DE60312507T3 - Eine methode zur in vitro molekularen evolution der proteinfunktion - Google Patents

Eine methode zur in vitro molekularen evolution der proteinfunktion Download PDF

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    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur molekularen in vitro-Evolution von Proteinfunktion, insbesondere durch Mischen (engl.: shuffling) von Einzelstrang-DNS-Segmenten, die unter Verwendung einer Nuklease erhalten werden.
  • Proteinfunktion kann in vitro durch eine Vielzahl von Verfahren modifiziert und verbessert werden, einschließlich platzgerichteter Mutationserzeugung (Alber et al., Nature, 5; 330(6143): 41–46, 1987), kombinatorisches Klonieren (Huse et al., Science, 246: 1275–1281, 1989; Marks et al., Biotechnology, 10: 779–783, 1992) und zufällige Mutationserzeugung kombiniert mit geeigneten Auswahlsystemen (Barbas et al., PNAS. USA, 89: 4457–4461, 1992).
  • Das Verfahren der zufälligen Mutationserzeugung zusammen mit Selektion ist in einer Anzahl von Fällen verwendet worden, um Proteinfunktion zu verbessern, und zwei unterschiedliche Strategien existieren. Zum Einen handelt es sich um die Zufallsverteilung der der gesamten Gensequenz in Kombination mit der Selektion einer Proteinvariante (eines Proteinmutanten) mit den gewünschten Eigenschaften gefolgt von einer neuen Runde der zufälligen Mutationserzeugung und Selektion. Dieses Verfahren kann dann wiederholt werden, bis eine Proteinvariante gefunden ist, die als optimal betrachtet wird (Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4): 551–567). Hierbei ist die traditionelle Route, Mutationen durch fehlerbehaftete PKR mit einer Mutationsrate von ungefähr 0,7% einzuführen (Leung et al., Technique, 1: 11–15, 1989). Zum Anderen können definierte Regionen des Gens mit degenerierten Primern mutiert werden, was Mutationsraten von bis zu 100% erlaubt (Griffiths et al., EMBO. J, 13: 3245–3260, 1994; Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392–403, 1995). Je höher die angewendete Mutationsrate ist, desto stärker ist der Bereich des Gens beschränkt, das der Mutationen unterworfen werden kann.
  • Zufällige Mutation ist umfangreich auf dem Gebiet des Antikörperengineering verwendet worden. In vivo-gebildete Antikörpergene können in vitro kloniert werden (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250–1256, 1989), und zufällige Kombinationen der Gene, die die variablen schweren und leichten Gene kodieren, können einer Selektion unterworfen werden (Marks et al., Biotechnology, 10: 779–783, 1992). Ausgewählte funktionale Antikörperfragmente können dann unter Anwendung von zufälliger Mutationserzeugung und zusätzlichen Selektionsrunden verbessert werden (Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4): 551–567).
  • Der Strategie der zufälligen Mutationserzeugung folgt die Selektion. Varianten mit interessanten Eigenschaften können ausgewählt werden, und die mutierten DNS-Regionen von unterschiedlichen Varianten, jeweils mit interessanten Eigenschaften, werden zu einer kodierenden Sequenz kombiniert (Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392–403, 1995). Dies ist ein sequenzieller Prozess aus vielen Schritten, und potentielle synergistische Effekte von unterschiedlichen Mutationen in unterschiedlichen Regionen können verlorengehen, da sie der Selektion nicht in Kombination unterworfen werden. Somit umfassen diese beiden Strategien keine simultane Mutationserzeugung von definierten Regionen und Selektion einer Kombination dieser Regionen.
  • Ein anderer Prozess bezieht das kombinatorische Paaren von Genen ein, das verwendet werden kann, um z. B. Antikörperaffinität zu verbessern (Marks et al., Biotechnology, 10: 779–783, 1992). Hier sind die drei CDR-Regionen in jedem variablen Gen fest, und diese Technologie erlaubt es nicht, individuelle Gensegmente in den Genen für die variable Domain, zum Beispiel einschließlich der CDR-Regionen, zwischen Klonen zu mischen.
  • Das Konzept des DNS-Mischens (engl.: DNA shuffling) (Stemmer, Nature 370: 389–391, 1994) wendet die zufällige Fragmentierung von DNS und den Zusammenbau von Fragmenten zu einer funktionalen kodierenden Sequenz an. Bei diesem Prozess ist es möglich, chemisch synthetisierte DNS-Sequenzen einzuführen und auf diese Weise eine Variation auf definierte Plätze in dem Gen zu richten, dessen DNS-Sequenz bekannt ist (Crameri et al., Biotechniques, 18: 194–196, 1995). Stemmer und Mitarbeiter entwickelten dieses in vitro-Verfahren, das den normalen Evolutionsprozess von Protein in der Natur nachbildet. Das DNS-Mischen erzeugt Diversität durch Rekombination, wobei nützliche Mutationen von individuellen Genen kombiniert werden. Es ist erfolgreich für die künstliche Evolution von unterschiedlichen Proteinen angewendet worden, z. B. von Enzymen und Cytokinen (Chang et al., Nature Biotech 17, 793–797, 1999; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4504–4509, 1997; Christians et al., Nature Biotech. 17, 259–264, 1999). Die Gene werden unter Verwendung von DNase I zufällig fragmentiert und dann durch Rekombination miteinander wieder zusammengebaut. Das Ausgangsmaterial kann entweder ein einzelnes Gen sein (das zuerst zufällig unter Anwendung fehlerbehafteter PKR mutiert, wird) oder natürlich auftretende homologe Sequenzen (sogenanntes Familienmischen (engl.: family shuffling)). DNase I hydrolysiert DNS vorzugsweise an Plätzen benachbart von Pyrimidinnukleotiden, deshalb ist sie eine geeignete Wahl für die zufällige Fragmentierung von DNS. Jedoch ist die Aktivität abhängig von Mg- oder Mn-Ionen, wobei Mg-Ionen die Fragmentgröße auf 50 bp beschränken, während die Mn-Ionen Fragmentgrößen kleiner als 50 bp ergeben. Deshalb muss das in Frage stehende Gen, um alle möglichen Größen für Rekombinationen zu haben, mindestens zweimal mit DNase I in der Anwesenheit von jeweils einem der zwei unterschiedlichen Ionen behandelt werden, gefolgt von Entfernen eben dieser Ionen.
  • Ein weiteres Verfahren zum Erzeugen einer rekombinanten DNS-Bibliothek unter Verwendung von unidirektionalen Einzelstrang-DNS-Fragmenten ist in der WO 02/38757 beschrieben.
  • In der Theorie ist es möglich, DNS zwischen jeglichen Klonen zu mischen. Wenn jedoch das resultierende gemischte Gen bezüglich Expression und Aktivität funktional sein soll, müssen die zu mischenden Klone vorzugsweise verwandt oder mit der Ausnahme eines geringen Maßes an zufälligen Mutationen sogar identisch sein. DNS-Mischen zwischen genetisch unterschiedlichen Klonen wird allgemein nichtfunktionale Gene erzeugen. Es ist jedoch durch die ITCHY-Methodik bewiesen worden, dass Interspeziesfusionsbibliotheken zwischen Fragmenten des E. coli- und des humanen Glycinamidribonukleotidtransformylasegens erzeugt werden können, die auf DNS-Niveau nur eine 50%ige Identität aufweisen (Ostermeier et al., Nat Biotechnol 17, 1205–9, 1999).
  • Eine erfolgreiche Rekombination von zwei unterschiedlichen Genen erfordert die Ausbildung von Hetero-Duplex-Molekülen. In einigen Fällen bildet das Familienmischen nahezu nur Homo-Duplexe aus, was in eine niedrige Rekombinationsfrequenz resultiert. Diesem Problem ist durch Verwendung von DNase I-aufgeschlossener Einzelstrang-DNS begegnet worden (Kikuchi et al., Gene 243, 133–137, 2000).
  • Einzelstrang-DNS kann unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel können bei den PKR-Reaktionen biotinylierte Primer in Kombination mit z. B. Dynabeads (Dynal, Norwegen) oder AffiniTip Streptavidin Capture Micro-Säulen (Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, USA) verwendet werden. Alternativ kann Einzelstrang-DNS durch Verwenden von Bakteriophagen erhalten werden, die in der Lage sind, Einzelstrang-DNS zu packen (Viruses and Related Entities in Modern Microbiology, Principles and Applications pp. 171–192, Ed. E. A. Birge, Wm. C. Brown Publishers, 1992; Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). Zusätzlich können asymmetrische PKR-Verfahren angewendet werden (siehe Beispiel 1).
  • Die Auswahl von Enzymen mit geänderten und verbesserten Eigenschaften wird oft auf die tatsächliche Funktion des Enzyms gestützt. Zum Beispiel kann nach erhöhter Thermostabilität eines Enzyms durch Inkubieren transformierter Kolonien bei Temperaturen selektiert werden, die eine Deaktivierung von Enzym des Wildtyps verursachen können. Zusätzlich kann verbesserte β-Glucosidaseaktivität durch Verwenden von PNPG als Substrat identifiziert werden (Arrizubieta et al., J Biol Chem Jun 27, 2000).
  • Die Selektion von funktionalen Proteinen aus Molekularbibliotheken ist durch die Entwicklung der Phagen-Display-Technologie revolutioniert worden (Parmley et al., Gene, 73: 305–391, 1988; McCafferty et al., Nature, 348: 552–554, 1990; Barbas et al., PNAS. USA, 88: 7978–7982, 1991). Hier wird der Phenotyp (das Protein) direkt mit seinem entsprechenden Genotyp (DNS) verknüpft; und dies erlaubt ein direktes Klonieren des genetischen Materials, das dann weiteren Modifikationen unterworfen werden kann, um die Proteinfunktion zu verbessern. Phagen-Display ist angewendet worden, um funktionale Bindeglieder aus einer Vielzahl von Molekularbibliotheken mit einer Größe von bis zu 1011 Transformanten zu klonieren (Griffiths et al., EMBO. J. 13: 3245–3260, 1994). Somit kann Phagen-Display angewendet werden, um funktionale Binder direkt aus molekularen Bibliotheken zu klonieren, und auch um die ursprünglich ausgewählten Klone zu verbessern. Andere Typen von Viren, die für die Oberflächenexpression von Proteinbibliotheken und die Selektionen daraus verwendet worden sind, sind Baculovirus (Boublik et al., Biotechnol 13: 1079–1084. 1995; Mottershead et al., Biochem Biophys Res Com 238: 717–722, 1997; Grabherr et al., Biotechniques 22: 730–735, 1997) und Retrovirus (Buchholz et al., Nature Biotechnol 16: 951–954, 1998).
  • Eine Auswahl von funktionalen Proteinen aus Molekularbibliotheken kann auch durch Zelloberflächen-Display durchgeführt werden. Auch hier ist der Phenotyp direkt mit dem entsprechenden Genotyp verknüpft. Bakterielles Zelloberflächen-Display ist z. B. zum Screenen von verbesserten Varianten von Carboxymethylcellulase (CMCase) verwendet worden (Kim et al., Appl Environ Microbiol 66: 788–93, 2000). Andere Zellen, die zu diesem Zweck verwendet werden können, sind Hefezellen (Boden und Wittrup Nat. Biotechnol 15: 553–557, 1997), COS-Zellen (Higuchi et al., J Immunol Meth 202: 193–204, 1997) und Insektenzellen (Granzerio et al., J Immunol Meth 203: 131–139, 1997; Ernst et al., Nucleic Acids Res 26: 1718–1723, 1998).
  • Die zufällige Kombination von DNS von unterschiedlichen mutierten Klonen in Kombination mit der Selektion von gewünschter Funktion ist ein verglichen mit der sequenziellen Selektion und Kombination von selektierten Klonen effizienterer Weg, um den Sequenzraum zu durchsuchen.
  • Die vorliegende Erfindung strebt danach, verbesserte Verfahren für die in vitro-Proteinevolution bereitzustellen. Insbesondere zielt die Erfindung darauf ab, effizientere Rekombinations- und Mischverfahren bereitzustellen, die stärker veränderte Moleküle ergeben und dadurch die Wahrscheinlichkeit verbessern, Moleküle mit wünschenswerten Eigenschaften zu finden.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder einer Population von Sequenzen aus einer Einzelstrangausgangspolynukleotidsequenz, die ein oder mehrere Proteinmotive kodiert, bereit gestellt, das die Schritte aufweist:
    • a) Bereitstellen einer ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen und einer zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen, wobei die erste und die zweite Population zusammen Plus- und Minusstränge von Ausgangspolynukleotidsequenzen ausbilden;
    • b) Durchführen einer Reaktion zum Aufschließen der ersten und der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen mit einer Exonuklease zum Erzeugen entsprechender Populationen von Einzelstrangpolynukleotidfragmenten;
    • c) Kontaktieren der Polynukleotidfragmente, die von den Plussträngen erzeugt wurden, mit Fragmenten, die von den Minussträngen erzeugt wurden;
    • d) Verstärken der Fragmente, die aneinander hybridisieren, um mindestens eine Polynukleotidsequenz zu erzeugen, die ein oder mehrere Proteinmotive mit verglichen mit dem einen oder mehreren Proteinmotiven, die durch die Ausgangspolynukleotide codiert werden, geänderten Eigenschaften codiert,
    wobei in Schritt (b) mindestens ein Parameter der Reaktion, die zum Aufschluss der ersten Population an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, anders als die äquivalenten Parameter ist, wie sie bei der Reaktion zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet werden.
  • Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenzvariante oder einer Population von Varianten von Einzelstrangpolynukleotidsequenzen bereit.
  • Die Verwendung von unterschiedlichen Reaktionsparametern, die für die Aufschluss der ersten und zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet werden, stellt den Vorteil von erhöhter Variabilität bei den Polynukleotidvarianten bereit, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt werden.
  • Vorzugsweise sind die Polynukleotidmoleküle von Schritt (a) DNS-Moleküle.
  • Mit ”entsprechenden Populationen von Einzelstrangpolynukleotidfragmenten” meinen wir die Population von Fragmenten, die durch Aufschluss der ersten und zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen mit einer Exonuklease erzeugt wird.
  • Mit ”äquivalentem Parameter” meinen wir denselben Parameter, der bei der Reaktion zum Aufschluss der anderen Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird. Zum Beispiel mag sich die Exonuklease, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Exonuklease unterscheiden, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • Mit ”Exonuklease” meinen wir ein Polypeptid, z. B. ein Enzym oder Fragment davon, das exonukleolytische Aktivität aufweist. Vorzugsweise ist die exonukleolytische Aktivität des Polypeptids größer als die endonukleolytische Aktivität des Polypeptids. Mehr bevorzugt weist das Polypeptid eine exonukleolytische Aktivität auf, ist aber im Wesentlichen frei von endonukleolytischer Aktivität.
  • Vorteilhafterweise ist der Parameter der Aufschlussreaktion, der sich unterscheidet, ausgewählt aus Exonukleasetyp, Exonukleasekonzentration, Reaktionsvolumen, Dauer der Aufschlussreaktion, Temperatur der Reaktionsmischung, pH-Wert der Reaktionsmischung, Länge der Einzelstrangausgangspolynukleotidsequenzen, Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen und Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Exonuklease, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Exonuklease, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird. Vorzugsweise ist die Exonuklease, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, eine 3'-Exonuklease (d. h. eine solche, die vorzugsweise oder exklusiv Nukleotide vom 3'-Terminus von Einzelstrang polynukleotiden entfernt), und die Exonuklease, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, ist eine 5'-Exonuklease (d. h. eine solche, die vorzugsweise oder exklusiv Nukleotide vom 5'-Terminus von Einzelstrang polynukleotiden entfernt).
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Exonukleasekonzentration, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Exonukleasekonzentration, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich das Reaktionsvolumen, das für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von dem Reaktionsvolumen, das für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Dauer der Aufschlussreaktion, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Dauer der Aufschlussreaktion, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Temperatur der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Temperatur der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich der pH-Wert der Reaktionsmischung, der für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von dem pH-Wert der Reaktionsmischung, der für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Länge der Polynukleotide in der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen von der Länge der Polynukleotide in der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich die Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen in der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen von der Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen in der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung bildet die erste Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen die Plusstränge der Ausgangspolynukleotidsequenzen und die zweite Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen die Minusstränge der Ausgangspolynukleotidsequenzen aus.
  • In geeigneter Weise weist Schritt (c) weiterhin das Zugeben von Primersequenzen auf, die unter Hybridisierungsbedingungen an das 3'- und/oder 5'-Ende mindestens eines der Ausgangspolynukleotide hybridisieren.
  • So stellt die Erfindung ein Verfahren zum Kombinieren von Polynukleotidfragmenten zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder eine Population von Sequenzen von gewünschten Eigenschaften bereit, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:
    • a) Aufschließen eines linearen Einzelstrangausgangspolynukleotids, das ein oder mehrere Proteinmotive kodiert, mit einer anderen Nuklease als DNase I, um eine Population von Einzelstrangfragmenten variierender Längen zu erzeugen;
    • b) Zusammenbauen einer Polynukleotidsequenz aus den Sequenzen, die Schritt (a) erhalten werden.
  • Vorzugsweise weist das Verfahren weiterhin den Schritt (c) des Exprimierens des resultierenden Proteins, das durch die zusammengebaute Polynukleotidsequenz kodiert wird, und d) des Screenens des Proteins nach gewünschten Eigenschaften auf.
  • Durch Kontrollieren der Parameter der Exonukleaseaufschlussreaktion kann die Größe der Polynukleotidfragmente gesteuert werden. Bestimmen der Länge von Polynukleotidfragmenten auf diese Weise vermeidet die Notwendigkeit, einen weiteren Schritt bereitzustellen, wie beispielsweise Aufreinigen der Fragmente gewünschter Länge von einem Gel.
  • Um eine Polynukleotidsequenz von gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, können die Ausgangspolynukleotide, die ein oder mehrere Proteinmotive kodieren, einer Mutationserzeugung unterworfen werden, um eine Vielzahl von unterschiedlich mutierten Derivaten davon zu erzeugen. In gleicher Weise kann ein Ausgangspolynukleotid erhalten werden, das bereits eine Mehrzahl von Proteinmotivvarianten von unbekannter Sequenz kodiert.
  • Zufällige Mutation kann durch jedes konventionelle Verfahren bewirkt werden, wie es oben beschrieben wurde, aber ein geeignetes Verfahren ist fehlerbehaftete (engl.: error-prone) PKR.
  • Es ist bevorzugt, PKR-Technologie zum Zusammenbauen der Einzelstrangpolynukleotidfragmente zu einer Doppelstrangpolynukleotidsequenz zu verwenden.
  • Die Polynukleotidsequenz ist vorzugsweise DNS, obwohl RNS verwendet werden kann. Der Einfachheit halber wird der Begriff Polynukleotid jetzt in dem folgenden Text in Bezug auf DNS verwendet werden, aber es wird vorausgesetzt, dass die vorliegende Erfindung sowohl auf RNS als auch auf DNS anwendbar ist.
  • Vorzugsweise kann jegliche Exonuklease, die Polynukleotide von dem 5'-Hauptende zu dem 3'-Hauptende hin, von dem 3'- zu dem 5'-Ende hin oder sowohl von dem 3'- als auch dem 5'-Ende her aufschließt, verwendet werden. Beispiele für geeignete Exonukleasen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen BAL 31, Exonuklease I, Exonuklease V, Exonuklease VII, Exonuklease T7 Gen 6, Bakteriophage lambda-Exonuklease und Exonuklease Rec Jf.
  • Die Verwendung von BAL 31-Nuklease bei dem DNS-Mischprozess der Erfindung stellt ein schnelles, einfaches und kontrollierbares System bereit. Dieses Enzym kann alle Größen von Genfragmenten ergeben, und die Aktivität des Enzyms kann durch Stoppen des Aufschlusses zu verschiedenen Zeitpunkten einfach gesteuert werden. BAL 31 ist vornehmlich eine 3'-Hauptnuklease, die Mononukleotide von beiden 3'-Termini der beiden Stränge von linearer DNS entfernt. BAL 31 ist auch eine Endonuklease; somit wird die Einzelstrang-DNS, die durch die 3'-Hauptexonukleaseaktivität erzeugt wird, durch die Endonuklease abgebaut. Die 3'-Hauptexonukleaseaktivität des Enzyms arbeitet ungefähr 20-fach effizienter als die Endonuklease. Die Enzymkonzentrationen sind deshalb entscheidend für die erhaltenen DNS-Fragmente. Eine hohe Enzymkonzentration favorisiert stumpf endende DNS, während bei niedrigeren Konzentrationen die Einzelstrang-DNS-Termini sehr lang sein können. BAL 31 besteht aus zwei kinetisch unterschiedlichen Formen des Enzyms, einer schnellen (engl.: fast = F) und einer langsamen (engl.: slow = S) Form. Die S-Form ist ein proteolytisches Abbauprodukt der F-Form. Weiterhin arbeitet BAL 31 asynchron, wobei eine Population von DNS-Molekülen erzeugt wird, deren Termini in unterschiedlichen Umfängen beschnitten wurden und deren Einzelstrangschwänze in der Länge variieren. Beide Formen wirken in einer exonukleolytischen Weise mit hohem Umsatz auch auf Einzelstrang-DNS. Die Richtung des Angriffs ist von dem 5'-Ende aus, im Gegensatz zu dem Aufschlussmodus von Duplex-DNS. Es ist gemutmaßt worden, dass die Nukleasemoleküle anfänglich in nicht produktiver Weise weg von den 5'-Enden gebunden sind und eine erleichterte Diffusion durchlaufen, um produktive (terminal gebundene) Enzym-Substrat-Komplexe zu ergeben (Lu T und Gray jr. HB Biochimica et Biophysica Acta 1995, vol. 1251, p 125–138). Das Enzym verwendet Ca2+ als Cofaktor, der in Komplexen mit EGTA (Ethylenglykol-bis-(β-Aminehtylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure) gebunden werden kann. Lineare DNS-Sequenzen werden mit BAL 31 aufgeschlossen, und die Reaktion wird durch Zugabe von EGTA zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestoppt.
  • Die einzelnen aufgeschlossenen Fragmente werden gereinigt, gemischt und mit PKR-Technologie wieder zusammengebaut. Die zusammengebauten (rekonstruierten) Gene können dann für das Exprimieren des Proteins in einen Expressionsvektor kloniert werden. Das Protein kann dann auf verbesserte Eigenschaften analysiert werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber bekannten Misch-(engl.: shuffling-)Techniken, einschließlich erhöhter Rekombinationsraten, erhöhter Variabilität und Steuerung der Fragmentgröße.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt für jeden Zeitpunkt, zu dem eine DNS-Probe von der BAL 31 Behandlung genommen wird, einen Satz von progressiv gekürzten DNS-Fragmenten. Die DNS-Proben können gesammelt und zusammengefasst werden, oder optional können einzelne Proben ausgewählt und bei dem Verfahren verwendet werden. So erlaubt die vorliegende Erfindung eine Auswahl der DNS-Proben, die bei dem Rekombinationssystem zu verwenden sind, und bietet deshalb ein volles Maß an Kontrolle.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann an jeglichem Polynukleotid ausgeführt werden, das ein bestimmtes Produkt kodiert, zum Beispiel irgendein Protein, das Bindungs- oder katalytische Eigenschaften aufweist, z. B. Antikörper oder Teile von Antikörpern, Enzyme oder Rezeptoren. Weiterhin kann jedes Polynukleotid, das eine Funktion aufweist, die geändert werden kann, wie zum Beispiel katalytische RNS, gemäß der vorliegenden Erfindung gemischt werden. Es ist bevorzugt, dass das Ausgangspolynukleotid, das ein oder mehrere Proteinmotive kodiert, mindestens 12 Nukleotide lang ist, mehr bevorzugt mindestens 20 Nukleotide lang, und noch mehr bevorzugt mehr als 50 Nukleotide lang. Polynukleotide, die mindestens 100 Nukleotide lang oder selbst mindestens 200 Nukleotide lang sind, können verwendet werden. Wo Ausgangspolynukleotide verwendet werden, die große Proteine kodieren, wie beispielsweise Enzyme oder Antikörper, können diese viele hundert oder tausend Basen lang sein. Die vorliegende Erfindung kann an Ausgangspolynukleotiden jeglicher Größe durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotidsequenzen bereit, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden und gewünschte Eigenschaften aufweisen. Diese Sequenzen können zum Erzeugen von Gentherapievektoren und von replikationsdefekten Gentherapiekonstrukten oder Impfvektoren für DNS-basierte Impfungen verwendet werden. Zusätzlich können die Polynukleotidsequenzen als Forschungswerkzeuge verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Polynukleotidbibliothek von Sequenzen bereit, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurde und aus der ein Polynukleotid ausgewählt werden kann, das ein Protein mit den gewünschten Eigenschaften kodiert. Es ist bevorzugt, dass die Polynukleotidbibliothek eine DNS- oder cDNS-Bibliothek ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Proteine bereit, wie beispielsweise Enzyme, Antikörper und Rezeptoren, die andere Eigenschaften aufweisen als diejenigen des Wildtyps und die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurden. Diese Proteine können einzeln oder innerhalb eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers als Impfstoffe oder Medikamente zur Therapie verwendet werden, zum Beispiel als Immunreaktionen erzeugende Mittel, Antigene oder in anderer Weise beim Erhalten spezifischer Antikörper. Sie können auch als Forschungswerkzeuge verwendet werden.
  • Die gewünschten Eigenschaften eines Polynukleotids, das durch die vorliegende Erfindung erzeugt wurde, oder eines Proteins, das durch ein Polynukleotid kodiert wird, das durch die vorliegende Erfindung erzeugt wurde, kann jegliche Variation oder Änderung bei der normalen Aktivität des (Ausgangs-)Polynukleotids vom Wildtyp oder des von ihm kodierten Polypeptids, Proteins oder Proteinmotivs sein. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, die katalytische Aktivität eines Enzyms zu reduzieren oder zu erhöhen oder die Bindungsspezifizität eines Antikörpers zu verbessern oder zu reduzieren. Weiterhin mag es, falls das Protein oder Polynukleotid ein Immunreaktionen erzeugendes Mittel ist, wünschenswert sein, seine Fähigkeit, spezifische Antikörper gegen es zu erhalten, zu reduzieren oder zu erhöhen.
  • Das Ausgangspolynukleotid kodiert vorzugsweise ein oder mehrere Proteinmotive. Diese sind als Regionen oder Elemente der Polynukleotidsequenz definiert, die eine Polypeptid-(d. h. Aminosäure-)Sequenz kodieren, welche charakteristische Proteinfunktion aufweist oder potentiell aufweist. Zum Beispiel kann ein Proteinmotiv einen Bereich eines ganzen Proteins definieren, wie beispielsweise ein Epitop, einen Spaltungsplatz oder einen katalytischen Platz usw. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung muss ein exprimiertes Proteinmotiv jedoch keine Aktivität zeigen oder ”korrekt” gefaltet sein.
  • Verschiedene recherchierbare Datenbanken von Proteinmotiven und potentiellen Proteinmotiven sind verfügbar, wie beispielsweise MOTIF, PROSITE, SMART und BLOCKS (www.blocks.fhcrc.org).
  • Es mag wünschenswert sein, ein Protein zu modifizieren, um so die Konformation bestimmter Epitope zu ändern und dadurch seine Antigenizität zu verbessern und/oder seine Kreuzreaktivität zu reduzieren. Zum Beispiel kann die Modifikation, sollte solch ein Protein als Antigen verwendet werden, jegliche Kreuzreaktion der gezogenen Antikörper mit ähnlichen Proteinen reduzieren.
  • Obwohl der Begriff ”Enzym” verwendet wird, ist dieser so zu interpretieren, dass er auch jegliches Polypeptid einschließt, das enzymartige Aktivität, d. h. eine katalytische Funktion, aufweist. Zum Beispiel können Polypeptide, die Teil eines Enzyms sind, immer noch katalytische Funktion besitzen. Weiterhin sind Proteine, wie beispielsweise Interferone und Cytokine, eingeschlossen. In gleicher Weise sollte der Begriff ”Antikörper” so ausgelegt werden, dass er jegliche bindende Substanz abdeckt, die eine bindende Domäne mit der erforderlichen Spezifizität aufweist. Dies umfasst Antikörperfragmente, Derivate, funktionale Äquivalente und Homologe von Antikörper, einschließlich synthetischer Moleküle und Moleküle, deren Form diejenige eines Antikörpers nachbildet, was sie in die Lage versetzt, an ein Antigen oder Epitop zu binden. Beispiele für Antikörperfragmente, die in der Lage sind, ein Antigen oder einen anderen Bindungspartner zu binden, sind das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, C1- und CH1-Domänen besteht, das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte DCR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein bivalentes Fragment, das zwei durch eine Disulphidbrücke in der Übergangsregion verbundene Fab-Fragmente umfasst. Einzelketten-Fv-Fragmente sind ebenfalls eingeschlossen.
  • Um Expression der erzeugten Polynukleotidsequenz zu erhalten, kann die Sequenz in einen Vektor eingebaut werden, der Kontrollsequenzen aufweist, welche funktional mit der Polynukleotidsequenz verbunden sind, um ihre Expression zu steuern. Die Vektoren können andere Sequenzen, wie beispielsweise Promotoren und Verstärker, um die Expression der eingesetzten Polynukleotidsequenz anzutreiben, weitere Polynukleotidsequenzen, so dass das durch das Polynukleotid kodierte Protein als Fusion produziert wird, und/oder Nukleinsäure umfassen, die Sekretionssignale kodiert, so dass das Protein, das in der Wirtszelle produziert wird, aus der Zelle sekretiert wird. Das durch die Polynukleotidsequenz kodierte Protein kann dann durch Transformieren des Vektors in Wirtszellen, in denen der Vektor funktional ist, Kultivieren der Wirtszellen, so dass das Protein produziert wird, und Bergen des Proteins von den Wirtszellen oder dem umgebenden Medium erhalten werden. Prokaryotische und eukaryotische Zellen werden zu diesem Zweck im Stand der Technik verwendet, einschließlich Stämmen von E. coli, Hefe und eukaryotischen Zellen, wie beispielsweise COS- oder CHO-Zellen. Die Wahl der Wirtszelle kann verwendet werden, um die Eigenschaften des diesen Zellen exprimierten Proteins zu steuern, um z. B. zu steuern, wo das Protein in den Wirtzellen abgelagert wird, oder um Eigenschaften wie beispielsweise seine Glykosylierung zu beeinflussen.
  • Das Protein, das durch die Polynukleotidsequenz kodiert wird, kann durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren exprimiert werden. Geeigneter Weise kann die Expression durch Ziehen einer Wirtszelle in Kultur, die solch einen Vektor enthält, unter geeigneten Bedingungen erreicht werden, die die Expression des Proteins verursachen oder erlauben.
  • Systeme zum Klonieren und zur Expression eines Proteins in einer Vielzahl von unterschiedlichen Wirtszellen sind gut bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen und Hefe, und Baculovirussysteme. Auch die Verwendung des Retrovirussystems zum Klonieren und zur Expression ist eine gute Alternative, da dieser Virus zusammen mit einer Anzahl von Zelltypen verwendet werden kann. Säugetierzelllinien, die im Stand der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids verfügbar sind, umfassen Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen, Babyhamsternierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein üblicher bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
  • Geeignete Vektoren können ausgewählt oder konstruiert werden, wobei sie nach Bedarf passende regulative Sequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Verstärkersequenzen, Markergene und andere Sequenzen enthalten. Vektoren können Plasmid-, Virus-, z. B. Phagen-, oder Phagemidvektoren sein, so wie es passt. Für weitere Details siehe zum Beispiel Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3. Auflage, Sambrook und Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation von Polynukleotidsequenzen, zum Beispiel bei der Präparation von Polynukleotidkonstrukten, Mutationserzeugung, Sequenzieren, Einführen von DNS in Zellen und Genexpression, und Analyse von Proteinen sind detailliert in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrgs., John Wiley & Sons, 1992 beschrieben.
  • Das System kann für die Erzeugung von DNS-Bibliotheken verwendet werden, die variable Sequenzen aufweisen und die nach gewünschter Proteinfunktion auf eine Vielzahl von Wegen gescreent werden können. Nach Enzymfunktion kann mit Verfahren gescreent werden, die spezifisch für die konkrete Enzymfunktion sind, z. B. CMCase-Aktivität, β-Glucosidaseaktivität und auch thermische Stabilität. Weiterhin können Phagen-Display und Zelloberflächen-Display zum Screenen nach Enzymfunktion verwendet werden (Crameri A. et al., Nature 1998 15; 391 (6664): 288–291; Zhang J. H. et al., PNAS. USA 1997 94 (9): 4504–4509; Warren M. S. et al., Biochemistry 1996, 9; 35 (27): 8855–8862; Kim et al., Appl Environ Microbiol 66: 788–93, 2000) sowie nach geänderten Bindungseigenschaften von z. B. Antikörpern (Griffith et al., EMBO J. 113: 3245–3260, 1994).
  • Ein Protein, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann beim Screenen nach Molekülen verwendet werden, die seine Aktivität oder Funktion beeinflussen oder modulieren. Solche Moleküle können in einem therapeutischen (möglicherweise einschließlich prophylaktischen) Kontext nützlich sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die Polynukleotidsequenzen aufweisen, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die entweder Polynukleotidsequenzen, Vektoren, die die Polynukleotidsequenzen aufweisen, oder Proteine, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder einen für Forschungszwecke akzeptablen Träger aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, das nach der Identifikation des Polynukleotids oder Polypeptids, das gewünschte Eigenschaften aufweist, durch das oben beschriebene Verfahren die Herstellung des Polypeptids oder Polynukleotids als Ganzes oder in Teilen optional in Verbindung mit zusätzlichen Polypeptiden oder Polynukleotiden aufweist.
  • Somit stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
    • (a) Erzeugung von Formvarianten eines Ausgangspolynukleotids unter Verwendung eines Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung;
    • (b) Exprimieren der Polynukleotidvariante, das in Schritt (a) erzeugt wurde, um Polypeptidvarianten zu erzeugen;
    • (c) Screenen der Polypeptidvarianten nach gewünschten Eigenschaften; und
    • (d) Selektieren eines Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften aus den Polypeptidvarianten.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Polypeptid bereit, das durch das obige Verfahren erhalten wurde.
  • Nach der Identifikation eines Polynukleotids oder Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften können diese dann durch wohlbekannte Techniken, wie beispielsweise PKR, Klonieren und Expression innerhalb einer Wirtszelle, hergestellt werden, um größere Zahlen bereitzustellen.
  • Die resultierenden Polypeptide und Polynukleotide können bei der Erzeugung von industriellen Enzymen verwendet werden, z. B. von Waschmittelenzymen, wobei eine erhöhte Aktivität bei tieferen Temperaturen bevorzugt ist. Alternativ können die hergestellten Polynukleotide oder Polypeptide als Forschungswerkzeug verwendet werden, d. h. Antikörper können in Immuntests verwendet werden und Polypeptide können als Hybridisierungssonden oder -primer verwendet werden. Alternativ können die resultierenden Polypeptide oder Polynukleotide bei der Erzeugung von Medikamenten zu diagnostischen Zwecken, zu pharmazeutischen Zwecken, zur Therapie usw. verwendet werden, wie im Folgenden diskutiert wird.
  • Die Polypeptide oder Polynukleotide, die durch die Verfahren der Erfindung erzeugt und als wünschenswerte Eigenschaften aufweisend identifiziert wurden, können in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich zu einer der obigen Substanzen ein pharmazeutisch akzeptables Streckungsmittel, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Pufferstabilisator oder andere Materialen aufweisen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Solche Materialien sollten nicht toxisch sein und sollten nicht die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffs stören. Die präzise Natur des Trägers oder der anderen Materialien kann von der Verabreichungsroute abhängen, z. B. der oralen, intravenösen, kutanen oder subkutanen, nasalen, intramuskulären, intraperitonealen Route.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen für die orale Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger aufweisen, wie beispielsweise Gelatine, oder einen Hilfsstoff. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen allgemein einen flüssigen Träger, wie beispielsweise Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetische Öle. Physiologische Salzlösung, Dextrose oder andere Saccharidlösungen oder Glykole, wie beispielsweise Äthylenglykol, Propylenglykol oder Polyäthylenglykol können eingeschlossen sein.
  • Für die intravenöse, kutane oder subkutane Injektion oder Injektion am Behandlungsort wird der aktive Inhaltsstoff die Form einer parenteral akzeptablen wässrigen Lösung haben, die keimfrei ist und einen geeigneten pH-Wert, geeignete Isotonizität und geeignete Stabilität aufweist. Die Fachleute sind gut in der Lage, unter Verwendung von zum Beispiel isotonischen Vehikeln, wie beispielsweise Natriumchloridinjektionslösung, Ringer-Injektionslösung, laktierter Ringer-Injektionslösung, geeignete Lösungen zu präparieren. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidantien und/oder andere Additive können eingeschlossen werden, wie dies erforderlich ist.
  • So stellt die Erfindung weiterhin ein Polypeptid, das durch die Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, zur Verwendung in der Medizin und die Verwendung eines Polypeptids, das durch die Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, bei der Zubereitung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung, Therapie und/oder Diagnose einer Krankheit bereit.
  • Ob es sich um ein Polypeptid, z. B. einen Antikörper oder ein Fragment davon, ein Enzym, ein Polynukleotid oder ein Nukleinsäuremolekül handelt, das nach Erzeugung durch die vorliegende Erfindung identifiziert wurde und das an ein Individuum verabreicht wird, die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer ”prophylaktisch wirksamen Menge” oder einer ”therapeutisch wirksamen Menge” (je nach Fall, obwohl Prophylaxe als Therapie angesehen werden kann), wobei diese ausreichend ist, um für das Individuum Nutzen zu zeigen. Die tatsächlich verabreichte Menge und die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung werden von der Natur und der Ernsthaftigkeit dessen abhängen, was behandelt wird. Verschreibung der Behandlung, z. B. Entscheidungen bezüglich der Dosierung usw., liegt innerhalb der Verantwortung des Allgemeinmediziners und anderer Mediziner und berücksichtigt typischerweise die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen Patienten, den Austragungsort, das Verfahren der Verabreichung und andere Faktoren, die dem praktischen Arzt bekannt sind. Beispiel für die Techniken und Protokolle, die oben erwähnt sind, können gefunden werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Osol, A. (Hrsg.), 1980.
  • Alternativ können zielgerichtete (engl.: targeting) Therapien verwendet werden, um das aktive Agens durch die Verwendung von zielrichtenden Systemen, wie beispielsweise von Antikörpern oder zellspezifischen Liganden, spezifischer an bestimmte Zelttypen auszutragen. Zielrichten kann aus einer Vielzahl von Gründen wünschenswert sein; zum Beispiel falls das Mittel unakzeptabel toxisch ist oder falls es anderenfalls eine zu hohe Dosierung erfordern würde oder falls es anderenfalls nicht in der Lage wäre, in die Zielzellen einzutreten.
  • Anstatt diese Agenzien direkt zu verabreichen, könnten sie in den Zielzellen durch Expression von einem kodierenden Gen produziert werden, das in die Zellen eingeführt wird, z. B. in einem Virusvektor (eine Variante der VDEPT-Technik, d. h. das aktivierende Agens, z. B. ein Enzym, wird in einem Vektor durch Expression von kodierender DNS in einem Virusvektor produziert). Der Vektor könnte auf die spezifischen Zellen, die zu behandeln sind, zielgerichtet werden, oder er könnte regulative Elemente enthalten, die mehr oder weniger selektiv durch die Zielzellen eingeschaltet werden.
  • Alternativ könnte das Agens in einer Vorform verabreicht werden zur Umwandlung in die aktive Form durch ein aktivierendes Agens, das in den zu behandelnden Zellen produziert oder auf diese zielgerichtet wird. Diese Art von Ansatz ist manchmal bekannt als ADEPT oder VDEPT; wobei der Erste das Zielrichten des aktivierenden Agens auf die Zellen durch Konjugation zu einem zellspezifischen Antikörper einbezieht, während der Letztere das Produzieren des aktivierenden Agens, z. B. eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression von kodierender DNS in einem Virusvektor einbezieht (siehe zum Beispiel EP-A-415731 und WO 90/07936 ).
  • Eine Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, entweder simultan oder sequenziell, abhängig von dem zu behandelnden Zustand.
  • Als eine weitere Alternative könnte das Polynukleotid, das nach der Erzeugung durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung als wünschenswerte Eigenschaften aufweisend identifiziert wurde, in einem Gentherapieverfahren verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, der unfähig ist, das aktive Polypeptid zu synthetisieren, das durch das Polynukleotid kodiert wird, oder der unfähig ist, es auf dem normalen Niveau zu synthetisieren, wodurch der Effekt bereitgestellt wird, der durch das entsprechende Wildtypprotein bereitgestellt wird.
  • Vektoren, wie beispielsweise Virusvektoren, sind im Stand der Technik verwendet worden, um Polynukleotide in eine große Vielfalt von unterschiedlichen Zielzellen einzuführen. Typischerweise werden die Vektoren den Zielzellen angeboten, so dass bei einem ausreichenden Anteil der Zellen eine Transfektion erfolgen kann, um einen nützlichen therapeutischen oder prophylaktischen Effekt durch die Expression des gewünschten Polypeptids bereitzustellen. Die transfizierte Nukleinsäure kann permanent in das Genom jeder der angezielten Tumorzellen eingebaut werden, was einen lang andauernden Effekt bereitstellt, oder alternativ kann die Behandlung periodisch zu wiederholen sein.
  • Eine Vielzahl von Vektoren, sowohl Virusvektoren als auch Plasmidvektoren, sind im Stand der Technik bekannt, siehe US-Patent Nr. 5,252,479 und WO 93/07282 . Insbesondere ist eine Anzahl von Viren als Gentransfervektoren verwendet worden, einschließlich Papovaviren, wie beispielsweise SV40, Vacciniavirus, Herpesvirus, einschließlich HSV und EBV, und Retroviren. Viele Gentherapieprotokolle im Stand der Technik haben inaktivierte murine Retroviren verwendet.
  • Als eine Alternative zu der Verwendung von Virusvektoren umfassen andere bekannte Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuren in Zellen Elektroporation, Kalziumphosphatcopräzipitation, mechanische Techniken, wie beispielsweise Mikroinjektion, durch Liposome und direkte DNS-Aufnahme vermittelten Transfer und Rezeptor-vermittelten DNS-Transfer.
  • Wie oben erwähnt ist, ist das Ziel von Gentherapie, die Nukleinsäure verwendet, welche ein Polypeptid oder einen aktiven Bereich davon kodiert, die Menge an Expressionsprodukt der Nukleinsäure in Zellen zu erhöhen, in denen das Niveau des Wildtyppolypeptids fehlt oder nur auf reduzierten Niveaus vorliegt. Solche Behandlung kann therapeutisch bei der Behandlung von Zellen sein, die bereits krebsartig sind, oder prophylaktisch bei der Behandlung von Individuen, die durch Screenen dahingehend bekannt sind, dass sie Suszeptibilitätsallele und entsprechend eine Prädisposition für zum Beispiel Krebs aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder einer Population von Sequenzen mit gewünschten Eigenschaften bereit, das Reagenzien für Einzeltrang-DNS-Zubereitung, eine Exonulease und Komponenten für das Durchführen einer PKR-Technik, zum Beispiel thermostabile DNS (Nukleotide) und eine Stoppeinrichtung, zum Beispiel EGTA, aufweist.
  • Wie oben dargelegt wurde, sorgt die vorliegende Erfindung in geeigneter Weise für die Erzeugung von mutierten Enzymgensequenzen und deren zufällige Kombination zu funktionalen Enzymen mit gewünschten Eigenschaften. Als Beispiel dieses Aspekts der Erfindung werden die Enzymgene durch fehlerbehaftete PKR mutiert, die in eine Mutationsrate von ungefähr 0,7% resultiert. Der resultierende Pool von mutierten Enzymgenen wird dann mit einer Exonuklease aufgeschlossen, z. B. BAL31, und die Reaktion wird durch die Zugabe von EGTA oder durch Wärmeaktivierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten inhibiert, was in einen Satz von DNS-Fragmenten von unterschiedlicher Größe resultiert. Diese können dann einem PKR-basierten Wiederzusammenbau unterworfen werden, wie oben beschrieben wurde. Die resultierenden wieder zusammengebauten DNS-Fragmente werden dann kloniert, und eine Genbibliothek wird konstruiert. Aus dieser Bibliothek können dann Klone selektiert und sequenziert werden.
  • Eine weitere Anwendung dieser Technologie ist die Erzeugung einer Population von variablen DNS-Sequenzen, die für weitere Selektionen und Analysen verwendet werden können. Neben der Kodierung größerer Proteine, z. B. von Antikörperfragmenten und Enzymen, kann die DNS Peptide kodieren, bei denen die funktionalen Moleküleigenschaften für die Entwicklung verschiedener Selektionssysteme verwendet werden können. Die Selektion von rekombinierten DNS-Sequenzen, die Peptide kodieren, ist zuvor beschrieben worden (Fisch et al., PNAS. USA 1996 Jul 23; 93 (15): 7761–7766). Zusätzlich kann die variable DNS-Population verwendet werden, um eine Population von RNS-Molekülen mit z. B. katalytischen Aktivitäten herzustellen. Vaish et al., (PNAS. USA 1998 Mar 3; 95 (5): 2158–2162) demonstrierten die Konstruktion eines funktionalen Systems für die Selektion von katalytischer RNS, und Eckstein F (Ciba Found. Symp. 1997; 209; 207–212) hat die Anwendungen von katalytischer RNS durch die spezifische Einführung von katalytischer RNS in Zellen dargelegt. Das System kann verwendet werden, um den Sequenzraum bei der Selektion von funktionalen Peptiden/Molekülen mit katalytischen Aktivitäten basierend auf rekombinierten DNS-Sequenzen weiter zu durchsuchen.
  • Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden jetzt beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren illustriert werden. Weitere Aspekte und Ausführungsformen werden dem Fachmann ersichtlich sein.
  • 1 zeigt das Prinzip des Verfahrens von einem Vorlagemolekül zu einem verbesserten Molekül.
  • 2 zeigt die prinzipiellen Schritte bei der Präparation von Einzelstrang-DNS unter Verwendung von Biotin.
  • 3 zeigt die prinzipiellen Schritte bei der Präparation von Einzelstrang-DNS unter Verwendung von Phage.
  • 4 zeigt die prinzipiellen Schritte beim Erzeugen von Einzelstrang-DNS-Fragmenten unter Verwendung von Exonukleasebehandlung.
  • 5 zeigt die prinzipiellen Schritte für den Zusammenbau von Einzelstrang-DNS-Fragmenten unter Verwendung von PKR.
  • 6 zeigt den Prozentsatz von Rekombinanten mit einer Überkreuzung, die nach Aufschluss von Doppelstrang-DNS mit 20 U/ml BAL31 für unterschiedliche Zeiträume ausgebildet wurden.
  • 7 zeigt den Prozentsatz von Rekombinanten mit zwei Überkreuzungen, die nach Aufschluss von Doppelstrang-DNS mit 20 U/ml BAL31 für verschiedene Zeiträume ausgebildet wurden.
  • 8 zeigt den Prozentsatz von Rekombinanten mit einer Überkreuzung, die nach Aufschluss von Einzelstrang-DNS mit 1,25 U/ml BAL31 für verschiedene Zeiträume ausgebildet wurden.
  • 9 zeigt den Prozentsatz von Rekombinanten mit zwei Überkreuzungen, die nach Aufschluss von Einzelstrang-DNS mit 1,25 U/ml BAL31 für variierende Zeiträume ausgebildet wurden.
  • 10 zeigt den Prozentsatz von Rekombinanten mit einer Überkreuzung, die nach Aufschluss von Einzelstrang-DNS mit 11 U/ml BAL31 für variierende Zeiträume ausgebildet wurden.
  • 11 zeigt den Prozentsatz von Rekombinanten mit zwei Überkreuzungen, die nach Aufschluss von Einzelstrang-DNS mit 11 U/ml BAL31 für variierende Zeiträume ausgebildet wurden.
  • 12 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng Einzelstrang-DNS mit BAL31 für 50 Minuten (Spur 1), 30 Minuten (Spur 2) und 10 Minuten (Spur 3) erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS ist in Spur 4 gezeigt. Molekulargewichtsmarker sind in Spur 5 gezeigt.
  • 13 zeigt die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 4 in 12.
  • 14 zeigt die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 3 in 12.
  • 15 zeigt die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 2 in 12.
  • 16 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng DNS mit Exonuklease VII für 10 Minuten (Spur 3), 20 Minuten (Spur 4) und 30 Minuten (Spur 5) erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS ist in Spur 2 gezeigt. Molekulargewichtsmarker sind in Spur 1 gezeigt.
  • 17 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng DNS mit Exonuklease Rec Jf (9 U/mg Einzelstrang-DNS) für 10 Minuten (Spur 2), 20 Minuten (Spur 3) und 30 Minuten (Spur 4) erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS ist in Spur 1 gezeigt. Molekulargewichtsmarker sind in Spur 5 gezeigt.
  • 18 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng DNS mit Exonuklease Rec Jf (36 U/mg Einzelstrang-DNS) für 10 Minuten (Spur 3), 20 Minuten (Spur 4) und 30 Minuten (Spur 5) erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS ist in Spur 2 gezeigt. Molekulargewichtsmarker sind in den Spuren 1 und 6 gezeigt.
  • 19 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng DNS mit DNase I (0,15 U Enzym/mg DNS) erzeugt wurden. Die Proben in den Spuren waren wie folgt:
    Spur 1: Molekulargewichtsmarker
    Spur 2: Unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mg-Puffer
    Spur 3: Einzelstrang-DNS mit DNase I fragmentiert in Mg-Puffer
    Spur 4: Unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mn-Puffer
    Spur 5: Einzelstrang-DNS mit DNase I fragmentiert in Mn-Puffer
    Spur 6: (leer)
    Spur 7: (leer)
  • 20 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng DNS mit DNase I erzeugt wurden. Die Proben in den Spuren waren wie folgt:
    Spur 1: Molekulargewichtsmarker
    Spur 2: Unbehandelte Doppelstrang-DNS in Mg-Puffer
    Spur 3: Unbehandelte Doppelstrang-DNS in Mg-Puffer
    Spur 4: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) in Mg-Puffer
    Spur 5: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) in Mg-Puffer
    Spur 6: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang) in Mg-Puffer
    Spur 7: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang) in Mg-Puffer
    Spur 8: Doppelstrang-DNS mit DNase I (0,24 U Enzym/μg DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
    Spur 9: Doppelstrang-DNS mit DNase I (1,3 U Enzym/μg DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
    Spur 10: Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) mit DNase I (0,24 U Enzym/μg DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
    Spur 11: Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) mit DNase I (1,3 U Enzym/μg DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
    Spur 12: Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang) mit DNase I (0,24 U Enzym/μg DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
    Spur 13: Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang) mit DNase I (1,3 U Enzym/μg DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
  • 21 zeigt die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 6 in 20.
  • 22 zeigt die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 12 in 20.
  • 23 zeigt die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 13 in 20.
  • 24 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss von 300 ng DNS mit Mungobohnennuklease erzeugt wurden. Die Proben in den Spuren waren wie folgt:
    Spur 1: Unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mg-Puffer
    Spur 2: Einzelstrang-DNS mit Mungobohnennuklease für 10 Minuten fragmentiert
    Spur 3: Molekulargewichtsmarker
  • 25 zeigt den Effekt der Dauer der Fragmentierung auf die Rekombinationsfrequenz von tet-Beständigkeitsgenen nach Fragmentierung von Einzelstrang-DNS mit (a) BAL31, (b) ExoI, (c) T7gene6 und (d) ExoV kombiniert mit ExoI.
  • 26 zeigt den Prozentsatz von mehrfachen Überkreuzungen, die nach Behandlung mit unterschiedlichen Nukleasen erzeugt wurden. Die Rekombinationsfrequenz wurde ausgewertet für a) ExoI-behandelte Einzelstrang-DNS, b) ExoI(10 min)-behandelte Einzelstrang-DNS kombiniert mit ExoVII-behandelter DNS, c) ExoI(10 min)-behandelte Einzelstrang-DNS kombiniert mit ExoV-behandelter Einzelstrang-DNS und d) ExoI(10 min)-behandelte Einzelstrang-DNS kombiniert mit ExoV- und ExoVII-behandelter Einzelstrang-DNS.
  • 27 zeigt einen Vergleich der Anzahl von Rekombinationen, die nach Fragmentierung von Einzelstrang-DNS mit einer Exonuklease und Fragmentierung von Doppelstrang-DNS mit einer Endonuklease beobachtet werden.
  • BEISPIELE
  • Die DNS-Mischprozedur kann durch die in den 1 bis 5 gezeigten Schritte illustriert werden. Das Gen, das das Protein von Interesse (X) in dem Plasmid pFab7chis kodiert, wird in diesem Beispiel verwendet. Zufällige Mutationen werden durch fehlerbehaftete PKR eingeführt. Einzelstrang-DNS wird präpariert. Dies kann durchgeführt werden entweder durch biotinylierte Primer oder durch die Verwendung von Phage, die in der Lage ist, Einzelstrang-DNS zu packen, wie oben diskutiert wurde. Die kodierenden und die nichtkodierenden Einzelstrang-DNS-Stränge werden in unterschiedlichen Reaktionen (A und B) präpariert. Die Einzelstrang-DNS-Stränge von beiden Reaktionen werden separater enzymatischer Behandlung unter Verwendung von z. B. BAL31 unterworfen. Durch Mischen der zwei Poole von Einzelstrang-DNS-Fragmenten in equimolaren Mengen kann das Gen in einer gemischten (engl.: shuffled) Weise und in vielen Versionen durch die Anwendung von zwei aufeinander folgenden PKR-Reaktionen wieder zusammengebaut werden, wobei die erste Reaktion keine Primer enthält.
  • Nach Klonieren dieser Bibliothek von wieder zusammengebauten Genen in pY können Selektionen durchgeführt werden, um die interessierenden verbesserten Moleküle zu erhalten.
  • Eine detailliertere Beschreibung der Beispiele der vorliegenden Erfindung wird unten gegeben.
  • Beispiel 1
  • Reagenzien
  • AmpliTaq®-Polymerase wurde von Perkin-Elmer Corp., dNTP von Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim, Deutschland) und BAL31-Nuklease von New England Biolabs Inc. (Beverly, USA) gekauft. Alle Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs Inc. (Beverly, USA) gekauft. Ethidiumbromid wurde von Bio-Rad Laborstories (Bio-Rad Laborstories, Hercules, CA, USA) gekauft. T4-DNS-Ligase wurde von New England Biolabs Inc. (Beverly, USA) gekauft. EDTA und EGTA wurden von Kebo Lab (Schweden) gekauft.
  • Alle Primer wurden im Labor konstruiert und von Life Technologies (Täby, Schweden) und SGS-DANN (Köping, Schweden) erhalten.
  • PKR
  • Alle Polymerasekettenreaktionen (PKR) wurden in einem automatischen Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus 480, Norwalk, CT, USA) durchgeführt. PKR-Techniken für die Vervielfältigung von Nukleinsäure sind in dem US-Patent Nr. 4,683,195 beschrieben. Quellen zur grundsätzlichen Verwendung von PKR-Techniken umfassen Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987), Ehrlich (Hrsg.), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich et al., Science, 252: 1643–1650, (1991), ”PCR protocols; A Guide to Methods and Applications”, Hrsg. Innis et al., Academic Press, New York, (1990).
  • Sequenzieren
  • Alle Konstrukte sind durch die Verwendung eines BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer, Elmervill, CA, USA) sequenziert worden. Das Sequenzieren wurde auf einem ABI Prism 377 DNS-Sequenzierer durchgeführt.
  • Agaroseelektrophorese
  • Agaroseelektrophorese von DNS wurde mit 2% Agarosegelen (AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)) mit 0,25 μg/ml Ethidiumbromid in Tris-Acetat-Puffer (TAE-Puffer 0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA) durchgeführt. Proben für die Elektrophorese wurden mit einem sterilen filtrierten Ladepuffer gemischt, der aus 25% Ficoll und Bromphenolblau zusammengesetzt war, und in die Löcher in einem 2% Agarosegel geladen. Die Elektrophorese lief bei 90 V für 45 Minuten in Tris-Acetat-Puffer mit 0,25 μg/ml Ethidiumbromid, soweit nichts anderes angegeben ist. Bänder von angemessener Größe wurden unter Verwendung des Qiaquick Gel Extraction Kits (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) Gel-gereinigt, wenn es nötig war. Als Molekulargewichtsstandard wurde die 1 kb DNS-Molekulargewichtsleiter (Gibco BRL) verwendet. Die DNS-Konzentration der Gel-extrahierten Produkte wurde unter Verwendung eines Sprektrophotometers abgeschätzt.
  • Bakterienstämme
  • Der Escherichia coli-Stamm TOP10F' wurde als bakterieller Wirt für Transformationen verwendet. Chemisch kompetente Zellen dieses Stamms wurden grundsätzlich so produziert, wie beschrieben ist von Hanahan, D. 1983: Studies an transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557–580. Elektrokompetente Zellen dieses Bakterienstamms wurden produziert (Dower, W. J., J. F. Miller und C. W. Ragsdale. 1988: High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16: 6127).
  • Plasmide
  • Alle genetischen Manipulationen wurden bei pFab5chis gemäß Molecular cloning; a laboratory manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) durchgeführt. Dieser Vektor ist konstruiert, um jegliches scFv-Gen aufzunehmen, das zwischen den SfiI- und NotI-Plätzen eingesetzt wird. Der SfiI-Platz ist in der pe1B-Führersequenz angeordnet, und der NotI-Platz ist direkt nach der VL-Region angeordnet, so dass VH-Linker-VL eingesetzt wird. In diesem Fall wurde ein Antikörper, der gegen CD40 gerichtet war, verwendet.
  • Primer
  • Zwei biotinylierte Primer, die das Antikörpergen von pFab5chis umgeben, wurden mit den folgenden Sequenzen einschließlich bestimmter einzigartiger Restriktionsplätze konstruiert:
  • 1736 SfiI-Vorwärtsprimer:
    Figure 00270001
  • und 1735 NotI-Rückwärtsprimer:
    Figure 00270002
  • Zwei nicht-biotinylierte Primer, die das Antikörpergen von pFab5chis umgeben, wurden mit den folgenden Sequenzen konstruiert, die bestimmte einmalige Restriktionsplätze umfassen:
  • 1664 SfiI-Vorwärtsprimer:
    Figure 00270003
  • und 1635 NotI-Rückwärtsprimer:
    Figure 00270004
  • Standard-PKR
  • Standard-PKR-Reaktionen liefen 25 Zyklen bestehend aus dem folgenden Profil: Denaturierung (94°C, 1 Minute), Primerhybridisierung (55°C, 1 Minute) und Verlängerung (72°C, 3 Minuten). Jede PKR-Reaktion enthielt 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 1 μM Vorwärtsprimer, 1 μM Rückwärtsprimer, 1,25 U thermostabile DNS-Polymerase AmpliTaq® (Perkin-Elmer Corp.) und 50 ng Vorlage in einem Endvolumen von 100 μl.
  • Fehlerbehaftete PKR
  • Die fehlerbehafteten PKR-Reaktionen wurden einem 10 ×-Puffer durchgeführt, der 500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM MgCl2, 100 μg Gelatine enthielt (gemäß Kuipers et al., Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25; 19 (16): 4558 aber mit von 2 mM auf 5 mM angehobener MgCl2-Konzentration).
  • Für jede 100 μl Reaktion wurde das Folgende gemischt:
    dAPT 5 mM 5 μl
    dGTP 5 mM 5 μl
    dTTP 10 mM 10 μl
    dCTP 10 mM 10 μl
    20 μM 3'-Primer 1,5 μl
    20 μM 5'-Primer 1,5 μl
    10 × Kuipers-Puffer 10 μl
    steriles mp H2O 46,3 μl
  • Die Vorlage in pFab5chis-Vektor wurde in einer Menge von 50 ng zugegeben. 10 μl 10 mM MnCl2 wurden zugegeben, und das Rohr wurde darauf überprüft, dass kein Niederschlag von MnO2 auftrat. Mindestens 5 Einheiten Taq-Enzym wurden zugegeben. Die fehlerbehaftete PKR lief bei den folgenden Temperaturen für 25 Zyklen ohne heißen Start: 94°C 1 Minute, 45°C 1 Minute, 72°C 1 Minute und 72°C 7 Minuten. Das resultierende Produkt war ein fehlerbehafteter Einsatz über das Protein von ungefähr 750 bp. Dieser Einsatz wurde vor weiterer Behandlung mit dem Gibco PKR Reinigungskit gereinigt.
  • Erzeugung von Einzelstrang-DNS durch biotonylierte Primer
  • Das interessierende Fragment wurde durch zwei separate PKR-Reaktionen vervielfacht. Diese Reaktionen können Standard-PKR wie oben beschrieben oder fehlerbehaftete PKR wie ebenfalls oben beschrieben sein. Die Primer sollten so ausgelegt sein, dass in einer Reaktion der Vorwärtsprimer biotinyliert und in der anderen Reaktion der Rückwärtsprimer biotinyliert ist. Zum Beispiel wurden PKR-Reaktionen mit A) Primern 1736 und 1635 und B) Primern 1664 und 1735 mit dem oben erwähnten Profil für 25 Zyklen mit pFab5chis-Antikörper als Vorlage durchgeführt. Dies ergab PKR-Produkte von ungefähr 750 bp, wobei bei A der obere Strang und bei B der untere Strang biotinyliert war.
  • Die nichtbiotinylierten Stränge wurden durch Reinigung unter Verwendung einer festen Matrix beschichtet mit Streptavidin, z. B. Dynabeads, erhalten. Die magnetischen Perlen werden gewaschen und mit PBS/1% BSA und B&W-Puffer, der 5 mM Tris pH 7,5, 1 M NaCl und 0,5 mM EGTA enthielt, eingestellt. 100 μl jedes PKR-Produkts werden mit 100 μl Perlen aufgelöst in 2 × B&W-Puffer gemischt und für 15 Minuten unter Rotation bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene PKR-Produkte werden durch zweimaliges vorsichtiges Waschen mit B&W entfernt. Der nichtbiotinylierte Strang der eingefangenen DNS wird durch alkalische Denaturierung eluiert, indem das DNS-Inkubat mit 25 μl 0,1 M NaOH für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Die Lösung wird von den Perlen separiert und mit 7,5 μl 0,33 M HCl und 2,5 μl 1 M Tris pH 8 neutralisiert.
  • Erzeugung von Einzelstrang-DNS unter Verwendung von Phage
  • Das Fragment von Interesse wurde unter Verwendung von PstI/HindIII-Restriktionsenzymen in Bakteriophage M13-Vektoren M13mp18 und M13mp19 kloniert. Die Bakteriophage wurde unter Verwendung des Escherichia coli-Stamms TOP10F' gemäß einem konventionellen Verfahren vermehrt. Einzelstrang-DNS führ den oberen Strang wurde von dem Bakteriophagevektor M13mp18 präpariert, und Einzelstrang-DNS für den unteren Strang wurde von dem Bakteriophagevektor M13mp19 präpariert. Kurz gesagt wurden 1,5 ml einer infizierten Bakterienkultur bei 12000 g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 200 μl 20% PEG8000/2,5 M NaCl präzipitiert. Die pelletierte Bakteriophage wurde in 100 μl TE resuspendiert. 50 μl Phenol eingestellt mit Tris-Cl (pH 8,0) wurden zugegeben, und die Probe wurde gevortext. Nach Zentrifugieren bei 12000 g für 1 Minute bei Raumtemperatur wurde die obere Phase, die die DNS enthielt, überführt und mit Ethanol präzipitiert. Das DNS-Pellet wurde in 50 μl TE (pH 8,0) aufgelöst und bei –20°C gelagert. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual 2. Aufl. Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989, Kapitel 4). Von Phage präparierte Einzelstrang-DNS ist ringförmig und muss vor der BAL31-Behandlung geöffnet werden. Dies kann durch eine Endonuklease durchgeführt werden, die in der Lage ist, Einzelstrang-DNS zu spalten.
  • Erzeugung von Einzelstrang-DNS unter Verwendung asymmetrischer PKR
  • PKR-Produkte werden unter Verwendung einer Spin-Säule gereinigt, um überschüssige Primer von der vorherigen PKR zu entfernen. 150 ng des gereinigten Produkts werden als Vorlage bei einer linearen Vervielfachung verwendet, die in 100 μl 1 × GeneAmp® 10 × PKR-Puffer, der 1,5 mM MgCl2 (Applied Biosystems), 200 μM von jedem dNTP (New England BioLabs), 1,25 U AmpliTaq®-DNS-Polymerase (Applied Biosystems) und 1,0 μM eines einzelnen Primers enthält. Die PKR-Zyklusbedingungen sind: Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, 35 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute, gefolgt von Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten.
  • Asymmetrische PKR-Produkte werden von der Doppelstrangmatrize auf einem 1% Agarosegel der Größe nach getrennt und unter Verwendung des Qiaquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gereinigt.
  • Erzeugung von fragmentierter Einzelstrang-DNS unter Verwendung von BAL 31
  • Die Einzelstrang-DNS-Stränge (die obere bzw. untere Stränge enthielten) wurden einer separaten enzymatischen Behandlung unter Verwendung von z. B. BAL 31 unterworfen. Jede Aufschlussreaktion enthielt 0,02 μg/μl Einzelstrang-DNS, 600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 1 mM EDTA pH 8,0 und BAL 31 in verschiedenen Enzymkonzentrationen, die von 0,1–5 U/ml reichten. Die Reaktionen wurden bei 30°C inkubiert und Fraktionen von aufgeschlossener Einzelstrang-DNS wurden nacheinander bei 10, 30, 60 und 120 Sekunden oder mehr gesammelt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA und Wärmebehandlung bei 65°C für 10 Minuten gestoppt. Die Einzelstrang-DNS-Fragmente wurden durch Phenol-/Chloroformextraktion gereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Die Einzelstrang-DNS wurden in 10 mM Tris pH 8,0 resuspendiert.
  • Das Aufschlussmuster wurde durch 1% Agarosegelelektrophorese ausgewertet.
  • Reinigung von durch Aufschluss erzeugten Fragmenten:
  • Aufgeschlossene DNS-Fragmente wurden durch Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkoholextraktion gereinigt. 50 μl gepuffertes Phenol wurden zu jedem Rohr von 100 μl Probe zusammen mit 50 μl einer Mischung von Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) hinzugegeben. Die Rohre wurden für 30 Sekunden gevortext, und dann für 1 Minute in einer Mikrofuge bei 14000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die obere Phase wurde dann gesammelt und mit 2,5 Volumen von 99,5% Ethanol gemischt (1/10 war 3 M Natriumacetat, pH 5,2). Die DNS wurde für 1 Stunde bei –80°C präzipitiert. Die DNS wurde dann durch Zentrifugieren für 30 Minuten in einer Mikrofuge bei 14000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Das Pellet wurde einmal mit 70% Ethanol gewaschen und dann erneut in 10 μl sterilem Wasser aufgelöst.
  • Analyse von durch Aufschluss erzeugten gereinigten Fragmenten auf Agarosegel
  • 5 μl des aufgelösten Pellets von jedem Zeitpunkt und von der Leerprobe wurden mit 2,5 μl Ladepuffer (25% Ficoll und Bromphenol blau) gemischt und in Löcher in einem 2% Agarosegel geladen. Die Elektrophoresen der unterschiedlichen Zeitpunkte wurden wie oben durchgeführt.
  • Wiederzusammenbau von Fragmenten voller Länge
  • Der Wiederzusammenbau der Einzelstrang-DNS-Fragmente wird durch zwei sequenzielle PKR-Reaktionen erreicht. Die erste PKR-Reaktion sollte 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,3 U Taq-Polymerase und 2 μl BAL31-behandelte Probe enthalten, alles in einem Endvolumen von 25 μl, und 5 Zyklen mit dem folgenden Profil unterworfen werden: 94°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten + 72°C für 5 Minuten. Die zweite PKR-Reaktion sollte 10 mM Tris-HCl, ph 8,3. 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,6 U Taq-Polymerase, 1 μM Vorwärtsprimer, 1 μM Rückwärtsprimer und 5 μM Probe von der ersten PKR-Reaktion enthalten, alles in einem Endvolumen von 50 μl, und 15 Zyklen mit dem folgenden Profil unterworfen werden: 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten + 72°C für 7 Minuten. Die resultierenden Produkte können durch Agarosegelelektrophorese ausgewertet werden.
  • Restriktionsaufschluss von wieder zusammengebautem Fragment und Plasmid mit SfiI und NotI
  • Das wieder zusammengesetzte Fragment und das Plasmid pFab5chis wurden zuerst unter Verwendung von NEB-Puffer 2, der BSA und 11 U Enzym/μg DNS enthielt, mit SfiI gespalten. Die Reaktion wurde für 4 Stunden bei 50°C durchgeführt. Danach wurde die DNS durch Zugabe von Umwandlungspuffer und 6 U Enzym/μg DNS mit NotI gespalten. Diese Reaktion wurde bei 37°C über Nacht durchgeführt.
  • Gelreinigung von restriktionsaufgeschlossenem Vektor und restriktionsaufgeschlossenem wieder zusammengesetztem Fragment
  • Die Spaltungsreaktion wurde auf einem 1% Agarosegel analysiert. Der restriktionsaufgeschlossene Einsatz zeigte ein Spaltungsprodukt von ungefähr 750 bp. Dies entspricht gut der erwarteten Größe. Das Band des gespaltenen Einsatzes und des Plasmids wurden ausgeschnitten und gelextrahiert, wie zuvor beschrieben wurde.
  • Ligatierung von wieder zusammengesetztem restriktionsaufgeschlossenem Fragment mit restriktionsaufgeschlossenem pFab5chis
  • Gereinigter gespaltener pFab5chis wurde mit gereinigtem wieder zusammengesetztem, restriktionsaufgeschlossenem Fragment bei 12°C Wasserbad für 16 Stunden ligatiert. 50 μl des Vektors wurden mit 50 μl des Einsatzes und 15 μl von 10 × Puffer (angereichert mit dem Enzym), 7,5 μl Ligase (5 U/μl) und sterilem Wasser bis auf ein Endvolumen von 150 μl gemischt. Eine Ligatierung des restriktionsaufgeschlossenen pFab5chis ohne jeglichen Einsatz wurde ebenfalls in derselben Weise durchgeführt.
  • Transformation von chemisch kompetentem E coli TOP10F' mit dem ligatierten wieder zusammengesetzten Einsatz und pFab5chis
  • Die Ligatierungsreaktionen wurden durch Phenol-/Chloroformextraktion wie oben beschrieben gereinigt. Die obere Phase von der Extraktion wurde gesammelt und mit 2,5 Volumen 99,5% Ethanol gemischt (1/10 war 3 M Natriumacetat, pH 5,2). Die DNS wurde für 1 Stunde bei –80°C präzipitiert. Die DNS wurde dann durch Zentrifugieren für 30 Minuten in einer Mikrofuge bei 14000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Das Pellet wurde einmal mit 70% Ethanol gewaschen und dann erneut in 10 μl sterilem Wasser aufgelöst. 5 μl von jeder Ligatierung wurden separat mit 95 μl chemisch kompetentem E coli-TOP10F' gemischt, für 1 Stunde auf Eis inkubiert und dann transformiert (Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual 2. Aufl. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). Nach einer Stunde Wachstum wurden die Bakterien von den zwei Transformationen auf Ampicillin enthaltende Agarplatten (100 μg/ml) ausgebreitet. Die Platten wurden kopfüber für 14 Stunden in einem 37°C Inkubator gezogen.
  • Beispiel 2 – Rekombinationsfrequenzen; Vergleich von Doppelstrang-DNS und Einzelstrang-DNS
  • In weiteren vergleichbaren Experimenten wurden drei scFv-Antikörperfragmente in Rekombinationsexperimenten verwendet, entweder als Doppelstrang-DNS oder als Einzelstrang-DNS.
  • Doppelstrang-DNS
  • Die drei scFv-Gene wurden jeweils unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern und einer Standard-PKR-Prozedur durch PKR vervielfacht. Die Größe der Bänder wurde durch Agaroseelektrophorese bestätigt, und der Rest der verstärkten PKR-Produkte wurde unter Verwendung des Concert PKR-Reinigungskits (Gibco) gereinigt. Die Doppelstrang-DNS von den drei scFv wurden in equimolaren Mengen gemischt und mit BAL31 behandelt. Jede Aufschlussreaktion enthielt Doppelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,02 μg/μl Reaktionsvolumen, 600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 1 mM EDTA pH 8,0 und BAL31 in unterschiedlichen Enzymkonzentrationen (unter Verwendung von 4, 20 oder 100 U Enzym/ml Reaktionsvolumen). Die Reaktionen wurden bei 30°C inkubiert und Fraktionen von aufgeschlossener Doppelstrang-DNS wurden der Reihe nach bei 10, 30 und 50 Minuten gesammelt. Die Reaktionen wurden mit EDTA und Wärmebehandlung gestoppt (alternativ kann ein EDTA-freies Wärmedeaktivierungsprotokoll verwendet werden; siehe unten) und unter Verwendung von Phenol-/Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die Doppelstrang-DNS-Proben wurden in 10 mM Tris pH 8,0 resuspendiert.
  • Unter Getrennthalten jedes Zeitpunkts wurden die Proben Wiederzusammenbau-PKR (für diesen Wiederzusammenbau wurden 60 ng DNS verwendet) und Verstärkungs-PKR gemäß dem Protokoll unterworfen und in pGEM (Produkt Nr. A362A, Promega, Madison, USA) kloniert. Achtzehn Klone von jedem Zeitpunkt wurden sequenziert, und die Anzahl und Frequenz von Rekombinationen wurden bestimmt.
  • Wärmedeaktivierung von Exonukleaseaufschlüssen
  • Ein Protokoll, um die BAL31-Reaktion ohne Verwendung von EDTA zu stoppen, wurde aufgestellt. Dieses Wärmedeaktivierungsprotokoll vermeidet die Verwendung von Phenol-/Chloroformextraktion, die gesundheitsgefährlich ist und auch einen Materialverlust verursacht.
  • Kurz gesagt wird die Probe für 10 Minuten bei 95°C inkubiert und dann direkt auf Eis gegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Danach kann die Probe unter Verwendung von Ethanol direkt präzipitiert werden.
  • Einzelstrang-DNS
  • Die drei scFv-Gene wurden jeweils in zwei PKR-Reaktionen unter Verwendung von Primerpaaren Vorwärts/Rückwärts-Biotin und Vorwärts-Biotin/Rückwärts unter Verwendung von Standard-PKR-Prozedur vervielfacht. Die Größe der Bänder wurde durch Agaroseelektrophorese bestätigt, und der Rest des verstärkten PKR-Produkts wurde unter Verwendung des Concert PKR-Reinigungskits (Gibco) gereinigt. Einzelstrang-DNS wurde unter Verwendung von magnetischen Perlen gemäß dem Protokoll erhalten, wodurch drei Sense-Stränge und drei Antisense-Stränge erreicht wurden. Die Sense-Stränge bzw. die Antisense-Stränge von den drei scFv wurden in equimolaren Mengen gemischt und gemäß dem Protokoll mit BAL31 behandelt (unter Verwendung von 1,25 oder 11 U Enzym/ml Reaktionsvolumen und Einzelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,015 μg/μl Reaktionsvolumen), und Proben wurden nach 0 (d. h. unaufgeschlossen), 10, 30 und 50 Minuten genommen. Die Reaktionen wurden mit EDTA und Wärmebehandlung gestoppt und unter Verwendung von Phenol-/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Unter getrennt Halten der einzelnen Zeitpunkte, aber unter Mischen der Sense- und Antisense-Stränge wurden die Proben Wiederzusammenbau-PKR (für diesen Wiederzusammenbau wurden 60 ng DNS verwendet) und Verstärkungs-PKR gemäß dem Protokoll unterworfen und in pGEM kloniert. Achtzehn Klone von jedem Zeitpunkt wurden sequenziert, und die Anzahl und Frequenz von Rekombinationen wurde bestimmt.
  • Resultate
  • Die höchste Rekombinationsfrequenz unter Verwendung von Doppelstrang-DNS wurde unter Verwendung von 20 U Enzym/ml Reaktionsvolumen (das 0,02 μg/μl DNS enthielt) und Behandeln für 10 Minuten erreicht. Dies ergab 39% der Klone mit einer Überkreuzung (6) und 17% der Klone mit zwei Überkreuzungen (7). Verwendung von 4 U Enzym/ml ergab keine Überkreuzungen unabhängig von der Dauer der Fragmentierung, und 100 U Enzym/ml resultierten in eine vollständige Fragmentierung in sehr kleine Fragmente, wie durch das Scheitern angezeigt wird, während des Wiederzusammenbaus das Gen voller Länge zurückzugewinnen.
  • Die Resultate der Experimente unter Verwendung von Einzelstrang-DNS sind in den 8 bis 10 gezeigt. 8 zeigt 1,25 U/ml BAL31 und Klone mit einer Überkreuzung, 9 zeigt 1,25 U/ml BAL31 und Klone mit zwei Überkreuzungen. 10 zeigt 11 U/ml BAL31 und Klone mit einer Überkreuzung, und 11 zeigt 11 U/ml BAL31 und Klone mit zwei Überkreuzungen.
  • Die höchste Frequenz von Rekombinationen, die eine Überkreuzung unter Verwendung von Einzelstrang-DNS ergaben, wurde unter Verwendung von 11 U Enzym/ml und Behandeln für 10 Minuten erreicht (10). 59% der Klone wiesen eine Überkreuzung auf. Die höchste Frequenz von Rekombinationen, die zwei Überkreuzungen unter Verwendung von Einzelstrang-DNS ergaben, wurde unter Verwendung von 1,25 U Enzym/ml und Behandeln für 30 Minuten erreicht (9). 20% der Klone wiesen zwei Überkreuzungen auf.
  • Schlussfolgerungen und Kommentare
  • Diese Daten zeigen deutlich, dass eine höhere Rekombinationsfrequenz unter Verwendung von Einzelstrang-DNS erreicht wird. Die drei verwendeten scFv haben dieselben Grundgerüstsequenzen, was darauf hinweist, dass die berichtete Anzahl von Überkreuzungen aufgrund von Überkreuzungen in Regionen, wo kein Sequenzunterschied resultieren wird, höher sein mag. Diese Experimente unter Verwendung von Einzelstrang-DNS wurden in einer nicht-optimalen Weise durchgeführt, um maximale Rekombination zu zeigen, da alle Stränge von allen drei Molekülen gemischt wurden. Mischen des Sense-Strangs von einem scFv mit dem Antisense-Strang von einem anderen scFv würde höhere Frequenzen an Überkreuzungen erzeugen, siehe das Beispiel 3, unten. Außerdem wurde hier jeder Zeitpunkt separat gehalten, und es wäre logisch, die Frequenz von Überkreuzungen als ansteigend abzuschätzen, falls unterschiedliche Zeitpunkte, d. h. unterschiedliche Fragmentgrößen, gemischt würden.
  • Beispiel 3 – Rekombinationsfrequenzen; Homologieabhängigkeit unter Verwendung von Einzelstrang-DNS
  • Um die Homologie zu untersuchen, die erforderlich ist, um Überkreuzungen zu erreichen, stellten wir Experimente an, um vier scFv (als SMUC159, CT17, AE11 und MO152 bezeichnet) zu rekombinieren, die wie folgt drei Paare mit unterschiedlichen Homologien ausbilden:
    SMUC159–CT17 92%
    SMUC159–AE11 70%
    SMUC159–MO152 60%
  • Die vier scFv-Gene wurden jeweils in zwei PKR-Reaktionen unter Verwendung von Primerpaaren Vorwärts/Rückwärts-Biotin und Vorwärts-Biotin/Rückwärts unter Anwendung von Standard-PKR-Prozedur vervielfacht. Die Größe der Bänder wurde mit Agaroseelektrophorese bestätigt, und der Rest des verstärkten PKR-Produkts wurde unter Verwendung des Concert PKR-Reinigungskits (Gibco) gereinigt. Einzelstrang-DNS wurde unter Verwendung von magnetischen Perlen gemäß dem Protokoll erhalten, was vier Sense-Stränge und vier Antisense-Stränge ergab. Jeder Strang wurde gemäß dem Protokoll (unter Verwendung von 4,2 oder 12,5 U Enzym/ml) mit BAL31 behandelt, und Proben wurden nach 0, 10, 30 und 50 Minuten oder 0, 15, 30, 45 und 60 Minuten entnommen. Die Reaktionen wurden mit EDTA und Wärmebehandlung gestoppt und unter Verwendung von Phenol-/Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Unter getrennt Halten jedes Zeitpunkts, aber unter Mischen der Sense- und Antisense-Stränge, die die oben angegebenen Paare bilden, wurden die Proben Wiederzusammenbau-PKR und Vervielfachungs-PKR gemäß dem Protokoll unterworfen und in pGEM kloniert. Fünfzehn Klone von jedem Zeitpunkt wurden sequenziert, und die Anzahl und Frequenz der Rekombinationen wurde bestimmt.
  • Resultate
  • Überkreuzungen wurden in allen Kombinationen von scFv identifiziert, was darauf hinweist, dass eine so niedrige wie 60%ige Homologie ausreichend ist, um Rekombinationen zu erreichen.
  • Beispiel 4 – Verbesserte Steuerung der Fragmentgröße unter Verwendung von Exonukleasen
  • (A) Exonukleasen
  • Wir verwenden bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung Exonukleasen, z. B. BAL31, Exonuklease I, Exonuklease V, Exonuklease VII, Exonuklease T7 Gen 6, Bakteriophage lambda-Exonuklease und Exonuklease Rec Jf für die Fragmentierung. Diese Enzyme spalten zu einem Zeitpunkt ein Nukleotid ab, entweder von dem 5' Ende oder dem 3' Ende oder von beiden Enden. Die Reaktion kann unter Verwendung von EDTA oder durch Hitzedeaktivierung (siehe oben) gestoppt werden, abhängig von dem verwendeten Enzym. Dies bedeutet, dass Fragmente von allen möglichen Größen, die sich um nur ein Nukleotid unterscheiden, erhalten werden können.
  • Die folgenden Beispiele demonstrieren, wie Exonukleaseaufschluss abhängig von den verwendeten Bedingungen die Erzeugung von Fragmenten von verschiedenen und steuerbaren Größen erlaubt.
  • BAL31
  • Einzelstrang-DNS wurde mit BAL31 gemäß dem Protokoll in Beispiel 1 aufgeschlossen, mit einer Enzymkonzentration von 4,2 U/ml Reaktionsvolumen und einer Einzelstrang-DNS-Konzentration von 0,008 μg/μl Reaktionsvolumen.
  • In einem typischen Experiment werden ungefähr 300 ng DNS zu jedem Zeitpunkt der BAL31-Behandlung isoliert. 12 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von solch einem Experiment mit unbehandelter Einzelstrang-DNS in Spur 4 und mit für 10 Minuten behandelter Einzelstrang-DNS in Spur 3, mit für 30 Minuten behandelter Einzelstrang-DNS in Spur 2 und mit für 50 Minuten behandelter Einzelstrang-DNS in Spur 1. Spur 5 ist der Molekulargewichts-(MW-)Standard.
  • Die 13 bis 15 zeigen die entsprechenden Gelchromatogramme der jeweiligen Spuren. 13 ist das unbehandelte Material, und die mehreren Peaks beziehen sich auf unterschiedliche Konformationen der Einzelstrang-DNS. 14 entspricht Spur 3 und dem für 10 Minuten behandelten Material. Das Material wurde wärmebehandelt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, und somit wurden die unterschiedlichen Konformationen aufgelöst, und nur ein Peak einer ausgeprägten Größe ist gezeigt. 15 entspricht Spur 2 und dem für 30 Minuten behandelten Material.
  • Hier ist es klar, dass der Peak, der größeren Fragmenten entspricht, abnimmt, und ein Peak von kleineren DNS-Fragmenten aufscheint.
  • Exonuklease VII
  • Einzelstrang-DNS wurde mit Exonuklease VII unter Verwendung einer Enzymkonzentration von 7,7 U/ml Reaktionsvolumen und einer Einzelstrang-DNS-Konzentration von 0,008 μg/μl Reaktionsvolumen aufgeschlossen. Der Reaktionspuffer wies 67 mM Kaliumphosphat (pH 7,9), 10 mM Mercaptoethanol, 6,7 mM MgCl2 und 8,3 mM EDTA auf.
  • Der Reaktion wurde es erlaubt, bei 37°C für 10, 20 und 30 Minuten vorzuschreiten, bevor sie durch Wärmedeaktivierung (95°C für 5 Minuten) gestoppt wurde.
  • In 16 ist das Fragmentierungsmuster unter Verwendung von Exonuklease VII gezeigt. Spur 1 ist MW-Standard, Spur 2 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS, Spur 3 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease VII für 10 Minuten, Spur 4 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease VII für 20 Minuten, und Spur 5 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease VII für 30 Minuten. Dies zeigt, dass die Fragmentgrößen mit der Zeit abnehmen.
  • Exonuklease Rec Jf
  • Einzelstrang-DNS wurde mit Exonuklease Rec Jf unter Verwendung einer Enzymkonzentration von entweder 2,5 U/ml Reaktionsvolumen oder 10 U/ml Reaktionsvolumen und Einzelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,007 μg/μl Reaktionsvolumen, entsprechend 0,36 U Enzym/μg DNS bzw. 1,4 U Enzym/μg DNS, aufgeschlossen. Der Reaktionspuffer wies 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreitol bei pH 7,9 auf.
  • Der Reaktion wurde es erlaubt, bei 37°C für 10, 20 und 30 Minuten fortzuschreiten, bevor sie durch Wärmedeaktivierung (95°C für 5 Minuten) gestoppt wurde.
  • In 17 ist das Fragmentierungsmuster unter Verwendung von Exonuklease Rec Jf bei 0,36 U/Mikrogramm Einzelstrang-DNS gezeigt. Spur 1 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS, Spur 2 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease Rec Jf für 10 Minuten, Spur 3 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease Rec Jf für 20 Minuten, und Spur 4 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease Rec Jf für 30 Minuten. Dies zeigt, dass die Fragmentgrößen mit der Zeit abnehmen. In 18 ist die Enzymkonzentration 4-fach erhöht (1,5 U/Mikrogramm Einzelstrang-DNS), und das Fragmentierungsmuster ist von 0 bis 30 Minuten gezeigt, was verglichen mit 17 ein höheres Maß an Fragmentierung zeigt. Dies zeigt, dass sowohl Zeit als auch Enzymkonzentration verwendet werden können, um die Fragmentierung zu steuern.
  • (B) Endonukleasen
  • Konventionelle DNS-Mischverfahren verwenden typischerweise DNase I für die Fragmentierung (siehe zum Beispiel Stemmer, 1994, Nature 370: 389–391). DNase I spaltet DNS in einer endonukleolytischen Weise an Plätzen benachbart zu Pyrimidinen. Konsequenterweise können nicht alle möglichen Fragmentgrößen erhalten werden.
  • Darüber hinaus wird unter Verwendung von Magnesium in dem Reaktionspuffer eine homologe Mischung von Mono- und Oligomeren erhalten. So müssen unterschiedliche Verfahren, wie beispielsweise Gelagaroseelektrophoreseaufreinigung oder Gelfiltration verwendet werden, um Fragmente von unterschiedlichen Größen zu isolieren. Oft sind Fragmente von kleinerer Größe oder eine Mischung von kleinen und größeren Fragmenten erwünscht, um die Rekombination zu optimieren. Diese Reinigungsverfahren führen jedoch einzelstrangige Ausbrüche in die doppelstrangigen PKR-Produkte ein. Fragmente einer bestimmten Größe gereinigt auf einem Gel würden somit aus Doppelstrang-DNS mit einer großen Anzahl von einzelstrangigen Ausbrüchen bestehen, was bei der Denaturierung zu vielen kleineren Fragmenten führen würde. Dies bedeutet, dass viele der Einzelstrangfragmente, die bei der Denaturierung erzeugt werden, zu kurz wären, um während der Hybridisierung als Primer zu funktionieren, was in einen großen Produktverlust resultiert.
  • Die Verwendung von Mangan in dem Reaktionspuffer erzeugt Fragmente von Größen kleiner als 50 bp, und keine Gelreinigung wird benötigt. Jedoch ist man hier auf die Verwendung nur kleiner Fragmente beschränkt, und diese können nicht mit größeren Fragmenten gemischt werden, etwas, was die Rekombinationsfrequenz möglicherweise erhöhen würde.
  • Die mit der Verwendung von Endonukleasen verbundenen Probleme werden in den folgenden Experimenten demonstriert:
  • DNase I
  • DNS wurde für 5 Minuten mit DNase I bei einer Konzentration von 0,15 U/μg DNS aufgeschlossen.
  • Magnesium- und Mangan-Puffer wurden beim Fragmentieren mit DNase I verglichen, und die Resultate sind in 19 gezeigt. Spur 1 ist MW-Standard, Spur 2 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mg-Puffer, Spur 3 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit DNase I in Mg-Puffer gemäß Stemmer (1994) Nature 370: 389–391, Spur 4 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mn-Puffer und Spur 5 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit DNase I in Mn-Puffer gemäß Kikuchi et al. (2000) Gene 243: 133–137. Aus 19 ist klar, dass dann, wenn Mg-Puffer und Bedingungen gemäß den Papern von Stemmer und Kikuchi verwendet werden, keine Fragmentierung auftritt. Darüber hinaus wird dann, wenn Mn-Puffer und Bedingungen gemäß den Papern von Stemmer und Kikuchi verwendet werden, alles Material vollständig binnen nur weniger Minuten fragmentiert.
  • In einem Versuch, Fragmente von unterschiedlichen Größen zu erhalten, entschieden wir, Mg-Puffer zu verwenden und die Enzymkonzentration zu erhöhen. 20 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild von solch einem Experiment unter Verwendung von DNase I. Spur 1 ist MW-Standard. Spur 6 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS. Spur 12 ist Einzelstrang-DNS behandelt gemäß den Papern von Stemmer und Kikuchi unter Verwendung von 0,15 U Enzym/Mikrogramm DNS, und Spur 13 ist dasselbe Material behandelt mit 1 U Enzym/Mikrogramm DNS (d. h. sechsmal mehr Enzym).
  • Die 21 bis 23 zeigen die entsprechenden Chromatogramme. Die unbehandelte Einzelstrang-DNS ist wärmebehandelt worden, deshalb erscheint nur ein Peak in 21 (mit einem Pfeil bezeichnet). In 22 ist deutlich, dass bei Verwendung der Menge an DNase I gemäß den Papern von Stemmer und Kikuchi der Peak für unbehandelte Einzelstrang-DNS etwas reduziert ist (bezeichnet durch den Pfeil), aber kein ausgeprägter Peak für die fragmentierte DNS sichtbar ist, nur ein Rauschen. Unter Verwendung von sechsmal mehr Enzym ist die unbehandelte Einzelstrang-DNS vollständig abgebaut (23), noch gibt es hier irgendeinen sichtbaren Peak der Fragmente.
  • Mungobohnennuklease
  • Einzelstrang-DNS wurde mit Mungobohnennuklease (Produkt Nr. MO250S, New England Biolabs) unter Verwendung einer Enzymkonzentration von 0,375 U/ml Reaktionsvolumen und Einzelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,007 μg/μl Reaktionsvolumen aufgeschlossen. Der Reaktionspuffer wies 50 mM Natriumacetat, 30 mM NaCl, 1 mM ZnSO4, bei pH 5,0 auf.
  • Der Reaktion wurde es erlaubt, für 10 Minuten bei 25°C fortzuschreiten, bevor sie durch Wärmedeaktivierung (95°C für 5 Minuten) gestoppt wurde.
  • 24 zeigt Fragmentierung unter Verwendung einer anderen Endonuklease, Mungobohnennuklease. Spur 1 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS, Spur 2 ist dasselbe Material behandelt für 10 Minuten. Spur 3 ist der MW-Standard.
  • Die Resultate weisen darauf hin, dass die gesamte DNS vollständig nach nur 10 Minuten Aufschluss mit Mungobohnennuklease fragmentiert war (siehe Spur 2), trotz Verwendung des Enzyms in einer niedrigeren Konzentration als durch der Hersteller empfohlen.
  • Schlussfolgerungen und Kommentare
  • Die obigen Beispiele zeigen, wie die Fragmentgrößen unter Verwendung von Exonukleasen und Änderung der Reaktionsbedingungen, d. h. Zeit, Reaktionsvolumen, Enzymkonzentration, gesteuert werden können. Die unterschiedlichen Peaks werden durch Gelbildchromatogramme visualisiert.
  • Im Gegensatz dazu ergibt die Verwendung von Endonukleasen, wie beispielsweise DNase I, eine schwer zu steuernde Reaktion. Die Verwendung von Bedingungen, die in der Literatur angegeben sind, unter Verwendung von entweder Mg- oder Mn-enthaltenden Puffern ergibt typischerweise eine Situation, in der entweder alles oder nichts fragmentiert wird, siehe insbesondere 20. Ein Experiment, das eine andere Endonuklease verwendet (Mungobohnennuklease), bestätigt diese Beobachtungen.
  • Beispiel 5 – Aufschluss von Unterpopulationen von Einzelstrang-DNS-Ausgangsmaterial mit unterschiedlichen Exonuleasen
  • In weiteren Experimenten wurde das Einzelstrang-DNS-Ausgangsmaterial in zwei Populationen aufgespalten, die dann unter Verwendung unterschiedlicher Exonukleasen aufgeschlossen wurden.
  • Materialen und Verfahren
  • Plasmide
  • Eine Tetrazyklin-zerstörte Variante des Plasmids pBR322 wurde durch Spaltung mit SalI und BamHI (Roche, Basel, Schweiz) Klenow-Behandlung (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Schweden) und Ligatierung am stumpfen Ende (New England Biolabs, MA, USA) konstruiert. Das resultierende Plasmid wurde auf Tetrazyklin-Empfindlichkeit überprüft und wird pBR322dtet bezeichnet.
  • PBR322stop1 und pBR322stop3 wurden durch PKR-Vervielfältigung des Tetrazyklin-Gens von pBR322 unter Verwendung bestimmter Primer (Tabelle 1) erzeugt. Jedes mutierte Tetrazyklin-Gen wurde in pBR322 kloniert.
  • Tabelle 1
  • Primersequenzen
  • pBR322 NheI vorwärts Stop:
    Figure 00430001
  • pBR322 EagI rückwärts:
    Figure 00430002
  • pBR322 HindIII vorwärts:
    Figure 00430003
  • pBR322 SalI rückwärts Stop:
    Figure 00430004
  • PKR
  • Soweit nichts anderes angegeben ist, enthielten die PKR-Reaktionen 4 μM jedes Primers, 160 μM dNTP (Roche, Basel, Schweiz), 1 × AmpliTaq-Reaktionspuffer, 2,5 U thermostabile AmpliTaq-DNS-Polymerase (Applied Biosystemsm CA, USA).
  • FIND-PKR 1: 5 oder 25 Zyklen von 94°C 30 Sekunden, 50°C 45 Sekunden, 72°C 1 Minute und dann 72°C für 7 Minuten, es waren keine externen Primer enthalten.
  • FIND-PKR 2: 15, 25 oder 50 Zyklen von 94°C 30 Sekunden, 55°C 45 Sekunden, 72°C 1 Minute und dann 72°C für 7 Minuten mit eingeschlossenen externen Primern.
  • Einzelstrang-DNS-Präparation
  • Das Gen von Interesse, d. h. tet-r, wurde unter Verwendung von bestimmten Primern vervielfacht, einer der Primer war biotinyliert. Einzelstrang-DNS von den Sense- und Antisense-Strängen wurde unter Verwendung von Streptavidin-Magnetperlen (entweder gekauft von Dynal AS, Oslo, Norwegen oder Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) gemäß den Herstellerempfehlungen gereinigt. Die dadurch erhaltene Einzelstrang-DNS wurde weiter entweder durch Ethanolpräzipitation oder unter Verwendung von Recochip (TaKaRa, Shiga, Japan) gemäß den Herstellerempfehlungen gereinigt.
  • FIND-Experimente
  • Die FIND-Experimente wurden durch Aufschließen von DNS mit einer Exonuklease begonnen. Die DNS war einzelstrangig (präpariert wie oben) und stammte von dem Tetrazyklin-resistenten Gen (pBR322stop1 oder pBR322stop3, 945 bp). Die Exonukleasen waren BAL31 (0,08–1 U/μg DNS, New England Biolabs, MA, USA), Exonuklease I (100 U/μg DNS, New England Biolabs, MA, USA), T7 Gen 6-Exunuklease (320 U/μg DNS, USB, Cleveland Ohio, USA) und Exonuklease V (12,5 U/μg DNS, USB, Cleveland Ohio, USA). Die Zeit für den Aufschluss lag in dem Bereich von 2–90 Minuten. Die Aufschlussreaktionen wurden durch Zugeben von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM und/oder Wärmedeaktivierung bei 65 oder 95°C für 10 Minuten gestoppt. Wenn EDTA verwendet wurde, um die DNS-Fragmentierung zu stoppen, wurde die DNS weiter durch Phenol-/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die Fragmente wurden in einer FIND-PKR1-Reaktion für 5 oder 25 Zyklen rekombiniert, und das Material wurde dann in einer FIND-PKR2-Reaktion für 15, 25 oder 50 Zyklen vervielfacht. Letztlich wurden die Gene voller Länge durch die Verwendung von HindIII und EagI (New England Biolabs, MA, USA) zur Funktionsauswertung in pBR322dtet oder zum Sequenzieren in pGEM (Promega, Madison, WI, USA) kloniert.
  • Auswertung der Funktionalität des Tetrazyklinklons
  • Die Klone, die in pBR322dtet eingeführt wurden, wurden in chemisch kompetente TG1-E. coli transformiert und auf LB-Agarplatten, die 1 μg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Ein- oder zweihundert Klone wurden dann auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml Tetrazyklin enthielten, überführt, und die Frequenz der Tetrazyklin-resistenten Klone konnte berechnet werden.
  • Resultate
  • Wie oben gezeigt ist, konnten höhere Rekombinationsfrequenzen unter Verwendung der FIND-Prozedur der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Einzelstrang-DNS bei der Fragmentierung erreicht werden. Die Exonuklease BAL31 ist vornehmlich eine 3'-Exonuklease, die Mononukleotide von beiden der 3'-Termini der beiden Stränge einer linearen Doppelstrang-DNS entfernt. Jedoch kann BAL31 auch die einzelstrangigen DNS-Enden abbauen, die durch die 3'-Exonukleaseaktivität an der Doppelstrang-DNS erzeugt werden. Die Aktivität von BAL31 auf Einzelstrang-DNS ist die Entfernung von Mononukleotiden nur von den 5'-Termini. Die Verwendung von BAL31 für die Fragmentierung von Einzelstrang-DNS und das dann wieder Zusammensetzen zu Genen voller Länge resultiert theoretischerweise in eine Überkreuzung pro Gen. Experimente wurden deshalb durchgeführt, um unterschiedliche Exonukleasen für die Fragmentierung von Einzelstrang-DNS zu testen. Exonuklease I weist nur 3'-Aktivität auf, während BAL31-, T7 Gen 6- und RecJ-Exonukleasen nur 5'-Aktivität aufweisen. Exonuklease V und Exonuklease VII haben Aktivität von beiden Enden (5' und 3'). Um zu zeigen, dass diese Exonukleasen in dem Fragmentierungsschritt in einem FIND-Experiment verwendet werden können und funktionale rekombinierte Gene ergeben, wurde ein Modellsystem basierend auf Tetrazyklinresistenzgenen verwendet.
  • Es wurde herausgefunden, dass BAL31 (25a) sowie Exonuclease I (25b) und T7 Gen 6-Exonuklease (25c) alle gut bei der FIND-Prozedur arbeiteten, und eine Abhängigkeit der Rekombinationsfrequenz von der Fragmentierungsdauer wurde beobachtet.
  • Wenn nur eine Exonuklease, die Einzelstrang-DNS nur von einem Ende aufschließt, verwendet wird, kann in der Theorie nur eine Überkreuzung erreicht werden. Es wurde jedoch herausgefunden, dass weitere Überkreuzungen erhalten werden können, wenn die DNS-Fragmente von der Behandlung durch unterschiedliche Exonukleasen kombiniert wurden. Exonuklease V- und Exonuklease VII-Behandlung resultieren in kleinere Fragmente ohne die 5'- und 3'-Enden. Diese Enden sind notwendig, um das rekombinierte Material in der letzten PKR-Reaktion zu vervielfachen. Diese DNS-Fragmente können deshalb mit der DNS kombiniert werden, die von den 5'- oder 3'-Enden aufgeschlossen wurde. Das Resultat solch einer Kombination kann in 25d gesehen werden, wo Einzelstrang-DNS behandelt mit Exonuklease I für 10 Minuten mit Einzelstrang-DNS behandelt mit Exonuklease V für 40 und 50 Minuten kombiniert wurde. Funktionale Klone von bis zu 40% wurden erhalten, ein Resultat, das mit dem Maximum von 25% verglichen werden sollte, das bei demselben System unter Verwendung nur eines Enzyms erreicht wird (25a–c). Es sind auch Fragmente von der Exonuklease I- und Exonuklease VII-Behandlung kombiniert worden, und Fragmente von der T7 Gen 6-Exonuklease- und Exonuklease VII-Behandlung, zu unterschiedlichen Zeitpunkten, und funktionale rekombinierte Klone konnten erhalten werden (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 6 – Aufschluss von Unterpopulationen von Einzelstrang-DNS-Ausgangsmaterial mit unterschiedlichen Exonukleasen (weitere Experimente)
  • In einem separaten Satz von Experimenten wurden Mehrfachüberkreuzungen durch Kombinieren von Fragmenten, die durch Aufschließen von Einzelstrang-DNS mit Exonuklease I erhalten wurden, mit Fragment, das durch Aufschließen von Einzelstrang-DNS mit Exonuklease V und/oder Exonuklease VII erhalten wurde, produziert.
  • Exonuklease I (Exo I) hat nur 3'-Aktivität, während Exonuklease V (Exo V) und Exonuklease VII (Exo VII) Aktivität von beiden Enden (5' und 3') aufweisen. Somit wird Exo V- und Exo VII-Behandlung in kleinere Fragmente ohne 5'- und 3'-Enden resultieren. Diese Enden sind notwendig, um das rekombinierte Material in der letzten PKR-Reaktion zu vervielfachen. Diese DNS-Fragmente können deshalb mit DNS kombiniert werden, die nur vom 5'- oder 3'-Ende aufgeschlossen wurde.
  • Eine equimolare Mischung der drei scFv-Gene wurde bei der Fragmentierung mit ExoI, ExoV und ExoVII verwendet. Unterschiedliche Kombinationen von fragmentiertem Material wurden gemischt und durch PKR in Gene voller Länger wieder zusammengebaut und letztlich sequenziert (26a–d). ExoI verhielt sich ähnlich wie BAL31 mit bis zu 40% Klonen mit einer Rekombination (26a). Die Kombination von ExoI mit ExoV oder ExoVII erhöhte die Anzahl von Überkreuzungen auf bis zu fünf Rekombinationen (26a bzw. c). ExoVII scheint effizienter als ExoV zu sein, die ExoI/ExoVII-Kombination erzeugte Rekombinationen in über 75% der Klone. Letztlich wurde eine Kombination von fragmentierter DNS von allen drei Enzymen gemischt, die Rekombinationen (1 bis 4) in nahezu allen Klonen erzeugte, nur 7% von ihnen waren Wildtypgene. Weiterhin waren längere Fragmentierungszeiten am effizientesten (26d). In diesem speziellen Fall bestehen die scFv-Gene aus großen Bereichen vollständiger Homologie (Grundgerüstregionen), was bedeutet, dass die Anzahl von identifizierten Rekombinationen (bis zu 4) diejenigen waren, die identifiziert werden konnten, d. h. die tatsächliche Anzahl an Rekombinationen mag viel höher sein.
  • Beispiel 7 – Vergleich der Effekte des Aufschlusses von Einzelstrang-DNS mit einer Exonuklease mit den Effekten des Aufschlusses von Doppelstrang-DNS mit einer Endonuklease
  • Die Experimente in 27 wurden durchgeführt durch Rekombinieren von Genen, die drei unterschiedliche scFv kodieren, unter Verwendung von entweder Einzelstrang-DNS und Exonukleasebehandlung oder Doppelstrang-DNS und Endonukleasebehandlung.
  • Endonukleaseaufschluss von Doppelstrang-DNS wurde durchgeführt unter Verwendung von DNase I, wie in Stemmer et al., 1994, Nature 370: 389–391. Exonukleaseaufschluss von Einzelstrang-DNS wurde durchgeführt unter Verwendung von Exo I, ExoV und ExoVII, wobei equimolare Mischungen von Fragmenten von ExoI (10 Minuten Reaktionszeit), ExoV (30 Minuten Reaktionszeit) und ExoVII (30 Minuten Reaktionszeit) in Rekombinationsreaktionen verwendet wurden.
  • Die Anzahl von Rekombinationen wurde unter Anwendung von Sequenzieren ausgewertet. Das Resultat zeigt, dass der Einzelstrang-DNS/Exonukleaseaufschluss weniger Wildtypklone und mehr Rekombinationen ergibt.

Claims (28)

  1. Verfahren zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder einer Population von Sequenzen aus einer Einzelstrangausgangspolynukleotidsequenz, die ein oder mehrere Proteinmotive codiert, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: a) Bereitstellen einer ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen und einer zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen, wobei die erste und die zweite Population zusammen Plus- und Minusstränge von Ausgangspolynukleotidsequenzen ausbilden; b) Durchführen einer Reaktion zum Aufschließen der ersten und der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen mit einer Exonuklease zum Erzeugen entsprechender Populationen von Einzelstrangpolynukleotidfragmenten; c) Kontaktieren der Polynukleotidfragmente, die von den Plussträngen erzeugt wurden, mit Fragmenten, die von den Minussträngen erzeugt wurden; d) Verstärken der Fragmente, die aneinander hybridisieren, um mindestens eine Polynukleotidsequenz zu erzeugen, die ein oder mehrere Proteinmotive mit verglichen mit dem einen oder mehreren Proteinmotiven, die durch die Ausgangspolynukleotide codiert werden, geänderten Eigenschaften codiert, wobei in Schritt (b) mindestens ein Parameter der Reaktion, die zum Aufschluss der ersten Population an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, anders als die äquivalenten Parameter ist, wie sie bei der Reaktion zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Reaktionsparameter ausgewählt ist aus Exonukleasetyp, Exonukleasekonzentration, Reaktionsvolumen, Dauer der Aufschlussreaktion, Temperatur der Reaktionsmischung, pH-Wert der Reaktionsmischung, Länge der Einzelstrangausgangspolynukleotidsequenzen, Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen und Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei sich die Exonuklease, die zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Exonuklease unterscheidet, die zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Exonuklease, die zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, eine 3'-Exonuklease ist, und die Exonuklease, die zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, eine 5'-Exonuklease ist.
  5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Exonukleasekonzentration, die zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Exonukleasekonzentration unterscheidet, die zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich das Reaktionsvolumen, das zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von dem Reaktionsvolumen unterscheidet, das zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Dauer der Aufschlussreaktion, die zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Dauer der Aufschlussreaktion unterscheidet, die zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Temperatur der Reaktionsmischung, die zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Temperatur der Reaktionsmischung unterscheidet, die zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich der pH-Wert der Reaktionsmischung, der zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von dem pH-Wert der Reaktionsmischung unterscheidet, der zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Länge der Polynukleotide in der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen von der Länge der Polynukleotide in der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen unterscheidet.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung, die zum Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung unterscheidet, die zum Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen in der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen von der Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen in der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen unterscheidet.
  13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen die Plusstränge der Ausgangspolynukleotidsequenzen ausbildet und die zweite Population der Einzelstrangpolynukleotide die Minusstränge der Ausgangspolynukleotidsequenzen ausbildet.
  14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Polynukleotidmoleküle von Schritt a) DNS-Moleküle sind.
  15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt c) weiterhin das Zugeben von Pimersequenzen aufweist, die unter Hybridisierungsbedingungen an das 3'- und/oder 5'-Ende mindestens eines der Ausgangspolynukleotide hybridisieren.
  16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Exonuklease, die verwendet wird, um die erste und/oder zweite Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen aufzuschließen, aus der Gruppe ausgewählt wird, welche besteht aus BAL 31, Exonuklease I, Exonuklease V, Exonuklease VII und Exonuklease Rec Jf.
  17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Ausgangspolynukleotidsequenz oder Ausgangspolynukleotidsequenzen einer Mutationserzeugung unterworfen wurde/wurden.
  18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine oder beide der Populationen oder der Fragmente, die in Schritt b) erzeugt werden, Mutationserzeugung unterworfen werden.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Mutationserzeugung fehlerbehaftete PKR ist.
  20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt b) ausgeführt wird, um Populationen von Einzelstrangfragmenten von unterschiedlichen Längen zu erzeugen.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei Schritt b) gesteuert wird, um eine Population von Einzelstrangfragmenten zu erzeugen, die eine mittlere Länge von ungefähr 50 Nukleotiden aufweist.
  22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das weiterhin den Schritt des in vitro Exprimierens mindestens einer Polynukleotidsequenz, die in Schritt d) erzeugt wurde, aufweist, um das codierte Polypeptid zu produzieren.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, das weiterhin den Schritt des Testens des codierten Polypeptids auf gewünschte Eigenschaften aufweist.
  24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausgangspolynukleotidsequenz einen Antikörper oder ein Fragment davon codiert.
  25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausgangspolynukleotidsequenz ein Enzym codiert.
  26. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausgangspolynukleotidsequenz ein Antigen codiert.
  27. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: (a) Erzeugen von Formvarianten eines Ausgangspolynukleotids unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 26; (b) Exprimieren der Polynukleotidvariante, das in Schritt (a) erzeugt wurde, um Polypeptidvarianten zu produzieren; (c) Screeenen der Polypeptidvarianten nach gewünschten Eigenschaften; und (d) Selektieren eines Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften aus den Polypeptidvarianten.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, das nach der Identifikation eines Polynukleotids und/oder codierten Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften das Zugeben des Polynukleotids und/oder codierten Polypeptids zu einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
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