DE60222882T2 - Peptide und verwandte moleküle, die an tall-1 binden - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Nach mehrjähriger Studie zur Nekrose von Tumoren wurden 1984 schließlich die Tumornekrosefaktoren (TNFs) α und β kloniert. Die nachfolgenden Jahre zeugten vom Auftauchen einer Superfamilie von TNF-Zytokinen, einschließlich dem Fas-Liganden (FasL), CD27-Liganden (CD27L), CD30-Liganden (CD30L), CD40-Liganden (CD40L), dem mit TNF verwandten Apoptose induzierenden Liganden (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL, auch als AGP-1 bezeichnet), dem Osteoprotegerin bindenden Protein (OPG-BP oder OPG-Ligand), 4-1BB-Liganden, LIGHT, APRIL und TALL-1. Smith et al. (1994), Cell 76: 959–962; Lacey et al. (1998), Cell 93: 165–176; Chichepotiche et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 32401–32410; Mauri et al. (1998), Immunity 8: 21–30; Hahne et al. (1998), J. Exp. Med. 188: 1185–90; Shu et al. (1999), J. Leukocyte Biology 65: 680–3. Diese Familie eint ihre Struktur, insbesondere am C-Terminus. Außerdem werden die meisten Mitglieder, die heutzutage bekannt sind, in Immunkompartimenten exprimiert, obwohl einige Mitglieder auch in anderen Geweben oder Organen ebenfalls exprimiert werden. Smith et al. (1994), Cell 76: 959–62. Alle Ligandenmitglieder, mit Ausnahme von LT-α, sind Transmembranproteine vom Typ II, die durch eine konservierte Region von 150 Aminosäuren innerhalb der C-terminalen extrazellulären Domäne charakterisiert sind. Obwohl sie nur auf 20 bis 25% Identität beschränkt ist, faltet sich die konservierte Domäne von 150 Aminosäuren zu einem charakteristischen β-Faltblatt-Sandwich und trimerisiert. Diese konservierte Region kann proteolytisch freigesetzt werden, wodurch eine lösliche funktionell Form erzeugt wird. Banner et al. (1993), Cell 73: 431–445.
  • Viele Mitglieder dieser Ligandenfamilie werden in mit Lymphzellen angereicherten Geweben exprimiert und spielen wichtige Rollen in der Entwicklung und Modulation des Immunsystems. Smith et al. (1994). Beispielsweise wird TNFα hauptsächlich durch Makrophagen synthetisiert und ist ein wichtiger Mediator von Entzündungsantworten und Immunabwehrreaktionen. Tracey & Cerami (1994), Ann. Rev. Med 45: 491–503. Der Fas-L, der hauptsächlich in der aktivierten T-Zelle exprimiert wird, moduliert die TCR-vermittelte Apoptose von Thymozyten. Nagata, S. & Suda, T. (1995) Immunology Today 16: 39–43; Castrim et al. (1996), Immunity 5: 617–27. CD40L, der ebenfalls durch aktivierte T-Zellen exprimiert wird, macht ein wesentliches Signal für das Überleben und die Proliferation von B-Zellen sowie für den Isotyp-„Switch” von Immunglobulin verfügbar. Noelle (1996), Immunity 4: 415–9.
  • Die verwandten Rezeptoren für die meisten Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie sind identifiziert worden. Diese Rezeptoren teilen charakteristische multiple cysteinreiche Wiederholungen (repeats) in ihren extrazellulären Domänen, und sie besitzen keine katalytischen Motive innerhalb der zytoplasmatischen Regionen. Smith et al. (1994). Die Rezeptoren übermitteln Sigunale durch direkte Interaktionen mit Todesdomäne-Proteinen (z. B. TRADD, FADD und RIP) oder mit den TRAF-Proteinen (z. B. TRAF2, TRAF3, TRAF5 und TRAF6), wodurch divergierende und sich überlappende Signalwege angestoßen werden, z. B. Apoptose, NF-κB-Aktivierung oder JNK-Aktivierung. Wallach et al. (1999), Annual Review of Immunology 17: 331–67. Diese Signalereignisse führen zum Zelltod, zur Proliferation, Aktivierung oder Differenzierung. Das Expressionsprofil jedes Rezeptormitglieds ist anders. Beispielsweise wird TNFR1 in einem breiten Spektrum von Geweben und Zellen exprimiert, während der Zelloberflächenrezeptor von OPGL hauptsächlich auf die Osteoklasten beschränkt ist. Hsu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3540–5.
  • Eine Reihe von Forschungsgruppen haben kürzlich Liganden der TNF-Familie mit derselben oder im Wesentlichen ähnlichen Sequenz identifiziert. Der Ligand ist unterschiedlich als Neutrokin α ( WO 98/18921 , offengelegt am 7. Mai 1998), 63954 ( WO 98/27114 , offengelegt am 25. Juni 1998), TL5 ( EP 869 180 , offengelegt am 7. Oktober 1998), NTN-2 ( WO 98/55620 und WO 98/55621 , offengelegt am 10. Dezember 1998), TNRL1-alpha ( WO 99/11791 , offengelegt am 11. Mai 1999), Kay-Ligand ( WO 99/12964 , offengelegt am 18. März 1999) und AGP-3 ( U.S. Prov. App. Nr. 60/119,906 , angemeldet am 12. Februar 1999 bzw. 60/166,271 , angemeldet am 18. November 1999) und TALL-1 ( WO 00/68378 , offengelegt am 16. November 2000) benannt worden. Nachfolgend werden die Liganden, über die hier berichtet wird, gemeinsam als TALL-1 bezeichnet.
  • TALL-1 ist ein Mitglied der Superfamilie der TNF-Liganden, das funktionell am Überleben und an der Proliferation von B-Zellen beteiligt ist. Transgene Mäuse, die TALL-1 überexprimieren, weisen eine schwere B-Zell-Hyperplasie und eine Lupus-artige Autoimmunerkrankung auf. Khare et al. (2000) PNAS 97(7): 3370–3375. Sowohl TACI als auch BCMA dienen als Zelloberflächenrezeptoren für TALL-1. Gross et al. (2000), Nature 404: 995–999; Ware (2000), J. Exp. Med. 192 (11): F35–F37; Ware (2000), Nature 404: 949–950; Xia et al. (2000), J. Exp. Med. 192(1): 137–143; Yu et al. (2000), Nature Immunnology 1(3): 252–256; Marsters et al. (2000), Current Biology 10: 7845–788, Hatzoglou et al. (2000) J. of Immunology 165: 1322–1330; Shu et al. (2000) PNAS 97(16): 9156–9162; Thompson et al. (2000) J. Exp. Med. 192(1): 129–135; Mukhopadhyay et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(23): 15978–81; Shu et al. (1999) J. Leukocyte Biol. 65. 680–683; Gruss et al. (1995) Blood 85(12): 3378–3404; Smith et al. (1994), Cell 76: 959–962; U.S. Pat. Nr. 5,969,102 , erteilt am 19. Oktober 1999; WO 00/67034 , offengelegt am 9. November 2000; WO 00/40716 , offengelegt am 13. Juli 2000; WO 99/35170 , offengelegt am 15. Juli 1999. Beide Rezeptoren werden auf B-Zellen exprimiert und übermitteln Signale durch die Interaktion mit TRAF-Proteinen. Außerdem binden sowohl TACI als auch BCMA an ein weiteres Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, nämlich APRIL. Yu et al. (2000), Nature Immunology 1(3): 252–256. Für APRIL ist auch gezeigt worden, dass dieser Ligand die B-Zell-Proliferation induziert.
  • Bis heute sind keine rekombinanten oder modifizierten Proteine, welche Peptidmodulatoren von TALL-1 einsetzen, aufgedeckt worden. Rekombinante und modifizierte Proteine stellen eine aufstrebende Klasse von therapeutischen Agenzien dar. Nützliche Modifikationen von Proteinen als therapeutischen Agenzien schließen eine Kombination mit der „Fc"-Domäne eines Antikörpers und eine Verknüpfung mit Polymeren, wie etwa Polyethylenglykol (PEG) und Dextran ein. Derartige Modifikation werden in einer Patentanmeldung mit dem Titel „Modified Peptides as Therapeutic Agents", offengelegt als WO 00/24782 , genau beschrieben.
  • Ein ganz anderer Ansatz zur Entwicklung von therapeutischen Agenzien ist das Durchsuchen von Peptidbibliotheken. Die Interaktion eines Proteinliganden mit seinem Rezeptor findet häufig an einer relativ großen Grenzfläche statt. Wie jedoch für das menschliche Wachstumshormon und seinen Rezeptor gezeigt wurde, tragen nur wenige Schlüsselreste an der Grenzfläche zu dem Hauptanteil der Bindungsenergie bei. Clackson et al. (1995), Science 267: 383–6. Der Großteil des Proteinliganden stellt die bindenden Epitope lediglich in der richtigen räumlichen Anordnung dar oder dient Funktionen, die mit der Bindung in keinem Zusammenhang stehen. Folglich können Moleküle, die nur „Peptid"-Länge (2–40 Aminosäuren) aufweisen, an das Rezeptorprotein eines vorgegebenen großen Proteinliganden binden. Derartige Peptide können die biologische Aktivität des großen Proteinliganden nachahmen („Pepti dagonisten") oder die biologische Aktivität des großen Proteinliganden durch kompetitive Bindung hemmen („Peptidantagonisten").
  • Phagen-Display-Peptidbibliotheken haben sich als ein leistungsfähiges Verfahren zum Identifizieren derartiger Peptidagonisten und -antagonisten erwiesen. Siehe beispielsweise Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; U.S. Pat. Nr. 5,223,409 , erteilt am 29. Juni 1993; U.S. Pat. Nr. 5,733,731 , erteilt am 31. März 1998; U.S. Patent Nr. 5,498,530 , erteilt am 12. März 1996; U.S. Pat. Nr. 5,432,018 , erteilt am 11. Juli 1995; U.S. Pat. Nr. 5,338,665 , erteilt am 16. August 1994; U.S. Pat. Nr. 5,922,545 , erteilt am 13. Juli 1999; WO 96/40987 , offengelegt am 19. Dezember 1996 und WO 98/15833 , offengelegt am 16. April 1998. Bei derartigen Bibliotheken werden zufällige Peptidsequenzen durch Fusion mit Hüllproteinen eines filamentösen Phagen dargestellt. Typischerweise werden die dargestellten Peptide in der Affinitätschromatographie gegen ein immobilisiertes Zielprotein eluiert. Die zurückgehaltenen Phagen können durch aufeinanderfolgende Runden einer Affinitätsreinigung und erneute Propagierung angereichert werden. Die am besten bindenden Peptide können sequenziert werden, um Schlüsselreste innerhalb einer oder mehrerer strukturell verwandter Familien von Peptiden zu identifizieren. Siehe z. B. Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696–9, worin zwei verschiedene Familien identifiziert wurden. Die Peptidsequenzen können auch nahelegen, welche Reste sicher durch „Alanin-Scanning" oder durch Mutagenese auf DNA-Ebene ersetzt werden können. Mutagenese-Bibliotheken können geschaffen und durchsucht werden, um die Sequenz des am besten bindenden Peptids weiter zu optimieren. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401–24.
  • Eine Strukturanalyse der Protein-Protein-Interaktion kann auch verwendet werden, um Peptide nahezulegen, welche die Bindungsaktivität von großen Proteinliganden nachahmen. In einer derartigen Analyse kann die Kristallstruktur die Identität und relative Orientierung der kritischen Reste des großen Proteinliganden nahelegen, aufgrund der ein Peptid entworfen werden kann. Siehe z. B. Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 151255–70. Diese analytischen Verfahren können auch verwendet werden, um die Interaktion zwischen einem Rezeptorprotein und Peptiden, die durch Phagen-Display ausgewählt wurden, zu untersuchen, was eine weitere Modifikation der Peptide nahelegen kann, um die Bindungsaffinität zu erhöhen.
  • Andere Verfahren in der Peptidforschung kompetieren mit dem Phagen-Display. Eine Peptidbibliothek kann mit dem Carboxyterminus des lac-Repressors fusioniert und in E. coli expri miert werden. Ein weiteres Verfahren auf der Grundlage von E. coli erlaubt die Darstellung auf der äußeren Zellmembran durch Fusion mit einem Peptidoglykan-assoziierten Lipoprotein (PAL). Nachfolgend werden diese und verwandte Verfahren hier gemeinsam als „E. coli-Display" bezeichnet. Bei einem weiteren Verfahren wird die Translation einer zufälligen RNA vor der Ribosomenfreisetzung angehalten, was zu einer Bibliothek von Polypeptiden führt, bei der die assoziierte RNA noch angeheftet ist. Nachfolgend werden diese und verwandte Verfahren hier gemeinsam als „Ribosomen-Display" bezeichnet. Andere Verfahren setzen Peptide ein, die mit RNA verknüpft sind, beispielsweise die PROfusion-Technologie, Phylos, Inc. Siehe beispielsweise Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297–303. Nachfolgend werden diese und verwandte Verfahren hier gemeinsam als „RNA-Peptid-Screening" bezeichnet. Es sind chemisch abgeleitete Peptidbibliotheken entwickelt worden, bei denen Peptide an stabilen, nicht-biologischen Materialien immobilisiert sind, wie etwa Polyethylenstäben oder lösungsmitteldurchlässigen Harzen. Eine andere chemisch abgeleitete Pepdidbibliothek verwendet die Photolithographie, um Peptide, die an Glasobjektträgern immobilisiert sind, abzutasten. Nachfolgend werden diese und verwandte Verfahren hier gemeinsam als „chemisches Peptid-Screening" bezeichnet. Ein chemisches Peptid-Screening kann vorteilhaft sein, da dies die Verwendung von D-Aminosäuren und anderen unnatürlichen Analoga erlaubt, ebenso wie von Elementen, die keine Peptide sind. Sowohl biologische als auch chemische Verfahren werden in Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol 3: 355–62 besprochen. Begrifflich kann man Peptidmimetika eines jeden Proteins unter Verwendung von Phagen-Display, RNA-Peptid-Screening und den anderen oben erwähnten Verfahren auffinden.
  • Kurzfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung, wie beansprucht, betrifft therapeutische Agenzien, welche die Aktivität von TALL-1 modulieren. Entsprechend der vorliegenden Offenbarung können Modulatoren von TALL-1 eine Aminosäuresequenz Dz2Lz4 (SEQ ID Nr. 108) umfassen, wobei z2 einen Aminosäurerest und z4 Threonyl oder Isoleucyl darstellen. Derartige Modulatoren von TALL-1 umfassen Moleküle der folgenden Formeln:
    Figure 00050001
    wobei:
    a1a2a3 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    a6 ein Aminosäurerest ist;
    a9 ein basischer oder hydrophober Rest ist;
    a8 ein Threonyl oder Isoleucyl ist;
    a10 ein Aminosäurerest ist;
    a12 ein neutraler hydrophober Rest ist; und
    a13 und a14 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind.
    Figure 00060001
    wobei:
    b1 und b2 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    b3 ein saurer Rest oder Amidrest ist;
    b5 ein Aminosäurerest ist;
    b6 ein aromatischer Rest ist;
    b8 ein Aminosäurerest ist;
    b10 T oder I ist;
    b11 ein basischer Rest ist;
    b12 und b13 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind;
    b14 ein neutraler hydrophober Rest ist; und
    b16b17b18 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind.
    Figure 00060002
    wobei:
    c1, c2 und c3 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    c5 ein Aminosäurerest ist;
    c7 ein Aminosäurerest ist;
    c9 T oder I ist;
    c10 ein basischer Rest ist;
    c11 und c12 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind;
    c13 ein neutraler hydrophober. Rest ist;
    C14 ein Aminosäurerest ist;
    c16 ein Aminosäurerest ist;
    c17 ein neutraler hydrophober Rest ist; und
    c18 ein Aminosäurerest ist oder fehlt.
    Figure 00070001
    wobei:
    d1, d2 und d3 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    d5, d6 und d7 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind;
    d10 ein Aminosäurerest ist;
    d12 T oder I ist;
    d13 ein Aminosäurerest ist
    d? ein Aminosäurerest ist; und
    d16, d17 und d18 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind.
    Figure 00070002
    wobei:
    e1, e2 und e3 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    e5, e6, e7, e9 und e13 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind;
    e11 T oder I ist; und
    e15, e16 und e17 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind.
    Figure 00070003
    wobei:
    f1, f2 und f3 fehlen oder Aminosäurereste sind (wobei einer von f1, f2 und f3 vorzugsweise C ist, wenn einer von f12, f13 und f14 C ist);
    f5 W, Y oder F ist (vorzugsweise W);
    f7 ein Aminosäurerest ist (vorzugsweise L);
    f8 T oder I ist (vorzugsweise T);
    f10 K, R oder H ist (vorzugsweise K);
    f12 C, ein neutraler hydrophober Rest oder ein basischer Rest ist (vorzugsweise W, C oder R);
    f13 C oder ein neutraler hydrophober Rest ist oder fehlt (vorzugsweise V);
    f14 jeder Aminosäurerest ist oder fehlt;
    vorausgesetzt dass nur einer von f1, f2 und f3 C sein kann und nur einer von f12, f13 und f14 C sein kann.
  • Verbindungen der Formeln I(a) bis I(f) oben schließen Dz2Lz4 ein, ebenso wie nachfolgende SEQ ID Nr. 63. Die Sequenz von I(f) wurde als eine Konsensussequenz abgeleitet, wie in Beispiel I unten beschrieben. Von den Verbindungen in Formel I(f) werden solche der Formel
    Figure 00080001
    bevorzugt. Verbindungen, die unter die Formel I(f) fallen, schließen die SEQ ID Nr. 32, 58, 60, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 114, 115, 122, 123, 124, 147–150, 152–177, 179, 180, 187 ein.
  • Der vorliegenden Offenbarung entsprechen ebenfalls Verbindungen, die folgendes Konsensusmotiv aufweisen:
    Figure 00080002
    die ebenfalls TALL-1 binden.
  • Weiterhin entsprechen der vorliegenden Offenbarung Verbindungen der folgenden Formeln:
    Figure 00080003
    wobei:
    g1, g2 und g3 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    g5 ein neutraler hydrophober Rest ist;
    g8 ein neutraler hydrophober Rest ist;
    g10 ein saurer Rest ist;
    g12 und g13 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind; und
    g14 fehlt oder ein Aminosäurerest ist.
    Figure 00090001
    wobei:
    h1, h2 und h3 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    h6 ein hydrophober Rest ist;
    h7 ein hydrophober Rest ist;
    h10 ein saurer oder polarer hydrophober Rest ist; und
    h12, h13 und h14 jeweils unabhängig voneinander fehlen oder Aminosäurereste sind;
    Figure 00090002
    wobei:
    i1 fehlt oder ein Aminosäurerest ist;
    i2 ein neutraler hydrophober Rest ist;
    i3 ein Aminosäurerest ist;
    i5, i6, i7 und i8 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind;
    i9 ein saurer Rest ist;
    i10 ein Aminosäurerest ist;
    i12 und i13 jeweils unabhängig voneinander Aminosäurereste sind; und
    i14 ein neutraler hydrophober Rest ist.
  • Die Verbindungen, die durch die Formeln I(g) bis I(i) definiert sind, binden auch an TALL-1.
  • Weiterhin umfassen Modulatoren von TALL-1 entsprechend der vorliegenden Offenbarung Folgendes:
    • a) eine TALL-1 modulierende Domäne (z. B. eine Aminosäuresequenz nach den Formeln I(a) bis I(i)), vorzugsweise die Aminosäuresequenz Dz2Lz4 oder Sequenzen, die durch Phagen-Display, RNA-Peptid-Screening oder andere oben erwähnte Techniken abgeleitet wurden; und
    • b) ein Vehikel, wie etwa ein Polymer (z. B. PEG oder Dextran) oder eine Fc-Domäne, welche bevorzugt ist;
  • wobei das Vehikel kovalent an die TALL-1 modulierende Domäne angefügt ist. Das Vehikel und die TALL-1 modulierende Domäne können über den N- oder C-Terminus der TALL-1 modulierenden Domäne verknüpft sein, wie weiter unten beschrieben. Das bevorzugte Vehikel ist eine Fc-Domäne, und die bevorzugte Fc-Domäne ist eine IgG-Fc-Domäne. Derartige Fc-verknüpfte Peptide werden hier als „Peptibodies" bezeichnet. Bevorzugte TALL-1 modulierende Domänen umfassen die hier nachfolgend in den Tabellen 1 und 2 beschriebenen Aminosäuresequenzen. Andere TALL-1 modulierende Domänen können durch Phagen-Display, RNA-Peptid-Screening und andere hier erwähnte Techniken erzeugt werden.
  • Weiterhin entspricht der vorliegenden Offenbarung ein Verfahren zum Herstellen von TALL-1-Modulatoren, welches Folgendes umfasst:
    • a. Auswählen von mindestens einem Peptid, das an TALL-1 bindet; und
    • b. kovalentes Verknüpfen dieses Peptids mit einem Vehikel.
  • Das bevorzugte Vehikel ist eine Fc-Domäne. Der Schritt (a) wird vorzugsweise durch Auswahl aus den hier nachfolgend in Tabelle 2 dargestellten Peptidsequenzen oder aus einem Phagen-Display, RNA-Peptid-Screening oder den anderen hier erwähnten Techniken durchgeführt.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können durch synthetische Standardverfahren, rekombinante DNA-Techniken oder anderen Verfahren zum Herstellen von Peptiden und Fusionsproteinen hergestellt werden. Die Verbindungen dieser Erfindung, die Teile umfassen, die keine Peptide sind, können durch Standardreaktionen der organischen Chemie zusätzlich zu Standardreaktionen der Peptidchemie synthetisiert werden, soweit diese anwendbar sind.
  • Die hauptsächliche Verwendung, die für die Verbindungen dieser Erfindung in Betracht gezogen wird, ist als therapeutische oder prophylaktische Agenzien. Das mit einem Vehikel verknüpfte Peptid kann eine Aktivität aufweisen, die mit der des natürlichen Liganden, der durch das Peptid nachgeahmt wird, vergleichbar oder sogar größer ist.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können zu therapeutischen oder prophylaktischem Zwecken verwendet werden, indem sie mit geeigneten pharmazeutischen Trägermaterialien formuliert und in einer wirksamen Menge an einen Patienten, wie etwa einen Menschen (oder ein anderes Säugetier), der (bzw. das) ihrer bedarf, verabreicht werden. Andere verwandte Aspekte werden ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen.
  • Zahlreiche zusätzliche Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Berücksichtigung der Figuren und der genauen Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt beispielhaft Fc-Dimere, die von einem IgG1-Antikörper abgeleitet werden können. „Fc" in der Figur stellt jede der Fc-Varianten im Rahmen der hier verwendeten Bedeutung von „Fc-Domäne" dar. „X1" und „X2" stellen Peptide oder Kombinationen aus Linker und Peptid dar, wie hier nachfolgend definiert. Die spezifischen Dimere sind wie folgt:
    • A, D: Dimere mit einer einzelnen Disulfidbindung. IgG1-Antikörper weisen typischerweise zwei Disulfidbindungen an der Gelenkregion des Antikörpers auf. Die Fc-Domäne in den 1A und 1D kann durch Verkürzung (Trunkierung) zwischen den beiden Disulfidbindungsstellen oder durch Substitution eines Cysteinylrests durch einen nicht reaktiven Rest (z. B. Alanyl) gebildet werden. In der 1A ist die Fc-Domäne an den Aminoterminus der Peptide, in 1D an den Carboxyterminus, gebunden.
    • B, E: Dimere mit doppelter Disultfidbindung. Diese Fc-Domäne kann durch Verkürzung des elterlichen Antikörpers gebildet werden, um beide Cysteinylreste in den Ketten der Fc- Domäne zu erhalten oder durch Expression eines Konstrukts, welches eine Sequenz einschließt, die eine derartige Fc-Domäne kodiert. In der 1B ist die Fc-Domäne an den Aminoterminus der Peptide, in 1E an den Carboxyterminus gebunden.
    • C, F: Nicht-kovalente Dimere. Diese Fc-Domäne kann durch Entfernung der Cysteinylreste entweder durch Verkürzung oder Substitution gebildet werden. Es kann wünschenswert sein, die Cysteinylreste zu entfernen, um Verunreinigungen zu vermeiden, die durch eine Reaktion des Cysteinylrests mit Cysteinylresten anderer Proteine, die in der Wirtzelle vorhanden sind, gebildet werden. Das nicht-kovalente Binden der Fc-Domänen reicht aus, um das Dimer zusammenzuhalten.
  • Andere Dimere können durch Verwendung von Fc-Domänen gebildet werden, die sich von verschiedenen Typen von Antikörpern ableiten (z. B. IgG2, IgM).
  • 2 zeigt die Struktur der bevorzugten Verbindungen der Erfindung, die sich durch Tandem-Wiederholungen (tandem repeats) des pharmakologisch aktiven Peptids auszeichnen. 2A zeigt ein Molekül mit einer Einzelkette und kann auch das DNA-Konstrukt des Moleküls darstellen. 2B zeigt ein Dimer, bei dem der Teil aus Linker und Peptid nur auf einer Kette des Dimers vorhanden ist. 2C zeigt ein Dimer, das den Peptidteil in beiden Ketten aufweist. Das Dimer in 2C wird sich in bestimmten Wirtszellen nach Expression eines DNA-Konstrukts spontan bilden, welches die in 3A gezeigte Einzelkette kodiert. Bei anderen Wirtszellen könnten die Zellen Bedingungen ausgesetzt werden, welche die Bildung von Dimeren begünstigen, oder die Dimere können in vitro gebildet werden.
  • 3 zeigt beispielhaft Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 1 bzw. 2) von menschlichem IgG1-Fc, das bei dieser Erfindung verwendet werden kann.
  • Die 4A bis 4F zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 3–27) S von NdeI- bis SalI-Fragmenten, welche ein Peptid und einen Linker kodieren.
  • Die 5A bis 5M zeigen die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 28) des pAMG21-RANK-Fc-Vektors, der verwendet wurde, um die Fc-verknüpften Moleküle der vorliegenden Erfindung zu konstruieren. Diese Figuren bezeichnen eine Reihe von Merkmalen der Nukleinsäuren, einschließlich:
    • • den Promotorregionen („promoter") PcopB, PrepA, RNAI, APHII, luxPR und luxPL;
    • • der mRNA für APHII, luxR;
    • • den kodierenden Sequenzen und Aminosäuresequenzen für die Proteine copB-Protein, copT, repAI, repA4, APHII, luxR, RANK und Fc;
    • • den Bindungsstellen („binding site") für die Proteine copB, CRP;
    • • den Haarnadelstrukturen („hairpin") T1, T2, T7 und toop;
    • • dem Ort des Operators („operator site") für das lux-Protein;
    • • den Schnittstellen für die Restriktionsenzyme für PflII08I, BglII, ScaI, BmnI, DrdII, DraIII, BstBI, AceIII, AflII, PflMI, BglI, SfiI, BstEII, BspLullI, NspV, BslI, EagI, BcgI, NsiI, BsaI, Pspl406I, AatII, BsmI, NruI, NdeI, ApaLI, Acc65I, KpnI, SalI, AccI, BspEI, AhdI, BspHI, EconI, BsrGI, BmaI, SmaI, SexAI, BamHI und BlpI.
  • Das Merkmal „kanamycin resistance gene" bedeutet Kanamycinresistenzgen.
  • Die 6A und 6B zeigen die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 97), die in pCFM1656 zwischen den einzigartigen Schnittstellen AatII (Position Nr. 4364 in pCFM1656) und SacII (Position Nr. 4585 in pCFM1656) eingefügt wurde, um das Expressionsplasmid pAMG21 (ATCC-Zugangsnr. 98113) zu bilden.
  • 7 zeigt, dass der TALL-1-Peptibody (SEQ ID Nr. 70) die durch TALL-1 vermittelte B-Zell-Proliferation hemmt. Es wurden gereinigte B-Zellen (105) aus B6-Mäusen in 96-Well-Platten in Dreifachansätzen mit den angegebenen Mengen an TALL-1-Konsensus-Peptibody in Gegenwart von 10 ng/ml TALL-1 plus 2 μg/ml anti-IgM-Antikörper kultiviert. Die Proliferation wurde durch die Aufnahme von radioaktivem [3H]Thymidin in den letzten 18 Stunden, in denen die Zellen gepulst wurden, gemessen. Die gezeigten Daten stellen den Mittelwert ± SD von Dreifachansätzen dar.
  • 8 zeigt, dass TALL-1-Peptibodies, die N-terminal Tandemdimere sind (SEQ ID Nr. 123, 124 in Tabelle 5B nachfolgend), zur Hemmung der durch TALL-1 vermittelten B-Zell- Proliferation zu bevorzugen sind. Es wurden gereinigte B-Zellen (105) aus B6-Mäusen in Dreifachansätzen in 96-Well-Platten mit den angegebenen Mengen an TALL-1 12-13-Peptibody und TALL-1-Konsensuspeptibody (SEQ ID Nr. 115 und 122 in Tabelle 5B) oder den verwandten Dimer-Peptibodies (SEQ ID Nr. 123, 124) in Gegenwart von 10 ng/ml TALL-1 plus 2 μg/ml anti-IgM-Antikörper kultiviert. Die Proliferation wurde durch die Aufnahme von radioaktivem [3H]Thymidin in den letzten 18 Stunden, in denen die Zellen gepulst wurde, gemessen. Die gezeigte Daten stellen den Mittelwert ± SD aus Dreifachansätzen dar.
  • 9. AGP3-Peptibody bindet an AGP3 mit hoher Affinität.
  • Die Dissoziationsgleichgewichtskonstante (KD) wurde aus einer nicht-linearen Regressionsanalyse der Kompetitionskurven unter Verwendung eines homogenen Bindungsmodells „dual-curve one-site" (KinExTM Software) erhalten. Die KD beträgt ungefähr 4 pM für die Bindung von AGP3-Peptibody mit menschlichem AGP3 (SEQ ID Nr. 123).
  • 10A und 10B. Der AGP3-Peptibody blockiert sowohl menschliches AGP3 als auch AGP3 der Maus in dem Biacore-Kompetitionstest. Lösliches menschliches TACI-Protein wurde an einem B1-Chip immobilisiert. Es wurden 1 nM rekombinantes menschliches AGP3-Protein (obere Tafel) oder 5 nM rekombinantes AGP3-Protein der Maus (untere Tafel) mit der angegebenen Menge an AGP3-Peptibody vor Injektion über die Rezeptoroberfläche inkubiert. Es wurde die relative Bindungsantwort von menschlichem AGP3 und AGP3 der Maus gezeigt (SEQ ID Nr. 123).
  • 11A und 11B. Der AGP3-Peptibody blockierte die Bindung von AGP3 an alle drei Rezeptoren TACI, BCMA und BAFFR im Biacore-Kompetitionstest. Es wurden rekombinante Proteine der löslichen Rezeptoren TACI, BCMA und BAFFR an einem CM5-Chip immobilisiert. 1 nM rekombinantes menschliches AGP3 (obere Tafel) wurde mit der angegebenen Menge an AGP3-Peptibody vor Injektion über jede Rezeptoroberfläche inkubiert. Es wurde die relative Bindung von AGP3 gemessen. Auf ähnliche Weise wurde 1 nM rekombinantes APRIL-Protein mit der angegebenen Menge an AGP3-Peptibody vor Injektion über jede Rezeptoroberfläche inkubiert. Der AGP3-Peptibody hemmte die APRIL-Bindung bei keinem der drei Rezeptoren (SEQ ID Nr. 123).
  • 12A und 12B. Der AGP3-Peptibody hemmt den durch menschliches AGP3 induzierten Anstieg des Immunglobulinspiegels in Mäuseserum. Balb/c-Mäuse erhielten 7 tägliche intraperitoneale Injektionen von 1 mg/kg menschlichem AGP3-Protein zusammen mit Salzlösung, menschlichem Fc oder AGP3-Peptibody in den angegebenen Dosen, und sie wurden am Tag 8 ausbluten gelassen. Der gesamte Serumspiegel an IgM und IgA wurde durch ELISA gemessen (SEQ ID Nr. 123).
  • 13. Eine Behandlung mit AGP-Peptibody verminderte die Schwere einer Arthritis in dem CIA-Mausmodell. Es wurden 8–12 Wochen alte DBA/1-Mäusemännchen mit Rinderkollagen Typ II (bovine collagen type II, bCII), emulgiert in komplettem Freund'schem Adjuvans, durch intradermale Injektion in die Schwanzwurzel immunisiert, und die Immunisierung wurde drei Wochen nach der anfänglichen Immunisierung mit bCII, emulgiert in inkomplettem Freund'schem Adjuvans, verstärkt (Verstärkungsimpfung, „boost"). Die Behandlung mit der angegebenen Dosierung des AGP3-Peptibodys wurde mit dem Tag der Verstärkungsimpfung begonnen und über 4 Wochen durchgeführt. Wie zuvor beschrieben (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653–9, 1995) wurden alle 4 Pfoten einzeln auf einer Skala von 0 bis 3 nach dem Schweregrad der Arthritis beurteilt (SEQ ID Nr. 123).
  • 14. Die Behandlung mit AGP3-Peptibody hemmte die Erzeugung von anti-Kollagen-Antikörper in dem CIA-Mausmodell. Eine Woche nach der letzten Behandlung (Tag 35) wurden Serumproben entnommen, wie oben beschrieben. Der Serumspiegel von anti-Kollagen II-Antiköper wurde durch ELISA-Analyse bestimmt (SEQ ID Nr. 123).
  • 15A und 15B. Eine Behandlung mit AGP3-Peptibody verzögerte den Beginn einer Proteinurie und verbesserte das Überleben bei NZB/NZW-Lupus-Mäusen. Fünf Monate alte, zu Lupus neigende NZB×NZBWF1-Mäuse wurden 3× wöchentlich i. p. über 8 Wochen mit PBS oder den angegebenen Dosen von AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) oder menschlichen Fc-Proteinen behandelt. Das Protein im Urin wurde monatlich während der Zeit des Experiments mit Albustix-Reagenzstreifen (Bayer AG) beurteilt.
  • Die 16A und 16B zeigen die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen eines bevorzugten TALL-1-bindenden Peptibodies (SEQ ID Nr. 189 und 123).
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Definition von Begriffen
  • Die in dieser Beschreibung durchgängig verwendeten Begriffe werden wie folgt definiert, es sei denn, sie werden in bestimmten Fällen anders beschränkt.
  • Allgemeine Definitionen
  • Der Begriff „umfassen" bedeutet, dass eine Verbindung zusätzliche Aminosäuren entweder an einem der N- oder C-Termini der vorgegebenen Sequenz oder an beiden beinhalten kann. Selbstverständlich sollten diese zusätzlichen Aminosäuren nicht signifikant mit der Aktivität der Verbindung interferieren.
  • Außerdem sind physiologisch annehmbare Salze der Verbindungen dieser Erfindung ebenfalls hier umfasst. Der Begriff „physiologisch annehmbare Salze" bezieht sich auf alle Salze, für die bekannt ist oder später entdeckt wurde, dass sie pharmazeutisch annehmbar sind. Einige spezifische Beispiele sind folgende: Acetat; Trifluoracetat; Hydrohalogenide, wie etwa Hydrochlorid und Hydrobromid; Sulfat; Citrat; Tartrat; Glykolat; und Oxalat.
  • Aminosäuren
  • Der Begriff „saurer Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welche saure Gruppen umfassen. Beispielhafte saure Reste schließen D und E ein.
  • Der Begriff „Amidrest" betrifft Aminosäuren in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welche Amidderivate von sauren Gruppen umfassen. Beispielhafte Reste schließen N und Q ein.
  • Der Begriff „aromatischer Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welche aromatische Gruppen umfassen. Beispielhafte aromatische Reste schließen F, Y und W ein.
  • Der Begriff „basischer Rest" betrifft Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welche basische Gruppen umfassen. Beispielhafte basische Reste schließen H, K und R ein.
  • Der Begriff „hydrophiler Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welche polare Gruppen umfassen. Beispielhafte hydrophile Reste schließen C, S, B, N und Q ein.
  • Der Begriff „nicht funktioneller Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welchen saure, basische oder aromatische Gruppen fehlen. Beispielhafte nicht funktionelle Aminosäurereste schließen M, G, A, V, I, L und Norleucin (Nle) ein.
  • Der Begriff „neutraler hydrophober Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, denen basische, saure oder polare Gruppen fehlen. Beispielhafte neutrale hydrophobe Aminosäurereste schließen A, V, L, I, P, W, M und F ein.
  • Der Begriff „polarer hydrophober Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, welche polare Gruppen umfassen. Beispielhafte polare hydrophobe Aminosäurereste schließen T, G, S, Y, C, Q und N ein.
  • Der Begriff „hydrophober Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten aufweisen, denen basische oder saure Gruppen fehlen. Beispielhafte hydrophobe Aminosäurereste schließen A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q und N ein.
  • Peptide
  • Der Begriff „Peptid" bezieht sich auf Moleküle mit 1–40 Aminosäuren, wobei Moleküle mit 5–20 Aminosäuren bevorzugt werden. Beispielhafte Peptide können die TALL-1 modulierende Domäne eines natürlich vorkommenden Moleküls oder zufällig ausgewählte Sequenzen umfassen.
  • Der Begriff „zufällig ausgewählt", wie er verwendet wird, um Peptidsequenzen zu bezeichnen, bezieht sich auf vollkommen zufällige Sequenzen (z. B. ausgewählt durch Phagen- Display-Verfahren oder RNA-Peptide-Screening) und Sequenzen, bei denen ein oder mehrere Reste eines natürlich vorkommenden Moleküls durch einen Aminosäurerest ersetzt sind, der in dieser Position in dem natürlich vorkommenden Molekül nicht auftritt. Beispielhafte Verfahren zum Identifizieren von Peptidsequenzen schließen Phagen-Display, E. coli-Display, Ribosomen-Display, RNA-Peptid-Screening, chemisches Screening und Ähnliches ein.
  • Der Begriff „TALL-1 modulierende Domäne" bezieht sich auf jede Aminosäuresequenz, die an TALL-1 bindet und natürlich vorkommende Sequenzen oder zufällig ausgewählte Sequenzen umfasst. Beispielhafte TALL-1 modulierende Domänen können durch Phagen-Display oder andere hier erwähnte Verfahren identifiziert oder abgeleitet werden.
  • Der Begriff „TALL-1-Antagonist" bezieht sich auf ein Molekül, das an TALL-1 bindet und einen oder mehrere Testparameter entgegengesetzt zu der Wirkung von nativem Vollänge-TALL-1 auf diese Parameter erhöht oder erniedrigt. Eine derartige Aktivität kann beispielsweise durch solche Tests bestimmt werden, wie in dem Unterabschnitt mit dem Titel „Biologische Aktivität von AGP-3" im Abschnitt Material und Methoden der Patentanmeldung mit dem Titel „TNF-Related Proteins", WO 00/47740 , offengelegt am 17. August 2000, beschrieben.
  • Vehikel und Peptibodies
  • Der Begriff „Vehikel" bezieht sich auf ein Molekül, welches den Abbau eines therapeutischen Proteins verhindert und/oder dessen Halbwertszeit erhöht, dessen Toxizität vermindert, dessen Immunogenität vermindert oder dessen biologische Aktivität erhöht. Beispielhafte Vehikel schließen eine Fc-Domäne (was bevorzugt ist) ebenso ein wie ein lineares Polymer (z. B. Polyethylenglykol (PEG), Polylysin, Dextran etc.); ein verzweigtkettiges Polymer (siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4,289,872 an Denkenwalter et al., erteilt am 15. September 1981; 5,229,490 an Tamm, erteilt am 20. Juli 1993; WO 93/21259 von Frechet et al., offengelegt am 28. Oktober 1993); ein Lipid; eine Cholesteringruppe (wie etwa ein Steroid); ein Kohlenhydrat oder Oligosaccharid (z. B. Dextran); jedes natürliche oder synthetische Protein, Polypeptid oder Peptid, das an einen „Salvage"-Rezeptor bindet; Albumin, einschließlich menschlichem Serumalbumin (human serum albumin, HSA); eine Leucin-Zipper-Domäne und andere derartige Proteine und Proteinfragmente ein. Die Vehikel sind wie hier nachfolgend näher beschrieben.
  • Der Begriff „natives Fc" bezieht sich auf ein Molekül oder eine Sequenz, welche die Sequenz eines nicht antigenbindenden Fragments umfasst, das aus dem Verdau eines vollständigen Antikörpers hervorgegangen ist, entweder in monomerer oder multimerer Form. Die ursprüngliche Quelle des Immunglobulins des nativen Fc ist vorzugsweise menschlichen Ursprungs und kann jedes der Immunglobuline sein, obwohl IgG1 und IgG2 bevorzugt werden. Native Fcs können aus monomeren Polypeptiden aufgebaut sein, die zu dimeren oder multimeren Formen durch kovalente (d. h. Disulfidbindungen) oder nicht-kovalente Assoziierung verknüpft sein können. Die Anzahl an intermolekularen Disulfidbindungen zwischen monomeren Untereinheiten von nativen Fc-Molekülen liegt im Bereich von 1 bis 4, was von der Klasse (z. B. IgG, IgA, IgE) oder Unterklasse (z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2) abhängt. Ein Beispiel eines nativen Fc ist ein Dimer mit einer Disulfidbindung, das aus einem Papainverdau eines IgG hervorgegangen ist (siehe Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071–9). Der Begriff „natives Fc", wie er hier verwendet wird, ist für die monomeren, dimerem und multimeren Formen generisch.
  • Der Begriff „Fc-Variante" bezieht sich auf ein Molekül oder eine Sequenz, die im Vergleich zu einem nativen Fc modifiziert ist, jedoch noch eine Bindungsstelle für den „Salvage"-Rezeptor FcRn umfasst. Die internationalen Anmeldungen WO 97/34631 (offengelegt am 25. September 1997) und WO 96/32478 beschreiben beispielhafte Fc-Varianten ebenso wie die Interaktion mit dem „Salvage"-Rezeptor. Folglich umfasst der Begriff „Fc-Variante" ein Molekül oder eine Sequenz, für das ein nicht-menschliches natives Fc humanisiert wurde. Weiterhin umfasst ein natives Fc Stellen, die entfernt werden können, da sie strukturelle Eigenschaften oder eine biologische Aktivität verfügbar machen, die für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich sind. Folglich umfasst der Begriff „Fc-Variante" ein Molekül oder eine Sequenz, dem eine oder mehrere native Fc-Stellen oder Reste fehlen, welche (1) eine Bildung von Disulfidbrücken, (2) eine Inkompatibilität mit einer ausgewählten Wirtszelle, (3) eine N-terminale Heterogenität nach Expression in einer ausgewählten Wirtszelle, (4) eine Glykosylierung, (5) eine Interaktion mit Komplement, (6) eine Bindung an einen Fc-Rezeptor, der kein „Salvage"-Rezeptor ist, oder (7) eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxcity, ADCC) beeinflussen oder daran beteiligt sind. Fc-Varianten werden nachfolgend genauer beschrieben.
  • Der Begriff „Fc-Domäne" umfasst natives Fc und Fc-Molekülvarianten und Sequenzen, wie oben definiert. Wie bei den Fc-Varianten und nativen Fcs schließt der Begriff „Fc-Domäne" Moleküle in monomerer oder multimerer Form ein, die entweder aus einem Verdau eines vollständigen Antikörpers hervorgegangen sind oder durch andere Mittel hergestellt wurden.
  • Der Begriff „multimer" oder „Multimer", wie er auf eine Fc-Domäne oder Moleküle, welche Fc-Domänen umfassen, angewendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die zwei oder mehr Polypeptidketten aufweisen, die kovalent, nicht kovalent oder durch sowohl kovalente als auch nicht kovalente Interaktionen assoziiert sind. IgG-Moleküle bilden typischerweise Dimere, IgM bildet Pentamere, IgD bildet Dimere und IgA bildet Monomere, Dimere, Trimere oder Tetramere. Multimere können gebildet werden, indem die Sequenz und die sich ergebende Aktivität der nativen Ig-Quelle des Fc ausgenutzt wird, oder durch Derivatisieren (wie unten definiert) eines solchen nativen Fcs.
  • Der Begriff „dimer" oder „Dimer", wie er auf Fc-Domänen oder Moleküle, die Fc-Domänen umfassen, angewendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die zwei Polypeptidketten aufweisen, die kovalent oder nicht kovalent assoziiert sind. Folglich sind beispielhafte Dimere, wie in 1 gezeigt, im Rahmen dieser Erfindung.
  • Die Begriffe „Derivatisieren" und „Derivat" oder „derivatisiert" umfassen Verfahren bzw. daraus hervorgehende Verbindungen, bei denen (1) die Verbindung einen zyklischen Teil aufweist; beispielsweise eine Quervernetzung zwischen Cysteinylresten innerhalb der Verbindung; (2) die Verbindung quervernetzt ist oder eine Quervernetzungsstelle aufweist; beispielsweise weist die Verbindung einen Cysteinylrest auf und bildet dadurch quervernetzte Dimere in Kultur oder in vivo; (3) eine oder mehrere Peptidylbindungen durch eine nicht-Peptidylbindung ersetzt sind; (4) der N-Terminus durch -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, eine Succinimidgruppe oder ein substituiertes oder nicht substituiertes Benzyloxycarbonyl-NH- ersetzt ist, wobei R und R1 und die Ringsubstituenten wie hier nachfolgend definiert sind; (5) der C-Terminus durch -C(O)R2 oder -NR3R4 ersetzt ist, wobei R2, R3 und R4 wie hier nachfolgend definiert sind; und (6) Verbindungen, bei denen einzelne Aminosäuregruppen durch Behandlung mit Agenzien modifiziert sind, die in der Lage sind, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren. Die Derivate werden hier nachfolgend weiter beschrieben.
  • Die Begriffe „Peptibody" und Peptibodies" beziehen sich auf Moleküle, welche eine Fc-Domäne und mindestens ein Peptid umfassen. Derartige Peptibodies können Multimere oder Dimere oder Fragmente davon sein, und sie können derivatisiert sein. Bei der vorliegenden Erfindung sind die Moleküle nach den Formeln II bis VI hier nachfolgend Peptibodies, wenn V1 eine Fc-Domäne ist.
  • Struktur von Verbindungen
  • Allgemeines. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen, die in der Lage sind, an TALL-1 zu binden und dessen biologische Aktivität zu modulieren. Diese Sequenzen können durch die oben erwähnten Techniken modifiziert werden, durch die eine oder mehrere Aminosäuren geändert werden können, während die Bindungsaffinität des Peptids erhalten bleibt oder sogar verbessert wird.
  • Bei den fraglichen Zusammensetzungen, die entsprechend dieser Erfindung hergestellt werden, können das Peptid bzw. die Peptide an das Vehikel über den N-Terminus oder C-Terminus des Peptids angefügt sein. Jedes dieser Peptide kann als Tandem (d. h. aufeinanderfolgend) verknüpft sein mit oder ohne Linker. Folglich können die Vehikel-Peptid-Moleküle dieser Erfindung durch die folgenden Formel beschrieben werden: (X1)a-V1-(X2)b IIwobei:
    V1 ein Vehikel ist (vorzugsweise eine Fc-Domäne);
    X1 und X2 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus -(L1)c-P1, -(L1)c-P1-(L2)d-P2, -(L1)c-P2)d-P2-(L3)e-P3, und -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
    P1, P2, P3 und P4 jeweils unabhängig voneinander Sequenzen von TALL-1 modulierenden Domänen sind, wie etwa jene nach den Formeln I(a) bis I(i);
    L1, L2, L3 und L4 jeweils unabhängig voneinander Linker sind, und
    a, b, c, d, e und f jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, vorausgesetzt, dass mindestens eine der Variablen a und b 1 ist.
  • Folglich umfasst die Verbindung II vorzugsweise Verbindungen der folgenden Formeln: X1-V1 IIIund Multimere davon, wobei V1 eine Fc-Domäne ist und an den C-Terminus von A1 angefügt ist; V1-X2 IVund Multimere davon, wobei V1 eine Fc-Domäne ist und an den N-Terminus von A2 angefügt ist; V1-(L1)c-P1 Vund Multimere davon, wobei V1 eine Fc-Domäne ist und an den N-Terminus von -(L1)c-P1 angefügt ist; und V1-(L1)c-P1-(L2)c-P2 VIund Multimere davon, wobei V1 eine Fc-Domäne ist und an den N-Terminus von -L1-P1-L2-P2 angefügt ist.
  • Peptide. Die Peptide dieser Erfindung sind als TALL-1 modulierende Peptide oder als TALL-1 modulierende Domänen in den Molekülen der Formeln II bis VI nützlich. Moleküle dieser Erfindung, welche diese Peptidsequenzen umfassen, können durch im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.
  • Bevorzugte Peptidsequenzen sind jene der vorangehenden Formeln I(a), welche die unten bezeichneten Substituenten aufweisen. Tabelle 1: Bevorzugte Peptidsubstituenten
    Formel I(a) a8 ist T; a9 ist ein basischer Rest (vorzugsweise K); und a12 ist ein neutraler hydrophober Rest (vorzugsweise F).
    Formel I(b) b3 ist D, Q oder E; b6 ist W oder Y; b10 ist T; b11 ist K oder R; und b14 ist V oder L.
    Formel I(c) c9 ist T; c10 ist K oder R; c13 ist ein I, L oder V; und C17 ist A oder L.
    Formel I(d) d12 ist T.
    Formel I(e) e11 ist T.
    Formel I(f) f9 ist T; f10 ist K; und f13 ist V.
    Formel I(g) g5 ist W; g8 ist P; g10 ist E; und g13 ist ein basischer Rest.
    Formel I(h) h1 ist G; h6 ist A; h7 ist ein neutraler hydrophober Rest; und h10 ist saurer Rest.
    Formel I(i) i2 ist W; und i14 ist W.
  • Bevorzugte Peptidsequenzen erscheinen in Tabelle 2 unten. Tabelle 2: Bevorzugte TALL-1 modulierende Domänen
    Figure 00250001
    Figure 00260001

  • Es ist bekannt, dass die bekannten Rezeptoren für TALL-1 eine gewisse Sequenzhomologie mit bevorzugten Peptiden aufweisen:
    Figure 00260002
  • Jedes Peptid, das einen Cysteinylrest enthält, kann mit einem anderen Cys-enthaltenden Peptid quervernetzt werden, wobei eines oder beide an ein Vehikel gebunden sein können. Jedes Peptid, das mehr als einen Cys-Rest aufweist, kann ebenfalls eine Disulfidbindung zwischen den Peptiden bilden. Jedes dieser Peptid kann derivatisiert werden, wie hier nachfolgend beschrieben.
  • Zusätzliche nützliche Peptidsequenzen können aus konservativen und/oder nicht konservativen Modifikationen der Aminosäuresequenzen der Sequenzen in Tabelle 2 hervorgehen.
  • Konservative Modifikationen werden Peptide hervorbringen, die funktionelle und chemische Eigenschaften aufweisen, die denen des Peptids ähnlich sind, bei dem derartige Modifikationen vorgenommen werden. Im Gegensatz dazu können wesentliche Modifikationen der funktionellen und/oder chemischen Eigenschaften der Peptide erreicht werden, indem Substitutionen in der Aminosäuresequenz ausgewählt werden, die sich wesentlich in ihrer Wirkung auf das Erhalten (a) der Struktur des molekularen Rückgrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als eine Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls am Zielort oder (c) der Größe des Moleküls unterscheiden.
  • Beispielsweise kann eine „konservative Aminosäuresubstitution" eine Substitution eines nativen Aminosäurerests durch einen nicht nativen Rest umfassen, derart, dass wenig oder keine Wirkung auf die Polarität oder Ladung des Aminosäurerests in dieser Position auftritt. Weiterhin kann jeder native Rest in dem Polypeptid auch durch Alanin substituiert sein, wie dies früher für die „Alanin-Scanning-Mutagenese" beschrieben wurde (siehe beispielsweise Mac-Lennan et al., 1998, Acta Physiol. Scnd. Suppl. 643: 55–67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1–24, worin die Alanin-Scanning-Mutagenese diskutiert wird).
  • Gewünschte Aminosäuresubstitutionen (entweder konservativ oder nicht konservativ) können durch diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, zu dem Zeitpunkt bestimmt werden, zu dem derartige Substitutionen gewünscht werden. Beispielsweise können Aminosäuresubstitutionen verwendet werden, um wichtige Reste der Peptidsequenz zu identifizieren oder um die Affinität des Peptids oder der hier beschriebenen Vehikel-Peptid-Moleküle (siehe die vorangehenden Formeln) zu erhöhen oder zu verringern. Beispielhafte Aminosäuresubstitutionen werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Aminosäuresubstitutionen
    ursprüngliche Reste beispielhafte Substitutionen bevorzugte Substitutionen
    Ala(A) Val, Leu, Ile Val
    Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys
    Asn (N) Gln Gln
    Asp (D) Glu Glu
    Cys (C) Ser, Ala Ser
    Gln (Q) Asn Asn
    Glu (E) Asp Asp
    Gly (G) Pro, Ala Ala
    His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg
    Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine Leu
    Leu (L) Norleucine, He, Val, Met, Ala, Phe Ile
    Lys (K) Arg, 1,4-Diaminobuttersäure, Gln, Asn Arg
    Met (M) Leu, Phe, Ile Leu
    Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
    Pro (P) Ala Gly
    Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr
    Thr (T) Ser Ser
    Trp (W) Tyr, Phe Tyr
    Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
    Val (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucine Leu
  • Bei bestimmten Ausführungen umfassen konservative Aminosäuresubstitutionen auch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste, die typischerweise durch chemische Peptidsynthese anstatt durch Synthese in biologischen Systemen eingebaut werden.
  • Wie in dem vorangehenden Abschnitt „Definition von Begriffen" erwähnt, können natürlich vorkommende Reste auf der Grundlage von gemeinsamen Eigenschaften der Seitenketten, die für die Modifikationen der Sequenz nützlich sein können, in Klassen eingeteilt werden. Beispielsweise können nicht konservative Substitutionen den Austausch eines Mitglieds eines dieser Klassen gegen ein Mitglied einer anderen Klasse umfassen. Derartige substituierte Reste können in Regionen des Peptids eingeführt werden, die zu nicht menschlichen Ortholgen homolog sind, oder in nicht homologe Regionen des Moleküls. Außerdem kann man zu dem Zweck, die Orientierung der Ketten zu beeinflussen, auch Modifikationen unter Verwendung von P oder G vornehmen.
  • Beim Vornehmen derartiger Modifikationen kann der hydropathische Index von Aminosäuren berücksichtigt werden. Jeder Aminosäure ist auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität und ihrer Ladungsmerkmale ein hydropathischer Index zugeschrieben worden, der folgendermaßen ist: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
  • Die Bedeutung des hydrpathischen Index von Aminosäuren beim Versehen eines Proteins mit einer interaktiven biologischen Funktion wird im Stand der Technik verstanden. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105–131 (1982). Es ist bekannt, dass bestimmte Aminosäuren gegen andere Aminosäuren, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder Punktewert aufweisen, ersetzt werden können und noch eine ähnliche biologische Aktivität beibehalten. Beim Vornehmen von Änderungen auf der Grundlage des hydropathischen Index ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indices im Bereich von ±2 liegen, bevorzugt, wobei solche, die im Bereich von ±1 liegen, besonders bevorzugt sind, und solche, die im Gereicht von ±0,5 liegen, sogar ganz besonders bevorzugt sind.
  • Es wird im Stand der Technik auch verstanden, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren auf der Grundlage der Hydrophilie wirksam vorgenommen werden kann. Die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie durch die Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren bestimmt, korreliert mit einer Immunogenität und Antigenität, d. h. mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins.
  • Die folgenden Hydrophilie-Werte sind Aminosäureresten zugeschrieben worden: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4). Beim Vornehmen von Änderungen auf der Grundlage von ähnlichen Hydrophilie-Werten wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Werte im Bereich von ±2 liegen, bevorzugt, solche die im Bereich von ±1 liegen, werden besonders bevorzugt und solche, die im Bereich von ±0,5 liegen, werden sogar ganz besonders bevorzugt. Man kann auch Epitope aus primären Aminosäuresequenzen auf der Grundlage von Hydrophilie identifizieren. Diese Regionen werden auch als „Epitop-Kernregionen" bezeichnet.
  • Ein Fachmann wird in der Lage sein, geeignete Varianten des Polypeptids, wie in den vorangehenden Sequenzen dargestellt, unter Verwendung von gut bekannten Techniken zu bestimmen. Zum Identifizieren geeigneter Bereiche des Moleküls, die geändert werden können, ohne die Aktivität zu zerstören, kann der Fachmann Bereiche anzielen, von denen angenommen wird, dass sie für die Aktivität nicht wichtig sind. Wenn beispielsweise ähnliche Polypeptide mit ähnlichen Aktivitäten von derselben Spezies oder von anderen Spezies bekannt sind, kann ein Fachmann die Aminosäuresequenz des Peptids mit ähnlichen Peptiden vergleichen. Durch einen solchen Verglich kann man Reste und Teile des Moleküls identifizieren, die zwischen ähnlichen Peptiden konserviert sind. Es wird verstanden werden, dass bei Änderungen in den Bereichen eines Peptids, die im Verhältnis zu derartigen ähnlichen Peptiden nicht konserviert sind, eine nachteilige Auswirkung auf die biologische Aktivität und/oder Struktur des Peptids weniger wahrscheinlich wäre. Ein Fachmann würde auch wissen, dass man selbst bei relativ konservierten Regionen chemisch ähnliche Aminosäuren gegen natürliche vorkommende Reste austauschen kann, während die Aktivität erhalten bleibt (konservative Substitutionen von Aminosäureresten). Deshalb können selbst Bereiche, die für die biologische Aktivität oder für die Struktur wichtig sein können, Gegenstand konservativer Aminosäuresubstitutionen sein, ohne die biologische Aktivität zu zerstören oder ohne die Peptidstruktur nachteilig zu beeinflussen.
  • Zusätzlich kann ein Fachmann Studien zu Struktur und Funktion, wodurch Reste in ähnlichen Peptiden identifiziert werden, die für die Aktivität oder Struktur wichtig sind, überprüfen. Angesichts eines solchen Vergleichs kann man die Bedeutung von Aminosäureresten in einem Peptid vorhersagen, die mit Aminosäureresten korrespondieren, die für die Aktivität oder die Struktur in ähnlichen Peptiden wichtig sind. Ein Fachmann kann sich für chemisch ähnliche Aminosäuresubstitutionen gegen derartige vorhergesagte wichtige Aminosäurereste der Peptide entscheiden.
  • Ein Fachmann kann auch die dreidimensionale Struktur und die Aminosäuresequenz im Verhältnis zu derjenigen Struktur in ähnlichen Polypeptiden analysieren. Angesichts dieser In formationen kann ein Fachmann die Anordnung von Aminosäureresten eines Peptids im Hinblick auf seine dreidimensionale Struktur vorhersagen. Ein Fachmann kann entscheiden, keine tiefgreifenden Änderungen bei Aminosäureresten vorzunehmen, für die vorhergesagt wurde, dass sie sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, da derartige Reste an wichtigen Interaktionen mit anderen Molekülen beteiligt sein könnten. Darüber hinaus kann ein Fachmann Testvarianten erzeugen, welche eine einzelne Aminosäuresubstitution an jedem gewünschten Aminosäurerest enthalten. Die Varianten können dann unter Verwendung von Aktivitätstests, die Fachleuten bekannt sind, durchgemustert werden. Derartige Daten könnten verwendet werden, um Informationen über geeignete Varianten zu sammeln. Wenn beispielsweise jemand entdeckt hat, dass eine Änderung an einem bestimmten Aminosäurerest zu einer zerstörten, unerwünscht verminderten oder ungeeigneten Aktivität führte, würden Varianten mit einer derartigen Änderung vermieden werden. Mit anderen Worten, auf der Grundlage von Informationen, die aus derartigen Routineexperimenten gesammelt wurden, kann ein Fachmann leicht die Aminosäuren bestimmen, bei denen weitere Substitutionen entweder allein oder in Kombination mit anderen Mutationen vermieden werden sollten.
  • Eine Reihe von wissenschaftlichen Publikationen haben sich der Vorhersage der Sekundärstruktur gewidmet. Siehe Moult J. Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422–427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222–245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211–222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45–148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251–276 und Chou et al., Biophys. J., 26: 367–384 (1979). Darüber hinaus sind derzeit Computerprogramme verfügbar, um beim Vorhersagen der Sekundärstruktur zu assistieren. Ein Verfahren zum Vorhersagen der Sekundärstruktur beruht auf Homologie-Modellierung. Beispielsweise haben zwei Polypeptide oder Proteine, die eine Sequenzidentität von mehr als 30% oder eine Ähnlichkeit von mehr als 40% aufweisen, häufig ähnliche räumliche Strukturen. Das kürzliche Wachstum der Proteinstrukturdatenbank (protein structural dato base, PDB) hat eine verbesserte Vorhersehbarkeit der Sekundärstruktur verfügbar gemacht, einschließlich der potenziellen Anzahl von Faltungen in der Struktur eines Polypeptids oder Proteins. Siehe Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244–247 (1999). Es ist nahegelegt worden (Brenner et al. Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369–376 (1997), dass es eine begrenezte Anzahl an Faltungen in einem vorgegebenen Polypeptid oder Protein gibt, und dass die Vorhersage von Strukturen dramatisch an Genauigkeit gewinnen wird, sobald eine kritische Anzahl an Strukturen aufgeklärt worden ist.
  • Zusätzliche Verfahren zum Vorhersagen der Sekundärstruktur schließen ein „Threading" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377–87 (1997); Sippl et al., Stuctures, 4(1): 15–9 (1996), eine „Profilananlyse" (Bowie et al., Science, 253: 164–170 (1991), Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146–159 (1990); Gribskov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84(13): 4355–8 (1987) und eine „evolutionäre Verknüpfung" (siehe Home, supra, und Brenner, supra) ein.
  • Vehikel. Diese Erfindung erfordert das Vorhandensein von mindestens einem Vehikel (V1), das an ein Peptid über den N-Terminus, C-Terminus oder eine Seitenkette von einem der Aminosäurereste angefügt ist. Es kann auch eine Vielzahl von Vehikeln verwendet werden, z. B. Fcs an jedem Terminus oder ein Fc an einem Terminus und eine PEG-Gruppe an dem anderen Terminus oder an einer Seitenkette. Beispielhafte Vehikel schließen folgende ein:
    • • eine Fc-Domäne;
    • • andere Proteine, Polypeptide oder Peptide, die in der Lage sind, an einen „Salvage"-Rezeptor zu binden;
    • • menschliches Serumalbumin (human serum albumin, HSA);
    • • eine Leucin-Zipper-(LZ)Domäne;
    • • Polyethylenglykol (PEG), einschließlich 5 kD, 20 kD und 30 kD PEG, ebenso wie andere Polymere;
    • • Dextran;
    und andere Moleküle, die im Stand der Technik bekannt sind, um eine verlängerte Halbwertszeit und/oder einen Schutz vor proteolytischem Abbau oder einer „Clearance" verfügbar zu machen.
  • Eine Fc-Domäne ist das bevorzugte Vehikel. Die Fc-Domäne kann mit den N- oder C-Termini der Peptide oder sowohl mit dem N- als auch dem C-Terminus fusioniert sein. Eine Fusion mit dem N-Terminus wird bevorzugt.
  • Wie oben erwähnt, sind Fc-Varianten geeignete Vehikel im Rahmen dieser Erfindung. Ein natives Fc kann umfangreich modifiziert werden, um eine Fc-Variante entsprechend dieser Erfindung zu bilden, vorausgesetzt, dass eine Bindung an den „Salvage"-Rezeptor erhalten bleibt; siehe beispielsweise WO 97/34631 und WO 96/32478 . Bei derartigen Fc-Varianten kann man eine oder mehrere Stellen eines nativen Fc, das strukturelle Eigenschaften verleiht oder eine funktionelle Aktivität, die für die Fusionsmoleküle dieser Erfindung nicht erforderlich ist, entfernen. Man kann diese Stellen beispielsweise durch Substituieren oder Deletieren von Resten, Einfügen von Resten in diese Stelle oder Verkürzen von Teilen, welche die Stelle enthalten, entfernen. Die eingefügten oder substituierten Reste können auch veränderte Aminosäuren, wie etwa Peptidomimetika oder D-Aminosäuren sein. Fc-Varianten können aus einer Reihe von Gründe wünschenswert sein, von denen etliche unten beschreiben werden. Beispielhafte Fc-Varianten schließen Moleküle und Sequenzen ein, bei denen:
    • 1. Stellen entfernt sind, die an einer Bildung von Disulfidbindungen beteiligt sind. Eine derartige Entfernung kann eine Reaktion mit anderen Cystein enthaltenden Proteinen vermeiden, die in der Wirtzelle vorhanden sind, die verwendet wird, um die Moleküle der Erfindung herzustellen. Zu diesem Zweck kann der N-Terminus um das Cystein enthaltende Segment verkürzt sein oder es können Cysteinreste deletiert oder durch andere Aminosäuren (z. B. Alanyl, Seryl) substituiert sein. Insbesondere kann man das N-terminale Segment von 20 Aminosäuren gemäß SEQ ID Nr. 2 verkürzen oder deletieren oder die Cysteinreste in den Positionen 7 und 10 gemäß SEQ ID Nr. 2 substituieren. Selbst wenn Cysteinreste entfernt werden, können die Einzelketten-Fc-Domänen noch eine dimere Fc-Domäne bilden, die durch nicht kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten wird.
    • 2. ein natives Fc modifiziert ist, um es mit einer ausgewählten Wirtszelle besser kompatibel zu machen. Beispielsweise kann man die PA-Sequenz in der Nähe des N-Terminus eines typischen nativen Fc entfernen, die durch ein Verdauungsenzym in E. coli, wie etwa Proliniminopeptidase, erkannt werden kann. Man kann auch einen N-terminalen Methioninrest anfügen, insbesondere wenn das Molekül rekombinant in einer Bakterienzelle wie etwa E. coli exprimiert wird. Die Fc-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 2 ist eine solche Fc-Variante.
    • 3. ein Teil des N-Terminus eines nativen Fc entfernt ist, um eine N-terminale Heterogenität zu vermeiden, wenn die Expression in einer ausgewählten Wirtszelle erfolgt. Zu diesem Zweck kann man jeden der ersten 20 Aminosäurereste am N-Terminus deletieren, insbesondere jeden in den Positionen 1, 2, 3, 4 und 5.
    • 4. eine oder mehrere Glykosylierungsstellen entfernt sind. Reste, die typischerweise glykosyliert sind (z. B. Asparagin), können eine zytolytische Antwort verleihen. Derartige Reste können deletiert oder durch nicht glykosylierte Reste (z. B. Alanin) substituiert sein.
    • 5. Stellen, die an einer Interaktion mit Komplement beteiligt sind, wie etwa die Clq-Bindungsstelle, entfernt sind. Beispielsweise kann man die EKK-Sequenz von menschlichem IgG1 deletieren oder substituieren. Eine Rekrutierung von Komplement kann für die Moleküle dieser Erfindung nicht von Vorteil sein und deshalb mit einer solchen Fc-Variante vermieden werden.
    • 6. Stellen entfernt sind, welche die Bindung an Fc-Rezeptoren beeinflussen, die kein „Salvage"-Rezeptor sind. Ein natives Fc kann Stellen zur Interaktion mit bestimmten weißen Blutzellen aufweisen, die bei den Fusionsmolekülen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich sind und deshalb entfernt werden können.
    • 7. die ADCC-Stelle entfernt ist. ADCC-Stellen sind im Stand der Technik bekannt; siehe beispielsweise Molec. Immunol. 29(5): 633–9 (1992) im Hinblick auf ADCC-Stellen in IgG 1. Diese Stellen sind ebenfalls bei den Fusionsmolekülen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich und können deshalb entfernt werden.
    • 8. das native Fc humanisiert sein kann, wenn sich das native Fc von einem nicht menschlichen Antikörper ableitet. Typischerweise wird man ausgewählte Reste in dem nicht menschlichen nativen Fc durch Reste substituieren, die in menschlichem naivem Fc normalerweise gefunden werden, um ein natives Fc zu humanisieren. Techniken zur Humanisierung von Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Bevorzugte Fc-Varianten schließen Folgendes ein. In SEQ ID Nr. 2 (3) kann das Leucin in Position 15 durch Glutamat, das Glutamat in Position 99 durch Alanin und die Lysine in den Positionen 101 und 103 durch Alanine substituiert sein. Außerdem können ein oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalaninreste ersetzt sein.
  • Ein alternatives Vehikel wäre ein Protein, Polypeptid, Peptid, Antikörper, Antikörperfragment oder kleines Molekül (small molecule) (z. B. eine peptidomimetische Verbindung), die in der Lage ist, an einen „Salvage"-Rezeptor zu binden. Beispielsweise könnte man als ein Vehikel eine Polypeptid verwenden, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,739,277 , erteilt am 14. April 1998 an Presta et al., beschrieben. Peptide könnten auch durch Phagen-Display oder RNA-Peptid-Screening aufgrund einer Bindung and den FcRn-„Salvage"-Rezeptor ausgewählt werden. Derartige, an den „Salvage"-Rezeptor bindende Verbindungen sind auch in der Bedeutung des Begriffs „Vehikel” eingeschlossen und liegen im Rahmen dieser Erfindung. Derartige Vehikel sollten aufgrund einer erhöhten Halbwertszeit (z. B. durch Vermeiden von Sequenzen, die durch Proteasen erkannt werden) und einer verminderten Immunogenität (z. B. durch Bevorzugen von nicht immunogenen Sequenzen, wie sie bei der Antikörperhumanisierung aufgedeckt werden) ausgewählt werden.
  • Wie oben erwähnt, können Polymervehikel auch für V1 verwendet werden. Verschiedene Mittel zum Anfügen chemischer Gruppen, die als Vehikel nützlich sind, sind gegenwärtig verfügbar; siehe z. B. Internationale Offenlegungsschrift unter dem Patent Cooperation Treaty („PCT") Nr. WO 96/11953 mit dem Titel „N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods". Diese PCT-Offenlegungsschrift offenbart unter anderem die selektive Anfügung von wasserlöslichen Polymeren an den N-Terminus von Proteinen.
  • Ein bevorzugtes Polymervehikel ist Polyethylenglykol (PEG). Die PEG-Gruppe kann jedes zweckmäßige Molekulargewicht aufweisen, und sie kann linear oder verzweigt sein. Das durchschnittliche Molekulargewicht des PEG wird vorzugsweise im Bereich von ungefähr 2 kiloDalton („kD") bis ungefähr 100 kD liegen, stärker bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 kD bis ungefähr 50 kD, am stärksten bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 10 kD. Die PEG-Gruppen werden im Allgemeinen an die Verbindungen der Erfindung durch Acylierung oder reduktive Alkylierung über eine reaktive Gruppe an der PEG-Gruppe (z. B. eine Aldehyd-, Amino-, Thiol- oder Estergruppe) an eine reaktive Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindung (z. B. eine Aldehyd-, Amino- oder Estergruppe) angefügt sein.
  • Eine nützliche Strategie zur PEGylierung von synthetischen Peptiden besteht im Kombinieren eines Peptids und einer PEG-Gruppe, wobei jeder Partner eine spezielle Funktionalität aufweist, die zueinander entgegengesetzt reaktiv sind, indem eine Konjugatverbindung in Lösung gebildet wird. Die Peptide können leicht mit herkömmlicher Festphasesynthese hergestellt werden. Die Peptide werden mit einer geeigneten funktionellen Gruppe an einer bestimmten Stelle „voraktiviert". Die Vorläufer werden gereinigt und vollständig charakterisiert, bevor sie mit der PEG-Gruppe reagieren gelassen werden. Eine Ligation des Peptids mit PEG findet gewöhnlich in wässriger Phase statt und kann leicht durch analytische Umkehrphasen-HPLC überwacht werden. Die PEGylierten Peptide können leicht durch präparative HPLC gereinigt und durch analytische HPLC, Aminosäureanalyse und Laserdesorptionsmassenspektrometrie charakterisiert werden.
  • Polysaccharidpolymere stellen eine andere Art von wasserlöslichem Polymer dar, die zur Proteinmodifikation verwendet werden können. Dextrane sind Polysaccharidpolymere, die einzelne Untereinheiten von Glukose enthalten, die hauptsächlich über α-1, 6-Verknüpfungen verknüpft sind. Das Dextran selbst ist in vielen Molekulargewichtsbereichen erhältlich, und es ist leicht erhältlich in Molekulargewichten von ungefähr 1 kD bis ungefähr 70 kD. Dextran ist ein geeignetes wasserlösliches Polymer zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung, entweder selbst als ein Vehikel oder in Kombination mit einem anderen Vehikel (z. B. Fc). Siehe beispielsweise WO 96/11953 und WO 96/05309 . Über die Verwendung von Dextran, das mit therapeutischen oder diagnostischen Immunglobulinen konjugiert ist, ist berichtet worden; siehe beispielsweise die europäische Patentschrift Nr. 0 315 456 . Dextran von ungefähr 1 kD bis ungefähr 20 kD wird bevorzugt, wenn Dextran als ein Vehikel entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Linker. Jede Linker-Gruppe ist fakultativ. Wenn sie vorhanden sind, ist ihre chemische Struktur nicht entscheidend, da sie hauptsächlich als ein Spacer dient. Der Linker ist vorzugsweise aus Aminosäuren aufgebaut, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Folglich ist der Linker in bevorzugten Ausführungen aus 1–30 Aminosäuren aufgebaut, die durch Peptidbindungen verknüpft sind, wobei die Aminosäuren aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren ausgewählt sind. Einige dieser Aminosäuren können glykosyliert sein, wie durch einen Fachmann leicht verstanden wird. In einer stärker bevorzugten Ausführung werden die 1 bis 20 Aminosäuren ausgewählt aus Glycin, Alanin, Prolin, Asparagin, Glutamin und Lysin. Noch stärker bevorzugt ist ein Linker aus einer Mehrheit von Aminosäuren aufgebaut, die sterisch ungehindert sind, wie etwa Glycin und Alanin. Folglich sind bevorzugte Linker Polyglycine (insbesondere (Gly)4, (Gly)5), poly(Gly-Ala) und Polyalanine. Andere spezifische Beispiele für Linker sind:
    Figure 00360001
    Figure 00370001
  • Um die obige Nomenklatur zu erklären, (Gly)3Lys(Gly)4 bedeutet beispielsweise Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID Nr. 40). Kombinationen von Gly und Ala sind ebenfalls bevorzugt. Die hier gezeigten Linker sind beispielhaft; Linker im Rahmen dieser Erfindung können sehr viel länger sein und sie können andere Reste beinhalten.
  • Bevorzugte Linker sind Aminosäurelinker, die mehr als 5 Aminosäuren umfassen, wobei geeignete Linker bis zu ungefähr 500 Aminosäuren, ausgewählt aus Glycin, Alanin, Prolin, Asparagin, Glutamin, Lysin, Threonin, Serin oder Aspartat, aufweisen. Linker von ungefähr 20 bis 50 Aminosäuren sind am stärksten bevorzugt. Eine Gruppe von bevorzugten Linker sind solche der folgenden Formeln:
    Figure 00370002
    wobei x1 und x3 jeweils unabhängig voneinander basische oder hydrophobe Reste sind und x2 und x4 jeweils unabhängig voneinander hydrophobe Reste sind. Besonders bevorzugte Linker sind:
    Figure 00370003
    Figure 00380001
    Linker, die keine Peptid-Linker sind („nicht-Peptid-Linker"), sind ebenfalls möglich. Beispielsweise könnten Alkyl-Linker, wie etwa -NH-(CH2)s-C(O)- verwendet werden, wobei s = 2–20. Diese Alkyl-Linker können weiterhin durch jede sterisch nicht hindernde Gruppe substituiert sein, wie etwa ein niedriges Alky (z. B. C1-C6), ein niedriges Acyl, ein Halogen (z. B. Cl, Br), CN, NH2, Phenyl etc. Ein beispielhafter nicht-Peptid-Linker ist ein PEG-Linker:
    Figure 00380002
    wobei n derart ist, dass der Linker ein Molekulargewicht von 100 bis 5000 kD, vorzugsweise 100 bis 500 kD aufweist. Die Peptid-Linker können verändert sein, um Derivate auf die gleichen Weise wie oben beschrieben zu bilden.
  • Derivate. Die Erfinder ziehen auch ein Derivatisieren eines Teil des Peptids und/oder des Vehikelteils der Verbindungen in Betracht. Derartige Derivate können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und Ähnliches der Verbindungen verbessern. Die Gruppen können alternativ jede unerwünschte Nebenwirkung der Verbindungen und Ähnliches ausschließen oder abschwächen. Beispielhafte Derivate schließen Verbindungen ein, bei denen:
    • 1. die Verbindung oder ein Teil davon zyklisch ist. Beispielsweise kann der Peptidteil modifiziert sein, um zwei oder mehr Cys-Reste zu enthalten (z. B. in dem Linker), wobei durch die Bildung einer Disulfidbindung eine Zyklisierung auftreten könnte.
    • 2. die Verbindung quervernetzt ist oder in die Lage versetzt ist, Querverbindungen zwischen Molekülen auszubilden. Beispielsweise kann der Peptidteil modifiziert sein, um einen Cys-Rest zu enthalten, und dadurch in der Lage zu sein, eine intramolekulare Disulfidbindung mit einem ähnlichen Molekül zu bilden. Die Verbindung kann auch über ihren C-Terminus quervernetzt sein, wie in dem unten gezeigten Molekül:
      Figure 00390001
      In der Formel VIII kann jedes „V1" typischerweise einen Strang der Fc-Domäne darstellen.
    • 3. eine oder mehrere Peptidyl [-C(O)NR-]-Verbindungen (Bindungen) durch eine Verbindung ersetzt sind, die keine Peptidyl-Verbindung ist („nicht-Peptidyl-Verbindung"). Beispielhafte nicht-Peptidyl-Verbindungen sind -CH2-Carbarmat [-CH2OC(O)NR-], Phosphonat, -CH2-Sulfonamid [-CH2-S(O)2NR-], Harnstoff [-NHC(O)NH-], sekundäres -CH2-Amin und alkyliertes Peptid [-C(O)NR6-, wobei R6 ein niedriges Alkyl ist].
    • 4. der N-Terminus derivatisiert ist. Typischerweise kann der N-Terminus acyliert oder zu einem substituierten Amin modifiziert sein. Beispielhafte Gruppen von N-terminalen Derivaten schließen N-RR1 (andere als -NH2), -NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, Succinimid oder Benzyloxycarbonyl-NH- (CBZ-NH-), wobei R und R1 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein niedriges Alkyl ist und wobei der Phenylring durch 1 bis 3 Substituenten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, Chlor und Brom besteht, substituiert sein kann, ein.
    • 5. der freie C-Terminus derivatisiert ist. Typischerweise ist der C-Terminus verestert oder amidiert. Beispielhafte Gruppen von C-terminalen Derivaten schließen beispielsweise -C(O)R2 ein, wobei R2 ein niedriges Alkoxy oder -NR3R4 ist, wobei R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff oder C1-C8-Alkyl (vorzugsweise C1-C4-Alkyl) sind.
    • 6. eine Disulfidbindung ersetzt ist durch eine andere, vorzugsweise stabilere quervernetzende Gruppe (z. B. ein Alkylen). Siehe z. B. Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814–9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357–9.
    • 7. ein oder mehrere einzelne Aminosäurereste modifiziert sind. Von verschiedenen derivatisierenden Agenzien ist bekannt, dass sie spezifisch mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren, wie unten genau beschrieben.
  • Lysinreste und aminoterminale Reste können durch Bernsteinsäure- oder andere Carbonsäureanhydride umgesetzt werden, was die Ladung der Lysinreste umkehrt. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von Resten, die eine alpha-Aminogruppe enthalten, schließen Imidoester, wie etwa Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulphonsäure; O-Methylisourea; 2,4-Pentandion; sowie eine Transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat ein.
  • Arginylreste können durch eine Reaktion mit einem oder einer Kombination aus etlichen herkömmlichen Reagenzien modifiziert werden, einschließlich Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Eine Derivatisierung von Arginylresten erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pKa-Werts der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin ebenso wie mit der epsilon-Aminogruppe von Arginin reagieren.
  • Eine spezifische Modifikation von Tyrosylresten ist ausführlich untersucht worden mit besonderem Interesse an dem Einführen von spektralen Markierungen in Tyrosylreste durch eine Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am häufigsten werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyl-Tyrosol-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden.
  • Carboxyseitenkettengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) können selektiv durch Reaktionen mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') modifiziert werden, wie etwa 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)- carbodiimid. Weiterhin können Aspartyl- und Glutamylreste zu Asparaginyl- und Glutaminylresten durch Reaktion mit Ammoniumionen umgesetzt werden.
  • Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste können zu den korrespondierenden Glutamyl- und Aspartyl-Resten deaminiert werden. Alternativ werden diese Reste unter milden sauren Bedingungen deaminiert. Jede Form dieser Reste fällt in den Rahmen dieser Erfindung.
  • Cysteinylreste können durch Aminosäurereste oder andere Gruppen ersetzt werden, entweder, um eine Disulfidbindung zu entfernen oder umgekehrt, um eine Querverbindung zu stabilisieren. Siehe z. B. Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814–9.
  • Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Agenzien ist zum Quervernetzen der Peptide oder ihrer funktionellen Derivate mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder anderen makromolekularen Vehikeln nützlich. Üblicherweise verwendete quervernetzende Agenzien schließen beispielsweise 1,1-bis(Diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie etwa 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide, wie etwa bis-N-Maleimido-1,8-octan, ein. Derivatisierende Agenzien, wie etwa Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, liefern photoaktivierbare Intermediate, die in der Lage sind, in Gegenwart von Licht Quervernetzungen zu bilden. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizes, wie etwa Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die in den U.S.-Patenten Nr. 3,969,287 , 3,691,016 , 4,195,128 , 4,247,642 , 4,229,537 und 4,330,440 beschriebenen reaktiven Substraten zur Immobilisierung von Protein eingesetzt.
  • Kohlenhydrat-(Oligosaccharid)Gruppen können zweckmäßigerweise an Stellen angefügt werden, die als Glykosylierungsstellen in Proteinen bekannt sind. Im Allgemeinen werden O-verknüpfte Oligosaccharide an Serin-(Ser) oder Threonin-(Thr)Reste angefügt, während N-verknüpfte Oligosaccharide an Asparagin-(Asn)Reste angefügt werden, wenn sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann. X ist vorzugsweise eine der 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Prolin. Die Strukturen von N-verknüpften und O-verknüpften Oligosacchariden und der Zuckerreste, die in jeder Art gefunden werden, sind verschieden. Eine Zuckerart, die üblicherweise bei beiden gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure (auch als Sialinsäure bezeichnet). Sialinsäure stellt gewöhn lich den terminalen Rest von sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden dar und kann aufgrund ihrer negativen Ladung der glykosylierten Verbindung saure Eigenschaften verleihen. Eine derartige Stelle bzw. derartige Stellen können in den Linker der Verbindungen dieser Erfindung eingebaut sein und werden vorzugsweise durch eine Zelle während der rekombinanten Herstellung der Polypeptidverbindungen glykosyliert (z. B. in Säugetierzellen wie etwa CHO, BHK, COS). Allerdings können derartige Stellen durch synthetische oder halbsynthetische Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, weiter glykosyliert werden.
  • Andere mögliche Modifikationen schließen eine Hydroxylierung von Prolin und Lysin, eine Phosphorylierung der Hydroxygruppen von Seryl- und Threonylresten, eine Oxidation des Schwefelatoms in Cys, eine Methylierung der alpha-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten ein. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), S. 79–86 (1983).
  • Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf DNA-Ebene ebenfalls geändert werden. Die DNA-Sequenz von jedem Teil der Verbindung kann zu Kodons geändert werden, die mit der ausgewählten Wirtszelle besser kompatibel sind. Für E. coli, welche die bevorzugte Wirtszelle darstellt, sind optimierte Kodons im Stand der Technik bekannt. Kodons können substituiert werden, um Restriktionsstellen zu entfernen oder um stille Restriktionsstellen aufzunehmen, was beim Prozessieren der DNA in der ausgewählten Wirtszelle helfen kann. Die Vehikel, Linker und Peptid-DNA-Sequenzen können modifiziert sein, um jede der vorangehenden Sequenzänderungen einzuschließen.
  • Herstellungsverfahren
  • Die Verbindungen dieser Erfindungen können weitgehend in transformierten Wirtszellen unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Um dies zu tun, wird ein rekombinantes DNA-Molekül, welches das Peptid kodiert, hergestellt. Verfahren zum Herstellen derartiger DNA-Moleküle sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispielsweise könnten Sequenzen, welche die Peptide kodieren, aus DNA unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen ausgeschnitten werden. Alternativ könnte das DNA-Molekül unter Verwendung chemischer Synthesetechniken, wie etwa der Phosphoramidat-Methode, synthetisiert werden. Auch könnte eine Kombination dieser Techniken verwendet werden.
  • Die Erfindung schließt auch einen Vektor ein, der in der Lage ist, die Peptide in einem geeigneten Wirt zu exprimieren. Der Vektor umfasst das DNA-Molekül, das die Peptide kodiert, das funktionsfähig mit geeigneten Sequenzen zur Steuerung der Expression verknüpft ist. Verfahren zum Herbeiführen dieser funktionsfähigen Verknüpfung, entweder bevor oder nachdem das DNA-Molekül in den Vektor eingefügt worden ist, sind gut bekannt. Sequenzen zur Steuerung der Expression schließen Promotoren, Aktivatoren, Enhancer, Operatoren, ribosomale Bindungsstellen, Startsignale, Stopsignale, Cap-Signale, Polyadenylierungssignale und andere Signale, die an der Steuerung von Transkription oder Translation beteiligt sind, ein.
  • Der sich ergebende Vektor, der das DNA-Molekül aufweist, wird verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transformieren. Diese Transformation kann unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Jede von einer großen Anzahl von verfügbaren und gut bekannten Wirtszellen kann bei der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Die Auswahl eines bestimmten Wirts hängt von einer Reihe von Faktoren ab, die auf dem Fachgebiet erkannt werden. Diese schließen beispielsweise eine Kompatibilität mit dem ausgewählten Expressionsvektor, eine Toxizität der Peptide, welche durch das DNA-Molekül kodiert werden, die Transformationsgeschwindigkeit, die Einfachheit der Wiedergewinnung der Peptide, Expressionseigenschaften, die biologische Sicherheit sowie Kosten ein. Ein Gleichgewicht dieser Faktoren muss in dem Bewusstsein getroffen werden, dass nicht alle Wirte für die Expression einer bestimmten DNA-Sequenz gleich wirksam sind. Innerhalb dieser allgemeinen Anleitungen schließen geeignete mikrobiologische Wirte Bakterien (wie etwa E. coli sp.), Hefe (wie etwa Saccharomyces sp.) und andere Pilz, Insekten, Pflanzen, Säugetierzellen (einschließlich menschlichen Zellen) in Kultur und andere im Stand der Technik bekannte Wirte ein.
  • Als nächstes wird der transformierte Wirt kultiviert und gereinigt. Wirtszellen können unter herkömmlichen Fermentierungsbedingungen kultiviert werden, damit die gewünschten Verbindungen exprimiert werden. Derartige Fermentierungsbedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Schließlich werden die Peptide aus der Kultur durch Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, gereinigt,
  • Die Verbindungen können auch durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Techniken einer Festphasesynthese verwendet werden. Geeignete Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen jene ein, die in Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, S. 335–61 (Katsoyannis und Panayotis Hrsg.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394–414; Steward und Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. Nr. 3,941,763 ; Finn et al. (1976), The Proteins (3. Aufl.) 2: 105–253; und Erickson et al. (1976), The Proteins (3. Aufl.) 2: 257–527 beschrieben wurden. Die Festphasesynthese ist die bevorzugt Technik zum Herstellen einzelner Peptide, da sie das kostengünstigste Verfahren zum Herstellen kleiner Peptide darstellt.
  • Verbindungen, welche derivatisierte Peptide enthalten oder welche Gruppen enthalten, die keine Peptide sind („nicht-Peptid-Gruppen"), können durch gut bekannte Techniken der organischen Chemie synthetisiert werden.
  • Verwendungen der Verbindungen
  • Verbindungen dieser Erfindung können besonders nützlich zur Behandlung von durch B-Zellen vermittelten Autoimmunerkrankungen sein. Insbesondere können die Verbindungen dieser Erfindung beim Behandeln, Verhüten, Lindern, Diagnostizieren oder Prognostizieren eines Lupus, einschließlich eines systemischen Lupus erythematosus (SLE), und von Erkrankungen und Zuständen, die mit einem Lupus im Zusammenhang stehen, nützlich sein. Andere bevorzugte Indikationen schließen B-Zell-vermittelte Krebsarten, einschließlich einem B-Zell-Lymphom ein.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können auch verwendet werden, um entzündliche Zustäde der Gelenke zu behandeln. Entzündliche Zustände eines Gelenks sind chronische Gelenkerkrankungen, welche weltweit Millionen Menschen in unterschiedlichem Ausmaß quälen und behindern. Die rheumatoide Arthritis ist eine Erkrankung der Gelenke, bei der Knorpel und Knochen langsam durch ein proliferatives, invasives Konnektivgewebe, das als Pannus bezeichnet wird, das sich von der Synovialmembran ableitet, weggefressen wird. Diese Erkrankung kann peri-artikuläre Strukturen beteiligen, wie etwa Schleimbeutel, Sehnenscheiden und Sehnen, ebenso wie extra-artikuläre Gewebe, wie etwa die Subkutis, das kardiovakuläre System, die Lungen, die Milz, Lymphknoten, Skelettmuskeln, das Nervensystem (zentral und peripher) und die Augen (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (Hrsg.), II: 1828).
  • Die Osteoarthritis ist eine weitverbreitete Gelenkerkrankung, die durch degenerative Änderungen im Gelenkknorpel und eine reaktive Proliferation von Knochen und Knorpel um das Gelenk charakterisiert ist. Die Osteoarthritis ist ein zellvermittelter aktiver Prozeß, der das Ergebnis der ungeeigneten Antwort von Chondrozyten auf katabole und anabole Stimuli sein kann. Änderungen in einigen Matrixmolekülen von Gelenkknorpel treten Berichten zufolge in der frühen Osteoarthritis auf (Thonar et al. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (Hrsg.), 19: 635–657 und Shinmei et al., (1992), Arthritis Rheum., 35: 1304–1308. Es wird angenommen, dass TALL-1, TALL-1R und Modulatoren davon bei der Behandlung dieser und verwandter Zustände nützlich sind.
  • Verbindungen dieser Erfindung können auch zur Behandlungen einer Reihe weiterer Erkrankungen und Störungen nützlich sein, die folgende einschließen:
    • • aktute Pankreatitis;
    • • ALS;
    • • Alzheimer-Krankheit;
    • • Asthma;
    • • Atherosklerose;
    • • autoimmune hämolytische Anämie;
    • • Krebs, insbesondere Krebsarten, die mit B-Zellen im Zusammenhang stehen;
    • • Cachexie, Anorexie;
    • • chronisches Erschöpfungssyndrom;
    • • Zirrhose (z. B. primäre biliäre Zirrhose);
    • • Diabetes (z. B. Insulin-Diabetes);
    • • Fieber;
    • • Glomerulonephritis, einschließlich IgA-Glomerulonephritis und primäre Glomerulonephritis;
    • • Goodpasture-Syndrom;
    • • Guillain-Barre-Syndrom;
    • • Transplantatabstoßung (graft versus host disease);
    • • Hashimoto-Thyroiditis;
    • • hämorrhagischer Schock;
    • • Hyperalgesie;
    • • entzündliche Darmerkrankung;
    • • entzündliche Zustände eines Gelenks, einschließlich Osteoarthritis, psoriatische Arthritis und rheumatoide Arthritis;
    • • entzündliche Zustände, die das Ergebnis einer Belastung, Verstauchung, eines Knorpelschadens, Traumas, eines orthopädischen chirurgischen Eingriffs, einer Infektion oder eines anderen Erkrankungsprozesses sind;
    • • insulinabhängiger Diabetes mellitus;
    • • ischämische Verletzung, einschließlich zerebrale Ischämie (z. B. Hirnverletzung als Ergebnis eines Traumas, von Epilepsie, Hämorrhagie oder Schlaganfall, wobei jedes dieser Ereignisse zu einer Neurodegeneration führen kann);
    • • Lernschwäche;
    • • Lungenerkrankung (z. B. ARDS);
    • • multiples Myelom;
    • • Multiple Sklerose;
    • • Myasthenia gravis;
    • • myeloische Leukämie (z. B. AML und CML) und andere Leukämien;
    • • Myopathien (z. B. Muskelproteinstoffwechsel, insbesondere bei Sepsis);
    • • Neurotoxizität (z. B. wie durch HIV induziert);
    • • Osteoporose;
    • • Schmerz;
    • • Parkinson-Krankheit;
    • • Pemphigus;
    • • Polymyositis/Dermatomyositis;
    • • pulmonare Entzündung, einschließlich autoimmune pulmonare Entzündung;
    • • vorzeitige Wehen;
    • • Psoriasis;
    • • Reiter-Krankheit;
    • • Reperfusionsverletzung;
    • • septischer Schock;
    • • Nebenwirkungen einer Strahlentherapie;
    • • Sjogren-Syndrom;
    • • Schlafstörung;
    • • temporale Kiefergelenkserkrankung;
    • • Thrombozytopenie, einschließlich idiopathische Thrombozytopenie und autoimmune neonatale Thrombozytopenie;
    • • Tumormetastase;
    • • Uveitis; und
    • • Vasculitis.
  • Verbindungen dieser Erfindung können allein oder in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge anderer Arzneimittel, einschließlich analgetisch wirkender Agenzien, krankheitsmodifizierender, antirheumatischer Arzneimittel (disease modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs) nicht-steroidaler entzündungshemmender Arzneimittel (non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) und jedes Immun- und/oder Entzündungsmodulators, verabreicht werden. Folglich können Verbindungen dieser Erfindung verabreicht werden mit Folgendem:
    • • Modulatoren von anderen Mitgliedern der TNF/TNF-Rezeptor-Familie, einschließlich TNF-Antagonisten, wie etwa Etanercept (EnbrelTM), sTNF-RI, Onercept, D2E7 und RemicadeTM
    • • Modulatoren des Nervenwachstumsfaktors (nerve growth factor, NGF).
    • • IL-1-Inhibitoren, einschließlich IL-Ira-Molekülen, wie etwa Anakinra und den kürzlich entdeckten IL-1ra-artigen Molekülen, wie etwa IL-1Hy1 und IL-Hy2; IL-1-"Fallenmolekülen", wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,844,099 , erteilt am 1. Dezember 1998, beschrieben; IL-1-Antikörpern; solubilisiertem IL-1-Rezeptor und Ähnlichem.
    • • IL-6-Inhibitoren (z. B. Antikörper gegen IL-6).
    • • IL-8-Inhibitoren (z. B. Antikörper gegen IL-8).
    • • IL-18-Inhibitoren (z. B. IL-18-bindendes Protein, solubilisierter IL-18-Rezeptor oder IL-18-Antikörper).
    • • Modulatoren des interleukin-1 converting enzyme (ICE).
    • • insulinartigen Wachstumsfaktoren (insulin-like growth factors, IGF-1, IGF-2) und Modulatoren davon.
    • • transformierendem Wachstumsfaktor-β (transforming growth factor-β, TGF-β), Mitgliedern der TGF-β-Familie und TGF-β-Modulatoren.
    • • Fibroblastenwachstumsfaktoren (fibroblast growth factors, FGF) FGF-1 bis FGF-10 und FGF-Modulatoren.
    • • Osteoprotegerin (OPG), OPG-Analoga, osteoprotektiven Agenzien und Antikörpern gegen OPG-Ligand (OPG-L).
    • • Agenzien, die anabolisch auf den Knochen wirken, wie etwa das parathyroide Hormon (PTH) (Parathormon), PTH-Fragmenten und Molekülen, welche PTH-Fragmente umfassen, z. B. PTH (1-34)-Fc).
    • • PAF-Antagonisten.
    • • Ketatinozytenwachstumsfaktor (keratinocyte growth factor, KGF), KGF-verwandten Molekülen (z. B. KGF-2) und KGF-Modulatoren.
    • • COX-2-Inhibitoren, wie etwa CelebrexTM und VioxxTM.
    • • Prostaglandin-Analoga (z. B. Prostglandine der E-Serie).
    • • Modulatoren der Matrixmetalloproteinase (MNP).
    • • Modulatoren der Stickoxidsynthase (nitric oxid synthase, NOS), einschließlich Modulatoren der induzierbaren NOS.
    • • Modulatoren des Glucokortikoidrezeptors.
    • • Modulatoren des Glutamatrezeptors.
    • • Modulatoren von Lipopolysaccharid-(LPS)Spiegeln.
    • • Agenzien zur Bekämpfung von Krebs, einschließlich Inhibitoren von Onkogenen (z. B. fos, jun) und Interferonen.
    • • Noradrenalin und Modulatoren und Mimetika davon.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Allgemeines. Die vorliegende Erfindung macht auch Verfahren zum Verwenden von pharmazeutischen Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Verbindungen verfügbar. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können zur Verabreichungen durch Injektion oder zur oralen, pulmonaren, nasalen, transdermalen oder zu anderen Formen einer Verabreichung vorgesehen sein. Im Allgemeinen umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche wirksame Mengen einer Verbindung der Erfindung gemeinsam mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Adjuvanzien und/oder Trägern umfassen. Derartige Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem Puffergehalt (z. B. TRIS-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und unterschiedlicher Innenstärke; Additive, wie etwa Detergenzien und löslich machende Agenzien (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidanzien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsstoffe (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Trennmittel (z. B. Lactose, Mannitol); die Aufnahme des Materials in partikuläre Zubereitungen von Polymerverbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure etc., oder in Liposomen; ein. Hyaluronsäure kann ebenfalls verwendet werden, und dies kann die Wirkung haben, einen anhaltenden Verbleib in der Zirkulation zu fördern. Derartige Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Freisetzungsgeschwindigkeit in vivo und die Geschwindigkeit der „Clearance" der vorliegenden Proteine und Derivate in vivo beeinflussen. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), S. 1435–1712. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden, oder sie können als getrocknetes Pulver, wie etwa in lyophilisierter Form, vorliegen. Implantierbare Formulierungen zur anhaltenden Freisetzung werden ebenfalls in Betracht gezogen, wie etwa transdermale Formulierungen.
  • Orale Dosierformen. Zur Verwendung hier in Betracht gezogen werden orale feste Dosierformen, die allgemein in Kapitel 89 von Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18. Aufl., Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 beschrieben werden. Feste Dosierformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Lutschtabletten, Portionspackungen oder Presslinge ein. Eine liposomale oder proteinartige Verkapselung kann verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie beispielsweise die proteinartigen Mikrosphären, über die in dem US-Patent Nr. 4,925,678 berichtet wurde). Es kann eine liposomale Verkapselung verwendet werden, und die Liposomen können durch verschiedene Polymere derivatisiert werden (z. B. U.S.-Patent Nr. 5,013,556 ). Eine Beschreibung möglicher fester Dosierformen für das Therapeutikum wird in Kapitel 10 von Marshall, K., Modem Pharmaceutics (1979), herausgegeben von G. S. Banker und C. T. Rhodes, gegeben. In Allgemeinen wird die Formulierung die erfindungsgemäße Verbindung einschließen sowie inerte Bestandteile, die einen Schutz gegen die Umgebung im Magen und eine Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Darm ermöglichen.
  • Ebenfalls besonders in Betracht gezogen werden orale Dosierformen der oben genannten erfindungsgemäßen Verbindungen. Falls erforderlich, können die Verbindungen chemisch modifiziert werden, damit eine orale Abgabe wirksam ist. Im Allgemeinen ist die in Betracht gezogene chemische Modifikation die Anfügung von mindestens einer Gruppe an das Molekül der Verbindung selbst, wobei die Gruppe (a) eine Hemmung der Proteolyse und (b) eine Aufnahme in den Blutstrom aus dem Magen oder dem Darm erlaubt. Ebenfalls gewünscht ist die Zunahme der Gesamtstabilität der Verbindung und eine Zunahme der Verweildauer im Kreislauf des Körpers. Gruppen, die als kovalent angefügte Vehikel bei dieser Erfindung nützlich sind, können zu diesem Zweck auch verwendet werden. Beispiele derartiger Gruppen schließen folgende ein: PEG, Copolymere von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Siehe beispielsweise Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg and Rogers, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, NY, S. 367–83; Newark, et al, (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185–9. Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-Dioxolan und Poly-1,3,6-Tioxocan. Zur pharmazeutischen Verwendung bevorzugt sind, wie oben angegeben, PEG-Gruppen.
  • Für Dosierformen zur oralen Abgabe ist es auch möglich, ein Salz einer modifizierten aliphatischen Aminosäure, wie etwa Natrium-N-(8[2-hydroxybenzoyl]amino)-caprylat (SNAC) als einen Carrier zur benutzen, um die Absorption der therapeutischen Verbindungen dieser Erfindung zu verstärken. Die klinische Wirksamkeit einer Heparin-Formulierung unter Verwendung von SNAC ist in einer Phase II-Studie, die durch Emisphere Technologies durchgeführt wurde, gezeigt worden. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,792,451 , „Oral drug delivery composition and methods".
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können in die Formulierung als feine Multiteilchen in Form von Granulat oder Presslingen mit einer Partikelgröße von ungefähr 1 mm eingeschlossen sein. Die Formulierung des Materials zur Verabreichung in Form einer Kapsel könnte auch als ein Puder, als leicht komprimierte Stopfen oder sogar als Tabletten vorliegen. Das Therapeutikum könnte durch Kompression hergestellt werden.
  • Es können alle Arten von Farbstoffen und Geschmacksstoffen eingeschlossen sein. Beispielsweise kann das Protein (oder Derivat) formuliert sein (wie etwa durch Liposomen- oder Mikrosphärenverkapselung) und dann weiter in einem verzehrbaren Produkt enthalten sein, wie etwa einem gekühlten Getränk, das Farbstoffe und Geschmacksstoffe enthält.
  • Man kann das Volumen der Verbindungen der Erfindung mit einem inerten Material strecken oder erhöhen. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Lactose, Zellulose, Sucrose, modifizierte Dextrane und Stärke einschließen. Bestimmte anorganische Salze können auch als Füllstoffe verwendet werden, einschließ lich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell erhältliche Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
  • In der Formulierung des Therapeutikums zu einer festen Dosierform können Sprengmittel eingeschlossen sein. Materialien, die als Sprengmittel verwendet werden, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Stärke, einschließlich dem kommerziellen Sprengmittel auf der Grundlage von Stärke, Explotab, ein. Natriumstärkeglykolat, Amberlite, Natriumcarboxymethylzellulose, Ultramylopectin, Natriumalginat, Gelatine, Orangeschale, Carboxymethylzellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Sprengmittel sind unlösliche Kationenaustauschharze. Gummis in Pulverform können als Sprengmittel und als Bindemittel verwendet werden, und diese können gepulverte Gummis, wie etwa Agar, Karaya oder Tragacanth beinhalten. Alginsäure und ihr Natriumsalz sind als Sprengmittel auch nützlich.
  • Es können Bindemittel verwendet werden, um das therapeutische Agens zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden, und sie schließen Materialien aus natürlichen Produkten ein, wie etwa Acazia, Tragacanth, Stärke und Gelatine. Andere schließen Methylzellulose (MC), Ethylzellulose (EC) und Carboxymethylzellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
  • Ein reibungshemmendes Agens kann in die Formulierung des Therapeutikums eingeschlossen sein, um ein Anheften während des Formulierungsvorgangs zu verhindern. Schmiermittel können als eine Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Formwand verwendet werden, und diese können, ohne darauf beschränkt zu sein, folgende einschließen: Stearinsäure, einschließlich ihrer Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssiges Parafin, Pflanzenöle und Wachse. Lösliche Schmiermittel können auch verwendet werden, wie etwa Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglykol mit veschiedenen Molekulargewichten, Carbowax 4000 und 6000.
  • Gleitmittel, welche die Fließeigenschaften des Arzneimittels während der Formulierung verbessern könnten, und um eine Neuordnung während der Kompression zu unterstützen, könnten zugesetzt werden. Die Gleitmittel können Stärke, Talkum, pyrogenes Silica und hydratisiertes Silicoaluminat einschließen.
  • Um eine Lösung der Verbindung dieser Erfindung in der wässrigen Umgebung zu unterstützen, könnte ein oberflächenaktives Agens als ein Netzmittel zugesetzt werden. Oberflächenaktive Agenzien können anionische Detergenzien, wie etwa Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfat einschließen. Kationische Detergenzien könnten verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid einschließen. Die Liste potentieller nicht-ionischer Detergenzien, die in die Formulierung als oberflächenaktive Agenzien eingeschlossen sein könnten, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40-Stearat, Polyoxyethylen, hydrogeniertes Rizinusöl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Sucrose-Fettsäureester, Methylzellulose und Carboxymethylzellulose. Die oberflächeaktiven Agenzien könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder allein oder als eine Mischung in verschiedenen Verhältnissen vorhanden sein.
  • In der Formulierung könnten auch Additive eingeschlossen sein, um die Aufnahme der Verbindung zu verstärken. Additive, welche diese Eigenschaft potentiell aufweisen, sind beispielsweise die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
  • Es kann eine Formulierung zur gesteuerten Freisetzung wünschenswert sein. Die Verbindung dieser Erfindung könnte in eine inerte Matrix aufgenommen sein, welche eine Freisetzung entweder durch Diffusion oder Auswaschungsmechanismen erlaubt, z. B. Gummis. Sich langsam abbauende Matrizes können in die Formulierung ebenfalls aufgenommen sein, z. B. Alginate, Polysaccharide. Eine weitere Form einer gesteuerten Freisetzung der Verbindungen dieser Erfindung wird durch ein Verfahren auf der Grundlage des therapeutischen OROS-Systems (AlzaCorp.) erreicht, d. h. das Arzneimittel wird in eine semipermeable Membran eingeschossen, welche das Eindringen von Wasser und das Hinausdrücken des Arzneimittels durch eine einzelne kleine Öffnung aufgrund osmotischer Wirkungen erlaubt. Einige enterische Beschichtungen weisen ebenfalls die Wirkung einer verzögerten Freisetzung auf.
  • Es können andere Beschichtungen für die Formulierung verwendet werden. Diese schließen eine Vielfalt von Zuckern ein, die in einem Drageekessel aufgebracht werden könnten. Das therapeutische Agens könnte auch in eine filmbeschichtete Tablette gegeben werden und die in diesem Fall verwendeten Materialien in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst die nicht-enterischen Materialien und schließen Methylzellulose, Ethylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Methylhydroxy-Ethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Hydroxypro pyl-Methylzellulose, Natriumcarboxy-Methylzellulose, Providon und die Polyethylenglykole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die üblicherweise Ester der Phthalsäure sind.
  • Es könnte eine Mischung von Materialien verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung verfügbar zu machen. Das Beschichten mit einem Film kann in einem Drageekessel oder in einem verflüssigten Bett oder durch Kompressionsbeschichtung durchgeführt werden.
  • Pulmonare Abgabeformen. Hier ebenfalls in Betracht gezogen wird eine pulmonare Abgabe des vorliegenden Proteins (oder von Derivaten davon). Das Proein (oder Derivat) wird an die Lungen eines Säugetiers während des Inhalieren abgegeben und tritt über das die Lunge auskleidende Epithel in den Blutstrom über. Andere Berichte hierzu schließen Adjei et al., Parma. Res. (1990) 7: 565–9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135–44 (Leuprolidacetat); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (Ergänzungsband 5): S. 143–146 (Endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206–12 (α1-Antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145–6 (α1-Proteinase); Oswein et al. (März 1990), „Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (rekombinantes menschliches Wachstumshormon); Debs et al. (1988); J. Immunol. 140: 3482–8 (Interferon-γ und Tumornekrosefaktor α) und Platz et al., U.S.-Patent Nr. 5,284,656 (granulocyte colony stiumulating factor) ein.
  • Zur Ausführung dieser Erfindung in Betracht gezogen wird eine große Auswahl von mechanischen Vorrichtungen, die zur pulmonalen Abgabe von therapeutischen Produkten entworfen wurden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Zerstäuber, Dosierinhalatoren und Pulverinhalatoren, wobei der Fachmann mit allen diesen vertraut ist. Einige spezifische Beispiele für kommerziell erhältliche Vorrichtungen, die zur Ausführung dieser Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Zerstäuber, hergestellt durch Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; der Acorn II-Zerstäuber, hergestellt durch Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; der Ventolin-Dosierinhalator, hergestellt durch Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; und der Spinhaler-Pulverinhalator, hergestellt durch Fisons Corp., Redford, Massachusetts.
  • Derartige Vorrichtungen erfordern alle die Verwendung von Formulierungen, die zum Dispensieren der erfindungsgemäßen Verbindung geeignet sind. Typischerweise ist jede Formu lierung für die Art der eingesetzten Vorrichtung spezifisch und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittelmaterials zusätzlich zu Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägern, die bei der Therapie nützlich sind, umfassen.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung sollte am vorteilhaftesten in partikulärer Form mit einer mittleren Partikelgröße von weniger als 10 um (oder Microns), am stärksten bevorzugt 0,5 bis 5 μm, für die wirksamste Abgabe an die distale Lunge hergestellt sein.
  • Pharmazeutisch annehmbare Träger schließen Kohlenhydrate ein, wie etwa Trehalose, Mannitol, Xylitol, Sucrose, Lactose und Sorbitol. Andere Bestandteile zur Verwendung in Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC einschließen. Es können natürliche oder synthetische oberflächenaktive Agenzien verwendet werden. PEG kann verwendet werden (sogar abgesehen von dessen Verwendung beim Derivatisieren des Proteins oder Analogons). Dextrane, wie etwa Cyclodextran, können verwendet werden. Gallensäuren und andere verwandte Verstärker können verwendet werden. Cellulose und Cellulosederivate können verwendet werden. Aminosäuren können verwendet werden, wie etwa zur Verwendung in einer Pufferformulierung.
  • Auch die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrosphären, Einschlusskomplexen oder anderen Arten von Trägern wird in Betracht gezogen.
  • Formulierungen, die zur Verwendung mit einem Zerstäuber, entweder mittels Düsen oder Ultraschall, geeignet sind, werden typischerweise die erfindungsgemäße Verwendung in Wasser gelöst in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg des biologisch aktiven Proteins pro ml Lösung umfassen. Die Formulierung kann auch einen Puffer und einen einfachen Zucker einschließen (z. B. zur Proteinstabilisierung und Regulation des osmotischen Drucks). Die Zerstäuberformulierung kann auch ein oberflächenaktives Agens enthalten, um eine oberflächeninduzierte Aggregation des Proteins zu verringern oder zu verhindern, die durch Atomisierung der Lösung beim Bilden des Aerosols verursacht wird.
  • Formulierungen zur Verwendung mit einer Dosierinhalatorvorrichtung werden im Allgemeinen ein fein verteiltes Pulver umfassen, das die erfindungsgemäße Verbindung suspendiert in einem Treibmittel mit der Hilfe eines oberflächenaktiven Agens umfasst. Das Treibmittel kann jedes herkömmliche Material sein, das zu diesem Zweck eingesetzt wird, wie etwa ein Chlorfluorkohlenstoff, ein Wasserstoffchlorfluorkohlenstoff, ein Wasserstofffluorkohlenstoff oder ein Wasserstoffkohlenstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon. Geeignete oberflächenaktive Agenzien schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin ein. Ölsäure kann auch als ein oberflächenaktives Agens nützlich sein.
  • Formulierungen zum Dispensieren aus einer Pulverinhalatorvorrichtung werden ein fein verteiltes trockenes Pulver umfassen, welches die erfindungsgemäße Verbindung enthält, und sie können auch ein Auflockerungsmittel einschließen, wie etwa Laktose, Sorbitol, Sucrose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen, welche eine Verteilung des Pulvers bei der Abgabe aus der Vorrichtung erleichtert, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung.
  • Nasale Abgabeformen. Eine nasale Abgabe der erfindungsgemäßen Verbindung wird ebenfalls in Betracht gezogen. Eine nasale Abgabe erlaubt den Übergang des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichen des therapeutischen Produkts an die Nase ohne die Notwendigkeit, das Produkt an die Lunge abzugeben. Formulierungen zur nasalen Abgabe schließen solche mit Dextran oder Cyclodextran ein. Die Abgabe mittels Transport über andere Schleimhäute wird ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Dosierungen. Der Dosierungsplan, der an einem Verfahren zum Behandeln der oben beschriebenen Zustände beteiligt ist, wird durch den behandelnden Arzt bestimmt werden, wobei verschiedene Faktoren, welche die Wirkung von Arzneimitteln modifizieren, berücksichtigt werden, z. B. das Alter, der Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Ernährungsweise des Patienten, die Schwere einer möglichen Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren. Im Allgemeinen sollte der tägliche Behandlungsplan Dosierungen im Bereich von 0,1–1000 Mikrogramm der erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht, vorzugsweise 0,1–150 Mikrogramm pro Kilogramm vorsehen.
  • Besonders bevorzugte Ausführungen
  • Die Erfinder haben bevorzugte Strukturen für die in Tabelle 4 unten aufgeführten bevorzugten Peptide bestimmt. Das Symbol „A" kann jeder der hier beschriebenen Linker sein oder es. kann einfach eine normale Peptidbindung darstellen (d. h. sodass kein Linker vorhanden ist).
  • Tandem-Wiederholungen (tandem repeats) und Linker werden zur Klarheit durch Striche abgetrennt. Tabelle 4: Bevorzugte Ausführungen
    Figure 00560001
  • "V1" ist eine Fc-Domäne, wie zuvor hier definiert. Zusätzlich zu jenen, die in Tabelle 4 aufgeführt sind, ziehen die Erfinder weiterhin Heterodimere in Betracht, bei denen jeder Strang eines Fc-Dimers mit einer anderen Peptidsequenz verknüpft ist, worin beispielsweise jedes Fc mit einer anderen, aus Tabelle 2 ausgewählten Sequenz, verknüpft ist.
  • Alle Verbindungen dieser Erfindung können durch Verfahren hergestellt werden, die in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/25044 beschrieben werden.
  • Die Erfindung wird nun durch die folgenden Arbeitsbeispiele weiter beschrieben werden, die der Veranschaulichung und nicht einer Beschränkung dienen.
  • BEISPIEL 1
  • Peptide
  • Peptid-Phagen-Display
  • 1. Herstellung von magnetischen Beads
  • A. Fc-TALL-1-Immobilisierung an magnetischen Beads
  • Das rekombinante Fc-TALL-1-Protein wurde an den Protein A-Dynabeads (Dynal) in einer Konzentration von 8 μg Fc-TALL-1 pro 100 μl der Bead-Stammlösung des Herstellers immobilisiert. Durch Ziehen der Beads auf eine Seite eines Röhrchens unter Verwendung eines Magneten und durch Abpipettieren der Flüssigkeit wurden die Beads zweimal mit der phosphatgepufferten Salzlösung (phosphate buffer saline, PBS) gewaschen und in PBS resuspendiert. Das Fc-TALL-1-Protein wurde zu den gewaschenen Beads in der oben angegeben Konzentration gegeben und unter Rotation eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die mit Fc-TALL-1 beschichteten Beads wurden dann durch Zugeben von Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) in einer Endkonzentration von 1% blockiert und über Nacht bei 4°C unter Rotation inkubiert. Die sich ergebenden, mit Fc-TALL-1 beschichteten Beads wurden dann zweimal mit PBST (PBS mit 0,05% Tween-20) gewaschen, bevor sie den Auswahlverfahren unterworfen wurden.
  • B. Bead-Herstellung durch negative Selektion
  • Es wurden auch weitere Beads für negative Selektionen hergestellt. Für jede Versuchsbedingung wurden 250 μl der Bead-Stammlösung des Herstellers dem oben beschriebenen Verfahren (Abschnitt 1A) unterworfen mit der Ausnahme, dass der Inkubationsschritt mit Fc-TALL-1 weggelassen wurde. In dem letzten Waschschritt wurden die Beads in fünf Aliquots zu 50 μl aufgeteilt.
  • 2. Selektion eines TALL-1 bindenden Phagen
  • A. Gesamtstrategie
  • Zwei Bibliotheken mit filamentösen Phagen, TN8-IX (5 × 109 unabhängige Transformanten) und TN12-I (1,4 × 109 unabhängige Transformanten) (Dyax Corp.) wurden verwendet, um einen TALL-1 bindenden Phagen auszuwählen. Jede Bibliothek wurden entweder einer pH 2-Elution oder einer „Bead-Elution" (Abschnitt 2E) unterworfen. Deshalb wurde das TALL-1-Projekt unter vier verschiedenen Versuchsbedingungen durchgeführt (TN8-IX unter Verwendung der pH 2-Elutionsmethode, TN8-IX unter Verwendung der Bead-Elutionsmethode, TN12-I unter Verwendung der pH 2-Elutionsmethode und TN12-I unter Verwendung der Bead-Elutionsmethode). Es wurden drei Selektionsrunden unter jeder Bedingung durchgeführt.
  • B. Negative Selektionen
  • Für jede Versuchsbedingung wurden 100 zufällige Bibliotheksäquivalente (5 × 1011 pfu für TN8-IX und 1,4 × 1011 pfu für TN12-I) aus der Bibliothek-Stammlösung aliquotiert und auf 300 μl mit PBST verdünnt. Nachdem die letzte Waschlösung aus dem ersten 50 μl-Aliquot der Beads, die für negative Selektionen (Abschnitt 1B) hergestellt worden waren, abgezogen worden war, wurden die 300 μl verdünnte Bibliothek-Stammlösung zu den Beads gegeben. Die sich ergebende Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Der Phagenüberstand wurde unter Verwendung des Magnets abgezogen und für einen weiteren negativen Selektionsschritt zu dem zweiten 50 μl-Aliquot gegeben. Auf diese Weise wurden fünf negative Selektionsschritte durchgeführt.
  • C. Selektion unter Verwendung der mit Fc-TALL-1-Protein beschichteten Beads
  • Der Phagenüberstand nach dem letzten Selektionsschritt (Abschnitt 1B) wurde zu den mit Fc-TALL-1 beschichteten Beads nach dem letzten Waschschritt (Abschnitt 1A) gegeben. Die Mischung wurde unter Rotation zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, was einem bestimmten Phagen erlaubte, an das Zielprotein zu binden. Nachdem der Überstand verworfen worden war, wurden die Beads siebenmal mit PBST gewaschen.
  • D. pH 2-Elution von gebundenem Phagen
  • Nach dem letzten Waschschritt (Abschnitt 2C) wurden die gebundenen Phagen von den magnetischen Beads eluiert, indem 200 μl CBST (50 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid, 0,05% Tween-20, pH 2) zugegeben wurden. Nach fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit, die den eluierten Phagen enthielt, abgezogen und in ein anderes Röhrchen überführt. Der Elutionsschritt wurde wieder wiederholt, indem 200 μl CBST zugegeben wurden und der Ansatz fünf Minuten inkubiert wurde. Die Flüssigkeiten von zwei Elutionsschritten wurden zusammengeführt und es wurden 100 μl 2 M Tris-Lösung (pH 8) zugegeben, um den pH-Wert zu neutralisieren. Es wurden 500 μl einer Min A-Salzlösung (60 mM K2HPO4, 33 mM KH2PO4, 7,6 mM (NH4)SO4 und 1,7 mM Natriumcitrat) zugegeben, um ein Endvolumen von 1 ml herzustellen.
  • E. „Bead-Elution"
  • Nach dem letzten Waschschritt wurde Flüssigkeit abgezogen (Abschnitt 2C), und es wurde 1 ml Min A-Salzlösung zu den Beads gegeben. Die Bead-Mischung wurde direkt zu einer konzentrierten Bakterienprobe zur Infektion gegeben (Abschnitt 3A und 3B).
  • 2. Amplifikation
  • A. Herstellung von Zellen zum Ausplattieren
  • Eine frische E. coli-Kultur (XL-1 Blue MRF') wurde bis zu einer Dichte von OD600 = 0,5 in LB-Medium, das 12,5 μg/ml Tetracyclin enthielt, wachsen gelassen. Für jede Versuchsbedingung wurden 20 ml dieser Kultur auf Eis abgekühlt und zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 1 ml der Min A-Salzlösung resuspendiert.
  • B. Transduktion
  • Jede Mischung, die aus verschiedenen Elutionsverfahren (Abschnitt 2D und 2E) gewonnen wurde, wurde zu einer konzentrierten Bakterienprobe (Abschnitt 3A) gegeben und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Es wurden 2 ml NZCYM-Medium (2XNZCYM, 50 μg/ml Ampicillin) zu jeder Mischung gegeben, und die Ansätze wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die sich ergebende Lösung von 4 ml wurde auf einer großen NZCYM-Agarplatte, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • C. Phagenernte
  • Jede der Bakterien/Phagen-Mischung, die über Nacht auf einer großen NZCYM-Agarplatte (Abschnitt 3B) wachsen gelassen wurde, wurde abgekratzt und in 35 ml LB-Medium überführt, und die Agarplatte wurde weiter mit zusätzlichen 35 ml LB-Medium gespült. Die sich ergebende Bakterien/Phagen-Mischung in LB-Medium wurde zentrifugiert, um die Bakterien durch Pelettieren zu entfernen. Es wurden 50 ml des Phagenüberstands in ein frisches Röhrchen überführt, und es wurden 12,5 ml PEG-Lösung (20% PEG 8000, 3,5 M Ammoniumacetat) zugegeben, und der Ansatz wurde auf Eis zwei Stunden inkubiert, um die Phagen zu präzipitieren. Die präzipitierten Phagen wurden abzentrifugiert und in 6 ml des Phagenresuspensionpuffers (250 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) resuspendiert. Diese Phagenlösung wurde durch Abzentrifugieren der verbleibenden Bakterien und Präzipitieren des Phagens zum zweiten Mal durch Zugeben von 1,5 ml der PEG-Lösung weiter gereinigt. Nach einem Zentrifugationsschritt wurde das Phagenpellet in 400 μl PBS resuspendiert. Die Lösung wurde einer letzten Zentrifugation unterworfen, um den verbleibenden Bakteriendebris zu entfernen. Die sich ergebende Phagenpreparation wurde durch einen Standardtest zur Plaquebildung titriert (Molecular Cloning, Maniatis et al., dritte Auflage).
  • 3. Zwei weitere Selektions- und Amplifikationsrunden
  • In der zweiten Runde wurde der amplifizierte Phage (1010 pfu) aus der ersten Runde (Abschnitt 3C) als Ausgangsphage verwendet, um die Selektions- und Amplifikationsschritte durchzuführen (Abschnitte 2 und 3). Der amplifizierte Phage (1010 pfu) aus der zweiten Runde wurde wiederum als der Ausgangsphage verwendet, um eine dritte Selektions- und Amplifikationsrunde (Abschnitte 2 und 3) durchzuführen. Nach den Elutionsschritten (Abschnitte 2D und 2E) der dritten Runde wurde eine kleine Fraktion des eluierten Phagen wie bei dem Plaquebildungstest (Abschnitt 3C) ausplattiert. Es wurden einzelne Plaques gepickt und in 96-Well-Mikrotiterplatten, die in jedem Well 100 μl TE-Puffer enthielten, überführt. Diese „Masterplatten" wurden in einem Inkubator bei 37°C eine Stunde inkubiert, um den Phagen zu ermöglichen, in den TE-Puffer zu eluieren.
  • 4. Klonanalyse (Phagen-ELISA und Sequenzierung)
  • Die Phagenklone wurden durch Phagen-ELISA und Sequenzierungsverfahren analysiert. Die Sequenzen wurden auf der Grundlage der kombinierten Ergebnisse aus diesen beiden Tests eingestuft.
  • A. Phagen-ELISA
  • Eine XL-1 Blue MRF'-Kultur wurde wachsen gelassen, bis die Dichte eine OD600 von 0,5 erreichte. Es wurden 30 μl dieser Kultur in jedes Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte aliquotiert. 10 μl von eluiertem Phagen (Abschnitt 4) wurden zu jedem Well gegeben, und man ließ den Phagen die Bakterien 15 Minuten lang bei Raumtemperatur infizieren. Es wurden 130 μl LB-Medium, das 12,5 μg/ml Tetracycline und 50 µg/ml Ampicillin enthielt, zu jedem Well gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Man ließ das rekombinante TALL-1-Protein (1 µg/ml in PBS) die 96-Well-Maxisorp-Platten (NUNC) über Nacht und bei 4°C beschichten. Als eine Kontrolle ließ man das rekombinante Fc-Trail-Protein eine getrennte Maxisorb-Platte in derselben molaren Konzentration wie das TALL-1-Protein beschichten.
  • Am folgenden Tag wurden die Flüssigkeiten in den proteinbeschichteten Maxisorp-Platten verworfen, und jedes Well wurde mit 300 µl einer 2%igen BSA-Lösung bei 37°C eine Stunde blockiert. Die BSA-Lösung wurde verworfen, und die Wells wurden dreimal mit der PBST-Lösung gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden 50 µl PBST zu jedem Well der mit Protein beschichteten Maxisorp-Platten gegeben. Jede der 50 µl Übernachtkulturen in der 96-Well-Mikrotiterplatte wurde in korrespondierende Wells der mit TALL-1 beschichteten Platten ebenso wie in mit Fc-Trail beschichtete Kontrollplatten übeführt. Die 100 µl-Mischungen in den zwei Arten von Platten wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit auf den Maxisorp-Platten wurde verworfen, und die Wells wurden fünfmal mit PBST gewaschen. Der HRP-konjugierte anti-M13-Antikörper (Pharmacia) wurde 1:7500 verdünnt, und es wurden 100 µl der verdünnten Lösung zu jedem Well der Maxisorp-Platten zur einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur gegeben. Die Flüssigkeit wurde wieder verworfen, und die Wells wurden siebenmal mit PBST gewaschen. Es wurden 100 µl Tetramethylbenzidin-(TMB)Substrat (Sigma) zu jedem Well gegeben, damit sich eine Farb reaktion entwickelte, und die Reaktion wurde mit 50 µl der 5 N H2SO4-Lösung abgestoppt.
  • Die OD450 wurde auf einem Plattenlesegerät (Molecular Devices) abgelesen.
  • B. Sequenzierung der Phagenklone
  • Für jeden Phagenklon wurde die Sequenzierungsmatrize durch ein PCR-Verfahren hergestellt.
  • Das folgende Oligonukleotid-Paar wurde verwendet, um ungefähr 500 Nukleotidfragmente zu amplifizieren:
    Figure 00620001
  • Die folgende Mischung wurde für jeden Klon hergestellt.
    Reagenzien Volumen (µl)/Röhrchen
    dH2O 26,25
    50% Glycerin 10
    10 × PCR-Puffer (ohne MgCl2) 5
    25 mM MgCl2 4
    10 mM dNTP-Mischung 1
    100 µM Primer 1 0,25
    100 µM Primer 2 0,25
    Taq-Polymerase 0,25
    Phage in TE (Abschnitt 4) 3
    Reaktions-Endvolumen 50
  • Der Thermocycler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) wurde verwendet, um das folgende Programm ablaufen zu lassen: 94°C für fünf Minuten; [94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 45 Sekunden] × 30 Zyklen; 72°C für sieben Minuten; Abkühlung auf 4°C. Das PCR-Produkt wurde überprüft, indem 5 µl von jedem PCR- Reaktionsansatz auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen wurden. Das PCR-Produkt in den verbleibenden 45 µl von jedem Reaktionsansatz wurde unter Verwendung des QIAquick Multiwell PCR Purification Kit (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt. Das sich ergebende Produkt wurde dann unter Verwendung des ABI 377 Sequenziergeräts (Perkin-Elmer) nach Anleitung des Herstellers sequenziert.
  • 5. Einstufen von Sequenzen und Bestimmung von Konsensus-Sequenzen
  • A. Einstufen von Sequenzen
  • Die Peptidsequenzen, die von unterschiedlichen Nukleotidsequenzen (Abschnitt 5B) translatiert wurden, wurden mit ELISA-Daten korreliert. Die Klone, die eine hohe OD450 in den mit TALL-1 beschichteten Wells und eine niedrige OD450 in den mit Fc-Trail beschichteten Wells zeigten, wurden als die wichtigeren betrachtet. Die Sequenzen, die mehrfach auftraten, wurden ebenfalls als wichtig betrachtet. Sequenzkandidaten wurden auf der Grundlage dieser Kriterien zur weiteren Analyse als Peptide oder Peptibodies ausgewählt. Fünf und neun Peptidsequenzkandidaten wurden aus den Bibliotheken TN8-IX bzw. TN12-I auswählt.
  • B. Bestimmung von Konsensus-Sequenzen
  • Der Hauptanteil von Sequenzen, die aus der Bibliothek TN12-I ausgewählt wurden, enthielt ein sehr konserviertes DBL-Motiv. Dieses Motiv wurde auch in Sequenzen beobachtet, die aus der Bibliothek TN8-IB ausgewählt wurden. Ein anderes Motiv, PFPWE (SEQ ID Nr. 110) wurde auch in Sequenzen, die aus der Bibliothek TN8-IB erhalten wurden, beobachtet.
  • Ein Konsensus-Peptid, FHDCKWDLLTKQWVCHGL (SEQ ID Nr. 58), wurde auf der Grundlage des DBL-Motivs entworfen. Da Peptide, die sich von der Bibliothek TN12-I ableiteten, die aktivsten waren, wurden die auf der Grundlage der oben angegebenen Einstufungskriterien (Abschnitt 5A) die besten 26 Peptidsequenzen mit dem DBL-Motiv abgeglichen. Die unterstrichene „Aminosäurekernsequenz" wurde durch Bestimmen der Aminosäure, die in jeder Position am häufigsten auftrat, erhalten. Die beiden Cysteine, die den Kernsequenzen benachbart waren, waren festgelegte Aminosäuren in der TN12-I-Bibliothek. Der Rest der Aminosäuresequenz in dem Konsensus-Peptid wird von einem der Peptidkandidaten, TALL-1-12-10 (Tabelle 2, SEQ ID Nr. 37), genommen. Das Peptid und der Peptibody, die von die ser Konsensus-Sequenz abgeleitet wurden, waren in dem B-Zell-Proliferationstest am aktivsten.
  • BEISPIEL 2
  • Peptibodies
  • Ein Satz von 12 inhibitorischen TALL-1-Peptibodies (Tabelle 5) wurde konstruiert, in denen ein Monomer jedes Peptids im Leseraster mit der Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert wurde. Jeder inhibitorische TALL-1-Peptibody wurde durch ein „Annealing" der in Tabelle 6 gezeigten Oligonukleotidpaare konstruiert, um einen Doppelstrang zu erzeugen, welcher das Peptid und einen Linker, der fünf Glycinreste und einen Valinrest umfasste, als ein NdeI bis SalI-Fragment kodiert. Diese doppelsträngigen Moleküle wurden in einen Vector (pAMG21–RANK-Fc, hier beschrieben), der das menschliche Fc-Gen enthielt, ebenfalls mit NdeI und SalI verdaut, ligiert. Die sich ergebenden Ligationsmischungen wurden durch Elektroporation in Zellen von E. coli Stamm 2596 (GM221, hier beschrieben) transformiert. Die Klone wurden auf die Fähigkeit, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen und die Genfusion mit der korrekten Nuldeotidsequenz zu besitzen, durchsucht. Ein solcher einzelner Klon wurde für jeden der Peptibodies ausgewählt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Fusionsproteine werden in den 4A bis 4F gezeigt. Tabelle 5: Peptidsequenzen und Oligonukleotide, die verwendet wurden, um inhibitorische TALL-1-Peptibodies zu erzeugen.
    Figure 00640001
    Tabelle 5B: Inhibitorische TALL-I-Peptibodies
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    Tabelle 6: Sequenzen von Oligonukleotiden, die zur Peptibody-Konstruktion verwendet wurden.
    Figure 00670001
    Figure 00680001
  • pAMG21-RANK-Fc-Vektor
  • pAMG21. Das Expressionsplasmid pAMG21 (ATCC-Zugangsnr. 98113) kann von dem Amgen-Expressionsvektor pCFM1656 (ATCC-Nr. 69576) abgeleitet werden, der wiederum von dem in dem U.S.-Patent Nr. 4,710,473 beschriebenen Amgen-Expressionsvektorsystem abgeleitet wird. Das pCFM1656-Plasmid kann von dem beschriebenen Plasmid pCFM836 ( U.S.-Patent Nr. 4,710,473 ) durch folgende Vorgehensweise abgeleitet werden:
    • • Zerstören der beiden endogenen NdeI-Schnittstellen durch Auffüllen der Enden mit T4-Polymerase-Enzym, gefolgt durch Ligation der stumpfen Enden;
    • • Ersetzen der DNA-Sequenz zwischen den einzigartigen Schnittstellen AatII und ClaI, welche den synthetischen PL-Promotor enthält, durch ein ähnliches Fragment, das von pCFM636 (Patent Nr. 4,710,473), welches den PL-Promotor (siehe SEQ ID Nr. 95 unten) enthält, erhalten wurde; und
    • • Substituieren der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einzigartigen Schnittstellen ClaI und KpnI durch das Oligonukleotid, welches die Sequenz von SEQ ID Nr. 96 aufweist.
    SEQ ID Nr. 95:
    Figure 00680002
    SEQ ID Nr. 96:
    Figure 00690001
  • Das Expressionsplasmid pAMG21 kann dann von pCFM1656 abgeleitet werden, indem eine Reihe von ortsgerichteten Basenaustauschen durch Mutagenese durch PCR mittels überlappender Oligonukleotide sowie Substitutionen in der DNA-Sequenz vorgenommen werden.
  • Beginnend mit der BglII-Schnittstelle (Plasmid bp Nr. 180) direkt 5' zu dem Replikationspromotor PcopB des Plasmids und fortfahrend in Richtung auf die Replikationsgene des Plasmids, sind die Änderungen der Basenpaare wie in Tabelle 7 unten gezeigt. Tabelle 7: Basenpaaränderungen, die zu pAMG21 führen
    pAMG21 bp Nr. bp in pCFM1656 bp in pAMG21 geändert zu
    Nr. 204 T/A C/G
    Nr. 428 A/T G/C
    Nr. 509 G/C A/T
    Nr. 617' -- Einfügung von zwei G/C bp
    Nr. 679 G/C T/A
    Nr. 980 T/A C/G
    Nr. 994 G/C A/T
    Nr. 1004 A/T C/G
    Nr. 1007 C/G T/A
    Nr. 1028 A/T T/A
    Nr. 1047 C/G T/A
    Nr. 1178 G/C T/A
    Nr. 1466 G/C T/A
    Nr: 2028 G/C bp-Deletion
    Nr. 2187 C/G T/A
    Nr. 2480 A/T T/A
    Nr. 2499–2502 AGTG TCAC GTCA CAGT
    Nr. 2642 TCCGAGC AGGCTCG 7 bp-Deletion
    Nr. 3435 G/C A/T
    Nr. 3446 G/C A/T
    Nr. 3643 A/T T/A
  • Die DNA-Sequenz zwischen den einzigartigen Schnittstellen AatII (Position Nr. 4364 in pCFM1656) und SacII (Position Nr. 4585 in pCFM1656) wird durch die unten angegebene DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 97) substituiert:
    Figure 00710001
    Figure 00720001
  • Während der Ligation der überhängenden Enden dieser DNA-Substitionssequenz werden die äußeren Schnittstellen AatII und SacII zerstört. Es gibt einzigartige AatII- und SacII-Schnittstellen in der substituierten DNA.
  • Ein Gen, welches menschliches RANK, fusioniert mit dem N-Terminus von Fc, kodiert, wurde in pAMG21 als ein NdeI- bis BamHI-Fragment ligiert, um den Amgen-Stamm Nr. 4125 zu erzeugen. Dieses Konstrukt wurde modifiziert, um ein Valinkodon an der Verbindung von RANK und Fc einzufügen. Die benachbarten Valin- und Aspartatkodons schaffen eine einzigartige SalI-Schnittstelle. Diese erlaubt die Fusion von Peptiden an dem N-Terminus von Fc3 zwischen den einzigartigen Schnittstellen NdeI und SalI. Die RANK-Sequenz wird nach Einfügung des neuen NdeI-SalI-Fragments deletiert. Die Sequenz des Vektors wird in 5A bis 5M wiedergegeben.
  • GM 221 (Amgen Nr. 2596). Der Amgen-Wirtsstamm Nr. 2596 ist ein E. coli K-12-Stamm, der vom Amgen-Stamm Nr. 393 abgeleitet wurde, der ein Derivat von E. coli W1485 ist, der von dem E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut (CGSC Stamm 6159) erhalten wurde. Er ist modifiziert worden, um sowohl den temperaturempfindlichen lambda-Repressor cI859s7 in der frühen ebg-Region als auch den lacIQ-Repressor in der späten ebg-Region (68 Minuten) zu enthalten. Das Vorhandensein dieser beiden Repressorgene erlaubt die Verwendung dieses Wirts mit einer Vielfalt von Expressionssystemen, wobei jedoch beide Repressoren für die Expression von luxPR bedeutungslos sind. Der nicht transformierte Wirt weist keine Resistenz gegenüber Antibiotika auf.
  • Die Ribosomen-Bindungsstelle des cI857s7-Gens ist modifiziert worden, um eine verstärkte RBS zu beinhalten. Sie ist in das ebg-Operon zwischen den Nukleotid-Positionen 1170 und 1411, wie in der Genbank-Zugangsnr. M64441Gb_Ba nummeriert, mit einer Deletion der dazwischen liegenden ebg-Sequenz eingefügt worden. Die Sequenz des Inserts wird unten gezeigt, wobei klein gedruckte Buchstaben die ebg-Sequenzen darstellen, welche das unten gezeigte Insert (SEQ ID Nr. 98) flankieren:
    Figure 00730001
  • Das Konstrukt wurde an das Chromosom unter Verwendung eines rekombinaten Phagen, der als MMebg-cI857s7enhancedRBS Nr. 4 bezeichnet wurde, in F'tet/393 abgegeben. Nach Rekombination und Auftrennung verbleibt nur das oben beschriebene chromosomale Insert in der Zelle. Sie erhielt den neuen Namen F'tet/GM101. F'tet/GM101 wurde dann durch die Abgabe eines lacIQ-Konstrukts in das ebg-Operon zwischen den Nukleotid-Positionen 2493 und 2937, wie in der Genbank-Zugangsnr. M64441Gb_Ba nummeriert, mit der Deletion in der dazwischen liegenden ebg-Sequenz modifiziert. Die Sequenz des Inserts wird unten gezeigt, wobei die klein gedruckten Buchstaben die ebg-Sequenzen darstellen, welches das unten gezeigte Insert (SEQ ID Nr. 99) flankieren:
    Figure 00730002
  • Das Konstrukt wurde an das Chromosom unter Verwendung eines rekombinanten Phagen, der als AGebg-LacIQ Nr. 5 bezeichnet wurde, in F'tet/GM101 abgegeben. Nach Rekombination und Auftrennung verbleibt nur das oben beschriebene chromosomale Insert in der Zelle. Sie erhielt den neuen Namen F'tet/GM221. Der Stamm wurde von dem F'tet-Episom unter Verwendung von Acridinorange in einer Konzentration von 25 µg/ml in LB kuriert. Der kurierte Stamm wurde als tetracyclinempfindlich identifiziert und als GM221 gelagert.
  • Expression in E. coli. Kulturen von jedem der pAMG21-Fc-Fusionskonstrukte in E. coli GM221 wurden bei 37°C in Luria Broth-Medium wachsen gelassen. Eine Induktion der Expression des Genprodukts von dem luxPR-Promotor wurde nach der Zugabe des synthetischen Autoinduktors N-(3-Oxohexanoyl)-DL-homoserinlakton zu den Kulturmedien in einer Endkonzentration von 20 ng/ml erreicht. Die Kulturen wurden bei 37 C weitere drei Stunden inkubiert. Nach drei Stunden wurden die Bakterienkulturen durch Mikroskopie auf das Vorhandensein von Einschlusskörperchen (inclusion bodies) untersucht und wurden dann durch Zentrifugation gesammelt. Refraktile Einschlusskörperchen wurden in induzierten Kulturen beobachtet, was anzeigte, dass die Fc-Fusionen am wahrscheinlichsten in der unlöslichen Fraktion in E. coli erzeugt wurden. Die Zellpellets wurden direkt durch Resuspension im Laemmli-Probenpuffer, der 10% β-Mercaptoethanol enthielt, lysiert und durch SDS-PAGE analysiert. In jedem Fall wurde eine mit Coomassie intensiv gefärbte Bande von geeignetem Molekulargewicht auf einem SDS-PAGE-Gel beobachtet.
  • BEISPIEL 3
  • TALL-1-Peptibody hemmt die durch TALL-1 vermittelte B-Zellproliferation
  • Mäuse-B-Lymphozyten wurden aus C57BL/6-Milzen durch negative Selektion isoliert (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Gereinigte (105) B-Zellen wurden in MEM, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 µl/ml Streptomycin in Dreifachansätzen in 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten mit 10 ng/ml TALL-1-Protein und 2 µg/ml Ziege-F(ab')2-anti-Maus-IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) mit der angegebenen Menge an rekombinantem TALL-1-Peptibody über einen Zeitraum von 4 Tagen bei 37°C, 5% CO2 kultiviert. Die Proliferation wurde durch die Aufnahme von radioaktivem 3[H]Thymidin nach einer 18-stündigen Inkubationsdauer gemessen.
  • BEISPIEL 4
  • TALL-1-Peptibody blockiert die Bindung von TALL-1 an seinen Rezeptor
  • Reacti-Gel 6× (Pierce) wurden mit menschlichem AGP3 (auch als TALL-1 bekannt, Khare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3370–3375, 2000) vorbeschichtet und mit BSA blockiert. Es wurden Proben mit 100 pM und 40 pM AGP3-Peptibody mit den angegebenen verschiedenen Konzentrationen an menschlichem AGP3 bei Raumtemperatur 8 Stunden vor einem Lauf durch die mit menschlichem AGP3 beschichteten Beads inkubiert. Die Menge an Peptibody, die an die Beads gebunden war, wurde durch fluoreszenzmarkierten (Cy5) Ziege-anti-Mensch-Fc-Antikörper (Jackson Immun Research) quantifiziert. Das Bindungssignal ist proportional zu der Konzentration an freiem Peptibody am Gleichgewichtspunkt der Bindung. Die Dissoziationsgleichsgewichtskonstante (KD) wurde aus einer nicht-linearen Regressionsanalyse der Kompetitionskurven unter Verwendung eines homogenen Bindungsmodells „dual-curve one-site" (KinExTM Software) erhalten. Die KD beträgt 4 pM für die Bindung von AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) mit AGP3 (9).
  • Um zu bestimmen, ob dieser AGP3-Peptibody die Bindung von Mäuse-AGP3 ebenso neutralisieren kann wie die von menschlichem AGP3, wurde ein BIAcore-Neutralisierungstest verwendet. Alle Experimente wurden mit einem BIAcore 3000 bei Raumtemperatur durchgeführt. Menschliches TACI-Fc-Protein (Xia et al., J. Exp. Med. 192, 137–144, 2000) wurde an einem B1-Chip unter Verwendung von 10 mM Acetat pH 4,0 in einer Menge von 2900 RU immobilisiert. Eine leere Durchflusszelle wurde als Hintergrundskontrolle verwendet. Unter Verwendung eines Laufpuffers aus PBS (ohne Calcium oder Magnesium), der 0,005% P20 enthielt, wurde 1 nM rekombinantes menschliches AGP3 (im Laufpuffer plus 0,1 mg/ml BSA) ohne und mit den angegebenen verschiedenen Mengen an AGP3-Peptibody (x-Achse) vor Injektion über die Oberfläche des Rezeptors inkubiert. Eine Regeneration wurde unter Verwendung von 8 mM Glycin pH 1,5 für eine Minute, 25 mM 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure (CAPS) pH 10,5, 1 M NaCl für eine Minute durchgeführt. Zur Bestimmung der Bindung von Mäuse-AGP3 wurde menschliches TACI, versehen mit „His-Tags", an 1000 RU in dem oben beschriebenen Puffers immobilisiert. Es wurden 5 nM rekombinantes Mäuse-AGP3 (im Laufpuffer plus 0,1 mg/ml BSA) ohne und mit den in 11 angegebenen verschiedenen Mengen an AGP3-Peptibody (x-Achse) vor Injektion über die Oberfläche des Rezeptors inkubiert. Eine Regeneration wurde mit 10 mM HCl pH 2 zweimal für 30 Sekunden durchgeführt. Es wurde die relative Bindung sowohl von menschlichem AGP3 als auch von Mäuse-AGP3 in Gegenwart vs Fehlen von AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) gemessen (y-Achse). Es wurde die relative Bindungsantwort als (RU-RU leer/RUo-RU leer) bestimmt. Der AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) hemmte die Bindung sowohl von menschlichem AGP3 als auch Mäuse-AGP3 an deren Rezeptor TACI (10A und 10B).
  • Um zu bestimmen, ob dieser AGP3-Peptibody die Bindung von AGP3 an alle drei Rezeptoren (TACI, BCMA und BAFFR) blockiert, wurden rekombinante Proteine der löslichen Rezeptoren TACI, BCMA und BAFFR an einem CM5-Chip immobilisiert. Unter Verwendung von 10 mM Acetat, pH 4, wurde menschliches TACI-Fc an 6300 RU, menschliches BCMA-Fc an 5000 RU und BAFFR-Fc an 6300 RU immobilisiert. Es wurde 1 nM rekombinantes menschliches AGP3 (in Laufpuffer, der 0,1 mg/ml BSA und 0,1 mg/ml Heparin enthielt) oder 1 nM rekombinantes APRIL-Protein (Yu, et al., Nat. Immunol., 1: 252–256, 2000) mit der angegebenen Menge an AGP3-Peptibody vor Injektion über jede Rezeptoroberfläche inkubiert. Eine Regeneration für das AGP3-Experiment wurde mit 8 mM Glycin, pH 1,5, für eine Minute, gefolgt von 25 mM CAPS, pH 10,5, 1 M NaCl, für eine Minute durchgeführt. Eine Regeneration für das APRIL-Experiment wurde mit 8 mM Glycin, pH 2, für eine Minute, gefolgt von 25 mM CAPS, pH 10,5, 1 M NaCl, für eine Minute durchgeführt. Es wurde die relative Bindung von AGP3 oder APRIL gemessen. Der AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) blockierte die Bindung von AGP3 an alle drei Rezeptoren (11A). Der AGP3-Peptibody beeinflusste die Bindung von APRIL an die Rezeptoren nicht (11B).
  • BEISPIEL 5
  • AGP3-Peptibody blockiert die durch AGP3 vermittelte B-Zellproliferation
  • Mäuse-B-Lymphozyten wurden aus C57BL/6-Milzen durch negative Selektion isoliert (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Gereinigte (105) B-Zellen wurden in Minimalmedium (minimal essential medium, MEM), 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (fetal calf serum, FCD), 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, in Dreifachansätzen in 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten mit 10 ng/ml AGP3-(TALL-1)Protein und 2 µg/ml Ziege-F(ab')2-anti-Maus-IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) mit der angegebenen Menge an rekombinantem AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) über einen Zeitraum von vier Tagen bei 37°C, 5% CO2 kultiviert. Die Proliferation wurde durch Aufnahme von radioaktivem 3[H]Thymidine nach einer 18-stündigen Inkubationsdauer gemessen.
  • BEISPIEL 6
  • Wirkung von AGP3-Peptibody auf die durch AGP3 stimulierte Ig-Produktion in Mäusen
  • Mäuse (Balb/c-Weibchen im Alter von 9–14 Wochen und mit einem Gewicht von 19–21 g) wurden von den Charles River Laborstories, Wilmington, MA bezogen. Die Mäuse (n = 10) wurden i. p. mit 1 mg/kg menschlichem AGP3 einmal täglich über fünf aufeinander folgende Tage behandelt, gefolgt durch 5 mg/kg oder 0,5 mg/kg AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) oder durch Salzlösung oder durch 5 mg/kg menschliches Fc. Andere Mäuse wurden unbehandelt gelassen. Die Mäuse wurden am sechsten Tag getötet, um IgM und IgA in Serum zu messen, was durch ELISA gemessen wurde. Kurz gesagt, wurden die Platten mit „Capture"-Antikörpern, die für IgM und IgA spezifisch waren (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), beschichtet, blockiert, und es wurden Verdünnungen eines Standards (IgM von Calbiochem, San Diego, CA und IgA von Southern Biotechnology Associates) oder Testproben zugegeben. Gebundenes Ig wurde unter Verwendung von biotinylierten Antikörpern, die für IgM oder IgA spezifisch waren (Southern Biotechnology Associates), Neutravidin-konjugierter Peroxidase (Pierce, Rockford, IL) und Tetramethylbenzidin-(TMB)Microwell-Peroxidasesubstrat (KPL, Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die optischen Dichten wurden in einem Thermomax ELISA-Lesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, Ca) quantifiziert.
  • Der durch menschliches AGP3 stimulierte Anstieg der Serumspiegel an IgM und IgA wurde durch 5 mg/kg des anti-AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123), nicht jedoch durch 0,5 mg/kg, blockiert (12A und 12B).
  • BEISPIEL 7
  • AGP3-Peptibody verminderte die Milz-B-Zellzahl in Mäusen
  • Es wurden Mäuse (wie oben, n = 7) i. p. über sieben aufeinander folgende Tage mit 5 mg/kg oder 1,5 mg/kg oder 0,5 mg/kg AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) oder mit Salzlösung oder mit 5 mg/kg menschlichem Fc behandelt. Die Mäuse wurden am achten Tag getötet, um die Anzahl an Milz-B-Zellen zu bestimmen. Die Milzen wurden in Salzlösung gesammelt und sanft durch manuelle Homogenisierung auseinander gerissen, um eine Zellsuspension zu ergeben. Die Gesamtzellzahl wurde mit einem H1E-Zählgerät (Technicon, Tarrytown, NY) erhalten. Die prozentualen Anteile von B-Zellen wurden durch Immunfluoreszenz-Doppelfärbung und Durchflusscytometrie unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat-(FITC) konjugiertem und Phycoerythrin-(PE) konjugiertem Antikörper gegen CD3 bzw. B220 (PharMingen, San Diego, CA) und eines FACScan-Analysegerät (Becton and Dickinson, Mountain View, CA) hergeleitet. Die B-Zellen, die CD3-B200+ waren, wurden identifiziert. Bei allen Dosen verringerte der AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) die Anzahl an Milz-B-Zellen auf eine dosisabhängige Weise (12A und 12B) (SEQ ID Nr. 123).
  • Eine Behandlung mit AGP3-Peptibody verringerte die Anzahl von B-Zellen in Mäusen. Balb/c-Mäuse erhielten sieben tägliche intraperitoneale Injektionen der angegebenen Menge an AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) oder menschlichem Fc-Protein. Am Tag 8 wurden die Milzen gesammelt und einer FACS-Analyse auf B220+-B-Zellen unterworfen, wie in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8: AGP3-Pb verringert die B-Zellzahl in normalen Mäusen
    n = 7 Dosis (1/Tagx7) Milz-B-Zellen (1 × 106) SD t-Test
    Salzlösung 51,3 9,6
    Fc 5 mg/kg 45,5 7,1
    Peptibody 5 mg/kg 20,1 3,8 1,37856–5
    1,5 mg/kg 22,6 6,9 5,10194–5
    0,5 mg/kg 25,8 3,6 0,000111409
  • BEISPIEL 8
  • AGP3-Peptibody verringerte die Schwere einer Arthritis im CIA-Mäusemodell
  • Es wurden 8–12 Wochen alte DBA/1-Mäuse (erhalten von den Jackson Laborstories, Bar Harbour, ME) durch Injektion von Rinderkollagen Typ II (bovine collagen type II, bCII) (bezogen von der University of Utah), emulgiert. in komplettem Freund'schem Adjuvanz (Difco), intradermal in die Schwanzwurzel immunisiert. Jede Injektion betrug 100 µl, worin 100 µg bCII enthalten waren. Die Mäuse erhielten drei Wochen nach der ersten Immunisierung eine Verstärkungsimpfung mit bCII, emulgiert in komplettem Freund'schen Adjuvanz (sie wurden „geboosted"). Die Behandlung wurde am Tag der „Boost"-Immunisierung begonnen und vier Wochen fortgesetzt. Die Mäuse wurden auf die Entwicklung einer Arthritis untersucht. Wie zuvor beschrieben (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653–9, 1995), wurden alle vier Pfoten einzeln nach einer Punktzahl von 0. bis 3 bewertet. Deshalb konnte die Schwere der Arthritis von 0 bis 12 von Tier zu Tier variieren. Eine Behandlung mit AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) verringerte die Schwere der Arthritis-Punktzahl signifikant (13).
  • Es wurden Serumproben eine Woche nach der letzten Behandlung (Tag 35) zur Analyse des anti-Kollagen-Antikörperspiegels entnommen. Hochbindende ELISA-Platten (Immulon, Nunc) wurden mit 50 µl einer Lösung von 4 µg/ml Rinder-CII in Carbonatpuffer beschichtet, und die Platten wurden über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Die Platten wurden dreimal mit kaltem Wasser gewaschen. Es wurden 75 μl einer Blockierungslösung, hergestellt aus PBS/0,05% Tween 20/1% BSA, für eine Stunde verwendet, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. Die Proben wurden in Verdünnungsplatten 1:25, 1:100, 1:400 und 1:1600 verdünnt (in Blockierungspuffer), und 25 µl dieser Proben wurden zu jedem Well der ELISA-Platte für eine Endverdünnung von 100, 400, 1600 und 6400 mit einem Endvolumen von 100 µg/Well gegeben. Nach drei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal erneut gewaschen. Es wurden 100 µl sekundärer Antikörper, verdünnt in Blockierungspuffer (Ratte-anti-Maus-IgM, -IgG2a, -IgG2b, -IgG1, -IgG3-HRP), zu jedem Well gegeben und die Platten wurden mindestens zwei Stunden inkubiert. Die Platten wurden viermal gewaschen. Es wurden 100 µl einer TMB-Lösung (Sigma) zu jedem Well gegeben, und die Reaktion wurde unter Verwendung von 50 µl 25% Schwefelsäure abgestoppt. Die Platten wurden unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts bei 450 nm gelesen. Die OD wurde mit einem Standardpool, der Units/ml darstellt, verglichen. Die Behandlung mit AGP3- Peptibody (SEQ ID Nr. 123) verringerte die Serumspiegel an anti-Kollagen II-IgG1, -IgG3, -IgG2a und -IgG2b im Vergleich zu Kontrollgruppen, die mit PBS oder Fc behandelt worden waren (14).
  • BEISPIEL 9
  • Behandlung mit AGP3-Peptibody in NZB/NZW-Lupus-Mäusen
  • Fünf Monate alte NZB×NZBWF1-Mäuse, die zu Lupus neigten, wurden i. p. dreimal wöchentlich über acht Wochen mit PBS oder den angegebenen Dosen an AGP3-Peptibody oder menschlichen Fc-Proteinen behandelt. Vor der Behandlung wurden die Tiere vorab auf Protein im Urin mit Albustix-Reagenzstreifen (Bayer AG) untersucht. Mäuse, die mehr als 100 mg/dl Protein im Urin aufwiesen, wurden nicht in die Studie aufgenommen. Das Protein im Urin wurde monatlich über die gesamte Zeit des Experiments ausgewertet. Eine Behandlung mit AGP3-Peptibody (SEQ ID Nr. 123) führte zu einer Verzögerung des Beginns einer Proteinurie und verbesserte das Überleben (15A und 15B). SEQUENCE LISTING
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    Figure 02650001
    Figure 02660001
    Figure 02670001
    Figure 02680001
    Figure 02690001
    Figure 02700001
    Figure 02710001
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    Figure 02800001
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    Figure 02830001
    Figure 02840001
    Figure 02850001
    Figure 02860001
    Figure 02870001
    Figure 02880001
    Figure 02890001

Claims (31)

  1. Zusammensetzung, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel
    Figure 02900001
    wobei f1‚ f2 und f3 entweder fehlen oder Aminosäurereste sind, f5 W, Y oder F ist, f7 ein Aminosäurerest ist, f9 oder I ist, f10 K, R oder H ist, f12 C, ein neutraler hydrophober Rest oder ein basischer Rest ist, vorzugsweise W, C oder R, f13 ein neutraler hydrophober Rest ist oder fehlt, und f14 irgendein Aminosäurerest ist oder fehlt, unter der Bedingung, dass nur einer von f1, f2 und f3 C sein kann, und nur einer von f12, f13 und f14 C sein kann.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei f7 L ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei f9 T ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei f10 K ist.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei f12 C ist und einer von f1, f2 oder f3 C ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei f13 V ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel
    Figure 02900002
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend SEQ ID Nr. 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147–150, 152–177, 179, 180 und 187.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel
    Figure 02910001
  10. Zusammensetzung mit der Formel (X1)a-V1-(X2)b und Multimeren davon, wobei V1 eine Fc-Domäne ist, X1 and X2 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus -(L1)c-P1, -(L1)c-P1-(L2)d-P2, -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3, und -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4, wobei einer oder mehrere von P1, P2, P3 und P4 jeweils unabhängig voneinander f1f2f3Kf5Df7Lf9f10Qf12f13f14 (SEQ ID Nr. 109), wie in Anspruch 1 definiert, umfassen, L1, L2, L3 und L4 jeweils unabhängig voneinander Linker sind, und a, b, c, d, e und f jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, unter der Bedingung, dass mindestens einer von a und b 1 ist.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 10 mit der Formel P1-(L1)c-P2-(L2)d-V1.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 10 mit der Formel V1-(L1)c-P1-(L2)d-P2.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei V1 eine IgG-Fc-Domäne ist.
  14. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei V1 eine IgG1-Fc-Domäne ist.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei V1 die Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei f5 W ist, f7 L ist, f10 K ist, und f13 V ist.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei einer oder mehrere von P1, P2, P3 und P4 jeweils unabhängig voneinander
    Figure 02920001
    umfassen.
  18. Zusammensetzung nach Anspruch 17 mit der Formel P1-(L1)c-P2-(L2)d-V1.
  19. Zusammensetzung nach Anspruch 17 mit der Formel V1-(L1)c-P1-(L2)d-P2.
  20. Zusammensetzung nach Anspruch 17 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 122, 123 und 124.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei L2 größer als 5 Aminosäuren ist.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei L2 ausgewählt ist aus
    Figure 02920002
    wobei x1 und x3 jeweils unabhängig voneinander basische oder hydrophobe Reste sind, und x2 und x4 jeweils unabhängig voneinander hydrophobe Reste sind.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei L2 ausgewählt ist aus
    Figure 02920003
    Figure 02930001
  24. DNA, kodierend für eine Zusammensetzung nach Anspruch 13.
  25. Expressionsvektor, umfassend die DNA nach Anspruch 24.
  26. Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 25.
  27. Zelle nach Anspruch 26, wobei die Zelle eine E. coli-Zelle ist.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 10 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer B-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheit.
  29. Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei die B-Zell-vermittelte Autoimmunkrankheit Lupus ist.
  30. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 10 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von B-Zell-vermitteltem Krebs.
  31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der B-Zell-vermittelte Krebs ein B-Zell-Lymphom ist.
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