DE60213115T2 - Synthese von cyclosporinanaloga - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung ist gerichtet auf Mischungen von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247. Es wird davon ausgegangen, dass die Mischungen eine verbesserte Wirksamkeit und/oder verminderte Toxizität gegenüber einzelnen Isomeren und gegenüber natürlich vorkommenden und anderen derzeit bekannten Cyclosporinen und Cyclosporinderivaten haben.
  • Literaturstellen
  • Die folgenden Literaturstellen haben eine Beziehung hierzu oder es wird auf sie hier durch Patent- oder Anmeldungsnummern oder in Klammern durch Autor und Jahr an den relevanten Stellen der Beschreibung Bezug genommen:
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    • U.S.-Patent Nr. 4 108 985.
    • U.S.-Patent Nr. 4 160 452.
    • U.S.-Patent Nr. 4 210 581.
    • U.S.-Patent Nr. 4 220 641.
    • U.S.-Patent Nr. 4 256 108.
    • U.S.-Patent Nr. 4 265 874.
    • U.S.-Patent Nr. 4 288 431.
    • U.S.-Patent Nr. 4 384 996.
    • U.S.-Patent Nr. 4 396 542.
    • U.S.-Patent Nr. 4 554 351.
    • U.S.-Patent Nr. 4 771 122.
    • U.S.-Patent Nr. 5 284 826.
    • U.S.-Patent Nr. 5 525 590.
    • Europäische Offenlegungsschrift Nr. 0 034 567.
    • Europäische Offenlegungsschrift Nr. 0 056 782.
    • Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 86/02080.
    • Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 99/18120.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Cyclosporinderivate bilden eine Klasse von cyclischen Polypeptiden, die aus elf Aminosäuren bestehen, die als sekundäre Metaboliten von der Pilzart Tolypocladium inflatum Gams erzeugt werden. Es wurde beobachtet, dass sie immunkompetente Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten, in der G0- oder G1-Phase des Zellzyklus reversibel hemmen. Es wurde auch beobachtet, dass Cyclosporinderivate die Erzeugung und Freisetzung von Lymphokinen reversibel hemmen (Granelli-Piperno et al., 1986). Obwohl eine Anzahl von Cyclosporinderivaten bekannt sind, ist Cyclosporin A das am häufigsten verwendete. Die supprimierenden Wirkungen von Cyclosporin A stehen in Bezug zu der Hemmung von T-zellvermittelten Aktivierungsereignissen. Diese Suppression wird erreicht durch die Bindung von Cyclosporin an das ubiquitäre intrazelluläre Protein Cyclophilin. Dieser Komplex hemmt wiederum die Calcium- und Calmodulin-abhängige Serin-Threonin-Phosphataseaktivität des Enzyms Calcineurin. Die Hemmung von Calcineurin verhütet die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, wie NFATp/c und NF-κB, die zur Induktion der Cytokingene (IL-2, IFN-γ, IL-4 und GM-CSF) während der T-Zellaktivierung notwendig sind. Cyclosporin hemmt auch die Lymphokinproduktion von T-Helferzellen in vitro und stoppt die Entwicklung von reifen CD8- und CD4-Zellen im Thymus (Granelli-Piperno et al. 1986). Andere in-vitro- Eigenschaften von Cyclosporin schließen die Hemmung von II-2 produzierenden T-Lymphozyten und cytotoxischen T-Lymphozyten, die Hemmung von IL-2, das von aktivierten T-Zellen freigesetzt wird, die Hemmung von ruhenden T-Lymphozyten als Antwort auf Alloantigen und exogenenes Lymphokin, die Hemmung der IL-1-Produktion und die Hemmung der Mitogenaktivierung von IL-2 produzierenden T-Lymphozyten ein (Granelli-Piperno et al., 1986).
  • Cyclosporin ist ein potentes immunsupprimierendes Mittel, von dem gezeigt wurde, dass es die humorale Immunität und zellvermittelte Immunreaktionen, wie die Allotransplantatabstoßung, die verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion, experimentelle allergische Enzephalomyelitis, Freund's Adjuvans-Arthritis und Graftversus-Host-Krankheit supprimiert. Es wird verwendet für die Prophylaxe der Organabstoßung nach Organtransplantation; zur Behandlung von Polyarthritis; zur Behandlung von Psoriasis und zur Behandlung anderer Autoimmunkrankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, Morbus Crohn, Lupus und dgl.
  • Seit der ursprünglichen Entdeckung von Cyclosporin wurden eine große Vielzahl von natürlich vorkommenden Cyclosporinen isoliert und identifiziert und viele weitere nicht natürliche Cyclosporine wurden mit vollständig oder halbsynthetischen Mitteln oder durch Anwendung modifizierter Kulturtechniken hergestellt. Die Klasse, die von den Cyclosporinen gebildet wird, ist daher nun substanziell und schließt z.B. die natürlich vorkommenden Cyclosporine A bis Z [c.f. Traber et al. (1977); Traber et al. (1982); Kobel et al. (1982) und von Wartburg et al. (1986)] ebenso wie verschiedene nicht natürliche Cyclosporinderivate und künstliche oder synthetische Cyclosporine ein, einschließlich der Dihydro- und Isocyclosporine; derivatisierter Cyclosporine (bei denen z.B. das 3'-O-Atom des -MeBmt-Rests acyliert ist oder ein weiterer Substituent am α-Kohlenstoffatom des Sarcosylrests an Position 3 eingeführt wurde); Cyclosporine, bei denen der -MeBmt-Rest in isomerer Form vorhanden ist (bei dem z.B. die Konfiguration über die Positionen 6' und 7' des -MeBmt-Rests cis statt trans ist) und Cyclosporine, bei denen variierende Aminosäuren an spezifischen Positionen innerhalb der Peptidsequenz eingebaut sind z.B. unter Anwendung der Gesamtsynthesemethode zur Herstellung von Cyclosporinen, die von R. Wenger entwickelt wurde – siehe z.B. Traber et al. (1977), Traber et al. (1982) und Kobel et al. (1982); U.S.-Patente Nr. 4 108 985, 4 210 581, 4 220 641, 4 288 431, 4 554 351 und 4 396 542; Europäische Patentschriften Nr. 0 034 567 und 0 056 782; Internationale Patentschrift Nr. WO 86/02080; Wenger (1983); Wenger (1985) und Wenger (1986). Über Cyclosporin-A-Analoga, die modifizierte Aminosäuren in Position 1 enthalten, wurde von Rich et al. (1986) berichtet. Immunsupprimierende, entzündungshemmende und antiparasitische Cyclosporin-A-Analoga werden in den U.S.-Patenten Nr. 4 384 996; 4 771 122; 5 284 826 und 5 525 590, die alle auf Sandoz übertragen wurden, beschrieben. Zusätzliche Cyclosporinanaloga werden in WO 99/18120, die auf Isotechnika übertragen wurde, offenbart. Die Ausdrücke Ciclosporin, ciclosporin, cyclosporin und Cyclosporin sind austauschbar und beziehen sich auf Cyclosporin.
  • Es gibt zahlreiche negative Wirkungen, die mit einer Cyclosporin-A-Therapie verbunden sind, einschließlich Nephrotoxizität, Hepatotoxizität, Kataraktogenese, Hirsutismus, Parathese und Gingivahyperplasie, um nur einige zu nennen (Sketris et al., 1995). Von diesen ist die Nephrotoxizität eine der schwer wiegendsten dosisabhängigen negativen Wirkungen, die durch Cyclosporin-A-Verabreichung entstehen. Cyclosporin-A-Wirkstoffprodukte mit sofortiger Freisetzung (z.B. Neoral® und Sandimmune®) können Nephrotoxizität und andere toxische Nebenwirkungen aufgrund ihrer schnellen Freisetzung und der Absorption hoher Blutkonzentrationen des Wirkstoffs verursachen. Es wird postuliert, dass die Spitzenkonzentrationen des Wirkstoffs mit den Nebenwirkungen in Beziehung stehen (Bennett, 1998). Der genaue Mechanismus, durch den Cyclosporin A Nierenschäden verursacht, ist nicht bekannt; es wird jedoch vorgeschlagen, dass ein Anstieg der Pegel an gefäßverengenden Substanzen in der Niere zu einer Gefäßverengung der afferenten Glomeruloarteriolen führt. Dies kann zu renaler Ischämie, einer Abnahme der glomerulären Filtrationsrate und über längere Zeit zu interstitieller Fibrose führen. Wenn die Dosis vermindert wird oder ein weiteres immunsupprimierendes Mittel substituiert wird, verbessert sich die Nierenfunktion (Valantine und Schroeder, 1995).
  • Somit besteht ein Bedarf für immunsupprimierende Mittel, die wirksam sind und eine verminderte Toxizität haben.
  • Cyclosporinanaloga, die modifizierte Aminosäuren in Position 1 enthalten, werden in WO 99/18120 offenbart, die auf den Anmelder der vorliegenden Anmel dung übertragen wurde. Auch übertragen auf den vorliegenden Anmelder wurde WO 03/033527, in der die Anmelder ein besonders bevorzugtes Cyclosporin-A-Analogon offenbarten, dass als "ISATX247" bezeichnet wird. Dieses Analogon ist strukturell identisch zu Cyclosporin A außer der Modifikation am Aminosäurerest 1. Die Anmelder fanden, dass bestimmte Mischungen von cis- und trans-Isomeren von ISATX247 eine Kombination aus verbesserter Wirksamkeit und/oder verminderter Toxizität gegenüber den natürlich vorkommenden und derzeit bekannten Cyclosporinen aufwiesen. Bestimmte alkylierte, arylierte und deuterierte Derivate von ISATX247 werden auch offenbart.
  • Typischerweise liegen die offenbarten Mischungen in WO 03/033527 in einem Bereich von etwa 10 bis 90 Gew.-% trans-Isomer und etwa 90 bis 10 Gew.-% cis-Isomer; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 15 bis 85 Gew.-% trans-Isomer und etwa 85 bis 15 Gew.-% cis-Isomer; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 25 bis 75 Gew.-% trans-Isomer und etwa 75 bis 25 Gew.-% cis-Isomer; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 35 bis 65 Gew.-% trans-Isomer und etwa 65 bis 35 Gew.-% cis-Isomer; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 45 bis 55 Gew.-% trans-Isomer und etwa 55 bis 45 Gew.-% cis-Isomer. In einer weiteren Ausführungsform ist die Isomerenmischung eine ISATX247-Mischung, die etwa 45 bis 50 Gew.-% trans-Isomer und etwa 50 bis 55 Gew.-% cis-Isomer enthält. Diese Gewichtsprozentanteile basieren auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In anderen Worten könnte eine Mischung 65 Gew.-% (E)-Isomer und 35 Gew.-% (Z)-Isomer enthalten oder umgekehrt. In einer anderen Nomenklatur kann das cis-Isomer auch als (Z)-Isomer beschrieben werden und das trans-Isomer könnte auch (E)-Isomer genannt werden.
  • Somit besteht ein Bedarf im Stand der Technik für Methoden zur Herstellung von Cyclosporinanaloga, einschließlich Isomeren von ISATX247. Synthesewege sind notwendig, die an einzelnen Isomeren angereicherte Zusammensetzungen erzeugen, ebenso wie Mischungen der Isomeren mit einem gewünschten Verhältnis der zwei Isomeren. Verfahren zur Herstellung von Derivaten von ISATX247 sind auch notwendig.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Cyclosporin und seine Analoga sind Mitglieder einer Klasse von cyclischen Polypeptiden mit potenter immunsupprimierender Aktivität. Trotz der Vorteile, die diese Wirkstoffe im Hinblick auf ihre immunsupprimierenden, entzündungshemmenden und antiparasitischen Aktivitäten bieten, gibt es zahlreiche negative Wirkungen, die mit einer Cyclosporin-A-Therapie verbunden sind, die eine Nephrotoxizität und Hepatotoxizität einschließen. Somit besteht ein Bedarf für neue immunsupprimierende Mittel, die pharmakologisch so aktiv sind, wie die natürlich vorkommende Verbindung Cyclosporin A, aber ohne die damit verbundenen toxischen Nebenwirkungen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert bestimmte Mischungen von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, die pharmazeutisch nützlich sind. Mischungen von ISATX247-Isomeren zeigen eine Kombination aus verbesserter Wirksamkeit und verminderter Toxizität gegenüber natürlich vorkommenden und derzeit bekannten Cyclosporinen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Erkenntnis, dass bestimmte isomere Mischungen von Analoga von Cyclosporin höhere immunsupprimierende Wirkungen zeigen ohne die negativen Wirkungen, die mit Cyclosporin A verbunden sind. Insbesondere wurde unerwarteterweise gefunden, dass isomere Mischungen (d.h. Mischungen aus sowohl cis- als auch trans-Isomeren) mit einem Bereich von etwa 10:90 bis etwa 90:10 (trans:cis) Cyclosporinanaloga, die am Aminosäurerest 1 modifiziert sind, eine bessere Wirksamkeit und Sicherheit liefern. Beispiele für solche Analoga werden in WO 99/18120 offenbart und schließen deuterierte und nicht deuterierte Verbindungen ein. Insbesondere wurde gefunden, dass Mischungen im Bereich von etwa 45:55 bis etwa 50:50 (trans:cis) und im Bereich von etwa 50% bis etwa 55% trans und etwa 45% bis etwa 50% cis besonders wirksam sind.
  • Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Isomerenmischungen eine Kombination von höherer Wirksamkeit und verminderter Toxizität gegenüber natürlich vorkommenden und anderen derzeit bekannten Cyclosporinen und Cyclosporinderivaten aufweisen.
  • Ein besonderes Analogon (hier als "ISATX247" bezeichnet) entspricht strukturell dem Cyclosporin A außer einer modifizierten funktionellen Gruppe an der Peripherie des Moleküls, an Aminosäurerest 1. Die Struktur dieser speziellen isomeren Analogonmischung im Vergleich zur Struktur von Cyclosporin A ist in den 1A, 1B, 2A und 2B gezeigt.
  • Die isomeren Mischungen können unter anderem zur Immunsuppression und zur Heilung verschiedener Immunstörungen, Krankheiten und Zustände verwendet werden, einschließlich der Prävention, Kontrolle, Linderung und Behandlung davon.
  • ISATX247-Isomere (und Derivate davon) können auf stereoselektiven Wegen synthetisiert werden, die im Selektivitätsgrad variieren können. Stereoselektive Wege erzeugen Zusammensetzungen, die an einem der (E)- und (Z)-Isomeren angereichert sind und diese Zusammensetzungen können so vereinigt werden, dass die entstehende Mischung ein gewünschtes Verhältnis der zwei Isomeren hat. Alternativ können die Reaktionsbedingungen eines stereoselektiven Synthesewegs so zugeschnitten werden, dass das gewünschte Verhältnis direkt in einer hergestellten Mischung erzeugt wird. Der Prozentanteil eines Isomers oder eines anderen in einer Mischung kann verifiziert werden unter Verwendung von kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) oder anderen Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind.
  • Jeder der Wege erfolgt typischerweise unter Anwendung einer Schutzgruppe für eine empfindliche alkoholische funktionelle Gruppe. In einer Ausführungsform wird der Alkohol als Acetat geschützt; in weiteren Ausführungsformen sind die Schutzgruppen Benzoatester oder Silylether. Obwohl Acetatschutzgruppen im Stand der Technik bekannt sind, ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass bei vielen der beispielhaften Ausführungsformen, die hier beschrieben werden, bestimmte unerwünschte Nebenreaktionen unter Beteiligung einer Acetatschutzgruppe vermieden werden können durch die Verwendung von Schutzgruppen, wie Benzoatester oder Silylether.
  • Die geschützte Verbindung kann dann als Vorläufer für eine Vielzahl von stereoselektiven Synthesewegen dienen einschließlich einiger, die phosphorhaltige Reagenzien als Teilnehmer an einer Wittig-Reaktion und anorganische Elemente als Mitglieder von organometallischen Reagenzien verwenden. Letztere Art kann über Übergangszustände mit sechsgliedrigen Ringen voranschreiten, wobei die sterische Hinderung die Konfiguration diktiert. Viele organometallische Reagenzien sind verfügbar, einschließlich solcher, die anorganische Elemente wie Bor, Silicium, Titan, Lithium und Schwefel aufweisen. Individuelle Isomere können aus einem einzelnen oder aus mehreren Vorläufern hergestellt werden.
  • Das Verhältnis von (E)- zu (Z)-Isomeren in jeder Mischung, kann, abhängig davon, ob es stereoselektiv oder nicht stereoselektiv erzeugt wurde, einen breiten Bereich an Werten annehmen. Z.B. kann die Mischung etwa 10 bis 90% des (E)-Isomers und etwa 90 bis 10% des (Z)-Isomers enthalten. In anderen Ausführungsformen kann die Mischung etwa 15 bis 85 Gew.-% des (E)-Isomers und etwa 85 bis 15% des (Z)-Isomers enthalten; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 25 bis 75 Gew.-% des (E)-Isomers und etwa 75 bis 25 Gew.-% des (Z)-Isomers; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 35 bis 65 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 65 bis 35 Gew.-% (Z)-Isomer; in einer weiteren Ausführungsform enthält die Mischung etwa 45 bis 55 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 55 bis 45 Gew.-% (Z)-Isomer. In einer weiteren Ausführungsform ist die isomere Mischung eine ISATX247-Mischung, die etwa 45 bis 50 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 50 bis 55 Gew.-% (Z)-Isomer enthält. Diese Gewichtsprozentangaben basieren auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung und es versteht sich, dass die Summe der Gewichtsprozente von (E)-Isomer und (Z)-Isomer 100 Gew.-% ergibt. In anderen Worten kann eine Mischung 65 Gew.-% (E)-Isomer und 35 Gew.-% (Z)-Isomer enthalten oder umgekehrt.
  • Somit liefert in einem ersten Aspekt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei der Syntheseweg die folgenden Stufen aufweist: dass ein Acetyl-η-halogencyclosporin A mit Trialkylphosphin, Triarylphosphin (z.B. Triphenylphosphin), Arylalkylphosphin oder Triarylarsin erhitzt wird, um ein Zwischenprodukt zu erzeugen; eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien hergestellt wird, indem das Zwischenprodukt mit Formaldehyd gerührt wird; und eine Mischung aus (E)- und (Z)- Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens mit einer Base behandelt wird.
  • In einem zweiten Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 gerichtet, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass ein Acetylcyclosporin-A-aldehyd in eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien umgewandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids, und eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird durch Behandlung der Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens mit einer Base.
  • Gemäß einem dritten Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 gerichtet, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass:
    • a) der β-Alkohol von Cyclosporin A geschützt wird, indem Acetylcyclosporin A als erstes Zwischenprodukt gebildet wird;
    • b) das Acetylcyclosporin A oxidiert wird, um Acetylcyclosporin-A-aldehyd als zweites Zwischenprodukt zu erzeugen;
    • c) der Acetylcyclosporin-A-aldehyd als Zwischenprodukt in eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien umgewandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und
    • d) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien mit einer Base behandelt wird.
  • In einem vierten Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 gerichtet, wobei der Syntheseweg die folgenden Stufen aufweist, dass:
    • a) der als Zwischenprodukt eingesetzte Acetylcyclosporin-A-aldehyd in eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien umgewandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid umgesetzt wird, das aus Tributylallylphosphoniumhalogenid oder Triphenylphosphoniumhaloge nid über eine Wittig-Reaktion hergestellt wurde, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und
    • b) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien mit einer Base behandelt wird.
  • In einem fünften Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 gerichtet, wobei das Verfahren einen Syntheseweg aufweist, bei dem ein (E)-Isomer und ein (Z)-Isomer von ISATX247 so hergestellt wird, dass das (E)-Isomer und das (Z)-Isomer in der Mischung in einem vorbestimmten Verhältnis vorhanden sind, wobei der Syntheseweg die folgenden Stufen aufweist, dass:
    • a) der β-Alkohol der Aminosäure 1 des Cyclosporins A geschützt wird;
    • b) das geschützte Cyclosporin A oxidiert wird, um einen geschützten Cyclosporin-A-aldehyd zu erzeugen;
    • c) der geschützte Cyclosporin-A-aldehyd in eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des geschützten 1,3-Diens umgewandelt wird, indem der geschützte Cyclosporin-A-aldehyd mit einem Phosphorylid über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und
    • d) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren hergestellt wird, indem bei dem geschützten 1,3-Dien die Schutzgruppen abgespalten werden.
  • In einem sechsten Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 gerichtet, wobei der Syntheseweg die folgenden Stufen aufweist, dass:
    • a) ein TMS-Cyclosporin-A-aldehyd als Zwischenprodukt in eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von TMS-1,3-dien umgewandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid, das aus einem Tributylallylphosphoniumhalogenid oder Triphenylphosphoniumhalogenid hergestellt wurde, über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und
    • b) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem bei der Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des TMS-1,3-diens die Schutzgruppen mit einer Säure abgespalten werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A zeigt die Struktur von Cyclosporin A, wobei die 11 Aminosäurereste dargestellt sind, die den cyclischen Peptidring des Moleküls bilden, ebenso wie die Struktur der Seitenkette des 1-Aminosäurerestes;
  • 1B ist eine weitere Darstellung der Struktur von Cyclosporin A mit speziellem Fokus auf die Definition des Ausdrucks "CsA", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird;
  • 2A zeigt die Struktur des (E)-Isomers (oder trans-Isomers) des Cyclosporin-A-analogons, das ISATX247 genannt wird;
  • 2B zeigt die Struktur des (Z)-Isomers (oder cis-Isomers) des Cyclosporin-A-analogons ISATX247;
  • 3 zeigt einen Überblick über beispielhafte Synthesewege, die verwendet werden können, um Cyclosporinanaloga der vorliegenden Erfindung herzustellen, wobei stereoselektive Wege nach den reaktiven Bedingungen gruppiert sind;
  • 4 zeigt einen Syntheseweg, der eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 aus einem Bromvorläufer erzeugt;
  • 5 zeigt einen weiteren Syntheseweg, der eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 aus einem Aldehydvorläufer zeigt;
  • 6 zeigt ein beispielhaftes stereoselektives Reaktionsschema, das verwendet werden kann, um Zusammensetzungen herzustellen, die entweder an (E)- oder (Z)-Isomeren von ISATX247 angereichert sind, wobei jedes Isomer aus dem gleichen Vorläuferalkohol hergestellt werden kann;
  • 7 zeigt ein alternatives Reaktionsschema für die stereoselektive Synthese einer Zusammensetzung, die an (Z)-Isomer von ISATX247 angereichert ist;
  • 8 erläutert ein alternatives Reaktionsschema für die stereoselektive Synthese einer Zusammensetzung, die an (E)-Isomer von ISATX247 angereichert ist;
  • 9A bis C zeigen beispielhafte Synthesewege zur Herstellung einer Mischung der (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei die Bedingungen für jede Reaktion so zugeschnitten wurden, dass ein spezielles beispielhaftes Verhältnis der zwei Isomeren erzeugt wird;
  • 10 zeigt beispielhafte stereoselektive Wege zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei Zusammensetzungen, die an einem der beiden Isomeren angereichert sind, zuerst hergestellt werden und dann entsprechend in vorbestimmten Anteilen vermischt werden, um das gewünschte Verhältnis zu erzielen;
  • 11 liefert die Ergebnisse eines Tests, der zeigt, dass die Hemmung der Calcineurinphosphataseaktivität durch ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) bis zu dreifach wirksamer war (wie mit IC50 bestimmt) als Cyclosporin A.
  • 12 gibt die Struktur und die isomere Zusammensetzung einiger deuterierter und nicht deuterierter Isomerenmischungen von Analoga an.
  • 13 liefert die Ergebnisse eines Tests, der zeigt, dass die Hemmung der Calcineurinphosphataseaktivität durch verschiedene deuterierte und nicht deuterierte analoge Isomerenmischungen mindestens so wirksam war (bestimmt mit IC50) wie mit Cyclosporin A.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung Synthese
  • Cyclosporin und seine Analoga sind Mitglieder einer Klasse von cyclischen Polypeptiden mit einer potenten immunsupprimierenden Aktivität. Trotz der Vorteile, die diese Wirkstoffe im Hinblick auf ihre immunsupprimierende, entzündungshemmende und antiparasitische Aktivität liefern, gibt es zahlreiche negative Wirkungen, die mit einer Cyclosporin-A-Therapie verbunden sind, was Nephrotoxizität und Hepatotoxizität einschließt. Somit besteht ein Bedarf für neue immunsupprimierende Mittel, die pharmakologisch so aktiv sind wie die natürlich vor kommende Verbindung Cyclosporin A, aber ohne die zugehörigen toxischen Nebenwirkungen.
  • Die Anmelder haben früher ein Cyclosporin-A-Analogon offenbart, das als ISATX247 bezeichnet wird. Dieses Analogon gleicht Cyclosporin A außer der Modifikation an dem Aminosäurerest 1. Die Anmelder fanden, dass bestimmte Mischungen von cis- und trans-Isomeren von ISATX247 eine Kombination von verbesserter Wirksamkeit und verminderter Toxizität gegenüber natürlich vorkommenden und derzeit bekannten Cyclosporinen zeigen.
  • ISATX247-Isomere (und Derivate davon) können auf stereoselektiven Wegen synthetisiert werden, die in dem Grad der Stereoselektivität variieren können. Stereoselektive Wege erzeugen Zusammensetzungen, die entweder an (E)-Isomer oder (Z)-Isomer angereichert sind und diese Zusammensetzungen können kombiniert werden, so dass die entstehende Mischung ein gewünschtes Verhältnis der beiden Isomeren hat. Alternativ können die Reaktionsbedingungen eines stereoselektiven Wegs so zugeschnitten werden, dass das gewünschte Verhältnis direkt in der hergestellten Mischung erzeugt wird.
  • Der chemische Name eines immunsupprimierenden Cyclosporinanalogons der vorliegenden Erfindung, das ISATX247 bezeichnet wird, wird chemisch beschrieben mit dem Namen Cyclo{{E,Z)-(2S,3R,4R)-3-hydroxy-4-methyl-2-(methylamino)-6,8-nonadienoyl}-L-2-aminobutyryl-N-methylglycyl-N-methyl-L-leucyl-L-valyl-N-methyl-L-leucyl-L-alanyl-D-alanyl-N-methyl-L-leucyl-N-methyl-L-leucyl-N-methyl-L-valyl}. Die empirische Formel ist C63H111N11O12 und es hat ein Molekulargewicht von etwa 1214,85. Der Ausdruck "ISATX247" ist eine Markenbezeichnung, die dieser pharmakologisch aktiven Verbindung gegeben wurde.
  • Die Struktur von ISATX247 wurde primär durch kernmagnetische Resonanz-(NMR)-Spektroskopie bestätigt. Sowohl die 1H- als auch 13C-Spektren wurden zugeordnet unter Verwendung einer Reihe von ein- und zweidimensionalen NMR-Versuchen und durch Vergleich mit den bekannten NMR-Zuordnungen für Cyclosporin A. Die absolute Zuordnung der (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 wurde durch Kern-Overhauser-Effekt-(NOE)-Versuche bestätigt. Zusätzliche unterstützende Hinweise lieferten die Massenspektralanalyse, die das Molekular gewicht bestätigte, und das Infrarotspektrum, das dem von Cyclosporin A sehr nahe kam. Letzteres Ergebnis wurde erwartet aufgrund der Ähnlichkeit zwischen den zwei Verbindungen.
  • Die Struktur von Cyclosporin A ist in 1A dargestellt. Die Struktur schließt die Identifikation der 11 Aminosäurereste ein, die den cyclischen Peptidring des Moleküls bilden. Diese 11 Aminosäurereste sind mit Zahlen gekennzeichnet, die im Uhrzeigersinn ansteigen beginnend mit der Aminosäure, die im oberen Zentrum des Rings gezeigt ist (und mit der Bezugsmarkierung "1-Aminosäure" identifiziert ist). Die erste Aminosäure ist der Deutlichkeit halber in einem gestrichelten Kasten gezeigt. Die Seitenkette des Aminosäurerestes 1 wurde chemisch hervorgehoben, da es diese allgemeine Stelle ist, an der die hier beschriebenen Synthesereaktionen stattfinden. Üblicherweise wird das Kohlenstoffatom, das der Carbonylgruppe einer Aminosäure benachbart ist, als α-Kohlenstoffatom bezeichnet, wobei die Buchstaben des griechischen Alphabets fortschreitend verwendet werden, um benachbarte Kohlenstoffatome in der Richtung entlang der Kette weg von dem Peptidring zu bezeichnen. Im Fall von Cyclosporin A, wie in 1A gezeigt, ist das β-Kohlenstoffatom der Seitenkette an eine Hydroxylgruppe gebunden und es gibt eine trans-orientierte Doppelbindung zwischen den ε- und ζ-Kohlenstoffatomen der Seitenkette.
  • Ein weiteres Schema der Cyclosporin-A-Struktur ist in 1B gezeichnet, wo ein anderer Teil des Moleküls in einem gestrichelten Kasten gezeigt ist. Diese Figur definiert die Nomenklatur, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, wobei der Ausdruck "CsA" sich auf den Teil des Cyclosporins A bezieht, der in dem Kasten enthalten ist. Die vorliegende Nomenklatur liefert eine Kurzbezeichnung, um den Bereich darzustellen, wo die hier beschriebenen Synthesereaktionen stattfinden (d.h. die Seitenkette des 1-Aminosäurerestes, die außerhalb des gestrichelten Kastens in 1B gezeichnet wurde), ohne den Rest des Moleküls jedes Mal wieder zeichnen zu müssen, wenn eine Reaktion beschrieben wird. Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, dass die Bindung zwischen dem α- und β-Kohlenstoffatom der Seitenkette eine normale Länge hat und nur in dieser Zeichnung hervorgehoben wurde, um die Definition des Ausdrucks "CsA" zu erläutern.
  • Wie oben angegeben, wird ein besonders bevorzugtes Cyclosporin-A-Analogon ISATX247 genannt und seine zwei Stereoisomeren (E) (oder trans) und (Z) (oder cis) sind in den 2A bzw. 2B gezeigt. Cis oder trans bei diesen Stereoisomeren bezieht sich auf die Konfiguration an der Doppelbindung zwischen dem ε- und ζ-Kohlenstoffatom der Seitenkette, d.h. der Doppelbindung, die dem Peptidring näher ist, im Gegensatz zur Doppelbindung am endständigen Ende der Kette.
  • Es soll etwas über die stereochemische Nomenklatur gesagt werden. In der vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrücke cis und (Z) austauschbar verwendet und die Ausdrücke trans und (E) werden austauschbar verwendet. Die Verwendung der Ausdrücke "erythro" und "threo" wird auf ein Minimum beschränkt wegen der offensichtlichen Konfusion in der Literatur im Hinblick auf deren Bedeutung. Siehe R. W. Hoffmann und H.-J. Zei in "Stereoselective synthesis of Alcohols. 8. Diastereoselective Synthesis of β-Methylhomoallyl Alcohols via Crotylboronates", J. Org. Chem., Bd. 46, S. 1309–1314 (1981); A. Streitwieser und C. H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2. Auflage (Macmillan, New York, 1981), S. 845–846 und M. B. Smith und J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), S. 144–147. In den wenigen Fällen, in denen die threo/erythro-Terminologie hier angewendet wird, wird die Konvention von Streitwieser und Heathcock verwendet, wobei "erythro"-Isomere sich auf die (R,S)- und (S,R)-Konfigurationen beziehen und die "threo"-Isomeren sich auf die (R,R)- und (S,S)-Konfigurationen beziehen.
  • Ein letzter Kommentar zur Nomenklatur betrifft die endständige Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, die in den 2A und 2B gezeigt ist. In einem anderen Nummerierungsschema können die Kohlenstoffatome in der Seitenkette des 1-Aminosäurerestes nummeriert werden ausgehend vom endständigen (θ) Kohlenstoff und hin zum Peptidring. In diesem System können die ISATX247-Isomere als 1,3-Diene gedacht werden gemäß der üblichen Nomenklatur in organischer Chemie, wo jede Doppelbindung durch das Kohlenstoffatom mit der geringsten Zahl identifiziert wird.
  • Es werden nun die Synthesewege, die in den 3 bis 8 dargestellt sind, diskutiert. Gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können isomere Mischungen direkt hergestellt werden, wobei die Reaktionsbedingungen eines speziellen Synthesewegs so zugeschnitten werden, dass das gewünschte Verhältnis von Isomeren in der Mischung erreicht wird. Alternativ können Zusammensetzungen hergestellt werden, die an einem von zwei geometrischen Isomeren eines Cyclosporin-A-Analogons angereichert sind und die Zusammensetzungen können in einem vorbestimmten Verhältnis kombiniert werden, um die gewünschte Mischung zu erzielen.
  • Ein Überblick über die Synthesewege gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist in 3 angegeben, wo speziell auf die Gruppierung der Reaktionswege nach Chemie und Stereoselektivität fokussiert wird. Bezug nehmend auf 3 sind Synthesewege, die die Wittig-Reaktionen verwenden, allgemein auf der rechten Seite des Diagramms gezeigt, was durch die Bezugsziffer 31 angegeben ist, während die Synthesewege 32 und 33, die organometallische Reagenzien verwenden, von denen angenommen wird, dass sie sechsgliedrige Ringübergangszustände bilden, in der Mitte und auf der linken Seite des Diagramms gezeigt sind. Jeder der Synthesewege kann eine Mischung der Isomeren liefern oder kann Zusammensetzungen erzeugen, die an einem von zwei Isomeren angereichert sind.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung liefern eine Vielzahl von Wegen, um bei der gewünschten Mischung von Isomeren anzukommen. Die Flexibilität und Vielseitigkeit der Synthesestrategien, die hier offenbart werden, wird zum Teil in den Symmetrien und Asymmetrien von 3 widergespiegelt. Eine Reaktion, die allen Wegen gemeinsam ist, ist der Schutz einer funktionellen Gruppe in Cyclosporin A 34; in dieser beispielhaften Ausführungsform ist diese Reaktion die Umwandlung von Cyclosporin A 34 in Acetylcyclosporin A 35. Eine Asymmetrie in 3 ist die Verwendung der Acetylcyclosporin-A-aldehydverbindung 51 als Vorläufer für alle Synthesewege unter Anwendung von organometallischen Titan- und Lithiumreagenzien, aber nur für einige der phosphorhaltigen Wittig-Reaktionswege.
  • Allgemein verwenden die Synthesewege von 3, deren Reaktionsbedingungen so eingestellt werden können, dass eine Mischung mit dem gewünschten Verhältnis von Isomeren erzeugt wird, phosphorhaltige Reagenzien als Teilneh mer an einer Wittig-Reaktion. Andere stereoselektive Wege wenden auch anorganische Elemente an, typischerweise als Mitglieder von organometallischen Reagenzien, die sechsgliedrige Ringübergangszustände durchlaufen, wobei eine sterische Hinderung die letztendliche Konfiguration diktiert. Eine Vielzahl von organometallischen Reagenzien sind für die vorliegende Erfindung nützlich, einschließlich solcher, die anorganische Elemente, wie Bor, Silicium, Titan, Lithium und Schwefel beinhalten.
  • Zusammensetzungen, die an dem einen oder dem anderen von einem Paar von Isomeren angereichert sind, können aus einem einzelnen Vorläufer hergestellt werden; alternativ können zwei Zusammensetzungen hergestellt werden aus verschiedenen Vorläufern. Bei einem der stereoselektiven Wege von 3 (Weg 32) führt ein einzelner Vorläufer zu beiden Isomeren von ISATX247 abhängig von den Reaktionsbedingungen, die ausgewählt werden. Auf einem anderen stereoselektiven Weg (Weg 33) sind zwei verschiedene Vorläufer notwendig, um jede der angereicherten Zusammensetzungen herzustellen.
  • Die Reaktionen von 3 werden nun im Detail diskutiert. Eine Reaktion, die allen Synthesewegen gemeinsam ist, ist der Schutz des Alkohols an Position β der Seitenkette des 1-Aminosäurerestes. Ein solches Schutzgruppenschema adressiert ein Problem, das in der organischen Synthese häufig auftritt, wenn eine erste funktionelle Gruppe ungewollt durch eine Reaktion modifiziert wird, die für eine zweite (ähnliche und/oder identische) funktionelle Gruppe vorgesehen ist, die an anderer Stelle des Moleküls angeordnet ist. Um das Schema auszuführen, wird die erste funktionelle Gruppe mit einer Schutzgruppe umgesetzt, die gewünschte Reaktion wird an der zweiten funktionellen Gruppe durchgeführt und die Schutzgruppe wird dann von der ersten funktionellen Gruppe entfernt.
  • Schutzgruppen sind in der organischen Synthese wohl bekannt und wurden von J. R. Hanson in Kapitel 2, "The Protection of Alcohols" der Veröffentlichung Protecting Groups in Organic Synthesis (Sheffield Academic Press, Sheffield, England, 1999), S. 24–25 diskutiert.
  • Hanson lehrt, wie Hydroxylgruppen geschützt werden, indem sie entweder in Ester oder Ether umgewandelt werden. Acetatester sind vielleicht die am häufigs ten verwendete Art in der Chemie des Schutzes für Hydroxylgruppen. Es gibt einen ausgedehnten Bereich an Bedingungen, die verwendet werden können, um die Acetatgruppe einzuführen. Diese Reagenzien und Lösungsmittel schließen Essigsäureanhydrid und Pyridin; Essigsäureanhydrid, Pyridin und Dimethylaminopyridin (DMAP); Essigsäureanhydrid und Natriumacetat; Essigsäureanhydrid und Toluol-p-sulfonsäure; Acetylchlorid, Pyridin und DMAP; und Keten ein. DMAP ist ein nützlicher Acylierungskatalysator wegen der Bildung eines hoch reaktiven N-Acylpyridiniumsalzes aus dem Anhydrid.
  • Der β-Alkohol von Cyclosporin A 34 kann als Acetat geschützt werden, indem 34 mit Acetylchlorid; Ethylacetat oder Kombinationen davon umgesetzt wird, wobei die Verbindung Acetylcyclosporin A 35 gebildet wird. Alternativ wird der β-Alkohol einer nucleophilen Addition von Essigsäureanhydrid unterzogen, wobei Acetylcyclosporin A 35 und Essigsäure gebildet werden. Diese Reaktionen können in Gegenwart von Dimethylaminopyridin (DMAP) durchgeführt werden, wobei ein Überschuss an Essigsäureanhydrid als Lösungsmittel dient. In diesen Fällen kann der Vorsatz "Acetyl" in der Nomenklatur während des Synthesewegs verwendet werden oder bis die Acetylgruppe entfernt ist. Z.B. wird das letzte Zwischenprodukt bei einem Syntheseweg mit einer Acetylgruppe am β-Kohlenstoffatom als "Acetyl-(E)-1,3-dien" bezeichnet.
  • Obwohl die Herstellung von Acetylcyclosporin A in der Literatur wohl etabliert ist, ist es selbstverständlich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass andere Schutzgruppen als Acetatester verwendet werden können, um den β-Alkohol des 1-Aminosäurerestes von Cyclosporin A 34 zu schützen. Diese Schutzgruppen können Benzoatester, substituierte Benzoatester, Ether und Silylether einschließen. Unter bestimmten Reaktionsbedingungen ist die Acetatschutzgruppe empfindlich für unerwünschte Nebenreaktionen, wie Eliminierung und Hydrolyse. Da Benzoatester, Ether und Silylether häufig gegenüber solchen Nebenreaktionen unter den gleichen Reaktionsbedingungen resistenter sind, ist es oft vorteilhaft, solche Schutzgruppen anstelle von Acetat anzuwenden. Cyclosporin oder Cyclosporinderivate, die durch eine Acetylgruppe oder eine andere Schutzgruppe geschützt wurden, werden als "geschütztes Cyclosporin A" bezeichnet. In gleicher Weise wird das letzte Zwischenprodukt auf dem beispielhaften Syntheseweg, auf den oben Bezug genommen wurde, "geschütztes (E)-1,3-Dien" statt "Acetyl-(E)-1,3-dien" bezeichnet. Die Art der ausgewählten Schutzgruppe kann einen Einfluss auf den gewünschten Verlauf weiterer Stufen in der Reaktionsreihenfolge haben.
  • Bezug nehmend auf 3 hat Acetylcyclosporin A 35 auf diesem beispielhaften Weg einen geschützten β-Alkohol und diese Verbindung dient als Vorläufer für die Synthese von ISATX247-Isomeren bei verschiedenen Synthesewegen. Wittig-Reaktionswege werden zuerst diskutiert.
  • Synthese von Mischungen von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 über eine Wittig-Reaktion
  • Wittig-Reaktionswege, die hier beispielhaft angegeben sind, sind in 3 mit dem Bezugszeichen 31 versehen. Methode 1 verläuft über das Bromzwischenprodukt Acetyl-η-bromcyclosporin 41, wohingegen Methode 2 den Acetylcyclosporin-A-aldehyd 51 als Ausgangspunkt verwendet. Die beispielhaften Methoden, die unten beschrieben werden, verwenden eine Wittig-Reaktion, um eine Alkenfunktionalität mit einer Mischung von stereochemischen Konfigurationen einzuführen.
  • Die Wittig-Reaktionen, die in den beispielhaften Ausführungsformen verwendet werden, die hier offenbart werden, um Mischungen von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 zu synthetisieren, können gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids durchgeführt werden. Es ist wohl bekannt, dass die Gegenwart von Lithiumhalogeniden bei Wittig-Reaktionen eine Wirkung auf das Verhältnis der erzeugten geometrischen Isomeren hat und daher kann die Zufügung einer solchen Verbindung dazu beitragen, eine gewünschte Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 herzustellen.
  • Methode 1
  • Eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 kann hergestellt werden, wie in 4 gezeigt. Die Verwendung der wellenförmigen Darstellung in 4 (siehe insbesondere Verbindungen 43 und 44) soll angeben, dass die beispielhafte Reaktionssequenz eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren erzeugt. Das prozentuale Verhältnis von (E)- zu (Z)-Isomeren erzeugte Bereiche von etwa 10 bis 90% (E)-Isomer zu etwa 90 bis 10% (Z)-Isomer; aber diese Bereiche sind nur beispielhaft und viele andere Bereiche sind möglich. Z.B. kann die Mischung etwa 15 bis 85 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 85 bis 15% (Z)-Isomer enthalten. Alternativ enthält die Mischung etwa 25 bis 75 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 75 bis 25 Gew.-% (Z)-Isomer; etwa 35 bis 65 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 65 bis 35 Gew.-% (Z)-Isomer und etwa 45 bis 55 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 55 bis 45% (Z)-Isomer. In einer noch weiteren Alternative ist die isomere Mischung eine ISATX247-Mischung, die etwa 45 bis 50 Gew.-% des (E)-Isomers und etwa 50 bis 55 Gew.-% des (Z)-Isomers enthält. Diese Gewichtsprozentangaben basieren auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung und es versteht sich, dass die Summe der Gewichtsprozentanteile von (E)-Isomer und (Z)-Isomer 100 Gew.-% ergeben. In anderen Worten kann eine Mischung 65 Gew.-% (E)-Isomer und 35 Gew.-% (Z)-Isomer oder umgekehrt enthalten.
  • Bezug nehmend auf 4 wird der endständige η-Kohlenstoff der Seitenkette des 1-Aminosäurerestes des Acetylcyclosporins A in der nächsten Stufe der Reaktion bromiert, indem Acetylcyclosporin A 35 mit N-Bromsuccinimid und Azo-bis-isobutyronitril in einem Lösungsmittel, wie Tetrachlorkohlenstoff, am Rückfluss erhitzt wird, was das Zwischenprodukt Acetyl-η-bromcyclosporin A 41 erzeugt. N-Bromsuccinimid ist ein Reagenz, das häufig verwendet wird, um allylische Wasserstoffe durch Brom zu ersetzen, und es wird angenommen, dass dies über einen freien Radikalmechanismus erfolgt. Die Herstellung des Zwischenprodukts 41 wurde im Wesentlichen von M. K. Eberle und F. Nuninger in "Synthesis of the Main Metabolite (OL-17) of Cyclosporin A", J. Org. Chem., Bd. 57, S. 2689–2691 (1992) beschrieben.
  • Das neue Zwischenprodukt Triphenylphosphoniumbromid von Acetylcyclosporin A 42 kann aus Acetyl-η-bromcyclosporin A 41 durch Erhitzen der letzteren Verbindung mit Triphenylphosphin in einem Lösungsmittel, wie Toluol, hergestellt werden.
  • Das neue Zwischenprodukt 42 und andere, die diesen ähnlich sind, werden als Schlüsselzwischenprodukte bei der Synthese einer Vielzahl von Cyclosporin-A-Analoga angesehen, die ein konjugiertes Diensystem in dem 1-Aminosäurerest enthalten. Z.B. können außer Triphenylphosphin Verbindungen, wie Triarylphosphine, Trialkylphosphine, Arylalkylphosphine und Triarylarsine mit Ace tyl-η-bromcyclosporin A 41 umgesetzt werden, um andere aktivierte Verbindungen, die 42 ähnlich sind, herzustellen.
  • Bezug nehmend auf 4 kann eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-1,3-dien 43 hergestellt werden, indem Triphenylphosphoniumbromid von Acetylcyclosporin A 42 mit einem Überschuss von Formaldehyd in Toluol bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach Zugabe des Formaldehyds wird eine Base, wie Natriumhydroxid, tropfenweise zugegeben und die isomere Mischung der Diene wird mit Ethylacetat extrahiert.
  • Zahlreiche Lehrbücher der organischen Chemie beschreiben die Wittig-Reaktion. Eine Beschreibung wird beispielsweise von J. McMurry in Organic Chemistry, 5. Aufl. (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), S. 780–783, angegeben. Eine Wittig-Reaktion kann verwendet werden, um ein Keton oder einen Aldehyd in ein Alken umzuwandeln. In einem solchen Verfahren kann ein Phosphorylid, auch als Phosphoran bezeichnet, mit dem Aldehyd oder Keton umgesetzt werden, was ein dipolares Zwischenprodukt ergibt, das Betain genannt wird. Typischerweise wird das Betainzwischenprodukt nicht isoliert, stattdessen zersetzt es sich spontan über einen viergliedrigen Ring, was ein Alken und ein Triphenylphosphinoxid liefert. Das Nettoergebnis ist der Ersatz des Carbonylsauerstoffatoms durch die R2C=Gruppe, die ursprünglich an den Phosphor gebunden war.
  • Es versteht sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass eine große Vielzahl von Reagenzien die beispielhaften Wittig-Reaktionsreagenzien, die oben zitiert wurden, ersetzen kann. Z.B. können zahlreiche Alkyl-, Aryl-, Aldehyd- und Ketonverbindungen den Formaldehyd ersetzen, um eine große Vielzahl von Cyclosporinderivaten herzustellen. Die Anmelder haben die obige Synthese mit Formaldehyd und anstelle von Formaldehyd mit Verbindungen, wie Acetaldehyd, deuteriertem Formaldehyd, deuteriertem Acetaldehyd, 2-Chlorbenzaldehyd, Benzaldehyd und Butyraldehyd durchgeführt. Solche Wittig-Reaktionen können mit anderen Verbindungen als Triphenylphosphoniumderivaten durchgeführt werden, wie Triarylphosphinen, Trialkylphosphinen, Arylalkylphosphinen und Triarylarsinen. Statt der Verwendung von Natriumhydroxid können zahlreiche andere Basen, wie Natriumcarbonat, Butyllithium, Hexyllithium, Natriumamid, sterisch gehinderte Lithiumbasen, wie Lithiumdiisopropylamid und Alkalimetallalkoxide verwendet werden. Zusätzlich zur Variation dieser Reagenzien kann die Reaktion in verschiedenen organischen Lösungsmitteln oder Mischungen von organischen Lösungsmitteln und Wasser in Gegenwart verschiedener Salze, insbesondere von Lithiumhalogeniden, und bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden. Alle oben aufgeführten Faktoren können geeigneterweise von einem Fachmann auf diesem Gebiet so ausgewählt werden, dass der gewünschte Effekt auf die Stereochemie der gebildeten Doppelbindung auftritt, d.h. der gewünschte Effekt auf das Verhältnis von cis- zu trans-Isomeren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Wittig-Reaktion in einem Lösungsmittel durchgeführt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetrahydrofuran und Toluol, wobei das Lösungsmittel in Gegenwart einer Verbindung verwendet wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Butyllithium, Natriumniedrigalkoxid, Kaliumniedrigalkoxid und Carbonat ausgewählt wird, bei einer Temperatur zwischen etwa –80 und 110°C. Das Kaliumniedrigalkoxid kann ein Kalium-tert.-butoxid sein. Weiterhin kann das Lösungsmittel Tetrahydrofuran sein, das in Gegenwart von Kalium-tert.-butoxid bei einer Temperatur zwischen etwa –70 und –100°C verwendet wird.
  • In einer letzten Stufe dieser Synthese kann die Schutzgruppe am β-Kohlenstoff entfernt werden unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Die Mischung von Acetyl-(E)-1,3-dien und Acetyl-(Z)-1,3-dien 43 wird in Methanol gelöst und dann wird Wasser zugefügt. Eine Base, wie Kaliumcarbonat, wird zugegeben und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur gerührt. Andere Basen als Kaliumcarbonat, die verwendet werden können, schließen Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumalkoxid und Kaliumalkoxid ein. Ethylacetat wird dann verwendet, um die fertige Produktmischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 44 zu extrahieren.
  • Methode 2
  • Bei einem alternativen Reaktionsweg zur Synthese einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 über eine Wittig-Reaktionsstrategie kann ein vierstufiger Syntheseweg angewendet werden wie folgt: 1) Schutz des β-Alkohols, wie in Methode 1, 2) Oxidation des in der ersten Stufe erzeugten Acetylcyclosporin A, um einen Aldehyd herzustellen; 3) eine Wittig-Reaktion und 4) eine Deacetylie rung des Wittig-Reaktionsproduktes oder in gleicher Weise Hydrolyse des Acetatesters, um den Alkohol freizusetzen. Diese Reaktionsreihenfolge ist in 5 erläutert.
  • Dieser Syntheseweg beginnt auf gleiche Weise wie der Wittig-Reaktionsweg von 4, indem in der ersten Stufe der β-Alkohol mit einer Acetatestergruppe geschützt wird. Die zwei Wege unterscheiden sich von hier an jedoch darin, dass in der nächsten Stufe von Methode 2 Acetylcyclosporin A 35 in einen Aldehyd umgewandelt wird, Acetylcyclosporin-A-aldehyd 51. Diese Reaktion verwendet ein Oxidationsmittel, das ausreichend stark ist, um eine C=C-Bindung zu spalten, was zwei Fragmente erzeugt. Alkenspaltung ist im Stand der Technik bekannt. Ozon ist vielleicht das am häufigsten verwendete Doppelbindungsspaltungsreagenz, aber andere Oxidationsmittel, wie Kaliumpermanganat (KMnO4) oder Osmiumtetroxid, können auch Doppelbindungen spalten.
  • Acetylcyclosporin A kann in einen Aldehyd umgewandelt werden mit Ozon als Oxidationsmittel gefolgt von einer Aufarbeitung mit einem Reduktionsmittel, um Acetylcyclosporin-A-aldehyd zu bilden. Die Ozonolysestufe wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa –80 bis 0°C durchgeführt. Das während der Ozonolyse verwendete Lösungsmittel kann ein niedriger Alkohol, wie Methanol sein. Das Reduktionsmittel kann ein Trialkylphosphin, wie Tributylphosphin, ein Triarylphosphin, ein Trialkylamin, wie Triethylamin, ein Alkylarylsulfid, ein Thiosulfat oder ein Dialkylsulfid, wie Dimethylsulfid sein. Wenn mit Tributylphosphin als Reduktionsmittel gearbeitet wird, weiß der Fachmann auf diesem Gebiet, dass die Reaktion dosiskontrolliert ist.
  • Der β-Alkohol von Cyclosporin A kann mit einer Trimethylsilyl-(TMS)-gruppe geschützt werden und mit Ozon als Oxidationsmittel oxidiert werden gefolgt von einer Aufarbeitung mit einem Reduktionsmittel, um TMS-Cyclosporin-A-aldehyd zu bilden. Die Ozonolysestufe wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa –80 bis 0°C durchgeführt. Das für die Ozonolyse verwendete Lösungsmittel kann eine Mischung aus einem niedrigen Alkohol und Dichlormethan sein. Das Reduktionsmittel kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Trialkylphosphinen, wie Tributylphosphin, Triarylphosphinen, Trialkylaminen, wie Triethylamin, Alkylarylsulfiden, Thiosulfaten oder Dialkylsulfiden, wie Dimethylsul fid. Wenn mit Tributylphosphin als Reduktionsmittel aufgearbeitet wird, weiß der Fachmann auf diesem Gebiet, dass die Reaktion dosiskontrolliert ist.
  • Zusätzlich kann der Cyclosporin-A-aldehyd hergestellt werden, indem der β-Alkohol von Cyclosporin A geschützt wird durch Bildung von Acetylcyclosporin A und dann das Acetylcyclosporin A mit Monopersulfat, bevorzugt Oxon, in Gegenwart eines Ketons, wie Acetoxyaceton oder Diacetoxyketon, zu Acetylcyclosporin-A-epoxid umgewandelt wird. Diese Stufe wird in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, das unter diesen Reaktionsbedingungen inert ist, wie Acetonitril und Wasser. Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz wird zugegeben, um jegliche Schwermetallionen, die vorhanden sein könnten, abzufangen. Die Epoxidierungsreaktion wird bevorzugt bei einem pH-Wert über 7 durchgeführt. An diese Epoxidierungsreaktion schließt sich eine oxidative Spaltung des Epoxids mit Periodsäure oder Periodatsalz unter sauren Bedingungen an. Gegebenenfalls kann die Oxidation und die oxidative Spaltung in einem Aufarbeitungsverfahren kombiniert werden. Diese Reaktionen wurden von Dan Yang et al. in "A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefines", J. Am. Chem. Soc., Bd. 118, S. 491–492 (1996) und "Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions", J. Org. Chem, Bd. 63, S. 9888–9894 (1998) diskutiert.
  • Die Verwendung von auf Ruthenium basierenden Oxidationsmitteln wurde von H. J. Carlsen et al. in "A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds", J. Org. Chem, Bd. 46, Nr. 19, S. 3736–3738 (1981) diskutiert. Carlsen et al. lehren, dass historisch die Kosten des Rutheniummetalls einen Anreiz lieferten zur Entwicklung von katalytischen Verfahren, wobei die populärsten davon Periodat oder Hypochlorit als stöchiometrische Oxidantien verwendeten. Diese Forscher fanden einen Verlust der katalytischen Aktivität im Verlauf der Reaktion bei der üblichen Verwendung von Ruthenium, von dem sie postulierten, dass er auf der Gegenwart von Carbonsäuren beruhte. Es erwies sich, dass die Zugabe von Nitrilen zu der Reaktionsmischung, insbesondere Acetonitril, die Rate und das Ausmaß der oxidativen Spaltung von Alkenen in einem CCl4/H2O/IO4 –-System bedeutend verbessert.
  • Acetylcyclosporin-A-aldehyd 51 kann aus Acetylcyclosporin A 35 hergestellt werden, indem er in einer Mischung aus Acetonitril und Wasser gelöst wird und dann zuerst Natriumperiodat und dann Rutheniumchloridhydrat zugefügt wird. Der Aldehyd 51 kann mit Ethylacetat extrahiert werden. Es ist anzumerken, dass die Synthese des Aldehyds 51 durch diese oxidative Spaltungsstrategie wichtig für viele stereoselektive Wege ist, die unten diskutiert werden, und demzufolge wird der Leser auf diesen Abschnitt zurückverwiesen.
  • Zusätzlich kann Cyclosporin-A-aldehyd hergestellt werden, indem der β-Alkohol von Cyclosporin A geschützt wird durch Bildung von Acetylcyclosporin A und dann das Acetylcyclosporin A in Acetylcyclosporin-A-epoxid in Gegenwart eines Ketons, bevorzugt eines aktivierten Ketons, bevorzugt Acetoxyaceton oder Diacetoxyaceton, mit einem Monopersulfat, bevorzugt Oxon, umgewandelt wird. Diese Stufe wird in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, das unter diesen Reaktionsbedingungen inert ist, wie Acetonitril und Wasser. Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz wird zugefügt, um jegliche Schwermetallionen, die vorhanden sein könnten, einzufangen. Die Epoxidierungsreaktion wird bevorzugt bei einem pH-Wert über 7 durchgeführt. An diese Epoxidierungsreaktion schließt sich eine oxidative Spaltung des Epoxids mit Periodsäure oder Periodatsalz unter sauren Bedingungen an. Die Oxidation und die oxidative Spaltung können in einem Aufarbeitungsverfahren kombiniert werden. Diese Reaktionen wurden von Dan Yang et al. in "A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefines", J. Am. Chem. Soc., Bd. 118, S. 491–492 (1996) und "Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions", J. Org. Chem, Bd. 63, S. 9888–9894 (1998) diskutiert.
  • Die dritte Stufe von Methode 2 beinhaltet die Umwandlung des Aldehyds 51 in eine Mischung aus (E)- und (Z)-Dienen über eine Wittig-Reaktion in gleicher Weise, wie bei Methode 1. Wie bei Methode 1 wird ein Phosphorylid an den Aldehyd addiert, was ein Betain liefert (das nicht isoliert wird), mit dem Nettoergebnis, dass das Carbonylsauerstoffatom des Aldehyds durch die R2C=Gruppe ersetzt wird, die ursprünglich an den Phosphor gebunden war. Wiederum können solche Wittig-Reaktionen mit anderen phosphorhaltigen Verbindungen durchgeführt werden als Triphenylphosphoniumderivaten, z.B. Triarylphosphinen, Trialkylphosphinen, Arylalkylphosphinen und Triarylarsinen, bei verschiedenen Tem peraturen und unter Verwendung einer Vielzahl von basischen Lösungen und Lösungsmitteln oder durch Zugabe verschiedener anorganischer Salze, die verwendet werden können, um die Stereochemie der neu gebildeten Doppelbindung zu beeinflussen.
  • Acetylcyclosporin-A-aldehyd 51 kann in Toluol gelöst werden, dem eine Base, wie Natriumhydroxid in Wasser, zugefügt wird. Allyltriphenylphosphoniumbromid 52 wird dann zugegeben und die Reaktion eine Zeit lang gerührt. Die Aufarbeitung der Produktmischung von Acetyl-(E)- und -(Z)-1,3-dienen 53 beinhaltet die Extraktion mit Hexan und/oder Ethylacetat, wobei der Ausdruck "Aufarbeitung" das Verfahren des Extrahierens und/oder Isolieren von Reaktionsprodukten aus einer Mischung von Reaktanten, Produkten, Lösungsmitteln etc. bedeuten soll.
  • In einer letzten Stufe von Methode 2, ähnlich der letzten Stufe von Methode 1, wird die Acetatestergruppe, die den Alkohol an der β-Kohlenstoffposition schützt, mit Kaliumcarbonat entfernt, was eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 54 liefert. Andere Basen als Kaliumcarbonat, die verwendet werden können, um die Schutzgruppe zu entfernen, schließen Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumalkoxid und Kaliumalkoxid ein.
  • Synthese von Zusammensetzungen, die an einem der beiden ISATX247 (E)- und (Z)-Isomeren angereichert sind, über organometallische Routen
  • Stereoselektive Synthesewege können die Verwendung von anorganischen Reagenzien beinhalten, die Elemente, wie Silicium, Bor, Titan, Schwefel, Phosphor und/oder Lithium enthalten. Diese Wege können über einen sechsgliedrigen Ring als Übergangszustand erfolgen, wobei eines der Mitglieder des Rings das anorganische Element aus dem organometallischen Reagenz ist. Sterisch gehinderte Wirkungen in Bezug auf den Übergangszustand können das stereochemische Ergebnis der Reaktion beeinflussen.
  • Zwei beispielhafte stereoselektive Schemata werden in der vorliegenden Offenbarung diskutiert. Bei dem ersten stereoselektiven Schema (Methode 3, auch gezeigt als Weg 32 in 3), wird eine siliciumhaltige Verbindung einer Eliminierungsreaktion unterzogen, um entweder das (E)- oder (Z)-Isomere zu erzeugen, abhängig davon, ob die Eliminierungsreaktion unter sauren oder basischen Be dingungen durchgeführt wird. Dies ist ein Beispiel einer Peterson-Olefinierung. In dem zweiten stereoselektiven Schema (Methode 4, auch als Weg 33 in 3 gezeigt) wird jedes der Isomere aus einem anderen Vorläufer erzeugt. Das (Z)-Isomer wird aus titan- und phosphorhaltigen Zwischenprodukten erzeugt, wohingegen das (E)-Isomer über ein lithiumhaltiges Zwischenprodukt erzeugt wird.
  • Methode 3
  • Dieser Syntheseweg erfolgt über den Acetylcyclosporin-A-aldehyd 51.
  • Ein ähnliches Reaktionsschema wurde allgemein von D. J. S. Tsai und D. S. Matteson in "A Stereocontrolled Synthesis of (Z) and (E) Terminal Dienes from Pinacol (E)-1-Trimethylsilyl-1-Propene-3-Boronate", Tetrahedron Letters, Bd. 22, Nr. 29, S. 2751–2752 (1981) diskutiert. Diese Methode wird in 6 erläutert. Allgemein beinhaltet die Synthese die Herstellung eines Trimethylsilylallylboronatesterreagenzes 62 und dann die Behandlung von Acetylcyclosporin-Aaldehyd 51 mit 62 unter Bildung eines β-Trimethylsilylalkohols 64. Es wird angenommen, dass sich dieser Alkohol über einen borhaltigen Übergangszustand 63 bildet. Da Boronatester in Allylborierungsreaktionen langsam reagieren, ergibt es sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass die Verwendung eines schneller reagierenden Boranreagenzes, wie E-γ-Trimethylsilyldiethylboran oder 9-(E-γ-Trimethylsilylallyl)-9-BBN Vorteile hat. Der β-Trimethylsilylalkohol 64 kann dann einer Peterson-Olefinierung unterzogen werden, um ein Alken herzustellen, in diesem Fall entweder das Dien 65 oder das Dien 67.
  • Die Bildung des Alkens folgt einem von zwei verschiedenen Wegen, abhängig davon, ob die Eliminierungsreaktion (die Olefinierung) unter sauren oder basischen Bedingungen durchgeführt wird. Unter sauren Bedingungen tritt eine anti-Eliminierung auf unter Bildung des (E)-Isomers, wohingegen unter basischen Bedingungen eine cis-Eliminierung erfolgt unter Bildung des (Z)-Isomers. Es ergibt sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass durch Verwendung dieses Synthesewegs jedes Isomer aus dem gleichen Vorläufer hergestellt werden kann. Das Produkt jeder Eliminierungsreaktion enthält eine Zusammensetzung, die an einem der beiden Isomere angereichert ist. Angereichert bedeutet z.B., dass die Zusammensetzung mehr als oder etwa 75 Gew.-% eines Isomers ent hält. Alternativ kann die angereicherte Zusammensetzung 80, 85 und 90 Gew.-% eines der Isomere enthalten. Die Zusammensetzungen, die an einem Isomer angereichert sind, können dann in einem vorbestimmten Verhältnis kombiniert werden, um die gewünschte Mischung zu erreichen, wie in 10 erläutert.
  • Die Reaktionen in 6 werden nun im Detail diskutiert, beginnend mit der Herstellung des borhaltigen Reagenzes 62. Eine allgemeine Untersuchung der Verwendung von siliciumhaltigen Reagenzien bei der Synthese von Kohlenstoff-Kohlenstoff-bindungsbildenden Reaktionen wurde von E. Ehlinger und P. Magnus in "Silicon in Synthesis. 10. The (Trimethylsilyl)allyl Anion: A β-Acyl Anion Equivalent for the Conversion of Aldehydes and Ketones into γ-Lactones", J. Am. Chem. Soc., Bd. 102, Nr. 15, S. 5004–5011 (1980) diskutiert. Insbesondere lehren diese Forscher die Reaktion zwischen dem (Trimethylsilyl)allylanion und einem Aldehyd. Das Anion kann hergestellt werden, indem Allyltrimethylsilan mit sec.-Butyllithium in Tetrahydrofuran bei –76°C, das ein Äquivalent Tetramethylethylendiamin (TMEDA) enthält, deprotoniert wird.
  • Die Deprotonierung von Allyltrimethylsilan (diese Stufe ist nicht in 6 gezeigt) wurde von J.-F. Biellmann und J.-B. Ducep in "Allylic and Benzylic Carbanions Substituted by Heteroatoms", Organic Reactions, Bd. 27 (Wiley, New York, 1982), S. 9, diskutiert. Ein Proton in α-Stellung zu dem Heteroatom in substituierten allylischen Systemen kann mit einem basischeren Mittel entfernt werden. Eine große Vielzahl solcher Agenzien sind verfügbar, wobei vielleicht n-Butyllithium das häufigste ist. n-Butyllithium wird in einer stöchiometrischen Menge bezogen auf die zu metallisierende Verbindung in Lösung mit Tetrahydrofuran (THF) verwendet. Die Temperatur wird gewöhnlich unter 0°C (oft unter –76°C) gehalten, wo das n-Butyllithium eine geringe Reaktivität aufgrund seiner polymeren Natur hat. Die Zugabe eines Komplexierungsmittels, wie N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TMEDA) führt dazu, dass das Polymer dissoziiert. Die Reaktion kann jedoch auch bei Raumtemperatur erfolgen, sogar in Abwesenheit von TMEDA.
  • Allylsilane können leicht deprotoniert werden, da das Anion, das erzeugt wird, nicht nur durch Konjugation mit der benachbarten Doppelbindung stabilisiert wird, sondern auch durch die benachbarte Silylgruppe. Das Anion kann mit Elektrophi len entweder über sein α-Kohlenstoffatom oder sein γ-Kohlenstoffatom reagieren. Das regiochemische und stereochemische Ergebnis dieser Reaktionen hängt von mehreren Faktoren ab, von denen der wichtigste die Art des Gegenions ist. Siehe die Diskussion von Allylsilanen von S. E. Thomas in Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), S. 84–87.
  • Bei diesem Reaktionsschema durchläuft das deprotonierte Allylsilan dann den elektrophilen Einfang durch Trimethylborat, was ein Zwischenprodukt erzeugt, das dann, wenn es mit Pinacol umgesetzt wird, die trans-(Trimethylsilyl)boronatverbindung 62 liefert. Das Boronat 62 kann auch als "Allylboran" (Allylboronatester) bezeichnet werden. Wenn 9-Methoxy-9-dialkylboran bei dem elektrophilen Einfang verwendet wird, würde dies alternativ zu einem Boronatkomplex führen, der dann demethoxyliert werden könnte unter Verwendung eines Bortrifluoridreagenzes (wie BF3Et2O), um das entsprechende 9-(γ-trans-Trimethylsilylallyl)-9-dialkylboran zu erzeugen.
  • Die Addition eines Aldehyds an Allylboran wurde von S. E. Thomas in der oben erwähnten Literaturstelle auf den Seiten 34 bis 35 diskutiert. Die Addition eines Aldehyds an ein Allylboran, wobei letzteres unsymmetrisch am distalen Ende der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung substituiert ist (distal bedeutet am weitesten vom Boratom entfernt), erzeugt einen homoallylischen Alkohol, der zwei benachbarte chirale Zentren enthält. (E)-Allylborane führen zu dem threo-Diastereoisomer, während (Z)-Allylborane zu dem erythro-Diastereoisomer führen. Eine beispielhafte Reaktion eines (E)-Allylboran 62 mit Cyclosporin-Aaldehyd 51 ist in 6 gezeigt, wo das Borzwischenprodukt 63 gebildet wird, nachdem die Reaktanten in einer THF-Lösung über einen Zeitraum von mehreren Tagen gerührt wurden.
  • Die Bezugsziffer 69 in dem Borzwischenprodukt 63 (6) soll darauf hindeuten, dass jede Anzahl von Strukturen an der Borposition möglich ist. Wenn z.B. das Boronatreagenz 62 ein Trialkylsilylallylboronatester ist, dann würde die Struktur an 69 einen 5-gliedrigen Ring aufweisen, der zwei Sauerstoffatome enthält. Substitutionen an den Boronat- oder den Boranreagenzien, die in 62 angewendet werden, sind in der Struktur in 63 vorhanden.
  • Es wurde postuliert, dass die Stereoselektivität, die bei Reaktionen erreicht wird, die Allylborane mit Aldehyden betreffen, auf dem sesselartigen Übergangszustand des 6-gliedrigen Rings, der beispielhaft für das Borzwischenprodukt 63 ausgeführt ist, und in 6 dargestellt ist; beruhen. Nur die zwei Carbonylatome des Aldehyds (Kohlenstoff und Sauerstoff, die doppelt gebunden sind) werden Mitglieder des 6-gliedrigen Rings als Übergangszustand, der Rest des Aldehyds erstreckt sich vom Ring weg. Der CsA-Anteil des Aldehyds, der sich von dem 6-gliedrigen Ring weg erstreckt, soll in einer äquatorialen statt axialen Position bezogen auf den Ring vorliegen, wegen der letzteren Konfiguration würde dies zu einer unvorteilhaften sterischen Hinderung führen zwischen dem Substituenten und einem Sauerstoffatom des Allylborans 62. Für den Fachmann auf diesem Gebiet ergibt sich, dass die Position der SiMe3-Gruppe aus dem (Trimethylsilyl)allylanion so gezeigt ist, dass sie eine Äquatorialposition in 6 besetzt, weil dieses Beispiel mit dem (E)-Diastereomer des Allylborans startet. Alternativ könnte die SiMe3-Gruppe in einer axialen Position gezeichnet werden, wenn das Ausgangsallylboran das (Z)-Diastereomer gewesen wäre.
  • Alternativ wird in Betracht gezogen, den erythro-Silylalkohol herzustellen, für den eine saure Eliminierung das cis-Isomer ergäbe und eine basische Eliminierung das trans-Isomer ergäbe in umgekehrter Weise zu den oben diskutierten Eliminierungsreaktionen. Es ist offensichtlich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass am Ende der Synthese die gleichen Produkte erhalten würden.
  • Die Behandlung des Produkts 63 im Übergangszustand mit Triethanolamin liefert den β-Trimethylsilylalkohol 64. Andererseits liefert das Allylborierungsprodukt von (Trimethylsilylallyl)dialkylboran den Silylalkohol 64 bei Oxidation unter Verwendung von NaOH/H2O2 oder bei wässriger Aufarbeitung. Der in 6 dargestellte Alkohol 64 ist das threo-Diastereoisomer, da das Allylboran 63 im Übergangszustand in (E)-Konfiguration war, obwohl es für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich ist, dass das andere Diastereoisomer hätte hergestellt werden können, wenn von dem Z-Allylboranreagenz ausgegangen worden wäre. Die Diastereoselektivität in den neu erzeugten chiralen Zentren wird nicht auf dieser Stufe bestimmt aufgrund der Entfernung dieser chiralen Zentren in einer späteren Stufe der Synthese. Die Struktur des β-Trimethylsilylalkohols 64, die in 6 gezeigt ist, wurde von den Anmeldern unter Verwendung von Spektraltechniken bestätigt.
  • Bei einer Methode der Alkensynthese, die als Peterson-Olefinierung bekannt ist, führt die Eliminierung der Trialkylsilylgruppe und der Hydroxygruppe aus dem β-Trimethylsilylakohol 64 zu einem Alken; in diesem Fall einem Dien, aufgrund der Doppelbindung, die bereits zwischen den zwei endständigen Kohlenstoffatomen der Kette vorhanden ist. Eine Diskussion der Umwandlung von β-Hydroxysilanen in Alkene wurde in der Literaturstelle (S. E. Thomas) auf den Seiten 68 und 69 gezeigt. Eine weitere Diskussion dieser Reaktion wird von P. F. Hurdlik und D. Peterson in "Stereospecific Olefn-Forming Elimination Reactions of β-Hydroxysilanes", J. Am. Chem. Soc., Bd. 97, Nr. 6, S. 1464–1468 (1975) dargestellt.
  • Bezug nehmend auf 6 kann sich an die Eliminierungsreaktion, die den Alkohol 64 in ein Dien umwandelt, einer von zwei eigenständigen mechanistischen Wegen anschließen, abhängig davon, ob die Reaktion unter sauren oder basischen Bedingungen ausgeführt wird. Ein Weg führt zu dem Dien 65, während der andere Weg zu dem Dien 67 führt. Unter sauren Bedingungen tritt eine anti-Eliminierung auf, während unter basischen Bedingungen eine syn-Eliminierung auftritt. In anderen Worten sind die Eliminierungsreaktionen von β-Hydroxysilanen stereospezifisch und die durch Säure bzw. Base geförderten Reaktionen nehmen einen entgegengesetzten stereochemischen Verlauf. Typische Säuren für die durch Säure geförderte Reaktion können Essigsäure, Schwefelsäure und verschiedene Lewis-Säuren einschließen; typische Basen schließen Natriumhydrid und Kaliumhydrid oder Kalium-tert.-butoxid ein. Es kann der Fall sein, dass Eliminierungsreaktionen unter Verwendung von Natriumhydrid in THF bei Raumtemperatur langsam sind, während Eliminierungsreaktionen, die Kaliumhydrid verwenden, schneller verlaufen.
  • Die Stereospezifität tritt auf dieser Stufe des Reaktionsweges auf, weil die Eliminierung unter sauren Bedingungen erfordert, dass die Trimethylsilyl- und Hydroxygruppen in einer antiperiplanaren Beziehung stehen. Im Gegensatz dazu erfordert die Eliminierung unter basischen Bedingungen, dass die Trimethylsilyl- und Hydroxygruppen eine synperiplanare Beziehung annehmen. Letztere Bedin gung erleichtert die Bildung einer starken Silicium-Sauerstoff-Bindung und eines 4-gliedrigen Rings als Zwischenprodukt, der in einer Art und Weise zerbricht, die analog ist zu der letzten Stufe einer Wittig-Reaktion. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass eine starke Silicium-Sauerstoff-Bindung eine schwächere Silicium-Sauerstoff-Bindung ersetzt, was den Ersatz einer starken Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung durch eine schwächere Kohlenstoff-Kohlenstoff-π-Bindung aufhebt.
  • Somit sind die Produkte der stereospezifischen Eliminierung eines β-Hydroxyalkylsilans die Acetyl-(E)-1,3-dienverbindung 67 und die Acetyl-(Z)-1,3-dienverbindung 65. Wie bei den vorherigen Methoden kann die Schutzgruppe nun von jedem dieser Diene entfernt werden durch Behandlung mit K2CO3 in Methanol und Wasser. Dies entfernt die Acetatgruppe, die an dem β-Kohlenstoff am 1-Aminosäurerest gebunden ist, so dass die funktionelle Gruppe an dem Kohlenstoff wieder zu einem Alkohol wird. Andere Basen als Kaliumcarbonat, die verwendet werden können, um die Schutzgruppe zu entfernen, schließen Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumalkoxid und Kaliumalkoxid ein.
  • Auf dieser Stufe der Herstellung ist die Synthese im Wesentlichen vollständig. Die Zusammensetzungen, die an dem einen oder anderen Isomer angereichert sind, können vermischt werden, um das gewünschte Verhältnis von Isomeren in der Mischung zu erzielen. Unter "angereichert" wird ein Produkt verstanden, das mindestens 75 Gew.-% eines Isomers aufweist, in anderen Worten, das Produkt kann bis zu 25 Gew.-% des "unerwünschten" Isomers enthalten. Die Mischung ist so ausgebildet, dass das gewünschte pharmakologische Ergebnis erzielt wird.
  • Methode 4
  • Dieser Weg erfolgt auch über den Acetylcyclosporin-A-aldehyd 51.
  • Ein anderes Schema zur Herstellung von stereoselektiven Isomeren ist in den 7 bis 8 erläutert. Dieser Syntheseweg unterscheidet sich von den vorher diskutierten darin, dass 1) der Syntheseweg zur Herstellung des (E)-Isomers von ISATX247 über andere Zwischenprodukte, als für das (Z)-Isomer erfolgt und 2) dass diese Synthesewege titan- und lithiumhaltige Reagenzien und/oder Zwischenprodukte anwenden.
  • Es ist bekannt, dass Titanreagenzien besonders nützlich sind in der organischen Synthese, da sie in ihren Reaktionen mit Aldehyden und Ketonen regio- und stereoselektiv sind. Die Eigenart von Titan in der stereoselektiven Chemie wurde allgemein von M. T. Reetz in Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), S. VII, 148–149 und 164–165 diskutiert. Hier wird angegeben, dass die Art des Titanliganden so variiert werden kann, dass die elektronische und sterische Identität des Reagenzes manipuliert werden können und das stereochemische Ergebnis vieler C-C-Bindungsbildungsreaktionen vorhergesagt werden kann. Bei dieser Chemie erzeugt die Vereinigung von zwei prochiralen Zentren von achiralen Molekülen zwei Zentren der Chiralität. Eine allgemeine Regel, die das stereoselektive Ergebnis steuert, ist, dass Z-konfigurierte Enolate oder Crotylmetallverbindungen bevorzugt syn-Addukte bilden, während E-konfigurierte Reagenzien die anti-Diastereomeren favorisieren. Der Trend kann wiederum erklärt werden mit der Annahme eines Übergangszustands in Form eines 6-gliedrigen Zyklus mit einer Sesselgeometrie.
  • Ein spezifisches Beispiel dieser Art von stereoselektiver Synthese wurde von Y. Ikeda et al. in "Stereoselective Synthesis of (Z)- and (E)-1,3-Alkadienes from Aldehydes Using Organotitanium and Lithium Reagents", Tetrahedron, Bd. 43, Nr. 4, S. 723–730 (1987) diskutiert. Diese Literaturstelle offenbart, dass Allyldiphenylphosphin verwendet werden kann, um ein [3-(Diphenylphosphino)allyl]titanreagenz zu erzeugen, das wiederum mit einem Aldehyd kondensiert werden kann gefolgt von einer Phosphoniumsalzbildung, was ein (Z)-1,3-Alkadien in hochregio- und stereoselektiver Art und Weise ergibt. Im Gegensatz dazu kann ein lithiiertes Allyldiphenylphosphinoxid mit einem Aldehyd kondensieren, was direkt ein (E)-1,3-Alkadien ergibt, wiederum mit der gewünschten Stereoselektivität.
  • Bezug nehmend auf 7 erfolgt die Synthese des (Z)-Isomers von ISATX247 (wie in den vorherigen Schemata), indem Acetylcyclosporin-A-adehyd 51 aus Cyclosporin A 34 erzeugt wird. Das [3-(Diphenylphosphino)allyl]titanreagenz 72 wird hergestellt, indem Allyldiphenylphosphin 71 mit einer starken Base, wie t-BuLi, deprotoniert wird und dann das Produkt mit Titantetraisopropoxid umgesetzt wird. Es wird theoretisch ein Übergangszustand 73 vorgeschlagen, der zu dem erythro-α-Addukt 74 führt, das dann wiederum in das β-Oxidophosphonium salz 75 umgewandelt werden kann durch Behandlung von 74 mit Iodmethan (Mel). Es wird postuliert, dass die Existenz des Übergangszustandes 73 mindestens teilweise verantwortlich für die Stereoselektivität dieses Synthesewegs ist.
  • Gemäß den beispielhaften Methoden, die in der vorliegenden Offenbarung ausgeführt wurden, kann die metallische Stelle des organometallischen Reagenzes die Einheit sein, die die Regioselektivität kontrolliert (Ikeda, S. 725). Dies bedeutet, dass der Aldehyd 51 in 7 mit der Diphenylphosphinoverbindung 72 an der α-Position reagiert, was das entsprechende α-Addukt 74 ergibt, da der γ-Kohlenstoff der Diphenylphosphinogruppe mit dem Metall koordiniert ist, das in diesem Fall Titan ist. Die beobachtete Z-Selektivität des Dienproduktes wird erklärt, indem der 6-gliedrige Übergangszustand 73 in Betracht gezogen wird. Da postuliert wird, dass sowohl die sperrige Cyclosporin-A-Seitenkette des Aldehyds 35 als auch die Diphenylphosphinogruppe äquatoriale Positionen im Übergangszustand annehmen, wird das erythro-α-Addukt 74 selektiv gebildet, was das (Z)-1,3-Dien 76 entstehen lässt.
  • Im Gegensatz zu dem in 7 dargestellten Reaktionsweg, in dem das (Z)-Isomer von ISATX247 über einen Titanübergangszustand erzeugt wird, kann das (E)-Isomer mit dieser Methode nicht leicht hergestellt werden. Tatsächlich wird berichtet, dass Versuche, das (E)-Isomer mit dieser Methode zu synthetisieren, allgemein schlechte Ausbeuten liefern. Stattdessen kann, wie in 8 gezeigt, das Lithioderivat 82 mit dem Aldehyd 51 umgesetzt werden, um den lithiumhaltigen Übergangszustand 83 zu erzeugen, der das 1,3-Dien in einem E/Z-Verhältnis bildet, das in einem Bereich liegt, das größer als ungefähr 75:25 ist. Wie in 7 beruht die hohe Stereoselektivität des Reaktionsproduktes möglicherweise auf dem Übergangszustand 83, bei dem die Vinylgruppe des Lithiumreagenzes 82 und die Cyclosporin-A-Seitenkette des Aldehyds 51 äquatoriale Positionen besetzen sollen, wodurch das (E)-1,3-Dien 84 in stereoselektiver Art und Weise erzeugt wird. Wie vorher diskutiert, können bestimmte unerwünschte Nebenreaktionen, die die Acetatschutzgruppe betreffen, bei allen stereoselektiven Synthesen durch Verwendung von Schutzgruppen, wie Benzoatestern oder Silylethern vermieden werden.
  • Herstellung von Mischungen
  • Wie vorher angegeben, wurde gefunden, dass bestimmte Mischungen von cis- und trans-Isomeren von ISATX247 eine Kombination von verbesserter Wirksamkeit und/oder verminderter Toxizität gegenüber den natürlich vorkommenden und derzeit bekannten Cyclosporinen aufweisen.
  • Gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ISATX247-Isomere (und Derivate davon) auf stereoselektiven Wegen synthetisiert, deren Grad an Stereoselektivität variieren kann. Stereoselektive Wege können ein erstes Material oder eine erste Zusammensetzung erzeugen, die an dem (E)-Isomer angereichert ist, und ein zweites Material oder eine zweite Zusammensetzung, die an dem (Z)-Isomer angereichert ist, und diese Materialien können dann so kombiniert werden, dass die entstehende Mischung ein gewünschtes Verhältnis der beiden Isomeren hat. Alternativ wird davon ausgegangen, dass das erste Material hergestellt werden kann, indem ein Reaktionsprodukt getrennt wird, um das (E)-Isomer zu isolieren und anzureichern, und das zweite Materialhergestellt wird, indem ein Reaktionsprodukt getrennt wird, um das (Z)-Isomer zu isolieren und anzureichern. In einer weiteren Ausführungsform können die Reaktionsbedingungen eines stereoselektiven Wegs so zugeschnitten werden, dass das gewünschte Verhältnis direkt in der hergestellten Mischung erzeugt wird.
  • Diese Prinzipien werden in den 9A bis C und 10 erläutert. In den 9A bis C werden drei hypothetische Synthesereaktionen gezeigt, die Verhältnisse von (E)- zu (Z)-Isomer von ungefähr 65 zu 35 Gew.-%, 50 zu 50 Gew.-% bzw. 35 zu 65 Gew.-% erzeugen. Natürlich sind diese Verhältnisse beispielhaft und dienen nur der Erläuterung und jedes hypothetische Paar von Zahlen könnte ausgewählt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Reaktionsbedingungen, die verwendet werden, um das Verhältnis in 9A zu erzeugen, verschieden sein können von denen in den 9B und 9C, um ein anderes Verhältnis von Isomeren in der Produktmischung zu erzielen. Die Bedingungen für jede Reaktion wurden so zugeschnitten, dass ein spezielles Verhältnis der zwei Isomeren für diesen Fall erzeugt wird.
  • Im Gegensatz zu einigen Synthesewegen, bei denen eine Mischung von Isomeren erzeugt wird, können die Isomeren zuerst einzeln hergestellt werden und dann in vorbestimmten Anteilen vermischt werden, um das gewünschte Verhältnis zu erzielen. Dieses Konzept wird in 10 erläutert, wo das Produkt eines stereoselektiven Wegs an einem der Isomeren so angereichert wird, dass das Produkt mehr als etwa 75 Gew.-% des (E)-Isomers enthält und das Produkt des anderen stereoselektiven Wegs wird an dem anderen Isomer so angereichert, dass dieses Produkt mehr als etwa 75 Gew.-% des (Z)-Isomers enthält. Diese Zahlen sind auch nur beispielhaft und die Reinheit der gewünschten Isomere, die auf einem stereoselektiven Weg entstehen, kann größer oder gleich etwa 75 Gew.-% in einer Ausführungsform sein. Das gewünschte Isomer kann mehr als oder gleich 80, 85, 90 bzw. 95 Gew.-% bilden.
  • Nachdem die Isomeren einzeln synthetisiert worden sind, können sie vermischt werden, um das gewünschte Verhältnis zu erzielen, wie in 10 erläutert. Zur Erläuterung wurden die gleichen hypothetischen Verhältnisse in 10 ausgewählt, wie in den 9A bis C. Bezug nehmend auf 10 werden die (E)- und (Z)-Isomeren vermischt, was drei verschiedene Mischungen liefert, die Verhältnisse von (E)- zu (Z)-Isomer von ungefähr 65 zu 35 Gew.-%, 50 zu 50 Gew.-% bzw. 35 zu 65 Gew.-% liefern.
  • Eine Mischung der (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247-Isomeren kann getrennt werden, so dass die Mischung an einem Isomer gegenüber dem anderen angereichert ist. Z.B. kann eine Diels-Alder-Reaktion verwendet werden, um das cis-Isomer in eine Verbindung mit geschlossenem Ring umzuwandeln, indem sie mit einem Alken umgesetzt wird. Wenn das Alken an ein Substrat gebunden ist, das zur Isolierung fähig ist (z.B. filtrierbar), kann das cis-Isomer im Wesentlichen aus der Mischung entfernt werden, was eine Zusammensetzung zurücklässt, die an dem trans-Isomer angereichert ist. Das cis-Isomer kann aus der Verbindung mit geschlossenem Ring rekonstituiert werden unter Anwendung von Wärme, was eine Zusammensetzung erzeugt, die an diesem cis-Isomer angereichert ist. Somit können auf diese Art und Weise cis- und trans-Isomere getrennt werden.
  • In der Praxis kann das Verhältnis von (E)- zu (Z)-Isomeren in jeder Mischung, unabhängig vom Grad der Stereoselektivität der Methode, mit der sie hergestellt wurde, einen ausgedehnten Bereich an Werten annehmen. Z.B. kann die Mischung etwa 10 bis 90% (E)-Isomer zu etwa 90 bis 10% (Z)-Isomer enthalten. Z.B. kann die Mischung etwa 15 bis 85 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 85 bis 15% (Z)-Isomer oder etwa 25 bis 75 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 75 bis 25 Gew.-% (Z)-Isomer oder etwa 35 bis 65 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 65 bis 35 Gew.-% (Z)-Isomer oder etwa 45 bis 55 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 55 bis 45% (Z)-Isomer enthalten. Die isomere Mischung kann eine ISATX247-Mischung sein, die etwa 45 bis 50 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 50 bis 55 Gew.-% (Z)-Isomer enthält. Diese Gewichtsprozentangaben basieren auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung und es versteht sich, dass die Summe der Gewichtsprozentangaben von (E)-Isomer und (Z)-Isomer 100 Gew.-% ergibt. In anderen Worten könnte eine Mischung 65 Gew.-% (E)-Isomer und 35 Gew.-% (Z)-Isomer enthalten oder umgekehrt.
  • Der Prozentanteil des einen Isomers oder des anderen in einer Mischung kann bestätigt werden unter Verwendung von kernmagnetischer Resonanz (NMR) oder mit anderen im Stand der Technik wohl bekannten Techniken.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die Erfindung ist von Interesse für die Behandlung von Patienten, die eine Immunsuppression benötigen und betrifft die Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die erfinderische Mischung als aktive Bestandteile enthalten. Die Indikationen, für die diese Kombination von Interesse ist, schließen insbesondere Autoimmunkrankheiten und entzündliche Zustände und Zustände, die mit einer Transplantatabstoßung verbunden sind oder für diese verursachend sind, z.B. Behandlung (einschließlich Verbesserung, Verminderung, Eliminierung oder Heilung der Etiologie oder der Symptome) oder Verhütung (einschließlich einer wesentlichen oder vollständigen Einschränkung, Prophylaxe oder Verhinderung) derfolgenden Zustände:
    • a) Akute Organ- oder Gewebetransplantatabstoßung, z.B. Behandlung von Empfängern von z.B. Herz-, Lunge-, kombinert Herz-Lunge-, Leber-, Niere-, Pankreas-, Haut-, Darm- oder Hornhauttransplantaten, insbesondere Verhütung und/oder Behandlung von T-Zell-vermittelter Abstoßung ebenso wie der Graft-versus-Host-Krankheit nach einer Knochenmarkstransplantation.
    • b) Chronische Abstoßung eines transplantierten Organs, insbesondere Verhütung der Transplantat-Gefäß-Krankheit, z.B. charakterisiert durch Stenose von Arterien des Transplantats als Ergebnis einer Verdickung der Intima aufgrund einer Proliferation von glatten Muskelzellen und damit verbundenen Wirkungen.
    • c) Xenotransplantatabstoßung einschließlich akuter, hyperakuter oder chronischer Abtoßung eines Organs, die auftritt, wenn der Organspender von einer anderen Art ist als der Empfänger, insbesondere durch B-Zellen oder Antikörper-vermittelte Abstoßung.
    • d) Autoimmunkrankheit und entzündliche Zustände, insbesondere entzündliche Zustände mit einer Etiologie einschließlich einer immunologischen oder Autoimmunkomponente, wie Arthritis (z.B. Polyarthritis, Arthritis chronica progrediente und Arthritis deformans) und andere rheumatische Krankheiten. Spezifische Autoimmunkrankheiten, für die die vorliegende synergistische Kombination der Erfindung angewendet werden kann, schließen hämatologische Autoimmunstörungen (z.B. hämatolytische Anämie, aplastische Anämie, reine Anämie der roten Blutzellen und idiopathische Thrombozytopenie), systemischen Lupus erythematodes, Polychondritis, Sklerodermie, Wegener-Granulomatose, Dermatomyositis, chronisch aktive Hepatitis, Myastenia gravis, Psoriasis, Stevens-Johnson-Syndrom, idiopathische Sprue, (autoimmun) entzündliche Darmkrankheit (einschließlich z.B. Colitis ulcerosa und Morbus Crohn), endokrine Ophthalmopathie, Basedow-Krankheit, Sarcoidose, Multiple Sklerose, primäre Gallenzirrhose, juvenilen Diabetes (Diabetes mellitus Typ I), Uveitis (anterior und posterior), Keratokonjunktivitis sicca und Frühlingskeratokonjunktivitis, interstitielle Lungenfibrose, psoriatische Arthritis, Glomerulonephritis (mit und ohne nephrotisches Syndrom, z.B. einschließlich idiopathischem nephrotischem Syndrom oder minimal verändernde Nephropathie) und juvenile Dermatomyositis ein. Autoimmunzustände und entzündliche Zustände der Haut werden auch als einer Behandlung und einer Verhütung zugänglich unter Verwendung der synergistischen Kombination der Erfindung angesehen, z.B. Psoriasis, Kontaktdermatitis, atopische Dermatitis, Alopecia areata, Erythema multiforma, Dermatitis herpetiformis, Skleroderma, Vitiligo, Überempfindlichkeits-Angiitis, Urticaria, bullöses Pemphigoid, Lupus erythematodes, Pemphigus, Epidermolysis bullosa acquisita und andere entzündliche oder allergische Zustände der Haut ebenso wie entzündliche Zustände der Lungen und Atemwege, einschließlich Asthma, Allergien und Pneumoconiose.
  • Die Mischungen der isomeren Analoga der Erfindung können rein oder mit einem pharmazeutischen Träger an ein warmblütiges Tier, das dies benötigt, verabreicht werden. Der pharmazeutische Träger kann fest oder flüssig sein. Die erfinderische Mischung kann oral, topisch, parenteral, durch Inhalationsspray oder rektal in Dosierungseinheitsformulierungen, die übliche nicht toxische pharmazeutisch annehmbare Träger, Adjuvanzien und Vehikel enthalten, verabreicht werden. Der Ausdruck parenteral, wie er hier verwendet wird, schließt subcutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale Injektion oder Infusionstechniken ein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die erfinderische Mischung enthalten, können bevorzugt in einer Form sein, die geeignet ist für die orale Verwendung, z.B. in Form von Tabletten, Dragees, Pastillen, wässrigen oder öligen Suspensionen, dispergierbaren Pulvern oder Körnchen, Emulsionen, harten oder weichen Kapseln, oder Sirupen oder Elixieren. Zusammensetzungen, die für die orale Verwendung vorgesehen sind, können mit Methoden, die auf dem Gebiet zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bekannt sind, hergestellt werden und solche Zusammensetzungen können ein oder mehrere Mittel enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Süßstoffen, Aromastoffen, Farbstoffen und konservierenden Mitteln, um pharmazeutisch elegante und verzehrbare Präparate bereitzustellen. Tabletten, die den aktiven Inhaltsstoff gemischt mit nicht toxischen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen enthalten, können auch mit bekannten Methoden hergestellt werden. Die verwendeten Hilfsstoffe können z.B. 1) inerte Verdünnungsmittel, wie Calciumcarbonat, Lactose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat; 2) Granulierungs- und Sprengmittel, wie Maisstärke oder Alginsäure; 3) Bindemittel, wie Stärke, Gelatine oder Gummi arabicum und 4) Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talkum sein. Die Tabletten können unbeschichtet sein oder sie können mit bekannten Techniken beschichtet werden, um die Zersetzung und die Absorption im Gastrointestinaltrakt zu verlangsamen und dadurch eine De potwirkung über einen längeren Zeitraum zu schaffen. Z.B. kann ein Zeitverzögerungsmaterial, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat angewendet werden. Sie können auch mit den in den U.S.-Patenten Nr. 4 256 108; 4 160 452 und 4 265 874 beschichtet werden, um osmotisch therapeutische Tabletten für kontrollierte Freisetzung zu bilden.
  • In einigen Fällen können Formulierungen für die orale Verwendung in Form von harten Gelatinekapseln sein, wobei der aktive Inhaltsstoff mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, z.B. Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin gemischt wird. Sie können auch in Form von weichen Gelatinekapseln sein, wobei der aktive Inhaltsstoff mit Wasser oder einem öligen Medium, z.B. Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl vermischt wird.
  • Wässrige Suspensionen enthalten normalerweise die aktiven Materialien gemischt mit Hilfsstoffen, die für die Herstellung von wässrigen Suspensionen geeignet sind. Solche Hilfsstoffe können (1) Suspensionsmittel, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Traganth und Gummi arabicum oder (2) Dispersions- oder Benetzungsmittel, die natürlich vorkommende Phosphatide, wie Lecithin, ein Kondensationsprodukt eines Alkylenoxids mit einer Fettsäure, z.B. Polyoxyethylenstearat, ein Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einem langkettigen aliphatischen Alkohol, z.B. Heptadecaethylenoxycetanol, ein Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einem Teilester, der von einer Fettsäure und einem Hexitol abgeleitet ist, wie Polyoxyethylensorbitolmonooleat, oder ein Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einem Teilester, der von einer Fettsäure und einem Hexitolanhydrid abgeleitet ist, z.B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat, sein.
  • Die wässrigen Suspensionen können auch ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten, z.B. Ethyl- oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat; ein oder mehrere Färbemittel; ein oder mehrere Aromastoffe und ein oder mehrere Süßstoffe, wie Saccharose, Aspartam oder Saccharin.
  • Eine ölige Suspension kann formuliert werden, indem der aktive Inhaltsstoff in einem pflanzlichen Öl, z.B. Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnussöl, einem Fischöl, das Ω-3-Fettsäure enthält, oder in einem Mineralöl, wie flüssigem Paraffin suspendiert wird. Die ölige Suspension kann ein Verdickungsmittel enthalten, z.B. Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol. Süßstoffe und Aromastoffe können zugegeben werden, um ein verzehrbares orales Präparat zu schaffen. Diese Zusammensetzungen können durch Zugabe eines Antioxidans, wie Ascorbinsäure, konserviert werden.
  • Dispergierbare Pulver und Körnchen sind geeignet zur Herstellung einer wässrigen Suspension. Sie liefern den aktiven Inhaltsstoff in einer Mischung mit einem Dispersions- oder Benetzungsmittel, einem Suspensionsmittel und einem oder mehreren Konservierungsmitteln. Geeignete Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel sind beispielsweise solche, die bereits oben erwähnt wurden. Zusätzliche Hilfsstoffe, z.B. die oben beschriebenen Süßstoffe, Aroma- und Färbemittel können auch vorhanden sein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die erfinderische Mischung enthalten, können auch in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion sein. Die ölige Phase kann ein pflanzliches Öl, wie Olivenöl oder Erdnussöl, oder ein Mineralöl, wie flüssiges Paraffin, oder eine Mischung davon sein. Geeignete Emulsionsmittel können (1) natürlich vorkommende Gummen, wie Gummi arabicum und Traganth, (2) natürlich vorkommende Phosphatide, wie Sojabohne und Lecithin, (3) Ester oder Teilester 30, die von Fettsäuren und Hexitolanhydriden abstammen, z.B. Sorbitanmonooleat, (4) Kondensationsprodukte von solchen Teilestern mit Ethylenoxid, z.B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat sein. Die Emulsionen können auch Süß- und Aromastoffe enthalten.
  • Sirupe und Elixiere können mit Süßstoffen, z.B. Glycerol, Propylenglycol, Sorbit, Aspartam oder Saccharose formuliert werden. Solche Formulierungen können auch ein Demulcens, ein Konservierungsmittel, und Aroma- und Färbestoffe enthalten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form einer sterilen injizierbaren wässrigen oder ölhaltigen Suspension sein. Diese Suspension kann mit bekannten Methoden formuliert werden unter Verwendung solcher geeigneten Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel, die oben erwähnt wurden. Das steril injizierbare Präparat kann auch eine steril injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, z.B. als Lösung in 1,3-Butandiol. Zu den annehmbaren Vehikeln und Lösungsmitteln, die angewendet werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile nicht-flüchtige Öle üblicherweise als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium angewendet. Für diesen Zweck kann jedes neutrale nicht-flüchtige Öl angewendet werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich finden Fettsäuren, wie Ölsäure, Anwendung in der Herstellung von injizierbaren Mitteln.
  • Die erfinderische Mischung kann auch in Form von Zäpfchen für die rektale Verabreichung des Wirkstoffs verabreicht werden. Diese Zusammensetzungen können hergestellt werden, indem der Wirkstoff mit einem geeigneten nicht reizenden Hilfsstoff, der bei üblichen Temperaturen fest ist, aber bei der Rektaltemperatur flüssig ist, vermischt werden und schmelzen daher im Rektum, um den Wirkstoff freizusetzen. Solche Materialien sind Kakaobutter und Polyethylenglycole.
  • Für die topische Verwendung können Cremes, Salben, Gele, Lösungen oder Suspensionen etc., die die offenbarten Cyclosporine enthalten; angewendet werden.
  • Bevorzugt wird eine flüssige Lösung, die ein Tensid, Ethanol, ein lipophiles und/oder ampiphiles Lösungsmittel als nicht aktive Inhaltsstoffe enthält, verwendet. Spezifisch werden eine orale Mehrfachemulsionsrezeptur, die die isomere Mischung von Analoga und die folgenden nicht-medizinischen Inhaltsstoffe enthält: d-α-Tocopherylpolyethylenglycol-1000-succinat (Vitamin E TPGS), mittelkettiges Triglycerid-(MCT)-Öl, Tween 40 und Ethanol verwendet. Eine weiche Gelatinekapsel (mit Gelatine, Glycerin, Wasser und Sorbit), die die isomere Mischung der Analoga und die gleichen nicht-medizinischen Inhaltsstoffe enthält, wie die orale Lösung, kann auch bevorzugt verwendet werden.
  • Dosierungshöhen der Größenordnung von etwa 0,05 mg bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht/Tag sind nützlich zur Behandlung der oben erwähnten Zustände. Die Dosierungshöhe und der Verabreichungsplan können variieren abhängig von der jeweils verwendeten Isomerenmischung, dem zu behandelnden Zustand und solchen zusätzlichen Faktoren, wie dem Alter und Zustand des Individuums. Bevorzugte Dosen sind von etwa 0,5 bis etwa 10 mg/kg/Tag und von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg/Tag. In einer bevorzugten Ausführungsform werden etwa 2 bis etwa 6 mg/kg/Tag oral b.i.d. verabreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden etwa 0,5 bis etwa 3 mg/kg/Tag oral b.i.d. verabreicht.
  • Die Menge an aktivem Wirkstoff, die mit den Trägermaterialien vereinigt werden kann, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, variiert abhängig von dem zu behandelnden Wirt und der jeweiligen Verabreichungsart. Z.B. kann eine Formulierung, die für die orale Verabreichung an Menschen vorgesehen ist, 2,5 mg bis 2,5 g aktives Mittel compoundiert mit einer geeigneten und angenehmen Menge an Trägermaterial enthalten, die von etwa 5 bis etwa 95% der gesamten Zusammensetzung variieren kann. Einheitsdosierungsformen enthalten im Allgemeinen etwa 5 mg bis etwa 500 mg aktiven Inhaltsstoff. In einer bevorzugten Ausführungsform werden einzelne Kapseln, die etwa 50 mg isomere Mischung enthalten, für die orale Verabreichung angewendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden orale Lösungen, die etwa 50 mg/ml isomere Mischung enthalten, für die orale Verabreichung verwendet.
  • Es versteht sich jedoch, dass die spezifische Dosishöhe für jeden spezifischen Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, einschließlich der Aktivität der spezifisch angewendeten Verbindung, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, Nahrungszustand, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Wirkstoffkombination und der Art und Schwere der jeweiligen Krankheit oder des Zustandes, für die oder den die Therapie durchgeführt wird.
  • Methodenlehre
  • Die Verwendung von Cyclosporinderivaten, einer Klasse von cyclischen Polypeptiden, die von dem Pilz Tolypocladium inflatum Gams hergestellt werden, nimmt bei immunsupprimierender Therapie aufgrund der bevorzugten Wirkungen auf T-Zell-vermittelte Reaktionen zu. Es wurde beobachtet, dass Cyclosporinderivate immunkompetente Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten, reversibel hemmen, ebenso wie sie die Lymphokinproduktion und Freisetzung hemmen. Diese Wirkung wird hauptsächlich durch durch Cyclosporin A induzierte Hemmung von Calcineurin, einem Phosphataseenzym, das im Cytoplasma von Zellen gefunden wird, vermittelt (Schreiber und Crabtree, 1992). Ein Indikator für die Wirksamkeit von Cyclosporin A oder einem Cyclosporin-A-Derivat ist die Fähigkeit, die Phosphataseaktivität von Calcineurin zu hemmen. Der Calcineurinhemmungsassay misst die Aktivität des Wirkstoffs an seiner Wirkstelle und ist als solches die genaueste und direkte in-vitro-Bestimmung der Wirksamkeit von Cyclosporin-A-Analoga (Fruman et al., 1992).
  • ISATX247 ist ein Cyclosporin-A-Analogon, das Cyclosporin A ähnlich ist, außer einer neuen Modifikation einer funktionellen Gruppe an dem Aminosäure-1-Rest des Moleküls. Es wurde nun gefunden, dass ISATX247 in dem Test zur in-vitro-Hemmung von Calcineurin eine bis zu dreifach höhere Potenz zeigt als Cyclosporin A.
  • Pharmakodynamische Untersuchungen (in vivo und in vitro) haben gezeigt, dass ISATX247 eine höhere Wirksamkeit hat als andere existierende Cyclosporinverbindungen. Die Wirksamkeit von isomeren Mischungen von Cyclosporinanaloga in einem Bereich von etwa 10:90 bis etwa 90:10 (trans zu cis), insbesondere ISATX247 mit 50 bis 55% (Z)-Isomer und 45 bis 50% (E)-Isomer, als immunsupprimierendes Mittel (gegenüber Cyclosporin A) wurde in einem in-vitro-Calcineurinaktivitätstest, einem Rattenherztransplantationsmodell, einem Inselzellenallotransplantations-Mausmodell, einem durch Collagen induzierten Arthritismodell bei der Maus, und/oder einem durch Antigen induzierten Arthritismodell bei Kaninchen gezeigt. Die Daten zeigen, dass diese isomeren Mischungen Cyclosporin A äquivalent sind oder wirksamer sind und daher nützlich sind zur Behandlung von immunregulatorischen Störungen.
  • Es gibt zahlreiche negative Wirkungen, die mit einer Cyclosporin-A-Therapie verbunden sind, einschließlich Nephrotoxizität, Hepatotoxizität, Kataraktogenese, Hirsutismus, Parathese und Gingiva-Hyperplasie, um nur einige zu nennen (Sketris et al., 1995). Von diesen ist Nephrotoxizität eine der ernstesten dosisabhängigen negativen Wirkungen, die durch Verabreichung von Cyclosporin A entstehen. Der genaue Mechanismus, durch den Cyclosporin A Nierenschäden verursacht, ist nicht bekannt. Es wird jedoch vorgeschlagen, dass ein Anstieg der Pegel von gefäßverengenden Substanzen in der Niere zu einer lokalen Verengung der afferenten glomerulären Arteriolen führt. Dies kann zu Ischämie, einer Abnahme der glomerulären Filtrationsrate und über längere Zeit zu interstitieller Fibrose führen.
  • Die nicht-klinische Sicherheit von ISATX247 wurde bei einer Anzahl von Tierarten ausgewertet. Toxizitätsstudien mit wiederholter oraler Dosis bei Ratten, Hunden und Primaten zeigten, dass ISATX247 gut toleriert wurde und Wirkungen erzeugte, die mit einer Immunsuppression übereinstimmten. Die einzige toxikologische Wirkung, die bei allen Arten festgestellt wurde, war Diarrhoe/weicher Stuhl.
  • ISATX247 hat keine mutagene Aktivität, was durch bakterielle reverse Mutation in vitro und Chromosomenaberrationstests und in einem in-vivo-Rattenmikronucleustest gezeigt wurde. Karzinogenizitätsstudien wurden bis jetzt nicht abgeschlossen. Studien zur reproduktiven Toxizität mit ISATX247 wurden bei trächtigen Ratten und Kaninchen abgeschlossen. Es gab keine mit der Behandlung in Beziehung stehenden Missbildungen oder Veränderungen. Bei Dosen, die zu einer maternalen Toxizität führten, wurde eine entsprechende Embryotoxizität beobachtet.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Acetylierung von Cyclosporin A
  • Essigsäureanhydrid (140 ml) wurde Cyclosporin A (50,0 g, 41,6 mmol) zugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre gerührt, bis alles Cyclosporin A gelöst war. Dimethylaminopyridin (7,62 g, 62,4 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre 3 Stunden lang oder bis die Reaktion abgeschlossen war, gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf 5°C gekühlt und dann filtriert. Die gesammelten Feststoffe wurden mit Hexan gewaschen, um zusätzliches Essigsäureanhydrid abzutreiben. Der entstehende pastenförmige Feststoff wurde langsam in eine heftig gerührte 5%ige wässrige Natriumbicarbonatlösung (1,5 l) überführt. Die entstehende Suspension wurde gerührt, bis eine feine Aufschlämmung erhalten wurde und die Entwicklung von CO2 aufgehört hatte. Die Feststoffe wurden durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat einen neutralen pH-Wert hatte. Das feste Produkt wurde in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet (55°C), was 44,0 g (85%) des Produkts als farblosen Feststoff ergab.
  • Beispiel 2: Oxidation des Produkts von Beispiel 1
  • Acetonitril (320 ml) und Wasser (80 ml) wurden zu Acetylcyclosporin A (42,97 g, 34,54 mmol) zugegeben und die Mischung gerührt, bis alles Material gelöst war. Natriumperiodat (14,77 g, 69,08 mmol) wurde zugegeben und anschließend Rutheniumchloridhydrat (0,358 g, 1,73 mmol) und dann wurde der Ansatz bei Raumtemperatur 3 Stunden lang unter N2-Atmosphäre gerührt. Wasser (300 ml) wurde zugegeben und die Mischung in einen Scheidetrichter überführt. Die Mischung wurde zweimal mit Ethylacetat (300 ml und dann 250 ml) extrahiert. Die dunklen schwarzen Ethylacetatextrakte wurden vereinigt und mit 250 ml Wasser und anschließend 250 ml Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Lösung wurde dann über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel verdampft, was einen grünlich-schwarzen Feststoff ergab. Das rohe Produkt wurde über Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 40% Aceton/60% Hexan als Elutionsmittel, was das Produkt (29,1 g, 68%) als farblosen Feststoff ergab.
  • Beispiel 3: Herstellung von Acetyl-ISATX247
  • i) In-situ-Erzeugung des Ylids:
  • Acetylcyclosporin-A-aldehyd (31,84 g, 25,84 mmol) wurde zu 340 ml Toluol zugegeben und die Mischung gerührt, bis das Material vollständig gelöst war. Zu der entstehenden Lösung wurden 340 ml 1 normales wässriges Natriumhydroxid zugegeben. Die entstehende Mischung wurde heftig gerührt und dann wurde Allyltriphenylphosphoniumbromid (58,22 g, 151,90 mmol) zugefügt. Der Ansatz wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann zusätzliches Allyltriphenylphosphoniumbromid (16,64 g, 43,42 mmol) zugefügt und das Rühren weitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Die Mischung wurde in einen Scheidetrichter überführt und die Toluolphase abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit weiteren 200 ml Toluol extrahiert. Die zwei Toluolextrakte wurden vereinigt und aufeinander folgend mit 200 ml deionisiertem Wasser und 200 ml gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wurde über MgSO4 getrocknet, filtriert und das Toluol verdampft, was ein sehr viskoses Gel ergab. Dieses Material wurde mit 142 ml Ethylacetat versetzt und gerührt, bis sich eine feine Aufschlämmung gebildet hatte. Hexan (570 ml) wurde langsam unter schnellem Rühren zugefügt. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und dann die entstehende Suspension filtriert und die gesammelten Feststoffe mit 160 ml 5:1 Hexan/Ethylacetat gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde an einem Rotationsverdampfer zu einem viskosen Halbfeststoff eingeengt. Dieses Material wurde mit 75 ml Ethylacetat versetzt und gerührt, bis eine feine Aufschlämmung erhalten wurde. Hexan (225 ml) wurde langsam unter schnellem Rühren zugefügt. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und dann wurde die entstehende Suspension filtriert und die gesammelten Feststoffe mit 100 ml 5:1 Hexan/Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde an einem Rotationsverdampfer eingeengt, was einen fahlgelben Feststoff ergab. Das rohe Produkt wurde über Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 40% Aceton/60% Hexan als Elutionsmittel, was das Produkt als farblosen Feststoff (14,09 g) ergab.
  • ii) Erzeugung von vorgebildetem Ylid und Reaktion in Gegenwart von LiBr:
  • Zu einer gerührten Suspension von Allyltriphenylphosphoniumbromid (7,67 g, 20 mmol) in THF (20 ml), die auf 0°C gekühlt wurde, wurde eine Lösung von KOBut in Tetrahydrofuran (20 ml, 20 mmol, 1 M Lösung) zugefügt. Das Rühren wurde bei dieser Temperatur 30 Minuten lang fortgesetzt und eine Lösung von LiBr in THF (10 ml, 10 mmol, 1 M Lösung) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann 30 Minuten lang gerührt und eine Lösung von Acetyl-CsA-aldehyd (4,93 g, 4 mmol) in THF (10 ml) über eine Kanüle zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit gesättigter NH4Cl-Lösung (25 ml) abgeschreckt. Die Aufarbeitung und Chromatographie wie oben lieferten acetyliertes ISATX247 als farblosen Feststoff (3,5 g).
  • Beispiel 4: Herstellung von ISATX247
  • Acetyl-ISATX247 (14,6 g, 11,62 mmol) wurde in 340 ml Methanol gelöst und dann 135 ml deionisiertes Wasser zugegeben. Kaliumcarbonat (13,36 g, 96,66 mmol) wurde zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 24 bis 48 Stunden lang gerührt, bis die Reaktion vollständig war. Das meiste Methanol wurde verdampft und dann wurden 250 ml Ethylacetat unter Rühren zugegeben. Eine 10%ige wässrige Citronensäurelösung (120 ml) wurde langsam zugegeben und dann die Ethylacetatphase abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit einem weiteren Anteil von 200 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden aufeinander folgend mit 150 ml deionisiertem Wasser, 100 ml 10%iger wässriger Citronensäurelösung und 150 ml gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen und dann über MgSO4 getrocknet. Das Ethylacetat wurde verdampft, was einen fahlgelben Feststoff ergab. Das rohe Produkt wurde über Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 40% Aceton/60% Hexan als Elutionsmittel, was ISATX247 (10,51 g, 75%) als farblosen Feststoff ergab. ISATX247 enthält 45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer.
  • Die Produkte in den Beispielen 1 bis 4 wurden mit Massenspektrometrie und/oder kernmagnetischer Resonanzspektroskopie charakterisiert.
  • Beispiel 5: Herstellung von Acetyl-η-bromcyclosporin A
  • Acetylcyclosporin A (41,48 g, 33,3 mmol), das in Beispiel 1 hergestellt worden war, N-Bromsuccinimid (10,39 g, 58,4 mmol) und Azobisisobutyronitril (1,09 g, 6,67 mmol) wurden in 250 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst und die entstehende Mischung 2,5 Stunden lang am Rückfluss erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde mit 350 ml Diethylether behandelt und filtriert, um unlösliches Material zu entfernen. Das Filtrat wurde aufeinander folgend mit 150 ml Wasser und 150 ml Kochsalzlösung gewaschen, dann über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Das rohe Material wurde auf Silicagel chromatographiert mit Aceton/Hexan (2:3), was 28,57 g (65%) Acetyl-γ-bromcyclosporin A als gelben Feststoff ergab.
  • Beispiel 6: Herstellung des Triphenylphosphoniumbromids von Acetylcyclosporin A
  • Acetyl-γ-bromcyclosporin A (28,55 g, 21,6 mmol) und Triphenylphosphin (7,55 g, 28,8 mmol) wurden in 210 ml Toluol gelöst und die entstehende Lösung 21 Stunden lang auf 100°C erhitzt. Die Lösung wurde gekühlt und das Toluol verdampft. Der entstehende ölige Halbfeststoff wurde mit 250 ml Hexan/Ether (1:4) versetzt, sorgfältig gemischt und das Lösungsmittel abdekantiert. Dieses Verfahren wurde drei weitere Male mit 150 ml Ether wiederholt. Der Rückstand wurde dann in 50 ml Ethylacetat gelöst und mit 220 ml Hexan ausgefällt. Der entstehende Feststoff wurde dann durch Filtration gesammelt, was 22,5 g (66%) Triphenylphosphoniumbromid von Acetylcyclosporin A als lohfarbenen Feststoff ergab.
  • Beispiel 7: Wittig-Reaktion
  • Das Triphenylphosphoniumbromid von Acetylcyclosporin (100 mg, 0,06 mmol), ein Überschuss von 37% Formaldehyd (0,25 ml) und Toluol (2 ml) wurden schnell bei Raumtemperatur gerührt. Wässriges Natriumhydroxid als 1 n Lösung (2 ml) wurde tropfenweise zugegeben und das Rühren 3,5 Stunden lang fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (20 ml) und Wasser (10 ml) verdünnt. Die Ethylacetatphase wurde abgetrennt, aufeinander folgend mit Wasser (10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Das rohe Material wurde auf Silicagel chromatographiert mit Aceton/Hexan (2:3), was 70 mg (88%) einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-ISATX247 als farblosen Feststoff ergab.
  • Beispiel 8: Deacetylierung des Produkts der Wittig-Reaktion
  • Die Mischung von Isomeren aus Beispiel 7 (70 mg, 0,056 mmol) wurde in Methanol (5 ml) gelöst und dann Wasser (1 ml) zugegeben. Kaliumcarbonat (75 mg) wurde zugegeben und der Ansatz bei Raumtemperatur 19 Stunden lang gerührt. Das meiste Methanol wurde verdampft und 15 ml Ethylacetat zu dem Rückstand zugegeben und anschließend 10 ml 10%ige wässrige Citronensäure. Die Ethylacetatphase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit weiteren 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden aufeinander folgend mit 10 ml Wasser, 10 ml 10% wässriger Citronensäure und 10 ml Kochsalzlösung gewaschen, bevor sie über Magnesiumsulfat getrocknet wurden und das Lösungsmittel verdampft wurde. Das rohe Material wurde auf Silicagel mit Aceton/Hexan (2:3) chromatographiert, was 37 mg (54%) ISATX247 als farblosen Feststoff ergab, der etwa 85% (E)-Isomer und etwa 15% (Z)-Isomer enthielt.
  • Die Produkte der Beispiele 5 bis 8 wurden durch Massenspektrometrie und/oder kernmagnetische Resonanzspektrometrie charakterisiert.
  • Beispiel 9: Herstellung der geometrischen Isomeren von ISATX247
  • Die cis- und trans-Isomeren von ISATX247 können unabhängig synthetisiert werden unter Verwendung des folgenden Reaktionsschemas. Die Sequenz beinhaltet die bekannte Metallierung von Allyltrimethylsilan, das elektrophile Einfangen durch ein Trimethylborat und anschließend Hydrolyse und Umesterung, um als Zwischenprodukt den trans-(Trimethylsilyl)allylboronatester zu erzeugen. Die Allylborierung von Cyclosporinaldehyd lieferte ein Borzwischenprodukt, das in den gewünschten β-Trimethylsilylalkohol durch Komplexierung umgewandelt wurde. Die Diastereoselektivität bei der Erzeugung neuer chiraler Zentren wird nicht auf dieser Stufe bestimmt aufgrund der Entfernung dieser Zentren in einer späteren Stufe. Es ist anzumerken, dass die relative Stereochemie der beiden Zentren in dem β-Trimethylsilylalkohol anti ist in Übereinstimmung mit den Erwartungen und aufgrund der trans-Doppelbindung in dem trans-(Trimethylsilyl)-boronatvorläufer.
  • Die durch Basen geförderte Eliminierung (Hudrlick et al., 1975) des β-Trimethylsilylalkohols lieferte eine Zusammensetzung, die an Acetyl-(Z)-1,3-dien angereichert war, während die durch Säure geförderte Eliminierung eine Zusammensetzung ergab, die an Acetyl-(E)-1,3-dien angereichert war. Die Abspaltung der Schutzgruppen führt zu den jeweiligen Dienalkoholen, den (Z)- bzw. (E)-Isomeren von ISATX247.
  • In einem alternativen Ansatz für Diene werden die Allylphosphorane verwendet. Die Metallisierung von Allyldiphenylphosphin und dann die trans-Metallisierung mit Ti(OPri)4 ergibt das Titanzwischenprodukt. Die Allyltitanierung gefolgt von einer stereospezifischen Eliminierung würde eine Zusammensetzung erzeugen, die an dem (Z)-Dien angereichert ist.
  • Wenn andererseits Allyldiphenylphosphinoxid einer gleichen Sequenz unterzogen wird (8), wird hauptsächlich das (E)-Isomer (75%) erzeugt.
  • i) Allylborierung von Acetyl-CsA-CHO:
  • Das (E)-1-Trimethylsilyl-1-propen-3-boronat wurde hergestellt nach den vorher beschriebenen Methoden (Ikeda et al., 1987). Zu einer gerührten Lösung von (E)-1-Trimethylsilyl-1-propen-3-boronat (0,2 g, 0,832 mmol) in THF (3 ml) wurde unter Stickstoff Acetylcyclosporin-A-aldehyd (1,026 g, 0,832 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde mit Hochleistungsflüssigchromatographie (C-8-Säule, Reverse Phase) überwacht und insgesamt 7 Tage lang gerührt. Dann wurde Triethanolamin (0,196 g, 1,3 mmol) zugegeben und das Rühren über weitere 4 Tage fortgesetzt. Der β-Trimethylsilylalkohol wurde durch Reinigung über eine Silicagelsäule erhalten. MS (ES) m/z 1368,9 (M + Na+).
  • Zu einer Suspension von KH (3,5 mg, 26,4 μmol, 30% Mineralöldispersion, die mit wasserfreien Hexanen gewaschen wurde) in wasserfreiem THF (1 ml) wurde β-Trimethylsilylalkohol (10 mg, 7,4 μmol) zugegeben und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Diethylether (10 ml) verdünnt und dann mit gesättigter NaHCO3-Lösung (2 × 5 ml) gewaschen. Das Trocknen (Na2SO4) und die Entfernung des Lösungsmittels lieferten das angereicherte (Z)-Acetyl-1,3-dien. MS (ES) m/z 1294,8 (M + K+).
  • ii) Allyltitanierung von Acetyl-CsA-CHO:
  • Zu einer gerührten und gekühlten (–78°C) Lösung von Allyldiphenylphosphin (0,54 g, 2,4 mmol) in wasserfreiem THF (8 ml) wurde t-BuLi (1,42 ml, 2,4 mmol, 1,7 M Lösung in Pentan) zugegeben. Die ziegelrot gefärbte Lösung wurde 15 Minuten bei dieser Temperatur und dann 30 Minuten bei 0°C gerührt. Sie wurde dann wieder auf –78°C gekühlt und Ti(OPri)4 (0,71 ml, 2,4 mmol) zugegeben. Die braun gefärbte Lösung wurde bei dieser Temperatur 15 Minuten lang gerührt und dann wurde eine Lösung von Acetyl-CsA-CHO (2,5 g, 2 mmol) in THF (10 ml) über eine Kanüle zugegeben. Die fahlgelb gefärbte Lösung wurde weitere 30 Minuten lang gerührt und dann über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt. Zu der Reaktionsmischung wurde Mel (0,15 ml, 2,4 mmol) bei 0°C zugegeben. Das Rühren wurde 1 Stunde lang bei dieser Temperatur und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde in eiskalte 1% HCl (100 ml) gegossen. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Der vereinigte organische Extrakt wurde mit Wasser (2 × 25 ml) und Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab einen gelben Feststoff, der über eine Silicagelsäule chromatographiert wurde. Die Elution mit 1:3 Aceton-Hexan-Mischung lieferte das an (Z)-angereicherte Isomer von Acetyl- ISATX247. Die Abspaltung der Schutzgruppen, wie in Beispiel 4, ergab das (Z)-angereicherte Isomer von ISATX247 (Z/E-Verhältnis 75:25).
  • Beispiel 10: Herstellung von einer an (E) angereicherten Mischung von ISATX247-Isomeren
  • Zu einer Lösung von Allyldiphenylphosphinoxid (1 mmol) und Hexamethylphosphoramid (2 mmol) in Tetrahydrofuran (5 ml) wurde bei –78°C n-Butyllithium (1 mmol, in Hexan) zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei –78°C gerührt. Eine Lösung von Acetylcyclosporin-A-aldehyd (0,8 mmol) in Tetrahydrofuran (7 ml) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung sich nach und nach auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann 18 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde in eiskalte 1 n Salzsäure (50 ml) gegossen und dann in Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde über Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 25% Aceton/75% Hexan als Elutionsmittel, was eine Mischung der (E)- und (Z)-Isomeren von Acetyl-ISATX247 ergab. Die Entfernung der Acetatschutzgruppe, wie in Beispiel 4 beschrieben, ergab eine an (E) angereicherte Mischung der ISATX247-Isomeren. Protonen-NMR-Spektroskopie zeigte, dass die Mischung aus 75% (E)- und 25% (Z)-Isomer von ISATX247 aufgebaut war. Diese Reaktion wurde auch gemäß Schlosser's Modifikation (R. Liu, M. Schlosser, Synlett, 1996, 1195) durchgeführt. Zu einer gerührten und gekühlten (–78°C) Lösung von Allyldiphenylphosphinoxid (1,21 g, 5 mmol) in THF (20 ml) wurde n-BuLi (2 ml, 5 mmol, 2,5 M Lösung in Hexan) zugegeben. Die rot gefärbte Lösung wurde 40 Minuten lang bei –78°C gerührt. Eine Lösung von Acetyl-CsA-CHO (1,25 g, 1,02 mmol) in THF (12 ml) wurde dann über eine Kanüle 15 Minuten lang zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung und Chromatographie wie oben ergab Acetyl-ISATX247 (Z:E-Verhältnis, 40:60 gemäß 1H-NMR-Analyse).
  • Beispiel 11: Herstellung von mit Benzoyl geschütztem Cyclosporin A
  • Cyclosporin A (6,01 g, 5 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (305 mg, 2,5 mmol) wurden in Pyridin (5 ml) gelöst. Benzoesäureanhydrid (3,4 g, 15 mmol) wurde zugegeben und die Mischung 19 Stunden lang bei 50°C gerührt. Weiteres Benzoesäureanhydrid (1,7 g, 7,5 mmol) und DMAP (305 mg, 2,5 mmol) wurden zu gegeben und das Rühren bei 50°C weitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Benzoesäureanhydrid (0,85 g, 3,8 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion weitere 23 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann langsam unter Rühren in Wasser gegossen. Ausgefälltes Cyclosporin-A-benzoat wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Der gesammelte Kuchen wurden in einem minimalen Volumen von Methanol gelöst und zu einer 10%igen Citronensäurelösung zugegeben und 1 Stunde lang gerührt. Das ausgefällte Produkt wurde durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Filtrats den des Wassers erreichte. Das feste Cyclosporin-A-benzoat wurde bei 50°C im Vakuum getrocknet, was einen farblosen Feststoff ergab.
  • Beispiel 12: Herstellung von mit Triethylsilylether geschütztem Cyclosporin A
  • Cyclosporin A (3,606 g, 3 mmol) wurde in trockenem Pyridin (8 ml) gelöst und dann DMAP (122 mg, 1 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C gekühlt und dann wurde Triethylsilyltrifluormethansulfonat (3,6 mmol) tropfenweise zugefügt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann langsam unter Rühren in Wasser gegossen. Der ausgefällte Triethylsilylether wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Der gesammelte Kuchen wurde in einem minimalen Volumen Methanol gelöst und zu einer 5%igen Citronensäurelösung zugegeben und 30 Minuten lang gerührt. Das ausgefällte Produkt wurde durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Filtrats den von Wasser erreichte. Der feste Triethylsilylether wurde bei 50°C im Vakuum getrocknet, was einen farblosen Feststoff ergab. Triisopropylsilyl- und tert.-Butyldimethylsilylschutzgruppen wurden auch gemäß einem analogen Verfahren eingeführt.
  • Beispiel 13: Immunsupprimierende Aktivität unter Verwendung des Calcineurin-Hemmtests
  • Ein Indikator der Wirksamkeit von Cyclosporin A oder einem Cyclosporin-A-derivat ist die Fähigkeit, die Phosphataseaktivität von Calcineurin zu hemmen. Der Calcineurin-Hemmtest misst die Aktivität des Wirkstoffs an seiner Wirkungsstelle und ist als solcher die direkte in-vitro-Beurteilung der Wirksamkeit von Cyclosporin-A-analoga (Fruman et al., 1992).
  • Die immunsupprimierende Aktivität von ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) gegenüber Cyclosporin A wurde untersucht unter Verwendung des Calcineurin-(CN)-Hemmtests. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, dass die Hemmung der Calcineurinphosphataseaktivität durch ISATX247 (45 bis 50% (Z)-Isomer und 50 bis 55% (E)-Isomer) bis zum Dreifachen potenter war (bestimmt durch IC50) als durch Cyclosporin A (11).
  • Die immunsupprimierende Aktivität verschiedener deuterierter und nicht deuterierter isomerer Analogmischungen im Vergleich zu Cyclosporin A wurde untersucht unter Verwendung des Calcineurin-(CN)-Hemmtests. Die Struktur und die Isomerenzusammensetzung dieser Analoga ist in 12 angegeben. In 12 entspricht die Bezeichnung "I4" der Struktur ISATX247. I4-M2 bezeichnet ISATX247, das mit der in den Beispielen 5 bis 8 beschriebenen Methode hergestellt wurde (als Methode 2 in dieser Figur bezeichnet). I4-D4 bezeichnet deuteriertes ISATX247, das mit der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Methode hergestellt wurde. I4-D2 bezeichnet deuteriertes ISATX247, das mit der in den Beispielen 5 bis 8 beschriebenen Methode hergestellt wurde. Andere isomere Mischungen sind wie in der Figur gezeigt.
  • Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, dass die Hemmung der Calcineurinphosphataseaktivität durch diese Mischungen von isomeren Analoga mindestens so wirksam (bestimmt durch IC50) war, wie Cyclosporin A (13). CsA bedeutet Cyclosporin A; Isocyclo4 bezeichnet ISATX247, das mit der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Methode hergestellt wurde. Isocyclo5 entspricht I5-M1 von 12. Isocyclo4-d4 entspricht I4-D4 von 12. Isocyclo5-d5 entspricht I5-D5 von 12. Isocyclo4-d2 entspricht I4-D2 von 12. Isocyclo4-M2 entspricht I4-M2 von 12. Isocyclo5-m2 entspricht I5-M5 von 12.
  • Beispiel 14: Immunsupprimierende Aktivität unter Verwendung des Rattenherztransplantatmodells
  • Die Wirksamkeit von ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) bei der Verhütung der Abstoßung von Herzen, die zwischen verschiedenen Stämmen von Ratten transplantiert wurden, wurde untersucht und mit der von Cyclosporin A verglichen. Das Rattenherztransplantatmodell ist das am häufigsten verwendete Modell, um die in-vivo-Potenz neuer immunsupprimierender Arzneimittel zu untersuchen, da eine verlängerte Transplantatüberlebensrate bei diesem Modell schwierig zu erreichen ist aufgrund der Immunabstoßung.
  • Das Verfahren beinhaltet die heterotope Transplantation (zu der abdominalen Aorta und Vena cava inferior) des Herzens von Wistar-Furth-Ratten zu Lewis-Ratten. Intraperitoneale Injektionen entweder von Cyclosporin A oder einer Mischung von isomeren Analoga wurden dem Transplantatempfänger 3 Tage vor der Transplantation und bis 30 Tage nach der Transplantation gegeben. Wenn eine Transplantatfunktionsstörung während des Zeitraums von 30 Tagen nach der Transplantation festgestellt wurde, wurde das Tier getötet. Wenn das Tier länger als 30 Tage nach der Transplantation überlebte, wurden der Test und die Kontrollartikel unterbrochen und das Tier wurde leben gelassen bis zu einer Transplantatfunktionsstörung oder bis zu 100 Tage nach Transplantation.
  • Die durchschnittlichen Überlebensraten für jede Gruppe von Empfängertieren ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Diese Ergebnisse zeigen, dass ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) bei einer optimalen Dosis von 1,75 mg/kg/Tag die Überlebenszeit ungefähr dreifach gegenüber Cyclosporin A erhöhte. Eine Anzahl von Tieren, die ISATX247 erhielten, hatte immer noch funktionierende Transplantate 100 Tage nach der Transplantation (70 Tage nach Abbruch der Dosierung). Diese Daten zeigen die immunsupprimierende Aktivität dieser Mischung von isomeren Analoga zur Verhütung der Transplantatabstoßung. Tabelle 1 Wirkung von ISATX247 und Cyclosporin A, nach intraperitonealer Verabreichung, auf die durchschnittlichen Überlebenszeiten von transplantierten Rattenherzen (Durchschnitt von zwei getrennten Studien, n 13)
    Figure 00590001
    • a,c Nicht signifikant verschieden
    • b Signifikant verschieden (p < 0,01)
  • Die Wirksamkeit verschiedener deuterierter und nicht deuterierter Mischungen von isomeren Analoga (Strukturen in 12 angegeben) zur Verhütung der Abstoßung von Herzen, die zwischen verschiedenen Stämmen von Ratten transplantiert worden waren, wurde auch untersucht und mit der von Cyclosporin A verglichen. Die Dosen waren 1,75 mg/kg/Tag über 30 Tage. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Diese Ergebnisse zeigen, dass die isomeren Mischungen mit 1,75 mg/kg/Tag die Überlebenszeit mindestens so stark erhöhten wie Cyclosporin A und zeigen die immunsupprimierende Aktivität dieser Mischungen von isomeren Analoga bei der Verhütung von Transplantatabstoßung.
  • Tabelle 2 Wirkung verschiedener Mischungen von isomeren Analoga und von Cyclosporin A, nach intraperiotenealer Verabreichung von 1,75 mg/kg/Tag, auf die durchschnittliche Überlebenszeit von transplantierten Rattenherzen
    Figure 00600001
  • Beispiel 15: Immunsupprimierende Aktivität bei Inselzellallotransplantation
  • Die Fähigkeit von ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) im Vergleich zu Cyclosporin A, das Überleben transplantierter Inselzellen in einem Mausmodell zu verlängern, wurde in einer Studie untersucht, die die Transplantation von 500 Inseln von einer CBA/J-Maus in die Nierenkapsel von diabetischen Balb/c-Mausempfängern betraf.
  • Nach der Transplantation wurde ISATX247 oder Cyclosporin A durch intraperitoneale (i.p.) Injektion in einer Dosishöhe von 0 (Vehikel), 1,75, 10, 20 oder 25 mg/kg/Tag insgesamt 30 Tage lang verabreicht. Die Blutglucose wurde täglich überwacht bis zu dem Zeitpunkt des Transplantatversagens, was durch einen Glucosepegel von mehr als 17 mmol/l an zwei aufeinander folgenden Tagen definiert wurde.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass ISATX247 die Länge des Transplantatüberlebens um 40% bei einer Dosis von 20 mg/kg/Tag erhöhte (Tabelle 3). Es wurde auch festgestellt, dass ISATX247 weniger toxisch war als Cyclosporin A, wenn die Dosis erhöht wurde. Dies war besonders offensichtlich bei einer Dosis von 25 mg/kg/Tag. Tabelle 3 Überleben von Mausinselallotransplantaten bei diabetischen Mäusen, die entweder ISATX247 oder Cyclosporin A durch intraperioteneale Injektion in einer Dosis von 1,75,10, 20 oder 25 mg/kg/Tag erhielten
    Figure 00610001
    • * 7 von 10 Tieren in dieser Gruppe starben aufgrund der CsA-Toxizität. Daher hielten nur 3 Tiere in dieser Gruppe durch und es wurde keine Statistik erhoben.
  • Beispiel 16: Immunsupprimierende Aktivität bei Arthritis
  • Im Verlauf der letzten drei Jahrzehnte wurden drei Tiermodelle für menschliche Polyarthritis intensiv untersucht und breit angewendet beim vorklinischen Screening und der Entwicklung neuer antirheumatischer Mittel. Diese schließen durch Adjuvans induzierte, durch Collagen induzierte und durch Antigen induzierte Arthritismodelle ein. Die folgenden Studien wurden entwickelt, um die entzündungshemmende Wirksamkeit von ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) sowohl bei dem durch Collagen induzierten Arthritismodell bei der Maus als auch dem durch Antigen induzierten Arthritismodell beim Kaninchen auszuwerten. Die bei diesen beiden Modellen beobachtete Histopathologie und Immunpathologie ähneln den Erkenntnissen bei der menschlichen Krankheit. In beiden Modellen wurde die Wirksamkeit von ISATX247, das Einsetzen der Arthritis (Präventionsprotokoll) zu verhindern und Arthritis zu behandeln (Behand lungsprotokoll), untersucht. Diese Studien stützen die immunsupprimierende Wirkung der beanspruchten Mischungen von isomeren Analoga.
  • A. Durch Collagen induzierte Arthritis
  • Männliche DBA/1-Lac-J-Mäuse, die unter virusantikörperfreien Bedingungen gehalten wurden, wurden subcutan in einem Alter von 8 bis 10 Wochen mit 100 μg Collagen Typ II vom Huhn, emulgiert in Freund's komplettem Adjuvans, immunisiert. ISATX247, Cyclosporin A oder Träger (Chremophor EL/Ethanol 72:28, Volumen/Volumen) wurde täglich durch intraperitoneale (i.p.) Injektion in 1- bis 50-facher Verdünnung des Vorratswirkstoffs (0,25, 0,5 oder 1 mg/ml) in Kochsalzlösung verabreicht, um Konzentrationen von 0 (Träger); 125, 250 oder 500 μg/Maus für ISATX247 und 250 oder 500 μg/Maus für Cyclosporin A zu erzielen. Tiere, die dem Präventionsprotokoll zugeordnet waren (12 pro Gruppe), erhielten die Dosis beginnend am Tag der Immunisierung mit Collagen (Tag 0) bis zur Tötung am Tag 40. Tiere, die dem Behandlungsprotokoll zugeordnet waren (12 pro Gruppe) erhielten am Tag des Einsetzens der Krankheit (ungefähr Tag 28) bis zur Tötung am Tag 38 ihre Dosis.
  • Die ausgewerteten Parameter schlossen Sterblichkeit, Serumcreatinin, Histologie und Auswertung des Ergebnisses, wie klinische Bewertung (visuell), Schwellung der hinteren Pfote, histologische Bewertung, Erosionsbewertung und Immunohistochemie ein.
  • Die Erosionsbewertung erfolgte in einem Blindversuch, indem Gitterabschnitte des proximalen Interphalangeal-(PIP)-gelenks des Mittelfingers auf Gegenwart oder Abwesenheit von Erosionen untersucht wurden (definiert als abgegrenzte Defekte im Knorpel oder Knochen, die mit entzündlichem Gewebe gefüllt waren). Dieser Ansatz lässt Vergleiche des gleichen Gelenks zu. Frühere Studien zeigten Erosionen von mehr als 90% bei unbehandelten arthritischen Tieren in diesem Gelenk.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die negativen Erosionsbewertungen bei der ISATX247-Hochdosisbehandlungsgruppe (500 μg/Maus) signifikant höher sind als die negativen Erosionsbewertungen bei der Trägerbehandlungsgruppe (p < 0,05). Sowohl die Behandlungsgruppe mit mittlerer Dosis von ISATX247 (250 μg/Maus) als auch die Behandlungsgruppe mit hoher Dosis Cyclosporin A (500 μg/Maus) hatten höhere negative Erosionswerte im Vergleich zu der Trägerbehandlungsgruppe (p < 0,1). Weiterhin haben die Behandlungsgruppen mit ISATX247 in geringer Dosis (125 μg/Maus) als auch die Behandlungsgruppe mit Cyclosporin A in mittlerer Dosis (250 μg/Maus) als Kontrolle höhere, wenn auch nicht statistisch signifikante, negative Erosionswerte im Vergleich zu der Trägerkontrollgruppe.
  • Die einzige Behandlung, um die Entwicklung von Gelenkserosionen signifikant zu verhüten, war ISATX247 mit 500 μg/Maus. Diese signifikante Reduktion im Vergleich der PIP-Gelenke, die erosive Veränderungen bei den mit ISATX247 behandelten Mäusen im Vergleich zu der Trägerkontrollgruppe zeigten, beweisen, dass ISATX247 die Krankheit modifizierende Eigenschaften hat.
  • B. Durch Antigen induzierte Arthritis
  • Weiße Kaninchen aus Neuseeland, die unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten wurden, wurden mit 10 mg Ovalbumin in Kochsalzlösung, das mit Freund's komplettem Adjuvans emulgiert war, immunisiert, das intramuskulär und subcutan an mehreren Stellen im Nacken gegeben wurde. 14 Tage später wurde bei allen Tieren mit intraartikulären Injektionen von 5 mg Ovalbumin und 65 ng humanem rekombinanten Transformationswachstumsfaktor 2 in Kochsalzlösung zweimal täglich gestartet.
  • ISATX247, Cyclosporin A oder Träger (Chremophor EL/Ethanol 72:28, V/V) wurden täglich durch subcutane Injektion von 1- bis 4-fachen Verdünnungen des Vorratswirkstoffs (in Träger) in Kochsalzlösung verabreicht, um Konzentrationen von 0 (Träger); 2,5, 5,0 oder 10 mg/kg/Tag für ISATX247 und 5,0, 10 oder 15 mg/kg/Tag für Cyclosporin A zu erzielen. Tiere, die dem Verhütungsprotokoll zugeordnet waren (8 pro Gruppe) wurden dosiert beginnend am Tag der Immunisierung mit Ovalbumin (Tag 0) bis zur Tötung am Tag 42. Tiere, die dem Behandlungsprotokoll zugeordnet waren (8 pro Gruppe) wurden dosiert beginnend am Tag des Einsetzens der Krankheit (ungefähr Tag 28) bis zur Tötung am Tag 42.
  • Ausgewertete Parameter schlossen Sterblichkeit, Körpergewicht, Serumcreatinin, Histologie und Beurteilung des Ergebnisses, wie Schwellung des Kniegelenks, Zählung der Synovialflüssigkeit, grobe Post-mortem-Analyse und Histologie ein.
  • Eine signifikante Abnahme der histopathologischen Bewertungen des Gelenks wurde beobachtet bei den ISATX247-(P 0,05)- und Cyclosporin-A-(P 0,05)-Tieren nach 28 Tagen Therapie (Verhütungsprotokoll), im Vergleich zu Trägerkontrolltieren. Dies war begleitet von signifikanten Reduktionen der Synovialflüssigkeitszählung (ISATX247, P 0,05; Cyclosporin A, P 0,05). Eine signifikante Verbesserung der histopathologischen Bewertungen der Gelenke bei Tieren mit etablierter Arthritis war auch 14 Tage nach Behandlung mit ISATX247 (P 0,05) und Cyclosporin A (P 0,05) im Vergleich zu Trägerkontrollen (Behandlungsprotokoll) offensichtlich. Eine signifikante Reduktion der makroskopischen Bewertung von Arthritis war offensichtlich bei ISATX247 (P = 0,01), aber nicht bei mit Cyclosporin A behandelten Tieren. Die Behandlung wurde gut toleriert ohne eine signifikante Toxizität bei Analyse des Serumcreatinins oder der Post-mortem-Histologie.
  • Die Daten zeigen, dass ISATX247 äquivalent oder potenziell wirksamer als Cyclosporin A ist bei der Behandlung und Verhütung von Polyarthritis in dem durch Antigen induzierten Arthritismodell beim Kaninchen.
  • Beispiel 17: Pharmakokinetische und toxikokinetische Eigenschaften
  • Die pharmakokinetischen und toxikokinetischen Parameter von ISATX247 (45 bis 50% (E)-Isomer und 50 bis 55% (Z)-Isomer) und Cyclosporin A wurden in einem Kaninchenmodell getestet. Das Kaninchen wurde auch als Modell verwendet, um die Nephrotoxizität von Cyclosporin A zu untersuchen, aber viel weniger häufig als die Ratte. Untersuchungen haben gezeigt, dass Cyclosporin A, das an Kaninchen verabreicht wurde, strukturelle und funktionelle Veränderungen bei einer Dosis verursacht, die nicht nur geringer ist als die, die früher für andere Tiermodelle berichtet wurde, sondern mindestens auch im oberen Abschnitt des therapeutischen Bereichs bei Menschen liegt (Thliveris et al., 1991, 1994). Auch die Feststellung einer interstitiellen Fibrose und Arteriolopathie zusätzlich zu den cytologischen Veränderungen in den Tubuli deutet darauf hin, dass das Kaninchen ein geeigneteres Modell ist, um die Nephrotoxizität zu untersuchen, da diese strukturellen Einheiten Hinweise auf bei Menschen beobachtete Nephrotoxizi tät sind. ISATX247 wurde die ersten 7 Tage intravenös (i.v.) und weitere 23 Tage subcutan (s.c.) gemäß dem folgenden Plan verabreicht.
  • Tabelle 4 Dosisverabreichungsplan für die Untersuchung der pharmakokinetischen und toxikokinetischen Eigenschaften von ISATX247 im Kaninchenmodell
    Figure 00650001
  • Pathogenfreie Kaninchen (SPF) wurden verwendet, um sicherzustellen, dass alle Nierenveränderungen, die beobachtet wurden, auf der Wirkung von ISATX247 und nicht auf Pathogenen beruhten. An den Tagen 1 und 7 wurden vor der Wirkstoffverabreichung und 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 18 und 24 Stunden nach der Dosis Blutproben entnommen, um ein pharmakokinetisches Profil zu erzeugen. Andere ausgewertete Parameter schlossen klinische Beobachtungen, Körpergewicht, Futterverbrauch, Hämatologie, klinische Chemie, Makropathologie und histopathologische Untersuchung ausgewählter Gewebe/Organe ein.
  • Blutproben wurden über Hochleistungsflüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LCMS) analysiert. Tabelle 5 unten fasst die durchschnittlichen pharmakokinetischen Parameter bei Kaninchen zusammen, die 10 mg/kg Cyclosporin A oder ISATX247 erhielten.
  • Tabelle 5 Pharmakokinetische Parameter für intravenös verabreichtes Cyclosporin A und ISATX247 bei männlichen Kaninchen, die 10 mg/kg/Tag erhielten. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± SD
    Figure 00660001
  • Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den pharmakokinetischen Parametern für Cyclosporin A und ISATX247 bei männlichen Kaninchen, die 10 mg/kg/Tag erhielten. Die pharmakokinetischen Parameter für ISATX247 bei weiblichen Ratten, die dieselbe Dosis erhielten, waren nicht signifikant verschieden von denen, die für männliche Kaninchen beobachtet wurden, mit der Ausnahme der maximalen Konzentration am Tag 7.
  • Es wurden keine signifikanten Veränderungen bei den hämatologischen Parametern festgestellt bei Kaninchen, die Träger als Kontrolle, Cyclosporin A oder ISATX247 erhielten. Ein Unterschied wurde festgestellt in den Creatininpegeln der verschiedenen Gruppen im Verlauf der Studie, wie in Tabelle 6 unten gezeigt. Diese Unterschiede deuteten darauf hin, dass Cyclosporin A eine signifikant höhere negative Wirkung auf die Nieren hatte als entweder Träger als Kontrolle oder ISATX247. Es ist anzumerken, dass sogar bei einer 50% höheren Dosis, 15 mg/kg/Tag, im Vergleich zu 10 mg/kg/Tag Cyclosporin A, ISATX247 nicht zu irgendeinem signifikanten Anstieg der Serumcreatininpegel führte.
  • Tabelle 6 Änderung der Serumcreatininpegel oberhalb der Basislinie bei männlichen Kaninchen, die Träger, Cyclosporin A oder ISATX247 30 Tage lang erhielten, in
    Figure 00670001
  • Die Untersuchung der Organe bei allen Kaninchen, die Träger als Kontrolle, 10 mg/kg Cyclosporin A, 5 mg/kg ISATX247 oder 10 mg/kg ISATX247 erhielten, zeigte keine signifikanten Anormalitäten. Dies traf insbesondere für die Nieren zu, bei denen kein Hinweis auf interstitielle Fibrose, die normalerweise bei mit Cyclosporin A behandelten Tieren festzustellen ist (Thliveris et al., 1991, 1994), festgestellt wurde. Bei männlichen Kaninchen, die 15 mg/kg ISATX247 erhielten, wurde eine Abnahme der Spermatogenese festgestellt. Es wurden keine Veränderungen bei den drei weiblichen Kaninchen festgestellt, die die Untersuchung mit der Dosis von 15 mg/kg ISATX247 beendeten.
  • Beispiel 18: Immunsupprimierende Wirkungen von ISATX247
  • Vollblut aus Makaken (n = 4) wurde mit ISATX247 oder Cyclosporin A inkubiert und mit verschiedenen Mitogenen im Kulturmedium stimuliert. Die Lymphozytenproliferation wurde untersucht durch Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin und durch durchflusscytometrische Analyse der Expression des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA) auf Zellen in SG2M-Phase. Die Durchflusscytometrie wurde auch verwendet, um die Erzeugung von intrazellulären Cytokinen durch T-Zellen und die Expression von T-Lymphozytaktivierungsantigenen zu untersuchen. Die EC50 (Konzentration des Wirkstoffs, der notwendig ist, um 50% der maximalen Wirkung zu erreichen) wurde anschließend berechnet unter Verwendung von WinNonlinTM-Software. Die Ergebnisse zeigten, dass Lymphozytenproliferation, Cytokinproduktion und Expression von T-Zelloberflächenantigenen potenter gehemmt wurden durch ISATX247 als durch Cyclosporin, was durch die EC50 (ausgedrückt in ng/ml) gezeigt ist, die in Tabelle 7 unten angegeben ist.
  • Tabelle 7
    Figure 00680001
  • Somit wurde unter Verwendung eines ex-vivo-Vollbluttests gefunden, dass ISATX247 diverse Immunfunktionen 2,3- bis 6-fach potenter als Cyclosporin supprimiert.
  • Beispiel 19: Wittig-Reaktion unter Verwendung von Tributylallylphosphoniumbromid
  • Kalium-tert.-butoxid (0,31 g, 2,8 mmol) wurde in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Bei etwa –40°C wurde Tributylallylphosphoniumbromid (0,99 g, 3,1 mmol), gelöst in 3 ml Tetrahydrofuran, langsam zugegeben. Die entstehende gelbe Mischung wurde etwa 10 Minuten lang bei etwa –40°C gerührt, bevor eine Lösung von Acetylcyclosporin-A-aldehyd (1,5 g, 1,2 mmol) in 6 ml Tetrahydrofuran langsam zugegeben wurde. Nach 1,5-stündigem Rühren der gelb-orangen Reaktionsmischung war die Reaktion abgeschlossen. Zum Abschrecken wurde die Reaktionsmischung auf wässrige Phosphorsäure (1,2 g, 1,0 mmol) überführt. Die entstehende wässrige Lösung wurde mit 100 ml Toluol und anschließend 50 ml Toluol extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Das Produkt, acetyliertes ISATX247, wurde als hellgelber Feststoff in ungefähr 90% Ausbeute erhalten. Das Isomerenverhältnis war etwa 87% (E)-Isomer und etwa 13% (Z)-Isomer (bestimmt mit 1H-NMR-Spektroskopie).
  • Beispiel 20: Wittig-Reaktion unter Verwendung von Tributylallylphosphoniumbromid und einer Lithiumbase
  • Tributylallylphosphoniumbromid (1,38 g, 4,3 mmol) wurde in einer Mischung aus 20 ml Toluol und 3 ml Tetrahydrofuran gelöst. Bei etwa –78°C wurde Butyllithium (1,6 M in Hexan, 2,43 ml, 3,9 mmol) langsam zugegeben. Die entstehende gelbe Mischung wurde etwa 10 Minuten lang bei etwa –78°C gerührt, bevor eine Lösung von Acetylcyclosporin-A-aldehyd (1,5 g, 1,2 mmol) in 6 ml Toluol langsam zugegeben wurde. Nach 3,5-stündigem Rühren der gelb-orangen Reaktionsmischung wurde die Reaktion abgeschreckt, indem die Reaktionsmischung auf eine Mischung von 50 ml Toluol und wässriger Phosphorsäure (0,25 g, 2,2 mmol) überführt wurde. Die entstehende zweiphasige Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, bevor die zwei Schichten getrennt wurden. Die Toluolphase wurde mit 20 ml Wasser gewaschen und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Das Produkt, acetyliertes ISATX247, wurde als hellgelber Feststoff in einer Ausbeute von ungefähr 80% erhalten. Das Isomerenverhältnis war etwa 70% (E)-Isomer und etwa 30% (Z)-Isomer (bestimmt mit 1H-NMR-Spektroskopie).
  • Beispiel 21: Wittig-Reaktion unter Verwendung von Tributylallylphosphoniumbromid und einer Lithiumbase
  • SAP 018 wurde durchgeführt wie oben beschrieben, aber nur bei etwa –40°C. Die Versuchsbedingungen von Beispiel 20 wurden wiederholt, dieses Mal unter Verwendung einer Reaktionstemperatur von etwa –40°C. Unter diesen Bedingungen war das Isomerenverhältnis des isolierten Produkts, acetyliertes ISATX247, etwa 74 Gew.-% (E)-Isomer und etwa 26 Gew.-% (Z)-Isomer, bestimmt mit 1H-NMR-Spektroskopie.
  • Beispiel 22: Wittig-Reaktion unter Verwendung von Tributylallylphosphoniumbromid
  • Eine Lösung von Acetylcyclosporin-A-aldehyd (1,5 g, 1,2 mmol) und Tributylallylphosphoniumbromid (0,99 g, 3,1 mmol) in 15 ml Tetrahydrofuran wurde auf etwa –80°C gekühlt. Kalium-tert.-butoxid (0,19 g, 1,7 mmol) gelöst in 9 ml Tetrahydrofuran wurde langsam zugegeben. Die entstehende gelbe Mischung wurde 1 Stunde lang bei etwa –80°C gerührt, um die Reaktion zu vervollständigen, bevor eine Lösung von 6 ml Tetrahydrofuran langsam zugegeben wurde. Nach 1,5- stündigem Rühren der gelb-orangen Reaktionsmischung war die Reaktion abgeschlossen. Zum Abschrecken wurde der Reaktionsmischung wässrige Phosphorsäure (0,15 g, 1,3 mmol) zugegeben. Die entstehende Mischung wurde eingeengt und der Rückstand in 5 ml Methanol gelöst. Dann wurde die Mischung langsam zu 5 ml Wasser zugegeben. Der entstehende Niederschlag wurde filtriert, mit 4 ml Methanol/Wasser (1:1) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt, acetyliertes ISATX247, wurde als farbloser Feststoff in einer Ausbeute von ungefähr 90% erhalten. Das Isomerenverhältnis war etwa 91 Gew.-% (E)-Isomer und 9 Gew.-% (Z)-Isomer (bestimmt mit 1H-NMR-Spektroskopie).
  • Beispiel 23: Ozonolyse von Acetyl-CsA
  • Eine Lösung von Acetylcyclosporin A (15 g, 12,1 mmol) in 200 ml Methanol wurde bei –78°C ozonisiert unter Verwendung eines Sander-Ozongenerators mit etwa 1,1 bar bei einer ständigen Strömung von 300 l O2/h, bis die Reaktion abgeschlossen war (etwa 5 Minuten). Die Lösung wurde mit Argon versetzt und mit Dimethylsulfid, gelöst in Methanol, abgeschreckt. Zum Abschluss der Reduktion wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen auf etwa 50 ml wurde die Lösung langsam zu 500 ml Wasser zugegeben. Der entstehende Niederschlag wurde filtriert, mit 60 ml Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt, acetylierter CsA-Aldehyd, wurde als farbloser Feststoff in einer Ausbeute von ungefähr 95% und in einer Reinheit von etwa 98% (bestimmt mit HPLC) erhalten.
  • Beispiel 24: Herstellung von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin A
  • Cyclosporin A (40 g, 1 Äquivalent) wurde in Dichlormethan (100 ml) bei 30°C gelöst. N,N-Bis-(trimethylsilyl)harnstoff (1,1 Äquivalent) wurde zugegeben. Nach 5 Minuten Rühren bei 30°C wurde p-Toluolsulfonsäure (0,02 Äquivalent) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde am Rückfluss erhitzt, bis die Reaktion fertig war, was mit Dünnschichtchromatographie (DC), Hochdruck- oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder Massenspektrometrie (MS) bestimmt wurde, und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Halb gesättigte wässrige Natriumbicarbonatlösung (100 ml) wurde zugegeben. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und wieder mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und filtriert. Das Lö sungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt, was das rohe mit Trimethylsilyl geschützte Cyclosporin A lieferte.
  • Beispiel 25: Herstellung von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-Aaldehyd
  • Mit Trimethylsilyl geschütztes Cyclosporin A (5 g, 1 Äquivalent) wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde dann auf eine Temperatur von etwa –78°C gekühlt, wonach Ozon durch die Lösung durchgeblasen wurde, bis eine blaue Farbe erschien. Als nächstes wurde Argon durch die Lösung geblasen, bis eine farblose Lösung erhalten wurde, um überschüssiges Ozon zu entfernen; diese Stufe wurde durchgeführt, um überschüssiges Ozon zu entfernen. Triethylamin (5 Äquivalente) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt. Der mit Trimethylsilyl geschützte Cyclosporin-A-aldehyd wurde nach wässriger Aufarbeitung erhalten.
  • Beispiel 26: Herstellung einer 3:1-Mischung von Z- zu E-Doppelbindunpsisomeren von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-dien über Wittig-Reaktionen
  • Zu einer Mischung von Kalium-tert.-butoxid (3 Äquivalente) und Allyltriphenylphosphoniumbromid (2 Äquivalente) in Toluol (10 ml), die vorher 60 Minuten lang gerührt worden war, wurde mit Trimethylsilyl geschützter Cyclosporin-Aaldehyd (1 g, 1 Äquivalent) zugegeben. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung nach 1 Stunde Reaktion bei Raumtemperatur lieferte eine 3:1-Mischung (gemäß NMR) von (Z)- und (E)-Doppelbindungsisomeren des mit Trimethylsilyl geschützten Cyclosporin-A-diens.
  • Beispiel 27: Herstellung einer 1:1-Mischung von Z- zu E-Doppelbindungsisomeren von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-dien über Wittig-Reaktionen
  • Der mit Trimethylsilyl geschützte Cyclosporin-A-aldehyd (2,5 g) wurde in 25 ml Toluol gelöst und mit 1 n wässriger Natriumhydroxidlösung (10 Äquivalente) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde heftig gerührt und Allyltriphenylphosphoniumbromid (7,5 Äquivalente, portionsweise) zugefügt. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung nach mehreren Stunden Reaktion bei Raumtemperatur lieferte eine ca. 1:1-Mischung (gemäß NMR) der Z- und E-Doppelbindungsisomeren des mit Trimethylsilyl geschützten Cyclosporin-A-diens.
  • Beispiel 28: Herstellung einer 1:2-Mischung von Z- zu E-Doppelbindungsisomeren von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-dien über Wittig-Reaktionen
  • Der mit Trimethylsilyl geschützte Cyclosporin-A-aldehyd (1 g) wurde in 5 ml Toluol zusammen mit Kaliumcarbonat (1,5 Äquivalente) und Allyltriphenylphosphoniumbromid (1,5 Äquivalente) gelöst. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung nach 4 Stunden Reaktion am Rückfluss unter heftigem Rühren lieferte eine 1:2-Mischung (gemäß NMR) der Z- und E-Doppelbindungsisomeren des mit Trimethylsilyl geschützten Cyclosporin-A-diens.
  • Beispiel 29: Herstellung einer 1:3-Mischung von Z- zu E-Doppelbindungsisomeren von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-dien über Wittig-Reaktionen
  • Allyltributylphosphoniumbromid (3 Äquivalente, hergestellt aus Allylbromid und Tributylphosphin) wurde in THF (3,5 ml) gelöst. Toluol (7,5 ml) wurde zugegeben und anschließend Kalium-tert.-butoxid (4 Äquivalente). Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf ca. –30°C gekühlt. Eine Lösung des mit Trimethylsilyl geschützten Cyclosporin-A-aldehyds (1 g, 1 Äquivalent) in Toluol (5 ml) wurde tropfenweise zugefügt. Nach 45 Minuten bei etwa –30°C wurde die Reaktionsmischung aufgearbeitet, was eine ungefähr 1:3-Mischung (gemäß NMR) der Z- und E-Doppelbindungsisomeren von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-dien lieferte.
  • Die folgenden zwei Beispiele, Beispiele 30 und 31, sind auf Allylmetallisierungen gerichtet.
  • Beispiel 30: Herstellung von mit Acetyl geschütztem Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol
  • Zu einer Lösung von Allyltrimethylsilan (10,1 Äquivalente) in THF (15 ml) wurde Butyllithium (1,6 M in Hexan, 10 Äquivalente) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 30 Minuten Reaktion wurde die Lösung auf –75°C gekühlt und mit Diethyl-B-methoxyboran (10,1 Äquivalente) versetzt. Nach 1 Stunde wurde Bortrifluoriddiethyletherkomplex (10,1 Äquivalente) zugefügt, um das B-(γ-Trimethylsilylallyl)diethylboranreagenz zu erzeugen. Nach einer Stunde wurde eine Lösung von mit Acetyl geschütztem Cyclosporin-A-aldehyd (5 g, 1 Äquivalent) in THF (15 ml) tropfenweise zugefügt. Nach 20 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf –10°C erwärmt und eine gesättigte wässrige NH4Cl-Lösung zugegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde Wasser (45 ml) zugegeben und die Reaktionsmischung dreimal mit 25 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden aufeinander folgend mit Wasser (25 ml) und einer gesättigten wässrigen NH4Cl-Lösung (25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck eingeengt. Das rohe Produkt wurde chromatographiert (Silicagel, Dichlormethan/Methanol oder Ethylacetat/Heptan), was mit Acetyl geschützten Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol lieferte.
  • Beispiel 31: Herstellung von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol
  • Zu einer Lösung von Allyltrimethyisilan (10,1 Äquivalente) in THF (15 ml) wurde Butyllithium (1,6 M in Hexan, 10 Äquivalente) bei Raumtemperatur zugegeben. Nachdem die Reaktion etwa 30 Minuten lang fortschreiten gelassen worden war, wurde die Lösung auf –65°C gekühlt und mit Diethyl-B-methoxyboran (10,1 Äquivalente) behandelt. Nach 1 Stunde wurde Bortrifluoriddiethyletherkomplex (10,1 Äquivalente) zugegeben, um das B-(γ-Trimethylsilylallyl)diethylboranreagenz zu erzeugen. Nach einer Stunde wurde eine Lösung von mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-aldehyd (5 g, 1 Äquivalent) in THF (15 ml) tropfenweise zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf 10°C erwärmt und eine gesättigte wässrige NH4Cl-Lösung zugegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde Wasser (12,5 ml) und gesättigtes NaHCO3 (25 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde zweimal mit 25 ml Methyl-t-butylether extrahiert. Die organischen Phasen wurden zweimal aufeinander folgend mit Wasser (2 × 25 ml) und einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung (25 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck eingeengt. Das rohe Produkt wurde chromatographierf (Silicagel, Heptan/Ethylacetat), was den mit Trimethylsilyl geschützten Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol lieferte.
  • Die folgenden drei Beispiele, Beispiele 32, 33 und 34 sind auf Peterson-Eliminierungsreaktionen gerichtet.
  • Beispiel 32: Herstellung von E-acetylgeschütztem Cyclosporin-A-dien
  • Der acetylgeschützte Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol (10 g, 1 Äquivalent) wurde in THF (50 ml) gelöst. Konzentrierte H2SO4 (1,24 ml, 3 Äquivalente) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (150 ml) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung mit Methyl-t-butylether (200 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde wieder mit Methyl-t-butylether (150 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit Wasser (150 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt, was das rohe acetylgeschützte Cyclosporin-A-dien (acetylgeschütztes ISATX247) ergab. Das rohe Produkt wurde aus Methyl-t-butylether/THF kristallisiert und dann aus Methyl-t-butylether/DCM umkristallisiert, was acetylgeschütztes Cyclosporin-A-dien (acetylgeschütztes ISATX247) als 99 bis 97%:1 bis 3% E- und Z-Doppelbindungsisomeren ergab (gemäß 400 MHz NMR, 2% Messfehler).
  • Die Hydrolyse von E-acetylgeschütztem Cyclosporin-A-dien wurde wie folgt durchgeführt: Acetylcyclosporin-A-dien (4 g, 1 Äquivalent) wurde in Methanol (80 ml) und Wasser (32 ml) gelöst. Kaliumcarbonat (3,65 g, 8,3 Äquivalente) wurde zugegeben. Nach 15-stündigem bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung 4 Stunden lang auf 40°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde bei vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand in Ethylacetat (70 ml) aufgenommen. Wässrige Citronensäurelösung 15% (30 ml) wurde langsam zugegeben und anschließend Wasser (10 ml). Die wässrige Phase wurde abgetrennt und wieder mit Ethylacetat (56 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit Wasser (30 ml), 15%iger Citronensäurelösung (40 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (30 ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Na2SP4 getrocknet und bei vermindertem Druck eingeengt, was Cyclosporin-A-dien (ISATX247) als 98:2 E/Z-Mischung von Doppelbindungsisomeren ergab (gemäß 400 MHz NMR, ca. 2 bis 3% Fehler). Siehe R. W. Hoffmann, Angewandte Chemie International Edition, Bd. 555 (1982); W. R. Roush, "Allylorganometallics", Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon Press, Bd. 2, S. 1–53, und Y. Yamamoto, N. Asao, Chemical Reviews, S. 2307 (1993).
  • Beispiel 33: Herstellung von Z-trimethylsilylgeschütztem Cyclosporin-A-dien und seine Umwandlung in Z-Cyclosporin-A-dien (ISATX247)
  • Der trimethylsilylgeschützte Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol (2 g, 1 Äquivalent) wurde in THF (20 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0 bis 2°C gekühlt und Kalium-t-butoxid (4 Äquivalente) wurde zugegeben. Nach 1,5 Stunden Reaktion wurden Ethylacetat (20 ml) und Wasser (40 ml) zugegeben. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und wieder mit Ethylacetat (20 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung (20 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck eingeengt, was eine Mischung aus Z-trimethylsilylgeschütztem Cyclosporin-A-dien (trimethylsilylgeschütztem ISATX247) und Z-Cyclosporin-A-dien (Z-Isomer von ISATX247) ergab. Die Desilylierung wurde vervollständigt, indem die rohe Produktmischung in Methanol (10 Gew.-% in der Lösung) gelöst wurde und 1 M wässrige Salzsäurelösung (1 Äquivalent) zugefügt wurde. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden Wasser und Ethylacetat zugegeben. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und wieder mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck eingeengt, was Cyclosporin-A-dien (ISATX247) als 94:6-Mischung von Z- und E-Doppelbindungsisomeren (gemäß NMR) lieferte.
  • Beispiel 34: Herstellung von E-Cyclosporin-A-dien (ISATX247)
  • Der trimethylsilylgeschützte Cyclosporin-A-β-trimethylsilylalkohol (500 mg, 1 Äquivalent) wurde in Dichlormethan gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 2°C gekühlt und mit Bortrifluoriddiethyletherkomplex (5 Äquivalente) behandelt. Nach 1 Stunde wurden Wasser (20 ml) und Dichlormethan (20 ml) zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser (20 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck eingeengt, was direkt Cyclosporin-A-dien (ISATX247) als E- und Z-Doppelbindungsisomeren in einer Mischung von 91:9 bezogen auf Gewicht lieferte (gemäß NMR).
  • Beispiel 35: Abspaltung der Schutzgruppen bei mit Trimethylsilyl geschütztem Cyclosporin-A-dien
  • Mit Trimethylsilyl geschütztes Cyclosporin-A-dien wurde in Methanol (10 Gew.-% in der Lösung) gelöst. Diese Lösung wurde mit 1 M wässriger Salzsäurelösung (1 Äquivalent) behandelt. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden Wasser und Ethylacetat zugegeben. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und wieder mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck eingeengt, was Cyclosporin-A-dien (ISATX247) lieferte.
  • Beispiel 36: Epoxidierung von Acetylcyclosporin A
  • Acetylcyclosporin A (2,0 g, 1,61 mmol) wurde in Acetonitril (30 ml) gelöst. 1,3-Diacetoxyaceton (0,14 g, 0,8 mmol) wurde zugegeben und anschließend 0,0004 M wässriges Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (20 ml) und Natriumbicarbonat (0,405 g, 4,82 mmol). Zu der gerührten Mischung wurde Oxon (43,8% KHSO5) (2,23 g, 6,43 mmol) portionsweise 2 Stunden lang zugegeben. Der pH-Wert wurde durch konstante Zugabe von 1 n NaOH (Gesamtmenge 6,4 ml) unter Verwendung eines pH-Stat auf 8,2 gehalten. Die Temperatur wurde auf 22 bis 25°C gehalten durch gelegentliches Kühlen unter Verwendung eines Kaltwasserbades. Nach 2,5 Stunden wurde die Reaktionsmischung durch wenige Tropfen Natriumbisulfitlösung abgesättigt. Wasser (100 ml) wurde zugegeben und die Mischung zweimal mit tert.-Butylmethylether (100 ml, dann 75 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit verdünntem wässrigem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen, vereinigt, über Na2SO4 getrocknet und eingeengt, was rohes Acetylcyclosporin-A-epoxid (1,92 g, 95%; HPLC: 99,4% Fläche) als weißen festen Schaum lieferte.
  • Beispiel 37: Herstellung von Acetylcyclosporin-A-aldehyd
  • Rohes Acetylcyclosporin-A-epoxid (1,92 g, 1,52 mmol) wurde in Acetonitril (25 ml) gelöst. Wasser (20 ml) wurde zugegeben und anschließend Natriumperiodat (489 mg, 2,28 mmol) und 0,5 M Schwefelsäure (3,05 ml, 1,52 mmol). Die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden lang bei 40°C gerührt, dann wurde überschüssiges Natriumperiodat abgesättigt durch Zugabe von wässrigem Natriumbisulfit. Verdünntes wässriges Natriumchlorid (100 ml) wurde zugegeben und die Mischung zweimal mit tert.-Butylmethylether (jeweils 100 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit verdünntem wässrigen Natriumchlorid (100 ml) gewaschen, vereinigt, über Na2SO4 getrocknet und eingeengt, was rohen Acetylcyclosporin-A-aldehyd (1,74 g, 92%; HPLC: 95,7% Fläche) als weißen Schaum lieferte. Das rohe Produkt wurde über Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 40% Aceton/60% Hexan als Elutionsmittel, was das Produkt (1,41 g, 71% basierend auf Acetylcyclosporin A; HPLC: 100% Fläche) als weißen festen Schaum lieferte.
  • Beispiel 38: Herstellung von Acetylcyclosporin-A-aldehyd unter Verwendung eines Eintopfverfahrens
  • Acetylcyclosporin A (2,0 g, 1,61 mmol) wurde in Acetonitril (30 ml) gelöst. 1,3-Diacetoxyaceton (0,084 g, 0,48 mmol) wurde zugegeben und anschließend 0,0004 M wässriges Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (20 ml) und Natriumbicarbonat (0,405 g, 4,82 mmol). Zu der gerührten Mischung wurde Oxon (43,8% KHSO5) (1,67 g, 4,82 mmol) portionsweise 2 Stunden lang zugegeben. Der pH-Wert wurde durch konstante Zugabe von 1 n NaOH (Gesamtmenge 3,4 ml) unter Verwendung eines pH-Stat auf 8,2 gehalten. Die Temperatur wurde auf 20 bis 25°C gehalten. Nach 3,5 Stunden wurde 0,5 M Schwefelsäure (5 ml, 2,5 mmol) zu der Reaktionsmischung zugegeben und anschließend wenige Tropfen konzentrierte Schwefelsäure, bis ein pH-Wert von 1,3 erreicht war. Dann wurde Natriumperiodat (516 mg, 2,41 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang und 22 Stunden lang bei 40°C gerührt. Wasser (100 ml) wurde zugegeben und die Mischung zweimal mit tert.-Butylmethylether (100 ml, dann 75 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit verdünntem wässrigen Natriumchlorid (100 ml) gewaschen, vereinigt, über Na2SO4 getrocknet und eingeengt, was rohen Acetylcyclosporin-A-aldehyd (1,9 g, 96%; HPLC: 83,4% Fläche) als weißen Schaum lieferte. Das rohe Produkt wurde über Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 40% Aceton/60% Hexan als Elutionsmittel, was das Produkt (1,35 g, 68% bezogen auf Acetylcyclosporin A; HPLC: 100% Fläche) als weißen festen Schaum lieferte.
  • Beispiel 39 (ISO): Wittig-Reaktion von Acetylcyclosporin-A-aldeyhd mit 3-Dimethylaminopropyltriphenylphosphoryliden
  • Eine stereoselektive Synthese von 1,3-Dienen wurde von E. J. Corey und M. C. Desai in Tetrahedron Letters, Bd. 26, Nr. 47, S. 5747–8 (1985) beschrieben. Diese Literaturstelle offenbart, dass das Ylid, das durch Behandeln von 3-(Dimethylamino)propyltriphenylphosphoran mit Kaliumhexamethyldisilazid erhalten wird, einer Wittig-Reaktion mit einem Aldehyd unterzogen werden kann unter selektiver Bildung eines Z-Alkenyldimethylamins. Die Oxidation des Amins mit m-Chlorperbenzoesäure ergibt das entsprechende N-Oxid, das dann erhitzt werden kann, was als Cope-Eliminierung bekannt ist, unter Bildung des gewünschten 1,3-Diens, bei dem die Konfiguration des während der Wittig-Stufe gebildeten Olefins ausschließlich Z oder cis ist.
  • Analog kann das Z-Isomer von ISATX247 hergestellt werden, indem Acetylcyclosporin-A-aldehyd mit einem Ylid umgesetzt wird, das erhalten wird, indem 3-(Dimethylamino)propyltriphenylphosphoniumbromid mit Kaliumhexamethyldisilazid umgesetzt wird. Das entstehende Zwischenprodukt durchläuft dann eine Oxidation gefolgt von einer Cope-Eliminierung, was Acetyl-(Z)-ISATX247 ergibt. Die Abspaltung der Schutzgruppen unter Verwendung einer Base führt zu (Z)-ISATX247. Das Oxidationsreagenz kann Metachlorperbenzoesäure sein.
  • Zu einer gerührten Suspension von 3-Dimethylaminopropyltriphosphoniumbromid (2,5 g, 5,83 mmol) in wasserfreiem Toluol (20 ml) wurde Kaliumhexamethyldisilazid (11,6 ml, 5,8 mmol, 0,5 M Lösung in Toluol) über eine Spritze zugegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die rot gefärbte Lösung zentrifugiert und der Überstand in einen Reaktionskolben über eine Kanüle überführt. Zu dem Feststoff wurde wasserfreies Toluol (10 ml) zugegeben, gerührt und zentrifugiert. Der Überstand wurde in den Reaktionskolben überführt und zu dem vereinigten rot gefärbten Ylid wurde OAc-CsA-CHO (1,44 g, 1,17 mmol) zugegeben. Das Rühren wurde weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, bis sich die Farbe in hellgelb verwandelte. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc (50 ml) verdünnt und aufeinander folgend mit gesättigter NaHCO3-Lösung (50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Trocknen und Lösungsmittelentfernung lieferten einen fahlgelben Feststoff. Die Chromatographie über eine Silicagelsäule und die Elution mit Aceton-Hexan-Mischung (Gradient: 10 bis 75% Aceton und 90 bis 25% Hexan) entfernte alle mit Phosphor in Beziehung stehenden Verunreinigungen. Eine weitere Elution mit Aceton lieferte das gewünschte Produkt als farblosen Feststoff. (1,28 g, 84% Ausbeute).
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2,23 (s, 6H), 2,03 (s, 3H);
    13C-NMR (300 MHz, CDCl3): 129,33, 126,95;
    MS m/z: 1301 (M+), 1324 (M + Na+).
  • Umwandlung in N-Oxid
  • Zu einer gerührten und gekühlten (0°C) Lösung der Dimethylaminoverbindung, die bei der Wittig-Reaktion erhalten worden war (0,44 g, 0,34 mmol) in CHCl3 (3 ml) wurde eine Lösung von m-CPBA (0,07 g, 0,405 mmol) in CHCl3 (2 ml) zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren wurde Dimethylsulfid (0,5 ml) und anschließend CH2Cl2 (50 ml) zugegeben. Die Aufarbeitung durch Waschen mit NaHCO3-Lösung (25 ml) und Wasser (25 ml), das Trocknen und die Lösungsmittelentfernung lieferten einen Feststoff (0,43 g).
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 3,19 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 2,03 (s, 3H);
    13C-NMR (300 MHz, CDCl3): 131,89, 124,13;
    MS m/z: 1340 (M + Na+).
  • Cope-Eliminierung des N-Oxids. Herstellung des (Z)-Isomers von Acetyl-ISATX247
  • Das N-Oxid (350 mg) wurde rein gerührt und im Vakuum 2 Stunden lang auf 100°C erhitzt. Es wurde dann über eine Silicagelsäule gegeben. Die Elution mit Aceton-Hexan-Mischung (Gradient: 5 bis 25% Aceton und 95 bis 75% Hexan) lieferte einen farblosen Feststoff (314 mg).
    1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6,49 (dt, J = 16,99, 10,5 Hz, 1H);
    13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 132,20, 131,09, 129,70, 116,85;
    MS m/z: 1279 (M + Na+).
  • (Z)-Isomer von ISATX247
  • Zu einer Lösung von (Z)-Acetyl-ISATX247 (50 mg) in MeOH (4 ml) wurde Wasser (1,5 ml) und K2CO3 (60 mg) zugegeben und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Von der Reaktionsmischung wurde das Lösungsmittel abgezogen und es wurde mit EtOAc (20 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen. Das Trocknen und die Lösungsmittelentfernung lieferten einen farblosen Feststoff.
    1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6,58 (dt, J = 16,99, 10,5 Hz, 1H);
    MS m/z: 1236,8 (M + Na+).
  • Die entstehende Verbindung war das Z-Isomer von ISATX247. E-Isomer konnte mit NMR nicht nachgewiesen werden.

Claims (36)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass: a) ein Acetyl-η-halogencyclosporin A mit einer ersten Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triarylphosphin, Trialkylphosphin, Arylalkylphosphin und Triarylarsin erhitzt wird, um ein Zwischenprodukt zu erzeugen; b) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens hergestellt wird, indem das Zwischenprodukt mit Formaldehyd gerührt wird und c) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung der (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens mit einer Base behandelt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Acetyl-η-halogencyclosporin A Acetyl-η-bromcyclosporin A ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin die Stufe beinhaltet, dass der η-Kohlenstoff der Seitenkette des 1-Aminosäurerestes von Cyclosporin A halogeniert wird unter Verwendung einer Bromierungsreaktion, die durchgeführt wird, indem Acetylcyclosporin A mit N-Bromsuccinimid und Azobisisobutyronitril am Rückfluss erhitzt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Verbindung Triphenylphosphin ist und das Zwischenprodukt Triphenylphosphoniumhalogenid von Acetylcyclosporin A ist.
  5. Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass: a) ein Acetylcyclosporin-A-aldehyd in eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens umgewandelt wird, indem Acetylcyclosporin-A-aldehyd mit einem Phosphorylid über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und b) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung der (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens mit einer Base versetzt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das in der Wittig-Reaktion verwendete Phosphorylid hergestellt wird aus einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triphenylphosphin, Triarylphosphin, Trialkylphosphin und Arylalkylphosphin.
  7. Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass: a) der β-Alkohol von Cyclosporin A geschützt wird, indem ein erstes Acetylcyclosporin-A-Zwischenprodukt gebildet wird; b) das Acetylcyclosporin A oxidiert wird, um einen Acetylcyclosporin-A-aldehyd als zweites Zwischenprodukt zu erzeugen; c) das Acetylcyclosporin-A-aldehydzwischenprodukt in eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens umgewandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und d) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens mit einer Base behandelt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Oxidationsstufe mit einem Oxidationsmittel durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ozon, Kaliumpermanganat, Rutheniumtetroxid, Osmiumtetroxid, Osmiumtetroxid auf einem Polymerträger und Rutheniumchlorid.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Rutheniumtetroxid und Rutheniumchlorid als Oxidationsmittel verwendet werden mit einem Co-Oxidationsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Periodat und Hypochlorit.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Oxidationsmittel Rutheniumtetroxid und Rutheniumchlorid mit Acetonitril verwendet werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 7, wobei die Base, die verwendet wird, um das Acetyl-1,3-dien zu behandeln, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumalkoxid und Kaliumalkoxid.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zwischenprodukt Triphenyl- oder Trialkylphosphoniumbromid von Acetylcyclosporin A ist und wobei die Stufe, bei der das Zwischenprodukt mit Formaldehyd gerührt wird, in Gegenwart von Lithiumhalogenid erfolgt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Acetylcyclosporinaldehyd hergestellt wird mit einem Verfahren, das die Stufen aufweist, dass a) der β-Alkohol von Cyclosporin A geschützt wird, indem Acetylcyclosporin A gebildet wird und b) Acetylcyclosporin A mit Ozon als Oxidationsmittel oxidiert wird, gefolgt von einer Aufarbeitung mit einem Reduktionsmittel.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Ozonolysestufe bei einer Temperatur im Bereich von –80 bis 0°C erfolgt.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reduktionsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Trialkylphosphinen, Triarylphosphinen und Trialkylaminen.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reduktionsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Alkylarylsulfiden, Thiosulfaten und Dialkylsulfiden.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Reduktionsmittel Dimethylsulfid ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Reduktionsmittel Tributylphosphin ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Reduktionsmittel Trialkylamin ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Reduktionsmittel Triethylamin ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei das für die Ozonolyse von Acetylcyclosporin A verwendete Lösungsmittel ein niedriger Alkohol ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Alkohol Methanol ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das für die Ozonolyse verwendete Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Dichlormethan und einer Mischung von Dichlormethethan und einem niedrigen Alkohol.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der niedrige Alkohol Methanol ist.
  25. Verfahren zur Herstellung einer Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass: a) das Zwischenprodukt Acetylcyclosporin-A-aldehyd in eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens umge wandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid umgesetzt wird, das aus einem Tributylallylphosphoniumhalogenid oder Triphenylphosphoniumhalogenid über eine Wittig-Reaktion hergestellt wurde, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und b) eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem die Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des Acetyl-1,3-diens mit einer Base behandelt wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Phosphoniumhalogenid Phosphoniumbromid ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Wittig-Reaktion in einem Lösungsmittel durchgeführt wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetrahydrofuran und Toluol, und wobei das Lösungsmittel in Gegenwart einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, die von Butyllithium, Natriumniedrigalkoxid, Kaliumniedrigalkoxid und Carbonat gebildet wird, bei einer Temperatur zwischen –80 und 110°C verwendet wird.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Kaliumniedrigalkoxid Kalium-tert.-butoxid ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Lösungsmittel Tetrahydrofuran ist und in Gegenwart von Kalium-tert.-butoxid bei einer Temperatur zwischen –70 und –100°C verwendet wird.
  30. Verfahren zur Herstellung einer Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei das Verfahren einen Syntheseweg beinhaltet, bei dem ein (E)-Isomer und ein (Z)-Isomer von ISATX247 hergestellt wird, so dass das (E)-Isomer und das (Z)-Isomer in der Mischung in einem vorbestimmten Verhältnis vorhanden sind, wobei der Syntheseweg die folgenden Stufen aufweist: a) dass der β-Alkohol der ersten Aminosäure von Cyclosporin A geschützt wird; b) das geschützte Cyclosporin A oxidiert wird, um einen geschützten Cyclosporin-A-aldehyd herzustellen; c) der geschützte Cyclosporin-A-aldehyd in eine Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren des geschützten 1,3-Diens umgesetzt wird, indem der geschützte Cyclosporin-A-aldehyd mit einem Phosphorylid über eine Wittig-Reaktion umgesetzt wird, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und d) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren hergestellt wird, indem bei dem geschützten 1,3-Dien die Schutzgruppen abgespalten werden.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der β-Alkohol der ersten Aminosäure von Cyclosporin A geschützt wird, indem Cyclosporin A mit einem Reagenz umgesetzt wird, was ein geschütztes Cyclosporin A ergibt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetatestern, Benzoatestern, substituierten Benzoatestern, Ethern und Silylethern.
  32. Verfahren zur Herstellung einer Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247, wobei der Syntheseweg die Stufen aufweist, dass: a) einen TMS-Cyclosporin-A-aldehyd als Zwischenprodukt in eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren des TMS-1,3-diens umgewandelt wird, indem das Zwischenprodukt mit einem Phosphorylid umgesetzt wird, das aus einem Tributylallylphosphoniumhalogenid oder Triphenylphosphoniumhalogenid über eine Wittig-Reaktion hergestellt wurde, gegebenenfalls in Gegenwart eines Lithiumhalogenids und b) eine Mischung von (E)- und (Z)-Isomeren von ISATX247 hergestellt wird, indem bei der Mischung aus (E)- und (Z)-Isomeren des TMS-1,3-diens mit einer Säure die Schutzgruppen abgespalten werden.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Phosphoniumhalogenid ein Phosphoniumbromid ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei Stufe a) in einem Lösungsmittel durchgeführt wird, das Tetrahydrofuran und/oder Toluol aufweist, das in Gegenwart von Natrium- oder Kaliumniedrigalkoxid, oder einem Carbonat bei einer Temperatur zwischen –80 und 110°C eingesetzt wird.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Natrium- oder Kaliumniedrigalkoxid Kalium-tert.-butoxid ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Säure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Salzsäure, Essigsäure, Citronensäure, einer Lewis-Säure und auf HF basierenden Reagenzien.
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