DE60223047T2

DE60223047T2 - Verfahren zur herstellung von aktivierten polyethylenglykolen

Info

Publication number: DE60223047T2
Application number: DE60223047T
Authority: DE
Inventors: Marie-Pierre Ville St-Laurent FAURE; Michel Montreal IBEA
Original assignee: Bioartificial Gel Technologies Inc
Current assignee: Bioartificial Gel Technologies Inc
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: CA2457876A1; CA2457876C; EP1419191B1; US20050080206A1; US7125558B2; ATE376020T1; EP1419191A1; DE60223047D1; WO2003018665A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die schnelle Herstellung von aktivierten Polyethylenglykolen oder PEG(NPC)²s. Spezifischer, die vorliegende Erfindung befasst sich mit einem Verfahren für die Herstellung von aktivierten PEGs, das kürzere Reaktionszeiten, niedrigere Reaktionstemperaturen und das Gestatten der prompten Wiedergewinnung von den aktivierten PEGs durch eine einfache Extraktionsmethode beinhaltet. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von aktivierten PEGs, wobei stöchiometrische Mengen von den Reagenzien verwendet werden. Die Erfindung erstreckt sich ferner auf die aktivierten PEGs, die durch dieses schnelle Verfahren hergestellt werden, und ihre Verwendung in einer Vielzahl von pharmazeutischen, medizinischen, kosmetischen und chemischen Anwendungen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Polyethylenglykol (PEG) ist ein Polymer, das die Struktur H(O-CH₂CH₂-)_n-OH aufweist. Es wird üblicherweise durch die Ringöffnungs-Polymerisation von Ethylenoxid synthetisiert. Während das Polymer gewöhnlicherweise eine lineare Struktur bei Molekulargewichten < 10 kDa aufweist, können die höhermolekulargewichtigen PEGs einen gewissen Grad an Verzweigung besitzen¹. Polyethylenglykole mit unterschiedlichen Molekulargewichten sind kürzlich in einer Anzahl von Anwendungen verwendet worden, einschließlich der Verbesserung der Löslichkeit von Arzneimitteln. Während der letzten drei Jahrzehnte ist Polyethylenglykol eingehend hinsichtlich der Zuführung von verschiedenen Proteinen über die parenteralen Routen untersucht worden. Im Allgemeinen sind PEGs am meisten für die Zuführung sowohl von traditionellen Arzneimitteln (kleinen Molekülen) als auch Proteinen/Enzymen in der Behandlung von Krebs verwendet worden.
Verschiedene chemische Verfahren sind für die Herstellung von aktivierten PEGs entwickelt worden, die dann verwendet werden können zur spezifischen Reaktion, unter milden wässrigen Bedingungen, mit den freien Aminogruppen an der Oberfläche von einem Enzym. PEGs sind erfolgreich durch die Umsetzung mit 1,1-Carbonyl-diimidazol, Cyanurchlorid, Tresylchlorid, 2,4,5-Trichlorphenyl-chlorformiat oder 4-Nitrophenyl-chlorformiat, verschiedenen N-Hydroxy-succinimid-Derivaten sowie durch die Moffatt-Swern-Reaktion aktiviert worden. ^2–10 In den meisten Fällen agieren die aktivierenden Reagenzien als ein Verbindungsstück zwischen dem PEG und dem Enzym oder Protein.
Einer von den hauptsächlichen Nachteilen, die bei den Prozessen, die gegenwärtig verfügbar sind, angetroffen werden, bezieht die Reaktionstemperaturen ein, bei denen die Aktivierungsreaktionen durchgeführt werden. Die am häufigsten gebrauchten Lösemittel sind Acetonitril (CH₃CN) und Dichlormethan (CH₂Cl₂), die geringe Volumen an Co-Lösemitteln, üblicherweise Triethylamin (TEA), enthalten. Wenn Acetonitril verwendet wird, werden die Aktivierungsreaktionen normalerweise unter Rückflussbedingungen bei einer Temperatur von etwa 84°C durchgeführt oder bei einer Temperatur von etwa 40°C, wenn Dichlormethan als das Lösemittel ausgesucht wird.
Mehrere Kristallisierungsschritte werden üblicherweise für die Isolierung und Reinigung von dem aktivierten PEG-Produkt benötigt. Solche Schritte können die gegenwärtig verfügbaren Verfahren für die Aktivierung von PEGs beschwerlich machen.
Die Aktivierung von PEGs mit 4-Nitrophenychlorformiat zur Erzeugung von PEG-dinitrophenylcarbonaten ist durch Fortier und Laliberté beschrieben worden. ¹⁰ Die Reaktionen wurden in Acetonitril, das Triethylamin (TEA) enthielt, über einen Zeitraum von 5 Stunden bei 60°C durchgeführt. Die langen Reaktionszeiten und die Reaktionstemperaturen, die benötigt werden, um die Aktivierungsreaktionen auszuführen, sind die hauptsäch lichen Nachteile von diesem Prozess. Zusätzlich wird, um das System so wasserfrei wie möglich zu halten, die Verwendung einer schwerfälligen Soxhlet-Apparatur benötigt. Dies verleiht dem Aktivierungsprozess eine ernsthafte Einschränkung, besonders wenn er auf einen größeren Maßstab übertragen wird.
Es gibt demzufolge einen Bedarf für ein preisgünstiges Verfahren für die Aktivierung von PEGs, das zeitlich effizient ist und bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann. Es gibt ebenfalls einen Bedarf für ein Verfahren, das die schnelle Isolierung und Reinigung von den aktivierten PEGs gestattet.
Darüber hinaus besteht ein Bedarf für ein Verfahren zur Aktivierung von PEG, das für die Produktion im großtechnischen Maßstab zugänglich ist.
Die vorliegende Erfindung versucht diesen und anderen Bedürfnissen zu entsprechen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren für die Aktivierung von PEGs, das durch einen verbesserten Wirkungsgrad der Reaktion und durch verbesserte Reaktionsbedingungen gekennzeichnet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren für die Aktivierung von PEGs, das durch die Verwendung von stöchiometrischen Mengen an Reagenzien gekennzeichnet ist und das einen hohen Grad der Aktivierung bereitstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein neuartiges Verfahren für die Aktivierung von PEGs, das ferner durch niedrige Herstellungskosten gekennzeichnet ist und das leicht zugänglich ist für die Produktion im großtechnischen Maßstab.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren für die Isolierung und die Reinigung von den hergestellten aktivierten PEGs, das durch eine wirkungsvolle Extraktions- und Ausfällungs-Prozedur gekennzeichnet ist.
Gemäß einem Aspekt von der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von aktivierten Polyethylenglykolen (PEGs) bereitgestellt, welches das Umsetzen von Polyethylenglykol (PEG) mit einem Aktivator in der Gegenwart von einer aromatischen, stickstoffhaltigen heterozyklischen Base umfasst, wobei die aromatische, stickstoffhaltige heterozyklische Base Dimethylaminopyridin (4-DMAP) ist und worin der Aktivator die allgemeine Struktur Y-Q-X aufweist und kann ausgewählt werden aus, ist aber nicht darauf beschränkt, der Gruppe bestehend aus ClSO₂Cl, ClCOCH₂SO₂Cl, 4-O₂NPhOCOCl, 2-O₂NPhOCOCl, PhOCOCl, Cl₂O₂CH₂CH₂SO₂Cl, POCl₃, PhOPOCl₂, PhPOCl₂, CCl₃COCl, CBr₃COCl und XbPhOCOCl, wobei X und Y identisch oder unterschiedlich sein können und eine elektronenziehende Gruppe repräsentieren und worin „b" eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist.
Wenn nichts anderes festgelegt ist, besitzen die hierin verwendeten wissenschaftlichen und technologischen Bezeichnungen und die Nomenklatur dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann verstanden werden. Im Allgemeinen sind Verfahren wie Extraktion, Präzipitation und Rekristallisation übliche Methoden, die auf dem Fachgebiet verwendet werden. Solche Standardtechniken können in den Referenzmanualen wie zum Beispiel Gordon und Ford (The Chemist's Companion: A handbook of Practical Data, Techniques and References, John Wiley & Sons, New York, NY, 1972) gefunden werden.
Die vorliegende Beschreibung bezieht sich auf eine Zahl oder routinemäßig verwendete chemische Bezeichnungen. Nichtsdestoweniger werden Definitionen von ausgewählten Bezeichnungen zur Verdeutlichung und Konsistenz bereitgestellt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „aprotisches Lösemittel" auf ein Lösemittel, das kein saures Proton besitzt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „elektronenziehende Gruppe" auf einen Substituenten an einem aromatischen Ring, der Elektronen aus dem aromatischen Ring durch induktive Wirkungen und/oder Resonanzwirkungen entzieht.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „etwa" auf eine +/– 5% Variation von dem Nominalwert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Formel PEG(NPC)² auf ein Polyethylenglykol, das doppelt mit einer 4-Nitrophenylcarbonat-Gruppe aktiviert ist.
Der weitere Bereich der Anwendbarkeit wird durch die detaillierte Beschreibung offensichtlich, die anschließend hierin gegeben wird. Es sollte jedoch verstanden werden, dass diese detaillierte Beschreibung, während sie auf bevorzugte Ausführungsformen hinweist, nur als eine Veranschaulichung gegeben ist, da verschiedene Änderungen und Modifikationen dem Fachmann augenscheinlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 repräsentiert ein Blockdiagramm, welches den Grad der PEG-Aktivierung in Verfahren darstellt, in denen DMAP beziehungsweise TEA verwendet werden, mit 4-Nitrophenylchlorformiat als Aktivator und unter Verwendung von stöchiometrischen Mengen von allen Reagenzien. Die Aktivierungsreaktionen wurden in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur durchgeführt.
2 repräsentiert ein Blockdiagramm, welches die Ausbeuten an aktiviertem PEG darstellt, das sowohl durch die DMAP- als auch TEA-Verfahren unter Verwendung von 4-Nitrophenylchlorformiat als Aktivator hergestellt wurde und unter Verwendung von stöchiometrischen Mengen von allen Reagenzien. Die Aktivierungsreaktionen wurden in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur durchgeführt.
3 repräsentiert ein Blockdiagramm, welches den Grad der Gelierung von den aktivierten PEGs darstellt, die sowohl durch die DMAP- als auch TEA-Verfahren unter Verwendung von 4-Nitrophenylchlorformiat als Aktivator hergestellt wurden und unter Verwendung von stöchiometrischen Mengen von allen Reagenzien. Die Aktivierungsreaktionen wurden in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur durchgeführt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem weiteren Sinn stellt die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren für die Aktivierung von PEGs bereit, das durch verbesserte Reaktionszeiten und Reaktionsbedingungen gekennzeichnet ist und das leicht für die Produktion im großtechnischen Maßstab zugänglich ist, während sie geringe Her stellungskosten aufrecht erhält.
Es wurde die Aktivierung von PEG unter Verwendung verschiedener Aktivierungsreagenzien untersucht, während eine aromatische, stickstoffhaltige heterozyklische Base, spezifischer Dimethylaminopyridin (DMAP) zugegen war. Die Aktivierungsreaktionen wurden in einem aprotischen Lösungsmittelsystem durchgeführt, vorzugsweise zusammengesetzt aus Methylenchlorid (CH₂Cl₂). Die Aktivierungsreaktionen wurden unter Verwendung von stöchiometrischen Mengen an PEG, einem Aktivierungsreagenz wie 4-Nitrophenylchlorformiat und 4-DMAP durchgeführt und bei Temperaturen ausgeführt, die von etwa 20 bis etwa 30°C reichen und insbesondere bei Raumtemperatur.
Das aprotische Lösemittel, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DMSO, DMF, Acetonitril, Nitromethan, HMPA, Aceton, Essigsäureanhydrid, Pyridin, o-Dichlorbenzol, Chlorbenzol, Benzol, Toluol, Xylen, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, THF, Dioxan, Ethylacetat, DME und Schwefelkohlenstoff. Diese aprotischen Lösemittel weisen einen Siedepunkt auf, der von etwa 35°C bis etwa 230°C reicht.
Das einzig signifikante Nebenprodukt, das in dem Aktivierungsprozess erzeugt wird, ist das Hydrochloridsalz von DMAP. Dieses Salz kann wirkungsvoll aus der Rektionsmischung durch einfache Extraktions- und Filtrationsverfahren entfernt werden. Diese unkomplizierte Reinigungsmethode ermöglicht die Isolierung von einem sehr reinen aktivierten PEG-Produkt. Es ist zu beachten, dass, während die Reaktion unter stöchiometrischen Bedingungen durchgeführt wird, jedes nicht umgesetzte Reagenz ebenfalls aus der Reaktionsmischung durch die oben angeführten Reinigungsverfahren entfernt werden kann.
Der PEG-Aktivierungsprozess von der vorliegenden Erfindung kann angemessen durch die folgende allgemeine Reaktionssequenz beschrieben werden:
Gleichung 1 wobei M ein Wasserstoffatom darstellt und „a" gleich 2 ist.
Der Aktivator Y-Q-X ist zur in situ Erzeugung von Ionen fähig, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Acylium, Sulfonium, Sulfurylium und Phosphonium; X und Y können H, Cl, Br, I oder andere Fluchtgruppen sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Mesylate, Tosylate und Phenoxide; X und Y könne beide identisch oder verschieden sein und „n" ist eine ganze Zahl, die im Bereich von 4 bis 800 und vorzugsweise von 65 bis 800 liegt, d. h. einem Molekulargewicht von PEG, das von 3.000 bis 35.000 Da reicht; und Q kann ein Teil sein, ist aber nicht darauf beschränkt, von der Gruppe bestehend aus -SO₂-, -CO (CHR₁)_tSO₂-, -CO-, -SO₂(CHR₁)_tSO₂-, – SO₂-O-(CHR₁)_t-O-SO₂, >PO, -CO-O-(CHR₁)_t-CR₂=CR₃-(CHR₄)_t-O-CO- und -SO₂-O-(CHR₁)_t-CR₂=CR₃-(CHR₄)_t-O-SO₂-, wobei „t" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 1 bis 3 liegt und wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ entweder identisch oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, niederem Alkyl, niederem verzweigten Alkyl, Aryl und Aralkyl. Insbesondere werden R₁, R₂, R₃ und R₄ aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl und Propyl ausgewählt. Insbesondere kann Q ein Teil sein, ist aber nicht darauf beschränkt, von der Gruppe bestehend aus -SO₂-, -CO-O-CH₂-CH=CH-CH₂-O-CO-, COCH₂SO₂-, -CO- und -SO₂CH₂CH₂SO₂-.
Spezifischer, Q kann wiedergegeben werden durch die allgemeine Formel 1: Q = (U₀)_n0 – [(Q₀)_n1(CHR₁)_n2 – (Q1)_n3]_p – [(R₂C=CR₃)_n4 – (Q₂)_n5]_m – [(CHR₄)_n6 – (Q₃)_n7]_q – (U₁)_n8 Formel 1 wobei Q₀, Q₁, Q₂, und Q₃ identisch oder unterschiedlich sind und ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff- und Schwefelatomen; R₁, R₂, R₃, und R₄ identisch oder unterschiedlich sind und ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, niederes Alkyl, niederes verzweigtes Alkyl, Aryl und Aralkyl; n₁, n₃, n₅ und n₇ ganze Zahlen sind, derart ausgewähl t , dass 0 = n₁ = 1, 0 = n₃ < 1, 0 = n₅ = 1 und 0 = n₇ = 1 sind; U₀ und U₁ identisch oder unterschiedlich sind und ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus -CO-; -SO₂- und >P = 0; n₀ und n₈ ganze Zahlen sind, derart ausgewählt, dass 0 = n₀ = 1 und 0 = n₈ = 1 sind; n₂, n₄ und n₆ ganze Zahlen sind, derart ausgewählt, dass 0 = n₂ = 3, 0 = n₄ = 1 und 0 = n₆ = 3 sind; und wobei p, m und q ganze Zahlen sind, derart ausgewählt, dass 0 = p = 6, 0 = m = 2, 0 = q = 6 und 0 = p + m = 8 sind.
Ausgewählte Beispiele von bevorzugten Aktivatoren (Y-Q-X) beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, folgende:
BEISPIEL 1:

Cl-CO-O-Ph-NO₂
wobei, basierend auf Formel 1 ((n₀ = 1; n₁ = n₂ = n₃ = n₈ = 0; p = 1; m = q = 0), Q = U₀ = -CO- ist und wobei X = Cl und Y = -OPh-NO₂ (4-Nitrophenoxy) sind.

BEISPIEL 2:

Cl-SO₂-O-CH₂-CH₂-O-SO₂-Cl
wobei, basierend auf Formel 1 (n₀ = n₁ = n₃ = n₈ = 1; n₂ = 2; p = 1; m = q = 0; U₀ = U₁ = SO₂; Q_o = Q_t = O (Sauerstoff) ; R, = H), Q = -SO₂-O-CH₂-CH₂-O-SO₂- ist und wobei X = Y = Cl ist.

BEISPIEL 3:

Cl-SO₂-O-CH₂-CH₂-O-CO-Cl
wobei, basierend auf Formel 1 (n₀ = n₁ = n₂ = n₆ = n₇ = n₈ = 1; n₃ = 0; P = q = 1; m = 0; U₀ = SO₂; U₁ = -CO-; Q₀ = Q₃ = 0 (Sau erstoff); R₁ = R₄ = H), Q = SO₂-O-CH₂-CH₂-O-CO- ist und wobei X = Y = Cl ist.

BEISPIEL 4:

Cl-CO-O-CH₂-CH=CH-CH₂-O-CO-Cl
wobei, basierend auf Formel 1 (n₀ = n₁ = n₂ = n₄ = n₆ = n₇ = n₈ = 1; n₃ = n₅ = 0; p = m = q = 1; U₀ = U₁ = -CO-; Q₀ = Q₃ = O (Sauerstoff); R₁ = R₂ = R₃ = R₄, = H), Q = CO-O-CH₂-CH=CH-CH₂-O-CO- ist und wobei X = Y = Cl ist.

Andere Beispiele von Aktivatoren beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, die folgenden: ClSO₂Cl, ClCOCH₂SO₂Cl, 2-O₂NPhOCOCl, PhOCOClPOCl₃, PhOPOCl₂, PhPOCl₂, CCl₃COCl, CBr₃COCl und ZbPhOCOCl, wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, I und -CN und wobei „b" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 1 bis 3 liegt.
Das Aktivierungsverfahren wird in der Gegenwart von einer aromatischen, stickstoffhaltigen heterozyklischen Base, Dimethylaminopyridin (DMAP), durchgeführt.
Die aromatische, stickstoffhaltige heterozyklische Base, Dimethylaminopyridin (DMAP), kann ebenfalls als ein Katalysator (0,01 < a < 1,5) bei Reaktionstemperaturen, die im Bereich von etwa 20°C bis etwa 30°C liegen, insbesondere bei Raumtemperatur, in Gemischen verwendet werden, die stöchiometrische Mengen von einer tertiären Aminbase umfassen, die aus der Gruppe, bestehend aus TEA, TIA, DIEA und 4-Methylmorpholin, ausgewählt sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird demzufolge ein aktiviertes PEG bereitgestellt, das, wie in 3 veranschaulicht, die allgemeine Struktur: Y-Q-O-(CH₂-CH₂-O)n-Q-Y Formel 3 aufweist, wobei Q ausgewählt ist aus, aber nicht darauf beschränkt, der Gruppe bestehend aus -SO₂-, -COCH₂SO₂-, -SO₂CH₂CH₂SO₂-, -CO-O-CH₂-CH=CH-CH₂-O-CO- und -CO-; Y ausgewählt ist aus, aber nicht darauf beschränkt, der Gruppe bestehend aus Cl und 4-O₂NPhO-, und wobei „n" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 4 bis 800 liegt, d. h. ein PEG vorliegt, das ein Molekulargewicht von 200 bis 35.000 Da aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird ein aktiviertes PEG, wie durch die Formel 4 beschrieben, bereitgestellt, wobei Y für Cl steht, Q für -SO₂- steht und „n" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 4 bis 800 liegt, d. h. ein PEG vorliegt, das ein Molekulargewicht von 200 bis 35.000 Da aufweist. Es wird bevorzugt, dass mindestens eine Ausführungsform durch die Struktur in Formel 4 repräsentiert ist.
Formel 4
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird ein aktiviertes PEG, wie durch die Formel 5 beschrieben, bereitgestellt, wobei Y für Cl steht, Q für -COCH₂SO₂- steht und „n" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 4 bis 800 liegt, d. h. ein PEG vorliegt, das ein Molekulargewicht von 200 bis 35.000 Da aufweist. Es wird bevorzugt, dass mindestens eine Ausführungsform durch die Struktur in Formel 5 repräsentiert ist.
Formel 5
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird ein aktiviertes PEG, wie durch die Formel 6 beschrieben, bereitgestellt, wobei Y für Cl steht, Q für -SO₂CH₂CH₂SO₂- steht und „n" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 4 bis 800 liegt, d. h. ein PEG vorliegt, das ein Molekulargewicht von 200 bis 35.000 Da aufweist. Es wird bevorzugt, dass mindestens eine Ausführungsform durch die Struktur in Formel 6 repräsentiert ist.
Formel 6
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird ein aktiviertes PEG, wie durch die Formel 7 beschrieben, bereitgestellt, wobei Y für 4-O₂NPhO- steht, Q für -CO- steht und „n" eine ganze Zahl ist, die im Bereich von 4 bis 800 liegt, d. h. ein PEG vorliegt, das ein Molekulargewicht von 200 bis 35.000 Da aufweist. Es wird bevorzugt, dass mindestens eine Ausführungsform durch die Struktur in Formel 7 repräsentiert ist:
Formel 7
Die aktivierten Polyethylenglykole sind empfänglich für das Umsetzen mit funktionellen Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppen, Amingruppen und Thiolgruppen, was in der Bildung von Biopolymeren resultiert. Die funktionellen Gruppen werden von Peptiden, Proteinen, Sacchariden, Polysacchariden und Oligonukleotiden erhalten. Die Biopolymere werden in chemischen, kosmetischen, kosmezeutischen, pharmazeutischen und dermopharmazeutischen Anwendungen verwendet.
Ein bevorzugtes Aktivierungsverfahren unter Verwendung von 4-DMAP und 4-Nitrophenylchlorformiat ist angemessen durch die Reaktionssequenz beschrieben, die nachfolgend in Schema 1 gezeigt ist: Schema 1
Die Funktion von 4-Nitrophenylchlorformiat ist es, bereitwillig mit dem PEG-Substrat zu reagieren, was in einem aktivierten PEG resultiert, das weiter eingesetzt werden kann, zum Beispiel, in Reaktionen mit Enzymoberflächen. Es wurde als das aktivierende Reagenz hauptsächlich aufgrund seiner Neigung, Nebenreaktionen auf ein Mindestmaß zu reduzieren, ausgewählt.
Die hauptsächliche Funktion von 4-DMAP ist es, den Aktivierungsprozess zu unterstützen. Es wird vermutet, dass es schnell eine reaktivere Zwischenstufe, von der angenommen wird, dass sie ein Acylium-Ion ist, durch die Reaktion mit 4-Nitrophenylchlorformiat bereitstellt. Diese vorübergehende Acylium-Zwischenstufe reagiert dann leicht mit dem PEG im Zuge von einer Aktivierungsreaktion, die bei Raumtemperatur unter stöchiometrischen Bedingungen stattfindet, um das aktivierte PEG in nur 2 Stunden Reaktionszeit herzustellen. Die sekundäre Funktion von 4-DMAP ist, als ein Säurescavenger zu fungieren, das heißt, durch Komplexieren mit der Salzsäure (HCl), die in der Aktivierungsreaktion erzeugt wird, ein Salz zu bilden. Das Abfangen von HCl durch 4-DMAP ist ein wichtiger Schritt in der Reaktionssequenz, da die Gegenwart von HCl zu einer großen Anzahl von ungewollten Nebenreaktionen führen könnte, welche wiederum eine nachteilige Wirkung auf den Gesamtwirkungsgrad von der Aktivierungsreaktion aufweisen würden.
Die Aktivierung von PEG unter Verwendung einer tertiären Aminbase wie Triethylamin (TEA) wurde ebenfalls unter identischen Reaktionsbedingungen untersucht, wie denjenigen, die in dem DMAP-Verfahren eingesetzt wurden, d. h. bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von 2 Stunden, und mit dem DMAP-Aktivierungsverfahren verglichen. Es wurde beobachtet, dass, obwohl 4-Nitrophenylchlorformiat wieder als das aktivierende Reagenz gewählt wurde, der Aktivierungsprozess die Verwendung von einem 3-fachen Überschuss von TEA benötigte und nicht länger bei Raumtemperatur ausgeführt werden konnte. Die Aktivierung von PEG wurde durch Umsetzen der Reaktionsmischung unter Rückfluss in Acetonitril (80°C) über einen Zeitraum von 8 Stunden erreicht.
Die Aktivierung von PEGs unter Verwendung von TEA ist weniger attraktiv als das Verfahren unter Verwendung von DMAP, da ein Umsetzen unter Rückfluss benötigt wird, welches eine fortdauernde Überwachung notwendig macht. Zusätzlich benötigen Umsetzungsverfahren unter Rückfluss schon an sich zusätzliches Material, wie einen Rückfluss-Kondensator oder eine Soxhlet-Apparatur. Wenn die Aktivierungsreaktionen in einem größeren Maßstab durchgeführt werden, kann diese zusätzliche Glasware schnell unhandlich und sehr teuer werden. Die zusätzliche Energieerfordernis ist ebenfalls ein Faktor, der nicht außer Acht gelassen werden kann.
Ein alternatives Aktivierungsverfahren unter Verwendung von Natrium-PEGylat und 4-Nitrophenylchlorformiat ist angemessen durch die Reaktionssequenz beschrieben, die nachstehend in Schema 2 gezeigt ist:
Schema 2
Der Aktivierungsprozess wird leicht durchgeführt, indem zuerst das Natrium-PEGylat hergestellt wird und dann das PE-Gylat mit 4-Nitrophenylchlorformiat umgesetzt wird. Dieser Aktivierungsprozess stellt jedoch nicht eine Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung dar, sondern ist lediglich eine grundlegende Technik, die nützlich ist, um die vorliegende Er findung zu verstehen.

Die Verwendung von einem Überschuss an Reagenzien weist Auswirkungen auf die Isolierungs- und Reinigungsschritte von dem Aktivierungsprozess auf, da diese Reagenzien von dem aktivierten PEG-Produkt entfernt werden müssen. Nach der Vervollständigung von dem TEA-induzierten Aktivierungsprozess ist die Reaktionsmischung hauptsächlich aus aktiviertem PEG, nicht-umgesetzten TEA und 4-Nitrophenylchlorformiat, sowie den Hydrochlorid-(HCl)Salzen von TEA zusammengesetzt. In den vorher beschriebenen Prozessen erforderte die Isolierung von dem aktivierten PEG-Produkt mehrere Präzipitations- oder Kristallisationsschritte, bevor ein relativ sauberes Produkt erhalten wurde. Ein direkter Vergleich zwischen den DMAP-, den TEA- und den Natrium-PEGylat-Aktivierungsverfahren ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Direkter Vergleich von dem DMAP-, dem TEA- und dem PEGylat-induzierten Aktivierungsprozess.

VergleichsElemente	DMAP-Verfahren	TEA-Verfahren	PEGylat-Verfahren
Stickstoffbase	DMAP (4-DMAP)	TEA	Keine Stickstoffbase
Struktur	Pyridin-	Tertiäres Amin	NA
Reaktionsaufbau	Becherglas mit Rührer	Rückfluss oder Soxhlet Apparatur	Becherglas mit Rührer
Aktivator	4-Nitrophenyl chlorformiat	4-Nitrophenyl chlorformiat	4-Nitrophenyl chlorformiat
Reagenzien-Menge	Stöchiometrisch	3-facher Überschuss (sowohl Base als auch Aktivator)	Stöchiometrisch
Lösemittel	CH₂Cl₂	CH₃CN	CH₂Cl₂
Reaktionszeit	2 Stunden	8 Stunden	2 Stunden
Reaktions-Temperatur	21°C	80°C	29°C
Reinigung	Extraktion und Präzipitation	Mehrere Präzipitations-/ Rekristallisations-	Extraktion und Präzipitation
Nebenprodukte	4-DMAP.HCl	TEA.HCl Überschuss an TEA und Aktivator	NaCl
Ausbeute	95%	99% (einschließlich überschüssigen Reagenzien)	97%

Die Rohausbeute von der Aktivierungsreaktion wurde unter Verwendung von Gleichung 2 kalkuliert, wie nachfolgend gezeigt:
Gleichung 2
Es ist zu beachten, dass die Menge an Rohprodukt theoretisch Spuren von nicht-aktiviertem PEG, mono-aktiviertes PEG und di-aktiviertes PEG (gewünschtes Produkt) beinhaltet. In dem Falle von der durch TEA geförderten Aktivierungsreaktion ist das Rohprodukt zusätzlich mit nicht vernachlässigbaren Mengen an TEA.HCl vermischt, sowie nicht umgesetztem 4-Nitrophenylchlorformiat, das nicht vollständig während der Rekristallisations-/Präzipitationsschritte entfernt werden konnte.
Der Grad der Aktivierung wurde unter Verwendung von Gleichung 3 kalkuliert, wie nachfolgend gezeigt:
Gleichung 3
Es ist zu beachten, dass die Menge an p-Nitrophenol, die erzeugt wurde, aus der Hydrolyse von dem rohen Reaktionsprodukt stammt. Die theoretische Menge an p-Nitrophenol, die erwartet werden kann, ist kalkuliert, basierend auf der Annahme, dass eine 100%-ige Umsetzung von PEG in das di-aktivierte PEG stattgefunden hat.
Aktivierungsspiegel, die höher als 100% liegen, können durch das durchgehende Vorhandensein von einem nicht-umgesetzten Überschuss an 4-Nitrophenylchlorformiat in dem rohen Reaktionsprodukt erklärt werden. Dieses nicht umgesetzte Ausgangsmaterial wird nach der Hydrolyse ebenfalls 4-Nitrophenol ergeben und wird somit zu der Menge an 4-Nitrophenol beitragen, die durch die Hydrolyse von dem rohen Reaktionsprodukt, das aus nicht umgesetztem PEG, mono-aktiviertem PEG und dem gewünschten di-aktivierten PEG zusammengesetzt ist, erzeugt wurde. Es ist zu beachten, dass die Gegenwart von 4-Nitrophenol, das eine relativ starke organische Säure ist, wässrige Lösungen ergeben wird, die niedrige pH-Werte aufweisen.
Die sehr hohen Ausbeuten, die für die TEA-Aktivierungsreaktion beobachtet wurden, sind auf die Schwierigkeiten, die dem Reinigungsprozess innewohnen, zurückzuführen. TEA.HCl, sowie überschüssiges p-Nitrophenylchlorformiat, sind insgesamt schwierig aus den Reaktionsmischungen zu entfernen. Sogar wenn eine ausführliche Präzipitation/Rekristallisation durchgeführt wurde, um diese Verunreinigungen aus dem ungereinigten Reaktionsprodukt zu entfernen, blieben nicht vernachlässigbare Mengen zurück. Darüber hinaus resultiert dieser ausführliche Präzipitations-/Rekristallisationsprozess normalerweise in einer deutlichen Abnahme in der Aus beute an aktiviertem PEG.

Einige physikalischen und chemischen Eigenschaften von den aktivierten PEGs, die durch die DMAP-, beziehungsweise TEA-Prozesse hergestellt wurden, werden nachfolgend in Tabelle 2 bereitgestellt: Tabelle 2: Vergleich von einigen physikalischen und chemischen Eigenschaften von den PEGs, die durch das DMAP- und TEA-Verfahren hergestellt wurden.

Eigenschaften	DMAP-Verfahren	TEA-Verfahren
Löslichkeit	> 800 mg/ml	Welche Konzentration auch immer, es wird normalerweise ein
Schmelzpunkt	53–55°C	54–55°C
Färbung	Weiße Festsubstanz Gelbe Lösung (entionisiertes	Weiße Festsubstanz Klare Lösung (entionisiertes
pH-Wert (220 mg/ml H₂O)	Lösung nimmt den pH-Wert von entionisiertem Wasser	Saurer pH = 2 – 3 (in entionisiertem Wasser)

* Das Präzipitat ist hauptsächlich aus nicht umgesetztem 4-Nitraphenylchlorformiat zusammengesetzt.

Die aktivierten PEGs, die durch das DMAP-Verfahren hergestellt wurden, weisen eine sehr gute Wasserlöslichkeit auf, mit Werten, die 800 mg/ml übersteigen.
Die Löslichkeit in entionisiertem Wasser von den PEGs, die durch den TEA-Prozess aktiviert wurden, konnte aufgrund des Auftretens von einem Präzipitat während der Auflösung von dem ungereinigten Produkt nicht genau bestimmt werden. Das Präzipitat ist hauptsächlich aus nicht umgesetztem 4-Nitrophenylchlorformiat zusammengesetzt, das nicht vollständig aus dem ungereinigten Reaktionsprodukt während der Präzipitations-/Rekristallisationsschritte entfernt werden konnte. Zusätzlich wird die Gegenwart von TEA.HCl in der ungereinigten Reaktionsmischung ein Phänomen, das als „Aussalzen" beschrieben wird, verursachen. Diese Phänomen verursacht, dass in ent ionisiertem Wasser ein Anteil von dem Produkt selbst unlöslich wird und in dem Präzipitieren aus der Lösung resultiert.
Das rohe Produkt, das aus dem durch TEA geförderten Prozess erzeugt und auf wiederholte Präzipitations-/Rekristallisationsschritte folgend isoliert wurde, ist im Wesentlichen aus aktiviertem PEG zusammengesetzt, enthält aber ebenfalls geringe Mengen von dem Hydrochloridsalz von TEA (TEA.HCl) und nicht umgesetztes p-Nitrophenylchlorformiat. Es wird angenommen, dass eine nicht vernachlässigbare Menge von dem Hydrochloridsalz von TEA und nicht umgesetztes p-Nitrophenylchlorformiat innerhalb des weitreichenden Netzwerkes, welches das aktivierte PEG bildet, eingeschlossen ist und dementsprechend innerhalb dieses Netzwerkes mit aufgelöst wird.
Die aktivierten PEGs, die durch den DMAP-Prozess hergestellt wurden, erzeugen wässrige Lösungen, die den pH-Wert von dem Lösemittel annehmen und die keine nennenswerte Bildung von Präzipitaten aufweisen. Dies ist ein direkter Hinweis auf die hohe Reinheit von den aktivierten PEGs und bestätigt die Abwesenheit von jeglichem DMAP-Hydrochloridsalz (DMAP.HCl), welches wiederum die Wirksamkeit von den Reinigungs- und Isolierungsschritten von dem Verfahren widerspiegelt.
Rohe, aktivierte PEGs, die durch das TEA-Verfahren hergestellt wurden, erzeugen im Wesentlichen saure wässrige Lösungen mit pH-Werten im Bereich zwischen 2 und 3. Dies konnte angesichts der Möglichkeit, dass das rohe aktivierte PEG-Produkt in der Gegenwart von dem 4-Nitrophenylchlorformiat verbleibt, welches nicht gänzlich durch die Präzipitations-/Rekristallisationsschritte entfernt werden konnte, erwartet werden. Wenn das rohe aktivierte PEG-Produkt, das durch das TEA-Verfahren hergestellt wurde, in Wasser aufgelöst wird, wird ein Anteil von dem durchgängig vorhandenen 4-Nitrophenylchlorformiat in die starke organische Säure 4-Nitrophenol hydrolysiert, bei einer gleichzeitigen Bildung von HCl, was die beobachteten sauren pH-Werte verursacht.
Eine Vergleichsstudie der Wirksamkeit von den DMAP- und den TEA-Verfahren wurde bei Raumtemperatur in CH₂Cl₂ unter Verwendung von stöchiometrischen Bedingungen durchgeführt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, resultiert das DMAP-Aktivierungsverfahren in beträchtlich höheren Aktivierungsgraden bei identischen Zeitintervallen. Tabelle 3: Aktivierungsgrade von rohem PEG, das aus den DMAP- und TEA-Verfahren resultiert, als eine Funktion der Zeit.

Aktivierungsgrad*

Reaktionszeit (Min) DMAP-vermittelte Aktivierung TEA-vermittelte Aktivierungs

30 60,0% 32,0%

60 59,9% 34,5%

90 76,9% 31,7%

120 97,7% 31,3%

* Sowohl die DMAP- als auch die TEA-Reagenzien wurden bei Raumtemperatur in CH₂Cl₂ unter stöchiometrischen Bedingungen verwendet, wobei 4-Nitrophenylchlorformiat als der Aktivator benutzt wurde.

Wie es aus den in der Tabelle 3 dargestellten Ergebnissen leicht ersichtlich wird, ist der durch DMAP vermittelte Aktivierungsprozess beträchtlich wirkungsvoller als der TEAvermittelte Prozess. Tatsächlich ist das gesamte PEG innerhalb von 2 Stunden vom Start der Aktivierungsreaktionen an aktiviert, während hingegen ungefähr nur 30% von dem PEG unter Verwendung von dem TEA-vermittelten Prozess aktiviert ist.
Die Verwendung von stöchiometrischen Mengen von den Reagenzien vereinfacht sehr stark den Reinigungsschritt. Zusätzlich gewährleistet die Verwendung von einer stöchiometrischen Menge an 4-Nitrophenylchlorformiat, dass im Wesentlichen alles von dem verbliebenen, nicht umgesetzten Reagenz während der Extraktions- und Präzipitationsschritte hydrolysiert wird, und demzufolge die Qualität von dem Endprodukt nicht beeinflusst wird.
Die Aktivierungsreaktionen wurden für eine vorgegebene Zeit durchgeführt und dann gestoppt. Die rohen Reaktionsmischungen wurden durch wiederholte Extraktions- und Präzipitationsschritte gereinigt und das so erhaltene Produkt wurde analysiert. Um dies durchzuführen, wurde eine Serie von Reaktio nen über einen Zeitraum von 30, 60, 90 und 120 Minuten laufen lassen, wobei in dem einen Fall DMAP und in dem anderen Fall TEA verwendet wurde. Die resultierenden Produkte wurden anschließend auf ihren Grad der Aktivierung analysiert.
Die Ergebnisse einer weiteren Wirksamkeitsuntersuchung, welche die Ausbeuten von aktiviertem PEG vergleicht, das unter Verwendung von DMAP- und TEA-Verfahren erhalten wurde, sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Ausbeute von rohem aktiviertem PEG, das aus den DMAP- und TEA-Verfahren erhalten wurde, als eine Funktion der Zeit.

Ausbeute %*

Reaktionszeit (Min) DMAP-vermittelter Aktivierungsprozess TEA-vermittelter Aktivierungsprozess

30 57,8 78,9

60 95,8 87,7

90 87,5 83,2

120 93,3 80,8

Wie aus Tabelle 4 festgestellt werden kann, werden relativ ähnliche Ausbeuten für beide Aktivierungsverfahren erhalten.
Die niedrigere Ausbeute, die für das DMAP-Verfahren als Ergebnis von einer 30-minütigen Reaktion beobachtet wird, ist auf den Verlust von dem Rohprodukt zurückzuführen, der während der Extraktions-/Präzipitationsschritte eingetreten ist. Die Ausbeuten nach der Isolierung, die durch das TEA-Verfahren erhalten wurden, sind aufgrund der vorher erwähnten Schwierigkeiten in der wirksamen Entfernung von all dem nicht umgesetzten 4-Nitrophenylchlorformiat aus dem rohen aktivierten PEG-Produkt irreführend. Die Menge an rohem aktivierten PEG, das aus dem TEA-Aktivierungsprozess isoliert wurde, enthält durchgehend nicht unerhebliche Mengen an nicht umgesetzten 4- Nitrophenylchlorformiat, was dementsprechend in den beobachteten höheren Ausbeuten resultierte. Das Vorhandensein von nicht umgesetzten 4-Nitrophenylchlorformiat ist ein Spiegelbild von einem weniger effizienten Aktivierungsprozess, wenn TEA verwendet wird. Der Aktivierungsprozess unter Verwendung von DMAP ist erheblich wirksamer und resultiert in einem im Wesentlichen vollständigen Verbrauch des Aktivierungsreagenz 4-Nitrophenylchlorformiat. Das einzige bedeutende Nebenprodukt, das unter der Verwendung von DMAP hergestellt wird, ist sein entsprechendes Hydrochlorsalz. Das Nebenprodukt wird jedoch aus dem rohen aktivierten PEG-Produkt durch die Extraktions-/Präzipitationsschritte effizient entfernt.
Die Aktivierungsreaktionen wurden wiederum in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur unter Verwendung stöchiometrischer Bedingungen durchgeführt. Eine Reihe von Reaktionen wurde für 30, 60, 90 und 120 Minuten laufen lassen, wobei in einem Fall DMAP und in dem anderen Fall TEA verwendet wurde, und wurden dann auf die Menge von dem aktivierten PEG, das produziert wurde, analysiert.
Die Neigung von den aktivierten PEGS, die durch die TEA- und DMAP-Verfahren hergestellt wurden, in Richtung der Gelierung wurde anschließend untersucht und die Ergebnisse werden in der Tabelle 5 dargestellt. Ein Gelierungsindex von Null deutet auf ein Gel hin, das in einem flüssigen Zustand verbleibt, während hingegen ein Gelierungsindex von Eins auf ein leicht viskös-flüssiges Gel hindeutet (verbleibt in einem im Wesentlichen flüssigen Zustand). Weiterhin ist ein Gelierungsindex von Zwei bezeichnend für ein gallertartiges Gel, welches sehr elastisch und klebrig ist, während hingegen ein Index von Drei für ein weiches Gel bezeichnend ist, das nur leicht klebrig und leicht elastisch ist, und das seine ursprüngliche Form nach der Deformation zurückgewinnt. Ein Gelierungsindex von Vier beschreibt ein festes und nicht-klebriges Gel, das ebenfalls nach der Deformation seine ursprüngliche Gestalt zurückgewinnt. Ein Gelierungsindex von Vier verkörpert den gewünschten physikalischen Zustand für solche Anwendungen wie Hydrogelbildung. Ein Gelierungsindex von Fünf ist schließlich bezeichnend für ein gummiartiges Gel. Die aktivierten PEGs wurden über einen Zeitraum von 1 Stunde den Gelierungs-Bedingungen in einem Teströhrchen ausgesetzt. Tabelle 5: Gelierung von rohem aktiviertem PEG.

Gelierungs-Grad

DMAP-vermittelter Aktivierungsprozess TEA-vermittelter Aktivierungsprozess Zeit (Min)

3 0 30

3 0 60

4 0 90

4 0 120
Eine Gelierung konnte für keines von den aktivierten PEGs, die durch den TEA-vermittelten Aktivierungsprozess hergestellt wurden, beobachtet werden. Die Lösungen, die aktiviertes PEG enthielten, das aus der 30-, 60-, 90-, oder 120-Minuten Aktivierungsreaktion unter Verwendung von TEA resultierte, zeigten keine wahrnehmbare Gelierung und verblieben im Wesentlichen in einem flüssigen Zustand. Die Abwesenheit von irgendeiner merklichen Gelierung ist ein unmittelbares Ergebnis von einem niedrigen Grad der Aktivierung von den rohen aktivierten PEGs, welche durch den TEA-vermittelten Aktivierungsprozess hergestellt wurden.
Eine Gelierung wurde für alle der aktivierten PEGs beobachtet, die durch das DMAP-Verfahren hergestellt wurden. Die Lösungen, die aktiviertes PEG enthielten, welches aus einer 30-, 60-, 90- oder 120-Minuten dauernden Aktivierungsreaktion unter Verwendung von DMAP erzeugt wurde, resultierte in der Bildung von Gelen, die von nachgiebig bis steif reichte. Aktivierte PEGs, welche durch eine Reaktion für 30 oder 60 Minuten hergestellt wurden, resultieren in der Bildung von nachgiebigen Gelen, die leicht klebrig und leicht elastisch sind und die ihre ursprüngliche Form nach einer Deformation zurückgewinnen. Aktivierte PEGs, welche durch eine Reaktion für 90 oder 120 Minuten hergestellt wurden, resultieren in der Bildung von steifen Gelen, die nicht klebrig sind und die ebenfalls ihre ursprüngliche Form nach einer Deformation zurückgewinnen.
Weiterhin weisen diese Gele den gewünschten physikalischen Zustand für solche Anwendungen wie zum Beispiel die Hydrogel-Herstellung auf. Der verbesserte physikalische Zustand von den Gelen, der sich aus den verlängerten Reaktionszeiten ergibt, ist eine unmittelbare Konsequenz von einem gesteigerten Grad der Aktivierung.
Die Schmelzpunkte von den aktivierten PEGs sind ein Hinweis auf ihren Grad der Aktivierung. Wie aus Tabelle 6 entnommen werden kann, weisen die aktivierten PEGs, die durch das DMAP-Verfahren hergestellt wurden, Schmelzpunkte auf, die durchweg niedriger sind als diejenigen von den durch das TEA-Verfahren hergestellten. Tabelle 6: Schmelzpunkte von aktivierten PEGs, die durch den DMAP- und TEA-Aktivierungsprozess hergestellt wurden.

Schmelzpunkts-Bereiche (°C)

DMAP-Verfahren TEA-Verfahren Zeit (Min)

57–59 60–61 30

57–59 59–61 60

56–57 59–60 90

53–55 60–61 120
Der Schmelzpunkt für nicht-aktiviertes PEG liegt zwischen etwa 62–63°C. Da die beobachteten Schmelzpunkte für die aktivierten PEGs, die über das TEA-Aktivierungsverfahren hergestellt wurden, nur leicht niedriger sind, würde dies ein Anzeichen für ihre physikalische Ähnlichkeit sein, was wiederum einen geringen Grad der Aktivierung voraussetzt. Im Falle von dem TEA-Aktivierungsverfahren ist der Schmelzpunkt, der für ein aktiviertes PEG-Produkt, das auf eine 30-minütige Aktivierungsreaktion nachfolgend hergestellt wurde, identisch zu dem von einem PEG-Produkt, das nachfolgend auf eine 120-minütige Aktivierungsreaktion hergestellt wurde. Dies ist in Übereinstimmung mit den in Tabelle 3 beschriebenen Ergebnissen, die auf einen niedrigen Aktivierungsgrad nach einer Reaktion für 30 Minuten hinweisen, mit einer kleinen oder gar keinen Änderung nachfolgend auf eine Reaktion für 120 Minuten.
Die Schmelzpunkte, die für die aktivierten PEGs, die über den DMAP-Aktivierungsprozess hergestellt wurden, beobachtet wurden, sind niedriger als solche, die durch den TEA-Prozess hergestellt wurden, was auf einen höheren Grad der Aktivierung hindeutet. Die aktivierten PEGs, die nachfolgend auf eine 120-minütige Aktivierungsreaktion unter Verwendung des DMAP-Verfahrens hergestellt wurden, weisen einen niedrigeren Schmelzpunkt auf als diejenigen, die nachfolgend auf eine 30-minütige Aktivierungsreaktion hergestellt wurden. Der niedrigere Schmelzpunkt ist ein Hinweis auf einen gesteigerten Grad der Aktivierung durch längere Aktivierungszeiten. Diese Ergebnisse werden wiederum durch die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse untermauert, was die gesteigerte Aktivierung veranschaulicht, wenn von einer 30-minütigen zu einer 120-minütigen Aktivierungsreaktion übergegangen wird.
Die vorliegende Erfindung sorgt für ein Verfahren für die schnelle Aktivierung von PEG. Der Aktivierungsprozess wird in geeigneter Weise bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Stunden durchgeführt, wobei stöchiometrische Mengen von den Reagenzien vorhanden sind. Die aktivierten PEGs der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung von Hydrogelen mittels Kombination von ihnen mit alkalisch hydrolysierten Sojalösungen verwendet werden. Die aktivierten PEGs können ebenfalls als Vernetzer für Harze verwendet werden und sie können leicht mit Proteine verbunden oder mit Enzymoberflächen umgesetzt werden.
EXPERIMENTELLES
1. Gelierungsverfahren
a) Herstellung einer Lösung mit einem 8 kDa aktivierten PEG [PEG-(NPC)²]: (220 mg/mL).
Aktiviertes PEG (8 kDa) wird aus dem Kühlschrank entnommen und langsam auf Raumtemperatur erwärmen lassen, wonach 1,65 g in entionisiertem Wasser (4 mL, pH = 5,5) unter Rühren aufgelöst werden. Die Lösung wird so lange gerührt, bis eine vollständige Auflösung beobachtet wird. Falls es notwendig wird, wird abhängig von dem Quellen von dem aktivierten PEG, das Volumen des entionisierten Wassers auf 7,5 mL ausgeglichen. Dann werden Aliquots (500 μL) zu einer Reihe von Teströhrchen hinzugegeben.
b) Herstellung von einer hydrolysierten Soja-Lösung: (120 mg/mL).
Das hydrolysierte Soja wird aus dem Kühlschrank entnommen und langsam auf Raumtemperatur erwärmen lassen, danach werden 600 mg in jedes von 5 Teströhrchen (15 mL) hineingegeben. Wie nachfolgend in Tabelle 7 dargestellt, wird eine NaOH-Lösung (5 mL), die eine unterschiedliche Normalität aufweist, dann zu jedem Teströhrchen hinzugefügt. Die sich ergebenden Lösungen werden so lange gerührt, bis eine vollständige Auflösung beobachtet wird. Tabelle 7: Herstellung von hydrolysierten Soja-Lösungen unter Verwendung von NaOH-Lösungen mit unterschiedlicher Normalität.

Menge an hydrolysiertem Soja (mg) NaOH Normalität (N) NaOH Volumen (mL)

600 0,11 5

600 0,12 5

600 0,13 5

600 0,14 5

600 0,15 5
c) Hydrogel-Bildung: Kopplung von aktiviertem PEG [PEG-(NPC)²] an hydrolysiertes Soja.
Eine hydrolysierte Soja-Lösung (500 μL) mit einer vorgegebenen Normalität wird pipettiert und ein Chronometer gestartet. Bei t = 10 Sekunden wird die hydrolysierte Soja-Lösung zu einem Teströhrchen hinzugefügt, das eine aktivierte PEG-Lösung (500 μL) enthält, die wie vorher beschrieben hergestellt wurde, während unter Verwendung von einem Vortexer gerührt wird. Das Teströhrchen, das die vereinigten Lösungen enthält wird dann auf seine Seite gelegt, um die Hydrogel-Bildung zu gestatten. Dieses Experiment wird noch zweimal unter Verwendung derselben hydrolysierten Soja-Lösung wiederholt.
Dieselbe Prozedur wird für jede von den vorher beschriebenen hydrolysierten Soja-Lösungen durchgeführt.
2. Herstellung von einem aktivierten PEG unter Verwendung von SO₂Cl₂
Das folgende ist ein Beispiel von einem allgemeinen experimentellen Verfahren für die Herstellung von einem aktivierten PEG unter Verwendung von Sulfurylchlorid als aktivierendem Reagenz.
Die Reaktion wird bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Stunden in wasserfreiem Dichlormethan (CH₂Cl₂) durchgeführt.
Wasserfreies SO₂Cl₂ (1.565 μL; 97%-ige Lösung) wird in wasserfreiem CH₂Cl₂ (25 mL) verdünnt. Die verdünnte Sulfurylchlorid-Lösung wird anschließend in einen Rundkolben (500 mL) überführt und, während gerührt wird, in einem Eisbad gekühlt. Zu dieser gekühlten Lösung wird dann eine vorher hergestellte DMAP-Lösung (2,44 g DMAP wurden in 5 mL wasserfreiem CH₂Cl₂ aufgelöst) hinzugefügt, während das Rühren fortgesetzt wird.
PEG, 8 kDa (36,36 g), wird in wasserfreiem CH₂Cl₂ (50 mL) aufgelöst. Die PEG-Lösung wird dann langsam zu der Lösung hinzugefügt, welche die Sulfurylchlorid- und DMAP-Reagenzien enthält, und in dem Eisbad unter kontinuierlichem Rühren gehalten. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für zusätzliche 2 Stunden gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird konzentriert und das resultierende rohe Festprodukt wird mit kaltem Diethylether (500 mL) extrahiert und präzipitiert. Die Suspension wird danach für einen Zeitraum von 30 Minuten in einen Kühlschrank (–20°C) gestellt. Die Suspension wird dann unter Vakuum filtriert und das Präzipitat mit zusätzlichem Diethylether (3 × 100 mL) gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wird danach unter Vakuum getrocknet.
3. Herstellung von Natrium-PEGylat
Das folgende ist ein Beispiel von einem allgemeinen experimentellen Verfahren für die Herstellung von Natrium-PEGylat. Dieser Prozess stellt jedoch nicht eine Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung dar, sondern ist lediglich eine grundlegende Technik, die nützlich ist, um die vorliegende Erfindung zu verstehen.
Die Reaktion wird bei Raumtemperatur in wasserfreiem Dichlormethan (CH₂Cl₂) unter Verwendung von stöchiometrischen Mengen der Reagenzien durchgeführt.
NaH (0,378 g von einer 60%-igen Dispersion in Mineralöl) wurde in einen Zweihals-Rundkolben gegeben, der mit einem magnetischen Rührer und einem Kühler ausgestattet war. Ein Röhrchen mit CaCl₂ wurde oben auf dem Kühler positioniert. Der Rundkolben wurde dann mit wasserfreiem Dichlormethan (50 mL) beladen.
PEG (-OH)₂, 8 kDa (36,36 g; 4,5 mmol), wurde in wasserfreiem Dichlormethan (50 mL) aufgelöst und die resultierende Lösung wurde danach tropfenweise unter heftigem Rühren zu der NaH-Suspension hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend so lange weiter gerührt, bis keine Wasserstoffgas-Entwicklung mehr beobachtet werden konnte, wonach noch für eine weitere Stunde gerührt wurde.
Die Reaktionsmischung wurde filtriert oder zentrifugiert und die sich ergebende Dichlormethan-Lösung wurde konzentriert. Das resultierende rohe Produkt wurde mit wasserfreiem Diethylether (100 mL) behandelt, was in der Präzipitation von PEG (-ONa)₂ resultierte. Das resultierende Präzipitat wurde mit weiteren Portionen Diethylether (3 × 100 mL) gewaschen und unter Vakuum getrocknet, was die Isolierung von PEG (-ONa)₂ als eine weiße Festsubstanz (35,8 g; 97% Ausbeute) gestattete.
4. Herstellung von aktiviertem Natrium-PEGylat
Das folgende ist ein Beispiel von einem allgemeinen experimentellen Verfahren für die Herstellung von aktiviertem Natrium-PEGylat. Dieser Prozess stellt jedoch nicht eine Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung dar, sondern ist lediglich eine grundlegende Technik, die nützlich ist, um die vorliegende Erfindung zu verstehen.
Die Reaktion wird bei 29°C über einen Zeitraum von 2 Stunden in wasserfreiem Dichlormethan (CH₂Cl₂) durchgeführt.
Wasserfreies SO₂Cl₂ (2,348 mL) wird in wasserfreiem CH₂Cl2 (25 mL) verdünnt. Die verdünnte Sulfurylchlorid-Lösung wird anschließend in einen Zweihalsrundkolben (50 mL) überführt, der mit einem magnetischen Rührer und einem Kühler ausgestattet ist. Ein Röhrchen mit CaCl₂ wurde oben auf dem Kühler positioniert. Die Lösung wurde langsam auf 29°C erwärmt und die genaue Überwachung der Temperatur wurde fortgeführt.
PEG (-ONa)₂, 8 kDa (36,36 g; 4,5 mmol), wurde in wasserfreiem Dichlormethan (50 mL) aufgelöst und die resultierende Lösung wurde danach tropfenweise unter heftigem Rühren zu der SO₂Cl₂-Lösung hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde an schließend für 2 weitere Stunde bei 29°C weiter gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von 5 Volumen Diethylether, der auf 4°C gekühlt war, präzipitiert. Die resultierende Suspension wurde dann für einen Zeitraum von 30 Minuten in einen Kühlschrank (–20°C) gestellt. Die Suspension wird dann unter Vakuum filtriert und das Präzipitat mit zusätzlichem kalten Diethylether (3 × 75 mL) gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wurde anschließend in einem Dichlormethan/Diethylether-Lösungsmittelsystem rekristallisiert.
5. Herstellung von einem aktivierten PEG unter Verwendung von p-Ni trophenylchlorformiat
Das folgende ist ein Beispiel von einem allgemeinen experimentellen Verfahren für die Herstellung von einem aktivierten PEG unter Verwendung von p-Nitrophenylchlorformiat als dem aktivierendem Reagenz.
Die Reaktion wird bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Stunden in wasserfreiem Dichlormethan (CH₂Cl₂) durchgeführt.
PEG, 8 kDa (363,36 g; 45 mmol), wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (500 mL) aufgelöst und p-Nitrophenylchlorformiat (19,63 g) wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (50 mL) aufgelöst. Beide Lösungen wurden dann in ein Reaktionsgefäß (8 L) gegeben und für etwa 1 Minute heftig gerührt. Zu dieser Lösung wurde dann eine vorher hergestellte DMAP-Lösung (12,22 g DMAP wurden in 50 mL wasserfreiem CH₂Cl₂ aufgelöst) hinzugefügt, während das Rühren fortgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung wurde anschließend für 2 weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und unter Verwendung von Diethylether (2,0 L), der auf 4°C gekühlt war, präzipitiert. Die resultierende Suspension wurde dann für einen Zeitraum von 30 Minuten in einen Kühlschrank (–20°C) gestellt. Die Suspension wird dann unter Vakuum filtriert und das Präzipitat mehrere Male mit zusätzlichem kalten Diethylether gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wurde anschließend in Wasser suspendiert, für etwa 30 Minuten heftig gerührt und unter Vakuum filtriert. Das so erhaltene gelbliche Filtrat wurde dann mit Dichlormethan extrahiert (3×) und die vereinigten Lösemittelfraktionen über Na₂SO₄ filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und das resultierende Produkt unter heftigem Rühren unter Verwendung von kaltem Diethylether präzipitiert. Das so erhaltene PEG(NPC)² wurde anschließend filtriert, mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
Die hierin verwendeten Bezeichnungen und Beschreibungen stellen bevorzugte Ausführungsformen dar, welche nur als exemplarische Veranschaulichungen dargelegt sind und nicht beabsichtigen, die vielen Variationen einzuschränken, welche von Fachleuten als geeignet in der Anwendung von der vorliegenden Erfindung erkannt werden.
VERWEISE

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Claims

Ein Verfahren zum Herstellen eines bis-aktivierten Polyethylenglykols, wobei das Verfahren aufweist ein Umsetzen von Polyethylenglykol mit einem Aktivator unter stöchiometrischen Bedingungen in der Gegenwart von Dimethylaminopyridin (4-DMAP), wie es durch Gleichung 1 nachfolgend dargestellt ist: H(O-CH₂-CH₂)_n-OH + 2Y-Q-X + 2W-T = Y-Q-O(CH₂-CH₂-O)_n-Q-Y + 2W-T·HX wobei Polyethylenglykol die Formel H(O-CH₂-CH₂)_n-OH und der Aktivator die Formel Y-Q-X hat, wobei X und Y unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, I, Mesylaten, Tosylaten und Phenoxiden, und Q ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -SO₂-, -C(O)-, -C(O)(CHR₁)_tSO₂-, -SO₂(CHR₁)_tSO₂- , -SO₂O(CHR₁)_tOSO₂-, -C(O)-O-(CHR₁)_t-CR₂=CR₃-(CHR₄)_t-O-C(O)- und -SO₂-O-(CHR₁)_t-CR₂=CR₃-(CHR₄)_t-O-SO₂-; wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einer niederen Alkyl-Gruppe, einer niederen verzweigten Alkyl-Gruppe, einer Aryl-Gruppe und einer Aralkyl-Gruppe; und t eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist; und Dimethylaminopyridin (4-DMAP) die Formel W-T hat, das bis-aktivierte Polyethylenglykol die Formel Y-Q-O-(CH₂-CH₂-O)-Q-Y hat, wobei Y und Q wie oberhalb definiert sind, und n eine ganze Zahl zwischen 4 und 800 ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei n eine ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 65 bis 800, ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einer Methyl-Gruppe, einer Ethyl-Gruppe, einer Isopropyl-Gruppe und einer Propyl-Gruppe.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Q ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SO₂, CO-O-CH₂-CH=CH-CH₂-O-CO, COCH₂SO₂, C(O) und SO₂CH₂CH₂SO₂.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Y-Q-X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 4-O₂N-Ph-O-CO-Cl, Cl-SO₂-O-CH₂-CH₂-O-SO₂-Cl, Cl-SO₂-O-CH₂-CH₂-O-CO-Cl, Cl-CO-O-CH₂-CH=CH-CH₂-O-CO-Cl, Cl-SO₂-Cl, Cl-CO-CH₂-SO₂-Cl, 2-O₂N-Ph-O-CO-Cl, Ph-O-CO-Cl und Z_bPh-O-CO-Cl, wobei Ph eine Phenyl-Gruppe ist, Z ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, I und -CN und b ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 3.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 6, wobei das organische Lösungsmittel ein aprotisches Lösungsmittel ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, wobei das aprotische Lösungsmittel einen Siedepunkt zwischen ungefähr 35°C und 230°C hat.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, wobei das aprotische Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus DMSO, DMF, Acetonitril, Nitromethan, HMPA, Aceton, Essigsäureanhydrid, Pyridin, o-Dichlorbenzol, Chlorbenzol, Benzol, Toluol, Xylen, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, THF, Dioxan, Ethylacetat, DME und Schwefelkohlenstoff.
Ein Verfahren nach Anspruch 9, wobei das aprotische Lösungsmittel Methylenchlorid ist.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20°C und 30°C durchgeführt wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt wird.