DE69033705T3

DE69033705T3 - Hybride immunglobuline

Info

Publication number: DE69033705T3
Application number: DE69033705T
Authority: DE
Inventors: J. Daniel CAPON; A. Laurence LASKY
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-11-21
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2010-11-22
Also published as: EP1970386A2; DK1029870T3; ES2155819T5; HK1013298A1; EP0526452B1; ATE396735T1; DK0526452T4; DE69034253D1; ES2155819T3; CA2072642C; DE69033705D1; EP0526452A1; ES2308826T3; DE122008000063I1; NL300372I1; WO1991008298A3; US5116964A; WO1991008298A2; EP1970386A8; DK0526452T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Liganden-Bindungsmoleküle und -Rezeptoren sowie Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung der Plasmazirkulations-Halbwertszeit von Liganden-Bindungsmolekülen. Insbesondere betrifft die Erfindung Hybrid-Immunglobulin-Moleküle.
Immunglobuline sind Moleküle, die durch Disulfidbindungen zusammengehaltene Polypeptidketten enthalten und typischerweise zwei Leichtketten und zwei Schwerketten aufweisen. In jeder Kette besitzt eine Domäne (V) eine variable Aminosäuresequenz je nach Antikörper-Spezifität des Moleküls. Die anderen Domänen (C) besitzen eine eher konstante Sequenz, die Molekülen der gleichen Klasse gemeinsam ist. Die Domänen werden vom aminoterminalen Ende in Sequenzen weg nummeriert.
Die Immunglobulin-Gen-Überfamilie besteht aus Molekülen mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen. Mitglieder dieser Familie sind die wesentlichen Histokompatibilitäts-Antigene der Klasse I und II, Immunglobuline, T-Zellen-Rezeptoren, α-, β-, γ- und δ-Ketten, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, die γ-, δ- und ε-Ketten von CD3, OX-2, Thy-1, die intrazellulären oder neuralen Zelladhäsionsmoleküle (1-CAM oder N-CAM), Lymphozyten-funktion-assoziiertes Antigen-3 (LFA-3), neurozytoplasmatisches Protein (NCP-3), Poly-Ig-Rezeptor, Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), IgE-Rezeptor hoher Affinität, das Haupt-Glykoprotein von peripherem Myelin (Po), von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor, Kolonie-Stimulations-Faktor-1-Rezeptor, Makrophagen-Fc-Rezeptor, Fc-γ-Rezeptoren und karzinoembryonales Antigen.
Es ist bekannt, dass man variable Domänen (einschließlich hypervariabler Regionen) eines Immunglobulins untereinander und speziesübergreifend substituieren kann. Siehe z.B. EP-A-0.173.494; EP-A-0.125.023; Munro, Nature 312 (13. Dezember 1984); Neuberger et al., Nature 312 (13. Dezember 1984); Sharon et al., Nature 309 (24. Mai 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984); Morrison et al., Science 229, 1202–1207 (1985); und Boulianne et al., Nature 312, 643–646 (13. Dezember 1984).
Morrison et al., Science 229, 1202–1207 (1985), lehren die Herstellung einer Immunglobulin-Chimäre mit einer variablen Region aus einer Spezies, die mit einer Immunglobulin-Konstantregion einer anderen Spezies fusioniert ist. Diese Publikation schlägt Moleküle mit Immunglobulin-Sequenzen vor, die mit Nicht-Immunglobulin-Sequenzen fusioniert sind (z.B. Enzymsequenzen), doch es sind nur an die Nicht-Immunglobulin-Sequenz gebundene variable Immunglobulin-Domänen beschrieben. Morrison et al., EP-A-0.173.494 offenbaren eine ähnliche Chimäre. Obwohl von den Autoren der Ausdruck "Rezeptor" verwendet wird und in der Einleitung auf "Rezeptoren wie z.B. Immunglobuline, Enzyme und Membranproteine" Bezug genommen wird, umfassen die angeführten "Rezeptoren von Interesse" "B-Zellen- und T-Zellen-Rezeptoren, insbesondere Immunglobuline wie z.B. IgM, IgG, IgA, IgD und IgE, sowie die verschiedenen Untertypen der einzelnen Gruppen" (Seite 3, Zeilen 10–13). Die Offenbarung betrifft spezifisch Immunglobulin-Chimären (siehe z.B. Seite 3, Zeilen 21–30).
Es wurde auch gezeigt, dass es möglich ist, variabel-ähnliche Immunglobulin-Domänen aus zwei Mitgliedern der Immunglobulin-Gen-Überfamilie (CD 4 und T-Zellen-Rezeptor) für eine variable Domäne in einem Immunglobulin zu substituieren; siehe z.B: Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 2936–2940 (1987); und die veröffentlichte EP 0 325 224 A2 .
Es ist eine große Anzahl proteinhaltiger Substanzen bekannt, die durch spezifische Bindung an Zielmoleküle funktionieren. Diese Zielmoleküle sind im Allgmeinen Proteine, müssen aber keine sein. Die Substanzen, die sich an Zielmoleküle oder Liganden binden, werden hierin als Liganden-Bindungspartner bezeichnet; zu ihnen zählen Rezeptoren und Trägerproteine sowie Hormone, Zelladhäsionsproteine, gewebespezifische Adhäsionsfaktoren, Lectin-Bindungsmoleküle, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Nährstoffsubstanzen und dergleichen.
Lymphozyten sind Beispiele für Zellen, die auf spezifische Gewebe abgezielt sind. Lymphozyten sind Mittler normaler Zellentzündungen sowie pathologischer Gewebeschädigungen, wie sie z.B. bei primärchronischer Polyarthritis und anderen Autoimmunerkrankungen auftritt. Wirbeltiere haben einen Mechanismus zur Verteilung von Lymphozyten mit diversen Antigenspezifitäten in räumlich unterschiedlichen Regionen des Organismus entwickelt (E.C. Butcher, Curr. Top. Micro. Immunol. 128, 85 (1986); W.M. Gallatin et al., Cell 44, 673 (1986); J.J. Woodruff et al., Ann. Rev. Immunol. 5, 201 (1987); A. Duijvestijn et al., Immunol. Today 10, 23 (1989); T.A. Yednock et al., Adv. Immunol. (in Druck) (1989)).
Dieser Mechanismus umfasst die kontinuierliche Rezirkulation der Lymphozyten zwischen dem Blut und den Lymphoidorganen. Die Migration von Lymphozyten zwischen dem Blut, wo die Zellen den höchsten Mobilitätsgrad aufweisen, und den Lymphorganen, wo die Lymphozyten auf maskiertes und verarbeitetes Antigen treffen, wird durch eine adhäsive Wechselwirkung zwischen Rezeptoren an der Oberfläche der Lymphozyten und Liganden auf den Endothelzellen spezialisierter postkapillarer Venülen, z.B. Endothel-reicher Venülen ("high endothel venules"; HEV) und den HEV-ähnlichen Gefäßen, die im chronisch entzündeten Synovium induziert werden, eingeleitet.
Die Lymphozyten-Adhäsionsmoleküle wurden spezifisch als "Homing"-Rezeptoren bezeichnet, da sie es diesen Zellen ermöglichen, in bestimmten sekundären Lymphorganen zu lokalisieren bzw. sie als "Heim" zu wählen.
Kandidaten für den Lymphozyten-Homing-Rezeptor wurden in Mäusen, Ratten und Menschen identifiziert (W.M. Gallatin et al., Nature 303, 30 (1983); R.A. Rasmussen et al., J. Immunol. 135, 19 (1985); Y.H. Chin et al., J. Immunol. 136, 2556 (1986); S. Jalkanen et al., Eur. J. Immunol. 10, 1195 (1986)). Die folgende Literatur beschreibt Arbeiten, die auf dem Gebiet unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers (Mel 14) gegen eine mutmaßliche Mäuseform eines Lymphozyten-Oberflächenproteins bereits geleistet wurde (W.M. Gallatin et al., s.o.; J.D. Mountz et al., J. Immunol. 140, 2943 (1988); D.M. Lewinsohn et al., J. Immunol. 138, 4313 (1987); M. Siegelman et al., Science 231, 823 (1986); T. St. John et al., Science 231, 845 (1986)).
Immunfällungsexperimente zeigten, dass dieser Antikörper ein diffuses Zelloberflächen-protein mit etwa 90.000 Dalton auf Lymphozyten (W.M Gallatin et al., s.o.) und ein Protein mit etwa 100.000 Dalton auf Neutrophilen erkennt (D.M. Lewinsohn et al., s.o.).
Eine Teilsequenz (13 Reste) für einen mutmaßlichen Lymphozyten-Homing-Rezeptor (identifiziert durch radioaktiv markierte Aminosäuresequenzierung eines Mel-14-Antikörper-definierten Glykoproteins) wurde von Siegelman et al. geoffenbart (M. Siegelman et al., Science 231, 823 (1986)).
Lectine sind Proteine mit einer Kohlenhydrat-Bindungsdomäne, die man bei einer Vielzahl von Tieren sowie dem Menschen vorfindet (z.B. im Rankenflusskrebs und in der Fleischfliege). Das Konzept von Lectinen, deren Wirkung sich bei der Zelladhäsion entfaltet, wird durch die Wechselwirkung verschiedener Viren und Bakterien mit eukaryotischen Wirtszellen veranschaulicht (J.C. Paulson, "The Receptors", Bd. 2, P.M. Conn (Hrsg.), (Acadernic Press, NY, 1985), S. 131; Sharon, N., FEBS Lett. 217, 145 (1987). In eukaryotischen Zell-Zell-Wechselwirkungen wurden adhäsive Funktionen in einer Vielzahl an Systemen für endogene Lectine identifiziert (L. Grabel et al., Cell 17, 477 (1979); B. Fenderson et al., J. Exp. Med. 160, 1591 (1984); V. Kunemund, J. Cell Biol. 106, 213 (1988); R. Bischoff, J. Cell Biol. 102, 2273 (1986); P.R. Croker et al., J. Exp. Med. 164, 1862 (1986); z.B. bei der Fertilisierung von Wirbellosen (C.G. Glabe et al., J. Cell Biol. 94, 123 (1982); P. DeAngelis et al., J. Biol. Chem. 262, 13946 (1987)) und Wirbeltieren (J.D. Bleil et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85, 6778 (1988); L.C. Lopez et al., J. Cell Biol. 101, 1501 (1985)). Die Nutzung von Protein-Zucker-Wechselwirkungen als Mittel zur Erreichung spezifischer Zellerkennung scheint allgemein bekannt zu sein.
Die Literatur schlägt vor, dass ein Lectin an der adhäsiven Wechselwirkung zwischen den Lymphozyten und ihren Liganden beteiligt ist (S.D. Rosen et al., Science 228, 1005 (1985); S.D. Rosen et al., J. Immunol. (in Druck) (1989); L.M. Stoolman et al., J. Cell Biol. 96, 722 (1983); L.M. Stoolman et al., J. Cell Biol. 99, 1535 (1984); T.A. Yednock et al., J. Cell Biol. 104, 725 (1987); L.M. Stoolman et al., Blood 70, 1842 (1987)). Ein ähnlicher Ansatz wurde von B.K. Brandley et al., J. Cell Biol. 105, 991 (1987); T.A. Yednock et al., in Vorbereitung; und T.A. Yednock et al., J. Cell Biol. 10, 725 (1987), gewählt.
Es wurden die Eigenschaften eines Oberflächenglykoproteins, das am Humanlymphozyten-Homing beteiligt ist, mit einer Reihe monoklonaler und polyklonaler Antikörper untersucht, die allgemein als Hermes bezeichnet werden. Diese Antikörper erkannten ein Oberflächenglykoprotein mit etwa 90.000 Dalton, das auf einer großen Anzahl immuner und nicht-immuner Zelltypen anzutreffen war und das sich in Antikörper-Vorclearing-Experimenten als mit dem Mel 14-Antigen verwandt herausstellte (S. Jalkanen et al., Ann. Rev. Med. 38, 467–476 (1987); S. Jalkanen et al., Blood 66 (3), 577–582 (1985); S. Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105, 983–990 (1987); S. Jalkanen et al., Eur. J. Immunol. 18, 1195–1202 (1986).
Epidermis-Wachstumsfaktor-ähnliche Domänen wurden auf einer Vielzahl von Proteinen identifiziert, z.B. auf Wachstumsfaktoren, Zelloberflächen-Rezeptoren, Entwicklungs-Genprodukten, Extrazellulärmatrix-Proteinen, Blutgerinnungsfaktoren, Plasminogen-Aktivatoren und Komplement (R.F. Doolittle et al., CSH Symp. 51, 447 (1986)).
Es wurde ein Lymphozyten-Zelloberflächenglykoprotein (nachstehend als "LHR" bezeichnet) charakterisiert, das die Bindung von Lymphozyten an das Endothel von Lymphgewebe vermittelt. cDNA-Klone voller Länge und DNA, die für das Human- und Mäuse-LHR (HuLHR bzw. MLHR) kodiert, wurden identifiziert und isoliert; außerdem wird diese DNA problemlos in rekombinanten Wirtszellen exprimiert. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des HuLHR ist in 1 dargestellt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des MLHR ist in 2 dargestellt.
Es wird hierin aufgezeigt, dass das LHR ein Glykoprotein ist, das die folgenden Proteindomänen enthält: eine Signalsequenz, eine Kohlenhydrat-Bindungsdomäne, eine Epidermiswachstumsfaktor-ähnliche (egf-) Domäne, zumindest eine, vorzugsweise zwei Komplementbindungs-Domänen-Repetitionen, eine Transmembran-Bindungsdomäne (TMD) und eine geladene intrazelluläre oder Zytoplasma-Domäne.
Eine erfolgreiche Strategie bei der Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung zahlreicher Abnormalitäten der Liganden-Bindungspartner-Wechselwirkungen war die Identifizierung von Antagonisten, welche die Bindung oder Wechselwirkung zwischen Ligand und Bindungspartner blockieren. Eine Methodologie war die Verwendung eines exogenen Bindungspartners als kompetitiver Antagonist für den nativen Bindungspartner. Viele Liganden-Bindungspartner sind jedoch Zellmembranproteine, die in der Lipiddoppelschicht von Zellen verankert sind. Die Gegenwart von Membrankomponenten ist typischerweise vom Standpunkt der Herstellung und Reinigung unerwünscht. Da außerdem diese Moleküle nur auf Zelloberflächen vorhanden sind, wäre es wünschenswert, sie in einer Form zu produzieren, die im Blutkreislauf stabiler ist. Sogar verkürzte oder lösliche Liganden-Bindungspartner sind möglicherweise als Therapeutika nicht optimal, da sie eine relativ kurze in vivo-Plasma-Halbwertszeit besitzen, da sie möglicherweise nicht die Plazentar- oder andere biologische Schranken überwinden und da das Maskieren ihrer Liganden-Erkennungsstelle ohne Bereitstellung einer Effektorfunktion möglicherweise für therapeutische Zwecke nicht ausreicht.
Demzufolge ist es ein Ziel der Erfindung, Liganden-Bindungspartner zu produzieren, die mit Gruppen fusioniert sind, die dazu dienen, die in vivo-Plasma-Halbwertszeit des Liganden-Bindungspartners zu verlängern, d.h. Immunglobulin-Domänen, und seine Reinigung durch Protein A vereinfachen. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung neuer Hybrid-Immunglobulin-Moleküle, welche die adhäsiven und Targeting-Eigenschaften eines Liganden-Bindungspartners mit Immunglobulin-Effektorfunktionen, wie z.B. Komplementbindung, Zellrezeptorbindung und dergleichen, kombinieren. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von Molekülen mit neuen Funktionalitäten (z.B. die oben beschriebenen) für therapeutische Anwendungen oder zur Verwendung als diagnostische Reagenzien für den in vitro-Assay der Liganden-Bindungspartner oder ihrer Ziele. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung multifunktioneller Moleküle, in denen eine Vielzahl an Liganden-Bindungspartnern (die gleich oder unterschiedlich sein können) angeordnet sind, wodurch die Moleküle zur Bindung und/oder Aktivierung mehr als eines Liganden befähigt werden.
Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, Moleküle zur Lenkung von Liganden-Bindungspartnern (z.B. Toxine, Zelloberflächen-Partner, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Hormone oder Effektormoleküle wie etwa Konstantdomänen-ähnliche Abschnitte eines Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie) zu Zellen, die Liganden für die Liganden-Bindungspartner tragen, und zur Erleichterung der Reinigung der Liganden-Bindungspartner herzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Liganden-Bindungspartner-Immunglobulin-Hybridheterodimeren, die zum Abzielen therapeutischer Gruppen auf spezifische Gewebe und Liganden verwendet werden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression dieser Moleküle in Rekombinations-Zellkultur.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Ziele der Erfindung werden durch Bereitstellung eines Immunglobulin-Schwerkettendimers nach Anspruch 1 erreicht.
Die neuen, hierin bereitgestellten Zusammensetzungen werden in pharmakologisch annehmbaren Vehikeln zur Verabreichung an Patienten gereinigt und formuliert, die antivirale, neuromodulierende oder immunmodulierende Therapie benötigen, und dienen auch zur Modulation von Zelladhäsion. Die Erfindung eignet sich besonders zur Behandlung von Patienten mit Rezeptor-vermittelten Abnormalitäten. Außerdem sind die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen nützliche Mittler bei der Reinigung des Liganden-Bindungspartners aus rekombinanter Zellkultur, worin Antikörper oder andere Substanzen, die zur Bindung der stabilen Plasmaprotein-Komponente fähig sind, zum Absorbieren der Fusion dienen oder sich für diagnostische Assays für den Liganden-Bindungspartner eignen, worin das stabile Plasmaprotein als indirekter Marker dient.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Aminosäure- und DNA-Sequenz des Human-LHR (HuLHR).
2 zeigt die Aminosäure- und DNA-Sequenz des Mäuse-LHR (MLHR).
3 veranschaulicht einen Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen für das reife HuLHR und MLHR.
Die 4A–4B stellen die Ergebnisse von Isolierung und N-terminaler Sequenzierung des MLHR dar. 4A zeigt die Gasphasen-Edman-Abbau-Ergebnisse einer 90.000 Dalton-Bande aus einem SDS-Polyacrylamidgel von Material, das aus einem Detergensextrakt von Mäusemilzen durch Affinitätschromatographie mit monoklonalem Mel 14-Antikörper gerinigt wurde. Die unterstrichenen Reste zwischen den Aminosäuren 7 und 15 wurden ausgewählt, um die in 4B gezeigte Oligonukleotidsonde zu produzieren. 4B stellt eine 32-fach redundante 26-Mer-Oligonukleotidsonde dar.
5 zeigt die transiente Expression des MLHR-cDNA-Klons. Die Spuren A-F bezeichnen Folgendes: A – Lysate von 293-Zellen, transfiziert mit einem MLHR-Expressionsplasmid, das mit monoklonalem Mel 14-Antikörper immungefällt wurde. B – Überstände von 293-Zellen, transfiziert mit einem MLHR-Expressionsplasmid, das mit monoklonalem Mel 14-Antikörper immungefällt wurde. C – Lysate von 293-Zellen, transfiziert mit einem Plasmid, welches das HIV-gp120-Hüllenglykoprotein exprimiert, das mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper immungefällt wurde. D – Überstände von 293-Zellen, transfiziert mit dem HIV-Hüllenexpressionsplasmid, das mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper immungefällt wurde. E – Überstände von 38C13- Zellen, die mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper immungefällt wurden. F – Lysate von 38C13-Zellen, die mit I¹²⁵ oberflächenmarkiert und mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper immungefällt wurden.
Die 6A–6C zeigen Proteinsequenzen, die heterolog, doch funktionell mit MLHR vergleichbar sind. Die mit "MLHR" versehenen Linien entsprechend dem MLHR aus 2. 6A vergleicht Kohlenhydrat-Bindungsdomänen; 6B vergleicht Epidermiswachstumsfaktor-Domänen; und 6C vergleicht Komplement-Bindungsfaktor-Domänen.
7 ist eine schematische Darstellung von Proteindomänen im LHR, einschließlich der Signalsequenz, der Kohlenhydrat-Bindungsdomäne, der Epidermiswachstumsfaktor-Domäne (egf-Domäne), zweier Komplement-Bindungsdomänen-Repetititionen (Pfeile), der Transmembranbindungsdomäne (TMD) und der geladenen intrazellulären Domäne.
8 zeigt die Konstuktion von MLHR-IgG-Chimären, welche die Lectin-, Lectin-egf- und Lectin-egf-Komplement-Regulationsmotive enthalten.
9 veranschaulicht die Gelelektrophorese der Produkte der Expression und Reinigung der MLHR-IgG-Chimären.
10 zeigt die Polyphosphomannanester-(PPME-) Bindungsanalyse verschiedener MLHR-IgG-Chimären.
Detaillierte Beschreibung
Liganden-Bindungspartner sind hierin als Proteine definiert, die sich bekanntermaßen spezifisch an Ligandenmoleküle binden und im Allgemeinen in ihrem nativen Zustand als sekretierte oder membrangebundene Polypeptide vorgefunden werden; membrangebundene Liganden-Bindungspartner enthalten typischerweise eine hydrophobe Transmembran-Region oder einen Phospholipid-Anker. Liganden-Bin dungspartner enthalten Rezeptoren und Trägerproteine sowie Hormone, Zelladhäsionsproteine (Proteine, welche die Adhäsion einer Zelle an eine andere lenken oder induzieren), Lectin-Bindungsmoleküle, Wachstumsfaktoren, Enzyme und dergleichen. CD-Antigene, die keine Mitglieder der Immunglobulin-Gen-Überfamilie sind oder aus anderen Gründen ausscheiden (siehe obige Ausführungen), sind geeignete Liganden-Bindungspartner (Knapp et al., Immunology Today 10(8), 253–258 (1989)). Der Insulinrezeptor kann gegebenenfalls ein Liganden-Bindungspartner sein. Liganden-Bindungspartner enthalten nicht nur die native Form voller Länge, sondern auch Kürzungen oder andere Aminosäuresequenz-Varianten, die nach wie vor zur Bindung an den normalen Liganden fähig sind.
Der Ausdruck "Liganden-Bindungspartner" schließt hierin polymorphe und nichtpolymorphe Mitglieder der Immunglobulin-Gen-Überfamilie sowie Proteine, die dazu homolog sind, z.B. die wesentlichen Histokompatibilitätsantigene der Klasse I und II, Immunglobuline, T-Zellen-Rezeptor, α-, β-, γ- und δ-Ketten, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, die γ-, δ- und ε-Ketten von CD3, OX-2-, Thy-1, die interzellulären oder neuralen Zelladhäsionsmoleküle (1-CAM oder N-CAM), Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen-3 (LFA-3), neurozytoplasmatisches Protein (NCP-3), Poly-Ig-Rezeptor, Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), IgE-Rezeptor hoher Affinität, das Haupt-Glykoprotein von peripherem Myelin (Po), von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor, Koloniestimulationsfaktor-1-Rezeptor, Makrophagen-Fc-Rezeptor, Fc-γ-Rezeptoren und karzinoembryonales Antigen, spezifisch aus. Homolog zu einem Mitglied der Immunglobulin-Gen-Überfamilie bedeutet (nur zum Zweck dieser ausschließenden Definition) das Aufweisen der Sequenz eines Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie oder einer Sequenz darin, die im Wesentlichen die gleiche (oder eine höhere) Aminosäuresequenz-Homologie mit einem bekannten Mitglied der Überfamilie aufweist wie die konkreten oben angeführten Beispiele mit der Sequenz einer variablen oder konstanten Immunglobulin-Domäne. Man beachte, dass dies keine Ausführungsformen ausschließt, in denen eine Liganden-Bindungspartner-Fusion zu einem Multimer mit zusätzlich einem Mitglied oder einer Fusion eines Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie zusammengesetzt ist.
Spezifisch vom Ausdruck "Liganden-Bindungspartner" ausgenommen sind hierin auch aus mehreren Untereinheiten (Ketten) bestehende Polypeptide, für die diskrete Gene kodieren (Gene, die nicht für ein einkettiges Vorläufer-Polypeptid kodieren, das zum aus mehreren Untereinheiten bestehenden Polypeptid führt), wobei zumindest eine Untereinheit des Polypeptids üblicherweise in die Zellmembran insertiert ist, z.B. zelluläre Rezeptoren (etwa Integrine) für Extrazellulärmatrixmoleküle, wie sie in WO 90/06953, veröffentlicht am 28. Juni 1990 geoffenbart sind. Man beachte, dass dies keine Ausführungsformen ausschließt, in denen eine Liganden-Bindungspartner-Fusion zu einem Multimer mit zusätzlich einem aus mehreren Untereinheiten bestehenden Polypeptid oder einer Fusion eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Polypeptids (wie in diesem Absatz definiert) zusammengesetzt ist.
Der Bindungspartner ist kein LHR. Das LHR ist als Polypeptid mit qualitativer biologischer Aktivität definiert, die es mit dem LHR aus 1 oder 2 gemeinsam hat, und enthält vorzugsweise eine Domäne, die zu mehr als 70 % mit der Kohlenhydrat-Bindungsdomäne, der Epidermiswachstumsfaktor-Domäne oder der Kohlenhydrat-Bindungsdomäne des LHR aus 1 oder 2 homolog ist.
Homologie in Bezug auf eine LHR ist hierin als Prozentsatz von Resten in der Kandidatensequenz definiert, die mit den Resten in der Kohlenhydrat-Bindungsdomäne, der Epidermiswachstumsfaktor-Domäne oder den Komplement-Bindungsdomänen aus 1 oder 2 nach dem Ausrichten der Sequenzen und gegebenenfalls der Einführung von Lücken zur Erreichung der maximalen prozentuellen Homologie identisch sind.
Innerhalb des Bedeutungsumfangs des hierin definierten LHR sind LHRs mit Aminosäuresequenzen des HuLHR oder MLHR (siehe 1 oder 2), deglykosylierte oder unglykosylierte Derivate des LHR, homologe Aminosäuresequenz-Varianten der Sequenz aus 1 oder 2 und homologe in vitro erzeugte Varianten und Derivate des LHR enthalten, die biologische Aktivität in Übereinstimmung mit dem LHR aus 1 oder 2 aufweisen können.
Biologische Aktivität eines LHR oder LHR-Fragments ist entweder als 1) immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop des LHR oder als 2) Besitz zumindest einer adhäsiven, regulatorischen oder Effektor-Funktion definiert, die qualitativ mit dem LHR übereinstimmt.
Ein Beispiel für die qualitativen biologischen Aktivitäten des LHR ist seine Bindung an Liganden auf den spezialisierten Endothel-reichen Zellen der Lymphoidgewebe. Außerdem ist häufig ein zweiwertiges Kation, wie z.B. Calcium, für die Ligandenbindung erforderlich.
"Immunologisch kreuzreaktiv" bedeutet hierin, dass das Kandidatenpolypeptid zur kompetitiven Hemmung der qualitativen biologischen Aktivität des LHR, das diese Aktivität aufweist, mit polyklonalen Antiseren, die gegen das bekannte aktive Analog gerichtet sind, fähig ist. Solche Antiseren werden in herkömmlicher Weise erzeugt, indem z.B. Ziegen oder Kaninchen subkutan mit dem bekannten aktiven Analog in vollständigem Freund-Adjuvans injiziert werden, gefolgt von intraperitonealer oder subkutaner Auffrischungsinjektion in unvollständigem Freund-Adjuvans.
Strukturell enthält das LHR wie aus 3 ersichtlich – mehrere Domänen, die wie folgt definiert sind (innerhalb von ± 10 Resten): eine Signalsequenz (Reste 20–32), gefolgt von einer Kohlenhydrat-Bindungsdmäne (in 3 als "Lectin"-Domäne identifiziert) (Reste 39–155), einer Epidermiswachstumsfaktor-Domäne (egf-Domäne) (Reste 160–193), einer Komplementfaktor-Bindungsdomäne (Reste 197–317), einer Transmembranbindungs-Domäne (TMD) (Reste 333–355) und einer Zytoplasma-Domäne (Reste 356–372). Die Grenze der extrazellulären LHR-Domäne liegt im Allgemeinen am – oder innerhalb von etwa 30 Resten des – N-Terminus der Transmembran-Domäne und lässt sich anhand einer Kontrolle der LHR-Sequenz problemlos identifizieren. Beliebige oder alle dieser Domänen werden bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet.
Die 6A–6C zeigen eine Vielzahl an Proteinen mit etwas Homologie zu drei dieser Domänen. 6A zeigt Kohlenhydrat-Bindungsdomänen, 6B veranschaulicht Epidermiswachstumsfaktor-Domänen, und 6C stellt etwas homologe Komplement-Bindungsdomänen dar.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von HuLHR und MLHR ist in 3 zu sehen; man erkennt einen hohen Grad an Gesamtsequenzhomologie (~ 83 %). Die Homologiegrade zwischen den verschiedenen Domänen im HuLHR gegenüber MLHR sind jedoch variabel. Beispielsweise beträgt der Grad an Sequenzkonservierung zwischen MLHR und HuLHR sowohl in Kohlenhydrat-Bindungsdomänen als auch in egf-Domänen etwa 83 %, während der Konservierungsgrad in der ersten Komplement-Bindungsrepetition auf 79 % und in der zweiten Repetition auf nur 63 % abfällt (bei einer Komplement-Bindungsdomänen-Gesamthomologie von ~ 71 %). Während die zwei MLHR-Komplement-Bindungsdomänen-Repetitionen identisch sind, weisen jene im HuLHR Unterschiede auf und unterscheiden sich auch von den Mäuserepetitionen. Interessanterweise ist der Konservierungsgrad zwischen den zwei Rezeptoren in der Transmembran-Sequenz und den umgebenden Regionen praktisch identisch, wobei nur eine konservative hydrophobe Substitution vorliegt (wahrscheinlich in der Transmembran-Ankerregion).
Das oben besprochene Oberflächen-Glykoprotein, das durch die Reihe monoklonaler und polyklonaler Antikörper erkannt wird (mit dem generellen Ausdruck Hermes bezeichnet), ist spezifisch aus dem Schutzbereich der Erfindung ausgenommen.
Immunglobuline und bestimmte ihrer Varianten sind bekannt, und viele von ihnen wurden in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Siehe z.B. die US-A-4.745.055; EP-A-256.654; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP-A-120.694; EP-A-125.023; Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Köhler et al., P.N.A.S. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al., P.N.A.S. USA 81, 6851 (1984); EP-A-255.694; EP-A-266.663; und WO 88/03559. Neu zusammengesetzte Immunglobulin-Ketten sind auch bekannt. Siehe z.B. die US-A-4.444.878; WO 88/03565; und EP-A-68.763 sowie die dort angegebenen Verweise.
Der Liganden-Bindungspartner ist C-terminal mit dem N-Terminus der konstanten Region von Immunglobulin-Schwerketten, die zumindest die Hinge-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Schwerkettenregion beibehalten, anstelle der variablen Region(en) davon fusioniert. Die Rransmembran-Regionen oder Lipid- oder Phospholipid-Ankererkennungssequenzen von Liganden-Bindungspartnern, die solche Regionen oder Sequenzen umfassen, werden vorzugsweise vor der Fusion inaktiviert oder deletiert.
Solche Fusionen behalten zumindest funktionell aktive Hinge-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen erfolgen auch unmittelbar N-terminal zum CH1 der Schwerkette. Dies wird üblicherweise durchgeführt, indem die geeignete DNA-Sequenz konstruiert und in rekombinanter Zellkultur exprimiert wird. Alternativ dazu können jedoch die Polypeptide der Erfindung gemäß bekannter Verfahren synthetisiert werden.
Die genaue Stelle, an der die Fusion durchgeführt wird, ist nicht entscheidend; bestimmte Stellen sind allgemein bekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften des Bindungspartners zu optimieren. Die optimale Stelle wird in Routineversuchen ermittelt.
Die Hybridimmunglobuline werden als Dimere zusammengesetzt. Im Allgemeinen besitzen diese zusammengesetzten Immunglobuline bekannte Struktureinheiten, die durch die folgenden schematischen Darstellungen beschrieben werden.
In den hierin angeführten schematischen Darstellungen bezieht sich "A" auf zumindest einen Teil eines Liganden-Bindungspartners, der eine Liganden-Bindungsstelle enthält, die zur Bindung ihres Liganden fähig ist; X ist ein Zusatzmittel, das ein weiterer funktioneller Liganden-Bindungspartner (gleich wie A oder unterschiedlich) ist; und C_H stellt konstante Schwerkettendomänen eines Immunglobulins dar. Homodimer:
Heterodimer:
Es ist zu beachten, dass diese schematischen Darstellungen lediglich veranschaulichend sind und dass man davon ausgehen kann, dass die Ketten der Multimere in gleicher Weise wie native Immunglobuline durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. Gemäß der Erfindung werden Hybridimmunglobuline problemlos aus mit der geeigneten Nukleinzelle transformierten Säugetierzellen sekretiert. Die sekretierten Formen sind jene, in denen das Bindungspartner-Epitop in Schwerketten-Dimeren vorhanden ist.
Man geht davon aus, dass die Zusammensetzungen der Erfindung, in denen ein biologisch aktiver Abschnitt eines Liganden-Bindungspartners für die variablen Regionen eines Immunglobulin-Schwerkettendimers substituiert ist, eine verbesserte in vivo-Plasma-Halbwertszeit aufweisen. Diese Hybrid-Immunglobuline sind ähnlich aufgebaut wie die Konstrukte, in denen eine Immunglobulin-ähnliche Domäne für die variable Domäne eines Immunglobulins substituiert ist; siehe z.B. Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 2936–2940 (1987); und EP 0 325 224 A2 . Die Hybrid-Immunglobuline der Erfindung sind auch ähnlich konstruiert wie Antikörper-Chimären, in denen eine variable Domäne aus einem Antikörper einer Spezies für die variable Domäne einer anderen Spezies substituiert ist. Siehe z.B. EP-A-0.125.023; Munro, Nature 312 (13. Dezember 1984); Neuberger et al., Nature 312 (13. Dezember 1984); Sharon et al., Nature 309 (24. Mai 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984); Morrison et al., Science 229, 1202–1207 (1985); und Boulianne et al., Nature 312, 643–646 (13. Dezember 1984). Die für den Bindungspartner kodierende DNA wird mit einem Restriktionsenzym am oder in der Nähe vom 3'-Ende der für die gewünschte(n) Bindungspartner-Domäne(n) kodierenden DNA oder an einem Punkt an oder nahe der DNA, die für das N-terminale Ende des reifen Polypeptids kodiert (worin die Verwendung eines unterschiedlichen Leaders möglich ist), oder in oder nahe der N-terminalen Kodierregion für den Bindungspartner (wenn ein natives Signal verwendet wird) gespalten. Dieses DNA-Fragment wird dann problemlos in die für eine konstante Immunglobulin-Schwerkettenregion kodierende DNA insertiert und gegebenenfalls durch Deletionsmutagenese zugeschnitten. Vorzugsweise handelt es sich um Human-Immunglobulin, wenn die Variante für die in vivo-Therapie beim Menschen vorgesehen ist.
Für konstante Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerketten kodierende DNA ist bekannt, aus cDNA-Banken erhältlich oder wird synthetisiert. Siehe beispielsweise Adams et al., Biochemistry 19, 2711–2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19, 2802-270 (1980); Dolby et al., P.N.A.S. USA 77, 6027–6031 (1980); Rice et al., P.N.A.S. USA 79, 7862–7865 (1982); Falkner et al., Nature 298: 286–288 (1982); und Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239–256 (1984).
Hierin werden für das LHR ködierende Sequenzen bereitgestellt. DNA-Sequenzen, die für andere gewünschte Bindungspartner kodieren und bekannt oder problemlos aus cDNA-Banken erhältlich sind, eignen sich ebenfalls für die praktische Durchführung der Erfindung.
Für eine Fusion der Erfindung kodierende DNA wird zur Expression in eine Wirtszelle transfiziert. Die Wirtszelle wird mit DNA transformiert, die für jede Kette kodiert, die das Multimer bildet, wobei die Wirtszelle optimalerweise so ausgewählt wird, dass sie die Ketten der Multimere in der gewünschten Weise zusammensetzen kann.
Allgemein hat sich herausgestellt, dass die Fusionen intrazellulär exprimiert und gut sekretiert werden, doch hinsichtlich des Sekretionsgrads verschiedener Fusionen aus rekombinanten Wirten liegt üblicherweise ein hohes Ausmaß an Variation vor.
Die Erfindung betrifft auch Aminosäuresequenz-Varianten des Bindungspartners. Aminosäuresequenz-Varianten des Bindungspartners werden unter Verfolgung verschiedener Ziele hergestellt, z.B. zur Steigerung der Affinität des Bindungspartners für seinen Liganden, zur Verbesserung der Stabilität sowie zur Vereinfachung der Reinigung und Erzeugung des Bindungspartners, zur Modifizierung seiner Plasma-Halbwertszeit, zur Erhöhung des therapeutischen Wirkungsgrads und zur Minderung des Schweregrads oder Auftretens von Nebenwirkungen während des therapeutischen Einsatzes des Bindungspartners. Die nachstehende Besprechung betrifft Aminosäuresequenz-Varianten des LHR, Beispiele für Varianten, die für die Liganden-Bindungspartner der Erfindung ausgewählt werden können.
Aminosäuresequenz-Varianten des Liganden-Bindungspartners fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: Insertions-, Substitutions- oder Deletionsvarianten. Diese Varianten werden üblicherweise durch stellenspezifische Mutagenese von Nukleotiden in der für den Liganden-Bindungspartner kodierenden DNA (wodurch für die Variante kodierende DNA erhalten wird) und durch anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur erzeugt. Fragmente mit bis zu etwa 100–150 Aminosäureresten werden jedoch günstigerweise durch in vitro-Synthese hergestellt. Die folgende Diskussion betrifft gleichermaßen jeden Liganden-Bindungspartner, sofern er auf die Strutur oder Funktion davon anwendbar ist.
Die Aminosäuresequenz-Varianten des Liganden-Bindungspartners sind vorbestimmte Varianten, die in der Natur oder natürlich vorkommenden Allelen nicht existieren. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität (z.B. Liganden-Bindungsaktivität) auf wie das natürlich vorkommende Analog. Doch die Varianten und Derivate, die sich nicht an ihre Liganden binden können, sind trotzdem nützlich als (a) Reagens in diagnostischen Assays auf den Liganden-Bindungspartner oder Antikörper dagegen, (b) wenn sie gemäß bekannter Verfahren als Mittel zur Reinigung von Anti-Liganden-Bindungspartner-Antikörpern aus Antiseren oder Hybridom-Kulturüberständen insolubilisiert werden, und (c) als Immunogene zur Bildung von Antikörpern gegen den Liganden-Bindungspartner oder als Immunassay-Setkomponenten (markiert als kompetitives Reagens für den nativen Ligan den-Bindungspartner, oder unmarkiert als Standard für den Liganden-Bindungspartner-Assay), sofern zumindest ein Liganden-Bindungspartner aktiv bleibt.
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt ist, muss die Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistung einer Mutation an einer konkreten Stelle zu optimieren, erfolgt Zufalls- oder Sättigungsmutagenese (worin alle 20 möglichen Reste insertiert werden) am Zielcodon, und die exprimierte Variante wird hinsichtlich der optimalen Kombination gewünschter Aktivitäten gescreent. Ein solches Screenen ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Aminosäure-Insertionen betreffen üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminoäsuren; Substitutionen werden typischerweise für Einzelreste eingefügt; und Deletionen reichen von etwa 1 bis 30 Resten. Deletionen oder Insertionen erfolgen vorzugsweise in angrenzenden Paaren, d.h. eine Deletion von 2 Resten oder Insertion von 2 Resten. Es geht unmissverständlich aus der folgenden Besprechung hervor, dass Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder jede Kombination davon eingeführt oder kombiniert werden, um ein Endkonstrukt zu erzielen.
Insertions-Aminosäuresequenz-Varianten des Liganden-Bindungspartners sind jene, in denen eine oder mehrere Aminosäurereste außerhalb des Liganden-Bindungspartners an einer vorbestimmten Stelle im Ziel-LHR eingeführt sind und die bestehenden Reste verdrängen.
Üblicherweise sind Insertionsvarianten Fusionen heterologer Proteine oder Polypeptide mit dem Amino- oder Carboxylterminus des Liganden-Bindungspartners. Solche Varianten werden als Fusionen des Liganden-Bindungspartners und eines Polypeptids bezeichnet, umfassend eine Sequenz, die eine andere als jene ist, die normalerweise im Liganden-Bindungspartner an der insertierten Position zu finden ist. Mehrere Gruppen von Fusionen sind gemäß der Erfindung möglich.
Die neuen Polypeptide der Erfindung eignen sich bei der Diagnostik oder Reinigung des Liganden-Bindungspartners durch an sich bekannte Immunaffinitäts-Techniken. Alternativ dazu werden die neuen Polypeptide bei der Reinigung des Bindungspartners dazu verwendet, die Fusion aus unreinen Gemischen zu adsorbieren; anschließend wird die Fusion eluiert und gegebenenfalls der Bindungspartner aus der Fusion gewonnen, z.B. durch enzymatische Spaltung.
Gewünschte Fusionen des Bindungspartners, die immunologisch sein können auch oder nicht, umfassen Fusionen der reifen Bindungspartner-Sequenz mit einer Signalsequenz, die zum Bindungspartner heterolog ist.
Gegebenenfalls werden Signalsequenz-Fusionen dazu verwendet, die Sekretion des Liganden-Bindungspartners rascher zu lenken. Das heterologe Signal ersetzt das native Liganden-Bindungspartnersignal, und wenn die resultierende Fusion erkannt – d.h. durch die Wirtszelle verarbeitet und gespalten – wird, wird der Liganden-Bindungspartner sekretiert. Signale werden auf der Basis der beabsichtigten Wirtszelle ausgewählt und können bakterielle, Hefe-, Säugetier- und virale Sequenzen umfassen. Das native LHR-Signal oder das Herpes gD-Glykoprotein-Signal ist zur Verwendung in Säugetier-Expressionssystemen geeignet.
Substitutionsvarianten sind jene, worin zumindest ein Rest der Sequenz aus 1 oder 2 entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle insertiert wurde. Solche Substitutionen erfolgen im Allgemeinen gemäß der nachstehenden Tabelle 1, wenn gewünscht wird, die Eigenschaften des Liganden-Bindungspartners einer Feinabstimmung zu unterziehen.
TABELLE 1
Neue Aminosäuresequenzen sowie isostere Analoge (Aminosäure oder andere) sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten.
Substanzielle Veränderungen der Funktion oder immunologischen Identität erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die weniger konservativ als jene von Tabelle 1 sind, d.h. durch Auswählen von Resten, die sich in ihrer Auswirkung auf Folgendes signifikanter unterscheiden: (a) die Aufrechterhaltung der Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) die Masse der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen man im Allgemeinen die stärksten Veränderungen der Eigenschaften erwartet, sind jene, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert ist, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Protein für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Asparagyl, substituiert ist; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert ist.
Einige Deletionen, Insertionen und Substitutionen führen zu keinen radikalen Veränderungen der Eigenschaften des Moleküls. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion im Vorhinein vorherzusagen, z.B. beim Modifizieren einer Kohlenhydrat-Bindungsdomäne oder eines Immunepitops, wird der Effekt – wie dies Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist – durch Routine-Screeningassays bewertet. Beispielsweise wird eine Variante typischerweise durch stellenspezifische Mutagenese der kodierenden Nukleinsäure, Expression der Nukleinsäure-Variante in rekombinanter Zellkultur und gegebenenfalls Reinigung aus der Zellkultur, z.B. durch Immunaffinitäts-Adsorption auf einer polyklonalen Säule (um die Variante zumindest über ein verbleibendes Immunepitop zu adsorbieren), erzeugt. Die Aktivität des Zelllysats oder der gereinigten Variante wird dann in einem geeigneten Screeningassay auf die gewünschte Eigenschaft gescreent. Beispielsweise wird eine Veränderung im immunologischen Charakter, z.B. Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch einen kompetitiven Immunassay gemessen. Modifikationen von Proteineigenschaften wie Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Sensibilität gegenüber proteolytischem Abbau oder Neigung zur Aggregatbildung mit Trägern oder zu Multimeren werden durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren untersucht.
Eine weitere Klasse von Varianten sind Deletionsvarianten. Deletionen sind durch die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäurereste aus der Sequenz gekennzeichnet.
Die Inaktivierung der Transmembran-Domäne des Liganden-Bindungspartners, typischerweise durch Deletion oder Substitution von Transmembran-Domänen-Hydroxylierungsreste, erleichtert die Gewinnung und Formulierung, indem ihre Zell- oder Membran-Lipidaffinität reduziert und ihre Löslichkeit in Wasser verbessert wird. Wenn die Transmembran- und Zytoplasma-Domänen deletiert werden, vermeidet man die Einsetzung potenziell immunogener Epitope, entweder durch Exposition von ansonsten intrazellulären Polypeptiden, die vom Körper als fremd erkannt werden könnten, oder durch Insertion heterologer Polypeptide, die potenziell immunogen sind. Die Inaktivierung der Membran-Bindungsfunktion erfolgt durch Deletion ausreichender Reste, um ein im Wesentlichen hydrophiles Hydropathieprofil an dieser Stelle zu erzeugen, oder durch Substitution mit heterologen Resten, was das gleiche Ergebnis erzielt.
Ein Hauptvorteil des transmembran-inaktivierten Liganden-Bindungspartners liegt darin, dass er in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert werden kann. Die Variante ist in Körperflüssigkeiten wie z.B. Blut löslich und besitzt keine auffallende Affinität für Zellmembranlipide, wodurch die Gewinnung aus rekombinanter Zellkultur beträchtlich vereinfacht wird.
Allgemein gesagt besitzen alle Varianten keine funktionelle Transmembran-Domäne und weisen vorzugsweise keine funktionelle Zytoplasma-Sequenz auf.
Beispielsweise kann die Transmembran-Domäne mit jeder beliebigen Aminosäuresequenz substituiert sein, z.B. eine Zufalls- oder eine vorbestimmte Sequenz von etwa 5 bis 50 Serin-, Threonin-, Lysin-, Arginin-, Glutamin-, Asparaginsäure- und anderen hydrophilen Resten, die alle ein hydrophiles Hydropathieprofil aufweisen. Diese Varianten werden in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert.
Kovalente Modifikationen des Moleküls sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten. Solche Modifikationen werden eingeführt, indem abgezielte Aminosäurereste des gewonnenen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren kann, oder indem man sich die Mechanismen posttranslationeller Modifikation, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen funktionieren, zunutze macht. Solche Modifikationen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden ohne großen experimentellen Aufwand durchgeführt.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln eignet sich zur Herstellung intermolekularer Aggregate des Hybrid-Immunglobulins mit Polypeptiden sowie zur Vernetzung des Hybrid-Immunglobulins mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Assay oder bei der Affinitätsreinigung der Liganden. Eine Studie der Vernetzungen innerhalb der Kette liefert außerdem direkte Informationen über die Konformationsstruktur. Üblicherweise verwendete Vernetzer sind 1,1-Bis(Diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester wie etwa Dissuccinimidester, z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Meleimide wie z.B. Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie etwa Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]pripioimidat liefern lichtaktivierbare Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht Vernetzungen bilden können. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrices, wie z.B. Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die systemreaktiven Substrate (beschrieben in den US-Patenten 3.959.080; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; und 4.330.440) für die Proteinimmobilisierung und Vernetzung verwendet.
Bestimmte posttranslationelle Derivatisierungen sind das Ergebnis der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslationell zu den korrespondierenden Glutamyl- und Asparagylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Schutzumfang der Erfindung.
Andere posttranslationelle Modifikationen sind die Hydroxylierung von Proliin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung des C-terminalen Carboxyls.
Andere Derivate umfassen die neuen Polypeptide der Erfindung, die kovalent mit einem nichtproteinhaltigen Polymer verbunden sind. Das nichtproteinhaltige Polymer ist normalerweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das ansonsten nicht in der Natur anzutreffen ist. Polymere, die jedoch in der Natur vorkommen und durch Rekombinations- oder in vitro-Methoden produziert werden, sind ebenso geeignet wie Polymere, die aus der Natur isoliert werden. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Schutzbereich der Erfindung, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders gut geeignet sind Polyalkylenether, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyoxyethylenester oder Methoxypolyethylenglykol; Polyoxyalkylene, wie z.B. Polyoxyethylen, Polyoxypropylen und Blockcopolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronics); Polymethacrylate; Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, umfassend die Saccharidmonomere D-Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Glucuronsäure, Sialinsäure, D-Galacturonsäure, D-Mannuronsäure (z.B. Polymannuronsäure oder Alginsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure, umfassend Homopolysaccharide und Heteropolysaccharide, wie z.B. Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glykogen oder die Polysaccharideinheit von Säuremucopolysacchariden, z.B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen, wie z.B. Polysorbit und Polymannit; sowie Heparin oder Heparon.
Wenn das Polysaccharid die native Glykosylierung oder die Glykosylierung bei der rekombinanten Expression ist, kann sich die Substitutionsstelle an einer anderen Stelle als einer nativen N- oder O-gebundenen Glykosylierungsstelle befinden, wenn eine zusätzliche oder substituierende N- oder O-gebundene Stelle in das Molekül eingeführt wurde. Gemische solcher Polymere sind möglich, oder das Polymer kann homogen sein. Das Polymer braucht vor der Vernetzung nicht wasserlöslich zu sein, ist es jedoch vorzugsweise; das Endkonjugat muss jedoch wasserlöslich sein. Außerdem sollte das Polymer in Konjugatform nicht stark immunogen sein und auch keine Viskosität aufweisen, die mit intravenöser Infusion oder Injektion unverträglich ist, wenn es auf diesem Wege verabreicht werden soll.
Vorzugsweise enthält das Polymer nur eine einzige Gruppe, die reaktiv ist. Dies trägt zur Vermeidung der Vernetzung von Proteinmolekülen bei. Es liegt jedoch im erfindungsgemäßen Schutzbereich, Reaktionsbedingungen zur Verringerung der Vernetzung zu optimieren oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder chromatographische Siebe zu reinigen, um im Wesentlichen homogene Derivate zu gewinnen.
Das Molekulargewicht des Polymers kann günstigerweise von etwa 100 bis 500.000 reichen, vorzugsweise von etwa 1.000 bis 20.000. Das gewählte Molekulargewicht hängt von der Beschaffenheit des Polymers und dem Substitutionsgrad ab. Im Allgemeinen gilt: je stärker die Hydrophilie des Polymers und der Substitutionsgrad, desto niedriger das Molekulargewicht, das verwendet werden kann. Optimale Molekulargewichte werden durch Routineversuche ermittelt.
Das Polymer ist hierin im Allgemeinen kovalent mit dem Hybrid-Immunglobulin verbunden (durch einen multifunktionellen Vernetzer, der mit dem Polymer und einer oder mehreren Aminosäuren oder einem oder mehreren Zuckerresten des Hybrids reagiert). Es liegt jedoch im Schutzbereich der Erfindung, direkt mit dem Polymer zu vernetzen, indem ein derivatisiertes Polymer mit dem Hybrid derivatisiert wird oder umgekehrt.
Die kovalente Vernetzungsstelle auf dem Hybrid-Immunglobulin enthält die N-terminale Aminogruppe und ε-Aminogruppen auf Lysinresten sowie andere Amino-, Imino-, Carboxyl-, Sulfhydryl-, Hydroxyl- oder andere hydrophile Gruppen. Das Polymer kann ohne die Verwendung eines multifunktionellen (üblicherweise bifunktionellen) Vernetzers direkt mit dem Hybrid kovalent verbunden werden. Kovalente Bindung an Aminogruppen erfolgt durch bekannte Chemien auf der Grundlage von Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, Aldehyd-reaktiven Gruppen (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid oder PEG-Chlorid plus das Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, Succinimidyl-aktive Ester, aktivertes Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorphenylchlorformiat- oder p-Nitrophenylchlorformiat-aktivertes PEG. Carboxylgruppen werden durch Verbindung von PEG-Amin unter Einsatz von Carbodiimid derivatisiert.
Polymere werden mittels Chemikalien, z.B. Metaperiodat, oder Enzymen, z.B. Glucose- oder Galactose-Oxidase (beide produzieren das Aldehydderivat des Kohlenhydrats) durch Oxidation an Oligosaccharidgruppen gebunden, gefolgt von der Reaktion mit Hydrazid oder aminoderivatisierten Poylmeren (siehe Heitzmann et al., P.N.A.S. 71, 3537–3541 (1974), oder Bayer et al., Methods in Enzymology 62, 310 (1979)), um die Markierung von Oligosacchariden mit Biotin oder Avidin durchzuführen. Auch andere chemische oder enzymatische Verfahren, die schon bisher dazu dienten, Oligosaccharide und Polymere zu verbinden, sind geeignet. Substituierte Oligosaccharide sind besonders vorteilhaft, da es im Allgemeinen weniger Substitutionen als Aminosäurestellen für die Derivatisierung gibt und die Oligosaccharid-Produkte demnach homogener sind. Die Oligosaccharid-Substituenten werden gegebenenfalls durch Enzymspaltung modifiziert, um Zucker zu entfernen, z.B. durch Neuraminidase-Spaltung, bevor die Polymer-Derivatisierung erfolgt.
Das Polymer trägt eine Gruppe, die direkt mit einer Aminosäure-Seitenkette oder dem N- oder C-Terminus des vorliegenden Polypeptids reaktiv ist oder die mit dem multifunktionellen Vernetzer reaktiv ist. Im Allgemeinen sind Polymere, die solche reaktiven Gruppen tragen, für die Herstellung immobilisierter Proteine bekannt. Um solche Chemien hier einzusetzen, sollte man ein wasserlösliches Polymer verwenden, das ansonsten in gleicher Weise wie unlösliche Polymere derivatisiert wird, die bislang für die Protein-Immobilisierung eingesetzt wurden. Bromcyan-Aktivierung ist ein besonders geeignetes Verfahren zum Vernetzen von Polysacchariden.
"Wasserlöslich" in Bezug auf das Ausgangspolymer bedeutet, dass das Polymer oder sein reaktives Zwischenprodukt zur Konjugation ausreichend wasserlöslich ist, um eine Derivatisierungsreaktion einzugehen.
"Wasserlöslich" in Bezug auf das Polymerkonjugat bedeutet, dass das Konjugat in physiologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Blut, löslich ist.
Der Substitutionsgrad mit einem derartigen Polymer variiert und hängt von der Anzahl reaktiver Stellen auf dem Protein und von folgenden Faktoren ab: ob das ganze Protein oder ein Fragment davon verwendet wird, ob das Protein eine Fusion mit einem heterologen Protein ist, vom Molekulargewicht, von der Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers und von den jeweils ausgewählten Protein-Derivatisierungsstellen. Im Allgemeinen enthält das Konjugat etwa 1 bis 10 Polymermoleküle, während heterologe Sequenzen mit einer im Wesentlichen unbegrenzten Anzahl an Polymermolekülen substituiert sein können, sofern die gewünschte Aktivität nicht stark negativ beeinflusst wird. Der optimale Vernetzungsgrad wird leicht durch eine Versuchsmatrix bestimmt, in der die Zeit, Temperatur und anderen Reaktionsbedingungen variiert werden, um den Substitutionsgrad zu verändern, wonach die Fähigkeit des Konjugats, in der gewünschten Weise zu funktionieren, bestimmt wird.
Das Polymer, z.B. PEG, wird durch eine Vielzahl an Verfahren vernetzt, die für die kovalente Modifizierung von Proteinen mit nicht-proteinhaltigen Polymeren wie z.B. PEG an sich bekannt sind. Bestimmte dieser Verfahren sind jedoch für die Zwecke der Erfindung nicht bevorzugt. Die Cyanurchlorid-Chemie führt zu vielen Nebenreaktionen, z.B. zur Proteinvernetzung. Außerdem ist es durchaus wahrscheinlich, dass sie zur Inaktivierung von Proteinen führt, die Sulfhydrylgruppen enthalten. Carbonyldiimidazol-Chemie (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131, 25–33 (1983)) erfordert einen hohen pH-Wert (> 8,5), der Proteine inaktivieren kann. Da außerdem das "aktivierte PEG"-Zwischenprodukt mit Wasser reagieren kann, ist ein sehr großer Molüberschuss an "aktiviertem PEG" gegenüber Protein erforderlich. Die hohen PEG-Konzentrationen, die für die Carbonyldiimidazol-Chemie notwendig sind, führen auch zu Problemen mit der Reinigung, da sowohl Gelfiltrations-Chromatographie als auch Hydrophob-Chromatographie negativ beeinflusst werden. Außerdem können die hohen Konzentrationen an "aktiviertem PEG" Protein fällen – ein Problem, das als solches bereits beschrieben wurde (Davis, US-A-4.179.337). Andererseits ist Aldehydchemie (Royer, US-A-4.002.531) effizienter; da sie nur einen 40 fachen Molüberschuss an PEG und ein- bis zweistündige Inkubation erfordert. Allerdings ist das von Royer zur Herstellung des PEG-Aldehyds vorgeschlagene Mangandioxid problematisch, da "die ausgeprägte Tendenz von PEG besteht, Komplexe mit metallbasierten Oxidationsmitteln zu bilden" (Harris et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, 341–352 (1984)). Die Anwendung von Moffatt-Oxidation unter Einsatz von DMSO und Essigsäureanhydrid löst dieses Problem. Außerdem muss das von Royer vorgeschlagene Natriumborhydrid bei hohem pH-Wert verwendet werden und weist die signifikante Tendenz auf, Disulfidbindungen zu reduzieren. Im Gegensatz dazu ist Natriumcyanoborhydrid, das bei neutralem pH-Wert wirksam ist und nur sehr wenig zur Reduktion von Disulfidbindungen neigt, bevorzugt.
Die Konjugate der Erfindung werden durch Gelfiltration von nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien getrennt. Heterologe Formen der Konjugate werden in gleicher Weise voneinander gereinigt.
Das Polymer kann auch wasserunlöslich als hydrophiles Gel oder geformter Gegenstand – z.B. als chirurgischer Schlauch in Form von Kathetern oder Dränageleitungen – vorliegen.
Für die Liganden-Bindungspartner kodierende DNA wird durch in vitro-Verfahren synthetisiert und problemlos aus cDNA-Banken erhalten. Die Möglichkeiten der synthetischen Herstellung von DNA (entweder manuell oder mit automatisierten Geräten) sind Fachleuten auf dem Gebiet im Allgemeinen bekannt, besonders im Lichte der hierin enthaltenen Lehren. Als Beispiele des aktuellen Wissensstandes betreffend die Polynukleotid-Synthese sei auf Maniatis et al., "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1984), und auf Horvath et al., "An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynukleoside 3'-Phosphoramidites", Methods in Enzymology 154, 313–326 (1987), verwiesen.
Im Allgemeinen werden Prokaryoten zum Klonieren von DNA-Sequenzen bei der Konstruktion der hierin geeigneten Vektoren verwendet. Beispielsweise ist E. coli K12-Stamm 294 (ATCCNr. 31446) besonders geeignet. Andere geeignete Mikrobenstämme sind E. coli B und E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sind lediglich veranschaulichend und nicht einschränkend. Alternativ dazu kommen in vitro-Klonierungsverfahren wie etwa Polymerase-Kettenreaktion in Frage.
Die Polypeptide der Erfindung werden in rekombinanter Zellkultur als N-terminales Methionylanalog oder als Fusion mit einem Polypeptid, das zum Hybrid/Abschnitt heterolog ist (vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des Hybrid/Abschnitts), direkt exprimiert.
Die neuartien Polypeptide können in jeder Wirtszelle exprimiert werden, werden aber vorzugsweise in Säugetierwirten synthetisiert. Wirtszellen aus Prokaryoten, Pilzen, Hefe, Insekten und dergleichen werden aber auch zur Expression verwendet. Beispiele für Prokaryoten sind die zum Klonieren geeigneten Stämme sowie E. coli W3110 (F^-, λ^-, prototroph, ATCC Nr. 27325), andere Enterobacteriaceae wie etwa Serratia marcescans, Bazillen und verschiedene Pseudomonaden. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren.
Expressionswirte werden typischeweise mit DNA transformiert, die für das Hybrid kodiert, das in einen Expressionsvektor ligiert wurde. Solche Vektoren tragen üblicherweise eine Replikationsstelle, obwohl dies nicht notwendig ist, wenn chromosomale Integration erfolgt. Expressionsvektoren enthalten auch Markersequenzen, die für phänotypische Selektion in transformierten Zellen sorgen können, wie dies weiter unten erläutert wird. Beispielswesie wird E. coli typischerweise mit pBR322, einem Plasmid, das aus einer E. coli-Spezies (Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)) abgeleitet ist, transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet somit eine einfache Möglichkeit der Identifizierung transformierter Zellen (zur Klonierung oder Expression). Expressonsvektoren enthalten optimalerweise auch Sequenzen, die sich für die Steuerung der Transkription und Translation eignen, z.B. Promotoren und Shine-Dalgarno-Sequenzen (für Prokaryoten) oder Promotoren und Enhancer (für Säugetierzellen). Die Promotoren können – müssen aber nicht – induzierbar sein; überraschenderweise stellte sich heraus, dass sogar leistungsstarke konstitutive Promotoren, wie etwa der CMV-Promotor für Säugetierwirte, das LHR ohne Wirtszellen-Toxizität produzieren. Während es vorstellbar ist, dass Expressionsvektoren keine Expressionssteuerung, replikative Sequenzen oder Selektionsgene aufweisen können, kann ihr Fehlen die Identifikation von Hybridtransformanten und die Erzielung hochgradiger Hybridimmunglobulin-Expression beeinträchtigen.
Promotoren, die sich zur Verwendung zusammen mit prokaryotischen Wirten eignen, sind beispielsweise die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, das Tryptophan-(trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), und EP-A-36.776) und Hybridpromotoren wie etwa der tac-Promotor (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Andere funktionelle bakterielle Promotoren kommen allerdings auch in Frage. Ihre Nukleotidsequenzen sind im Allgemeinen bekannt, wodurch sie Fachleute auf dem Gebiet operabel mit kodierender DNA ligieren können (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), wobei Linker oder Adaptoren zur Bereitstellung allenfalls erforderlicher Restriktionsstellen zum Einsatz kommen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-Sequenz (S.D.-Sequenz), die mit der kodierenden DNA operabel verbunden ist.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind auch eukaryotische Mikroben wie etwa Hefe oder Fadenpilze zufrieden stellend. Saccharomyces cerevisiae ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch einige andere Stämme üblicherweise zur Verfügung stehen. Das Plasmid YRp7 ist ein zufrieden stellender Expressionsvektor in Hefe (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für eine Stammmutante von Hefe lie fert, die keine Fähigkeit aufweist, sich in Tryptophan zu vermehren, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Charakteristikum des Hefe-Wirtszellengenoms schafft dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Detektieren der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Ander Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen steuerten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme im Zusammenhang mit dem Stickstoff-Stoffwechsel, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und die Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefe-Expression werden von R. Hitzeman et al., EP-A-73.657, beschrieben.
Expressions-Steuersequenzen sind für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene besitzen eine AT-reiche Region, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf von jener Stelle befindet, wo die Transkription eingeleitet wird. Eine weitere Sequenz 70 bis 80 Basen stromauf vom Start der Transkription zahlreicher Gene ist eine CXCAAT-Region, worin X jedes beliebige Nukleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene steht eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des poly A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodiersequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden in Säugetier-Expressionsvektoren insertiert.
Geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen werden problemlos aus verschiedenen Quellen erhalten, z.B. aus den Genomen von Viren wie etwa Polyoma-Virus, SV40, Adenovirus, MMV (Steroid-induzierbar), Retroviren (z.B. LTR von HIV), Hepatitis B-Virus und am meisten bevorzugt Cytomegalievirus, oder aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. aus dem β-Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren von SV40 werden günstigerweise als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Siehe Fiers et al., Nature 273, 113 (1978). Der unmittelbar frühe Promotor des Human-Cytomegalievirus wird günstigerweise als HindIII E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway, P.J. et al., Gene 18, 355–360 (1982).
Die Transkription einer für das Hybrid-Immunglobulin und/oder Hybridabschnitte kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Insertieren einer Enhancersequenz in einen Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise mit etwa 10–300 bp, die auf einen Promotor einwirken können, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und liegen 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 (1983)) von der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)). Viele Enhancersequenzen sind nun aus Säugetier-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man aber einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–der frühe Zytomegalievirus-Promotor-Enhancer, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Human- oder kernhältigen Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) enthalten auch Sequenzen, die für die Termination der Transkription, die die mRNA-Expression beeinflussen kann, notwendig sind. Diese Regionen werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der für das Hybrid-Immunglobulin kodierenden mRNA transkribiert. Die untranslatierten 3'-Regionen enthalten auch Transkriptions-Terminationsstellen.
Expressionsvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reductase (DHFR), Thymidin-Kinase (TK) oder Neomycin. Wenn solche selektierbaren Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle übertragen werden, kann die transformierte Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie selektivem Druck ausgesetzt ist. Es gibt zwei allgemein verwendete unterschiedliche Kategorien selektiver Regime. Die erste Kategorie basiert auf dem Zellmetabolismus und der Verwendung einer Zelllinienmutante, die nicht die Fähigkeit aufweist, sich unabhängig von einem ergänzten Medium zu vermehren. Zwei Beispiele sind CHO-CHFR^--Zellen und Mäuse-LTK^--Zellen. Diese Zellen besitzen nicht die Fähigkeit, sich ohne die Zugabe von Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu vermehren. Da diese Zellen einen Mangel an bestimmten Genen aufweisen, die für einen vollständigen Nukleotid-Syntheseweg notwendig sind, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zum Ergänzen des Mediums ist das Einsetzen eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen ohne die jeweiligen Gene, wodurch ihre Wachstumsanforderungen verändert werden. Individuelle Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, können im nicht ergänzten Medium nicht überleben.
Die zweite Kategorie selektiver Regime ist die dominante Selektion, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das für jeden Zelltyp anwendbar ist und nicht die Verwendung einer Zelllinienmutante erfordert. Diese Schemata verwenden typischerweise ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle zu stoppen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, exprimieren ein Protein, das Arzneimittel-Resistenz verleiht, und überleben daher das Selektionsregime. Beispiele für eine derartige dominante Selektion sehen die Verwendung der Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 (1987)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)) vor. Diese drei Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Steuerung, um Resistenz gegenüber dem jeweils geeigneten Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Geeignete eukaryotische Wirtszellen zur Expression des Hybrid-Immunglobulins sind die Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), Humanembryo-Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zwecks Wachstum in Suspensionskultur, F.L. Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); China-Hamstereierstock-Zellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennieren-Zellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); Human-Zervikalkarzinom-Zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, GB 8065); Mäuse-Brusttumor- (MMT 060562, ATCC CCL 51); und TRI-Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)).
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die gewünschten Kodier- und Steuersequenzen enthalten, wenden Standard-Ligationstechniken an. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
Bei der Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden dienen die Ligationsgemische dazu, E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) zu transformieren, und es werden erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls anhand von Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert. Es werden Plasmide aus den Transformanten präpariert, durch Restriktion analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Wirtszellen werden mit den Expressionsvektoren der Erfindung transformiert und in herkömmlichem Nährstoffmedium kultiviert, das gegebenenfalls zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, z.B. Temperatur, pH-Wert und dergleichen, sind jene, die in Bezug auf die für die Expression ausgewählten Wirtszellen verwendet wurden, und sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.
Die in dieser Offenbarung angeführten Wirtszellen umfassen Zellen in in vitro-Kulturen ebenso wie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
"Transformation" ist hierin das Einbringen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist – entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. Sofern nicht anders angeführt, ist das hierin zur Transformation der Wirtszellen eingesetzte Verfahren das Verfahren von F. Graham und A. van der Eb, Virology 52, 456–457 (1973). Andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen wie z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion kommen jedoch auch in Frage. Wenn prokaryotische Zellen oder Zellen, die nennenswerte Zellwand-Konstruktionen aufweisen, verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid; siehe F.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972).
"Transfektion" bezieht sich hierin auf die Einbringung von DNA in eine Wirtszelle – gleichgültig ob nun Kodiersequenzen schließlich exprimiert werden oder nicht. Es sind Fachleuten auf dem Gebiet zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, z.B. CaPO₄ und Elektroporation. Die Transformation der Wirtszelle ist ein Indiz für erfolgreiche Transfektion.
Das neue Polypeptid wird aus rekombinanten Zellkulturen mittels bekannter Verfahren gewonnen und gereinigt, z.B. Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, Immunaffinitäts-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatogra phie und Lectin-Chromatographie. Andere bekannte Reinigungsverfahren innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung verwenden immobilisierte Kohlenhydrate, Epidermiswachstumsfaktor oder Komplementdomänen. Außerdem eignen sich RP-HPLC und -Chromatographie unter Einsatz von Liganden für das Hybrid-Immunglobulin, um das Hybrid zu reinigen. Günstigerweise können geringe Konzentrationen (etwa 1–5 mM) Calciumionen während der Reinigung vorhanden sein. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise in Gegenwart eines Protease-Hemmers, wie z.B. PMSF.
Die Auswahl an Liganden-Bindungspartnern mit spezifischer Affinität für bestimmte Gewebe verbessert deutlich die Fähigkeit, therapeutische Mittel zuzuführen, die stabil sind, relativ lange Halbwertszeiten besitzen und ohne aufwändige Versuche ein präzises Zurechtschneiden ermöglichen.
Das neue Polypeptid wird gemeinsam mit erforderlichen Cofaktoren in sterile isotonische Formulierungen eingebracht und gegebenenfalls durch auf dem Gebiet bekannte Standardmittel verabreicht. Die Formulierung ist vorzugsweise flüssig und üblicherweise eine physiologische Salzlösung, die 0,5–10 mM Calcium, Nicht-Phosphat-Puffer mit pH 6,8–7,6 enthält, oder kann ein lyophilisiertes Pulver sein.
Es wird daran gedacht, dass intravenöse Verabreichung oder Verabreichung durch Katheter oder andere chirurgische Schläuche die primäre Route der therapeutischen Zufuhr ist. Alternativmöglichkeiten sind Tabletten und dergleichen, im Handel erhältliche Zerstäuber für flüssige Formulierungen und die Inhalation lyophilisierter oder Sprayrezeptoren. Flüssige Formulierungen können nach Rekonstitution aus Pulverformulierungen verwendet werden.
Das neue Polypeptid kann auch über Mikrokügelchen, Liposome, andere Mikroteilchen-Zufuhrsysteme oder Retardformulierungen verabreicht werden, die in bestimmte Gewebe, wie z.B. Blut, platziert werden. Geeignete Beispiele für Retardträger sind semipermeable Polymermatrices als Formteile, z.B. Zäpfchen oder Mikrokapseln. Implantierbare oder Mikrokapsel-Retardmatrizen sind z.B. Polylactide (US-A- 3.773.919, EP-A-58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers 22(1), 547–556 (1985)), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder -ethylenvinylacetat (R. Langer et al., J. Biomed: Mater. Res 15, 167–277 (1981), und R. Langer, Chem. Tech: 12, 98–105 (1982)). Liposome, umfassend das Hybrid-Immunglobulin, werden durch bekannte Verfahren hergestellt; siehe DE 3.218.121A ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP-A-52.322, EP-A-36.676, EP-A-88.046; EP-A-143.949; EP-A-142.541; JP-A-83-11808; US-A-4.485.045 und 4.544.545; und UP-A-102.342. Üblicherweise sind die Liposome klein (etwa 200–800 Ängström) und unilamellar, worin der Lipidanteil höher als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist und der ausgewählte Anteil auf die optimale Rate des Polypeptid-Austritts eingestellt ist.
Retard-Polypeptid-Zusammensetzungen werden nahe der Entzündungs- oder Therapiestelle implantiert oder injiziert, z.B. benachbart zu arthritischen Gelenken oder peripheren Lymphknoten.
Die Dosis des erfindungsgemäßen verabreichten Polypeptids hängt von den Eigenschaften des verwendeten Hybrids ab, z.B. von seiner Bindungsaktivität und in vivo-Plasma-Halbwertszeit, von der Konzentration des Hybrids in der Formulierung, der Verabreichungsweise des Hybrids, der Stelle und Dosierrate, der klinischen Toleranz des jeweiligen Patienten, vom pathologischen Zustand des Patienten und dergleichen, wie dies für Ärzte offenkundig ist.
Die Polypeptide der Erfindung können auch gemeinsam mit anderen pharmakologischen Mitteln verabreicht werden, die dazu dienen, die oben angeführten Zustände zu behandeln, z.B. mit Antibiotika, entzündungshemmenden Mitteln und Anti-Tumor-Mitteln. Es kann auch nützlich sein, das Polypeptid gemeinsam mit anderen therapeutischen Proteinen wie z.B. γ-Interferon und anderen Immunmodulatoren zu verabreichen.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erklären, seien bestimmte häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe erklärt.
"Plasmide" werden durch ein klein geschriebenes p bezeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die Ausgangsplasmide sind hierin entweder im Handel erhältlich, öffentlich uneingeschränkt erhältlich oder können aus verfügbaren Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind auf dem Gebiet äquivalente Plasmide bekannt und für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.
Insbesondere ist es vorzuziehen, dass diese Plasmide einige oder alle der folgenden Eigenschaften aufweisen: (1) sie besitzen eine minimale Anzahl an Wirtorganismus-Sequenzen; (2) sie sind im gewünschten Wirt stabil; (3) sie können in hoher Kopieanzahl im gewünschten Wirt vorhanden sein; (4) sie besitzen ein regulierbaren Promotor; und (5) sie weisen zumindest eine DNA-Sequenz auf, die für ein selektierbares Merkmal kodiert, das auf einem Teil des Plasmids vorhanden ist, der von jenem getrennt ist, wo die neue DNA-Sequenz insertiert ist. Die Änderung von Plasmiden zur Erfüllung der obigen Kriterien kann von Fachleute angesichts der veröffentlichten Literatur und der Lehren hierin problemlos durchgeführt werden. Man beachte, dass zusätzliche Kloniervektoren heute bestehen oder in Zukunft entdeckt werden können, welche die oben angeführten Eigenschaften aufweisen und sich daher zur Verwendung in der Erfindung eignen; es ist davon auszugehen, dass diese Vektoren im Schutzumfang der Erfindung enthalten sind.
"Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur in bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich; ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen entsprachen der von Fachleuten auf dem Gebiet bevorzugten Praxis. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Um DNA-Fragmente für die Plasmidkonstruktion zu isolieren, werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37 °C sind üblicherweise geeignet, können aber je nach Anweisungen des Herstellers variieren. Nach der Spaltung wird das Reaktionsgemisch direkt Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt mittels 8 % Polyacrylamidgel wie von D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), beschrieben.
"Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der endständigen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, dass die zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments "ringschließen", d.h. eine geschlossene Schleife bilden, welche die Inerstion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Methoden und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind konventionell. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 3–134 (1982). Reaktionen unter Einsatz von BAP erfolgen in 50 mM Tris bei 68 °C, um die Aktivität von Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können: Die Reaktionen werden 1 Stunde lang fortgesetzt. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment gelgereinigt.
"Oligonukleotide" beziehen sich entweder auf ein einstrangiges Polydesoxynukleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynukleotid-Stränge, die chemisch synthetisiert sein können. Derartige synthetische Oligonukleotide besitzen kein 5' Phosphat und ligieren daher nicht an ein anders Oligonukleotid, ohne ein Phosphat mit einem ATP in Gegenwart einer Kinase zuzuführen. Ein synthetisches Oligonukleotid ligiert an ein Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde.
"Ligation" ist ein Verfahren zur Herstellung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., s.o., 146). Sofern nicht anders angegeben, erfolgt die Ligation unter Einsatz bekannter Puffer und Be dingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
"Füllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf Verfahren, durch die das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer Restriktionsenzym-gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dieses verfahren ist ein vielseitiges Instrument zur Umwandlung eines restriktionsgespaltenen Endes, das mit den Enden, die nur durch ein oder einige wenige andere Restriktionsenzyme gebildet sind, kohäsiv sein kann, in einen Terminus, der mit jeder stumpfschneidenden Restriktions-Endonuklease oder einem anderen aufgefüllten kohäsiven Terminus verträglich ist. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2–15 μg der Ziel-DNA in 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5) Puffer bei etwa 37 °C in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 μM jedes der vier Desoxynukleosidtriphosphate. Die Inkubation ist im Allgemeinen nach 30-minütiger Phenol- und Chloroformextraktion und Ethanolfällung abgeschlossen.
Man geht derzeit davon aus, dass die dreidimensionale Struktur der Zusammensetzungen der Erfindung für ihre hierin beschriebene Funktionsweise von großer Bedeutung ist. Daher sind alle verwandten Strukturanaloge, welche die aktive Struktur jener imitieren, die durch die vorliegenden Zusammensetzungen gebildet werden, spezifisch im Schutzbereich der Erfindung enthalten.
Man beachte, dass die Anwendung der Lehren der Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine konkrete Situation im Lichte der hierin enthaltenen Lehren innerhalb des Kompetenzbereichs von Fachleuten auf dem Gebiet liegt. Repräsentative Verfahren zur Isolierung, Verwendung und Herstellung von Hybrid-LHR-Immunglobulin-Molekülen sind nachstehend angeführt; sie veranschaulichen die Erfindung trotz der Abgrenzung bezüglich des Lymphozyten-Homing-Rezeptors.
Beispiele
Alle in den Beispielen enthaltenen Bezugnahmen auf den monoklonalen "Mel 14"-Antikörper oder auf "Mel 14" beziehen sich auf einen monoklonalen Antikörper gegen eine mutmaßliche Mäuseform eines Lymphozyten-Oberflächenproteins wie von Gallatin et al., s.o., Nature 303, 30 (1983), beschrieben.
Beispiel 1 Reinigung und Klonierung von MLHR
Isolierung eines für MLHR kodierenden cDNA-Klons
MLHR wurde durch Immunaffinitäts-Chromatographie unter Einsatz des monoklonalen Mel 14-Antikörpers aus mit Detergens behandelten Mäusemilzen isoliert.
Bei einem typischen Präparat wurden 300 Milzen aus weiblichen ICR-Mäusen (16 Wochen alt) zerkleinert und dann mit einer Potter-Elvehjem-Gewebemühle in 180 ml 2 % Triton X-100 in Dulbecco PBS, umfassend 1 mM PMSF und 1 % Aprotinin, homogenisiert. Die Lyse wurde 30 Minuten lang auf einem Schüttler bei 4 °C fortgesetzt. Das Lysat wurde bei 2.000 × g 5 min lang und danach bei 40.000 × g 30 min lang zentrifugiert.
Der Überstand wurde durch Nitex-Sieb filtriert und dann durch Adsorption mit Rattenserum vorgeklärt, das an Bromcyan-aktivierte Sepharose 4B (10 ml des gepackten Gels) gebunden war. Das Rattenserum wurde für die Verbindung 1:10 verdünnt, wobei die Konjugation gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgte. Der Durchfluss wurde auf eine 3 ml-Säule mit Mel 14-Antikörper aufgebracht, der in 0,5 mg pro ml an Sepharose 4B gebunden war. Alle Säulenpuffer enthielten Natriumazid in einer Menge von 0,02 %.
Die Säule wurde mit 25 ml 2 % Triton X-100 in PBS gewaschen, gefolgt von 25 ml 10 mM CHAPS im gleichen Puffer. Antigen wurde durch Zugabe von 10 ml 10 mM CHAPS in 100 mM Glycin, 200 mM NaCl, pH 3, freigesetzt und durch Sammeln in 1 ml 1 M Tris HCl, pH 7,6, neutralisiert. Nach dem Waschen der Säule mit 20 mM Tri ethylamin, 200 mM NaCl, pH 11, und dem Re-Äquilibrieren in 10 mM CHAPS in PBS wurde das neutralisierte Antigen, verdünnt auf 100 ml des Säulenpuffers, erneut aufgebracht und die Wasch- und Freisetzschritte wiederholt.
Das gereinigte Protein wurde in einem Centricon 30 (Amicon, Inc.) aufkonzentriert und mittels SDS-PAGE (7,5 % Acrylamid) mittels Silbereinfärbung zur Visualisierung analysiert. Eine typische Reinigung lieferte 30–40 μg Antigen pro 300 Mäusen (auf der Grundlage von Vergleichen mit Orosomukoid-Standards).
In nicht dargestellten Daten zeigte ein Polyacrylamidgel des gereinigten Materials eine diffuse Bande, die bei etwa 90.000 Dalton migrierte, und ein höhermolekulares Protein bei etwa 180.000 Dalton. Das Verhältnis der Komponenten mit 90.000 Dalton und 180.000 Dalton betrug bei allen einer großen Anzahl von Präparaten 10:1 oder mehr. Das Material wurde durch Silbereinfärbung auf einem 10 % Polyacrylamidgel visualisiert.
Gasphasen-Edman-Abbau der 90.000 Dalton-Bande resultierte in der Identifizierung einer einzigen N-terminalen Sequenz (4A), welche genau die N-terminale Aminosäure enthielt. 38 N-terminale Aminosäuren wurden mit vier Lücken (X) an den Positionen 1, 19, 33 und 34 identifiziert. Das Asparagin (N) an Position 22 wurde aus dem Fehlen eines Aminosäuresignals an dieser Position – kombiniert mit den folgenden Tyrosin-(Y) und Threonin-(T) Resten – gefolgert, was zu einer N-gebundenen Glykosylierungsstellen-Konsenssequenz (NXT/S) führte.
Der 13-Sequenz-Rest aus 4A oberhalb des 38 Reste langen N-Terminus ist jener, der bereits von Siegelman et al., s.o., mittels radioaktiv markierter Aminosäure-Sequenzierung abgeleitet wurde; er zeigt einen hohen Grad an Homologie (11 von 13 Resten) mit der hierin bestimmten Sequenz des LHR.
In keinem der drei Sequenzierläufe, die mit zwei getrennten MLHR-Präparaten erfolgten, wurde eine Ubiquitin-Sequenz erhalten. Es war denkbar, dass diese Modifi kation in Mäuse-Splenozyten fehlte, oder der N-Terminus des Ubiquitins ist gegenüber Edman-Abbau im LHR aus dieser Quelle blockiert.
Die Aminosäuresequenzen aus 2 wurden mit bekannten Sequenzen in der Dayhoff-Proteindatenbank unter Verwendung des Algorithmus von D. Lipman et al., Science 227, 1435–1441 (1981), verglichen.
Die Reste aus 4A, die zwischen den Aminosäuren 7 und 15 unterstrichen sind, wurden ausgewählt, die in 4B gezeigte Oligonukleotidsonde herzustellen. Eine 32fach redundante 26-Mer-Oligonukleotidsonde wurde aus diesen Resten konstruiert und auf einem Oligonukleotid-Synthetisierer von Applied Biosystems synthetisiert. Alle der möglichen Codon-Redundanzen waren in dieser Sonde enthalten – außer das Prolin an Position 9, wo das Codon CCC gemäß Säugetiercodon-Verwendungsbestimmungen ausgewählt wurde.
Das Screenen einer Mäusemilz-cDNA-Bank aus sezierten Mäusemilzen mit der Sonde führte zur Isolierung eines einzelnen hybridisierenden cDNA-Klons. 600.000 Plaques aus einer Oligo dT-geprimten Δ gt 10-Mäusemilz-cDNA-Bank, produziert aus mRNA, isoliert aus Mäuse-Splenozyten mit 5 μg/ml Concanavalin A über den Zeitraum von 6 Stunden, wurden mit 50.000 Phagen pro Platte ausplattiert (12 Platten) und mit der P³²markierten 32fach redundanten 26-Mer-Oligonukleotidsonde aus 4B in 20 % Dormamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumsphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierter, geschorener Lachssperma-DNA über Nacht bei 42 °C hybridisiert. Diese Parameter werden hierin als "raue Bedingungen" bezeichnet. Die Filter wurden in 1 × SSC, 0,1 % SDS bei 42 °C 2 × 30 Minuten lang gewaschen und bei –70 °C über Nacht autoradiographiert. Ein einzelner in Doppelansätzen positiver Klon wurde erneut gescreent, das EcoRI-Insert wurde isoliert und in M13- oder PUC 118/119-Vektoren insertiert und die Nukleotidsequenz anhand einzelstrangiger Template mittels sequenzspezifischer Primer bestimmt.
2 zeigt die vollständige DNA-Sequenz für das 2,2 kb-EcoRI-Insert, das in diesem Bakteriophagen enthalten ist. Der längste offene Leserahmen beginnt mit einem Methionincodon an Position 106–108. Kozak Box-Homologie liegt um dieses Methionincodon herum vor – ein Anzeichen dafür, dass dieses Codon wahrscheinlich die Initiierung der Proteintranslation bewirkt. Eine Proteinsequenz, die 373 Aminosäuren aufweist, mit einem Molekulargewicht von etwa 42.200 wird durch diesen offenen Leserahmen kodiert. Das translatierte Protein zeigt eine Sequenz der Resten 40 bis 76, die genau der N-terminalen Aminosäuresequenz entspricht, die anhand des isolierten MLHR bestimmt wurde.
Dieses Ergebnis legt nahe, dass der reife N-Terminus des MLHR mit dem Tryptophanrest an Position 39 beginnt. Man geht jedoch davon aus, dass möglicherweise eine gewisse proteolytische Verarbeitung des tatsächlichen N-Terminus des LHR während der Isolierung des Proteins erfolgt ist.
Ein Hydrophobieprofil des Proteins zeigt eine N-terminal positionierte hydrophobe Domäne, die als Signalsequenz für die Insertion in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums dienen könnte. Die abgeleitete Sequenz für die Positionen 39 bis 333 ist vorwiegend hydrophil; gefolgt von einer hydrophoben Domäne aus 22 Resten, die für eine Stopptransfer- oder eine Membrananker-Domäne charakteristisch ist.
Die mutmaßliche intrazelluläre Region am äußersten C-Terminus des Proteins ist relativ kurz und weist eine Länge von nur 17 Resten auf. Auf der unmittelbar C-terminalen Seite der vorhergesagten membranüberspannenden Domäne liegen mehrere basische Aminosäuren – ein Merkmal, das für Verbindungsstellen zwischen Membrananker- und Zytoplasma-Domänen von Zelloberflächen-Rezeptoren typisch ist; siehe Yarden et al., Nature. Ein einzelner Serinrest, potenziell eine Phosphorylierungsstelle, ist innerhalb der mutmaßlichen Zytoplasma-Domäne vorhanden.
Das Protein enthält 10 potenzielle N-gebundene Glykosylierungsstellen, die alle innerhalb der projizierten extrazellulären Domäne liegen. Das Fehlen von Asparagin an Position 60 (Rest 22 des reifen Proteins) in der Peptid-Sequenzanalyse bestätigt Glykosylierung an dieser Stelle und setzt die extrazelluläre Orientierung dieser Region fest. Die Kodierregion enthält insgesamt 25 Cysteinreste, obwohl 4 dieser Reste innerhalb der mutmaßlichen Leadersequenz liegen.
Proteinmotive innerhalb des MLHR
Wie aus 6 ersichtlich zeigte ein Vergleich der abgeleiteten MLHR-Aminosäuresequenz mit anderen Proteinen in der Dayhoff-Proteinsequenz-Datenbank unter Anwendung des fastp-Programms (D. Lipman und W. Pearson, Science 227, 1435–1441 (1985)) einige interessante Sequenzhomologien.
Proteine mit den höchsten Sequenzhomologie-Werten sind in Rahmen dargestellt, die Regionen mit der größten Sequenzhomologie einschließen. Die Zahlen am Beginn der Sequenzen geben die Positionen innerhalb der Proteine an, an denen diese homologen Sequenzen liegen.
Aus 6A ist ersichtlich, dass das N-terminale Motivdes LHR (Reste 39 bis 155) bestimmte Kohlenhydrat-Bindungsprotein-Homologien aufweist, die nachstehend aufgelistet sind (der Prozentsatz der Homologie dieser Sequenzen zum MLHR sind in Klammern angegeben und die Quellen nach den Beispielen angeführt): Drickamer; die Aminosäurereste von Drickamer et al. (1), MuLHR; die MLHR-Sequenz, Hu.HepLec (27,8 %); Human-Hepatolectin (2), Barn.Lec (25 %); Rankenflusskrebs-Lectin (3), Ra.HepLec (23,5 %); Ratten-Hepatolectin (4), Ch.HepLec (27,5 %); Hühner-Hepatolectin (5), Hu.IgERec (28,6 %); Human-IgE-Rezeptor (6), RaHepLec2 (22,6 %); Ratten-Hepatolectin 2 (7), Ra.ASGRec (22,6 %); Ratten-Asialoglykoprotein-Rezeptor (8), Ra.IRP (25,6 %); Ratten-Inselregenerationsprotein (9), Ra.MBP (26,1 %); Ratten-Mannosebindungsprotein (10), Ra.MBDA (26,1 %); Ratten-Mannosebindungsprotein-Vorläufer A (11), Ra.KCBP (27 %); Ratten-Kupfer-Zellbindungsprotein (12), FlyLec (23,1 %); Fleischfliegen-(Sarcophaga-) Lectin (13) und Rab.Surt (20,9 %); Kaninchenlungen-Tensid (14).
6A zeigt erkennbar, dass das am weitesten N-terminal positionierte Motiv des LHR einen hohen Grad an Homologie mit einigen Calcium-abhängigen Tierlectinen aufweist, d.h. mit C-Typ-Lectinen (1). Dazu zählen u.a. verschiedene Hepatozucker-Bindungsproteine aus löslichen Hühner-, Ratten- und Human-Mannosebindungslectinen, ein Lectin aus Kupfer-Zellen, der Asialoglykoprotein-Rezeptor, ein Knorpel-Proteoglykan-Kernprotein, pulmonale Tensidapoproteine und zwei Wierbellosen-Lectine von der Fleischfliege und vom Rankenflusskrebs. Obwohl das Komplement "invarianter" Aminosäuren (zuerst von Drickamer et al., s.o., als C-Typ-Tierlectinen gemeinsam identifiziert) in der Kohlenhydrat-Bindungsdomäne des MLHR nicht voll- ständig konserviert ist, ist der Homologiegrad in diesen Resten und an anderen Positionen offenkundig. Die bekannten Lectine, die der C-Typ-Familie angehören, weisen eine Reihe an Zuckerbindungs-Spezifitäten auf, z.B. Oligosaccharide mit terminaler Galactose, N-Acetylglucosamin und Mannose (1).
Die Tatsache, dass es viele Reste gibt, die sich in allen dieser Kohlenhydrat-Bindungsproteine als invariant herausstellen, legt nahe, dass diese Region als Kohlenhydrat-Bindungsdomäne im MLHR fungiert, und erklärt die beobachtete Fähigkeit von Lymphozyten, sich an das spezialisierte Endothel von Lymphoidgewebe in Zucker- und Calcium-abhängiger Weise zu binden. In einigen Ausführungsformen wird bei der Durchführung der Erfindung die Kohlenhydrat-Bindungsdomäne des LHR alleine – ohne flankierende LHR-Regionen – eingesetzt.
Das nächste Motiv (Reste 160–193), das fast unmittelbar nach dem Ende der Kohlenhydrat-Bindungsdomäne zu finden ist, zeigt einen hohen Grad an Homologie zur Familie des Epidermiswachstumsfaktor-(egf-) Familie. 6B zeigt egf-Homologien: MLHR; die MLHR-Sequenz, Notch (38,5 %); den Drosophila melanogaster-Notch-Locus (15), S. purp (31,7 %); Strongylocentrotur purpuratus-egf-ähnliches Protein (16), Pro.Z (34,1 %); Rinderprotein Z (17), Fact.X (34,2 %); Koagulationfaktor X (18), Fact.VII (27,3 %); Koagulationsfaktor VII (19), Fact.IX (33,3 %); Koagulationsfaktor IX (20), Lin-12 (32,1 %); Caenorhabditis elegans Lin-12-Locus (21), Fact. XII (26 %); Koagulationsfaktor XII (22) und Mu.egf (30 %); Mäuse-egf (23).
Wie aus 6B erkennbar ist der höchste Homologiegrad des MLHR in dieser Region beim neurogenen Drosophila-Locus (Notch) feststellbar, obwohl signifikante Homologie zu einigen anderen Mitgliedern dieser großen Familie existiert. Die variable Position dieser Domäne unter den Mitgliedern dieser Familie legt nahe, dass diese Region möglicherweise in einem Genom-Segment enthalten ist, das zur Erfüllung unterschiedlicher Funktionen zwischen verschiedenen Proteinen hin- und herverschoben werden kann.
Zusätzlich zu 6 Cysteinresten sind praktisch allen Mitgliedern dieser Familie drei Glycinreste gemeinsam. Die Konservierung von Cystein- und Glycinresten stimmt mit der Möglichkeit einer strukturellen Rolle für diese Region im LHR überein. Man geht davon aus, dass diese Domäne die N-terminal positionierte Kohlenhydrat-Bindungsregion in eine für die Liganden-Wechselwirkung geeignete Orientierung platzieren kann. Man geht ferner davon aus, dass diese Domäne dazu dienen könnte, die Wechselwirkung zwischen Lymphozyten und Entothel durch Bindung an ein egf-Rezeptorhomolog auf der Endotheloberfläche verstärken kann.
Für das endgültige Proteinmotiv in der extrazellulären Region des HLHR wird von den Aminosäuren 197 bis 328 kodiert. Diese Region des Glykoproteins enthält zwei direkte Repetitionen einer 62-Reste-Sequenz, die ein Aminosäuremotiv enthält, das einen hohen Grad an Homologie zu einigen Komplementfaktor-Bindungsproteinen aufweist (6C).
6C zeigt Komplement-Bindungsprotein-Homologien: MLHR; MLHR-Sequenz, HuComH (31,9 %); Human-Komplementprotein-H-Vorläufer (24), MuComH (28,9 %); Mäuse-Komplementprotein-H-Vorläufer (25), Huß (25,6 %); Human-β-2-Glykoprotein I (26), HuCR1 (29,9 %); Human-CR1 (27), EBV/3d (25 %) 6; Human-Epstein-Barr-Virus/C3d-Rezeptor (28), HuC2 (27,1 %); Human-Komplement-C2-Vorläufer (29), HuB (23,1 %); Human-Komplementfaktor B (30), MuC4b (22 %), Mäuse-C4-Bindungsvorläufer (31), HuC1s (29,2 %); Human-C1s-Zymogen (32), HuC4b (26,1 %); Human- C4b-Bindungsprotein (33), HuDAF (27,1 %); Human-Abbau-Beschleunigungsfaktor (34), VacSecP (26,2 %); Vaccinia-Virus-sekretierendes Peptid (35).
Diese Proteine, die für eine Vielzahl an Multiplen dieser repetierten Domäne kodieren, sind z.B. die Human- und Mäuse-Komplement-N-Vorläufer, das Human-β2-Glykoprotein, der Epstein-Barr-Virus/C3d-Vorläufer, das Human-C4b-Bindungsprotein, der Abbau-Beschleunigungsfaktor und das Vaccinia-Virus-sekretierende Polypeptid.
7C zeigt die Homologien zwischen den zwei direkten Repetitionen im MLHR und die direkten Repetitionen in Proteinen, die innerhalb der Komplement-Bindungsfamilie enthalten sind. Viele der Aminosäuren, die in dieser Klasse von Komplement-Bindungsproteinen konserviert sind, einschließlich einiger konservierter Cysteinreste, befinden sind auch in den zwei Repetitionen dieser Region des MLHR.
Interessanterweise sind die zwei im MLHR enthaltenden Repetitionen nicht nur exakte Duplikate voneinander auf Aminosäureebene, sondern sie weisen auch präzise Homologie auf der Ebene der Nukleotidsequenz auf (Nukleotidreste 685–865 und 866–1056). Es ist zwar möglich, dass dieses Ergebnis auf ein Klonierartefakt zurückzuführen ist, doch ist eine duplizierte Region in einigen anderen Klonen, die aus einer getrennten cDNA-Bank isoliert wurden (produziert aus der MLHR-exprimierenden Zelllinie 38C13, erhältlich bei der Stanfort University, Palo Alto, CA, USA), sowie in einem Human-Homolog des MLHR (weiter unten besprochen) festgestellt worden. Außerdem weisen einige andere Gene, vor allem das Lp(a)-Gen, einen noch höheren Grad an intragener Repetitionssequenz-Konservierung dieser Domäne auf. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass MLHR wie andere Mitglieder der Komplement-Bindungsfamilie mehrere Repetitionen dieser Bindungsdomäne enthält.
Zusammenfassend scheint die extrazelluläre Region des MLHR drei getrennte Proteinmotive zu enthalten, die miteinander verbunden wurden, um als neue Funktion(en) zu dienen. Eine Übersicht über die in diesem Glykoprotein enthaltenen Proteinmotive ist aus 7 ersichtlich.
Beispiel 2. Klonieren von HuLHR
Wie allgemein im vorhergehenden Beispiel beschrieben wurde das oben beschriebene 2,2 kb-EcoRI-Insert des Mäuse-Mel 14-Antigen-cDNA-Klons isoliert, zu hoher spezifischer Aktivität durch zufällig geprimte DNA-Polymerase-Synthese mit P³²-Triphosphaten markiert und dazu verwendet, 600.000 Klone aus einer mit Oligo-dT geprimten λgt10-cDNA-Bank (abgeleitet aus Human-Peripherblut-Lymphozyten-mRNA, erhalten aus Primärzellen) zu screenen. Die Filter wurden über Nacht bei 42 °C in 40 % Formamid, 5 × SSC (1 × SSC ist 30 mM NaCl, 3 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 10 % Dextransulfat, 5 × Denhardt-Lösung und 20 μg/ml geschorener gekochter Lachssperma-DNA hybridisiert. Sie wurden 2 × 40 Minuten in 0,2 × SSC, 0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 55 °C gewaschen. 12 Klone (etwa ein positiver pro Platte mit 50.000 Phagen) wurden selektiert, das größte EcoRI-Insert (~ 2,2 kb) isoliert und die DNA-Sequenz durch Didesoxynukleotid-Sequenzierung im Bakteriophagen m13 unter Einsatz sequenzspezifischer Primer bestimmt.
Der Klon mit ~ 2,2 kb kodierte für einen offenen Leserahmen von 372 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von etwa 42.200 Dalton, der mit einem Methionin begann, vor dem eine Kozak Box-Homologie angeordnet war. Das kodierte Protein enthielt 26 Cysteinreste und 8 potenzielle N-gebundene Glykosylierungsstellen. Eine stark hydrophobe Region am N-Terminus des Proteins (Reste 20–33) war eine potenzielle Signalsequenz, während eine andere stark hydrophobe C-terminale Region mit einer Länge von 22 Aminosäuren (Reste 335–357) eine potenzielle Stoptransfer- oder Membrananker-Domäne war. An diese hydrophobe C-terminale Region schloss sich eine geladene, vermutlich Zytoplasma-, Region.
Der Vergleich der Nukleotidsequenz dieses Humanklons mit der für MLHR identifizierten zeigt einen hohen Grad an gesamter DNA-Sequenzhomologie (~ 83 %). Die relativen Grade an Aminosäuresequenz-Konservierung zwischen dem MLHR und HuLHR in jeder der LHR-Domänen sind: Kohlenhydrat-Bindungsdomäne – 83 %; egf-ähnliche Domäne – 82 %; Komplement-Bindungsrepetition 1 – 79 %; Komplement- Bindungsrepetition 2 – 63 %); gesamte Komplement-Bindungsdomäne – 71 %; und Transmembran-Domäne – 96 %.
Der Vergleich der veröffentlichten Hermes-Sequenz, Jalkanen, s.o., mit der HuLHR-Sequenz aus 1 weist auf einen Mangel an Sequenzhomologie hin.
Beispiel 3. Expression des MLHR
Um schlüssig zu beweisen, dass der hierin isolierte Mäuse-cDNA-Klon für MLHR kodiert, wurde der Klon in einen Expressionsvektor insertiert und in einem transienten Zelltransfektionsassay analysiert. Die Expression des HuLHR erfolgte in ähnlicher Weise.
Das EcoRI-Fragment, das den oben beschriebenen offenen Leserahmen enthielt (das ~ 2,2 kb-EcoRI-Fragment, dessen Sequenz in 2 dargestellt ist), wurde isoliert und in den pRK5-Vektor ligiert, der einen Cytomegalievirus-Promotor enthält (D. Eaton et al., Biochemistry 25, 8343–8347 (1986); EP-A-307.247, veröffentlicht am 15. März 1989), ein Plasmid, das die insertierte cDNA in der korrekten Orientierung relativ zum Promotor enthält, wurde selektiert und mittels CaPO₄-Fällung auf Humanembryo-293-Nierenzellen transfiziert.
Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit 500 μCi S³⁵-Cystein und Methionin inkubiert. Lysate und Überstände wurden gemäß einem beschriebenen Verfahren hergestellt (L. Lasky et al., Cell 50, 975–985 (1987)) und mit monoklonalem Mel 14-Antikörper (gereinigt durch Immunaffinitäts-Chromatographie) immungefällt, indem ein polyklonaler Anti-Ratten-IgG-Antikörper in einem Sandwich zwischen dem monoklonalen Mel 14-Antikörper und Protein A-Sepharose eingesetzt wurde.
Gleichzeitig wurde das B-Zellen-Lymphom 38C13, eine Zelle, die bekanntermaßen MLHR exprimiert, entweder metabolisch mit Methionin oder Cystein (zwecks Analyse des MLHR-Überstands) markiert, oder es wurden die Zelloberflächen-Glykoproteine mit I¹²⁵ und Lactoperoxidase zwecks Analyse von zellassoziiertem LHR markiert und durch Mel 14-Antikörper-Immunfällung analysiert.
Die resultierenden Immunpräzipitate wurden auf 7,5 % Polyacrylamid-SDS-Gelen analysiert und über Nacht bei –70 °C autoradiographiert.
Die Ergebnisse dieser Assays sind aus 5 ersichtlich. In dieser Abbildung bedeuten die Spuren A-F Folgendes:

A – Lysate von 293-Zellen, transfiziert mit einem MLHR-Expressionsplasmid, immungefällt mit monoklonalem Mel 14-Antikörper;
B – Überstände von 293-Zellen, transfiziert mit einem MLHR-Expressionsplasmid, immungefällt mit monoklonalem Mel 14-Antikörper;
C – Lysate von 293-Zellen, transfiziert mit einem Plasmid, welches das HIV gp120-Hüllenglykoprotein exprimiert, immungefällt mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper;
D – Überstände von 293-Zellen, transfiziert mit dem HIV-Hüllen-Expressionsplasmid, immungefällt mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper;
E – Überstände von 28C13-Zellen, immungefällt mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper;
F – Lysate von 38C13-Zellen, oberflächenmarkiert mit I¹²⁵ und immungefällt mit dem monoklonalen Mel 14-Antikörper.

Wie aus 5 erkennbar produzieren mit diesem Konstrukt transfizierte Zellen zellassoziierte Proteine, die spezifisch mit dem Mel 14-Antikörper reagierten. Die zellassoziierten Proteine wanderten bei etwa 70.000 Dalton und 85.000 Dalton, was darauf schließen lässt, dass das ca. 42.200 Dalton-Kernprotein in den transfizierten Zellen glykosyliert wird. Die größere Bande war hinsichtlich des Molekulargewichts nach der Sialidase-Behandlung (Daten nicht dargestellt) verschoben – ein Hinweis darauf, dass sie eine relativ reife Form des Glykoproteins ist, während die Bande mit niedrigerem Molekulargewicht gegenüber dem Enzym resistent war – ein Indiz, dass sie eine Vorläuferform sein könnte.
FACs-Analyse transient transfizierter Zelllinien mit dem Mel 14-Antikörper zeigte, dass ein Teil des in diesen Zellen exprimierten LHR an der Zelloberfläche detektierbar war (Daten nicht dargestellt).
Das in der transfizierten Zelllinie produzierte höhermolekulare Glykoprotein stellte sich als etwas kleiner als jenes heraus, das durch das Peripher-Lymphknoten-Homing-B-Zellen-Lymphom 38C13 (5, Spur F) produziert wurde – ein Ergebnis, das man auch bei anderen transfizierten Zelllinien erzielte und das möglicherweise auf zellspezifische Unterschiede in der Glykosylierung zurückzuführen ist.
Interessanterweise scheinen sowohl die 38C13-Zellen als auch die transfizierten Humanzellen eine niedermolekulare Form des MLHR in das Medium abzugeben (5, Spuren B und E). Die Beschaffenheit dieses abgegebenen Moleküls ist unklar, obwohl sein reduziertes Molekulargewicht nahe legt, dass es ein Spaltprodukt der Zelloberflächenform sein könnte, das aufgrund der Proteolyse in der Nähe des Membranankers entstanden war.
Zusammenfassend gesagt zeigen diese Ergebnisse in überzeugender Weise, dass der von den Anmeldern isolierte cDNA-Klon für MLHR kodiert.
Beispiel 4. Konstruktion Reinigung und Analyse gekürzter MLHR-IgG-Chimären
8 zeigt die Konstruktion von MLHR-IgG-Chimären, welche die Lectin-, Lectin- egf- und Lectin-egf-Komplement-Regulationsmotive enthalten. Der obere Teil der Abbildung zeigt die Proteindomänen des Mäuse-Lymphozyten-Homing-Rezeptors (MLHR), umfassend die N-terminale Signalsequenz (SS), das Lectin, den Epidermiswachstumsfaktor (egf) und duplizierte Komplement-Regulationsdomänen (CDB) sowie eine Transmembran-Ankerdomäne (TMD) und eine kurze Zytoplasma-Sequenz. Die drei verkürzten MLHR-IgG-Chimären, die das Lectin-(MLHR-L + IgG), das Lectin-und- egf- (MLHR-LE + IgG) und das Lectin-, egf- und zwei Komplement-Regulationsmotive (MLHR-LEC + IgG) enthalten, sind auch in 8 dargestellt. Diese ge kürzten Proteine sind alle mit einer Human-Schwerketten-γ1-Region knapp stromauf von der Hinge-Domäne (H) verbunden, sodass alle diese Chimären die zwei Cysteinreste (C) des Hinge, die für die Immunglobulin-Dimerisierung verantwortlich sind, sowie die CH2- und CH3-Konstantregionen enthalten. Es wurde eine bereits charakterisierte Human-Schwerketten-IgG 1-Konstantregionen-Kassette (Capon et al., s.o., 1989) verwendet. Verbindungsstellen zwischen den LHR- und Human-IgG-Sequenzen wurde so gewählt, dass die Bindung der Moleküle in der Nähe der Hinge-Region zu chimären Molekülen führte, die effizient synthetisiert und in Abwesenheit von Leichtketten-Produktion dimerisiert wurden. Zusätzlich dazu löst die Verwendung der Human-IgG1-Konstantregion das Problem infolge der Kreuzreaktivität mit endogenen Mäuse-IgG in den unten beschriebenen immunhistochemischen Experimenten.
Wie aus 9 erkennbar wurden diese Chimären in den transienten Transfektionsassays effizient synthetisiert und sekretiert. Die Reaktivität dieser Chimären mit Protein A-Sepharose ohne zugegebene Antikörper zeigt, dass die Konstantregionen-Domänen normalerweise gefaltet sind. 9 veranschaulicht, dass diese Moleküle unter nichtreduzierenden Bedingungen dimerisieren, was zeigt, dass die Hinge-Region in diesen Chimären voll funktionell ist. Schließlich ermöglicht die Protein A-Reaktivität auch die Reinigung dieser Chimären fast bis zur Homogenität auf Protein A-Sepharose-Säulen. Die vorliegenden Ergebnisse lassen die Produktion von Antikörperähnlichen Gebilden erkennen, von deren "variabler" Domäne man sagen kann, dass sie von MLHR abgeleitet ist, während die konstante Domäne von der Human-IgG-γ1-Schwerkette abgeleitet ist.
Konstruktion von Chimären
Beginnend mit einem bereits beschriebenen MLHR-PRKS-Expressionsplasmid (Eaton et al. (1986); Lasky et al., Cell 50, 975–985 (1987)) und einer cDNA-Kopie eines Human-Schwerketten-IgG (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989)) wurde ein HindIII-Fragment, das für die CH1-CH3-Regionen der Human-IgG1-Konstantregion kodiert, 3' von der PolyA-Stelle der MLHR-cDNA insertiert. Dieses Plasmid wurde durch Verwendung eines m13-Replikationsursprungs und des K07-Helferphagen in ein einstrangiges Templat umgewandelt, wonach Regionen zwischen dem Hinge und dem Lectin, egf und der zweiten Komplement-Bindungsrepetition N-terminal zur mutmaßlichen Transmembran-Ankerregion mit 48-Mer-Oligonukleotiden durch in vitro-Mutagenese (Zoller und Smith, 1982) "Loop-out" unterzogen wurden. Die resultierenden Mutanten wurden mit ³²P-markierten, die Deletionsverbindungen überspannenden 21-Mer-Oligonukleotiden gescreent und die isolierten Mutanten mittels Supercoil-Sequenzierung sequenziert.
Korrekte Mutanten wurden auf Expression durch Transfektion auf menschliche Nieren-293-Zellen mittels bereits beschriebener Verfahren untersucht. ³⁵S-Methionin- und Cystein-markierte Überstände wurden durch Immunfällung mit Protein A-Sepharose-Perlen ohne zugegebene Antikörper analysiert. Die gefällten Proteine wurden auf 7,5 %-Polyacrylamid-SDS-Gelen entweder mit oder ohne Reduktion mit β-Mercaptoethanol analysiert. Plasmide, die zu korrekt exprimierten Chimären führten, wurden durch Transfektion in Gegenwart selektiver Plasmide, die für Resistenz gegen G418 sowie Dihydrofolat-Reductase kodieren, in 293-Zellen eingesetzt. Klone wurden in G418 selektiert und die eingearbeiteten Plasmide in Gegenwart von Methotrexat amplifiziert. Permanente Zelllinien, die hohe Werte jedes Konstrukts exprimierten, wurden in großem Umfang in T-Kolben gezüchtet und die Zellüberstände durch Zentrifugation und Filtration geklärt. Die resultierenden Überstände wurden durch Amicon-Filtration aufkonzentriert und über herkömmliche Protein A-Sepharose-Säulen geschickt, mit PBS gewaschen und mit 0,1 M Esssigsäure, 0,15 M NaCl (pH 3,5) eluiert. Das eluierte Material wurde sofort mit 3 M Tris, pH 9, neutralisiert und durch SDS-Gel-Elektrophorese sowie ELISA-Assay quantifiziert.
Die im vorhergehenden Absatz beschriebenen Gelelektrophorese-Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Reduzierte Proteine sind in den Spuren A-F dargestellt, nichtreduzierte Proteine in den Spuren G-I und gereinigte Proteine in den Spuren J-L. Die Molekulargewichte der Marker sind in Kilodalton angegeben. Die Spurenidentifizierungen sind wie folgt: A -sekretiertes MLHRLEC-IgG, B – intrazelluläres MLHRLEC- IgG, C – sekretiertes MLHRLE-IgG, D – intrazelluläres MLHRLE-IgG, E – sekretiertes MLHRL-IgG, F – intrazelluläres MLHRL-IgG, G – sekretiertes MLHRLEC-IgG, H – sekretiertes MLHRLE-IgG, 1 – sekretiertes MLHRL-IgG, J – gereinigtes MLHRLEC-IgG, K – gereinigtes MLHRLE-IgG und L – gereinigtes MLHRL-IgG.
Isolierte LHR-IgG-Chimären wurden unter Verwendung eines ELISA-Formats quantifiziert, das aus einem Anti-Human-IgG1-spezifischen monoklonalen Antikörper bestand, mit dem Mikrotiternäpfe überzogen waren. Unbekannte Proben sowie hochgereinigter Human-CD4-IgG1-Immunadhäsin-Standard wurden mit Antikörperbeschichteten Platten inkubiert, bevor die Platten gewaschen wurden und das gebundene Material mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG1 umgesetzt wurde, gefolgt von weiteren Waschgängen und der Zugabe von Substrat. Dieser quantitaitve Assay ermöglichte die Messung von unter Nanogramm liegenden Mengen an isolierten LHR-IgG-Chimären.
Analyse von MLHR-IgG-Chimären-PPME-Reaktivität mittels ELISA
Die Fähigkeit verschiedener IgG-Chimären, das Hefezellwand-Kohlenhydrat, Polyphosphomannan-Ester (PPME) zu erkennen, wurde in einem bereits beschriebenen ELISA-Format analysiert (Imai et al. (1989)). Etwa äquimolekulare Mengen der gereinigten Chimären wurden – zusammenfassend – über Nacht auf Mikrotiternäpfe bei 4 °C aufgebracht. Nicht-spezifische Stellen wurden mit BSA blockiert, bevor die gebundenen Antigene mit 5 μg pro ml PPME-Lösung umgesetzt wurden. Gebundenes Kohlenhydrat wurde mit einem dagegen gebildeten polyklonalen Antikörper und herkömmlichen immunhistochemischen Färbungsreagenzien (Vector) detektiert. Die Hemmung mit Mel 14 erfolgte durch Vorinkubieren von MLHRLEC-IgG-enthaltenden Näpfen mit dem monoklonalen Antikörper vor der Zugabe von PPME, während die Calcium-Abhängigkeit der Homing-Rezeptor-Kohlenhydrat-Wechselwirkung durch Miteinbezug von 10 mM EGTA während der Bindungsreaktion gezeigt wurde. Verschiedene andere Additive wurden vor der PPME-Inkubation in Inhibitionsassays zugegeben. Nach 1 h bei 22 °C wurden die Platten gewaschen und mit polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen PPME 1 h lang bei 22 °C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit Vector ABC-AP 30 min lang inkubiert, gewaschen und entwickelt. Die resultierenden Assays wurden auf einem Plattenlesegerät gemessen. Die in den Inhibitionsassays verwendeten Kohlenhydrate stammten von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Die Ergebnisse der PPME-Bindungsanalyse sind aus 10 ersichtlich. Die Spuren enthalten die folgenden MLHR-IGG-Chimären: A – Bindung von PPME an MLHRL-, MLHRLE- und MLHRLEC-IgG-Chimären; B – Hemmung der MLHRLEC-IgG-PPME-Bindung mit monoklonalem Mel 14-Antikörper und EGTA; C – Hemmung von MLHRLEC-IgG-PPME-Bindung mit anderen Kohlenhydraten.
Bereits veröffentlichte Arbeiten zeigten, dass sich das LHR an ein Hefezellwand-Mannan, Polyphosphomannanester oder PPME binden kann (Yednock et al., J. Cell Biol. 104, 725–731 (1987)) und dass diese Bindung die Fähigkeit von Lymphozyten hemmt, sich an Endothelgefäße mit hohem Anteil an peripheren Lymphknoten zu binden; dies stimmt mit der Annahme überein, dass die periphere Lymphknoten-LHR-Lectin-Domäne ein Kohlenhydrat auf dem peripheren Lymphknoten-Endothel erkennen kann. Außerdem stellte man fest, dass der Mel 14-Antikörper die Bindung von PPME an die Lymphozyfen-Oberfläche hemmt (Yednock et al., s.o. (1987)); dies stimmt mit der Vorstellung überein, dass sich dieses Kohlenhydrat an die Lectindomäne des peripheren Lymphknoten-LHR band.
Die Chimäre, welche die Lectin-, egf- und duplizierten Komplementbindungs-Repetitionsstrukturen enthielt, band sich an PPME. Diese Bindung konnte durch den Mel 14-Antikörper gehemmt werden, was mit Daten konform geht, die aufzeigen, dass die MLHRLEC-IgG-Chimäre durch diesen Antikörper erkannt wird (Daten nicht dargestellt), und war quantitativ mit jener vergleichbar, die bereits mit aus Milzzellen isoliertem MLHR festgestellt wurde (Imai et al., zur Veröffentlichung vorgelegt, 1989) – dies legt nahe, dass sie die gleiche Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkung darstellt, die bereits mit dem LHR an der Lymphozyten-Oberfläche identifiziert wurde (Yednock et al., s.o. (1987)). Darüber hinaus stellte sich die Bindung auch als Calciumabhängig heraus (Stoolman und Rosen, J. Cell Biol. 96, 722–729 (1983)), was impli ziert, dass die Typ C- oder Calcium-abhängige Lectindomäne (Drickamer, J. Biol. Chem. 263, 9557–9560 (1988)) zumindest teilweise für diese Wechselwirkung verantwortlich ist, wie dies für den Lymphozyten-assoziierten Rezeptor belegt wurde (9B).
Frühere Arbeiten zeigten, dass eine Vielzahl an Kohlenhydraten neben PPME durch das von der Milz abgeleitete MLHR erkannt werden kann (Yednock et al., s.o. (1987); Imai et al., s.o. (1989)). Dazu zählen Fucoidin, Dextransulfat und aus dem Gehirn stammende Sulfatide. Die Fähigkeit dieser Kohlenhydrate, die Wechselwirkung zwischen der MLHRLEC-IgG-Chimäre und PPME zu hemmen, wurde untersucht, um die Spezifität dieses Moleküls gegenüber dem bereits beschriebenen Milz-Glykoprotein (Imai et al., s.o. (1989)) zu beleuchten. Wie aus 9 erkennbar sind Fucoidin, Dextransulfat und Sulfatid alle in der Lage, die Wechselwirkungen zwischen PPME und MLHRLEC-IgG zu hemmen, was impliziert, dass die Kohlenhydrat-Spezifität dieses rekombinant abgeleiteten Proteins jene imitiert, die bereits für natürlich vorkommendes Protein beschrieben wurde. Die mangelnde Hemmung durch zwei andere geladene Kohlenhydrate – Chondroitinsulfat und Heparin – lässt darauf schließen, dass die Hemmung auf spezifische Kohlenhydraterkennung und nicht auf nicht-spezifische Interferenz infolge der stark geladenen Beschaffenheit der Verbindungen zurückzuführen ist.
Zellblockierungs-Assays mit MLHR-IgG-Chimären
Der Stampfer-Woodruff-Zellblockierungs-Assay (Stamper und Woodruff, J. Exp. Med. 144, 828–833 (1976)) erfolgte mit Kryostat-geschnittenen Teilen peripherer Mäuse-Lymphknoten sowie mit Peyer-Plaque (siehe Goffrey und Rosen, J. Cell. Biol., in Druck, 1989). Zusammenfassend gesagt wurden die gefrorenen Abschnitte mit mesenterialen Lymphozyten in Gegenwart von MLHR-IgG-Chimären, isoliertem Milz-MLHR oder Puffer alleine inkubiert. MLHR-IgG-Chimären wurden in Konzentrationen von bis zu 10 μg pro Abschnitt eingeschlossen und auf gefrorenen Schnitten vorinkubiert, bevor die Zugabe von 1 × 10⁷ Zellen pro ml erfolgte. Die Objektträger wurden gewaschen und die Lymphozyten-Bindung durch digitale Morphometrie als Zahl der Lymphozyten, die in diesen Lymphoidorganen pro Flächeneinheit an HEV gebunden waren, gemessen.
In nicht dargestellten Daten stellte sich heraus, dass die MLHRLEC-IgG-Chimäre die Bindung von Lymphozyten an periphere Lymphknoten-HEV mit etwa 75 % hemmt, während in diesem Assay das von der Milz abgeleitete MLHR mit etwa 50 % blockierte. Diese Hemmung war Calcium-abhängig und wurde durch den Einschluss des monoklonalen Mel 14-Antikörpers blockiert (Daten nicht dargestellt).
Immunhistochemische Analyse von MLHR-IgG-Chimären
Isolierte MLHR-IgG-Chimären wurden in immunhistochemischen Experimenten verwendet, bei denen die gleichen Verfahren zum Einsatz kamen wie bei monoklonalen Antikörpern. 8–10 μm-Gewebeschnitte wurden in einem Kryostat geschnitten und mit 0,1 M Cacodylat, 1 % Paraformaldehyd 30 min lang bei 4 °C fixiert. Die Schnitte wurden in Dulbecco-PBS gewaschen und mit variierenden Mengen MLHR-IgG-Chimäre in 5 % normalem Mäuseserum 30 min lang bei 4 °C eingefärbt. Die Schnitte wurden dann gewaschen und mit einer zweiten Phase inkubiert, umfassend biotinylierten Ziegen-Anti-Human-Fc-spezifischen Antikörper (Vector). Endogene Peroxidase wurde durch Behandeln der Schnitte mit Wasserstoffperoxid-Methanol eliminiert (nach der Zugabe von Reagens der zweiten Phase und vor der Zugabe des Vector-ABC-Komplexes). Die Schnitte wurden gewaschen und 5–10 min lang mit Substrat (AEC) inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte mit wässrigem Hematoxylin (Biomedia) gegengefärbt und mit einem Zeiss-Axioplot betrachtet.
Diese immunhistochemischen Analysen der drei MLHR-IgG-Chimären verwendeten als Gewebequelle periphere Lymphknoten. Die Auswahl von peripheren Lymphknoten als Histologiequelle wurde von der umfangreichen Literatur diktiert, die aufzeigt, dass sich Lymphozyten solcherart an die HEVs dieses Lymphoidgewebes binden, dass das Blockieren mit Mel 14 möglich ist, was impliziert, dass die größte Menge an durch das MLHR erkanntem Liganden im Gewebe sein sollte (Gallatin et al., Nature 304, 30–34 (1983)). Die MLHRLEC-IgG-Chimäre konnte periphere Lymphknoten- HEVs einfärben. Die Einfärbung wurde ausschließlich über die starkwandigen Endothelzellen festgestellt, nicht in den ad- oder abluminalen Regionen. Außerdem konnte diese Einfärbung durch Mel 14-Antikörper blockiert werden und hing von der Gegenwart von Calcium ab; dies lässt darauf schließen, dass die Bindung von MLHRLEC-IgG an periphere Lymphknoten-HEVs die Adhäsion zwischen Lymphozyten und den HEVs imitiert. In Übereinstimmung mit dem PPME-Bindungsdaten konnte die Einfärbung von peripheren Lymphknoten-HEVs durch MLHRLEC-IgG durch Fucoidin und Dextransulfat gehemmt werden (5), während Chondroitinsulfat und einfache Mannane die Einfärbungsreaktion nicht hemmen konnten (Daten nicht dargestellt); wiederum impliziert dies, dass die Einfärbungsreaktion auf die Erkennung eines Kohlenhydratliganden zurückzuführen ist, der auf den peripheren Lymphknoten-HEVs exprimiert wird. Diese Daten veranschaulichen, dass dieser Typ von immunhistochemischem Reagens dazu dienen kann, die Gewebeverteilung des/der Endothelmoleküls/e zu untersuchen, das/die zur Wechselwirkung mit dem peripheren Lymphknoten-LHR fähig ist/sind.
Der MLHR-Ligand findet sich in Peyer-Plaques
Die Anmelder stellten aufgrund nicht dargestellter Ergebnisse immunhistochemischer Assays fest, dass die MLHRLEC-IgG-Chimäre überraschenderweise in der Lage ist, das Endothel in Peyer-Plaques spezifisch zu erkennen. Die Chimäre scheint das starkwandige Endothel von Peyer-Plaque-Gefäßen, die Lymphozyten enthalten, einzufärben. Diese Einfärbung ist durch den Mel 14-Antikörper hemmbar und auch Calcium-abhängig. Interessanterweise scheint die Einfärbung der Peyer-Plaques gegenüber jener der peripheren Lymphknoten-HEVs etwas schwächer zu sein – ein Hinweis darauf, dass eine geringere Menge an MLHR-Ligand(en) in diesem Lymphorgan exprimiert werden kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass zwar andere Adhäsionssysteme an diesem Organ beteiligt sein können (Holzman et al., Cell 56, 37–46 (1989)), der/die Ligand(en) für das periphere Lymphknoten-LHR aber exprimiert wird und daher an der Lymphozytenbindung an das Endothel dieses Lymphorgans mitwirkt/mitwirken.
LITERATURZITATE IN DEN BEISPIELEN

1. Drickamer, K., J. Biol. Chem. 263, 9557 (1988); Drickamer, K., Kidney Int. 32, 167 (1987).
2. Spiess, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 82, 6465 (1985).
3. Muramoto, K., et al., Biochem Biophys. Acta 874, 285 (1986).
4. Leung, J., et al., J. Biol. Chem. 260, 12523 (1985); Holland, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 81, 7338 (1984).
5. Drickamer, K., J. Biol. Chem. 256, 5827 (1981).
6. Kikutani, H., et al., Cell 47, 657 (1986).
7. McPhaul, M., et al., Molec. Cell. Biol. 7, 1841 (1987).
8. Halberg, D., et al., J. Biol. Chem. 262, 9828 (1987).
9. Terzaono, K., et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988).
10. Drickamer, K., et al., J. Biol. Chem. 262, 2582 (1987).
11. Drickamer, K., et al., J. Biol. Chem. 261, 6878 (1986).
12. Hoyle, G., et al., J. Biol. Chem. 263, 7487 (1988).
13. Takahashi, H., et al., J. Biol. Chem. 260, 12228 (1985).
14. Boggaram, V., et al., J: Biol. Chem. 263, 2939 (1988).
15. Kidd, S., et al., Mol. Cell. Biol. 6, 3094 (1986).
16. Hursh, D., et al., Science 237, 1487 (1987).
17. Hojrup, P., et al., FEBS Lett. 184, 333 (1985).
18. Fung, M., et al., Nucl. Acids Res. 12, 4481 (1984).
19. Takeya, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 76, 4990 (1979).
20. McMullen, B., et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 115, 8 (1983).
21. Greenwald, I., Cell 43, 583 (1985).
22. Cool, D., et al., Biol. Chem. 260, 13666 (1985).
23. Gray, A., et al., Nature 303, 722 (1983).
24. Schulz, T., et al., Eur. J. Immunol. 16, 1351 (1986).
25. Kristensen, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 83, 3963 (1986).
26. Lozier, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 81, 3640 (1984).
27. Bentley, D. Biochem. J. 239, 339 (1986).
28. Moore, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 84, 9194 (1987).
29. Bentley, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 81, 1212 (1984).
30. Mole, J., et al., J. Biol. Chem. 259, 3407 (1984).
31. DiScipio, R., et al., J. Biol. Chem. 263, 549 (1988).
32. Kusomoto, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; U.S.A. 85, 7307 (1988).
33. Lintin, S., et al., FEBS Lett. 204, 77 (1986).
34. Caras, I., et al., Nature 325, 545 (1987).
35. Kotwal, G., et al., Nature 335, 176 (1988).

Claims

Immunglobulin-Schwerkettendimer, worin eine Aminosäuresequenz eines Liganden-Bindungspartners, der aus einer einzelnen Kette besteht und ein Rezeptor, Trägerprotein, Hormon, Wachstumsfaktor oder Enzym ist und kein Lymphozyten-Homing-Rezeptor ist, kein Vertreter der Immunglobulin-Gen-Überfamilie oder ein dazu homologes Protein ist und kein aus mehreren Untereinheiten bestehendes Polypeptid ist, für das diskrete Gene kodieren, anstelle der variablen Regionen der Immunglobulin-Schwerketten substituiert ist, wobei die Immunglobulin-Schwerketten zumindest die Hinge-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Schwerkettenregion beibehalten.
Dimer nach Anspruch 1, worin der Liganden-Bindungspartner ein Rezeptor ist.
Dimer nach Anspruch 1, worin der Liganden-Bindungspartner ein Trägerprotein ist.
Dimer nach Anspruch 1; worin der Liganden-Bindungspartner ein Hormon ist.
Dimer Anspruch 1, worin der Liganden-Bindungspartner ein Wachstumsfaktor ist.
Dimer nach Anspruch 1, worin der Liganden-Bindungspartner ein Enzym ist.
Dimer nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend eine von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD oder IgM erhaltene Immunglobulin-Sequenz.
Dimer nach Anspruch 7, umfassend eine konstante Domäne einer IgG-Schwerkette.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das eine Human-Immunglobulinsequenz umfasst.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Liganden-Bindungspartner vom Menschen stammt.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Liganden-Bindungspartner-Protein in der Fusion nicht zur Zellmembran-Verankerung fähig ist.
Dimer nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der Liganden-Bindungspartner ein Zellmembranprotein ist.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Immunglobulin-Kette von einer anderen Spezies stammt als der Bindungspartner.
Dimer nach Anspruch 1, worin zwei variable Regionen durch unterschiedliche Liganden-Bindungspartner-Aminosäuresequenzen substituiert sind.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das nicht mit Glykosylierung assoziiert ist.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem physiologisch annehmbaren Träger.
Dimer nach Anspruch 17, worin der Träger eine sterile, isotonische Lösung ist.
Dimer nach Anspruch 17, worin der Träger eine Retard-Formulierung ist.
Dimer nach Anspruch 17, worin der Träger ein Liposom ist.
Dimer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Immunglobulin-Schwerketten die vollständige konstante Schwerketten-Region beibehalten.
Dimer nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die Immunglobulin-Schwerketten die konstante Schwerketten-Region ohne CH1 beibehalten.