DE60316150T2

DE60316150T2 - Metallbeschichtetes nanokristallines silizium als ein aktives oberflächenerweitertes substrat für die raman-spektroskopie (sers)

Info

Publication number: DE60316150T2
Application number: DE60316150T
Authority: DE
Inventors: Selena San Jose CHAN; Andrew San Jose Berlin; Yamakawa Campbell MINEO
Original assignee: Intel Corp
Current assignee: Intel Corp
Priority date: 2002-06-12
Filing date: 2003-05-16
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2023-05-17
Also published as: JP4347801B2; EP1511980A1; US6970239B2; WO2003106943A1; CN1659425B; CN1659425A; HK1071427A1; TW200407536A; US20030231304A1; KR100990580B1; TWI290621B; AU2003232139A1; MY134271A; ATE372505T1; DE60316150D1; KR20050013571A; EP1511980B1; JP2005524857A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Verfahren und die Vorrichtung 300 betreffen die Gebiete des molekularen Nachweises und/oder der molekularen Charakterisierung durch Raman-Spektroskopie. Noch genauer betreffen die Verfahren und die Vorrichtung 300 metallbeschichtetes, poröses Silicium als ein Substrat 240, 340 für die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS), oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERRS), Hyper-Raman- und/oder kohärente Anti-Strokes-Raman-Spektroskopie (CARS).
HINTERGRUND
Der sensitive und exakte Nachweis und/oder die Identifizierung von einzelnen Molekülen aus biologischen und anderen Proben hat sich als schwer fassbares Ziel erwiesen, mit ausgedehnten Anwendungsmöglichkeiten in der medizinischen Diagnostik, Pathologie, Toxikologie, Probenahmen aus der Umwelt, chemischen Analyse, Forensik und einer Vielzahl anderer Gebiete. Es wurden Versuche unternommen, die Raman-Spektroskopie und/oder Oberflächenplasmaresonanz zu verwenden, um dieses Ziel zu erreichen. Wenn Licht durch ein konkretes Medium tritt, wird eine bestimmte Menge von seiner ursprünglichen Richtung abgelenkt, ein Phänomen, das als Raman-Streuung bekannt ist. Ein Teil des gestreuten Lichts unterscheidet sich auch in der Frequenz von dem ursprünglichen anregenden Licht, aufgrund der Absorption des Lichts und der Anregung der Elektronen auf ein höheres Energieniveau, gefolgt von einer Lichtemission bei einer anderen Wellenlänge. Die Wellenlängen eines Raman-Emissionsspektrums sind charakteristisch für die chemische Zusammensetzung und Struktur der lichtabsorbierenden Moleküle in einer Probe, während die Intensität der Lichtstreuung von der Konzentration der Moleküle in der Probe abhängig ist.
Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Raman-Interaktion zwischen einem angeregten Lichtstrahl und einem individuellen Molekül in einer Probe vorkommt, ist sehr gering und hat eine geringe Empfindlichkeit und beschränkte Anwendbarkeit der Raman-Analyse zur Folge. Es ist beobachtet worden, dass Moleküle nahe angerauten Silberoberflächen eine verstärkte Raman-Streuung von bis zu sechs bis sieben Zehnerpotenzen zeigen. Dieser oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie(SERS)-Effekt ist verwandt mit dem Phänomen der Plasmaresonanz, wobei Metallnanopartikel in Antwort auf einfallende elektromagnetische Strahlung eine ausgeprägte optische Resonanz zeigen, aufgrund der kollektiven Verknüpfung der Leitungselektronen im Metall. Im Wesentlichen können Nanopartikel aus Gold, Silber, Kupfer und bestimmten anderen Metallen als Miniatur-„Antennen” dienen, um die örtlich begrenzten Wirkungen der elektromagnetischen Strahlung zu verstärken. Moleküle, die in der Nähe von solchen Teilchen liegen, zeigen eine viel größere Empfindlichkeit gegenüber der Raman-Spektroskopieanalyse.
Es sind Versuche unternommen worden, SERS für den molekularen Nachweis und die molekulare Analyse auszunutzen, üblicherweise durch das Beschichten von Metallnanopartikeln oder die Herstellung rauer Metallfilme auf der Oberfläche eines Substrates und dann Auftragen einer Probe auf die metallbeschichtete Oberfläche. Allerdings ist die Anzahl von Metallpartikeln, die auf einer planaren Oberfläche angebracht werden können, beschränkt und führt zu einem relativ geringen Verstärkungsfaktor für SERS und verwandte Raman-Verfahren unter Verwendung solcher Oberflächen. Es besteht Bedarf für Verfahren zur Herstellung von SERS-aktiven Substraten mit höherer Dichte der Metallpartikel und Vorrichtungen, die solche Substrate umfassen.
EP 0 984 269 A1 beschriebt ein Trägersubstrat für die Analyse von Substanzen anhand von oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie. Das Trägersubstrat enthält eine Vielzahl von Nanokörperchen. Das Nanokörperchen-enthaltende Trägersubstrat wird erhalten, indem ein Gießkörper verwendet wird, der mit dem Material gefüllt ist, das das Trägersubstrat und die Nanokörperchen bildet. Das US-Patent 5,567,628 beschreibt den Nachweis eines Analyten unter Verwendung der Raman-Spektroskopie, wobei ein Einfangreagens, das in der Lage ist, den Analyten zu binden, für den Nachweis eingesetzt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die folgenden Abbildungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und werden miteinbezogen, um weiter bestimmte Aspekte der offenbarten Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen können unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Abbildungen in Verbindung mit der genauen Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen hierin besser verstanden werden.
1 veranschaulicht eine beispielhafte Vorrichtung 100 (nicht maßstabsgetreu) und ein Verfahren zur Herstellung eines porösen Siliciumsubstrats 110.
2 veranschaulicht ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung eines metallbeschichteten, porösen Siliciumssubstrats 240, 340.
3 veranschaulicht eine beispielhafte Vorrichtung 300 und ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung eines Analyten unter Verwendung eines metallbeschichteten SERS-aktiven Substrats 240, 340.
BESCHREIBUNG VON VERANSCHAULICHENDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Verfahren wie sie in den Ansprüchen definiert sind, sind zur Verwendung für den Nachweis und/oder die Identifizierung von Analyten mittels oberflächenverstärktem Raman-Spektroskopie(SERS)-, oberflächenverstärktem Resonanz-Raman-Spektroskopie(SERRS)- und/oder kohärentem Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie(CARS)-Nachweis. Im Vergleich mit bestehenden Verfahren liefern die beschriebenen Verfahren und die Vorrichtung 300 SERS-aktive Substrate 240, 340 mit erhöhter Metallpartikeidichte und größerer Feldtiefe der SERS-Verstärkung, was einen effizienteren Raman-Nachweis und/oder eine effizientere Raman-Identifizierung von Analyten erlaubt.
Frühere Verfahren für den SERS-Nachweis verschiedener Analyten haben kolloidale Metallpartikel verwendet wie aggregierte Silbernanopartikel, mit denen üblicherweise ein Substrat und/oder ein Träger beschichtet wurde (z.B. U.S.-Patent-Nrn. 5,306,403 ; 6,149,868 ; 6,174,677 ; 6,376,177 ). Während solche Anordnungen fallweise den SERS-Nachweis mit einer bis zu 10⁶ bis 10⁸ höheren Empfindlichkeit erlauben, sind sie nicht in der Lage wie hierin beschrieben, einzelne Moleküle kleiner Analyten wie Nucleotide nachzuweisen. Eine erhöhte Empfindlichkeit des Raman-Nachweises ist offensichtlich nicht einheitlich innerhalb eines kolloidalen Partikelaggregats, sondern hängt von dem Vorkommen von „Hot Spots" ab. Die physikalische Struktur solcher Hot Spots, der Bereich der Abstände von den Nanopartikeln bei denen eine verstärkte Empfindlichkeit vorkommt, und die räumliche Beziehung zwischen Nanopartikelaggregat und Analyten, die eine verstärkte Empfindlichkeit erlauben, sind nicht charakterisiert worden. Des weitern sind aggregierte Nanopartikel von Natur aus in Lösung unstabil, mit negativen Wirkungen auf die Reproduzierbarkeit des Einzelmolekül-Analytnachweises. Die erfindungsgemäßen Verfahren und die Vorrichtung 300, die hierin beschrieben werden, liefern eine stabile Mikroumgebung für den SERS-Nachweis, in dem die physikalische Konformation und Dichte des Raman-aktiven Metallsubstrates genau kontrolliert werden kann, und erlaubt den reproduzierbaren, sensitiven und exakten Nachweis von Analyten in Lösungen.
Die folgende genaue Beschreibung enthält zahlreiche bestimmte Details, um ein tieferes Verständnis der beschriebenen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen zu liefern. In anderen Fällen sind Vorrichtungen, Verfahren, Techniken und Einzelteile, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hierin nicht weiter beschrieben.
DEFINITIONEN
Wie hierin verwendet, bedeutet „ein", „eine" oder „eines" ein oder mehr als eines von einer Sache.
Wie hierin verwendet, bedeutet „etwa" innerhalb zehn Prozent eines Wertes. Zum Beispiel würde „etwa 100" einen Wert zwischen 90 und 110 bedeuten.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Analyt" irgendein Atom, eine Chemikalie, ein Molekül, eine Verbindung, eine Zusammensetzung oder ein Aggregat von Interesse für den Nachweis und/oder die Identifizierung. Nicht beschränkte Beispiele für Analyten umfassen ein/e Aminosäure, Peptid, Polypeptid, Protein, Glycoprotein, Lipoprotein, Nucleosid, Nucleotid, Oligonucleotid, Nucleinsäure, Zucker, Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Polysaccharid, Fettsäure, Lipid, Hormon, Metabolit, Cytokin, Chemokin, Rezeptor, Neurotransmitter, Antigen, Allergen, Antikörper, Substrat, Metabolit, Cofaktor, Inhibitor, Arzneistoff, Pharmazeutikum, Nährstoff, Prion, Toxin, Gift, Explosivstoff, Pestizid, chemisches Kampfmittel, biologisch gefährliches Agens, Radioisotop, Vitamin, heterocyclische aromatische Verbindung, Carcinogen, Mutagen, Narkotikum, Amphetamin, Barbiturat, Halluzinogen, Abfallprodukt und/oder Verunreinigung. In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden einer oder mehrere der Analyten mit einem oder mehreren Raman-Markierungen wie nachstehend beschrieben, markiert.
Ein „Einfang"-Molekül wie hierin verwendet bedeutet irgendein Molekül, das an ein oder mehrere Zielanalyten binden kann. Nicht-einschränkende Beispiele von „Einfang"-Molekülen umfassen Antikörper, Antikörperfragmente, genetisch veränderte Antikörper, Einzelkettenantikörper, Rezeptorproteine, Bindeproteine, Enzyme, Inhibitorproteine, Lektine, Zelladhäsionsproteine, Oligonucleotide, Polynucleotide, Nucleinsäuren und Aptamere.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „nanokristallines Silicium" auf Silicium, das Siliciumkristalle im Nanometermaßstab enthält, üblicherweise in einem Größenbereich von 1 bis 100 Nanometer (nm). „Poröses Silicium" 110, 210 bezieht sich auf Silicium, das geätzt worden ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet „funktionell verbunden", dass eine funktionelle Interaktion zwischen zwei oder mehr Einheiten einer Vorrichtung 300 und/oder Systems besteht. Zum Beispiel kann ein Raman-Detektor 380 funktionell mit einem Computer 160, 395 verbunden sein, wenn der Computer 160, 395 Daten erhalten, prozessieren, speichern und/oder auf Raman-Signale, die durch den Detektor 380 nachgewiesen wurden, übertragen kann.
NANOKRISTALLINES, PORÖSES SILICIUM
Nanokristallines Silicium
Hierin wird eine Vorrichtung 300 beschrieben, die eine oder mehrere Schichten nanokristallines Silicium enthält. Verschiedene Verfahren zur Herstellung von nanokristallinem Silicium sind auf dem Fachgebiet bekannt (z.B. Petrova-Koch et al., „Rapid-thermal-oxidized porous silicon – the superior photoluminescent Si", Appl. Phys. Lett. 61: 943, 1992; Edelberg et al., „Visible luminescence from nanocrystalline silicon films produced by plasma enhanced chemical vapor deposition", Appl. Phys. Lett. 68: 1415–1417, 1996; Schoenfeld et al., „Formation of Si quantum dots in nanocrystalline silicon", Proc. 7th Int. Conf. On Modulated Semiconductor Structures, Madrid, S. 605–608, 1995; Zhao et al., „Nanocrystalline Si: amaterial constructed by Si quantum dots", 1^st Int Conf an Low Dimensional Structures and Devisces, Singapur, S. 467–471, 1995; Lutzen et al., Structural characteristics of ultrathin nanocrystalline silicon films formed by annealing amorphous silicon, J. Vac. Sci. technology B 16: 2802–05, 1998; U.S.-Patent-Nrn. 5,770,022 ; 5,994,164 ; 6,268,041 ; 6,294,442 ; 6,300,193 ). Die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und die Vorrichtung 300 sind im Hinblick auf das Herstellungsverfahren von geätztem nanokristallinem Silicium nicht eingeschränkt.
Nicht-beschränkende beispielhafte Verfahren zur Herstellung von nanokristallinem Silicium umfassen: Silicium (Si)-Implantation in ein siliciumreiches Oxid und Tempern; Festphasenkristallisation mit Metall als Katalysator für die Keimbildung; chemische Gasphasenabscheidung; PECVD (plasmagestützte chemische Gasphasenabscheidung, engl.: plasma enhanced chemical vapor deposition); Gasabdampfung; Gasphasenpyrolyse; Gasphasenphotopyrolyse, elektrochemisches Ätzen, Plasmazersetzung von Silanen und Polysilanen; Hochdruckflüssigphasen-Reduktions/Oxidationsreaktionen; schnelles Tempern von amorphen Siliciumschichten; Abscheidung einer amorphen Siliciumschicht unter Verwendung von LPCVD (chemischer Niederdruckgasphasenabscheidung, engl.: low pressure chemical vapor deposition) gefolgt von RTA (schnelles thermisches Glühen engl.: rapid thermal annea/)-Zyklen; Plasmalichtbogenabscheidung unter Verwendung einer Siliciumanode und Laserablation von Silicium ( U.S.-Patent-Nrn. 5,770,022 ; 5,994,164 ; 6,268,041 ; 6,294,442 ; 6,300,193 ). Abhängig vom Verfahren können Si-Kristalle mit einer Größe irgendwo zwischen 1 und 100 nm oder mehr erzeugt werden, als dünne Schicht auf einem Chip, als separate Schicht und/oder als aggregierte Kristalle. In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann eine dünne Schicht, die nanokristallines Silicium an eine Substratschicht 110, 210 gebunden enthält, verwendet werden.
Gemäß der Erfindung wird das Silicium geätzt und mit einem Ramansensitiven Metall beschichtet wie in 2 beispielhaft erläutert.
In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die Größe und/oder Form der Siliciumkristalle und/oder die Porengröße in porösem Silicium gewählt werden, um in vorherbestimmten Grenzen zu liegen, zum Beispiel um die Plasmon-Resonanzfrequenz von metallbeschichtetem porösem Silicium 240, 340 zu optimieren (siehe, z.B. U.S.-Patent-Nr. 6,344,272 ). Die Plasmon-Resonanzfrequenz kann auch durch die Kontrolle der Dicke der Metallschicht, mit der das poröse Silicium 240, 340 beschichtet ist, angepasst werden ( U.S.-Patent-Nr. 6,344,272 ). Verfahren zur Kontrolle der Größe von Siliciumkristallen im Nanobereich sind bekannt (z.B. U.S.-Patent-Nrn. 5,994,164 und 6,294,442 ).
Poröses Silicium
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung eines Raman-aktiven, metallbeschichteten, porösen Siliciumsubstrats 240, 340. In verschiedenen Ausführungsformen enthält das Substrat geätztes, nanokristallines, poröses Silicium 110, 210. Beschrieben sind auch Substrate, die Siliciumnitrid, Germanium und/oder andere in der Chip-Herstellung bekannte Materialien enthalten. Andere geringere Mengen an Material können auch vorkommen, wie Metallkeimbildungskatalysatoren und/oder Dotierungsmittel. Das erfindungsgemäße Erfordernis ist, dass das Substratmaterial ein poröses Siliciumsubstrat 110, 210 ist, das mit einem Ramansensitiven Metall beschichtet ist, wie in 2 beispielhaft erläutert. Poröses Silicium hat ein großes Oberflächenareal von bis zu 783 m²/cm³ und liefert eine sehr große Oberfläche für die oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopieverfahren.
Poröses Silicium 110, 210 wurde in den späten 1950ern durch Elektropolieren von Silicium in verdünnten Flusssäurelösungen entdeckt. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, wird poröses Silicium 110, 210 durch Ätzen eines Siliciumsubstrats 110, 210 mit verdünnter Flusssäure (HF) 150 in einer elektrochemischen Zelle 120 hergestellt. In bestimmten Fällen kann das Silicium zu Beginn in HF 150 bei geringen Stromdichten geätzt werden. Nachdem die anfänglichen Poren erzeugt wurden, kann das Silicium aus der elektrochemischen Zelle 120 entfernt werden und in sehr verdünnter HF 150 geätzt werden, um die in der elektrochemischen Zelle 120 erzeugten Poren auszuweiten. Die Zusammensetzung des Siliciumsubstrats 110, 120 wird auch die Porengröße beeinflussen, abhängig davon, ob das Silicium dotiert ist oder nicht, der Art des Dotierungsmittels und dem Grad der Dotierung. Die Auswirkung der Dotierung auf die Siliciumporengröße ist auf dem Fachgebiet bekannt. Für erfindungsgemäße Ausführungsformen, die den Nachweis und/oder die Identifizierung von großen Biomolekülen beinhalten, kann eine Porengröße von etwa 2 nm bis 100 oder 200 nm gewählt werden. Die Ausrichtung der Poren in porösem Silicium kann in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen ebenfalls gewählt werden. Zum Beispiel wird eine geätzte 1,0,0-Kristallstruktur Poren aufweisen, die senkrecht zu den Kristallen ausgerichtet sind, während 1,1,1- oder 1,1,0-Kristallstrukturen Poren aufweisen werden, die diagonal entlang der Kristallachse ausgerichtet sind. Die Wirkung der Kristallstruktur auf die Ausrichtung der Poren ist auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt. Die Kristallzusammensetzung und Porosität kann auch reguliert werden, um die optischen Eigenschaften des porösen Siliciums zu ändern, damit die Raman-Signale verstärkt und das Hintergrundrauschen vermindert werden. Die optischen Eigenschaften von porösem Silicium sind auf dem Fachgebiet bekannt (z.B. Cullis et al., J. Appl. Phys. 82; 909–965, 1997; Collins et al., Physics Today 50: 24–31, 1997).
Ein nicht-einschränkendes Beispiel eines Verfahrens und einer Vorrichtung 100 zur Herstellung eines porösen Siliciumsubstrats 110, 210 wird in 1 veranschaulicht. Ein Silicium-Wafer 110 wird innerhalb einer elektrochemischen Zelle 120, die ein inertes Material wie Teflon^® enthält, platziert. Der Wafer 110 wird mit einem positiven Pol einer Konstantstromquelle 130 verbunden und bildet somit die Anode 110 der elektrochemischen Zelle 120. Der negative Pol der Konstantstromquelle 130 wird an eine Kathode 140 wie beispielsweise eine Platinkathode, angeschlossen. Die elektrochemische Zelle 120 kann mit einer verdünnten Elektrolytlösung aus HF in Ethanol 150 gefüllt werden. In einer anderen Ausführungsform kann HF 150 in anderen Alkoholen und/oder auf dem Fachgebiet bekannten oberflächenaktiven Mitteln wie Pentan oder Hexan gelöst werden. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann ein Computer 160, 395 funktionell mit der Konstantstromquelle 130 verbunden werden, um die Stromstärke, Spannung und/oder Zeit des elektrochemischen Ätzens zu regulieren. Der Silicium-Wafer, der in der elektrochemischen Zelle 120 dem HF-Elektrolyt 150 ausgesetzt wird, wird geätzt, um ein poröses Siliciumsubstrat 110, 210 zu erzeugen. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Dicke der porösen Siliciumschicht 210 und der Grad der Porosität des Siliciums 210 kontrolliert werden, indem die Zeit und/oder die Stromdichte der Anodisierung und die Konzentration von HF 150 in der Elektrolytlösung reguliert wird (z.B. U.S.-Patent-Nr. 6,358,815 ).
In verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Teile des Silicium-Wafers 110 durch Beschichten mit irgendeiner bekannten Resistverbindung wie Polymethylmethacrylat vor dem HF 150-Ätzen geschützt werden. Lithographieverfahren wie Photolithographie, die verwendbar sind, um ausgewählte Teile eines Silicium-Wafers 110 dem HF 150-Ätzen auszusetzen, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Selektives Ätzen kann nützlich sein, um die Größe und Form einer porösen Siliciumzelle, für die Verwendung bei der Raman-Spektroskopie, zu kontrollieren. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann eine poröse Siliciumzelle von etwa 1 μm (Mikrometer) im Durchmesser verwendet werden. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann eine Grube oder ein Kanal aus porösem Silicium von etwa 1 μm Breite verwendet werden. Die Größe der porösen Siliciumzelle ist nicht eingeschränkt und es wird in Betracht gezogen, dass jede Größe oder Form der porösen Siliciumzelle verwendet werden kann. Eine 1 μm große Zelle kann zum Beispiel mit einem anregenden Laser, der eine Größe von 1 μm aufweist, zu verwenden sein.
Das vorstehend beschriebene, beispielhafte Verfahren ist nicht beschränkend für die Herstellung von porösen Siliciumsubstraten 110, 210 und es wird in Betracht gezogen, dass jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden kann. Nicht-einschränkende Beispiele für Verfahren zur Herstellung von porösen Siliciumsubstraten 110, 210 umfassen elektrolytisches Ätzen von Silicium-Wafern 110; Elektroplattieren und Abscheiden eines Silicium/Sauerstoff-enthaltenden Materials gefolgt von kontrolliertem Tempern (z.B. Canham, „Silicon quantum wire array fabrication by electrochemical and chemical dissolution of Wafers", Appl. Phys. Lett. 57; 1046; 1990; U.S.-Patent-Nrn. 5,561,304 ; 6,153,489 ; 6,171,945 ; 6,322,895 ; 6,358,613 ; 6,358,815 ; 6,359,276 ). In verschiedenen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die poröse Siliciumschicht 210 an eine oder mehrere Trägerschichten wie Siliciummasse, Quarz, Glas und/oder Kunststoff, gebunden werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine Ätz-Stopschicht wie Siliciumnitrid verwendet werden, um die Tiefe des Ätzens zu kontrollieren. Die poröse Siliciumschicht 210 kann in einen Halbleiterchip eingebaut werden, unter Verwendung bekannter Verfahren der Chipherstellung. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die metallbeschichtete, poröse Silicium 240, 340-Zelle als Teil eines integralen Chips entwickelt werden, verbunden mit verschiedenen Kanälen, Mikrokanälen, Nanokanälen, Mikrofluidkanälen, Reaktionszellen usw.. In alternativen Ausführungsformen kann die metallbeschichtete poröse Silicium 240, 340-Zelle aus einem Silicium-Wafer ausgeschnitten und in einen Chip und/oder anderen Baustein eingebaut werden.
In bestimmten, alternativen Ausführungsformen der Erfindung wird in Betracht gezogen, dass zusätzliche Modifikationen des porösen Siliciumsubstrats 110, 210 entweder vor oder nach der Metallbeschichtung hergestellt werden können. Zum Beispiel kann ein poröses Siliciumsubstrat 110, 210, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, zu Siliciumoxid und/oder Siliciumdioxid oxidiert werden. Die Oxidation kann zum Beispiel verwendet werden, um die mechanische Festigkeit und Stabilität des porösen Siliciumsubstrats 110, 210 zu erhöhen. In einer anderen Ausführungsform kann das metallbeschichtete Siliciumsubstrat 240, 340 einem weiteren Ätzvorgang unterzogen werden, um das Siliciummaterial zu entfernen, was eine Metallhülle zurücklässt, die ausgehöhlt belassen werden kann oder mit anderen Materialien wie beispielsweise einem zusätzlichen Raman-aktiven Metall gefüllt werden kann.
Metallbeschichtung des porösen Siliciums
Das poröse Siliciumsubstrat 110, 210 kann durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren mit einem Raman-aktiven Metall beschichtet werden, wie Gold, Silber, Platin, Kupfer oder Aluminium. Nicht-einschränkende, beispielhafte Verfahren umfassen Elektroplattierung; kathodische Elektrowanderung; Verdampfung und Zerstäubung von Metallen unter Verwendung von Impfkristallen, um das Beschichten zu katalysieren (d.h. Verwendung eines Kupfer/Nickel-Keims, um elektrochemisch zu vergolden); Ionenimplantation; Diffusion oder jedes andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zum Plattieren dünner Metallschichten auf ein Siliciumsubstrat 110, 210, 240, 340 (siehe z.B. Lopez und Fauchet „Erbium emission form porous silicon one-dimensional photonic band gap structures", Appl. Phys. Lett. 77: 3704–6, 2000; U.S.-Patent-Nrn. 5,561,304 ; 6,171,945 ; 6,359,276 ). Ein anders nicht-einschränkendes Beispiel der Metallbeschichtung umfasst stromlose Plattierung (z. B. Gole et al., „Patterned metallization of porous silicon from electroless solution for direct electrical contact", J. Electrochem. Soc. 147: 3785, 2000). Die Zusammensetzung und/oder Dicke der Metallschicht kann kontrolliert werden, um die Plasmon-Resonanzfrequenz des metallbeschichteten porösen Siliciums 240, 340 zu optimieren.
In alternativen Ausführungsformen der Erfindung kann das Raman-aktive Substrat 240, 340, das für den Analytnachweis verwendet wurde, folgendes umfassen: ein metallbeschichtetes, nanokristallines, poröses Siliciumsubstrat 240, 240; immobilisierte Metallkolloide wie Silber- oder Goldnanopartikel, die auf einen anderen Substrattyp beschichtet wurden, und/oder immobilisierte Metallkolloide, die oben auf ein metallbeschichtetes, nanokristallines, poröses Siliciumsubstrat 240, 240, beschichtet wurden. Die letztere Zusammensetzung würde eine sehr hohe Dichte des Raman-aktiven Metalls aufweisen, mit relativ kleinen Kanälen für die Analyten in Lösung, um in das Substrat einzudringen. Auch wenn dies für große Analytmoleküle wie große Proteine oder Nucleinsäuren weniger günstig ist, kann es eine bessere Empfindlichkeit und einen besseren Nachweis von kleinen Analyten wie einzelne Nucleotide oder Aminosäuren liefern. Metallkolloide können wie nachstehend erläutert in Form von Nanopartikeln sein.
Nanopartikel
In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Raman-aktive Metallpartikel wie Gold- oder Silbernanopartikel zu dem metallbeschichteten porösen Siliciumsubstrat 240, 340 gegeben werden, um das Raman-Signal weiter zu verstärken. In verschiedenen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Nanopartikel zwischen 1 nm und 2 μm im Durchmesser verwendet werden. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung werden Nanopartikel von 2 nm bis 1 μm, 5 nm bis 500 nm, 10 nm bis 200 nm, 20 nm bis 100 nm, 30 nm bis 80 nm, 40 nm bis 70 nm oder 50 nm bis 60 nm im Durchmesser in Erwägung gezogen. In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Nanopartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 50 nm, 50 bis 100 nm oder etwa 100 nm in Erwägung gezogen. Die Größe der Nanopartikel wird von dem Durchmesser der Poren in dem metallbeschichteten Silicium 240, 340 abhängen und kann so gewählt werden, dass die Nanopartikel in die Poren hinein passen. Die Nanopartikel können annäherungsweise eine sphärische Form aufweisen, obwohl Nanopartikel jeder Form oder von ungleichmäßiger Form verwendet werden können. Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln sind bekannt (z.B. U.S.-Patent-Nrn. 6,054,495 ; 6,127,120 ; 6,149,868 ; Lee und Meisel, J. Phys. Chem. 86: 3391–3395, 1982). Nanopartikel können auch in Form von Nanoprismen hergestellt werden (Jin et al., „Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms". Science 294: 1901, 2001). Nanopartikel können aus handelsüblichen Quellen bezogen werden (z.B. Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polyscience, Inc., Warrington, PA).
In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen können die Nanopartikel zufällige Aggregate von Nanopartikeln sein (kolloidale Nanopartikel). In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Nanopartikel vernetzt sein, um besondere Nanopartikelaggregate zu erzeugen, wie Dimere, Trimere, Tetramere oder andere Aggregate. Bestimmte alternative Ausführungsformen der Erfindung können heterogene Gemische von Aggregaten verschiedener Größe verwenden, während andere alternative Ausführungsformen homogene Populationen von Nanopartikelaggregaten verwenden können. In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Aggregate, die eine ausgewählte Anzahl von Nanopartikeln (Dimere, Trimere, usw.) enthalten, mittels bekannter Verfahren wie Ultrazentrifugation in Saccharosegradientlösungen angereichert oder aufgereinigt werden.
Verfahren zum Vernetzen von Nanopartikeln sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Feldheim, „Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges", The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, S. 22–25). Eine Reaktion von Goldnanopartikeln mit Linker-Verbindungen, die endständige Thiol- oder Sulfydrylgruppen tragen, ist bekannt (Feldheim, 2001). In einigen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann eine einzelne Linker-Verbindung mit Thiolgruppen an beiden Enden derivatisiert sein. Nach der Reaktion mit Goldnanopartikeln würde der Linker Nanopartikeldimere erzeugen, die über die Länge des Linkers getrennt sind. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Linker mit drei, vier oder mehr Thiolgruppen verwendet werden, um gleichzeitig an viele Nanopartikel zu binden (Feldheim, 2001). Die Verwendung eines Überschusses an Nanopartikeln gegenüber den Linker-Verbindungen verhindert die Entstehung von Vielfachvernetzungen und eine Nanopartikelpräzipitation. Aggregate aus Silbernanopartikeln können mittels auf dem Fachgebiet bekannter Standardsyntheseverfahren erzeugt werden.
In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Gold- oder Silbernanopartikel mit derivatisierten Silanen wie Aminosilan, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOP) oder Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) beschichtet werden. Die reaktiven Gruppen an den Enden der Silane können verwendet werden, um vernetzte Nanopartikelaggregate zu erzeugen. Es ist in Erwägung zu ziehen, dass die verwendeten Linker-Verbindungen nahezu jede Länge aufweisen können und von etwa 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 bis 100 nm reichen oder sogar einer größeren Länge. Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung können Linker heterogener Länge verwenden.
In einer anderen alternativen Ausführungsform der Erfindung können die Nanopartikel, bevor sie an die Linker-Verbindungen geknüpft werden, modifiziert werden, um verschiedene reaktive Gruppen zu enthalten. Modifizierte Nanopartikel sind im Handel erhältlich, wie die Nanogold^®-Nanopartikel von Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY). Nanogold^®-Nanopartikel sind entweder mit einer einzelner oder vielfachen Maleimidgruppen, Amingruppen oder anderen pro Nanopartikel gebundenen Gruppen erhältlich. Die Nanogold^®-Nanopartikel sind auch in entweder positiv oder negativ geladener Form erhältlich, um die Manipulation der Nanopartikel in einem elektrischen Feld zu vereinfachen. Derart modifizierte Nanopartikel können an eine Vielzahl bekannter Linker-Verbindungen gebunden werden, um Dimere, Trimere oder andere Nanopartikelaggregate zu liefern.
Die Art der verwendeten Linker-Verbindung ist nicht beschränkt, solange sie zur Herstellung von kleinen Nanopartikelaggregaten führt, die nicht in Lösung präzipitieren. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die Linkergruppe Phenylacetylen-Polymere enthalten (Feldheim, 2001). In einer andern Ausführungsform können Linkergruppen Polytetrafluorethylen, Polyvinylpyrrolidon, Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylamid, Polyethylen oder andere bekannte Polymere enthalten. Die verwendeten Linker-Verbindungen sind nicht auf Polymere beschränkt, sondern können auch andere Arten von Molekülen wie Silane, Alkane, derivatisierte Silane oder derivatisierte Alkane einschließen. In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Linker-Verbindungen von relativ einfacher chemischer Struktur wie Alkane oder Silane verwendet werden, um Störungen mit den Raman-Signalen, die von den Analyten abgestrahlt werden, zu verhindern.
MIKROELEKTROMECHANISCHE SYSTEME (MEMS)
In einigen Ausführungsformen der Verfahren der Erfindung kann das Raman-aktive, metallbeschichtete, poröse Siliconsubstrat 240, 340 in eine größere Vorrichtung 300 und/oder System eingebaut werden. In bestimmten Ausführungsformen kann das Substrat 240, 340 in ein mikroelektromechanisches System (MEMS, engl.: Micro-Electro-Mechanical System) eingebaut werden. MEMS sind integrierte Systeme, die mechanische Elemente, Sensoren, Aktuatoren und Elektronik umfassen. All diese Komponenten können durch bekannte Mikrostrukturherstellungsverfahren auf einem gewöhnlichen Chip auf Siliciumbasis oder einem gleichwertigen Substrat hergestellt werden (z.B. Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng. 1: 401–425, 1999). Die Sensorkomponenten des MEMS können verwendet werden, um mechanische, thermische, biologische, chemische, optische und/oder magnetische Phänomene zu messen. Die Elektronik kann die Information der Sensoren verarbeiten, die Aktuatorkomponenten wie zum Beispiel Pumpen, Ventile, Heizelemente, Kühler, Filter usw. steuern und dabei die Funktion des MEMS kontrollieren.
Die elektronischen Komponenten des MEMS können unter Verwendung von Verfahren zum Bau integrierter Schaltkreise (IC, eng.: integrated circuit) hergestellt werden (z.B. CMOS, Bipolar oder BICMOS-Verfahren). Sie können unter Verwendung von Photolithographie und Ätzverfahren strukturiert werden. Die mikromechanischen Komponenten können unter Verwendung von Mikrobearbeitungsverfahren hergestellt werden, die selektiv Teile des Silicium-Wafers wegätzen oder neue strukturelle Schichten hinzufügen, um die mechanischen und/oder elektromechanischen Komponenten zu erzeugen.
Grundlegende Verfahren in der MEMS-Herstellung schließen das Beschichten eines Substrates mit dünnen Materialfilmen, das Aufbringen einer strukturierten Maske auf den Filmen durch photolithographische Bilderzeugung oder andere bekannte lithographische Verfahren und das selektive Ätzen der Filme ein. Ein dünner Film kann eine Dicke im Bereich von einigen wenigen Nanometern bis 100 Mikrometer haben. Nutzbare Beschichtungsverfahren können chemische Verfahren wie zum Beispiel chemische Gasphasenabscheidung (CVD, engl.: chemical vapor deposition), elektrochemische Abscheidung, epitaktisches Aufwachsen und thermische Oxidation und physikalische Verfahren wie physikalische Gasphasenabscheidung (PVD, engl.: physical vapor deposition) und Gießen umfassen. Verfahren zur Fabrikation von nanoelektromechanischen Systemen können für bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen verwendet werden (siehe z.B. Craighead, Science 290: 1532–36, 2000).
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren kann das metallbeschichtete, poröse Siliciumsubstrat 240, 340 an verschiedene flüssigkeitsgefüllte Kompartimente wie Mikrofluidkanäle, Nanokanäle und/oder Mikrokanäle angeschlossen werden. Diese und andere Komponenten der Vorrichtung 300 können als eine einzelne Einheit, zum Beispiel in Form eines Chips erzeugt werden, wie bekannt bei Halbleiterchips und/oder Mikrokapillarchips oder Mikrofluidchips. In einer anderen Ausführungsform kann das metallbeschichtete, poröse Siliciumsubstrat 240, 340 von einem Silicium-Wafer entfernt und an anderen Komponenten einer Vorrichtung 300 befestigt werden. Jegliche Materialien, die für die Verwendung in solchen Chips bekannt sind, können in der beschriebenen Vorrichtung 300 verwendet werden, einschließlich Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Kunststoff, Glas, Quarz usw..
Batch-Verfahren zur Anfertigung von Chips sind auf dem Gebiet der Computerchip-Herstellung und/oder Mikrokapaillarchip-Herstellung bestens bekannt. Solche Chips können durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren wie Photolithographie und Ätzen, Laserablation, Spritzgießen, Gießen, Molekularstrahlepitaxie, Dip-Pen-Nanolithographie, chemische Gasphasenabscheidungs(CVD)-Herstellung, Elektronenstrahl- oder fokussierter Ionenstrahlverfahren oder Prägungsverfahren hergestellt werden. Nicht-einschränkende Beispiele umfassen herkömmliches Gießen mit einem fließfähigen, optisch reinen Material wie Kunststoff oder Glas; Photolithographie und Trockenätzen von Siliciumdioxid; Elektronenstrahllithographie unter Verwendung eines Polymethylmethacrylat-Resists, um eine Aluminiummaske auf ein Siliciumdioxydsubstrat zu strukturieren, gefolgt von reaktivem Ionenätzen. Verfahren zur Herstellung von nanoelektromechanischen Systemen könne für bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen verwendet werden (siehe Craighead, Science 290: 1532–36, 2000). Verschiedenen Arten von mikrostrukturell hergestellten Chips sind im Handel erhältlich, z.B. von Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA) und ACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA).
In bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Teil oder die gesamte Vorrichtung 300 so gewählt werden, das sie für elektromagnetische Strahlung in den Anregungs- und Emissionsfrequenzen, die für die Raman-Spektroskopie verwendet werden, durchlässig ist, wie Glas, Silicium, Quarz oder jedes andere optisch reine Material. Für flüssigkeitsgefüllte Kompartimente, die verschiedenen Biomolekülen wie beispielsweise Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuren, Nucleotiden und Ähnlichen ausgesetzt werden können, können die Oberflächen, die diesen Molekülen ausgesetzt werden, durch Beschichten modifiziert werden, zum Beispiel um eine Oberfläche von einer hydrophoben in eine hydrophile Oberfläche umzuwandeln und/oder um die Adsorption von Molekülen an eine Oberfläche zu vermindern. Eine Oberflächenmodifikation von gebräuchlichen Chipmaterialien wie Glas, Silicium, Quarz und/oder PDMS ist auf dem Fachgebiet bekannt (z.B. U.S.-Patent-Nr. 6,263,286 ). Zu solchen Modifikationen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, das Beschichten mit im Handel erhältlichen Kapillarbeschichtungen (Supelco, Bellafonte, PA), Silane mit verschiedenen funktionellen Gruppen wie Polyethylenoxid oder Acrylamid oder jede andere auf dem Fachgebiet bekannte Beschichtung.
RAMAN-SPEKTROSKOPIE
Raman-Detektoren
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren können Analyten durch jedes bekannte Raman-Spektroskopieverfahren nachgewiesen und/oder identifiziert werden. In solchen Ausführungsformen kann das Raman-aktive Substrat 240, 340 funktionell an eine oder mehrere Raman-Nachweiseinheiten 360 gekoppelt werden. Verschiedene Verfahren zum Nachweis von Analyten mittels Raman-Spektroskopie sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. U.S.-Patent-Nrn. 6,002,471 ; 6,040,191 ; 6,149,868 ; 6,174,677 , 6,313,914 ). Abwandlungen von der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS), der oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERRS), der Hyper-Raman-Spektroskopie und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) sind beschrieben worden.
In der SERS und SERRS wird die Empfindlichkeit des Raman-Nachweises um einen Faktor von 10⁶ oder mehr für Moleküle verstärkt, die auf angerauten Oberflächen wie Silber-, Gold-, Platin-, Kupfer- oder Aluminiumoberflächen adsorbiert sind.
Ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine Raman-Nachweiseinheit 360 wird im U.S.-Patent-Nr. 6,002,471 beschrieben. Ein Anregungsstrahl 390 wird entweder durch einen Frequenz-verdopplten Nd:YAG-Laser 370 bei einer Wellenlänge von 532 nm oder einen Frequenz-verdoppelten Ti:Saphir-Laser 370 bei einer Wellenlänge von 365 nm erzeugt. Gepulste Laserstrahlen 390 oder kontinuierliche Laserstrahlen 390 können verwendet werden. Der Anregungsstrahl 390 fällt durch eine konfokale Optik und ein Mikroskopobjektiv und wird auf das Raman-aktive Substrat 240, 340, das einen oder mehrere Analyten enthält, fokussiert. Das Raman-Emissionslicht von den Analyten wird durch das Mikroskopobjektiv und die konfokale Optik gesammelt und wird mit einem Monochromator für die spektrale Zerlegung gekoppelt. Zu der konfokalen Optik gehört eine Kombination von dichroitischen Filtern, Sperrfiltern, konfokalen Lochblenden, Linsen und Spiegeln zur Reduktion des Hintergrundsignals. Das gesamte Feld der Standardoptik kann verwendet werden genauso wie die konfokale Optik. Das Raman-Emissionssignal wird durch einen Raman-Detektor 380 nachgewiesen, der eine Lawinenphotodiode enthält, die mit einem Computer 160, 395 für die Berechnung und die Digitalisierung des Signals gekoppelt ist.
Ein anderes Beispiel für eine Raman-Nachweiseinheit 360 wird in dem U.S.-Patent-Nr. 5,306,403 beschrieben und umfasst ein Spex Model 1403 Doppelgitter-Spektralphotometer mit einer Gallium/Arsenid-Photovervielfacherröhre (RCA Model C31034 oder Burle Industries Model C3103402), die im Einzelphoton-Zählmodus betrieben wird. Die Anregungsquelle enthält einen 514,5 nm Linie-Argonionenlaser 370 von SpectraPhysics, Modell 166, und eine 647,1 nm Linie eines Kryptonionenlasers 370 (Innova 70, Coherent).
Zu den alternativen Anregungsquellen gehören ein Stickstofflaser 370 (Laser Science Inc.) bei 337 nm und ein Helium/Cadmiumiaser 370 (Liconox) bei 325 nm ( U.S.-Patent-Nr. 6,174,677 ), eine Leuchtdiode, ein Nd:YLF-Laser 370 und/oder verschiedene Ionenlaser 370 und/oder Farbstofflaser 370. Der Anregungsstrahl 390 kann mit einem Bandpassfilter (Corion) spektral aufgereinigt und unter Verwendung einer 6×-Objektivlinse (Newport, Model L6X) auf das Raman-aktive Substrat 240, 340 fokussiert werden. Die Objektivlinse kann sowohl für die Anregung des Analyten als auch für das Sammeln des Raman-Signals verwendet werden, in dem ein holographischer Strahlungsteiler (Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18) verwendet wird, um eine rechtwinkelige Geometrie für den Anregungsstrahl 390 und das emittierte Raman-Signal zu erzeugen. Ein holographischer Kerbfilter (Kaiser Optical Systems, Inc.) kann verwendet werden, um die Rayleigh-Streustrahlung zu reduzieren. Alternative Raman-Detektoren 380 schließen einen ISA HR-320-Spektrographen ein, der mit einem rot-verstärkten, intensivierten, ladungsgekoppeltem Bauelement(RE-ICCD, engl.: red-enhanced intensified chargecoupled device)-Nachweissystem (Princeton Instruments) ausgestattet ist. Andere Arten von Detektoren 380 können verwendet werden wie Fourier-Transform-Spektrographen (basierend auf Michaelson-Interferometern), Ladungsinjektionselememte, Photodiodenfeld, InGaAs-Detektoren, Elektronenvervielfachtes CCD, intensiviertes CCD und/oder Phototransistorfelder.
Jede geeignet Form oder Konfiguration der Raman-Spektroskopie oder verwandter Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können für den Nachweis von Analyten verwendet werden, dazu gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, normale Raman-Streuung, Resonanz-Raman-Streuung, oberflächenverstärkte Raman-Streuung, oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Streuung, kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS), stimulierte Raman-Streuung, inverse Raman-Spektroskopie, stimulierte Raman-Verstärkungs-Spektroskopie, Hyper-Raman-Streuung, Raman-Spektroskopie mit Lasermikrosonde (MOLE, engl.: molecular optical laser examiner) oder Raman-Mikrosonde oder Raman-Mikroskopie oder konfokale Raman-Mikrospektrometrie, dreidimensionales oder Raster-Raman, Raman-Sättigungsspektroskopie, zeitaufgelöstes Resonanz-Raman, Raman-Entkopplungsspektroskopie oder UV-Raman-Mikroskopie.
Raman-Markierungen
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung können das Anbringen einer Markierung an einen oder mehrere Analyten mit sich bringen, um ihre Messung mit der Raman-Nachweiseinheit 360 zu vereinfachen. Zu nicht-einschränkenden Beispielen von Markierungen, die für die Raman-Spektroskopie verwendet werden können, gehören TRIT (Tetramethylrhodaminisothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), Texas Red-Farbstoff, Phthalsäure, Terephthalsäure, Isophthalsäure, Cresylechtviolett, Cresylblauviolett, Brilliantcresylblau, para-Aminobenzoesäure, Erythrosin, Biotin, Digoxigenin, 5-Carboxy-4'5'-dichlor-2'7'-dimethoxyfluorescein, 5-Carboxy-2'4'5'7'-tetrachlorfluorescein, 5-Carboxyfluorescein, 5-Carboxyrhodamin, 6-Carboxyrhodam in, 6-Carboxytetramethylaminophthalocyanine, Azomethine, Cyanine, Xanthine, Succinylfluoresceine, Aminoacridin, Quantenpunkte, Kohlenstoffnanoröhren und Fullerene. Diese und andere Raman-Markierungen können über handelsübliche Quellen bezogen werden (z.B. Molecular Probes, Eugene, OR; Sigma Aldrich Chemicals Co., St. Louis, MO) und/oder mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren synthetisiert werden.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt, können polycyclische aromatische Verbindungen als Raman-Markierungen funktionieren. Zu anderen Markierungen, die für besondere, erfindungsgemäße Ausführungsformen Verwendung finden, gehören Cyanid, Thiol, Chlor, Brom, Methyl, Phosphor und Schwefel. Die Verwendung von Markierungen in der Raman-Spektroskopie sind bekannt (z.B. U.S.-Patent-Nrn. 5,306,403 und 6,174,677 ). Der Fachmann wird erkennen, dass die verwendeten Raman-Markierungen unterscheidbare Raman-Spektren erzeugen sollten, und spezifisch an verschieden Arten von Analyten gebunden oder mit ihnen assoziiert sein können.
Die Markierungen können direkt oder über verschiedene Linker-Verbindungen mit den Analyten verbunden sein. Vernetzungsreagenzien und Linker-Verbindungen, die in den beschriebenen Verfahren verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Raman-Markierungen, die reaktive Gruppen enthalten, die entwickelt wurden, um kovalent mit anderen Molekülen wie Analyten zu reagieren, sind im Handel erhältlich (z.B. Molecular Probes, Eugene, OR). Verfahren zur Herstellung von markierten Analyten sind bekannt (z.B. U.S.-Patent-Nrn. 4,962,037 ; 5,405,747 ; 6,136,543 ; 6,210,896 ).
COMPUTER
In bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren kann die Vorrichtung 100, 300 einen Computer 160, 395 beinhalten. Die Ausführungsformen sind nicht eingeschränkt hinsichtlich des verwendeten Computers 160, 395. Ein beispielhafter Computer 160, 395 kann einen Bus zur Informationsübertragung und einen Prozessor zur Informationsverarbeitung enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Prozessor aus der Familie der Pentium^®-Prozessoren ausgewählt, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Pentium^® II-, Pentium^® III- und der Pentium^® 4-Prozessorfamilie, erhältlich von Intel Corp. (Santa Clara, CA). In alternativen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der Prozessor ein Celeron^®-, ein Itanium^®- und X-Scale- oder ein Pentium Xeon^®-Prozessor sein (Intel Corp., Santa Clara, CA). In verschiedenen anderen Ausführungsformen der Erfindung. kann der Prozessor auf einer Intel-Architektur basieren, wie zum Beispiel Intel IA-32 oder Intel^® IA-64-Architektur. Wahlweise können auch andere Prozessoren verwendet werden.
Der Computer 160, 395 kann des weiteren einen Arbeitsspeicher (RAM, engl.: random access memory) oder eine andere dynamische Speichervorrichtung (Hauptspeicher), einen Nur-Lese-Speicher (ROM) oder andere statische Speichervorrichtungen und eine Datenspeichervorrichtung wie Magnetscheibe oder optische Speicherplatte und sein entsprechendes Laufwerk enthalten. Der Computer 160, 395 kann auch andere auf dem Fachgebiet bekannte Peripheriegeräte enthalten wie beispielsweise ein Anzeigegerät (z.B. Kathodenstrahlröhre oder Flüssigkristallanzeige), ein alphanumerisches Eingabegerät (z.B. Tastatur), ein Cursor-Kontrollgerät (z.B. Maus, Rollkugel oder Cursorpfeiltasten) und ein Kommunikationsgerät (z.B. Modem, Netzwerkschnittstellenkarte oder eine Schnittstelle zur Ankopplung an Ethernet, Token-Ring oder andere Netzwerktypen).
In besonderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Versuche kann die Raman-Nachweiseinheit 360 funktionell mit dem Computer 160, 395 verbunden sein. Daten von der Nachweiseinheit 360 können von dem Prozessor verarbeitet und die Daten im Hauptspeicher gespeichert werden. Daten der Emissionsprofile für Standardanalyten können auch im Hauptspeicher oder ROM gespeichert werden. Der Prozessor kann die Emissionsspektren von Analyten im Raman-aktiven Substrat 240, 340 vergleichen, um die Art der/s Analyten in der Probe zu identifizieren. Der Prozessor kann die Daten von der Nachweiseinheit 360 analysieren, um die Identität und/oder Konzentration der verschiedenen Analyten zu bestimmen. Es ist einzusehen, dass ein unterschiedlich ausgestatteter Computer 160, 395 für bestimmte praktische Ausführungen verwendet werden kann. Daher können die Konfigurationen des Systems in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung variieren.
Während die hierin beschriebenen Verfahren unter der Kontrolle eines programmierten Prozessors durchgeführt werden können, können in alternativen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen die Verfahren vollständig oder teilweise durch jede programmierbare oder festverdrahtete logische Schaltung implementiert werden wie zum Beispiel FPGAs (engl.: Field Programmable Gate Arrays), TTL-Logikschaltkreise oder anwendungsspezifische integrierte Schaltungen (ASICs, engl.: Application Specific Integrated Circuits). Zusätzlich können die beschriebenen Verfahren mit jeder Kombination von programmierten Universalcomputer 160, 395 – Komponenten und/oder kundenspezifischen Hardwarekomponenten durchgeführt werden.
Nach der Datenaufnahme werden die Daten üblicherweise einer Datenanalyse zugeführt. Um die Analyse zu vereinfachen, werden die Daten, die durch die Nachweiseinheit 360 erhalten wurden, üblicherweise unter Verwendung eines Digitalrechners 160, 395 wie der vorstehend beschriebene analysiert. Üblicherweise wird der Computer 160, 395 für die Aufnahme und Speicherung der Daten von der Nachweiseinheit 360 genauso wie für die Analyse und Darstellung der gesammelten Daten in geeigneter Weise programmiert.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können kundenspezifisch gestaltete Softwarepakete verwendet werden, um die von der Nachweiseinheit 360 erhaltenen Daten zu analysieren. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung kann die Datenanalyse mit einem Datenverarbeitungs- und Kontrollsystems und handelsüblichen Softwarepaketen durchgeführt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung eines Raman-aktiven Substrats
Erzeugen von porösem nanokristallinem Silicium
Ein beispielhaftes Verfahren und die Vorrichtung 100 zur Erzeugung nanokristalliner, poröser Siliciumsubstrate 110, 210 wird in 1 veranschaulicht. Verfahren zur Herstellung von nanokristallinem Silicium sind auf dem Fachgebiet bekannt (z.B. U.S.-Patent-Nr. 6,017,773 ). Eine Schicht aus nanokristallinem, porösen Silicium kann elektrochemisch erzeugt werden wie es in Petrova-Koch et al. (Appl. Phys. Lett. 61: 943, 1992) beschrieben wird. Abhängig von der bestimmten Anwendung kann das Silicium vor dem Ätzen leicht oder stark p-dotiert oder n-dotiert werden, um die Eigenschaften des porösen Siliciumsubstrats 110, 210 einzustellen. Einkristall-Silicium-Ingots können durch das bestens bekannte Czochralski-Verfahren hergestellt werden (z.B. http://www.msil.ab.psiweb.com/english/msilhist4-e.html). Ein Einkristall-Silicium-Wafer 110 kann mit elektrolytischem Ätzen in verdünntem HF/Ethanol 150 behandelt werden, um ein nanokristallines, poröses Siliciumsubstrat 110, 210 zu erzeugen. In einer anderen Ausführungsform kann chemisches Ätzen in einer Lösung aus HF, Salpetersäure und Wasser 150 ohne anodisches Ätzen verwendet werden.
Der Wafer kann vor dem Ätzen mit Polymethylmethacrylat-Resist oder irgend einer anderen bekannten Resistverbindung beschichtet werden. Ein Muster für das nanokristalline, poröse Siliciumsubstrat 110, 210 kann mittels Standardphotolithographieverfahren erzeugt werden. In unterschiedlichen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann das nanokristalline, poröse Substrat 110, 210 kreisförmig, furchenförmig, kanalförmig oder von jeder anderen gewählten Form sein. In bestimmten Ausführungsformen können auf einem einzelnen Silicium-Wafer 110 viele poröse Substrate 110, 210 erzeugt werden, um mehere Samplingkanäle und/oder Samplingkammern für die Raman-Analyse zu ermöglichen. Jeder Samplingkanal und/oder jede Samplingkammer kann funktionell mit einer oder mehreren Raman-Detektoren 380 gekoppelt sein.
Nach Resistbeschichtung und Lithographie kann der Wafer 110 in einer elektrochemischen Zelle 120, die aus Teflon® besteht, einer Lösung 150 von zwischen etwa 15 bis 50 Gewichtsprozent HF in Ethanol und/oder destilliertem Wasser ausgesetzt werden wie in 1 beschrieben. In verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der ganze Resist-beschichtete Wafer 110 in eine HF-Lösung 150 eingetaucht werden. In alternativen Ausführungsformen kann der Wafer 110 in der elektrochemischen Zelle 120, unter Verwendung von zum Beispiel einer Scheibe aus synthetischem Kautschuk an Ort und Stelle gehalten werden, wobei nur ein Teil der Wafer 110-Oberfläche der HF-Lösung 150 ausgesetzt wird ( U.S.-Patent-Nr. 6,322,895 ). In jedem Fall kann der Wafer 110 elektrisch mit dem positiven Pol einer Konstantstromquelle 130 verbunden werden, um die Anode 110 der elektrochemischen Zelle 120 zu erzeugen. Eine Platinelektrode kann die Kathode 140 für die Zelle 120 liefern. Der Wafer 110 kann geätzt werden unter Verwendung einer Anodisierungsstromdichte zwischen 5 bis 250 Miliamper/cm² für die Dauer von 5 Sekunden bis 30 Minuten im Dunkeln, abhängig von dem gewählten Grad der Porosität. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung kann eine Porosität von etwa 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% gewählt werden. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, kann die zur Erzeugung von porösem Silicium 110, 210 erforderliche Anodisierungsstromdichte zum Teil von der Art des verwendeten Siliciumsubstrats 110 abhängen, wie zum Beispiel ob das Substrat 110 leicht oder stark p-dotiert oder n-dotiert ist.
In anderen alternativen Ausführungsformen der Erfindung kann das nanokristalline, poröse Silicium-Substrat 110, 210, unter Verwendung von bekannten Chip-Herstellungsverfahren, in eine MEMS-Vorrichtung eingebaut werden, die eine Reihe von Detektoren, Sensoren, Elektroden, anderen elektrischen Komponenten, mechanischen Antriebselementen usw. enthält. In bestimmten Ausführungsformen können solche Herstellungsverfahren vor und/oder nach der Erzeugung eines porösen Siliciumsubstrats 110, 210 und/oder dem Beschichten mit einem Ramansensitiven Metall erfolgen.
Metallbeschichtung
Das poröse Silicium 110, 210 kann mittels kathodischer Elektrowanderung unter Verwendung bekannter Verfahren mit Metall beschichtet werden (Lopez und Fauchet, 2000). Für die Zwecke des vorliegenden Beispiels wird Silber als Metallbeschichtung verwendet, obwohl andere Metalle wie Gold oder Platin verwendet werden können. Die poröse Siliciumoberfläche 110, 210 wird gereinigt und mit Silber durch Elektrowanderung gemäß Lopez und Fauchet (Appl. Phys. Lett. 75: 3989, 1999) dotiert. Der Fachmann wird erkennen, dass jedes bekannte Verfahren zur Erzeugung einer dünnen Metallbeschichtung auf einem porösen Siliciumsubstrat 110, 210 in verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet werden kann.
Beispiel 2: Raman-Nachweis von Analyten
Ein Raman-aktives metallbeschichtetes Substrat 240, 340, das wie vorstehend beschrieben erzeugt wurde, kann in eine Vorrichtung 300 für den Raman-Nachweis, die Identifizierung und/oder Quantifizierung von Analyten eingebaut werden wie in 3 beispielhaft erläutert. Das Substrat 240, 340 kann zum Beispiel in eine Durchflusszelle 330 eingebaut werden, die mit den Einlass 320- und den Auslass 350-Kanälen verbunden ist. Der Einlasskanal 320 kann mit einer oder mehreren anderen Vorrichtungen 310 wie einem Probengeber 310 und/oder einer Reaktionskammer 310 verbunden werden. Analyten können in die Durchflußzelle 330 eindringen und das Raman-aktive Substrat durchströmen, wo sie mittels einer Raman-Nachweiseinheit 360 nachgewiesen werden. Die Nachweiseinheit 360 kann einen Raman-Detektor 380 und eine Lichtquelle 370 wie einen Laser 370 enthalten. Der Laser 370 kann einen Anregungsstrahl 390 aussenden, der die Analyten aktiviert und zur Emission von Raman-Signalen führt. Die Raman-Signale werden von dem Detektor 380 nachgewiesen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann der Detektor 380 funktionell an einen Computer 395 gekoppelt sein, der die Daten über die in der Probe vorhandenen Analyten verarbeitet, analysiert, speichert und/oder überträgt.
In einer beispielhaften Ausführungsform der Erfindung wird der Anregungsstrahl 390 durch einen Titan:Saphir-Laser 370 (Tsunami von Spectra-Physics) bei einer Wellenlänge im nahen Infrarotbereich (750–950 nm) oder einen Galium-Aluminium-Arsenid-Diodenlaser 370 (PI-ECL-Serie von Process Instruments) bei 785 oder 830 nm erzeugt. Pulsierende Laserstrahlen 390 oder kontinuierliche Strahlen 390 können verwendet werden. Der Anregungsstrahl 390 wird von einem dichroitischen Spiegel (holographischer Sperrfilter von Kaiser Optical oder ein Interferenzfilter von Chroms oder Omega Optical) in einer kolinearen Geometrie mit dem gesammelten Strahl reflektiert. Der reflektierte Strahl 390 durchquert ein Mikroskopobjektiv (Nikon LU-Serie) und wird auf das Raman-aktive Substrat 230, 340 fokussiert, wo sich die Zielanalyten befinden. Das Raman-Streulicht der Analyten wird von demselben Mikroskopobjektiv gesammelt und durchquert den dichroitischen Spiegel zum dem Raman-Detektor 380. Der Raman-Detektor 380 enthält eine Fokussierlinse, einen Spektrographen und einen Felddetektor. Die Fokussierlinse fokussiert das Raman-Streulicht durch den Eintrittsspalt des Spektrographen. Der Spektrograph (RoperScientific) enthält ein Gitter, das das Licht hinsichtlich seiner Wellenlänge streut. Das gestreute Licht wird auf einem Felddetektor (hintergrundbeleuchtete, tiefenarme CCD-Kamera von RoperScientific) sichtbar gemacht. Der Felddetektor wird an einen Reglerkreis angeschlossen, die für den Transfer von Daten und der Kontrolle der Detektor 380-Funktion mit einem Computer 160, 395 verbunden ist.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist die Nachweiseinheit 360 in der Lage, eine Vielzahl von Analyten nachzuweisen, zu identifizieren und/oder zu quantifizieren, und zwar mit hoher Empfindlichkeit, bis hinunter zum Einzelmolekülnachweis und/oder zur Einzelmolekülidentifikation. In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen können die Analyten einzelne Nucleotide enthalten, die Raman-markiert sind oder nicht. In anderen Ausführungsformen können eine oder mehrere Oligonucleotidsonden mit unterscheidbaren Raman-Markierungen markiert sein oder nicht und es wird ihnen ermöglicht, an Zielnucleinsäuren in einer Probe zu hybridisieren. Die Anwesenheit einer Zielnucleinsäure kann durch die Hybridisierung mit einer komplementären Oligonucleotidsonde und dem Raman-Nachweis unter Verwendung der Vorrichtung 300 der 3 angezeigt werden. In einer anderen Ausführungsform können, unter Verwendung der beschriebenen Verfahren und der Vorrichtung 300, Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine von Interesse nachgewiesen und/oder identifiziert werden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Verfahren und die Vorrichtung 300 nicht beschränkt sind hinsichtlich der Art der Analyten, die nachgewiesen, identifiziert und/oder quantifiziert werden können, sondern dass eher jeder Analyt, ob markiert oder unmarkiert, der mittels Raman-Nachweis nachgewiesen werden kann, innerhalb des Schutzbereichs des beanspruchten Gegenstands analysiert werden kann.
In bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen können ein oder mehrere „Einfang"-Moleküle entweder kovalent oder nicht-kovalent an das Ramanaktive Substrat 240, 340 gebunden sein, um die Empfindlichkeit und/oder Spezifität des Raman-Nachweises von Analyten zu verstärken. Zum Beispiel könnte eine Oligonucleotidsonde, die spezifisch für eine gewählte Zielnucleinsäure ist, mittels bekannter Verfahren an die Metalloberfläche des Substrates 240, 340 gebunden werden (z.B. kann ein Oligonucleotid kovalent modifiziert werden, damit es eine Sulfhydryl-Komponente enthält, die an ein goldbeschichtetes Substrat 240, 340 binden kann). In einer anderen Ausführungsform könnte ein Antikörper, spezifisch für ein Zielprotein, -peptid oder eine andere Verbindung, an das Substrat 240, 340 gebunden sein. Die Anwesenheit eines Zielanalyten kann nachgewiesen werden, indem das an das Substrat 240, 340 gebundene Oligonucleotid einer Probe ausgesetzt wird, unter Bedingungen, die ein Hybridisieren an komplementäre Nucleinsäuresequenzen erlauben, gefolgt von Waschen und dann dem Nachweis von gebundenen Analyten. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung können ein oder mehrere Analyten in einer Probe, bevor er/sie dem Raman-aktiven Substrat 240, 340 ausgesetzt wird, mit einer unterscheidbaren Raman-Markierung markiert werden, um den Nachweis des gebundenen Analyten zu vereinfachen. Ähnliche Verfahren könnten mit Antikörper/Antigen-Paaren, Ligand/Rezeptor-Paaren oder irgendwelchen anderen bekannten Analytpaaren, die ein selektives und/oder spezifisches Binden aneinander aufweisen, verwendet werden. Das Substrat 240, 340 kann wieder verwertet und verwendet werden, indem es mit verschiedenen Agentien behandelt wird, um gebundene Analyten und/oder Einfangmoleküle zu entfernen, wie beispielsweise Waschen mit Säure, Wasser, organischen Lösungsmitteln oder einem Detergens, chemisch behandeln und/oder behandeln mit lytischen Enzymen wie beispielsweise Exonucleasen und/oder Proteasen.
Alle hier beschriebenen und beanspruchten Verfahren können angesichts der vorliegenden Offenbarung ohne unzumutbares Experimentieren durchgeführt und verwendet werden.

Claims

Verfahren umfassend: a) Ätzen eines Siliciumsubstrats, um ein poröses Siliciumsubstrat zu bilden; b) Beschichten des porösen Siliciumsubstrats mit einer Raman-sensitiven Metalloberfläche, die hergerichtet ist, um ein oder mehrere Analyten zu adsorbieren, und wobei die Oberfläche ein oder mehrere Einfangmoleküle umfasst; c) Inkontaktbringen der Oberfläche mit einer Probe, die einen oder mehrere Analyten umfasst, um die Analyten an der Oberfläche des Substrats einzufangen; d) Verwenden von Laseranregung und Spektroskopie, um einen oder mehrere der Analyten nachzuweisen und/oder zu identifizieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Siliciumsubstrat nanokristallines Silicium, Einkristall-Silicium, amorphes Silicium, mittels Laser geglühtes Silicium, oder polykristallines Silicium ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Metall-Nanopartikel der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats hinzugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Metallbeschichtung der Oberfläche Silber, Gold, Platin, Kupfer und/oder Aluminium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Spektroskopie Raman-Spektroskopie ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Raman-Spektroskopie oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS), oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERRS), Hyper-Raman- und/oder kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure, Peptid, Polypeptid, Protein, Glycoprotein, Lipoprotein, Nucleosid, Nucleotid, Oligonucleotid, Nucleinsäure, Zucker, Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Polysaccharid, Fettsäure, Fett, Hormon, Metabolit, Cytokin, Chemokin, Rezeptor, Neurotransmitter, Antigen, Allergen, Antikörper, Substrat, Metabolit, Cofaktor, Inhibitor, Arzneistoff, Pharmazeutikum, Nährstoff, Prion, Toxin, Gift, Explosivstoff, Pestizid, chemisches Kampfmittel, biologisch gefährliches Agens, Bakterien, Virus, Radioisotop, Vitamin, heterocyclische aromatische Verbindung, Carcinogen, Mutagen, Narkotikum, Amphetamin, Barbiturat, Halluzinogen, Abfallprodukt und Verunreinigung.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Analyt ein Nucleosid, Nucleotid, Oligonucleotid, eine Nucleinsäure, Aminosäure, ein Peptid, Polypeptid oder Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der eine oder die mehreren Analyten mit einer oder mehreren Raman-Markierungen markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei jeder Analyt mit einer unterscheidbaren Raman-Markierung markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eine oder die mehreren Einfangmoleküle, einzeln oder in Verbindung, an einen oder mehrere Analyten binden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das eine oder die mehreren Einfangmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligonucleotiden, Nucleinsäuren, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antigenen, Epitopen, Lektinen, Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Rezeptorproteinen, Liganden, Hormonen, Vitaminen, Metaboliten, Substraten, Inhibitoren, Cofaktoren, Pharmazeutika, Aptameren, Cytokinen und Neurotransmittern.