DE60311961T2 - Detektionsverfahren für papillomavirus mrna - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in-vitro-Verfahren zur Durchmusterung von menschlichen Testpersonen, um deren Risiko zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs zu bestimmen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebärmutterhalskrebs ist eine der am häufigsten vorkommenden malignen Erkrankungen weltweit und stellt eine der Haupttodes- und Mortalitätsursachen bei Frauen dar (Parkin DM, Pisani P, Ferlay J (1993) Int J Cancer 54: 594-606; Pisani P, Parkin DM, Ferlay J (1993) Int J Cancer 55: 891-903). 15.700 neue Fälle eines invasiven Gebärmutterhalskrebses wurden in den Vereinigten Staaten 1996 vorhergesagt, und das jährliche weltweite Vorkommen wird durch die Weltgesundheitsorganisation auf 450.000 geschätzt (1990). Die jährliche Vorkommensrate unterscheidet sich in unterschiedlichen Teilen der Welt in einem Bereich von 7,6 pro 100.000 in Westasien bis 46,8 pro 100.000 in Südafrika (Parkin et al., 1993 ibid).
  • Die gegenwärtige Konzeption von Gebärmutterhalskrebs besteht darin, dass es sich um eine Krankheit mit mehreren Stadien handelt, die sich regelmäßig über einen Zeitraum von 10 bis 25 Jahren entwickelt. Ein invasives Plattenepithelkarzinom der Gebärmutter entfaltet sich durch eine Penetration durch die basale Lamina und einem Eindringen der Stroma oder der epithelialen Lamina-Propria. Der klinische Verlauf eines Gebärmutterhalskrebses zeigt eine beträchtliche Variation. Die Prognose wurde auf das klinische Stadium, Lymphknotenentwicklung, primäre Tumormasse, histologischer Typ, Invasionstiefe und lymphatische Permeation gerichtet (Delgado G et al., (1990) Gynecol Oncol 38: 352-357). Einige Patienten mit weniger günstigen Tumoreigenschaften besitzen eine relativ gute Entwicklung, während andere an einer fatalen Entwicklung einer anfangs eingeschränkten Krankheit leiden. Dies zeigt einen klaren Bedarf an zusätzlichen Markern, um neu diagnostizierte Gebärmutterhalskarzinome weiter zu charakterisieren, um eine risikoangepasste Therapie zu verabreichen (Ikenberg H et al., Int. J. Cancer 59:322-6. 1994).
  • Die Epidemiologie von Gebärmutterhalskrebs hat eine starke Verbindung mit religiösen, familiären und sexuellen Mustern gezeigt. In beinahe 100 Fallkontrollstudien wurde die Beziehung zwischen HPV und einer zervikalen Neoplasie untersucht, und beinahe alle fanden positive Verbindungen (IARC Monographen, 1995). Die Verbindung ist stark, andauernd und spezifisch auf eine beschränkte Anzahl von viralen Typen (Munoz N, Bosch FX (1992) HPV and cervical neoplasia: review of case-control and cohort studies. IARC Sci PubI 251-261). Unter den am meisten informativen Studien wurden starke Verbindungen mit HPV 16 DNA mit bemerkenswerter Konsistenz für invasiven Krebs und hochgradige CIN-Läsionen beobachtet, was die Möglichkeit ausschließt, dass diese Verbindung durch Zufall, Vorbestimmung oder Verwechslung erklärt werden kann (IARC Monographen, 1995). Ein indirekter Beweis legt nahe, dass in Krebszellen nachgewiesene HPV-DNA einen guten Marker für die Rolle einer HPV-Infektion in der frühen Karzinogenese darstellt. Es wurde eine Dosis-Antwort-Beziehung zwischen einer zunehmenden viralen Beladung und dem Risiko von Gebärmutterhalskrebs berichtet (Munoz und Bosch, 1992 ibid). In einigen größeren Reihen waren bis zu 100 % der Tumore positiv auf HPV, jedoch ist das Vorkommen von Virus-negativen Gebärmutterhalskarzinomen noch immer debattierbar (Meijer CJ et al., (1992) Detection of human papillomavrius in cervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytology: possible implications for cervical cancer screening. IARC Sci PubI 271-281; Das BC, et al., (1993) Cancer 72: 147-153).
  • Die am häufigsten vorkommenden HPV-Arten, die in Plattenepithel-Gebärmutterhals-Karzinomen gefunden wurden, sind HPV 16 (41%-86%) und 18 (2%-22%). Zusätzlich werden auch HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 66 und 68 gefunden (IARC, Monographen, 1995), Auf der HPV 2000 Internationalen Konferenz in Barcelona wurden HPV 16, 18, 31 und 45 als hoch-risikoreich definiert, während HPV 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 68 als mittel-risikoreich definiert wurden (Keerti V. Shah. P71). Die 13 HPV mit hohem und mittlerem Risiko werden zusammen oft als Krebs-assoziierte HPV-Arten bezeichnet.
  • Eine Anzahl von Studien hat die potentielle Rolle eines HPV-Testes für ein zervikales Screening untersucht (s. Cuzick et al. A systematic review of the role of human papillomavrius testing withing a cervical screening programme. Health Technol Assess 3:14. 1999).
  • Reid et al., (Reid R, et al., (1991) Am J Obstet Gynecol 164: 1461-1469) waren die Ersten, die eine Rolle für einen HPV-Test in einem Screening-Zusammenhang demonstrierten. Diese Studie wurde an Frauen mit hohem Risiko von sexuell übertragenen Krankheitsverläufen mit spezialisierten Gynäkologen durchgeführt, die eine empfindliche (niedrig stringente) Southern Blot-Hybridisierung zur HPV-Detektion verwendeten. Insgesamt waren 1012 Frauen eingeschrieben, und eine Zervikographie wurde auch als mögliche Ergänzung zur Zytologie in Erwägung gezogen. 23 CIN II/III-Läsionen wurden insgesamt gefunden, jedoch wurden lediglich 12 durch Zytologie nachgewiesen (Sensitivität 52 %, Spezifität 92 %). Der HPV-Test hat 16 hochgrädige Läsionen gefunden.
  • Bauer et al. (Bauer HM, et al., (1991) JAMA 265: 472-477) berichten über eine frühere PCR-basierte Studie unter Verwendung von MY09/11-Primern (Manos M, et al., (1990) Lancet 335: 734) in jungen Frauen, die an Routine-Abstrichen teilnahmen (Universitätsstudentinnen). Sie fanden eine positive Rate von 46 % in 467 Frauen, die wesentlich höher war als in einem Dot-Blot-Assay (11 %).
  • In einer unter Einsatz von PCR durchgeführten Studie mit GP5/6-Primern (Van Den Brule AJ, et al., (1990) J Clin Microbiol 28: 2739-2743) van der Brule et al. (Van Den Brule AJ, et al., (1991) Int J Cancer 48: 404-408) wurde eine sehr starke Korrelation von positiven HPV mit einer zervikalen Neoplasie gezeigt, was anhand einer Zytologie bestimmt wurde. In älteren Frauen (in einem Alter von 35 bis 55 Jahren) betrug die positive HPV-Rate durch negative Zytologie lediglich 3,5 %, und diese war auf 1,5 % vermindert, wenn nur die Arten 16, 18, 31 und 33 herangezogen wurden, während Frauen mit einem histologischen Karzinom in situ alle HPV-positiv waren, und 90 % hatten eine der vier oben genannten Arten. Frauen mit weniger schweren zytologischen Abnormalitäten hatten niedrigere positive HPV-Raten in einem abgestuften Weg und zeigten einen klaren Trend.
  • Roda Housman et al. (Roda Housman AM, et al., (1994) Int J Cancer 56: 802-806) erweiterte diese Beobachtungen, indem sie auf weitere 1.373 Frauen mit abnormalen Abstrichen schaute. Diese Studie bestätigte auch die zunehmende positive Rate mit zunehmender Schwere der Abstrichergebnisse. Sie bemerkten auch, dass das Niveau der HPV-Heterogenität auf 22 Typen von niedriggradigen Abstrichen auf 10 "Hochrisiko"-Typen bei hochgradigen Abstrichen absank. Dieses Dokument enthielt keine zytologisch negativen Frauen, noch wurde eine zytologische Krankheit histologisch bestätigt.
  • Cuzick et al. (Cuzick J, et al., (1992) Lancet 340: 112-113; Cuzick J, et al., (1994) Br J Cancer 69: 167-171) waren die Ersten, die berichteten, dass ein HPV-Test nützliche Informationen zur Sichtung zytologischer Anormalitäten während eines zufälligen Screenings lieferte. In einer Studie mit 133 Frauen mit Verweis auf eine Koloposkopie fanden sie einen positiven Prognosewert von 42 %, der ähnlich dem einer moderaten Dyskaryose war. Die Ergebnisse waren umso auffälliger für HPV 16, wo 39 von 42 HPV 16-positiven Frauen eine hochgradige CIN bei der Biopsie zeigten. Diese Studie stellte die Wichtigkeit der Bestimmung einer viralen Belastung dar und erachtete lediglich hohe Niveaus von Hochrisiko-Arten als positiv.
  • Cox et al. (Cox JT, et al., (1995) Am J Obstet Gynecol 172: 946-954) demonstrierten eine Rolle für einen HPV-Test unter Verwendung des Hybrid CaptureTM Systems (DIGENE Corporation, Gaithersburg, MD, USA) zur Sichtung von Frauen mit grenzwertigen Abstrichen. Dieser Test wurde mit 217 Frauen von einem Universitätsvermittlungsdienst durchgeführt, und es wurde eine Empfindlichkeit von 93 % für CINII/III festgestellt im Vergleich zu 73 % einer wiederholten Zytologie. Es wurde eine hohe virale Belastung festgestellt, welche die Leistung weiter verbesserte, indem Falsch-Positive vermindert wurden. Wenn 5 RLU als Ausschlusswert genommen wurden, wurde eine PPV von ungefähr 24 % ohne Empfindlichkeitsverlust festgestellt.
  • Cuzick et al. (Cuzick J, et al., (1995) Lancet 345: 1533-1536) etablierten einen HPV-Test in einem primären Screening-Kontext in 1.985 Frauen, die an einem Routine-Screening bei einer Familienplanungsklinik teilnahmen. Die Empfindlichkeit bei Verwendung einer Artenspezifischen PCR für die vier häufig vorkommenden HPV-Arten (75 %) war größer als die der Zytologie (46 %), und der PPV für einen positiven HPV-Test (42 %) entsprach in etwa dem einer moderaten Dyskaryose (43 %).
  • WO 91/08312 beschreibt Verfahren zur Bestimmung der Prognose von Individuen, die, mit HPV infiziert sind, umfassend das Messen der HPV-Aktivitätsspiegel durch eine Detektion von Transkripten des gesamten oder eines Teils der E6 und/oder E7-HPV-Gene in einer Probe und Vergleichen der Messungen der HPV-Aktivität mit einer zuvor etablierten Beziehung zwischen Aktivität und dem Risiko einer Entwicklung eines ernsten zervikalen Dysplasie oder eines Karzinoms.
  • WO 99/29890 beschreibt Verfahren für die Bestimmung einer HPV-Infektion basierend auf der Messung und Analyse der Genexpressionsspiegel. Insbesondere beschreibt WO 99/29890 Verfahren, die auf der Messung der Expressionsspiegel von zwei oder mehreren HPV-Genen (z.B. HPV E6, E7, L1 und E2) und anschließendes Vergleichen des Expressionsverhältnisses von Kombinationen dieser Gene basieren, um einen Hinweis auf das Stadium der HPV-basierenden Krankheit in einem Patienten zu geben.
  • EP-A-0 662 518 (AMOCO CORP; 12.07.1995) offenbart ein Verfahren zum Nachweis von E6/E7 mRNA Transkripten, welche "Indikatoren oder Prediktoren des Risikos einer Progression zu einer ernsten Dysplasie oder einem zervikalen Karzinom" sind (S. 2, Zeilen 23-32). Das Prognoseverfahren basiert "auf die Assoziation zwischen einer transkriptionellen HPV-Aktivität und dem Risiko zur Entwicklung einer ernsten zervikalen Dysplasie oder eines Karzinoms" (S. 2, Zeile 58). Dieses Dokument erklärt, dass "die Expression der E6- und/oder E7-Gene von HPV 16 und 18 für die zelluläre Transformation wichtig sind und für die Entwicklung von CIS wichtig sein können" (S. 4, Zeile 40) und dass "die E6*-Transkripte sich auf ein onkogenes Potential der HPV-Arten beziehen können" (S. 5, Zeile 4). Ferner wird offenbart, dass spezifische Expressionsmuster "die Basis bereitstellen, auf der das vorliegende Verfahren verwendet wird, um das Risiko einer Entwicklung von zervikalen Abnormalitäten zu bestimmen" (S. 5, Zeilen 11-14).
  • EP-A-0 373 352 (BEHRINGWERKE AG; 20.06.1990) offenbart ein Verfahren zum Nachweis von HPV E6/E7 mRNA (Beispiele 1-4) als Hinweis auf das maligne Potential des HPV (Seite 2, Zeilen 16-21) und gibt eine Erklärung über die Assoziation zwischen HPV und Gebärmutterhalskrebs, der Bedeutung einer E6/E7-Genomintegration auf eine maligne Transformation und der intensiven Transkription von E6/E7 in transformierten Zellen (S. 2). Das Verfahren zielt auf den Nachweis von E6/E7-Transkripten zum Prognosezweck ab (S. 5, Zeile 7 und Zeile 34). Ferner offenbart es Primer, um E6/E7 im mRNA zu amplifizieren (Beispiele 4a und 4b).
  • WO 94 26934 A (BROWN JANICE T; BAXTER DIAGNOSTICS INC (US); 24.11-1994) offenbart einen spezifischen Assay für HPV-Infektionen, die mit einer zervikalen Dysplasie und einer zellulären Transformation zur Malignität durch Nachweis von E6/E7 mRNA-Transkripten von Hochrisiko-HPV-Arten assoziiert sind (S. 2, Zeilen 23-32). Das Dokument erklärt, dass "die Expression von E6/E7 für Gebärmutterhalskrebs oder prä-maligne Stadien diagnostisch ist".
  • SMITHS H L ET AL ('Application of the NASBA nucleic acid amplification method for the detection of human Papillomvirus type 16 E6-E7 transcripts' JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, AMSTERDAM, NL, Bd. 54, Nr. 1, 1995, Seiten 75-81) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis der Expression von HPV E6-mRNA-Transkripten in zervikalen Abstrichen durch eine isothermale NASBA-Amplifikation (s. Zusammenfassung und Seiten 76-80). Darin wird erklärt, dass "eine schnelle HPV-16-RNA-Detektion in epidemiologischen Studien oder als diagnostisches Werkzeug potentiell von Wert sein könnte" und dass "die spezifische Detektion von (E6/E7) RNA den Nachweis von transkriptionell aktiven viralen Infektionen ermöglichen würde" und dass "die Expression von E6 und E7 das maligne Stadium zu induzieren und zu erhalten scheint" (Seite 76). Das Dokument offenbart außerdem Primerpaare, um HPV16 E6/E7 mRNA zu amplifizieren.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass es möglich ist, eine klinisch sinnvolle Bestimmung einer HPV-assoziierten Krankheit lediglich basierend auf einer einfachen Positiv-/Negativ-Bestimmung der Expression von HPV L1 und E6-mRNA Transkripten durchzuführen, ohne dass genaue quantitative Messungen der Expressionsspiegel oder Unterschiede der Expressionsspiegel der beiden Transkripte notwendig sind. Dieses Verfahren ist technisch einfach und kann in einer bevorzugten Ausführungsform für eine Automatisierung in einem Format mit mittlerem bis hohem Durchsatz modifiziert werden. Weiterhin haben die Erfinder auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse ein neuartiges Schema zur Klassifizierung von Patienten auf der Basis des Risikos einer Entwicklung von Zervixkarzinom entwickelt, das sich auf krankheitsrelevante molekulare Veränderungen in dem Muster der HPV-Genexpression bezieht und unabhängig von der CIN-Klassifikation ist.
  • Dieses Verfahren umfasst ein in-vitro-Verfahren zur Durchmusterung menschlicher Versuchspersonen, um deren Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms zu ermitteln, umfassend die Durchmusterung der Expression von mRNA-Transkripten aus dem L1-Gen und dem E6-Gen von humanem Papillomvirus, wobei die Versuchspersonen hinsichtlich der Expression von L1 und/oder der vollständigen E6-mRNA gewertet werden, ein Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms zu haben.
  • Ein positives Durchmusterungsergebnis in dem Verfahren wird durch eine positive Expression von L1-mRNA und/oder E6-mRNA in Zellen der Gebärmutter angezeigt. Eine positive Expression einer dieser mRNAs oder beider mRNAs wird als Hinweis dafür genommen, dass die Versuchsperson "einem Risiko" zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms ausgesetzt ist. Frauen, die E6-mRNA exprimieren, unterliegen einem hohen Risiko, Zellveränderungen zu entwickeln, da onkogene E6 und E7 an regulatorische Zellzyklusproteine binden und als Schalter für die Zellproliferation wirken. Eine klare Expression von E6-mRNA stellt einen direkten Hinweis von Zellveränderungen in der Gebärmutter dar. Eine Expression von L1-mRNA mit oder ohne Expression von E6-mRNA weist ebenfalls auf das Vorliegen eines aktiven HPV hin.
  • Im weiteren Kontext einer zervikalen Durchmusterung können Frauen, die hinsichtlich einer L1 und/oder E6-mRNA-Expression als positiv identifiziert wurden, für eine weitere Untersuchung ausgewählt werden, beispielsweise durch Verwendung von Zytologie. Daher kann das Verfahren auf einer Stufe ein technisch einfaches Mittel für eine vorherige Durchmusterung einer Population von Frauen bereitstellen, um HPV-positive Individuen zu identifizieren, die für eine weitere Untersuchung ausgewählt werden können.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann das Verfahren verwendet werden, um Individuen in vier unterschiedliche Risikoklassen zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms auf der Basis einer Positiv-/Negativauszählung der Expression von L1- und E6-mRNA verwendet werden.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst das Verfahren ein in-vitro-Verfahren zur Durchmusterung menschlicher Versuchspersonen, um deren Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms zu bestimmen, umfassend die Durchmusterung der Versuchsperson auf die Expression von mRNA-Transkripten des L1-Gens von HPV und mRNA-Transkripte des E6-Gens von HPV, und Einsortieren der Versuchsperson in eine der vier Risikokategorien zur Entwicklung von Zervixkarzinom basierend auf der Expression von L1- und/oder E6-mRNA gemäß der folgenden Klassifizierung:
    • Risikokategorie 1: Versuchspersonen, die hinsichtlich der Expression von L1-mRNA negativ sind, aber hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von wenigstens einem der HPV-Arten 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 oder 68 positiv sind. Solche Individuen, die hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von wenigstens einer der HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 positiv sind, werden unter ein höheres Risiko fallend gewertet als beispielsweise im Vergleich zu Individuen, die für diese Arten negativ sind, aber positiv hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von wenigstens einer der HPV-Arten 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 oder 68.
    • Risikokategorie 2: Versuchspersonen, die hinsichtlich der Expression von L1-mRNA und der Expression von E6-mRNA von wenigstens einem der HPV-Arten 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 oder 68 positiv sind. Solche Individuen, die hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von wenigstens einer der HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 positiv sind, werden unter ein höheres Risiko fallend gewertet als beispielsweise im Vergleich zu Individuen, die für diese Arten negativ sind, aber positiv hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von wenigstens einer der HPV-Arten 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 oder 68.
    • Risikokategorie 3: Individuen, die hinsichtlich der Expression von L1-mRNA-positiv sind, aber negativ hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von Krebs-assoziierten HPV-Arten (z.B.
    • negativ hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von HPV-Arten 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 und 68).
    • Risikokategorie 4: Versuchspersonen, die hinsichtlich der Expression von L1-mRNA negativ sind und hinsichtlich der Expression von E6-mRNA negativ sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine positive Expression durch das Vorliegen von mehr als 50 Kopien des Transkriptes pro ml (oder das Gesamtvolumen der Probe) gekennzeichnet, und eine negative Expression ist durch das Vorliegen von weniger als eine Kopie des Transkriptes pro ml (oder Gesamtvolumen der Probe) gekennzeichnet.
  • Die oben genannte Klassifizierung basiert auf den molekularen Ereignissen, die hinsichtlich des Risikos zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms relevant sind, und sind unabhängig von dem CIN-Status der Versuchspersonen. Daher kann dieses Klassifizierungsverfahren eine Alternative zur Verwendung der Zytologie in einer Routinedurchmusterung von Frauen darstellen, um solche Frauen zu identifizieren, die einem potentiellen Risiko zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs ausgesetzt sind. Das Verfahren kann auch als zusätzliche Maßnahme zur Zytologie verwendet werden, beispielsweise als ein Bestätigungstest, um eine Risikoeinschätzung basierend auf der Zytologie zu bestätigen.
  • Frauen, die hinsichtlich der Expression einer Hochrisiko E6-mRNA von einem der HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 positiv sind, jedoch hinsichtlich der Expression von L1 negativ sind, befinden sich auf dem höchsten Risikoniveau zur Entwicklung von schweren Zellveränderungen und Zellabnormalitäten. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass ein Negativergebnis für eine L1-mRNA-Expression direkt auf einen integrierten HPV hinweist und daher eine höhere Wahrscheinlichkeit für eine starke und konstante Expression von E6 und E7 besteht. Die Integration eines Virus in das humane Genom hat auch eine direkte Wirkung auf die Stabilität der Zellen. Die Integration von HPV reduziert auch die Möglichkeit einer Regression von Zellveränderungen.
  • Frauen, die hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von einer der HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 positiv sind und hinsichtlich der Expression von L1-mRNA positiv sind, besitzen eine "Hochrisiko"-HPV-Expression, und es ist immer noch möglich, dass sich das HPV integriert hat. Jedoch wird das Risiko dieser Frauen nicht als so hoch klassifiziert wie bei solchen Frauen, die L1-negativ und E6-positiv sind, da eine realistische Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie kein integriertes HPV besitzen.
  • Frauen, die hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von den HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 negativ sind, aber hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von anderen HPV-Arten positiv sind, z.B. 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 und 68, werden noch immer "mit Risiko" angesehen und können daher in die Risikokategorien 1 oder 2 (wie oben definiert) eingeordnet werden, was davon abhängt, ob diese hinsichtlich der Expression von L1-mRNA positiv oder negativ sind.
  • Frauen, die hinsichtlich L1-mRNA positiv, aber hinsichtlich E6-mRNA negativ sind, werden unter ein moderates Risiko fallend gewertet. Es können Hochrisiko-HPV-Arten in der Probe vorliegen und eine L1-Expression weist auf eine lytische Aktivität hin. Es können auch integrierte HPV-Arten vorkommen, jedoch nur bei Viren, die selten sind. Jedoch kann ein Nachweis einer lytischen Aktivität zeigen, dass die Zelle bald anfängt, einige Veränderungen durchzumachen.
  • Im weiteren Kontext einer zervikalen Durchmusterung kann das Verfahren verwendet werden, um Frauen hinsichtlich ihres Risikos zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms zu klassifizieren, und kann daher eine Basis für Entscheidungen darstellen, welche die Behandlung und/oder weitere Durchmusterung betrifft. Zum Beispiel: Frauen der Risikokategorie 1, insbesondere solche, die eine positive Expression von E6-mRNA von wenigstens einem der HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 aufweisen, könnten identifiziert werden, dass sie eine "Sofortmaßnahme" benötigen, das heißt eine Konisation oder Kolposkopie, einschließlich einer Biopsie und Histologie.
  • Frauen der Risikokategorie 2, wie oben definiert, könnten gewertet werden, dass sie eine Sofortbehandlung benötigen, das heißt eine Kolposkopie allein oder eine Kolposkopie einschließlich einer Biopsie und Histologie.
  • Frauen der Risikokategorie 3, wie oben definiert, könnten gewertet werden, dass sie eine sofortige Wiederholungsuntersuchung benötigen, das heißt eine Aufforderung zu einem weiteren Test auf eine HPV-Expression unmittelbar oder nach einem relativ kurzen Zeitraum, z.B. sechs Monate.
  • Frauen der Risikokategorie 4, wie oben definiert, könnten dem Durchmusterungsprogramm zurückverwiesen werden, um auf eine HPV-Expression zu einem späteren Zeitpunkt erneut getestet zu werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt das Verfahren ein in-vitro-Verfahren zur Durchmusterung menschlicher Versuchspersonen auf das Vorliegen von integriertem HPV oder eines modifizierten episomalen HPV-Genoms bereit, wobei das Verfahren die Durchmusterung der Versuchsperson auf die Expression von mRNA-Transkripten von dem L1-Gen und dem E6-Gen des humanen Papillomvirus umfasst, wobei die Versuchspersonen, die hinsichtlich der Expression von L1-mRNA negativ, aber hinsichtlich der Expression von E6-mRNA positiv sind, als Träger von integriertem HPV gewertet werden.
  • Der Ausdruck "integriertes HPV" bezeichnet ein HPV-Genom, das in das menschliche Genom integriert ist.
  • Der Ausdruck "modifiziertes episomales HPV-Genom" wird verwendet, um ein HPV-Genom zu bezeichnen, das innerhalb einer Zelle der menschlichen Versuchsperson als ein Epsiom vorliegt, d.h. nicht in das menschliche Genom integriert ist, und das eine Modifikation trägt, die äquivalent ist mit dem Wildtyp HPV-Genom, wobei die Modifikation zu einer konstitutiven oder andauernden Expression von Transkripten der E6- und/oder E7-Gene führt. Die "Modifikation" wird typischerweise eine Deletion, Multimerisierung oder Concatermerisierung des Episoms, eine Neuanordnung des Episoms etc. sein und die Regulation der E6-/E7-Expression beeinflussen.
  • Wie zuvor gesagt, wird das Vorliegen von integriertem HPV oder eines modifizierten episomalen HPV-Genoms durch ein Negativergebnis auf der L1-mRNA Expression angezeigt, zusammen mit einem Positivergebnis der Expression von E6-mRNA in Zellen der Zervix. Daher hängt die Fähigkeit zur Vorhersage des Vorliegens von integriertem HPV oder eines modifizierten episomalen HPV-Genoms in diesem Assay in kritischer Weise von der Fähigkeit ab, ein Negativergebnis auf L1-mRNA-Expression zu werten. Dies erfordert eine Nachweistechnik, die eine größtmögliche Empfindlichkeit besitzt, jedoch so wenig wie möglich Falsch-Negativ-Ergebnisse erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dies unter Einsatz einer sensitiven Amplifikation und einer Echtzeitdetektionstechnik erreicht, um das Vorliegen oder Fehlen von L1-mRNA zu durchmustern. Die am meisten bevorzugte Technik ist eine Echtzeit-NASBA-Amplifikation unter Verwendung molekularer Signalsonden, wie von Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Bd. 26, 2150-2155, beschrieben. Aufgrund der Empfindlichkeit dieser Technik wird das Vorkommen von Falsch-Negativ-Ergebnissen reduziert und ein Ergebnis einer "negativen L1-Expression" kann mit größerer Sicherheit gewertet werden.
  • Gemäß der Erfindung kann ein Verfahren zur Durchmusterung menschlicher Versuchspersonen auf das Vorliegen von integriertem HPV oder eines modifizierten episomalen HPV-Genoms auf eine Durchmusterung der Expression von E6-mRNA allein basieren. Daher betrifft die Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Durchmusterung humaner Versuchspersonen auf das Vorliegen von integriertem HPV, wobei das Verfahren die Durchmusterung der Versuchsperson auf die Expression von mRNA-Transkripten von dem E6-Gen des human Papillomvirus umfasst, insbesondere von jeder der einzigen HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und 45 unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wobei die Versuchspersonen hinsichtlich der Expression von E6-mRNA von wenigstens einer der genannten HPV-Arten positiv sind und als Träger von integriertem HPV gewertet werden.
  • Darüber hinaus werden Individuen in eine der beiden Risikokategorien zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs basierend auf einer "An-/Aus"-Bestimmung der Expression von E6-mRNA allein eingestuft. Daher stellt die Erfindung insbesondere ein in-vitro-Verfahren zur Durchmusterung humaner Versuchspersonen bereit, um deren Risiko zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs zu bestimmen, wobei das Verfahren die Durchmusterung der Versuchsperson auf die Expression von mRNA-Transkripten des E6-Gens von jeder der einzigen HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und 45 unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens und die Einstufung der Versuchsperson in eine der beiden Risikokategorien zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs basierend auf der Expression von E6-mRNA von wenigstens einer der HPV-Arten umfasst, wobei die Individuen, die hinsichtlich der Expression der E6-mRNA positiv sind, als Träger von integriertem HPV gewertet werden und daher als unter "hohes Risiko" fallend zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs klassifiziert werden, wobei Individuen, die hinsichtlich der Expression der E6-mRNA negativ sind, als kein Träger von integriertem HPV gewertet werden und deshalb in "kein nachweisbares Risiko" zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs klassifiziert werden.
  • Im Kontext der zervikalen Durchmusterungs-Klassifizierung von Versuchspersonen in die beiden Gruppen mit "hohem Risiko" oder "keinem nachweisbaren Risiko" zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms stellt dies eine Basis für Entscheidungen bezüglich der Behandlung und/oder weiteren Durchmusterung dar. Beispielsweise können Versuchspersonen in der Hochrisiko-Kategorie gewertet werden, dass sie eine sofortige weitere Analyse benötigen, z.B. durch eine histologische Kolposkopie, während solche in der nicht nachweisbaren Risikokategorie zurück in das Durchmusterungsprogramm mit drei oder fünf Jahresintervallen verwiesen werden können. Diese Verfahren sind insbesondere zur Bestimmung des Risikos zur Entwicklung eines Karzinoms in Versuchspersonen verwendbar, bei denen eine Infektion mit HPV bekannt ist, z.B. solche, die auf HPV-DNA positiv getestet wurden, oder Versuchspersonen, bei denen zuvor eine zervikale Abnormalität über eine Zytologie oder einem Pap-Abstrich festgestellt wurde. Versuchspersonen, die in die "Nicht-Risiko-Kategorie" auf der Basis der E6-mRNA-Expression eingeordnet wurden, können HPV-DNA besitzen, jedoch zeigt das Negativergebnis auf eine E6-Expression, dass HPV zum Testzeitpunkt nicht mit einer onkogenen Aktivität im Zusammenhang stand.
  • Das Vorliegen von integriertem HPV, was anhand eines positiven Ergebnisses auf eine E6-mRNA-Expression angezeigt wird, zeigt schon selbst, dass die Versuchsperson abnormale Zellveränderungen in der Gebärmutter besitzt. Daher wird ein Verfahren bereitgestellt, das einem in-vitro-Verfahren zur Identifizierung menschlicher Versuchspersonen mit abnormalen Zellveränderungen in der Gebärmutter entspricht, wobei das Verfahren der Durchmusterung der Versuchsperson auf eine Expression von mRNA-Transkripten des E6-Gens von HPV, wie oben aufgelistet, entspricht, wobei die hinsichtlich einer Expression von E6-mRNA positiven Individuen mit abnormalen Zellveränderungen in der Gebärmutter identifiziert werden.
  • Der Ausdruck "abnormale Zellveränderungen in der Gebärmutter" umfasst Zellveränderungen, die für eine schwerere Krankheit charakteristisch sind als niedrig-gradige zervikale Läsionen oder geringe intraepitheliale Plattenläsionen, einschließlich Zellveränderungen, die charakteristisch sind für eine Krankheit, deren Schwere gleich oder größer ist als hochgradige CIN (definiert als eine neoplastische Expansion von transformierten Zellen), CIN (zervikale intraepitheliale Neoplasie) III, oder schwere intraepitheliale Platten-Neoplasie (HSIL), einschließlich Läsionen mit einem multiploiden DNA-Profil und "maligne" CIN-Läsionen mit erhöhten DNA-Index-Durchschnittswerten, einem hohen Prozentsatz einer DNA-Aneuplodie und 2.5c Überschussraten ((Hanselaar et al., 1992, Anal Cell Pathol., 4:315-324; Rihet et al., 1996, J. Clin Pathol 49:892-896; and McDermott et al., 1997, Br. J. Obstet Gynaecol. 104:623-625).
  • Eine zervikale intraepitheliale Neoplasie (abgekürzt "CIN"), auch zervikale Dysplasie genannt, stellt einen zervikalen Zustand dar, der von humanem Papillomvirus verursacht wird. CIN wird als I, II oder III in Abhängigkeit von deren Schwere klassifiziert. Sie wird als präkarzinogene Abnormalität angesehen, stellt jedoch keinen eigentlichen Krebs dar. Die schwächste Form, CIN I, verschwindet normalerweise von selbst, obwohl sie sich selbst manchmal zu Krebs entwickeln kann. Die schweren Formen, CIN II und CIN III, bleiben meistens gleich oder werden mit der Zeit schlimmer. Sie können zu einem Krebs entarten, meist jedoch nicht, wenn sie richtig behandelt wurden.
  • HPV wurde als auslösendes Mittel bei der Entwicklung zellulärer Veränderungen in der Gebärmutter identifiziert, was zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms führen kann. Diese zellulären Veränderungen sind mit einer konstitutiven oder anhaltenden Expression von E6/E7-Proteinen von dem viralen HPV-Genom assoziiert. Daher ist es möglich, daraus zu schließen, dass Versuchspersonen, bei denen die Expression von E6-mRNA nachgewiesen wird, insbesondere solche Versuchspersonen, die eine anhaltende E6-Expression über einen längeren Zeitraum aufweisen, bereits zelluläre Veränderungen in der Gebärmutter durchgemacht haben. Diese Veränderungen können in nur wenigen Zellen der Gebärmutter stattgefunden haben und können unter Umständen durch eine konventionelle Zytologie nicht detektierbar sein. Trotzdem ist es bei Verwendung der empfindlichen, spezifischen und genauen Verfahren zum Nachweis von E6-mRNA möglich, solche Versuchspersonen zu identifizieren, die bereits zelluläre Veränderungen in der Gebärmutter zu einem viel früheren Zeitpunkt aufweisen, als es bei Verwendung konventioneller zytologischer Durchmusterung möglich wäre. Dies ermöglicht einen früheren Eingriff mit Behandlungen, die darauf ausgelegt sind, die Entwicklung eines Zervixkarzinoms zu verhindern.
  • Als Folge der HPV-Integration in das humane Genom oder als Folge der "Modifikation" in modifiziertes episomales HPV-Genom ist die normale Kontrolle der viralen E6/E7-Onkogen-Transkription verloren gegangen (Durst et al., 1985, J Gen Virol, 66(Pt 7): 1515-1522; Pater and Pater, 1985 Virology 145:313-318; Schwarz et al., 1985, Nature 314: 111-114; Park et al., 1997, ibid). Im Gegensatz dazu können in prä-malignen Läsionen HPV-infizierte normale Epithel-Papillomviren in "nicht modifizierten" episomalen Formen vorherrschen, und somit kann eine onkogene (E6/E7) Transkription fehlen oder effizient heruntergeregelt sein (Johnson et al., 1990, J Gen Virol, 71 (PT 7): 1473-1479; Falcinelli et al., 1993, J Med Virol, 40: 261-265). Es wurde festgestellt, dass die Integration humaner Papillomvirus-Typ 16-DNA in das humane Genom zu einer unstabileren Zellaktivität/Genom und zu einer zunehmenden Stabilität von E6- und E7-mRNA führt (Jeon and Lambert, 1995, Proc NatI Acad Sci USA 92: 1654-1658). Daher erscheint eine HPV-Integration, die typischerweise in Gebärmutterhalskrebsen, nicht jedoch häufig in CIN-Läsionen vorgefunden wird (Carmody et al., 1996, Mol Cell Probes, 10: 107-116), ein wichtiges Ereignis für die zervikale Karzinogenese darzustellen.
  • Die vorliegenden Verfahren weisen eine virale E6/E7-mRNA-Expression in der Gebärmutter anstelle von DNA nach. Eine virale E6/E7-Expression in Zervixzellen stellt eine viel genauere Bestimmung des Risikos zur Entwicklung von Krebs dar, als einfach das Vorliegen des HPV-Virus zu zeigen. Ferner kann der Nachweis von HPV-Onkogen-Transkripten ein empfindlicher Indikator der direkten Beteiligung von viralen Onkogenen bei der Karzinogenese darstellen (Rose et al., 1994, Gynecol Oncol, 52: 212-217, Rose et al., 1995, Gynecol Oncol, 56: 239-244). Der Nachweis von E6/E7-Transkripten durch eine Amplifikation und Nachweis ist ein nützliches diagnostisches Werkzeug für Risikobewertungen hinsichtlich der Entwicklung von CIN und deren Verlauf zu Gebärmutterhalskrebs, insbesondere in Hoch-Risiko-HPV-Typ-infizierten Patientinnen mit ASCUS und CIN I(Sotlar et al., 1998, Gynecol Oncol, 69: 114-121; Selinka et al., 1998, Lab Invest, 78: 9-18).
  • Die Expression von E6/E7-Transkripten von HPV-16/18 wird einheitlich mit dem physikalischen Zustand von HPV-DNA korreliert (Park et al., 1997, Gynecol Oncol, Bd:65(1), 121-9). In den meisten zervikalen Karzinomzellen werden die E6- und E7-Gene von spezifischen humanen Papillomviren von viralen Sequenzen transkribiert, die in Wirtszellchromosomen integriert sind (von Kleben Doeberitz et al., 1991, Proc NatI Acad Sci U S A. Bd.:88(4), 1411-5). Die virale Belastung und Integration wurden im großen Maßstab bei CIN-Läsionen untersucht (Pietsaro et al., 2002, J Clin Microbiol, Bd.:40(3), 886-91). Lediglich eine Probe enthielt ausschließlich episomale HPV16-DNA und diese Läsion entwickelte sich spontan zurück. Siebzehn von 37 invasiven zervikalen Karzinomproben wurden zuvor identifiziert, dass sie das vollständig integrierte HPV16-Genom enthalten, indem eine PCR eingesetzt wurde, welche das gesamte E1/E2-Gen abdeckt, und dies wurde durch rIiPCR in 16 Fällen bestätigt. Ein Fall zeigte jedoch einen niedrigen Spiegel episomaler Desoxyribonukleinsäure neben der vorherrschenden integrierten Form. Von den verbleibenden 20 Karzinomproben, die episomale Formen der zuvor genannten Analyse zeigen, wurde bei 14 unter Verwendung von rIiPCR festgestellt, dass sie integrierte Formen enthalten, und vier enthielten multimere (modifizierte) episomale Formen. Daher zeigten insgesamt 31 von 37 der Karzinome (84 %) integriertes HPV16-Genom, während ein Ausbleiben der Integration nicht nachgewiesen werden konnte (Kalantari et al., 2001, Diagn Mol Pathol, Bd:10(1), 46-54).
  • Es gab so gut wie keine Beobachtungen, dass zervikale Karzinomzellen ohne integriertem HPV oder modifiziertem episomalem HPV-DNA existieren (Kalantari et al. 2001; Pietsaro et al., 2002, ibid). Es wurde ferner gezeigt, dass E6 und E7 nur von integrierter oder modifizierter episomaler HPV-DNA transkribiert werden kann (von Kleben Doeberitz et al., 1991, ibid). Daher vermuten die Erfinder, dass der Nachweis einer E6/E7-Expression einen direkten Hinweis auf integriertes HPV oder modifiziertes episomales HPV sowie eine hohe Onkogen-Aktivität liefert und schließen daraus, dass in einem klinischen Kontext der Nachweis einer E6 (E6/E7)-Expression allein ausreicht, um Versuchspersonen mit "hohem Risiko" zur Entwicklung eines zervikalen Karzinoms zu identifizieren. Mit anderen Worten: wenn eine E6/E7-mRNA- Expression in einer zervikalen Probe nachgewiesen werden kann, so weist dies direkt auf zelluläre Abnormalitäten in der Gebärmutter hin, und es besteht ein sehr hohes Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms aufgrund einer andauernden HPV-Onkogen-Aktivität. Daher weist der Nachweis von E6/E7-mRNA in einer menschlichen Versuchsperson darauf hin, dass die Versuchsperson einem sehr hohen Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms ausgesetzt ist und eine sofortige weitere Durchmusterung durchlaufen sollte, z.B. mittels Kolposkopie.
  • Wenn eine HPV-E6/E7-mRNA-Expression nicht nachgewiesen wird, kann die Versuchsperson noch immer eine HPV-Infektion haben. Jedoch kann sich diese aufgrund einer fehlenden Integration und Onkogen-Aktivität spontan zurückentwickeln (wie von Pietsaro et al., 2002, ibid, beobachtet).
  • In einem klinischen Kontext ist die Leistungsfähigkeit der Verfahren, welche von der Durchmusterung auf eine Expression von E6-mRNA alleine abzielen, in kritischer Weise abhängig von der Fähigkeit, ein negatives Ergebnis auf eine E6-mRNA-Expression mit Sicherheit zu werten. Dies erfordert wiederum eine Nachweistechnik, die eine maximale Empfindlichkeit besitzt, und ferner so wenig wie möglich Falsch-Negativ-Ergebnisse produziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dies unter Verwendung einer empfindlichen Amplifikation und einem Echtzeit-Nachweisverfahren erreicht, um auf das Vorliegen oder Fehlen von E6-mRNA zu durchmustern. Die bevorzugte Technik ist eine Echtzeit-NASBA-Amplifikation unter Verwendung von molekularen Signalsonden, wie von Leone et al, Nucleic Acids Research, 1998, Bd. 26, 2150-2155, beschrieben. Aufgrund der Sensitivität dieser Technik ist das Auftreten von Falsch-Negativ-Ergebnissen minimiert, und es kann das Ergebnis einer "negativen E6-Expression" mit größerer Sicherheit gewertet werden. Dies ist extrem wichtig, wenn die Assays im Zusammenhang eines klinischen Durchmusterungsprogramms verwendet werden.
  • In den erfindungsgemäßen Verfahren, die auf dem Nachweis von E6-mRNA allein basieren, ist es notwendig, dass nur HPV 16, 18, 31, 33 und 45 nachgewiesen wird. DNA von den HPV-Arten 16, 18, 31 und 33 wurde in mehr als 87 % der zervikalen Karzinomproben nachgewiesen (Karlsen et al., 1996, J Clin Microbiol, 34:2095-2100). Andere Untersuchungen haben gezeigt, dass E6 und E7 beinahe ausnahmslos in zervikalen Krebsen vorkommen, da deren Expression vermutlich zur Umwandlung und Erhaltung des malignen Zustandes notwendig ist (Choo et al., 1987, J Med Virol 21:101-107; Durst et al., 1995, Cancer Genet Cytogenet, 85: 105-112). Im Gegensatz zu HPV-Nachweissystemen, die auf dem Nachweis des nicht beschädigten Genoms oder der L1-Gensequenz basieren, kann der Nachweis von HPV-mRNA, die von der E6/E7-Gegend exprimiert wird, mehr als 90 % der Patientinnen nachweisen, die direkt mit einem Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms in Beziehung gebracht werden.
  • In der Klinik werden Verfahren basierend auf dem Nachweis von E6-mRNA zur Verwendung für ein Post-Screening bevorzugt, d.h. für eine weitere Analyse der Individuen mit einer zuvor erstellten Diagnose von ASCUS, CIN 1 oder Kondylom. Das Verfahren kann verwendet werden, um solche mit einem hohen Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms von einer Gruppe von Individuen mit einer zuvor gestellten Diagnose von ASCUS, CIN 1 oder Kondylom auszuwählen. ASCUS, Kondylom und CIN I können mehr oder weniger durch dieselbe Diagnose definiert werden aufgrund der sehr niedrigen Reproduzierbarkeit zwischen unterschiedlichen Zytologen und unterschiedlichen zytologischen Abteilungen. Östör (Int J. Gyn Path. 12:186-192. 1993) fanden, dass lediglich etwa 1 % der CIN-Fälle sich zu einem Zervixkarzinom entwickeln können. Daher besteht ein tatsächlicher Bedarf an einem effizienten Verfahren zur Identifizierung einer Untergruppe von Individuen mit ASCUS, Kondylom oder CIN I, bei denen ein substantielles Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms besteht. Eine der HPV-Arten 16, 18, 31 oder 33 wurde in 87 % der Zervixkarzinom-Fallstudien von Karlsen et al., 1996, nachgewiesen. Durch den Einschluss von HPV 45 wurden beinahe 90 % der zervikalen Karzinomproben mit diesen fünf HPV-Arten in Beziehung gebracht. Daher werden, basierend auf der Berechnung aus den von Östör bereitgestellten Daten (Int J. Gyn Path. 12:186-192, 1993) mehr als 99,9 % der Fälle mit ASCUS, CIN I oder Kondylom detektierten Fälle von unserem HPV-Nachweis-Kit nicht erfasst.
  • In den erfindungsgemäßen Verfahren wird eine "positive Expression" einer mRNA benutzt, um eine Expression oberhalb des Hintergrundes zu bezeichnen. Es gibt kein absolutes Erfordernis für eine genaue quantitative Bestimmung des mRNA-Expressionsspiegels oder für eine genaue Bestimmung der relativen Expressionsspiegel von L1- und E6-mRNA.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verfahren eine quantitative Bestimmung von mRNA-Expressionsspiegeln umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Bestimmung einer "positiven Expression" das Vorliegen von mehr als 50 Kopien der relevanten mRNA (pro ml Probe oder pro Gesamtvolumen der Probe) erfordern, um eine klare Unterscheidung zwischen "positiver Expression" und "negativer Expression" zu machen, wohingegen eine Bestimmung einer "negativen Expression" das Vorliegen von weniger als eine Kopie der relevanten mRNA (pro ml Probe oder pro GesamtBd.umen der Probe) erfordert.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten die Durchmusterung auf E6-mRNA unter Verwendung eines Verfahrens, das in der Lage ist, E6-mRNA von krebsassoziierten HPV-Arten spezifisch nachzuweisen, vorzugsweise von "Hochrisiko"-krebsassoziierten HPV-Arten. Die Verfahren beinhalten die Durchmusterung auf E6-mRNA unter Verwendung eines Verfahrens, das in der Lage ist, E6-mRNA von HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und 45 nachzuweisen. Das Verfahren wird die Expression von E6-mRNA von allen fünf Arten spezifisch nachweisen. Jedoch können Frauen, die hinsichtlich einer Expression von E6 von anderen Arten als 16, 18, 31, 33 und 45, z.B. 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 und 68, noch immer "unter Risiko" zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms stehen. Eine Durchmusterung auf die Expression von E6-mRNA von einer oder mehreren dieser HPV-Arten, vorzugsweise neben einer Durchmusterung auf E6-mRNA von den HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und 45, kann durchgeführt werden. Bestimmte HPV-Arten zeigen eine markierte geographische/Populations-Verteilung.
  • Um Unklarheiten zu vermeiden, umfasst der Ausdruck "E6-mRNA", wie hier verwendet, sämtliche natürlich vorkommende mRNA-Transkripte, die das gesamte oder einen Teil des offenen Leserasters von E6 enthalten, einschließlich natürlich vorkommender Spleiß-Varianten, und schließt daher Transkripte ein, die zusätzlich das gesamte oder einen Teil des offenen Leserahmens von E7 (und tatsächlich weitere offene Leserahmen) enthalten, soweit nicht anders angegeben. Die Ausdrücke E6/E7-mRNA", "E6/E7-Transkripte" etc. werden austauschbar mit den Ausdrücken "E6-mRNA", "E6-Transkripte" verwendet und umfassen auch natürlich vorkommende mRNA-Transkripte, die den gesamten oder einen Teil des offenen Leserahmens von E6 enthalten, einschließlich natürlich vorkommender Spleiß-Varianten, und Transkripte, die den gesamten oder einen Teil des offenen Leserahmens von E7 enthalten. Der Ausdruck "Onkogen-Expression" bezeichnet auch natürlich vorkommende mRNA-Transkripte, die den gesamten oder einen Teil des Leserahmens von E6 enthalten, einschließlich natürlich vorkommender Spleiß-Varianten, die den gesamten oder einen Teil des offenen Leserahmens von E7 enthalten, soweit nicht anders angegeben.
  • Es wurden so weit vier E6/E7-mRNA-Spezies in Zellen beschrieben, die mit HPV 16 infiziert waren, nämlich ein nicht gespleißtes E6-Transkript und drei gespleißte Transkripte, die mit E6*I, E6*II und E6*III bezeichnet sind (Smotkin D, et al., J Virol. 1989 Mar 63(3):1441-7; Smotkin D, Wettstein FO. Proc NatI Acad Sci USA. 1986 Jul 83(13):4680-4; Doorbar J. et al., Virology. 1990 Sep 178(1):254-62; Cornelissen MT, et al. J Gen Virol. 1990 May 71(Pt 5):1243- 6; Johnson MA, et al. J Gen Virol. 1990 Jul 71(Pt 7):1473-9; Schneider-Maunoun S, et al. J Virol. 1987 Oct 61(10):3295-8; Sherman L, et al. Int J Cancer. 1992 Feb 50(3):356-64). Alle vier Transkripte werden von einem einzelnen Promotor (p97) transkribiert, der unmittelbar stromaufwärts des zweiten ATG von dem E6-ORF lokalisiert ist.
  • In einer Ausführungsform können die Verfahren die Durchmusterung auf E6-Transkripte umfassen, welche den gesamten oder einen Teil des offenen Leserahmens von E7 enthalten. Dies kann beispielsweise unter Verwendung von Primern oder Sonden durchgeführt werden, die für die kodierende Region von E7 spezifisch sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform können die Verfahren die Durchmusterung auf das Vorliegen von E6-Transkripten "mit voller Länge" umfassen. Im Falle von HPV 16 bezeichnet der Ausdruck "E6-Transkripte mit voller Länge" Transkripte, die die gesamte Region von dem Nukleotid (nt) 97 bis nt 880 im den E6-ORF enthalten, einschließlich 97 und 880. Die Nukleotidpositionen sind entsprechend der Standard-HPV-Nomenklatur nummeriert (s. Human Papillomvirus Compendium Online, verfügbar über das Internet oder in Papierform von der HV-Datenbank, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545, USA). Der spezifische Nachweis von Transkripten mit voller Länge kann beispielsweise unter Verwendung von Primern oder Sonden durchgeführt werden, die für die Region spezifisch sind, welche nur in den E6-Transkripten mit voller Länge vorhanden ist, nicht jedoch in Spleißvarianten. Unterschiedliche HPV-Arten zeigen unterschiedliche Muster einer E6/E7-mRNA-Expression. Die Transkriptkarten für verschiedene HPV-Arten, einschließlich der HPV-Arten 16 und 31, welche als Hilfe für die Konstruktion der Sonden oder Primer zum Nachweis von E6/E7-Transkripten verwendet werden können, sind über das Humane Papillomvirus Compendium (s. oben) öffentlich zugänglich.
  • Es werden hier E6-Oligonukleotid-Primer beschrieben, die zur Amplifikation von Regionen der E6-mRNA von verschiedenen HPV-Arten durch NASBA oder PCR geeignet sind.
  • Verfahren, welche die Durchmusterung auf eine L1-mRNA-Expression beinhalten, können die Durchmusterung auf eine L1-mRNA-Expression unter Verwendung einer Technik umfassen, die in der Lage ist, L1-mRNA von nahezu allen bekannten HPV-Arten oder wenigstens von den Haupt-Krebs-assoziierten Arten nachzuweisen (z.B. vorzugsweise alle HPV-Arten 16, 18, 31 und 33). L1-Primer und Sonden sind hier beschrieben, die in der Lage sind, L1-mRNA von den HPV-Arten 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35 und 51 in Zervixproben nachzuweisen.
  • Man kann sagen, dass der Nachweis von L1-Transkripten eine HPV-"Virulenz" feststellt, d.h. das Vorliegen einer lytischen HPV-Aktivität. Es kann gesagt werden, dass der Nachweis von E6/E7-Transkripten eine HPV-"Pathogenese" feststellt, da eine Expression dieser mRNAs auf molekulare Ereignisse hinweist, die mit dem Risiko zur Entwicklung eines Karzinoms assoziiert sind.
  • In einer Studie von 4589 Frauen war es möglich, alle Fälle bis auf einen von CIN III-Läsionen oder Krebs unter Verwendung eines Verfahrens nachzuweisen, das auf die Durchmusterung auf eine Expression von E6- und L1-mRNA basiert (s. nachfolgende Beispiele).
  • Die zuvor genannten Verfahren können die Durchmusterung auf eine Expression von mRNA-Transkripten von dem humanen p16ink4a-Gen, neben einer Durchmusterung auf eine Expression von HPV L1- und/oder E6-Transkripten umfassen.
  • Ein positives Ergebnis auf eine Expression von p16ink4a-mRNA wird als weiterer Hinweis für ein Risiko zur Entwicklung eines Zervixkarzinoms herangezogen.
  • p16ink4a, und damit verwandte Familienmitglieder, kann eine funktionsgemäße Regulation der Phosphorilierung und der suppressiven Wachstumsaktivität des Restinoblastom-Genprodukts (RB) besitzen. Dafür spricht, dass festgestellt wurde, dass es eine umgekehrte Beziehung zwischen der Expression des p16ink4a-Proteins und dem Vorliegen normaler RB in ausgewählten Krebszelllinien gibt; das p16ink4a-Protein ist nachweisbar, wenn RB mutiert, deletiert oder inaktiviert ist, und es ist in Zelllinien beträchtlich vermindert oder fehlt, die ein normales RB enthalten. Kheif et al. (Kheif SN et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 93:4350-4354, 1996) haben festgestellt, dass das p16ink4a-Protein in humanen zervikalen Karzinomzellen exprimiert wird, die entweder ein mutantes RB oder ein Wildtyp-RB enthalten, das durch E7 funktionell inaktiviert ist. Sie zeigen auch, dass die Inaktivierung von RB mit einer Hochregulation von p16ink4a korreliert, was einen Rückkopplungsmechanismus bestätigt, bei dem p16ink4a und RB beteiligt sind. Milde-Langosch et al. (Milde-Langosch K, et al., (2001) Virchows Arch 439: 55-61) haben festgestellt, dass es signifikante Korrelationen zwischen einer starken p16-Expression und einer HPV 16/18-Infektion und zwischen einer starken p16-Expression und einer HPV 16/18 E6/E7-Onkogen-Expression gab. Klaes et al., (Klaes R, et al., (2001) Int J Cancer 92: 276-284) beobachteten eine starke Überexpression des p16ink4a-Genprodukts in 150 von 152 hochgradigen dysplastischen zervikalen Läsionen (CIN II bis invasiver Krebs), während normale zervikale Epithel- oder inflammatorische oder metaplastische Läsionen nicht mit dem monoklonalen p16ink4a-spezifischen Antikörper E6H4 gefärbt wurden. Alle CIN I-gewerteten Läsionen, die mit HR-HPV-Arten assoziiert waren, zeigten keine oder nur eine begrenzte oder sporadische Reaktivität, während alle bis auf zwei CIN I-gewerteten Läsionen, die mit HR-HPV-Arten assoziiert waren, eine starke und diffuse Färbung auf p16ink4a zeigten.
  • Die offenbarten Durchmusterungsverfahren können mit einer Nukleinsäure-Präparation durchgeführt werden, die von einer klinischen Probe oder Biopsie isoliert wurde, die zervikale Zellen enthalten, die von der unter dem Test stehenden Versuchsperson entnommen wurde. Geeignete Proben, die als Nukleinsäurequelle verwendet werden können, umfassen (aber nicht ausschließlich) zervikale Abstrichstäbchen, zervikale Biopsien, zervikale Abschabungen, Hautbiopsien/Warzen, auch paraffineingebettete Gewebe, und mit Formalin oder Methanol fixierte Zellen.
  • Die unter Verwendung des offenbarten Verfahrens zur durchmusternde Nukleinsäure-Präparation muss mRNA einschließen, es muss sich jedoch nicht um eine Präparation von aufgereinigter poly A+ mRNA und Präparationen von Gesamt-RNA oder Rohpräparationen von Gesamtnukleinsäure, die sowohl RNA als auch genomische DNA enthalten, oder sogar Rohzelllysate, die auch als Ausgangsmaterial für eine NASBA-Reaktion geeignet sind, handeln. Es kann im Wesentlichen jedes auf dem Gebiet bekannte Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäurepräparation, die mRNA einschließt, verwendet werden, um Nukleinsäure von einer Testprobe zu isolieren. Ein bevorzugtes Verfahren ist das "Boom"-Isolierungsverfahren, das in US-A-5,234,809 und EP-B-0389,063 beschrieben ist. Dieses Verfahren, das zur Isolierung einer Nukleinsäurepräparation, die sowohl RNA als auch DNA enthält, verwendet werden kann, basiert auf den Nukleinsäure-Bindungseigenschaften von Silikondioxidpartikeln beim Vorliegen des chaotrophen Agenzes Guanidin-Thiocyanat (GuSCN).
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren basieren auf der Bestimmung der aktiven Transkription des HPV-Genoms in zervikalen Zellen. Die Verfahren sind nicht bezüglich der zum Nachweis der mRNA-Expression verwendeten genauen Amplifikationstechnik beschränkt. Es sind viele Verfahren zum Nachweis spezifischer mRNA-Sequenzen im Stand der Technik bekannt und können gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • Eine mRNA-Expression wird mittels eines Amplifikationsverfahrens nachgewiesen, vorzugsweise durch eine isothermale Amplifikation wie z.B. NASBA, Transkriptions-vermittelte Amplifikation, Signal-vermittelte Amplifikation von RNA-Technologie, isothermale Lösungsphasenamplifikation etc. Alle diese Verfahren sind auf dem Gebiet bekannt. Vorzugsweise wird eine mRNA-Expression durch eine isothermale Amplifikation zusammen mit einer Echtzeit-Detektion des Amplifikationsproduktes nachgewiesen. Die am meisten bevorzugte Kombination ist eine Amplifikation durch NASBA, gekoppelt mit einer Echtzeitdetektion des Amplifikationsproduktes unter Verwendung der molekularen Signaltechnologie, wie von Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Bd. 26, 2150-2155, beschrieben.
  • Die Verfahren zum Nachweis von HPV in einer Testprobe unter Verwendung der NASBA-Technik werden im Allgemeinen die folgenden Schritte umfassen:
    • (a) Zusammenfügen eines Reaktionsmediums, umfassend geeignete Primer-Paare, eine RNA-gesteuerte DNA-Polymerase, eine Ribonuklease, welche den RNA-Strang eines RNA-DNA-Hybrids hydrolysiert, ohne einzelne oder doppelstränige RNA oder DNA zu hydrolysieren, eine RNA-Polymerase, die diesen Promotor erkennt, und Ribonukleosid- und Desoxyribonukleosid-Triphosphate;
    • (b) Inkubieren des Reaktionsmediums mit einer Nukleinsäurepräparation, die von einer Testprobe isoliert wurde, die unter Verdacht steht, HPV zu enthalten, unter Reaktionsbedingungen, die eine NASBA-Amplifikationsreaktion ermöglichen; und
    • (c) Nachweisen und/oder quantitatives Messen eines HPV-spezifischen Produktes der NASBA-Amplifikationsreaktion.
  • Der Nachweis des spezifischen Produktes (der Produkte) der NASBA-Reaktion (d.h. Sinn- und/oder Antisinn-Kopien der Ziel-RNA) kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden. In einem Ansatz kann das NASBA-Produkte) durch Verwendung einer HPV-spezifischen Hybridisierungssonde nachgewiesen werden, die in der Lage ist, sich spezifisch an das NASBA-Produkt anzulagern. Die Hybridisierungssonde kann an einen sichtbaren Marker geknüpft sein, z.B. eine fluoreszierende, lumineszierende, radioaktive oder chemilumineszierende Verbindung oder eine Enzymmarkierung oder eine andere Markierungsart, die für den Fachmann bekannt ist. Die Art der Markierung ist nicht kritisch, jedoch sollte sie in der Lage sind, ein Signal zu erzeugen, das durch externe Mittel nachweisbar ist, entweder selbst oder zusammen mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen (z.B. das Substrat für ein Enzym).
  • Ein bevorzugtes Nachweisverfahren ist der sogenannte "Echtzeit-NASBA", der eine kontinuierliche Beobachtung der Bildung des Produktes der NASBA-Reaktion über den Reaktionsverlauf ermöglicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann dies mittels einer "molekularen Signal"-Sonde erreicht werden, die eine HPV-spezifische Sequenz umfasst, die in der Lage ist, sich an das NASBA-Produkt anzulagern, eine Stamm-Duplex bildende Oligonukleotid-Sequenz und ein Paar Fluoreszenz-/Lösch-Reste anzulagern, wie auf dem Gebiet bekannt und hier beschrieben. Wenn die molekulare Signalsonde vor der Amplifikation dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, kann es möglich sein, die Bildung des NASBA-Produktes in Echtzeit zu verfolgen (Leone et al., Nucleic Acis Research, 1998, Bd. 26, 2150-2155). Reagenzien und Apparate zur Durchführung einer Echtzeit-NASBA-Detektion sind kommerziell erhältlich (z.B. NucliSensTM EasyQ-System, von Organon Teknika).
  • In einem weiteren Ansatz kann die molekulare Signaltechnologie in dem Primer 2 Oligonukleotid eingebaut werden, was eine Echtzeitverfolgung der NASBA-Reaktion ermöglicht, ohne dass eine separate Hybridisierungssonde erforderlich ist.
  • In einem weiteren Ansatz können die Produkte der NASBA-Reaktion unter Verwendung einer generischen markierten Detektionssonde verfolgt werden, die an eine Nukleotidsequenz in dem 5'-Terminus des Primer 2 Oligonukleotids hybridisiert. Dies ist äquivalent zu dem "NucliSensTM"-Detektionssystem, bereitgestellt von Organon Teknika. In diesem System kann die Spezifität für NASBA-Produkte, die von der Ziel-HPV-mRNA abgeleitet sind, verliehen werden, indem HPV-spezifische Abfangsonden verwendet werden, die die hier beschriebenen Sonden-Oligonukleotide umfassen und an einem Festträger wie z.B. einem magnetischen Microbead gebunden sind. Vorzugsweise ist die generische markierte Detektionssonde die ECLTM-Detektionssonde, die von Organon Teknika bereitgestellt wird. NASBA-Amplikons sind an die HPV-spezifischen Abfangsonden und die generische ECL-Sonde (über eine Komplementärsequenz auf Primer 2) hybridisiert. Nach der Hybridisierung können die Bead/Amplikon/ECL-Sonden-Komplexe an der magnetischen Elektrode eines automatischen ECL-Lesegerätes abgefangen werden (z.B. dem NucliSensTM-Lesegerät, bereitgestellt von Organon Teknika). Danach steuert ein Spannungspuls die ECLTM-Reaktion.
  • Der Nachweis von HPV-mRNA ist auch in anderen Krebsarten als Zervixkarzinom von klinischer Relevanz, einschließlich z.B. Kopf- und Nackenkarzinom, Mund- und Zungenkarzinom, Hautkarzinom, anales und vaginales Karzinom. Der Nachweis von HPV-mRNA kann auch zur Diagnose von Mikrometastasen in Lymphknoten im unteren Bereich des Körpers eingesetzt werden.
  • Kits zur Verwendung zum Nachweis von Transkripten der L1- und E6-Gene von HPV umfassen wenigstens ein Primer-Paar, das zur Amplifikation einer Region von L1-Transkripten von wenigstens einer der HPV-Arten 16, 18, 31 und 33 und vorzugsweise auch HPV 45 verwendet werden kann, sowie einem oder mehreren Primerpaaren, welche eine Amplifikation einer Region von E6-Transkripten der HPV-Arten 16, 18, 31 und 33 und vorzugsweise auch HPV 45 ermöglicht.
  • Der Ausdruck "Primer-Paar" wird benutzt, um ein Paar von Primern zu beschreiben, die in Kombination verwendet werden, um eine spezifische Region der L1- oder E6-mRNA unter Verwendung bekannter Nukleinsäuretechniken zu amplifizieren. In bevorzugten Ausführungsformen werden die in dem Kit enthaltenen Primer-Paare für eine NASBA-Amplifikation oder ähnliche isothermale Amplifikationstechniken geeignet sein.
  • Die einzelnen Primer, aus denen jedes Primer-Paar besteht, das in dem Kit enthalten ist, können separat bereitgestellt werden (z.B. als ein separater Behälter von jedem Primer), oder können vorzugsweise gemischt in einem einzelnen Behälter bereitgestellt werden. Kombinationen von zwei oder mehreren Primer-Paaren können in einem Fertiggemisch in einem einzelnen Behälter innerhalb des Kits bereitgestellt werden. Es kann geeignet sein, zwei oder mehrere Primer-Paare in einem einzelnen Behälter bereitzustellen, wo die beiden oder mehrere Amplifikationsreaktionen "gebündelt", d.h. gleichzeitig in einem einzelnen Reaktionsgefäß durchgeführt werden.
  • Das/die Primen-Paar(e), das/die zur Verwendung zur Amplifikation einer Region von E6-Transkripten geeignet ist/sind, sollte(n) eine Amplifikation einer Region von E6-mRNA von den Haupt-Krebs-assoziierten HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und auch HPV 45 ermöglichen. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie dies erreicht werden kann.
  • Der Kit kann getrennte Primer-Paare enthalten, die spezifisch für jede der HPV-Arten 16, 18, 31 und 33, und 45 sind. Diese Primer-Paare können in dem Kit in getrennten Behältern bereitgestellt werden oder können als Gemische der beiden oder mehreren Primer-Paaren in einem einzelnen Behälter bereitgestellt werden, z.B. um eine Bündelung der Amplifikationsreaktionen zu ermöglichen.
  • Der Kit kann ein einzelnes Primer-Paar enthalten, das zur Amplifikation einer Region des E6-Gens von den HPV-Arten 16, 18, 31, 33, und auch HPV 45 fähig ist und somit eine Amplifikation von allen fünf Arten in einer einzelnen Amplifikationsreaktion ermöglicht. Dies könnte beispielsweise durch Verwendung eines Paares degenerierter Primer erreicht werden oder durch Selektion einer Region der E6-mRNA, die unter den HPV-Arten hoch konserviert ist.
  • Das E6-Primer-Paar kann einer beliebigen Region der E6-mRNA entsprechen und kann eine Amplifikation des gesamten oder eines Teils des offenen Leserahmens von E6 und/oder des offenen Leserahmens von E7 ermöglichen.
  • Das/die Primen-Paar(e), das/die zur Verwendung zur Amplifikation einer Region von N1-Transkripten geeignet ist (sind), sollte(n) in der Lage sein, eine Region der L1-mRNA von wenigstens den Hauptkrebs-assoziierten HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und vorzugsweise auch HPV 45 zu amplifizieren und wird/werden vorzugsweise für die Verwendung zur Amplifikation einer Region von L1-mRNAs von im Wesentlichen allen bekannten HPV-Arten geeignet sein. Bei Verwendung solcher Primer ist es möglich, eine aktive Transkription von L1-mRNAs von mehreren HPV-Arten in einer einzelnen Amplifikationsreaktion zu testen.
  • Es ist möglich, Primer zu konstruieren, die zum Nachweis von L1-Transkripten von mehreren HPV-Arten durch Auswahl von Regionen des L1-Transkriptes, die hoch konserviert sind, fähig sind.
  • In einem weiteren Ansatz kann die Spezifität für mehrere HPV-Arten erreicht werden, indem degenerierte Oligonukleotid-Primer oder Komplex-Gemische von Polynukleotiden verwendet werden, welche nur geringe Sequenzvariationen aufweisen, vorzugsweise solche, die den Stellen entsprechen, welche eine Sequenzvariation zwischen HPV-Genotypen aufweisen. Der Grund hinter der Verwendung solcher degenerierten Primer oder Gemische ist, dass das Gemisch wenigstens ein Primer-Paar enthalten kann, das zum Nachweis jeder HPV-Art fähig ist.
  • In einem weiteren Ansatz kann die Spezifität für mehrere HPV-Arten erreicht werden, indem in die Primer ein oder mehrere Inosin-Nukleotide eingebaut werden, vorzugsweise an Stellen einer Sequenzvariation zwischen HPV-Genotypen.
  • Die E6- und L1-Primer-Paare können in getrennten Behältern innerhalb des Kits bereitgestellt werden, oder das/die L1-Primer-Paar(e) kann(können) als ein Gemisch mit einem oder mehreren E6-Primer-Paaren in einem einzelnen Behälter bereitgestellt werden.
  • Die Kits können ferner eine oder mehrere Sonden umfassen, die für die Verwendung zur Detektion der Produkte der Amplifikationsreaktionen, die unter Verwendung der in dem Kit enthaltenen Primer-Paare durchgeführt wurden, geeignet sind. Die Sonde(n) kann(können) als getrenntes Reagenz in dem Kit bereitgestellt werden. Alternativ kann(können) die Sonde(n) als ein Gemisch einer oder mehrere Primer-Paare bereitgestellt werden.
  • Die in dem Kit enthaltenen Primer und Sonden sind vorzugsweise einzelsträngige DNA-Moleküle. Nicht natürliche, snythetische Polynukleotide, welche die Fähigkeit besitzen, eine Basenpaarung mit einem komplementären Nukleinsäuremolekül einzugehen, können ebenfalls verwendet werden, einschließlich synthetischer Oligonukleotide, welche modifizierte Basen einbauen, und synthetische Oligonukleotide, bei denen die Verbindungen zwischen einzelnen Nukleosiden andere Bindungen als Phosphodiester-Bindungen einschließen. Die Primer und Sonden können entsprechend bekannter Verfahren auf dem Gebiet hergestellt werden, wie z.B. durch chemische Synthese unter Verwendung von Standardvorrichtungen und -protokollen zur Oligonukleotidsynthese.
  • Die Primer und Sonden werden typischerweise als einzelsträngige Polynukleotide von nicht mehr als 100 Basenlänge, typischerweise weniger als 55 Basenlänge, isoliert. Um Unklarheiten zu vermeiden, ist hier festgelegt, dass die Ausdrücke "Primer" und "Sonde" natürlich vorkommende HPV-Genome voller Länge ausschließen.
  • Es können mehrere verschiedene Arten von Oligonukleotid-Primern und Sonden, welche die HPV-spezifischen Sequenzen eingebaut haben, in dem Kit enthalten sein. Typischerweise werden solche Primer und Sonden zusätzliche Nicht-HPV-Sequenzen umfassen, beispielsweise Sequenzen, die für eine Amplifikationsreaktion erforderlich sind oder welche den Nachweis der Produkte der Amplifikationsreaktion ermöglichen.
  • Die erste Art von Primern sind Primer 1 Oligonukleotide (hier auch als NASBA P1 Primer bezeichnet), welche Nukleotide mit einer Länge von allgemein ungefähr 50 Basen sind, die im Durchschnitt ungefähr 20 Basen am 3'-Ende enthalten, das komplementär ist zu einer Region der Ziel-mRNA. Oligonukleotide, die zur Verwendung als NASBA P1 Primer geeignet sind, werden als "P1/PCR" in Tabelle 1 bezeichnet. P1-Primer- Oligonukleotide haben die allgemeine Struktur X1-SEQ, wobei SEQ eine HPV-spezifische Sequenz darstellt und X1 eine Sequenz ist, die einen Promotor umfasst, der durch eine spezifische RNA-Polymerase erkannt wird. Bakteriophagen-Promotoren, z.B. die T7-, T3- und SP6-Promotoren sind zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden bevorzugt, da sie den Vorteil einer Transkription auf hohem Niveau besitzen, was lediglich von der Bindung der geeigneten RNA-Polymerase abhängt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Sequenz " X1" die Sequenz AATTCTAATACGACTCACTATAGGG oder die Sequenz AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG umfassen. Diese Sequenzen enthalten einen T7-Promotor, einschließlich der Transkriptions-Initiations-Stelle für die T7-RNA-Polymerase.
  • Die HPV-spezifischen Sequenzen in den Primern, die in der Tabelle 1 als "P1/PCR" bezeichnet sind, können auch zur Verwendung als Standard-PCR-Primer angepasst werden. Wenn diese Sequenzen als Basis von NASBA-P1-Primern verwendet werden, besitzen die allgemeine Struktur X1-SEQ, wie oben definiert. Die Promotor-Sequenz X1 ist in einem NASBA-P1-Primer essentiell. Jedoch ist es nicht notwendig, X1 einzuschließen, wenn dieselben Sequenzen als Basis von Standard-PCR-Primern verwendet werden.
  • Eine zweite Art von Primern sind NASBA-Primer 2-Oligonukleotide (hier auch als NASBA-P2-Primer bezeichnet), welche im Allgemeinen eine Sequenz von ungefähr 20 Basen umfassn, die im Wesentlichen identisch sind zu einer Region der Ziel-mRNA. Die in Tabelle 1 als "P2/PCR" aufgeführten Oligonukleotid-Sequenzen sind zur Verwendung als NASBA-P2-Primer und Standard-PCR-Primer verwendbar.
  • Oligonukleotide, die als NSBA-P2-Primer in einer bestimmten, aber nicht darauf beschränkten Ausführungsform verwendet werden sollen, umfassen ferner eine Sequenz von Oligonukleotiden am 5'-Ende, welche sich nicht auf die Ziel-mRNA bezieht, welche jedoch in der Lage ist, an eine generische Detektionssonde zu hybridisieren. Die Detektionssonde wird vorzugsweise markiert sein, z.B. mit einer fluoreszierenden, lumineszierenden oder enzymatischen Markierung. In einer Ausführungsform ist die Detektionssonde mit einer Markierung markiert, welche die Detektion unter Verwendung der ECLTM-Technologie ermöglicht, obwohl es anerkannt werden muss, dass die Erfindung keinesfalls auf dieses bestimmte Detektionsverfahren beschränkt werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das 5'-Ende der Primer-2- Oligonukleotide die Sequenz GATGCAAGGTCGCATATGAG umfassen. Diese Sequenz ist in der Lage, an eine generische ECLTM-Sonde zu hybridisieren, die kommerziell von Organon Teknika verfügbar ist und folgende Struktur besitzt:
    Ru(bpy)3 2+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3'
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Primer-2-Oligonukleotid die "molekulare Signal"-Technologie einschließen, die auf dem Gebiet bekannt ist und beispielsweise in der WO 95/13399 von Tyagi und Kramer, Nature Biotechnology. 14: 303-308, 1996, beschrieben ist, um eine Echtzeitverfolgung der NASBA-Reaktion zu ermöglichen.
  • Ziel-spezifische Sonden-Oligonukleotide können auch in dem Kit enthalten sein. Sonden-Oligonukleotide umfassen im Allgemeinen eine Sequenz von ungefähr 20-25 Basen, die im Wesentlichen identisch sind zu einer Region der Ziel-mRNA oder des Komplements davon. Ein Beispiel von HPV-spezifischen Oligonukleotid-Sequenzen, die zur Verwendung als Sonden geeignet sind, sind in Tabelle 1 mit "PO" bezeichnet. Die Sonden-Oligonukleotide können als Ziel-spezifische Hybridisierungssonden zum Nachweis der Produkte einer NASBA- oder PCR-Reaktion verwendet werden. Bei dieser Verbindung können die Sonden-Oligonukleotide an einen Festträger wie z.B. paramagnetische Beads gekoppelt werden, um eine Abfangsonde zu bilden (siehe unten). In einer bevorzugten Ausführungsform kann das 5'-Ende des Sonden-Oligonukleotids mit Biotin markiert sein. Der Zusatz einer Biotin-Markierung ermöglicht die Verknüpfung der Sonde an einen Festträger über eine Biotin-Streptavidin- oder Biotin/Avidin-Verbindung.
  • Ziel-spezifische Sonden, die eine Echtzeit-Detektion von Amplifikationsprodukten ermöglichen, können in der "molekularen Signal"-Technologie eingebaut sein, was auf dem Gebiet bekannt ist und beispielsweise von Tyagi und Kramer, Nature Biotechnology. 14: 303-308, 1996 und in WO 95/13399 beschrieben wurde. Beispiele von HPV-spezifischen Sonden-Oligonukleotid-Sequenzen, die zur Verwendung als molekulare Signalsonden geeignet sind, sind in Tabelle 1 mit "MB" bezeichnet.
  • Der Ausdruck "molekulare Signalsonden", wie hier verwendet, wird benutzt, um Moleküle mit der Struktur zu bezeichnen:
    X2-arm1-Ziel-arm2-X3
    worin "Ziel" eine zielspezifische Sequenz von Nukleotiden bezeichnet, "X2" und "X3" einen fluoreszierenden Rest und einen Quencher-Rest bezeichnen, der die Fluoreszenz von dem fluoreszierenden Rest wesentlich oder vollständig löscht, wenn die beiden nahe zusammengebracht werden, und "arm1" und "arm2" bezeichnen komplementäre Sequenzen, die zur Bildung einer Stammduplex fähig sind.
  • Bevorzugte Kombinationen von "arm1" und "arm2"-Sequenzen sind wie folgt, jedoch sollen diese zur Veranschaulichung dienen und nicht die Erfindung beschränken:
    cgcatg-SEQ-catgcg
    ccagct-SEQ-agctgg
    cacgc-SEQ-gcgtg
    cgatcg-SEQ-cgatcg
    ccgtcg-SEQ-cgacgg
    cggacc-SEQ-ggtccg
    ccgaagg-SEQ-ccttcgg
    cacgtcg-SEQ-cgacgtg
    cgcagc-SEQ-gctgcg
    ccaagc-SEQ-gcttgg
    ccaagcg-SEQ-cgcttgg
    cccagc-SEQ-gctggg
    ccaaagc-SEQ-gctttgg
    cctgc-SEQ-gcagg
    ccaccc-SEQ-gggtgg
    ccaagcc-SEQ-ggcttgg
    ccagcg-SEQ-cgctgg
    cgcatg-SEQ-catgcg
  • Die Verwendung der molekularen Signal-Technologie ermöglicht eine Echtzeit-Verfolgung von Amplifikations-Reaktionen, beispielsweise einer NASBA-Amplifikation (s. Leone et al., Nucleic Acids Research., 1998, Bd. 26, S. 2150-2155). Die molekularen Signalsonden umfassen im Allgemeinen komplementäre Sequenzen, welche die HPV-spezifische Sequenz flankieren, hier dargestellt durch den Notations-arm1 und -arm2, die in der Lage sind, aneinander zu hybridisieren, um eine Stammduplex-Struktur zu bilden. Die präzisen Sequenzen von arm1 und arm2 sind nicht Gegenstand der Erfindung, außer dem Erfordernis, dass diese Sequenzen in der Lage sein müssen, eine Stammduplex zu bilden, wenn die Sonde nicht an eine Ziel-HPV-Sequenz gebunden ist.
  • Molekulare Signalsonden umfassen auch einen fluoreszierenden Rest und einen Quencher-Rest; der fluoreszierende und die Quencher-Reste werden hier anhand der Abkürzung X2 und X3 dargestellt. Der Fachmann wird erkennen, dass die fluoreszierenden und Quencher-Reste so ausgewählt sind, dass der Quencher-Rest in der Lage ist, die Fluoreszenz von dem fluoreszierenden Rest wesentlich oder vollständig zu löschen, wenn die beiden Reste nahe zusammengebracht werden, z.B. wenn die Sonde in der "geschlossenen" Haarnadelkonformation in Abwesenheit der Zielsequenz vorliegt. Nach Bindung an die Zielsequenz werden die fluoreszierenden und Quencher-Reste auseinander gebracht, so dass die Fluoreszenz des fluoreszierenden Restes nicht länger gelöscht wird.
  • Es sind viele Beispiele von geeigneten Paaren von Quencher-/fluoreszierenden Resten entsprechend der vorliegenden Erfindung auf dem Gebiet bekannt (s. WO 95/13399, Tyagi und Kramer, ibid). Eine Vielzahl von Fluorophoren in unterschiedlichen Farben kann verwendet werden, einschließlich z.B. 5-(2'-Aminoethyl)Aminonaphtalen-1-Sulphonsäure (EDANS), Fluoreszein, FAM und Texas Rot (s. Tyagi, Bratu und Kramer, 1998, Nature Biotechnology, 16, 49-53). Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlich gefärbten Fluorophoren markiert sind, ermöglicht eine "Multiplex"-Detektion von zwei oder mehreren unterschiedlichen Sonden in einem einzelnen Reaktionsgefäß. Ein bevorzugter Quencher ist 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)Benzoesäure (DABCYL), eine nicht fluoreszierende Chromophore, die als ein "universeller" Quencher für eine Vielzahl von Fluorophoren dient. Die fluoreszierenden und Quencher-Reste können kovalent an die Sonde in beliebiger Orientierung gebunden sein; entweder befindet sich der fluoreszierende Rest am oder in der Nähe des 5'-Ende(s), und der Quencher liegt am oder in der Nähe des 3'-Ende(s) oder umgekehrt. Protokolle zur Synthese von molekularen Signalsonden sind bekannt. Ein detailliertes Protokoll zur Synthese wird in einem Dokument mit dem Titel "Molecular Beacons: Hybridization Probes for Detection of Nucleic Acids in Homogenous Solutions" von Sanjay Tyagi et al., Department of Molecular Genetics, Public Health Research Institute, 455 First Avenue, New York, NY 10016, USA, bereitgestellt, welches online über die PHRI-Webseite verfügbar ist (bei www.phri.nyu.edu oder www.molecular-beacons.org).
  • Geeignete Kombinationen der NASBA-P1- und NASBA-P2-Primer können verwendet werden, um eine NASBA-Amplifikationsreaktion zu steuern. Um eine NASBA-Amplifikationsreaktion zu steuern, müssen die Primer 1- und Primer 2-Oligonukleotide in der Lage sein, die Synthese von einer doppelsträngigen DNA von einer Zielregion der mRNA einzuleiten. Damit dies erfolgen kann, müssen die Primer 1- und Primer 2-Oligonukleotide zielspezifische Sequenzen umfassen, die komplementär sind zu Regionen des Sinn- bzw. Antisinn-Stranges der Ziel-mRNA.
  • In der ersten Phase des NASBA-Amplifikationszyklus, der sogenannten "nicht-zyklischen" Phase lagert sich das Primer 1-Oligonukleotid an eine komplementäre Sequenz in der Ziel-mRNA an, und dessen 3'-Ende wird durch die Akivität einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase verlängert (z.B. reverse Transkriptase), um eine Erststrang-cDNA-Synthese auszulösen. Der RNA-Strang des entstehenden RNA:DNA-Hybrids wird dann gespalten, beispielsweise durch die Wirkung von RNaseH, um einen einzelnen Strang DNA zu überlassen. Das Primer 2-Oligonukleotid lagert sich an die komplementäre Sequenz gegen das 3'-Ende dieser einzelsträngigen DNA an, und dessen 3'-Ende wird (durch die Wirkung einer reversen Transkriptase) verlängert, um eine doppelsträngige DNA zu bilden. Die RNA-Polymerase ist dann in der Lage, mehrere RNA-Kopien aus der nun transkriptionsaktiven Promotor-Sequenz innerhalb der doppelsträngigen DNA zu transkribieren. Dieses RNA-Transkript, welches zu der ursprünglichen Ziel-mRNA in Antisinn-Orientierung ist, kann als eine Matrize für eine weitere Runde von NASBA-Reaktionen dienen, wobei der Primer 2 sich an die RNA anlagert und die Synthese des ersten cDNA-Stranges und der Primer 2 die Synthese des zweiten cDNA-Stranges einleitet. Die generellen Prinzipien der NASBA-Reaktion sind auf dem Gebiet bekannt (s. Compton, J. Nature. 350: 91-92).
  • Die hier beschriebenen Ziel-spezifischen Sonden-Oligonukleotide können auch an einen Festträger gebunden werden, wie z.B. magnetische Mikrobeads, und als "Abfangsonden" verwendet werden, um das Produkt der NASBA-Amplifikationsreaktion zu immobilisieren (eine einzelsträngige RNA). Die hier beschriebenen, Ziel-spezifischen "molekularen Signal"-Sonden können für eine Echtzeitverfolgung der NASBA-Reaktion verwendet werden.
  • Die Kits können auch eine Positiv-Kontrolle einschließen, die E6 und/oder L1-mRNA einer bekannten HPV-Art enthalten. Geeignete Kontrollen umfassen beispielsweise Nukleinsäureextrakte, die von Zelllinien präpariert wurden, die mit bekannten HPV-Arten infiziert sind (z.B. HeLa, CaSki).
  • Die Kits können weiter interne Kontroll-Amplifikations-Primer enthalten, z.B. Primer, die für menschliche U1A RNA spezifisch sind.
  • Kits, die Primer (und ggf. Sonden) enthalten, die zur Verwendung in der NASBA-Amplifikation geeignet sind, können ferner ein Gemisch von Enzymen umfassen, das für die NASBA-Reaktion erforderlich ist, z.B. ein Enzymgemisch, das eine RNA-gesteuerte DNA-Polymerase (z.B. eine reverse Transkriptase), eine Ribonuklease, welche den RNA-Strang eines RNA-DNA-Hybrids ohne Hydrolyse einzelsträngiger oder doppelsträngiger RNA oder DNA hydrolisiert (z.B. RNaseH) und eine RNA-Polymerase enthalten. Die RNA-Polymerase sollte eine sein, welche die in der terminierten 5'-Region vorliegende Promotor-Sequenz der NASBA-P1-Primer, die in dem Reaktionskit bereitgestellt werden, erkennt. Der Kit kann auch einen Vorrat des NASBA-Puffers umfassen, der die Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside enthält, die für die RNA- und DNA-Synthese erforderlich sind. Die Zusammensetzung eines Standard-NASBA-Reaktionspuffers ist für den Fachmann bekannt (s. auch Leone et al., ibid).
  • Tabelle 1: E6-spezifische Sequenzen zum Einbau in NASBA/PCR-Primern und Sonden
    Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Tabelle 2: L1-spezifische Sequenzen zum Einbau in NASBA/PCR-Primern und Sonden
    Figure 00350001
  • Bevorzugte Primer, die zur Verwendung für den Nachweis von HPV L1- und E6-mRNA durch NASBA geeignet sind, sind in den folgenden Tabellen aufgeführt. Jedoch dienen diese lediglich zur Veranschaulichung und sollen den Umfang der Erfindung nicht auf diese spezifischen Moleküle beschränken.
  • In den folgenden Tabellen umfassen die NASBA-P2-Primer (p2) die Sequenz GATGCAAGGTCGCATATGAG am 5'-Ende; die NASBA-P1-Primer(p1) umfassen die Sequenz AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG am 5'-Ende. Oligonukleotide, die zur Verwendung als Sonden geeignet sind, werden mit "po" bezeichnet. Die p2-Primer enthalten im Allgemeinen HPV-Sequenzen von dem positiven Strang, wohingegen die p1-Primer im Allgemeinen HPV-Sequenzen von dem Negativstrang enthalten. Nt bezeichnet die Nukleotidposition in der relevanten genomischen HPV-Sequenz.
  • Tabelle 3: Bevorzugte E6-NASBA-Primer und Sonden
    Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Paare von P1- und P2-Primern mit demselben Präfix (z.B. Hae6701p1 und Hae6701p2) sind zur Verwendung in Kombination vorgesehen. Jedoch können auch andere Kombinationen verwendet werden, wie unten zusammengefasst für die HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und 45.
  • Geeignete Primerpaare zur Amplifikation von HPV 16 E6-mRNA sind wie folgt:
    Hae6701p2 oder Hae6702p2 (beide Nt 166) mit Hae6701p1 oder Hae6702p1 (beide Nt 368).
    Hae6701p2 oder Hae6702p2 (beide Nt 116) mit HPV16p1 (Nt 258).
    H16e6702Ap2 (Nt 142), H16e6702Bp2 (Nt 182), H16e6702Cp2 (Nt 185) oder H16e6702Dp2 (Nt 188) mit Hae6701p1 oder Hae6702p1 (beide Nt 368).
  • Hae6701p2 oder Hae6702p2 (beide Nt 116) mit Hae6702Ap1 (Nt 208), Hae6702Bp1 (Nt 191), Hae6702Dp1 (185). Diese Kombinationen sind zur Amplifikation von sämtlichen E6-Spleiß-Varianten geeignet.
  • Hae6703p2 oder Hae6704p2 (beide Nt 656) mit Hae6703p1 oder Hae6704p1 (beide Nt 741). Diese Kombinationen sind zur Amplifikation von sämtlichen Transkripten, welche die kodierende E7-Region enthalten (wenigstens bis zu Nt 741), geeignet.
  • Die folgenden Primer-Paare sind zur Amplifikation von HPV-18-E6-mRNA bevorzugt:
    H18e6701p2 (Nt 702) oder H18e6702p2 (Nt 698) mit H18e6701p1 oder H18e6702p1 (beide Nt 869).
    H18e6703p2 (Nt 651) mit H18e6703p1 (Nt 817).
    H18e6704p2 (Nt 179) mit H18e6704p1 (Nt 379).
  • Die folgenden Primer-Paare sind zur Amplifikation von HPV 31 E6-mRNA bevorzugt:
    H31e6701p2 oder H31e6702p2 (beide Nt 164) mit H31 e6701p1 oder H31e6702p1 (beide Nt 423).
    H31e6703p2 (Nt 617), H31e6704p2 (Nt 619) oder H31e6705p2 (Nt 617) mit H31e6703p1 (Nt 766), H31e6704p1 (766) oder H31e6705p1 (Nt 809).
  • Die folgenden Primer-Paare sind zur Amplifikation von HPV 33 E6-mRNA bevorzugt:
    H33e6701p2 (Nt 618) oder H33e6703p2 (Nt 620) mit H33e6701p1 (Nt 763) oder H33e6703p1 (Nt 807).
    H33e6702p2 (Nt 431) mit H33e6702p1 (Nt 618).
  • Das folgende Primer-Paar ist zur Amplifikation von HPV 45 bevorzugt:
    HPV45p2 (Nt 430) mit HPV45p1 (Nt 527).
  • Tabelle 4: E6 PCR Primer
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Bevorzugte PCR-Primer-Paare für HPV-Arten 16, 18, 31 und 33 sind analog zu den NASBA-Primer-Paaren.
  • Tabelle 5: Bevorzugte L1-NASBA-Primer und Sonden
    Figure 00460002
  • Figure 00470001
  • Tabelle 6 – Bevorzugte L1 PCR-Primer
    Figure 00470002
  • Die HPV-spezifischen Sequenzen in SEQ ID Nos. 149 und 150 (Primer Onc2A2/Onc2A1-PCR und Onc2A1/Onc2A2-PCR) sind identisch zu den Fragmenten der genomischen Sequenz von HPV-Art 16 an der Position 6596 – 6615 (SEQ ID NO:149; Onc2A2/Onc2A1-PCR), und von der Position 6729 bis 6747 (SEQ ID NO:150; Onc2A1/Onc2A2-PCR).
  • Die HPV-spezifischen Sequenzen SEQ ID Nos:152 und 153 (Onc2B2/Onc2B1-PCR bzw. Onc2B1/Onc2B2-PCR) sind Varianten der oben genannten Sequenzen, einschließlich mehrerer degenerierter Basen. Darstellungen der Sequenzen von hier bereitgestellten degenerierten Oligonukleotid-Molekülen verwenden den Standard-IUB-Code für gemischte Basenstellen: N=G,A,T,C; V=G,A,C; B=G,T,C; H=A,T,C; D=G,A,T; K=G,T; S=G,C; W=A,T; M=A,C; Y=C,T; R=A, G.
  • Es ist auch möglich, Varianten der HPV-spezifischen Sequenzen SEQ ID NO:152 (Onc2B2/Onc2B1-PCR) und SEQ ID NO:153 (Onc2B1/Onc2B2-PCR) zu verwenden, worin beliebige zwei Nukleotide "SRH" gegen das 3'-Ende der Sequenz mit Inosin (I) ersetzt werden können, wie folgt:
    5' AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3'
    5' AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3'
    5' AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3'
  • Die HPV-spezifischen Sequenzen SEQ ID NOs: 156-163 (vorhanden in Primern Onc2C2, Onc2D2, Onc2E2, Onc2F2, Onc2G2, Onc2H2, Onc2I2, Onc2J2, Onc2C1-PCR, Onc2D1-PCR, Onc2E1-PCR, Onc2F1-PCR, Onc2G1-PCR, Onc2H1-PCR, Onc2I1-PCR und Onc2J1-PCR) sind Varianten basierend auf der HPV-spezifischen Sequenz SEQ ID NO:152 (Onc2B2/Onc2B1-PCR), in denen die HPV-spezifischen Sequenzen SEQ ID NOs: 164-169 (vorhanden in Primern Onc2K1, Onc2L1, Onc2M1, Onc2N1, Onc2O1, Onc2P1, Onc2K2-PCR, Onc2L2-PCR, Onc2M2-PCR, Onc2N2-PCR, Onc2O2-PCR und Onc2P2-PCR Varianten sind, die auf der HPV-spezifischen Sequenz SEQ ID NO:153 (Onc2B1/Onc2B2-PCR) basieren. Diese Varianten umfassen degenerierte Basen und auch Inosin (I)-Reste. Diese Sequenzvariation ermöglicht, dass Oligonukleotide, welche die Variantensequenzen eingebaut haben, an mehrere HPV-Arten binden. Inosinbasen interferieren nicht mit der Hybridisierung und können so an Variationsstellen zwischen HPV-Arten angeschlossen sein, um einen "Konsensus"-Primer zu konstruieren, der zur Bindung an mehrere HPV-Arten fähig ist.
  • Einer oder mehrere der Primer Onc2A2, Onc2B2, Onc2C2, Onc2D2, Onc2E2, Onc2F2, Onc2G2, Onc2H2, Onc2I2 und Onc2J2 können in Kombination mit einem oder mehreren der Primer Onc2A1, Onc2B1, Onc2K1, Onc2L1, Onc2M1, Onc2N1, Onc2O1 und Onc2P1 zur NASBA-Amplifikation von HPV-L1-mRNA verwendet werden.
  • Einer oder mehrere der Primer Onc2A1-PCR, Onc2B1-PCR, Onc2C1-PCR, Onc2D1-PCR, Onc2E1-PCR, OncF1-PCR, Onc2G1-PCR, Onc2H1-PCR, Onc2I1-PCR und Onc2J1-PCR können in Kombination mit einem oder mehreren der Primer Onc2A2-PCR, Onc2B2-PCR, Onc2K2-PCR, Onc2L2-PCR, Onc2M2-PCR, Onc2N2-PCR, Onc2O2-PCR und Onc2P2-PCR zur PCR-Amplifikation von HPV-L1 verwendet werden.
  • Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden experimentellen Beispiele und Zeichnungen näher beschrieben, in denen:
  • 1 die Ergebnisse eines Einzelreaktion-Echtzeit-NASBA-Assays unter Verwendung eines molekularen FAM-Signals für HPV 16 mit einer Patientenprobe zeigt, während 1B einen Multiplex-Echtzeit-NAABA-Assay zeigt, unter Verwendung des molekularen FAM-Signals von 1A und eines molekularen Signals, das mit Texas-Rot für UIA markiert ist,
  • 2A einen Einzelreaktion-Echtzeit-NASBA mit einem molekularen FAM-Signal für HPV 18 mit einer Patientenprobe zeigt, während 2B eine Multiplex-Version mit einem Texas-Rot-markierten molekularen Signal für HPV 18 und einem FAM-markierten Signal für HPV 33 zeigt,
  • 3A einen Einzelreaktion-Echtzeit-NASBA mit einem HPV 31 FAM-markierten molekularen Signal zeigt, während 3B eine Multiplex-Version ist, die ein HPV 45 Texas-Rot-markiertes molekulares Signal einschließt,
  • 4A einen Einzelreaktion-Echtzeit-NASBA mit einem HPV 33 FAM-markierten molekularen Signal zeigt, während 4B eine Multiplex-Version ist, die ein Texas-Rot-markiertes molekulares HPV-18-Signal einschließt,
  • 5A einen Einzelreaktion-Echtzeit-NASBA mit einem HPV 45 FAM-markierten molekularen Signal zeigt, während 5B die Multiplex-Version zeigt, die ein HPV 45 Texas-Rot-markiertes molekulares Signal und ein FAM-markiertes molekulares HPV-31-Signal einschließt, und
  • 6 HPV, detektiert durch PreTect HPV-Proofer und PCR im Vergleich zur Zytologie oder Histologie zeigt.
  • Beispiel 1 – Nachweis von HPV-mRNA durch auf NASBA basierende Nukleinsäure-Amplifikation und Echtzeit-Detektion
  • Sammlung und Präparation klinischer Proben
  • Pap-Abstriche und HPV-Proben wurden von 5970 Frauen in dem zervikalen Durchmusterungsprogramm in Oslo, Norwegen, gesammelt. Die Proben, die zur RNA/DNA-Extraktion vorgesehen sind, wurden wie folgt behandelt:
    Die Zervixproben wurden von jeder Frau, die an dem Zervix-Durchmusterungsprogramm teilnahm, unter Verwendung einer Zytobürste (Rovers Medical Devices, The Netherlands) gesammelt. Die Zytobürste wurde dann in 9 ml Lysepuffer eingetaucht (5M Guanidinthiocyanat). Da RNA am besten in 5M Guanidinthiocyanat bei –70° geschützt ist, wurde lediglich 1 ml Gesamtvolumen Probe für jede Extraktionsrunde verwendet. Die Proben in Lysepuffer wurden bei –20° C für nicht mehr als eine Woche gelagert, dann bei –70°C bis zur Isolierung von DNA/RNA gelagert.
  • RNA und DNA wurden automatisch von 5300 Frauen in der ersten Extraktionsrunde isoliert unter Verwendung von 1 ml der Gesamtprobe von 9 ml Lysepufter. RNA und DNA wurden gemäß dem "Booms"-Isolierungsverfahren von Organon Teknika (Organon Teknika B.V., Boselind 15, P.O. Box 84, 5280 AB Baxtel, Niederlande; jetzt Biomerieux, 69280 Marcy I'Etoile, Frankreich), unter Verwendung des NuclisensTM-Extraktors, dem Protokoll für eine automatisierte Extraktion folgend, extrahiert.
  • Zelllinien
  • DNA und RNA von HeLa (HPV 18), SiHa (HPV 16) und CaSki (HPV 16) Zelllinien wurden als Positivkontrollen für die PCR- und NASBA-Reaktion verwendet. Diese Zellen wurden auch als Probenmaterial in der Sensitivitätsstudie verwendet (Beispiel 2). SiHa-Zellen haben 1-2 Kopien HPV-16 pro Zelle integriert, während CaSki-Zellen zwischen 60-600 Kopien HPV 16 sowohl im integrierten als auch im episomalen Zustand haben. HeLa-Zellen haben ungefähr 10-50 Kopien HPV 18 pro Zelle.
  • HPV-Detektion und -Bestimmung durch PCR
  • Isolierte DNA von zervikalen Abstrichen wurde einer PCR unter Verwendung der Konsensus GP5+/6+-Primer (EP-B-0 517 704) ausgesetzt. Die PCR wurde in 50 μl Reaktionsvolumen, enthaltend 75 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25° C), 20 mM (NH4)2SO4, 0,01 Tween 20TM, 200 mM jeweils dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1 U rekombinante Taq-DNA-Polymerase (MBI-Fermentas), 3 μl DNA-Probe und 50 pmol von jedem GP5+- und GP6+-Primer durchgeführt. Ein zweiminütiger Denaturierungsschritt wurde bei 94° C, gefolgt von 40 Amplifikationszyklen mit einem PCR-Prozessor durchgeführt (Primus 96, HPL-Block, MWG, Deutschland). Jeder Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt von einer Minute, einen Primer-Anlagerungsschritt bei 40° C für 2 Minuten und einen Kettenverlängerungsschritt bei 72° C für 1,5 Minuten. Der endgültige Elongationsschritt wurde um 4 Minuten verlängert, um eine vollständige Verlängerung der amplifizierten DNA sicherzustellen.
  • Die GP5+/6+-positiven Proben wurden den Protokollen für die HPV-Arten 16, 31 und 33 wie folgt ausgesetzt: HPV 16, 31 und 33: die PCR wurde in 50 μl durchgeführt, enthaltend 75 mM Tris-HCl 8pH 8,8 bei 25° C), 200 mM von jedem dNTP, 1,5 mM MgCl2, 2,5 U-rekombinante Taq-DNA-Polymerase (MBI Fermentas), 3 μl DNA-Probe und 25 pmol von jedem Primer. Ein zweiminütiger Denaturierungsschritt bei 94° C, gefolgt von 35 Amplifikationszyklen mit einem PCR-Prozessor (Primus 96, HPL-Block, MWG, Deutschland), wurde durchgeführt. Jeder Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt bei 30 Sek., einen Primer-Anlagerungsschritt bei 57° C für 30 Sek. und einen Kettenverlängerungsschritt bei 72° C für 1 Minute. Der endgültige Elongationsschritt wurde um 10 Min. verlängert, um eine Bd.lständige Verlängerung der amplifizierten DNA sicherzustellen. Das Protokoll für HPV 33 sieht einen Primer-Anlagerungsschritt bei 52° C vor. HPV 18 Protokoll: die Primer wurden konstruiert, um HPV-Art 18 nachzuweisen. Die PCR wurde in 50 μl durchgeführt, enthaltend 75 mM Tris-HCl (ph 8,8 bei 25° C), 20 mM (NH4)2SO4, 0,01 % Tween 20, 200 mM jeweils dNTP, 2,0 mM MgCl2, 2,5 U-rekombinante Taq-DNA-Polymerase (MBI-Fermentas), 3 μl DNA-Probe und 25 pmol von jedem Primer. Ein zweiminütiger Denaturierungsschritt wurde bei 94° C, gefolgt von 35 Amplifikationszyklen mit einem PCR-Prozessor durchgeführt (Primus 96, HPL-Block, MWG, Deutschland). Jeder Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt von 30 Sek., einen Primer-Anlagerungsschritt bei 57° C für 30 Sek. und einen Kettenverlängerungsschritt bei 72° C für 1 Minute. Der endgültige Elongationsschritt wurde um 10 Minuten verlängert, um eine vollständige Verlängerung der amplifizierten DNA sicherzustellen.
  • Der gegen das humane β-Globin-Gen gerichtete Primersatz wurde als Kontrolle für die DNA-Qualität verwendet (Operating procedure, University Hospital Vrije Universiteit, Amsterdam, Niederlande). Die PCR wurde durchgeführt in 50 μl, enthaltend 75 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25° C), 200 mM von jedem dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1 U rekombinante Taq DNA-Polymerase (MBI Fermentas), 3 μl DNA-Probe und 25 pmol von jedem Primer. Ein zweiminütiger Denaturierungsschritt bei 94° C, gefolgt von 35 Amplifikationszyklen mit einem PCR-Prozessor (Primus 96, HPL Block, MWG, Deutschland) wurde durchgeführt. Jeder Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94° C für 1 Minute, einen Primeranlagerungsschritt bei 55° C für 1 % Min. und einen Kettenverlängerungsschritt bei 72° C für 2 Minuten. Der endgültige Verlängerungsschritt wurde um 4 Min. verlängert, um eine vollständige Verlängerung der amplifizierten DNA sicherzustellen. HeLa wurden als Positivkontrollen für HPV 18 verwendet, während SiHa oder CaSki als Positivkontrolle für HPV 16 verwendet wurden. Wasser wurde als Negativkontrolle verwendet.
  • Primer, die für die HPV PCR verwendet wurden:
    Figure 00520001
  • Die Visualisierung der PCR-Produkte wurde auf einem DNA-500-Chip entsprechend dem Handbuch durchgeführt (Agilent Technologies, USA). Der DNA-Chip verwendet eine Mikroskalengel-Elektrophorese mit einem optimalen Detektionslimit von 0,5 bis 50 ng/ml. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Bioanalyser 2100 Software ausgewertet (Agilent Technologies, USA).
  • Die folgende Tabelle stellt die Primer dar, die für die HPV-PCR in Patientenproben verwendet wurden und gibt zusätzliche PCR-Primer an, die für HPV 35, 39, 45, 51, 52, 58 und HPV 6/11 verwendbar sind.
  • PCR-Primer zur Detektion von HPV
    Figure 00530001
  • NASBA-RNA-Amplifikation
  • Vorkehrungen zur Vermeidung einer Kontamination:
    • 1. Durchführung einer Nukleinsäure-Freisetzung, Isolierung und Amplifikation/Detektion in getrennten Laborbereichen.
    • 2. Lagerung und Herstellung von Reagenzien zur Nukleinsäure-Freisetzung, Isolierung und Amplifikation/Detektion in den Laborbereichen, in denen eine Nukleinsäure-Freisetzung, Isolierung und Amplifikation/Detektion durchgeführt wird.
    • 3. Sämtliche Behälter und Gefäße sollen geschlossen sein, wenn sie nicht verwendet werden.
    • 4. Pipetten und anderes Werkzeug, das in einem Laborbereich verwendet wurde, dürfen nicht in anderen Bereichen verwendet werden.
    • 5. Verwendung einer frischen Pipette oder Pipettenspitze für jede Pipettieraktion.
    • 6. Verwendung von Pipetten mit aerosolresistenten Spitzen für Fluide, die möglicherweise Nukleinsäure enthalten. Die Pipettierung der Lösung muss jedes Mal aus oder in ein isoliertes Gefäß erfolgen, das speziell für diese Aktion geöffnet und geschlossen wird. Alle anderen Röhrchen und Gefäße sollten geschlossen bleiben und von den zu behandelnden Röhrchen und Gefäßen getrennt werden.
    • 7. Verwendung von Wegwerf-Handschuhen bei Arbeit mit klinischem Material, das möglicherweise Ziel-RNA oder amplifiziertes Material enthält. Wenn möglich, Handschuhwechsel nach jedem Pipettierschritt in der Testprozedur, insbesondere nach Kontakt mit möglicherweise kontaminiertem Material.
    • 8. Sammeln von verwendetem wegwerfbarem Material in einem Behälter. Verschließen und Entfernen des Behälters nach jedem Testlauf.
    • 9. Eintauchen von Röhrchenständern, die während der Nukleinsäureisolierung oder Amplifikation/Detektion verwendet wurden, in ein Detergenz (z.B. Merck Extran MA01 Alkali) für wenigstens eine Stunde nach jedem Testlauf.
  • Die folgende Prozedur wurde durchgeführt unter Verwendung von Reagenzien von NuclisensTM Basic Kit, zur Verfügung gestellt von Organon Teknika.
  • Prozedur für n=10 Proben:
  • 1. Herstellung der Enzymlösung:
  • Hinzufügen von 55 μl Enzymverdünnung (von NuclisensTM Basic Kit, enthält Sorbitol in wässriger Lösung) zu jeder der 3 lyophylisierten Enzymsphären (von NuclisensTM Basic Kit; enthält AMV-RT, RNase H, T7 RNA Polymerase und BSA). Belasse dieser Enzymlösung für wenigstens 20 Min. bei Raumtemperatur. Überführen der Enzymlösungen in ein Röhrchen, gutes Vermischen durch Antippen des Röhrchens mit dem Finger, kurzes Abzentrifugieren und Verwendung innerhalb einer Stunde. Endkonzentrationen in dem Enzymmix sind 375 mM Sorbitol, 2,5 μg BSA, 0,08 U RNase H, 32 U T7 RNA Polymerase und 6,4 U AMV-reverse Transkriptase.
  • 2. Herstellung der Reagenzspähren-/KCl-Lösung
  • Für 10 Proben: Hinzufügen von 80 μl Reagenzsphärenverdünnung (von NuclisensTM Basic Kit; enthält Tris/HCl (pH 8,5), 45 % DMSO) zu der lyophylisierten Reagenzsphäre (von NuclisensTM Basic Kit; enthält Nukleotide, Dithiotreitol und MgCl2) und unmittelbaren guten Vortexen. Führe dies mit 3 Reagenzsphären durch und mische die Lösungen in ein Röhrchen.
  • Hinzufügen von 3 μl NASBA-Wasser (von NuclisensTM Basic Kit) zu der rekonstituierten Reagenzsphärenlösung und gutes Vermischen.
  • Hinzufügen von 56 μl der KCl-Stammlösung (von NuclisensTM Basic Kit) und gutes Vermischen. Die Verwendung dieses KCl/Wasser-Gemisches wird NASBA-Reaktionen mit einer KCl-Endkonzentration von 70 mM ergeben. Die Endkonzentrationen in der Reagenz/KCl-Lösung sind 1 mM für jedes dNTP, 2 mM ATP, UTP und CTP, 1,5 mM GTP und 0,5 mM ITP, 0,5 mM Dithiotreitol, 70 mM KCl, 12 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl (pH 8,5).
  • 3. Herstellung der Primer-/Sondenlösung, die zielspezifische Primer und eine molekulare Signalsonde enthält.
  • Für jede Zielreaktion wurden 91 μl der Reagenzspähren/KCl-Lösung (hergestellt in Schritt 2) in ein frisches Röhrchen überführt. Hinzufügen von 25 μl der Primer/molekularen Signalsondenlösung (um eine Endkonzentration von ungefähr 0,1-0,5 μM für jeden der Sinn- und Antisinn-Primer und ungefähr 15-70 pmol der molekularen Signalsonde pro Reaktion zu ergeben). Gutes Vermischen durch Vortexen, kein Zentrifugieren.
  • Für den Fall, dass weniger als 10 Ziel-RNA-Amplifikationen durchgeführt wurden, bezieht man sich auf die Tabelle unten für die geeigneten Mengen von Reagenzspährenlösung, KCl-Wasserlösung und der zu verwendenden Primer. Die Primer-Lösungen sollten innerhalb von 30 Minuten nach deren Präparation verwendet werden.
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • 4. Zusatz von Proben
  • Für jede Ziel-RNA-Reaktion:
  • Zu jeder Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen wurden 10 μl der Primer-/Sondenlösung (hergestellt in Schritt 3) in jede der 10 Vertiefungen pipettiert. Hinzufügen von 5 μl Nukleinsäureextrakt zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Mikrotiter-Platte für 4 Min. bei 65 ± 1 ° C. Abkühlen ab auf 41 ± 0,5° C für 4 Min. Dann Hinzufügen von 5 μl Enzymlösung zu jeder Vertiefung. Gib die Mikrotiter-Platte unverzüglich in ein Fluoreszenz-Detektions-Gerät (z.B. NucliSensTM EasyQ Analyzer) und starte die Amplifikation.
  • Ergebnisse der klinischen Studie
  • Tabelle 7 zeigt die Verteilung von Echtzeit-NASBA HPV-positiven (L1- und/oder E6-Expression) und PCR-HPV-positiven Fällen bezogen auf zytologische Ergebnisse. Die PCR-Amplifikation wurde durchgeführt wie beschrieben von Karlsen et al., J Clin Microbiol. 34: 2095-2100, 1996. Die Figuren für die erwartete Histologie basieren auf Durchschnittsergebnissen einer ähnlichen Studie von CIN III-Läsionen (Clavel et al., Br J Cancer, 84: 1616-1623, 2001). Die Ergebnisse von mehreren Beispielfällen sind in Tabelle 8 aufgeführt.
  • Tabelle 7:
    Figure 00560002
  • Tabelle 8:
    Figure 00570001
  • Beispiel 2: Empfindlichkeit der Echtzeit-NASBA auf Kontrollzelllinien
  • Zervikale Krebszelllinien, CaSki, SiHa und HeLa wurden in Lyse-Puffer entweder vor der automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung des Boom's Extraktions-Verfahrens von Organon Teknika/bioMerieux (Parallelen 1 und 3) oder nach der Nukleinsäure-Extraktion (Parallele 2) verdünnt. Der Echtzeit-NASBA wurde unter Verwendung von molekularen Signalsonden durchgeführt, die mit Texas-Rot (16, L1 und 18) oder FAM (U1A, 33 und 31) entsprechenden dem oben beschriebenen Protokoll markiert waren.
  • Tabelle 9:
    Figure 00580001
  • Somit ist es möglich, HPV E6 mRNA in weniger als einer Zelle unter Verwendung von Echtzeit-NASBA nachzuweisen.
  • Der Echtzeit-NASBA wurde sowohl als ein gebündelter Assay als auch in Einzelreaktionen getestet. Die Ergebnisse der folgenden Sensitivitätsstudie basieren auf parallelen Läufen mit CaSki-, SiHa- und HeLa-Zelllinien sowie auf drei parallelen Läufen mit synthetischen DNA-Oligos für die HPV-Art 16, 18, 31 und 33. Die Festlegung der Detektionsgrenze besteht darin, dass beide Proben in der Parallelen positiv sind. Die Zahl in Klammern (x) bezeichnet, dass die spezifizierte Menge von Zellen auch in einigen Läufen nachgewiesen worden ist. Die Empfindlichkeit wird als die Menge von Zellen definiert, die für die Detektion von HPV in zwei parallelen Läufen notwendig ist. Die HPV-Arten werden durch PCR bestimmt, und die Spezifität basiert auf NASBA im Vergleich zur PCR.
  • Sensitivität
  • PCR: die HPV-Konsensus-PCR unter Verwendung von Gp5+/6+ detektierte lediglich bis zu 104 SiHA- und HeLa-Zellen und bis zu 103 CaSki-Zellen. Jedoch waren die artspezifischen PCR-Primer-Sätze sensitiver und detektierten 103 (102) SiHa-Zellen und 0,1 CaSki-Zellen für den HPV 16 artspezifischen PCR-Primer-Satz, während der HPV 18 artspezifische PCR-Primer-Satz 102-Zellen nachwies.
  • Echtzeit-NASBA: Echtzeit-NASBA mit Primern, die spezifisch für U1A sind, führte zum Nachweis von 10 (1) SiHa- und CaSki-Zellen und einer HeLa-Zelle in dem Reaktionsgemisch.
  • Für die HPV16-spezifischen Primer war das untere Detektionslimit (10) (102, 1) SiHa-Zellen und 10 (1) CaSki-Zellen, und bei den HPV18-spezifischen Primern war das Detektionslimit 1 (0,1) HeLa-Zellen. Die universellen L1-Primer führten zum Nachweis von 10 CaSki-Zellen. HeLa-Zellen und SiHa-Zellen wurden mit dem universellen L1-Primer nicht nachgewiesen.
  • Echtzeit-Multiplex-NASBA mit den U1A-spezifischen Primern hatte ein niedriges Detektionslimit von 102(10) SiHa-Zellen und 10(1) CaSki-Zellen bei Kombination mit den HPV16-spezifischen Primern, welche ein niedrigeres Detektionslimit für 10(1) SiHa und 10(1) CaSki-Zellen hatten. Die L1-spezifischen Primer in Kombination mit den HPV33-spezifischen Primern führte zum Nachweis von 103(102) CaSki-Zellen. Es war keine konkurrierende HPV33-Probe in der Reaktion. Bei den HPV18-spezifischen Primern war das niedrigere Detektionslimit 1 (0,1) HeLa-Zellen bei Kombination mit den HPV31-spezifischen Primern. Es war keine konkurrierende HPV31-Probe in der Reaktion. Die Empfindlichkeit der HPV31- und HPV33-spezifischen Primern wurde aufgrund des Fehlens von Zelllinien, welche diese HPV-Arten beherbergen, nicht getestet. Sie wurden gegen Proben getestet, die HPV 31 und HPV 33 enthalten, jedoch war die Anzahl der Zellen und die Kopienzahl von HPV 31 und HPV 33 in diesen Zellen unbekannt und variierte vermutlich in unterschiedlichen Proben.
  • Tabelle 10: Sensitivität von Echtzeit-NASBA im Vergleich zu PCR
    Figure 00590001
  • Echtzeit-NASBA wurde mit Proben von Frauen durchgeführt, die vom Ostfold Central Krankenhaus stammten, zur Behandlung von CIN im Zeitraum von 1999-2001 (s. Beispiel 3). Molekulare Signalsonden, die mit FAM oder Texas-Rot markiert waren, wurden zusammen mit der Nukleinsäure-Extraktion und den oben beschriebenen NASBA-Protokollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 1A und 1B gezeigt (HPV 16 – Patientenprobe 205), 2A und 2B (HPV 18 – Patientenprobe 146), 3A und 3B (HPV 31 – Patientenprobe 236), 4A und 4B (HPV 33 – Patientenprobe 218) und 5A und 5B (HPV 45 – Patientenprobe 343). In jedem Fall bezieht sich die "A"-Figur auf eine Einzelreaktion, während sich die "B"-Figur auf den Multiplex-Assay bezieht.
  • Spezifität: Die Kreuzreaktivität von Echtzeit-NASBA.
  • Echzeit-NASBA-Primer-Kombinationen wurden gegen 490 Zervixproben von der Oslo-Studie getestet, die mit PCR für HPV 6/11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58 oder HPV X positiv waren, um eine Kreuzreaktivität zwischen den HPV-Arten unter Verwendung von NASBA zu überprüfen. Alle Proben wurden durch Konsensus-PCR und einer artspezifischen PCR für die jeweiligen HPV-Arten charakterisiert, außer für die HPV-Art 39(2), 52(1) und 58(2). Diese Proben wurden zum Test gegen PreTect-HPV-Proofer hinzugefügt. HPV X sind positiv für die Konsensus Gp5+/6+-PCR, jedoch negativ für HPV6/11, 16, 18, 31, 33, 35, 45 und 51 durch artspezifische PCR. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Es wurde keine Kreuzreaktivität gezeigt. Der Sequenznachweis für eine ausgewählte Anzahl von Fällen aus Tabelle 14 ist in Tabelle 14a gezeigt.
  • PCR: insgesamt wurden 773 Zervixproben mit PCR und dem PreTect HPV-Proofer getestet (Echtzeit-Multiplex-NASBA), und insgesamt 24,6 % (190/773) Proben waren positiv mit den Gp5+/6+-Konsenus-PCR-Primern. 74,1 % (83/112) wurden als HPV 16, 13 % (15/112) als HPV 18, 17 % (19/112) als HPV 31 und 12 % (13/112) als HPV 33 eingeordnet, einschließlich multipler HPV-Infektionen. Insgesamt 103 Proben hatten eine einzelne oder mehrere HPV-Infektionen, und 91,3 % (94/103) besaß lediglich eine einzelne HPV-Infektion. Doppelte HPV-Infektionen traten in 8,7 % (9/103) der Proben auf. Alle Proben wurden zuerst mit den Konsenus Gp5+/6+-PCR-Primern getestet. Die HPV-PCR-negativen Proben von den Konsenus Gp5+/6+ wurden dann mit den β-Globin-Kontroll-Primern zur Verifizierung von intakter DNA getestet. Die HPV-PCR-positiven Proben wurden dieser DNA-Kontrolle nicht ausgesetzt. Die HPV-Negativ-Proben in dieser Studie waren alle positiv mit den β-Globin-Kontroll-Primern. Lediglich DNA-Proben, die bei einer Gp5+/6+-PCR positiv waren, wurden einer HPV-artspezifischen PCR ausgesetzt. HPV-Arten von Interesse waren HPV 16, 18, 31 und 33.
  • Echtzeit-Multiplex-NASBA: Für die Echtzeit-NASBA-Reaktionen wurden die Primer und Sonden von dem U1A-Genprodukt als Leistungskontrolle für intakte RNA verwendet. Proben, die negativ für U1A waren, wurden zurückgewiesen. Insgesamt 14,2 % (110/773) der Proben waren positiv für wenigstens einen der HPV-artspezifischen NASBA-Primer, einschließlich Proben, die mehrere HPV-Infektionen zeigten. Von diesen Proben waren 54,5 % (60/110) positiv mit den HPV16-NASBA-Primern, 13,6 % (15/110) mit den HPV18-Primern, 21,8 % (24/110) mit den HPV31-Primern und 13,6 % (15/110) mit den HPV33-Primern. Insgesamt 45 Proben waren positiv mit den L1-Konsensus-Primern und im Allgemeinen zusammen mit der HPV16-E6/E7-Onkogen-Expression 82,2 % (37/45). Der Konsensus L1 wurde in 2,2 % (1/45) zusammen mit entweder HPV 18, 31 bzw. 33 nachgewiesen. L1 wurde auch alleine in 8,9 % (4/45) der Fälle nachgewiesen, und sie alle waren PCR-positiv mit den Gp5+/6+-Primern. Insgesamt 108 Proben hatten eine einzelne oder mehrere HPV-Infektionen, und 98,1 % (106/108) hatten lediglich eine einzelne HPV-Infektion. Eine doppelte mRNA-Expression trat in 1,9 % (2/108) der Proben auf.
  • Echtzeit-Multiplex-NASBA im Vergleich zur PCR: insgesamt 87 Proben zeigten ein Vorliegen von HPV16-DNA oder RNA bei der HPV16-PCR oder PreTect HPV-Proofer. 64,4 % (56/87) wurden positiv für HPV 16 sowohl bei der PCR- als auch der Echtzeit-NASBA bestimmt. 39,1 % (34/87) waren lediglich bei der PCR positiv, und 3,4 % (3/87) waren lediglich beim Echtzeit-NASBA positiv. Bei HPV 18 zeigten insgesamt 20 Proben das Vorliegen von HPV 18 DNA oder RNA entweder in der PCR- oder im Echtzeit-NASBA. Von diesen 20 Proben waren 50 % (10/20) positiv bei beiden Tests, und 35 % (7/20) waren lediglich positiv bei der PCR, und 15 % (3/20) waren lediglich positiv beim Echtzeit-NASBA. Insgesamt 27 Proben zeigten das Vorliegen von HPV 31 DNA oder RNA entweder in der PCR- oder Echtzeit-NASBA. Von diesen 27 Proben waren 59,3 % (16/27) positiv bei beiden Tests, und 11,1 % (3/27) waren positiv lediglich beim PCR-Test, und 18,5 % (5/27) waren lediglich positiv beim Echtzeit-NASBA-Test. Bei HPV 33 zeigten insgesamt 18 Proben das Vorliegen von HPV DNA oder RNA entweder bei PCR- oder PreTect-HPV-Proofern, und 55,6 % (10/18) der Proben waren bei beiden Tests positiv getestet worden. 16,7 % (3/18) waren lediglich positiv bei der PCR, und 22,2 % (4/18) waren lediglich positiv beim Echtzeit-NASBA.
  • Tabelle 11: Statistische Verteilung von HPV in Proben bei PCR und Echtzeit-NASBA
    Figure 00620001
  • Tabelle 12: Vergleich zwischen PCR und Echtzeit-NASBA
    Figure 00620002
  • Tabelle 13: Echtzeit-NASBA-Ergebnisse für L1
    Figure 00620003
  • Tabelle 14: Genetische Spezifität von Echtzeit-Multiplex-NASBA im Vergleich zu PCR
    Figure 00630001
  • Tablle 14a: DNA-Sequenzierung von Gp5+-PCR-Primern (nicht in dem Artikel eingeschlossen)
    Figure 00630002
  • Diskussion
  • Die Empfindlichkeit des Echtzeit-NASBA war im Allgemeinen besser als die Empfindlichkeit der PCR. Die allgemeine Empfindlichkeit von Echtzeit-NASBA für alle Marker betrug zwischen 1 und 102 Zellen, was um Einiges besser ist als für die PCR-Reaktion mit einem Empfindlichkeitsbereich von 102 bis 104. Wie erwartet, war die Empfindlichkeit der spezifischen Primer und Sonden besser als die Empfindlichkeit der universellen Primer und Sonden. Echtzeit-NASBA war genau so sensitiv oder sensitiver als ein Echtzeit-Multiplex-NASBA.
  • Echzeit-NASBA-Primer und die molekulare Signalsonde, die gegen U1A gerichtet war (ein menschliches Haushaltsgen), wurden als Leistungskontrolle für das Probenmaterial in der Echtzeit-NASBA-Reaktion verwendet, um sicherzustellen, dass die in dem Probenmaterial vorhandene RNA intakt war. Ein positives Signal von dieser Reaktion war notwendig zur Validierung der Echtzeit-NASBA-Reaktion.
  • Die Empfindlichkeit des universellen Echtzeit-NASBA mit L1 (das Hauptkapsidprotein von HPV) war viel besser als die universelle Gp5+/6+-PCR, ebenfalls gerichtet gegen L1, mit einer Empfindlichkeit von 10 Zellen im Vergleich zu 103 (102) CaSki-Zellen. Diese zwei Primersätze (PCR und NASBA) haben ihre Ziele in derselben Region des konservierten L1-Gens von verschiedenen HPV-Arten. Die Unterschiede in der Empfindlichkeit sind auf die Tatsache zurückzuführen, dass es im Allgemeinen nur eine Kopie von jedem Gen pro Zelle gibt, während die Kopienanzahl von mRNA mehrere Hundert sein kann. Die Echtzeit-NASBA-L1-Primer detektierten keine SiHa- oder HeLa-Zellen wie die Gp5+/6+-PCR-Primer, was auf eine fehlende L1-Expression in diesen Zelllinien hinweist. Gp5+/6+-PCR-Primer führten zum Nachweis von 104 SiHa- oder HeLa-Zellen. Unter Berücksichtigung der Anzahl von HPV-Kopien in jeder Zelle macht es Sinn, dass die CaSki-Zellen in 1/10 der Menge von SiHa- und Hela-Zellen nachgewiesen wurden, da CaSki-Zellen 60-600 HPV-Kopien pro Zelle besitzen, sowohl integriert als auch episomal, während SiHa-Zellen 1-2 HPV-Kopien, integriert pro Zelle, und HeLa-Zellen 10-50 HPV-Kopien, integriert pro Zelle, besitzen. Der L1-Primersatz detektierte lediglich CaSki-Zellen, sowohl mit integrierter als auch episomalen Formen von HPV, und detektierte keine SiHa- oder HeLa-Zellen mit lediglich integrierten Formen von HPV. Dies könnte darauf hinweisen, dass das L1-Gen lediglich in episomalen Stadien der HPV-Infektion exprimiert wird, und daher kann L1 ein wertbarer Marker zur Integration und Beständigkeit einer HPV-Infektion sein.
  • Die HPV-artspezifischen NASBA-Primer sind gegen das E6/E7-Transkript Bd.ler Länge gerichtet, welches in großen Mengen in Krebszellen aufgrund des fehlenden E2-Gen-Produkts exprimiert wird. Die Echtzeit-NASBA-16-artspezifischen Primer führten zum Nachweis von 10(1) SiHa-Zellen und 10(1) CaSki-Zellen im Vergleich zu den HPV 16 PCR-Primern, welche 103(102) SiHa-Zellen detektierten. Die Erklärung hierfür könnte die unterschiedliche Menge von HPV-Kopien in jeder Zelllinie sein. Die CaSki-Zellen hatten sowohl integrierte als auch episomale Formen von HPV, während die SiHa-Zellen lediglich integrierte Formen von HPV besaßen. Dies kann auf eine hohe Expression von mRNA von den E6/E7-Genen zurückzuführen sein. Bei der Detektion von CaSki-Zellen war das Detektionslimit für die NASBA-HPV16-Primer 10(1) CaSki-Zellen im Vergleich zu 0,1 CaSki-Zellen für die HPV-16-PCR-Primer. Dies ist wenig, aber eine Erklärung könnte sein, dass die CaSki-Zellen 60-600 Kopien HPV16-DNA enthalten, so dass es möglich ist, 0,1 CaSki-Zellen mit 6-60 HPV16-DNA-Kopien nachzuweisen. Die niedrige Empfindlichkeit des Echtzeit-NASBA im Vergleich zur PCR kann darauf hinweisen, dass die Expression von E6/E7 in den CaSki-Zellen moderat/niedrig ist. Der Abbau nicht stabiler mRNA kann auch eine Erklärung sein. Die Menge von HPV-Kopien in den CaSki-Zellen bewegt sich in der Größenordnung des 60-600-fachen der SiHa-Zellen, was durch die empfindlichere Detektion von CaSki-Zellen gezeigt wird.
  • Die artspezifischen HPV18-PCR-Primer führten zum Nachweis von 102-HeLa-Zellen. Dies ist eine Größenordnung von 100 besser als der HPV-Konsensus-Gp5+/6+-Primer und zeigt, dass spezifische Primer im Allgemeinen empfindlicher sind als Konsensus-Primer. Die Empfindlichkeit der artspezifischen HPV18-NASBA-Primer betrug 1 (0,1) HeLa-Zellen, was auf eine hohe Expression von E6/E7 in HeLa-Zellen hinweist.
  • Die Empfindlichkeit von U1A-NASBA-Primern betrug 10 SiHa- oder CaSki-Zellen. Das Ziel für den U1A-Primersatz ist ein humanes Haushaltsgen, das in jeder menschlichen Zelle exprimiert wird.
  • Die Empfindlichkeit von PCR und NASBA variiert für unterschiedliche Primersätze und Probenmaterial, und im Allgemeinen sind artspezifische Primer empfindlicher als Konsensus-Primer aufgrund des Basenpaarmismatches in den Konsensus-Primersätzen. Die Anlagerungstemperatur für die Primer in der PCR-Reaktion kann optimiert werden, was eine optimale Reaktionsbedingung für die Primer bereitstellt. Im Gegensatz zu der Anlagerungstemperatur in der PCR muss die Anlagerungstemperatur für die NASBA-Primer auf 41 ° C gesetzt werden. Diese fehlende Temperaturflexibilität kann die NASBA-Primer weniger empfindlich und spezifisch als die PCR-Primer machen.
  • Die PCR amplifiziert doppelsträngige DNA, und das Ziel ist im Allgemeinen als eine Kopie pro Zelle vorhanden, und dies macht es für die Anzahl von Zellen in dem Probenmaterial auswertbar. Das Ziel für die NASBA-Reaktion ist RNA, und mRNA kann in mehreren Kopien pro Zelle vorliegen, was von der Expression der Gene abhängt. Durch die Wahl eines hoch exprimierten Gens kann die Anzahl der mRNA-Kopien mehrere Hundert pro Zelle betragen und kann daher einfacher nachzuweisen sein.
  • dsDNA ist in der Zelle relativ stabil, und das Material bleibt für eine längere Zeit intakt. Im Gegensatz zu dsDNA ist mRNA im Allgemeinen nicht sehr stabil, und der Abbau von mRNA erfolgt schnell, was von der Zelle abhängt. Es gibt keine detektierbare DNase- oder RNase-Aktivität im Lysepuffer, so dass sowohl dsDNA als auch ssRNA stabil sein sollten. Eine autokatalytische Aktivität kann sowohl DNA als auch RNA abbauen. Die DNA/RNA von der Zervixprobe sollte für 24 Stunden bei 15-30°, 7 Tage bei 2-8° C oder bei –70° C für eine Langzeitlagerung bei Lagerung im Lysepuffer intakt bleiben.
  • Eine Beschränkung bei der Echtzeit-NASBA-Reaktion ist die Konzentration der molekularen Signalsonden. Die Menge von Produkten wird die Konstellation der molekularen Sigaalsonden übersteigen, und daher wird sie nicht nachgewiesen werden, da eine hohe molekulare Signalsondenkonzentration das Reaktionsgemisch komplexer machen und die Amplifikationsreaktion inhibieren wird. Nukleotide können auch eine Beschränkung zu der Endmenge des Amplifikationsproduktes darstellen, sowohl bei der PCR als auch in der NASBA-Reaktion. Die Endkonzentration des amplifizierten Produktes kann selbst eine weitere Amplifikation aufgrund der Menge des Produktes und der Komplexität des Reaktionsgemisches inhibieren. Während einer NASBA-Reaktion beim Vorliegen von molekularen Signalen könnte die Sonde mit der Amplifikation durch Hybridisierung an die Matrize konkurrieren, was sie für die nachfolgende RNA-Synthese unverfügbar macht. In diesem Fall wird RNA für die reversen Transkriptionsschritte als Substrat extrahiert sowie für die weitere RNA-Synthese durch T7-RNA-Polymerase. Diese Kompetition ist bei niedrigen Mengen des molekularen Signals nicht signifikant und bei einer großen Menge des molekularen Signals kann diese Inhibition durch eine hohe Anzahl von Kopien der Input-RNA überwunden werden.
  • Die lineare Beziehung zwischen der Menge von Input-RNA und der Zeit für das Positiv-Signal wurde in 10-fach-Serienverdünnungen von unterschiedlicher HPV-Zelllinien getestet. Es gab einen klaren Hinweis, dass ein positives Signal von der Menge von Input-RNA und der Zeit abhängig war. Die Multiplex-Reaktion erforderte mehr Zeit als eine Einzelreaktion, um ein positives Signal hervorzurufen. Dies könnte auf die Kompetition in dem komplexeren Gemisch in dem Multiplex-Reaktionsgefäß zurückzuführen sein und auch auf die Tatsache, dass die Multiplex-Reaktion eine unterschiedliche und niedrigere Konzentration von Primer und Sonde besitzt. Die Beziehung zwischen Menge und Ziel-RNA und der Zeit für ein positives Signal öffnet sich für eine quantitative Echtzeit-Multiplex-Amplifikationsreaktion mit internen RNA-Standards in jedem Reaktionsgefäß.
  • Echtzeit-NASBA: Einzel vs. Multiplex. Ein Echtzeit-NASBA war im Allgemeinen empfindlicher als ein Echtzeit-Multiplex-NASBA. Dies ist wie erwartet, da eine Kompetition zwischen Primern und Sonden in der Multiplex-Reaktion stattfindet. Die Endkonstellation von Primern und molekularen Signalsonden wurde in der Multiplex-Reaktion optimiert, so dass für wenigstens einen der Primer- und Sondensätze die Konzentration geringer war als in der Einzelreaktion. Daraus folgt, dass bei einer niedrigeren Konzentration von Primern die Reaktion weniger empfindlich ist oder die Reaktion wenigsten weniger schnell abläuft. Es nimmt eine längere Zeit in Anspruch, um das exponentielle Stadium der Amplifikationsreaktion zu erreichen und daher eine längere Zeit, um die Produkte nachzuweisen. Die Konzentration der Primer stellt keine Limitierung für die Endkonzentration des Produktes in der NASBA-Reaktion dar, da die von den Primern erzeugte doppelsträngige DNA weiter als Matrize für die RNA-Polymerase immer wieder in einer Schleife dient. Die Empfindlichkeit des Multiplex-Echtzeit-NASBA war dieselbe für HPV 16 und HPV 18 im Vergleich zu einem einzelnen Echtzeit-NASBA, jedoch sank die Empfindlichkeit für L1 drastisch von einem Detektionslimit von 10(1) in der Einzelreaktion auf 103(102) CaSki-Zellen in der Multiplex-Reaktion ab. Bei U1A-NASBA-Primern sank die Empfindlichkeit von 10(1) auf 102(10) SiHa-Zellen ab, während das Detektionslimit für die CaSki-Zellen gleich blieb. Diese Abnahme beim Detektionslimit ist vermutlich auf eine komplexere Kompetition von Primern und molekularen Signalsonden in der Multiplex-Reaktion zurückzuführen. Die Endkonzentration von Primern und molekularen Signalsonden mag nicht die beste sein, und die unterschiedlichen Primer und Signalsonden in der Multiplex-Reaktion können miteinander interferieren. Die U1A-NASBA-Primer detektierten eine HeLa-Zelle. Man könnte dasselbe Detektionsniveau in allen Zelllinien erwarten, jedoch betrug die Sensitivität von HeLa-Zellen 1/10 des Detektionsniveaus von SiHa- und CaSki-Zellen. Diese Zelllinien sind Krebszellen und könnten daher eine andere Wirkung auf die Zellen haben, so dass die Expression von U1A anders ist. Die Unterschiede können auch auf die unterschiedlichen Zellmengen in jeder Reaktion zurückzuführen sein, wegen der Zählfehler während der Ernte der Zellen.
  • Ein Echtzeit-NASBA zeigte keine Kreuzreaktivität zwischen HPV 16, 18, 31 und 33 oder mit HPV 6/11, 35, 39, 45, 51, 52, 58 oder HPV X.
  • Die Spezifität der PCR-Reaktion kann besser sein als die Spezifität der Echtzeit-NASBA-Reaktion, da die NASBA-Reaktion eine isothermale Reaktion bei 41 ° C ist ohne Möglichkeiten, die Anlagerungstemperatur der Primer zu verändern. Die Primer sind grundsätzlich auf dieselbe Weise entworfen wie die PCR-Primer. In einer PCR-Reaktion hat man die Möglichkeit, die Anlagerungstemperatur zu verändern, anders als bei der NASBA-Reaktion, und daher kann man auch eine Anlagerungstemperatur wählen, die für die beiden Primer optimal ist. Dies macht die Anlagerung der Primer spezifischer. Die PCR-Ergebnisse wurden mit Gel-Elektrophorese visualisiert. Jedoch sind die molekularen Signalsonden in der Echtzeit-NASBA-Reaktion ein zusätzlicher Parameter im Vergleich zur PCR und können der Gesamt-NASBA-Reaktion eine bessere Spezifität verleihen. Es ist auch einfacher, zwei unterschiedliche Regionen auf der DNA-Sequenz für eine Primeranlagerung zu finden, da eine viel größere Flexibilität in der Länge des PCR-Produktes vorhanden ist als beim NASBA-Produkt, welches wenigstens 250 bp lang sein sollte. Es ist für die Spezifität der NASBA-Reaktion wichtig, ein einzigartiges Gebiet auszuwählen, das zwischen den unterschiedlichen HPV-Arten nicht konserviert ist. Ein Paar Basenfehlpaarungen kann noch immer zu einer Amplifikation oder Hybridisierung des Ziels führen.
  • Die Detektion von CaSki-Zellen (im integrierten oder episomalen Stadium) mit den universellen L1-NASBA-Primern, nicht jedoch von SiHa- oder HeLa-Zellen (beide integriert), kann einen Hinweis geben, dass das integrierte HPV keine L1-Expression zeigt, während HPV im episomalen Stadium eine L1-Expression liefern kann.
  • Zusammengefasst wurde ein Identifikations-Assay für die HPV-Arten 16, 18, 31 und 33 entwickelt, der die onkogene E6/E7-Expression dieser HPV-Arten genau identifizieren lässt. Der Assay kann auch die Expression des Hauptkapsidproteins, L1, identifizieren.
  • Beispiel 3: Weitere klinische Studien an 190 Patienten
  • Patienten/klinische Proben
  • Es wurden Biopsien von 190 Frauen, bereitgestellt vom Ostfold Zentral Krankenhaus, zur Behandlung von CIN im Zeitraum von 1999-2001 entnommen. Das Durchschnittsalter der 190 Frauen in der Studie betrug 37,4 Jahre (Bereich von 22-74 Jahren). Die Biopsien waren bei –80° C unmittelbar nach der Entnahme eingefroren.
  • Zytologische Untersuchung der Proben
  • Es wurden routinemäßige zytologische Protokolle verwendet, um zytologische Befunde aufzuzeichnen. Es wurden keine Versuche unternommen, die Objektträger erneut zu bewerten. Jeder von ihnen wies auf einen CIN-II-III-Zustand hin, das heißt einer hochgradigen Dysplasie oder HSIL, was die Basis für eine Krankenhausbehandlung, Kolposkopie und Biopsie war.
  • Histologische Untersuchung der Proben
  • Eine Biopsie, hier als Biopsie 1 bezeichnet, wurde nach einem hochgradigen Zytologie-Protokoll entnommen. Wenn es eine hochgradige Läsion bestätigt hat (CIN-II oder -III), wurde der Patient wiederum ins Krankenhaus überwiesen, dieses Mal für eine Koloskopie-geführte Konisation. Vor der Konisation, jedoch nach Anwendung einer lokalen Anästhäsie, wurde eine zweite Biopsie (Biopsie 2 von einem Gebiet entnommen, wo eine Dysplasie am ehesten zu erwarten war, geschätzt anhand der Vorbefunde. Diese Biopsie (2 × 2 mm) wurde innerhalb von 2 Min. in einer –80° C-Tiefkühltruhe eingefroren.
  • Die Biopsie 2 wurde nach dem Einfrieren halbiert, und eine Hälfte wurde für die DNA/RNA-Extraktion verwendet. Die andere Hälfte wurde in 10 % gepuffertem Formaldehyd fixiert und für eine histopathologische Untersuchung weiterverarbeitet. Einige Läsionen waren in dem Paraffinblock nicht richtig orientiert und mussten neu orientiert oder seriell geschnitten werden, um das relevante Oberflächenepithel zu zeigen. Daher kann nicht garantiert werden, dass genau dasselbe Gewebe für die Extraktion für die histopathologische Bewertung verwendet wurde. Die Zapfenart wurde letztendlich durch den örtlichen Pathologen bewertet, der in allen Fällen das Vorliegen einer Dysplasie bestätigen konnte. Diese war nicht immer in demselben Grad wie in der ursprünglichen Biopsie und in vielen Fällen nicht die gleiche wie in Biopsie 2.
  • Extraktion von Nukleinsäuren
  • Nukleinsäuren wurden unter Verwendung des automatisierten Nuclisens-Extraktors wie zuvor beschrieben isoliert (Boom et al., 1990). Jede Biopsie wurde in zwei Hälften geschnitten, eine war für eine histologische Untersuchung bestimmt und die andere Hälfte für eine RNA-Analyse. Das für die RNA-Analyse bestimmte Material wurde in kleinere Stücke aufgeteilt, während es auf Trockeneis (–80° C) gehalten wurde und in 1 ml Lysepuffer gegeben (wie oben), gefolgt von einer 20 Sek. langen Homogenisierung unter Verwendung von wegwerfbaren Pestillen. 100 ml der Probe wurden weiter 10-fach in Lysepuffer verdünnt und 100 ml wurden dann für DNA/RNA extrahiert. Die extrahierte DNA/RNA wurde mit ungefähr 40 ml Elutionspuffer eluiert (Organon Teknika) und bei –70° C gelagert.
  • Alle in dieser Studie verwendeten molekularen Signalsonden machten Gebrauch von der Flurophore FAM (6-Carboxyfluoreszin) am 5'-Ende der Struktur. Diese war an eine variable Stamm-Schleifen-Sequenz gebunden, die an den universellen Quencher 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzolsäure (DABCYL) am 3'-Ende gekooppelt war. Die Sonden wurden von Eurogentec, Belgien, geliefert. Die Endekonzentration der in der Reaktion verwendeten MBs betrug 2,5 mM. Für den Echtzeit-NASBA verwendeten wir den NucliSens Basic Kit (Organon Teknika, Niederlande), der für die Entwicklung von benutzerdefinierten RNA-Amplifikations-Assays bestimmt ist. Die NASBA-Amplifikation wurde in einem Volumen von 20 μl durchgeführt. Die Primer-Sätze und -Sonden waren gegen E6/E7-mRNA voller Länge für die Hochrisiko-HPV 16, 18, 31 und 33 gerichtet. Als Leistungskontrolle sowie zur Vermeidung von Falsch-Negativ-Ergebnissen aufgrund der Degradation von Nukleinsäure verwendeten wir einen Primersatz und eine Sonde, die gegen das menschliche kleine nukleare U1 Ribonukleinprotein (snRNP) spezifische A-Protein (U1A mRNA) gerichtet war (Nelissen et al., 1991). Alle Proben wurden zweifach auf getrennten Apparaten laufen gelassen (Mikroplatten-Lesegeräte zur Messung der Fluoreszenz und Absorption, Bio-tek FL-600 FA von MWG). mRNA, die von CaSki/SiHa- oder HeLa-Zellen isoliert war, diente als Positivkontrolle für die HPV 16- bzw. HPV 18-Transkripte. Negativkontrollen, die für jede siebte Reaktion eingeschlossen waren, bestanden aus einer Reaktion, die alle Reagenzien außer mRNA enthielten.
  • HPV-DNA-Analyse; Polymerase-Kettenreaktion
  • Dieselben Extrakte und Mengen wie in der NASBA-Reaktion wurden auch für die PCR verwendet. Die L1-Konsensus-Prier GpS+/Gp6+ wurden verwendet, um alle Proben zu detektieren, die HPV-DNA enthalten. Die PCR-Amplifikation wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die erste DNA-Denaturierung wurde für 2 Minuten bei 94° C durchgeführt, dann wurden 40 PCR-Zyklen laufen gelassen: Denaturierung für 1 Minute bei 94° C, Anlagerung für 2 Min. bei 40° C, Verlängerung für 1,5 Min. bei 72° C, gefolgt von einer Schlussverlängerung für 4 Min. bei 72° C. Die Einordnung von HPV wurde unter Verwendung von PCR-artspezifischen Primern gegen HPV 16, 18, 31 und 33 durchgeführt, wie oben beschrieben (6/11, 35, 45, 51, 52, 58).
  • Ergebnisse
  • Von ursprünglich 190 Patienten wurde eine Biopsie entnommen, nachdem eine Diagnose für CIN I, CIN II oder CIN III anhand der Zytologie gestellt wurde. Eine hochgradige Läsion wurde durch eine histologische Untersuchung bestätigt, 150 Proben wurden als CIN III (78,9 %) diagnostiziert. Biopsie 2, entnommen vor der Konisation, wurde für eine RNA-Analyse verwendet. Jedoch führte eine histologische Untersuchung dieser Biopsie zu einer Diagnose von lediglich 53 Proben der ursprünglich 150 Proben als CIN III (54 ergaben keine Diagnose, 24 wurden als CIN II diagnostiziert, 18 als CIN I und 4 als HPV/Kondylom). Die Anzahl von CIN II-Proben nahm von 16 (8,4 %) auf 30 (15,8 %) zu (durch Histologie I, 24 diagnostiziert als CIN III, 4 als CIN II, 1 als Karzinom und 1 als CIN I. 12 CIN II-Fällen der Histologie I wurde eine niedrigere Diagnose in Histologie II gegeben). Der Grad von CIN I nahm von 6 Proben (3,2 %) auf 32 Proben (16,8 %) zu. Die 2 Plattenepithelzellkarzinome wurden in der Histologie II als CIN III diagnostiziert, das Adenokarzinom als CIN II. In 71 Proben (38,4 %) wurden keine hochgradigen Läsionen nachgewiesen.
  • Onkogene HPV-RNA wurde in 69 (36 %) der 190 Patienten nachgewiesen. Von den 53 Proben (28 %), die als CIN III in der Histologie II diagnostiziert waren, hatten wir 40 (76 %) der Fälle, die eine HPV 16, 18, 31 oder 33 onkogene Expression zeigten. Zusätzlich fanden wir eine onkogene Expression in 9 von 30 Fällen (30 %) von CIN II, in 4 von 32 Fällen (13 %) von CIN I, 14 von 71 Fällen (20 %) zeigten keine Zellabnormalitäten, und in 2 von 4 (50 %) der Proben wurde HPV/Kondylom diagnostiziert.
  • HPV 16 RNA wurde in 42 der 190 Patienten gefunden, HPV 18 wurde in 7 (3,7 %), HPV 31 in 15 (7,9 %) und HPV 33 in 8 (4,2 %) gefunden. Ein Patient hatte eine gemischte Infektion mit HPV 16 und HPV 18 und einer mit HPV 16 und HPV 31.
  • Unter Verwendung der Konsenus-GpS+/Gp6+-Primer, die gegen das L1-Gen gerichtet waren, welches das Hauptkapsidprotein kodiert, führte eine PCR zum Nachweis von HPV in 81 der 190 Zervixbiopsien (43 %). Von diesen 119 Fällen, denen eine Diagnose in der zweiten histologischen Untersuchung gegeben wurde (115 wurden als CIN, 4 als HPV/Kondylom diagnostiziert), wurde bei 63 festgestellt, dass sie HPV-DNA enthalten. Die zusätzlichen 18 nachgewiesenen Fälle ergaben keine histologische Diagnose. 20 der 81 Fälle waren nicht durch den NASBA detektierbar; 7 von diesen ergaben eine Diagnose von CIN III, 2 wurden als CIN II diagnostiziert, 4 als CIN I, und 7 ergaben keine Diagnose.
  • Eine artspezifische PCR detektierte 85 Fälle, die HPV enthalten, 66 mit HPV 16, 10 mit HPV 18, 14 mit HPV 31, 7 mit HPV 33. 12 Fälle hatten eine Mehrfach-Infektion: 3 mit HPV 16+18; 4 mit HPV 16+33, 5 mit HPV 16+31. 20 hatten keine Diagnose.
  • Beispiel 4
  • HPV, detektiert durch PreTect HPV-Proofer und PCR im Vergleich zur Zytologie und Histologie:
    Normale und ASCUS-Proben (einschließlich Grenzabstriche) wurden durch Zytologie bestimmt. Alle Proben wurden mit Konsensus-PCR und PreTect HPV-Proofern getestet, jedoch wurden nur die Konsensus-positiven Proben durch PCR typisiert. Die CIN 3- und Krebs-Proben wurden durch Histologie bestimmt, und alle Proben wurden mit sämtlichen drei Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Eine Übereinstimmung zwischen Echtzeit-Multiplex-NASBA und PCR im Vergleich zur Zytologie oder Histologie ist in Tabelle 15 unten gezeigt.
  • Tabelle 15: Übereinstimmung zwischen Echtzeit-Multiplex-NASBA und PCR im Vergleich zur Zytologie oder Histologie
    Figure 00720001
  • Es wurden nur Proben, die positiv durch Gp5+/6+ PCR waren, typisiert.
    • a einschließlich PCR und Echtzeit-Multiplex-NASBA-positive und -negative Proben.
    • b einschließlich PCR und/oder Echtzeit-Multiplex-NASBA-positive Proben.
    • c ASCUS ohne Grenzbereichsabstriche.
  • Beispiel 5
  • Ein Kit zum Nachweis von mRNA-Transkripten von dem E6-Gen(en) von HPV wird bereitgestellt, wobei der Kit ein oder mehrere, zwei oder mehrere und vorzugsweise alle folgenden Primer-Paare und nachfolgende Identifikationssonden umfasst.
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Als Alternative zu den oben gezeigten Sonden kann der Kit gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden molekularen Signalsonden einschließen: Molekulare Signalsonden:
    H16e6702mb2-FAM ccagctTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctgg
    H18e6702mb1-TxR cgcatgGAACCAACGTCACACAATGcatgcg
    H31e6704mb2-FAM ccgtcgGGACAAGCAGAACCGGACAGATCCAAcgacgg
    H33e6703mb1-FAM ccaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcttgg
  • Vorzugsweise schließt der Kit auch das folgende Primer-Paar und folgende Sonde ein:
    Figure 00750001
  • Die HPV 45 Sonde oben kann durch eine molekulare HPV-Signalsonde wie folgt ersetzt werden:
    Figure 00750002
  • Zusätzlich kann der Kit ein oder mehrere der folgenden Primer-Paare und nachfolgende Identifikationssonden einschließen, was von dem geographischen Anwendungsgebiet des Kits abhängt.
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Die oben gezeigten Sonden können in dem Kit durch die folgenden molekularen Signalsonden ersetzt werden:
    Figure 00770002
    Sequenzprotokoll
    Figure 00780001
    Figure 00790001
    Figure 00800001
    Figure 00810001
    Figure 00820001
    Figure 00830001
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    Figure 00910001
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    Figure 00970001
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Claims (6)

  1. In-vitro-Verfahren zur Durchmusterung von menschlichen Versuchspersonen zur Bestimmung ihres Risikos zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs, wobei das Verfahren die Durchmusterung der Versuchsperson auf die Expression von mRNA-Transkripten des E6-Gens von jeder der einzigen HPV-Arten 16, 18, 31, 33 und 45 unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens und das Einteilen der Versuchspersonen in eine der beiden Risikokategorien zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs basierend auf der Expression von E6-mRNA aus zumindest einer der genannten HPV-Arten umfasst, wobei Individuen, die hinsichtlich der Expression der genannten E6-mRNA aus zumindest einer der genannten HPV-Arten positiv sind, als Träger von integrierten HPV gewertet werden und daher als risikoreich zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs klassifiziert werden, wobei Individuen, die hinsichtlich der Expression von allen E6-mRNA negativ sind, als keine Träger von integrierten HPV gewertet werden und deshalb als kein nachweisbares Risiko zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs klassifiziert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchmusterung auf die genannte E6-mRNA-Expression unter Verwendung einer isothermalen Amplifikation in Kombination mit einer Echtzeit-Detektion des Amplifikationsproduktes durchgeführt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die isothermale Amplifikation ein NASBA, eine Transkriptions-vermittelte Amplifikation, eine Signal-vermittelte Amplifikation von RNA oder eine isothermale Lösungsphasenamplifikation ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Durchmusterung auf die genannte E6-mRNA-Expression unter Verwendung eines Echtzeit-NASBA durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die menschlichen Versuchspersonen Patienten sind, bei denen zuvor eine Infektion mit menschlicher Papillomvirus-DNA in Zellen des Gebärmutterhalses festgestellt wurde.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die menschlichen Versuchspersonen Patienten mit einer zuvor gestellten Diagnose auf ASCUS, CIN-1-Läsionen oder Kondylom sind.
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