DE60223384T2

DE60223384T2 - Amperometrischer biosensor in dickfilmtechnologie

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Publication number: DE60223384T2
Application number: DE60223384T
Authority: DE
Inventors: Alexander Adlassnig; Julius Schuster
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-08-09
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2022-07-13
Also published as: AT410223B; WO2003014378A2; US20040241746A1; WO2003014378A3; EP1414990A2; ATE377653T1; EP1414990B1; ATA12482001A; DE60223384D1; US7442289B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Biosensoren in Dickschichttechnologie zur selektiven Detektion und/oder Bestimmung von enzymkatalytische Reaktionen durchmachenden Substanzen, auf Verfahren zur Herstellung solcher Biosensoren, auf für diese Verfahren geeignete Siebdruckfarben sowie auf die Synthese solcher Druckfarben.
Biosensoren beruhen auf der Kopplung von einer oder mehr biochemisch aktiven Substanzen mit hoher Selektivität (z. B. Enzymen, Antikörpern etc.) mit einem physikalisch-chemischen Aufnehmer und anschließender elektronischer Signalverarbeitung und/oder -anzeige. Amperometrische Sensoren werden für Anwendungen mit niedrigen Nachweisgrenzen (≥ 10^–8 mol/l) und lineare Messbereiche über bis zu 6 Konzentrationsdekaden verwendet. Sie basieren auf heterogenen Elektronentransferreaktionen zwischen den bioaktiven Substanzen und dem Aufnehmer. Die elektrische Kommunikation erfolgt über so genannte Mediatoren. Ein natürlich verfügbarer Kandidat für die Funktion des Mediators ist das Produkt aus der Reaktion zwischen der bioaktiven Substanz und der interessierenden Substanz im Analyt. Bei komplexen Analyten, die zusätzliche elektroaktive Substanzen enthalten, kommt es bei den bekannten Biosensoren zu Signalinterferenzen, wenn diese Substanzen zum Aufnehmer gelangen können. Ein Lösungskonzept für dieses Problem besteht in der Zugabe von alternativen Mediatoren, die eine geringere Überspannung an der Elektrode aufweisen und daher bei niedrigeren Potentialen reagieren als die Störsubstanzen. Die Verwendung solcher alternativer Mediatoren ermöglicht die Verwendung von Grafit als Aufnehmer. Es ist üblich, Grafit, eine bioaktive Substanz und ein Lösungsmittel mit anderen Zusatzstoffen zu verwenden, um eine siebdruckfähige Farbe zu erhalten. Dabei können die Vorteile der Siebdrucktechnik (z. B. Zeichenstrukturierung, wirtschaftliche Massenproduktion etc.) bei der Herstellung der bioaktiven Schicht von Sensoren genutzt werden. Die Verwendung von kleinen, beweglichen Molekülen als alternative Mediatoren bringt jedoch das Problem mit sich, dass diese entweder wasserlöslich sind und daher während der Messung aus der bioaktiven Schicht ausgewaschen werden (z. B. Hexacyanoferrat, Hydrochinon) oder dass sie giftig und somit für in-vivo-Anwendungen bedenklich sind (z. B. Vinylferrocen). Es wurde daher vorgeschlagen, das Problem des Auswaschens durch kovalentes Binden des Mediators an die bioaktive Substanz zu vermeiden ( US-PS 5 804 047 ). Soweit bisher bekannt, weisen jedoch mit diesem Verfahren hergestellte Sensoren einen unzureichenden, kleinen linearen Messbereich auf. Alternativ wurde vorgeschlagen, den Mediator kovalent an den Aufnehmer zu binden ( AT 397512 B ). In diesem Fall kann die bioaktive Schicht jedoch nicht mittels Siebdruck erzeugt werden.
Es gibt ein weiteres Konzept in der Biosensortechnik, bei dem solche alternative Mediatoren (und die damit verbundenen Probleme) vermieden werden: Und zwar werden zusätzliche Membranen entweder zwischen dem Analyt und der bioaktiven Schicht oder zwischen der bioaktiven Schicht und der Elektrode angeordnet. Bei erster Ausführung kann eine wirkungsvolle Diffusionsbarriere (d. h. die Störsubstanzen verändern das Signal innerhalb der Messzeit nicht signifikan) für sämtliche Störsubstanzen außer der interessierenden Substanz im Analyt gebildet werden, bei letzterer für alle Störsubstanzen außer dem Mediator. Zur Bildung einer derartigen wirkungsvollen Diffusionsbarriere reichen Dicken von etwa 100 nm, die typischerweise durch Trocknen von Flüssigkeitsfilmen (welche z. B. durch einmaliges Dip-Coating hergestellt werden) oder Tropfen herstellbar sind, nicht aus. Andererseits gestattet die Dickschichttechnologie die Herstellung von Membranen mit Schichtdicken von ≥ 5 μm in einem einzigen Herstellungsschritt. Wie oben erwähnt, enthalten früher veröffentlichte Dickschicht-Farbformulierungen für bioaktive und/oder biokompatible Schichten in Biosensoren immer Grafit, der zusätzlich als Aufnehmer fungiert. Solche Farben eignen sich daher nicht zur Herstellung einer Diffusionsbarriere zwischen der bioaktiven Substanz und dem Aufnehmer. Ohne Zusatz von Grafit sind bisher beschriebene Formulierungen jedoch nicht siebdruckfähig, und somit kann eine Schicht, die ausreichend dick für die Bildung einer wirkungsvollen Diffusionsbarriere ist, nicht in einem einzigen Herstellungsschritt erhalten werden.
Die EP 0 691 408 offenbart einen unter Verwendung von Dickschichttechnologie hergestellten amperometrischen Biosensor zur Detektion von Glucose, wobei die Arbeitselektrode mittels Siebdruck als zweite Schicht einer UV-polymerisierbaren Enzympaste modifiziert wird, die nach dem Drucken unter Verwendung von UV-Strahlung gehärtet wird.
Die EP 0 652 436 A2 offenbart unter Verwendung von Dickschichttechnologie hergestellte amperometrische Biosensoren, bei denen die bioaktive Schicht durch Siebdruck aufgebracht wird, wobei eine Paste eingesetzt wird, die Grafitpulver enthält, das sehr leitfähig ist.
Die EP 0 987 333 A2 und EP 0 634 488 A2 offenbaren unter Verwendung von Dickschichttechnologie hergestellte amperometrische Biosensoren, bei denen eine Enzymgelschicht oben auf eine mittels Siebdruck hergestellte Leiterbahn aufgebracht wird. Eine Enzymgelschicht/-unterlage selbst wird nicht durch Siebdruck aufgebracht.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte Biosensoren in Dickschichttechnologie zur Verfügung zu stellen. Solche verbesserten Biosensoren sollten vorzugsweise robust, auch in industriellem Maßstab einfach herzustellen und auf besonders bevorzugte Weise grafitfrei sein.
Daher stellt die vorliegende Erfindung einen amperometrischen Biosensor in Dickschichttechnologie zur Detektion und/oder Bestimmung von enzymkatalytische Reaktionen durchmachenden Substanzen, insbesondere Glucose oder Laktat, zur Verfügung, umfassend:

• ein inertes Trägermaterial,
• mindestens eine Aufnehmerschicht mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit von χ > 10⁴ Ω^–1cm^–1, und
• mindestens eine mittels Siebdruck ohne Einsatz von UV-Strahlung aufgebrachte und als Diffusionsbarriere fungierende bioaktive Schicht, die mindestens ein mit der zu messenden Substanz spezifisch reagierendes Enzym enthält, wobei die bioaktive Schicht eine spezifische elektrische Leitfähigkeit von χ < 1 Ω^–1cm^–1 aufweist und weiters andere elektroaktive Substanzen wirkungsvoll daran hindert, die Aufnehmerschicht innerhalb der Messzeit zu erreichen.

Die Erfindung vereinigt die Vorteile von Biosensoren (wie z. B. hohe Spezifität in komplexen Medien) mit den Vorteilen der Dickschichttechnologie (wie z. B. hohe Flexibilität bei der Ausführung des Sensors, einfache Integration in elektrische Schaltungen, Massenfertigung in standardisierter Qualität). Dadurch ist eine wirtschaftliche Produktion von Sensoren zur Anwendung in Lebensmittel-, biologischen, pharmazeutischen und medizinischen Analysen möglich. Weiters kann die Erfindung für Überwachungszwecke eingesetzt werden, die von Körperfunktionen über Bioreaktoren bis zur Umwelt reichen.
Zur Immobilisierung der bioaktiven Substanz(en) (wie z. B. Enzyme) in der bioaktiven Schicht ist es bei Verwendung von einem oder mehr biokompatiblen Polymer(en) und/oder anorganischen Gel(en) möglich, auf Bestandteile in der Druckfarbe zu verzichten, die zur Erzielung der Druckfähigkeit notwendig, aber der Ausbildung einer wirkungsvollen Diffusionsbarriere gegen elektroaktive Störsubstanzen zwischen dem Analyt und den Aufnehmern abträglich sind.
Bei der Herstellung von grafitfreien bioaktiven Schichten in Dickschichttechnologie gemäß der vorliegenden Erfindung kommt es, ohne dass alternative Mediatoren eingesetzt werden müssen, zu keinen Störsignalen, die von anderen in komplexen Analyten vorhandenen elektrodenaktiven Substanzen verursacht werden.
Die Herstellung sämtlicher Sensorschichten einschließlich der bioaktiven Schichten in Dickschichttechnologie gestattet unmittelbar die Strukturierung von miniaturisierten Mehrfachsensor-Arrays. Dabei werden die Zuverlässigkeit der Vorrichtung durch die Parallelstrukturierung mehrerer identischer Sensoren sowie die Selektivität der Vorrichtung durch die logische Verknüpfung mehrerer nicht identischer Sensoren signifikant erhöht.
Durch die Herstellung der bioaktiven Schicht in Dickschichttechnologie werden Inhomogenitätsprobleme bei der Bioaktivität und somit bei der Sensitivität ausgeschaltet. Diese treten häufig bei Sensoren auf, die gemäß dem Stand der Technik erzeugt werden (z. B. unter Verwendung von Dip-Coating etc.). Auf Grund der kostengünstigen (und daher in der Elektronikindustrie gut etablierten) Dickschichttechnologie können Anwendungen für Einmalgebrauch realisiert werden, die bisher nicht denkbar, weil unwirtschaftlich waren.
Der erfindungsgemäße Biosensor kann mindestens eine als Diffusionsbarriere fungierende bioaktive Schicht umfassen, die aus zwei oder mehr Zonen besteht, von denen die an die elektrisch leitende Schicht grenzende Zone vorzugsweise an bioaktiven Substanzen abgereichert ist. Allerdings werden vorzugsweise auch bioaktive Schicht(en) verwendet, die darin homogen verteilte Enzyme enthalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors, der dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine als Diffusionsbarriere fungierende bioaktive Schicht mittels Siebdruck hergestellt ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• Vorsehen eines inerten Trägermaterials,
• Aufbringen mindestens einer elektrisch leitenden Schicht auf dieses inerte Trägermaterial, und
• Aufbringen mindestens einer als Diffusionsbarriere fungierenden bioaktiven Schicht auf die mindestens eine elektrisch leitende Schicht mittels Siebdruck ohne Einsatz von UV-Strahlung unter Verwendung einer ein Enzym und ein biokompatibles Polymer enthaltenden, aufnehmerfreien Druckfarbe.

Bevorzugt wird mindestens eine bioaktive Schicht aus einer Druckfarbe synthetisiert, die zumindest eine bioaktive Substanz enthält, aber frei von als Aufnehmer fungierenden Bestandteilen ist.
Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf eine Druckfarbe, die eine bioaktive Substanz, insbesondere ein Enzym, enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass sie siebdruckfähig ist und bioaktive Schichten bildet, die als Diffusionsbarriere wie oben definiert fungieren.
Die erfindungsgemäßen Druckfarben entsprechen

(a) den Anforderungen des Siebdruckverfahrens (z. B. bezüglich Rheologie, Haftung auf dem Substrat etc.) und bilden nach dieser Schritt
(b) Membrane, die den Anforderungen der interessierenden Biosensoren entsprechen (z. B. bezüglich Bioaktivität, Selektivität, Empfindlichkeit, Homogenität, Zuverlässigkeit, etc.)

Wie oben definiert, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen amperometrischen Biosensor mit folgendem bevorzugtem Aufbau: Auf einen inerten Träger (z. B. Al₂O₃) werden eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine Referenzelektrode sowie die erforderlichen elektrischen Anschlüsse aufgebracht (unter Verwendung von Siebdruck (wie z. B. in Whithe „Thick Film Technology" in Prudenziati (Ed.) „Thick Film Sensors" (Elsevier, Amsterdam, 1994) S. 3ff. beschrieben)), getrocknet und fixiert (z. B. durch Sintern). Auf die Arbeitselektrode wird eine Beschichtung aus grafitfreiem bioaktivem Material mit einer Schichtdicke von ≥ 5 μm (vorzugsweise mittels Siebdruck) aufgebracht und getrocknet. Die so gebildete bioaktive Schicht enthält bioaktive Substanzen (wie z. B. ein oder mehr Enzyme, vorzugsweise Oxidasen), die ohne Einsatz von Wärme oder UV-Strahlen durch Geleinschluß in mindestens einem biokompatiblen Polymer oder anorganischen Gel (vorzugsweise polyHEMA, SiO₂) immobilisiert werden.
Bei Kontaktieren dieser bioaktiven Schicht mit einem Analyt, der das Substrat mindestens eines der in der Schicht immobilisierten Enzyme enthält (wie z. B. Glucose für Glucoseoxidase) diffundiert dieses Substrat in die Schicht, bis es enzymatisch umgesetzt wird. Das Reaktionsprodukt (z. B. H₂O₂) fungiert als in situ gebildeter Mediator und diffundiert in die als Aufnehmer dienende Arbeitselektrode.
Bei solchen „in-situ"-Mediatoren sind die Diffusionsgeschwindigkeiten in dem zur Herstellung der bioaktiven Schicht gewählten biokompatiblen Polymer oder anorganischen Gel (vorzugsweise polyHEMA, SiO₂) höher als die Diffusionsgeschwindigkeiten von anderen elektrodenaktiven Substanzen (wie z. B. Ascorbinsäure), die typischerweise in komplexen Analyten enthalten sind und bei dem zur Detektion des „in-situ"-Mediators nötigen Potential Störsignale im Sensor bewirken. Eine (Polymer- und/oder Gel-)Schicht mit einer Dicke von ≥ 5 μm bildet somit eine wirkungsvolle Diffusionsbarriere für solche Störsubstanzen und gewährleistet, dass das Sensorsignal innerhalb der Messzeit gezielt vom „in-situ"-Mediator erzeugt wird. Die Herstellung der bioaktiven Schicht in Dickschichttechnologie bewirkt, dass das Sensorsignal gezielt auf die interessierende Bioreaktion (z. B. Oxidation von Glucose durch Glucoseoxidase) zurückgeht.
Ist auch das Substrat für die Enzymreaktion von der oben beschriebenen Diffusionsbarrierewirkung betroffen, kann es günstig sein, bioaktive Substanzen (z. B. Enzyme etc.) nur der an den Analyt grenzenden Zone der bioaktiven Schicht beizumischen und ihren Gehalt in der Zone neben dem Aufnehmer zu reduzieren. Dieser technisch kompliziertere Produktionsprozess erbringt beim Einsatz von teuren bioaktiven Substanzen vorteilhafte Einsparungen bei den Materialkosten.
Die Verwendung von Siebdruck zur Herstellung der bioaktiven Schicht bietet den Vorteil, dass die Strukturierung der Sensorkomponenten mit einer signifikant höheren Auflösung (≤ 10 μm) ausgeführt werden kann als bei Verfahren, die auf dem Trocknen eines Flüssigkeitsfilms oder -tropfens beruhen (wie z. B. Dip-Coating). Diese Eignung der Siebdrucktechnologie zur kostengünstigen Massenproduktion von parallelen Sensoranordnungen bestehend aus mehreren miniaturisierten identischen Sensoren erhöht die Zuverlässigkeit der Vorrichtung signifikant, weil ein produktionsbedingtes Nichtfunktionieren eines einzelnen Sensors nicht gleich den Ausfall der gesamten Vorrichtung zur Folge hat. Die gleichfalls kostengünstige, in Massenfertigung erzielbare logische Verknüpfung mit einer Anordnung von mehreren miniaturisierten, nicht identischen Sensoren gestattet die kombinierte Detektion/Bestimmung von mehr als einer Substanz im Analyt und somit eine Steigerung der Selektivität über die einer einzigen Bioreaktion hinaus. Das bedeutet eine entscheidende Unterstützung bei der Diagnose von medizinischen und biologischen Phänomenen.
Die Herstellung der bioaktiven Schicht mittels Siebdruck ermöglicht eine nachvollziehbare Steuerung der Homogenität der Verteilung der bioaktiven Substanz in derselben. Damit lassen sich Inhomogenitäten vermeiden, die vom Trocknen von mittels Dip-Coating oder verwandten Verfahren hergestellten Schichten herrühren und bei bisher bekannter Sensoren zu ungünstigen Empfindlichkeitsschwankungen führen.
Die siebdruckfähige Farbe, aus der Sensoren hergestellt werden, die durch solche vorteilhaften bioaktiven Schichten gekennzeichnet sind, bestehen zumindest aus

(a) einer oder mehr bioaktiven Substanz(en) (z. B. einem Enzym, vorzugsweise Oxidase) in Puffermilieu,
(b) einer oder mehr biokompatiblen anorganischen oder organischen Substanz(en) (z. B. einem biokompatiblen Polymer, vorzugsweise polyHEMA; einem anorganischen Gelbildner, vorzugsweise einem oder mehr Silikat(en), Aluminat(en), deren Hydrat(en), Hydroxid(en), Alkoholat(en) etc.) zur Einstellung der für Siebdruckverfahren erforderlichen rheologischen Eigenschaften (z. B. Viskosität, Thixotropie etc.) und
(c) ein Lösungsmittel oder eine Lösungsmittelmischung (z. B. Wasser, Alkohole, Glycole, Polyglycole etc.), die weder physikalisch noch chemisch eine Deaktivierung der bioaktiven Substanz(en) bewirken.

Solche erfindungsgemäßen Farben sind frei von Bestandteilen, die als Aufnehmer fungieren. Da bisher alle siebgedruckten bioaktiven Schichten Grafit enthalten, bilden sie keine wirkungsvollen Diffusionsbarrieren gegen Störsubstanzen aus dem Analyt, und daraus hergestellte Sensoren erfordern die Zugabe von alternative Mediatoren für ein selektives Signal. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind diese nicht mehr erforderlich.
Die Herstellung der oben beschriebenen Farbe erfolgt vorteilhaft durch die separate Herstellung und anschließende kontrollierte Vereinigung von Lösungen des biokompatiblen Polymers, des anorganischen Gelbildners und der gepuffertem bioaktiven Substanz. Zur Herstellung von Lösungen des Polymers sowie des anorganischen Gelbildners kann entweder ein zuvor „ex situ" synthetisiertes Verdickungsmittel (z. B. polyHEMA) verwendet werden, oder das Verdickungsmittel kann aus den Bestandteilen (z. B. den anorganische Gele bildenden Oxiden, Hydroxiden, Hydraten oder Alkoholaten von Al, B, Ca, Fe, K, Na, Mg, Si, Ti) „in situ" synthetisiert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Zeichnungen näher beschrieben.
1 zeigt das rheologische Verhalten einer erfindungsgemäßen Druckfarbe;
2 zeigt den Zusammenhang zwischen Glucosekonzentrationen und Strom; und
3 zeigt die Selektivität des potentiostatisch gemessenen Signals eines erfindungsgemäßen Biosensors.
Beispiele:
Beispiel 1: Synthese einer Glucoseoxidase-Druckfarbe
Eine Polymerlösung bestehend aus 6,625 Masseteilen polyHEMA (polymerisiertem Hydroxyethylenmethacrylat, Molekulargewicht 45000), 59,581 Masseteilen Diethylenglykol (DEG) und 33,794 Masseteilen Wasser wird mit 14,959 Masseteilen SiO₂-Gelbildner vereinigt. Zu dieser Lösung werden 720 E/(g Farbe) Glucoseoxidase (GOD, EC 1.1.3.4.) gegeben, typischerweise gelöst in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, der durch Vermischen von 50 mM KH₂PO₄ und 50 mM K₂HPO₄ mit Wasser hergestellt wird (der pH-Wert des Kaliumphosphatpuffers wird mit 3 M NaOH eingestellt). Diese Farbe kann unmittelbar zum Siebdrucken verwendet oder bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 2: Herstellung einer Laktatoxidase-Druckfarbe
Zu einer Lösung aus Polymer und anorganischem Gel wie in Beispiel 1 beschrieben werden 380 E/(g Farbe) Laktatoxidase (LOD, EC 1.1.3.2.) gegeben, typischerweise gelöst in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, der durch Vermischen von 50 mM KH₂PO₄ und 50 mM K₂HPO₄ mit Wasser hergestellt wird (der pH-Wert des Kaliumphosphatpuffers wird mit 3 M NaOH eingestellt). Diese Farbe kann unmittelbar zum Siebdrucken verwendet oder bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 3: Herstellung einer Glucoseoxidase-Druckfarbe
Zu einer Polymerlösung wie in Beispiel 1 beschrieben werden 3,506 Masseteile SiO₂, 0,800 Masseteile Al₂O₃, 0,040 Masseteile Fe₂O₃/FeO, 0,011 Masseteile TiO₂, 0,185 Masseteile MgO, 0,080 Masseteile CaO und 0,014 Masseteile Na₂O-Gelbildner gegeben. Dann wird eine Glucoseoxidaselösung gemäß Beispiel 1 zugegeben. Diese Farbe kann unmittelbar zum Siebdrucken verwendet oder bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 4: Synthese einer Laktatoxidase-Druckfarbe
Zu einer Polymerlösung wie in Beispiel 1 beschrieben wird ein Gelbildner gemäß Beispiel 3 gegeben. Dann wird eine Laktatoxidaselösung gemäß Beispiel 2 zugesetzt. Diese Farbe kann unmittelbar zum Siebdrucken verwendet oder bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 5: Fließverhalten einer siebdruckfähigen Glucoseoxidase-Druckfarbe
Eine Siebdruckfarbe bestehend aus 66,63 Masseteilen polyHEMA, 89,326 Masseteilen Diethylenglycol und 4,011 Masseteilen Wasser, 14,959 Masseteilen SiO₂-Gelbildner und 720 E/(g Farbe) Glucoseoxidase (GOD, EC 1.1.3.4.), typischerweise gelöst in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, der durch Vermischen von 50 mM KH₂PO₄ und 50 mM K₂HPO₄ mit Wasser hergestellt wird (der pH-Wert des Kaliumphosphatpuffers wird mit 3 M NaOH eingestellt) hat ein Fließverhalten wie in 1 gezeigt und eignet sich daher zum Siebdrucken.
Beispiel 6: Synthese einer bioaktiven Schicht mit kontrollierter Schichtdicke mittels Siebdruck
Eine Siebdruckfarbe gemäß z. B. Beispiel 1 wird oben auf das Sieb einer Siebdruckmaschine aufgebracht und gleichmäßig verstrichen. Die Farbe wird dann mit Hilfe einer Rakel durch das Sieb gedrückt, ausnivellieren und trocknen gelassen. Die Dicke der bioaktiven Schicht kann z. B. mit Hilfe der Trocknungsparameter gesteuert werden (Tabelle 1). Tabelle 1. Veränderung der Schichtdicke mit der Trocknungstemperatur

Trocknungsbedingungen Schichtdicke

3 Tage bei 4° C37 μm

3 Tage bei RT 23 μm

3 Tage bei 37°C 22 μm

3 Tage bei 80°C 19 μm
Beispiel 7: Bioaktive Glucoseoxidase-Dickfilmschicht
Ein Sensor mit einer bioaktiven Schicht, hergestellt gemäß Beispiel 6 aus einer Siebdruckfarbe gemäß Beispiel 1, enthält GOD mit einer Aktivität von 80% der Ausgangsaktivität. Das Sensorsignal liegt im μA-Bereich, ist nach 20 Sekunden stabil und ist für Glucosekonzentrationen zwischen 0 und 20 mM (2) linear, weshalb es den physiologisch interessierenden Bereich quantitativ abdeckt.
Beispiel 8: Selektivität der bioaktiven Dickfilmschicht mit GOD
Ein Biosensor mit einer Dickfilmschicht gemäß Beispiel 7 liefert ein spezifisches Signal für Glucose. Dieses Signal wird nicht durch Störsubstanzen wie z. B. Ascorbinsäure, Harnstoff, Glycin oder Paracetamol beeinträchtigt. 3 zeigt das Signal für eine derartige Elektrode, potentiostatisch gemessen. Kurve A: Analyt mit 5 mM Glucose (typische physiologische Konzentration im Blut) und keine Störsubstanzen; Kurve B: Analyt mit 5 mM Glucose plus 60 μM Ascorbinsäure (maximale physiologische Konzentration im Blut); Kurve C: Analyt mit 5 mM Glucose plus 25 mM Harnstoff (das 5-fache der typischen Konzentration im Blut), Kurve D: Analyt mit 5 mM Glucose plus 2,5 mM Paracetamol (das 15-fache der maximalen Konzentration im Blut eines mit dieser Arznei behandelten Arthrosepatienten). Selbst bei einer Vergrößerung der Figur (Insert in 3) sind alle Kurven identisch innerhalb der Versuchsgenauigkeit.

Claims

Amperometrischer Biosensor in Dickschichttechnologie zur Detektion und/oder Bestimmung von enzymkatalytische Reaktionen durchmachenden Substanzen, insbesondere Glucose oder Laktat, umfassend • ein inertes Trägermaterial, • mindestens eine Aufnehmerschicht mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit von χ > 10⁴ Ω^–1cm^–1, und • mindestens eine mittels Siebdruck ohne Einsatz von UV-Strahlung aufgebrachte und als Diffusionsbarriere fungierende bioaktive Schicht, die mindestens ein mit der zu messenden Substanz spezifisch reagierendes Enzym enthält, wobei die bioaktive Schicht eine spezifische elektrische Leitfähigkeit von χ < 1 Ω^–1cm^–1 aufweist und weiters andere elektroaktive Substanzen wirkungsvoll daran hindert, die Aufnehmerschicht innerhalb der Messzeit zu erreichen.
Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine als Diffusionsbarriere fungierende bioaktive Schicht umfasst, die aus zwei oder mehr Zonen besteht, von denen die an die elektrisch leitende Schicht grenzende Zone vorzugsweise an bioaktiven Substanzen abgereichert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: • Vorsehen eines inerten Trägermaterials, • Aufbringen mindestens einer elektrisch leitenden Schicht auf dieses inerte Trägermaterial, und • Aufbringen mindestens einer als Diffusionsbarriere fungierenden bioaktiven Schicht auf die mindestens eine elektrisch leitende Schicht mittels Siebdruck ohne Einsatz von UV-Strahlung unter Verwendung einer ein Enzym und ein biokompatibles Polymer enthaltenden, aufnehmerfreien Druckfarbe.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine bioaktive Schicht aus einer Druckfarbe synthetisiert wird, die mindestens eine bioaktive Substanz enthält, aber frei von als Aufnehmer fungierenden Bestandteilen ist.
Druckfarbe, enthaltend ein Enzym, dadurch gekennzeichnet, dass sie siebdruckfähig ist und als Diffusionsbarriere fungierende bioaktive Schichten gemäß Anspruch 1 bildet.