DE69133332T2

DE69133332T2 - Menschliche hematopoietische Stammzellen

Info

Publication number: DE69133332T2
Application number: DE69133332T
Authority: DE
Inventors: Ann Palo Alto Tsukamoto; Charles M. Mountain View Baum; Yukoh Aihara; Irving Palo Alto Weissman
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1990-03-30
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: JP3160600B2; US5750397A; ES2210226T3; EP0451611B1; DE69133332D1; US5763197A; US5716827A; EP1344819A2; AU7398691A; CA2039315A1; EP0451611A2; EP1344819A3; EP0451611A3; JP3017320B2; US5061620A; CA2039315C; US5643741A; US5914108A; ATE253112T1; JP2000078968A

Description

EINLEITUNG
Technisches Gebiet
Das Gebiet der Erfindung ist die Isolierung, Regenerierung und Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen.
Hintergrund
Säugerblutzellen sorgen für einen außergewöhnlich verschiedenartigen Bereich von Aktivitäten. Die Blutkörperchen werden in mehrere Zelllinien, einschließlich lymphoide, myeloide und erythroide Zelllinien, unterteilt. Die lymphoide Zelllinie, die B-Zellen und T-Zellen umfasst, sorgt für die Erzeugung von Antikörpern, die Regelung des zellulären Immunsystems, den Nachweis von Fremderregern im Blut, den Nachweis von Zellen, die für den Wirt fremd sind, und dergleichen. Die myeloide Zelllinie, die Monozyten, Granulozyten, Megakaryozyten sowie andere Zellen umfasst, überwacht das Vorhandensein von Fremdkörpern im Blutstrom, sorgt für Schutz gegen neoplastische Zellen, fängt Fremdmaterialien im Blutstrom, erzeugt Thrombozyten und dergleichen. Die erythroide Zelllinie erzeugt die roten Blutkörperchen, die als Sauerstoffträger wirken.
Trotz der Unterschiedlichkeit der Natur, Morphologie, Charakteristika und Funktionen der Blutkörperchen wird gegenwärtig angenommen, dass es einen einzigen Vorläufer gibt, der zur Selbstregenerierung fähig ist und durch Einwirkung von Wachstumsfaktoren einer spezifischen Zelllinie dediziert wird.
Die Stammzellenpopulation macht nur einen kleinen Prozentsatz der Gesamtanzahl an Leukozyten im Knochenmark aus. Des weiteren ist gegenwärtig nicht be kannt, wie viele der mit differenzierten Zellen assoziierten Marker auch an der Stammzelle vorhanden sind. Ein Marker, von dem berichtet wird, dass er für eine gewisse Verstärkung der Vorläuferaktivität sorgt, ist Klasse II HLA (insbesondere ein konserviertes DR-Epitop, das von einem monoklonalen Antikörper, der als J143 bezeichnet wird, erkannt wird). Diese Marker sind jedoch an zahlreichen, zelllinienfestgelegten hämatopoetischen Zellen zu finden. Ein Marker; von dem angegeben ist, dass er an Stammzellen vorhanden ist, CD34, ist auch an einer beträchtlichen Anzahl von zelllinienfestgelegten Vorläufern zu finden. Insbesondere B-Zellen (CD19+) und myeloide Zellen (CD33+) machen 80 bis 90% der CD34+ Population aus. Des weiteren markiert eine Kombination von CD3, 8, 10, 15, 19, 20 und 33 > 90% aller CD34+ Zellen. Deshalb sind angesichts des geringen Anteils der Gesamtanzahl der Zellen im Knochenmark, die Stammzellen sind, der Ungewissheit der Marker, die im Unterschied zu differenzierteren Zellen mit der Stammzelle assoziiert sind, und der allgemeinen Unfähigkeit, biologische Untersuchungen mit Bezug auf humane Stammzellen durchzuführen, die Identifizierung und Reinigung von Stammzellen unzuverlässig. Kürzlich wurde die Mausstammzelle in einer zumindest hoch konzentrierten, wenn nicht gereinigten Form erhalten, wobei weniger als etwa 30 Zellen, die aus dem Knochenmark erhalten wurden, fähig waren, die gesamten Zelllinien des hämatopoetischen Systems einer mit tödlichen Strahlen bestrahlten Maus zu rekonstituieren. Tatsächlich sollte eine injizierte Zelle imstande sein, alle hämatopoetischen Zelllinien zu rekonstituieren.
Das Thy-1-Molekül ist ein hochkonserviertes Protein, das im Hirn und im hämatopoetischen System von Ratten, Mäusen und Menschen vorhanden ist. Diese Spezies exprimieren dieses Antigen unterschiedlich, und die wahre Funktion dieses Moleküls ist unbekannt. Das Thy-1-Molekül wurde jedoch an hämatopoetischen Stammzellen von Ratten und Mäusen identifiziert. Dieses Protein ist auch an humanen Knochenmarkzellen vorhanden und ist für die Auswahl von hämatopoetischen Stammzellen brauchbar.
Es besteht ein großes Interesse daran, die humane hämatopoetische Stammzelle zu identifizieren. Wenn man im Besitz der Stammzelle ist, gestattet dies die Identifizierung von Wachstumsfaktoren, die mit ihrer Selbstregenerierung assoziiert sind. Des Weiteren könnte es noch unentdeckte Wachstumsfaktoren geben, die assoziiert sind mit (1) den frühen Stufen der Dedizierung der Stammzelle zu einer bestimmten Zelllinie; (2) der Verhinderung einer solchen Dedizierung; und (3) der negativn Kontrolle der Stammzellenproliferation. Die Verfügbarkeit von Stammzellen wäre bei der Knochenmarktransplantation sowie bei der Transplantation anderer Organe im Zusammenhang mit der Transplantation von Knochenmark extrem nützlich. Stammzellen sind wichtige Ziele für die Gentherapie, wo die insertierten Gene die Gesundheit der Person, in die die Stammzellen transplantiert werden, fördern. Des weiteren kann die Fähigkeit, die Stammzellen zu isolieren, bei der Behandlung von Lymphomen und Leukämien sowie von anderen neoplastischen Zuständen, z. B. Brustkrebs, nützlich sein. So gab es überall auf der Welt Anstrengungen in Richtung auf die Isolierung der humanen hämatopoetischen Stammzelle in im Wesentlichen reiner oder reiner Form.
Relevante Literatur
US-Patent Nr. 4,714,680 beschreibt eine Zusammensetzung, die humane Stammzellen aufweist. EPA 0 341 966 beschreibt die Isolierung von Stammzellen der Maus. Über Analysen mit Bezug auf hämatopoetische Vorläufer wurde von Whitlock und Witte, PNAS USA (1982) 79: 3608 und Whitlock et al., Cell (1987) 48: 1009, berichtet. Thy-1 ist ein Oberflächenmarker von rekonstituierenden Knochenmarkstammzellen von Nagetieren (Berman und Baush Exp. Hematol. (1985) 13: 1952 und Goldschneider et al., J. Exp. Med. (1978) 148: 1351). Müller-Sieburg et al., Cell (1986) 44: 653 beschreiben Thy-1¹⁰ Lin^– hämatopoetische Mausstammzellen und die Verwendung einer Grenzverdünnung.
Eine Übersicht über die humanen Zelllinienmarker wird von Bundschuh et al., 1988 (Lexikon der Immunologie, Seiten 238–239) gegeben. Andrews et al., Mai 1989: J. Exp. Medicine, Band 169, Seiten 1721–1731, beschreiben die Erkenntnis, dass die Expression der CD33- und CD34-Antigene beim Menschen Vorläufer von koloniebildenden Zellen von koloniebildenden Zellen unterscheiden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zur Verfügung gestellt werden Verfahren, die zur Isolierung von im Wesentlichen homogenen Zusammensetzungen von humanen hämatopoetischen Stammzellen führen. Bei den Verfahren werden ein vorbestimmter Abtrennungsplan und Bioassays für das Festlegen der Erzeugung von jeder der hämatopoetischen Zelllinien aus den isolierten Zellen verwendet. Diese humanen Stammzellen finden Anwendung (1) beim Regenerieren des hämatopoetischen Systems eines Wirts, dem es an Stammzellen mangelt, (2) bei einem Wirt, der erkrankt ist und durch Entfernen von Knochenmark, Isolieren von Stammzellen und Behandlung von Personen mit Medikamenten oder Strahlung vor dem erneuten Transplantieren der Stammzellen behandelt werden kann, (3) beim Erzeugen verschiedener hämatopoetischer Zellen, (4) beim Nachweis und bei der Bewertung von Wachstumsfaktoren, die für die Stammzellenselbstregenerierung relevant sind, (5) bei der Entwicklung von hämatopoetischen Zelllinien und der Untersuchung mit Bezug auf Faktoren, die mit der hämatopoetischen Entwicklung verbunden sind, und (6) bei der Behandlung von genetischen Krankheiten durch das Ersetzen von Genen in autologen Stammzellen.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bereitgestellt wird eine Zusammensetzung von fetalen und/oder adulten hämatopoetischen Zellen, die im Wesentlichen frei von Zellen ist, die einer bestimmten Zelllinie dediziert sind, wobei die Zellen Marker tragen, die mit einer Zellliniendedizierung assoziiert sind, wobei die Stammzellen fähig sind, sich zu regenerieren und differenzieren, um die verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien zu besetzen. Die im Wesentlichen homogene Zusammensetzung kann durch selektive Isolierung von Zellen, die frei von Markern sind, die mit differenzierten Zellen assoziiert sind, während sie epitope Charakteristika aufweisen, die mit Stammzellen assoziiert sind, und durch Regenerierung der isolierten Stammzellen in definierten Kultursystemen, die zu unterschiedlichen hämatopoetischen Zelllinien führen, erhalten werden.
Die hämatopoetischen Stammzellen sind sowohl durch die Anwesenheit von Markern, die mit spezifischen durch Antikörper identifizierten epitopen Stellen assoziiert sind, als auch durch das Fehlen von bestimmten Markern gekennzeichnet, wie dies durch das Fehlen des Bindens von bestimmten Antikörpern identifiziert ist. Es ist nicht notwendig, dass die Auswahl mit einem für Stammzellen spezifischen Marker erreicht wird. Durch Verwendung einer Kombination der negativen Auswahl (Entfernung von Zellen) und der positiven Auswahl (Isolierung von Zellen) kann eine im Wesentlichen homogene Stammzellenzusammensetzung erzielt werden.
Falls gewünscht, kann ein großer Anteil von differenzierten Zellen entfernt werden, indem anfänglich eine "relativ grobe" Abtrennung verwendet wird. Die Quelle der Zellen kann das Knochenmark, eine fetale, neonatale oder adulte oder eine andere Quelle hämatopoetischer Zellen sein, beispielsweise fetale Leber, peripheres Blut, Nabelschnurblut und dergleichen. Beispielsweise können anfänglich Magnetkügelchenabtrennungen verwendet werden, um eine große Anzahl der zelllinienfestgelegten Zellen, nämlich der Hauptzellpopulationen der hämatopoetischen Systeme, einschließlich solcher Zelllinien wie T-Zellen, B-Zellen (sowohl prä-B- als auch B-Zellen), myelomonozytische Zellen oder kleinere Zellpopulationen wie Megakaryozyten, Mastzellen, Eosinophile und Basophile zu entfernen. Wünschenswerterweise werden mindestens etwa 70%, üblicherweise mindestens 80% der gesamten hämatopoetischen Zellen entfernt. Es ist nicht wesentlich, jede dedizierte Zellklasse, insbesondere die geringeren Populationsmitglieder, in der anfänglichen Stufe zu entfernen. Üblicherweise werden die Thrombozyten und Erythrozyten vor dem Sortieren entfernt. Da es in dem Protokoll eine positive Se lektion gibt, werden die dedizierten Zellen, denen der positiv ausgewählte Marker fehlt, zurückgelassen. Es wird jedoch bevorzugt, dass es für alle dedizierten Zelllinien eine negative Selektion gibt, so dass in der letzten positiven Selektion die Anzahl der vorhandenen dedizierten Zellen auf ein Minimum herabgesetzt ist.
Die hämatopoetischen Stammzellen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie größtenteils CD34⁺, CD3^–, CD7^–, CD8^–, CD10^–, CD14^–, CD15^–, CD19^–, CD20^–, CD33^– und Thy-1⁺ sind. Eine Zellzusammensetzung mit einer hohen Stammzellenkonzentration ist CD34⁺, CD10^–, CD19^– und CD33^–, insbesondere des weiteren CD3^– und CD8^–, vorzugsweise des weiteren Thy-1⁺. CD3^–, 8^–, 10^–, 19^–, 20^– und 33^– werden als Lin^– bezeichnet. Die CD10/19/20-Marker sind mit B-Zellen assoziiert, die CD3/4/8-Marker sind mit T-Zellen assoziiert, die CD14/15/33-Zellmarker sind mit myeloiden Zellen assoziiert. Der Thy-1-Marker fehlt bei humanen T-Zellen. Bei humanem CD34⁺ kann Rhodamin 123 die Zellen auch in hohe und niedrige Teilmengen teilen (siehe Spangrude; (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7433 bezüglich einer Beschreibung der Verwendung von Rhodamin 123 bei Mausstammzellen). Vorzugsweise weisen die Zellen wenig Rhodamin auf.
Um die erfindungsgegenständlichen Stammzellen zu erhalten, ist es notwendig, die seltene pluripotente humane Stammzelle aus den anderen Zellen im Knochenmark oder einer anderen hämatopoetischen Quelle zu isolieren. Anfänglich können Knochenmarkszellen aus einer Quelle des Knochenmarks, beispielsweise Darmbeinkamm, Tibia, Femora, Wirbelsäule oder anderen Knochenhöhlen, erhalten werden. Andere Quellen humaner hämatopoetischer Stammzellen umfassen die fetale Leber, die fetale und adulte Milz, Blut, einschließlich adultes peripheres Blut und Nabelschnurblut.
Für die Isolierung des Knochenmarks aus fetalem Knochen oder einer anderen Knochenquelle kann eine geeignete Lösung verwendet werden, um den Knochen zu spülen, wobei die Lösung eine ausgewogene Salzlösung ist, die in geeigneter Weise mit fetalem Kalbsserum oder anderen in der Natur vorkommenden Fakto ren, zusammen mit einem akzeptablen Puffer mit niedriger Konzentration, im Allgemeinen von 5 bis 25 mM, ergänzt, ist. Geeignete Puffer umfassen Hepes, Phosphatpuffer, Lactatpuffer usw. Ansonsten kann Knochenmark auch aus dem Knochen mittels üblicher Methoden abgesaugt werden.
Die morphologische Bewertung der 34+Thy+Lin– Zellen zeigt an, dass die multipotenten Vorläufer, "Stammzellen" von mittlerer Größe sind. Die Lichtstreuungsbewertung zeigt, dass "Stammzellen" ein Stammzellenprofil mit geringer Seitenstreuung aufweisen. Diese Beobachtungen zeigen, dass die "Stammzellen", ein einzigartiges Dichteprofil aufweisen. Es wurde gefunden, dass die Fraktionen mit niedriger Dichte aus dem dichtefraktionierten humanen Knochenmark mit Bezug auf CD34+Thy+Lin– Zellen angereichert sind.
Verschiedene Techniken können verwendet werden, um die Zellen abzutrennen, indem anfänglich Zellen einer dedizierten Zelllinie entfernt werden. Monoklonale Antikörper sind für das Identifizieren von Markern (Oberflächenmembranproteinen), die mit bestimmten Zelllinien und/oder Stufen der Differenzierung verbunden sind, besonders brauchbar. Die Antikörper können an einen festen Träger angeheftet werden, um eine Grobabtrennung zu ermöglichen. Die verwendeten Abtrennungstechniken sollten die Erhaltung der Lebensfähigkeit der zu sammelnden Fraktion maximieren. Bei "relativ groben" Abtrennungen, d. h. Abtrennungen, bei denen bis zu 10%, üblicherweise nicht mehr als etwa 5%, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1% der vorhandenen gesamten Zellen, die den Marker aufweisen, in der zurückzuhaltenden Zellpopulation verbleiben können, können verschiedene Techniken unterschiedlicher Wirksamkeit verwendet werden. Die besondere verwendete Technik hängt von der Wirksamkeit der Abtrennung, der Zytotoxizität der Methodik, der Mühelosigkeit und Geschwindigkeit der Durchführung und der Notwendigkeit ausgeklügelter Geräte und/oder technischer Fähigkeiten ab.
Abtrennungsverfahren können die magnetische Abtrennung unter Verwendung von mit Antikörpern beschichteten Magnetkügelchen, Affinitätschromatographie, zytotoxischen Mitteln, die mit einem monoklonalen Antikörper verbunden sind oder in Zusammenhang mit einem monoklonalen Antikörper verwendet werden, beispielsweise Komplemente und Zytotoxine und "Panning" mit einem an eine Feststoffmatrix, z. B. eine Platte gebundenen Antikörper, oder andere geeignete Techniken umfassen. Techniken, die für eine genaue Abtrennung sorgen, umfassen mit Fluoreszenz aktivierte Zellsortierer, die einen unterschiedlichen Grad an Komplexität aufweisen, beispielsweise eine Vielzahl von Farbkanälen, Kanäle, die Kleinwinkel- und Stumpfwinkellichtstreuung feststellen, Impedanzkanäle usw.
Ein Verfahren, das verwendet werden kann, besteht darin, dass in einer ersten Stufe nach dem Inkubieren der Zellen aus dem Knochenmark während eines kurzen Zeitraums bei verringerten Temperaturen, im Allgemeinen etwa 4°C, mit gesättigten Konzentrationen von Antikörpern, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, beispielsweise CD3 und 8 für T-Zellendeterminanten, die Zellen dann mit einem fetalen Kalbsserum-(FCS)-Kissen gewaschen werden können. Die Zellen können dann in einem Puffermedium wie vorstehend beschrieben suspendiert und mit Hilfe der Antikörper für die bestimmte Determinanten unter Verwendung verschiedener Proteine abgetrennt werden, die für die Antikörper oder den Antikörper-Antigen-Komplex spezifisch sind.
Geeigneterweise können die Antikörper mit Markern wie Magnetkügelchen, die die direkte Abtrennung gestatten, Biotin, das mit an einem Träger gebundenes Avidin oder Streptavidin entfernt werden kann, Fluorochromen, die mit einem mit Fluoreszenz aktivierten Zellsortierer verwendet werden können, oder dergleichen konjugiert werden, um die einfache Abtrennung eines bestimmten Zelltyps zu ermöglichen. Jede Technik, die für die Lebensfähigkeit der verbleibenden Zellen nicht übermäßig schädlich ist, kann verwendet werden.
Geeigneterweise können nach einer beträchtlichen Anreicherung der Zellen, denen die reifen Zellmarker fehlen, im Allgemeinen um fast etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 70%, die Zellen jetzt mittels eines mit Fluoreszenz aktivierten Zellsortierers (FACS) oder einer anderen Methode mit einer hohen Spezifizität abgetrennt werden. Mehrfarbenanalysen können mit dem FACS verwendet werden, was besonders geeignet ist. Die Zellen können auf der Grundlage des Grads der Anfärbung für die bestimmten Antigene abgetrennt werden. Bei einer ersten Abtrennung kann nach dem Beginn mit mindestens etwa 1 × 10¹⁰, vorzugsweise mindestens etwa 3 × 10¹⁰ Zellen, der Antikörper für CD34 mit einem Fluorochrom markiert werden, während die Antikörper für die verschiedenen dedizierten Zelllinien an ein unterschiedliches Fluorochrom konjugiert werden können. Fluorochrome, die bei einer Mehrfarbenanalyse Anwendung finden können, umfassen Phycobiliproteine, z. B. Phycoerythrin und Allophycocyanine, Fluorescein, Texas Rot usw.. Während jede der Zelllinien in einem separaten Schritt abgetrennt werden kann, werden die Zelllinien wünschenswerterweise gleichzeitig abgetrennt, da eine Zelllinie CD34 oder einen äquivalenten Marker positiv selektiert. Im Allgemeinen ist die Anzahl der erhaltenen Zellen kleiner als etwa 1% der ursprünglichen Zellen, meistens weniger als etwa 0,5%. Sie kann auch nur 0,2% oder weniger betragen.
Die Zellen können dann weiter durch positives Selektieren für Thy⁺ abgetrennt werden, wobei die Zellen im Allgemeinen weniger als 0,5% der ursprünglichen Zellen ausmachen und im Allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 0,5% liegen. Die Zellen können gegen tote Zellen unter Verwendung von Farbstoffen, die mit toten Zellen assoziiert sind (Propidiumiodid, LDS), selektiert werden. Wünschenswerterweise werden die Zellen in einem Medium gesammelt, das 2% fetales Kalbsserum enthält. Andere Techniken für die positive Selektion können verwendet werden, die eine genaue Abtrennung gestatten, wie Affinitätskolonnen oder dergleichen. Das Verfahren sollte das Entfernen bis auf eine Restmenge von weniger als etwa 20%, vorzugsweise weniger als etwa 5%, der Nichtstammzellpopulationen gestatten.
CD34⁺Lin^– und CD34⁺Lin^–Thy-1⁺ weisen geringe Seitenstreuungs- und geringe Vorwärtsstreuungsprofile mittels FACS-Analyse auf. Cytospin-Zubereitungen zeigen, dass die Stammzellen eine Größe zwischen reifen Lymphoidzellen und reifen Granulozyten aufweisen. Zellen können auf der Grundlage von Lichtstreuungseigenschaften sowie ihrer Expression von verschiedenen Zelloberflächenantigenen selektiert werden.
Es wird zwar angenommen, dass die bestimmte Reihenfolge der Abtrennung für diese Erfindung nicht kritisch ist, doch die angegebene Reihenfolge wird bevorzugt. Vorzugsweise werden Zellen anfänglich durch eine grobe Abtrennung, gefolgt von einer feinen Abtrennung mit positiver Selektion eines mit Stammzellen assoziierten Markers und einer negativen Selektion mit Bezug auf Marker, die mit zelllinienfestgelegten Zellen assoziiert sind, abgetrennt. Auf diese Abtrennung folgt eine Selektion mit Bezug auf eine zelluläre Zusammensetzung mit einem Mehrzelllinien-Potential und verbesserter Selbstregenerierungsfähigkeit.
Zusammensetzungen mit mehr als 90%, üblicherweise mehr als etwa 95% humaner hämatopoetischer Stammzellen können auf diese Weise erzielt werden, wobei die gewünschten Stammzellen dadurch identifiziert werden, dass sie CD34⁺, Lin^– and Thy-1⁺ sind und fähig sind, für eine Zellregenerierung und die Entwicklung von Mitgliedern aller unterschiedlichen hämatopoetischen Zelllinien zu sorgen. Letztendlich könnte eine einzige Zelle aus einer Stammzellenzusammensetzung erhalten und für die langfristige Rekonstitution eines immundefizienten Menschen verwendet werden, wenn man sicher wäre, dass sich die Zelle in vivo in der richtigen Umgebung befinden würde.
Es wurde gefunden, dass die erfindungsgegenständlichen Zusammensetzungen für die Produktion von myeloiden Zellen und lymphoiden Zellen in geeigneten Kulturen sorgen, wobei Kulturen mit Hydrokortison für die Produktion myeloider Zellen (mit Kulturen vom Dexter-Typ assoziiert) und B-Lymphozyten in Kulturen, denen Hydrokortison (mit Kulturen vom Whitlock-Witte-Typ assoziiert) fehlt, sorgen. Bei jeder der Kulturen werden Maus- oder humane Stromazellen geschaffen, die aus unterschiedlichen Stämmen, AC3 oder AC6, Stromazellen, die aus Maus- oder humanem fetalen Knochenmark durch Selektion mit Bezug auf die Fähigkeit, humane Stammzellen aufrechtzuerhalten, abgeleitet sind, und dergleichen stammen können. Das für die Kultivierung der Zellen verwendete Medium ist geeigneterweise ein definiertes angereichertes Medium wie IMDM (Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium), eine 50 : 50 Mischung von IMDM und RPMI, und besteht im Allgemeinen aus Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, 5 × 10^–5 M 2-ME, Streptomycin/Penicillin und 10% fetalem Kalbsserum, und kann von Zeit zu Zeit, im Allgemeinen mindestens einmal bis zweimal pro Woche, ausgewechselt werden. Insbesondere durch das Übertragen von Zellen von einer Kultur mit Hydrokortison in eine andere Kultur ohne Hydrokortison und das Demonstrieren der Produktion von Mitgliedern der unterschiedlichen Zelllinien in den unterschiedlichen Kulturen wird die Gegenwart der Stammzelle und ihre Aufrechterhaltung unterstützt. Auf diese Weise kann die Produktion von sowohl myeloiden Zellen als auch B-Zellen identifiziert werden.
Um die Differenzierung zu T-Zellen zu zeigen, kann man fetalen Thymus isolieren und den Thymus 4 bis 7 Tage bei etwa 25°C kultivieren, um die lymphoide Population des fetalen Thymus im Wesentlichen zu erschöpfen. Die zu testenden Zellen werden dann in das Thymusgewebe mikroinjiziert, wo die HLA der Population, die injiziert wird, mit der HLA der Thymuszellen fehlgepaart wird. Das Thymusgewebe kann dann in eine SCID/SCID-Maus, wie in EPA 0 322 240 beschrieben, transplantiert werden, insbesondere durch Transplantieren in die Nierenkapsel.
Bei roten Blutkörperchen kann man herkömmliche Techniken verwenden, um BFU-E-Einheiten zu identifizieren, beispielsweise eine Methylcellulosekultur (Metcalf (1977) In: Recent Results in Cancer Research 61, Springer-Verlag, Berlin, Seiten 1–227), was zeigt, dass die Zellen fähig sind, die erythroide Zelllinie zu entwickeln.
Beim Identifizieren der myeloiden und B-Zellen-Fähigkeit wird die zu testende Population in geeigneter Weise zuerst in ein Hydrokortison enthaltendes Kulturmedium eingeführt und sechs Wochen in einem solchen Kulturmedium wachsen gelassen. Das verwendete Medium umfasst eine 50 : 50 Mischung von RPMI 1640 und IMDM, das 10% FCS, 10% Pferdeserum, Streptomycin/Penicillin, Glutamin und 5 × 10^–7 M Hydrokortison enthält. Während des sechswöchigen Zeitraums wäre es zu erwarten, dass bei Fehlen der Vorläuferzellen alle reifen Zellen sterben würden. Falls am Ende von sechs Wochen immer noch myeloide Zellen beobachtet werden, kann daraus geschlossen werden, dass es eine Vorläuferzelle gibt, die für die kontinuierliche Differenzierung zu myeloiden Zellen sorgt. Zu diesem Zeitpunkt kann man dann das Medium wechseln, so dass dem Medium jetzt Hydrokortison fehlt, um das Wachstum von B-Zellen anzuregen. Wenn man 3 bis 4 Wochen wartet und das Vorhandensein von B-Zellen mittels FACS-Analyse nachweist, kann daraus geschlossen werden, dass die Vorläuferzellen, die zuvor fähig waren, myeloide Zellen zu produzieren, auch fähig sind, B-Zellen zu produzieren. Humane hämatopoetische Zellen, die in Gegenwart von Hydrokortison gezüchtet wurden, können mindestens vier Monate aufrechterhalten werden. In gleicher Weise enthalten humane hämatopoetische Zellen, die in Abwesenheit von Hydrokortison gezüchtet wurden, mindestens vier Monate lang B-Lymphozyten (CD19+) sowie myelomonozytische Zellen. Aus diesen Kulturmedien kann man mit Bezug auf CD34+ Lin–, CD34+ Thy+, Thy+Lin– oder CD34+ Thy+ Lin– sortieren, was eine Zusammensetzung ergeben sollte, die im Wesentlichen mit Bezug auf die hämatopoetische Vorläuferstammzelle konzentriert ist. Die aus diesen Kulturmedien erhaltenen CD34+Lin^–-, CD34+Thy+-, Thy+Lin^–- oder CD34+Thy+Lin^– -Zellen führen zu B-Zellen, T-Zellen und myelomonozytischen Zellen in den vorstehend beschriebenen Assays.
Eine pluripotente humane hämatopoetische Stammzelle kann wie folgt definiert werden: (1) sie führt zu Nachkommen in allen definierten hämatolymphoiden Zelllinien und (2) eine begrenzte Anzahl der Zellen ist fähig, einen ernsthaft immungeschädigten, humanen Wirt in allen Blutzelltypen und ihren Vorläufern, ein schließlich der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle, durch Zellerneuerung vollständig zu rekonstituieren. Bei den erfindungsgegenständlichen Zusammensetzungen können im Vergleich zu der Anzahl von Stammzellen, die in den gesamten Knochenmarktransplantaten (~10⁷) enthalten ist, weniger als insgesamt etwa 10⁷ Zellen, üblicherweise weniger als 10⁶ Zellen, verwendet werden, um einen immungeschädigten humanen Wirt zu rekonstituieren. Die Anzahl der Zellen ist erforderlich, um sicherzustellen, dass ein geeignetes Seeding an einer geeigneten Stelle stattfindet, an der sich die Stammzelle selbst erneuern kann. Die Anzahl der erforderlichen Zellen, die an einer geeigneten Stelle zur Selbsterneuerung geseedet wird, kann weniger als 50 Zellen betragen, und nur insgesamt etwa 20 Zellen oder weniger sind imstande, die vorstehend angegebenen Bedingungen zu erfüllen. So sind die erfindungsgegenständlichen Zusammensetzungen auf der Grundlage der für die früheste pluripotente Vorläuferstammzelle gesetzten Standards fähig, diese Erfordernisse zu erfüllen. Des weiteren scheinen die erfindungsgegenständlichen Zellen auf der Grundlage der Analyse der Knochenmarkzellen in einem Bereich von etwa 0,01 bis 0,1% Knochenmarkzellen, insbesondere 0,01 bis 0,05% zu liegen.
Wenn die hämatopoetischen Stammzellen isoliert worden sind, können sie durch Wachsenlassen in einem konditionierten Medium aus Stromazellen, wie Stromazellen, die aus dem Knochenmark, dem fetalen Thymus oder der fetalen Leber erhalten werden können, vermehrt werden, und es wird gezeigt, dass sie für die Absonderung von Wachstumsfaktoren, die mit dem Aufrechterhalten von Stammzellen assoziiert sind, sorgen, bei einer Kokultivierung mit solchen Stromazellen oder in einem Medium, das Aufrechthaltungsfaktoren umfasst, die die Proliferation von Stammzellen unterstützen, wobei die Stromazellen allogen oder xenogen sein können. Vor der Verwendung in dem Kokulturmedium können die gemischten Stromazellenzubereitungen von hämatopoetischen Zellen unter Verwendung geeigneter monoklonaler Antikörper zur Entfernung der unerwünschten Zellen befreit werden, beispielsweise mit Antikörper-Toxin-Konjugaten, Antikörper und Komplement usw. Alternativ können geklonte Stromazelllinien in Fällen verwendet werden, in denen die Stromazelllinien allogen oder xenogen sein können.
Die erfindungsgegenständlichen Zellzusammensetzungen können auf verschiedene Weise Verwendung finden. Da die Zellen naiv sind, können sie verwendet werden, um einen bestrahlten Wirt und/oder einen Wirt, der einer Chemotherapie unterzogen wurde, vollständig zu rekonstituieren, oder als Quelle von Zellen für spezifische Zelllinien verwendet werden, indem für ihre Reifung, Proliferation und Differenzierung in eine oder mehr ausgewählte Zelllinien durch Verwendung einer Vielzahl von Faktoren, wie Erythropoetin, koloniestimulierenden Faktoren, z. B. GM-CSF, G-CSF oder M-CSF, Interleukinen, z. B. IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 usw., Leukemia Inhibitory Factory (LIF), Steel Factor (Stl), oder dergleichen gesorgt wird, oder Stromazellen, die mit Stammzellen assoziiert sind, werden auf eine bestimmte Zelllinie festgelegt, oder mit ihrer Proliferation, Reifung und Differenzierung ... [AdÜ: Satzteil entweder doppelt oder unvollständig]. Die hämatopoetischen Stammzellen können auch bei der Isolierung und Bewertung von Faktoren verwendet werden, die mit der Differenzierung und Reifung von hämatopoetischen Zellen assoziiert sind. So können diese Stammzellen in Assays verwendet werden, um die Aktivität von Medien, wie konditionierten Medien zu bestimmen, Fluida für die Zellwachstumsaktivität, die Involvierung mit Dedizierung bestimmter Zelllinien und dergleichen zu bewerten.
Die hämatopoetischen Stammzellen können für die Behandlung genetischer Krankheiten verwendet werden. Mit hämatopoetischen Zellen assoziierte, genetische Krankheiten können durch die genetische Modifizierung autologer oder allogener Stammzellen behandelt werden, um den genetischen Defekt zu korrigieren. Beispielsweise können Krankheiten wie B-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Adenosindesaminasemangel, Rekombinasemangel, Rekombinaseregulatorgenmangel usw. durch Einführen eines Wildtyp-Gens in die Stammzellen, entweder durch homologe oder ungeordnete Rekombination, korrigiert werden. Mit allogenen Stammzellen können normale Zellen, die keinen genetischen Defekt haben, als Therapie verwendet werden. Andere Indikationen der Gentherapie sind die Einführung von Drogenwiderstandsgenen, um normalen Stammzellen einen Vorteil zu verschaffen und sie selektivem Druck auszusetzen, z. B. Multiple Drug Resistance Gene (MDR). Andere Krankheiten als solche, die mit hämatopoetischen Zellen assoziiert sind, können ebenfalls behandelt werden, z. B. Fälle, bei denen die Krankheit mit dem Mangel eines bestimmten abgesonderten Produkts wie eines Hormons, Enzyms, Interferons, Faktors oder dergleichen zusammenhängt. Durch Verwenden eines geeigneten Regulationsinitiationsbereichs kann die induzierbare Produktion des fehlenden Proteins erzielt werden, so dass die Produktion des Proteins der natürlichen Produktion entspricht, obgleich die Produktion in einem Zelltyp stattfindet, welcher sich von dem Zelltyp unterscheidet, der normalerweise ein solches Protein produziert. Es ist auch möglich, ein Ribozym, Antisinn- (Antisense-) oder andere Informationen zu insertieren, um bestimmte Genprodukte oder die Anfälligkeit gegenüber Krankheiten, insbesondere hämatolymphotropen Krankheiten zu inhibieren.
Alternativ kann es erwünscht sein, einen bestimmten variablen Bereich eines T-Zellenrezeptors aus dem T-Zellenrepertoire zu entfernen. Durch Verwendung homologer Rekombination oder Antisinn- oder Ribozymsequenz, welche die Expression verhindert, kann die Expression eines bestimmten T-Zellenrezeptors inhibiert werden. Für hämatotrope Pathogene, wie HIV, HTLV-I und II usw., könnten die hämatopoetischen Stammzellen genetisch modifiziert werden, um eine Antisinn-Sequenz oder Ribozym einzuführen, die bzw. das die Proliferation des Pathogens in der Stammzelle oder in von den Stammzellen differenzierten Zellen verhindern würde.
Verfahren zur Rekombination in Säugerzellen sind in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1989) Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor, NY, zu finden.
Die Zellen können bei Flüssigstickstofftemperaturen eingefroren und längere Zeit gelagert werden, wobei sie aufgetaut und wieder verwendet werden können. Die Zellen werden üblicherweise in 10% DMSO, 70% autologem Plasma (mit 2500 Rad bestrahlt), 20% TC 199 (Gewebekulturmedium) aufbewahrt. Die Zellen werden in einem programmierbaren Gefrierapparat in flüssigem Stickstoff auf –180°C eingefroren. Nach dem Auftauen können die Zellen durch Verwendung von Wachstumsfaktoren oder Stromazellen, die mit der Stammzellproliferation und -differenzierung assoziiert sind, expandiert werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angeboten.
EXPERIMENTELLER TEIL
Materialien und Verfahren
Antikörper. Die Antikörper für die verschiedenen Marker werden wie folgt erhalten: CD3, 8, 10, 14, 15, 19, 20, 33, 34 (Becton-Dickinson) CD33 (Coulter Immunology), (Dalchau und Fabre, J. Exp. Med. (1979) 149: 576). Der CD34 Antikörper (IgG3) Tük3, erhalten von A. Ziegler (in Leukocyte Typing IV; White cell differentiation antigens 1989, 817). Die CD3, -8, -10, -14, -15, -19, -20, -33 wurden als FITC-Konjugate gekauft. Der Antikörper von Ziegler wurde unter Verwendung des geeigneten Anti-IgG3, an Fluorescein (FL) oder Phycoerythrin (PE) oder Texas Rot (TR (Caltag) konjugiert, nachgewiesen. Der Thy-1-Antikörper war ein Fluorescein-, Phycoerythrin- oder Biotinkonjugat, wobei das Biotinkonjugat mit TR, FL oder PE-Avidin (Caltag) nachgewiesen wurde.
Analyse und Sortieren mit mit Fluoreszenz aktiviertem Zellsortierer (FACS) Ein Becton-Dickinson FACS, der wie beschrieben (Parks und Herzenberg, Meth. Enzymol. (1984) 108: 197) modifiziert wurde, wurde verwendet. Das Duallaser instrument gestattet das Aufzeichnen von vier Fluoreszenzparametern und zwei Lichtstreuungsparametern für jede analysierte Zelle. Restliche Erythrozyten und tote Zellen und Trümmer wurden aus der Analyse mittels Lichtstreuungsausblenden und PI-(Propidiumiodid)-Färbung oder durch Streuen allein in Vierfarbanalysen ausgeschlossen. Ein Ausgleich für räumliche Überlappungen von Fluorescein and Phycoerythrin und Fluorescein und Propidiumiodid wurde wie beschrieben (Parks and Herzenberg, (1984) siehe oben) elektronisch eingestellt. Vier Farbfärbungen wurden unter Verwendung von mehreren Kombinationen der gleichen Reagenzien, die mit Bezug auf unterschiedliche Fluorochrome konjugiert wurden, durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse ungeachtet der verschiedenen räumlichen Überlappungen der Fluorochrome beständig waren. Des weiteren wurden die Ergebnisse der Vierfarbanalysen durch Vergleich mit Daten aus Zwei- und Dreifarbanalysen kalibriert.
Für das Zellsortieren wurden die gefärbten Proben während des ganzen Sortierungsvorgangs bei 4°C gehalten. Sortierte Tropfen wurden in RPMI 1640 gesammelt, das 10% fetales Kalbsserum enthielt (Hazelton Biologics Inc., Lenexa, KS). Bei zwei Farbsortierungen wurden Phycoerythrin zur Markierung von CD34 und Fluorescein zur Markierung von LIN-Zellen verwendet, wobei Propidiumiodid (PI) zur Markierung toter Zellen verwendet wurde, wobei beide Signale in einem einzigen FACS-Kanal nachgewiesen und ausgeschlossen wurden. Bei drei Farbsortierungen wurden Texas Rot zur Markierung von CD34, Phycoerythrin zur Markierung von Lin-Zellen und Fluorescein zur Markierung von Thy-1-Zellen verwendet. Nach dem Isolieren einer Zellpopulation mittels FACS wurde die Probe 1 : 1 in HBSS verdünnt, 10 Minuten bei einem RCF von 200 zentrifugiert und erneut in 50 oder 100 μl HBSS für das Zählen mittels Hämozytometer suspendiert.
Die Kulturassays wurden wie folgt durchgeführt:
Verschiedene Mausstromazelllinien wurden verwendet, von denen drei in Whitlock et al., Cell (1987) 48: 1009–1021 beschrieben sind. Konfluente Stromazelllinien wurden bis zu 3 bis 4 Wochen ohne Passage durch Wechseln des Gewebekulturmediums alle 5 bis 7 Tage aufrechterhalten. Für die Passage wurden die Stromazellschichten dreimal mit serumfreien Medium gewaschen, dann mit 2,5 ml (T-25 Kolben) 0,5 mg/ml Kollagenase-Dispase (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) in serumfreien Medium überdeckt. Die Kulturen wurden 15 bis 30 Minuten bei 37°C inkubieren gelassen, dann wurden die Zellen in dem enzymenthaltenden Medium gesammelt und RPMI-1640 Medium mit Serum wurde hinzugefügt. Die Stromazellen wurden mittels Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette suspendiert, dann direkt beim Ein- bis Fünffachen bis Ein- bis Fünfzigfachen der ursprünglichen Zellenkonzentration kultiviert. Im Allgemeinen erreichten konfluente Stromaschichten, die bei 1 : 10 subkultiviert wurden, nach 5 bis 7 Tagen wieder eine Konfluenz. Subklone wurden durch Begrenzen der Verdünnungskultur von 30 bis 0,3 Zellen pro Vertiefung erhalten. Humane Stromazelllinien wurden in ähnlicher Weise behandelt.
Zellsuspensionen von humanem, fetalen Knochenmark wurden aus den langen Knochen von Feten nach einer Gestation von 10 bis 18 Wochen hergestellt. Die Knochen werden der Länge nach gespalten, und die medulläre Höhle wird mit einer Skalpellklinge ausgekratzt. Die Knochen werden dann in eine 1 mg/ml Lösung von Kollagenase/Dispase in RPMI-1640 verbracht. Die Knochen werden 30 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach die medulläre Höhle mit Medium (RPMI-1640 mit Pen/Strep, 2-ME und 5% FCS) gespült wird, um hämatopoetische Zellen zu entfernen. Alternativ kann Knochenmark ohne Kollagenase/Dispase-Behandlung aus der Knochenmarkshöhle gespült werden.
Zellsuspensionen werden aus den Lebern von Feten aus der 16. bis 20. Gestationswoche hergestellt. Die Leber wird zerkleinert und dann zur Freigabe von Zellen pipettiert. Die Zellsuspension wird dann auf einen Ficoll-Gradienten verbracht, um Hepatozyten, rote Blutkörperchen und Trümmer zu entfernen. Die hämatopoetischen Zellen werden dann geerntet.
Adultes Knochenmark wird aus Knochenmarkabsaugungen erhalten, die behandelt werden, um vor der Verwendung rote Blutkörperchen zu entfernen.
Massenkulturen werden erhalten, indem die humanen Zellen auf die zuvor hergestellte konfluente Schicht aus Maus- oder humanen Stromazelllinien verbracht werden. 3 × 10⁴ bis 2 × 10⁵ Zellen pro ml werden auf die Stromazellen entweder in T-25-Kolben oder Platten mit 6 Vertiefungen durch Zugabe von 3 ml in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen oder von 5 ml in den T-25-Kolben verbracht. Eine 50 : 50 Mischung RPMI-1640 und IMDM, das 50 μg/ml Penicillin/50 μg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 5 × 10^–5 2-Mercaptoethanol und 10% fetales Kalbsserum enthält, wird verwendet. Für Bedingungen vom Dexter-Typ wird IMDM, das 50 μg/ml Penicillin/50 μg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 10% fetales Kalbsserum, 20% Pferdeserum und 10^–6 M Hydrokortisonnatriumsuccinat enthält, verwendet. Knochenmarkszellen, die in dem Medium vom Dexter-Typ wachsen gelassen werden, führen nur zu einer myeloiden Differenzierung. Kulturen wurden mit Ganzzellpopulationen oder Zellen hergestellt, die mittels ihrer Expression der Zelloberflächenantigene (CD34, HLA-DR, Thy-1, Zelllinienmarker) fraktioniert wurden.
Kulturen mit Grenzverdünnung wurden unter Verwendung von Platten mit 96 Vertiefungen hergestellt, die die Mausstromazellen als konfluente Schichten enthielten. Die humanen Zellen wurden in die Platten mit fortschreitend geringeren Konzentrationen titriert, wobei bei jeder Zellkonzentration mindestens 24 Vertiefungen plattiert werden. Die Platten wurden dann untersucht, um den Prozentsatz der positiven Vertiefungen bei jeder Zellenanzahl zu bestimmen. Die Daten werden dann graphisch aufgetragen.
AC3- und AC6-Kokulturen
Kokulturen, die mit Mausknochenmarkstromazelllinien hergestellt wurden, AC3 oder AC6, haben erfolgreich als Feeder-Schichten für humane Kulturen gedient und haben bei geringen Zelldichten ein übermäßiges Fibroblastenwachstum inhibiert.

(1) Zellsuspensionen aus mehr als einhundert humanen, fetalen Knochenmark-, fetalen Leber- oder adulten Knochenmarkproben wurden bis zu 20 Wochen unter kontinuierlicher Produktion hämatopoetischer Zellen während dieser Zeit kokultiviert, was anzeigt, dass frühe humane Vorläufer oder Stammzellen in diesen Kulturen hergestellt wurden.
(2) Kulturen zeigen kleine bis mittelgroße humane Knochenmarkzellen, die an die Mausstromazellen angeheftet sind, und Proliferation tritt während der ersten ein bis drei Wochen der Kultivierung auf; danach bleiben sie ziemlich stabil.
(3) Zellen bilden lose Anhäufungen, die aus nichthaftenden und haftenden Zellen bestehen, die über den Stromazellen liegen, die ihrerseits über kleinen bis Zwischengrößenzellen liegen (Pseudoemperipolese). Insgesamt ist das Aussehen der Kulturen ähnlich desjenigen von langfristigen Mauskulturen.
(4) Cytospin- und fluoreszenzaktivierte Zellsortierer-(FACS)-Analysen zeigen die Aufrechterhaltung von humanen hämatolymphoiden Zellen. Bei Fehlen von Hydrokortison (Whitlock-Witte-artige Bedingungen) sind die Kulturen eine Mischung von myeloiden, monozytoiden und lymphoiden Zelllinien im Hinblick auf die Morphologie. Die Mehrzahl der Zellen ist myeloid und variiert von Myeloblasten zu reifen polymorphonuklearen Zellen. 15 bis 40% der Zellen sind mononuklear, und viele dieser Zellen haben eine lymphoide Morphologie.
(5) Etwa 20 bis 40% der Zellen werden mit CD15-Antikörper gefärbt, und 10 bis 50% der Zellen werden mit B-Zelllinienmarkern, CD10, CD19 oder CD20, gefärbt, was eine signifikante Anzahl von B-Zellen angibt. Zellen, die aus dem fetalen Knochenmark für die CD19 Expression ausgewählt sind, überleben weniger als drei Wochen in der Kultur. Die Gegenwart von CD10⁺ und CD19⁺ Zellen nach > 4 Wochen in der Kultur gibt an, dass frühe B-Zellen aus den festgelegten Vorläufern entstehen. Des weiteren färben sich 1 bis 10% der Zellen mit Bezug auf zytoplasmatische μ schwere Ketten, was die Gegenwart von Prä-B-Zellen bestätigt. Eine signifikante Anzahl von Zellen exprimiert CD20, obgleich weniger als 1% sIg exprimiert, was anzeigt, dass wenige der frühen B-Zellen unter den angegebenen Kulturbedingungen reifen. Des weiteren zeigen Kulturen, die nach Verarmung von B-Zellen (CD10, CD19) durch Zellsortieren begonnen wurden, eine B-Zellenentwicklung innerhalb von einer Woche nach Beginn der Kultur.
(6) Kulturen, die in Gegenwart von Hydrokortison begonnen wurden (Dexterartige Bedingungen) haben keine nachweisbaren T- oder B-Zellen und weisen einen großen Prozentsatz von Granulozyten und myeloiden Zellen auf, wie mittels FACS-Analyse und Cytospin bewiesen wurde. Die Gegenwart von mitotischen Zahlen und die langfristige Aufrechterhaltung dieser Kulturen gibt die Anwesenheit einiger aktiver Vorläuferzellen an. Wenn diese Hydrokortison enthaltenden Kulturen auf Medien ohne Hydrokortison umgestellt werden, können innerhalb von zwei Wochen 2 bis 6% CD19 Zellen gefunden werden. Diese Daten begründen die Gegenwart einer aktiven Vorläuferzelle in diesem Kokultursystem weiter.

Unter Verwendung des vorstehend erwähnten Kokultursystems wurde ein Grenzverdünnungsassay entwickelt, der verwendet werden kann, um die Häufigkeit der koloniebildenden Zellen in den verschiedenen Zellsubpopulationen zu bestimmen. Die Häufigkeit wird mittels der Zellenanzahl, bei der 37% der Vertiefungen keine Kolonien zeigen, bestimmt. Ein repräsentatives Experiment zeigte, dass 1/2000 Ganzknochenmarkszellen reagierten, während 1/200 und 1/30.000 Zellen in den CD34+ bzw. CD34– Teilmengen reagierten.
Des weiteren wurde ein Einzelzellassay entwickelt, bei dem einzelne mittels FACS sortierte Vorläuferzellen in einzelne Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen verbracht wurden, die eine Maus- oder humane Knohchenmarkstromazellen-Feederschicht enthielten. Die Ergebnisse, die in Tabelle 7 gezeigt sind, geben an, dass 1 von 40 CD34+ LIN^– (Lin = CD3, 10, 19, 20, 15, 33) oder 1 von 80 CD34+ Lin+ Zellen durch Koloniebildung reagieren (0,5–1% des Knochenmarks). Analysen der Kolonien zeigen, dass 40% und 25% der Kolonien multipotent, wie mittels FACS und Methylcellulose-Analyse bestimmt (B lymphoid, myeloid, erythroid), in den CD34+ Lin– und CD34+ Lin+ Populationen sind. Des weiteren zeigen CD34+ Thy+ Zellen (0,1–0,5% des Knochenmarks) ein Koloniewachstum in 1 von 20 Vertiefungen. Die Mehrzahl der Kolonien ist multipotent (> 70%). Die CD34+Thy+ Zellen sind die wirksamste Population, was das Wachstum nach dem Übertragen auf neue Stromaschichten betrifft. Im Gegensatz dazu reagieren die CD34+Thy– Zellen, die > 90% der CD34+ Zellen darstellen, schlecht auf den Kokulturassay; 1 von 400 Zellen bildet Kolonien, von denen keine multipotent ist. Die Thy+ Population kann auch gemäß der Expression von reifen Zelllinienmarkern unterteilt werden. Die Thy+Lin– Zellteilmenge (0,1 bis 0,5% des Knochenmarks) reagiert gut im Einzelzellassay (1/20), während die Thy+Lin+ Teilmengen schlecht reagieren (0/800). FACS und Methylcelluloseassays zeigen, dass > 70% der Kolonien, die von Thy+Lin+ Zellen abgeleitet sind, multipotent sind. Die vorstehend angegebenen Daten geben an, dass "Stammzellen" in der Teilmenge von Zellen vorhanden sind, die CD34 und Thy-1 exprimieren, denen jedoch eine Expression von Zelllinienmarkern fehlt. Zellen mit diesem Phänotyp stellen weniger als 1 von 1000 Ganzknochenmarkzellen dar.
Die Häufigkeit der Zellen in der Ausgangspopulation, die unter den vorstehend definierten Bedingungen wachsen, kann bestimmt werden. Die Häufigkeit wird durch die Anzahl der Zellen bestimmt, bei denen 37% der Vertiefungen kein Wachstum zeigen. Bei einer Studie reagieren 1/1500 der nicht sortierten Zellen, während 1/40 der CD34+ Fraktion und 1/4000 der CD34– Fraktion reagieren. Die nachstehenden Tabellen zeigen die Ergebnisse für die in vitro Kulturassays.
FACS-Abtrennung von fetalem Knochenmark (FBM) wurde durchgeführt durch Trennen von Fraktionen in CD34⁺, 10⁺, 19⁺ und CD34⁺ 10^–, 19^–. Die Fraktionen werden dann in Abwesenheit von Hydrokortison acht Wochen kontinuierlich wachsen gelassen und mit Bezug auf das Vorhandensein von myeloiden Zellen und B-Zellen untersucht.
Alternativ wird fetales WBM mittels FACS in CD34⁺, 33^–, 10^–, 19^– getrennt, und die Zellen werden in Abwesenheit von Hydrokortison wachsen gelassen. Durch Verwendung einer Grenzverdünnung wurde gefunden, dass etwa 10 bis 100 Zellen in der Kokultur während eines Zeitraums von mehr als sechs Wochen aufrechterhalten werden können und in reife myeloide und B-Zellen differenziert werden können.
Die Ergebnisse der CD34, 33, 10 Abtrennung sind in Tabelle 4 gezeigt. Die sortierten Zellpopulationen sowie die nichtsortierten Zellen wurden zum Zeitpunkt der Abtrennung (t = 0) sowie einundzwanzig Tage (t = 21) später analysiert. Die Analyse des FACS-Färbungsprofils bei t = 0 zeigt, dass myeloide und B-Zellen wirksam aus den CD34⁺CD10^–CD33^– Zellen mit weniger als 5% kontaminierenden B- und myeloiden Zellen entfernt wurden. Im Gegensatz dazu waren am Tag 21 etwa 50% der CD34⁺CD10^–CD33^– Zellen B-Zellen. Des weiteren gab es eine zehnfache Erhöhung der Anzahl der Zellen zwischen t = 0 und t = 21. Deshalb gab es eine gesamte 100-fache Erhöhung der B-Zellen während des 21-tägigen Zeitraums. Des weiteren exprimieren etwa ein Drittel der B-Zellen sIg mit einem 2/1 Verhältnis von Kappa und Lambda leichten Ketten. Die Ergebnisse zeigen, dass die B-Zellen polyklonal sind und keine virale Epstein-Barr Transformation darstellen. Im Vergleich dazu zeigen die CD34⁺CD10⁺CD33⁺ Zellen eine dramatische Abnahme der B-Zellen und der Gesamtzellenanzahl während des 21-tägigen Zeitraums. Die Ergebnisse zeigen, dass die CD34⁺ Zellen, die CD10 und/oder CD19 exprimieren, keine langlebigen Vorläufer sind.
Die Differenzierung von myeloiden Zellen wurde mittels FACS und Methylcelluloseassay analysiert. Die FACS-Analyse zeigte eine 10-fache Erhöhung der reifen myeloiden Zellen in der CD34⁺CD10^–CD33^– Zellenteilmenge. Die Analyse der Methylcellulosedaten zeigte, dass 90 bis 95% der CFU-GM und BFU-e Aktivität zum Zeitpunkt Null in der CD34⁺CD10⁺CD33⁺ Zellenteilmenge enthalten ist. Jedoch haben am Tag 21 die CD34⁺CD10⁺CD33⁺ und die CD34⁺CD10^–CD33^– Zellpopulationen fast äquivalente CFU-GM und BFU-e Zellniveaus. Deshalb haben die CD34⁺CD10^–CD33^– Zellen die Fähigkeit, während 21 Tagen in der Kultur zu B-Zellen (CD19⁺, cytoplasmatischem μ⁺, sIg⁺), myeloiden Zellen (CD15⁺, -33⁺, CFU-GM) und erythroiden Zellen (BFU-e) zu führen. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn Zellen auf der Grundlage von CD34, CD10, CD19, CD33 oder CD34, CD3, CD7, CD8, CD10, CD14, CD15, CD19, CD20, CD33 abgetrennt werden.
Wenn CD34⁺ Zellen in Thy-1⁺ und Thy-1^– Fraktionen geteilt und in dem Methylcelluloseassay analysiert werden, ergeben diese beiden Fraktionen ähnliche Ablesungen, wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist. Wenn die CD34⁺, Thy-1⁺ Fraktion durch Grenzverdünnung und in Kokulturen einem Assay unterzogen wird, ist sie mit Bezug auf Vorläuferaktivität angereichert, wie durch 1) den Prozentsatz der in der Kokultur erzeugten B-Zellen, 2) die Häufigkeit von reagierenden Zellen in dem Grenzverdünnungsassay und 3) die Häufigkeit von reagierenden Zellen in dem Einzelzellassay bewiesen ist (Tabellen 5. und 6). Um 75% positive Vertiefungen bei dem Grenzverdünnungsassay zu erhalten, benötigte die Thy-1⁺ Fraktion etwa 1/30 bis 1/50 Zellen, während die Thy-1^– Fraktion 1/170 bis 1/500 Zellen benötigte. Dies zeigt, dass die Thy-1⁺ Fraktion weiter mit Bezug auf die Vorläuferzelle konzentriert wird. Des weiteren führt die Thy-1⁺ Fraktion, wenn sie in dem in vivo T-Zellenassay analysiert wird, zu donorabgeleiteten T-Zellen, während die Thy-1^– Fraktion dies nicht tut.
TABELLE 5 HÄUFIGKEITSANALYSE DER CD34+ THY1 POPULATIONEN IN METHYLCELLULOSE- UND GRENZVERDÜNNUNGSASSAYS
Der Thymusassay für die T-Zellenerzeugung wurde wie folgt durchgeführt. Fetale Thymusfragmente (einzelne thymische Lappen) mit einer Größe von etwa 1 mm³ werden erhalten. Die Fragmente werden in einem Thymusorgankultursystem bei 25°C 3 bis 7 Tage kultiviert, um die in vitro Aufnahmefähigkeit des Thymus mit Bezug auf Vorläuferzellen zu stimulieren.
Die Zellzusammensetzung, die etwa 10⁰ bis 10⁴ Zellen in einer FCS enthaltenden, ausgewogenen Salzlösung umfasst, wird mit einem Volumen von 1 μl unter Verwendung einer Glasmikropipette, die mit einer mit Öl gefüllten, mit einer mikrometrischen Schnecke betriebenen Spritze verbunden ist, injiziert. Vierundzwanzig Stunden nach dem Injizieren werden die in vitro kolonisierten Thymusfragmente unter die Nierenkapsel von SCID-Mäusen implantiert (siehe EPA 0 322 240). Die injizierten Zellen werden mit dem Thymus HLA fehlgepaart. In Abständen werden die Empfängertiere geopfert und die Transplantate geerntet. Zellsuspensionen werden in einem Zweifarben-Immunofluoreszenzassay mit Bezug auf die Anwesenheit von donorabgeleiteten T-Lymphozyten (CD3⁺, 8⁺) analysiert.
TABELLE 8
Die vorstehend angegebenen Ergebnisse zeigen, dass eine kleine Population von ausgewählten Zellen zu T-Zellen führt, was zu endständig differenzierten CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen führt. Die Thy-1^– Population scheint nicht für ein nachweisbares Niveau von differenzierten T-Zellen zu sorgen.
Humane Knochenfragmente können an verschiedenen Stellen (i. p., s. c. usw.) entweder in bestrahlte (200 bis 300 Rad) oder nichtbestrahlte CB17 SCID/SCID-Mäuse transplantiert werden. Die Knochenfragmente wachsen über Zeiträume von mindestens 9 Monaten mit der kontinuierlichen Produktion von humanen B-, myeloiden und erythroiden Zellen. Die Knochenfragmente wirken als unterstützende Mikroumgebung für humane allogene Vorläuferpopulationen. Allogene Knochenmarkvorläufer (Fehlpaarung für HLA Klasse I) können entweder vor oder nach der Transplantation in die Empfängermaus in das Knochenfragment injiziert werden. Falls die Vorläuferzellen vor der Transplantation injiziert werden sollen, werden die sortierten Zellen in den Knochen mikroinjiziert, wonach die injizierten Knochen über Nacht bei Raumtemperatur vor der Transplantation in die CB17 SCID/SCID-Mäuse (i. p. oder s. c.) inkubiert werden. Falls Vorläuferzellen nach der Transplantation mikroinjiziert werden sollen, werden CB17 SCID/SCID-Mäuse mit Knochenfragmenten transplantiert (i. p., s. c.). Nach 6 Wochen kann das Knochentransplantat bestrahlt werden (200 bis 1000 Rad auf das Transplantat mit Abschirmung der Maus), gefolgt von der Injizierung der Vorläuferzellen. Alternativ können die Vorläuferzellen in nichtbestrahlte Knochenfragmente injiziert werden.
Ergebnisse des Knochenmarkassays zeigen, dass CD34+ Zellen praktisch die gesamte Knochenmarkregenerierungsfähigkeit besitzen. Die Subfraktionierung der CD34 Population hat gezeigt, dass die Thy⁺ Zellen in der CD34 Teilmenge (5% der CD34 Zellen) praktisch die gesamte B-Zell-, myeloide Zell- und erythroide Vorläuferaktivität in der CD34 Fraktion enthalten. Der Assay kann erfolgreich mit 10 bis 10.000 Zellen durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung ist in Tabelle 9 gezeigt.
Ein sekundärer Übertragungsassay kann zur Bewertung der Selbsterneuerung und Langlebigkeit von humanen Stammzellen verwendet werden. Donorvorläuferzellen werden in HLA fehlgepaarte Knochenfragmente wie vorstehend angegeben injiziert. Nach 2 bis 3 Monaten können die sich ergebenden Donorzellen, die sich expandiert haben, für den "Stammzellen"-Phänotyp (CD34⁺, Thy⁺, Lin^–) erneut sortiert werden. Diese Zellen werden dann erneut in einen zweiten HLA fehlgepaarten Donor injiziert. Nach 1 bis 3 Monaten wird der Knochen mit Bezug auf verschiedene Vorläuferpopulationen sowie Stammzellen bewertet. Auf diese Weise kann man das langfristige Potential von "Stammzellen", die zu hämatopoetischen Zellen verschiedener Zelllinien führen, sowie die Anzahl von "Stammzellen" bewerten, die sich aus einer bekannten zugeführten "Stammzellen"-Zahl ergeben. Dies sorgt für eine Schätzung der Stammzellenselbsterneuerung. Beim erfindungsgegenständlichen Assay würden die Stammzellen der vorliegenden Erfindung für eine langfristige Erneuerung sorgen.
Es ist aus den vorstehend angegebenen Ergebnissen ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung Zellen bereitstellt, die in den Charakteristika humaner hämatopoetischer Stammzellen gemäß dieser Erfindung im Wesentlichen homogen sind. So kann durch geeignete Auswahl mit bestimmten Faktoren und die Entwicklung von Bioassays, die die Selbstregenerierung von Stammzellen und das Untersuchen von Stammzellen mit Bezug auf ihre Oberflächenmarker gestatten, eine im Wesentlichen homogene, lebensfähige humane hämatopoetische Stammzellenzusammensetzung für eine Vielzahl von Zwecken erzeugt werden. Die Stammzellen können in Knochenmarktransplantaten verwendet werden, wo die Zellen von neoplastischen Zellen oder anderen Zellen, die pathogen sind, beispielsweise mit HIV infizierten Zellen, befreit werden können. Des weiteren verhindert die Verwendung reiner Stammzellen eine Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung (Graftvs-Host). Des weiteren können die Zellen durch geeignete Rekombination, entweder homolog oder nichthomolog, modifiziert werden, um genetische Defekte zu korrigieren oder für genetische Fähigkeiten zu sorgen, die in den Stammzellen naturgemäß fehlen, entweder mit Bezug auf die einzelnen Stammzellen oder die Stammzellen im Allgemeinen. Des weiteren kann die Stammzellenzusammensetzung, da die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von anderen Zellen ist, zur Isolierung und Definition von Faktoren, die mit der Regenerierung und Differenzierung verbunden sind, verwendet werden.

Claims

Zusammensetzung aus fetalen und/oder adulten hämatopoetischen Zellen, wobei mindestens 80% der Zellen als human, hämatopoetisch und CD34⁺10^–19^–33^– charakterisiert sind.
Zelluläre Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zellen ferner durch Thy-1⁺ charakterisiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die zelluläre Komponente zur Selbstregeneration und Differenzierung zu Vertretern von lymphoiden, erythroiden und myelomonocytischen hämatopoetischen Linien fähig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, die zumindest 5% an linientauglichen Zellen enthält, die zur Selbstregenerierung in einem Co-Kulturmedium und zur Differenzierung zu Vertretern von zumindest der hämatopoetischen T-, B- und Makrophagen-Linien fähig sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–4, die genetisch modifizierte hämatopoetische Stammzellen enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur therapeutischen Verwendung.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer therapeutischen zellulären Zusammensetzung zur Rekonstitution eines bestrahlten Patienten und/oder eines Patienten, der einer Chemotherapie unter zogen wird, oder zur Behandlung einer genetischen Erkrankung oder zur Prävention der Proliferation eines hämatotrophen Krankheitserregers.
Verfahren zur Erlangung einer Zellpopulation, die bezüglich fetaler und/oder adulter hämatopoetischer Stammzellen angereichert ist, gekennzeichnet durch den Abtrennschritt einer Fraktion, worin zumindest 80% der Zellen als human, hämatopoetisch und CD34⁺10^–19^–33^– charakterisiert sind, aus einem Gemisch aus humanen hämatopoetischen Stammzellen und differenzierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Selektion mittels monoklonaler Antikörper ausgeführt wird, die mit Markierungen konjugiert sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Markierungen aus Magnetkügelchen, Biotin oder Fluorochromen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte (i) Vereinigung eines Gemisches aus humanen hämatopoetischen Zellen und differenzierten Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD34, die mit Fluoreszenzmarkierungen konjugiert sind, und gegen zumindest einen der folgenden Marker: CD10, CD19 und CD33, worin die Antikörper gegen CD34 eine sich von den anderen Antikörpern unterscheidende Fluoreszenzmarkierung tragen, (ii) Abtrennung einer Zellfraktion über diese Fluoreszenzmarkierungen, die für CD34 positiv und für die anderen Markierungen negativ ist, (iii) Kombination der so erhaltenen Zellfraktion mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen Thy-1, und (iv) Isolierung einer Thy-1⁺ Fraktion.