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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität unter 35 U.S.C. § 119(e)
der U.S. Provisorischen Patentanmeldungen 60/277.081, eingereicht
am 19. März
2001 mit dem Titel „Nucleic
Acid Directed Synthesis of Chemical Compounds"; 60/277.094, eingereicht am 19. März 2001
mit dem Titel „ Approaches
to Generating New Molecular Function"; und 60/306,691, eingereicht am 20.
Juli 2001 mit dem Titel „Approaches
to Generating New Molecular Function", und die gesamten Inhalte von jeder
dieser Anmeldungen werden durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Der
klassische „chemische
Ansatz", um Moleküle mit neuen
Funktionen zu erzeugen, wurde über
das letzte Jahrhundert in Anwendungen, die von der Arzneimittelentdeckung über synthetische
Methologie bis hin zu Materialwissenschaft reichen, extensiv verwendet.
Bei diesem Ansatz (1, schwarz), synthetisieren
oder isolieren Forscher Kandidatenmoleküle, untersuchen diese Kandidaten
auf gewünschte
Eigenschaften, bestimmen die Strukturen von aktiven Verbindungen,
wenn unbekannt, formulieren Struktur-Aktivitätsbeziehungen basierend auf
den Untersuchungs- und Strukturdaten, und synthetisieren dann eine
neue Generation von Molekülen,
die entwickelt sind, um verbesserte Eigenschaften zu besitzen. Während kombinatorische
Chemieverfahren (siehe, zum Beispiel, A.V. Eliseev und J. M. Lehn.
Combinatorial Chemistry In Biology 1999, 243, 159–172; K.
W. Kuntz, M. L. Snapper und A. H. Hoveyda. Current Opinion in Chemical
Biology 1999, 3, 313–319;
D. R. Liu und P.G. Schultz. Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 1999, 38,
36) den Durchsatz dieses Ansatzes erhöht haben, bleiben seine fundamentalen
Beschränkungen
unverändert.
Mehrere Faktoren beschränken
die Wirksamkeit des chemischen Ansatzes, um molekulare Funktion
zu erzeugen. Erstens ist unsere Fähigkeit, die Strukturänderungen
genau vorherzusagen, die zu einer neuen Funktion führen werden,
aufgrund feiner konformativer Umordnungen vom Molekül, unvorhergesehener
Lösungsmittelintreraktionen
oder unbekannter stereochemischer Anforderungen der Bindung oder
Reaktionsvorgänge
unzureichend. Die resultierende Komplexität der Struktur- Aktivitätsbeziehungen
beschränken
häufig
den Erfolg der rationalen Ligand- oder Katalysatorentwicklung einschließlich jenen
Anstrengungen, die in einer Hochdurchsatzweise ausgeführt sind.
Zweitens, das Erfordernis, jedes Mitglied einer Sammlung von Kandidaten
eher zu untersuchen oder zu screenen als auszuwählen, begrenzt die Anzahl von
Molekülen,
die je Experiment gesucht werden können. Schlussendlich stellt
das Fehlen eines Weges, synthetische Moleküle zu amplifizieren, Anforderungen
an die minimale Menge an Material, das für die Charakterisierung, das
Screening und die Strukturaufklärung
hergestellt werden muss. Demzufolge kann es schwierig sein, Bibliotheken
mit mehr als ungefähr
106 unterschiedlichen synthetischen Verbindungen
herzustellen.
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Im
Gegensatz dazu erzeugt die Natur Proteine mit neuen Funktionen unter
Verwendung einer grundsätzilch
unterschiedlichen Methode, die viele dieser Beschränkungen
bewältigt.
Bei diesem Ansatz (1, grau) induziert ein Protein
mit gewünschten
Eigenschaften das Überleben
und die Amplifikation der Information, die das Protein kodiert.
Diese Information wird durch spontane Mutation und DNA-Rekombination
diversifiziert, und dann in eine neue Generation von Kandidatenproteinen
unter Verwendung der Ribosome translatiert. Die Leistung dieses
Vorgangs wird anerkannt (siehe F. Arnold Acc. Chem. Res. 1998, 31,
125; F.H. Arnold et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 54–59; J.
Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284–90) und wird
durch die Tatsache bewiesen, dass Proteine und Nukleinsäure die
Lösungen
zu vielen komplexen chemischen Problemen dominieren trotz ihrer
beschränkten
chemischen Funktionalität.
Offensichtlich, im Gegensatz zu dem oben beschriebenen linearen
chemischen Ansatz, bilden die von der Natur verwendeten Schritte
einen Zyklus der molekularen Evolution. Die von diesem Prozess entstehenden
Proteine wurden eher direkt ausgewählt als einfach auf gewünschte Aktivitäten gescreent.
Da die Information, die entstehende Proteine kodieren (DNA), amplifiziert
werden kann, kann in der Theorie ein einzelnes Proteinmolekül mit gewünschter
Aktivität zu
dem Überleben
und zur Vermehrung der DNA, die seine Struktur kodiert, führen. Die
verschwindend kleinen Mengen an Material, die benötigt werden,
um in einem Zyklus der Molekularevolution teilzunehmen, ermöglicht das
Herstellen von Bibliotheken mit viel größerer Diversität, als jene,
die durch chemische Ansätze
synthetisiert werden und auf gewünschte
Funktion in kleinen Volumina selektiert werden.
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In
Anerkennung der Leistung und Wirksamkeit des Ansatzes der Natur
haben Forscher die molekulare Evolution verwendet, um viele Proteine
und Nukleinsäure
mit neuartigen Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften zu erzeugen
(siehe zum Beispiel J. Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol.
1999, 3, 284–90;
C. Schmidt-Dannert et al. Trends Biotechnol. 1999, 17, 135–6; D. S.
Wilson et al. Annu. Rev. Biochem. 1999,68, 611–47). Durch Forscher entwickelte
Proteine und Nukleinsäuren
haben den Nutzen als Forschungswerkzeuge, diagnostische und industrielle
Reagenzien und Therapeutika demonstriert, und haben unser Verständnis der
molekularen Interaktionen außerordentlich
vergrößert, die
Proteine und Nukleinsäuren
mit Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften ausstatten (siehe,
M. Famulok et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 320–7).
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Trotz
des wirksamen Ansatzes der Natur, Funktion zu erzeugen, ist die
molekulare Evolution der Natur auf zwei Arten von „natürlichen" Molekülen Proteine
und Nukleinsäuren
beschränkt,
da soweit die Information in der DNA nur in ein Protein oder in
eine andere Nukleinsäure
translatiert werden kann. Viele synthetische Moleküle von Interesse
repräsentieren
im Allgemeinen keine Nukleinsäurerückgrate,
und die Verwendung von DNA-Matrizenbasierenden
Synthese, um DNA-Sequenzen in synthetische kleine Moleküle zu translatieren, würde nur
weitgehend brauchbar sein, wenn synthetische Moleküle außer Nukleinsäuren und
Nukleinsäure-Analoga
in einer DNA-Matrizenbasierenden Art und Weise synthetisiert werden
könnten.
Ein idealer Ansatz, um funktionelle Moleküle zu erzeugen, würde die
leistungsstärksten
Aspekte der molekularen Evolution mit der Flexibilität der synthetischen
Chemie verbinden. Offensichtlich würde das Ermöglichen der Evolution von nicht-natürlichen
synthetischen kleinen Molekülen
und Polymeren, ähnlich
zu dem Weg, wie die Natur Biomoleküle entwickelt, zu viel wirksameren
Verfahren zum Entwickeln von neuen synthetischen Liganden, Rezeptoren,
Katalysatoren führen,
die unter Verwendung des rationellen Designs schwierig oder unmöglich herzustellen
sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erkennung des Bedarfs, in der Lage zu sein, Klassen von Molekülen abgesehen
von Nukleinsäuren
und Proteinen zu amplifizieren und zu entwickeln, führte zu
der vorliegenden Erfindung, die die Verfahren und Zusammensetzungen
für die
Matrizen-gerichtete Synthese, Amplifikation und Entwicklung von
Molekülen vorsieht.
Im Allgemeinen verwenden diese Verfahren eine ableitbare Matrize,
um die Synthese einer chemischen Verbindung oder Bibliothek von
chemischen Verbindungen (d.h., die Matrize kodiert tatsächlich die
Synthese einer chemischen Verbindung) zu lenken. Basierend auf einer
Bibliothek, die unter Verwendung einer Matrize wie einer Nukleinsäure, kodiert
und synthetisiert ist, werden Verfahren zum Amplifizieren, Entwickeln und
Screenen der Bibliothek bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen
von speziellem Interesse sind die chemischen Verbindungen, Verbindungen,
die keine Nukleinsäure
oder Analoga davon sind, oder diesen nicht ähnlich sind. In bestimmten
Ausführungsformen
sind die chemischen Verbindungen dieser Matrizen-kodierten kombinatorischen
Bibliotheken Polymere und sind noch mehr bevorzugt unnatürliche Polymere
(d. h. ausgeschlossen sind natürliche
Peptide, Proteine und Polynukleotide). In anderen Ausführungsformen
sind die chemischen Verbindungen kleine Moleküle.
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In
bestimmten Ausführungsformen
weist das Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung oder der Bibliothek
von Verbindungen zuerst das Bereitstellen einer oder mehrer Nukleinsäurematrizen
auf, welche eine oder mehrere Nukleinsäurematrizen gegebenenfalls
eine damit assoziierte reaktive Einheit haben. Die Nukleinsäurematrize
wird dann mit einer oder mehreren Transfereinheiten in Kontakt gebracht,
die ausgebildet sind, um einen ersten Anteil, ein Antikodon, welcher
an eine Sequenz der Nukleinsäure
hybridisiert hat, und mit einem zweiten Anteil, einer reaktiven
Einheit, assoziiert ist, welche eine Baueinheit der zu synthetisierenden
Verbindung enthält.
Sobald diese Transfereinheiten an die Nukleinsäurematrize in einer sequenz-spezifischen Weise
hybridisiert haben, kann die Synthese der chemischen Verbindung
aufgrund der Interaktionen der reaktiven Anteile, die auf diesen
Transfereinheiten und/oder Nukleinsäurematrizen vorhanden sind,
stattfinden. Signifikanterweise kann die Sequenz der Nukleinsäure später bestimmt
werden, um die synthetische Historie der angehefteten Verbindung
und dadurch seine Struktur zu dekodieren. Es wird erkannt werden,
dass das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden kann, um
jeweils ein Molekül
zu synthetisieren, oder kann verwendet werden, um Tausende bis Millionen
von Verbindungen unter Verwendung von kombinatorischen Verfahren zu
synthetisieren.
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Es
wird erkannt, dass auf diese Art und Weise synthetisierte Bibliotheken
(d.h. die durch eine Nukleinsäure
kodiert werden) den Vorteil haben, amplifizierbar und ableitbar
zu sein. Sobald ein Molekül
identifiziert ist, kann seine Nukleinsäurematrize, abgesehen von dem
Wirken als ein Tag, welches verwendet wird, um die angeheftete Verbindung
zu identifizieren, unter Verwendung von Standard-DNA-Techniken,
wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Diese
amplifzierte Nukleinsäure
kann dann verwendet werden, um mehr der gewünschten Verbindung zu synthetisieren.
In bestimmten Ausführungsformen
werden während des
Amplifikations-Schrittes Mutationen in die Nukleinsäure eingeführt, um
eine Population von chemischen Verbindungen zu erzeugen, die mit
der Stammverbindung verwandt sind, aber an einer oder mehreren Stellen modifiziert
sind. Die mutierten Nukleinsäuren
können
dann verwendet werden, um eine neue Bibliothek von verwandten Verbindungen
zu synthetisieren. Auf dieser Weise kann die zu screenende Bibliothek
entwickelt werden, um mehrere Verbindungen mit der gewünschten
Aktivität
zu enthalten oder um Verbindungen mit einem höheren Grad an Aktivität zu enthalten.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine
große
Anzahl von chemischen Verbindungen zu synthetisieren. In bestimmten
Ausführungsformen
werden die Verfahren verwendet, um unnatürliche Polymere (d.h. ausschließlich von
Polynukleotiden und Peptiden) zu synthetisieren und zu entwickeln,
welche unter Verwendung von derzeit verfügbaren Standardtechniken nicht
amplifiziert oder entwickelt werden können. In bestimmten anderen
Ausführungsformen
werden die erfindungsgemäßen Verfahren und
Zusammensetzungen für
die Synthese von kleinen Molekülen
benutzt, die typischerweise nicht polymer sind. In noch anderen
Ausführungsformen
wird das Verfahren für
das Erzeugen von nicht natürlichen
Nukleinsäure-Polymeren
verwendet.
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Die
vorliegende Erfindung bietet auch Transfer-Moleküle (z.B. Nukleinsäure-Matrizen
und/oder Transfereinheiten), die beim Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich
sind. Diese Transfermoleküle enthalten üblicherweise
einen Abschnitt, der zum Hybrisieren an eine Sequenz der Nukleinsäure in der
Lage ist, und einen zweiten Abschnitt wie Monomeren, anderen Baueinheit,
oder Reaktanten, die in die zu synthetisierende Endverbindung eingebaut
werden. Es ist erkennbar, dass die zwei Abschnitte auf dem Transfermolekül vorzugsweise
miteinander, entweder direkt oder durch einen Linker-Anteil, assoziiert
sind. Es ist ebenfalls erkennbar, dass die reaktive Einheit und
das Antikodon in demselben Molekül
vorhanden sein können
(z.B. ein nicht-natürliches
Nukleotid mit darin eingebauter Funktionalität).
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Die
vorliegende Erfindung bietet ebenfalls, Ausrüstungssätze und Zusammensetzungen,
die zum Ausführen
der erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich
sind. Diese Ausrüstungssätze können Nukleinsäure-Matrizen,
Transfer-Moleküle,
Monomere, Lösungsmittel,
Puffer, Enzyme, Reagenzien für
die PCR, Nukleotide, kleine Molekülgerüste, etc. enthalten. Der Ausrüstungssatz
kann auch bei der Synthese einer bestimmten Art von unnatürlichem
Polymer oder kleinem Molekül
verwendet werden.
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Definitionen
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Der
Begriff Antikörper
bezieht sich auf ein Immunglobulin, ob natürlich oder vollkommen oder
teilweise synthetisch hergestellt. Alle Derivate davon, welche eine
spezifische Bindungsfähigkeit
aufrechterhalten, sind ebenfalls in diesem Begriff eingeschlossen.
Der Begriff deckt jedes Protein mit einer Bindungsdomäne, welche homolog
oder größtenteils
homolog zu der Immunoglobulin-Bindungsdomäne ist, ab. Diese Proteine
können von
natürlichen
Quellen abgeleitet sein, teilweise oder vollkommen synthetisch produziert
werden. Ein Antikörper
kann monoklonal oder polyklonal sein. Der Antikörper kann ein Mitglied einer
beliebigen Immunglobulin Klasse sein, einschließlich irgendeiner der menschlichen
Klassen: IgG, IgM, IgA, IgD, und IgE. Derviate der IgG Klasse werden
jedoch in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
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Der
Begriff „assoziiert
mit" wird verwendet,
um die Interaktion zwischen oder unter zwei oder mehreren Gruppen,
Anteilen, Verbindungen, Monomeren, etc. zu beschreiben. Wenn zwei
oder mehrere Einheiten untereinander „assoziiert mit" sind, wie hierin
beschrieben, sind sie durch eine direkte oder indirekte kovalente, oder
nicht-kovalente Interaktion verbunden. Vorzugsweise ist die Assoziation
kovalent. Die kovalente Assoziation kann über eine Amid-, Ester-, Kohlenstoff-Kohlenstoff,
Disulfid-, Carbamat-, Ether- oder Karbonatbindung sein. Die kovalente
Assoziation kann ein Linker-Anteil, wie einen photospaltbaren Linker
enthalten. Zu wünschenswerten
nicht-kovalenten Interaktionen zählen
Wasserstoffbindung, van der Waals Interaktionen, hydrophobe Interaktionen,
magnetische Interaktionen, elektrostatische Interaktionen etc. Ebenfalls
können
zwei oder mehrere Einheiten oder Mittel miteinander „assoziiert" sein, in dem sie
zusammen in derselben Zusammensetzung vorhanden sind.
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Ein
biologisches Makromolekül
ist ein Polynukleotid (z.B. RNA, DNA, RNA/DNA Hybrid), Protein,
Peptid, Lipid, natürliches
Produkt oder Polysaccharid. Das biologische Markomolekül kann natürlich vorkommen oder
nicht natürlich
vorkommen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das biologische
Markomolekül ein
Molekulargewicht von mehr als 500 g/mol auf.
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Polynukleotid,
Nukleinsäure
oder Olinukleotid bezieht sich auf ein Polymer von Nukleotiden.
Das Polymer kann natürliche
Nukleoside (d.h. Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin, Uridin,
Deoxyadenosin, Deoxythymidin, Deoxyguanosin, und Deoxycytidin),
Nukleosid-Analoga (z.B. 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosin,
Pyrrolpyrimidin, 3-Methyladenosin,
5-Methylcytidin, C5-Bromuridin, C5-Fluoruridin, C5-Ioduridin, C5-Propynyluridin, C5-Propynylcytidin,
C5-Methylcytidin, 7-Deazaadenosin, 7-Deazaguanosin, 8-Oxoadenosin, 8-Oxoguanosin,
O(6)-Methylguanin, und 2-Thiocytidin), chemisch modifizierte Basen,
biologisch modifizierte Basen (z.B. methylierte Basen), Einschlussbasen,
modifizierte Zucker (z.B. 2'-Fluorribose,
Ribose, 2'-Deoxyribose,
Arabinose, und Hexose) oder modifizierte Phosphatgruppen (z.B. Phosphorthioate
und 5'-N-Phosphoramidit-Bindungen)
beinhalten.
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Ein
Protein weist ein Polymer von Aminosäureresten, die zusammen durch
Peptidbindungen gebunden sind, auf. Der Begriff, wie hierin verwendet,
bezieht sich auf Proteine, Polypeptide, und Peptide jeglicher Größe, Struktur
oder Funktion. Typischerweise wird ein Protein zumindest drei Aminosäuren lang
sein. Ein Protein kann sich auf ein individuelles Protein oder eine
Sammlung von Proteinen beziehen. Ein Protein kann sich auf ein Protein
voller Länge
oder ein Fragment eines Proteins beziehen. Erfindungsgemäße Proteine
enthalten vorzugsweise nur natürliche
Aminosäuren,
obwohl nicht-natürliche
Aminosäuren
(d.h. Verbindungen, die in der Natur nicht vorkommen, aber die in
eine Polypeptidkette eingebaut werden könnten; siehe z.B. http://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif
welche Strukturen von nicht natürlichen
Aminosäuren
anzeigt, die erfolgreich in funktionelle Ionenkanäle eingebaut
wurden) und/oder Aminosäure-Analoga,
die im Stand der Technik bekannt sind, können alternativ eingesetzt
werden. Ebenfalls können
eine oder mehrere der Aminosäuren
in einem erfindungsgemäßen Protein
modifiziert sein, z.B. durch die Addition einer chemischen Einheit,
wie einer Kohlenhydratgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Phosphatgruppe,
einer Farnesyl-Gruppe, einer Isofarnesyl-Gruppe, einer Fettsäuregruppe,
einem Linker für
die Konjugation, Funktionalisierung, oder andere Modifikationen,
etc. Ein Protein kann ebenfalls ein einzelnes Molekül sein,
oder kann ein multi-molekularer Komplex sein. Ein Protein kann nur
ein Fragment eines natürlich
vorkommenden Proteins oder Peptids sein, ein Protein kann natürlich vorkommen,
rekombinant, oder synthetisch, oder jede Kombination von diesen sein.
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Der
Begriff „kleines
Molekül", so wie hierin verwendet,
bezieht sich auf eine nicht-peptidische,
nicht-oligomere organische Verbindung, die entweder in einem Labor
synthetisiert oder in der Natur gefunden wird. Kleine Moleküle, wie
hierin verwendet, können
sich auch auf Verbindungen beziehen, die „Naturprodukt-ähnlich" sind, jedoch ist
der Begriff „kleines
Molekül" nicht auf „Naturprodukt-ähnliche
Verbindungen beschränkt. Vielmehr
ist ein kleines Molekül
typischerweise dadurch charakterisiert, dass es eine oder mehrere
der folgenden Charakteristiken besitzt, einschließlich mehreren
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindungen mit mehreren Stereo-Zentren,
mit mehreren funktionellen Gruppen, mit zumindest zwei unterschiedlichen
Arten von funktionellen Gruppen und mit einem Molekulargewicht von weniger
als 1.500, obwohl diese Charakterisierung nicht beabsichtigt ist,
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung einschränkend zu sein.
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Der
Begriff „kleines
Molekülgerüst", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf eine chemische Verbindung mit zumindest einer Stelle
für die
Funktionalisierung. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das kleine Molekülgerüst eine
Vielzahl von Stellen für
die Funktionalisierung aufweisen. Diese Funktionalisierungsstellen können geschützt oder
maskiert sein, wie durch einen Fachmann erkennbar wäre. Die
Stellen können
ebenfalls auf einer zugrundeliegenden Ringstruktur oder einem zugrunde
liegenden Rückgrat
gefunden werden.
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Der
Begriff „Transfereinheit", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf ein Molekül,
welches einen Antikodon-Anteil aufweist, der mit einer reaktiven
Einheit assoziiert ist, einschließlich, aber nicht auf eine
Baueinheit, ein Monomer, eine Monomer-Einheit, oder einen Reaktanten,
der/die zum Synthetisieren der Nukleinsäure kodierten Moleküle verwendet
wird, beschränkt
ist.
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Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
den Ansatz der Natur (grau) und den klassischen chemischen Ansatz
(schwarz), um eine molekulare Funktion zu erzeugen.
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2 zeigt
bestimmte auf DNA-Matrizen basierende Reaktionen für Nukleinsäuren und
Analoga davon.
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3 zeigt
das allgemeine Verfahren zum Synthetisieren eines Polymers unter
Verwendung der Nukleinsäure-Matrizen
basierenden Synthese.
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4 zeigt
ein vierer und dreier nicht-rahmenverschiebende Kodonsatz. Jeder
Satz bietet neun mögliche
Kodons.
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5 zeigt
Verfahren zum Screenen einer Bibliothek für Bindungs-Spaltungs und Bindungs-Bildungskatalysatoren.
Diese Verfahren nutzen die natürliche
Affinität
von Streptavidin für
Biotin aus.
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6A zeigt die Synthese, die durch eine Haarnadel
(H) und Ende der Helix (E) DNA-Matrizen
gelenkt wird. Reaktionen wurden durch denautrierende PAGE nach den
angegebenen Reaktionszeiten analysiert. Die Bahnen drei und vier
enthielten die Matrizen, die mit einem Überschuss an β-Merkptoethanol
vor der Reaktion. abgelöscht
wurden.
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6B zeigt übereinstimmende
(M) oder nicht übereinstimmende
(X) Reagenzien Dianthiole (S) oder primäre Amine (N) gebunden sind,
wurden mit einem Äquivalent
von Matrize vermischt, die mit einer Vielzahl von gezeigten Elektrophilen
funktionalisiert sind. Die Reaktionen mit den Thiolreagenzien wurden
bei pH 7,5 unter den folgenden Bedingungen ausgeführt: SIAB
und SBAP: 37°C,
16h; SIA: 25°C,
16h, SMCC, GMBS, BMPS, SVSB: 25°C,
10 min. Die Reaktionen mit Aminreagenzien wurden bei 25°C, pH 8.5
für 75
Minuten durchgeführt.
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7 zeigt
(a) H Matrizen, die an eine Iodacetamid Gruppe gebunden sind, welche
mit Thiolreagenzien, welche 0, 1 oder 3 Nichtübereinstimmungen enthielten,
bei 25°C
reagiert wurden. (b) Reaktionen in (a) wurden bei den angegebenen
Temperaturen für
16 Stunden wiederholt. Berechnete Schmelztemperatur des Reagenzes:
38°C (Übereinstimmung),
28°C (einzelne
Nichtübereinstimmung).
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8 zeigt
eine Reaktion, die unter Verwendung einer 41-Base E Matrize und
eines 10-Base Reagenzes,
das so ausgebildet ist, um 1–30
Basen von dem 5' Ende
der Matrize anzulagern, durchgeführt.
Die kinetischen Profile in dem Diagramm zeigen den Durchschnitt
von zwei Versuchen (Abweichungen < 10
%). Das „n
= 1 mis" Reagenz
enthält
drei Nichtübereinstimmungen.
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9 zeigt
die wiederholte N = 10 Reaktion in 8, in
welcher die neun Basen, die dem 5'-NH2-dT folgen, mit den Rückgratanaloga,
die gezeigt sind, ersetzt wurden. Fünf Äquivalente eines DNA-Oligonukleotids,
welches zu den dazwischenliegenden Basen komplementär ist, wurden
zu der „DNA
+ clamp" Reaktion hinzugefügt. Die
Reagenzien stimmten überein
(0) oder enthielten drei Nichtübereinstimmungen
(3). Das Gel zeigt die Reaktionen bei 25°C nach 25 min.
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10 zeigt die n = 1, n = 10, und n = 1 Nichtübereinstimmungs
(mis) Reaktionen, die in 8 beschrieben
sind, welche mit Matrize und Reagenz-Konzentrationen von 12,5, 25,
62,5 oder 125 nM wiederholt wurden.
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11 zeigt eine Modelltranslation, Selektion und
Amplifikation von synthetischen Molekülen, die Streptavidin aus einer
DNA-kodierten Bibliothek binden.
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12 zeigt (a) Bahnen 1 und 5: PCT: amplifizierte
Bibliothek vor der Streptavidin Bindungsselektion. Bahnen 2 und
6: PCR amplizifierte Bibliothek nach Selektion. Bahnen 3 und 7:
PCR amplifizierte authentische Biotin kodierte Matrize. Bahn 4:
20 bp Leiter. Bahnen 5–7
wurden mit Tsp45I verdaut. DNA Sequenzierungsspuren der amplifizierten
Matrizen vor und nach der Selektion sind ebenfalls gezeigt, zusammen
mit den Sequenzen der nicht-Biotinkodierten und Biotin-kodierten
Matrizen. (b) Allgemeines Schema für die Erzeugung und Evolution
von Bibliotheken von nicht-natürlichen
Molekülen
unter Verwendung der DNA-Matrizen
basierenden Synthese, wobei -R1 von Produktfunktionalität, die von
der Reagenzbibliothek 1 übertragen
wurde, darstellt, und -R1B ein ausgewähltes Produkt
darstellt.
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13 zeigt eine beispielhafte DNA-Matrizen basierende
Reaktion. Für
alle Reaktionen unter den spezifizierten Bedingungen waren die Produktausbeuten
der Reaktion mit übereinstimmenden
Matrizen und Reagenzsequenzen größer als
20fach höher
als die von Kontrollreaktionen mit durchmischten Reagenzsequenzen.
Die Reaktionen wurden bei 25°C
mit einem Äquivalent
von jeder Matrize und Reagenz bei 60 nM Endkonzentration, wenn nichts
anderes angegeben, durchgeführt.
Bedingungen: (a) 3 mM NaBH3CN, 0,1 M MES
Puffer pH 6,0, 0,5 M NaCl, 1,5 h; b) 0,1 M TAPS Puffer pH 8,5, 300
mM NaCl, 12 h; c) 0,1 M pH 8,0 TAPS Puffer, 1 M NaCl, 5°C, 1,5 h;
d) 50 mM MOPS Puffer pH 7,5, 2,8 M NaCl, 22 h; e) 120 nM 19, 1,4
mM Na2PdCl4, 0,5
M NaOAc Puffer pH 5,0, 18 h; f) Vermischung Na2PdCl4 mit zwei Äquivalenten an P (p-SO3C6H4)3 in Wasser 15 min, dann Hinzufügen zu den
Reaktanten in 0,5 M NaOAc Puffer pH 5,0, 75 mM NaCl, 2 h (End [Pd]
= 0,3 mM, [19] = 120 nM). Die Olefingeometrie der Produkte aus 13
und der Regiochemien der Cycloadditionsprodukte aus 14 und 16 werden
angenommen, aber nicht verfiziert.
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14 zeigt die Analyse durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese
von repräsentativen DNA-Matrizen
basierenden Reaktionen, die in 13 und 15 aufgelistet
sind. Die Strukturen der Reagenzien und Matrizen entsprechen der
Nummerierung der 13 und 15.
Die Bahnen 1, 3, 5, 7, 9, 11: Reaktionen von übereinstimmenden (komplementären) Reagenzien
und Matrizen unter Bedingungen, die in 13 und 15 aufgelistet
sind (die Reaktion von 4 und 6 wurde durch DMT-MM vermittelt). Die
Bahnen 2, 4, 6, 8, 10, 12: Reaktionen von nicht übereinstimmenden (nicht-komplementären) Reagenzien
und Matrizen unter Bedingungen, die identisch zu jenen in Bahnen
1, 3, 5, 7, 9 bzw. 11 sind.
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15 zeigt die DNA Matrizen Amidbindungsbildung,
die durch EDC und Sulfo-NHS oder durch DMT-MM für eine Vielzahl von substituierten
Carbonsäuren
und Aminen vermittelt wird. In jeder Reihe, werden die Ausbeuten
die DMT-MM vermittelten Reaktionen zwischen Reagenzien und Matrizen,
die in der Sequenz komplementär
sind, durch Ausbeuten der EDC und Sulfo-NHS-vermittelten Reaktionen
versorgt. Bedingungen: 60 nM Matrize, 120 nM Reagenz, 50 mM DMT-MM
in 0,1 M MOPS Puffer pH 7,0, 1 M NaCl, 16 h, 25°C; oder 60 nM Matrize, 120 nM
Reagenz, 20 mM EDC, 15 mM Sulfo-NHS, 0,1 M MES Puffer pH 6,0, 1
M NaCl, 16 h, 25°C.
In allen Fällen
ergaben Kontrollreaktionen mit nichtübereinstimmenden Reagenzsequenzen
wenig oder kein detektierbares Produkt.
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16 zeigt (a) Konzeptmodell für die entfernungsabhängige DNA-Matrizen
basierende Synthese. Wie die Entfernung zwischen den reaktiven Gruppen
eines angelagerten Reagenzes und Matrize(n) erhöht wird, wird angenommen, dass
die Rate der Bindungsbildung abnimmt. Für jene Werte von n, bei welchen
die Rate der Bindungsbildung signifikant höher ist, als die Rate der Matrize-Reagenzanlagerung,
bleibt die Rate der Produktbildung konstant. Bei diesem Schmema
zeigt die DNA-Matrizen basierende Reaktion eine Entfernungsabhängigkeit.
(b) Denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese einer DNA-Matrizen
Wittig Olefinierung zwischen komplementären 11 und 13 mit entweder
0-Basen (Bahnen 1–3)
oder 10 Basen (Bahnen 4–6), die
angelagerte Reaktanten trennen. Obwohl die offensichtlichen Ratenkonstanten
zweiter Ordnung für
die n=0 und n=10 Reaktionen sich um dreifach unterscheiden (kapp
(n=0) = 9,9 × 103 M–1 s–1 während kapp
(n=10) = 3,5 × 103 M–1 s–1),
waren die Produktausbeuten nach 13 Stunden bei weiten Entfernungen
beinahe quantitativ. Kontrollreaktionen, die Sequenznichtübereinstimmungen
enthalten, ergaben kein detektierbares Produkt (nicht gezeigt).
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17 zeigt bestimmte beispielhafte DNA-Matrizen
Komplexitätsbildungs-Reaktionen.
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18 zeigt beispielhafte Linker für die Verwendung
in dem Verfahren der Erfindung.
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19 zeigt bestimmte zusätzliche beispielhafte Linker
für die
Verwendung in dem Verfahren der Erfindung.
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20 zeigt einen beispielhaften Thioesterlinker
für die
Verwendung in dem Verfahren der Erfindung.
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21 zeigt DNA-Matrizen Amidbindungsbildungsreaktionen,
in welchen die Reagenzien und Matrizen mit Diemethyldidodecylammonium-Kationen
komplexiert sind.
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22 zeigt den Zusammenbau von Transfereinheiten
entlang der Nukleinsäure-Matrize und Polymerisierung
der Nukleotidantikodon-Anteile.
-
23 zeigt die Polymerisation der Dicarbamat-Einheiten
entlang der Nukleinsäure-Matrize, um ein Polycarbamat
zu bilden. Um die Polymerisation zu iniziieren, wird das „Start" Monomer, welches
in einem O-Nitrobenzylcarbamat endet, photoschutzeliminiert, um
das primäre
Amin freizulegen, welches die Carbamat-Polymerisierung iniziieren.
Die Polymerisierung findet dann in der 5'-3' Richtung
entlang des DNA Rückgrates statt,
wobei jeder Nukleophile Angriff in einem nachfolgenden Entmaskieren
eines neuen Aminnukleophils resultiert. Der Angriff auf das „Stopp" Monomer setzt ein
Acetamid frei anstelle eines Amins, wodurch die Polymeristation
beendet wird.
-
24 zeigt die Spaltung des Polycarbamats von dem
Nukleotidrückgrat.
Die Desylierung des Enol-Ether-Linkers, welcher an den Antikodon-Anteil
an die Monomer-Einheit anheftet, und die Eliminierung des Phosphats,
welches durch die resultierende Freisetzung des Phenols angetrieben
wird, stellt das Polycarbamat bereit, welches an seinem Carboxy-Terminus
an seine kodierende einzelsträngige
DNA kovalent gebunden ist.
-
25 zeigt Komponenten einer amplifizierbaren, entwickelbaren
funktionaliserenden Peptidnukleinsäure Bibliothek.
-
26 zeigt Testreagenzien, die verwendet werden,
um Reagenzien und Bedingungen für
DNA-Matrizen PNA Kopplung zu optimieren.
-
27 zeigt einen einfachen Satz von PNA Monomeren,
die von kommerziell erhältlichen
Baueinheiten abgeleitet sind, die für das Entwickeln eines PNA-basierenden
Fluoreszenz Ni2+-Sensor nützlich sind.
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28 zeigt zwei Schemata für die Selektion eines Biotin-beendeten
funktionalisierten PNAs, welches in der Lage ist, eine Aldol oder
Retroaldol Reaktion zu katalysieren.
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29 zeigt die DNA-Matrizen-gerichtete Synthese
einer kombinatorischen kleinen Molekül Bibliothek.
-
30 zeigt schematisch, wie DNA-gebundene kleine
Molekülgerüste Sequenzspezifisch
funktionalisiert werden können,
durch Reaktion mit synthetischen Reagenzien, die an komplementäre Nukleinsäure Oligonukleotide
gebunden sind, dieser Vorgang kann wiederholt werden, um die synthetische
Transformation abzuschließen,
was zu einem vollständig
funktionalisierten Molekül
führt.
-
31 zeigt die Funktionalisierung eines Cephalosporin
kleinen Molekülgerüstes mit
verschiedenen Reaktanten.
-
32 zeigt einen Weg zum Messen der Reaktionsrate
zwischen einem fixen Nukleophil und einem Elektrophil, welches bei
verschiedenen Distanzen entlang einer Nukleinsäure Matrize hybridisiert, um
ein essenzielles Reaktionsfenster zu definieren, in welchem die
Nukleinsäure-Matrizen
basierende Synthese von nicht Polymeren-Strukturen stattfinden kann.
-
33 zeigt drei Linker-Strategien für die DNA
Matrizen basierende Synthese. Bei der selbstspaltenden Linkerstrategie,
wird die Bindung, die das Produkt verbindet, von dem Reagenzooligonukleotid
als eine natürliche
Konsequenz der Reaktion gespalten. Bei den narbenlosen und nützlichen
Narben-Linkerstrategien wird diese Bindung im Anschluss an die DNA-Matrizen
Reaktion gespalten. Die gezeigten Reaktionen wurden durch denaturierende
Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert (unten). Die Bahnen 1–3 wurden
unter Verwendung von UV-Licht ohne DNA Färbung visualisiert. Die Bahnen
4–10 wurden
durch Anfärben
mit Ethidiumbromid, gefolgt durch UV Transillumination visualisiert.
Bedingungen: 1 bis 3: ein Äquivalent
von jedem Reagenz und jeder Matrize, 0,1 M TAPS Puffer pH 8,5, 1
M NaCl, 25°C, 1,5
h, 4 bis 6: drei Äquivalente
von 4, 0,1 M MES Puffer pH 7,0, 1 M NaHO2,
10 m M AGNO3, 37°C, 8 h; 8 bis 9: 0,1 M CAPS
Puffer pH 11,8, 60 mM BME, 37°C,
2 h; 11 bis 12: 50 mM wässrige
NaIO4, 25°C,
2 h. R1 = NH(CH2)2NH-Dansyl; R2 =
Biotin.
-
34 zeigt die Strategien für das Reinigen der Produkte
der DNA-Matrizen basierenden Synthese. Unter Verwendung von biotinylierten
Reagenz-Polynukleotiden werden Produkte, die von einem selbstspaltenden
Linker entstehen, teilweise durch Waschen der Rohreaktion mit Avidin-gebundenen
Kügelchen
(Proben) gereinigt. Produkte, die von DNA-Matrizen basierenden Reaktionen unter
Verwendung der narbenlosen oder nützlichen Narbenlinker erzeugt
wurden, können
unter Verwendung von biotinylierten Reagenz-Oligonukleotiden gereinigt werden, wobei
Rohreaktionsprodukte mit Avidin-gebundenen Kügelchen eingefangen werden, und
die gewünschten
Produkte durch Induzieren der Linkerspaltung eluiert (unten) werden.
-
35 zeigt die Erzeugung eines anfänglichen
Matrizenpools für
eine beispielhafte Bibliotheks-Synthese.
-
36 zeigt die DNA-Matrizen basierende Synthese
einer nicht-natürlichen
Peptid-Bibliothek.
-
37 zeigt eine 5'-Reagenz DNA-Linker-Aminosäure.
-
38 zeigt die DNA-Matrizen basierende Synthese
einer entwickelbaren Diversität
orientierten bizyklischen Bibliothek.
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39 zeigt die DNA-Matrizen basierende mehrstufige
Tripeptid-Synthese. Jede DNA-Matrizen
basierende Amidbildung verwendete Reagenzien, die den Sulfonlinker,
der im Text beschrieben ist, enthält. Bedingungen: Schritt 1:
Aktivieren zweier Äquivalente
13 in 20 mM EDC, 15 mM Sulfo-NHS, 0,1 M MES Puffer pH 55, 1 M NaCl,
10 min, 25°C,
dann Hinzufügen
zur Matrize in 0,1 M MOPS pH 7,5, 1 M NaCl, 25°C, 1 h; Schritte 2 und 3: Zwei Äquivalente
am Reagenz, 50 mM DMT-MM, 0,1 M MOPS Puffer pH 7,0 M NaCl, 6 h, 25°C. Das gewünschte Produkt
nach jedem Schritt wurde durch Einfangen auf Avidin-gebundenen Kügelchen und
Eluieren mit 0,1 M CAPS Puffer pH 11,8, 60 mM BME, 37°C, 2 h gereinigt.
Der Forstschritt jeder Reaktion und Reinigung wurde durch denaturierende
Polyacrylamid Gelelektrophorese (unten) überwacht. Die Bahnen 3, 6 und
9: Kontrollreaktionen unter Verwendung von Reagenzien, die zusammengerührte Oligonukleotid
Sequenzen enthalten.
-
40 zeigt die nicht-peptidische DNA-Matrizen basierende
mehrstufige Synthese. Die Reagenz-Linker, die in den Schritten 1,
2, und 3 verwendet wurden, waren der Diollinker, selbstspaltender
Wittiglinker bzw. Sulfonlinker; siehe 1 für Linker
Spaltungsbedingungen. Bedingungen: 17 bis 18: Aktivieren zweier Äquivalente
17 in 20 mM EDC, 15 mM Sulfo-NHS, 0,1 M MES Puffer pH 5,5. 1 M NaCl,
10 min, 25°C,
dann Hinzufügen
zu Matrize in 0,1 M MOPS pH 7,5, 1 M NaCl, 16°C, 8 h; 19 bis 21: 3 Äquivalente
20, 0,1 M TAPS pH 9,0, 3 M NaCl, 24 h, 25°C; 22 bis 23; drei Äquivalente
22, 0,1 M TAPS pH 8,5, 1 M NaCl, 21 h, 25°C. Der Fortschritt jeder Reaktion
und Reinigung wurde durch denaturierende Polyacylamid Gelelektrophorese
(unten) überwacht.
Bahnen 3, 6 und 9: Kontrollreaktion unter Verwendung von Reagenzien,
die zusammengerührte
Oligonukleotidsequenzen enthalten.
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41 zeigt die Verwendung von Nukleinsäuren, um
die Synthese von neuen Polymeren und Kunststoffen durch Anheften
der Nukleinsäuren
an den Liganden eines Polymerisierungskatalysators zu lenken. Die Nukleinsäure kann
in eine komplexe Struktur falten, welche die Selektivität und Aktivität des Katalysators
beeinflussen.
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42 zeigt die Verwendung der Grubbs' Ringöffnungs
Metathese Polymerisierungskatalyse bei Entwicklung von Kunststoffen.
Das synthetische Schema eines Dihydroimidazolliganden, sowie das
Monomer, das in der Polymerisierungsreaktion verwendet wird, wird
gezeigt.
-
43 zeigt die Entwicklung von Kunststoffen durch
iterative Zyklen von Ligand Diversifizierung, Selektion und Amplifikation,
um Polymere mit gewünschten
Eigenschaften zu erzeugen.
-
44 zeigt ein beispielhaftes Schema für die Synthese,
in vito Selektion und Amplifikation einer Bibliothek von Verbindungen.
-
45 zeigt beispielhafte Matrizen für die Verwendung
in die Rekombination.
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46 zeigt mehrere beispielhafte Deoxyribunukleotide
und Ribonukleotide, die Modifikationen an Gruppen tragen, die nicht
in Watson-Crick Wasserstoffbindungen teilnehmen, und bekannten,
mit einer hohen Sequenzgenauigkeit gegenüber natürlichen DNA-Matrizen eingefügt zu werden.
-
47 zeigt beispielhafte Metallbindungs-Uridin-
und 7-Deazaadenosin Analoga.
-
48 zeigt die Synthese von Analogon (7).
-
49 zeigt die Synthese von Analogon (30).
-
50 zeigt die Synthese von 8-modifizierten Deoxyadenosintriphosphaten.
-
51 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung, die
die Akzeptanz von modifizierten Nukleotiden durch DNA Polymerasen
evaluiert.
-
52 zeigt die Synthese von 7-Deazaadenosin-Derivaten.
-
53 zeigt bestimmte beispielhafte Nukleotidtriphosphate.
-
54 zeigt ein allgemeines Verfahren zur Herstellung
von Bibliotheken von Metallbindungs-Polymeren.
-
55 und 56 zeigt
ein beispielhaftes Schema für
die in vitro-Selektion auf nicht natürliche Polymer-Katalysatoren.
-
57 zeigt ein beispielhaftes Schema für die in
vitro Selektion von Katalysatoren für Heck Reaktionen, Hetero-Diels-Alder
Reaktionen und Aldol Additionen.
-
Beschreibung
von bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung
-
Wie
oben diskutiert ist, wäre
es wünschenswert,
in der Lage zu sein, chemische Verbindungen zu entwickeln und zu
amplifizieren, einschließlich
ohne auf kleine Moleküle
und Polymere beschränkt
zu sein, auf dieselbe Art und Weise, wie Biopolymere, wie Polynukleotide
und Proteine, entwickelt und amplifiziert werden können. Es
wurde demonstriert, dass die DNA-Matrizen
basierende Synthese ein mögliches
Mittel zum Translatieren der Information in einer DNA Sequenz in
ein synthetisches kleines Molekül
bereitstellt. Im Allgemeinen können
DNA-Matrizen, die
an einem Reaktant gebunden sind, in der Lage sein, eine zweite reaktive
Gruppe, die an ein komplementäres
DNA Molekül
gebunden ist, zu rekrutieren, um ein Produkt zu ergeben. Da die
DNA Hybridisierung Sequenz-spezifisch ist, ist das Ergebnis der
DNA-Matrizen basierenden Reaktion die Translation einer spezifischen
DNA-Sequenz in ein entsprechendes Reaktions-Produkt. Wie in 2 gezeigt
ist, wurde die Fähigkeit
von einsträngigen
Nukleinsäure-Matrizen,
die Sequenz-spezifische Oligomerisierung von komplementären Oligonukleotiden
zu katalysieren (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666;
T. Inou et al. J. Mol. Biol. 1984, 178, 669–76) demonstriert. Diese Entdeckung
wurde bald von den Ergebnissen gefolgt, dass DNA oder RNA Matrizen
die Oligomerisierung von komplementären DNA oder RNA Mono-, Di-,
Tri-, oder Oligonukleotiden katalysieren könnten (T. Inoue et al. J. Am.
Chem. Soc. 1981, 103, 7666; L. E. Orgel et al. Acc, Chem. Res. 1995,
28, 109–118;
H. Rembold et al. J. Mol. Evol. 1994, 38, 205; L. Rodriguez et al.
J. Mol. Evol. 1991, 33, 477; C. B. Chen et al. J. Mol. Biol. 1985,
181, 271). DNA oder RNA Matrizen haben seit damals gezeigt, die
Bildung einer Vielzahl von nicht-natürlichen Nukleinsäuren Analoga,
einschließlich
Peptid-Nukleinsäuren (C.
Bohler et al. Nature 1995, 376, 578), Phosphorothioat- (M. K. Herrlein
et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151–10152), Phosphorselenat- (Y.
Xu et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9040–9041; Y. Xu et al. Nat. Biotechnol.
2001, 19, 148–152)
und Phophoramidat- (A. Luther et al. Nature 1998, 396, 245–8) enthaltende
Nukleinsäuren,
nicht-Ribose Nukleinsäuren
(M. Bolli et al. Chem. Biol. 1997, 4, 309–20), und DNA Analoga, in welchen
eine Phosphatbindung mit einer Aminoethyl-Gruppe ausgetauscht wurde
(Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19–28) zu beschleunigen. Nukleinsäure-Matrizen
können
Amin-Acylierung zwischen Nukleotid-Analoga ebenfalls katalysieren
(R. K. Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49–56).
-
Obwohl
die Fähigkeit
von Nukleinsäure-Matrizen,
die Bildung einer Vielzahl von nicht-natürlichen
Nukleinsäure-Analoga
zu beschleunigen, demonstriert wurde, wurden beinahe alle dieser
Reaktionen, von denen früher
gezeigt wurde, dass sie durch Nukleinsäure-Matrizen katalysiert werden,
konstruiert, um über Übergangszustände zu verlaufen,
die der Struktur des natürlichen
Nukleinsäure-Rückgrates
stark ähnelt
(2), die überlicherweise
Produkte lifern, die denselben 6-Bindungsrückgratsabstand zwischen den
Nukleotideinheiten konservieren. Die Motivation hinter dieser Konstruktion
war vermutlich die Annahme, dass die durch die Nukleinsäure Matrizen
bereitgestellte Ratenerhöhung
von einer präzisen
Ausrichtung der reaktiven Gruppen abhängt, und die Präzision dieser
Ausrichtung maximiert ist, wenn die Reaktanten und Produkte die
Struktur der DNA und RNA Rückgrate
nachahmen. Unterstützende
Hinweise der Hypothese, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese
nur Produkte erzeugen kann, die den Nukleinsäure-Rückgraten ähnelt, kommt von der bekannten
Schwierigkeit der Makrozyklisierung in der organischen Synthese
(G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95–102; R.
B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210–3213).
Die Ratenerhöhung von
intramolekularen Ringschlussreaktionen, im Vergleich mit ihren intermolekularen
Gegenstücken,
ist bekannt schnell abzunehmen, wie rotierbare Bindungen zwischen
reaktiven Gruppen hinzugefügt
werden, so dass Verbindungsreaktanten mit einem flexiblem 14-Kohlenstofflinker
kaum eine Ratenbeschleunigung ergeben (G. Illuminati et al. Acc.
Chem. Res. 1981, 14, 95–102).
-
Da
normalerweise synthetische Moleküle
von Interesse Nukleinsäure
Rückgraten
nicht ähneln,
würde die
Verwendung der DNA-Matrizen basierende Synthese, um DNA-Sequenzen
in synthetische kleine Moleküle zu
translatieren, nur allgemein nützlich
sein, wenn synthetische Moleküle
außer
Nukleinsäuren
und Nukleinsäure-Analoga
in einer DNA-Matrizen basierenden Art und Weise synthetisiert werden
können.
Die Fähigkeit der
DNA-Matrizen basierenden Synthese, DNA-Sequenzen in willkürliche nicht-natürliche kleine
Moleküle
zu translatieren, erfordert deshalb, das Demonstrieren, dass die
DNA-Matrizen basierende Synthese ein viel allgemeineres Phänomen ist,
als früher
beschrieben wurde.
-
Signifikanterweise
wurde hierin für
das erste Mal demonstriert, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese
tatsächlich
ein allgemeines Phänomen
ist und für
eine Vielzahl von Reaktionen und Bedingungen verwendet werden kann,
um eine diverse Kollektion an Verbindungen zu erzeugen, einschließlich für das erste Mal
besonders Verbindungen, die keine Nukleinsäuren oder Analoga davon sind,
oder diesen nicht ähnlich sind.
Insbesondere erweitert die folgende Erfindung die Fähigkeit,
Bibliotheken von chemischen Verbindungen jenseits von natürlichen
Biopolymeren zu amplifizieren und zu entwickeln. Die Fähigkeit,
chemische Verbindungen mit willkürlicher
Struktur zu synthetisieren, ermöglicht
Forschern, ihren eigenen genetischen Code zu schreiben, der eine
große
Auswahl an chemischer Funktionalität in ein neuartiges Rückgrat und
Seitenkettenstrukturen einbaut, welcher die Entwicklung von neuartigen Katalysatoren,
Arzneimitteln und Polymeren, um eigene Beispiel zu nennen, ermöglicht.
Zum Beispiel ermöglicht
die Fähigkeit,
diese Moleküle
durch genetische Selektion direkt zu amplifizieren und zu entwickeln,
die Entdeckung von komplett neuen Familien von künstlichen Katalysatoren, welche
eine Aktivität,
Bioverfügbarkeit,
Lösungsmittel,
oder thermische Stabilität oder
andere physikalische Eigenschaften (wie Fluorescenz, Spin-Markierung,
oder Photolabilität)
besitzen, die unter Verwendung des limitierten Satzes von natürlichen
Protein- und Nukleinsäure-Baueinheiten
schwierig oder unmöglich
zu erreichen sind. Auf ähnliche
Weise ermöglicht
das Entwickeln von Verfahren, um synthetische kleine Moleküle durch
wiederholende Zyklen von Mutation und Selektion zu amplifizieren
und direkt zu entwickeln, die Isolation von neuartigen Liganden
oder Arzneimitteln mit Eigenschaften, die jenen, die durch traditionelle
rationale Entwicklung oder kombinatorische Screening-Arzneimittelentdeckungsverfahren
isoliert wurden, überlegen
sind. Zusätzlich
würde das
Ausdehnen der Ansätze,
die hierin beschrieben sind, auf Polymere von Signifikanz in der
Materialwissenschaft, die Entwicklung von neuen Kunststoffen ermöglichen.
-
Im
Allgemeinen beinhaltet das Verfahren der Erfindung 1) das Bereitstellen
einer oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen,
welche eine oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen gegebenenfalls
eine reaktive Einheit, die damit assoziiert ist, aufweise; und 2)
das Kontaktieren der einen oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen
mit einer oder mehreren Transfereinheiten, die ausgebildet sind,
um einen ersten Anteil, ein Antikodon, zu haben, welches an eine
Sequenz der Nukleinsäure
hybridisiert, und mit einem zweiten Anteil, einer reaktiven Einheit, assoziiert
ist, welche spezifische Funktionalität enthält, einer Baueinheit, einem
Reaktant, etc. für
die zu synthetisierende Verbindung. Es ist erkennbar, dass in bestimmten
Ausführungsformen
der Erfindung, die Transfereinheit einen Anteil aufweist, der die
Hybridisierungsfähigkeit
der Antikoden-Einheit und die chemische Funktionalität der Reaktionseinheit
umfasst. Sobald diese Transfereinheiten an die Nukleinsäure-Matrize
in einer Sequenz-spezifischen Art und Weise hybridisiert haben,
kann die Synthese der chemischen Verbindung aufgrund der Interaktion
der auf den Transfereinheiten und/oder der Nukleinsäure-Matrize
vorhandenen reaktiven Einheiten stattfinden. Signifikanterweise
kann die Sequenz der Nukleinsäure
später
bestimmt werden, um die synthetische Historie der angelagerten Verbindung
und dadurch ihre Struktur zu dekodieren. Es ist erkennbar, dass
das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden kann, um jeweils
ein Molekül
zu synthetisieren oder kann verwendet werden, um Tausende bis Millionen
von Verbindungen unter Verwendung von kombinatorischen Verfahren
zu synthetisieren.
-
Es
ist erkennbar, dass eine Vielzahl von chemischen Verbindungen gemäß dem Verfahren
der Erfindung hergestellt und entwickelt werden kann. In bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung werden die Verfahren jedoch für die Synthese von chemischen
Verbindungen, die keine Nukleinsäuren
oder Nukleinsäure-Analoga
sind, oder diesen nicht ähnlich
sind, benutzt. Zum Beispiel können
in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung kleine Molekülverbindungen
durch Bereitstellen einer Matrize, welche eine damit assoziierte
reaktive Einheit (z.B. Baueinheit oder kleines Molekülgerüst hat)
(direkt oder durch einen Linker, wie detaillierter in Beispiel 5
hierin beschrieben ist, gebunden) aufweist, und gleichzeitiges oder
sequenzielles Kontaktieren der Matrize mit einer oder mehreren damit
assoziierten reaktiven Einheiten, synthetisiert werden. In bestimmten
anderen Ausführungsformen
können
nicht-natürliche
Polymere durch Bereitstellen einer Matrize und gleichzeitiges Kontaktieren
der Matrize mit einer oder mehreren Transfereinheiten mit einer
oder mehreren damit assoziierten reaktiven Einheiten unter Bedingungen,
die geeignet sind, um die Reaktion der benachbarten reaktiven Einheiten
auf jeder der Transfereinheiten zu bewirken, synthetisiert werden
(siehe z.B. 3 und Beispiele 5 und 9, wie
hierin in detaillierter beschrieben ist).
-
Bestimmte
Ausführungsformen
werden detaillierter unten diskutiert; es ist jedoch erkennbar,
dass die vorliegende Erfindung nicht beabsichtigt ist, auf jene
Ausführungsformen,
die unten diskutiert sind, beschränkt zu sein. Vielmehr ist die
vorliegende Erfindung beabsichtigt, diese Ausführungsformen und Äquivalente
davon zu umfassen.
-
Matrizen
-
Wie
oben diskutiert ist, werden eine oder mehrere Nukleinsäure-Matrizen
in dem Verfahren der Erfindung benutzt, und Hybridisieren an die
Transfereinheiten, um die Synthese der chemischen Verbindung zu
lenken. Wie ein Fachmann erkennen wird, kann jede Nukleinsäure-Matrize
in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Matrizen, welche mutiert und dadurch entwickelt
sein können,
können
verwendet werden, um die Synthese einer anderen chemischen Verbindung
oder Bibliothek von chemischen Verbindungen, wie in der vorliegenden
Erfindung beschrieben ist, zu führen.
Wie hierin im größeren Detail
beschrieben ist, kodiert die entwickelbare Matrize die Synthese
einer chemischen Verbindung und kann später verwendet werden, um die
synthetische Historie der chemischen Verbindung zu dekodieren, um die
chemische Verbindung indirekt zu amplifizieren, und/oder um die
chemische Verbindung zu entwickeln (d.h. Diversifizieren, Selektieren,
und Amplifizieren).
-
Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure-Matrizen
sind aus DNA, RNA, ein Hybrid von DNA und RNA, oder einem Derivat
von DNA und RNA hergestellt, und können einzel- oder doppelsträngig sein.
Die Sequenz der Matrize wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet, um die Synthese einer chemischen Verbindung, vorzugsweise
einer Verbindung, die keine Nukleinsäure oder Nukleinsäure-Analogon (z.B.
ein unnatürliches
Polymer oder ein kleines Molekül)
ist, oder diesen nicht ähnelt,
zu kodieren. In dem Fall von bestimmten unnatürlichen Polymeren wird die
Nukleinsäure-Matrize
verwendet, um die Monomer-Einheiten in der Sequenz, auszurichten,
wie sie in dem Polymer erscheinen werden, und um sie in nahe Umgebung mit
benachbarten Monomer-Einheiten entlang der Matrize zu bringen, so
dass sie reagieren werden und durch kovalente Bindung verbunden
werden. In dem Fall eines kleinen Moleküls wird die Matrize verwendet,
um bestimmte Reaktanten in die Nähe
des kleinen Molekülgerüstes zu
bringen, so dass sie das Gerüst
auf eine bestimmte Art und Weise modifizieren können. In bestimmten anderen
Ausführungsformen,
kann die Matrize benutzt werden, um nicht-natürliche Polymere durch PCR-Amplifikation
einer synthetischen DNA-Matrizen Bibliothek, welche aus zufälligen Nukleotid-Regionen
besteht, wie hierin in Beispiel 9 beschrieben ist, zu erzeugen.
-
Wie
ein Fachmann erkennen kann, kann die Sequenz der Matrize auf eine
Vielzahl von Wegen konstruiert werden, ohne den Umfang der vorliegenden
Erfindung zu verlassen. Zum Beispiel muss die Länge des Kodons bestimmt werden
und die Kodonsequenz muss eingestellt werden. Wenn eine Kodonlänge von
zwei verwendet wird, dann sind unter Verwendung der vier natürlich vorkommenden
Basen nur 16 mögliche
Kombinationen verfügbar,
die beim Kodieren der Bibliothek verwendet werden können. Wenn
die Länge
des Kodons auf drei erhöht
wird (die Anzahl, die die Natur beim Kodieren von Proteinen verwendet
wird) erhöht
sich die Anzahl von möglichen
Kombinationen auf 64. Andere Faktoren, die beim Bestimmten der Länge des
Kodons zu beachten sind, sind Nichtübereinstimmung, Rahmenverschiebung,
Komplexität
der Bibliothek, etc. Wie die Länge
des Kodons bis zu einem bestimmten Ausmaß erhöht wird, wird die Anzahl der
Nichtübereistimmungen
verringert; übermäßige-lange
Kodons werden jedoch trotz nichtübereinstimmenden
Basenpaaren hybrisieren. In bestimmten Ausführungsformen von speziellem
Interesse reicht die Länge
des Kodons von 2 bis 10 Basen.
-
Ein
anderes mit der Verwendung einer Nukleinsäure-Matrize assoziiertes Problem
ist die Rahmenverschiebung. Das Problem der Rahmenverschiebung in
der Translation eines Proteins von einer mRNA wird in der Natur
durch die Verwendung der komplexen Maschinerie der Ribosome vermieden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren
werden jedoch nicht eine solche komplexe Maschinerie ausnutzen.
Anstelle wird die Rahmenverschiebung durch verlängern jedes Kodons beseitigt,
so dass die Hybridisierung eines Kodons außerhalb des Rahmen eine Nichtübereinstimmung
garantieren wird. Zum Beispiel kann jedes Kodon mit einem G beginnen,
und nachfolgende Positionen können
auf T, C und A beschränkt
sein (4). In einem anderen Beispiel kann
jedes Kodon mit einem G beginnen und enden, und nachfolgende Positionen
können
auf T, C und A beschränkt
sein. Ein anderer Weg zum Vermeiden der Rahmenverschiebung ist,
ein ausreichend langes Kodon zu haben, so dass die Sequenz des Kodons
nur innerhalb der Sequenz der Matrize „im Rahmen" gefunden wird. Spacer-Sequenzen können ebenfalls
zwischen die Kodons platziert sein, um die Rahmenverschiebung zu
verhindern.
-
Es
ist erkennbar, dass die Matrize in der Anzahl der Basen stark variieren
kann. Zum Beispiel kann in bestimmten Ausführungsformen die Matrize eine
Länge von
10 bis 10.000 Basen, vorzugsweise eine Länge zwischen 10 und 1.000 Basen
aufweisen. Die Länge
der Matrize wird natürlich
von der Länge
der Kodons, der Komplexität
der Bibliothek, der Länge
des zu synthetisierenden unnatürlichen
Polymers, de Komplexität
der zu synthetisierenden kleinen Moleküle, die Verwendung von Spacer-Sequenzen,
etc. abhängen.
Die Nukleinsäure-Sequenz kann unter
Verwendung jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, um Nukleinsäure herzustellen,
hergestellt werden. Zu diesen Verfahren zählen sowohl in vivo als auch
in vitro-Verfahren, einschließlich
PCR, Plasmid-Präparation,
Endonuklease-Verdau, Festphasensynthese, in vitro Transkription, Strangtrennung
etc. In bestimmten Ausführungsformen
wird die Nukleinsäure-Matrize
unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthetisierers synthetisiert.
-
Wie
oben diskutiert ist, wird in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung,
das Verfahren verwendet, um chemische Verbindungen zu synthetisieren,
die keine Nukleinsäuren
oder Nukleinsäure-Analoga
sind, oder diesen nicht ähnlich
sind. Obwohl es demonstriert wurde, da die DNA-Matrizen basierende
Synthese benutzt werden kann, um die Synthese von Nukleinsäuren und
Analoga davon zu lenken, wurde es früher nicht demonstriert, dass
das Phänomen
der DNA-Matrizen basierenden Synthese allgemein genug ist, um sich
auf komplexere chemische Verbindungen (z.B. kleine Moleküle, nicht-natürliche Polymere)
zu erstrecken. Wie hierin detaillierter beschrieben ist, wurde demonstriert,
dass die DNA-Matrizen basierende Synthese tatsächlich ein allgemeineres Phänomen ist,
und dass eine Vielzahl von Reaktionen ausgenutzt werden können.
-
Somit
weist in bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung die Nukleinsäure-Matrize Sequenzen von Basen
auf, die die Synthese eines unnatürlichen Polymers oder kleinen
Moleküls
kodieren. Die in der Nukleinsäure-Matrize
kodierte Nachricht beginnt vorzugsweise mit einem spezifischen Kodon,
dass eine chemisch reaktive Stelle an eine Stelle bringt, von welcher
die Polymerisation stattfinden kann, oder im Fall des Synthetisierens
eines kleinen Moleküls
kann das „Start" Kodon ein Antikodon
kodieren, welches mit einem kleinen Molekülgerüst oder einem ersten Reaktanten
assoziiert ist. Das „Start" Kodon der vorliegenden Erfindung
ist ein Analogon zu dem „Start" Kodon, ATG, welches
in der Natur gefunden wird, welches die Aminosäure Methionin kodiert. Um nur
ein Beispiel für
die Verwendung zum Synthetisieren einer unnatürlichen Polymerbibliothek zu
geben, kann das Startkodon eine Start-Monomer Einheit kodieren, welche ein
primäres Amin
aufweist, welches durch eine photolabile Schutzgruppe maskiert ist,
wie unten in Beispiel 5A gezeigt ist.
-
In
noch weiteren Ausführungsformen
der Erfindung kann die Nukleinsäure-Matrize
selbst modifiziert sein, um eine Initiationsstelle für die Polymer-Synthese
(z.B. ein Nukleophil) oder ein kleines Molekülgerüst enthalten. In bestimmten
Ausführungsformen
enthält
die Nukleinsäure-Matrize
eine Haarnadelschleife an einem ihrer Enden, die in einer reaktiven
Gruppe endet, die verwendet wird, um die Polymerisierung der Monomer-Einheiten
zu initiieren Zum Beispiel kann eine DNA-Matrize eine Haarnadelschleife
aufweisen, die in einer 5' Aminogruppe
endet, welche geschützt
sein kann oder nicht. Von der Aminogruppe kann die Polymerisierung des
unnatürlichen
Polymers beginnen. Die reaktive Aminogruppe kann ebenfalls verwendet
werden, um ein kleines Molekülgerüst auf eine
Nukleinsäure-Matrize
zu binden, um eine kleine Molekülbibliothek
zu synthetisieren.
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Um
die Synthese des unnatürlichen
Polymers zu beenden, sollte ein „Stopp" Kodon in der Nukleinsäure-Matrize,
vorzugsweise am Ende der kodierenden Sequenzen, enthalten sein.
Das „Stopp" Kodon der vorliegenden
Erfindung ist analog zu den „Stopp" Kodons (d.h. TAA,
TAG, TGA), die in mRNA Transkripten gefunden werden. In der Natur
führen
diese Kodon zu dem Abbruch der Proteinsynthese. In bestimmten Ausführungsformen
wird ein „Stopp" Kodons ausgewählt, das
mit dem, um das unnatürliche
Polymer zu kodieren verwendeten künstlichen genetischen Code
kompatibel ist. Zum Beispiel sollte das „Stopp" Kodon nicht mit anderen Kodons kollidieren,
die verwendet werden, um die Synthese zu kodieren, und es sollte
von dem gleichen allgemeinen Format sein, wie die anderen in der
Matrize verwendeten Kodons. Das „Stopp" Kodon kann eine Monomer-Einheit kodieren,
die die Polymerisierung durch das Nicht-Bereitstellen einer reaktiven Gruppe
für die
weitere Anbindung beendet. Zum Beispiel kann eine Stopp-Monomer-Einheit
eine blockierte reaktive Gruppe, wie ein Acetamid anstelle eines primären Amins,
wie in Beispiel 5a unten gezeigt ist, enthalten. In noch anderen
Ausführungsformen
weist die Stopp-Monomer-Einheit einen biotinylierten Terminus auf,
der einen angenehmen Weg zum Beendigen des Polymerisierungsschrittes
und zum Reinigen des resultierenden Polymers bereitstellt.
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Transfer-Einheit
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Wie
oben beschrieben ist, werden in dem Verfahren der Erfindung ebenfalls
Transfereinheiten bereitgestellt, welche ein Antikodon und eine
reaktive Einheit aufweisen. Es ist erkennbar, dass die in der vorliegenden
Erfindung verwendeten Antikodons konstruiert sind, um zu den Kodons
komplementär
zu sein, die innerhalb der Nukleinsäure-Matrize vorhanden sind,
und sollten unter Berücksichtigung
der Nukleinsäure-Matrize und
der Kodons, die darin verwendet werden, konstruiert werden. Zum
Beispiel müssen
die in der Matrize verwendeten Sequenzen sowie die Länge der
Kodons beim Entwickeln der Antikodons berücksichtigt werden. Jedes Molekül, welches
zu einem Kodon komplementär
ist, welches in der Matrize verwendet wird, kann in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden (z.B. Nukleotide oder nicht-natürliche
Nukleotide). In bestimmten Ausführungsformen
weisen die Kodons eine oder mehrere in der Natur gefundenen Basen
auf (d.h. Thymidin, Uracil, Guanidin, Cytosin, Adenin). In bestimmten
anderen Ausführungsformen
weist das Antikodon ein oder mehrere Nukleotide auf, die normalerweise
in der Natur mit einer Base, einem Zucker und einer wahlweisen Phosphatgruppe
gefunden werden. In noch anderen Ausführungsformen werden die Basen
entlang eines Rückgrates
aufgereiht, welches kein Zucker-Phosphat-Rückgrat ist, welches normalerweise
in der Natur gefunden wird (z.B. nicht natürliche Nukleotide).
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Wie
oben diskutiert ist, ist das Antikodon mit einer besonderen Art
von reaktiven Einheit assoziiert, um eine Transfereinheit zu bilden.
Es ist erkennbar, dass diese reaktive Einheit eine eindeutige Einheit
repräsentieren
kann oder Teil der Funktionalität
der Antikodon-Einheit sein kann (siehe Beispiel 9). In bestimmten
Ausführungsformen
ist jede Antikodon-Sequenz mit einer Monomerart assoziiert. Zum
Beispiel kann die Antikodon-Sequenz ATTAG mit einem Carbamat-Rest
mit einer Isobutyl-Seitenkette assoziiert sein, und die Antikodon-Sequenz
CATAG kann mit einem Carbamat-Rest mit einer Phenylseitenkette assoziiert
sein. Diese Eins-für-Eins Kartierung
von Antikodon zu Monomer-Einheiten ermöglicht, dass jedes Polymer
der Bibliothek durch Sequenzieren der Nukleinsäure-Matrize, die in der Synthese
verwendet wird, dekodiert wird und ermöglicht, dass dasselbe Polymer
oder ein verwandtes Polymer durch Wissen der Sequenz des ursprünglichen
Polymers synthetisiert wird.. Es wird durch einen Fachmann erkannt,
dass durch Ändern
(z.B. Mutieren) der Sequenz der Matrize, unterschiedliche Monomer-Einheiten
an die Stelle gebracht werden, wodurch die Synthese von verwandten
Polymeren ermöglicht
wird, welche im Anschluss selektiert und entwickelt werden können. In bestimmten
bevorzugten Ausführungsformen
können
mehrere Antikodons eine Monomer-Einheit,
wie in der Natur der Fall ist, kodieren.
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In
bestimmten anderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, wo eine kleine Molekülbibliothek erzeugt werden
soll, anstelle einer Polymer-Bibliothek, ist das Antikodon mit einem
Reaktant, welches verwendet wird, um das kleine Molekülgerüst zu modifizieren,
assoziiert. In bestimmten Ausführungsformen
ist der Reaktant mit dem Antikodon durch einen Linker assoziiert,
der lang genug ist, um den Reaktant zu ermöglichen, in Kontakt mit dem
kleinen Molekülgerüst zu kommen.
Der Linker sollte vorzugsweise eine solche Länge und Zusammensetzung aufweisen,
um intramolekular Reaktionen zu ermöglichen und um intermolekular Reaktionen
zu minimieren. Die Reaktanten enthalten eine Vielzahl von Reagenzien,
wie durch eine große
Anzahl von Reaktionen demonstriert wird, die in der DNA-Matrizen basierenden
Synthese ausgenutzt werden können
(siehe Beispiele 2, 3 und 4 hierin) und können eine beliebige chemische
Gruppe, Katalysator (z.B. organometallische Verbindung) oder reaktiver
Anteil (z.B. Elektrophile, Nukleophile), die auf dem chemischen Gebiet
bekannt sind, sein.
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Zusätzlich kann
die Assoziation zwischen dem Antikodon und der Monomeren-Einheit,
oder Reaktant in der Transfereinheit kovalent oder nicht-kovalent
sein. In bestimmten Ausführungsformen
von speziellem Interesse ist die Assoziation durch eine kovalente
Bindung und in bestimmten Ausführungsformen
ist die kovalente Bindung trennbar. Die Bindung kann durch Licht,
Oxidation, Hydrolyse, Exposition zu Säure, Exposition zu Base, Reduktion,
gespalten werden. Für
Beispiele von Bindungen, die in diesem Fach verwendet werden, siehe
bitte Fruchtel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17, 1996. Das
Antikodon und die Monomer-Einheit oder
Reaktant können
durch nicht-kovalten Interaktionen, wie ionische, elektrostatische,
Wasserstoffbindung, van der Waals Interaktionen, hydrophobe Interaktionen,
pi-stacking, etc. und Kombinationen davon, assoziiert sein. Um nur
ein Beispiel zu geben, kann das Antikodon an Biotin gebunden sein,
und die Monomer-Einheit kann an Streptavidin gebunden sein. Die
Neigung von Streptavidin an Biotin zu binden, führt zu einer nicht kovalenten
Assoziation zwischen dem Antikodon und der Monomer-Einheit, um eine
Transfer-Einheit zu bilden.
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Synthese von
bestimmten beispielhaften Verbindungen
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Es
ist erkennbar, dass eine Vielzahl von Verbindungen und/oder Bibliotheken
unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung hergestellt werden
können.
Wie oben diskutiert ist, werden in bestimmten Ausführungsformen
von speziellem Interesse Verbindungen, die keine Nukleinsäuren oder
Analoga davon sind, und diesen nicht ähneln, gemäß dem Verfahren der Erfindung
synthetisiert.
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In
bestimmten Ausführungsformen
werden Polymere, insbesondere unnatürliche Polymere gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung hergestellt. Die unnatürlichen
Polymere, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Systems
erzeugt werden können,
enthalten jedes nicht-natürliche
Polymer. Beispielhafte unnatürliche
Polymere enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Polycarbamate,
Polyharnstoffe, Polyester, Polyacrylate, Polyalkylene (z.B. Polyethylen,
Polypropylen), Polycarbonate, Polypeptide mit unnatürlicher
Stereochemie, Polypeptide mit unnatürlichen Aminosäuren, und
Kombinationen davon. In bestimmen Ausführungsformen weisen die Polymere
zumindest zehn Monomer-Einheiten
auf. In bestimmten anderen Ausführungsformen
weisen die Polymere zumindest 50 Monomer-Einheiten auf. In noch
anderen Ausführungsformen
weisen die Polymeren zumindest 100 Monomer-Einheiten auf. Die unter
Verwendung des erfindungsgemäßen Systems
synthetisierten Polymere können
als Katalysator, Pharmazeutika, Metallchelatoren, Materialien, etc.
verwendet werden.
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Beim
Herstellen bestimmter unnatürlicher
Polymere, können
die Monomer-Einheiten, die an die Antikodons angeheftet sind, und
in der vorliegenden Erfindung ein beliebiges verwendet wurden, Monomer
oder Oligomer sein, das in der Lage ist, zusammengebunden zu werden,
um ein Polymer zu bilden. Die Monomer-Einheiten können Carbomate,
D-Aminosäuren,
unnatürliche
Aminosäuren,
Harnstoffe, Hydroxysäuren, Ester,
Carbonate, Acrylate, Ether, etc. sein. In bestimmten Ausführungsformen
weisen die Monomer-Einheiten zwei reaktive Gruppen auf, die verwendet
werden, um die Monomer-Einheit in die wachsende Polymerkette zu binden.
Vorzugsweise sind die reaktiven Gruppen nicht dieselben, so dass
die Monomer-Einheit in das Polymer in einer direktionalen Richtung
eingebaut wird, z.B. kann an einem Ende ein Elektrophil sein und
an dem anderen Ende ein Nukleophil. Zu reaktiven Gruppen können, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Ester, Amide, Carbonsäuren,
aktivierte Carbonylgruppen, Säurechloride,
Amine, Hydroxylgruppen, Thiole etc. zählen. In bestimmten Ausführungsformen sind
die reaktiven Gruppen maskiert oder geschützt (Greene & Wuts Protective Groups
in Organic Synthesis, 3. Ausgabe Wiley, 1999), so dass die Polymerisierung
bis zu einem gewünschten Zeitpunkt
nicht stattfinden kann, wenn die reaktiven Gruppen schutzeliminiert
werden. Sobald die Monomer-Einheiten entlang der Nukleinsäure-Matrize
zusammengebaut sind, resultiert die Initiierung der Polymerisierungssequenz
in einer Kaskade von Polymerisierungs- und Schutzeliminierungsschritten,
wobei der Polymerisierungsschritt zu der Schutzeliminierung einer
reaktiven Gruppe führt,
die in einem nachfolgenden Polymerisierungsschritt verwendet wird
(siehe 3).
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Die
zu polymerisierenden Monomer-Einheiten können zwei oder mehrere Einheiten
aufweisen, in Abhängigkeit
von der Geometrie entlang der Nukleinsäure-Matrize. Wie durch einen
Fachmann erkennbar ist, müssen
die zu polymerisierenden Monomer-Einheiten in der Lage sein, sich
entlang der Nukleinsäure-Matrize und
insbesondere über
die Entfernung, die durch sein kodierendes Antikodon und wahlweisen
Spacersequenz umspannt ist, zu erstrecken. In bestimmten Ausführungsformen
weist die Monomer-Einheit tatsächlich
zwei Monomere auf, z.B. ein Dicarbamat, ein Diharnstoff, ein Dipeptid,
etc. In noch anderen Ausführungsformen weist
die Monomer-Einheit tatsächlich
drei oder mehrere Monomere auf.
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Die
Monomer-Einheiten können
jede chemische Gruppe, die im Stand der Technik bekannt ist, enthalten.
Wie durch einen Fachmann erkennbar ist, werden reaktive chemische
Gruppen, insbesondere jene, die mit der Polymerisierung, Hybridisierung,
etc. interferieren würden,
unter Verwendung bekannter Schutzgruppen maskiert (Greene & Wuts Protective
Groups in Organic Synthesis, 3 Ausgabe Wiley 1999). Im Allgemeinen sind
die Schutzgruppen, die verwendet werden, um diese reaktiven Gruppen
zu maskieren, orthogonal zu jenen, die zum Schützen der Gruppen verwendet
werden, die in den Polymerisierungsschritten verwendet werden.
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Beim
Synthetisieren eines unnatürlichen
Polymers wird in bestimmten Ausführungsformen
eine Matrize bereitgestellt, die die Sequenz von Monomer-Einheiten
kodiert. Den Transfer-Einheiten wird dann ermöglicht, die Matrize unter Bedingungen
zu kontaktieren, die eine Hybridisierung der Antikodons an die Matrize ermöglichen.
Der Polymerisierung der Monomereinheiten entlang der Matrize wird
dann ermöglicht
stattzufinden, um das unnatürliche
Polymer zu bilden. Das neu synthetisierte Polymer kann dann von
den Antikodons und/oder der Matrize gespalten werden. Die Matrize
kann dann als ein Tag verwendet werden, um die Struktur des Polymer
aufzuklären
oder kann verwendet werden, um das unnatürliche Polymer zu amplifizieren
und zu entwickeln. Wie unten detaillierter beschrieben ist, kann
das vorliegende Verfahren verwendet werden, um eine Bibliothek von
unnatürlichen
Polymeren herzustellen. Zum Beispiel kann in bestimmten Ausführungsformen,
wie in Beispiel 9 hierin detaillierter beschrieben ist, eine Bibliothek
von DNA-Matrizen benutzt werden, um unnatürliche Polymere herzustellen.
Im Allgemeinen nutzt das Verfahren die Tatsache aus, dass bestimmte DNA-Polymerasen
in der Lage sind, bestimmte modifizierte Nukleotidtriphosphat-Substrate
zu akzeptieren, und das mehrere Deoxyribonnuekleotide und Ribonukleotide,
die modifizierte Gruppen tragen, nicht in Watson-Crick Bindung teilnehmen,
dafür bekannt
sind, mit hoher Sequenzspezifität
gegenüber
natürlichen DNA-Matrizen
eingebaut zu werden. Dementsprechend können einzelsträngige DNA,
die modifizierte Nukleotide enthalten, als wirksame Matrizen für den DNA-Polymerase
katalysierten Einbau von natürlichen
oder modifizierten Nukleotiden dienen.
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Es
ist erkennbar, dass die erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls verwendet
werden können,
um andere Klassen von chemischen Verbindungen abgesehen von unnatürlichen
Polymeren zu synthetisieren. Zum Beispiel können kleine Moleküle unter
Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen, die durch die vorliegende
Erfindung vorgesehen sind, hergestellt werden. Diese kleinen Moleküle können Naturprodukt-ähnlich,
nicht polymer, und/oder nicht-oligomer sein. Das beachtliche Interesse
an kleinen Molekülen
ist teilweise aufgrund ihrer Verwendung als aktive Wirkstoffe in
vielen pharmazeutischen Zubereitungen, obwohl sie ebenfalls als
Katalysatoren, Materialien, Zusatzstoffen, etc. verwendet werden
können.
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Zum
Synthetisieren kleiner Moleküle
unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird
eine entwickelbare Matrize ebenfalls bereitgestellt. Die Matrize
kann entweder ein kleines Molekülgerüst aufweisen,
auf welches das kleine Molekül
aufgebaut wird, oder ein kleines Molekülgerüst kann zu der Matrize hinzugefügt werden.
Das kleine Molekülgerüst kann
jede chemische Verbindung mit Stellen für die Funktionalisierung sein.
Zum Beispiel kann das kleine Molekülgerüst ein Ringsystem (zum Beispiel,
das ABCD Steroidringsystem, das in Cholesterol gefunden wird) mit
funktionalisierbaren Gruppen von den Atomen, die den Ring ausmachen
aufweisen. In einem anderen Beispiel kann das kleine Molekül die zugrundeliegende
Struktur eines pharmazeutischen Wirkstoffes wie Morphin oder ein
Cephalosporin Antibiotikum sein (siehe Beispiele 5C und 5D, unten).
Die zu funktionalisierenden Stellen oder Gruppen auf dem kleinen
Molekülgerüst können unter Verwendung
im Stand der Technik bekannter Verfahren und Schutzgruppen geschützt werden.
Die in dem kleinen Molekülgerüst verwendeten
Schutzgruppen können
zueinander orthogonal sein, so dass die Schutzgruppen, eine nach
den anderen, entfernt werden kann.
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In
dieser Ausführungsform
weisen die Transfer-Einheiten ein Antikodon auf, welches ähnlich zu
jenen ist, die in der unnatürlichen
Polymersynthese beschrieben sind; jedoch sind diese Antikodons mit
Reaktanten oder Baueinheiten assoziiert, um bein Modifizieren, beim
Hinzufügen
oder beim Wegnehmen von dem kleinen Molekülgerüst verwendet zu werden. Die
Reaktanten oder Baueinheiten können
Elektrophile (z.B. Acetyl, Amide, Säurechloride, Ester, Nitrile,
Imine), Nukleophile (z. B. Amine, Hydroxyl-Gruppen, Thiole), Katalysatoren (z.B.
organometallische Katalysatoren), Seitenketten etc. sein. Siehe
zum Beispiel Reaktionen in wässrigen und
organischen Medien, wie hierin in den Beispielen 2 und 4 beschrieben
ist. Den Transfer-Einheiten wird ermöglicht, die Matrize unter Hybridisierungsbedingungen
zu kontaktieren, und dem angehefteten Reaktant oder der angehefteten
Baueinheit wird es ermöglicht,
mit einer Stelle auf dem kleinen Molekülgerüst zu reagieren. In bestimmten
Ausführungsformen
werden die Schutzgruppen auf der kleinen Molekül-Matrize, eine nach dem anderen,
von der zu funktionalisierenden Stellen entfernt, so dass der Reaktant
der Transfer-Einheit nur
an der gewünschten
Position auf dem Gerüst
reagieren wird. Wie durch einen Fachmann erkennbar ist, kann das
Antikodon mit dem Reaktant durch einen Linkeranteil assoziiert sein
(siehe Beispiel 3). Der Linker erleichtert den Kontakt des Reaktanten
mit dem kleinen Molekülgerüst und in
bestimmten Ausführungsformen, abhängig von
der gewünschten
Reaktion, positionierte die DNA als eine Abgangsgruppe („selbstspaltbare" Strategie), oder
kann die reaktiven Gruppen an die Matrize über die „narbenlose" Linkerstrategie
binden (welche Produkt ergibt, ohne eine zusätzliche chemische Funktionalität zurückzulassen),
oder eine „nützliche
Narben" Strategie,
(in welcher der Linker zurückgelassen
wird und in nachfolgenden Schritten im Anschluss an die Linkerspaltung
funktionalisiert werden kann). Die Reaktionsbedingungen, Linker,
Reaktant, und zu funktionalisierende Stelle wird ausgewählt, um
intermolekulare Reaktionen zu vermeiden und intramolekulare Reaktionen
zu beschleunigen. Es ist ebenfalls erkennbar, dass das Verfahren
der vorliegenden Erfindung sowohl sequenzielles als auch simultanes
Kontaktieren der Matrize mit Transfer-Einheiten umfasst, abhängig von
der bestimmten Verbindung, die zu synthetisieren ist. In bestimmten
Ausführungsformen
von speziellem Interesse wird die mehrstufige Synthese von chemischen
Verbindungen bereitgestellt, in welcher die Matrize sequenziell mit
zwei oder mehreren Transfereinheiten kontaktiert wird, um die mehrstufige
Synthese von komplexen chemischen Verbindungen zu erleichtern.
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Nachdem
die Stellen auf dem Gerüst
modifiziert wurden, wird das neu synthetisierte kleine Molekül an die
Matrize gebunden, die die Synthese kodiert. Durch das Dekodieren
des Matrizen-Tags wird ermöglicht,
die synthetische Historie, und dadurch die Struktur des kleinen
Moleküls
aufzuklären.
Die Matrize kann ebenfalls amplifiziert werden, um mehr von dem
gewünschten
kleinen Molekül
zu erzeugen, und/oder die Matrize kann entwickelt werden, um verwandte
kleine Moleküle
zu erzeugen. Das kleine Molekül
kann ebenfalls von der Matrize für
die Reinigung oder das Screening abgespalten werden.
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Wie
durch einen Fachmann erkennbar ist, kann eine Vielzahl von Matrizen
verwendet werden, um die Synthese einer kombinatorischen Bibliothek
von kleinen Molekülen
unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zu kodieren.
Dies würde
die Amplifikation und Entwicklung einer kleinen Molekülbibliothek
ermöglichen,
eine Leistung, welche vor der vorliegenden Erfindung noch nicht
erreicht wurde.
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Verfahren
zum Synthetisieren von Bibliotheken von Verbindungen
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird einen Nukleinsäure-Matrize,
wie oben beschrieben, bereitgestellt, um die Synthese eines unnatürlichen
Polymers, eines kleinen Moleküls,
oder einer beliebigen anderen Art von Molekül von Interesse zu lenken.
Im Allgemeinen wird eine Vielzahl von Nukleinsäure-Matrizen bereitgestellt,
wobei die Anzahl von unterschiedlichen Sequenzen, die bereitgestellt
sind, von 2 bis 1015 reichen. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Vielzahl von Nukleinsäure-Matrizen
bereitgestellt, vorzugsweise zumindest 100 unterschiedliche Nukleinsäure-Matrizen,
noch mehr bevorzugt zumindest 10.000 unterschiedliche Nukleinsäure-Matrizen,
und am meisten bevorzugt zumindest 1.000.000 unterschiedliche Nukleinsäure-Matrizen.
Jede bereitgestellte Matrize weist eine einzigartige Nukleinsäure-Sequenz
auf, die verwendet wird, um die Synthese eines bestimmten unnatürlichen
Polymers oder kleinen Moleküls
zu kodieren. Wie oben beschrieben, kann die Matrize ebenfalls eine
Funktionalität,
wie ein primäres Amin,
von welchem die Polymerisierung ausgelöst wird, oder ein kleines Molekülgerüst aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen
werden die Nukleinsäure-Matrizen
in einem „Gefäß" bereitgestellt.
In bestimmten anderen Ausführungsformen
werden die Matrizen in wässrigen
Medien bereitgestellt, und nachfolgende Reaktionen werden in wässrigen
Medien ausgeführt.
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Zu
der Matrize werden Transfer-Einheiten mit Antikodons, wie oben beschrieben,
die mit einer Monomer-Einheit, wie oben beschrieben, assoziiert
sind, hinzugefügt.
In bestimmten Ausführungsformen
wird eine Vielzahl von Transfereinheiten bereitgestellt, so dass
es ein Antikodon für
jedes in der Matrize repräsentierte Kodon
gibt. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden bestimmte Antikodons als Start und Stoppstellen verwendet.
Im Allgemeinen wird eine groß genuge
Anzahl von Transfer-Einheiten bereitgestellt, so dass alle entsprechenden
Kodonstellen auf der Matrize nach der Hybridisierung aufgefüllt sind.
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Den
Antikodons auf den Transfereinheiten wird ermöglicht, an die Nukleinsäure-Matrize
zu hybridisieren, wodurch die Monomer-Einheiten in einer spezifischen
Sequenz, wie durch die Matrize bestimmt ist, zusammengebracht werden.
In der Situation, wo eine kleine Molekül-Bibliothek synthetisiert wird, werden
die Reaktanten in Nähe
eines kleinen Molekülgerüstes gebracht.
Die Hybridisierungsbedingungen, wie durch einen Fachmann erkennbar
ist, sollten vorzugsweise nur eine perfekte Übereinstimmung zwischen dem
Kodon und seinem Antikodon ermöglichen.
Sogar eine Einzelbasenpaar-Nichtübereinstimmung
sollte vermieden werden. Hybridisierungsbedingungen können beinhalten,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Temperatur, Salzkonzentration, pH, Matrizenkonzentration,
Antikodonskonzentration und Lösungsmittel.
Die für
das Synthetisieren der Bibliothek verwendeten Hybridisierungsbedingungen
können
von der Länge
des Kodons/Antikodons, der Ähnlichkeit
zwischen den Kodons, die in den Matrizen vorhanden sind, dem Gehalt
von G/C versus A/T Basenpaaren, etc. abhängen (für weitere Informationen in
Bezug auf die Hybridisierungsbedingungen, siehe bitte, Molecular
Cloning: A. Laboratory Manula, 2. Ausgabe., herausgegeben durch
Sambrook, Fritsch, und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press:
1989); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins Herausgeber, 1984);
die Abhandlung, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);
Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New
York, 1999);
Nachdem die Hybridisierung der Antikodons an die
Kodons auf der Matrize stattgefunden haben, werden dann die Monomer-Einheiten
in dem Fall der Synthese eines unnatürlichen Polymers polymerisiert.
Die Polymerisierung der Monomer-Einheiten kann spontan stattfinden
oder müssen
initiiert werden, zum Beispiel durch die Schutzeliminierung einer
reaktiven Gruppe, wie ein Nukleophil oder durch das Bereitstellen
von Licht einer bestimmten Wellenlänge. In bestimmten anderen
Ausführungsformen
können
Polymere durch DNA-Polymerisierung katalysiert werden, die in der
Lage sind, eine Polymerisierung von nicht-natürlichen
Nukleotiden zu bewirken (siehe Beispiel 9). Die Polymerisierung
findet vorzugsweise in einer Richtung entlang der Matrize mit benachbarten
Monomer-Einheiten, die durch eine kovalente Bindung verbunden werden,
statt. Die Beendigung des Polymerisierungsschrittes findet durch
die Zugabe einer Monomer-Einheit statt, die nicht in der Lage ist,
hinzugefügt
zu werden. Im Falle der Synthese von kleinen Molekülen wird
den Reaktanten ermöglicht,
mit dem kleinen Molekülgerüst zu reagieren.
Der Reaktant kann spontan reagieren, oder Schutzgruppen auf den Reaktant
und/oder dem kleinen Molekülgerüst müssen entfernt
werden. Andere Reagenzien (z.B. Säure, Base Katalysator, Wasserstoffgas,
etc) können
ebenfalls benötigt
werden, um die Reaktion zu bewirken (siehe Beispiel 5A–5E).
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Nachdem
die unnatürlichen
Polymere oder kleine Moleküle
mit der Hilfe der Nukleinsäure-Matrize
erzeugt wurden, können
sie von der Nukleinsäure-Matrize
und/oder Antikodons, die verwendet wurden, um sie zu synthetisieren,
abgespalten werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Polymere
oder kleine Moleküle,
bevor sie vollständig
von den Nukleinsäure-Matrizen,
die sie kodieren, abgelöst
werden, untersucht. Sobald das Polymer oder kleine Molekül ausgewählt ist,
kann die Sequenz der Matrize oder ihres Komplementes bestimmt werden,
um die Struktur des angehefteten Polymers oder kleinen Moleküls aufzuklären. Diese Sequenz
kann dann amplifziert und/oder entwickelt werden, um neue Bibliotheken
von verwandten Polymeren oder kleinen Molekülen zu entwickeln, die wiederum
gescreent oder entwickelt werden können.
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Verwendungen
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Die
Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen
einen neuen Weg, um Moleküle
mit gewünschten
Eigenschaften zu erzeugen, dar. Dieser Ansatz verbindet die extrem
leistungsfähigen
genetischen Verfahren, die Molekularbiologen für Dekaden ausgenutzt haben,
mit der Flexibilität
und Leistung der organischen Chemie. Die Fähigkeit, um unnatürliche Polymere
durch genetische Selektion herzustellen, zu amplifizieren und zu
entwickeln, kann zu neuen Klassen von Katalysatoren führen, die
Aktivität,
Bioverfügbarkeit,
Stabilität,
Fluorescenz, Photolabilität
oder andere Eigenschaften besitzen, unter Verwendung der eingeschränkten Menge
an Baueinheiten, die in Proteinen und Nukleinsäuren gefunden werden, die schwierig oder
unmöglich
zu erreichen sind. Ähnlicherweise
kann das Entwickeln neuer Systeme für das Herstellen, Amplifizieren
und Entwickeln von kleinen Molekülen
durch sich wiederholende Zyklen an Mutation und Selektion zu der
Isolierung von neuartigen Liganden oder Arzneimitteln mit Eigenschaften,
die jenen, die durch die langsameren traditionellen Arzneimittelentdeckungsverfahren
isoliert wurden, überlegen
sind, führen
(siehe Beispiel 7).
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Das
Durchführen
organischer Bibliothekssynthese in einem molekular biologischen
Maßstab
ist ein grundsätzlich
unterschiedlicher Ansatz zu der traditionellen Festphasenbibliotheks-Synthese
und trägt
signifikante Vorteile. Eine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
erzeugte Bibliothek kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik
bekannten Verfahren gescreent werden (z.B. Bindungsuntersuchung,
katalytische Untersuchung). Zum Beispiel kann die Selektion basierend
auf der Bindung auf ein Zielmolekül an der gesamten Bibliothek
ausgeführt
werden, in dem die Bibliothek über
ein Harz, welches kovalent an das Ziel gebunden ist, geleitet wird.
Jene Biopolymere, die eine Affinität für das Harz-gebundene Ziel aufweisen,
können
mit freien Zielmolekülen
eluiert werden, und die selektiven Verbindungen können den
unter der Verwendung oben beschriebenen Verfahren amplifiziert werden.
Nachfolgende Selektions- und Amplifikationsrunden können zu
einem Pool an Verbindungen führen,
die mit Sequenzen angereichert sind, die an das Zielmoleküle binden.
In bestimmten Ausführungsformen
ahnt das Zielmolekül
einen Übergangszustand
einer chemischen Reaktion nach, und die ausgewählten chemischen Verbindungen
können
als ein Katalysator für
die chemische Reaktion dienen. Da die Information, die die Synthese
von jedem Molekül
kodiert, kovalent an das Molekül
an einem Ende angelagert ist, kann eine gesamte Bibliothek auf einmal
gescreent werden und dennoch wird jedes Molekül auf einer individuellen Basis
ausgewählt.
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Eine
solche Bibliothek kann ebenfalls durch Einführen von Mutationen auf der
DNA-Ebene unter
Verwendung der error-prone PCR entwickelt werden (Cadwell et al.
PCR Methods Appl. 2:28, 1992;) oder durch Unterziehen der DNA einer
in vitro homologen Rekombination (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91:10747, 1994; Stemmer Nature 370:389, 1994; jede von ihnen
ist aufgenommen). Wiederholte Zyklen an Selektion, Amplifikation,
Mutation, kann Polymere mit stark erhöhter Bindungsaffinität für Zielmoleküle oder
mit signifikant verbesserten katalytischen Eigenschaften liefern.
Der Endpool an entwickelten Biopolymeren mit den gewünschten
Eigenschaften kann durch Sequenzieren der von den Polymeren abgespalteten
Nukleinsäure
sequenziert werden. Die Nukleinsäure-freien
Polymere können
unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt
werden, einschließlich
HPLC, Säulenchromatographie,
FLPC, etc, und seine Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften
können
in der Abwesenheit von kovalent angelagerter Nukleinsäure verifiziert
werden.
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Die
Polymerisierung von synthetisch erzeugten Monomer-Untereinheiten
unabhängig
von der ribosomalen Maschinerie ermöglicht den Einbau von einer
großen
Vielzahl von Seitenketten mit neuartigen chemischen, biophysikalischen
oder biologischen Eigenschaften. Das Abschließen jedes Biopolymers mit einer
Biotinseitenkette, z.B., ermöglicht
die leichte Reinigung von nur Biopolymeren mit voller Länge, welche
vollständig
translatiert wurden, in dem die Bibliothek durch ein Avidin-gebundenes
Harz geleitet wird. Biotin-begrenzte Biopolymere können für die aktuelle
Katalyse von Bindungs-brechenden Reaktionen selektiert werden, indem diese
Polymere über
ein Harz, welches über
das Substrat an Avidin gebunden ist, geleitet werden (5). Jene
Biopolymere, die die Substratspaltung katalysieren, würden von
der Säule,
die mit diesem Harz geladen ist, selbst eluieren. Ähnlicherweise
können
Biotin-begrenzte
Biopolymere für
die Katalyse von Bindungs-bildenden Reaktionen selektiert werden
(5). Ein Substrat ist an das Harz gebunden und
das zweite Substrat ist an Avidin gebunden. Biopolymere, die die
Bindungsbildung zwischen den Substraten katalysieren, werden durch
ihre Fähigkeit,
die Substrate zusammen zu legieren ausgewählt, was zu der Anlagerung
des Biopolymers an das Harz führt.
Neuartige Seitenketten können
ebenfalls verwendet werden, um einen Cofaktor in die Biopolymere
einzuführen.
Eine Seitenkette, die einen Metallchelator enthält, kann z.B. Biopolymere mit
Metall-vermittelten katalytischen Eigenschaften bereitstellen, während eine
Flavin-enthaltende Seitenkette Biopolymere mit dem Potenzial, eine
Redox Reaktion zu katalysieren, ausstatten kann.
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Auf
diese Weise können
unnatürliche
Biopolymere isoliert werden, welche als künstliche Rezeptoren dienen,
um Moleküle
selektiv zu binden, oder welche chemische Reaktionen katalysieren.
Die Charakterisierung dieser Moleküle würde eine wichtige Erkenntnis
in die Fähigkeit
von Polycarbamaten, Polyharnstoffen, Polyesters, Polycarbonaten,
Polypeptiden mit unnatürlichen
Seitenketten und Stereochemien, oder anderen unnatürlichen
Polymeren bereitstellen, um sekundäre oder tertiäre Strukturen
mit Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften zu bilden.
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Ausrüstungssätze
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Ausrüstungssätze und
Zusammensetzungen für
die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren können ebenfalls
bereitgestellt werden. Die Ausrüstungssätze können jeder
Einheit oder Zusammensetzung enthalten, die beim Ausführen der
vorliegenden Erfindung nützlich
sind. Die Ausrüstungssätze können enthalten,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Matrizen, Antikodons, Transfereinheiten, Monomer-Einheiten,
Baueinheiten, Reaktanten, kleine Molekülgerüste, Puffer, Lösungsmittel,
Enzyme (z.B. hitzestabile Polymerase, Umkehrtranskriptase, Ligase,
Restriktionsendonuklease, Exonuklease, Klenow Fragment, Polymerase,
Alkalische Phosphatase, Polynukleotidkinase) Linker, Schutzgruppen,
Polynukleotide, Nukleotide, Nukleotide, Salze, Säuren, Basen, Feststoffträger, oder
jede Kombination davon.
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Wie
durch einen Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar ist, würde ein
Ausrüstungssatz
zum Herstellen von unnatürlichen
Polymeren Gegenstände
enthalten, die benötigt
werden, um unter Verwendung der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
unnatürliche
Polymere herzustellen. Ein solcher Ausrüstungssatz kann Matrizen, Antikodons,
Transfereinheiten, Monomereinheiten, oder Kombinationen davon enthalten.
Ein Ausrüstungssatz
zum Synthetisieren kleiner Moleküle
kann Matrizen, Antikodons, Transfer-Einheiten, Baueinheiten, kleine Molekülgerüste oder
Kombinationen davon enthalten.
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Der
Ausrüstungssatz
kann ebenfalls mit Gegenständen,
die zum Amplifizieren und/oder Entwickeln einer Polynukleotid-Matrize
benötigt
werden, wie eine hitzestabile Polymerase für die PCR, Nukleotide, Puffer und
Primer ausgerüstet
sein. Der Ausrüstungssatz
kann ebenfalls Gegenstände,
die häufig
zum Ausführen des
DNA shuffling verwendet werden, wie Polynukleotide, Ligase und Nukleotide,
enthalten.
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Zusätzlich zu
den Matrizen und Transfer-Einheiten, die hierin beschrieben sind,
enthält
die vorliegende Erfindung auch Zusammensetzungen, die komplexe kleine
Moleküle,
Gerüste
oder unnatürliche
Polymere aufweisen, die durch ein beliebiges oder durch mehrere
der Verfahren der Erfindung, wie hierin beschrieben, hergestellt
wurden.
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ÄQUIVALENTE
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Die
repräsentativen
Beispiele, die nun folgen, sind beabsichtigt, die Erfindung illustrieren
zu helfen, und sind nicht beabsichtigt, und sind auch nicht dahingehend
auszulegen, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken. Verschiedene
Modifikationen der Erfindung und viele weitere Ausführungsformen
davon, zusätzlich
zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, werden tatsächlich für den Fachmann
aus dem vollen Inhalt dieses Dokumentes, einschließlich der
Beispiele, welche folgen und den Referenzen zu der wissenschaftlichen
und Patentliteratur, die hierin zitiert ist, offensichtlich.
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Die
folgenden Beispiele enthalten wichtige zusätzliche Informationen, Erläuterungen
und Anleitungen, die zum Ausführen
dieser Erfindung in seinen verschiedenen Ausführungsformen und den Äquivalenten
davon angepasst werden können.
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ERLÄUTERUNGEN
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Beispiel 1: Die Allgemeingültigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese:
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Die
Umsetzung des kleinen Molekül
Evolutionsansatzes, der oben beschrieben ist, erfordert das Etablieren
der Allgemeingültigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese. Die vorliegende Erfindung
etabliert, für
das erste Mal, die Allgemeingültigkeit
dieses Ansatzes und ermöglicht
somit die Synthese einer Vielzahl von chemischen Verbindungen unter
Verwendung der DNA-Matrizen
basierenden Synthese. Wie in 6a gezeigt
ist, wurde die Fähigkeit
von zwei DNA Architekturen, die Lösungs-Phase DNA-Matrizen basierende Synthese
zu unterstützen,
etabliert. Sowohl Haarnadel (H) als auch End-von-Helix (E) Matrizen,
die elektrophile Maleimid Gruppen tragen, reagierten wirksam mit
einem Äquivalent
Thiolreagenz, welches an ein komplementäres DNA-Oligonukleotid gebunden
ist, um das Thioether-Produkt in Minuten bei 25°C zu ergeben. Die DNA-Matrizen
basierenden Reaktionsraten (kapp = ~105 M–1 s–1)
waren für
H und E Architekturen ähnlich,
trotz signifikanter Unterschiede in der relativen Orientierung ihrer
reaktiven Gruppen. Im Gegensatz wurde kein Produkt beobachtet, wenn
Reagenzien verwendet wurden, die Sequenz-Nichtübereinstimmungen enthalten,
oder wenn Matrizen verwendet wurden, die mit einem Überschuss
an β-Mercaptoethanol
vorgelöscht
wurden (6a). Beide Matrizen unterstützen deshalb
die Sequenz-spezifische DNA-Matrizen basierende Addition eines Thiols
an ein Maleimid, obwohl die Strukturen der resultierenden Produkte
sich markant von der Struktur des natürlichen DNA-Rückgrats
unterscheiden. Weniger oder keine nicht-Matrizen intermolekulare
Reaktionsprodukte wurden unter den Reaktionsbedingungen beobachtet
(pH 7,5, 25°C,
250 mM NaCl, 60 nM Matrize und Reagenz).
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Zusätzlich umspannen
Sequenz-spezifische DNA Matrizen basierende Reaktionen eine Vielzahl
von Reaktionsarten (SN2 Substitutionen,
Additionen an α,β-ungesättigte Carbonylsysteme,
und Additionen an Vinylsulfone), Nukleophile (Thiole und Amine),
und Reaktantenstrukturen, alle verliefen in einer guten Ausbeute mit
exzellenter Sequenzselektivität
(6b). Die erwarteten Produktmassen wurden durch
Massen-Spektrometrie verifiziert. In jedem Fall ergaben übereinstimmende,
jedoch nicht nichtübereinstimmende
Reagenzien, Produkt effizient, trotz beachtlicher Variationen in
ihrer Übergangszustand-Geometrie,
sterischer Hinderung und konformativer Flexibilität. Insgesamt
weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die DNA-Matrizen basierende
Synthese ein allgemeines Phänomen
ist, das in der Lage ist, eine Auswahl von Reaktionsarten zu unterstützen, und
ist nicht auf die Erzeugung von Strukturen, die Nukleinsäure-Rückgraten,
wie früher
beschrieben, ähneln,
beschränkt.
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Da
die Sequenzdiskreminierung für
die genau Translation von DNA in synthetische Strukturen wichtig ist,
wurde die Reaktionsrate eines übereinstimmenden
Reagenzes im Vergleich zu jener, eines Reagenzes, das eine einzelne
nichtübereinstimmende
Base in der Nähe
des Zentrums seines 10- Basen Oligonukleotids trägt, gemessen. Bei 25°C war die
anfängliche
Reaktionsrate von übereinstimmenden
Thiolreagenzen mit Iodoacetamid-gebundenen H-Matrizen 200-fach schneller, als jene
von Reagenzien, die eine einzelne Nichtübereinstimmung tragen (kapp = 2,4 × 104 M–1 s–1 vs-
1,1 × 102 M–1 s–1, 7).
Zusätzlich
können
kleinen Mengen von Produkten, die sich aus dem Anlagern von nichtübereinstimmenden
Reagenzien ergeben, durch Erhöhen der
Reaktionstemperaturen über
die Tm der nichtübereinstimmenden Reagenzien
eleminiert werden (7). Die Abnahme der Produktbildungsrate,
wie die Temperatur erhöht
wird, weist weiters darauf hin, dass die Produktbildung eher über einen
DNA-Matrizen basierenden Mechanismus, als über einen einfachen intermolekularen
Mechanismus verläuft.
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Zusätzlich zu
der Reaktionsallgemeingültigkeit
und Sequenz-Spezifität
demonstriert die DNA-Matrizen basierende Synthese auch eine beachtliche
Entfernungsunabhängigkeit.
Sowohl H als auch E-Matrizen, die an Maleimid oder α-Iodoacetamid
Gruppen gebunden sind, fördern
die Sequenz-spezifische Reaktion mit übereinstimmenden, nicht jedoch
mit nichtübereinstimmenden,
Thiol-Reagenzien, die irgendwo auf den Matrizen, die bis jetzt untersucht
sind, angelagert sind (bis zu 30 Basen entfernt von der reaktiven
Gruppe auf der Matrize). Reaktanten, die nur eine Base entfernt
angelagert sind, reagieren mit ähnlichen
Raten, wie jene, die 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, oder 30 Basen entfernt
angelagert sind (8). In allen Fällen sind
die Matrizen-basierenden Reaktionsraten mehrere 100-fach höher als
die Raten von Nicht-Matrizen (nichtübereinstimmenden) Reaktionen
(kapp = 104 – 105 M–1 s–1 vs.
5 × 101 M–1 s–1).
Bei einer Zwischendistanz von 30 Basen werden die Produkte effizient
gebildet, vermutlich durch Übergangszustände, die
200-gliedrigen Ringen ähneln.
Diese Ergebnisse sind im scharfen Gegensatz zu den bekannten Schwierigkeiten
der Makrozyklisierung (siehe zum Beispiel, G. Illuminati et al.
Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95–102;
R.B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210–3213) in
der organischen Synthese.
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Um
die Basis der Entfernungsunabhängigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese zu bestimmen, wurde eine Reihe
von modifizierten E-Matrizen zuerst synthetisiert, in welchen die
dazwischenliegenden Basen durch eine Reihe von DNA-Analoga ersetzt
wurden, die so konstruiert sind, um den möglichen Beitrag von (i) Interbasen-Interaktionen,
(ii) konformative Präferenzen
des DNA-Rückgrats,
(iii) des geladenen Phosphatrückgrats,
und (iv) der Rückgrat-Hydrophilizität zu evaluieren.
Matrizen, in welchen die dazwischenliegenden Basen mit irgendeinem
der Analoga in 9 ersetzt wurden, hatten eine
geringe Wirkung auf die Produktbildungsrate. Diese Ergebnisse weisen
darauf hin, dass Rückgrat-Strukturelemente,
die für
DNA spezifisch sind, nicht für
die beobachtete Entfernungsunabhängigkeit
der DNA-Matrizen
basierenden Synthese verantwortlich sind. Die Addition einer 10-Basen
DNA Oligonukleotid „clamp", die komplementär zu der
einzelsträngigen
dazwischenliegenden Region ist, reduzierte die Produktbildung jedoch
signifikant (9), was darauf hinweist, dass
die Flexibilität
dieser Region für
eine effiziente DNA-Matrizen basierende Synthese kritisch ist.
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Die
Distanz unabhängigen
Reaktionsraten können
erklärt
werden, wenn die Bindungsbildungs-Vorgänge in einem DNA-Matrizen basierenden
Format in Bezug auf ihre nicht-Matrizen
basierenden Gegenstücke ausreichend
beschleunigt sind, so daß eher
die DNA-Anlagerung
Geschwindigkeits-bestimmend ist. Wenn die DNA-Anlagerung zumindest
teilweise Geschwindigkeits-beschränkend ist, dann sollte die
Produktbildungsrate, wie die Konzentration an Reagenzien verringert
wird, abnehmen, da die Anlagerung, im Gegensatz zu der Matrizen
basierenden Bindungsbildung, ein bimolekularer Prozess ist. Die
Verringerung der Reaktanten-Konzentration
in dem Fall der E-Matrize mit einer oder zehn dazwischenliegenden
Basen zwischen den reaktiven Gruppen führte zu einer merklichen Abnahme
der beobachteten Reaktionsrate (10).
Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die Nachbarschaftswirkungen
der DNA-Matrizen basierenden Synthese die Bindungsbildungs-Raten
zu dem Punkt verstärken
kann, dass die DNA-Anlagerung Geschwindigkeits-bestimmend wird.
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Diese
Ergebnisse ergeben die Möglichkeit
der Verwendung der DNA-Matrizen basierenden Synthese, um ein Gefäß Bibliotheken
von DNA in Lösungsphasen-Bibliotheken
von synthetischen Molekülen
zu translatieren, die für
die PCR-Amplifikation und Selektion geeignet sind. Die Fähigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese, um eine Vielzahl von Übergangszustands-Geometrien
zu unterstützen,
weist auf ein Potenzial beim Lenken einer Reihe von leistungsfähigen Wasser-kompatiblen
synthetischen Reaktionen hin (siehe Li, C.J. Organic Reactions in
Aqueous Media, Wiley und Sons, New York: 1997). Die oben beschriebene
Sequenz-Spezifität
weist darauf hin, dass Mischungen von Reagenzien in der Lage sein
können,
vorhersehbar mit komplementären
Mischungen an Matrizen zu reagieren. Schließlich weist die beobachtete
Entfernungsunabhängigkeit
darauf hin, dass unterschiedliche Regionen von DNA „Kodons" verwendet werden
können,
um unterschiedliche Gruppen auf dem gleichen synthetischen Gerüst ohne
Beeinträchtigung
der Reaktionsraten zu kodieren. Als eine Demonstration dieses Ansatzes,
wurde eine Bibliothek von 1.025 Maleimid-gebundenen Matrizen synthetisiert,
jede mit einer unterschiedlichen DNA-Sequenz in einer Acht-Basen
kodierenden Region (11). Eine dieser Sequenzen,
5'-TGACGGGT-3', wurde willkürlich ausgewählt, um
die Anheftung einer Biotingruppe an die Matrize zu kodieren. Eine
Bibliothek von Thiolreagenzien, die an 1.025 unterschiedliche Oligonukleotide
gebunden ist, wurde ebenfalls erzeugt. Das an die 3'-ACTGCCCA-5' gebundene Reagenz
enthielt eine Biotingruppe, während
die anderen 1.024 Reagenzien kein Biotin enthielten. Äquimolare
Verhältnisse
von allen 1.025 Matrizen und 1.025 Reagenzien wurden in einem Gefäß für 10 min.
bei 25°C
gemischt, und die resultierenden Produkte wurden in vitro auf Bindung
an Streptavidin selektiert. Moleküle, die die Selektion überlebten,
wurden durch PCR amplifiziert und durch Restriktionsverdauung und
DNA Sequenzierung analysiert.
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Verdau
mit der Restriktions-Endonuklease Tsp45I, welche GTGAC spaltet und
deshalb die Biotin-kodierende Matrize schneidet, aber keine der
anderen Matrizen, offenbart ein 1:1 Verhältnis von Biotin kodierenden
zu Nicht-Biotin kodierenden Matrizen im Anschluss an die Selektion
(12). Dies stellt eine 1.000-fache Anreicherung
im Vergleich zu der nicht-selektierten
Bibliothek dar. Die DNA-Sequenzierung des PCR amplifizierten Pools,
vor und nach der Selektion, wies auf einem ähnlichen Anreichungsgrad hin
und zeigten an, dass die Biotin-kodierende Matrize das Hauptprodukt
nach der Selektion und Amplifikation ist (12).
Die Fähigkeit
der DNA-Matrize basierenden Synthese, die simultane Sequenz-spezifische
Reaktion von 1.025 Reagenzien zu unterstützen, wobei jede von diesen
einem 1.024:1 Verhältnis
von nicht-Partner zu Partner Matrizen begegnet, demonstriert sein
Potenzial als ein Verfahren, um synthetische Bibliotheken in einem
Gefäß zu erzeugen.
Die obige prinzipielle praktische Realisierbarkeit der Translation,
Selektion und Amplifikation eines synthetischen Bibliothek-Mitglieds mit einer
spezifischen Eigenschaft (in diesem Beispiel Avidin-Affinität) adressiert
mehrere Schlüsselanforderungen
für die
Entwicklung von nicht-natürlichen
kleinen Molekül-Bibliotheken in Richtung
gewünschter
Eigenschaften.
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Zusammengefasst
weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die DNA-Matrizen basierenden
Synthese ein erstaunlich allgemeines Phänomen ist, welches in der Lage
ist, eine Auswahl an chemischen Reaktionen eher zu lenken, als einfach
zu kodieren, um Produkte zu bilden, die mit ihrer Struktur mit Nukleinsäure-Rückgraten
nicht verwandt sind. Für
mehrere untersuchte Reaktionen, beschleunigt das DNA-Matrizen basierende
Format die Bindungbildungs-Rate, über die Rate eines 10- Basen
DNA Oligonukleotids, welches an sein Komplement anlagert ist, hinaus,
was zu einer erstaunlichen Entfernungsunabhängigkeit führt. Die einfache Natur der
weitreichenden DNA-Matrizen basierenden Reaktionen kann ebenfalls
zum Teil von der Tendenz des Wassers, das Volumen von nicht-polaren
Reaktanten zu kontaktieren, herrühren
(siehe C.-J. Li et al. Organic Reaktions in Aqueous Media, Wiley
und Sons; New York, 1997) und von der möglichen Kompaktheit der dazwischenliegenden
einzelsträngigen
DNA zwischen den reaktiven Gruppen. Diese Ergebnisse können Auswirkungen
auf die präbiotische
Evolution und für
das Verständnis
des Mechanismus von katalytischen Nukleinsäuren haben, welche üblicherweise
Substrate an einen Strang von RNA oder DNA lokalisieren.
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Verfahren:
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DNA
Synthese. DNA Oligonukleotide wurden auf einem PerSeptive Biosystems
Expedite 8909 DNA-Synthetisierer unter Verwendung von Standardverfahren
synthetisiert, und durch Umkehrphasen HPLC gereinigt. Die Oligenukleotide
wurden spektophotometrisch und durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE), gefolgt durch die Färbung
mit Ethidiumbromid oder SYBR Green (Molecular Probes) quantifiziert
und die Quantifizierung unter Verwendung eines Stratagene Eagle
Eye II Densitometer. Phosphoramidite, die die Synthese von 5'-NH2-dT,
5' Tetrachlorfluorescein,
eines basischen Rückgrat-Spacers,
C3 Rückgratspacers,
9-Bindungs-Polyethylenglycol-Spacers, 12-Bindungs-gesättigte Kohlenwasserstoff
Spacers ermöglicht,
und 5' Biotingruppen,
wurden von Glen Research gekauft. Thiol-gebundene Oligonukleotid-Reagenzien
wurden auf einem C3 Disulfid Controlled-Pore-Glass (Glen Research) synthetisiert.
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Matrizen-Funktionalisierung.
Matrizen, die 5'-NH2-dT Gruppen tragen, wurden in eine Vielzahl
Elektrophile funktionelle Gruppen durch Reaktion mit dem geeigneten
Elektrophil-NHS
Ester (Pierce) transformiert. Reaktionen wurden in 200 mM Natriumphosphat
pH 7,2 mit 2 mg/mL Elektorphil-NHS Ester, 10 % DMSO, und bis zu
100 μg 5'-Amino-Matrize bei
25°C für eine 1
h durchgeführt.
Die gewünschten
Produkte wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und durch Gelelektrophorese
und MALDI Massenspektrometrie charakterisiert.
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DNA-Matrizen
basierende Synthese-Reaktionen. Die Reaktionen wurden durch Mischen
von äquimolaren
Mengen an Reagenz und Matrize in Puffer, welcher 50 mM MOPS pH 7,5,
und 250 mM NaCl enthält,
bei der gewünschten
Temperatur (25°C,
wenn nicht anderes angegeben) ausgelöst. Die Konzentrationen an
Reagenzien und Matrizen waren 60 nM, wenn nicht anders angegeben.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquote entnommen, mit einem Überschuss
an β-Mercaptoethanol
gelöscht,
und durch denturierende PAGE analysiert. Die Reaktionsprodukte wurden
durch Densitometrie unter Verwendung ihrer intrinsischen Fluoreszenz
oder durch Färben,
gefolgt durch Densitometrie, quantifiziert. Repräsentative Produkte wurden ebenfalls durch
MALDI Massenspektometrie verifiziert.
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In
vitro Selektion auf Avidin-Bindung. Produkte der Bibliothek-Translations-Reaktion
wurden durch Ethanol-Präzipitation
isoliert, und im Bindungspuffer (10 mM Tris pH 8.1 M NaCl, 10 mM
EDTA) aufgelöst.
Die Produkte wurden mit 30 μg
Streptavidin-gebundenen magentischen Kügelchen (Roche Biosciences)
für 10 min.
bei Raumtemperatur in 100 μl
Gesamtvolumen inkubiert. Die Kügelchen
wurden 16 mal mit Bindungspuffer gewaschen und durch Behandlung
mit einem 1 μmol
freiem Biotin in 100 μl
Bindungspuffer bei 70°C
für 10 Minuten
eluiert. Die eluierten Moleküle
wurden durch Ethanol-Präzipitation
isoliert und durch Standard PCR Protokolle (2 M MgCl2,
Anlagerung bei 55°C,
20 Zyklen) unter Verwendung der Primer 5'-TGGTGCGGAGCCGCCG und 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCCCGGCTCCTCGGCTCGG
amplifiziert. Die automatische DNA Sequenzierung verwendete die
Primer 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCC.
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DNA
Sequenzen. Sequenzen, die in den Figuren nicht bereitgestellt sind,
sind wie folgt: Übereinstimmendes
Reagenz in 6b SIAB und SBAP Reaktionen:
5'-CCCGAGTCGAAGTCGTACC-SH;
nicht übereinstimmendes
Reagenz in 6b SIAB und SBAP Reaktionen:
5'-GGGCTCAGCTTCCCCATAA-SH;
nichtübereinstimmende
Reagenzien für
andere Reaktionen in den 6b, 6c, 6d und 8a; 5'-FAAATCTTCCC-SH
(F = Tetrachlorfluorescein); die Reagenzien in den 6c und 6d enthalten eine Nichtübereinstimmung: 5'-FAATTCTTACC-SH;
die Matrizen in den 6a, 6b SMCC,
GMBS, BMPS und SVSB Reaktionen, und 8a:
5'-(NH2dt)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTTCGACTCG AGG;
F Matrize in 6B SIAG, SBAP und SIA Reaktionen:
5'-(NH2dT)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTC;
Clamp-Oligonukleotid in 8b: 5'-ATTCGTACCA
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Beispiel 2: Beispielhafte
Reaktionen für
die Verwendung in der DNA-Matrizen basierenden Synthese:
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Wie
oben diskutiert ist, wurde die Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden
synthetischen Chemie untersucht (siehe Liu et al. J. Am. Chem. Soc.
2001, 123, 6961). Insbesondere wurde die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden
Synthese, um eine kleine Sammlung von chemischen Reaktionen ohne
die Notwendigkeit der genauen Ausrichtung von reaktiven Gruppen
in DNA-ähnlichen
Konformationen zu lenken, demonstriert. Tatsächlich ermöglichte die Entfernungsunabhängigkeit
und Sequenz-Genauigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese, die
gleichzeitige, ein Gefäß-Translation
einer Modell-Bibliothek von mehr als 1.000 Matrizen in die entsprechenden
Thioetherprodukte, von welchen eines durch in vitro Selektion auf
die Bindung an das Protein Streptavidin angereichert wurde und durch
PCR amplifiziert wurde.
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Wie
hierin im Detail beschrieben ist, wurde die Allgemeingültigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese weiters ausgedehnt und es
wurde demonstriert, dass eine Vielzahl von chemischen Reaktionen
für die
Konstruktion von kleinen Molekülen
ausgenutzt werden kann und insbesondere, für das erste Mal, DNA-Matrizen
basierende organometallische Kopplungen und Kohlenstoff-Kohlenstoff
Bindungsbildungs-Reaktionen, außer
der Pyrimidin-Photodimerisierung.
Diese Reaktionen stellen eindeutig einen wichtigen Schritt in Richtung
der in vitro Evolution von nicht-natürlichen synthetischen Molekülen dar,
indem die DNA-Matrizen basierende Konstruktion einer viel diverseren
Gruppe von Strukturen, als bisher erreicht wurde, ermöglicht wird.
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Die
Fähigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese, Reaktionen zu lenken, die
einen nicht-DNA-gebundenen Aktivator, Katalysator oder anderes Reagenz
zusätzlich
zu den prinzipiellen Reaktanten benötigen, wurde ebenfalls hierin
demonstriert. Um die Fähigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese zu testen, solche Reaktionen
ohne der Notwendigkeit der strukturellen Nachahmung des DNA-Matrizen
basierenden Rückgrats
zu vermitteln, können
DNA-Matrizen basierende reduktive Aminierungen zwischen einer Amin-gebundenen
Matrize (1) und Benzaldehyd- oder Glyoxal-gebundenen Reagenzien
(3) mit millimolaren Konzentrationen an NaBH3CN
bei Raumtemperatur in wässrigen
Lösungen
durchgeführt
werden. Signifikanterweise bildeten sich die Produkte effizient,
wenn die Matrizen- und Reagenz-Sequenzen komplementär waren,
während
Kontrollreaktionen, in welchen die Sequenz des Reagenzes nicht zu
jener der Matrize komplementär
war, oder in welcher NaBH3CN weggelassen
wurde, kein signifikantes Produkt ergaben (siehe 13 und 14).
Obwohl DNA-Matrizen
basierende reduktive Aminierungen, um Produkte, die die Struktur
von doppelsträngiger
DNA genau nachahmen, zu erzeugen, früher berichtet wurden (siehe
z.B. X. Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746 und Y. Gat et
al. Biopolymers 1998, 48, 19), demonstrieren die obigen Ergebnisse, dass
die reduktive Animierung, um Strukturen, die mit dem Phosphoribose-Rückgrat nicht
verwandt sind, zu erzeugen, effizient und Sequenz-spezifisch stattfinden
kann. Unter Bezugnahme auf 15,
die DNA-Matrizen basierenden Amid-Bindungsbildungen zwischen Amin gebundenen
Matrizen 4 und 5 und Carboxylat-gebundenen Reagenzien 6–9, die
durch 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC) und N-Hydroxylsulfosuccinimid
(Sulfo-NHS) vermittelt sind, um Amid-Produkte mit guten Ausbeuten
bei pH 6,0, 25°C
zu erzeugen (15). Die Produktbildung war
Sequenz-spezifisch, abhängig
von der Gegenwart von EDC, und gegen die sterische Behinderung des
Amins oder Carboxylats überraschenderweise
unempfindlich. Die effiziente DNA-Matrizen basierende Amidbildung
wurde ebenfalls durch den Wasser stabilen Aktivator 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-trizin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid
(DMT-MM), anstelle von EDC und Sulfo-NHS, vermittelt (14 und 15).
Die Wirksamkeit und Allgemeingültigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildung unter diesen Bedingungen,
zusammen mit der großen
Anzahl von kommerziell erhältlichen
chiralen Aminen und Carbonsäuren,
machen diese Reaktion einen attraktiven Kandidaten für die zukünftigen
DNA-Matrizen basierenden Synthesen von strukturell diversen kleinen
Molekül-Bibliotheken.
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Es
ist erkennbar, dass die Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildungs-Reaktionen
in sowohl chemischen als auch biologischen Synthesen wichtig sind,
und somit ebenfalls mehrerer solcher Reaktionen in dem DNA-Matrizen
basierenden Format benutzt. Sowohl die Reaktion von Nitroalkan-gebundenen
Reagenz (10) mit Aldehyd gebundener Matrize (11) (Nitro-Aldol oder
Henry Reaktion) als auch die Konjugat-Addition von 10 an Maleimid-gebundener
Matrize (12) (Nitro-Michael Addition) verlief effizient und mit
hoher Sequenz-Spezifität
bei pH 7,5–8,5,
25°C (13 und 14).
Zusätzlich
ergab die Sequenz-spezifische DNA-Matrizen basierende Wittig Reaktion
zwischen einem stabilisierten Phosphoniumylid-Reagenz 13 und Aldehydgebundenen Matrizen
14 oder 11 die entsprechenden Olefin-Produkte mit ausgezeichnetenr
Ausbeuten bei pH 6,0–8,0,
bei 25°C
(13 und 14).
Auf ähnliche
Weise ergab die DNA-Matrizen
basierende 1,3-Dipolare Cycloaddition zwischen Nitron-gebundenen
Reagenzien 15 und 16 und Olefin-gebundenen-Matrizen 12, 17 oder
18 ebenfalls Produkte Sequenz-spezifisch bei pH 7,5, 25°C (13 und 14).
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Reaktionen, können organometallische Kopplungs-Reaktionen in der
vorliegenden Erfindung ebenfalls benutzt werden. Zum Beispiel wurden
DNA-Matrizen basierende Heck Reaktionen in der Gegenwart von wasserlöslichen
Pd Präkatalysatoren
durchgeführt.
In der Gegenwart von 170 mM Na2PdCl4, Aryliodid-gebundenem Reagenz 19 und einer
Vielzahl von Olefin-gebundenen Matrizen, einschließlich Maleimid
12, Acrylamid 17, Vinylsulfon 18 oder Cinnamamid 20 ergaben Heck-Kopplungsprodukte
in mässigem
Ausbeuten bei pH 5,0, 25°C
(13 und 14).
Für Kopplungen
mit Olefinen 17, 18 und 20, erhöhte üblicherweise
das Hinzufügen
von zwei Äquivalenten
an P (p-SO3C6H4)3 pro Äquivalent
PD vor der Matrizen- und Reagenzzugabe, die Gesamtausbeute um das
doppelte. Kontrollreaktionen, die Sequenz-Nichtübereinstimmungen enthalten,
oder denen der Pd-Präkatalysator
fehlte, ergaben kein Produkt. Unseres Wissens stellen die obigen
DNA-Matrizen basierenden Nitro-Aldol-Addition, Nitro-Michael-Addition,
Wittig Olefinierung, dipolare Cycloaddition und Heck Kopplung die
ersten berichteten Nukleinsäure-Matrize-basierenden organometallischen
Reaktionen und Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildungs-Reaktionen,
außer
der Pyrimidin-Photodimerisierung, dar.
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Es
wurde zuvor entdeckt, dass dieselben DNA-Matrizen basierenden Reaktionen
eine Entfernungsunabhängigkeit,
die Fähigkeit,
Produkte bei einer Rate zu bilden, die unabhängig von der Anzahl der dazwischenliegenden
Basen zwischen den angelagerten Reaktanten ist, demonstrieren. Es
wurde hypothetisiert (16a), dass die
Distanzunabhängigkeit
entsteht, wenn die Bindungsbildungsrate in der DNA-Matrizen basierenden
Reaktion größer als
die Rate der Matrizen-Reagenz-Anlagerung ist. Obwohl nur eine Teilmenge
der Chemien in diese Kategorie fallen, ist jede DNA-Matrizen basierende
Reaktion, die vergleichbare Produktausbeuten liefert, wenn das Reagenz
bei verschiedenen Entfernungen von dem reaktiven Ende der Matrize
angelagert wird, von speziellen Interesse, da es eine Vielzahl von
Matrizen-Positionen
kodieren kann. Um die Fähigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Reaktionen zu evaluieren, die oben
entwickelt wurden, um effizient stattzufinden, wenn die Reaktanten
durch Entfernungen relevant zu der Bibliothek-Kodierung getrennt
sind, wurden die Ausbeuten der reduktiven Aminierung, der Amidbildung,
der Nitro-Aldol-Addition, der Nitro-Michael-Addition, der Wittig-Olefirierung, der
dipolaren Cycloaddition, und der Heck-Kopplung, wenn Null oder zehn Basen
angelagerte reaktive Gruppen trennten (16a.
n=0 versus n=10) verglichen. Unter den oben beschriebenen oder in
frührer
Arbeit beschriebenen Reaktionen, demonstrieren die Amidbindungsbildung,
Nitro-Aldol-Addition, Wittig-Olefinierung, Heck-Kopplung, Konjugat-Addition von Thiolen
an Maleimide und SN2 Reaktionen zwischen
Thiolen und α-Iodamiden
eine vergleichbare Produktbildung, wenn die reaktiven Gruppen durch
0 oder 10 Basen getrennt sind (16b).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Reaktionen während der
Synthese durch Nukleotide, die von dem reaktiven Ende der Matrize
entfernt sind, ohne signifikante Beeinträchtigung der Produktbildung,
kodiert sein können.
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Zusätzlich zu
der DNA-Matrizen basierenden SN2 Reaktion,
Konjugat-Addition, Vinylsulfon-Addition, Amidbindungsbildung, reduktive
Aminierung, Nitro-Aldol (Henry Reaktion), Nitro-Michael, Wittig-Olefinierung, 1,3-dipolaren
Cycloaddition und Heck Kopplungs-Reaktionen, die unmittelbar zuvor
beschrieben sind, können eine
Vielzahl von zusätzlichen
Reagenzien in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
Zum Beispiel, wie in 17 gezeigt ist, können leistungsfähige wässrige DNA-Matrizen
basierende synthetische Reaktionen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein,
die Lewissäurekatalysierte
Aldol-Addition, Mannich-Reaktion, Robinson-Annulierungs-Reaktionen,
Additionen von Allylindium, Zink und Zinn an Ketone und Aldehyde,
Pd-assistierte allylische Substitution, Diels-Alder Cycloadditionen,
und Hetero-Diels-Alder Reaktionen in wässrigem Lösungsmittel effizient benutzt
werden, und sind wichtige Komplexitätsbildungs-Reaktionen.
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Zusammengenommen
erweitern diese Ergebnisse den Reaktionsumfang der DNA-Matrizen basierenden
Synthese beachtlich. Eine große
Vielzahl von Reaktionen verlief effizient und selektiv, nur wenn
die entsprechenden Reaktanten mit komplementären Sequenzen programmiert
werden. Durch Vergrößern des
Repertoirs von bis jetzt bekannten DNA-Matrizen basierenden Reaktionen,
einschließlich
Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildung und organometallische Reaktionen
(Nitro-Aldol Additionen, Nitro-Michael Additionen, Wittig-Olefinierungen, dipolare-Cycloadditionen
und Heck-Kopplungen) zusätzlich
zu den früher
berichteten Amidbindungsbildung (siehe Schmidt et al. Nucleic Acids
Res. 1997, 25, 4792; Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49), Iminbildung
(Czlapinski et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8618), reduktive
Amimierung (Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746; Gat et al.
Biopolymers, 1998, 48, 19), SN2 Reaktionen
(Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961; Xu et al. Nat.
Biotechnol. 2001, 19, 148; Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,
10151) Konjugat-Addition von Thiolen (Gartner et al. J. Am. Chem.
Soc. 2001, 123, 6961) und Phosphoester oder Phosphonamid Bildung
(Orgel et al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109; Luther et al. Nature,
1998, 396, 245), können
diese Ergebnisses die Sequenz-spezifische Translation von DNA-Bibliotheken
in Bibliotheken von strukturell und funktionell diversen synthetischen
Produkten ermöglichen.
Da winzige Mengen von Matrizen-kodierenden gewünschten Molekülen durch
PCR amplifiziert werden können,
sind die Ausbeuten der DNA-Matrizen basierenden Reaktionen wohl
weniger kritisch, als die Ausbeuten von traditionell synthetischen Umwandlungen.
Nichtsdestotrotz verliefen viele der oben entwickelten Reaktionen
effizient. Durch Demonstrieren, dass die DNA-Matrizen basierende
Synthese in der Abwesenheit von Proteinen eine großen Vielfalt
von chemischen Reaktionen lenken kann, unterstützen diese Ergebnisse zusätzlich früher fortgeschlagene
Hypothesen, dass die Nukleinsäure-Matrizen
basierende Synthese replizierbare Information in einige der frühesten funktionellen
Molekülen,
wie Polypeptide, Terpene und Polypeptide vor der Entwicklung der
Protein-basierenden Enzyme translatiert haben kann. Die Vielfalt
der hier gezeigten Chemie, einfach durch das Bringen der Reaktanten
in die Nachbarschaft durch DNA-Hybridisierung ohne offensichtliche
strukturelle Anforderungen kontrollierbar zu sein, bietet eine experimentelle
Basis für
diese Möglichkeiten.
Die Translation von amplifizierbarer Information in eine große Auswahl
von Strukturen ist eine Schlüsselanforderung
für das
Anwenden des molekularen Evolutionsansatzes der Natur für die Entwicklung
von nicht-natürlichen
Molekülen
mit neuen Funktionen.
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Verfahren für beispielhafte
Reaktionen für
die Verwendung in der DNA-Matrizen basierenden Synthese:
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Funktionalisierte
Matrizen und Reagenzien wurden üblicherweise
durch Reagieren von 5'-NH2-begrenzten Oligonukleotiden (für Matrize
1), 5'-NH2-(CH2O)2-begrenzten
Oligonukleotiden (für
alle anderen Matrizen) oder 3'-OPO3-CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2 begrenzten Nukleotiden
(für alle
Reagenzien) mit den geeigneten NHS-Estern (0,1 Volumen einer 20
mg/mL Lösung
in DMF) in 0,2 M Natriumphosphat Puffer, pH 7,2, 25°C, 1 h hergestellt,
um die Matrizen- und Reagenzstrukturen, die in den 13 und 15 gezeigt
sind, bereitzustellen. Für
Aminosäure-gebundene
Reagenzien 6 bis 9, wurden 3'-OPO3CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2 begrenzte
Oligonukleotide in 0,2 M Natriumphosphat Puffer, pH 7,2 mit 0,1
Volumina einer 100 mM bis[2-Succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon
(BSOCOES, Pierce] Lösung
in DMF für
10 min. bei 35°C,
gefolgt von 0,3 Volumina einer 300 mM Aminosäure in 300 mM NaOH für 30 min.
bei 25°C
reagiert.
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Funktionalisierte
Matrizen und Reagenzien wurden unter Gelfiltration unter Verwendung
von Sephadex G-25, gefolgt von Umkehrphasen HPLC (0,1 Triethylammoniumacetat-Acetonitril-Gradient)
gereinigt und durch MALDI Massenspektometrie charakterisiert. DNA-Matrizen basierende
Reaktionen wurden unter den in 13 und 15 beschriebenen
Bedingungen ausgeführt
und die Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese
und MALDI Massenspektometrie charakterisiert.
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Die
Sequenzen der Oligonukleotid-Matrizen und Reagenzien waren wie folgt
(5' bis 3' Richtung, n bezieht
sich auf die Anzahl der Basen zwischen den reaktiven Gruppen, wenn
die Matrize und das Reagenz wie in 16 annealed
sind). 1: TGGTACGAATTCGACTCGGG; 2 und 3 übereinstimmen: GAGTCGAATTCGTACC;
2 und 3 nichtübereinstimmend:
GGGCTCAGCTTCCCCA; 4 und 5: GGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT; 6–9 übereinstimmen
(n=10): TCCCGAGTCG; 6 übereinstimmend
(n=10): AATTCGTACC; 6–9 übereinstimmend:
TCACCTAGCA; 11, 12, 14, 17, 18, 20: GGTACGAATTCGACTCGGGA; 10, 13,
16, 19, übereinstimmend:
TCCCGAGTCGAATTCGTACC; 10, 13, 16, 19 nichtübereinstimmend: GGGCTCAGCTTCCCCATAAT;
15 übereinstimmend;
AATTCGTACC; 15 fehlübereinstimmend:
TCGTATTCCA; Matrize für
n=10 vs. n=0 Vergleich: TAGCGATTACGGTACGAATTCGACTCGGGA.
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Die
Reaktionsausbeuten wurden durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese,
gefolgt von Ethidiumbromid Färbung,
UV Visulaisierung und CCD-basierender Densitometrie von Produkt
und Matrizen-Ausgangsmaterial-Banden quantifiziert. Die Ausbeute-Berechnungen
nahmen an, dass die Matrizen und Produkte mit gleicher Intensität pro Base
färbten,
für jene
Fälle,
in welchen die Produkte teilweise während der Quantifizierung doppelsträngig waren,
kann die Änderung
der Färbungsintensität zu höheren scheinbaren Ausbeuten
führen.
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Beispiel 3: Entwicklung
von beispielhaften Linkern
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Wie
durch einen Durchschnittsfachmann erkennbar ist, ist es häufig nützlich,
den DNA-Anteil des
Reagenzes an die Produkte während
der Reaktionsentwicklung gebunden zu belassen, um die Analyse durch Gelelektrophorese
zu erleichtern. Die Verwendung der DNA-Matrizen basierenden Synthese,
um Bibliotheken von DNA in entsprechende Bibliotheken von synthetischen
kleinen Molekülen
zu translatieren, die für
die in vitro Selektion geeignet sind, erfordert jedoch die Entwicklung
von spaltbaren Linkern, die die reaktiven Gruppen von Reagenzien
mit ihren dekodierenden DNA Oligonukleotiden verbinden. Wie hierin
und unten beschrieben ist, wurden drei beispielhafte Arten von Linkern
entwickelt (siehe 18). Für Reagenzien mit einer reaktiven
Gruppe, wäre
es wünschenswert,
die DNA als eine Abgangsgruppe an den reaktiven Anteil zu positionieren.
Unter dieser „selbstspaltbaren" Linkerstrategie,
wird die DNA-reaktive Gruppe-Bindung als eine natürliche Konsequenz
der Reaktion gespalten. Nur als ein Beispiel dieses Ansatzes, wurde
ein fluoreszierendes Wittig-Phosphoran-Reagenz
(14, betreffend 19) synthetisiert, in welchem
das dekodierende DNA Oligonukleotid an eine der Aryl-Phosphin Gruppen
angeheftet wurde (siehe 19,
links). Die DNA-Matrizen basierende Wittig Reaktion mit Aldehyd-gebundenen
Matrizen führte
zu dem nahezu quantitativen Transfer der fluoreszierenden Gruppe
von dem Wittig-Reagenz auf die Matrize und die gleichzeitige Freisetzung
des Alkenproduktes von dem DNA Anteil des Reagenzes. Zusätzlich können Reagenzien,
die mehr als eine reaktive Gruppe tragen, an ihre dekodierenden
DNA Oligonukleotide durch eine von zwei zusätzlichen Linkerstrategien gebunden
werden. In der „narbenlosen" Linkerstrategie
wird die DNA-Matrizen basierende Reaktion von einer reaktiven Gruppe
durch die Spaltung des Linkers, der durch eine zweite reaktive Gruppe
gebunden ist, gefolgt, um Produkte ohne das Hinterlassen von zusätzlicher
chemischer Funktionalität
zu ergeben. Zum Beispiel wurde eine Reihe von Aminosäure Reagenzien
synthetisiert, welche durch einen Carbamoylethylsulfon-Linker an ihre
dekodierenden DNA Oligonukleotide gebunden waren (19, Mitte). Die Produkte der DNA- Matrizen basierenden
Amidbindungsbildung unter Verwendung dieser Aminosäure Reagenzien
wurden mit wässrigem
alkalischenm Puffer behandelt, um die quantitative Eliminierung
und spontane Decarboxylierung der Carbamoyl-Gruppe zu bewirken.
Das Produkt, das diesen narbenlosen Linker verlässt, ist deshalb der sauber-transformierte
Aminosäure-Anteil.
In noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung kann eine dritte Linker-Strategie, eine „nützliche
Narbe" aufgrund
der Theorie benützt
werden, dass es vorteilhaft sein kann, nützliche chemische Gruppen als
eine Konsequenz der Linker-Spaltung einzuführen. Insbesondere kann einen „nützliche Narbe" in nachfolgenden
Schritten funktionalisiert werden, und wird im Anschluss an die
Linkerspaltung zurückgelassen.
Zum Beispiel wurden Aminosäure
Reagenzien, die durch 1,2 Diole an ihre dekodierenden DNA Oligonukleotide
gebunden sind, erzeugt. Im Anschluss an die Amidbindungsbildung,
wurde dieser Linker quantitativ durch die Oxidation mit NaIO4 gespalten, um Produkte zu ergeben, die
nützliche
Aldehydgruppen tragen (siehe 19,
rechts). Zusätzlich
zu den direkt oben beschriebenen Linkern, kann eine Vielzahl von weiteren
Linkern benutzt werden. Zum Beispiel, wie in 20 gezeigt
ist, kann ein Thioester Linker durch Carbodiimed vermittelte Kopplung
von Thiol-begrenzter DNA mit Carboxylatenthaltenden Reagenzien erzeugt werden
und mit wässriger
Base gespalten werden. Wie die Carboxylat-Gruppe einen Zugang zu
den DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildungs-Reaktionen, die oben
beschrieben sind, bietet, würde
dieser Linker eine „nützliche
Narbe" freisetzen,
wenn er gespalten wird (siehe 20).
Alternativ kann der Thioester-Linker als ein selbstspaltbarer Linker
während
einer Aminacylierungs-Reaktion in der Gegenwart von Ag(I) Kationen verwendet
werden (siehe Zhang et al. J. Am. Chem. Coc. 1999, 121, 3311–3320),
da der Thiol-DNA-Anteil des Reagenzes als eine natürliche Konsequenz
der Reaktion freigesetzt wird. Es ist erkennbar, dass ein Thioether-Linker,
der oxidiert und bei pH 11 eliminiert werden kann, um ein Vinylsulfon
freizusetzen, als ein „nützlicher
Narben"-Linker benutzt
werden kann. Wie hierin demonstriert ist, dient die Vinylsulfon-Gruppe
als das Substrat in einer Vielzahl von nachfolgenden DNA-Matrizen
basierenden Reaktionen.
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Beispiel 4: Beispielhafte
Reaktionen in organischen Lösungsmitteln:
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Wie
hierin demonstriert ist, können
eine Vielzahl von DNA-Matrizen basierenden Reaktionen in wässrigen
Medien stattfinden. Es wurde auch demonstriert, wie oben diskutiert,
dass DNA-Matrizen basierende Reaktionen in organischen Lösungsmitteln
stattfinden können,
was somit den Umfang der DNA-Matrizen basierenden Synthese stark
erweitert. Insbesondere wurden DNA-Matrizen und Reagenzien mit langkettigen
Tetraalkylammonium-Kationen komplexiert (siehe, Jost et al. Nucleic
Acids Res. 1989, 17, 2143; Mel'nikov
et al. Langmuir, 1999, 15, 1923–1928),
um die quantitative Auflösung
von Reaktionskomponenten in wasserfreien organischen Lösungsmitteln,
einschließlich
CH2Cl2, CHCl3, DMF und McOH zu ermöglichen. Es wurde überraschenderweise
gefunden, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese tatsächlich in
wasserfreien organischen Lösungsmitteln
mit hoher Sequenzselektivität
stattfinden kann. Gezeigt in 21 sind
DNA-Matrizen basierende Amidbindungbildungsreaktionen, in welchen
die Reagenzien und Matrizen mit Dimethyldidodecylammonium-Kationen
entweder in getrennten Gefäßen oder
nach vorhergehendem Anlagern in Wasser komplexiert werden, zur Trockenheit
lyophilisiert, in CH2Cl2 aufgelöst und zusammengemischt
werden. Übereinstimmende,
jedoch nicht nichtübereinstimmende,
Reaktionen lieferten Produkte sowohl wenn die Reaktanten in wässriger
Lösung
preannealed wurden als auch wenn sie für das erste Mal in CH2Cl2 gemischt wurden
(siehe 21). Die DNA-Matrizen basierende
Amidbildung und die Pd-mediierte Heck-Kopplung in wasserfreiem DMF verlief
ebenfalls Sequenz-spezifisch. Offensichtlich implizieren diese Beobachtungen
der Sequenz-spezifischen DNA-Matrizen basierenden Synthese in organischen
Lösungsmittel
die Gegenwart von zumindest etwas Sekundärstruktur innerhalb der Tetraalkylammonium-komplexierten
DNA in organischen Medien, und sollte die Entwicklung von DNA Rezeptoren
und Katalysatoren in Richtung stereoselektiver Bindung oder katalytischen
Eigenschaften in organischen Lösungsmitteln
ermöglichen.
Insbesondere können
DNA-Matrizen basierende Reaktionen, von denen bekannt ist, dass
sie in wässrigen
Medien auftreten, einschließlich
Konjugat-Additionen, Cycloadditionen, Verdrängungsreaktionen, und Pd-mediierte
Kopplungen, ebenfalls in organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden.
In bestimmten anderen Ausführungsformen
können
die Reaktionen in organischen Lösungsmitteln
benützt
werden, die in Wasser ineffizient oder unmöglich durchzuführen sind.
Während
z.B. die Ru-katalysierte Olefin-Metathese in Wasser durch Grubbs
und Mitarbeiter berichtet wurde (siehe, Lynn et al. J. Am. Chem.
Soc. 1998, 120, 1627–1628;
Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6601–6609; Mohr et al. Organometallics
1996, 15, 4317–4325)
ist das wässrige
Metathesesystem äußerst sensitiv
gegenüber
funktionellen Gruppen. Die funktionelle Gruppentoleranz der RU-katalysierten
Olefin-Metathese in organischen Lösungsmitteln ist jedoch signifikant
robuster. Einige beispielhafte Reaktionen, die in organischen Lösungsmitteln
ausgenutzt werden können,
beinhalten, ohne darauf beschränkt
zu sein, die 1,3-dipolare Cycloaddition zwischen Nitronen und Olefinen,
welche über Übergangszustände verlaufen
kann, die weniger polar sind, als die Grundzustands Ausgangsmateralien.
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Wie
oben detailliert ist, wurde die Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden
Synthese durch Ausführen
von mehreren unterschiedlichen DNA-Matrizen basierenden Reaktionsarten
etabliert, keine von diesen ist auf das Erzeugen von Struktur beschränkt, die
dem natürlichen
Nukleinsäurerückgrat ähnlich ist,
und viele von diesen sind äußerst nützliche
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsbildungs- oder Komplexitäts-bildende synthetische
Reaktionen. Es wurde gezeigt, dass die Entfernungsunabhängigkeit
der DNA-Matrizen basierenden Synthese ermöglicht, dass unterschiedliche
Regionen einer DNA-Matrize jeweils unterschiedliche synthetische
Reaktionen kodieren. Die DNA-Matrizen basierende Synthese kann die
Sequenzgenauigkeit aufrechterhalten, sogar in einem Bibliotheksformat,
in welchem mehr als 1000 Matrizen und 1000 Reagenzien gleichzeitig
in einem Gefäß reagieren.
Wie oben und unten beschrieben ist, wurden Linker Strategien entwickelt,
welche zusammen mit den entwickelten Reaktionen, wie oben beschrieben,
die erste mehrstufige DNA-Matrizen basierende Synthese von einfachen
synthetischen kleinen Molekülen
ermöglicht
haben. Zusätzlich
wurde die Sequenz-spezifische DNA-Matrizen basierende Synthese in
organischen Lösungsmitteln
demonstriert, was den Umfang dieses Ansatzes erweitert.
-
Beispiel 5:Synthese von
beispielhaften Verbindungen und Bibliotheken von Verbindungen:
-
- A) Synthese einer Polycarbamat-Bibliothek:
Eine Ausführungsform
der oben beschrieben Strategie ist die Erzeugung einer amplifizierbaren
Polycarbamat Bibliothek. Von den verwendeten 16 möglichen
Dinukleotiden, um die Bibliothek zu kodieren, wird einem eine Startkodonfunktion
zugeordnet, und einem wird zugeordnet, als Stoppkodon zu dienen.
Ein künstlicher
genetischer Code wird dann durch Zuordnen von jedem der bis zu 14
verbleibenden Dinukleotiden zu einem unterschiedlichen Monomer erzeugt.
Aus geometrischen Gründen
enthält
ein Monomer tatsächlich
ein Dicarbamat, welches zwei Seitenketten aufweist. Innerhalb jedes
Monomers wird das Dicarbamat an das entsprechende Dinukleotid angeheftet
(analog zu einem tRNA Antikodon), durch einen Silylenolether Linker,
welcher die native DNA und das freie Carbamat bei der Behandlung
mit Fluorid freisetzt. Der Dinukleotidanteil existiert als das aktivierte
5'-2-Methyllimidazolphosphat,
welches demonstriert würde
(Inoue et al. J. Mol. Biol. 162:201, 1982; Rembold et al. J. Mol. Evol.
38:205, 1994; Chen et al. J. Mol. Biol. 181:271, 1985; Acevedo et
al. J. Mol. Biol. 197:187, 1987; Inoue et al. J. Am. Chem. Soc.
103:7666, 1981), als eine exzellente Abgangsgruppe für die Matrizen-gerichtete Oligomerisierung
von Nukleotiden zu dienen, ist dennoch relativ stabil unter neutralen
oder basischen wässrigen
Bedingungen (Schwartz et al. Science 228:585, 1985). Der Dicarbamat-Anteil
existiert in einer zyklischen Form, die durch einen Vinyloxycarbonat-Linker
verbunden ist. Die Vinyloxycarbonat-Gruppe wurde demonstriert, in
neutralen oder basischen wässrigen
Bedingungen stabil zu sein (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563,
1977; Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1567, 1977; Olofson et
al. Tetrahedron Lett. 18:1571, 1977) und es wurde weiters gezeigt,
dass es Carbamate in sehr hohen Ausbeuten bei der Zugabe von Aminen
bereitstellt (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977)
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Der
Vinylcarbonat-Linker, wenn durch ein Amin von einer naszierenden
Polycarbamatkette angegriffen, angetrieben durch die Aromatisierung
von m-Cresol, setzt ein freies Amin frei. Dieses freie Amin dient nachfolgend
als das Nukleophil, um das nächste
Vinyloxycarbonat anzugreifen, was die Polymerisierung der wachsenden
Carbamatkette propagiert. Eine solche Strategie minimiert das Potential
der Kreuzreaktivität
und bidirektionalen Polymerisierung durch Sicherstellen, dass nur
ein Nukleophil zu jeder Zeit während
der Polymerisierung vorhanden ist.
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Unter
Verwendung des oben beschriebenen Monomers, kann die künstliche
Translation von DNA in ein Polycarbamat als ein drei-stufiger Prozess
betrachtet werden. Bei der ersten Stufe werden einzelsträngige DNA-Matrizen,
die die Bibliothek kodieren, verwendet, um den Zusammenbau und die
Polymerisierung der Dinukleotidanteile der Monomere zu führen, welche mit
den „Stopp" Monomer beendet
wird, welche einen 3' Methylether
an Stelle einer 3'Hydroxylgruppe
besitzt (22).
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Sobald
die Nukleotide zusammengebaut sind und in die doppelsträngige DNA
polmerisiert sind, wird das „Start"-Monomer, welches
mit einem o-Nitrobenzylcarbamat endet, photoschutzeliminert, um
das primäre Amin
freizulegen, welches die Carbamatpolymerisierung initiiert. Die
Polymerisierung verläuft
in die 5' bis 3' Richtung entlang
des DNA-Rückgrats,
wobei jeder nukleophile Angriff zu einem nachfolgenden Entmaskieren eines
neuen Amin-Nukleophils
führt.
Der Angriff auf das „Stopp"-Monomer setzt ein
Acetamid anstelle eines Amins frei, wodurch die Polymerisierung
beendet wird (23). Da die DNA bei dieser
Stufe in einer stabilen doppelsträngigen Form existiert, können Variablen,
wie die Temperatur und pH, ausgenutzt werden, um die Polymerisierungswirksamkeit
zu optimieren.
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Im
Anschluss an die Polymerisierung wird das Polycarbamat von dem Phosphatrückgrat der
DNA durch die Behandlung mit Fluorid abgespalten. Die Desilylierung
des Enolether-Linkers
und der Eliminierung des Phosphats, angetrieben durch die resultierende
Freisetzung von Phenol, liefert das Polycarbamat, welches an seinem
Carboxy-Terminus an seine kodierende einzelsträngige DNA kovalent gebunden
ist. (24).
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An
dieser Stufe kann das Polycarbamat vollständig von der DNA freigesetzt
werden, durch Basenhydrolyse der Esterbindung. Das freigesetzte
Polycarbamat kann durch HPLC gereinigt werden und erneut getestet
werden, um zu verifizieren, dass seine gewünschten Eigenschaften intakt
sind. Die freie DNA kann unter Verwendung von PCR amplifiziert werden,
mit error-prone PCR (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2:28, 1992) oder
DNA shuffling mutiert (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747,
1994; Stemmer Nature 370:389, 1994; U.S. Patent 5,811,238, erteilt
am 22. September, 1998;), und/oder sequenziert, um die Primärstruktur des
Polycarbamats zu offenbaren.
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Synthese
der Monomer Einheiten. Nachdem die Monomere synthetisiert sind,
sollten der Zusammenbau und die Polymerisierung der Monomere auf
dem DNA Gerüst
spontan stattfinden. Shikimisäure
1, kommerziell erhältlich,
biosynthetisch (Davis Adv. Enzymol. 16:287, 1955; durch Bezugnahme
hierin ausgenommen) oder durch kurze Synthesen aus D-Mannose (Fleet et
al. J. Chem. Soc., Perkins Trans. I 905, 1984; Harvey et al. Tetrahedron
Lett. 32:4111, 1991;) dient als ein geeigneter Startpunkt für die Monomer-Synthese.
Die syn Hydroxyl Gruppen werden als das p-Methoxybenzyliden, und
die verbleibenden Hydroxylgruppen als der tert-Butyldimethylsilyl-Ether,
geschützt,
um 2 zu ergeben. Der Carboxylat-Anteil der geschützten Shikimisäure wird
dann vollständig
durch LAH Reduktion reduziert, Tosylierung des resultierenden Alkohols,
und weitere Reduktion mit LAH, um 3 zu ergeben.
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Kommerziell
enthältliche
und synthetisch zugängliche
N-geschützte
Aminosäuren
dienen als die Ausgangsmaterialien für den Dicarbamat-Anteil von
jedem Monomer. Reaktive Seitenketten werden als photolabile Ether,
Ester, Acetale, Carbamate oder Thioether geschützt. Das Nacharbeiten einer
früher
entwickelten Chemie (Cho et al. Science 261:1303, 1993) wird eine
gewünschte
Aminosäure
4 in den entsprechenden Aminoalkohol 5 durch gemischte Anhydrid-Bildung
mit Isobutylchlorformat, gefolgt von der Reduktion mit Natriumborhydrid
umgewandelt. Der Aminoalkohol wird dann in das aktivierte Carbonat
durch Behandlung mit p-Nitrophenylchlorformat
umgewandelt, um 6 zu ergeben, welches dann an einen zweiten Aminoalkohol
7 gekoppelt wird, um, im Anschluss an die Silylierung der Hydroxylgruppe
und FMOC Schutzeliminierung, Carbamat 8 zu ergeben.
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Die
Kopplung von Carbamat 8 auf den die Shikimisäure-abgeleiteten Linker verläuft wie
folgt. Die allylische Hydroxylgruppe von 3 wird mit TBAF schutzeliminiert,
mit Trifluormethansulfonsäure-Anhydrid
behandelt, um das sekundäre
Triflat zu bilden, dann mit Aminocarbamat 8 verdrängt, um
9 zu ergeben. Die Gegenwart der vinylischen Methylgruppe in 3 sollte
beim Minimieren der Menge an ungewünschtem Produkt, welches von
der SN2' Addition
resultiert, assistieren (Magid Tetrahedron 36:1901, 1980). Die Michael
Additionen von deprotonierten Carbamaten an α,β-ungesättigte Estern sind gut dokumentiert
(Collado et al. Tetrahedron Lett. 35: 8037, 1994; Hirama et al.
J. Am. Chem. Soc. 107:1797, 1985, Nagasaka et al. Heterocycles 29:155,
1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987;
Hirama et al. Heterocycles 28:1229, 1989). Analog wird das sekundäre Amin
als das O-Nitrobenzyl-Carbamat
(NBOC) geschützt,
und die resultierende Verbindung wird an dem Carbamat-Stickstoff deprotoniert.
Die Deprotonierung kann typischerweise mit entweder Natriumhydrid
oder Kalium tert-Butyloxid durchgeführt werden (Collado et al.
Tetrahedron Lett. 35:8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc.
107:1797, 1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29:2155, 1989; Shishido
et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987; Hirama et al. Heterocycles
28:1229, 1989), obwohl andere Basen ausgenützt werden können, um
die Deprotonierung des nitrobenzylischen Protons zu minimieren.
Additionen des deprotonierten Carbamats an das α,β-ungesättigtes Keton 10, gefolgt durch
das Abfangen des resultierenden Enolats mit TBSCI, sollte den Silylenol
Ether 11 ergeben. Die zuvorgefundene Stereoselektivität von Konjugat-Additionen
an 5-substituierte Enone, wie 10 (House et al. J. Org. Chem. 33:949,
1968; Still et al. Tetrahedron 37:3981, 1981) weist auf die bevorzugte
Bildung von 11 übers
ein Diastereomer hin. Keton 10, der Vorläufer des Fluorid-spaltbaren
Carbamat-Phosphat-Linkers, kann aus 2 durch ein-Gefäß-Decarboxylierung
synthetisiert werden (Barton et al. Tetrahedron 41:3901, 1985),
gefolgt durch die Behandlung mit TBAF, Swern Oxidierung des resultierenden
Alkohols, um 12 zu ergeben, Schutzeliminierung mit DDQ, selektive
Nitrobenzyl-Etherbildung des weniger gehinderten Alkohols, und Reduktion
der α-Hydroxyl-Gruppe
mit Samariumiodid (Molander In Organic Reactions, Paquette, Herausgeber
46:211, 1994).
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Die
p-Methoxybenzylidien Gruppe von 11 wird in den α-Hydroxy PMB Ether unter Verwendung
von Natriumcyanoborhydrid und TMS Chlorid umgewandelt (Johannson
et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2371, 1984) und die TES Gruppe
mit 2 % HF schutzeliminiert (Bedingungen, die den TBS Ether nicht
beeinflussen sollten (Boschelli et al. Tetrahedron Lett. 26:5239,
1985)), um 13 zu ergeben. Die PMB Gruppe, dem vorangehenden folgend,
(Johannson et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2371, 1984; Sutherlin
et al. Tetrahedron Lett. 34:4897, 1993) sollte auf dem stärker gehinderten
sekundären
Alkohol zurückbleiben.
Die zwei freien Hydroxyl-Gruppen
können
durch die sehr langsame Zugabe von 13 zu einer Lösung von p-Nitrophenylchlorformat (oder einem anderen
Phosgen-Analogon) makrozyklisiert werden, was 14 bereitstellt. Der
PMB-Ether wird schutzeliminiert, und der resultierende Alkohol in
ein Triflat umgewandelt und unter kinetischen Bedingungen mit einer
sterisch-behinderten Base eliminiert, um Vinyloxycarbonat 15 zu
ergeben. Die Photoschutzeliminierung des Nitrobenzyl-Ethers und
Nitrobenzylcarbamat ergibt Alkohol 16.
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Die
Monomer Synthese wird durch die sequenzielle Kopplung von 3 Komponenten
abgeschlossen. Chlordiisopropylaminophospin 17 wird durch die Reaktion
von PCl3 mit Diisopropylamin synthetisiert
(King et al. J. Org. Chem. 49:1784, 1984). Harzgebundenes (oder
3'-o-Nitrobenzylether
geschützes)
Nukleosid 18 wird an 17 gekoppelt, um Phosphoramidit 19 zu ergeben.
Die nachfolgende Kopplung von 19 mit dem Nukleosid 20 (Inoue et
al. J. Am. Chem. Soc. 103:7666, 1981) liefert 21. Alkohol 16 wird
dann mit 21 reagiert, um nach der sorgfältigen Oxidation unter Verwendung
von MCPBA oder I2, gefolgt von der Spaltung
von dem Harz (oder Photoschutzeliminierung), das vollständige Monomer
22 zu ergeben. Diese Strategie der sequenziellen Kopplung von 17
mit Alkoholen wurde erfolgreich verwendet, um Phosphate, die drei
unterschiedliche Alkoxysubstituenten tragen, mit exzellenten Ausbeuten
zu erzeugen (Bannwarth et al. Helv. Chim. Acta 70:175, 1987).
-
-
Die
einzigartigen verwendeten Start und Stopp-Monomere, um die Carbamat
Polymerisierung zu induzieren und zu beendigen, können durch
einfache Modifikation des obigen Schemas synthetisiert werden.
- B) Entwickelbare funktionalisierte Peptid-Nukleinsäuren (PNAs):
In einer anderen Ausführungsform
wird eine amplifizierbare Peptid-Nukleinsäure-Bibliothek erzeugt. Orgel
und Mitarbeiter haben demonstriert, das Peptid-Nukleinsäuren (PNAs)
Oligomere zu der effizienten Polymerisierung auf komplementären DNA
oder RNA Matrizen in der Lage sind (Böhler et al. Nature 376:578,
1995; Schmidt et al. Nucl. Acids Res. 25:4792, 1997). Diese Erkenntnis
zusammen mit der kürzlichen
Synthese und Charakterisierung von chiralen Peptid Nukleinsäuren, die
Aminosäure-Seitenketten
tragen (Haaima et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:1939–1942, 1996;
Püschl
et al. Tetrahedron Lett. 39:4707, 1998), ermöglicht die Vereinigung des
Polymerrückgrats
und des wachsenden Nukleinsäure-Strangs
in eine einzige Struktur. In diesem Beispiel besteht jede Matrize
aus einer DNA Haarnadel, die in einer 5' Aminogruppe endet; die Festphase und
Lösungssynthese
von solchen Molekülen
wurden früher
beschrieben (Uhlmann et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:2632,
1996). Jedes Erweiterungsmonomer besteht aus einem PNA Trimer (oder
länger),
welches Seitenketten trägt,
welche Funktionalität von
Interesse enthalten. Ein künstlicher
genetischer Code wird geschrieben, um jedes Trinukleotid einem unterschiedlichen
Satz von Seitenketten zuzuordnen. Der Zusammenbau, die Aktivierung
(z.B. mit einem Carbodiimid und entsprechender Abgangsgruppe), und
Polymerisierung der PNA Dimere entlang der komplementären DNA-Matrize
in der Carboxy- zu Amino-terminalen Richtung ergibt das unnatürliche Polymer
(20). Wählen
eines „Stopp" Monomers mit einem
biotinylierten N-Terminus stellt einen geeigneten Weg zum Beenden
der Erweiterung und Reinigen von Polymeren mit voller Länge bereit.
Die resultierenden Polymere, die kovalent an ihre kodierende DNA
gebunden sind, sind für
die Selektion, Sequenzierung oder Mutation bereit.
-
Der
experimentelle Ansatz in Richtung des Implementierens einer entwickelbaren
funktionalisierten Peptid-Nukleinsäure-Bibliothek enthält (i) Verbessern
und Adaptieren bekannter Chemie für die hoch effiziente Matrizen-gerichtete
Polymerisierung von PNAs; (ii) Definieren eines Kodonformats (Länge und
Zusammensetzung), das für
die PNA Kopplung einer Anzahl von unterschiedlichen Monomeren an
einen komplementären Strang
von kodierender DNA, die frei von signifikanter Ungenauigkeit, Rahmenverschiebung,
oder falsche Initiierung der Polymerisierung ist, geeignet ist;
(iii) Auswählen
eines anfänglichen
Satzes von Seitenketten, die unseren neuen genetischen Code definieren
und Synthetisieren entsprechender Monomere; und (iv) Unterziehen
einer Bibliothek von funktionalisierten PNAs Zyklen von Selektion,
Amplifikation und Mutation und Charakterisieren der resultierenden,
entwickelnden Moleküle,
um die Basis ihrer neuartigen Aktivitäten zu verstehen.
- (i) Verbessern der Kopplungschemie: Während Orgel und Mitarbeiter
die Matrizengerichtete DNA-Polymerisation berichtet haben, sind
die berichteten Ausbeuten und Anzahl von erfolgreichen Kopplungen
signifikant geringer als gewünscht
wäre. Eine
vielversprechende Route in Richtung des Verbesserns dieses Schlüsselkopplungsprozesses
ist das Auffinden neuer Kopplungsreagenzien, Temperaturen und Lösungsmittel,
welche zuvor nicht untersucht wurden (vermutlich da sich frühere Bemühungen auf
Bedingungen konzentriert haben, welche auf der präbiotischen
Erde existiert haben könnten).
Die Entwicklung von entwickelbaren funktionalisierten PNA-Polymeren
enthält
das Einsetzen von Aktivatoren (DCC, DIC, EDC, HATU/DIEA, HBTU/DIEA,
ByBOP/DIEA, Chloracetonitril), Abgangsgruppen (2-Methylimidazol, Imidazol, Pentafluorphenol,
Phenol, Thiophenol, Trifluoracetat, Acetat, Toluensulfonsäure, Coenzym
A, DMAP, Ribose), Lösungsmittel
(wässrig
bei mehreren pH-Werten,
DMF, DMSO, Chloroform, TFE), und Temperatur (0°C, 4°C, 25°C, 37°C, 55°C) in einem großen kombinatorischen
Screen, um neue Kopplungsbedingungen zu isolieren. Jede Kammer einer
384-Kammerplatte wird einer spezifischen Kombination von einem Aktivator, einer
Abgangsgruppe, einem Lösungsmittel
und einer Temperatur zugeordnet. Festphasen-Synthesekügelchen, die kovalent an DNA-Haarnadel
Matrizen gebunden sind, werden in jeder Kammer zusammen mit einem
Fluoreszenz-markierten DNA-Monomer, welches zu der Matrize komplementär ist, platziert.
Ein erfolgreicher Kopplungsvorgang führt zu der kovalenten Bindung
des Fluorophors an das Kügelchen (26); ungewünschte
nicht-Matrizen basierende Kopplungen können durch Kontrollereaktionen
mit nicht übereinstimmenden
Monomeren unterschieden werden. Im Anschluss an die Kügelchen-Waschung und
Spaltung des Produktes von dem Feststoffenträger wird jede Kammer mit einem
Fluoreszenz Plattenleser untersucht.
- (ii) -Definieren eines Kodonformats: Während die Natur erfolgreich
ein Tripletkodon in der Protein-Biosynthese eingesetzt hat, kann
ein neues Polymer, welches unter sehr unterschiedlichen Bedingungen
ohne die Assistenz von Enzymen zusammengebaut wird, einen komplett
neuartiges Kodonformat erfordern. Rahmenverschiebung kann durch
Verlängern
jedes Kodons, so dass die Hybridisierung eines Kodons außerhalb
des Rahmens eine Nichtübereinstimmung
garantiert (zum Beispiel, durch Starten jedes Kodons mit einem G
und durch Beschränken
nachfolgender Positionen in dem Kodon auf T, C und A), beseitigt
werden. Es würde
thermodynamisch erwartet werden, dass sich die Genauigkeit mit zunehmender
Kodonlänge
bis zu einem Punkt verbessert. Kodons, die übermäßig lang sind, werden jedoch
in der Lage sein, trotzt nichtübereinstimmender
Basen zu hybridisieren und verkomplizieren außerdem die Monomer-Synthese.
Eine optimale Kodonlänge
für die
künstliche
Translation mit hoher Genauigkeit kann unter Verwendung eines optimierten
Platten-basierenden kombinatorischen Screens, der oben entwickelt
wurde, definiert werden. Die Länge
und die Zusammensetzung jedes Kodons in der Matrize wird durch Festphasen-Synthese
der geeignete DNA-Haarnadel variiert. Diesen Matrizen-Haarnadeln
wird dann ermöglicht,
mit Fluoreszenzmarkierten PNA-Monomeren mit variierender Sequenz
zu koppeln. Das ideale Kodonformat ermöglicht nur Monomeren, die die
exakte komplementäre
Sequenz tragen, mit den Matrizen zu koppeln, sogar in der Anwesenheit
von nichtübereinstimmenden
DNA-Monomeren (welche unterschiedlich markiert sind, um das Untersuchen
der übereinstimmenden
versus nichtübereinstimmenden
Kopplung zu erleichtern). Triplet und Vierer-Kodons, in welchen
zwei Basen unter A, T und C variiert werden, während die restliche Base oder Basen
als G fixiert sind, um eine richtige Registrierung während der
Polymerisierung sicherzustellen, werden als Erstes studiert.
- (iii) Schreiben eines neuen genetischen Codes: Seitenketten
werden ausgewählt,
welche eine interessante Funktionalität bereitstellen, die in den
natürlichen
Biopolymeren nicht notwendigerweise vorhanden ist, welche synthetisch
zugänglich
sind, und welche mit den Kopplungsbedingungen kompatibel sind. Zum
Beispiel besteht ein einfacher genetischer Code, welcher verwendet
werden könnte,
um eine Ni+2 Chelat-bildende PNA zu entwickeln,
aus einer Vielzahl von geschützten
Carboxylat tragenden Seitenketten sowie einem Satz aus kleinen Seitenketten,
um die Polymere mit konformativer Flexibilität und struktureller Diversität auszustatten
(27), Die erfolgreiche Selektion von PNAs, die
in der Lage sind, Ni+2 mit hoher Affinität zu binden,
könnten
durch eine Expansion dieses genetischen Codes gefolgt werden, um
ein Fluorophor sowie einen fluoreszierenden Quencher zu beinhalten.
Die resultierenden Polymere könnten
dann in Richtung eines fluoreszierenden Ni+2 Sensors
entwickelt werden, welcher unterschiedliche fluoreszierende Eigenschaften
in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Nickel besitzt. Das Ersetzen
der fluoreszierenden Seitenkette mit einer photocaged Seitenkette
kann die Entwicklung von Polymeren ermöglicht werden, die Ni+2 in der Gegenwart von bestimmten Lichtwellenlängen chelatieren
oder welche Ni+2 bei der Photolyse freisetzen.
Diese einfachen Beispiele demonstrieren die enorme Flexibilität in potenziellen
chemischen Eigenschaften von entwickelbaren unnatürlichen
Molekülen,
die durch die Freiheit verliehen wird, synthetische Baueinheiten,
die nicht länger
auf jene limitiert sind, die mit der ribosomalen Maschinerie kompatibel
sind, einzubauen.
- (iv) Selektieren auf gewünschte
unnatürliche
Polymere: Viele der entwickelten Verfahren für das Selektieren von biologischen
Molekülen
können
auf das Selektieren von entwickelten PNAs mit gewünschten
Eigenschaften angewendet werden. Ähnlich wie die Nukleinsäuren oder
Phage-Display Selektionen, sind die Bibliotheken von unnatürlichen
Polymeren, die durch die obenbeschriebenen DNA-Matrizen basierenden Polymerisierungsverfahren
erzeugt werden, selbst-markiert und müssen deshalb nicht räumlich getrennt oder
auf Pins oder Kügelchen
synthetisiert werden. Die Bindung von Ni+2 an
die PNA kann leicht durch das Hindurchleiten der gesamten Bibliothek,
welche von der Translation resultiert, oder eines zufälligen Oligonukleotids
durch ein kommerziell erhältliches
Ni-NTA („His-Tag") Harz, welches mit
Nickel vorgeladen ist, erreicht werden. Die gewünschten Moleküle binden
an das Harz und werden mit EDTA eluiert. Die Sequenzierung dieser
PNAs nach mehreren Zyklen bestehend aus Selektion, Mutagenese und
Amplifikation offenbarte, welche der anfänglich ausgewählten Seitenketten
zusammenlagern können,
um einen Ni+2 Rezeptor zu bilden. Zusätzlich repräsentiert
die Isolierung eines PNA Ni+2 Chelators
das DNA Äquivalent
eines Histidin Tags, welches sich als nützlich für die Reinigung von nachfolgenden
unnatürlichen
Polymeren herausstellen kann. Spätere
Anstrengungen werden ambitioniertere Selektionen beinhalten. Zum
Beispiel können PNAs,
die in der Gegenwart von spezifischen Liganden fluoreszieren, durch
FACS-Sortierung von translatierten Polymeren, die durch ihre DNA-Matrizen
an Kügelchen
gebunden sind, selektiert werden. Jene Kügelchen, die in der Gegenwart,
jedoch nicht in der Abwesenheit, des Zielliganden fluoreszieren,
werden isoliert und charakterisiert. Schlußendlich ermöglicht die
Verwendung eines biotinylierten „Stopp" Monomers, wie oben beschrieben, die
direkte Selektion für
die Katalyse von vielen Bindungsbildungs- oder Bindungsbrechungsreaktionen.
Zwei in 28 dargestellte Beispiele behandeln
eine Selektion einer funktionalisierten PNA, die die Retroaldol-Spaltung
von Fruktose 1,6-bisphosphat zu Glyceraldehyd 3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat
katalysiert, einem essenziellen Schritt in der Glycolyse, sowie
eine Selektion für PNA,
die die umgekehrte Aldol-Reaktion
katalysieren.
- C) Entwickelbare Bibliotheken von kleinen Molekülen: In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verfahren
zum Herstellen von amplifizierbaren und entwickelbaren unnatürlichen,
nichtpolymer-Molekülen,
einschließlich
synthetischen Arzneimittelgerüsten, verwendet.
Nukleophile oder elektrophile Gruppen werden individuell auf einem
kleinen Molekülgerüst, welches
durch eine einfache kovalente Bindung oder durch einen gewöhnlichen
Feststoffträger
an eine kodierende Oligonukleotid-Matrize gebunden ist, maskiert.
Elektrophile oder nukleophile Reaktanten, die an kurze Nukleinsäure-Sequenzen
gebunden sind, werden an die entsprechenden Matrizen hybridisiert.
Sequenz spezifische Reaktion mit dem geeigneten Reagenz findet durch
Proximität-Katalyse statt (29).
-
Im
Anschluss an die synthetische Funktionalisierung von allen Positionen
auf eine Weise, die durch die Sequenz der angelagerten DNA bestimmt
ist (30 & 31),
können
die resultierenden kodierenden Kügelchen
einer großen
Auswahl von biologischen Screens, welche für das Untersuchen von Verbindungen auf
Harz entwickelt wurden, unterzogen werden (Gordon et al. J. Med.
Chem. 37:1385, 1994; Gallop et al. J. Med. Chem. 37:1233–1251, 1994;)
-
Die
kodierende DNA wird von jedem in dem Screen identifizierten Kügelchen
abgespalten und einer PCR, Mutagenese, Sequenzierung, oder homologen
Rekombination vor der erneuten Anheftung an einen Feststoffträger unterzogen.
Letztendlich ist dieses System am flexibelsten wenn die kodierende
DNA direkt auf das kombinatorische synthetische Gerüst ohne
ein Zwischenkügelchen
gebunden ist. In diesem Fall kann die gesamte Bibliothek an Verbindungen
auf die gewünschten
Aktivitäten
gescreent oder selektiert werden, ihre kodierende DNA freigesetzt,
amplifiziert, mutiert, und rekombiniert werden und neue Verbindungen
synthetisiert werden, alles in einer kleinen Reihe von ein-Gefäß, im Großen und
Ganzen parallelen Reaktionen. Ohne einen Kügelchenträger müssen jedoch die Reaktivitäten von
hybridisierten Reaktanten hoch effizient sein, da nur ein Matrizenmolekül die Synthese
aller kleinen Moleküle
lenkt.
-
Die
Entwicklung von entwickelbaren synthetischen kleinen Molekülbibliotheken
beruht auf der chemischen Katalyse, die durch die Proximität von DNA
hybridisierten Reaktanten bereitgestellt wird. Es ist erkennbar,
dass akzeptable Entfernungen zwischen hybridisierten Reaktanten
und entmaskierten reaktiven Gruppen zuerst für die effiziente DNA-Matrizen
basierende Funktionalisierung durch Hybridisieren radiomarkierte
Elektrophile (aktivierte Ester in unseren ersten Versuchen), die
an kurze Oligonukleotide in verschiedenen Entfernungen von einem
reaktiven Nukleophil (einem primären
Amin) auf einem DNA-Strang angeheftet sind, definiert werden müssen. Zu
gegebenen Zeitpunkten werden Aliquote einer Gelelektrophorese und
Autoradiographie unterzogen, um den Verlauf der Reaktion zu überwachen.
Das graphische Darstellen der Reaktion als eine Funktion der Entfernung
(in Basen) zwischen dem Nukleophil und Elektrophil wird ein akzeptables
Distanzfenster definiert, innerhalb welchem die Proximitätbasierende
Katalyse einer DNA-hybridisierten Reaktion stattfinden kann. Die
Breite dieses Fensters wird die Anzahl von unterschiedlichen Reaktionen,
die wir auf einem Strang der DNA kodieren können (ein größeres Fenster
erlaubt mehrere Reaktionen), sowie die Natur der Kodons (ein größeres Fenster
ist für
längere
Kodons benötigt)
bestimmen (32).
-
Sobald
akzeptable Entfernungen zwischen funktionellen Gruppen auf einem
kombinatorischen synthetischen Gerüst und hybridisierenden Reaktanten
bestimmt ist, wird das Kodonformat bestimmt. Die nichtpolymere Natur
der kleinen Molekülsynthese
vereinfacht das Kodonlesen, da die Rahmenverschiebung keine Rolle
spielt und relativ große
Kodons verwendet werden können,
um sicherzustellen, dass jeder Satz von Reaktanten nur mit einer
Region des kodierenden DNA Strangs hybridisiert.
-
Sobald
die Entfernung des Linkers zwischen der funktionellen Gruppe und
dem synthetischen kleinen Molekülgerüst und das
Kodonformat bestimmt wurden, können
kleine Moleküle
basierend auf einem kleinen Molekülgerüst, wie das in 31 gezeigte Cephalosporin-Gerüst, synthetisiert werden. Das
primäre
Amin der 7-säure
wird zuerst unter Verwendung von FMOC-Cl geschützt, und dann wird die Acetylgruppe
durch Behandlung mit einer Base hydrolisiert. Die kodierende DNA
Matrize wird dann durch eine Amidbindung unter Verwendung von EDC
und HOBt an die Carbonsäure-Gruppe
angelagert. Einen Transfermolekül
mit einem Antikodon, welches in der Lage ist, an die angehängte DNA-Matrize
zu hybridisieren, wird dann ermöglicht,
an die Matrize zu hybridisieren. Mit dem Transfermolekül ist durch
eine Disulfidbindung ein R1 tragendes primäres Amin
assoziiert. Die Aktivierung der primären Hydroxylgruppe auf dem
Cephalosporin-Gerüst
mit DSC, gefolgt von der Behandlung mit TCEP, ergibt das Amin, welches
durch eine Carbamatbindung kovalent an das Gerüst gebunden ist. Die weitere
Behandlung mit einer weiteren Transfereinheit mit einer Aminosäure führt zu der Funktionalisierung
des schutzeliminierten primären
Amins auf dem Cephalosporin-Gerüst.
Cephalosporin ähnliche
Moleküle,
die auf diese Art synthetisiert werden, können dann ausgewählt, amplifiziert,
und/oder entwickelt werden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
und Zusammensetzungen. Die DNA-Matrize kann unter Verwendung von
DNA-Shuffling diversifiziert und entwickelt werden.
- D) Mehrstufige kleine Molekül
Synthese, die durch DNA-Matrizen programmiert ist: Die molekulare
Entwicklung erfordert die Sequenz-spezifische Translation eines
amplifizierbaren Informationsträgers
in die Strukturen des sich entwickelnden Moleküls. Diese Anforderung hat die
Arten der Moleküle,
die direkt entwickelt wurden, auf zwei Klassen, Proteine und Nukleinsäuren, beschränkt, da
nur diese zwei Molekülklassen
von Nukleinsäure-Sequenzen translatiert
werden können.
Wie oben allgemein beschrieben ist, verwendet ein vielversprechender
Ansatz für
die Entwicklung von Molekülen
außer
Proteinen und Nukleinsäuren
die DNA-Matrizen basierende Synthese als ein Verfahren zum Translatieren
von DNA-Sequenzen in synthetische kleine Moleküle. Die DNA-Matrizen basierende
Synthese kann eine große
Auswahl von leistungsfähigen
chemischen Reaktionen mit hoher Sequenz-Spezifität und ohne das Benötigen einer
strukturellen Nachahmung des DNA-Rückgrats, lenken. Die Anwendung
dieses Ansatzes auf synthetischen Moleküle von nützlicher Komplexität erfordert
jedoch die Entwicklung von allgemeinen Verfahren, um dem Produkt einer
DNA-Matrizen basierenden Reaktion zu ermöglichen, nachfolgende DNA-Matrizen
basierende Transformationen zu durchmachen. Die erste DNA-Matrizen
basierende mehrstufige kleine Molekül-Synthese wird hierin detailliert
beschrieben. Zusammen mit jüngsten
Fortschritten in dem Reaktionsumfang der DNA-Matrizen basierenden
Synthese, setzen diese Ergebnisse die Stufe für die in vitro Evolution von
synthetischen kleinen Molekül-Bibliotheken.
-
Die
mehrstufige DNA-Matrizen basierende kleine Molekül-Synthese begegnet zwei Hauptherausforderungen,
die über
jene hinausgehen, die im Allgemeinen mit der DNA-Matrizen basierenden
Synthese assoziiert sind. Erstes muss die DNA, die verwendet wird,
um die Reagenzien zu den entsprechenden Matrizen zu lenken, von
dem Produkt einer DNA-Matrizen basierenden Reaktion vor den nachfolgenden
DNA-Matrizen basierenden Syntheseschritten entfernt werden, um eine
ungewünschte
Hybridiserung an die Matrize zu verhindern. Zweitens erfordert die
mehrstufige Synthese oft die Reinigung und Isolierung von Zwischenprodukten, dennoch
sind gewöhnliche
Verfahren, die verwendet werden, um Reaktionsprodukte zu reinigen
und isolieren, für
die mehrstufige Synthese in einem molekularbiologischen Maßstab nicht
geeignet. Um diese Herausforderungen zu adressieren, wurden drei
unterschiedliche Strategien in die Festphasen-organische Synthese
implementiert, für
das Verbinden chemischer Reagenzien mit ihren dekodierenden DNA-Oligonukleotiden
und zwei allgemeine Ansätze
für die
Produktreinigung nachdem jeder DNA-Matrizen basierende synthetische Schritt
entwickelt wurde.
-
Wenn
möglich
positioniert ein idealer Reagenz-Oligonukleotid-Linker für die DNA-Matrizen-basierende
Synthese, das Oligonukleotid als eine Abgangsgruppe des Reagenzes.
Unter dieser „selbstspaltender" Linkerstrategie
wird die Oligonukleotid-Reagenzbindung als eine natürliche chemische
Konsequenz der Reaktion gespalten (33).
Als das erste Beispiel dieses Ansatzes, der auf die DNA-Matrizen
basierende Chemie angewendet wird, wurde ein dansyliertes Wittig
Phosphoran-Reagenz (1), in welchem das dekodierende DNA-Oligonukleotid
an eine der Arylphosphin-Gruppen angehängt war, synthetisiert (I.
Hughes, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7595). Die DNA-Matrizen basierende
Wittig-Olefinierung (wie oben beschrieben) mit Aldehyd-gebundener
Matrize 2 resultierte in dem effizienten Transfer der fluoreszierenden
Dansylgruppe von dem Reagenz auf die Matrize, um Olefin 3 bereitzustellen
(33). Als ein zweites Beispiel eines selbstspaltenden Linkers
acylierte der DNA-gebundene Thioester 4, wenn mit Ag(I) bei pH 7,0
aktiviert (Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311), die
Aminobegrenzte Matrize 5, um das Amidprodukt 6 zu ergeben (33). Die ribosomale Protein-Biosynthese verwendet aminoacylierte
tRNAs in einem ähnlichen
selbstspaltenden Linkerformat, um die RNA-Matrizen basierende Peptid-Bindungsbildung
zu vermitteln. Um die gewünschten
Produkte von unreagierten Reagenzien und von gespaltenden Oligonukleotiden
im Anschluss an die DNA-Matrizen basierenden Reaktionen unter Verwendung
von selbstspaltenden Linkern zu reinigen, wurden biotinylierte Reagenz-Oligonukleotide
und Waschen der Rohreaktionen mit Streptavidin-gebundenen magnetischen
Kügelchen
(34) benutzt. Obwohl dieser Ansatz die reagierten
Matrizen nicht von den unreagierten Matrizen trennt, können unreagierte
Matrizen in nachfolgenden DNA-Matrizen basierenden Reaktionen und
Reinigungsschritten entfernt werden (siehe unten).
-
Reagenzien,
die mehr als eine funktionelle Gruppe tragen, können an ihre dekodierenden
DNA-Oligonukleotide durch eine zweite und dritte Linkerstrategie
gebunden werden. In dem „narbenlosen
Linker"-Ansatz ist
eine funktionelle Gruppe des Reagenzes für die DNA-Matrizen basierende
Bindungsbildung reserviert, während
die zweite funktionelle Gruppe verwendet wird, um einen Linker,
der ohne das Einführen
einer zusätzlichen
ungewünschten
chemischen Funktionalität
gespalten werden kann, anzuhängen.
Die DNA-Matrizen basierende Reaktion wird durch die Spaltung des
Linkers, welcher durch die zweite funktionelle Gruppe angehängt ist,
gefolgt, um die gewünschten
Produkte zu ergeben (33). Zum Beispiel wurde eine
Reihe von Aminoacylierungs-Reagenzien, wie (D)-Phe Derivat 7, in
welchen das α-Amin
durch einen Carbamoylethylsulfon-Linker (Zarling et al. J. Immunology
1980, 124, 913) an sein dekodierendes DNA-Oligonukleotid gebunden ist,
synthetisiert. Das Produkt (8) der DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildung
(wie hierin beschrieben) unter Verwendung dieses Reagenzes und einer
Amin-begrenzten Matrize (5) wurde mit einer wässrigen Base behandelt, um
die quantitative Eliminierung und spontane Decarboxylierung des
Linkers zu bewirken, was Produkt 9 ergibt, welches die sauber transferierte
Aminosäure-Gruppe
enthält
(33). Dieser Sulfon-Linker ist in einem Puffer
bei pH 7 oder niedriger bei 25°C
für mehr
als 24 h stabil, wird dennoch quantitativ gespalten, wenn er einem
pH 11,8 Puffer für
2 h bei 37°C
ausgesetzt ist.
-
In
einigen Fällen
kann es vorteilhaft sein, neue chemische Gruppen als eine Konsequenz
der Linkerspaltung einzuführen.
Unter einer dritten Linker-Strategie, erzeugt die Linkerspaltung
eine „nützliche
Narbe", die in nachfolgenden
Schritten funktionalisiert werden kann. Als ein Beispiel dieser
Klasse von Linker wurden die Aminosäure-Reagenzien, wie (L)-Phe
Derivat 10, erzeugt, welche durch 1,2-Diole (Fruchart et al Tetrahedron
Lett. 1999, 40, 6225) an ihre dekodierenden DNA Oligonukleotide
gebunden sind. Im Anschluss an die DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung
mit der Amin-begrenzten Matrize (5) wurde dieser Linker durch Oxidation
mit 50 mM wässrigem
NaIO4 bei pH 5,0 gespalten, um Produkt 12,
welches eine Aldehyd-Gruppe, die für die nachfolgende Funktionalisierung
geeignet ist (z.B. in einer DNA-Matrizen basierenden Wittig Olefinierung,
reduktive Aminierung, oder Nitrol-Aldol-Addition (33)),
enthält,
zu ergeben.
-
Gewünschte Produkte,
die durch DNA-Matrizen basierende Reaktionen unter Verwendung der
narbenlosen oder nützlichen
Narben-Linker erzeugt wurden, können
unter Verwendung von biohinylierten Reagenz-Oligonukleotiden leicht
gereinigt werden (34). Reagenz-Oligonukleotide
zusammen mit den gewünschten
Produkten werden zuerst auf Streptavidin-gebundenen magnetischen
Kügelchen
eingefangen. Jede unreaktive Matrize, die durch Basenpaarung an
das Reagenz gebunden ist, wird durch Waschen der Kügelchen
mit Puffer, welcher 4 M Guanidiumchlorid enthält, entfernt. Biotinylierte
Moleküle
bleiben unter diesen Bedingungen an die Streptavidin Kügelchen
gebunden. Das gewünschte
Produkt wird dann in reiner Form durch Eluieren der Kügelchen
mit Linkerspaltungs-Puffer (in den obigen Beispielen entweder pH
11 oder NaIO4-enthaltendem Puffer) isoliert,
während
reagierte und unreagierte Reagenzien an die Kügelchen gebunden bleiben.
-
Zusammenfassen
des kürzlich
erweiterten Repertoires an synthetischen Reaktionen, die mit der DNA-Matrizen
basierenden Synthese kompatibel sind, und der oben beschriebenen
Linker-Strategien, können mehrstufige
DNA-Matrizen basierende kleine Molekül-Synthesen ausgeführt werden.
-
In
einer Ausführungsform
wird eine Lösungsphasen-DNA-Matrizen
basierende Synthese einer nicht-natürlichen Peptid-Bibliothek im
Allgemeinen unten beschrieben und ist im Allgemeinen in 35 gezeigt. Wie in 35 gezeigt
ist, werden, um den anfänglichen
Matrizenpol für
die Bibliothek zu erzeugen, dreißig synthetische biotinylierte
5'-Amino Oligonukleotide
des in 35 gezeigten Sequenzformats
mit einer von dreißig
unterschiedlichen natürlichen
oder nicht-natürlichen
Aminosäuren
unter Verwendung der Standard EDC-Kopplungsprozeduren acyliert.
Vier Basen, die ein „Kodon" innerhalb jedes
Amino acylierten Primers repräsentieren,
werden die Identität
der Seitenkette (R1) Kennzeichen. Der „genetische
Code" für diese
Seitenketten werden mit säurelabilen
Schutzgruppen, ähnlich
zu jenen, die häufig
in der Peptidsynthese verwendet werden, geschützt. Die resultierenden dreißig Amino-acylierten
DNA Primer werden an de Matrizen-DNA-Oligonukleotid-Bibliothek,
die durch automatisierte DNA-Synthese erzeugt wird, angelagert.
Die Primererweiterung mit einer DNA-Polymerase, gefolgt von der
Strang-Denaturierung und Reinigung mit Streptavidin gebundenen magnetischen
Kügelchen
ergibt die Ausgangsmatrizen-Bibliothek (siehe 35). Als nur ein Beispiel ist eine Lösungsphasen
DNA-Matrizen basierenden Synthese einer nicht-natürlichen
Peptid-Bibliothek in 36 gezeigt. Die Matrizen-Bibliothek
wird drei DNA-Matrizen
basierenden Peptidbindungsbildungs-Reaktionen unter Verwendung von
Aminosäure- Reagenzien, die an
10 Basen dekodierende DNA Oligonukleotide durch den oben beschriebenen
Sulfon-Linker gebunden sind, unterzogen. Die Produkte von jedem
Schritt werden durch präparative
denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese vor der Linkerspaltung,
wenn gewünscht,
obwohl dies nicht notwendig sein muss, gereinigt. Jedes DNA-gebundene
Reagenz kann durch Koppeln eines 3'-Amino begrenzten DNA-Oligonukleotids
an die kodierende Aminosäure
durch das bis-NHS Carbonat Derivat des Sulfonlinkers, wie in 37 gezeigt ist, synthetisiert werden. Die Kodons
werden wiederum so ausgewählt,
dass verwandte Kodons chemisch ähnliche
Aminosäuren
kodieren. Im Anschluss an jede Peptidbindungsbildungs-Reaktion wird Essigsäureanhydrid
verwendet, um unreagierte Ausgangsmaterialien zu bedecken, und pH
11 Puffer wird verwendet, um die Linkerspaltung zu bewirken, um
eine neue Aminogruppe für
die nächste
Peptidbindungsbildungs-Reaktion freizulegen. Sobald das Tetrapeptid
vollständig
ist, können jene
Bibliotheks-Mitglieder, die Carboxylat-Seitenketten tragen, ebenfalls
mit ihren Amino-Termini zyklisiert werden, um makrozyklische Peptide
zu bilden, während
lineare Peptid-Mitglieder einfach N-acetyliert werden können (siehe 36).
-
Es
ist erkennbar, dass eine nahezu unbegrenzte Auswahl von Aminosäure-Baueinheiten
in eine nicht-natürliche
Peptid-Bibliothek eingebaut werden kann. Im Gegensatz zu Peptid-Bibliotheken, die
mittels der Protein-biosynthetischen Maschinerie, wie Phagen Display
Bibliotheken, erzeugt wurden (O'Neil
et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, 5, 443–9), mRNA Display Bibliotheken
(Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1997, 94, 12297–12302),
Ribosomen Display Bibliotheken (Roberts et al. Curr. Opin. Chem.
Biol. 1999, 3, 268–73; Schaffitzel
et al. J. Immunol Methods 1999, 231, 119–5), oder intrazelluläre Peptid-Bibliotheken
(Norman et al. Science 1999, 285, 591–5), können Aminosäuren mit nicht-proteinogenen
Seitenketten, nicht-natürlicher
Seitenketten Sterechemie, oder nicht-peptidischer Rückgrate
in diese Bibliothek eingebaut werden. Zusätzlich können die vielen kommerziell
erhältlichen
Di-, Tri- und Oligopeptide als Baueinheiten verwendet werden, um längere Bibliotheksmitglieder
zu erzeugen. Das Vorhandensein von nicht-natürlichen Peptiden in dieser
Bibliothek kann verstärkte
pharmakologische Eigenschaften, wie Protease-Resistenz, im Vergleich
zu ribosomal erzeugten Peptiden, verleihen. Ähnlicherweise können die
makrozyklischen Bibliotheks-Mitglieder
höhere
Affinitätsliganden
ergeben, da der Entropy-Verlust bei Bindung ihrer Ziele geringer
sein kann, als der ihrer flexibleren linearen Gegenstücke. Basierend
auf der ernormen Vielfalt von kommerziell erhältlichen Aminosäuren, die
in diese Beschreibungen passen, kann die maximale Diversität dieser
nicht-natürlichen
zyklischen und linearen Tetrapeptid-Bibliothek 100 × 100 × 100 × 100 =
108 Mitglieder übersteigen.
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Ein
anderes Beispiel einer Bibliothek unter Verwendung des oben beschriebenen
Ansatzes enthält
die DNA-Matrizen basierende Synthese einer Diversität-orientierten
makrobizyklischen Bibliothek, die 5- und 14-gliedrige Ringe enthält (38). Das Ausgangsmaterial für diese Bibliothek besteht
aus DNA-Matrizen, die mit einer Vielzahl von Seitenketten-geschützten Lysinderivaten
und kommerziell enthältlichen
Lysinanaloga (einschließlich
Aminoethylzystein, Aminoethylserin und 4-Hydroxylysin) aminoacyliert
sind. In dem ersten Schritt findet die DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung
mit einer Vielzahl von DNA-gebundenen Aminosäuren, wie in der nicht-natürlichen
Peptid-Bibliothek beschrieben ist, statt, mit der Aufnahme das der oben
beschriebene vicinale Diol-Linker 16 anstelle des spurlosen Sulfon-Linkers
verwendet wird. Im Anschluss an die Amidbindungsbildung wird der
Diol-Linker oxidativ mit Natriumperiodat gespalten. Die Schutzeliminerung
des Seitenketten-Amins
des Lysin-Analogons wird durch die DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung,
die durch silbertrifluoracetat katalysiert ist, zwischen dem freien
Amin und einer Bibliothek von acrylischen-abgeleiteten Thioestern
gefolgt. Die resultierenden Olefine werden mit einem Hydroxyl-Amin
behandelt, um Nitrone zu bilden, welche eine 1,3-dipolare Cycloaddition
durchmachen, um die bizyklische Bibliothek zu ergeben (38). Die DNA-gebundenen Reagenzien für diese
Bibliothek werden durch Koppeln von Lysin-Analoga an 5'-Amino-begrenzte Matrizen-Primer
(35), Koppeln von aminoacylierten Diol-Linken an 3'-Amino-begrenzte DNA Oligonukleotide
(38), um Koppeln von Arylsäuren an 3'-Thiol-begrenzte DNA Oligonukleotide
(38) hergestellt.
-
Als
nur ein Beispiel einer spezifischen Bibliothek, die von dem ersten
allgemeinen oben beschriebenen Ansatz erzeugt wurde, wurden drei
sich wiederholende Zyklen von DNA-Matrizen basierende Amidbildung, spurenloser
Linkerspaltung, Reinigung mit Streptavidingebundenen Kügelchen
verwendet, um ein nicht natürliches
Tripeptid zu erzeugen (39).
Jedes Aminosäure-Reagenz
wurde an ein einzigartiges biotinyliertes 10-Basen DNA Oligonukleotid
durch den oben beschriebenen Sulfon-Linker gebunden. Die 30-Basen Amin-begrenzte Matrize,
die programmiert war, um die Tripeptid-Synthese zu lenken, enthielt
drei aufeinanderfolgende 10 Basen Regionen, die zu den drei Reagenzien
komplementär
waren, was die Strategie nachahmt, die in der mehrstufigen DNA-Matrizen
basierenden kleinen Molekül-Bibliothek-Synthese
verwendet werden würde.
Das erste Aminosäure-Reagenz
(13) wurde mit der Matrize und dem Aktivator 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid
(DMT-MM) kombiniert (Kunishima et al. Tetrahedron 2001, 57, 1551),
um die DNA-Matrizen basierende Peptidbindungsbildung zu bewirken.
Das gewünschte Produkt wurde
durch Mischen der Rohreaktion mit Streptavidin-gebundenen magnetischen
Kügelchen
gereinigt, waschen mit 4 M Guanidiniumchlorid, und Eluieren mit
pH 11 Puffer, um die Sulfonlinker-Spaltung zu bewirken, was Produkt
14 bereitstellt. Die freie Aminogruppe in 14 wurde dann in der zweiten
und dritten Runden aus DNA-Matrizen basierender Amidbildung und
Linkerspaltung aufgearbeitet, um das Dipeptid 15 und das Tripeptid
16 zu ergeben (39).
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Der
Fortschritt jedes Reaktion-, Reinigung- und Sulfon-Linker Spaltungsschrittes
wurde durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese verfolgt.
Das Endtripeptid, welches an Matrize (16) gebunden ist, wurde mit
der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und das Verdauungsfragment,
welches das Tripeptid enthält,
wurde durch MALDI Massenspektrometrie charakterisiert. Beginnend
mit 2 nmol (~ 20 μg)
Ausgangsmaterial wurde genügend
Tripeptid Produkt erzeugt, um als die Matrize für mehr als 106 in
vitro Selektionen und PCR Reaktionen zu denen (Kramer et al. in
Current Protocols in Molecular Biology, Ausgabe 3 (Herausgeber:
F. M. Ausubel), Wiley, 1999, Seiten 15.1) (unter der Annahme, dass
1/10.000 Moleküle
die Selektion überleben).
Kein signifikantes Produkt wurde erzeugt, wenn die Ausgangsmaterial-Matrize mit Essigsäureanhydrid
bedeckt war, oder wenn Kontrollreagenzien, die Sequenz-Nichtübereinstimmungen
enthalten, anstelle der komplementären Reagenzien verwendet wurden
(39).
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Eine
nicht-peptidische, mehrstufige DNA-Matrizen basierende kleine Molekül-Synthese
(40), die alle drei oben entwickelten Linker-Strategien
verwendete, wurde ebenfalls durchgeführt. Eine Amino-begrenzte 30
Basen Matrize wurde einer DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung
unter Verwendung eines Aminoacyl Donator Reagenzes (17), die den
Diol-Linker und ein biotinyliertes 10-Basen Oligonukleotid enthält, unterzogen,
um das Amid 18 zu ergeben. Das gewünschte Produkt wurde durch
Einfangen der Rohreaktion auf Streptavidin-Kügelchen
isoliert, gefolgt durch die Spaltung des Linkers mit NaIO4, um Aldehyd 19 zu erzeugen. Die DNA Matrizen-basierende
Wittig-Reaktion von 19 mit dem biotinylierten selbstspaltenden Phosphoran-Reagenz
20 ergab Fumaramid 21. Die Produkte von der zweiten DNA-Matrizen
basierenden Reaktion wurden teilweise durch Waschen mit Streptavidin-Kügelchen gereinigt, um reagiertes
und unreagiertes Reagenz zu entfernen. In dem dritten DNA-Matrizen basierenden
Schritt wurde Fumaramid 21 einer DNA-Matrizen basierenden Konjugat-Addition (Gartner
et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961) unter Verwendung des Thiol-Reagenzes 22, welches
durch den Sulfon-Linker an ein biotinyliertes Oligonukleotid gebunden
ist, unterzogen. Das gewünschte
Konjugat-Additionsprodukt (23) wurde durch Immobilisierung mit Streptavidin-Kügelchen
gereinigt. Die Linkerspaltung mit pH 11 Puffer ergab das Endprodukt
24 mit einer gesamten isolierten Ausbeute von 5–10 % für die drei Bindungsbildungs-Reaktionen,
zwei Linker-Spaltungsschritte, und drei Reinigungsschritte (40). Dieses Endprodukt wurde mit EcoRI verdaut
und die Masse des kleinen Molekül
gebundenen Matrizen-Fragments wurde durch MALDI Massenspektometrie
bestätigt
(exakte Masse: 2568, beobachtete Masse: 2566 ± 5). Wie in dem Tripeptid
Beispiel, lagert es sich jedes der drei Reagenzien, welche während dieser
mehrstufigen Synthese verwendet wurden, an eine einzigartige Stelle
auf der DNA-Matrize an, und Kontrollreaktionen mit Sequenz-Nichtübereinstimmungen
ergaben kein Produkt (40). Wie erwartet, erzeugten
Kontrollreaktionen, in welchen das Wittig Reagenz weggelassen wurde
(Schritt 2), ebenfalls kein Produkt im Anschluss an den dritten
Schritt. Zusammengefasst demonstrieren die DNA-Matrizen basierenden Synthesen von 16
und 24 die Fähigkeit
von DNA, die Sequenz-programmierte,
mehrstufige Synthese von sowohl Oligomeren als auch nicht-Oligomeren
kleinen Molekülen,
die in ihrer Struktur mit Nukleinsäure nicht verwandt sind, zu
lenken.
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Die
kommerzielle Verfügbarkeit
von vielen Substraten für
DNA-Matrizen basierenden Reaktionen, einschließlich Aminen, Carbonsäuren, α-Halogen
Carbonylverbindungen, Olefinen, Alkoxyamine, Aldehyde und Nitroalkane
können
die Translation von großen
Bibliotheken von DNA in diverse kleine Molekülbibliotheken ermöglichen.
Die direkte ein Gefäß Selektion
von diesen Bibliotheken auf Mitglieder mit gewünschten Bindungs- oder katalytischen
Aktivitäten,
gefolgt von der PCR Amplifikation und Diversifizierung der DNA,
die aktive Moleküle
kodiert, kann den synthetischen kleinen Molekülen ermöglichen, sich auf eine Weise
zu entwickeln, die den leistungsfähigen Verfahren, die die Natur
verwendet, um neue molekulare Funktion zu erzeugen, angepasst sind.
Zusätzlich
ist die mehrstufige Nukleinsäure-Matrizen-basierende
Synthese eine Anforderung für
die früher
vorgeschlagenen Modelle (A.I. Scott, Tetrahedron Lett. 1997, 38,
4961; Li et al. Nature 1994, 369, 218; Tamura et al. Proc. Natl.
Acad. Sci USA 2001, 98, 1393) für
die präbiotische
Translation von replizierbarer Information in funktionelle Moleküle. Diese
Ergebnisse demonstrieren, dass Nukleinsäure-Matrizen tatsächlich in
der Lage sind, die iterative oder nicht-iterative, mehrstufige kleine
Molekül-Synthese
zu lenken, sogar wenn sich Reagenzien bei stark unterschiedlichen
Entfernungen von dem wachsenden Molekül anlagern (in den obigen Beispielen,
Null bis 20 Basen). Wie unten detaillierter beschrieben ist, können Bibliotheken
von synthetischen Molekülen
dann in Richtung aktiver Ligand und Katalysatoren durch Zyklen von
Translation, Selektion, Amplifikation und Mutagenese entwickelt
werden.
- E) Entwickeln von Kunststoff: In noch
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure (z.B. DNA, RNA, Derivat
davon) an einen Polymerisierungs-Katalysator angeheftet. Da Nukleinsäuren in
komplexe Strukturen falten können,
kann die Nukleinsäure
verwendet werden, um die Polymerisierung einer wachsenden Polymerkette
zu lenken und/oder zu beeinflussen. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure die
Selektion von Monomer-Einheiten, die zu polymerisieren sind, ebenso
wie das Stattfinden der Polymerisierungs-Reaktionen (z.B. Stereochemie,
Taktizität,
Aktivität)
beeinflussen. Die synthetisierten Polymere können auf spezifische Eigenschaften,
wie Molekulargewicht, Dichte, Hydrophobizität, Taktizität, Stereselektivität, etc.
ausgewählt
werden und die Nukleinsäure,
welche einen integralen Teil des Katalysators bildt, welcher seine
Synthese steuerte, kann amplifiziert und entwickelt werden (41). Sich wiederholende Zyklen von Liganden-Diversifizierung,
Selektion und Amplifikation ermöglichen
die wahre Evolution von Katalysaten und Polymeren in Richtung der
gewünschten
Eigenschaften.
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Um
nur ein Beispiel zu geben, wird eine Bibliothek von DNA-Molekülen an Grubbs' Ruthenium-basierenden
Ringöffnungs-Metathese-Polymerisierungs
(ROMP) Katalysator durch einen Dihydroimidazol Ligand angeheftet
(Scholl et al. Org. Lett. 1(6):953, 1999), was einen großen, diversen
Pool an potentiell katalytischen Molekülen erzeugt, wobei jedes einzigartig
ist durch die Natur des funktionalisierten Liganden. Zweifellos
wird das Funktionalisieren des Katalysators mit einem relativ großen DNA-Dihydroimidazol
(DNA-DHI) Ligand die Aktivität
des Katalysators verändern.
Jedes DNA Molekül
hat das Potential, in eine einzigartige stereoelektronische Form
zu falten, welche potentiell unterschiedliche Selektivitäten und/oder
Aktivitäten
in der Polymerisierungs-Reaktion hat (42).
Deshalb kann die Bibliothek von DNA-Liganden in eine Bibliothek
von Kunststoffen bei der Addition von verschiedenen Monomeren „translatiert" werden. In bestimmten
Ausführungsformen
werden DNA-DHI Liganden verwendet, die in der Lage sind, sich selbst
kovalent in das wachsende Polymer einzufügen, wodurch ein Polymer erzeugt
wird, welches mit der DNA markiert ist, die seine Erzeugung kodiert.
Unter Verwendung des in 42 gezeigten,
synthetischen Schemas werden DHI Liganden erzeugt, die zwei chemische
Griffe enthalten, wobei einer verwendet wird, um die DNA an den
Liganden zu binden, und der andere verwendet wird, um ein anhängendes
Olefin an das DHI Rückgrat
zu binden. Die Methatese-Raten sind bekannt, basierend auf der Olefin-Substitution sowie
der Identität
des Katalysators, stark zu variieren. Durch Ändern dieser Variablen, kann
die Rate des Einbaus des anhängenden
Olefins moduliert werden, so dass kanhängende Olefin
Methtese << kROMP,
dadurch das Bilden von Polymeren mit mässigen bis hohen Molekulargewichten
ermöglichen,
vor der Einführung
des DNA-Tags und entsprechender Polymer-Termination. Vinylether werden
entweder häufig
in der ROMP verwendet, um die Polymer-Termini zu funktionalisieren
(Gordon et al. Chem. Biol. 7:9–16,
2000) sowie um Polymere mit verringertem Molekulargewicht zu erzeugen.
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Die
nachfolgende Selektion eines Polymers auf der Bibliothek basierend
auf einer gewünschten
Eigenschaft durch Elektrophorese, Gelfiltration, zentrifugale Sedimentation,
Verteilung in Lösungsmitteln
unterschiedlicher Hydrophobizitäten,
etc. Amplifikation und Diversifizierung der kodierenden Nukleinsäure mittels Techniken
wie error-prone PCR oder DNA Shuffling, gefolgt durch die Anheftung
an ein DHI-Rückgrat
wird die Produktion eines anderen Pools von potenziellen ROMP Katalysatoren
ermöglichen,
die in der ausgewählten Aktivität angereichert
sind (43). Dieses Verfahren stellt
einen neuen Ansatz bereit, um polymere Materialien und die Katalysatoren,
die diese erzeugen, herzustellen.
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Beispiel 6: Charakterisierung
von DNA-Matrizen-basierenden synthetischen kleine Molekül-Bibliotheken:
-
Die
oben beschriebenen nicht-natürlichen
Peptid und bicyclischen Bibliotheken werden in mehreren Stufen charakterisiert.
Jedes Kandidatenreagenz wird an sein dekodierendes DNA Oligonukleotid
konjugiert, dann Modellreaktionen mit übereinstimmenden und nichtübereinstimmenden
Matrizen unterzogen. Die Produkte von diesen Reaktionen werden durch
denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, um die Reaktionswirksamkeit
zu beurteilen, und durch Massenspektrometrie, um die erwarteten
Produktstrukturen zu verifizieren. Sobald ein vollständiger Satz
an robusten Reagenzien identifiziert ist, wird die komplette mehrstufige
DNA-Matrizen-basierende Synthese von repräsentativen Einzelbibliotheksmitgliedern
in einem großen Maßstab durchgeführt und
die Endprodukte werden durch Massenspektrometrie charakterisiert.
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Spezifischer
wird die Sequenzgenauigkeit jeder mehrstufigen DNA-Matrizenbasierenden
Bibliotheksynthese durch Nachfolgen des Schicksals von einzelnen
chemisch-markierten
Reagenzien während
dem Verlauf von ein-Gefäß-Bibliotheksynthesereaktionen
getestet. Zum Beispiel werden Produkte, die von Baueinheiten entstehen,
die eine Khetongruppe tragen, mit kommerziell erhältlichem
Hydrazit-gebundendem Harz abgefangen und durch DNA-Sequenzierung analysiert,
um die Sequenzgenauigkeit während
der DNA-Matrizen-basierenden Synthese zu verifizieren. Auf ähnliche
Weise, wenn nicht biotinylierte Modellmatrizen verwendet werden,
werden Baueinheiten, die Biotingruppen tragen, nach der DNA-Matrizen-basierenden Synthese
unter Verwendung von Streptavidin-magnetischen Kügelchen gereinigt und einer
DNA-Sequenzierung unterzogen (Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 2001,
123, 6961–6963).
Kodons, die eine größere Neigung
zeigen, mit nichtübereinstimmender
DNA zu annalen, werden durch Screenen auf diese Weise identifiziert
und von dem genetischen Code dieser synthetischen Bibliotheken entfernt.
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Beispiel 7: In Vitro Selektion
von Proteinliganden von entwickelbaren synthetischen Bibliotheken:
-
Da
jedes in diesem Ansatz erzeugte Bibliothekenmitglied kovalent an
ein DNA-Oligonukleotid
gebunden ist, das seine Synthese kodiert und lenkt, können Bibliotheken
wahren in vitro Selektionen unterzogen werden. Obwohl direkte Selektionen
auf kleine Molekülkatalysatoren
von Bindungsbilungs- oder Bindungsspaltungsreaktionen eine aufregende
potenzielle Anwendung dieses Ansatzes sind, ist die einfachste in
vitro Selektion, die verwendet werden kann, um diese Bibliotheken
zu entwickeln, eine Selektion auf Bindung an ein Zielprotein. Ein
ideales anfängliches
Zielprotein für
die synthetische Bibliothek-Selektion spielt sowohl eine wichtige
biologische Rolle als auch besitzt bekannte Liganden mit unterschiedlichen
Affinitäten
für das
Validieren der Selektionsverfahren.
-
Ein
Rezeptor von speziellen Interesse für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung ist der αvβ3 Rezeptor. Der αvβ3 Rezeptor
ist ein Mitglied der Integrin-Familie von Transmembranheterodimeren-Glycoproteinrezeptoren
(Miller et al. Drug Discov Today 2000, 5, 397–408; Berman et al. Membr.
Cell Biol. 2000, 13, 207–44).
Der αvβ3 Integrinrezeptor wird auf der Oberfläche von
vielen Zellarten, wie Osteoklasten, vaskuläre glatte Muskelzellen, Endothelzellen,
und einigen Tumorzellen exprimiert. Dieser Rezeptor vermittelt mehrere wichtige
biologische Prozesse, einschließlich
der Adhäsion
von Osteoklasten an die Knochenmatrix (van der Pluijm et al. J.
Bone Miner. Res. 1994, 9, 1021–8),
glatte Muskelzellenmigration (Choi et al. J. Vasc. Surg. 1994, 19,
125–34)
und die Tumor-induzierte Angiogenese (Brooks et al. Cell 1994, 79,
1157–64)
(der Auswuchs von neuen Blutgefäßen). Während der
Tumor-induzierten Angiogenese binden invasive Endothelzellen an
die extrazellulären
Matrixkomponenten durch ihre αvβ3 Integrinrezeptoren. Mehrere Studien (Brooks
et al. Cell 1994, 79, 1157–64;
Broks et al. Cell 1998, 92, 391–400;
Friedlander et al. Science 1995, 270, 1500–2; Varner et al. Cell Adhes
Commun 1995, 3, 367–74;
Brooks et al. J. Clin Invest 1995, 96, 1815–22) haben demonstriert, dass die
Inhibierung dieses Integrin-Bindungsvorgangs
mit Antikörpern
oder kleinen synthetischen Peptiden die Apoptose der proliferativen
angiogenen vaskulären
Zellen induziert und die Tumor-Metastasen inhibieren kann.
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Eine
Anzahl von Peptid-Liganden mit unterschiedlichen Affinitäten und
Selektivitäten
führt den αvβ3 Integrinrezpetor
wurden berichtet. zwei Referenzen αvβ3 Integrinantagonisten
sind das lineare Peptid GRGDSPK (IC50 =
210 nM (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033–40; Pfaff
et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233–8) und das zyklische Peptid
Cyclo-RGDfV (Pfaff et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233–8) (f =
(D)-Phe, IC50 = 10 nM). Während Peptidantagonisten
für Integrine
häufig
RGD enthalten, sind nicht alle RGD-enthaltenen Peptide Hochaffinität-Integrinliganden.
Der konformative Zusammenhang von RGD und anderen Peptidsequenzen
kann vielmehr eine profunde Wirkung auf die Integrinaffinität und Spezifität haben
(Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328–1335; Geyer
et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 7735–7743; Rai et al. Bioorg. Med
Chem. Lett 2001,11, 1797–800;
Rai et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101–19). Aus diesem Grund sind
kombinatorische Ansätze
in Richtung der αvβ3 Integrin-Rezeptorantagonistenwicklung besonders
vielversprechend.
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Die
biologische Wichtigkeit und medizinisch relevante Rolle des αvβ3 Integrinrezeptors
zusammen mit seinen bekannten Peptidantagonisten und seiner kommerziellen
Verfügbarkeit
(Chemicon International, Inc., Temecula, CA) machen den αvβ3 Integrinrezeptor
zu einem idealen Anfangziel für
die DNA-Matrizen-basierende synthetische kleinen Molekül-Bibliotheken. Der αvβ3 Integrinrezeptor
kann durch Absorption an Mikrotiterplatten-Kammern ohne Beeinträchtigung
seiner Ligandenbindungsfähigkeit
oder Spezififät
immobilisiert werden (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999,
42, 3033–40
M; Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328–1335; Haubner
et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7461–7472). Alternativ kann der
Rezeptor durch Konjugation mit NHS-Ester oder Maleimid-Gruppen,
die kovalent an die Sepharosekügelchen
gebunden sind, immobilisiert werden und die Fähigkeit des resultierenden
Integrin-Affinitätsharzes,
die bekannten Ligandbindungseigenschaften aufrechtzuerhalten, kann
verifiziert werden.
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Um
die tatsächlichen
Proteinbindungsselektionen auszuführen, werden DNA-Matrizengebundene synthetische
Peptide oder makrozyklische Bibliotheken in wässrigem Bindungpuffer in einem
Gefäß aufgelöst und in
der Gegenwart von immobilisierten αvβ3 Integrinrezeptor äquilibriert.
Nicht-Binder werden mit Puffer weggewaschen. Jene Moleküle, die
eher durch ihre angeheftete DNA-Matrizen als durch ihre synthetischen Anteile
binden können,
werden durch Waschen der gebundenen Bibliothek mit nicht funktionalisierten DNA-Matrizen, denen PCR-Primer-Bindungsstellen
fehlen, eliminiert. Die restlichen Liganden, die an den immobilisierten αvβ3 Integrinrezeptor
gebunden sind, werden durch Denaturieren oder durch die Addition
eines Überschusses
an, hochaffinitäts-RGD-enthaltendem
Peptidligand eluiert. Die DNA-Matrizen, die die Synthese von αvβ3 Integrinbindern
kodieren und lenken, werden durch PCR unter Verwendung von einem
Primer, der so konstruiert ist, um an eine konstante 3' Region der Matrize
zu binden, und einem Pool von biotinylierten Primern, die an ihrem
5' Ende mit den
Biblithek-Ausgangsmaterialien funktionalisiert sind, amplifiziert
(44). Die Reinigung des biotinylierten Strangs
vervollständigt
einen Zyklus von synthetischen Molekültranslation, Selektion, und
Amplifikation, was eine Unterpopulation von DNA-Matrizen ergibt,
welche in der Sequenz, die die synthetischen αvβ3 Integrinliganden
kodieren, angereichert ist. Aus ähnlichen
Gründen,
wie jene, die den αvβ3 Integrinrezeptor zu einem attraktiven Anfangsziel
für den
Ansatz, um synthetische Moleküle
mit gewünschten
Eigenschaften zu erzeugen, machen, dient die Faktor Xa Serinprotease
ebenfalls als ein vielversprechendes Proteinziel. Die Blutkoagulation
beinhaltet eine komplexe Kaskade von Enzym-katalysierten Reaktionen,
die schlussendlich Fibrin erzeugen, die Grundlage der Blutgerinnsel
(Rai et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101–109; Vacca et al. Curr. Opin.
Chem Biol 2000, 4, 394–400).
Trombin ist die Serinprotease, die Fibrinogen in Fibrin während der
Blutgerinnung umwandelt. Trombin wiederum wird durch die proteolytische Wirkung
von Faktor Xa auf Prothrombin erzeugt. Da thromboembolitische (Blutgerinnung)
Krankheiten, wie Schlag eine führende
Todesursache in der Welt bleibt (Vacca et al. Curr. Opin. Chem.
Biol. 2000, 4, 394–400) ist
die Entwicklung von Arzneimitteln, die Thrombin oder Faktor Xa inhibieren,
ein Hauptgebiet der pharmazeutischen Forschung. Die Inhibierung
von Faktor Xa ist ein neuerer Ansatz, von dem angenommen wird, die
mit der Inhibierung von Thrombin assozierten Nebenwirkungen zu umgehen,
welches ebenfalls in der normalen Hämostase eingebunden ist (Maignan
et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 3226–32; Leadley et al. J. Cardiovasc. Pharmacol.
1999, 34, 791–9;
Becker et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2753–8; Choi-Sledski
et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2539–44; Choi-Sledeski et al. J.
Med. Chem. 1999, 42, 3572–87;
Ewing et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3557–71; Bostwick et al. Thromb
Haemost 1999, 81, 157–60).
Obwohl viele Wirkstoffe, einschließlich Heparin, Hirudin und
Hirulog entwickelt wurden, um die Produktion von Thrombin zu steuern, haben
diese Wirkstoffe im Allgemeinen den Nachteil, dass sie zusätzlich zu
den möglichen
Nebenwirkungen mehrmals täglich
eine intravenöse
oder subkontane Injektion benötigen
und die Suche nach synthetischen kleinen Molekül-Faktor Xa Inhibitoren bleibt
der Gegenstand von großen
Forschungsbemühungen.
-
Unter
den Faktor Xa Inhibitoren mittels bekannten Bindungsaffinitäten sind
eine Reihe von Tripeptiden, die mit Argininaldehyd enden (Marlowe
et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 13–16), die leicht in die DNA-Matrizen-basierende
nicht-natürliche
Peptidbibliothek, die oben beschrieben ist, inkludiert werden können. In
Abhängigkeit
von den Identitäten
die ersten zwei Reste, zeigen die Tripeptide IC50 Werte
im Berich von 15 nM bis 60 μM
(Marlowe et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 13–16) und
bieten deshalb eine ideale positive Kontrolle zum Validieren und
Kalibrieren einer in vitro Selektion auf synthetische Faktor Xa
Liganden (siehe unten). Sowohl Faktor Xa als auch aktiver Faktor
Xa, die auf einem Harz immoblisiert sind, sind kommerziell erhältlich (Protein
Engineering Technologies, Dänemark).
Der Harz-gebundene
Faktor Xa wird verwendet, um Mitglieder von sowohl der DNA-Matrizen
basierenden nicht-natürlichen
Peptid-Bibliothek als auch der bizyklischen Bibliothek mit Faktor
Xa Affinität
auf eine Art und Weise auszuwählen,
die zu der Integrinrezeptorbindungsselektionen, die oben beschrieben
ist, analog ist.
-
Im
Anschluss an die PCR Amplifikation von DNA-Matrizen, die die ausgewählten synthetischen
Moleküle
kodieren, werden zusätzliche
Runden an Translation, Selektion und Amplifikation durchgeführt, um
die höchsten
Affinitätsbinder
in der Bibliothek anzureichern. Die Stringenz der Selektion wird
schrittweise erhöht, indem
die Salzkonzentration der Bindungs- und Waschungspuffer erhöht wird,
die Dauer der Bindung verkürzt wird,
die Bindungs- und Waschungstemperaturen erhöht werden, und die Konzentration
der Waschadditive, wie Matrizen-DNA oder nicht-verwandte Protein
erhöht
wird. Wesentlich ist, dass die in vitro Selektionen ebenfalls auf
Spezifität
zusätzlich
zur Bindungsaffinität
selektieren können.
Um jene Moleküle
zu eliminieren, die ungewünschte
Bindungseingeschaften besitzen, werden Bibliotheksmitglieder, die
an immobilisiertes αvβ3 Integrin oder Faktor Xa gebunden sind,
mit Nicht-Zielproteinen, wie andere Integrine oder andere Serinproteasen,
gewaschen, was nur jene Moleküle
hinterlässt,
die an das Zielprotein binden, nicht jedoch an Nicht-Zielproteine
binden.
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Sich
wiederholende Zyklen von Translation, Selektion und Amplifikation
führt eher
zu der Bibliotheksanreicherung als zu der Bibliotheksrevolution,
welche eine Diversifizierung zwischen den Selektionsrunden erfordert.
Die Diversifizierung dieser synthetischen Bibliotheken werden auf
zumindest zwei Arten erreicht, beide sind analog zu den Verfahren,
die von der Natur verwendet werden, um Proteine zu diversifizieren.
Die Zufallspunktmutangenese wird durch Ausführen des PCR-Amplifikationsschrittes
unter error-prone PCR Bedingungen durchgeführt (Caldwell et al. PCR Methods
Applic. 1992, 2, 28–33).
Da der genetische Code dieser Moleküle geschrieben wird, um verwandte
Kodons verwandten chemischen Gruppen zuzuordnen, ähnlich zu
dem Weg, wie der natürliche
Proteingenetische Code konstruiert wird, wird die Zufallspunktmutationen
in den Matrizen, die die ausgewählten
Moleküle
kodieren, die Nachkommenschaft in Richtung chemisch-verwandter Analoga
diversifizieren. Zusätzlich
zu der Punktmutagenese, werden synthetische Bibliotheken, die in
diesem Ansatz erzeugt wurden, ebenfalls unter Verwendung der Rekombination
diversifiziert. Die zu rekombinierenden Matrizen haben die in 45 gezeigte Struktur, in welcher die Kodons durch
fünf-Basen
nicht- palindromische
Restriktionendonuklease-Spaltungsstellen getrennt sind, wie jene,
die durch AvaII (G/GWCC, W=A oder T), Sau96I (G/GNCC, N=A, G, T,
oder C), DdeI (G/TNAG), oder HinFI (G/ANTC) gespalten werden. Im
Anschluss an die Selektionen werden die Matrizen, die die gewünschten
Moleküle
kodieren, enzymatisch mit diesen kommerziell erhältlichen Restriktionsenzymen
verdaut. Die verdauten Fragmente werden dann in intakte Matrizen
mit T4 DNA-Ligase rekombiniert. Da die Restriktionsstellen, die
die Kodons voneinander trennen, nicht palindrom sind, können sich
die Matrizenfragmente nur so wieder zusammenlagern, um intakte rekombinierte
Matrizen zu bilden (45). Die DNA-Matrizen-basierende
Translation von rekombinierten Matrizen liefert rekombinierte kleine
Moleküle.
Auf diese Art werden funktionelle Gruppen zwischen synthetischen
kleinen Molekülen
mit gewünschten
Aktivitäten
auf eine Art und Weise rekombiniert, die zu der Rekombination von Aminosäureresten
zwischen Proteinen in der Natur analog ist. Es ist erkennbar, dass
die Rekombination den Sequenzraum eines Moleküls effizienter erkundet, als
die Punktmutagenese allein (Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol.
1999, 3, 284–90;
Bogarad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2591–5; Stemmer,
W. Nature 1994, 370, 389–391).
-
Die
kleine Molekülevolution
unter Verwendung von Mutation und Rekombination bietet zwei potenzielle
Vorteile im Vergleich zu der einfachen Anreicherung. Wenn die Gesamtdiversität der Bibliothek
viel kleiner ist als die Anzahl der gemachten Moleküle (üblicherweise
1012 bis 1015),
ist jedes mögliche
Bibliotheksmitglied zu Beginn der Selektion vorhanden. In diesem
Fall ist die Diversifikation nach wie vor nützlich, da sich die Selektionsbedingungen
im Laufe des Evolutionsfortschrittes beinahe immer ändern. Zum
Beispiel werden spätere
Selektionsrunden eher unter hohen Stringenzen ausgeführt, und
kann die Gegenselektionen gegen das Binden von Nicht-Zielproteinen
beinhalten. Die Diversifikation ergibt Bibliotheksmitglieder, die
während
früherer Selektionsrunden
verworfen wurden, die Chance in späteren Runden unter veränderten
Selektionsbedingungen erneut zu erscheinen, in welchen ihre Fitness
in Bezug auf andere Mitglieder größer sein kann. Zusätzlich ist
es gut möglich
unter Verwendung dieses Ansatzes, um eine synthetische Bibliothek
zu erzeugen, die eine theoretische Diversität von mehr als 1015 Molekülen hat.
In diesem Fall ermöglicht
die Diversifikation Molekülen,
die niemals in der ursprünglichen
Bibliothek existierten, in weiteren Selektionsrunden, auf der Basis
ihrer Ähnlichkeit
zu ausgewählten
Molekülen
hervorzutreten, ähnlich
der Art, auf welche die Proteinevolution, die Weite des Proteinsequenzraumes
einer kleinen Teilmenge jeweils durchsucht.
-
Beispiel 8: Charakterisierung
von entwickelten Verbindungen:
-
Im
Anschluss an mehrere Runden an Selektion, Amplifikation, Diversifikation
und Translation werden die Moleküle,
die die Selektion überleben,
auf ihre Fähigkeit,
das Zielprotein zu binden, charakterisiert. Um die DNA-Sequenzen
zu identifizieren, die die entwickelten synthetischen Moleküle, die
die Selektion überleben, kodieren,
werden PCR-amplifizierte Matrizen in Vektoren kloniert, in Zellen
transformiert und als individuelle Klone sequenziert. Die DNA-Sequenzierung
dieser subklonierten Matrizen offenbarten die Identität der synthetischen
Moleküle,
die die Selektion überlebten.
Um allgemeine Information über
die funktionellen Gruppen, die während
den Evolutionsrunden selektiert werden, zu erhalten, wurden Populationen
an Matrizen in Pools sequenziert, um die Verteilung von A, G, T
und C an jeder Kodonposition zu offenbaren. Das vernünftige Design des
genetischen Codes von jeder funktionellen Gruppe ermöglicht die
Sammlung von beachtlichen Informationen von der Populationsequenzierung.
Zum Beispiel kann ein G an der ersten Position eines Kodons eine geladene
Gruppe bezeichnen, während
ein C an dieser Position einen hydrophoben Substituenten kodieren kann.
-
Um
die Integrin-Bindungsselektion zu validieren und um die selektierten
Bibliotheksmitglieder mit bekannten αvβ3 Integrinliganden
zu vergleichen, werden lineare GRGDSPK und ein zyklisches RGDfV
Analogon (zyklisches Iso-ERGDfV) ebenfalls in die DNA-Matrizen-basierende
zyklische Peptid-Bibliothek eingebunden. Die Selektionsbedingungen
werden bis zur Verifizierung angepasst, sodass Bibliotheken, die
diese bekannten Integrinliganden enthalten, eine Anreicherung der
DNA-Matrizen, die die bekannten Liganden kodieren, bei der Selektion
auf die Integrinbindung durchmachen. Zusätzlich wird der Anreicherungsgrad
der Matrizensequenzen, die diese bekannten αvβ3 Integrinliganden
kodieren, mit ihren bekannten Affinitäten und mit der Anreicherung
und Affinität
von neu entdeckten αvβ3 Integrinliganden korreliert.
-
Sobald
die Anreicherung von Matrizensequenzen, die die bekannten und neuen
Integrinliganden kodieren, bestätigt
ist, werden neuartig-entwickelte Liganden durch Nicht-DNA-Matrizen-basierende
Synthese synthetisiert und auf ihre αvβ3 Integrin-Rezeptorantagonist-Aktivität und Spezifität untersucht.
Standard in vitro Bindungsuntersuchungen zu Integrinrezeptoren (Dechantsreiter
et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033–40) werden durch Konkurrieren
der Bindung von biotinyliertem Fibrinogen (einem natürlichen
Integrin-Liganden) an immobilisierten Integrinrezeptor mit dem zu
untersuchenden Ligand durchgeführt.
Die Inhibierung der Bindung an Fibrinogen wird durch Inkubieren
mit einem alkalischen Phosphatase-konjugiertem Antibiotin-Antikörper und
einem chromogenen alkalischen Phosphatase-Substrat quantifiziert.
Der Vergleich der Bindungsaffinitäten von zufällig ausgewählten Bibliotheksmitgliedern,
vor und nach der Selektion, wird die Evolution der Bibliothek in
Richtung der Zielbindung validieren. Untersuchungen für die Bindung
von Nicht-Zielproteinen
offenbart die Fähigkeit
von diesen Bibliotheken, in Richtung der Bindungsspezifität zusätzlich zu
der Bindungsaffinität
entwickelt zu werden.
-
Ähnlicherweise
wird die Selektion der Faktor Xa-Bindung durch das Einschließen der
bekannten Faktor Xa Tripeptid-Inhibitoren in das Bibliotheksdesign
validiert und verifiziert, dass eine Runde von Xa Bindungselektion
und PCR Amplifikation in der Anreicherung ihrer assoziierten DNA-Matrizen
resultiert. Synthetische Bibliotheksmitglieder, die entwickelt wurden,
um an Faktor Xa zu binden, wurden in vitro auf ihre Fähigkeit,
die Faktor Xa Aktivität
zu inhibieren, untersucht. Die Faktor Xa Inhibierung kann leicht
unter Verwendung des kommerziell erhältlichen chromogenen Substrat
S-2765 (Chromogenix, Italien) spektrophotometrisch untersucht werden.
-
Während die
DNA-Sequenz allein eines nicht-natürlichen Peptid-Bibliotheksmitglieds
wahrscheinlich ist, die exakte Identität des entsprechenden Peptids
eher zu offenbaren, ist der Endschritt in der bizyklischen Bibliothekssynthese
eine nicht-DNA-Matrizen-basierende intramolekulare 1,3-dipolare
Cycloaddition, die diastereomere Paare von Regioisomeren ergeben
kann. Obwohl die Modellierung stark darauf hinweist, dass sich nur
das in 38 gezeigte Regioisomer aus
sterischen Gründen
ausbilden kann, ist fakiale Selektivität weniger bestimmt. Die dastereomere
Reinheit ist keine Anforderung für
die in vitro Selektionen, die oben beschrieben sind, da jedes Molekül aus einer
Einzelmolekülbasis
ausgewählt
wird. Nichtsdestotrotz kann es nützlich sein,
die Diastereoselektivität
der dipolaren Cycloaddition zu charakterisieren. Um dies zu erreichen,
wird die nicht-DNA-Matrizen-basierende Synthese von ausgewählten bizyklischen
Bibiliotheksmitglieder durchgeführt, Diastereomere
werden durch chirale präparative
HPLC getrennt und die Produktstereochemie wird durch nOe- oder Röntgenbeugung
bestimmt.
-
Beispiel 9: Tanslatieren
von DNA in nicht-natüliche
Polymere unter Verwendung von DNA-Polymerasen:
-
Ein
alternativer Ansatz zum Translatieren von DNA in nicht-natürliche,
entwickelbare Polymere nutzt die Fähigkeit von einigen DNA-Polymerasen
aus, bestimmte modifizierte Nukleotidtriphophat-Substrate zu aktzeptieren
(D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556; D. M. Perrin
et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377–91; T. Gourlain et al. Nucleic
Acids Res. 2001, 29, 1898–1905;
S. E. Lee et al. Nucleic Acids REs. 2001, 29, 156–73; K.
Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2872–2875).
Es ist von einigen Deoxyribonukleotiden (45)
und Ribonukleotide, die Modifikationen an Gruppen tragen, die nicht
in Watson-Crick Wasserstoffbindungen teilnehmen, bekannt, mit hoher Sequenzgenauigkeit
gegenüber
natürlichen DNA-Matrizen
eingefügt
zu werden. Es ist wesentlich, dass modifizierte Nukleotide enthaltende
einzelsträngige
DNA als wirksame Matrizen für
den DNA-Polymerase katalysierten Einbau von natürlichen oder modifizierten
Mononukleotiden dienen kann. In einem der frühesten Beispiele des modifizierten
Nukleotideinbaus durch DNA-Polymerase berichteten Toole und Mitarbeiter
die Akzeptanz von 5-(1-Pentynyl)-Deoxyuridin 1 durch Vent DNA Polymerase
unter PCR-Bedingungen (J. A. Latham et al. Nucleic Acid Res. 1994,
22, 2817–22). Mehrere
zusätzliche
5-funktionalisierte Deoxyuridin (2–7) Derivate wurden nachfolgend
gefunden, durch thermostabile DNA-Polymerase, die für die PCR geeignet sind, akzeptiert
zu werden (K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37,
2872–2875).
Das erste funktionalisierte Purin, welches durch DNA-Polymerase akzeptiert
wurde, Deoxyadenosin-Analogon 8, wurde in DNA durch die T7 DNA-Polymerase zusammen
mit Deoxyuridin-Analogon 7 eingebaut (D. M. Perrin et al. Nucleosides
Nucleotides 1999, 18, 377–91).
DNA-Bibliotheken, die sowohl 7 als auch 8 enthalten, wurden erfolgreich
für die
Metall-unabhängige
RNA-Spaltungsaktivität
ausgewählt
(D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556–63). Williams
und Mitarbeiter untersuchten kürzlich
mehrere Deoxyuridin-Derivate auf die Akzeptanz durch Taq-DNA Polymerasen
und schlussfolgerten, dass die Akzeptanz am größten ist, wenn C5-modifizierte
Uridine, die starre Alkyn oder Trans-Alkengruppen, wie 9 und 10, tragen,
verwendet werden (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29,
1565–73).
Eine ähnliche
Studie (T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898–1905) an
C7-funktionalisierten 7-Deaza-Deoxyadenosinen offenbarte die Akzeptanz
durch Taq-DNA-Polymerase
von 7-Aminopropyl-(11), cis-7-Aminopropenyl-(12), und 7-Aminopropynyl-7-deazadeoxyadenosin
(13).
-
Die
durch DNA-Polymerasen eingebaute funktionalisierte Nukleotide, in 46 gezeigt, haben sich auf das Hinzufügen von „proteinähnlicher" saurer und basischer
Funktionalität
zur DNA konzentriert. Während des
Ausstattens von Nukleinsäuren
mit allgemeiner saurer und allgemein basischer Funktionalität, wie primären Amin-
und Carobxylatgruppen, die Fähigkeit
von Nukleinsäurekatalysatoren
erhöhen
kann, haben funktionelle Gruppen, die in natürlichen Nukleinsäurebasen
vorhanden sind, bereits die Fähigkeit
demonstriert, als allgemeine Säuren
und Basen zu dienen.
-
Von
dem Hepatitis-Delta-Ribozym, zum Beispiel, wird angenommen, dass
es das pKa-modulierte endozyklische Amin von Cytosin
75 als eine allgemeine Säure
zu verwendet (S. Nakano et al. Science 2000, 287, 1493–7) und
die Peptidyltransferase-Aktivität
des Ribosoms kann ähnlicherweise
auf einer allgemeinen Basen- oder allgemeinen Säurekatalyse beruhen (G. W:
Muth et. al. Science 2000, 289, 947–50; P. Nissen et al. Science
2000, 289, 920–930;
N. Ban et al. Science 2000, 289, 905–920), obwohl der spätere Fall
der Gegenstand einer aktuellen Debatte bleibt (N. Polacek et al.
Nature 2001, 411, 498–501).
Das Ausstatten von DNA-Basen mit zusätzlichen Brønsted sauren und basischen
Gruppen, kann deshalb den Umfang der DNA-Katalyse nicht tiefgreifend erweitern.
-
Im
Gegensatz zu der einfachen allgemeinen Säure- und allgemeinen Basenfunktionalität, würden chirale
Metallzentren den chemischen Umfang von Nukleinsäuren beachtlich erweitern.
Funktionalität,
die auf das Binden chemisch-potenter Metallzentren abziehlt, müssen noch
in Nukleinsäure-Polymere
eingebaut werden. Natürliche
DNA hat die Fähigkeit
demonstriert, in komplexe dreidimensionalen Strukturen zu falten,
die in der Lage sind, stereospezifisch Zielmoleküle zu binden (C. H. Lin et
al. Chem. Biol. 1997, 4, 817–32;
C. H. Lin et al. Chem. Biol. 1998, 5, 555–72; P. Schultze et al. J.
Mol. Biol. 1994, 235, 1532–47)
oder Phosphodiesterbindungs-Manipulationen zu katalysieren (S. W.
Santoro et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4262–6; R. R.
Breaker et al. Chem. Biol. 1995, 2, 655–60; Y. Li et al. Biochemistry
2000, 39, 3106–14;
Y. Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2746–51). Die
DNA-Depurinierung (T. L. Sheppard et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 2000, 97, 7802–7807)
und Porphyrinmetallation (Y. Li et al. Biochemistry 1997, 36, 5589–99; Y.
Li et al. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743–7). Mit der Fähigkeit
an chemisch-wirksame, wasserkompatible Metalle, wie Cu, La, Ni,
Pd, Rh, Ru, oder Sc zu binden, vermehrte nicht-natürliche Nukleinsäuren können stark
ausgedehnte katalytische Eigenschaften besitzen. Zum Beispiel kann
ein Pd-bindendes Oligonukleotid, welches in eine gut definierte
Struktur faltet, die Fähigkeit
besitzen, die Pd-vermittelte
Kopplungsreaktionen mit einem hohen Ausmaß an Regiospezifität oder Stereospezifität zu katalysieren. Ähnlicherweise
können
nicht-natürliche
Nukleinsäuren,
die chirale Sc-Bindungsstellen bilden, als enantioselektive Zykloadditions-
oder Aldol-Additionskatalysatoren
dienen. Die Fähigkeit
von DNA-Polymerasen, DNA Sequenzen in diese nicht-natürliche Polymere,
die mit in vitro Selektionen auf katalytische Aktivitäten gekoppelt
sind, zu translatieren, würden
deshalb die direkte Evolution von gewünschten Katalysatoren aus zufälligen Bibliotheken
ermöglichen.
-
Entstehende
Katalysatoren in diesem Ansatz widmen sich der Schwierigkeit des
rationellen Konstruierens von katalytischen aktiven Stellen mit
spezifischen chemischen Eigenschaften, die durch kürzliche
kombinatorische Ansätze
(K. W. Kuntz et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 313–319; M.
B. Francis et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 422–8) zu organometallischen
Katalysatorentdeckung angeregt wurden. Zum Beispiel identifizierten
Hoveyda und Mitarbeiter die auf Tibasierenden enatioselektiven Epoxidationskatalysatoren durch
serielles Screenen von Peptidliganden (K. D. Shimizu et al. Angew.
Chem. Int. Ed. 1997, 36) Serielles Screening wurde ebenfalls durch
Jacobsen und Mitarbeiter verwendet, um Peptidliganden zu identifizieren, die,
wenn mit Metallkationen komplexiert, enantioselektive Epoxidationskatalysatoren
binden, (M. B. Francis et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999,
38, 973–941).
Kürzlich
wurde eine Peptidbibliothek, die Phosphin-Seitenketten enthält, auf
die Fähigkeit
gescreent, Malonatesteraddition an Cyclopentenylacetat in der Gegenwart von
Pd zu katalysieren (S. R. Gilbertson et al. J. Am. Chem. Soc. 2000,
122, 6522–6523).
Der derzeitige Ansatz unterscheidet sich jedoch wesentlich von früheren kombinatorischen
Katalysatorentdeckungsbemühungen
darin, dass er Katalysatoren mit gewünschten Eigenschaften ermöglicht,
spontan aus einem Gefäß, Lösungsphasenbibliotheken
nach entwicklungsmäßigen Zyklen
von Diversifikation, Amplifikation, Translation und Selektion herauszubilden.
Diese Strategie ermöglicht,
dass bis zu 1015 unterschiedliche Katalysatoren
entwickelt und auf gewünschte
Eigenschaften in einem einzelnen Experiment selektiert werden. Die
Kompatibilität unseres
Ansatzes mit in vitro Selektionen in einem Gefäß ermöglich die direkte Selektion
für die
Reaktionskatalyse, anstelle des Screenens auf ein Phänomen welches
mit der Katalyse assoziiert ist, wie Metallbindung oder Wärmeerzeugung.
Zusätzlich
können
Eigenschaften, die schwierig sind schnell zu screenen, wie Substratstereospezifität oder Metallselektivität, unter
Verwendung unseres Ansatzes direkt selektiert werden (siehe unten).
-
Schlüsselintermediate
für eine
Vielzahl von C5-funktionalisierten Uridinanaloga und C7-funktionalisierten
7-Deazaadenosin-Analoga wurde für
den Einbau in nicht natürliche
DNA-Polymere synthetisiert.
Zusätzlich wurde
die Synthese von sechs C8-funktionalisierten Adenosin-Analoga, die
Deoxyribonukleotid Triphosphaten, vollendet. Da nur eine beschränkte Information über die
Fähigkeit
von DNA-Polymerasen, modifizierte Nukleotide zu akzeptieren, existiert,
wählen
wir Analoga zu synthetisieren, die nicht nur Metallbindungsfunktionalität zu Nukleinsäure bringen,
sondern auch Einblicke in die Determinanten der DNA-Polymerasen-Akzeptanz bereitstellen
werden.
-
Die
Strategie für
die Synthese von Metall-bindendem Uridin und 7-Deazaadenosin-Analoga ist in 47 gezeigt. Beide Wege enden mit der Amidbindung
zwischen NHS-Ester von Metall-bindenden funktionellen Gruppen und
Amino-modifizierten Deoxyribonukleotid Triphosphaten (7 und 13).
Von Analoga 7 und 13 sowie die acetylierten Derivate von 7 wurden
früher
gezeigt (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556–63; D.
M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377–91; J.
A. Latham et al. Nucleic Acid Res. 1994, 22, 2817–22; T.
Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898–1905; S.
E. Lee et al. Nucleic Acid Res. 2001, 29 1565–73; K. Sakthivel et al. Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872–2875) dass sie durch DNA-Polymerasen
toleriert zu werden, einschließlich
thermostabile DNA- Polymerasen,
die für
die PCR geeignet sind. Dieser konvergente Ansatz ermöglicht einer
großen
Auswahl von Metall-bindenden Liganden schnell in jedes Nukleotid-Analogon
eingebaut zu werden. Die Synthese von 7 wurde durch Folgen eines
zuvor berichteten (K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
1998, 37, 2872–2875)
Weges (48, Phillips, Chorba, Liu,
nicht veröffentlichte
Ergebnisse) vollendet. Die Heckkopplung von kommerziell erhältlichem 5-Iod-2'-Deoxyuridin (22) mit N-Allyltrifluoroacetamid
ergab 23. Die 5'-Triphosphatgruppe
wurde durch Behandlung von 23 mit Trimethylphosphat, POCl3, und Protonschwamm (1,8-bis(dimethylamion)-Naphthalen), gefolgt
durch Tri-n-Butylammonium-Pyrophosphat, installiert, und die Trifluoroacetamidgruppe
wurde dann mit wässrigem
Ammoniak entfernt um 7 zu ergeben.
-
Mehrere
Schritte in Richtung der Synthese von 13 wurden vollendet, das Schlüsselzwischenprodukt für 7-Deazaadenosinanaloga
(49). Einer bekannten Route folgend (J. Davoll.
J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 131–138)
wurde Diethoxyethylcyanoacetat (24) aus Bromacetal 25 und Ethylcyanoacetat
(26) synthetisiert. Die Konzentration von 24 mit Thioharnstoff ergab
Pyrimidin 27, welches mit Raney-Nickel desulfuriert wurde und dann
mit verdünnter
wässriger
HCl zu Pyrrolpyrimidin 28 zyklisiert wurde. Die Behandlung von 28
mit POCl3 ergab 4-Chlor-7-Deazaadenin (29).
Die Acryljodidgruppe, welche als ein Sonogashirea-Kupplungspartner
für die
Installation des propargylischen Amins in 13 dient, wurde durch
Reagieren von 29 mit N-Iodsuccinimid installiert, um 4-Chlor-7-Iod-7-Deazaadenin
(30) mit einer Gesamtausbeute von 13 % aus Bromacetal zu erzeugen.
-
Als
Alternative funktionalisierte Adeninanaloga, die sowohl die strukturellen
Anforderungen der DNA-Polymeraseakzeptanz untersuchen als auch potentielle
Metallbildungsfunktionalität
bereitstellen werden, wurden sechs 8-modifizierte Deoxyadenosintriphosphate
(50) synthetisiert. Alle funktionellen Gruppen wurden
durch Addition an 8-Brom-Deoxyadenosin (31) installiert, welches
durch Brominierung von Desoxyadenosin in der Gegenwart von ScCl3 hergestellt wurde, von welchen wir herausgefunden
haben, dass es die Produktausbeute stark erhöht. Methyl-(32), Ethyl-(33),
und Vinyladenosin (34) wurden durch Pd-vermittelte Stillekopplung
des entsprechenden Alkyl-Zinnreagenzes
und 31 synthetisiert (P. Mamos et al. Tetrahedron Lett. 1992, 33,
2413–2416).
Methylamino-(35) (E. Nandanan et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 1625–1638),
Ethylamio-(36), und Histaminoadenosin (37) wurden durch Behandlung
von 23 mit dem entsprechenden Amin in Wasser oder Ethanol hergestellt.
Die 5'-Nukleotid-Triphosphate
von 32–37
wurden wie oben beschrieben synthetisiert.
-
Die
Fähigkeit
von thermostabilen DNA-Polymersasen, die für die PCR-Amplifikation geeignet
sind, diese modifizierten, Metall-Bindungsfunktionalität Nukleotid-Triphosphate
enthaltenden, zu akzeptieren. Nicht natürliche Nukleotid-Triphosphate
wurde durch Ionenaustausch HPLC gereinigt und zu PCR-Reaktionen,
die Taq-DNA-Polymerase, drei natürliche
Deoxynukleotid-Triphosphate, pUC19 Matrizen-DNA und zwei DNA-Primer
enthalten, hinzugefügt.
Die Primer wurden so ausgewählt,
um PCR-Produkte zu erzeugen, die in Länge von 50 bis 200 Basenpaaren
reichen. Kontroll-PCR-Reaktionen enthielten die vier natürlichen
Deoxynukleotid-Triphosphate und keine nicht natürlichen Nukleotide. Die PCR-Reaktionen wurden
durch Agarose oder durch denaturierende Acrylamid-Gelelektrophorese
analysiert. Amino-modifiziertes Uridinderivat 7 wurde durch Taq-DNA-Polymerase über 30 PCR-Zyklen
effektiv eingebaut, während
das Triphosphat von 23 kein effizientes Polymerasesubstrat war (51). Frühere
Ergebnisse über
die Akzeptanz von 7 durch Taq-DNA-Polymerase
sind als in Konflikt sowohl mit der nicht-Akzeptanz (K. Sakthivel
et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872–2875) als
auch mit der Akzeptanz (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001,
29, 1565–73)
berichtet.
-
Nicht
natürliche
Metallbindung Deoxyribonukleotid Triphosphatsynthese: Die Synthese
des C5-Funktionalisierten Uridin, des C7-funktionalisierten 7-Deazaadenosin,
und des C8-funktionalisiserten
Adenosin Deoxynukleotid Triphosphate wird vollendet sein. Die Synthese
der 7-Deazzaadenosinderivate von 4-Chlor-7-Iod-Deazaadenin (30)
verläuft
durch Glycosylierung von 30 mit geschütztem Deoxyribosylchlorid 38, gefolgt
durch die Ammonolyse, um 7-Iod-Adenosin (39) zu ergeben (31) (Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001,
29, 1898–1905).
Geschütztes
Deoxyribosylchlorid 38 kann aus Deoxyribose, wie in 52 gezeigt, erzeugt werden. Die Pd-vermittelte
Sonogashirakupplung (Seela et al. Helv. Chem. Acta 1999, 82, 1878–1898) von
39 mit N-Propynyltrifluoroacetamid ergibt 40, welches dann zu dem
5' Nukleotid-Triphosphat
umgewandelt wird und mit Ammoniak schutzeliminiert wird, wie oben
beschrieben um 13 zu ergeben.
-
Um
schnell eine Sammlung von Metallbindungs-Uridin und Adenosin-Analoga
zu erzeugen, wird eine Vielzahl von Metallbindenden Gruppen, wie
NHS-Ester an C5-modifiziertes Uridin-Zwischenprodukt 7 (bereits synthetisiert)
und C7-modifiziertes 7-Deazaadenosin-Zwischenprodukt 13 gekoppelt. Die Metall-bindungsgruppen,
die anfänglich
untersucht werden, sind in 47 gezeigt
und beinhalten Phosphine, Thiopyridylgruppen, und Hemi-Salenanteile.
Wenn unsere anfängliche
Polymeraseakzeptanz-Untersuchungen (siehe in folgenden Abschnitt)
von Triphosphaten von 8-modifizierten Adenosinen 32–37 (50) darauf hinweisen, dass eine Vielzahl von 8-modifizierten
Adenosinanalga durch thermostabile Polymerasen akzeptiert werden,
werden Alkyl- und Vinyl-Trifluoroacetamide an 8-Brom-Deoxyadenosin
(31) gekoppelt werden, um Nukleotid-Triphosphate zu erzeugen, wie
41 und 42 (53). Diese Zwischenprodukte
werden dann mit in 46 gezeigten NHS Estern gekoppelt,
um eine Vielzahl von Metallbindungs-8-funktionalisierten Deoxyadenosintriphosphaten
zu erzeugen.
-
Evaluieren
von nichtnatürlichen
Nukleotiden: Jedes funktionalisiertes Deoxyribonukleotidtriphosphat wird
dann auf seine Eignung als eine Baueinheit einer entstehenden nicht
natürlichen
Polymer-Bibliothek in zwei Stufen untersucht. Erstens wird die einfache
Akzeptanz durch thermostabile DNA-Polymerasen durch die PCR Amplifikation
von Fragmenten von DNA Plasmiden pUC19 mit verschiedener Länge gemessen.
PCR Reaktionen enthalten synthetische Primer, die bestens ausgebildet
sind, um an die Enden des Fragments, einer kleinen Menge an pUC19
Matrizen DNA, einer thermostabilen DNA Polymerase (Taq, Pfu oder
Vent), drei natürlichen
Deoxyribonnukleotid Triphosphate, und das zu testende nicht natürliche Nukleotid
Trisphospat zu binden. Der vollständige erfolgreiche Einbau des
nicht natürlichen
Nukleotids führt
zu der Erzeugung von DNA Produkten einer beliebigen Länge mit
einer Rate, die ähnlich
jener der Kontrollreaktion ist. Jene Nukleotide, die zumindest den
Einbau von 10 oder mehrer nicht natürlichen Nukleotiden in einem
einzigen Produktmolekül mit
zumindest mässiger
Wirksamkeit erlauben, werden einem zweiten Evaluierungsschritt unterzogen.
-
Durch
thermostabile DNA Polymerasen akzeptierte nicht natürliche Nukleotide
werden auf ihre mögliche
Mutagene Eigenschaften evaluiert. Wenn DNA Polymerasen ein nicht
natürliches
Nukleotid gegenüber
einer inkorrekten (nicht Watson-Crick) Matrizen Base einfügen, und
ein inkorrektes natürliches
Nukleotid gegenüber
einem nicht natürlichen
Nukleotid in der Matrize einfügen,
wird die Genauigkeit der Bibliotheks-Amplifikation und Translation
beeinträchtigt.
Um diese Möglichkeit
zu evaluieren, werden die in der obigen Untersuchung erzeugten PCR
Produkte einer DNA Sequenzierung unter Verwendung von jedem der
PCR Primer unterzogen. Abweichungen von der Sequenz der pUC19 Matrize
implizieren, dass eine oder beide der Mutagenen Mechanismen stattfinden.
Fehlerraten von weniger als 0,7 % pro Base pro 30 PCR Zyklen sind
akzeptabel, da error prone PCR, die Fehler mit ungefähr dieser
Rate erzeugt (Caldwell et al. PCT Methods Applic. 1992, 2, 28–33), dennoch
erfolgreich verwendet wurde, um Nukleinsäure Bibliotheken zu entwickeln.
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Paare
von viel versprechenden nicht natürlichen Adenosin Analoga und
nicht natürlichen
Uridin Analoga werden zusammen auf ihre Fähigkeit, die DNA-Polymerisation
in einer PCR Reaktion, die beide modifizierten Nukleotid Triphosphate
zusammen mit dGTP und dCTP enthält,
zu unterstützen,
getestet. Die erfolgreiche PCR Produktbildung mit zwei nicht natürlichen
Nukleotid Trisphosphaten ermöglicht
den Einbau von zwei nicht natürlichen
Metallbindenden Basen in dasselbe Polymermolekül. Funktionalisierte Nukleotide,
die von besonderem Interesse sind, aber dennoch mit Taq, Pfu oder
Vent thermostabilen DNA Polymerasen kompatibel sind, können nach
wie vor in den Bibliotheken verwendet werden, unter der Voraussetzung,
dass sie durch eine kommerziell erhältliche DNA Polymerase, wie
das Klenow Fragment von E. coli DNA Polymerase 1, T7 DNA Polymerase,
T4 DNA Polymerase, oder M-MuLV
Umkehrtranskriptase akzeptiert werden. In diesem Fall erfordert
die Untersuchung das Ausführen
des Primer-Erweiterungsschrittes der PCR Reaktion bei 25 bis 37°C, und frische
Polymerase muss bei jedem Zyklus im Anschluss an den 94°C Denaturierungsschritt
hinzugefügt
werden. Die DNA-Sequenzierung zur Evaluierung der möglichen
mutagenen Eigenschaften der nicht natürlichen Nukleotiden, wird nach
wie vor wie oben beschrieben, ausgeführt.
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Erzeugen
von Bibliotheken von Metallbindungs-Polymeren. Basierend auf den
Ergebnissen der obigen nicht natürlichen
Nukleotiduntersuchungen, werden mehrere Bibliotheken von ~1015 unterschiedlichen Nukleinsäure-Sequenzen
ausgefertigt, die ein oder zwei der am meisten Polymerase-kompatiblen
und chemisch viel versprechenden nicht natürlichen Metallbindungs-Nukleotiden
enthalten. Die Bibliotheken werden durch PCR Amplifikation einer
synthetischen DNA-Matrizen-Bibliothek, die aus einer zufälligen Region
von 20 oder 40 Nukleotiden, die durch zwei 15-Basen konstante Primingregionen
markiert sind, enthalten, erzeugt (54).
Die Primingregionen enthalten Restriktionsendnuklease Spaltungsstellen,
um das Klonieren in Vektoren für
die DNA Sequenzierung von Tools oder individuellen Bibliotheksmitgliedern
zu ermöglichen.
Ein Primer enthält
einen chemischen Griff, wie eine primäre Amingruppe oder eine Thiolgruppe
an seinen 5' Terminus und
wird zu dem kodierenden Strang der Bibliothek. Der andere Primer
enthält
ein biotinyliertes T an seinem 5'-Terminus und wierd
der nicht-kodierende Strang. Die PCR Reaktion enthält ein oder
zwei nicht natürliche Metallbindungs-Deoxyribonukleotid
Trisphosphate, drei oder zwei natürliche Deoxyribonukleotide
Triphospate, und eine DNA Polymerase, die mit dem(n) nicht natürlichen
Nukleotid(en) kompatibel ist. Im Anschluss an die PCR Reaktion,
um die doppelsträngige
Form der Bibliothek zu erzeugen und Gelreinigung, um benötigte Primer
zu entfernen, werden Bibliotheksmitglieder-Duplexe chemisch denaturiert.
Die nicht kodierenden Stränge werden
dann durch mehrere Waschungen mit Streptavidin-gebundenen magnetischen
Kügelchen entfernt,
um sicher zu stellen das kein biotinylierter Strang in der Bibliothek
zurückbleibt.
Bibliotheken von bis zu 1015 unterschiedlichen
Mitgliedern werden durch dieses Verfahren erzeugt, was die kombinierte
Diversität
von früheren kombinatorischen
Katalysatorleistungen bei weitem übersteigt.
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Jede
Bibliothek wird dann in einer wässrigen
Lösung
mit einem Metall von Interesse inkubiert, die aus der folgenden
nicht einschränkenden
Liste von wasserlöslichen
Metallsalzen ausgewählt
ist (Fringueli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439–455; Zaitoun
et al. J. Phys. Chem. B 1997, 1857–1860): ScCl3,
CrCl3, MnCl2, FeCl2, FeCl3, CoCl2, NiCl2, CuCl2, ZnCl2, GaCl3, YCl3, RuCl3, RhCl3, PdCl2, AgCl, GdCl2, InCl3, SnCl2, La(OTf)3, Ce(OTf)3, Pr(OTf)3, Nd(OTf)3, Sm(OTf)3, Eu(OTf)3, Gd(OTf)3, Tb(OTf)3, Dy(OTf)3, Ho(OTf)3, Er(OTf)3, Tm(OTf)3, Yb(OTf)3, Lu(OTf)3, IrCl3, PtCl2, AuCl, HgCl2, HgC, PbCl2, oder
BiCl3. Die Metalle werden basierend auf
den spezifischen zu katalysieren chemischen Reaktionen ausgewählt. Zum
Beispiel werden Bibliotheken, die auf Reaktionen wie Aldol Kondensation
oder hetero Diels-Alder
Reaktionen gerichtet sind, von denen bekannt ist (Fringuelli et
al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439–455) dass sie durch Lewis
Säuren
katalysiert werden, mit ScCL3 oder mit einem
der Lanthanid Triflaten inkubiert, während jene, die auf die Kopplung
von Elektronen effizienten Olefinen mit Arylhaliden abzielen, mit
PdCl2 inkubiert werden. Die Metallat-Bibliothek wird
dann von ungebundenen Metallsalzen durch Gelfiltration unter Verwendung
von Sephadex oder Acrylamid Kartuschen gereinigt, welche DNA Oligonukleotide
25 Basen oder länger
von ungebundenen kleinen Molekülkomponenten
trennt.
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Die
Fähigkeit
der Polymerbibliothek (oder eines individuellen Bibliotheksmitglied)
Metalle von Interesse zu bilden, wird durch Behandlung der Metallat-Bibliothek,
die kein ungebundenes Metall enthält, mit Metall-färbenden
Reagenzien wie Dithiooxamid, Dimethylglyoxim, KSCN (Francis et al.
Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 422–8) oder EDTA (Zaitoun et al.
J. Phys. Chem. B 1997, 101, 1857–1860), die in Gegenwart von unterschiedlichen
Metallen merklich gefärbt
werden, verifiziert. Das ungefähre
Ausmaß der
Metallbindung wird durch spektrophotometrischen Vergleich mit Lösungen von
freien Metallen mit bekannten Konzentrationen und mit Lösungen von
positiven Kontrolloligonukleotiden, die eine EDTA Gruppe enthalten
(welche unter Verwendung eines kommerziell enthältlichen Phosphoramidid von
Glen Research eingefügt
werden kann) gemessen.
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In
vitro Selektionen auf nicht natürliche
Polymere Katalysatoren: Metallat-Bibliotheken von entwickelbaren
nicht natürlichen
Polymeren, die Metall-bindende Gruppen enthalten, werden einer Eingefäß-, Lösungsphasen-Selektion
auf katalytische Aktivitäten
von Interesse unterzogen. Bibliotheks-Mitglieder, die nahezu jede
Reaktion katalysieren, die die Bindungsbildung zwischen zwei Substratmolekülen verursacht,
oder die einen Bindungsbruch in zwei Produktmoleküle verursacht,
werden unter Verwendung der in 54 und 55 vorgeschlagenen
Schemata selektiert. Um auf Bindungs-Bildungs-Katalysatoren zu selektieren
(z.B. Hetero Diels-Alder, Heck Kopplung, Aldol Reaktion oder Olefin-Metathese-Katalysatoren)
werden Bibliotheksmitglieder kovalent an ein Substrat durch ihre
5'-Amino- oder Thiol-termini
gebunden. Das andere Substrat der Reaktion wird als ein Derivat,
welches an Biotin gebunden ist, synthetisiert. Wenn verdünnte Lösungen des
Bibliotheks-Substrat-Konjugats mit dem Substrat-Biotin Konjugat
reagiert werden, bewirken jene Bibliotheks-Mitglieder, die die Bindungsbildung
katalysieren, dass die Biotingruppe kovalent an sich selbst angeheftet
wird. Aktive Bindungsbildungs-Katalysatoren können dann von inaktiven Bibliotheksmitgliedern
durch Einfangen des Ersteren mit immobilisierten Streptavidin und
Wegwaschen von inaktiven Polymeren getrennt werden (55).
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Auf
analoge Art können
Bibliotheks-Mitglieder, die Bindungspaltungs-Reaktionen, wie Retro-Aldol
Reaktionen, Amidhydrolyse, Eliminations-Reaktionen, oder Olefin
Dihydroxylierung gefolgt von der Periodatspaltung, katalysieren,
selektiert werden. In diesem Fall werden Metallat-Bibliotheks-Mitglieder
kovalent an biotinylierte Substrate gebunden, so dass die Bindungspaltungs-Reaktion
die Trennung des Biotin-Anteils von den Bibliotheks-Mitgliedern hervorruft
(56). Bei der Inkubation und der Reaktionsbedingungen
induzieren aktive Katalysatoren, nicht jedoch inaktive Bibliotheks-Mitglieder,
den Verlust ihrer Biotingruppen. Streptavidin-gebundene Kügelchen
können
dann verwendet werden, um inaktive Polymere einzufangen, während aktive
Katalysatoren in der Lage sind, von den Kügelchen zu eluieren. Verwandte
Bindungsbildungs- und Bindungspaltungs-Selektionen wurden erfolgreich
in der katalytischen RNA und DNA Evolution verwendet (Jäschke et
al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257–62). Obwohl diese Selektionen
nicht explizit auf multiple Stoffumsatzkatalyse selektieren, haben
sich die auf diese Art selektierten RNAs und DNAs als multiple Stoffumsatzkatalysatoren
herauskristallisiert, wenn sie von ihren Substratanteile getrennt
werden (Jäschke
et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257–62; Jaeger et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1999, 96,14712–7;
Bartel et al. Science, 1993, 261, 1411–8; Sen et al Curr. Opoin.
Chem. Biol. 1998, 2, 680–7).
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Katalysatoren
von drei wichtigen und unterschiedlichen Bindungsbildungs-Reaktionen
werden anfänglich
entwickelt: Heck Kopplung, Hetero Diels-Alder Cycloaddition und
Aldol Addition. Alle drei Reaktionen sind wasserkompatibel (Kobayashi
et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8287–8288; Fringuelli et al. Eur.
J. Org. chem. 2001, 2001, 439–455;
Li et al. Organic Reactions in Aqueous Media: Wiley and Sons: New
York, 1997) und sind bekannt durch Metalle katalysiert zu werden.
Als Heck Kopplungs-Substrate werden Elektronen deffiziente und nicht
aktivierte Olefine, zusammen mit Aryl Iodid und Aryl Chlorid verwendet.
Heck Reaktionen mit Aryl Chloriden in wässriger Lösung, sowie Raumtemperatur-Heck-Reaktionen
mit nicht aktivierten Aryl Chloriden, wurden zu unserem Wissen bis
jetzt noch nicht berichtet. Bibliotheken für die Heck Kopplungs-Katalysator-Evolution
verwenden PdCl2 als eine Metallquelle. Hetero
Diels-Alder Substrate beinhalten einfache Diene und Aldehyde, während Aldol
Additions Substrate aus Aldehyden und sowohl Silyl Enol Ether als
auch einfachen Ketonen bestehen. Charakteristisches Selektions Schemata
für die
Heck Kopplung, Hetero Diels-Alder und
Aldol Additions Katalysatoren sind in 57 gezeigt.
Die Stringenz dieser Selektionen kann zwischen den Selektionsrunden
durch Verringern der Reaktionszeiten, sinkende Reaktionstemperaturen
oder das Verwenden von weniger aktivierten Substraten (zum Beispiel,
weniger elektronenarme Aryl Chloride (Littke et al. J. Am. Chem.
Soc. 2001, 123, 6989–7000)
oder einfache Ketone anstelle von Silyl Enol Ether) erhöht werden.
-
Entstehende nicht natürliche Polymere:
Diversifikation und Selektieren auf Stereospezifität:
-
Im
Anschluss an jede Selektionsrunde werden aktive Bibliotheks-Mitglieder
durch PCR mit nicht natürlichen
Nukleotiden amplifiziert und zusätzlichen
Selektionsrunden unterzogen, um die Bibliothek an den gewünschten
Katalysatoren anzureichern. Diese Bibliotheken werden durch Einführen eines
Diversifikationsschrittes vor jeder Selektionsrunde genau entwickelt.
Bibliotheken werden durch Zufallsmutagenese unter Verwendung der
error-prone PCR (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992, 2, 28–33) oder
durch Rekombination unter Verwendung von modifizierten DNA Shufflings-Verfahren,
die kleine nicht homologe Nukleinsäure Fragmente rekombiniert,
diversifiziert. Da die error-prone PCR von Natur aus weniger effizient
ist als die normale PCR, wird die error-prone PCR Diversifikation
mit nur natürlichen
dATP, dTTP, dCTP und dGTP und unter Verwendung von Primern, die
chemische Griffe oder Biotingruppen Fällen durchgeführt. Die
resultierenden mutagenisierten Produkte werden dann einer PCR Translation
in nicht natürliche
Nukleinsäure
Polymere unter Verwendung von Standard PCR Reaktionen, die die nicht
natürlichen
Nukleotide, die biotinylierten Primer und den Amino- oder Thiol-begrenzenden
Primer enthalten, unterzogen.
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Zusätzlich zu
der einfachen Entwicklung von aktiven Katalysatoren werden die oben
beschriebenen in vitro-Selektionen verwendet, um nicht natürliche Polymer-Bibliotheken
in leistungsfähige
Richtungen zu entwickeln, die schwierig sind, unter Verwendung von
anderen Katalysator-Auffindansätzen
zu erreichen. Ein Freigabemerkmal dieser Selektionen ist die Fähigkeit
entweder auf Bibliotheks-Mitglieder, die biotinyliert werden oder
die nicht biotinyliert werden, zu selektieren. Die Substrat-Spezifität unter
den Katalysatoren kann deshalb entwickelt werden, indem auf aktive
Katalysatoren in der Gegenwart des gewünschten Substrats selektiert
wird und dann in demselben Gefäß auf inaktive
Katalysatoren in der Gegenwart von einem oder mehreren ungewünschten
Substraten selektiert wird. Wenn sich die gewünschten Substrate durch die
Konfiguration an einen oder mehreren Stereozentren unterscheiden,
können
enantiosselektive oder diastereoselektive Katalysatoren von den
Selektionsrunden hervorgehen. Auf ähnliche Weise kann die Metall-Selektivität durch
Selektieren auf aktive Katalysatoren in der Gegenwart von gewünschten
Metallen und Selektieren auf inaktive Katalysatoren in der Gegenwart
von ungewünschten
Metallen entwickelt werden. Umgekehrt können Katalysatoren mit einer breiten
Substrat-Toleranz durch Variieren der Substratstrukturen zwischen
erfolgreichen Selektionsrunden entwickelt werden.
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Schließlich weisen
die Beobachtungen der Sequenz-spezifischen DNA-Matrizen-basierenden Synthese
in DMF und CH2Cl2 darauf
hin, dass DNA-Tetralkylammonium Kation Komplexe Basen-gepaarte Strukturen in
organischen Lösungsmittel
bilden können.
Dieses Erkenntnis ergibt die Möglichkeit
zum Entwickeln von nicht natürlichen
Nukleinsäure-Katalysatoren in
organischen Lösungsmittel
unter Verwendung von leicht modifizierten Versionen der oben beschriebenen
Selektionen. Die tatsächlichen
Bindungsbildungs und Bindungspaltungs-Selektions-Reaktionen werden
in organischen Lösungsmittel
ausgeführt,
die Rohreaktionen werden mit Ethanol präzipitiert, um die Tetraalkylammonium
Kationen zu entfernen, und die immobilisierte Avidin-Trennung von
biotinylierten und nicht biotinylierten Bibliotheksmitgliedern in
wässriger
Lösung
wird ausgeführt.
Die PCR Amplifikation von ausgewählten
Mitgliedern wird dann wie oben beschrieben stattfinden. Die erfolgreiche Entwicklung
von Reaktions-Katalysatoren, die in organischen Lösungsmittel
funktionieren, würde
sowohl den Umfang der Reaktionen, die katalysiert werden können, als
auch den Nutzen der resultierenden entwickelten nicht-natürlichen
Polymer-Katalysatoren beachtlich erweitern.
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Charakterisierung
der entwickelnden nicht natürliche
Polymere: Bibliotheken, die mehreren Evolutionsrunden unterzogen
wurden, werden auf ihre Fähigkeit,
Reaktionen von Interesse sowohl als Pools von gemischten Sequenzen
oder als auch individuelle Bibliotheksmitglieder zu katalysieren,
charakterisiert. Individuelle Mitglieder werden aus entwickelnden
Pools durch Ligieren von PCR amplifizierten Sequenzen in DNA Vektoren,
Transformieren von verdünnten
Lösungen
von ligierten Vektoren in kompetente Bakterienzellen, und Auswählen von
Einzelkolonien von Transformanten freigesetzt. Untersuchungen an
Pools oder individuellen Sequenzen werden sowohl in dem Einzelstoffumsatzformat
und in einem wahren Mehrfachstoffumsatz katalytischen Format ausgeführt. Für die Einzelumsatz-Untersuchungen, wird
die Rate, bei welcher Substrat-gebundene Bindungsbildungs-Katalysatoren ihre
eigene Biotinylierung in der Gegenwart von freien biotinylierten Substrat
bewirkt, oder die Rate, bei welcher biotinylierte Bindungsbruch-Katalysatoren
den Verlust ihrer Biotingruppen bewirkt, gemessen werden. Mehrere
Stoffumsatzuntersuchungen werden durch Inkubieren von entwickelten
Katalysatoren mit kleinen Molekülversionen
von Substraten und Analysieren der Produktbildungsrate durch tlc,
NMR, Massen-Spectometrie, HPLC oder Spektrophotometrie ausgeführt.
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Sobald
multiple Wirksoffumsatz-Katalysatoren entwickelt und durch diese
Verfahren verifiziert werden, können
detaillierte mechanistische Studien an den Katalysatoren ausgeführt werden.
Die DNA-Sequenzen, die den Katalysatoren entsprechen, werden durch
Sequenzieren von PCR-Produkten oder DNA-Vektoren, die die Matrizen
der aktiven Katalysatoren enthalten, aufgedeckt. Metall-Präferenzen
werden durch Metalat-Katalysatoren mit einer großen Vielzahl von Metall-Kationen
und Messen der resultierenden Änderung
der Aktivität
evaluiert. Die Substrat-Spezifität
und Stereoselektivität
dieser Katalysatoren werden durch Messen der Stoffumsatzraten einer
Reihe von Substrat-Analoga beurteilt. Die Diastereoselektivitäten und
Enantioselektivitäten
der Produktbildung werden durch Vergleichen der Reaktionsprodukte
mit jenen von bekannter Stereo-Chemie aufgedeckt. Frühere Studien
weisen darauf hin, dass aktive Stellen, die innerhalb von großen chiralen
Umgebungen verdeckt sind, oft hohe Grade von Stereoselektivität besitzen.
Zum Beispiel haben Peptid-basierende Katalysatoren, die in kombinatorischen
Ansätzen
erzeugt wurden, schlechte bis exzellente Stereoselektivitäten demonstriert,
die mit der Größe des Peptid-Ligands
korrelieren (Jarvo et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11638–11643),
während
RNA-basierende Katalysatoren und Antikörper-basierende Katalysatoren
häufig
exzellente Stereoselektivitäten
demonstrieren (Jäschke
et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257–262; Seelig et al. Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 2000, 39, 4576–4579; Hilvert, D. Annu. Rev.
Biochem. 2000, 69, 751–93; Barbas
et al. Science 1997, 278, 2085–92;
Zhong et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 3738–3741; Zhong
et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8131–8132; Listet al. Org. Lett.
1999, 1, 59–61).
Die direkte Selektionen auf Substrat-Stereoselektivität, die oben
beschrieben ist, sollte diese Eigenschaft unter entwickelten Katalysatoren
weitere erhöhen.
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Struktur-Funktions-Studien
an entwickelten Katalysatoren werden durch die Leichtigkeit der
automatisierten DNA Synthese außerordentlich
erleichtert. Orts-spezifisch strukturelle Modifikationen werden
durch Synthetisieren von DNA-Sequenzen, die „mutierten" Katalysatoren entsprechen, in welchen
die Basen von Interesse zu anderen Basen verändert werden, eingeführt. Das Ändern der
nicht natürlichen
Basen in einem Katalysator zu einer natürlichen Base (U* zu C oder
A* zu G) und Untersuchung der resultierenden Mutanten kann die chemisch
wichtigen Metallbindungsstellen in jedem Katalysator identifizieren.
Das für
eine wirksame Katalyse erforderte minimale Polymer wird durch Synthetisieren
und Untersuchen von stufenweise verkürzten Versionen der aktiven
Katalysatoren bestimmt. Schließlich
werden die drei-dimensionalen Strukturen der mit Metall komplexierten
entwickelt Katalysatoren von größtem Interesse
in Zusammenarbeit mit lokalen makromolekularen NMR Spektroskopikern
oder Röntgen-Kristallographern
gelöst.