wurde variiert, um die Kapazität der Matrix und die optimale Ausbeute an IgG pro Liter Molke zu finden.
Ein Experiment wurde gemäß Beispiel 14 mit den folgenden Modifizierungen durchgeführt.
In drei aufeinanderfolgenden Experimenten wurden auf die EBA-Säule 707 ml, 942 ml beziehungsweise 1.413 ml Süßmolke (von der Herstellung von Mozarella-Käse), welche auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt worden war, geladen, was in Adsorbens:Molke-Verhältnissen (v/v) von 1:15, 1:20 beziehungsweise 1:30 resultierte. Nach dem Laden wurden die Säulen mit 2,5 mg/ml Caprylsäure pH-Wert 6,0 gewaschen. Volumen der Waschflüssigkeit für alle drei Säulen: 530 ml. Flussrate für alle drei Säulen: 450 cm/h = 1,4 l/h.
Das IgG wurde durch 20 mM NaOH eluiert.
Ergebnisse:
Die nachstehende Tabelle zeigt die Kapazität und die Ausbeute, welche mit dem 2-Mercaptobenzoesäure-Adsorbens bei unterschiedlichen Molke-Verhältnissen erhalten wurden.
Die Menge an IgG wurde aus spektrophotometrischen Messungen an den Eluaten bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von E^1% _280nm = 13 berechnet. Die Volumina der Eluate waren 170 ml, 174 ml beziehungsweise 226 ml.
Die vorstehende Tabelle zeigt, dass die höchste Ausbeute pro Liter Molke bei einem Molke-Verhältnis von 1:15 erhalten wird, was in 468 mg IgG/ml Molke resultiert.
Die Kapazität des Harzes steigt um 75%, wenn das Molke-Verhältnis von 15 auf 30 Liter pro Liter Harz geladene Molke erhöht wird.
Beispiel 17.
EBA-Isolierung von Immunglobulinen aus Molke: Kapazität und Ausbeute als eine Funktion der Flussraten während dem Laden der Molke:
Experimente wurden wie in Beispiel 14 beschrieben mit den folgenden Modifizierungen durchgeführt. In drei aufeinanderfolgenden Experimenten betrugen die während dem Laden des Rohmaterials (Süßmolke, von der Herstellung von Mozarella-Käse, welche auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt wurde) verwendeten Flussraten 300, 450 beziehungsweise 600 cm/h.
Nach dem Laden wurden die Säulen mit 2,5 mg/ml Caprylsäure pH-Wert 6,0 gewaschen.
Volumen der Waschflüssigkeit für alle drei Säulen: 530 ml. Flussrate während dem Waschen für alle drei Säulen: 450 cm/h = 1,4 l/h.
Das IgG wurde dann mit 20 mM NaOH unter Verwendung einer Flussrate von 450 cm/h = 1,4 l/h für alle drei Säulen eluiert.
Ergebnisse:
Die Expansion während dem Laden der drei Säulen war 1,7 (300 cm/h), 2 (450 cm/h) beziehungsweise 2,3 (600 cm/h).
Die nachstehende Tabelle zeigt die Kapazität und die Ausbeute, welche mit dem 2-Mercaptobenzoesäure-Adsorbens bei unterschiedlichen während dem Laden der Molke verwendeten Flussraten erhalten wurden.
Die Menge an IgG wurde aus spektrophotometrischen Messungen bei 280 nm berechnet. Die Volumina der Eluate waren 212 ml, 175 ml beziehungsweise 156 ml.
Die Tabelle zeigt, dass die höchste Ausbeute pro Liter aufgebrachte Molke bei einer Flussrate von 300 cm/h während einem Laden von 457 mg IgG/ml Molke erreicht wird.
Die Kapazität des Harzes wird um ungefähr 30% von 9,1 auf 6,2 mg IgG/ml Harz verringert, wenn die Flussrate von 300 auf 600 cm/h erhöht wird.
Beispiel 18.
Integriertes modulares EBA-Verfahren zur Reinigung von LP, LF und IgG aus Molke:
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass es möglich ist, LP, LF und IgG mit der in 2 gezeigten Gestaltung eines Zwei-Schritt-Verfahrens zu isolieren, wobei der pH-Wert des Ausflusses vom ersten Schritt auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt wird, bevor er in den zweiten Schritt eintritt.
Die zwei für dieses integrierte Verfahren verwendeten Säulen waren 30 cm-EBA-Säulen (FastLine 300) von UpFront Chromatography A/S (Katalognr.: 7300-0000).
Säule Nr. 1: Reinigung von LP und LF

Betthöhe: 10 cm inerte Glas-Teilchen, 15 cm des in Beispiel 3 beschriebenen Sulfonsäure-Kationenaustauschers (10,6 l).

Das Experiment wurde ansonsten gemäß Beispiel 7 mit den folgenden Modifizierungen durchgeführt.
Volumen der Equilibrierung: 53 l.
Molkeladung: 3180 l = Adsorbens:Molke-Verhältnis 1:300.
Volumen der Waschung mit Wasser: 160 l.
Flussrate während dem Laden und dem Waschen: 900 cm/h.
Volumen des LP-Eluats: 101 l.
Volumen des LF-Eluats: 55 l.
Flussrate während der Elution: 450 cm/min.
Der Ausfluss von Säule 1 wird inline auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt, bevor er auf die Säule 2 geladen wird.
Säule Nr. 2: Isolierung von IgG

Betthöhe: 10 cm inerte Glas-Teilchen, 15 cm des in Beispiel 5 beschriebenen 2-Mercaptobenzoesäure-Harzes (10,6 l).

Das Experiment wurde ansonsten gemäß Beispiel 14 durchgeführt.
Volumen der Equilibrierung: 30 l.
Molkeladung: 212 l = Verhältnis 1:20.
Volumen der Waschung mit Wasser: 160 l.
Volumen der Waschung mit 2,5 mg/ml Caprylsäure: 120 l.
Volumen des IgG-Eluats: 40 l.
Flussrate während dem gesamten Verfahren: 450 cm/h.
Ergebnisse:
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ausbeute und die Reinheit der drei Proteine, welche aus der Gestaltung des Zwei-Schritt-Verfahrens gewonnen wurden.
Die Mengen an LP, LF und IgG in jedem Eluat wurde aus spektrophotometrischen Messungen an den Eluaten bei 280 nm unter Verwendung von E^1% _280,LP = 12, E^1% _280,LF = 10, E^1% _280,IgG = 13 berechnet.
Beispiel 19.
Herstellungsabschätzungen.
Das Folgende sind Berechnungen und Herstellungsabschätzungen basierend auf den Ergebnissen, welche während der Arbeit mit den beschriebenen Adsorbentien erhalten wurden.
Eine Fraktionierungsvorrichtung, wie sie in Beispiel 18 mit zwei Säulen im Großmaßstab in Schritt I (⌀ = 1,5 Meter) beschrieben wird, wobei jede 265 Liter Adsorbens enthält, kann Lactoferrin und Lactoperoxidase aus einem 690.000 Liter-Molkestrom pro Tag (24 Stunden) extrahieren. Die ungefähre Produktivität beträgt 21 kg Lactoperoxidase und 52 kg Lactoferrin pro Tag, was einer Extraktionsausbeute von 30 mg Lactoperoxidase und 75 mg Lactoferrin pro Liter Molke entspricht. Beide Produkte zeichnen sich durch hohe Reinheit aus (> 90% Reinheit).
Immunglobulin ist in Molke in einer wesentlich höheren Konzentration (0,5 bis 1,0 g/l Molke) als Lactoferrin und Lactoperoxidase vorhanden. Folglich werden in Schritt II mehr Säulen benötigt, um aus der Molke Immunglobulin zu extrahieren. Ein 690.000 Liter-Molkestrom pro Tag benötigt drei Säulen (⌀ = 1,5 Meter), wobei jede 265 Liter Adsorbens-Medien enthält. Die Produktivität beträgt ungefähr 277 kg Immunglobulin pro Tag, was einer Extraktionsausbeute von 400 mg Immunglobulin pro Liter Molke entspricht.
Variationen bei der Produktivität gemäß dem Molketyp und der Vorbehandlung der Molke können auftreten. Alle hier angegebenen Produktivitätsabschätzungen basieren auf Ergebnissen von Versuchen im Pilotmaßstab.
Beispiel 20
EBA-Adsorbentien, welche Wolframcarbid-Teilchen mit 8 Mikron Teilchengröße umfassen.
Der Ausdruck „UpFront Wolframcarbid-8-Agarose" betrifft Adsorbens-Teilchen, welche durch ein Emulgierverfahren hergestellt wurden (Wolframcarbid-Teilchen/geschmolzene Agarose-Suspension, emulgiert in heißem Vaselinöl, gefolgt von Kühlen, Waschen der resultierenden Agarose/Wolframcarbid-Beads und Sieben). Sie umfassen ein Kernmaterial von Wolframcarbid-Teilchen (WC 8.0, Kennametal Hertel, Deutschland) mit einer Größe von 8 μm und einer Dichte von 15,6 g/ml. Die Adsorbens-Teilchen umfassen die Wolframcarbid-Teilchen als einen Kern mit hoher Dichte, welche gleichmäßig in dem kugelförmigen Agarose-Bead (siehe 9) verteilt sind. Für Vergleichszwecke wurden drei unterschiedliche Zubereitungen in Bezug auf die Expansion als eine Funktion der Flussrate in einer EBA-Säule analysiert.
10 zeigt die Expansionskurve an den drei Zubereitungen: A, B und C.
Es wurde bestimmt, dass die Zubereitung A eine Dichte von 2,4 g/ml und eine wie in 11 veranschaulichte Teilchengrößenverteilung aufwies.
Es wurde bestimmt, dass die Zubereitung B eine Dichte von 3,3 g/ml und eine wie in 12 veranschaulichte Teilchengrößenverteilung aufwies.
Es wurde bestimmt, dass die Zubereitung C eine Dichte von 3,2 g/ml und eine wie in 13 veranschaulichte Teilchengrößenverteilung aufwies.
Die für die drei Zubereitungen gemessenen Dichten können für die Berechnung des mittleren Volumens, welches von den Wolframcarbid-Teilchen eingenommen wird, relativ zum Volumen des gesamten Beads wie in der Beschreibung beschrieben verwendet werden:
Volumen von Wolframcarbid in:

Zubereitung A: ungefähr 10%
Zubereitung B: ungefähr 16%
Zubereitung C: ungefähr 15,4%

Die mittlere Teilchengröße kann aus der Teilchengrößenverteilungsanalyse bestimmt werden:
Mittlere Teilchengröße:

Zubereitung A: 56 μm
Zubereitung B: 59 μm
Zubereitung C: 90 μm

Beispiel 21
EBA-Adsorbentien, welche Wolframcarbid-Teilchen mit 25 Mikron Teilchengröße umfassen.
Der Ausdruck „UpFront Wolframcarbid-25-Agarose" betrifft Adsorbens-Teilchen, welche durch ein Emulgierverfahren hergestellt wurden (Wolframcarbid-Teilchen/geschmolzene Agarose-Suspension, emulgiert in heißem Vaselinöl, gefolgt von Kühlen, Waschen der resultierenden Agarose/Wolframcarbid-Beads und Sieben). Sie umfassen ein Kernmaterial von Wolframcarbid-Teilchen (WC 25.0, Kennametal Hertel, Deutschland) mit einer Größe von 25 μm und einer Dichte von 15,6 g/ml. Die Adsorbens-Teilchen umfassen die Wolframcarbid-Teilchen als einen Kern mit hoher Dichte aus einem oder mehreren Wolframcarbid-Teilchen, welche in dem kugelförmigen Agarose-Bead eingebettet sind (siehe 14). Eine Zubereitung wurde in Bezug auf die Expansion als eine Funktion der Flussrate in einer EBA-Säule analysiert.
15 zeigt die Expansionskurve an der Zubereitung D.
Es wurde bestimmt, dass die Zubereitung D eine Dichte von 3,7 g/ml und eine wie in 16 veranschaulichte Teilchengrößenverteilung aufwies.
Die für die Zubereitung gemessene Dichte kann zur Berechnung des mittleren Volumens, welches von den Wolframcarbid-Teilchen eingenommen wird, relativ zum Volumen des gesamten Beads wie in der Beschreibung beschrieben verwendet werden:
Volumen von Wolframcarbid in:

Zubereitung D: ungefähr 18,5%

Zubereitung D: 77 μm

Beispiel 22
EBA an Süßmolke. Bindekapazität bei hoher Flussrate.
Die vier Wolframcarbid-Agarose-Zubereitungen (A bis D), welche in Beispiel 20 und 21 beschrieben und charakterisiert sind, wurden chemisch wie in Beispiel 2 und 3 beschrieben derivatisiert, um vier Zubereitungen von Sulfonsäure-Ionenaustauschern herzustellen. Diese vier Ionenaustauscher wurden dann auf ihre Fähigkeit zur Bindung von Lactoferrin wie grundlegend in Beispiel 7 beschrieben analysiert.
Vier Experimente wurden durchgeführt, welche als I, II, III und IV markiert wurden. Die Experimente veranschaulichen die Lactoferrin-Bindeeffizienz der vier Teilchenzubereitungen bei einer Flussrate von 25 cm/min während dem Laden der Molke.
Vier Säulen wurden gepackt. Jede FastLine 20-Säule wurde mit 10 cm Glas-Beads und mit 5 cm Höhe an Festbett von entsprechendem Wolframcarbid-Agarose-Sulfonsäure-Kationenaustauscher gepackt. Die vier Experimente umfassten die vier in Beispiel 1 und 2 beschriebenen (dasselbe Dokument) Teilchenzubereitungen:
Säule I: Teilchenzubereitung A, mittlere Teilchengröße: 56 Mikron, Dichte = 2,4 g/ml
Säule II: Teilchenzubereitung B, mittlere Teilchengröße: 59 Mikron, Dichte = 3,3 g/ml
Säule III: Teilchenzubereitung C, mittlere Teilchengröße: 90 Mikron, Dichte = 3,2 g/ml
Säule IV: Teilchenzubereitung D, mittlere Teilchengröße: 77 Mikron, Dichte = 3,7 g/ml
Nicht pasteurisierte Süßmolke (von der Herstellung von Mozarella-Käse), welche auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt worden war, wurde auf die Säulen in einem Verhältnis von 1:300 geladen und man ließ die 4 unterschiedlichen Säulen mit einer linearen Flussrate von 25 cm/min laufen.
Ergebnisse: Ausbeute aus der Messung der OD 280 nm der Eluate.
Bestimmung der Reinheit aus SDS-PAGE

Claims

Verfahren zur Fraktionierung eines Protein enthaltenden Gemisches, wobei das Protein enthaltende Gemisch ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Milch, von Milch abgeleiteten Produkten, von Milch abgeleiteten Rohmaterialien, von Gemüse abgeleiteten Produkten, von Gemüse abgeleiteten Extrakten, von Früchten abgeleiteten Produkten, von Früchten abgeleiteten Extrakten, von Fisch abgeleiteten Produkten und von Fisch abgeleiteten Extrakten, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes des Gemisches; (b) Aufbringen des Gemisches auf eine Adsorptionssäule mit einem Adsorbens, das Teilchen mit mindestens einem nicht-durchlässigen Kern mit hoher Dichte, umgeben von durchlässigem Material, umfasst, und mit einer Teilchendichte des Adsorbens von mindestens 1,5 g/ml und einer mittleren Teilchengröße von höchstens 150 μm umfasst; (c) gegebenenfalls Waschen der Säule; und (d) Eluieren von mindestens einem Protein vom Adsorbens.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aufbringen des Gemisches bei einer Flussrate von mindestens 3 cm/min ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Aufbringen des Gemisches bei einer Flussrate von etwa 5–50 cm/min ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nicht-durchlässige Kern mit hoher Dichte eine Dichte von mindestens 4 g/ml hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der nicht-durchlässige Kern mit hoher Dichte eine Dichte im Bereich von etwa 4–25 g/ml hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Adsorbens eine Teilchendichte von mindestens 1,8 g/ml hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Adsorbens eine mittlere Teilchengröße von höchstens 120 μm hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Adsorbens eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 40 bis 150 μm hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nicht-durchlässige Kern höchstens 50% des Gesamtvolumens des Adsorbens-Teilchens ausmacht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Adsorptionssäule eine Festbett-Adsorptionssäule ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das in der Säule vorhandene Adsorbens relativ zum auf die Säule zu ladenden Protein enthaltenden Gemisch in einem Verhältnis von mindestens 1 zu 1000, gemessen auf einer Volumen/Volumen-Basis, vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Eluieren mit einem Eluenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verdünnter Base, verdünnter Säure und Wasser ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die verdünnte Base ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Ammoniumhydroxid.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Elution der gebundenen Substanzen vom Adsorbens eine Salzendkonzentration im Eluat von weniger als 50 mM Salz liefert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das durchlässige Material eine polymere Grundmatrix umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das polymere Grundmaterial ein Polysaccharid ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Adsorbens einen Liganden mit Affinität für Proteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Ligandenkonzentration des Adsorbens mindestens 30 mM ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Adsorbens eine Bindekapazität von mindestens 10 g/l BSA gemäß dem Testverfahren A, wie es in der Beschreibung definiert ist, hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein zu isolierendes Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lactoperoxidase, Lactoferrin, Rinderserumalbumin, β-Lactoglobulin, Immunglobulin, α-Lactalbumin und Glycomacropeptid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 20, wobei mindestens ein isoliertes Proteingemisch mindestens 70% w/w eines einzelnen Proteins umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Reinheit des zu isolierenden Proteins, gemessen im Eluat, mindestens 65% ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Fraktionierung der Proteine von den Adsorbentien die Schritte umfasst: (i) gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes in dem Protein enthaltenden Gemisch; (ii) gegebenenfalls Equilibrieren des Adsorbens; (iii) Aufbringen des Protein enthaltenden Gemisches auf die Adsorbentien; (iv) gegebenenfalls Waschen mit einer Flüssigkeit; (v) Eluieren der adsorbierten Proteine mit einem oder mehreren Eluenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verdünnter Säure, verdünnter Base und Wasser; und (vi) Isolieren von mindestens einem Proteingemisch, das ein einzelnes Protein oder verschiedene Proteine umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Teilchengröße kleiner ist als 120 μm und die Teilchendichte mindestens 1,6 g/ml ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Teilchengröße kleiner als 90 μm und die Teilchendichte mindestens 1,8 g/ml ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Teilchengröße kleiner als 75 μm und die Teilchendichte mindestens 2,0 g/ml ist.