DE60213826T3

DE60213826T3 - Entwicklung neuer molekularer funktionen

Info

Publication number: DE60213826T3
Application number: DE60213826T
Authority: DE
Inventors: David Liu; Zev Gartner; Mattew KANAN
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2013-10-17
Anticipated expiration: 2022-03-20
Also published as: US7557068B2; US20050025766A1; EP1832567A2; US20120165228A1; IL206585A0; JP4384229B2; US20030113738A1; DK1423400T4; EP1423400B2; JP2004536162A; JP2008183010A; US20050142583A1; JP2013010761A; JP5509270B2; WO2002074929A3; JP2009232869A; EP2332896A3; DE60213826T8; IL206586A0; US20050227281A1

Description

Prioritätsinformation
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität unter 35 U. S. C. § 119 (e) der U. S. Provisorischen Patentanmeldungen 60/277.081, eingereicht am 19. März 2001 mit dem Titel „Nucleic Acid Directed Synthesis of Chemical Compounds”; 60/277.094, eingereicht am 19. März 2001 mit dem Titel „Approaches to Genrating New Molecular Function”; und 60/306,691, eingereicht am 20. Juli 2001 mit dem Titel „Approaches to Genrating New Molecular Function”, und die gesamten Inhalte von jeder dieser Anmeldungen werden durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
Hintergrund der Erfindung
Der klassische „chemische Ansatz”, um Moleküle mit neuen Funktionen zu erzeugen, wurde über das letzte Jahrhundert in Anwendungen, die von der Arzneimittelentdeckung über synthetische Methologie bis hin zu Materialwissenschaft reichen, extensiv verwendet. Bei diesem Ansatz (1, schwarz), synthetisieren oder isolieren Forscher Kandidatenmoleküle, untersuchen diese Kandidaten auf gewünschte Eigenschaften, bestimmen die Strukturen von aktiven Verbindungen, wenn unbekannt, formulieren Struktur-Aktivitätsbeziehungen basierend auf den Untersuchungs- und Strukturdaten, und synthetisieren dann eine neue Generation von Molekülen, die entwickelt sind, um verbesserte Eigenschaften zu besitzen. Während kombinatorische Chemieverfahren (siehe, zum Beispiel, A. V. Eliseev und J. M. Lehn. Combinatorial Chemistry In Biology 1999, 243, 159–172; K. W. Kuntz, M. L. Snapper und A. H. Hoveyda. Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3, 313–319; D. R. Liu und P. G. Schultz. Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 1999, 38, 36) den Durchsatz dieses Ansatzes erhöht haben, bleiben seine fundamentalen Beschränkungen unverändert. Mehrere Faktoren beschränken die Wirksamkeit des chemischen Ansatzes, um molekulare Funktion zu erzeugen. Erstens ist unsere Fähigkeit, die Strukturänderungen genau vorherzusagen, die zu einer neuen Funktion führen werden, aufgrund feiner konformativer Umordnungen vom Molekül, unvorhergesehener Lösungsmittelintreraktionen oder unbekannter stereochemischer Anforderungen der Bindung oder Reaktionsvorgänge unzureichend. Die resultierende Komplexität der Struktur-Aktivitätsbeziehungen beschränken häufig den Erfolg der rationalen Ligand- oder Katalysatorentwicklung einschließlich jenen Anstrengungen, die in einer Hochdurchsatzweise ausgeführt sind. Zweitens, das Erfordernis, jedes Mitglied einer Sammlung von Kandidaten eher zu untersuchen oder zu screenen als auszuwählen, begrenzt die Anzahl von Molekülen, die je Experiment gesucht werden können. Schlussendlich stellt das Fehlen eines Weges, synthetische Moleküle zu amplifizieren, Anforderungen an die minimale Menge an Material, das für die Charakterisierung, das Screening und die Strukturaufklärung hergestellt werden muss. Demzufolge kann es schwierig sein, Bibliotheken mit mehr als ungefähr 10⁶ unterschiedlichen synthetischen Verbindungen herzustellen.
Im Gegensatz dazu erzeugt die Natur Proteine mit neuen Funktionen unter Verwendung einer grundsätzilch unterschiedlichen Methode, die viele dieser Beschränkungen bewältigt. Bei diesem Ansatz (1, grau) induziert ein Protein mit gewünschten Eigenschaften das Überleben und die Amplifikation der Information, die das Protein kodiert. Diese Information wird durch spontane Mutation und DNA-Rekombination diversifiziert, und dann in eine neue Generation von Kandidatenproteinen unter Verwendung der Ribosome translatiert. Die Leistung dieses Vorgangs wird anerkannt (siehe F. Arnold Acc. Chem. Res. 1998, 31, 125; F. H. Arnold et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 54–59; J. Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284–90) und wird durch die Tatsache bewiesen, dass Proteine und Nukleinsäure die Lösungen zu vielen komplexen chemischen Problemen dominieren trotz ihrer beschränkten chemischen Funktionalität. Offensichtlich, im Gegensatz zu dem oben beschriebenen linearen chemischen Ansatz, bilden die von der Natur verwendeten Schritte einen Zyklus der molekularen Evolution. Die von diesem Prozess entstehenden Proteine wurden eher direkt ausgewählt als einfach auf gewünschte Aktivitäten gescreent. Da die Information, die entstehende Proteine kodieren (DNA), amplifiziert werden kann, kann in der Theorie ein einzelnes Proteinmolekül mit gewünschter Aktivität zu dem Überleben und zur Vermehrung der DNA, die seine Struktur kodiert, führen. Die verschwindend kleinen Mengen an Material, die benötigt werden, um in einem Zyklus der Molekularevolution teilzunehmen, ermöglicht das Herstellen von Bibliotheken mit viel größerer Diversität, als jene, die durch chemische Ansätze synthetisiert werden und auf gewünschte Funktion in kleinen Volumina selektiert werden.
In Anerkennung der Leistung und Wirksamkeit des Ansatzes der Natur haben Forscher die molekulare Evolution verwendet, um viele Proteine und Nukleinsäure mit neuartigen Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften zu erzeugen (siehe zum Beispiel J. Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284–90; C. Schmidt-Dannert et al. Trends Biotechnol. 1999, 17, 135–6; D. S. Wilson et al. Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 611–47). Durch Forscher entwickelte Proteine und Nukleinsäuren haben den Nutzen als Forschungswerkzeuge, diagnostische und industrielle Reagenzien und Therapeutika demonstriert, und haben unser Verständnis der molekularen Interaktionen außerordentlich vergrößert, die Proteine und Nukleinsäuren mit Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften ausstatten (siehe, M. Famulok et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 320–7).
Trotz des wirksamen Ansatzes der Natur, Funktion zu erzeugen, ist die molekulare Evolution der Natur auf zwei Arten von „natürlichen” Molekülen Proteine und Nukleinsäuren beschränkt, da soweit die Information in der DNA nur in ein Protein oder in eine andere Nukleinsäure translatiert werden kann. Viele synthetische Moleküle von Interesse repräsentieren im Allgemeinen keine Nukleinsäurerückgrate, und die Verwendung von DNA-Matrizenbasierenden Synthese, um DNA-Sequenzen in synthetische kleine Moleküle zu translatieren, würde nur weitgehend brauchbar sein, wenn synthetische Moleküle außer Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Analoga in einer DNA-Matrizenbasierenden Art und Weise synthetisiert werden könnten. Ein idealer Ansatz, um funktionelle Moleküle zu erzeugen, würde die leistungsstärksten Aspekte der molekularen Evolution mit der Flexibilität der synthetischen Chemie verbinden. Offensichtlich würde das Ermöglichen der Evolution von nicht-natürlichen synthetischen kleinen Molekülen und Polymeren, ähnlich zu dem Weg, wie die Natur Biomoleküle entwickelt, zu viel wirksameren Verfahren zum Entwickeln von neuen synthetischen Liganden, Rezeptoren, Katalysatoren führen, die unter Verwendung des rationellen Designs schwierig oder unmöglich herzustellen sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erkennung des Bedarfs, in der Lage zu sein, Klassen von Molekülen abgesehen von Nukleinsäuren und Proteinen zu amplifizieren und zu entwickeln, führte zu der vorliegenden Erfindung, die die Verfahren und Zusammensetzungen für die Matrizen-gerichtete Synthese, Amplifikation und Entwicklung von Molekülen vorsieht. Im Allgemeinen verwenden diese Verfahren eine ableitbare Matrize, um die Synthese einer chemischen Verbindung oder Bibliothek von chemischen Verbindungen (d. h., die Matrize kodiert tatsächlich die Synthese einer chemischen Verbindung) zu lenken. Basierend auf einer Bibliothek, die unter Verwendung einer Matrize wie einer Nukleinsäure, kodiert und synthetisiert ist, werden Verfahren zum Amplifizieren, Entwickeln und Screenen der Bibliothek bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen von speziellem Interesse sind die chemischen Verbindungen, Verbindungen, die keine Nukleinsäure oder Analoga davon sind, oder diesen nicht ähnlich sind. In bestimmten Ausführungsformen sind die chemischen Verbindungen dieser Matrizen-kodierten kombinatorischen Bibliotheken Polymere und sind noch mehr bevorzugt unnatürliche Polymere (d. h. ausgeschlossen sind natürliche Peptide, Proteine und Polynukleotide). In anderen Ausführungsformen sind die chemischen Verbindungen kleine Moleküle.
In bestimmten Ausführungsformen weist das Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung oder der Bibliothek von Verbindungen zuerst das Bereitstellen einer oder mehrer Nukleinsäurematrizen auf, welche eine oder mehrere Nukleinsäurematrizen gegebenenfalls eine damit assoziierte reaktive Einheit haben. Die Nukleinsäurematrize wird dann mit einer oder mehreren Transfereinheiten in Kontakt gebracht, die ausgebildet sind, um einen ersten Anteil, ein Antikodon, welcher an eine Sequenz der Nukleinsäure hybridisiert hat, und mit einem zweiten Anteil, einer reaktiven Einheit, assoziiert ist, welche eine Baueinheit der zu synthetisierenden Verbindung enthält. Sobald diese Transfereinheiten an die Nukleinsäurematrize in einer sequenz-spezifischen Weise hybridisiert haben, kann die Synthese der chemischen Verbindung aufgrund der Interaktionen der reaktiven Anteile, die auf diesen Transfereinheiten und/oder Nukleinsäurematrizen vorhanden sind, stattfinden. Signifikanterweise kann die Sequenz der Nukleinsäure später bestimmt werden, um die synthetische Historie der angehefteten Verbindung und dadurch seine Struktur zu dekodieren. Es wird erkannt werden, dass das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden kann, um jeweils ein Molekül zu synthetisieren, oder kann verwendet werden, um Tausende bis Millionen von Verbindungen unter Verwendung von kombinatorischen Verfahren zu synthetisieren.
Es wird erkannt, dass auf diese Art und Weise synthetisierte Bibliotheken (d. h. die durch eine Nukleinsäure kodiert werden) den Vorteil haben, amplifizierbar und ableitbar zu sein. Sobald ein Molekül identifiziert ist, kann seine Nukleinsäurematrize, abgesehen von dem Wirken als ein Tag, welches verwendet wird, um die angeheftete Verbindung zu identifizieren, unter Verwendung von Standard-DNA-Techniken, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Diese amplifzierte Nukleinsäure kann dann verwendet werden, um mehr der gewünschten Verbindung zu synthetisieren. In bestimmten Ausführungsformen werden während des Amplifikations-Schrittes Mutationen in die Nukleinsäure eingeführt, um eine Population von chemischen Verbindungen zu erzeugen, die mit der Stammverbindung verwandt sind, aber an einer oder mehreren Stellen modifiziert sind. Die mutierten Nukleinsäuren können dann verwendet werden, um eine neue Bibliothek von verwandten Verbindungen zu synthetisieren. Auf dieser Weise kann die zu screenende Bibliothek entwickelt werden, um mehrere Verbindungen mit der gewünschten Aktivität zu enthalten oder um Verbindungen mit einem höheren Grad an Aktivität zu enthalten.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine große Anzahl von chemischen Verbindungen zu synthetisieren. In bestimmten Ausführungsformen werden die Verfahren verwendet, um unnatürliche Polymere (d. h. ausschließlich von Polynukleotiden und Peptiden) zu synthetisieren und zu entwickeln, welche unter Verwendung von derzeit verfügbaren Standardtechniken nicht amplifiziert oder entwickelt werden können. In bestimmten anderen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen für die Synthese von kleinen Molekülen benutzt, die typischerweise nicht polymer sind. In noch anderen Ausführungsformen wird das Verfahren für das Erzeugen von nicht natürlichen Nukleinsäure-Polymeren verwendet.
Die vorliegende Erfindung bietet auch Transfer-Moleküle (z. B. Nukleinsäure-Matrizen und/oder Transfereinheiten), die beim Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind. Diese Transfermoleküle enthalten üblicherweise einen Abschnitt, der zum Hybrisieren an eine Sequenz der Nukleinsäure in der Lage ist, und einen zweiten Abschnitt wie Monomeren, anderen Baueinheit, oder Reaktanten, die in die zu synthetisierende Endverbindung eingebaut werden. Es ist erkennbar, dass die zwei Abschnitte auf dem Transfermolekül vorzugsweise miteinander, entweder direkt oder durch einen Linker-Anteil, assoziiert sind. Es ist ebenfalls erkennbar, dass die reaktive Einheit und das Antikodon in demselben Molekül vorhanden sein können (z. B. ein nicht-natürliches Nukleotid mit darin eingebauter Funktionalität).
Die vorliegende Erfindung bietet ebenfalls, Ausrüstungssätze und Zusammensetzungen, die zum Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind. Diese Ausrüstungssätze können Nukleinsäure-Matrizen, Transfer-Moleküle, Monomere, Lösungsmittel, Puffer, Enzyme, Reagenzien für die PCR, Nukleotide, kleine Molekülgerüste, etc. enthalten. Der Ausrüstungssatz kann auch bei der Synthese einer bestimmten Art von unnatürlichem Polymer oder kleinem Molekül verwendet werden.
Definitionen
Der Begriff Antikörper bezieht sich auf ein Immunglobulin, ob natürlich oder vollkommen oder teilweise synthetisch hergestellt. Alle Derivate davon, welche eine spezifische Bindungsfähigkeit aufrechterhalten, sind ebenfalls in diesem Begriff eingeschlossen. Der Begriff deckt jedes Protein mit einer Bindungsdomäne, welche homolog oder größtenteils homolog zu der Immunglobulin-Bindungsdomäne ist, ab. Diese Proteine können von natürlichen Quellen abgeleitet sein, teilweise oder vollkommen synthetisch produziert werden. Ein Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Der Antikörper kann ein Mitglied einer beliebigen Immunglobulin Klasse sein, einschließlich irgendeiner der menschlichen Klassen: IgG, IgM, IgA, IgD, und IgE. Derviate der IgG Klasse werden jedoch in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Der Begriff „assoziiert mit” wird verwendet, um die Interaktion zwischen oder unter zwei oder mehreren Gruppen, Anteilen, Verbindungen, Monomeren, etc. zu beschreiben. Wenn zwei oder mehrere Einheiten untereinander „assoziiert mit” sind, wie hierin beschrieben, sind sie durch eine direkte oder indirekte kovalente, oder nicht-kovalente Interaktion verbunden. Vorzugsweise ist die Assoziation kovalent. Die kovalente Assoziation kann über eine Amid-, Ester-, Kohlenstoff-Kohlenstoff, Disulfid-, Carbamat-, Ether- oder Karbonatbindung sein. Die kovalente Assoziation kann ein Linker-Anteil, wie einen photospaltbaren Linker enthalten. Zu wünschenswerten nicht-kovalenten Interaktionen zählen Wasserstoffbindung, van der Waals Interaktionen, hydrophobe Interaktionen, magnetische Interaktionen, elektrostatische Interaktionen etc. Ebenfalls können zwei oder mehrere Einheiten oder Mittel miteinander „assoziiert” sein, in dem sie zusammen in derselben Zusammensetzung vorhanden sind.
Ein biologisches Makromolekül ist ein Polynukleotid (z. B. RNA, DNA, RNA/DNA Hybrid), Protein, Peptid, Lipid, natürliches Produkt oder Polysaccharid. Das biologische Markomolekül kann natürlich vorkommen oder nicht natürlich vorkommen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das biologische Markomolekül ein Molekulargewicht von mehr als 500 g/mol auf.
Polynukleotid, Nukleinsäure oder Olinukleotid bezieht sich auf ein Polymer von Nukleotiden. Das Polymer kann natürliche Nukleoside (d. h. Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Deoxyadenosin, Deoxythymidin, Deoxyguanosin, und Deoxycytidin), Nukleosid-Analoga (z. B. 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosin, Pyrrolpyrimidin, 3-Methyladenosin, 5-Methylcytidin, C5-Bromuridin, C5-Fluoruridin, C5-Ioduridin, C5-Propynyluridin, C5-Propynylcytidin, C5-Methylcytidin, 7-Deazaadenosin, 7-Deazaguanosin, 8-Oxoadenosin, 8-Oxoguanosin, O(6)-Methylguanin, und 2-Thiocytidin), chemisch modifizierte Basen, biologisch modifizierte Basen (z. B. methylierte Basen), Einschlussbasen, modifizierte Zucker (z. B. 2'-Fluorribose, Ribose, 2'-Deoxyribose, Arabinose, und Hexose) oder modifizierte Phosphatgruppen (z. B. Phosphorthioate und 5'-N-Phosphoramidit-Bindungen) beinhalten.
Ein Protein weist ein Polymer von Aminosäureresten, die zusammen durch Peptidbindungen gebunden sind, auf. Der Begriff, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Proteine, Polypeptide, und Peptide jeglicher Größe, Struktur oder Funktion. Typischerweise wird ein Protein zumindest drei Aminosäuren lang sein. Ein Protein kann sich auf ein individuelles Protein oder eine Sammlung von Proteinen beziehen. Ein Protein kann sich auf ein Protein voller Länge oder ein Fragment eines Proteins beziehen. Erfindungsgemäße Proteine enthalten vorzugsweise nur natürliche Aminosäuren, obwohl nicht-natürliche Aminosäuren (d. h. Verbindungen, die in der Natur nicht vorkommen, aber die in eine Polypeptidkette eingebaut werden könnten; siehe z. B. http://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif, welche Strukturen von nicht natürlichen Aminosäuren anzeigt, die erfolgreich in funktionelle Ionenkanäle eingebaut wurden) und/oder Aminosäure-Analoga, die im Stand der Technik bekannt sind, können alternativ eingesetzt werden. Ebenfalls können eine oder mehrere der Aminosäuren in einem erfindungsgemäßen Protein modifiziert sein, z. B. durch die Addition einer chemischen Einheit, wie einer Kohlenhydratgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Farnesyl-Gruppe, einer Isofarnesyl-Gruppe, einer Fettsäuregruppe, einem Linker für die Konjugation, Funktionalisierung, oder andere Modifikationen, etc. Ein Protein kann ebenfalls ein einzelnes Molekül sein, oder kann ein multi-molekularer Komplex sein. Ein Protein kann nur ein Fragment eines natürlich vorkommenden Proteins oder Peptids sein, ein Protein kann natürlich vorkommen, rekombinant, oder synthetisch, oder jede Kombination von diesen sein.
Der Begriff „kleines Molekül”, so wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine nicht-peptidische, nicht-oligomere organische Verbindung, die entweder in einem Labor synthetisiert oder in der Natur gefunden wird. Kleine Moleküle, wie hierin verwendet, können sich auch auf Verbindungen beziehen, die „Naturprodukt-ähnlich” sind, jedoch ist der Begriff „kleines Molekül” nicht auf „Naturprodukt-ähnliche Verbindungen beschränkt. Vielmehr ist ein kleines Molekül typischerweise dadurch charakterisiert, dass es eine oder mehrere der folgenden Charakteristiken besitzt, einschließlich mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindungen mit mehreren Stereo-Zentren, mit mehreren funktionellen Gruppen, mit zumindest zwei unterschiedlichen Arten von funktionellen Gruppen und mit einem Molekulargewicht von weniger als 1.500, obwohl diese Charakterisierung nicht beabsichtigt ist, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung einschränkend zu sein.
Der Begriff „kleines Molekülgerüst”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine chemische Verbindung mit zumindest einer Stelle für die Funktionalisierung. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das kleine Molekülgerüst eine Vielzahl von Stellen für die Funktionalisierung aufweisen. Diese Funktionalisierungsstellen können geschützt oder maskiert sein, wie durch einen Fachmann erkennbar wäre. Die Stellen können ebenfalls auf einer zugrundeliegenden Ringstruktur oder einem zugrunde liegenden Rückgrat gefunden werden.
Der Begriff „Transfereinheit”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, welches einen Antikodon-Anteil aufweist, der mit einer reaktiven Einheit assoziiert ist, einschließlich, aber nicht auf eine Baueinheit, ein Monomer, eine Monomer-Einheit, oder einen Reaktanten, der/die zum Synthetisieren der Nukleinsäure kodierten Moleküle verwendet wird, beschränkt ist.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt den Ansatz der Natur (grau) und den klassischen chemischen Ansatz (schwarz), um eine molekulare Funktion zu erzeugen.
2 zeigt bestimmte auf DNA-Matrizen basierende Reaktionen für Nukleinsäuren und Analoga davon.
3 zeigt das allgemeine Verfahren zum Synthetisieren eines Polymers unter Verwendung der Nukleinsäure-Matrizen basierenden Synthese.
4 zeigt ein vierer und dreier nicht-rahmenverschiebende Kodonsatz. Jeder Satz bietet neun mögliche Kodons.
5 zeigt Verfahren zum Screenen einer Bibliothek für Bindungs-Spaltungs und Bindungs-Bildungskatalysatoren. Diese Verfahren nutzen die natürliche Affinität von Streptavidin für Biotin aus.
6A zeigt die Synthese, die durch eine Haarnadel (H) und Ende der Helix (E) DNA-Matrizen gelenkt wird. Reaktionen wurden durch denautrierende PAGE nach den angegebenen Reaktionszeiten analysiert. Die Bahnen drei und vier enthielten die Matrizen, die mit einem Überschuss an β-Merkptoethanol vor der Reaktion abgelöscht wurden.
6B zeigt übereinstimmende (M) oder nicht übereinstimmende (X) Reagenzien Dianthiole (S) oder primäre Amine (N) gebunden sind, wurden mit einem Äquivalent von Matrize vermischt, die mit einer Vielzahl von gezeigten Elektrophilen funktionalisiert sind. Die Reaktionen mit den Thiolreagenzien wurden bei pH 7,5 unter den folgenden Bedingungen ausgeführt: SIAB und SBAP: 37°C, 16 h; SIA: 25°C, 16 h, SMCC, GMBS, BMPS, SVSB: 25°C, 10 min. Die Reaktionen mit Aminreagenzien wurden bei 25°C, pH 8.5 für 75 Minuten durchgeführt.
7 zeigt (a) H Matrizen, die an eine Iodacetamid Gruppe gebunden sind, welche mit Thiolreagenzien, welche 0, 1 oder 3 Nichtübereinstimmungen enthielten, bei 25°C reagiert wurden. (b) Reaktionen in (a) wurden bei den angegebenen Temperaturen für 16 Stunden wiederholt. Berechnete Schmelztemperatur des Reagenzes: 38°C (Übereinstimmung), 28°C (einzelne Nichtübereinstimmung).
8 zeigt eine Reaktion, die unter Verwendung einer 41-Base E Matrize und eines 10-Base Reagenzes, das so ausgebildet ist, um 1–30 Basen von dem 5' Ende der Matrize anzulagern, durchgeführt. Die kinetischen Profile in dem Diagramm zeigen den Durchschnitt von zwei Versuchen (Abweichungen < 10%). Das „n = 1 mis” Reagenz enthält drei Nichtübereinstimmungen.
9 zeigt die wiederholte N = 10 Reaktion in 8, in welcher die neun Basen, die dem 5'-NH2-dT folgen, mit den Rückgratanaloga, die gezeigt sind, ersetzt wurden. Fünf Äquivalente eines DNA-Oligonukleotids, welches zu den dazwischenliegenden Basen komplementär ist, wurden zu der „DNA + clamp” Reaktion hinzugefügt. Die Reagenzien stimmten überein (0) oder enthielten drei Nichtübereinstimmungen (3). Das Gel zeigt die Reaktionen bei 25°C nach 25 min.
10 zeigt die n = 1, n = 10, und n = 1 Nichtübereinstimmungs (mis) Reaktionen, die in 8 beschrieben sind, welche mit Matrize und Reagenz-Konzentrationen von 12,5, 25, 62,5 oder 125 nM wiederholt wurden.
11 zeigt eine Modelltranslation, Selektion und Amplifikation von synthetischen Molekülen, die Streptavidin aus einer DNA-kodierten Bibliothek binden.
12 zeigt (a) Bahnen 1 und 5: PCT: amplifizierte Bibliothek vor der Streptavidin Bindungsselektion. Bahnen 2 und 6: PCR amplizifierte Bibliothek nach Selektion. Bahnen 3 und 7: PCR amplifizierte authentische Biotin kodierte Matrize. Bahn 4: 20 bp Leiter. Bahnen 5–7 wurden mit Tsp45I verdaut. DNA Sequenzierungsspuren der amplifizierten Matrizen vor und nach der Selektion sind ebenfalls gezeigt, zusammen mit den Sequenzen der nicht-Biotin-kodierten und Biotin-kodierten Matrizen. (b) Allgemeines Schema für die Erzeugung und Evolution von Bibliotheken von nicht-natürlichen Molekülen unter Verwendung der DNA-Matrizen basierenden Synthese, wobei –R₁ von Produktfunktionalität, die von der Reagenzbibliothek 1 übertragen wurde, darstellt, und –R_1B ein ausgewähltes Produkt darstellt.
13 zeigt eine beispielhafte DNA-Matrizen basierende Reaktion. Für alle Reaktionen unter den spezifizierten Bedingungen waren die Produktausbeuten der Reaktion mit übereinstimmenden Matrizen und Reagenzsequenzen größer als 20fach höher als die von Kontrollreaktionen mit durchmischten Reagenzsequenzen. Die Reaktionen wurden bei 25°C mit einem Äquivalent von jeder Matrize und Reagenz bei 60 nM Endkonzentration, wenn nichts anderes angegeben, durchgeführt. Bedingungen: (a) 3mM NaBH₃CN, 0,1 M MES Puffer pH 6,0, 0,5 M NaCl, 1,5 h; b) 0,1 M TAPS Puffer pH 8,5, 300 mM NaCl, 12 h; c) 0,1 M pH 8,0 TAPS Puffer, 1 M NaCl, 5°C, 1,5 h; d) 50 mM MOPS Puffer pH 7,5, 2,8 M NaCl, 22 h; e) 120 nM 19, 1,4 mM Na₂PdCl₄, 0,5 M NaOAc Puffer pH 5,0, 18 h; f) Vermischung Na₂PdCl₄ mit zwei Äquivalenten an P (p-SO₃C₆H₄)₃ in Wasser 15 min, dann Hinzufügen zu den Reaktanten in 0,5 M NaOAc Puffer pH 5,0, 75 mM NaCl, 2 h (End[Pd] = 0,3 mM, [19] = 120 nM). Die Olefingeometrie der Produkte aus 13 und der Regiochemien der Cycloadditionsprodukte aus 14 und 16 werden angenommen, aber nicht verfiziert.
14 zeigt die Analyse durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese von repräsentativen DNA-Matrizen basierenden Reaktionen, die in 13 und 15 aufgelistet sind. Die Strukturen der Reagenzien und Matrizen entsprechen der Nummerierung der 13 und 15. Die Bahnen 1, 3, 5, 7, 9, 11: Reaktionen von übereinstimmenden (komplementären) Reagenzien und Matrizen unter Bedingungen, die in 13 und 15 aufgelistet sind (die Reaktion von 4 und 6 wurde durch DMT-MM vermittelt). Die Bahnen 2, 4, 6, 8, 10, 12: Reaktionen von nicht übereinstimmenden (nicht-komplementären) Reagenzien und Matrizen unter Bedingungen, die identisch zu jenen in Bahnen 1, 3, 5, 7, 9 bzw. 11 sind.
15 zeigt die DNA Matrizen Amidbindungsbildung, die durch EDC und Sulfo-NHS oder durch DMT-MM für eine Vielzahl von substituierten Carbonsäuren und Aminen vermittelt wird. In jeder Reihe, werden die Ausbeuten die DMT-MM vermittelten Reaktionen zwischen Reagenzien und Matrizen, die in der Sequenz komplementär sind, durch Ausbeuten der EDC und Sulfo-NHS-vermittelten Reaktionen versorgt. Bedingungen: 60 nM Matrize, 120 nM Reagenz, 50 mM DMT-MM in 0,1 M MOPS Puffer pH 7,0, 1 M NaCl, 16 h, 25°C; oder 60 nM Matrize, 120 nM Reagenz, 20 mM EDC, 15 mM Sulfo-NHS, 0,1 M MES Puffer pH 6,0, 1 M NaCl, 16 h, 25°C. In allen Fällen ergaben Kontrollreaktionen mit nichtübereinstimmenden Reagenzsequenzen wenig oder kein detektierbares Produkt.
16 zeigt (a) Konzeptmodell für die entfernungsabhängige DNA-Matrizen basierende Synthese. Wie die Entfernung zwischen den reaktiven Gruppen eines angelagerten Reagenzes und Matrize (n) erhöht wird, wird angenommen, dass die Rate der Bindungsbildung abnimmt. Für jene Werte von n, bei welchen die Rate der Bindungsbildung signifikant höher ist, als die Rate der Matrize-Reagenzanlagerung, bleibt die Rate der Produktbildung konstant. Bei diesem Schmema zeigt die DNA-Matrizen basierende Reaktion eine Entfernungsabhängigkeit. (b) Denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese einer DNA-Matrizen Wittig Olefinierung zwischen komplementären 11 und 13 mit entweder 0-Basen (Bahnen 1–3) oder 10 Basen (Bahnen 4–6), die angelagerte Reaktanten trennen. Obwohl die offensichtlichen Ratenkonstanten zweiter Ordnung für die n = 0 und n = 10 Reaktionen sich um dreifach unterscheiden (kapp (n = 0) 9,9 × 10³M^–1s^–1 während kapp (n = 10) = 3,5 × 10³M^–1s^–1), waren die Produktausbeuten nach 13 Stunden bei weiten Entfernungen beinahe quantitativ. Kontrollreaktionen, die Sequenznichtübereinstimmungen enthalten, ergaben kein detektierbares Produkt (nicht gezeigt).
17 zeigt bestimmte beispielhafte DNA-Matrizen Komplexitätsbildungs-Reaktionen.
18 zeigt beispielhafte Linker für die Verwendung in dem Verfahren der Erfindung.
19 zeigt bestimmte zusätzliche beispielhafte Linker für die Verwendung in dem Verfahren der Erfindung.
20 zeigt einen beispielhaften Thioesterlinker für die Verwendung in dem Verfahren der Erfindung.
21 zeigt DNA-Matrizen Amidbindungsbildungsreaktionen, in welchen die Reagenzien und Matrizen mit Diemethyldidodecylammonium-Kationen komplexiert sind.
22 zeigt den Zusammenbau von Transfereinheiten entlang der Nukleinsäure-Matrize und Polymerisierung der Nukleotidantikodon-Anteile.
23 zeigt die Polymerisation der Dicarbamat-Einheiten entlang der Nukleinsäure-Matrize, um ein Polycarbamat zu bilden. Um die Polymerisation zu initiieren, wird das „Start” Monomer, welches in einem O-Nitrobenzylcarbamat endet, photoschutzeliminiert, um das primäre Amin freizulegen, welches die Carbamat-Polymerisierung iniziieren. Die Polymerisierung findet dann in der 5'-3' Richtung entlang des DNA Rückgrates statt, wobei jeder Nukleophile Angriff in einem nachfolgenden Entmaskieren eines neuen Aminnukleophils resultiert. Der Angriff auf das „Stopp” Monomer setzt ein Acetamid frei anstelle eines Amins, wodurch die Polymeristation beendet wird.
24 zeigt die Spaltung des Polycarbamats von dem Nukleotidrückgrat. Die Desylierung des Enol-Ether-Linkers, welcher an den Antikodon-Anteil an die Monomer-Einheit anheftet, und die Eliminierung des Phosphats, welches durch die resultierende Freisetzung des Phenols angetrieben wird, stellt das Polycarbamat bereit, welches an seinem Carboxy-Terminus an seine kodierende einzelsträngige DNA kovalent gebunden ist.
25 zeigt Komponenten einer amplifizierbaren, entwickelbaren funktionaliserenden Peptidnukleinsäure Bibliothek.
26 zeigt Testreagenzien, die verwendet werden, um Reagenzien und Bedingungen für DNA-Matrizen PNA Kopplung zu optimieren.
27 zeigt einen einfachen Satz von PNA Monomeren, die von kommerziell erhältlichen Baueinheiten abgeleitet sind, die für das Entwickeln eines PNA-basierenden Fluoreszenz Ni²⁺-Sensor nützlich sind.
28 zeigt zwei Schemata für die Selektion eines Biotin-beendeten funktionalisierten PNAs, welches in der Lage ist, eine Aldol oder Retroaldol Reaktion zu katalysieren.
29 zeigt die DNA-Matrizen-gerichtete Synthese einer kombinatorischen kleinen Molekül Bibliothek.
30 zeigt schematisch, wie DNA-gebundene kleine Molekülgerüste Sequenzspezifisch funktionalisiert werden können, durch Reaktion mit synthetischen Reagenzien, die an komplementäre Nukleinsäure Oligonukleotide gebunden sind, dieser Vorgang kann wiederholt werden, um die synthetische Transformation abzuschließen, was zu einem vollständig funktionalisierten Molekül führt.
31 zeigt die Funktionalisierung eines Cephalosporin kleinen Molekülgerüstes mit verschiedenen Reaktanten.
32 zeigt einen Weg zum Messen der Reaktionsrate zwischen einem fixen Nukleophil und einem Elektrophil, welches bei verschiedenen Distanzen entlang einer Nukleinsäure Matrize hybridisiert, um ein essenzielles Reaktionsfenster zu definieren, in welchem die Nukleinsäure-Matrizen basierende Synthese von nicht Polymeren-Strukturen stattfinden kann.
33 zeigt drei Linker-Strategien für die DNA Matrizen basierende Synthese. Bei der selbstspaltenden Linkerstrategie, wird die Bindung, die das Produkt verbindet, von dem Reagenzooligonukleotid als eine natürliche Konsequenz der Reaktion gespalten. Bei den narbenlosen und nützlichen Narben-Linkerstrategien wird diese Bindung im Anschluss an die DNA-Matrizen Reaktion gespalten. Die gezeigten Reaktionen wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert (unten). Die Bahnen 1–3 wurden unter Verwendung von UV-Licht ohne DNA Färbung visualisiert. Die Bahnen 4–10 wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid, gefolgt durch UV Transillumination visualisiert. Bedingungen: 1 bis 3: ein Äquivalent von jedem Reagenz und jeder Matrize, 0,1 M TAPS Puffer pH 8,5, 1 M NaCl, 25°C, 1,5 h, 4 bis 6: drei Äquivalente von 4, 0,1 M MES Puffer pH 7,0, 1 M NaHO₂, 10 mM AGNO₃, 37°C, 8 h; 8 bis 9: 0,1 M CAPS Puffer pH 11,8, 60 mM BME, 37°C, 2 h; 11 bis 12: 50 mM wässrige NaIO₄, 25°C, 2 h. R₁ = NH(CH₂)₂NH-Dansyl; R₂ = Biotin.
34 zeigt die Strategien für das Reinigen der Produkte der DNA-Matrizen basierenden Synthese. Unter Verwendung von biotinylierten Reagenz-Polynukleotiden werden Produkte, die von einem selbstspaltenden Linker entstehen, teilweise durch Waschen der Rohreaktion mit Avidin-gebundenen Kügelchen (Proben) gereinigt. Produkte, die von DNA-Matrizen basierenden Reaktionen unter Verwendung der narbenlosen oder nützlichen Narbenlinker erzeugt wurden, können unter Verwendung von biotinylierten Reagenz-Oligonukleotiden gereinigt werden, wobei Rohreaktionsprodukte mit Avidin-gebundenen Kügelchen eingefangen werden, und die gewünschten Produkte durch Induzieren der Linkerspaltung eluiert (unten) werden.
35 zeigt die Erzeugung eines anfänglichen Matrizenpools für eine beispielhafte Bibliotheks-Synthese.
36 zeigt die DNA-Matrizen basierende Synthese einer nicht-natürlichen Peptid-Bibliothek.
37 zeigt eine 5'-Reagenz DNA-Linker-Aminosäure.
38 zeigt die DNA-Matrizen basierende Synthese einer entwickelbaren Diversität orientierten bizyklischen Bibliothek.
39 zeigt die DNA-Matrizen basierende mehrstufige Tripeptid-Synthese. Jede DNA-Matrizen basierende Amidbildung verwendete Reagenzien, die den Sulfonlinker, der im Text beschrieben ist, enthält. Bedingungen: Schritt 1: Aktivieren zweier Äquivalente 13 in 20 mM EDC, 15 mM Sulfo-NHS, 0,1 M MES Puffer pH 55, 1 M NaCl, 10 min, 25°C, dann Hinzufügen zur Matrize in 0,1 M MOPS pH 7,5, 1 M NaCl, 25°C, 1 h; Schritte 2 und 3: Zwei Äquivalente am Reagenz, 50 mM DMT-MM, 0,1 M MOPS Puffer pH 7,0 M NaCl, 6 h, 25°C. Das gewünschte Produkt nach jedem Schritt wurde durch Einfangen auf Avidin-gebundenen Kügelchen und Eluieren mit 0,1 M CAPS Puffer pH 11,8, 60 mM BME, 37°C, 2 h gereinigt. Der Forstschritt jeder Reaktion und Reinigung wurde durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese (unten) überwacht. Die Bahnen 3, 6 und 9: Kontrollreaktionen unter Verwendung von Reagenzien, die zusammengerührte Oligonukleotid Sequenzen enthalten.
40 zeigt die nicht-peptidische DNA-Matrizen basierende mehrstufige Synthese. Die Reagenz-Linker, die in den Schritten 1, 2, und 3 verwendet wurden, waren der Diollinker, selbstspaltender Wittiglinker bzw. Sulfonlinker; siehe 1 für Linker Spaltungsbedingungen. Bedingungen: 17 bis 18: Aktivieren zweier Äquivalente 17 in 20 mM EDC, 15 mM Sulfo-NHS, 0,1 M MES Puffer pH 5,5. 1 M NaCl, 10 min, 25°C, dann Hinzufügen zu Matrize in 0,1 M MOPS pH 7,5, 1 M NaCl, 16°C, 8 h; 19 bis 21: 3 Äquivalente 20, 0,1 M TAPS pH 9,0, 3 M NaCl, 24 h, 25°C; 22 bis 23; drei Äquivalente 22, 0,1 M TAPS pH 8,5, 1 M NaCl, 21 h, 25°C. Der Fortschritt jeder Reaktion und Reinigung wurde durch denaturierende Polyacylamid Gelelektrophorese (unten) überwacht. Bahnen 3, 6 und 9: Kontrollreaktion unter Verwendung von Reagenzien, die zusammengerührte Oligonukleotidsequenzen enthalten.
41 zeigt die Verwendung von Nukleinsäuren, um die Synthese von neuen Polymeren und Kunststoffen durch Anheften der Nukleinsäuren an den Liganden eines Polymerisierungskatalysators zu lenken. Die Nukleinsäure kann in eine komplexe Struktur falten, welche die Selektivität und Aktivität des Katalysators beeinflussen.
42 zeigt die Verwendung der Grubbs' Ringöffnungs Metathese Polymerisierungskatalyse bei Entwicklung von Kunststoffen. Das synthetische Schema eines Dihydroimidazolliganden, sowie das Monomer, das in der Polymerisierungsreaktion verwendet wird, wird gezeigt.
43 zeigt die Entwicklung von Kunststoffen durch iterative Zyklen von Ligand Diversifizierung, Selektion und Amplifikation, um Polymere mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen.
44 zeigt ein beispielhaftes Schema für die Synthese, in vito Selektion und Amplifikation einer Bibliothek von Verbindungen.
45 zeigt beispielhafte Matrizen für die Verwendung in die Rekombination.
46 zeigt mehrere beispielhafte Deoxyribunukleotide und Ribonukleotide, die Modifikationen an Gruppen tragen, die nicht in Watson-Crick Wasserstoffbindungen teilnehmen, und bekannten, mit einer hohen Sequenzgenauigkeit gegenüber natürlichen DNA-Matrizen eingefügt zu werden.
47 zeigt beispielhafte Metallbindungs-Uridin- und 7-Deazaadenosin Analoga.
48 zeigt die Synthese von Analogon (7).
49 zeigt die Synthese von Analogon (30).
50 zeigt die Synthese von 8-modifizierten Deoxyadenosintriphosphaten.
51 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung, die die Akzeptanz von modifizierten Nukleotiden durch DNA Polymerasen evaluiert.
52 zeigt die Synthese von 7-Deazaadenosin-Derivaten.
53 zeigt bestimmte beispielhafte Nukleotidtriphosphate.
54 zeigt ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Bibliotheken von Metallbindungs-Polymeren.
55 und 56 zeigt ein beispielhaftes Schema für die in vitro-Selektion auf nicht natürliche Polymer-Katalysatoren.
57 zeigt ein beispielhaftes Schema für die in vitro Selektion von Katalysatoren für Heck Reaktionen, Hetero-Diels-Alder Reaktionen und Aldol Additionen.
Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
Wie oben diskutiert ist, wäre es wünschenswert, in der Lage zu sein, chemische Verbindungen zu entwickeln und zu amplifizieren, einschließlich ohne auf kleine Moleküle und Polymere beschränkt zu sein, auf dieselbe Art und Weise, wie Biopolymere, wie Polynukleotide und Proteine, entwickelt und amplifiziert werden können. Es wurde demonstriert, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese ein mögliches Mittel zum Translatieren der Information in einer DNA Sequenz in ein synthetisches kleines Molekül bereitstellt. Im Allgemeinen können DNA-Matrizen, die an einem Reaktant gebunden sind, in der Lage sein, eine zweite reaktive Gruppe, die an ein komplementäres DNA Molekül gebunden ist, zu rekrutieren, um ein Produkt zu ergeben. Da die DNA Hybridisierung Sequenz-spezifisch ist, ist das Ergebnis der DNA-Matrizen basierenden Reaktion die Translation einer spezifischen DNA-Sequenz in ein entsprechendes Reaktions-Produkt. Wie in 2 gezeigt ist, wurde die Fähigkeit von einsträngigen Nukleinsäure-Matrizen, die Sequenz-spezifische Oligomerisierung von komplementären Oligonukleotiden zu katalysieren (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666; T. Inou et al. J. Mol. Biol. 1984, 178, 669–76) demonstriert. Diese Entdeckung wurde bald von den Ergebnissen gefolgt, dass DNA oder RNA Matrizen die Oligomerisierung von komplementären DNA oder RNA Mono-, Di-, Tri-, oder Oligonukleotiden katalysieren könnten (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666; L. E. Orgel et al. Acc, Chem. Res. 1995, 28, 109–118; H. Rembold et al. J. Mol. Evol. 1994, 38, 205; L. Rodriguez et al. J. Mol. Evol. 1991, 33, 477; C. B. Chen et al. J. Mol. Biol. 1985, 181, 271). DNA oder RNA Matrizen haben seit damals gezeigt, die Bildung einer Vielzahl von nicht-natürlichen Nukleinsäuren Analoga, einschließlich Peptid-Nukleinsäuren (C. Bohler et al. Nature 1995, 376, 578), Phosphorothioat-(M. K. Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151–10152), Phosphorselenat-(Y. Xu et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9040–9041; Y. Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148–152) und Phophoramidat-(A. Luther et al. Nature 1998, 396, 245–8) enthaltende Nukleinsäuren, nicht-Ribose Nukleinsäuren (M. Bolli et al. Chem. Biol. 1997, 4, 309–20), und DNA Analoga, in welchen eine Phosphatbindung mit einer Aminoethyl-Gruppe ausgetauscht wurde (Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19–28) zu beschleunigen. Nukleinsäure-Matrizen können Amin-Acylierung zwischen Nukleotid-Analoga ebenfalls katalysieren (R. K. Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49–56).
Obwohl die Fähigkeit von Nukleinsäure-Matrizen, die Bildung einer Vielzahl von nicht-natürlichen Nukleinsäure-Analoga zu beschleunigen, demonstriert wurde, wurden beinahe alle dieser Reaktionen, von denen früher gezeigt wurde, dass sie durch Nukleinsäure-Matrizen katalysiert werden, konstruiert, um über Übergangszustände zu verlaufen, die der Struktur des natürlichen Nukleinsäure-Rückgrates stark ähnelt (2), die üblicherweise Produkte liefern, die denselben 6-Bindungsrückgratsabstand zwischen den Nukleotideinheiten konservieren. Die Motivation hinter dieser Konstruktion war vermutlich die Annahme, dass die durch die Nukleinsäure Matrizen bereitgestellte Ratenerhöhung von einer präzisen Ausrichtung der reaktiven Gruppen abhängt, und die Präzision dieser Ausrichtung maximiert ist, wenn die Reaktanten und Produkte die Struktur der DNA und RNA Rückgrate nachahmen. Unterstützende Hinweise der Hypothese, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese nur Produkte erzeugen kann, die den Nukleinsäure-Rückgraten ähnelt, kommt von der bekannten Schwierigkeit der Makrozyklisierung in der organischen Synthese (G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95–102; R. B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210–3213). Die Ratenerhöhung von intramolekularen Ringschlussreaktionen, im Vergleich mit ihren intermolekularen Gegenstücken, ist bekannt schnell abzunehmen, wie rotierbare Bindungen zwischen reaktiven Gruppen hinzugefügt werden, so dass Verbindungsreaktanten mit einem flexiblem 14-Kohlenstofflinker kaum eine Ratenbeschleunigung ergeben (G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95–102).
Da normalerweise synthetische Moleküle von Interesse Nukleinsäure Rückgraten nicht ähneln, würde die Verwendung der DNA-Matrizen basierende Synthese, um DNA-Sequenzen in synthetische kleine Moleküle zu translatieren, nur allgemein nützlich sein, wenn synthetische Moleküle außer Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Analoga in einer DNA-Matrizen basierenden Art und Weise synthetisiert werden können. Die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese, DNA-Sequenzen in willkürliche nicht-natürliche kleine Moleküle zu translatieren, erfordert deshalb, das Demonstrieren, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese ein viel allgemeineres Phänomen ist, als früher beschrieben wurde.
Signifikanterweise wurde hierin für das erste Mal demonstriert, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese tatsächlich ein allgemeines Phänomen ist und für eine Vielzahl von Reaktionen und Bedingungen verwendet werden kann, um eine diverse Kollektion an Verbindungen zu erzeugen, einschließlich für das erste Mal besonders Verbindungen, die keine Nukleinsäuren oder Analoga davon sind, oder diesen nicht ähnlich sind. Insbesondere erweitert die folgende Erfindung die Fähigkeit, Bibliotheken von chemischen Verbindungen jenseits von natürlichen Biopolymeren zu amplifizieren und zu entwickeln. Die Fähigkeit, chemische Verbindungen mit willkürlicher Struktur zu synthetisieren, ermöglicht Forschern, ihren eigenen genetischen Code zu schreiben, der eine große Auswahl an chemischer Funktionalität in ein neuartiges Rückgrat und Seitenkettenstrukturen einbaut, welcher die Entwicklung von neuartigen Katalysatoren, Arzneimitteln und Polymeren, um eigene Beispiel zu nennen, ermöglicht. Zum Beispiel ermöglicht die Fähigkeit, diese Moleküle durch genetische Selektion direkt zu amplifizieren und zu entwickeln, die Entdeckung von komplett neuen Familien von künstlichen Katalysatoren, welche eine Aktivität, Bioverfügbarkeit, Lösungsmittel, oder thermische Stabilität oder andere physikalische Eigenschaften (wie Fluorescenz, Spin-Markierung, oder Photolabilität) besitzen, die unter Verwendung des limitierten Satzes von natürlichen Protein- und Nukleinsäure-Baueinheiten schwierig oder unmöglich zu erreichen sind. Auf ähnliche Weise ermöglicht das Entwickeln von Verfahren, um synthetische kleine Moleküle durch wiederholende Zyklen von Mutation und Selektion zu amplifizieren und direkt zu entwickeln, die Isolation von neuartigen Liganden oder Arzneimitteln mit Eigenschaften, die jenen, die durch traditionelle rationale Entwicklung oder kombinatorische Screening-Arzneimittelentdeckungsverfahren isoliert wurden, überlegen sind. Zusätzlich würde das Ausdehnen der Ansätze, die hierin beschrieben sind, auf Polymere von Signifikanz in der Materialwissenschaft, die Entwicklung von neuen Kunststoffen ermöglichen.
Im Allgemeinen beinhaltet das Verfahren der Erfindung 1) das Bereitstellen einer oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen, welche eine oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen gegebenenfalls eine reaktive Einheit, die damit assoziiert ist, aufweise; und 2) das Kontaktieren der einen oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen mit einer oder mehreren Transfereinheiten, die ausgebildet sind, um einen ersten Anteil, ein Antikodon, zu haben, welches an eine Sequenz der Nukleinsäure hybridisiert, und mit einem zweiten Anteil, einer reaktiven Einheit, assoziiert ist, welche spezifische Funktionalität enthält, einer Baueinheit, einem Reaktant, etc. für die zu synthetisierende Verbindung. Es ist erkennbar, dass in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung, die Transfereinheit einen Anteil aufweist, der die Hybridisierungsfähigkeit der Antikoden-Einheit und die chemische Funktionalität der Reaktionseinheit umfasst. Sobald diese Transfereinheiten an die Nukleinsäure-Matrize in einer Sequenz-spezifischen Art und Weise hybridisiert haben, kann die Synthese der chemischen Verbindung aufgrund der Interaktion der auf den Transfereinheiten und/oder der Nukleinsäure-Matrize vorhandenen reaktiven Einheiten stattfinden. Signifikanterweise kann die Sequenz der Nukleinsäure später bestimmt werden, um die synthetische Historie der angelagerten Verbindung und dadurch ihre Struktur zu dekodieren. Es ist erkennbar, dass das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden kann, um jeweils ein Molekül zu synthetisieren oder kann verwendet werden, um Tausende bis Millionen von Verbindungen unter Verwendung von kombinatorischen Verfahren zu synthetisieren.
Es ist erkennbar, dass eine Vielzahl von chemischen Verbindungen gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt und entwickelt werden kann. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die Verfahren jedoch für die Synthese von chemischen Verbindungen, die keine Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga sind, oder diesen nicht ähnlich sind, benutzt. Zum Beispiel können in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kleine Molekülverbindungen durch Bereitstellen einer Matrize, welche eine damit assoziierte reaktive Einheit (z. B. Baueinheit oder kleines Molekülgerüst hat) (direkt oder durch einen Linker, wie detaillierter in Beispiel 5 hierin beschrieben ist, gebunden) aufweist, und gleichzeitiges oder sequenzielles Kontaktieren der Matrize mit einer oder mehreren damit assoziierten reaktiven Einheiten, synthetisiert werden. In bestimmten anderen Ausführungsformen können nicht-natürliche Polymere durch Bereitstellen einer Matrize und gleichzeitiges Kontaktieren der Matrize mit einer oder mehreren Transfereinheiten mit einer oder mehreren damit assoziierten reaktiven Einheiten unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Reaktion der benachbarten reaktiven Einheiten auf jeder der Transfereinheiten zu bewirken, synthetisiert werden (siehe z. B. 3 und Beispiele 5 und 9, wie hierin in detaillierter beschrieben ist).
Bestimmte Ausführungsformen werden detaillierter unten diskutiert; es ist jedoch erkennbar, dass die vorliegende Erfindung nicht beabsichtigt ist, auf jene Ausführungsformen, die unten diskutiert sind, beschränkt zu sein. Vielmehr ist die vorliegende Erfindung beabsichtigt, diese Ausführungsformen und Äquivalente davon zu umfassen.
Matrizen
Wie oben diskutiert ist, werden eine oder mehrere Nukleinsäure-Matrizen in dem Verfahren der Erfindung benutzt, und Hybridisieren an die Transfereinheiten, um die Synthese der chemischen Verbindung zu lenken. Wie ein Fachmann erkennen wird, kann jede Nukleinsäure-Matrize in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Matrizen, welche mutiert und dadurch entwickelt sein können, können verwendet werden, um die Synthese einer anderen chemischen Verbindung oder Bibliothek von chemischen Verbindungen, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, zu führen. Wie hierin im größeren Detail beschrieben ist, kodiert die entwickelbare Matrize die Synthese einer chemischen Verbindung und kann später verwendet werden, um die synthetische Historie der chemischen Verbindung zu dekodieren, um die chemische Verbindung indirekt zu amplifizieren, und/oder um die chemische Verbindung zu entwickeln (d. h. Diversifizieren, Selektieren, und Amplifizieren).
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure-Matrizen sind aus DNA, RNA, ein Hybrid von DNA und RNA, oder einem Derivat von DNA und RNA hergestellt, und können einzel- oder doppelsträngig sein. Die Sequenz der Matrize wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, um die Synthese einer chemischen Verbindung, vorzugsweise einer Verbindung, die keine Nukleinsäure oder Nukleinsäure-Analogon (z. B. ein unnatürliches Polymer oder ein kleines Molekül) ist, oder diesen nicht ähnelt, zu kodieren. In dem Fall von bestimmten unnatürlichen Polymeren wird die Nukleinsäure-Matrize verwendet, um die Monomer-Einheiten in der Sequenz, auszurichten, wie sie in dem Polymer erscheinen werden, und um sie in nahe Umgebung mit benachbarten Monomer-Einheiten entlang der Matrize zu bringen, so dass sie reagieren werden und durch kovalente Bindung verbunden werden. In dem Fall eines kleinen Moleküls wird die Matrize verwendet, um bestimmte Reaktanten in die Nähe des kleinen Molekülgerüstes zu bringen, so dass sie das Gerüst auf eine bestimmte Art und Weise modifizieren können. In bestimmten anderen Ausführungsformen, kann die Matrize benutzt werden, um nicht-natürliche Polymere durch PCR-Amplifikation einer synthetischen DNA-Matrizen Bibliothek, welche aus zufälligen Nukleotid-Regionen besteht, wie hierin in Beispiel 9 beschrieben ist, zu erzeugen.
Wie ein Fachmann erkennen kann, kann die Sequenz der Matrize auf eine Vielzahl von Wegen konstruiert werden, ohne den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Zum Beispiel muss die Länge des Kodons bestimmt werden und die Kodonsequenz muss eingestellt werden. Wenn eine Kodonlänge von zwei verwendet wird, dann sind unter Verwendung der vier natürlich vorkommenden Basen nur 16 mögliche Kombinationen verfügbar, die beim Kodieren der Bibliothek verwendet werden können. Wenn die Länge des Kodons auf drei erhöht wird (die Anzahl, die die Natur beim Kodieren von Proteinen verwendet wird) erhöht sich die Anzahl von möglichen Kombinationen auf 64. Andere Faktoren, die beim Bestimmten der Länge des Kodons zu beachten sind, sind Nichtübereinstimmung, Rahmenverschiebung, Komplexität der Bibliothek, etc. Wie die Länge des Kodons bis zu einem bestimmten Ausmaß erhöht wird, wird die Anzahl der Nichtübereistimmungen verringert; übermäßige-lange Kodons werden jedoch trotz nichtübereinstimmenden Basenpaaren hybrisieren. In bestimmten Ausführungsformen von speziellem Interesse reicht die Länge des Kodons von 2 bis 10 Basen.
Ein anderes mit der Verwendung einer Nukleinsäure-Matrize assoziiertes Problem ist die Rahmenverschiebung. Das Problem der Rahmenverschiebung in der Translation eines Proteins von einer mRNA wird in der Natur durch die Verwendung der komplexen Maschinerie der Ribosome vermieden. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden jedoch nicht eine solche komplexe Maschinerie ausnutzen. Anstelle wird die Rahmenverschiebung durch verlängern jedes Kodons beseitigt, so dass die Hybridisierung eines Kodons außerhalb des Rahmen eine Nichtübereinstimmung garantieren wird. Zum Beispiel kann jedes Kodon mit einem G beginnen, und nachfolgende Positionen können auf T, C und A beschränkt sein (4). In einem anderen Beispiel kann jedes Kodon mit einem G beginnen und enden, und nachfolgende Positionen können auf T, C und A beschränkt sein. Ein anderer Weg zum Vermeiden der Rahmenverschiebung ist, ein ausreichend langes Kodon zu haben, so dass die Sequenz des Kodons nur innerhalb der Sequenz der Matrize „im Rahmen” gefunden wird. Spacer-Sequenzen können ebenfalls zwischen die Kodons platziert sein, um die Rahmenverschiebung zu verhindern.
Es ist erkennbar, dass die Matrize in der Anzahl der Basen stark variieren kann. Zum Beispiel kann in bestimmten Ausführungsformen die Matrize eine Länge von 10 bis 10.000 Basen, vorzugsweise eine Länge zwischen 10 und 1.000 Basen aufweisen. Die Länge der Matrize wird natürlich von der Länge der Kodons, der Komplexität der Bibliothek, der Länge des zu synthetisierenden unnatürlichen Polymers, de Komplexität der zu synthetisierenden kleinen Moleküle, die Verwendung von Spacer-Sequenzen, etc. abhängen. Die Nukleinsäure-Sequenz kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, um Nukleinsäure herzustellen, hergestellt werden. Zu diesen Verfahren zählen sowohl in vivo als auch in vitro-Verfahren, einschließlich PCR, Plasmid-Präparation, Endonuklease-Verdau, Festphasensynthese, in vitro Transkription, Strangtrennung etc. In bestimmten Ausführungsformen wird die Nukleinsäure-Matrize unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthetisierers synthetisiert.
Wie oben diskutiert ist, wird in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung, das Verfahren verwendet, um chemische Verbindungen zu synthetisieren, die keine Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga sind, oder diesen nicht ähnlich sind. Obwohl es demonstriert wurde, da die DNA-Matrizen basierende Synthese benutzt werden kann, um die Synthese von Nukleinsäuren und Analoga davon zu lenken, wurde es früher nicht demonstriert, dass das Phänomen der DNA-Matrizen basierenden Synthese allgemein genug ist, um sich auf komplexere chemische Verbindungen (z. B. kleine Moleküle, nicht-natürliche Polymere) zu erstrecken. Wie hierin detaillierter beschrieben ist, wurde demonstriert, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese tatsächlich ein allgemeineres Phänomen ist, und dass eine Vielzahl von Reaktionen ausgenutzt werden können.
Somit weist in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Nukleinsäure-Matrize Sequenzen von Basen auf, die die Synthese eines unnatürlichen Polymers oder kleinen Moleküls kodieren. Die in der Nukleinsäure-Matrize kodierte Nachricht beginnt vorzugsweise mit einem spezifischen Kodon, dass eine chemisch reaktive Stelle an eine Stelle bringt, von welcher die Polymerisation stattfinden kann, oder im Fall des Synthetisieren eines kleinen Moleküls kann das „Start” Kodon ein Antikodon kodieren, welches mit einem kleinen Molekülgerüst oder einem ersten Reaktanten assoziiert ist. Das „Start” Kodon der vorliegenden Erfindung ist ein Analogon zu dem „Start” Kodon, ATG, welches in der Natur gefunden wird, welches die Aminosäure Methionin kodiert. Um nur ein Beispiel für die Verwendung zum Synthetisieren einer unnatürlichen Polymerbibliothek zu geben, kann das Startkodon eine Start-Monomer Einheit kodieren, welche ein primäres Amin aufweist, welches durch eine photolabile Schutzgruppe maskiert ist, wie unten in Beispiel 5A gezeigt ist.
In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die Nukleinsäure-Matrize selbst modifiziert sein, um eine Initiationsstelle für die Polymer-Synthese (z. B. ein Nukleophil) oder ein kleines Molekülgerüst enthalten. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Nukleinsäure-Matrize eine Haarnadelschleife an einem ihrer Enden, die in einer reaktiven Gruppe endet, die verwendet wird, um die Polymerisierung der Monomer-Einheiten zu initiieren. Zum Beispiel kann eine DNA-Matrize eine Haarnadelschleife aufweisen, die in einer 5' Aminogruppe endet, welche geschützt sein kann oder nicht. Von der Aminogruppe kann die Polymerisierung des unnatürlichen Polymers beginnen. Die reaktive Aminogruppe kann ebenfalls verwendet werden, um ein kleines Molekülgerüst auf eine Nukleinsäure-Matrize zu binden, um eine kleine Molekülbibliothek zu synthetisieren.
Um die Synthese des unnatürlichen Polymers zu beenden, sollte ein „Stopp” Kodon in der Nukleinsäure-Matrize, vorzugsweise am Ende der kodierenden Sequenzen, enthalten sein. Das „Stopp” Kodon der vorliegenden Erfindung ist analog zu den „Stopp” Kodons (d. h. TAA, TAG, TGA), die in mRNA Transkripten gefunden werden. In der Natur führen diese Kodon zu dem Abbruch der Proteinsynthese. In bestimmten Ausführungsformen wird ein „Stopp” Kodons ausgewählt, das mit dem, um das unnatürliche Polymer zu kodieren verwendeten künstlichen genetischen Code kompatibel ist. Zum Beispiel sollte das „Stopp” Kodon nicht mit anderen Kodons kollidieren, die verwendet werden, um die Synthese zu kodieren, und es sollte von dem gleichen allgemeinen Format sein, wie die anderen in der Matrize verwendeten Kodons. Das „Stopp” Kodon kann eine Monomer-Einheit kodieren, die die Polymerisierung durch das Nicht-Bereitstellen einer reaktiven Gruppe für die weitere Anbindung beendet. Zum Beispiel kann eine Stopp-Monomer-Einheit eine blockierte reaktive Gruppe, wie ein Acetamid anstelle eines primären Amins, wie in Beispiel 5a unten gezeigt ist, enthalten. In noch anderen Ausführungsformen weist die Stopp-Monomer-Einheit einen biotinylierten Terminus auf, der einen angenehmen Weg zum Beendigen des Polymerisierungsschrittes und zum Reinigen des resultierenden Polymers bereitstellt.
Transfer-Einheit
Wie oben beschrieben ist, werden in dem Verfahren der Erfindung ebenfalls Transfereinheiten bereitgestellt, welche ein Antikodon und eine reaktive Einheit aufweisen. Es ist erkennbar, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikodons konstruiert sind, um zu den Kodons komplementär zu sein, die innerhalb der Nukleinsäure-Matrize vorhanden sind, und sollten unter Berücksichtigung der Nukleinsäure-Matrize und der Kodons, die darin verwendet werden, konstruiert werden. Zum Beispiel müssen die in der Matrize verwendeten Sequenzen sowie die Länge der Kodons beim Entwickeln der Antikodons berücksichtigt werden. Jedes Molekül, welches zu einem Kodon komplementär ist, welches in der Matrize verwendet wird, kann in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden (z. B. Nukleotide oder nicht-natürliche Nukleotide). In bestimmten Ausführungsformen weisen die Kodons eine oder mehrere in der Natur gefundenen Basen auf (d. h. Thymidin, Uracil, Guanidin, Cytosin, Adenin). In bestimmten anderen Ausführungsformen weist das Antikodon ein oder mehrere Nukleotide auf, die normalerweise in der Natur mit einer Base, einem Zucker und einer wahlweisen Phosphatgruppe gefunden werden. In noch anderen Ausführungsformen werden die Basen entlang eines Rückgrates aufgereiht, welches kein Zucker-Phosphat-Rückgrat ist, welches normalerweise in der Natur gefunden wird (z. B. nicht natürliche Nukleotide).
Wie oben diskutiert ist, ist das Antikodon mit einer besonderen Art von reaktiven Einheit assoziiert, um eine Transfereinheit zu bilden. Es ist erkennbar, dass diese reaktive Einheit eine eindeutige Einheit repräsentieren kann oder Teil der Funktionalität der Antikodon-Einheit sein kann (siehe Beispiel 9). In bestimmten Ausführungsformen ist jede Antikodon-Sequenz mit einer Monomerart assoziiert. Zum Beispiel kann die Antikodon-Sequenz ATTAG mit einem Carbamat-Rest mit einer Isobutyl-Seitenkette assoziiert sein, und die Antikodon-Sequenz CATAG kann mit einem Carbamat-Rest mit einer Phenylseitenkette assoziiert sein. Diese Eins-für-Eins Kartierung von Antikodon zu Monomer-Einheiten ermöglicht, dass jedes Polymer der Bibliothek durch Sequenzieren der Nukleinsäure-Matrize, die in der Synthese verwendet wird, dekodiert wird und ermöglicht, dass dasselbe Polymer oder ein verwandtes Polymer durch Wissen der Sequenz des ursprünglichen Polymers synthetisiert wird. Es wird durch einen Fachmann erkannt, dass durch Ändern (z. B. Mutieren) der Sequenz der Matrize, unterschiedliche Monomer-Einheiten an die Stelle gebracht werden, wodurch die Synthese von verwandten Polymeren ermöglicht wird, welche im Anschluss selektiert und entwickelt werden können. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können mehrere Antikodons eine Monomer-Einheit, wie in der Natur der Fall ist, kodieren.
In bestimmten anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wo eine kleine Molekülbibliothek erzeugt werden soll, anstelle einer Polymer-Bibliothek, ist das Antikodon mit einem Reaktant, welches verwendet wird, um das kleine Molekülgerüst zu modifizieren, assoziiert. In bestimmten Ausführungsformen ist der Reaktant mit dem Antikodon durch einen Linker assoziiert, der lang genug ist, um den Reaktant zu ermöglichen, in Kontakt mit dem kleinen Molekülgerüst zu kommen. Der Linker sollte vorzugsweise eine solche Länge und Zusammensetzung aufweisen, um intramolekular Reaktionen zu ermöglichen und um intermolekular Reaktionen zu minimieren. Die Reaktanten enthalten eine Vielzahl von Reagenzien, wie durch eine große Anzahl von Reaktionen demonstriert wird, die in der DNA-Matrizen basierenden Synthese ausgenutzt werden können (siehe Beispiele 2, 3 und 4 hierin) und können eine beliebige chemische Gruppe, Katalysator (z. B. organmetallische Verbindung) oder reaktiver Anteil (z. B. Elektrophile, Nukleophile), die auf dem chemischen Gebiet bekannt sind, sein.
Zusätzlich kann die Assoziation zwischen dem Antikodon und der Monomeren-Einheit, oder Reaktant in der Transfereinheit kovalent oder nicht-kovalent sein. In bestimmten Ausführungsformen von speziellem Interesse ist die Assoziation durch eine kovalente Bindung und in bestimmten Ausführungsformen ist die kovalente Bindung trennbar. Die Bindung kann durch Licht, Oxidation, Hydrolyse, Exposition zu Säure, Exposition zu Base, Reduktion, gespalten werden. Für Beispiele von Bindungen, die in diesem Fach verwendet werden, siehe bitte Fruchtel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 17, 1996. Das Antikodon und die Monomer-Einheit oder Reaktant können durch nicht-kovalten Interaktionen, wie ionische, elektrostatische, Wasserstoffbindung, van der Waals Interaktionen, hydrophobe Interaktionen, pi-stacking, etc. und Kombinationen davon, assoziiert sein. Um nur ein Beispiel zu geben, kann das Antikodon an Biotin gebunden sein, und die Monomer-Einheit kann an Streptavidin gebunden sein. Die Neigung von Streptavidin an Biotin zu binden, führt zu einer nicht kovalenten Assoziation zwischen dem Antikodon und der Monomer-Einheit, um eine Transfer-Einheit zu bilden.
Synthese von bestimmten beispielhaften Verbindungen
Es ist erkennbar, dass eine Vielzahl von Verbindungen und/oder Bibliotheken unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung hergestellt werden können. Wie oben diskutiert ist, werden in bestimmten Ausführungsformen von speziellem Interesse Verbindungen, die keine Nukleinsäuren oder Analoga davon sind, und diesen nicht ähneln, gemäß dem Verfahren der Erfindung synthetisiert.
In bestimmten Ausführungsformen werden Polymere, insbesondere unnatürliche Polymere gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt. Die unnatürlichen Polymere, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Systems erzeugt werden können, enthalten jedes nicht-natürliche Polymer. Beispielhafte unnatürliche Polymere enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Polycarbamate, Polyharnstoffe, Polyester, Polyacrylate, Polyalkylene (z. B. Polyethylen, Polypropylen), Polycarbonate, Polypeptide mit unnatürlicher Stereochemie, Polypeptide mit unnatürlichen Aminosäuren, und Kombinationen davon. In bestimmen Ausführungsformen weisen die Polymere zumindest zehn Monomer-Einheiten auf. In bestimmten anderen Ausführungsformen weisen die Polymere zumindest 50 Monomer-Einheiten auf. In noch anderen Ausführungsformen weisen die Polymeren zumindest 100 Monomer-Einheiten auf. Die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Systems synthetisierten Polymere können als Katalysator, Pharmazeutika, Metallchelatoren, Materialien, etc. verwendet werden.
Beim Herstellen bestimmter unnatürlicher Polymere, können die Monomer-Einheiten, die an die Antikodons angeheftet sind, und in der vorliegenden Erfindung ein beliebiges verwendet wurden, Monomer oder Oligomer sein, das in der Lage ist, zusammengebunden zu werden, um ein Polymer zu bilden. Die Monomer-Einheiten können Carbamate, D-Aminosäuren, unnatürliche Aminosäuren, Harnstoffe, Hydroxysäuren, Ester, Carbonate, Acrylate, Ether, etc. sein. In bestimmten Ausführungsformen weisen die Monomer-Einheiten zwei reaktive Gruppen auf, die verwendet werden, um die Monomer-Einheit in die wachsende Polymerkette zu binden. Vorzugsweise sind die reaktiven Gruppen nicht dieselben, so dass die Monomer-Einheit in das Polymer in einer direktionalen Richtung eingebaut wird, z. B. kann an einem Ende ein Elektrophil sein und an dem anderen Ende ein Nukleophil. Zu reaktiven Gruppen können, ohne darauf beschränkt zu sein, Ester, Amide, Carbonsäuren, aktivierte Carbonylgruppen, Säurechloride, Amine, Hydroxylgruppen, Thiole etc. zählen. In bestimmten Ausführungsformen sind die reaktiven Gruppen maskiert oder geschützt (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3. Ausgabe Wiley, 1999), so dass die Polymerisierung bis zu einem gewünschten Zeitpunkt nicht stattfinden kann, wenn die reaktiven Gruppen schutzeliminiert werden. Sobald die Monomer-Einheiten entlang der Nukleinsäure-Matrize zusammengebaut sind, resultiert die Initiierung der Polymerisierungssequenz in einer Kaskade von Polymerisierungs- und Schutzeliminierungsschritten, wobei der Polymerisierungsschritt zu der Schutzeliminierung einer reaktiven Gruppe führt, die in einem nachfolgenden Polymerisierungsschritt verwendet wird (siehe 3).
Die zu polymerisierenden Monomer-Einheiten können zwei oder mehrere Einheiten aufweisen, in Abhängigkeit von der Geometrie entlang der Nukleinsäure-Matrize. Wie durch einen Fachmann erkennbar ist, müssen die zu polymerisierenden Monomer-Einheiten in der Lage sein, sich entlang der Nukleinsäure-Matrize und insbesondere über die Entfernung, die durch sein kodierendes Antikodon und wahlweisen Spacersequenz umspannt ist, zu erstrecken. In bestimmten Ausführungsformen weist die Monomer-Einheit tatsächlich zwei Monomere auf, z. B. ein Dicarbamat, ein Diharnstoff, ein Dipeptid, etc. In noch anderen Ausführungsformen weist die Monomer-Einheit tatsächlich drei oder mehrere Monomere auf.
Die Monomer-Einheiten können jede chemische Gruppe, die im Stand der Technik bekannt ist, enthalten. Wie durch einen Fachmann erkennbar ist, werden reaktive chemische Gruppen, insbesondere jene, die mit der Polymerisierung, Hybridisierung, etc. interferieren würden, unter Verwendung bekannter Schutzgruppen maskiert (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3 Ausgabe Wiley 1999). Im Allgemeinen sind die Schutzgruppen, die verwendet werden, um diese reaktiven Gruppen zu maskieren, orthogonal zu jenen, die zum Schützen der Gruppen verwendet werden, die in den Polymerisierungsschritten verwendet werden.
Beim Synthetisieren eines unnatürlichen Polymers wird in bestimmten Ausführungsformen eine Matrize bereitgestellt, die die Sequenz von Monomer-Einheiten kodiert. Den Transfer-Einheiten wird dann ermöglicht, die Matrize unter Bedingungen zu kontaktieren, die eine Hybridisierung der Antikodons an die Matrize ermöglichen. Der Polymerisierung der Monomereinheiten entlang der Matrize wird dann ermöglicht stattzufinden, um das unnatürliche Polymer zu bilden. Das neu synthetisierte Polymer kann dann von den Antikodons und/oder der Matrize gespalten werden. Die Matrize kann dann als ein Tag verwendet werden, um die Struktur des Polymer aufzuklären oder kann verwendet werden, um das unnatürliche Polymer zu amplifizieren und zu entwickeln. Wie unten detaillierter beschrieben ist, kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um eine Bibliothek von unnatürlichen Polymeren herzustellen. Zum Beispiel kann in bestimmten Ausführungsformen, wie in Beispiel 9 hierin detaillierter beschrieben ist, eine Bibliothek von DNA-Matrizen benutzt werden, um unnatürliche Polymere herzustellen. Im Allgemeinen nutzt das Verfahren die Tatsache aus, dass bestimmte DNA-Polymerasen in der Lage sind, bestimmte modifizierte Nukleotidtriphosphat-Substrate zu akzeptieren, und das mehrere Deoxyribonnuekleotide und Ribonukleotide, die modifizierte Gruppen tragen, nicht in Watson-Crick Bindung teilnehmen, dafür bekannt sind, mit hoher Sequenzspezifität gegenüber natürlichen DNA-Matrizen eingebaut zu werden. Dementsprechend können einzelsträngige DNA, die modifizierte Nukleotide enthalten, als wirksame Matrizen für den DNA-Polymerase katalysierten Einbau von natürlichen oder modifizierten Nukleotiden dienen.
Es ist erkennbar, dass die erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls verwendet werden können, um andere Klassen von chemischen Verbindungen abgesehen von unnatürlichen Polymeren zu synthetisieren. Zum Beispiel können kleine Moleküle unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung vorgesehen sind, hergestellt werden. Diese kleinen Moleküle können Naturprodukt-ähnlich, nicht polymer, und/oder nicht-oligomer sein. Das beachtliche Interesse an kleinen Molekülen ist teilweise aufgrund ihrer Verwendung als aktive Wirkstoffe in vielen pharmazeutischen Zubereitungen, obwohl sie ebenfalls als Katalysatoren, Materialien, Zusatzstoffen, etc. verwendet werden können.
Zum Synthetisieren kleiner Moleküle unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine entwickelbare Matrize ebenfalls bereitgestellt. Die Matrize kann entweder ein kleines Molekülgerüst aufweisen, auf welches das kleine Molekül aufgebaut wird, oder ein kleines Molekülgerüst kann zu der Matrize hinzugefügt werden. Das kleine Molekülgerüst kann jede chemische Verbindung mit Stellen für die Funktionalisierung sein. Zum Beispiel kann das kleine Molekülgerüst ein Ringsystem (zum Beispiel, das ABCD Steroidringsystem, das in Cholesterol gefunden wird) mit funktionalisierbaren Gruppen von den Atomen, die den Ring ausmachen aufweisen. In einem anderen Beispiel kann das kleine Molekül die zugrundeliegende Struktur eines pharmazeutischen Wirkstoffes wie Morphin oder ein Cephalosporin Antibiotikum sein (siehe Beispiele 5C und 5D, unten). Die zu funktionalisierenden Stellen oder Gruppen auf dem kleinen Molekülgerüst können unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren und Schutzgruppen geschützt werden. Die in dem kleinen Molekülgerüst verwendeten Schutzgruppen können zueinander orthogonal sein, so dass die Schutzgruppen, eine nach den anderen, entfernt werden kann.
In dieser Ausführungsform weisen die Transfer-Einheiten ein Antikodon auf, welches ähnlich zu jenen ist, die in der unnatürlichen Polymersynthese beschrieben sind; jedoch sind diese Antikodons mit Reaktanten oder Baueinheiten assoziiert, um bein Modifizieren, beim Hinzufügen oder beim Wegnehmen von dem kleinen Molekülgerüst verwendet zu werden. Die Reaktanten oder Baueinheiten können Elektrophile (z. B. Acetyl, Amide, Säurechloride, Ester, Nitrile, Imine), Nukleophile (z. B. Amine, Hydroxyl-Gruppen, Thiole), Katalysatoren (z. B. organometallische Katalysatoren), Seitenketten etc. sein. Siehe zum Beispiel Reaktionen in wässrigen und organischen Medien, wie hierin in den Beispielen 2 und 4 beschrieben ist. Den Transfer-Einheiten wird ermöglicht, die Matrize unter Hybridisierungsbedingungen zu kontaktieren, und dem angehefteten Reaktant oder der angehefteten Baueinheit wird es ermöglicht, mit einer Stelle auf dem kleinen Molekülgerüst zu reagieren. In bestimmten Ausführungsformen werden die Schutzgruppen auf der kleinen Molekül-Matrize, eine nach dem anderen, von der zu funktionalisierenden Stellen entfernt, so dass der Reaktant der Transfer-Einheit nur an der gewünschten Position auf dem Gerüst reagieren wird. Wie durch einen Fachmann erkennbar ist, kann das Antikodon mit dem Reaktant durch einen Linkeranteil assoziiert sein (siehe Beispiel 3). Der Linker erleichtert den Kontakt des Reaktanten mit dem kleinen Molekülgerüst und in bestimmten Ausführungsformen, abhängig von der gewünschten Reaktion, positionierte die DNA als eine Abgangsgruppe („selbstspaltbare” Strategie), oder kann die reaktiven Gruppen an die Matrize über die „narbenlose” Linkerstrategie binden (welche Produkt ergibt, ohne eine zusätzliche chemische Funktionalität zurückzulassen), oder eine „nützliche Narben” Strategie, (in welcher der Linker zurückgelassen wird und in nachfolgenden Schritten im Anschluss an die Linkerspaltung funktionalisiert werden kann). Die Reaktionsbedingungen, Linker, Reaktant, und zu funktionalisierende Stelle wird ausgewählt, um intermolekulare Reaktionen zu vermeiden und intramolekulare Reaktionen zu beschleunigen. Es ist ebenfalls erkennbar, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung sowohl sequenzielles als auch simultanes Kontaktieren der Matrize mit Transfer-Einheiten umfasst, abhängig von der bestimmten Verbindung, die zu synthetisieren ist. In bestimmten Ausführungsformen von speziellem Interesse wird die mehrstufige Synthese von chemischen Verbindungen bereitgestellt, in welcher die Matrize sequenziell mit zwei oder mehreren Transfereinheiten kontaktiert wird, um die mehrstufige Synthese von komplexen chemischen Verbindungen zu erleichtern.
Nachdem die Stellen auf dem Gerüst modifiziert wurden, wird das neu synthetisierte kleine Molekül an die Matrize gebunden, die die Synthese kodiert. Durch das Dekodieren des Matrizen-Tags wird ermöglicht, die synthetische Historie, und dadurch die Struktur des kleinen Moleküls aufzuklären. Die Matrize kann ebenfalls amplifiziert werden, um mehr von dem gewünschten kleinen Molekül zu erzeugen, und/oder die Matrize kann entwickelt werden, um verwandte kleine Moleküle zu erzeugen. Das kleine Molekül kann ebenfalls von der Matrize für die Reinigung oder das Screening abgespalten werden.
Wie durch einen Fachmann erkennbar ist, kann eine Vielzahl von Matrizen verwendet werden, um die Synthese einer kombinatorischen Bibliothek von kleinen Molekülen unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zu kodieren. Dies würde die Amplifikation und Entwicklung einer kleinen Molekülbibliothek ermöglichen, eine Leistung, welche vor der vorliegenden Erfindung noch nicht erreicht wurde.
Verfahren zum Synthetisieren von Bibliotheken von Verbindungen
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird einen Nukleinsäure-Matrize, wie oben beschrieben, bereitgestellt, um die Synthese eines unnatürlichen Polymers, eines kleinen Moleküls, oder einer beliebigen anderen Art von Molekül von Interesse zu lenken. Im Allgemeinen wird eine Vielzahl von Nukleinsäure-Matrizen bereitgestellt, wobei die Anzahl von unterschiedlichen Sequenzen, die bereitgestellt sind, von 2 bis 10¹⁵ reichen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Vielzahl von Nukleinsäure-Matrizen bereitgestellt, vorzugsweise zumindest 100 unterschiedliche Nukleinsäure-Matrizen, noch mehr bevorzugt zumindest 10.000 unterschiedliche Nukleinsäure-Matrizen, und am meisten bevorzugt zumindest 1.000.000 unterschiedliche Nukleinsäure-Matrizen. Jede bereitgestellte Matrize weist eine einzigartige Nukleinsäure-Sequenz auf, die verwendet wird, um die Synthese eines bestimmten unnatürlichen Polymers oder kleinen Moleküls zu kodieren. Wie oben beschrieben, kann die Matrize ebenfalls eine Funktionalität, wie ein primäres Amin, von welchem die Polymerisierung ausgelöst wird, oder ein kleines Molekülgerüst aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen werden die Nukleinsäure-Matrizen in einem „Gefäß” bereitgestellt. In bestimmten anderen Ausführungsformen werden die Matrizen in wässrigen Medien bereitgestellt, und nachfolgende Reaktionen werden in wässrigen Medien ausgeführt.
Zu der Matrize werden Transfer-Einheiten mit Antikodons, wie oben beschrieben, die mit einer Monomer-Einheit, wie oben beschrieben, assoziiert sind, hinzugefügt. In bestimmten Ausführungsformen wird eine Vielzahl von Transfereinheiten bereitgestellt, so dass es ein Antikodon für jedes in der Matrize repräsentierte Kodon gibt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden bestimmte Antikodons als Start und Stoppstellen verwendet. Im Allgemeinen wird eine groß genuge Anzahl von Transfer-Einheiten bereitgestellt, so dass alle entsprechenden Kodonstellen auf der Matrize nach der Hybridisierung aufgefüllt sind.
Den Antikodons auf den Transfereinheiten wird ermöglicht, an die Nukleinsäure-Matrize zu hybridisieren, wodurch die Monomer-Einheiten in einer spezifischen Sequenz, wie durch die Matrize bestimmt ist, zusammengebracht werden. In der Situation, wo eine kleine Molekül-Bibliothek synthetisiert wird, werden die Reaktanten in Nähe eines kleinen Molekülgerüstes gebracht. Die Hybridisierungsbedingungen, wie durch einen Fachmann erkennbar ist, sollten vorzugsweise nur eine perfekte Übereinstimmung zwischen dem Kodon und seinem Antikodon ermöglichen. Sogar eine Einzelbasenpaar-Nichtübereinstimmung sollte vermieden werden. Hybridisierungsbedingungen können beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Temperatur, Salzkonzentration, pH, Matrizenkonzentration, Antikodonskonzentration und Lösungsmittel. Die für das Synthetisieren der Bibliothek verwendeten Hybridisierungsbedingungen können von der Länge des Kodons/Antikodons, der Ähnlichkeit zwischen den Kodons, die in den Matrizen vorhanden sind, dem Gehalt von G/C versus A/T Basenpaaren, etc. abhängen (für weitere Informationen in Bezug auf die Hybridisierungsbedingungen, siehe bitte, Molecular Cloning: A. Laboratory Manula, 2. Ausgabe., herausgegeben durch Sambrook, Fritsch, und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins Herausgeber, 1984); die Abhandlung, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999);
Nachdem die Hybridisierung der Antikodons an die Kodons auf der Matrize stattgefunden haben, werden dann die Monomer-Einheiten in dem Fall der Synthese eines unnatürlichen Polymers polymerisiert. Die Polymerisierung der Monomer-Einheiten kann spontan stattfinden oder müssen initiiert werden, zum Beispiel durch die Schutzeliminierung einer reaktiven Gruppe, wie ein Nukleophil oder durch das Bereitstellen von Licht einer bestimmten Wellenlänge. In bestimmten anderen Ausführungsformen können Polymere durch DNA-Polymerisierung katalysiert werden, die in der Lage sind, eine Polymerisierung von nicht-natürlichen Nukleotiden zu bewirken (siehe Beispiel 9). Die Polymerisierung findet vorzugsweise in einer Richtung entlang der Matrize mit benachbarten Monomer-Einheiten, die durch eine kovalente Bindung verbunden werden, statt. Die Beendigung des Polymerisierungsschrittes findet durch die Zugabe einer Monomer-Einheit statt, die nicht in der Lage ist, hinzugefügt zu werden. Im Falle der Synthese von kleinen Molekülen wird den Reaktanten ermöglicht, mit dem kleinen Molekülgerüst zu reagieren. Der Reaktant kann spontan reagieren, oder Schutzgruppen auf den Reaktant und/oder dem kleinen Molekülgerüst müssen entfernt werden. Andere Reagenzien (z. B. Säure, Base Katalysator, Wasserstoffgas, etc) können ebenfalls benötigt werden, um die Reaktion zu bewirken (siehe Beispiel 5A–5E).
Nachdem die unnatürlichen Polymere oder kleine Moleküle mit der Hilfe der Nukleinsäure-Matrize erzeugt wurden, können sie von der Nukleinsäure-Matrize und/oder Antikodons, die verwendet wurden, um sie zu synthetisieren, abgespalten werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Polymere oder kleine Moleküle, bevor sie vollständig von den Nukleinsäure-Matrizen, die sie kodieren, abgelöst werden, untersucht. Sobald das Polymer oder kleine Molekül ausgewählt ist, kann die Sequenz der Matrize oder ihres Komplementes bestimmt werden, um die Struktur des angehefteten Polymers oder kleinen Moleküls aufzuklären. Diese Sequenz kann dann amplifziert und/oder entwickelt werden, um neue Bibliotheken von verwandten Polymeren oder kleinen Molekülen zu entwickeln, die wiederum gescreent oder entwickelt werden können.
Verwendungen
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen einen neuen Weg, um Moleküle mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, dar. Dieser Ansatz verbindet die extrem leistungsfähigen genetischen Verfahren, die Molekularbiologen für Dekaden ausgenutzt haben, mit der Flexibilität und Leistung der organischen Chemie. Die Fähigkeit, um unnatürliche Polymere durch genetische Selektion herzustellen, zu amplifizieren und zu entwickeln, kann zu neuen Klassen von Katalysatoren (ihren, die Aktivität, Bioverfügbarkeit, Stabilität, Fluorescenz, Photolabilität oder andere Eigenschaften besitzen, unter Verwendung der eingeschränkten Menge an Baueinheiten, die in Proteinen und Nukleinsäuren gefunden werden, die schwierig oder unmöglich zu erreichen sind. Ähnlicherweise kann das Entwickeln neuer Systeme für das Herstellen, Amplifizieren und Entwickeln von kleinen Molekülen durch sich wiederholende Zyklen an Mutation und Selektion zu der Isolierung von neuartigen Liganden oder Arzneimitteln mit Eigenschaften, die jenen, die durch die langsameren traditionellen Arzneimittelentdeckungsverfahren isoliert wurden, überlegen sind, führen (siehe Beispiel 7).
Das Durchführen organischer Bibliothekssynthese in einem molekular biologischen Maßstab ist ein grundsätzlich unterschiedlicher Ansatz zu der traditionellen Festphasenbibliotheks-Synthese und trägt signifikante Vorteile. Eine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Bibliothek kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Verfahren gescreent werden (z. B. Bindungsuntersuchung, katalytische Untersuchung). Zum Beispiel kann die Selektion basierend auf der Bindung auf ein Zielmolekül an der gesamten Bibliothek ausgeführt werden, in dem die Bibliothek über ein Harz, welches kovalent an das Ziel gebunden ist, geleitet wird. Jene Biopolymere, die eine Affinität für das Harz-gebundene Ziel aufweisen, können mit freien Zielmolekülen eluiert werden, und die selektiven Verbindungen können den unter der Verwendung oben beschriebenen Verfahren amplifiziert werden. Nachfolgende Selektions- und Amplifikationsrunden können zu einem Pool an Verbindungen führen, die mit Sequenzen angereichert sind, die an das Zielmoleküle binden. In bestimmten Ausführungsformen ahnt das Zielmolekül einen Übergangszustand einer chemischen Reaktion nach, und die ausgewählten chemischen Verbindungen können als ein Katalysator für die chemische Reaktion dienen. Da die Information, die die Synthese von jedem Molekül kodiert, kovalent an das Molekül an einem Ende angelagert ist, kann eine gesamte Bibliothek auf einmal gescreent werden und dennoch wird jedes Molekül auf einer individuellen Basis ausgewählt.
Eine solche Bibliothek kann ebenfalls durch Einführen von Mutationen auf der DNA-Ebene unter Verwendung der error-prone PCR entwickelt werden (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2: 28, 1992;) oder durch Unterziehen der DNA einer in vitro homologen Rekombination (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747, 1994; Stemmer Nature 370: 389, 1994; jede von ihnen ist aufgenommen). Wiederholte Zyklen an Selektion, Amplifikation, Mutation, kann Polymere mit stark erhöhter Bindungsaffinität für Zielmoleküle oder mit signifikant verbesserten katalytischen Eigenschaften liefern. Der Endpool an entwickelten Biopolymeren mit den gewünschten Eigenschaften kann durch Sequenzieren der von den Polymeren abgespalteten Nukleinsäure sequenziert werden. Die Nukleinsäure-freien Polymere können unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt werden, einschließlich HPLC, Säulenchromatographie, FLPC, etc, und seine Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften können in der Abwesenheit von kovalent angelagerter Nukleinsäure verifiziert werden.
Die Polymerisierung von synthetisch erzeugten Monomer-Untereinheiten unabhängig von der ribosomalen Maschinerie ermöglicht den Einbau von einer großen Vielzahl von Seitenketten mit neuartigen chemischen, biophysikalischen oder biologischen Eigenschaften. Das Abschließen jedes Biopolymers mit einer Biotinseitenkette, z. B., ermöglicht die leichte Reinigung von nur Biopolymeren mit voller Länge, welche vollständig translatiert wurden, in dem die Bibliothek durch ein Avidin-gebundenes Harz geleitet wird. Biotin-begrenzte Biopolymere können für die aktuelle Katalyse von Bindungs-brechenden Reaktionen selektiert werden, indem diese Polymere über ein Harz, welches über das Substrat an Avidin gebunden ist, geleitet werden (5). Jene Biopolymere, die die Substratspaltung katalysieren, würden von der Säule, die mit diesem Harz geladen ist, selbst eluieren. Ähnlicherweise können Biotin-begrenzte Biopolymere für die Katalyse von Bindungs-bildenden Reaktionen selektiert werden (5). Ein Substrat ist an das Harz gebunden und das zweite Substrat ist an Avidin gebunden. Biopolymere, die die Bindungsbildung zwischen den Substraten katalysieren, werden durch ihre Fähigkeit, die Substrate zusammen zu legieren ausgewählt, was zu der Anlagerung des Biopolymers an das Harz führt. Neuartige Seitenketten können ebenfalls verwendet werden, um einen Cofaktor in die Biopolymere einzuführen. Eine Seitenkette, die einen Metallchelator enthält, kann z. B. Biopolymere mit Metall-vermittelten katalytischen Eigenschaften bereitstellen, während eine Flavin-enthaltende Seitenkette Biopolymere mit dem Potenzial, eine Redox Reaktion zu katalysieren, ausstatten kann.
Auf diese Weise können unnatürliche Biopolymere isoliert werden, welche als künstliche Rezeptoren dienen, um Moleküle selektiv zu binden, oder welche chemische Reaktionen katalysieren. Die Charakterisierung dieser Moleküle würde eine wichtige Erkenntnis in die Fähigkeit von Polycarbamaten, Polyharnstoffen, Polyesters, Polycarbonaten, Polypeptiden mit unnatürlichen Seitenketten und Stereochemien, oder anderen unnatürlichen Polymeren bereitstellen, um sekundäre oder tertiäre Strukturen mit Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften zu bilden.
Ausrüstungssätze
Ausrüstungssätze und Zusammensetzungen für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren können ebenfalls bereitgestellt werden. Die Ausrüstungssätze können jeder Einheit oder Zusammensetzung enthalten, die beim Ausführen der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Die Ausrüstungssätze können enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Matrizen, Antikodons, Transfereinheiten, Monomer-Einheiten, Baueinheiten, Reaktanten, kleine Molekülgerüste, Puffer, Lösungsmittel, Enzyme (z. B. hitzestabile Polymerase, Umkehrtranskriptase, Ligase, Restriktionsendonuklease, Exonuklease, Klenow Fragment, Polymerase, Alkalische Phosphatase, Polynukleotidkinase) Linker, Schutzgruppen, Polynukleotide, Nukleoside, Nukleotide, Salze, Säuren, Basen, Feststoffträger, oder jede Kombination davon.
Wie durch einen Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar ist, würde ein Ausrüstungssatz zum Herstellen von unnatürlichen Polymeren Gegenstände enthalten, die benötigt werden, um unter Verwendung der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren unnatürliche Polymere herzustellen. Ein solcher Ausrüstungssatz kann Matrizen, Antikodons, Transfereinheiten, Monomereinheiten, oder Kombinationen davon enthalten. Ein Ausrüstungssatz zum Synthetisieren kleiner Moleküle kann Matrizen, Antikodons, Transfer-Einheiten, Baueinheiten, kleine Molekülgerüste oder Kombinationen davon enthalten.
Der Ausrüstungssatz kann ebenfalls mit Gegenständen, die zum Amplifizieren und/oder Entwickeln einer Polynukleotid-Matrize benötigt werden, wie eine hitzestabile Polymerase für die PCR, Nukleotide, Puffer und Primer ausgerüstet sein. Der Ausrüstungssatz kann ebenfalls Gegenstände, die häufig zum Ausführen des DNA shuffling verwendet werden, wie Polynukleotide, Ligase und Nukleotide, enthalten.
Zusätzlich zu den Matrizen und Transfer-Einheiten, die hierin beschrieben sind, enthält die vorliegende Erfindung auch Zusammensetzungen, die komplexe kleine Moleküle, Gerüste oder unnatürliche Polymere aufweisen, die durch ein beliebiges oder durch mehrere der Verfahren der Erfindung, wie hierin beschrieben, hergestellt wurden.
ÄQUIVALENTE
Die repräsentativen Beispiele, die nun folgen, sind beabsichtigt, die Erfindung illustrieren zu helfen, und sind nicht beabsichtigt, und sind auch nicht dahingehend auszulegen, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken. Verschiedene Modifikationen der Erfindung und viele weitere Ausführungsformen davon, zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, werden tatsächlich für den Fachmann aus dem vollen Inhalt dieses Dokumentes, einschließlich der Beispiele, welche folgen und den Referenzen zu der wissenschaftlichen und Patentliteratur, die hierin zitiert ist, offensichtlich.
Die folgenden Beispiele enthalten wichtige zusätzliche Informationen, Erläuterungen und Anleitungen, die zum Ausführen dieser Erfindung in seinen verschiedenen Ausführungsformen und den Äquivalenten davon angepasst werden können.
ERLÄUTERUNGEN
Beispiel 1: Die Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese:
Die Umsetzung des kleinen Molekül Evolutionsansatzes, der oben beschrieben ist, erfordert das Etablieren der Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese. Die vorliegende Erfindung etabliert, für das erste Mal, die Allgemeingültigkeit dieses Ansatzes und ermöglicht somit die Synthese einer Vielzahl von chemischen Verbindungen unter Verwendung der DNA-Matrizen basierenden Synthese. Wie in 6a gezeigt ist, wurde die Fähigkeit von zwei DNA Architekturen, die Lösungs-Phase DNA-Matrizen basierende Synthese zu unterstützen, etabliert. Sowohl Haarnadel (H) als auch End-von-Helix (E) Matrizen, die elektrophile Maleimid Gruppen tragen, reagierten wirksam mit einem Äquivalent Thiolreagenz, welches an ein komplementäres DNA-Oligonukleotid gebunden ist, um das Thioether-Produkt in Minuten bei 25°C zu ergeben. Die DNA-Matrizen basierenden Reaktionsraten (k_app = ~10⁵ M^–1s^–1) waren für H und E Architekturen ähnlich, trotz signifikanter Unterschiede in der relativen Orientierung ihrer reaktiven Gruppen. Im Gegensatz wurde kein Produkt beobachtet, wenn Reagenzien verwendet wurden, die Sequenz-Nichtübereinstimmungen enthalten, oder wenn Matrizen verwendet wurden, die mit einem Überschuss an β-Mercaptoethanol vorgelöscht wurden (6a). Beide Matrizen unterstützen deshalb die Sequenz-spezifische DNA-Matrizen basierende Addition eines Thiols an ein Maleimid, obwohl die Strukturen der resultierenden Produkte sich markant von der Struktur des natürlichen DNA-Rückgrats unterscheiden. Weniger oder keine nicht-Matrizen intermolekulare Reaktionsprodukte wurden unter den Reaktionsbedingungen beobachtet (pH 7,5, 25°C, 250 mM NaCl, 60 nM Matrize und Reagenz).
Zusätzlich umspannen Sequenz-spezifische DNA Matrizen basierende Reaktionen eine Vielzahl von Reaktionsarten (S_N2 Substitutionen, Additionen an α,β-ungesättigte Carbonylsysteme, und Additionen an Vinylsulfone), Nukleophile (Thiole und Amine), und Reaktantenstrukturen, alle verliefen in einer guten Ausbeute mit exzellenter Sequenzselektivität (6b). Die erwarteten Produktmassen wurden durch Massen-Spektrometrie verifiziert. In jedem Fall ergaben übereinstimmende, jedoch nicht nichtübereinstimmende Reagenzien, Produkt effizient, trotz beachtlicher Variationen in ihrer Übergangszustand-Geometrie, sterischer Hinderung und konformativer Flexibilität. Insgesamt weisen diese Ergebnisse daraufhin, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese ein allgemeines Phänomen ist, das in der Lage ist, eine Auswahl von Reaktionsarten zu unterstützen, und ist nicht auf die Erzeugung von Strukturen, die Nukleinsäure-Rückgraten, wie früher beschrieben, ähneln, beschränkt.
Da die Sequenzdiskreminierung für die genau Translation von DNA in synthetische Strukturen wichtig ist, wurde die Reaktionsrate eines übereinstimmenden Reagenzes im Vergleich zu jener, eines Reagenzes, das eine einzelne nichtübereinstimmende Base in der Nähe des Zentrums seines 10-Basen Oligonukleotids trägt, gemessen. Bei 25°C war die anfängliche Reaktionsrate von übereinstimmenden Thiolreagenzen mit Iodoacetamid-gebundenen H-Matrizen 200-fach schneller, als jene von Reagenzien, die eine einzelne Nichtübereinstimmung tragen (k_app = 2,4 × 10⁴ M^–1s^–1 vs- 1,1 × 10² M^–1s^–1, 7). Zusätzlich können kleinen Mengen von Produkten, die sich aus dem Anlagern von nichtübereinstimmenden Reagenzien ergeben, durch Erhöhen der Reaktionstemperaturen über die T_m der nichtübereinstimmenden Reagenzien eleminiert werden (7). Die Abnahme der Produktbildungsrate, wie die Temperatur erhöht wird, weist weiters daraufhin, dass die Produktbildung eher über einen DNA-Matrizen basierenden Mechanismus, als über einen einfachen intermolekularen Mechanismus verläuft.
Zusätzlich zu der Reaktionsallgemeingültigkeit und Sequenz-Spezifität demonstriert die DNA-Matrizen basierende Synthese auch eine beachtliche Entfernungsunabhängigkeit. Sowohl H als auch E-Matrizen, die an Maleimid oder α-Iodoacetamid Gruppen gebunden sind, fördern die Sequenz-spezifische Reaktion mit übereinstimmenden, nicht jedoch mit nichtübereinstimmenden, Thiol-Reagenzien, die irgendwo auf den Matrizen, die bis jetzt untersucht sind, angelagert sind (bis zu 30 Basen entfernt von der reaktiven Gruppe auf der Matrize). Reaktanten, die nur eine Base entfernt angelagert sind, reagieren mit ähnlichen Raten, wie jene, die 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, oder 30 Basen entfernt angelagert sind (8). In allen Fällen sind die Matrizen-basierenden Reaktionsraten mehrere 100-fach höher als die Raten von Nicht-Matrizen (nichtübereinstimmenden) Reaktionen (k_app = 10⁴–10⁵ M^–1s^–1 vs. 5 × 10¹ M^–1s^–1). Bei einer Zwischendistanz von 30 Basen werden die Produkte effizient gebildet, vermutlich durch Übergangszustände, die 200-gliedrigen Ringen ähneln. Diese Ergebnisse sind im scharfen Gegensatz zu den bekannten Schwierigkeiten der Makrozyklisierung (siehe zum Beispiel, G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95–102; R. B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210–3213) in der organischen Synthese.
Um die Basis der Entfernungsunabhängigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese zu bestimmen, wurde eine Reihe von modifizierten E-Matrizen zuerst synthetisiert, in welchen die dazwischenliegenden Basen durch eine Reihe von DNA-Analoga ersetzt wurden, die so konstruiert sind, um den möglichen Beitrag von (i) Interbasen-Interaktionen, (ii) konformative Präferenzen des DNA-Rückgrats, (iii) des geladenen Phosphatrückgrats, und (iv) der Rückgrat-Hydrophilizität zu evaluieren. Matrizen, in welchen die dazwischenliegenden Basen mit irgendeinem der Analoga in 9 ersetzt wurden, hatten eine geringe Wirkung auf die Produktbildungsrate. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Rückgrat-Strukturelemente, die für DNA spezifisch sind, nicht für die beobachtete Entfernungsunabhängigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese verantwortlich sind. Die Addition einer 10-Basen DNA Oligonukleotid „clamp”, die komplementär zu der einzelsträngigen dazwischenliegenden Region ist, reduzierte die Produktbildung jedoch signifikant (9), was darauf hinweist, dass die Flexibilität dieser Region für eine effiziente DNA-Matrizen basierende Synthese kritisch ist.
Die Distanz unabhängigen Reaktionsraten können erklärt werden, wenn die Bindungsbildungs-Vorgänge in einem DNA-Matrizen basierenden Format in Bezug auf ihre nicht-Matrizen basierenden Gegenstücke ausreichend beschleunigt sind, so daß eher die DNA-Anlagerung Geschwindigkeits-bestimmend ist. Wenn die DNA-Anlagerung zumindest teilweise Geschwindigkeits-beschränkend ist, dann sollte die Produktbildungsrate, wie die Konzentration an Reagenzien verringert wird, abnehmen, da die Anlagerung, im Gegensatz zu der Matrizen basierenden Bindungsbildung, ein bimolekularer Prozess ist. Die Verringerung der Reaktanten-Konzentration in dem Fall der E-Matrize mit einer oder zehn dazwischenliegenden Basen zwischen den reaktiven Gruppen führte zu einer merklichen Abnahme der beobachteten Reaktionsrate (10). Diese Beobachtung weist daraufhin, dass die Nachbarschaftswirkungen der DNA-Matrizen basierenden Synthese die Bindungsbildungs-Raten zu dem Punkt verstärken kann, dass die DNA-Anlagerung Geschwindigkeits-bestimmend wird.
Diese Ergebnisse ergeben die Möglichkeit der Verwendung der DNA-Matrizen basierenden Synthese, um ein Gefäß Bibliotheken von DNA in Lösungsphasen-Bibliotheken von synthetischen Molekülen zu translatieren, die für die PCR-Amplifikation und Selektion geeignet sind. Die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese, um eine Vielzahl von Übergangszustands-Geometrien zu unterstützen, weist auf ein Potenzial beim Lenken einer Reihe von leistungsfähigen Wasser-kompatiblen synthetischen Reaktionen hin (siehe Li, C. J. Organic Reactions in Aqueous Media, Wiley und Sons, New York: 1997). Die oben beschriebene Sequenz-Spezifität weist daraufhin, dass Mischungen von Reagenzien in der Lage sein können, vorhersehbar mit komplementären Mischungen an Matrizen zu reagieren. Schließlich weist die beobachtete Entfernungsunabhängigkeit darauf hin, dass unterschiedliche Regionen von DNA „Kodons” verwendet werden können, um unterschiedliche Gruppen auf dem gleichen synthetischen Gerüst ohne Beeinträchtigung der Reaktionsraten zu kodieren. Als eine Demonstration dieses Ansatzes, wurde eine Bibliothek von 1.025 Maleimid-gebundenen Matrizen synthetisiert, jede mit einer unterschiedlichen DNA-Sequenz in einer Acht-Basen kodierenden Region (11). Eine dieser Sequenzen, 5'-TGACGGGT-3', wurde willkürlich ausgewählt, um die Anheftung einer Biotingruppe an die Matrize zu kodieren. Eine Bibliothek von Thiolreagenzien, die an 1.025 unterschiedliche Oligonukleotide gebunden ist, wurde ebenfalls erzeugt. Das an die 3'-ACTGCCCA-5' gebundene Reagenz enthielt eine Biotingruppe, während die anderen 1.024 Reagenzien kein Biotin enthielten. Äquimolare Verhältnisse von allen 1.025 Matrizen und 1.025 Reagenzien wurden in einem Gefäß für 10 min. bei 25°C gemischt, und die resultierenden Produkte wurden in vitro auf Bindung an Streptavidin selektiert. Moleküle, die die Selektion überlebten, wurden durch PCR amplifiziert und durch Restriktionsverdauung und DNA Sequenzierung analysiert.
Verdau mit der Restriktions-Endonuklease Tsp45I, welche GTGAC spaltet und deshalb die Biotin-kodierende Matrize schneidet, aber keine der anderen Matrizen, offenbart ein 1:1 Verhältnis von Biotin kodierenden zu Nicht-Biotin kodierenden Matrizen im Anschluss an die Selektion (12). Dies stellt eine 1.000-fache Anreicherung im Vergleich zu der nicht-selektierten Bibliothek dar. Die DNA-Sequenzierung des PCR amplifizierten Pools, vor und nach der Selektion, wies auf einem ähnlichen Anreichungsgrad hin und zeigten an, dass die Biotin-kodierende Matrize das Hauptprodukt nach der Selektion und Amplifikation ist (Figur 12). Die Fähigkeit der DNA-Matrize basierenden Synthese, die simultane Sequenz-spezifische Reaktion von 1.025 Reagenzien zu unterstützen, wobei jede von diesen einem 1.024:1 Verhältnis von nicht-Partner zu Partner Matrizen begegnet, demonstriert sein Potenzial als ein Verfahren, um synthetische Bibliotheken in einem Gefäß zu erzeugen. Die obige prinzipielle praktische Realisierbarkeit der Translation, Selektion und Amplifikation eines synthetischen Bibliothek-Mitglieds mit einer spezifischen Eigenschaft (in diesem Beispiel Avidin-Affinität) adressiert mehrere Schlüsselanforderungen für die Entwicklung von nicht-natürlichen kleinen Molekül-Bibliotheken in Richtung gewünschter Eigenschaften.
Zusammengefasst weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die DNA-Matrizen basierenden Synthese ein erstaunlich allgemeines Phänomen ist, welches in der Lage ist, eine Auswahl an chemischen Reaktionen eher zu lenken, als einfach zu kodieren, um Produkte zu bilden, die mit ihrer Struktur mit Nukleinsäure-Rückgraten nicht verwandt sind. Für mehrere untersuchte Reaktionen, beschleunigt das DNA-Matrizen basierende Format die Bindungbildungs-Rate, über die Rate eines 10-Basen DNA Oligonukleotids, welches an sein Komplement anlagert ist, hinaus, was zu einer erstaunlichen Entfernungsunabhängigkeit führt. Die einfache Natur der weitreichenden DNA-Matrizen basierenden Reaktionen kann ebenfalls zum Teil von der Tendenz des Wassers, das Volumen von nicht-polaren Reaktanten zu kontaktieren, herrühren (siehe C.-J. Li et al. Organic Reaktions in Aqueous Media, Wiley und Sons; New York, 1997) und von der möglichen Kompaktheit der dazwischenliegenden einzelsträngigen DNA zwischen den reaktiven Gruppen. Diese Ergebnisse können Auswirkungen auf die präbiotische Evolution und für das Verständnis des Mechanismus von katalytischen Nukleinsäuren haben, welche üblicherweise Substrate an einen Strang von RNA oder DNA lokalisieren.
Verfahren:
DNA Synthese. DNA Oligonukleotide wurden auf einem PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA-Synthetisierer unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert, und durch Umkehrphasen HPLC gereinigt. Die Oligenukleotide wurden spektophotometrisch und durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), gefolgt durch die Färbung mit Ethidiumbromid oder SYBR Green (Molecular Probes) quantifiziert und die Quantifizierung unter Verwendung eines Stratagene Eagle Eye II Densitometer. Phosphoramidite, die die Synthese von 5'-NH₂-dT, 5' Tetrachlorfluorescein, eines basischen Rückgrat-Spacers, C3 Rückgratspacers, 9-Bindungs-Polyethylenglycol-Spacers, 12-Bindungs-gesättigte Kohlenwasserstoff Spacers ermöglicht, und 5' Biotingruppen, wurden von Glen Research gekauft. Thiol-gebundene Oligonukleotid-Reagenzien wurden auf einem C3 Disulfid Controlled-Pore-Glass (Glen Research) synthetisiert.
Matrizen-Funktionalisierung. Matrizen, die 5'-NH₂-dT Gruppen tragen, wurden in eine Vielzahl Elektrophile funktionelle Gruppen durch Reaktion mit dem geeigneten Elektrophil-NHS Ester (Pierce) transformiert. Reaktionen wurden in 200 mM Natriumphosphat pH 7,2 mit 2 mg/mL Elektorphil-NHS Ester, 10% DMSO, und bis zu 100 μg 5'-Amino-Matrize bei 25°C für eine 1 h durchgeführt. Die gewünschten Produkte wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und durch Gelelektrophorese und MALDI Massenspektrometrie charakterisiert.
DNA-Matrizen basierende Synthese-Reaktionen. Die Reaktionen wurden durch Mischen von äquimolaren Mengen an Reagenz und Matrize in Puffer, welcher 50 mM MOPS pH 7,5, und 250 mM NaCl enthält, bei der gewünschten Temperatur (25°C, wenn nicht anderes angegeben) ausgelöst. Die Konzentrationen an Reagenzien und Matrizen waren 60 nM, wenn nicht anders angegeben. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquote entnommen, mit einem Überschuss an β-Mercaptoethanol gelöscht, und durch denturierende PAGE analysiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Densitometrie unter Verwendung ihrer intrinsischen Fluoreszenz oder durch Färben, gefolgt durch Densitometrie, quantifiziert. Repräsentative Produkte wurden ebenfalls durch MALDI Massenspektometrie verifiziert.
In vitro Selektion auf Avidin-Bindung. Produkte der Bibliothek-Translation-Reaktion wurden durch Ethanol-Präzipitation isoliert, und im Bindungspuffer (10 mM Tris pH 8. 1 M NaCl, 10 mM EDTA) aufgelöst. Die Produkte wurden mit 30 μg Streptavidin-gebundenen magentischen Kügelchen (Roche Biosciences) für 10 min. bei Raumtemperatur in 100 μl Gesamtvolumen inkubiert. Die Kügelchen wurden 16 mal mit Bindungspuffer gewaschen und durch Behandlung mit einem 1 μmol freiem Biotin in 100 μl Bindungspuffer bei 70°C für 10 Minuten eluiert. Die eluierten Moleküle wurden durch Ethanol-Präzipitation isoliert und durch Standard PCR Protokolle (2 M MgCl₂, Anlagerung bei 55°C, 20 Zyklen) unter Verwendung der Primer 5'-TGGTGCGGAGCCGCCG und 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCCCGGCTCCTCGGCTCGG amplifiziert. Die automatische DNA Sequenzierung verwendete die Primer 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCC.
DNA Sequenzen. Sequenzen, die in den Figuren nicht bereitgestellt sind, sind wie folgt: Übereinstimmendes Reagenz in 6b SIAB und SBAP Reaktionen: 5'-CCCGAGTCGAAGTCGTACC-SH; nicht übereinstimmendes Reagenz in 6b SIAB und SBAP Reaktionen: 5'-GGGCTCAGCTTCCCCATAA-SH; nichtübereinstimmende Reagenzien für andere Reaktionen in den 6b, 6c, 6d und 8a; 5'-FAAATCTTCCC-SH (F = Tetrachlorfluorescein); die Reagenzien in den 6c und 6d enthalten eine Nichtübereinstimmung: 5'-FAATTCTTACC-SH; die Matrizen in den 6a, 6b SMCC, GMBS, BMPS und SVSB Reaktionen, und 8a: 5'-(NH₂dt)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTTCGACTCGAGG; F Matrize in 6B SIAG, SBAP und SIA Reaktionen: 5'-(NH₂dT)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTC; Clamp-Oligonukleotid in 8b: 5'-ATTCGTACCA
Beispiel 2: Beispielhafte Reaktionen für die Verwendung in der DNA-Matrizen basierenden Synthese:
Wie oben diskutiert ist, wurde die Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden synthetischen Chemie untersucht (siehe Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961). Insbesondere wurde die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese, um eine kleine Sammlung von chemischen Reaktionen ohne die Notwendigkeit der genauen Ausrichtung von reaktiven Gruppen in DNA-ähnlichen Konformationen zu lenken, demonstriert. Tatsächlich ermöglichte die Entfernungsunabhängigkeit und Sequenz-Genauigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese, die gleichzeitige, ein Gefäß-Translation einer Modell-Bibliothek von mehr als 1.000 Matrizen in die entsprechenden Thioetherprodukte, von welchen eines durch in vitro Selektion auf die Bindung an das Protein Streptavidin angereichert wurde und durch PCR amplifiziert wurde.
Wie hierin im Detail beschrieben ist, wurde die Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese weiters ausgedehnt und es wurde demonstriert, dass eine Vielzahl von chemischen Reaktionen für die Konstruktion von kleinen Molekülen ausgenutzt werden kann und insbesondere, für das erste Mal, DNA-Matrizen basierende organometallische Kopplungen und Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildungs-Reaktionen, außer der Pyrimidin-Photodimerisierung. Diese Reaktionen stellen eindeutig einen wichtigen Schritt in Richtung der in vitro Evolution von nicht-natürlichen synthetischen Molekülen dar, indem die DNA-Matrizen basierende Konstruktion einer viel diverseren Gruppe von Strukturen, als bisher erreicht wurde, ermöglicht wird.
Die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese, Reaktionen zu lenken, die einen nicht-DNA-gebundenen Aktivator, Katalysator oder anderes Reagenz zusätzlich zu den prinzipiellen Reaktanten benötigen, wurde ebenfalls hierin demonstriert. Um die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese zu testen, solche Reaktionen ohne der Notwendigkeit der strukturellen Nachahmung des DNA-Matrizen basierenden Rückgrats zu vermitteln, können DNA-Matrizen basierende reduktive Aminierungen zwischen einer Amin-gebundenen Matrize (1) und Benzaldehyd- oder Glyoxal-gebundenen Reagenzien (3) mit millimolaren Konzentrationen an NaBH₃CN bei Raumtemperatur in wässrigen Lösungen durchgeführt werden. Signifikanterweise bildeten sich die Produkte effizient, wenn die Matrizen- und Reagenz-Sequenzen komplementär waren, während Kontrollreaktionen, in welchen die Sequenz des Reagenzes nicht zu jener der Matrize komplementär war, oder in welcher NaBH₃CN weggelassen wurde, kein signifikantes Produkt ergaben (siehe 13 und 14). Obwohl DNA-Matrizen basierende reduktive Aminierungen, um Produkte, die die Struktur von doppelsträngiger DNA genau nachahmen, zu erzeugen, früher berichtet wurden (siehe z. B. X. Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746 und Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19), demonstrieren die obigen Ergebnisse, dass die reduktive Animierung, um Strukturen, die mit dem Phosphoribose-Rückgrat nicht verwandt sind, zu erzeugen, effizient und Sequenz-spezifisch stattfinden kann. Unter Bezugnahme auf 15, die DNA-Matrizen basierenden Amid-Bindungsbildungen zwischen Amin gebundenen Matrizen 4 und 5 und Carboxylat-gebundenen Reagenzien 6–9, die durch 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC) und N-Hydroxylsulfosuccinimid (Sulfo-NHS) vermittelt sind, um Amid-Produkte mit guten Ausbeuten bei pH 6,0, 25°C zu erzeugen (15). Die Produktbildung war Sequenz-spezifisch, abhängig von der Gegenwart von EDC, und gegen die sterische Behinderung des Amins oder Carboxylats überraschenderweise unempfindlich. Die effiziente DNA-Matrizen basierende Amidbildung wurde ebenfalls durch den Wasser stabilen Aktivator 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-trizin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid (DMT-MM), anstelle von EDC und Sulfo-NHS, vermittelt (14 und 15). Die Wirksamkeit und Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildung unter diesen Bedingungen, zusammen mit der großen Anzahl von kommerziell erhältlichen chiralen Aminen und Carbonsäuren, machen diese Reaktion einen attraktiven Kandidaten für die zukünftigen DNA-Matrizen basierenden Synthesen von strukturell diversen kleinen Molekül-Bibliotheken.
Es ist erkennbar, dass die Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildungs-Reaktionen in sowohl chemischen als auch biologischen Synthesen wichtig sind, und somit ebenfalls mehrerer solcher Reaktionen in dem DNA-Matrizen basierenden Format benutzt. Sowohl die Reaktion von Nitroalkan-gebundenen Reagenz (10) mit Aldehyd gebundener Matrize (11) (Nitro-Aldol oder Henry Reaktion) als auch die Konjugat-Addition von 10 an Maleimid-gebundener Matrize (12) (Nitro-Michael Addition) verlief effizient und mit hoher Sequenz-Spezifität bei pH 7,5–8,5, 25°C (13 und 14). Zusätzlich ergab die Sequenz-spezifische DNA-Matrizen basierende Wittig Reaktion zwischen einem stabilisierten Phosphoniumylid-Reagenz 13 und Aldehyd-gebundenen Matrizen 14 oder 11 die entsprechenden Olefin-Produkte mit ausgezeichneten Ausbeuten bei pH 6,0–8,0, bei 25°C (13 und 14). Auf ähnliche Weise ergab die DNA-Matrizen basierende 1,3-Dipolare Cycloaddition zwischen Nitron-gebundenen Reagenzien 15 und 16 und Olefin-gebundenen-Matrizen 12, 17 oder 18 ebenfalls Produkte Sequenz-spezifisch bei pH 7,5, 25°C (13 und 14).
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Reaktionen, können organometallische Kopplungs-Reaktionen in der vorliegenden Erfindung ebenfalls benutzt werden. Zum Beispiel wurden DNA-Matrizen basierende Heck Reaktionen in der Gegenwart von wasserlöslichen Pd Präkatalysatoren durchgeführt. In der Gegenwart von 170 mM Na₂PdCl₄, Aryliodid-gebundenem Reagenz 19 und einer Vielzahl von Olefin-gebundenen Matrizen, einschließlich Maleimid 12, Acrylamid 17, Vinylsulfon 18 oder Cinnamamid 20 ergaben Heck-Kopplungsprodukte in mässigem Ausbeuten bei pH 5,0, 25°C (13 und 14). Für Kopplungen mit Olefinen 17, 18 und 20, erhöhte üblicherweise das Hinzufügen von zwei Äquivalenten an P (p-SO₃C₆H₄)₃ pro Äquivalent PD vor der Matrizen- und Reagenzzugabe, die Gesamtausbeute um das doppelte. Kontrollreaktionen, die Sequenz-Nichtübereinstimmungen enthalten, oder denen der Pd-Präkatalysator fehlte, ergaben kein Produkt. Unseres Wissens stellen die obigen DNA-Matrizen basierenden Nitro-Aldol-Addition, Nitro-Michael-Addition, Wittig Olefinierung, dipolare Cycloaddition und Heck Kopplung die ersten berichteten Nukleinsäure-Matrize-basierenden organometallischen Reaktionen und Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildungs-Reaktionen, außer der Pyrimidin-Photodimerisierung, dar.
Es wurde zuvor entdeckt, dass dieselben DNA-Matrizen basierenden Reaktionen eine Entfernungsunabhängigkeit, die Fähigkeit, Produkte bei einer Rate zu bilden, die unabhängig von der Anzahl der dazwischenliegenden Basen zwischen den angelagerten Reaktanten ist, demonstrieren. Es wurde hypothetisiert (16a), dass die Distanzunabhängigkeit entsteht, wenn die Bindungsbildungsrate in der DNA-Matrizen basierenden Reaktion größer als die Rate der Matrizen-Reagenz-Anlagerung ist. Obwohl nur eine Teilmenge der Chemien in diese Kategorie fallen, ist jede DNA-Matrizen basierende Reaktion, die vergleichbare Produktausbeuten liefert, wenn das Reagenz bei verschiedenen Entfernungen von dem reaktiven Ende der Matrize angelagert wird, von speziellen Interesse, da es eine Vielzahl von Matrizen-Positionen kodieren kann. Um die Fähigkeit der DNA-Matrizen basierenden Reaktionen zu evaluieren, die oben entwickelt wurden, um effizient stattzufinden, wenn die Reaktanten durch Entfernungen relevant zu der Bibliothek-Kodierung getrennt sind, wurden die Ausbeuten der reduktiven Aminierung, der Amidbildung, der Nitro-Aldol-Addition, der Nitro-Michael-Addition, der Wittig-Olefirierung, der dipolaren Cycloaddition, und der Heck-Kopplung, wenn Null oder zehn Basen angelagerte reaktive Gruppen trennten (16a. n = 0 versus n = 10) verglichen. Unter den oben beschriebenen oder in frührer Arbeit beschriebenen Reaktionen, demonstrieren die Amidbindungsbildung, Nitro-Aldol-Addition, Wittig-Olefinierung, Heck-Kopplung, Konjugat-Addition von Thiolen an Maleimide und S_N2 Reaktionen zwischen Thiolen und α-Iodamiden eine vergleichbare Produktbildung, wenn die reaktiven Gruppen durch 0 oder 10 Basen getrennt sind (16b). Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass diese Reaktionen während der Synthese durch Nukleotide, die von dem reaktiven Ende der Matrize entfernt sind, ohne signifikante Beeinträchtigung der Produktbildung, kodiert sein können.
Zusätzlich zu der DNA-Matrizen basierenden S_N2 Reaktion, Konjugat-Addition, Vinylsulfon-Addition, Amidbindungsbildung, reduktive Aminierung, Nitro-Aldol (Henry Reaktion), Nitro-Michael, Wittig-Olefinierung, 1,3-dipolaren Cycloaddition und Heck Kopplungs-Reaktionen, die unmittelbar zuvor beschrieben sind, können eine Vielzahl von zusätzlichen Reagenzien in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Zum Beispiel, wie in 17 gezeigt ist, können leistungsfähige wässrige DNA-Matrizen basierende synthetische Reaktionen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die Lewissäure-katalysierte Aldol-Addition, Mannich-Reaktion, Robinson-Annulierungs-Reaktionen, Additionen von Allylindium, Zink und Zinn an Ketone und Aldehyde, Pd-assistierte allylische Substitution, Diels-Alder Cycloadditionen, und Hetero-Diels-Alder Reaktionen in wässrigem Lösungsmittel effizient benutzt werden, und sind wichtige Komplexitätsbildungs-Reaktionen.
Zusammengenommen erweitern diese Ergebnisse den Reaktionsumfang der DNA-Matrizen basierenden Synthese beachtlich. Eine große Vielzahl von Reaktionen verlief effizient und selektiv, nur wenn die entsprechenden Reaktanten mit komplementären Sequenzen programmiert werden. Durch Vergrößern des Repertoirs von bis jetzt bekannten DNA-Matrizen basierenden Reaktionen, einschließlich Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungsbildung und organometallische Reaktionen (Nitro-Aldol Additionen, Nitro-Michael Additionen, Wittig-Olefinierungen, dipolare-Cycloadditionen und Heck-Kopplungen) zusätzlich zu den früher berichteten Amidbindungsbildung (siehe Schmidt et al. Nucleic Acids Res. 1997, 25, 4792; Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49), Iminbildung (Czlapinski et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8618), reduktive Amimierung (Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746; Gat et al. Biopolymers, 1998, 48, 19), S_N2 Reaktionen (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961; Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148; Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151) Konjugat-Addition von Thiolen (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961) und Phosphoester oder Phosphonamid Bildung (Orgel et al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109; Luther et al. Nature, 1998, 396, 245), können diese Ergebnisses die Sequenz-spezifische Translation von DNA-Bibliotheken in Bibliotheken von strukturell und funktionell diversen synthetischen Produkten ermöglichen. Da winzige Mengen von Matrizen-kodierenden gewünschten Molekülen durch PCR amplifiziert werden können, sind die Ausbeuten der DNA-Matrizen basierenden Reaktionen wohl weniger kritisch, als die Ausbeuten von traditionell synthetischen Umwandlungen. Nichtsdestotrotz verliefen viele der oben entwickelten Reaktionen effizient. Durch Demonstrieren, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese in der Abwesenheit von Proteinen eine großen Vielfalt von chemischen Reaktionen lenken kann, unterstützen diese Ergebnisse zusätzlich früher fortgeschlagene Hypothesen, dass die Nukleinsäure-Matrizen basierende Synthese replizierbare Information in einige der frühesten funktionellen Molekülen, wie Polypeptide, Terpene und Polypeptide vor der Entwicklung der Protein-basierenden Enzyme translatiert haben kann. Die Vielfalt der hier gezeigten Chemie, einfach durch das Bringen der Reaktanten in die Nachbarschaft durch DNA-Hybridisierung ohne offensichtliche strukturelle Anforderungen kontrollierbar zu sein, bietet eine experimentelle Basis für diese Möglichkeiten. Die Translation von amplifizierbarer Information in eine große Auswahl von Strukturen ist eine Schlüsselanforderung für das Anwenden des molekularen Evolutionsansatzes der Natur für die Entwicklung von nicht-natürlichen Molekülen mit neuen Funktionen.
Verfahren für beispielhafte Reaktionen für die Verwendung in der DNA-Matrizen basierenden Synthese:
Funktionalisierte Matrizen und Reagenzien wurden üblicherweise durch Reagieren von 5'-NH₂-begrenzten Oligonukleotiden (für Matrize 1), 5'-NH₂-(CH₂O)₂-begrenzten Oligonukleotiden (für alle anderen Matrizen) oder 3'-OPO₃-CH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₄NH₂ begrenzten Nukleotiden (für alle Reagenzien) mit den geeigneten NHS-Estern (0,1 Volumen einer 20 mg/mL Lösung in DMF) in 0,2 M Natriumphosphat Puffer, pH 7,2, 25°C, 1 h hergestellt, um die Matrizen- und Reagenzstrukturen, die in den 13 und 15 gezeigt sind, bereitzustellen. Für Aminosäure-gebundene Reagenzien 6 bis 9, wurden 3'-OPO₃CH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₄NH₂ begrenzte Oligonukleotide in 0,2 M Natriumphosphat Puffer, pH 7,2 mit 0,1 Volumina einer 100 mM bis[2-Succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES, Pierce] Lösung in DMF für 10 min. bei 35°C, gefolgt von 0,3 Volumina einer 300 mM Aminosäure in 300 mM NaOH für 30 min. bei 25°C reagiert.
Funktionalisierte Matrizen und Reagenzien wurden unter Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25, gefolgt von Umkehrphasen HPLC (0,1 Triethylammoniumacetat-Acetonitril-Gradient) gereinigt und durch MALDI Massenspektometrie charakterisiert. DNA-Matrizen basierende Reaktionen wurden unter den in 13 und 15 beschriebenen Bedingungen ausgeführt und die Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese und MALDI Massenspektometrie charakterisiert.
Die Sequenzen der Oligonukleotid-Matrizen und Reagenzien waren wie folgt (5' bis 3' Richtung, n bezieht sich auf die Anzahl der Basen zwischen den reaktiven Gruppen, wenn die Matrize und das Reagenz wie in 16 annealed sind). 1: TGGTACGAATTCGACTCGGG; 2 und 3 übereinstimmen: GAGTCGAATTCGTACC; 2 und 3 nichtübereinstimmend: GGGCTCAGCTTCCCCA; 4 und 5: GGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT; 6–9 übereinstimmen (n = 10): TCCCGAGTCG; 6 übereinstimmend (n = 10): AATTCGTACC; 6–9 übereinstimmend: TCACCTAGCA; 11, 12, 14, 17, 18, 20: GGTACGAATTCGACTCGGGA; 10, 13, 16, 19, übereinstimmend: TCCCGAGTCGAATTCGTACC; 10, 13, 16, 19 nichtübereinstimmend: GGGCTCAGCTTCCCCATAAT; 15 übereinstimmend; AATTCGTACC; 15 fehlübereinstimmend: TCGTATTCCA; Matrize für n = 10 vs. n = 0 Vergleich: TAGCGATTACGGTACGAATTCGACTCGGGA.
Die Reaktionsausbeuten wurden durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromid Färbung, UV Visulaisierung und CCD-basierender Densitometrie von Produkt und Matrizen-Ausgangsmaterial-Banden quantifiziert. Die Ausbeute-Berechnungen nahmen an, dass die Matrizen und Produkte mit gleicher Intensität pro Base färbten, für jene Fälle, in welchen die Produkte teilweise während der Quantifizierung doppelsträngig waren, kann die Änderung der Färbungsintensität zu höheren scheinbaren Ausbeuten führen.
Beispiel 3: Entwicklung von beispielhaften Linker
Wie durch einen Durchschnittsfachmann erkennbar ist, ist es häufig nützlich, den DNA-Anteil des Reagenzes an die Produkte während der Reaktionsentwicklung gebunden zu belassen, um die Analyse durch Gelelektrophorese zu erleichtern. Die Verwendung der DNA-Matrizen basierenden Synthese, um Bibliotheken von DNA in entsprechende Bibliotheken von synthetischen kleinen Molekülen zu translatieren, die für die in vitro Selektion geeignet sind, erfordert jedoch die Entwicklung von spaltbaren Linker, die die reaktiven Gruppen von Reagenzien mit ihren dekodierenden DNA Oligonukleotiden verbinden. Wie hierin und unten beschrieben ist, wurden drei beispielhafte Arten von Linker entwickelt (siehe 18). Für Reagenzien mit einer reaktiven Gruppe, wäre es wünschenswert, die DNA als eine Abgangsgruppe an den reaktiven Anteil zu positionieren. Unter dieser „selbstspaltbaren” Linkerstrategie, wird die DNA-reaktive Gruppe-Bindung als eine natürliche Konsequenz der Reaktion gespalten. Nur als ein Beispiel dieses Ansatzes, wurde ein fluoreszierendes Wittig-Phosphoran-Reagenz (14, betreffend 19) synthetisiert, in welchem das dekodierende DNA Oligonukleotid an eine der Aryl-Phosphin Gruppen angeheftet wurde (siehe 19, links). Die DNA-Matrizen basierende Wittig Reaktion mit Aldehyd-gebundenen Matrizen führte zu dem nahezu quantitativen Transfer der fluoreszierenden Gruppe von dem Wittig-Reagenz auf die Matrize und die gleichzeitige Freisetzung des Alkenproduktes von dem DNA Anteil des Reagenzes. Zusätzlich können Reagenzien, die mehr als eine reaktive Gruppe tragen, an ihre dekodierenden DNA Oligonukleotide durch eine von zwei zusätzlichen Linkerstrategien gebunden werden. In der „narbenlosen” Linkerstrategie wird die DNA-Matrizen basierende Reaktion von einer reaktiven Gruppe durch die Spaltung des Linkers, der durch eine zweite reaktive Gruppe gebunden ist, gefolgt, um Produkte ohne das Hinterlassen von zusätzlicher chemischer Funktionalität zu ergeben. Zum Beispiel wurde eine Reihe von Aminosäure Reagenzien synthetisiert, welche durch einen Carbamoylethylsulfon-Linker an ihre dekodierenden DNA Oligonukleotide gebunden waren (19, Mitte). Die Produkte der DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildung unter Verwendung dieser Aminosäure Reagenzien wurden mit wässrigem alkalischenm Puffer behandelt, um die quantitative Eliminierung und spontane Decarboxylierung der Carbamoyl-Gruppe zu bewirken. Das Produkt, das diesen narbenlosen Linker verlässt, ist deshalb der sauber-transformierte Aminosäure-Anteil. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann eine dritte Linker-Strategie, eine „nützliche Narbe” aufgrund der Theorie benützt werden, dass es vorteilhaft sein kann, nützliche chemische Gruppen als eine Konsequenz der Linker-Spaltung einzuführen. Insbesondere kann einen „nützliche Narbe” in nachfolgenden Schritten funktionalisiert werden, und wird im Anschluss an die Linkerspaltung zurückgelassen. Zum Beispiel wurden Aminosäure Reagenzien, die durch 1,2 Diole an ihre dekodierenden DNA Oligonukleotide gebunden sind, erzeugt. Im Anschluss an die Amidbindungsbildung, wurde dieser Linker quantitativ durch die Oxidation mit NaIO₄ gespalten, um Produkte zu ergeben, die nützliche Aldehydgruppen tragen (siehe 19, rechts). Zusätzlich zu den direkt oben beschriebenen Linker, kann eine Vielzahl von weiteren Linker benutzt werden. Zum Beispiel, wie in 20 gezeigt ist, kann ein Thioester Linker durch Carbodiimed vermittelte Kopplung von Thiol-begrenzter DNA mit Carboxylat-enthaltenden Reagenzien erzeugt werden und mit wässriger Base gespalten werden. Wie die Carboxylat-Gruppe einen Zugang zu den DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildungs-Reaktionen, die oben beschrieben sind, bietet, würde dieser Linker eine „nützliche Narbe” freisetzen, wenn er gespalten wird (siehe 20). Alternativ kann der Thioester-Linker als ein selbstspaltbarer Linker während einer Aminacylierungs-Reaktion in der Gegenwart von Ag(I) Kationen verwendet werden (siehe Zhang et al. J. Am. Chem. Coc. 1999, 121, 3311–3320), da der Thiol-DNA-Anteil des Reagenzes als eine natürliche Konsequenz der Reaktion freigesetzt wird. Es ist erkennbar, dass ein Thioether-Linker, der oxidiert und bei pH 11 eliminiert werden kann, um ein Vinylsulfon freizusetzen, als ein „nützlicher Narben”-Linker benutzt werden kann. Wie hierin demonstriert ist, dient die Vinylsulfon-Gruppe als das Substrat in einer Vielzahl von nachfolgenden DNA-Matrizen basierenden Reaktionen.
Beispiel 4: Beispielhafte Reaktionen in organischen Lösungsmitteln:
Wie hierin demonstriert ist, können eine Vielzahl von DNA-Matrizen basierenden Reaktionen in wässrigen Medien stattfinden. Es wurde auch demonstriert, wie oben diskutiert, dass DNA-Matrizen basierende Reaktionen in organischen Lösungsmitteln stattfinden können, was somit den Umfang der DNA-Matrizen basierenden Synthese stark erweitert. Insbesondere wurden DNA-Matrizen und Reagenzien mit langkettigen Tetraalkylammonium-Kationen komplexiert (siehe, Jost et al. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 2143; Mel'nikov et al. Langmuir, 1999, 15, 1923–1928), um die quantitative Auflösung von Reaktionskomponenten in wasserfreien organischen Lösungsmitteln, einschließlich CH₂Cl₂, CHCl₃, DMF und MeOH zu ermöglichen. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die DNA-Matrizen basierende Synthese tatsächlich in wasserfreien organischen Lösungsmitteln mit hoher Sequenzselektivität stattfinden kann. Gezeigt in 21 sind DNA-Matrizen basierende Amidbindungbildungsreaktionen, in welchen die Reagenzien und Matrizen mit Dimethyldidodecylammonium-Kationen entweder in getrennten Gefäßen oder nach vorhergehendem Anlagern in Wasser komplexiert werden, zur Trockenheit lyophilisiert, in CH₂Cl₂ aufgelöst und zusammengemischt werden. Übereinstimmende, jedoch nicht nichtübereinstimmende, Reaktionen lieferten Produkte sowohl wenn die Reaktanten in wässriger Lösung preannealed wurden als auch wenn sie für das erste Mal in CH₂Cl₂ gemischt wurden (siehe 21). Die DNA-Matrizen basierende Amidbildung und die Pd-mediierte Heck-Kopplung in wasserfreiem DMF verlief ebenfalls Sequenz-spezifisch. Offensichtlich implizieren diese Beobachtungen der Sequenz-spezifischen DNA-Matrizen basierenden Synthese in organischen Lösungsmittel die Gegenwart von zumindest etwas Sekundärstruktur innerhalb der Tetraalkylammonium-komplexierten DNA in organischen Medien, und sollte die Entwicklung von DNA Rezeptoren und Katalysatoren in Richtung stereoselektiver Bindung oder katalytischen Eigenschaften in organischen Lösungsmitteln ermöglichen. Insbesondere können DNA-Matrizen basierende Reaktionen, von denen bekannt ist, dass sie in wässrigen Medien auftreten, einschließlich Konjugat-Additionen, Cycloadditionen, Verdrängungsreaktionen, und Pd-mediierte Kopplungen, ebenfalls in organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden. In bestimmten anderen Ausführungsformen können die Reaktionen in organischen Lösungsmitteln benützt werden, die in Wasser ineffizient oder unmöglich durchzuführen sind. Während z. B. die Ru-katalysierte Olefin-Metathese in Wasser durch Grubbs und Mitarbeiter berichtet wurde (siehe, Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1627–1628; Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6601–6609; Mohr et al. Organometallics 1996, 15, 4317–4325) ist das wässrige Metathesesystem äußerst sensitiv gegenüber funktionellen Gruppen. Die funktionelle Gruppentoleranz der RU-katalysierten Olefin-Metathese in organischen Lösungsmitteln ist jedoch signifikant robuster. Einige beispielhafte Reaktionen, die in organischen Lösungsmitteln ausgenutzt werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die 1,3-dipolare Cycloaddition zwischen Nitronen und Olefinen, welche über Übergangszustände verlaufen kann, die weniger polar sind, als die Grundzustands Ausgangsmateralien.
Wie oben detailliert ist, wurde die Allgemeingültigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese durch Ausführen von mehreren unterschiedlichen DNA-Matrizen basierenden Reaktionsarten etabliert, keine von diesen ist auf das Erzeugen von Struktur beschränkt, die dem natürlichen Nukleinsäurerückgrat ähnlich ist, und viele von diesen sind äußerst nützliche Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsbildungs- oder Komplexitäts-bildende synthetische Reaktionen. Es wurde gezeigt, dass die Entfernungsunabhängigkeit der DNA-Matrizen basierenden Synthese ermöglicht, dass unterschiedliche Regionen einer DNA-Matrize jeweils unterschiedliche synthetische Reaktionen kodieren. Die DNA-Matrizen basierende Synthese kann die Sequenzgenauigkeit aufrechterhalten, sogar in einem Bibliotheksformat, in welchem mehr als 1000 Matrizen und 1000 Reagenzien gleichzeitig in einem Gefäß reagieren. Wie oben und unten beschrieben ist, wurden Linker Strategien entwickelt, welche zusammen mit den entwickelten Reaktionen, wie oben beschrieben, die erste mehrstufige DNA-Matrizen basierende Synthese von einfachen synthetischen kleinen Molekülen ermöglicht haben. Zusätzlich wurde die Sequenz-spezifische DNA-Matrizen basierende Synthese in organischen Lösungsmitteln demonstriert, was den Umfang dieses Ansatzes erweitert.
Beispiel 5: Synthese von beispielhaften Verbindungen und Bibliotheken von Verbindungen:

A) Synthese einer Polycarbamat-Bibliothek: Eine Ausführungsform der oben beschrieben Strategie ist die Erzeugung einer amplifizierbaren Polycarbamat Bibliothek. Von den verwendeten 16 möglichen Dinukleotiden, um die Bibliothek zu kodieren, wird einem eine Startkodonfunktion zugeordnet, und einem wird zugeordnet, als Stoppkodon zu dienen. Ein künstlicher genetischer Code wird dann durch Zuordnen von jedem der bis zu 14 verbleibenden Dinukleotiden zu einem unterschiedlichen Monomer erzeugt. Aus geometrischen Gründen enthält ein Monomer tatsächlich ein Dicarbamat, welches zwei Seitenketten aufweist. Innerhalb jedes Monomers wird das Dicarbamat an das entsprechende Dinukleotid angeheftet (analog zu einem tRNA Antikodon), durch einen Silylenolether Linker, welcher die native DNA und das freie Carbamat bei der Behandlung mit Fluorid freisetzt. Der Dinukleotidanteil existiert als das aktivierte 5'-2-Methyllimidazolphosphat, welches demonstriert würde (Inoue et al. J. Mol. Biol. 162: 201, 1982; Rembold et al. J. Mol. Evol. 38: 205, 1994; Chen et al. J. Mol. Biol. 181: 271, 1985; Acevedo et al. J. Mol. Biol. 197: 187, 1987; Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 103: 7666, 1981), als eine exzellente Abgangsgruppe für die Matrizen-gerichtete Oligomerisierung von Nukleotiden zu dienen, ist dennoch relativ stabil unter neutralen oder basischen wässrigen Bedingungen (Schwartz et al. Science 228: 585, 1985). Der Dicarbamat-Anteil existiert in einer zyklischen Form, die durch einen Vinyloxycarbonat-Linker verbunden ist. Die Vinyloxycarbonat-Gruppe wurde demonstriert, in neutralen oder basischen wässrigen Bedingungen stabil zu sein (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18: 1563, 1977; Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18: 1567, 1977; Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18: 1571, 1977) und es wurde weiters gezeigt, dass es Carbamate in sehr hohen Ausbeuten bei der Zugabe von Aminen bereitstellt (Olofson et. al. Tetrahedron Lett. 18: 1563, 1977)

Der Vinylcarbonat-Linker, wenn durch ein Amin von einer naszierenden Polycarbamatkette angegriffen, angetrieben durch die Aromatisierung von m-Cresol, setzt ein freies Amin frei. Dieses freie Amin dient nachfolgend als das Nukleophil, um das nächste Vinyloxycarbonat anzugreifen, was die Polymerisierung der wachsenden Carbamatkette propagiert. Eine solche Strategie minimiert das Potential der Kreuzreaktivität und bidirektionalen Polymerisierung durch Sicherstellen, dass nur ein Nukleophil zu jeder Zeit während der Polymerisierung vorhanden ist.
Unter Verwendung des oben beschriebenen Monomers, kann die künstliche Translation von DNA in ein Polycarbamat als ein drei-stufiger Prozess betrachtet werden. Bei der ersten Stufe werden einzelsträngige DNA-Matrizen, die die Bibliothek kodieren, verwendet, um den Zusammenbau und die Polymerisierung der Dinukleotidanteile der Monomere zu führen, welche mit den „Stopp” Monomer beendet wird, welche einen 3' Methylether an Stelle einer 3'Hydroxylgruppe besitzt (22).
Sobald die Nukleotide zusammengebaut sind und in die doppelsträngige DNA polmerisiert sind, wird das „Start”-Monomer, welches mit einem o-Nitrobenzylcarbamat endet, photoschutzeliminert, um das primäre Amin freizulegen, welches die Carbamatpolymerisierung initiiert. Die Polymerisierung verläuft in die 5' bis 3' Richtung entlang des DNA-Rückgrats, wobei jeder nukleophile Angriff zu einem nachfolgenden Entmaskieren eines neuen Amin-Nukleophils führt. Der Angriff auf das „Stopp”-Monomer setzt ein Acetamid anstelle eines Amins frei, wodurch die Polymerisierung beendet wird (23). Da die DNA bei dieser Stufe in einer stabilen doppelsträngigen Form existiert, können Variablen, wie die Temperatur und pH, ausgenutzt werden, um die Polymerisierungswirksamkeit zu optimieren.
Im Anschluss an die Polymerisierung wird das Polycarbamat von dem Phosphatrückgrat der DNA durch die Behandlung mit Fluorid abgespalten. Die Desilylierung des Enolether-Linkers und der Eliminierung des Phosphats, angetrieben durch die resultierende Freisetzung von Phenol, liefert das Polycarbamat, welches an seinem Carboxy-Terminus an seine kodierende einzelsträngige DNA kovalent gebunden ist. (24).
An dieser Stufe kann das Polycarbamat vollständig von der DNA freigesetzt werden, durch Basenhydrolyse der Esterbindung. Das freigesetzte Polycarbamat kann durch HPLC gereinigt werden und erneut getestet werden, um zu verifizieren, dass seine gewünschten Eigenschaften intakt sind. Die freie DNA kann unter Verwendung von PCR amplifiziert werden, mit error-prone PCR (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2: 28, 1992) oder DNA shuffling mutiert (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747, 1994; Stemmer Nature 370: 389, 1994; U. S. Patent 5,811,238 , erteilt am 22. September, 1998;), und/oder sequenziert, um die Primärstruktur des Polycarbamats zu offenbaren.
Synthese der Monomer Einheiten. Nachdem die Monomere synthetisiert sind, sollten der Zusammenbau und die Polymerisierung der Monomere auf dem DNA Gerüst spontan stattfinden. Shikimisäure 1, kommerziell erhältlich, biosynthetisch (Davis Adv. Enzymol. 16: 287, 1955; durch Bezugnahme hierin ausgenommen) oder durch kurze Synthesen aus D-Mannose (Fleet et al. J. Chem. Soc., Perkins Trans. 1905, 1984; Harvey et al. Tetrahedron Lett. 32: 4111, 1991;) dient als ein geeigneter Startpunkt für die Monomer-Synthese. Die syn Hydroxyl Gruppen werden als das p-Methoxybenzyliden, und die verbleibenden Hydroxylgruppen als der tert-Butyldimethylsilyl-Ether, geschützt, um 2 zu ergeben. Der Carboxylat-Anteil der geschützten Shikimisäure wird dann vollständig durch LAH Reduktion reduziert, Tosylierung des resultierenden Alkohols, und weitere Reduktion mit LAH, um 3 zu ergeben.
Kommerziell enthältliche und synthetisch zugängliche N-geschützte Aminosäuren dienen als die Ausgangsmaterialien für den Dicarbamat-Anteil von jedem Monomer. Reaktive Seitenketten werden als photolabile Ether, Ester, Acetale, Carbamate oder Thioether geschützt. Das Nacharbeiten einer früher entwickelten Chemie (Cho et al. Science 261: 1303, 1993) wird eine gewünschte Aminosäure 4 in den entsprechenden Aminoalkohol 5 durch gemischte Anhydrid-Bildung mit Isobutylchlorformat, gefolgt von der Reduktion mit Natriumborhydrid umgewandelt. Der Aminoalkohol wird dann in das aktivierte Carbonat durch Behandlung mit p-Nitrophenylchlorformat umgewandelt, um 6 zu ergeben, welches dann an einen zweiten Aminoalkohol 7 gekoppelt wird, um, im Anschluss an die Silylierung der Hydroxylgruppe und FMOC Schutzeliminierung, Carbamat 8 zu ergeben.
Die Kopplung von Carbamat 8 auf den die Shikimisäure-abgeleiteten Linker verläuft wie folgt. Die allylische Hydroxylgruppe von 3 wird mit TBAF schutzeliminiert, mit Trifluormethansulfonsäure-Anhydrid behandelt, um das sekundäre Triflat zu bilden, dann mit Aminocarbamat 8 verdrängt, um 9 zu ergeben. Die Gegenwart der vinylischen Methylgruppe in 3 sollte beim Minimieren der Menge an ungewünschtem Produkt, welches von der S_N2' Addition resultiert, assistieren (Magid Tetrahedron 36: 1901, 1980). Die Michael Additionen von deprotonierten Carbamaten an α,β-ungesättigte Ester sind gut dokumentiert (Collado et al. Tetrahedron Lett. 35: 8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107: 1797, 1985, Nagasaka et al. Heterocycles 29: 155, 1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987; Hirama et al. Heterocycles 28: 1229, 1989). Analog wird das sekundäre Amin als das O-Nitrobenzyl-Carbamat (NBOC) geschützt, und die resultierende Verbindung wird an dem Carbamat-Stickstoff deprotoniert. Die Deprotonierung kann typischerweise mit entweder Natriumhydrid oder Kalium tert-Butyloxid durchgeführt werden (Collado et al. Tetrahedron Lett. 35: 8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107: 1797, 1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29: 2155, 1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987; Hirama et al. Heterocycles 28: 1229, 1989), obwohl andere Basen ausgenützt werden können, um die Deprotonierung des nitrobenzylischen Protons zu minimieren. Additionen des deprotonierten Carbamats an das α,β-ungesättigtes Keton 10, gefolgt durch das Abfangen des resultierenden Enolats mit TBSCl, sollte den Silylenol Ether 11 ergeben. Die zuvorgefundene Stereoselektivität von Konjugat-Additionen an 5-substituierte Enone, wie 10 (House et al. J. Org. Chem. 33: 949, 1968; Still et al. Tetrahedron 37: 3981, 1981) weist auf die bevorzugte Bildung von 11 übers ein Diastereomer hin. Keton 10, der Vorläufer des Fluorid-spaltbaren Carbamat-Phosphat-Linkers, kann aus 2 durch ein-Gefäß-Decarboxylierung synthetisiert werden (Barton et al. Tetrahedron 41: 3901, 1985), gefolgt durch die Behandlung mit TBAF, Swern Oxidierung des resultierenden Alkohols, um 12 zu ergeben, Schutzeliminierung mit DDQ, selektive Nitrobenzyl-Etherbildung des weniger gehinderten Alkohols, und Reduktion der α-Hydroxyl-Gruppe mit Samariumiodid (Molander In Organic Reactions, Paquette, Herausgeber 46: 211, 1994).
Die p-Methoxybenzylidien Gruppe von 11 wird in den α-Hydroxy PMB Ether unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid und TMS Chlorid umgewandelt (Johannson et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2371, 1984) und die TES Gruppe mit 2% HF schutzeliminiert (Bedingungen, die den TBS Ether nicht beeinflussen sollten (Boschelli et al. Tetrahedron Lett. 26: 5239, 1985)), um 13 zu ergeben. Die PMB Gruppe, dem vorangehenden folgend, (Johannson et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2371, 1984; Sutherlin et al. Tetrahedron Lett. 34: 4897, 1993) sollte auf dem stärker gehinderten sekundären Alkohol zurückbleiben. Die zwei freien Hydroxyl-Gruppen können durch die sehr langsame Zugabe von 13 zu einer Lösung von p-Nitrophenylchlorformat (oder einem anderen Phosgen-Analogon) makrozyklisiert werden, was 14 bereitstellt. Der PMB-Ether wird schutzeliminiert, und der resultierende Alkohol in ein Triflat umgewandelt und unter kinetischen Bedingungen mit einer sterisch-behinderten Base eliminiert, um Vinyloxycarbonat 15 zu ergeben. Die Photoschutzeliminierung des Nitrobenzyl-Ethers und Nitrobenzylcarbamat ergibt Alkohol 16.
Die Monomer Synthese wird durch die sequenzielle Kopplung von 3 Komponenten abgeschlossen. Chlordiisopropylaminophospin 17 wird durch die Reaktion von PCl₃ mit Diisopropylamin synthetisiert (King et al. J. Org. Chem. 49: 1784, 1984). Harzgebundenes (oder 3'-o-Nitrobenzylether geschützes) Nukleosid 18 wird an 17 gekoppelt, um Phosphoramidit 19 zu ergeben. Die nachfolgende Kopplung von 19 mit dem Nukleosid 20 (Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 103: 7666, 1981) liefert 21. Alkohol 16 wird dann mit 21 reagiert, um nach der sorgfältigen Oxidation unter Verwendung von MCPBA oder I₂, gefolgt von der Spaltung von dem Harz (oder Photoschutzeliminierung), das vollständige Monomer 22 zu ergeben. Diese Strategie der sequenziellen Kopplung von 17 mit Alkoholen wurde erfolgreich verwendet, um Phosphate, die drei unterschiedliche Alkoxysubstituenten tragen, mit exzellenten Ausbeuten zu erzeugen (Bannwarth et al. Helv. Chim. Acta 70: 175, 1987).
Die einzigartigen verwendeten Start und Stopp-Monomere, um die Carbamat Polymerisierung zu induzieren und zu beendigen, können durch einfache Modifikation des obigen Schemas synthetisiert werden.

B) Entwickelbare funktionalisierte Peptid-Nukleinsäuren (PNAs): In einer anderen Ausführungsform wird eine amplifizierbare Peptid-Nukleinsäure-Bibliothek erzeugt. Orgel und Mitarbeiter haben demonstriert, das Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) Oligomere zu der effizienten Polymerisierung auf komplementären DNA oder RNA Matrizen in der Lage sind (Böhler et al. Nature 376: 578, 1995; Schmidt et al. Nucl. Acids Res. 25: 4792, 1997). Diese Erkenntnis zusammen mit der kürzlichen Synthese und Charakterisierung von chiralen Peptid Nukleinsäuren, die Aminosäure-Seitenketten tragen (Haaima et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1939–1942, 1996; Püschl et al. Tetrahedron Lett. 39: 4707, 1998), ermöglicht die Vereinigung des Polymerrückgrats und des wachsenden Nukleinsäure-Strangs in eine einzige Struktur. In diesem Beispiel besteht jede Matrize aus einer DNA Haarnadel, die in einer 5' Aminogruppe endet; die Festphase und Lösungssynthese von solchen Molekülen wurden früher beschrieben (Uhlmann et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2632, 1996). Jedes Erweiterungsmonomer besteht aus einem PNA Trimer (oder länger), welches Seitenketten trägt, welche Funktionalität von Interesse enthalten. Ein künstlicher genetischer Code wird geschrieben, um jedes Trinukleotid einem unterschiedlichen Satz von Seitenketten zuzuordnen. Der Zusammenbau, die Aktivierung (z. B. mit einem Carbodiimid und entsprechender Abgangsgruppe), und Polymerisierung der PNA Dimere entlang der komplementären DNA-Matrize in der Carboxy- zu Amino-terminalen Richtung ergibt das unnatürliche Polymer (20). Wählen eines „Stopp” Monomers mit einem biotinylierten N-Terminus stellt einen geeigneten Weg zum Beenden der Erweiterung und Reinigen von Polymeren mit voller Länge bereit. Die resultierenden Polymere, die kovalent an ihre kodierende DNA gebunden sind, sind für die Selektion, Sequenzierung oder Mutation bereit.

Der experimentelle Ansatz in Richtung des Implementieren einer entwickelbaren funktionalisierten Peptid-Nukleinsäure-Bibliothek enthält (i) Verbessern und Adaptieren bekannter Chemie für die hoch effiziente Matrizen-gerichtete Polymerisierung von PNAs; (ii) Definieren eines Kodonformats (Länge und Zusammensetzung), das für die PNA Kopplung einer Anzahl von unterschiedlichen Monomeren an einen komplementären Strang von kodierender DNA, die frei von signifikanter Ungenauigkeit, Rahmenverschiebung, oder falsche Initiierung der Polymerisierung ist, geeignet ist; (iii) Auswählen eines anfänglichen Satzes von Seitenketten, die unseren neuen genetischen Code definieren und Synthetisieren entsprechender Monomere; und (iv) Unterziehen einer Bibliothek von funktionalisierten PNAs Zyklen von Selektion, Amplifikation und Mutation und Charakterisieren der resultierenden, entwickelnden Moleküle, um die Basis ihrer neuartigen Aktivitäten zu verstehen.

(i) Verbessern der Kopplungschemie: Während Orgel und Mitarbeiter die Matrizen-gerichtete DNA-Polymerisation berichtet haben, sind die berichteten Ausbeuten und Anzahl von erfolgreichen Kopplungen signifikant geringer als gewünscht wäre. Eine vielversprechende Route in Richtung des Verbesserns dieses Schlüsselkopplungsprozesses ist das Auffinden neuer Kopplungsreagenzien, Temperaturen und Lösungsmittel, welche zuvor nicht untersucht wurden (vermutlich da sich frühere Bemühungen auf Bedingungen konzentriert haben, welche auf der präbiotischen Erde existiert haben könnten). Die Entwicklung von entwickelbaren funktionalisierten PNA-Polymeren enthält das Einsetzen von Aktivatoren (DCC, DIC, EDC, HATU/DIEA, HBTU/DIEA, ByBOP/DIEA, Chloracetonitril), Abgangsgruppen (2-Methylimidazol, Imidazol, Pentafluorphenol, Phenol, Thiophenol, Trifluoracetat, Acetat, Toluensulfonsäure, Coenzym A, DMAP, Ribose), Lösungsmittel (wässrig bei mehreren pH-Werten, DMF, DMSO, Chloroform, TFE), und Temperatur (0°C, 4°C, 25°C. 37°C, 55°C) in einem großen kombinatorischen Screen, um neue Kopplungsbedingungen zu isolieren. Jede Kammer einer 384-Kammerplatte wird einer spezifischen Kombination von einem Aktivator, einer Abgangsgruppe, einem Lösungsmittel und einer Temperatur zugeordnet. Festphasen-Synthesekügelchen, die kovalent an DNA-Haarnadel Matrizen gebunden sind, werden in jeder Kammer zusammen mit einem Fluoreszenz-markierten DNA-Monomer, welches zu der Matrize komplementär ist, platziert. Ein erfolgreicher Kopplungsvorgang führt zu der kovalenten Bindung des Fluorophors an das Kügelchen (26); ungewünschte nicht-Matrizen basierende Kopplungen können durch Kontrollereaktionen mit nicht übereinstimmenden Monomeren unterschieden werden. Im Anschluss an die Kügelchen-Waschung und Spaltung des Produktes von dem Feststoffenträger wird jede Kammer mit einem Fluoreszenz Plattenleser untersucht.
(ii) –Definieren eines Kodonformats: Während die Natur erfolgreich ein Tripletkodon in der Protein-Biosynthese eingesetzt hat, kann ein neues Polymer, welches unter sehr unterschiedlichen Bedingungen ohne die Assistenz von Enzymen zusammengebaut wird, einen komplett neuartiges Kodonformat erfordern. Rahmenverschiebung kann durch Verlängern jedes Kodons, so dass die Hybridisierung eines Kodons außerhalb des Rahmens eine Nichtübereinstimmung garantiert (zum Beispiel, durch Starten jedes Kodons mit einem G und durch Beschränken nachfolgender Positionen in dem Kodon auf T, C und A), beseitigt werden. Es würde thermodynamisch erwartet werden, dass sich die Genauigkeit mit zunehmender Kodonlänge bis zu einem Punkt verbessert. Kodons, die übermäßig lang sind, werden jedoch in der Lage sein, trotzt nichtübereinstimmender Basen zu hybridisieren und verkomplizieren außerdem die Monomer-Synthese. Eine optimale Kodonlänge für die künstliche Translation mit hoher Genauigkeit kann unter Verwendung eines optimierten Platten-basierenden kombinatorischen Screens, der oben entwickelt wurde, definiert werden. Die Länge und die Zusammensetzung jedes Kodons in der Matrize wird durch Festphasen-Synthese der geeignete DNA-Haarnadel variiert. Diesen Matrizen-Haarnadeln wird dann ermöglicht, mit Fluoreszenz-markierten PNA-Monomeren mit variierender Sequenz zu koppeln. Das ideale Kodonformat ermöglicht nur Monomeren, die die exakte komplementäre Sequenz tragen, mit den Matrizen zu koppeln, sogar in der Anwesenheit von nichtübereinstimmenden DNA-Monomeren (welche unterschiedlich markiert sind, um das Untersuchen der übereinstimmenden versus nichtübereinstimmenden Kopplung zu erleichtern). Triplet und Vierer-Kodons, in welchen zwei Basen unter A, T und C variiert werden, während die restliche Base oder Basen als G fixiert sind, um eine richtige Registrierung während der Polymerisierung sicherzustellen, werden als Erstes studiert.
(iii) Schreiben eines neuen genetischen Codes: Seitenketten werden ausgewählt, welche eine interessante Funktionalität bereitstellen, die in den natürlichen Biopolymeren nicht notwendigerweise vorhanden ist, welche synthetisch zugänglich sind, und welche mit den Kopplungsbedingungen kompatibel sind. Zum Beispiel besteht ein einfacher genetischer Code, welcher verwendet werden könnte, um eine Ni⁺² Chelat-bildende PNA zu entwickeln, aus einer Vielzahl von geschützten Carboxylat tragenden Seitenketten sowie einem Satz aus kleinen Seitenketten, um die Polymere mit konformativer Flexibilität und struktureller Diversität auszustatten (27), Die erfolgreiche Selektion von PNAs, die in der Lage sind, Ni⁺² mit hoher Affinität zu binden, könnten durch eine Expansion dieses genetischen Codes gefolgt werden, um ein Fluorophor sowie einen fluoreszierenden Quencher zu beinhalten. Die resultierenden Polymere könnten dann in Richtung eines fluoreszierenden Ni⁺² Sensors entwickelt werden, welcher unterschiedliche fluoreszierende Eigenschaften in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Nickel besitzt. Das Ersetzen der fluoreszierenden Seitenkette mit einer photocaged Seitenkette kann die Entwicklung von Polymeren ermöglicht werden, die Ni⁺² in der Gegenwart von bestimmten Lichtwellenlängen chelatieren oder welche Ni⁺² bei der Photolyse freisetzen. Diese einfachen Beispiele demonstrieren die enorme Flexibilität in potenziellen chemischen Eigenschaften von entwickelbaren unnatürlichen Molekülen, die durch die Freiheit verliehen wird, synthetische Baueinheiten, die nicht länger auf jene limitiert sind, die mit der ribosomalen Maschinerie kompatibel sind, einzubauen.
(iv) Selektieren auf gewünschte unnatürliche Polymere: Viele der entwickelten Verfahren für das Selektieren von biologischen Molekülen können auf das Selektieren von entwickelten PNAs mit gewünschten Eigenschaften angewendet werden. Ähnlich wie die Nukleinsäuren oder Phage-Display Selektionen, sind die Bibliotheken von unnatürlichen Polymeren, die durch die obenbeschriebenen DNA-Matrizen basierenden Polymerisierungsverfahren erzeugt werden, selbst-markiert und müssen deshalb nicht räumlich getrennt oder auf Pins oder Kügelchen synthetisiert werden. Die Bindung von Ni⁺² an die PNA kann leicht durch das Hindurchleiten der gesamten Bibliothek, welche von der Translation resultiert, oder eines zufälligen Oligonukleotids durch ein kommerziell erhältliches Ni-NTA („His-Tag”) Harz, welches mit Nickel vorgeladen ist, erreicht werden. Die gewünschten Moleküle binden an das Harz und werden mit EDTA eluiert. Die Sequenzierung dieser PNAs nach mehreren Zyklen bestehend aus Selektion, Mutagenese und Amplifikation offenbarte, welche der anfänglich ausgewählten Seitenketten zusammenlagern können, um einen Ni⁺² Rezeptor zu bilden. Zusätzlich repräsentiert die Isolierung eines PNA Ni⁺² Chelators das DNA Äquivalent eines Histidin Tags, welches sich als nützlich für die Reinigung von nachfolgenden unnatürlichen Polymeren herausstellen kann. Spätere Anstrengungen werden ambitioniertere Selektionen beinhalten. Zum Beispiel können PNAs, die in der Gegenwart von spezifischen Liganden fluoreszieren, durch FACS-Sortierung von translatierten Polymeren, die durch ihre DNA-Matrizen an Kügelchen gebunden sind, selektiert werden. Jene Kügelchen, die in der Gegenwart, jedoch nicht in der Abwesenheit, des Zielliganden fluoreszieren, werden isoliert und charakterisiert. Schlußendlich ermöglicht die Verwendung eines biotinylierten „Stopp” Monomers, wie oben beschrieben, die direkte Selektion für die Katalyse von vielen Bindungsbildungs- oder Bindungsbrechungsreaktionen. Zwei in 28 dargestellte Beispiele behandeln eine Selektion einer funktionalisierten PNA, die die Retroaldol-Spaltung von Fruktose 1,6-bisphosphat zu Glyceraldehyd 3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat katalysiert, einem essenziellen Schritt in der Glycolyse, sowie eine Selektion für PNA, die die umgekehrte Aldol-Reaktion katalysieren.
C) Entwickelbare Bibliotheken von kleinen Molekülen: In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen von amplifizierbaren und entwickelbaren unnatürlichen, nichtpolymer-Molekülen, einschließlich synthetischen Arzneimittelgerüsten, verwendet. Nukleophile oder elektrophile Gruppen werden individuell auf einem kleinen Molekülgerüst, welches durch eine einfache kovalente Bindung oder durch einen gewöhnlichen Feststoffträger an eine kodierende Oligonukleotid-Matrize gebunden ist, maskiert. Elektrophile oder nukleophile Reaktanten, die an kurze Nukleinsäure-Sequenzen gebunden sind, werden an die entsprechenden Matrizen hybridisiert. Sequenz spezifische Reaktion mit dem geeigneten Reagenz findet durch Proximität-Katalyse statt (29).

Im Anschluss an die synthetische Funktionalisierung von allen Positionen auf eine Weise, die durch die Sequenz der angelagerten DNA bestimmt ist (30 & 31), können die resultierenden kodierenden Kügelchen einer großen Auswahl von biologischen Screens, welche für das Untersuchen von Verbindungen auf Harz entwickelt wurden, unterzogen werden (Gordon et al. J. Med. Chem. 37: 1385, 1994; Gallop et al. J. Med. Chem. 37: 1233–1251, 1994;)
Die kodierende DNA wird von jedem in dem Screen identifizierten Kügelchen abgespalten und einer PCR, Mutagenese, Sequenzierung, oder homologen Rekombination vor der erneuten Anheftung an einen Feststoffträger unterzogen. Letztendlich ist dieses System am flexibelsten wenn die kodierende DNA direkt auf das kombinatorische synthetische Gerüst ohne ein Zwischenkügelchen gebunden ist. In diesem Fall kann die gesamte Bibliothek an Verbindungen auf die gewünschten Aktivitäten gescreent oder selektiert werden, ihre kodierende DNA freigesetzt, amplifiziert, mutiert, und rekombiniert werden und neue Verbindungen synthetisiert werden, alles in einer kleinen Reihe von ein-Gefäß, im Großen und Ganzen parallelen Reaktionen. Ohne einen Kügelchenträger müssen jedoch die Reaktivitäten von hybridisierten Reaktanten hoch effizient sein, da nur ein Matrizenmolekül die Synthese aller kleinen Moleküle lenkt.
Die Entwicklung von entwickelbaren synthetischen kleinen Molekülbibliotheken beruht auf der chemischen Katalyse, die durch die Proximität von DNA hybridisierten Reaktanten bereitgestellt wird. Es ist erkennbar, dass akzeptable Entfernungen zwischen hybridisierten Reaktanten und entmaskierten reaktiven Gruppen zuerst für die effiziente DNA-Matrizen basierende Funktionalisierung durch Hybridisieren radiomarkierte Elektrophile (aktivierte Ester in unseren ersten Versuchen), die an kurze Oligonukleotide in verschiedenen Entfernungen von einem reaktiven Nukleophil (einem primären Amin) auf einem DNA-Strang angeheftet sind, definiert werden müssen. Zu gegebenen Zeitpunkten werden Aliquote einer Gelelektrophorese und Autoradiographie unterzogen, um den Verlauf der Reaktion zu überwachen. Das graphische Darstellen der Reaktion als eine Funktion der Entfernung (in Basen) zwischen dem Nukleophil und Elektrophil wird ein akzeptables Distanzfenster definiert, innerhalb welchem die Proximität-basierende Katalyse einer DNA-hybridisierten Reaktion stattfinden kann. Die Breite dieses Fensters wird die Anzahl von unterschiedlichen Reaktionen, die wir auf einem Strang der DNA kodieren können (ein größeres Fenster erlaubt mehrere Reaktionen), sowie die Natur der Kodons (ein größeres Fenster ist für längere Kodons benötigt) bestimmen (32).
Sobald akzeptable Entfernungen zwischen funktionellen Gruppen auf einem kombinatorischen synthetischen Gerüst und hybridisierenden Reaktanten bestimmt ist, wird das Kodonformat bestimmt. Die nichtpolymere Natur der kleinen Molekülsynthese vereinfacht das Kodonlesen, da die Rahmenverschiebung keine Rolle spielt und relativ große Kodons verwendet werden können, um sicherzustellen, dass jeder Satz von Reaktanten nur mit einer Region des kodierenden DNA Strangs hybridisiert.
Sobald die Entfernung des Linkers zwischen der funktionellen Gruppe und dem synthetischen kleinen Molekülgerüst und das Kodonformat bestimmt wurden, können kleine Moleküle basierend auf einem kleinen Molekülgerüst, wie das in 31 gezeigte Cephalosporin-Gerüst, synthetisiert werden. Das primäre Amin der 7-säure wird zuerst unter Verwendung von FMOC-Cl geschützt, und dann wird die Acetylgruppe durch Behandlung mit einer Base hydrolisiert. Die kodierende DNA Matrize wird dann durch eine Amidbindung unter Verwendung von EDC und HOBt an die Carbonsäure-Gruppe angelagert. Einen Transfermolekül mit einem Antikodon, welches in der Lage ist, an die angehängte DNA-Matrize zu hybridisieren, wird dann ermöglicht, an die Matrize zu hybridisieren. Mit dem Transfermolekül ist durch eine Disulfidbindung ein R₁ tragendes primäres Amin assoziiert. Die Aktivierung der primären Hydroxylgruppe auf dem Cephalosporin-Gerüst mit DSC, gefolgt von der Behandlung mit TCEP, ergibt das Amin, welches durch eine Carbamatbindung kovalent an das Gerüst gebunden ist. Die weitere Behandlung mit einer weiteren Transfereinheit mit einer Aminosäure führt zu der Funktionalisierung des schutzeliminierten primären Amins auf dem Cephalosporin-Gerüst. Cephalosporin ähnliche Moleküle, die auf diese Art synthetisiert werden, können dann ausgewählt, amplifiziert, und/oder entwickelt werden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen. Die DNA-Matrize kann unter Verwendung von DNA-Shuffling diversifiziert und entwickelt werden.

D) Mehrstufige kleine Molekül Synthese, die durch DNA-Matrizen programmiert ist: Die molekulare Entwicklung erfordert die Sequenz-spezifische Translation eines amplifizierbaren Informationsträgers in die Strukturen des sich entwickelnden Moleküls. Diese Anforderung hat die Arten der Moleküle, die direkt entwickelt wurden, auf zwei Klassen, Proteine und Nukleinsäuren, beschränkt, da nur diese zwei Molekülklassen von Nukleinsäure-Sequenzen translatiert werden können. Wie oben allgemein beschrieben ist, verwendet ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung von Molekülen außer Proteinen und Nukleinsäuren die DNA-Matrizen basierende Synthese als ein Verfahren zum Translatieren von DNA-Sequenzen in synthetische kleine Moleküle. Die DNA-Matrizen basierende Synthese kann eine große Auswahl von leistungsfähigen chemischen Reaktionen mit hoher Sequenz-Spezifität und ohne das Benötigen einer strukturellen Nachahmung des DNA-Rückgrats, lenken. Die Anwendung dieses Ansatzes auf synthetischen Moleküle von nützlicher Komplexität erfordert jedoch die Entwicklung von allgemeinen Verfahren, um dem Produkt einer DNA-Matrizen basierenden Reaktion zu ermöglichen, nachfolgende DNA-Matrizen basierende Transformationen zu durchmachen. Die erste DNA-Matrizen basierende mehrstufige kleine Molekül-Synthese wird hierin detailliert beschrieben. Zusammen mit jüngsten Fortschritten in dem Reaktionsumfang der DNA-Matrizen basierenden Synthese, setzen diese Ergebnisse die Stufe für die in vitro Evolution von synthetischen kleinen Molekül-Bibliotheken.

Die mehrstufige DNA-Matrizen basierende kleine Molekül-Synthese begegnet zwei Hauptherausforderungen, die über jene hinausgehen, die im Allgemeinen mit der DNA-Matrizen basierenden Synthese assoziiert sind. Erstes muss die DNA, die verwendet wird, um die Reagenzien zu den entsprechenden Matrizen zu lenken, von dem Produkt einer DNA-Matrizen basierenden Reaktion vor den nachfolgenden DNA-Matrizen basierenden Syntheseschritten entfernt werden, um eine ungewünschte Hybridiserung an die Matrize zu verhindern. Zweitens erfordert die mehrstufige Synthese oft die Reinigung und Isolierung von Zwischenprodukten, dennoch sind gewöhnliche Verfahren, die verwendet werden, um Reaktionsprodukte zu reinigen und isolieren, für die mehrstufige Synthese in einem molekularbiologischen Maßstab nicht geeignet. Um diese Herausforderungen zu adressieren, wurden drei unterschiedliche Strategien in die Festphasen-organische Synthese implementiert, für das Verbinden chemischer Reagenzien mit ihren dekodierenden DNA-Oligonukleotiden und zwei allgemeine Ansätze für die Produktreinigung nachdem jeder DNA-Matrizen basierende synthetische Schritt entwickelt wurde.
Wenn möglich positioniert ein idealer Reagenz-Oligonukleotid-Linker für die DNA-Matrizen-basierende Synthese, das Oligonukleotid als eine Abgangsgruppe des Reagenzes. Unter dieser „selbstspaltender” Linkerstrategie wird die Oligonukleotid-Reagenzbindung als eine natürliche chemische Konsequenz der Reaktion gespalten (33). Als das erste Beispiel dieses Ansatzes, der auf die DNA-Matrizen basierende Chemie angewendet wird, wurde ein dansyliertes Wittig Phosphoran-Reagenz (1), in welchem das dekodierende DNA-Oligonukleotid an eine der Arylphosphin-Gruppen angehängt war, synthetisiert (I. Hughes, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7595). Die DNA-Matrizen basierende Wittig-Olefinierung (wie oben beschrieben) mit Aldehyd-gebundener Matrize 2 resultierte in dem effizienten Transfer der fluoreszierenden Dansylgruppe von dem Reagenz auf die Matrize, um Olefin 3 bereitzustellen (33). Als ein zweites Beispiel eines selbstspaltenden Linkers acylierte der DNA-gebundene Thioester 4, wenn mit Ag(I) bei pH 7,0 aktiviert (Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311), die Amino-begrenzte Matrize 5, um das Amidprodukt 6 zu ergeben (33). Die ribosomale Protein-Biosynthese verwendet aminoacylierte tRNAs in einem ähnlichen selbstspaltenden Linkerformat, um die RNA-Matrizen basierende Peptid-Bindungsbildung zu vermitteln. Um die gewünschten Produkte von unreagierten Reagenzien und von gespaltenden Oligonukleotiden im Anschluss an die DNA-Matrizen basierenden Reaktionen unter Verwendung von selbstspaltenden Linkem zu reinigen, wurden biotinylierte Reagenz-Oligonukleotide und Waschen der Rohreaktionen mit Streptavidin-gebundenen magnetischen Kügelchen (34) benutzt. Obwohl dieser Ansatz die reagierten Matrizen nicht von den unreagierten Matrizen trennt, können unreagierte Matrizen in nachfolgenden DNA-Matrizen basierenden Reaktionen und Reinigungsschritten entfernt werden (siehe unten).
Reagenzien, die mehr als eine funktionelle Gruppe tragen, können an ihre dekodierenden DNA-Oligonukleotide durch eine zweite und dritte Linkerstrategie gebunden werden. In dem „narbenlosen Linker”-Ansatz ist eine funktionelle Gruppe des Reagenzes für die DNA-Matrizen basierende Bindungsbildung reserviert, während die zweite funktionelle Gruppe verwendet wird, um einen Linker, der ohne das Einführen einer zusätzlichen ungewünschten chemischen Funktionalität gespalten werden kann, anzuhängen. Die DNA-Matrizen basierende Reaktion wird durch die Spaltung des Linkers, welcher durch die zweite funktionelle Gruppe angehängt ist, gefolgt, um die gewünschten Produkte zu ergeben (33). Zum Beispiel wurde eine Reihe von Aminoacylierungs-Reagenzien, wie (D)-Phe Derivat 7, in welchen das α-Amin durch einen Carbamoylethylsulfon-Linker (Zarling et al. J. Immunology 1980, 124, 913) an sein dekodierendes DNA-Oligonukleotid gebunden ist, synthetisiert. Das Produkt (8) der DNA-Matrizen basierenden Amidbindungsbildung (wie hierin beschrieben) unter Verwendung dieses Reagenzes und einer Amin-begrenzten Matrize (5) wurde mit einer wässrigen Base behandelt, um die quantitative Eliminierung und spontane Decarboxylierung des Linkers zu bewirken, was Produkt 9 ergibt, welches die sauber transferierte Aminosäure-Gruppe enthält (33). Dieser Sulfon-Linker ist in einem Puffer bei pH 7 oder niedriger bei 25°C für mehr als 24 h stabil, wird dennoch quantitativ gespalten, wenn er einem pH 11,8 Puffer für 2 h bei 37°C ausgesetzt ist.
In einigen Fallen kann es vorteilhaft sein, neue chemische Gruppen als eine Konsequenz der Linkerspaltung einzuführen. Unter einer dritten Linker-Strategie, erzeugt die Linkerspaltung eine „nützliche Narbe”, die in nachfolgenden Schritten funktionalisiert werden kann. Als ein Beispiel dieser Klasse von Linker wurden die Aminosäure-Reagenzien, wie (L)-Phe Derivat 10, erzeugt, welche durch 1,2-Diole (Fruchart et al Tetrahedron Lett. 1999, 40, 6225) an ihre dekodierenden DNA Oligonukleotide gebunden sind. Im Anschluss an die DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung mit der Amin-begrenzten Matrize (5) wurde dieser Linker durch Oxidation mit 50 mM wässrigem NaIO₄ bei pH 5,0 gespalten, um Produkt 12, welches eine Aldehyd-Gruppe, die für die nachfolgende Funktionalisierung geeignet ist (z. B. in einer DNA-Matrizen basierenden Wittig Olefinierung, reduktive Aminierung, oder Nitrol-Aldol-Addition (33)), enthält, zu ergeben.
Gewünschte Produkte, die durch DNA-Matrizen basierende Reaktionen unter Verwendung der narbenlosen oder nützlichen Narben-Linker erzeugt wurden, können unter Verwendung von biohinylierten Reagenz-Oligonukleotiden leicht gereinigt werden (34). Reagenz-Oligonukleotide zusammen mit den gewünschten Produkten werden zuerst auf Streptavidin-gebundenen magnetischen Kügelchen eingefangen. Jede unreaktive Matrize, die durch Basenpaarung an das Reagenz gebunden ist, wird durch Waschen der Kügelchen mit Puffer, welcher 4 M Guanidiumchlorid enthält, entfernt. Biotinylierte Moleküle bleiben unter diesen Bedingungen an die Streptavidin Kügelchen gebunden. Das gewünschte Produkt wird dann in reiner Form durch Eluieren der Kügelchen mit Linkerspaltungs-Puffer (in den obigen Beispielen entweder pH 11 oder NaIO₄-enthaltendem Puffer) isoliert, während reagierte und unreagierte Reagenzien an die Kügelchen gebunden bleiben.
Zusammenfassen des kürzlich erweiterten Repertoires an synthetischen Reaktionen, die mit der DNA-Matrizen basierenden Synthese kompatibel sind, und der oben beschriebenen Linker-Strategien, können mehrstufige DNA-Matrizen basierende kleine Molekül-Synthesen ausgeführt werden.
In einer Ausführungsform wird eine Lösungsphasen-DNA-Matrizen basierende Synthese einer nicht-natürlichen Peptid-Bibliothek im Allgemeinen unten beschrieben und ist im Allgemeinen in 35 gezeigt. Wie in 35 gezeigt ist, werden, um den anfänglichen Matrizenpol für die Bibliothek zu erzeugen, dreißig synthetische biotinylierte 5'-Amin Oligonukleotide des in 35 gezeigten Sequenzformats mit einer von dreißig unterschiedlichen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäuren unter Verwendung der Standard EDC-Kopplungsprozeduren acyliert. Vier Basen, die ein „Kodon” innerhalb jedes Amino acylierten Primers repräsentieren, werden die Identität der Seitenkette (R₁) Kennzeichen. Der „genetische Code” für diese Seitenketten werden mit säurelabilen Schutzgruppen, ähnlich zu jenen, die häufig in der Peptidsynthese verwendet werden, geschützt. Die resultierenden dreißig Amino-acylierten DNA Primer werden an de Matrizen-DNA-Oligonukleotid-Bibliothek, die durch automatisierte DNA-Synthese erzeugt wird, angelagert. Die Primererweiterung mit einer DNA-Polymerase, gefolgt von der Strang-Denaturierung und Reinigung mit Streptavidin gebundenen magnetischen Kügelchen ergibt die Ausgangsmatrizen-Bibliothek (siehe 35). Als nur ein Beispiel ist eine Lösungsphasen DNA-Matrizen basierenden Synthese einer nicht-natürlichen Peptid-Bibliothek in 36 gezeigt. Die Matrizen-Bibliothek wird drei DNA-Matrizen basierenden Peptidbindungsbildungs-Reaktionen unter Verwendung von Aminosäure-Reagenzien, die an 10 Basen dekodierende DNA Oligonukleotide durch den oben beschriebenen Sulfon-Linker gebunden sind, unterzogen. Die Produkte von jedem Schritt werden durch präparative denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese vor der Linkerspaltung, wenn gewünscht, obwohl dies nicht notwendig sein muss, gereinigt. Jedes DNA-gebundene Reagenz kann durch Koppeln eines 3'-Amino begrenzten DNA-Oligonukleotids an die kodierende Aminosäure durch das bis-NHS Carbonat Derivat des Sulfonlinkers, wie in 37 gezeigt ist, synthetisiert werden. Die Kodons werden wiederum so ausgewählt, dass verwandte Kodons chemisch ähnliche Aminosäuren kodieren. Im Anschluss an jede Peptidbindungsbildungs-Reaktion wird Essigsäureanhydrid verwendet, um unreagierte Ausgangsmaterialien zu bedecken, und pH 11 Puffer wird verwendet, um die Linkerspaltung zu bewirken, um eine neue Aminogruppe für die nächste Peptidbindungsbildungs-Reaktion freizulegen. Sobald das Tetrapeptid vollständig ist, können jene Bibliotheks-Mitglieder, die Carboxylat-Seitenketten tragen, ebenfalls mit ihren Amino-Termini zyklisiert werden, um makrozyklische Peptide zu bilden, während lineare Peptid-Mitglieder einfach N-acetyliert werden können (siehe 36).
Es ist erkennbar, dass eine nahezu unbegrenzte Auswahl von Aminosäure-Baueinheiten in eine nicht-natürliche Peptid-Bibliothek eingebaut werden kann. Im Gegensatz zu Peptid-Bibliotheken, die mittels der Protein-biosynthetischen Maschinerie, wie Phagen Display Bibliotheken, erzeugt wurden (O'Neil et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, 5, 443–9), mRNA Display Bibliotheken (Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1997, 94, 12297–12302), Ribosomen Display Bibliotheken (Roberts et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 268–73; Schaffitzel et al. J. Immunol Methods 1999, 231, 119–5), oder intrazelluläre Peptid-Bibliotheken (Norman et al. Science 1999, 285, 591–5), können Aminosäuren mit nicht-proteinogenen Seitenketten, nicht-natürlicher Seitenketten Sterechemie, oder nicht-peptidischer Rückgrate in diese Bibliothek eingebaut werden. Zusätzlich können die vielen kommerziell erhältlichen Di-, Tri- und Oligopeptide als Baueinheiten verwendet werden, um längere Bibliotheksmitglieder zu erzeugen. Das Vorhandensein von nicht-natürlichen Peptiden in dieser Bibliothek kann verstärkte pharmakologische Eigenschaften, wie Protease-Resistenz, im Vergleich zu ribosomal erzeugten Peptiden, verleihen. Ähnlicherweise können die makrozyklischen Bibliotheks-Mitglieder höhere Affinitätsliganden ergeben, da der Entropy-Verlust bei Bindung ihrer Ziele geringer sein kann, als der ihrer flexibleren linearen Gegenstücke. Basierend auf der ernormen Vielfalt von kommerziell erhältlichen Aminosäuren, die in diese Beschreibungen passen, kann die maximale Diversität dieser nicht-natürlichen zyklischen und linearen Tetrapeptid-Bibliothek 100 × 100 × 100 × 100 = 10⁸ Mitglieder übersteigen.
Ein anderes Beispiel einer Bibliothek unter Verwendung des oben beschriebenen Ansatzes enthält die DNA-Matrizen basierende Synthese einer Diversität-orientierten makrobizyklischen Bibliothek, die 5- und 14-gliedrige Ringe enthält (38). Das Ausgangsmaterial für diese Bibliothek besteht aus DNA-Matrizen, die mit einer Vielzahl von Seitenketten-geschützten Lysinderivaten und kommerziell enthältlichen Lysinanaloga (einschließlich Aminoethylzystein, Aminoethylserin und 4-Hydroxylysin) aminoacyliert sind. In dem ersten Schritt findet die DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung mit einer Vielzahl von DNA-gebundenen Aminosäuren, wie in der nicht-natürlichen Peptid-Bibliothek beschrieben ist, statt, mit der Aufnahme das der oben beschriebene vicinale Diol-Linker 16 anstelle des spurlosen Sulfon-Linkers verwendet wird. Im Anschluss an die Amidbindungsbildung wird der Diol-Linker oxidativ mit Natriumperiodat gespalten. Die Schutzeliminerung des Seitenketten-Amins des Lysin-Analogons wird durch die DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung, die durch silbertrifluoracetat katalysiert ist, zwischen dem freien Amin und einer Bibliothek von acrylischen-abgeleiteten Thioestern gefolgt. Die resultierenden Olefine werden mit einem Hydroxyl-Amin behandelt, um Nitrone zu bilden, welche eine 1,3-dipolare Cycloaddition durchmachen, um die bizyklische Bibliothek zu ergeben (38). Die DNA-gebundenen Reagenzien für diese Bibliothek werden durch Koppeln von Lysin-Analoga an 5'-Amino-begrenzte Matrizen-Primer (35), Koppeln von aminoacylierten Diol-Linken an 3'-Amino-begrenzte DNA Oligonukleotide (38), um Koppeln von Arylsäuren an 3'-Thiol-begrenzte DNA Oligonukleotide (38) hergestellt.
Als nur ein Beispiel einer spezifischen Bibliothek, die von dem ersten allgemeinen oben beschriebenen Ansatz erzeugt wurde, wurden drei sich wiederholende Zyklen von DNA-Matrizen basierende Amidbildung, spurenloser Linkerspaltung, Reinigung mit Streptavidin-gebundenen Kügelchen verwendet, um ein nicht natürliches Tripeptid zu erzeugen (39). Jedes Aminosäure-Reagenz wurde an ein einzigartiges biotinyliertes 10-Basen DNA Oligonukleotid durch den oben beschriebenen Sulfon-Linker gebunden. Die 30-Basen Amin-begrenzte Matrize, die programmiert war, um die Tripeptid-Synthese zu lenken, enthielt drei aufeinanderfolgende 10 Basen Regionen, die zu den drei Reagenzien komplementär waren, was die Strategie nachahmt, die in der mehrstufigen DNA-Matrizen basierenden kleinen Molekül-Bibliothek-Synthese verwendet werden würde. Das erste Aminosäure-Reagenz (13) wurde mit der Matrize und dem Aktivator 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid (DMT-MM) kombiniert (Kunishima et al. Tetrahedron 2001, 57, 1551), um die DNA-Matrizen basierende Peptidbindungsbildung zu bewirken. Das gewünschte Produkt wurde durch Mischen der Rohreaktion mit Streptavidin-gebundenen magnetischen Kügelchen gereinigt, waschen mit 4 M Guanidiniumchlorid, und Eluieren mit pH 11 Puffer, um die Sulfonlinker-Spaltung zu bewirken, was Produkt 14 bereitstellt. Die freie Aminogruppe in 14 wurde dann in der zweiten und dritten Runden aus DNA-Matrizen basierender Amidbildung und Linkerspaltung aufgearbeitet, um das Dipeptid 15 und das Tripeptid 16 zu ergeben (39).
Der Fortschritt jedes Reaktion-, Reinigung- und Sulfon-Linker Spaltungsschrittes wurde durch denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese verfolgt. Das Endtripeptid, welches an Matrize (16) gebunden ist, wurde mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und das Verdauungsfragment, welches das Tripeptid enthält, wurde durch MALDI Massenspektrometrie charakterisiert. Beginnend mit 2 nmol (~20 μg) Ausgangsmaterial wurde genügend Tripeptid Produkt erzeugt, um als die Matrize für mehr als 10⁶ in vitro Selektionen und PCR Reaktionen zu denen (Kramer et al. in Current Protocols in Molecular Biology, Ausgabe 3 (Herausgeber: F. M. Ausubel), Wiley, 1999, Seiten 15.1) (unter der Annahme, dass 1/10.000 Moleküle die Selektion überleben). Kein signifikantes Produkt wurde erzeugt, wenn die Ausgangsmaterial-Matrize mit Essigsäureanhydrid bedeckt war, oder wenn Kontrollreagenzien, die Sequenz-Nichtübereinstimmungen enthalten, anstelle der komplementären Reagenzien verwendet wurden (39).
Eine nicht-peptidische, mehrstufige DNA-Matrizen basierende kleine Molekül-Synthese (40), die alle drei oben entwickelten Linker-Strategien verwendete, wurde ebenfalls durchgeführt. Eine Amino-begrenzte 30 Basen Matrize wurde einer DNA-Matrizen basierende Amidbindungsbildung unter Verwendung eines Aminoacyl Donator Reagenzes (17), die den Diol-Linker und ein biotinyliertes 10-Basen Oligonukleotid enthält, unterzogen, um das Amid 18 zu ergeben. Das gewünschte Produkt wurde durch Einfangen der Rohreaktion auf Streptavidin-Kügelchen isoliert, gefolgt durch die Spaltung des Linkers mit NaIO₄, um Aldehyd 19 zu erzeugen. Die DNA Matrizen-basierende Wittig-Reaktion von 19 mit dem biotinylierten selbstspaltenden Phosphoran-Reagenz 20 ergab Fumaramid 21. Die Produkte von der zweiten DNA-Matrizen basierenden Reaktion wurden teilweise durch Waschen mit Streptavidin-Kügelchen gereinigt, um reagiertes und unreagiertes Reagenz zu entfernen. In dem dritten DNA-Matrizen basierenden Schritt wurde Fumaramid 21 einer DNA-Matrizen basierenden Konjugat-Addition (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961) unter Verwendung des Thiol-Reagenzes 22, welches durch den Sulfon-Linker an ein biotinyliertes Oligonukleotid gebunden ist, unterzogen. Das gewünschte Konjugat-Additionsprodukt (23) wurde durch Immobilisierung mit Streptavidin-Kügelchen gereinigt. Die Linkerspaltung mit pH 11 Puffer ergab das Endprodukt 24 mit einer gesamten isolierten Ausbeute von 5–10% für die drei Bindungsbildungs-Reaktionen, zwei Linker-Spaltungsschritte, und drei Reinigungsschritte (40). Dieses Endprodukt wurde mit EcoRI verdaut und die Masse des kleinen Molekül gebundenen Matrizen-Fragments wurde durch MALDI Massenspektometrie bestätigt (exakte Masse: 2568, beobachtete Masse: 2566 ± 5). Wie in dem Tripeptid Beispiel, lagert es sich jedes der drei Reagenzien, welche während dieser mehrstufigen Synthese verwendet wurden, an eine einzigartige Stelle auf der DNA-Matrize an, und Kontrollreaktionen mit Sequenz-Nichtübereinstimmungen ergaben kein Produkt (40). Wie erwartet, erzeugten Kontrollreaktionen, in welchen das Wittig Reagenz weggelassen wurde (Schritt 2), ebenfalls kein Produkt im Anschluss an den dritten Schritt. Zusammengefasst demonstrieren die DNA-Matrizen basierenden Synthesen von 16 und 24 die Fähigkeit von DNA, die Sequenz-programmierte, mehrstufige Synthese von sowohl Oligomeren als auch nicht-Oligomeren kleinen Molekülen, die in ihrer Struktur mit Nukleinsäure nicht verwandt sind, zu lenken.
Die kommerzielle Verfügbarkeit von vielen Substraten für DNA-Matrizen basierenden Reaktionen, einschließlich Aminen, Carbonsäuren, α-Halogen Carbonylverbindungen, Olefinen, Alkoxyamine, Aldehyde und Nitroalkane können die Translation von großen Bibliotheken von DNA in diverse kleine Molekülbibliotheken ermöglichen. Die direkte ein Gefäß Selektion von diesen Bibliotheken auf Mitglieder mit gewünschten Bindungs- oder katalytischen Aktivitäten, gefolgt von der PCR Amplifikation und Diversifizierung der DNA, die aktive Moleküle kodiert, kann den synthetischen kleinen Molekülen ermöglichen, sich auf eine Weise zu entwickeln, die den leistungsfähigen Verfahren, die die Natur verwendet, um neue molekulare Funktion zu erzeugen, angepasst sind. Zusätzlich ist die mehrstufige Nukleinsäure-Matrizen-basierende Synthese eine Anforderung für die früher vorgeschlagenen Modelle (A. I. Scott, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4961; Li et al. Nature 1994, 369, 218; Tamura et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2001, 98, 1393) für die präbiotische Translation von replizierbarer Information in funktionelle Moleküle. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Nukleinsäure-Matrizen tatsächlich in der Lage sind, die iterative oder nicht-iterative, mehrstufige kleine Molekül-Synthese zu lenken, sogar wenn sich Reagenzien bei stark unterschiedlichen Entfernungen von dem wachsenden Molekül anlagern (in den obigen Beispielen, Null bis 20 Basen). Wie unten detaillierter beschrieben ist, können Bibliotheken von synthetischen Molekülen dann in Richtung aktiver Ligand und Katalysatoren durch Zyklen von Translation, Selektion, Amplifikation und Mutagenese entwickelt werden.

E) Entwickeln von Kunststoff: In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure (z. B. DNA, RNA, Derivat davon) an einen Polymerisierungs-Katalysator angeheftet. Da Nukleinsäuren in komplexe Strukturen falten können, kann die Nukleinsäure verwendet werden, um die Polymerisierung einer wachsenden Polymerkette zu lenken und/oder zu beeinflussen. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure die Selektion von Monomer-Einheiten, die zu polymerisieren sind, ebenso wie das Stattfinden der Polymerisierungs-Reaktionen (z. B. Stereochemie, Taktizität, Aktivität) beeinflussen. Die synthetisierten Polymere können auf spezifische Eigenschaften, wie Molekulargewicht, Dichte, Hydrophobizität, Taktizität, Stereselektivität, etc. ausgewählt werden und die Nukleinsäure, welche einen integralen Teil des Katalysators bildt, welcher seine Synthese steuerte, kann amplifiziert und entwickelt werden (41). Sich wiederholende Zyklen von Liganden-Diversifizierung, Selektion und Amplifikation ermöglichen die wahre Evolution von Katalysaten und Polymeren in Richtung der gewünschten Eigenschaften.

Um nur ein Beispiel zu geben, wird eine Bibliothek von DNA-Molekülen an Grubbs' Ruthenium-basierenden Ringöffnungs-Metathese-Polymerisierungs (ROMP) Katalysator durch einen Dihydroimidazol Ligand angeheftet (Scholl et al. Org. Lett. 1 (6): 953, 1999), was einen großen, diversen Pool an potentiell katalytischen Molekülen erzeugt, wobei jedes einzigartig ist durch die Natur des funktionalisierten Liganden. Zweifellos wird das Funktionalisieren des Katalysators mit einem relativ großen DNA-Dihydroimidazol (DNA-DHI) Ligand die Aktivität des Katalysators verändern. Jedes DNA Molekül hat das Potential, in eine einzigartige stereoelektronische Form zu falten, welche potentiell unterschiedliche Selektivitäten und/oder Aktivitäten in der Polymerisierungs-Reaktion hat (42). Deshalb kann die Bibliothek von DNA-Liganden in eine Bibliothek von Kunststoffen bei der Addition von verschiedenen Monomeren „translatiert” werden. In bestimmten Ausführungsformen werden DNA-DHI Liganden verwendet, die in der Lage sind, sich selbst kovalent in das wachsende Polymer einzufügen, wodurch ein Polymer erzeugt wird, welches mit der DNA markiert ist, die seine Erzeugung kodiert. Unter Verwendung des in 42 gezeigten, synthetischen Schemas werden DHI Liganden erzeugt, die zwei chemische Griffe enthalten, wobei einer verwendet wird, um die DNA an den Liganden zu binden, und der andere verwendet wird, um ein anhängendes Olefin an das DHI Rückgrat zu binden. Die Methatese-Raten sind bekannt, basierend auf der Olefin-Substitution sowie der Identität des Katalysators, stark zu variieren. Durch Ändern dieser Variablen, kann die Rate des Einbaus des anhängenden Olefins moduliert werden, so dass k_{anhängendeOlefinMethtese} << k_ROMP, dadurch das Bilden von Polymeren mit mässigen bis hohen Molekulargewichten ermöglichen, vor der Einführung des DNA-Tags und entsprechender Polymer-Termination. Vinylether werden entweder häufig in der ROMP verwendet, um die Polymer-Termini zu funktionalisieren (Gordon et al. Chem. Biol. 7: 9–16, 2000) sowie um Polymere mit verringertem Molekulargewicht zu erzeugen.
Die nachfolgende Selektion eines Polymers auf der Bibliothek basierend auf einer gewünschten Eigenschaft durch Elektrophorese, Gelfiltration, zentrifugale Sedimentation, Verteilung in Lösungsmitteln unterschiedlicher Hydrophobizitäten, etc. Amplifikation und Diversifizierung der kodierenden Nukleinsäure mittels Techniken wie error-prone PCR oder DNA Shuffling, gefolgt durch die Anheftung an ein DHI-Rückgrat wird die Produktion eines anderen Pools von potenziellen ROMP_Katalysatoren ermöglichen, die in der ausgewählten Aktivität angereichert sind (43). Dieses Verfahren stellt einen neuen Ansatz bereit, um polymere Materialien und die Katalysatoren, die diese erzeugen, herzustellen.
Beispiel 6: Charakterisierung von DNA-Matrizen-basierenden synthetischen kleine Molekül-Bibliotheken:
Die oben beschriebenen nicht-natürlichen Peptid und bicyclischen Bibliotheken werden in mehreren Stufen charakterisiert. Jedes Kandidatenreagenz wird an sein dekodierendes DNA Oligonukleotid konjugiert, dann Modellreaktionen mit übereinstimmenden und nichtübereinstimmenden Matrizen unterzogen. Die Produkte von diesen Reaktionen werden durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, um die Reaktionswirksamkeit zu beurteilen, und durch Massenspektrometrie, um die erwarteten Produktstrukturen zu verifizieren. Sobald ein vollständiger Satz an robusten Reagenzien identifiziert ist, wird die komplette mehrstufige DNA-Matrizen-basierende Synthese von repräsentativen Einzelbibliotheksmitgliedern in einem großen Maßstab durchgeführt und die Endprodukte werden durch Massenspektrometrie charakterisiert.
Spezifischer wird die Sequenzgenauigkeit jeder mehrstufigen DNA-Matrizen-basierenden Bibliotheksynthese durch Nachfolgen des Schicksals von einzelnen chemisch-markierten Reagenzien während dem Verlauf von ein-Gefäß-Bibliotheksynthesereaktionen getestet. Zum Beispiel werden Produkte, die von Baueinheiten entstehen, die eine Khetongruppe tragen, mit kommerziell erhältlichem Hydrazit-gebundendem Harz abgefangen und durch DNA-Sequenzierung analysiert, um die Sequenzgenauigkeit während der DNA-Matrizen-basierenden Synthese zu verifizieren. Auf ähnliche Weise, wenn nicht biotinylierte Modellmatrizen verwendet werden, werden Baueinheiten, die Biotingruppen tragen, nach der DNA-Matrizen-basierenden Synthese unter Verwendung von Streptavidin-magnetischen Kügelchen gereinigt und einer DNA-Sequenzierung unterzogen (Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961–6963). Kodons, die eine größere Neigung zeigen, mit nichtübereinstimmender DNA zu annalen, werden durch Screenen auf diese Weise identifiziert und von dem genetischen Code dieser synthetischen Bibliotheken entfernt.
Beispiel 7: In Vitro Selektion von Proteinliganden von entwickelbaren synthetischen Bibliotheken:
Da jedes in diesem Ansatz erzeugte Bibliothekenmitglied kovalent an ein DNA-Oligonukleotid gebunden ist, das seine Synthese kodiert und lenkt, können Bibliotheken wahren in vitro Selektionen unterzogen werden. Obwohl direkte Selektionen auf kleine Molekülkatalysatoren von Bindungsbilungs- oder Bindungsspaltungsreaktionen eine aufregende potenzielle Anwendung dieses Ansatzes sind, ist die einfachste in vitro Selektion, die verwendet werden kann, um diese Bibliotheken zu entwickeln, eine Selektion auf Bindung an ein Zielprotein. Ein ideales anfängliches Zielprotein für die synthetische Bibliothek-Selektion spielt sowohl eine wichtige biologische Rolle als auch besitzt bekannte Liganden mit unterschiedlichen Affinitäten für das Validierender Selektionsverfahren.
Ein Rezeptor von speziellen Interesse für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist der α_vβ₃ Rezeptor. Der α_vβ₃ Rezeptor ist ein Mitglied der Integrin-Familie von Transmembranheterodimeren-Glycoproteinrezeptoren (Miller et al. Drug Discov Today 2000, 5, 397–408; Berman et al. Membr. Cell Biol. 2000, 13, 207–44). Der α_vβ₃ Integrinrezeptor wird auf der Oberfläche von vielen Zellarten, wie Osteoklasten, vaskuläre glatte Muskelzellen, Endothelzellen, und einigen Tumorzellen exprimiert. Dieser Rezeptor vermittelt mehrere wichtige biologische Prozesse, einschließlich der Adhäsion von Osteoklasten an die Knochenmatrix (van der Pluijm et al. J. Bone Miner. Res. 1994, 9, 1021–8), glatte Muskelzellenmigration (Choi et al. J. Vasc. Surg. 1994, 19, 125–34) und die Tumor-induzierte Angiogenese (Brooks et al. Cell 1994, 79, 1157–64) (der Auswuchs von neuen Blutgefäßen). Während der Tumor-induzierten Angiogenese binden invasive Endothelzellen an die extrazellulären Matrixkomponenten durch ihre α_vβ₃ Integrinrezeptoren. Mehrere Studien (Brooks et al. Cell 1994, 79, 1157–64; Broks et al. Cell 1998, 92, 391–400; Friedlander et al. Science 1995, 270, 1500–2; Varner et al. Cell Adhes Commun 1995, 3, 367–74; Brooks et al. J. Clin Invest 1995, 96, 1815–22) haben demonstriert, dass die Inhibierung dieses Integrin-Bindungsvorgangs mit Antikörpern oder kleinen synthetischen Peptiden die Apoptose der proliferativen angiogenen vaskulären Zellen induziert und die Tumor-Metastasen inhibieren kann.
Eine Anzahl von Peptid-Liganden mit unterschiedlichen Affinitäten und Selektivitäten führt den α_vβ₃ Integrinrezpetor wurden berichtet. zwei Referenzen α_vβ₃ Integrinantagonisten sind das lineare Peptid GRGDSPK (IC₅₀ = 210 nM (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033–40; Pfaff et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233–8) und das zyklische Peptid Cyclo-RGDfV (Pfaff et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233–8) (f = (D)-Phe, IC₅₀ = 10 nM). Während Peptidantagonisten für Integrine häufig RGD enthalten, sind nicht alle RGD-enthaltenen Peptide Hochaffinität-Integrinliganden. Der konformative Zusammenhang von RGD und anderen Peptidsequenzen kann vielmehr eine profunde Wirkung auf die Integrinaffinität und Spezifität haben (Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328–1335; Geyer et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 7735–7743; Rai et al. Bioorg. Med Chem. Lett 2001,11, 1797–800; Rai et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101–19). Aus diesem Grund sind kombinatorische Ansätze in Richtung der α_vβ₃ Integrin-Rezeptorantagonistenwicklung besonders vielversprechend.
Die biologische Wichtigkeit und medizinisch relevante Rolle des α_vβ₃ Integrinrezeptors zusammen mit seinen bekannten Peptidantagonisten und seiner kommerziellen Verfügbarkeit (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) machen den α_vβ₃ Integrinrezeptor zu einem idealen Anfangziel für die DNA-Matrizen-basierende synthetische kleinen Molekül-Bibliotheken. Der α_vβ₃ Integrinrezeptor kann durch Absorption an Mikrotiterplatten-Kammern ohne Beeinträchtigung seiner Ligandenbindungsfähigkeit oder Spezififät immobilisiert werden (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033–40 M; Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328–1335; Haubner et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7461–7472). Alternativ kann der Rezeptor durch Konjugation mit NHS-Ester oder Maleimid-Gruppen, die kovalent an die Sepharosekügelchen gebunden sind, immobilisiert werden und die Fähigkeit des resultierenden Integrin-Affinitätsharzes, die bekannten Ligandbindungseigenschaften aufrechtzuerhalten, kann verifiziert werden.
Um die tatsächlichen Proteinbindungsselektionen auszuführen, werden DNA-Matrizengebundene synthetische Peptide oder makrozyklische Bibliotheken in wässrigem Bindungpuffer in einem Gefäß aufgelöst und in der Gegenwart von immobilisierten α_vβ₃ Integrinrezeptor äquilibriert. Nicht-Binder werden mit Puffer weggewaschen. Jene Moleküle, die eher durch ihre angeheftete DNA-Matrizen als durch ihre synthetischen Anteile binden können, werden durch Waschen der gebundenen Bibliothek mit nicht funktionalisierten DNA-Matrizen, denen PCR-Primer-Bindungsstellen fehlen, eliminiert. Die restlichen Liganden, die an den immobilisierten α_vβ₃ Integrinrezeptor gebunden sind, werden durch Denaturieren oder durch die Addition eines Überschusses an, hochaffinitäts-RGD-enthaltendem Peptidligand eluiert. Die DNA-Matrizen, die die Synthese von α_vβ₃ Integrinbindern kodieren und lenken, werden durch PCR unter Verwendung von einem Primer, der so konstruiert ist, um an eine konstante 3' Region der Matrize zu binden, und einem Pool von biotinylierten Primern, die an ihrem 5' Ende mit den Biblithek-Ausgangsmaterialien funktionalisiert sind, amplifiziert (44). Die Reinigung des biotinylierten Strangs vervollständigt einen Zyklus von synthetischen Molekültranslation, Selektion, und Amplifikation, was eine Unterpopulation von DNA-Matrizen ergibt, welche in der Sequenz, die die synthetischen α_vβ₃ Integrinliganden kodieren, angereichert ist. Aus ähnlichen Gründen, wie jene, die den α_vβ₃ Integrinrezeptor zu einem attraktiven Anfangsziel für den Ansatz, um synthetische Moleküle mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, machen, dient die Faktor Xa Serinprotease ebenfalls als ein vielversprechendes Proteinziel. Die Blutkoagulation beinhaltet eine komplexe Kaskade von Enzym-katalysierten Reaktionen, die schlussendlich Fibrin erzeugen, die Grundlage der Blutgerinnsel (Rai et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101–109; Vacca et al. Curr. Opin. Chem Biol 2000, 4, 394–400). Trombin ist die Serinprotease, die Fibrinogen in Fibrin während der Blutgerinnung umwandelt. Trombin wiederum wird durch die proteolytische Wirkung von Faktor Xa auf Prothrombin erzeugt. Da thromboembolitische (Blutgerinnung) Krankheiten, wie Schlag eine führende Todesursache in der Welt bleibt (Vacca et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 394–400) ist die Entwicklung von Arzneimitteln, die Thrombin oder Faktor Xa inhibieren, ein Hauptgebiet der pharmazeutischen Forschung. Die Inhibierung von Faktor Xa ist ein neuerer Ansatz, von dem angenommen wird, die mit der Inhibierung von Thrombin assozierten Nebenwirkungen zu umgehen, welches ebenfalls in der normalen Hämostase eingebunden ist (Maignan et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 3226–32; Leadley et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1999, 34, 791–9; Becker et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2753–8; Choi-Sledski et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2539–44; Choi-Sledeski et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3572–87; Ewing et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3557–71; Bostwick et al. Thromb Haemost 1999, 81, 157–60). Obwohl viele Wirkstoffe, einschließlich Heparin, Hirudin und Hirulog entwickelt wurden, um die Produktion von Thrombin zu steuern, haben diese Wirkstoffe im Allgemeinen den Nachteil, dass sie zusätzlich zu den möglichen Nebenwirkungen mehrmals täglich eine intravenöse oder subkontane Injektion benötigen und die Suche nach synthetischen kleinen Molekül-Faktor Xa Inhibitoren bleibt der Gegenstand von großen Forschungsbemühungen.
Unter den Faktor Xa Inhibitoren mittels bekannten Bindungsaffinitäten sind eine Reihe von Tripeptiden, die mit Argininaldehyd enden (Marlowe et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 13–16), die leicht in die DNA-Matrizen-basierende nicht-natürliche Peptidbibliothek, die oben beschrieben ist, inkludiert werden können. In Abhängigkeit von den Identitäten die ersten zwei Reste, zeigen die Tripeptide IC₅₀ Werte im Berich von 15 nM bis 60 μM (Marlowe et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 13–16) und bieten deshalb eine ideale positive Kontrolle zum Validieren und Kalibrieren einer in vitro Selektion auf synthetische Faktor Xa Liganden (siehe unten). Sowohl Faktor Xa als auch aktiver Faktor Xa, die auf einem Harz immoblisiert sind, sind kommerziell erhältlich (Protein Engineering Technologies, Dänemark). Der Harz-gebundene Faktor Xa wird verwendet, um Mitglieder von sowohl der DNA-Matrizen basierenden nicht-natürlichen Peptid-Bibliothek als auch der bizyklischen Bibliothek mit Faktor Xa Affinität auf eine Art und Weise auszuwählen, die zu der Integrinrezeptorbindungsselektionen, die oben beschrieben ist, analog ist.
Im Anschluss an die PCR Amplifikation von DNA-Matrizen, die die ausgewählten synthetischen Moleküle kodieren, werden zusätzliche Runden an Translation, Selektion und Amplifikation durchgeführt, um die höchsten Affinitätsbinder in der Bibliothek anzureichern. Die Stringenz der Selektion wird schrittweise erhöht, indem die Salzkonzentration der Bindungs- und Waschungspuffer erhöht wird, die Dauer der Bindung verkürzt wird, die Bindungs- und Waschungstemperaturen erhöht werden, und die Konzentration der Waschadditive, wie Matrizen-DNA oder nicht-verwandte Protein erhöht wird. Wesentlich ist, dass die in vitro Selektionen ebenfalls auf Spezifität zusätzlich zur Bindungsaffinität selektieren können. Um jene Moleküle zu eliminieren, die ungewünschte Bindungseingeschalten besitzen, werden Bibliotheksmitglieder, die an immobilisiertes α_vβ₃ Integrin oder Faktor Xa gebunden sind, mit Nicht-Zielproteinen, wie andere Integrine oder andere Serinproteasen, gewaschen, was nur jene Moleküle hinterlässt, die an das Zielprotein binden, nicht jedoch an Nicht-Zielproteine binden.
Sich wiederholende Zyklen von Translation, Selektion und Amplifikation führt eher zu der Bibliotheksanreicherung als zu der Bibliotheksrevolution, welche eine Diversifizierung zwischen den Selektionsrunden erfordert. Die Diversifizierung dieser synthetischen Bibliotheken werden auf zumindest zwei Arten erreicht, beide sind analog zu den Verfahren, die von der Natur verwendet werden, um Proteine zu diversifizieren. Die Zufallspunktmutangenese wird durch Ausführen des PCR-Amplifikationsschrittes unter error-prone PCR Bedingungen durchgeführt (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992, 2, 28–33). Da der genetische Code dieser Moleküle geschrieben wird, um verwandte Kodons verwandten chemischen Gruppen zuzuordnen, ähnlich zu dem Weg, wie der natürliche Proteingenetische Code konstruiert wird, wird die Zufallspunktmutationen in den Matrizen, die die ausgewählten Moleküle kodieren, die Nachkommenschaft in Richtung chemisch-verwandter Analoga diversifizieren. Zusätzlich zu der Punktmutagenese, werden synthetische Bibliotheken, die in diesem Ansatz erzeugt wurden, ebenfalls unter Verwendung der Rekombination diversifiziert. Die zu rekombinierenden Matrizen haben die in 45 gezeigte Struktur, in welcher die Kodons durch fünf-Basen nicht-palindromische Restriktionendonuklease-Spaltungsstellen getrennt sind, wie jene, die durch AvaII (G/GWCC, W = A oder T), Sau96I (G/GNCC, N = A, G, T, oder C), Ddel (G/TNAG), oder HinFI (G/ANTC) gespalten werden. Im Anschluss an die Selektionen werden die Matrizen, die die gewünschten Moleküle kodieren, enzymatisch mit diesen kommerziell erhältlichen Restriktionsenzymen verdaut. Die nverdauten Fragmenta werden dann in intakte Matrizen mit T4 DNA-Ligase rekombiniert. Da die Restriktionsstellen, die die Kodons voneinander trennen, nicht palindrom sind, können sich die Matrizenfragmente nur so wieder zusammenlagern, um intakte rekombinierte Matrizen zu bilden (45). Die DNA-Matrizen-basierende Translation von rekombinierten Matrizen liefert rekombinierte kleine Moleküle. Auf diese Art werden funktionelle Gruppen zwischen synthetischen kleinen Molekülen mit gewünschten Aktivitäten auf eine Art und Weise rekombiniert, die zu der Rekombination von Aminosäureresten zwischen Proteinen in der Natur analog ist. Es ist erkennbar, dass die Rekombination den Sequenzraum eines Moleküls effizienter erkundet, als die Punktmutagenese allein (Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284–90; Bogarad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2591–5; Stemmer, W. Nature 1994, 370, 389–391).
Die kleine Molekülevolution unter Verwendung von Mutation und Rekombination bietet zwei potenzielle Vorteile im Vergleich zu der einfachen Anreicherung. Wenn die Gesamtdiversität der Bibliothek viel kleiner ist als die Anzahl der gemachten Moleküle (üblicherweise 10¹² bis 10¹⁵), ist jedes mögliche Bibliotheksmitglied zu Beginn der Selektion vorhanden. In diesem Fall ist die Diversifikation nach wie vor nützlich, da sich die Selektionsbedingungen im Laufe des Evolutionsfortschrittes beinahe immer ändern. Zum Beispiel werden spätere Selektionsrunden eher unter hohen Stringenzen ausgeführt, und kann die Gegenselektionen gegen das Binden von Nicht-Zielproteinen beinhalten. Die Diversifikation ergibt Bibliotheksmitglieder, die während früherer Selektionsrunden verworfen wurden, die Chance in späteren Runden unter veränderten Selektionsbedingungen erneut zu erscheinen, in welchen ihre Fitness in Bezug auf andere Mitglieder größer sein kann. Zusätzlich ist es gut möglich unter Verwendung dieses Ansatzes, um eine synthetische Bibliothek zu erzeugen, die eine theoretische Diversität von mehr als 10¹⁵ Molekülen hat. In diesem Fall ermöglicht die Diversifikation Molekülen, die niemals in der ursprünglichen Bibliothek existierten, in weiteren Selektionsrunden, auf der Basis ihrer Ähnlichkeit zu ausgewählten Molekülen hervorzutreten, ähnlich der Art, auf welche die Proteinevolution, die Weite des Proteinsequenzraumes einer kleinen Teilmenge jeweils durchsucht.
Beispiel 8: Charakterisierung von entwickelten Verbindungen:
Im Anschluss an mehrere Runden an Selektion, Amplifikation, Diversifikation und Translation werden die Moleküle, die die Selektion überleben, auf ihre Fähigkeit, das Zielprotein zu binden, charakterisiert. Um die DNA-Sequenzen zu identifizieren, die die entwickelten synthetischen Moleküle, die die Selektion überleben, kodieren, werden PCR-amplifizierte Matrizen in Vektoren kloniert, in Zellen transformiert und als individuelle Klone sequenziert. Die DNA-Sequenzierung dieser subklonierten Matrizen offenbarten die Identität der synthetischen Moleküle, die die Selektion überlebten. Um allgemeine Information über die funktionellen Gruppen, die während den Evolutionsrunden selektiert werden, zu erhalten, wurden Populationen an Matrizen in Pools sequenziert, um die Verteilung von A, G, T und C an jeder Kodonposition zu offenbaren. Das vernünftige Design des genetischen Codes von jeder funktionellen Gruppe ermöglicht die Sammlung von beachtlichen Informationen von der Populationsequenzierung. Zum Beispiel kann ein G an der ersten Position eines Kodons eine geladene Gruppe bezeichnen, während ein C an dieser Position einen hydrophoben Substituenten kodieren kann.
Um die Integrin-Bindungsselektion zu validieren und um die selektierten Bibliotheksmitglieder mit bekannten α_vβ₃ Integrinliganden zu vergleichen, werden lineare GRGDSPK und ein zyklisches RGDfV Analogon (zyklisches Iso-ERGDfV) ebenfalls in die DNA-Matrizen-basierende zyklische Peptid-Bibliothek eingebunden. Die Selektionsbedingungen werden bis zur Verifizierung angepasst, sodass Bibliotheken, die diese bekannten Integrinliganden enthalten, eine Anreicherung der DNA-Matrizen, die die bekannten Liganden kodieren, bei der Selektion auf die Integrinbindung durchmachen. Zusätzlich wird der Anreicherungsgrad der Matrizensequenzen, die diese bekannten α_vβ₃ Integrinliganden kodieren, mit ihren bekannten Affinitäten und mit der Anreicherung und Affinität von neu entdeckten α_vβ₃ Integrinliganden korreliert.
Sobald die Anreicherung von Matrizensequenzen, die die bekannten und neuen Integrinliganden kodieren, bestätigt ist, werden neuartig-entwickelte Liganden durch Nicht-DNA-Matrizen-basierende Synthese synthetisiert und auf ihre α_vβ₃ Integrin-Rezeptorantagonist-Aktivität und Spezifität untersucht. Standard in vitro Bindungsuntersuchungen zu Integrinrezeptoren (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033–40) werden durch Konkurrieren der Bindung von biotinyliertem Fibrinogen (einem natürlichen Integrin-Liganden) an immobilisierten Integrinrezeptor mit dem zu untersuchenden Ligand durchgeführt. Die Inhibierung der Bindung an Fibrinogen wird durch Inkubieren mit einem alkalischen Phosphatase-konjugiertem Antibiotin-Antikörper und einem chromogenen alkalischen Phosphatase-Substrat quantifiziert. Der Vergleich der Bindungsaffinitäten von zufällig ausgewählten Bibliotheksmitgliedern, vor und nach der Selektion, wird die Evolution der Bibliothek in Richtung der Zielbindung validieren. Untersuchungen für die Bindung von Nicht-Zielproteinen offenbart die Fähigkeit von diesen Bibliotheken, in Richtung der Bindungsspezifität zusätzlich zu der Bindungsaffinität entwickelt zu werden.
Ähnlicherweise wird die Selektion der Faktor Xa-Bindung durch das Einschließen der bekannten Faktor Xa Tripeptid-Inhibitoren in das Bibliotheksdesign validiert und verifiziert, dass eine Runde von Xa Bindungselektion und PCR Amplifikation in der Anreicherung ihrer assoziierten DNA-Matrizen resultiert. Synthetische Bibliotheksmitglieder, die entwickelt wurden, um an Faktor Xa zu binden, wurden in vitro auf ihre Fähigkeit, die Faktor Xa Aktivität zu inhibieren, untersucht. Die Faktor Xa Inhibierung kann leicht unter Verwendung des kommerziell erhältlichen chromogenen Substrat S-2765 (Chromogenix, Italien) spektrophotometrisch untersucht werden.
Während die DNA-Sequenz allein eines nicht-natürlichen Peptid-Bibliotheksmitglieds wahrscheinlich ist, die exakte Identität des entsprechenden Peptids eher zu offenbaren, ist der Endschritt in der bizyklischen Bibliothekssynthese eine nicht-DNA-Matrizen-basierende intramolekulare 1,3-dipolare Cycloaddition, die diastereomere Paare von Regioisomeren ergeben kann. Obwohl die Modellierung stark darauf hinweist, dass sich nur das in 38 gezeigte Regioisomer aus sterischen Gründen ausbilden kann, ist fakiale Selektivität weniger bestimmt. Die dastereomere Reinheit ist keine Anforderung für die in vitro Selektionen, die oben beschrieben sind, da jedes Molekül aus einer Einzelmolekülbasis ausgewählt wird. Nichtsdestotrotz kann es nützlich sein, die Diastereoselektivität der dipolaren Cycloaddition zu charakterisieren. Um dies zu erreichen, wird die nicht-DNA-Matrizen-basierende Synthese von ausgewählten bizyklischen Bibiliotheksmitglieder durchgeführt, Diastereomere werden durch chirale präparative HPLC getrennt und die Produktstereochemie wird durch nOe- oder Röntgenbeugung bestimmt.
Beispiel 9: Tanslatieren von DNA in nicht-natüliche Polymere unter Verwendung von DNA-Polymerasen:
Ein alternativer Ansatz zum Translatieren von DNA in nicht-natürliche, entwickelbare Polymere nutzt die Fähigkeit von einigen DNA-Polymerasen aus, bestimmte modifizierte Nukleotidtriphophat-Substrate zu aktzeptieren (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556; D. M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377–91; T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898–1905; S. E. Lee et al. Nucleic Acids REs. 2001, 29, 156–73; K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2872–2875). Es ist von einigen Deoxyribonukleotiden (45) und Ribonukleotide, die Modifikationen an Gruppen tragen, die nicht in Watson-Crick Wasserstoffbindungen teilnehmen, bekannt, mit hoher Sequenzgenauigkeit gegenüber natürlichen DNA-Matrizen eingefügt zu werden. Es ist wesentlich, dass modifizierte Nukleotide enthaltende einzelsträngige DNA als wirksame Matrizen für den DNA-Polymerase katalysierten Einbau von natürlichen oder modifizierten Mononukleotiden dienen kann. In einem der frühesten Beispiele des modifizierten Nukleotideinbaus durch DNA-Polymerase berichteten Toole und Mitarbeiter die Akzeptanz von 5-(1-Pentynyl)-Deoxyuridin 1 durch Vent DNA Polymerase unter PCR-Bedingungen (J. A. Latham et al. Nucleic Acid Res. 1994, 22, 2817–22). Mehrere zusätzliche 5-funktionalisierte Deoxyuridin (2-7) Derivate wurden nachfolgend gefunden, durch thermostabile DNA-Polymerase, die für die PCR geeignet sind, akzeptiert zu werden (K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2872–2875). Das erste funktionalisierte Purin, welches durch DNA-Polymerase akzeptiert wurde, Deoxyadenosin-Analogon 8, wurde in DNA durch die T7 DNA-Polymerase zusammen mit Deoxyuridin-Analogon 7 eingebaut (D. M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377–91). DNA-Bibliotheken, die sowohl 7 als auch 8 enthalten, wurden erfolgreich für die Metall-unabhängige RNA-Spaltungsaktivität ausgewählt (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556–63). Williams und Mitarbeiter untersuchten kürzlich mehrere Deoxyuridin-Derivate auf die Akzeptanz durch Taq-DNA Polymerasen und schlussfolgerten, dass die Akzeptanz am größten ist, wenn C5-modifizierte Uridine, die starre Alkyn oder Trans-Alkengruppen, wie 9 und 10, tragen, verwendet werden (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565–73). Eine ähnliche Studie (T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898–1905) an C7-funktionalisierten 7-Deaza-Deoxyadenosinen offenbarte die Akzeptanz durch Taq-DNA-Polymerase von 7-Aminopropyl-(11), cis-7-Aminopropenyl-(12), und 7-Aminopropynyl-7-deazadeoxyadenosin(13).
Die durch DNA-Polymerasen eingebaute funktionalisierte Nukleotide, in 46 gezeigt, haben sich auf das Hinzufügen von „proteinähnlicher” saurer und basischer Funktionalität zur DNA konzentriert. Während des Ausstatten von Nukleinsäuren mit allgemeiner saurer und allgemein basischer Funktionalität, wie primären Amin- und Carobxylatgruppen, die Fähigkeit von Nukleinsäurekatalysatoren erhöhen kann, haben funktionelle Gruppen, die in natürlichen Nukleinsäurebasen vorhanden sind, bereits die Fähigkeit demonstriert, als allgemeine Säuren und Basen zu dienen.
Von dem Hepatitis-Delta-Ribozym, zum Beispiel, wird angenommen, dass es das pK_a modulierte endozyklische Amin von Cytosin 75 als eine allgemeine Säure zu verwendet (S. Nakano et al. Science 2000, 287, 1493–7) und die Peptidyltransferase-Aktivität des Ribosoms kann ähnlicherweise auf einer allgemeinen Basen- oder allgemeinen Säurekatalyse beruhen (G. W. Muth et. al. Science 2000, 289, 947–50; P. Nissen et al. Science 2000, 289, 920–930; N. Ban et al. Science 2000, 289, 905–920), obwohl der spätere Fall der Gegenstand einer aktuellen Debatte bleibt (N. Polacek et al. Nature 2001, 411, 498–501). Das Ausstatten von DNA-Basen mit zusätzlichen Brønsted sauren und basischen Gruppen, kann deshalb den Umfang der DNA-Katalyse nicht tiefgreifend erweitern.
Im Gegensatz zu der einfachen allgemeinen Säure- und allgemeinen Basenfunktionalität, würden chirale Metallzentren den chemischen Umfang von Nukleinsäuren beachtlich erweitern. Funktionalität, die auf das Binden chemisch-potenter Metallzentren abziehlt, müssen noch in Nukleinsäure-Polymere eingebaut werden. Natürliche DNA hat die Fähigkeit demonstriert, in komplexe dreidimensionalen Strukturen zu falten, die in der Lage sind, stereospezifisch Zielmoleküle zu binden (C. H. Lin et al. Chem. Biol. 1997, 4, 817–32; C. H. Lin et al. Chem. Biol. 1998, 5, 555–72; P. Schultze et al. J. Mol. Biol. 1994, 235, 1532–47) oder Phosphodiesterbindungs-Manipulationen zu katalysieren (S. W. Santoro et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4262–6; R. R. Breaker et al. Chem. Biol. 1995, 2, 655–60; Y. Li et al. Biochemistry 2000, 39, 3106–14; Y. Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2746–51). Die DNA-Depurinierung (T. L. Sheppard et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 7802–7807) und Porphyrinmetallation (Y. Li et al. Biochemistry 1997, 36, 5589–99; Y. Li et al. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743–7). Mit der Fähigkeit an chemisch-wirksame, wasserkompatible Metalle, wie Cu, La, Ni, Pd, Rh, Ru, oder Sc zu binden, vermehrte nicht-natürliche Nukleinsäuren können stark ausgedehnte katalytische Eigenschaften besitzen. Zum Beispiel kann ein Pd-bindendes Oligonukleotid, welches in eine gut definierte Struktur faltet, die Fähigkeit besitzen, die Pd-vermittelte Kopplungsreaktionen mit einem hohen Ausmaß an Regiospezifität oder Stereospezifität zu katalysieren. Ähnlicherweise können nicht-natürliche Nukleinsäuren, die chirale Sc-Bindungsstellen bilden, als enantioselektive Zykloadditions- oder Aldol-Additionskatalysatoren dienen. Die Fähigkeit von DNA-Polymerasen, DNA Sequenzen in diese nicht-natürliche Polymere, die mit in vitro Selektionen auf katalytische Aktivitäten gekoppelt sind, zu translatieren, würden deshalb die direkte Evolution von gewünschten Katalysatoren aus zufälligen Bibliotheken ermöglichen.
Entstehende Katalysatoren in diesem Ansatz widmen sich der Schwierigkeit des rationellen Konstruierens von katalytischen aktiven Stellen mit spezifischen chemischen Eigenschaften, die durch kürzliche kombinatorische Ansätze (K. W. Kuntz et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 313–319; M. B. Francis et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 422–8) zu organometallischen Katalysatorentdeckung angeregt wurden. Zum Beispiel identifizierten Hoveyda und Mitarbeiter die auf Tibasierenden enatioselektiven Epoxidationskatalysatoren durch serielles Screenen von Peptidliganden (K. D. Shimizu et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36) Serielles Screening wurde ebenfalls durch Jacobsen und Mitarbeiter verwendet, um Peptidliganden zu identifizieren, die, wenn mit Metallkationen komplexiert, enantioselektive Epoxidationskatalysatoren binden, (M. B. Francis et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 973–941). Kürzlich wurde eine Peptidbibliothek, die Phosphin-Seitenketten enthält, auf die Fähigkeit gescreent, Malonatesteraddition an Cyclopentenylacetat in der Gegenwart von Pd zu katalysieren (S. R. Gilbertson et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6522–6523). Der derzeitige Ansatz unterscheidet sich jedoch wesentlich von früheren kombinatorischen Katalysatorentdeckungsbemühungen darin, dass er Katalysatoren mit gewünschten Eigenschaften ermöglicht, spontan aus einem Gefäß, Lösungsphasenbibliotheken nach entwicklungsmäßigen Zyklen von Diversifikation, Amplifikation, Translation und Selektion herauszubilden. Diese Strategie ermöglicht, dass bis zu 10¹⁵ unterschiedliche Katalysatoren entwickelt und auf gewünschte Eigenschaften in einem einzelnen Experiment selektiert werden. Die Kompatibilität unseres Ansatzes mit in vitro Selektionen in einem Gefäß ermöglich die direkte Selektion für die Reaktionskatalyse, anstelle des Screenens auf ein Phänomen welches mit der Katalyse assoziiert ist, wie Metallbindung oder Wärmeerzeugung. Zusätzlich können Eigenschaften, die schwierig sind schnell zu screenen, wie Substratstereospezifität oder Metallselektivität, unter Verwendung unseres Ansatzes direkt selektiert werden (siehe unten).
Schlüsselintermediate für eine Vielzahl von C5-funktionalisierten Uridinanaloga und C7-funktionalisierten 7-Deazaadenosin-Analoga wurde für den Einbau in nicht natürliche DNA-Polymere synthetisiert. Zusätzlich wurde die Synthese von sechs C8-funktionalisierten Adenosin-Analoga, die Deoxyribonukleotid Triphosphaten, vollendet. Da nur eine beschränkte Information über die Fähigkeit von DNA-Polymerasen, modifizierte Nukleotide zu akzeptieren, existiert, wählen wir Analoga zu synthetisieren, die nicht nur Metallbindungsfunktionalität zu Nukleinsäure bringen, sondern auch Einblicke in die Determinanten der DNA-Polymerasen-Akzeptanz bereitstellen werden.
Die Strategie für die Synthese von Metall-bindendem Uridin und 7-Deazaadenosin-Analoga ist in 47 gezeigt. Beide Wege enden mit der Amidbindung zwischen NHS-Ester von Metall-bindenden funktionellen Gruppen und Amino-modifizierten Deoxyribonukleotid Triphosphaten (7 und 13). Von Analoga 7 und 13 sowie die acetylierten Derivate von 7 wurden früher gezeigt (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556–63; D. M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377–91; J. A. Latham et al. Nucleic Acid Res. 1994, 22, 2817–22; T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898–1905; S. E. Lee et al. Nucleic Acid Res. 2001, 29 1565–73; K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872–2875) dass sie durch DNA-Polymerasen toleriert zu werden, einschließlich thermostabile DNA-Polymerasen, die für die PCR geeignet sind. Dieser konvergente Ansatz ermöglicht einer großen Auswahl von Metall-bindenden Liganden schnell in jedes Nukleotid-Analogon eingebaut zu werden. Die Synthese von 7 wurde durch Folgen eines zuvor berichteten (K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872–2875) Weges (48, Phillips, Chorba, Liu, nicht veröffentlichte Ergebnisse) vollendet. Die Heckkopplung von kommerziell erhältlichem 5-Iod-2'-Deoxyuridin (22) mit N-Allyltrifluoroacetamid ergab 23. Die 5'-Triphosphatgruppe wurde durch Behandlung von 23 mit Trimethylphosphat, POCl₃, und Protonschwamm (1,8-bis(dimethylamion)-Naphthalen), gefolgt durch Tri-n-Butylammonium-Pyrophosphat, installiert, und die Trifluoroacetamidgruppe wurde dann mit wässrigem Ammoniak entfernt um 7 zu ergeben.
Mehrere Schritte in Richtung der Synthese von 13 wurden vollendet, das Schlüsselzwischenprodukt für 7-Deazaadenosinanaloga (49). Einer bekannten Route folgend (J. Davoll. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 131–138) wurde Diethoxyethylcyanoacetat (24) aus Bromacetal 25 und Ethylcyanoacetat (26) synthetisiert. Die Konzentration von 24 mit Thioharnstoff ergab Pyrimidin 27, welches mit Raney-Nickel desulfuriert wurde und dann mit verdünnter wässriger HCl zu Pyrrolpyrimidin 28 zyklisiert wurde. Die Behandlung von 28 mit POCl₃ ergab 4-Chlor-7-Deazaadenin (29). Die Acryljodidgruppe, welche als ein Sonogashirea-Kupplungspartner für die Installation des propargylischen Amins in 13 dient, wurde durch Reagieren von 29 mit N-Iodsuccinimid installiert, um 4-Chlor-7-Iod-7-Deazaadenin (30) mit einer Gesamtausbeute von 13% aus Bromacetal zu erzeugen.
Als Alternative funktionalisierte Adeninanaloga, die sowohl die strukturellen Anforderungen der DNA-Polymeraseakzeptanz untersuchen als auch potentielle Metallbildungsfunktionalität bereitstellen werden, wurden sechs 8-modifizierte Deoxyadenosintriphosphate (50) synthetisiert. Alle funktionellen Gruppen wurden durch Addition an 8-Brom-Deoxyadenosin (31) installiert, welches durch Brominierung von Desoxyadenosin in der Gegenwart von ScCl₃ hergestellt wurde, von welchen wir herausgefunden haben, dass es die Produktausbeute stark erhöht. Methyl-(32), Ethyl-(33), und Vinyladenosin (34) wurden durch Pd-vermittelte Stillekopplung des entsprechenden Alkyl-Zinnreagenzes und 31 synthetisiert (P. Mamos et al. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 2413–2416). Methylamino-(35) (E. Nandanan et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 1625–1638), Ethylamio-(36), und Histaminoadenosin (37) wurden durch Behandlung von 23 mit dem entsprechenden Amin in Wasser oder Ethanol hergestellt. Die 5'-Nukleotid-Triphosphate von 32–37 wurden wie oben beschrieben synthetisiert.
Die Fähigkeit von thermostabilen DNA-Polymersasen, die für die PCR-Amplifikation geeignet sind, diese modifizierten, Metall-Bindungsfunktionalität Nukleotid-Triphosphate enthaltenden, zu akzeptieren. Nicht natürliche Nukleotid-Triphosphate wurde durch Ionenaustausch HPLC gereinigt und zu PCR-Reaktionen, die Taq-DNA-Polymerase, drei natürliche Deoxynukleotid-Triphosphate, pUC19 Matrizen-DNA und zwei DNA-Primer enthalten, hinzugefügt. Die Primer wurden so ausgewählt, um PCR-Produkte zu erzeugen, die in Länge von 50 bis 200 Basenpaaren reichen. Kontroll-PCR-Reaktionen enthielten die vier natürlichen Deoxynukleotid-Triphosphate und keine nicht natürlichen Nukleotide. Die PCR-Reaktionen wurden durch Agarose oder durch denaturierende Acrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Amino-modifiziertes Uridinderivat 7 wurde durch Taq-DNA-Polymerase über 30 PCR-Zyklen effektiv eingebaut, während das Triphosphat von 23 kein effizientes Polymerasesubstrat war (51). Frühere Ergebnisse über die Akzeptanz von 7 durch Taq-DNA-Polymerase sind als in Konflikt sowohl mit der nicht-Akzeptanz (K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872–2875) als auch mit der Akzeptanz (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565–73) berichtet.
Nicht natürliche Metallbindung Deoxyribonukleotid Triphosphatsynthese: Die Synthese des C5-Funktionalisierten Uridin, des C7-funktionalisierten 7-Deazaadenosin, und des C8-funktionalisiserten Adenosin Deoxynukleotid Triphosphate wird vollendet sein. Die Synthese der 7-Deazzaadenosinderivate von 4-Chlor-7-Iod-Deazaadenin (30) verläuft durch Glycosylierung von 30 mit geschütztem Deoxyribosylchlorid 38, gefolgt durch die Ammonolyse, um 7-Iod-Adenosin (39) zu ergeben (31) (Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898–1905). Geschütztes Deoxyribosylchlorid 38 kann aus Deoxyribose, wie in 52 gezeigt, erzeugt werden. Die Pd-vermittelte Sonogashirakupplung (Seela et al. Helv. Chem. Acta 1999, 82, 1878–1898) von 39 mit N-Propynyltrifluoroacetamid ergibt 40, welches dann zu dem 5' Nukleotid-Triphosphat umgewandelt wird und mit Ammoniak schutzeliminiert wird, wie oben beschrieben um 13 zu ergeben.
Um schnell eine Sammlung von Metallbindungs-Uridin und Adenosin-Analoga zu erzeugen, wird eine Vielzahl von Metallbindenden Gruppen, wie NHS-Ester an C5-modifiziertes Uridin-Zwischenprodukt 7 (bereits synthetisiert) und C7-modifiziertes 7-Deazaadenosin-Zwischenprodukt 13 gekoppelt. Die Metall-bindungsgruppen, die anfänglich untersucht werden, sind in 47 gezeigt und beinhalten Phosphine, Thiopyridylgruppen, und Hemi-Salenanteile. Wenn unsere anfängliche Polymeraseakzeptanz-Untersuchungen (siehe in folgenden Abschnitt) von Triphosphaten von 8-modifizierten Adenosinen 32–37 (50) darauf hinweisen, dass eine Vielzahl von 8-modifizierten Adenosinanalga durch thermostabile Polymerasen akzeptiert werden, werden Alkyl- und Vinyl-Trifluoroacetamide an 8-Brom-Deoxyadenosin (31) gekoppelt werden, um Nukleotid-Triphosphate zu erzeugen, wie 41 und 42 (53). Diese Zwischenprodukte werden dann mit in 46 gezeigten NHS Ester gekoppelt, um eine Vielzahl von Metallbindungs-8-funktionalisierten Deoxyadenosintriphosphaten zu erzeugen.
Evaluieren von nichtnatürlichen Nukleotiden: Jedes funktionalisiertes Deoxyribonukleotidtriphosphat wird dann auf seine Eignung als eine Baueinheit einer entstehenden nicht natürlichen Polymer-Bibliothek in zwei Stufen untersucht. Erstens wird die einfache Akzeptanz durch thermostabile DNA-Polymerasen durch die PCR Amplifikation von Fragmenten von DNA Plasmiden pUC 19 mit verschiedener Länge gemessen. PCR Reaktionen enthalten synthetische Primer, die bestens ausgebildet sind, um an die Enden des Fragments, einer kleinen Menge an pUC 19 Matrizen DNA, einer thermostabilen DNA Polymerase (Taq, Pfu oder Vent), drei natürlichen Deoxyribonnukleotid Triphosphate, und das zu testende nicht natürliche Nukleotid Trisphospat zu binden. Der vollständige erfolgreiche Einbau des nicht natürlichen Nukleotids führt zu der Erzeugung von DNA Produkten einer beliebigen Länge mit einer Rate, die ähnlich jener der Kontrollreaktion ist. Jene Nukleotide, die zumindest den Einbau von 10 oder mehrer nicht natürlichen Nukleotiden in einem einzigen Produktmolekül mit zumindest mässiger Wirksamkeit erlauben, werden einem zweiten Evaluierungsschritt unterzogen.
Durch thermostabile DNA Polymerasen akzeptierte nicht natürliche Nukleotide werden auf ihre mögliche Mutagene Eigenschaften evaluiert. Wenn DNA Polymerasen ein nicht natürliches Nukleotid gegenüber einer inkorrekten (nicht Watson-Crick) Matrizen Base einfügen, und ein inkorrektes natürliches Nukleotid gegenüber einem nicht natürlichen Nukleotid in der Matrize einfügen, wird die Genauigkeit der Bibliotheks-Amplifikation und Translation beeinträchtigt. Um diese Möglichkeit zu evaluieren, werden die in der obigen Untersuchung erzeugten PCR Produkte einer DNA Sequenzierung unter Verwendung von jedem der PCR Primer unterzogen. Abweichungen von der Sequenz der pUC 19 Matrize implizieren, dass eine oder beide der Mutagenen Mechanismen stattfinden. Fehlerraten von weniger als 0,7% pro Base pro 30 PCR Zyklen sind akzeptabel, da error prone PCR, die Fehler mit ungefähr dieser Rate erzeugt (Caldwell et al. PCT Methods Applic. 1992, 2, 28–33), dennoch erfolgreich verwendet wurde, um Nukleinsäure Bibliotheken zu entwickeln.
Paare von viel versprechenden nicht natürlichen Adenosin Analoga und nicht natürlichen Uridin Analoga werden zusammen auf ihre Fähigkeit, die DNA-Polymerisation in einer PCR Reaktion, die beide modifizierten Nukleotid Triphosphate zusammen mit dGTP und dCTP enthält, zu unterstützen, getestet. Die erfolgreiche PCR Produktbildung mit zwei nicht natürlichen Nukleotid Trisphosphaten ermöglicht den Einbau von zwei nicht natürlichen Metall-bindenden Basen in dasselbe Polymermolekül. Funktionalisierte Nukleotide, die von besonderem Interesse sind, aber dennoch mit Taq, Pfu oder Vent thermostabilen DNA Polymerasen kompatibel sind, können nach wie vor in den Bibliotheken verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass sie durch eine kommerziell erhältliche DNA Polymerase, wie das Klenow Fragment von E. coli DNA Polymerase 1, T7 DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, oder M-MuLV Umkehrtranskriptase akzeptiert werden. In diesem Fall erfordert die Untersuchung das Ausführen des Primer-Erweiterungsschrittes der PCR Reaktion bei 25 bis 37°C, und frische Polymerase muss bei jedem Zyklus im Anschluss an den 94°C Denaturierungsschritt hinzugefügt werden. Die DNA-Sequenzierung zur Evaluierung der möglichen mutagenen Eigenschaften der nicht natürlichen Nukleotiden, wird nach wie vor wie oben beschrieben, ausgeführt.
Erzeugen von Bibliotheken von Metallbindungs-Polymeren. Basierend auf den Ergebnissen der obigen nicht natürlichen Nukleotiduntersuchungen, werden mehrere Bibliotheken von ~10¹⁵ unterschiedlichen Nukleinsäure-Sequenzen ausgefertigt, die ein oder zwei der am meisten Polymerase-kompatiblen und chemisch viel versprechenden nicht natürlichen Metallbindungs-Nukleotiden enthalten. Die Bibliotheken werden durch PCR Amplifikation einer synthetischen DNA-Matrizen-Bibliothek, die aus einer zufälligen Region von 20 oder 40 Nukleotiden, die durch zwei 15-Basen konstante Primingregionen markiert sind, enthalten, erzeugt (54). Die Primingregionen enthalten Restriktionsendnuklease Spaltungsstellen, um das Klonieren in Vektoren für die DNA Sequenzierung von Tools oder individuellen Bibliotheksmitgliedern zu ermöglichen. Ein Primer enthält einen chemischen Griff, wie eine primäre Amingruppe oder eine Thiolgruppe an seinen 5' Terminus und wird zu dem kodierenden Strang der Bibliothek. Der andere Primer enthält ein biotinyliertes T an seinem 5'-Terminus und wierd der nicht-kodierende Strang. Die PCR Reaktion enthält ein oder zwei nicht natürliche Metallbindungs-Deoxyribonukleotid Trisphosphate, drei oder zwei natürliche Deoxyribonukleotide Triphospate, und eine DNA Polymerase, die mit dem(n) nicht natürlichen Nukleotid(en) kompatibel ist. Im Anschluss an die PCR Reaktion, um die doppelsträngige Form der Bibliothek zu erzeugen und Gelreinigung, um benötigte Primer zu entfernen, werden Bibliotheksmitglieder-Duplexe chemisch denaturiert. Die nicht kodierenden Stränge werden dann durch mehrere Waschungen mit Streptavidin-gebundenen magnetischen Kügelchen entfernt, um sicher zu stellen das kein biotinylierter Strang in der Bibliothek zurückbleibt. Bibliotheken von bis zu 10¹⁵ unterschiedlichen Mitgliedern werden durch dieses Verfahren erzeugt, was die kombinierte Diversität von früheren kombinatorischen Katalysatorleistungen bei weitem übersteigt.
Jede Bibliothek wird dann in einer wässrigen Lösung mit einem Metall von Interesse inkubiert, die aus der folgenden nicht einschränkenden Liste von wasserlöslichen Metallsalzen ausgewählt ist (Fringueli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439–455; Zaitoun et al. J. Phys. Chem. B 1997, 1857–1860): ScCl₃, CrCl₃, MnCl₂, FeCl₂, FeCl₃, CoCl₂, NiCl₂, CuCl₂, ZnCl₂, GaCl₃, YCl₃, RuCl₃, RhCl₃, PdCl₂, AgCl, GdCl₂, InCl₃, SnCl₂, La(OTf)₃, Ce(OTf)₃, Pr(OTf)₃, Nd(OTf)₃, Sm(OTf)₃, Eu(OTf)₃, Gd(OTf)₃, Tb(OTf)₃, Dy(OTf)₃, Ho(OTf)₃, Er(OTf)₃, Tm(OTf)₃, Yb(OTf)₃, Lu(OTf)₃, IrCl₃, PtCl₂, AuCl, HgCl₂, HgC, PbCl₂, oder BiCl₃. Die Metalle werden basierend auf den spezifischen zu katalysieren chemischen Reaktionen ausgewählt. Zum Beispiel werden Bibliotheken, die auf Reaktionen wie Aldol Kondensation oder hetero Diels-Alder Reaktionen gerichtet sind, von denen bekannt ist (Fringuelli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439–455) dass sie durch Lewis Säuren katalysiert werden, mit ScCL₃ oder mit einem der Lanthanid Triflaten inkubiert, während jene, die auf die Kopplung von Elektronen effizienten Olefinen mit Arylhaliden abzielen, mit PdCl₂ inkubiert werden. Die Metallat-Bibliothek wird dann von ungebundenen Metallsalzen durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex oder Acrylamid Kartuschen gereinigt, welche DNA Oligonukleotide 25 Basen oder länger von ungebundenen kleinen Molekülkomponenten trennt.
Die Fähigkeit der Polymerbibliothek (oder eines individuellen Bibliotheksmitglied) Metalle von Interesse zu bilden, wird durch Behandlung der Metallat-Bibliothek, die kein ungebundenes Metall enthält, mit Metall-färbenden Reagenzien wie Dithiooxamid, Dimethylglyoxim, KSCN (Francis et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 422–8) oder EDTA (Zaitoun et al. J. Phys. Chem. B 1997, 101, 1857–1860), die in Gegenwart von unterschiedlichen Metallen merklich gefärbt werden, verifiziert. Das ungefähre Ausmaß der Metallbindung wird durch spektrophotometrischen Vergleich mit Lösungen von freien Metallen mit bekannten Konzentrationen und mit Lösungen von positiven Kontrolloligonukleotiden, die eine EDTA Gruppe enthalten (welche unter Verwendung eines kommerziell enthältlichen Phosphoramidid von Glen Research eingefügt werden kann) gemessen.
In vitro Selektionen auf nicht natürliche Polymere Katalysatoren: Metallat-Bibliotheken von entwickelbaren nicht natürlichen Polymeren, die Metall-bindende Gruppen enthalten, werden einer Eingefäß-, Lösungsphasen-Selektion auf katalytische Aktivitäten von Interesse unterzogen. Bibliotheks-Mitglieder, die nahezu jede Reaktion katalysieren, die die Bindungsbildung zwischen zwei Substratmolekülen verursacht, oder die einen Bindungsbruch in zwei Produktmoleküle verursacht, werden unter Verwendung der in 54 und 55 vorgeschlagenen Schemata selektiert. Um auf Bindungs-Bildungs-Katalysatoren zu selektieren (z. B. Hetero Diels-Alder, Heck Kopplung, Aldol Reaktion oder Olefin-Metathese-Katalysatoren) werden Bibliotheksmitglieder kovalent an ein Substrat durch ihre 5'-Amino- oder Thiol-termini gebunden. Das andere Substrat der Reaktion wird als ein Derivat, welches an Biotin gebunden ist, synthetisiert. Wenn verdünnte Lösungen des Bibliotheks-Substrat-Konjugats mit dem Substrat-Biotin Konjugat reagiert werden, bewirken jene Bibliotheks-Mitglieder, die die Bindungsbildung katalysieren, dass die Biotingruppe kovalent an sich selbst angeheftet wird. Aktive Bindungsbildungs-Katalysatoren können dann von inaktiven Bibliotheksmitgliedern durch Einfangen des Ersteren mit immobilisierten Streptavidin und Wegwaschen von inaktiven Polymeren getrennt werden (55).
Auf analoge Art können Bibliotheks-Mitglieder, die Bindungspaltungs-Reaktionen, wie Retro-Aldol Reaktionen, Amidhydrolyse, Elimination-Reaktionen, oder Olefin Dihydroxylierung gefolgt von der Periodatspaltung, katalysieren, selektiert werden. In diesem Fall werden Metallat-Bibliotheks-Mitglieder kovalent an biotinylierte Substrate gebunden, so dass die Bindungspaltungs-Reaktion die Trennung des Biotin-Anteils von den Bibliotheks-Mitgliedern hervorruft (56). Bei der Inkubation und der Reaktionsbedingungen induzieren aktive Katalysatoren, nicht jedoch inaktive Bibliotheks-Mitglieder, den Verlust ihrer Biotingruppen. Streptavidin-gebundene Kügelchen können dann verwendet werden, um inaktive Polymere einzufangen, während aktive Katalysatoren in der Lage sind, von den Kügelchen zu eluieren. Verwandte Bindungsbildungs- und Bindungspaltungs-Selektionen wurden erfolgreich in der katalytischen RNA und DNA Evolution verwendet (Jäschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257–62). Obwohl diese Selektionen nicht explizit auf multiple Stoffumsatzkatalyse selektieren, haben sich die auf diese Art selektierten RNAs und DNAs als multiple Stoffumsatzkatalysatoren herauskristallisiert, wenn sie von ihren Substratanteile getrennt werden (Jäschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257–62; Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 14712–7; Bartel et al. Science, 1993, 261, 1411–8; Sen et al Curr. Opoin. Chem. Biol. 1998, 2, 680–7).
Katalysatoren von drei wichtigen und unterschiedlichen Bindungsbildungs-Reaktionen werden anfänglich entwickelt: Heck Kopplung, Hetero Diels-Alder Cycloaddition und Aldol Addition. Alle drei Reaktionen sind wasserkompatibel (Kobayashi et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8287–8288; Fringuelli et al. Eur. J. Org. chem. 2001, 2001, 439–455; Li et al. Organic Reactions in Aqueous Media: Wiley and Sons: New York, 1997) und sind bekannt durch Metalle katalysiert zu werden. Als Heck Kopplungs-Substrate werden Elektronen deffiziente und nicht aktivierte Olefine, zusammen mit Aryl Iodid und Aryl Chlorid verwendet. Heck Reaktionen mit Aryl Chloriden in wässriger Lösung, sowie Raumtemperatur-Heck-Reaktionen mit nicht aktivierten Aryl Chloriden, wurden zu unserem Wissen bis jetzt noch nicht berichtet. Bibliotheken für die Heck Kopplungs-Katalysator-Evolution verwenden PdCl₂ als eine Metallquelle. Hetero Diels-Alder Substrate beinhalten einfache Diene und Aldehyde, während Aldol Additions Substrate aus Aldehyden und sowohl Silyl Enol Ether als auch einfachen Ketonen bestehen. Charakteristisches Selektion Schemata für die Heck Kopplung, Hetero Diels-Alder und Aldol Additions Katalysatoren sind in 57 gezeigt. Die Stringenz dieser Selektionen kann zwischen den Selektionsrunden durch Verringern der Reaktionszeiten, sinkende Reaktionstemperaturen oder das Verwenden von weniger aktivierten Substraten (zum Beispiel, weniger elektronenarme Aryl Chloride (Littke et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6989–7000) oder einfache Ketone anstelle von Silyl Enol Ether) erhöht werden.
Entstehende nicht natürliche Polymere: Diversifikation und Selektieren auf Stereospezifität:
Im Anschluss an jede Selektionsrunde werden aktive Bibliotheks-Mitglieder durch PCR mit nicht natürlichen Nukleotiden amplifiziert und zusätzlichen Selektionsrunden unterzogen, um die Bibliothek an den gewünschten Katalysatoren anzureichern. Diese Bibliotheken werden durch Einführen eines Diversifikationsschrittes vor jeder Selektionsrunde genau entwickelt. Bibliotheken werden durch Zufallsmutagenese unter Verwendung der error-prone PCR (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992, 2, 28–33) oder durch Rekombination unter Verwendung von modifizierten DNA Shufflings-Verfahren, die kleine nicht homologe Nukleinsäure Fragmente rekombiniert, diversifiziert. Da die error-prone PCR von Natur aus weniger effizient ist als die normale PCR, wird die error-prone PCR Diversifikation mit nur natürlichen dATP, dTTP, dCTP und dGTP und unter Verwendung von Primern, die chemische Griffe oder Biotingruppen Fällen durchgeführt. Die resultierenden mutagenisierten Produkte werden dann einer PCR Translation in nicht natürliche Nukleinsäure Polymere unter Verwendung von Standard PCR Reaktionen, die die nicht natürlichen Nukleotide, die biotinylierten Primer und den Amino- oder Thiol-begrenzenden Primer enthalten, unterzogen.
Zusätzlich zu der einfachen Entwicklung von aktiven Katalysatoren werden die oben beschriebenen in vitro-Selektionen verwendet, um nicht natürliche Polymer-Bibliotheken in leistungsfähige Richtungen zu entwickeln, die schwierig sind, unter Verwendung von anderen Katalysator-Auffindansätzen zu erreichen. Ein Freigabemerkmal dieser Selektionen ist die Fähigkeit entweder auf Bibliotheks-Mitglieder, die biotinyliert werden oder die nicht biotinyliert werden, zu selektieren. Die Substrat-Spezifität unter den Katalysatoren kann deshalb entwickelt werden, indem auf aktive Katalysatoren in der Gegenwart des gewünschten Substrats selektiert wird und dann in demselben Gefäß auf inaktive Katalysatoren in der Gegenwart von einem oder mehreren ungewünschten Substraten selektiert wird. Wenn sich die gewünschten Substrate durch die Konfiguration an einen oder mehreren Stereozentren unterscheiden, können enantiosselektive oder diastereoselektive Katalysatoren von den Selektionsrunden hervorgehen. Auf ähnliche Weise kann die Metall-Selektivität durch Selektieren auf aktive Katalysatoren in der Gegenwart von gewünschten Metallen und Selektieren auf inaktive Katalysatoren in der Gegenwart von ungewünschten Metallen entwickelt werden. Umgekehrt können Katalysatoren mit einer breiten Substrat-Toleranz durch Variieren der Substratstrukturen zwischen erfolgreichen Selektionsrunden entwickelt werden.
Schließlich weisen die Beobachtungen der Sequenz-spezifischen DNA-Matrizen-basierenden Synthese in DMF und CH₂Cl₂ daraufhin, dass DNA-Tetralkylammonium Kation Komplexe Basen-gepaarte Strukturen in organischen Lösungsmittel bilden können. Dieses Erkenntnis ergibt die Möglichkeit zum Entwickeln von nicht natürlichen Nukleinsäure-Katalysatoren in organischen Lösungsmittel unter Verwendung von leicht modifizierten Versionen der oben beschriebenen Selektionen. Die tatsächlichen Bindungsbildungs und Bindungspaltungs-Selektions-Reaktionen werden in organischen Lösungsmittel ausgeführt, die Rohreaktionen werden mit Ethanol präzipitiert, um die Tetraalkylammonium Kationen zu entfernen, und die immobilisierte Avidin-Trennung von biotinylierten und nicht biotinylierten Bibliotheksmitgliedern in wässriger Lösung wird ausgeführt. Die PCR Amplifikation von ausgewählten Mitgliedern wird dann wie oben beschrieben stattfinden. Die erfolgreiche Entwicklung von Reaktion-Katalysatoren, die in organischen Lösungsmittel funktionieren, würde sowohl den Umfang der Reaktionen, die katalysiert werden können, als auch den Nutzen der resultierenden entwickelten nicht-natürlichen Polymer-Katalysatoren beachtlich erweitern.
Charakterisierung der entwickelnden nicht natürliche Polymere: Bibliotheken, die mehreren Evolutionsrunden unterzogen wurden, werden auf ihre Fähigkeit, Reaktionen von Interesse sowohl als Pools von gemischten Sequenzen oder als auch individuelle Bibliotheksmitglieder zu katalysieren, charakterisiert. Individuelle Mitglieder werden aus entwickelnden Pools durch Ligieren von PCR amplifizierten Sequenzen in DNA Vektoren, Transformieren von verdünnten Lösungen von ligierten Vektoren in kompetente Bakterienzellen, und Auswählen von Einzelkolonien von Transformanten freigesetzt. Untersuchungen an Pools oder individuellen Sequenzen werden sowohl in dem Einzelstoffumsatzformat und in einem wahren Mehrfachstoffumsatz katalytischen Format ausgeführt. Für die Einzelumsatz-Untersuchungen, wird die Rate, bei welcher Substrat-gebundene Bindungsbildungs-Katalysatoren ihre eigene Biotinylierung in der Gegenwart von freien biotinylierten Substrat bewirkt, oder die Rate, bei welcher biotinylierte Bindungsbruch-Katalysatoren den Verlust ihrer Biotingruppen bewirkt, gemessen werden. Mehrere Stoffumsatzuntersuchungen werden durch Inkubieren von entwickelten Katalysatoren mit kleinen Molekülversionen von Substraten und Analysieren der Produktbildungsrate durch tlc, NMR, Massen-Spectometrie, HPLC oder Spektrophotometrie ausgeführt.
Sobald multiple Wirksoffumsatz-Katalysatoren entwickelt und durch diese Verfahren verifiziert werden, können detaillierte mechanistische Studien an den Katalysatoren ausgeführt werden. Die DNA-Sequenzen, die den Katalysatoren entsprechen, werden durch Sequenzieren von PCR-Produkten oder DNA-Vektoren, die die Matrizen der aktiven Katalysatoren enthalten, aufgedeckt. Metall-Präferenzen werden durch Metalat-Katalysatoren mit einer großen Vielzahl von Metall-Kationen und Messen der resultierenden Änderung der Aktivität evaluiert. Die Substrat-Spezifität und Stereoselektivität dieser Katalysatoren werden durch Messen der Stoffumsatzraten einer Reihe von Substrat-Analoga beurteilt. Die Diastereoselektivitäten und Enantioselektivitäten der Produktbildung werden durch Vergleichen der Reaktionsprodukte mit jenen von bekannter Stereo-Chemie aufgedeckt. Frühere Studien weisen daraufhin, dass aktive Stellen, die innerhalb von großen chiralen Umgebungen verdeckt sind, oft hohe Grade von Stereoselektivität besitzen. Zum Beispiel haben Peptid-basierende Katalysatoren, die in kombinatorischen Ansätzen erzeugt wurden, schlechte bis exzellente Stereoselektivitäten demonstriert, die mit der Größe des Peptid-Ligands korrelieren (Jarvo et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11638–11643), während RNA-basierende Katalysatoren und Antikörper-basierende Katalysatoren häufig exzellente Stereoselektivitäten demonstrieren (Jäschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257–262; Seelig et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000, 39, 4576–4579; Hilvert, D. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 751–93; Barbas et al. Science 1997, 278, 2085–92; Zhong et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 3738–3741; Zhong et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8131–8132; List et al. Org. Lett. 1999, 1, 59–61). Die direkte Selektionen auf Substrat-Stereoselektivität, die oben beschrieben ist, sollte diese Eigenschaft unter entwickelten Katalysatoren weitere erhöhen.
Struktur-Funktion-Studien an entwickelten Katalysatoren werden durch die Leichtigkeit der automatisierten DNA Synthese außerordentlich erleichtert. Orts-spezifisch strukturelle Modifikationen werden durch Synthetisieren von DNA-Sequenzen, die „mutierten” Katalysatoren entsprechen, in welchen die Basen von Interesse zu anderen Basen verändert werden, eingeführt. Das Ändern der nicht natürlichen Basen in einem Katalysator zu einer natürlichen Base (U* zu C oder A* zu G) und Untersuchung der resultierenden Mutanten kann die chemisch wichtigen Metallbindungsstellen in jedem Katalysator identifizieren. Das für eine wirksame Katalyse erforderte minimale Polymer wird durch Synthetisieren und Untersuchen von stufenweise verkürzten Versionen der aktiven Katalysatoren bestimmt. Schließlich werden die drei-dimensionalen Strukturen der mit Metall komplexierten entwickelt Katalysatoren von größtem Interesse in Zusammenarbeit mit lokalen makromolekularen NMR Spektroskopikern oder Röntgen-Kristallographern gelöst.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Durchführen von auf Nucleinsäurematrizen basierender, mehrstufiger Synthese, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Bereitstellen, in einer einzigen Lösung, von (i) einer Matrize, die eine erste reaktive Einheit aufweist, die mit einem ersten Oligonucleotid covalent verbunden ist, welches eine Vielzahl unterschiedlicher Codonsequenzen aufweist und eine erste Codonsequenz definiert, und (ii) einer Vielzahl unterschiedlicher Transfereinheiten, die eine anti-Codonsequenz und eine reaktive Einheit aufweisen, welche eine erste Transfereinheit beinhaltet, die eine zweite reaktive Einheit aufweist, die mit einem zweiten Oligonucleotid covalent verbunden ist, welches eine erste anti-Codonsequenz definiert, die zu der ersten Codonsequenz der Matrize komplementär ist; und b) Annealing der ersten Codonsequenz und der ersten anti-Codonsequenz aneinander, um die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit in reaktionsfähige Nähe zu bringen, wobei eine Reaktion zwischen der ersten und der zweiten reaktiven Einheit erzeugt wird, um unabhängig von der ribosomalen Maschinerie ein Reaktionsprodukt zu erzeugen, wobei das Reaktionsprodukt keine Nukleinsäure ist.
Verfahren zum Durchführen von auf Nucleinsäurematrizen basierender Synthese, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: (1) Erzeugen einer Bibliothek von Verbindungen durch ein Verfahren welches folgendes aufweist: a) Bereitstellen von (i) einer amplifizierbaren Matrize, die eine erste reaktive Einheit verbunden mit einem ersten eine erste Codonsequenz definierenden Oligonucleotid aufweist, und (ii) einer ersten Transfereinheit, die eine zweite reaktive Einheit aufweist, die mit einem zweiten Oligonucleotid verbunden ist, das eine anti-Codonsequenz, die zur ersten Codonsequenz komplementär ist, aufweist, und b) Annealing der Codonsequenzen und der anti-Codonsequenzen aneinander, um die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit in reaktionsfähige Nähe zu bringen, wobei eine Reaktion zwischen den ersten und den zweiten reaktiven Einheiten ausgelöst wird, um unabhängig von der ribosomalen Maschinerie ein Reaktionsprodukt zu erzeugen, wobei das Reaktionsprodukt keine Nukleinsäure ist; (2) Identifizieren, aus der Bibliothek, einer Verbindung, die einer Matrize zugeordnet ist, welche wirkt, um die Verbindung zu identifizieren; und (3) Amplifizieren der in Schritt 2 identifizierten Matrize.
Verfahren zum Durchführen von auf Nucleinsäurematrizen basierender Synthese, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Bereitstellen, in einer einzigen Lösung, von (i) einer Matrize, die eine erste reaktive Einheit verbunden mit einem eine Vielzahl unterschiedlicher Codonsequenzen aufweisenden ersten Oligonucleotid, welches eine erste Codonsequenz definiert, aufweist, (ii) einer Vielzahl unterschiedlicher Transfereinheiten, die ein anti-Codon und eine reaktive Einheit aufweisen, welche eine erste Transfereinheiten aufweist, die eine zweite reaktive Einheit aufweist, die mit einem zweiten Oligonucleotid kovalent verbunden ist, welches eine erste zu der ersten Codonsequenz der Matrize komplementäre anti-Codonsequenz definiert; b) Annealing der ersten Codonsequenz und der ersten anti-Codonsequenz aneinander, um die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit in reaktionsfähige Nähe zu bringen, wobei eine Reaktion zwischen der ersten und der zweiten reaktiven Einheit ausgelöst wird, um unabhängig von der ribosomalen Maschinerie ein Reaktionsprodukt zu erzeugen, wobei das Reaktionsprodukt keine Nukleinsäure ist; c) Auswählen des mit der Matrize in Verbindung stehenden Produktes; und d) Ermitteln der Sequenz der Matrize, wodurch die Identifikation des Reaktionsprodukts erleichtert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Matrize weiters eine zweite unterschiedliche Codonsequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, welches weiters das Bereitstellen einer zweiten Transfereinheit aufweist, die in der Lage ist, sich an die zweite unterschiedliche Codonsequenz der Matrize zu annealen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die erste und die zweite Transfereinheit gemeinsam in Schritt (a) bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiters den zusätzlichen Schritt des Auswählens des mit der Matrize in Verbindung stehenden Reaktionsproduktes aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Reaktionsprodukt covalent an die Matrize angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 7, welches weiters den zusätzlichen Schritt des Amplifizierens der Matrize aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, welches weiters den zusätzlichen Schritt des Bestimmens der Sequenz der Matrize aufweist, um dadurch die Identifikation des Reaktionsproduktes zu erleichtern.
Verfahren nach Anspruch 2, welches weiters den zusätzlichen Schritt des Bestimmens der Sequenz der Matrize aufweist, um dadurch die Identifikation des Reaktionsproduktes zu erleichtern.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die erste reaktive Einheit an das erste Oligonucleotid covalent angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste reaktive Einheit an das erste Oligonucleotid nicht-covalent angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste reaktive Einheit an das erste Oligonucleotid über ein drittes Oligonucleotid angelagert ist, welches mit dem ersten Oligonucleotid hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Matrize durch eine Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reaktionsprodukt covalent an die Matrize angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reaktionsprodukt nicht-covalent an die Matrize angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die erste reaktive Einheit nicht-covalent an das erste Oligonucleotid angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die erste reaktive Einheit nicht-covalent an das erste Oligonucleotid über eine Oligonucleotidsequenz angelagert ist, welche mit dem ersten Oligonucleotid hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Reaktionsprodukt covalent an die Matrize angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, welches weiters den zusätzlichen Schritt des Amplifizierens der Matrize aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die erste reaktive Einheit ein kleines Molekülgerüst aufweist, das in der Lage ist, mit einer Vielzahl von Reaktanten zu reagieren.
Verfahren zum Durchführen von auf Nucleinsäurematrizen basierender Synthese, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Bereitstellen von (i) einer Matrize, die ein kleines Molekülgerüst in Verbindung mit einem ersten eine erste Codonsequenz definierenden Oligonucleotid und einer zweiten, unterschiedlichen Codonsequenz aufweist, wobei das kleine Molekülgerüst eine Vielzahl von Modifikationsstellen enthält, und (ii) einer ersten Transfereinheit, die eine erste reaktive Einheit aufweist, die mit einem zweiten Oligonucleotid covalent verbunden ist, das eine erste anti-Codonsequenz, die zur ersten Codonsequenz komplementär ist, definiert, und (iii) eine zweite Transfereinheit, die eine zweite reaktive Einheit aufweist, die mit einem dritten Oligonucleotid assoziiert ist, das eine zweite anti-Codonsequenz definiert, die in der Lage ist sich an die zweite, unterschiedliche Codonsequenz der Matrize zu annealen; und b) Annealing der Codonsequenzen und der anti-Codonsequenzen aneinander, um das kleine Molekülgerüst und die reaktiven Einheiten in reaktionsfähige Nähe zu bringen, wobei covalente Bindungen ausbildende Reaktionen zwischen der reaktiven Einheiten und dem kleinen Molekülgerüst ausgelöst werden, um unabhängig von der ribosomalen Maschinerie ein modifiziertes kleines Molekülgerüst zu erzeugen, wobei das modifizierte kleine Molekülgerüst keine Nukleinsäure und kein Nukleinsäureanalog ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das kleine Molekülgerüst covalent an das erste Oligonucleotid angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 23, welches weiters den zusätzlichen Schritt des Auswählens eines mit der Matrize in Verbindung stehenden modifizierten kleinen Molekülgerüsts aufweist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das modifizierte kleine Molekülgerüst covalent an die Matrize angelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 25, welches weiters den Schritt des Amplifizierens der Matrize aufweist.
Verfahren nach Anspruch 25, welches weiters den Schritt des Ermittelns der Sequenz der Matrize zur Erleichterung der Identifizierung des modifizierten kleinen Molekülgerüsts aufweist.
Verfahren nach Anspruch 27, welches weiters den Schritt des Ermittelns der Sequenz der Matrize zur Erleichterung der Identifizierung des modifizierten kleinen Molekülgerüsts aufweist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die ersten und die zweiten Transfereinheiten gemeinsam in Schritt (b) bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das kleine Molekülgerüst in der Lage ist, mit einer Vielzahl von Reaktanten zu reagieren.
Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Reaktionsprodukten in einer einzigen Lösung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen, in einer einzigen Lösung, (i) einer Vielzahl von Matrizen, die eine Vielzahl von unterschiedlichen ersten reaktiven Einheiten in Verbindung mit einer korrespondierenden Vielzahl von ersten Oligonucleotiden aufweisen, wobei jedes erste Oligonucleotid wenigstens eine Codonsequenz definiert und (ii) einer Vielzahl von Transfereinheiten, welche eine Vielzahl von zweiten reaktiven Einheiten covalent verbunden mit einer entsprechenden Vielzahl von zweiten Oligonucleotiden aufweisen, wobei jedes der zweiten Oligonucleotide eine zu einer Codonsequenz komplementäre anti-Codonsequenz definiert; und a) Annealing der Oligonucleotide, die komplementäre Codon- und anti-Codonsequenzen aufweisen, um die ersten und die zweiten reaktiven Einheiten in reaktive Nähe zu bringen, wobei unabhängig von der ribosomalen Maschinerie covalente Bindungen ausbildende Reaktionen zwischen den reaktiven Einheiten ausgelöst werden, um eine Vielzahl an unterschiedlichen Reaktionsprodukten zu erzeugen, wobei die Reaktionsprodukte keine Nukleinsäuren sind.
Verfahren nach Anspruch 32, welches weiters der Schritt des Auswählens eines die gewünschten Eigenschaften besitzenden Reaktionsproduktes aufweist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei wenigstens eines der Reaktionsprodukte an ein Targetmolekül bindet.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die ersten mit jeder Matrize in Verbindung stehenden reaktiven Einheiten unterschiedlich sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eines der Oligonucleotide weiters ein Paar komplementärer Sequenzen aufweist, die mit einander zur Erzielung einer Haarnadel annealen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite reaktive Einheit der ersten Transfereinheit über einen Linker mit dem zweiten Oligonucleotid verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsprodukt durch einen Linker an dem zweiten Oligonucleotid der ersten Transfereinheit angelagert verbleibt.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die erste Transfereinheit einen Linker aufweist, der, wenn er abgeschnitten wird, keine Atome an dem Reaktionsprodukt zurücklässt.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die erste Transfereinheit einen Linker aufweist, der, wenn er abgeschnitten wird, eine chemische Gruppe an dem Reaktionsprodukt zurücklässt.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Reaktionsprodukt automatisch während oder nach der Ausbildung des Reaktionsproduktes vom zweiten Oligonucleotid abgeschnitten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Matrize DNA oder RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest eine von Matrize oder Transfereinheit auf einer Oberfläche immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit spontan beim Annealing der Oligonucleotide reagieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit beim Exponieren an einen Katalysator reagieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit in einem wässrigen Lösungsmittel zur Erzeugung eines Reaktionsproduktes reagieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste reaktive Einheit und die zweite reaktive Einheit in einem organischen Lösungsmittel zur Erzeugung eines Reaktionsproduktes reagieren.