DE69229729T3

DE69229729T3 - Wundheilung

Info

Publication number: DE69229729T3
Application number: DE69229729T
Authority: DE
Inventors: Mark W.J. Univ. of Manchester FERGUSON; David M. Univ. of Manchester FOREMAN; Mamta Shah
Original assignee: Renovo Ltd
Current assignee: Renovo Ltd
Priority date: 1991-03-28
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2012-03-31
Also published as: US20050287139A1; ES2136618T3; ATE182792T1; EP0585242A1; EP0585242B1; IE921013A1; JP2002275094A; CA2387247A1; US5662904A; WO1992017206A1; DK0585242T3; US20100152095A1; US20020187149A1; AU661840B2; EP0585242B2; GB9106678D0; DK0585242T4; GR3030924T3; DE69229729T2; AU1436892A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Heilen von Wunden und auf Mittel und Verfahren zur Erleichterung der Reparation und Heilung von tierischen Geweben, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, von Haut- oder anderen Epithelgeweben, die beispielsweise durch bei Unfällen verursachte Wunden, chirurgische Eingriffe oder andere Traumen beschädigt worden sind. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf das Heilen von Wunden beim Menschen oder anderen Vertebraten.
Wie allgemein bekannt, ist das Heilen von Wunden in Geweben wie der Haut gewöhnlich zumindest bei erwachsenen Menschen und anderen Vertebraten mit einem Biosynthese-, Umbau- und Organisationsprozess in der extrazellulären Matrix (EZM) verbunden, der im allgemeinen zur Bildung faseriger Bindegewebenarben und dadurch zum Verlust normaler Gewebefunktionen führt.
Im Bereich der Chirurgie stellt die Bildung und das Zusammenziehen von Narbengewebe ein ernstliches klinisches Problem dar, für das gegenwärtig noch keine vollständig befriedigende Lösung zur Verfügung steht. Ebenso haben die Narbenbildung und Fibrose im Falle einer Brandwunde oder anderer Verletzungen oder Traumen besonders bei Kindern oft schwerwiegende Folgen, die zu beeinträchtigter Funktion, gestörtem weiterem Wachstum und unansehnlichen ästhetischen Auswirkungen führen und wiederum ein großes Problem darstellen.
Was die durch Narben hervorgerufenen unansehnlichen ästhetischen Auswirkungen anbetrifft, so ergibt sich dadurch oft die Notwendigkeit einer kosmetischen Behandlung oder Operation, mit dem Ziel, diese Verunstaltungen zur Verbesserung des Aussehens zu entfernen. Auch entsteht ein ähnlicher Bedarfsfall für kosmetische Behandlungen oft in Verbindung mit unerwünschten Tätowierungen und anderen Hautmakeln. Gegenwärtig ist es jedoch schwierig oder unmöglich, derartige kosmetische Behandlungen oder Operationen mit zufriedenstellendem Ergebnis durchzuführen, da im allgemeinen ein operativer Eingriff bis zu einem gewissen Grad damit verbunden ist, der wiederum wahrscheinlicherweise Wunden verursacht und dadurch zur Bildung neuer unansehnlicher Narbengewebe führt.
Bei erwachsenen Menschen und anderen Säugervertebraten ist die Wundheilung in Geweben wie der Haut im allgemeinen ein Reparationsprozess, im Gegensatz zu einem Regenerationsprozess, der beim Heilen fetaler oder embryonaler Gewebe stattzufinden scheint. Das Resultat eines Wundreparationsprozesses scheint durch eine Anzahl verschiedener Faktoren, einschließlich sowohl intrinsischer Parameter wie der Versorgung der Gewebe mit Sauerstoff als auch extrinsischer Parameter wie der Wundverbände beeinflusst zu werden. Es bestehen jedoch starke Anzeichen dafür, daß der Prozess der Heilung und Reparation durch Wunden beschädigter Gewebe insgesamt, einschließlich der notwendigen interzellulären Kommunikation, bei erwachsenen Menschen und anderen Säugern auf koordinierte Weise durch eine Anzahl spezifischer löslicher Wachstumsfaktoren gesteuert wird, die im Bereich der Wunde (besonders durch degranulierende Blutplättchen und eintretende Makrophagen) freigesetzt werden und unter anderem eine Neovaskularisierung, Leukocytenchemotaxis, Fibroblastenproliferation und das Wandern und Absetzen von Kollagen und anderen Molekülen der extrazellulären Matrix innerhalb der Wunden hervorzurufen scheinen. Bei denjenigen Wachstumsfaktoren, die bis jetzt identifiziert und isoliert worden sind, handelt es sich im allgemeinen um spezialisierte, lösliche Proteine oder Polypeptide, einschließlich des transformierenden Wachstumsfaktors Alpha (TGF-α), des transformierenden Wachstumsfaktors Beta (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 usw.), des von den Blutplättchen sezernierten Wachstumsfaktors (PDGF), des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2 II (IGFI und IGFII) und der sauren und basischen Fibroblastenwachstumsfaktoren (sauren FGF und basischen FGF). Viele dieser Wachstumsfaktoren sind schon durch Gentechnik mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt worden.
Allgemeine Überblicke über diese Wachstumsfaktoren sind in den Artikeln von Man H. McGrath in Clinics in Plastic Surgery, Band 17, Nr. 3, Juli 1990, Seite 421–432 und von George A. Ksander in Annual Reports in Medicinal Chemistry, 1989, Abschnitt 24 (Verlag Academic Press, Inc.) zu finden.
In den Artikeln 54 (3) und 54 (4) des EPÜ werden die Veröffentlichungen WO 91/04748, WO 91/10727 und WO 92/13553 erwähnt.
In WO 91/04748 wird die Hemmung von TGF-β (einschließlich sowohl der fibrotischen als auch der nichtfibrotischen Mitglieder der Familie) zur Verhinderung der Akkumulation extrazellulärer Matrix, d.h. zur Verhinderung der Narbenbildung geoffenbart. Es werden darin jedoch keine Zusammensetzungen gegen Narbenbildung geoffenbart, die nur fibrotische Wachstumsfaktoren hemmende Mittel enthalten.
WO 91/10727 betrifft die Hemmung von Zellregulationsfaktoren, einschließlich der fünf "TGF-β". Keinem der TGF-β wird eine spezielle Eigenschaft (Förderung oder Hemmung der Narbenbildung) zugeschrieben.
WO 92/13553 betrifft die Verabreichung von Wundheilungsmodulatoren für die Behandlung gestörter Wundheilung. Die verwendeten Modulatoren verursachen eine Reizung der Gewebe, führen jedoch nicht zur Hemmung der Narbenbildung.
Die Erkenntnis, wie wichtig die Rolle derartiger Wachstumsfaktoren zum unter Kontrolle halten der Wundheilung ist, hat zu zahlreichen Vorschlägen geführt für ihre klinische Verwendung bzw. Anwendung als exogene Wachstumsfaktorenmittel bei der Behandlung zum Beschleunigen und Fördern der Wundheilung, besonders in Fällen unzulänglicher Wundheilungszustände (vergleiche beispielsweise Sporn et al., Science (1983) 219, 1329–1331, Brown et al., J. Exp. Med. (1986) 163, 1319–1324, Mustoe et al., Science (1987) 237, 1319–1324) und dies ist bis jetzt die Haupttendenz des Bestrebens gewesen, therapeutische Anwendungen für das bezüglich dieser Wachtumsfaktoren erworbene Wissen zu entwickeln.
Der vorliegenden Erfindung gemäß wird die Verwendung einer wirksamen aktivitätshemmenden Menge eines Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittels geboten, das spezifisch nur gegen PDGF wirkt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden zur Hemmung der Narbengewebebildung bei der Heilung.
Man glaubt, daß beispielsweise die Familie der TGF-β-Wachstumsfaktoren eine besonders wichtige Regulationsrolle bei der Wundreparation, besonders bei Adulttieren, als Stimulans der Makrophageninfiltration, der Fibroblastwanderung und der extrazellulären Matrixsynthese, besonders der Kollagensynthese und der Deposition durch Fibroblaste spielt, die bei der Bildung von Narbengewebe eine Rolle spielen. Andere Wachstumsfaktoren, z.B. PDGF, sind bei diesem Vorgang ebenfalls wichtig und es wird bis zu einem gewissen Grad angenommen, daß sie in dem komplizierten Gesamtreguliervorgang, der bei der Wundheilung mitspielt, miteinander zusammenwirken. Im PCT/US90/05566 wird die allgemeine Verwendung von Antikörpern gegen TGF-β zur Reduzierung der Fibrose in einem mit Rattennierennephrose induzierten Model geoffenbart. Es ist nun jedoch festgestellt worden, daß nicht alle TGF-β-Wachstumsfaktoren fibrotisch sind und daß das Unterdrücken der TGFβ-3-Aktivität insbesondere sich nachteilig auswirkt.
Im PCT/US90/05566 werden TGFβ-1 und TGFβ-2 dahingehend erwähnt, daß sie die Funktion haben, die Bildung extrazellulärer Matrix zu erhöhen, es wird jedoch nichtbehauptet, jeder TGF-β besitze eine derartige Wirkung.
Entsprechend der Erfindung, bei dem Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel kann es sich um einen wachstumsfaktorneutralisierenden Antikörper, z.B. Antikörper gegen TGF-β1, TGF-β2 und PDGF, handeln.
Das Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel kann in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwendet werden. Der pharmazeutisch akzeptable Träger kann eine neutrale sterile Creme, ein neutrales steriles Gel oder einen neutralen sterilen Puder für die topische Anwendung oder eine sterile Lösung für die Injektion, die Irrigation oder das Inhalieren oder ein Aerosol umfassen oder er kann einen sterilen Verband für das topische Bedecken einer Wunde, beispielsweise ein biologisch abbaubares/absorptionsfähiges Polymer umfassen oder in Form einer Tablette oder Kapsel für die enterale Verabreichung vorliegen oder der Träger kann ein Biopolymer/Polymer-Pflaster oder ein Depot-Implantat umfassen.
Das für diesen Zweck verwendete hemmende Mittel oder die Mischung solcher Mitteln umfaßt einen oder mehrere für PDGF oder die Vorläufer derartiger Wachstumsfaktoren spezifische neutralisierende Antikörper. Vorteilhafterweise handelt es sich bei einem oder jedem derartigen Antikörper um einen monoklonalen Antikörper, der durch Rekombinant-DNA-Verfahren erhalten wird. Polyklonale Antikörper, die beispielsweise durch Reinigung durch Affinitätschromatographie eines durch Injektion eines bzw. mehrerer entsprechender Wachstumsfaktoren in einen geeigneten Wirt zubereiteten Antiserums erhalten werden, können jedoch auch ziemlich zufriedenstellend als Alternative verwendet werden, wie bei den meisten der experimentellen Voruntersuchungen der Fall gewesen ist. Falls erwünscht, können anstatt vollständiger Antikörper auch Fragmente (die sogenannten Fab) derselben, die die spezifische Antigenbindungscharakteristik beibehalten, verwendet werden und derartige Fragmente sollen ebenfalls unter den Umfang des Ausdrucks "Antikörper", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, fallen.
Was die Vorläufer dieser Wachstumsfaktoren anbetrifft, so ist bekannt, daß die Wachstumsfaktoren in vielen Fällen anfänglich in einem inaktiven Zustand als Teil eines größeren Proteinmoleküls vorliegen oder als Ligand daran gebunden sind und von letzterem beispielsweise durch Enzymaktivität während ihrer Freisetzung in aktiver Form abgetrennt werden. Das Binden eines Neutralisierungsmittels, wie eines Antikörpers, an derartige inaktive Proteinvorläufer kann daher die proteolytische Wirkung und die Freisetzung der aktiven Wachstumsfaktoren verhindern oder hemmen, was zu einem Neutralisationseffekt insgesamt und einer Hemmung der Aktivität auf die gleiche Weise führt, wie der alternative Vorgang der direkten Bindung eines Hemmungsmittels an die aktiven Wachstumsfaktormoleküle selbst oder die Zellrezeptorstellen derartiger Wachstumsfaktoren.
Anstatt Wachstumsfaktoren neutralisierende Antikörper zu verwenden, kann das Hemmungsmittel oder die Mischung von Hemmungsmitteln alternativ aus einem synthetischen Peptid oder aus synthetischen Peptiden bestehen, die in der Lage sind, auf die Wachstumsfaktoraktivität antagonistisch zu wirken oder diese zu blockieren, z.B. durch Blockieren der Bindung des bzw. der Wachstumsfaktor(en) an Zellrezeptorstellen, ohne dabei eine intrazelluläre "Sekundär-Messenger"-Antwort hervorzurufen. Derartige Peptid-"Blockiermittel" bieten eventuell den Vorteil, von potentiellen nachteiligen immungenetischen Wirkungen frei zu sein und können eventuell leichter als Antikörper durch Membranbarrieren hindurchgehen, so daß sie für die Herstellung pharmazeutischer Rezepturen oder Zusammensetzungen für die topische Anwendung äußerst geeignet wären. Diese "blockierenden" Peptide lassen sich ohne weiteres auf der Basis der Kenntnis der Aminosäuresequenz der jeweiligen Wachstumsfaktoren und desjenigen Anteils dieser Sequenz konstruieren, der sich an die Zellrezeptoren anbindet, da diese Peptide diesen Bindungsanteil der Sequenz "imitieren" müssen, obwohl nicht Teil der Erfindung. Es ist beispielsweise bekannt, daß beim TGF-β1 die C-terminale Region des Moleküls bei der Rezeptorbindung im Spiel ist. Ähnlicherweise ist es die Region zwischen Cys 33 und Cys 42, die beim TFG-α bei der Rezeptorbindung im Spiel ist und bei EGF sind es die Regionen zwischen Cys 20 und Cys 31, zwischen Tyrosin 14 und Cys 31 und zwischen Leucin 15 und Arginin 53, die im Spiel sind. Bei den FGF liegt die kritische Rezeptorbindungsregion zwischen den Aminosäuren 105 und 115.
Als weitere Möglichkeit kann das hemmende bzw. die hemmenden Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel aus anderen Moleküleinheiten bestehen, die durch direktes Anbinden an einen Wachstumsfaktor bzw. mehrere -faktoren oder einen bzw. mehrere Vorläufer derselben wirksam sind, um diese(n) zu inaktivieren. Ein Beispiel eines derartigen Neutralisier- oder Hemmungsmittels ist das Decorin, das ein kleines Chondroitin-Dermatansulfat-Proteoglykan darstellt, von dem bekannt ist, daß es sich stark an TGF-β anbindet, wie von Yamaguchï et al, Nature (1990), 346, 281–284 berichtet worden ist.
Die Verwendung eines Antikörpers oder anderen Mittels, das eine Neutralisierwirkung nur gegen einen PDGF aufweist, kann zur Verhinderung der Bildung von Narbengewebe in beträchtlichem Umfang ausreichen. In einigen Fällen kann jedoch festgestellt werden, daß die kombinierte Verabreichung von zwei oder mehr verschiedenen Antikörpern oder anderen Hemmungsmitteln mit einer neutralisierenden Wirkung gegen zwei oder mehr verschiedene jeweilige Wachstumsfaktoren noch wirksamer ist, beispielsweise besonders bei relativ großen Exzisionswunden. In diesem Fall können die verschiedenen oder anderen Hemmungsmittel getrennt, jedoch gleichzeitig oder aufeinanderfolgend verabreicht werden oder sie können zu einer Mischung oder einen ,Cocktail' verarbeitet werden, die bzw. der in eine einzige pharmazeutische Rezeptur eingearbeitet wird.
Obwohl man glaubt, daß eine Reihe dieser Wachstumsfaktoren, einschließlich mindestens derjenigen der TGF-β-Fannlie und PDGF, normalerweise auf koordinierte Weise miteinander zusammenwirken, derart, daß der Gesamtprozeß der Wundheilung, einschließlich der zur Bildung von Narbengeweben führenden Schritte geregelt wird, so dürfte sich die Wirkung der Reduzierung oder Neutralisierung der Aktivität eines jeden der Wachstumsfaktoren bei der Narbengewebebildung wahrscheinlich in Abhängigkeit von der Natur oder der Identität dieses Wachstumsfaktors und der Form des resultierenden Aktivwachstumsfaktorprofils ändern. Während die Hemmung der Aktivität von PDGF in dieser Hinsicht im allgemeinen sehr wirksam sein kann, dürfte die Hemmung der Aktivität gewisser anderer Wachstumsfaktoren – zumindest als solche – daher wahrscheinlich zur Reduzierung der Narbengewebebildung unter ähnlichen Bedingungen weniger wirksam sein, obwohl derartige andere Wachstumsfaktoren unter Umständen immer noch notwendig sein oder zumindest in Verbindung mit der Unterstützung der Wundheilung eine günstige Wirkung haben können.
Es kann sich daher eine weitere Möglichkeit für die Anwendung der Erfindung in Form der Verwendung eines hemmenden oder neutralisierenden Mittels oder derartiger Mittel bieten, das bzw. die zur Reduzierung der Aktivität des PDGF wirksam ist bzw. sind, welche Wachstumsfaktoren bei der Bildung von Narbengewebe eine wichtige Rolle spielen, wobei diese Faktoren in Verbindung mit einem anderen exogenen Wachstumsfaktor oder Mittel, der bzw. das als solche die Bildung von Narbengewebe nicht in signifikantem Maße fördert aber gleichzeitig unabhängig die Wundheilung unterstützen oder mit Bezug auf die Qualität der Heilung eine günstige Wirkung haben kann. Zumindest in einigen Fällen kann ein derartiger zusätzlicher exogener Wachstumsfaktor zur Verwendung in Kombination mit einem PDGF neutralisierendem Mittel bzw. solchen Mitteln durch Fibroblastwachstumsfaktoren (FGF) bereitgestellt werden. Durch Bereitstellen einer pharmazeutischen Zubereitung mit einem Verhältnis des aktiven Cytokins FGF zum bzw. zu den TGF-β und/oder PDGF neutralisierenden Mittel(n), läßt sich eine Zubereitung erzielen, die nicht nur die Vernarbung einer Wunde verhindert, sondern auch den gesamten Prozeß der Wundheilung beschleunigt.
Es wäre zu erwarten gewesen, daß eine jegliche Behandlung zum Reduzieren oder Verhindern der Narbengewebebildung am wirksamsten während einer relativ späten Stufe der Heilung in der Phase der Gewebeumbildung oder -reorganisierung angewendet werden könnte, die auf die Bildung von Granulationsgewebe hin stattfindet, das das ursprünglich in den anfänglichen Stufen der Heilung gebildete Fibrin ersetzt. Im Gegensatz zu derartigen Erwartungen hat es sich jedoch erstaunlicherweise gezeigt, daß beim Anwenden der vorliegenden Erfindung die Behandlung mit dem Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel bzw. -mitteln unter Umständen während einer frühen Stufe der Heilung durchgeführ werden muß, um effektiv zu sein. Im allgemeinen wird die Behandlung am besten vor und/oder während der Granulationsphase durchgeführt, während der Fibrin noch vorliegt, d.h. bevor das Fibrin vollständig durch Granulationsgewebe ersetzt worden ist. Dies wird gewöhnlich innerhalb einer Zeitspanne von ca. 1.4 Tagen vom ursprünglichen Auftreten der Wunde an stattfinden. Bevorzugt wird die Behandlung jedoch früher begonnen, d.h. innerhalb von sieben Tagen auf die Verletzung hin oder, falls möglich, innerhalb von 3 Tagen oder weniger. In der Tat kann es oft am vorteilhaftesten sein, mit der Behandlung am Tag der Verletzung, oder zumindest am nächsten Tag zu beginnen und im Falle von chirurgischen Wunden kann der Beginn dieser Behandlung, sagen wir durch topische oder parenterale Applikation des bzw. der Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel in einer pharmazeutischen, auf den Wundbereich aufgetragenen Rezeptur ohne weiteres als integraler Teil in die chirurgische Behandlung eingebaut und vor der Operation oder sofort nach Abschluß der Hauptoperation vor oder nach dem Vernähen durchgeführt werden.
Wiederum etwas erstaunlich war es, festzustellen, daß die Behandlung nicht unbedingt repetitiv zu sein und nicht während aller Phasen der Wundheilung kontinuierlich durchgeführt zu werden braucht. Um wirksam zu sein, genügt es unter Umständen oft, das bzw. die Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel in einer entsprechenden Dosis einmal oder höchstens nur einige Male während der frühen Stufen der Wundheilung zu verabreichen. Dies ist natürlich dort wichtig, wo Mittel wie Proteine im Spiel sind, die eventuell dazu neigen, immunologische Reaktionen hervorzurufen, und es bieten sich dabei auch andere praktische und wirtschaftliche Vorteile.
Obwohl es möglich ist, daß in einigen Fällen die zur Erzielung einer vollständigen Heilung einer Wunde notwendige Gesamtzeit durch Anwendung dieser Behandlung eventuell verlängert wird, kann eine Verlängerung der Gesamtheilzeit unter Umständen mehr als ausreichend durch die verbesserte Qualität der geheilten Wunde ausgeglichen werden. Ein bemerkenswertes und des weiteren erstaunliches Merkmal der bis jetzt durchgeführten Versuchsarbeiten besteht jedoch darin, daß keine wirklich signifikante Erhöhung der Gesamtheilzeit beobachtet worden ist; auch ist die Wundenstärke nach der Heilung nicht beeinträchtigt worden. Bezüglich dieses letzteren Punktes scheint es in der Tat, als ob die Wundenstärke eventuell noch verbessert wird, da die beobachtete Orientierung der neuen, während der Heilung gebildeten Kohagenfasern oder -fibrillen zumindest im Fall von Inzisionshautwunden derjenigen unbeschädigter Gewebe ähnlicher ist, da sie im allgemeinen parallel zur Außenhautoberfläche anstatt in einem breiten Winkel oder im allgemeinen senkrecht zur äußeren Oberfläche liegen, wie es gewöhnlich anzutreffen ist, wenn derartige Wunden normal unter Bildung von Narbengeweben abheilen.
Als weitere Hintergrunderklärung und Beschreibung der Erfindung sind im folgenden veranschaulichende Beispiele einiger der durchgeführten Untersuchungen und der bei der Entwicklung der Erfindung erhaltenen Ergebnisse aufgeführt, aus denen dem Fachmann die Natur derselben noch leichter verständlich wird und durch die er die Erfindung noch leichter praktisch anwenden kann.
Zuerst folgt hier ein Umriß oder eine Zusammenfassung der Materialien, Methoden und Verfahren, die im allgemeinen bei den Untersuchungen und in den veranschaulichenden Beispielen, auf die Bezug genommen wird, verwendet worden sind, es sei denn, es wird im folgenden etwas anderes angegeben.
Die Vorversuchsarbeiten zu diesen Untersuchungen wurden an Ratten als Modellversuchstieren durchgeführt, die Ergebnisse lassen sich jedoch im allgemeinen auf den Menschen und andere Tiere anwenden.
Männliche Sprague-Dawley-Adultratten von 200 bis 250 Gramm Gewicht wurden durch Halothan-/Distickstoffoxid-/Sauerstoffinhalierung anästhesiert. Auf das örtliche Stutzen des Pelzes hin wurden vier lineare Inzisionen von 10 mm Länge durch die volle Dicke der Rückenhaut der Tiere in gleichem Abstand von der Mittellinie und neben den vier Gliedmassen gemacht.
Bei jedem Tier wurde eine Wunde (Kontrolle) im unmanipulierten Zustand gelassen, in eine (Scheinkontrolle) wurde ein irrelevanter Antikörper eingespritzt, in eine (die positive Kontrolle) wurde ein unten genauer angegebener Wachstumsfaktor eingespritzt und in eine (die Versuchswunde) wurde eine Zubereitung des bzw. der geeigneten Wachstumsfaktor neutralisierenden Antikörper eingespritzt. Die Versuche wurden an Gruppen dieser Tiere durchgeführt und je nach der Gruppe wurden die Einspritzungen (jeweils 100 μl) täglich für eine Zeitspanne von drei aufeinanderfolgenden Tagen oder sieben aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt, mit Beginn entweder am Tag der Wundeneinbringung oder am folgenden Tag oder in einigen Gruppen zu einem viel späteren Zeitpunkt, z.B. sieben Tage oder neunzehn Tage nach der Wundeneinbringung.
Bei jeder Gruppe wurden gewöhnlich mindestens zwei Tiere getötet (durch eine Überdosis von Chloroform am 7., 14., 28. und 42. Tag nach der Wundeneinbringung und in manchen Fällen auch am 70., 112, und 168. Tag nach der Wundeneinbringung. Alle vier Wunden wurden mit einem 0, cm breiten Rand rundum sofort nach dem Tod des jeweiligen Tieres ausgeschnitten und einer Gewebeanalyse durch herkömmliche immunohistochemische, histologische Färbungs- und biochemische Verfahren unterzogen.
Zur Durchführung dieser Analyse wurde jede Wunde im allgemeinen in zwei Hälften geteilt, um zwei Proben zu erhalten, die entweder eingefroren und/oder fixiert und für das immunocytochemische Färben unter Zuhilfenahme von Antikörpern gegen Kollagen I, III, IV, Laminin und Fibronectin oder für die histologische Routineuntersuchung unter Zuhilfenahme einer Reihe verschiedener Bindegewebefärbungen behandelt wurden, oder sie wurden sofort nach der Sezierung unter dem Mikroskop für die biochemische Analyse einer Gefriertrocknung unterzogen.
Bei den immunohistochemischen Analysen wurden primäre und sekundäre Antikörper für die indirekte Immunfärbung wie in den folgenden Tabellen gezeigt, verwendet. TABELLE I Primäre Antikörper
TABELLE 2 Sekundäre Antikörper
Schlüssel zu den Ouellencoden

a SEROTEC LTD, Oxford, Großbritannien
b Institut Pasteur de Lyon, Frankreich
c DAKOPATTS, Kopenhagen, Dänemark
d AMERSHAM, INTERNATIONAL Plc, Amersham, Großbritannien

Anmerkung:
Die sekundären Antikörper 1, 2 und 4 wurden mit FITC konjugiert (mit Fluoresceinisothiocyanat markiert) zur immunofluorometrischen Bestimmung und Messung; 3 wurde biotyniliert.
Bei der indirekten Immunfärbung wurde die Inkubation mit dem primären Antikörper eine Stunde lang durchgeführt, gefolgt von drei Spülungen in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS). Die Inkubation mit FITC konjugierte sekundären Antisera erfolgte über eine Stunde, gefolgt von drei weiteren Spülungen mit PBS. Für die Immunfärbung auf Makrophagen und Monocyten wurde das BiotinStreptavidin-Verfahren verwendet, d.h. nach der ersten Inkubation und Spülung wurden die Schnitte eine Stunde mit dem biotynilierten anti-Maus-IgG vom Schaf bebrütet, dreimal mit PBS gespült, mit Fluorescein-Streptavidin 20 Minuten bebrütet und zum Schluß dreimal mit PBS gewaschen. Die Schnitte wurde in DABCO (1,4Diazobicyclo-(2,2,2)-octan), einem sich nicht verfärbenden Mittel, präpariert und unter einem Leitz Dialux-Mikroskop und einem Kodak Ektachrome 400 ASA Film photographiert.
Für jeden primären Antikörper und jede Wunde wurden Kontrollschnitte gefärbt, wobei der primäre Antikörper durch die PBS ersetzt wurde.
Bei der Durchführung der histologischen Routinefärbung wurde die Zellularität der Wunde durch Färben des Gefrierschnitts der Gewebe (in Bouinscher Flüssigkeit nachfixiert) mit Hämatoxylin und Eosin nach Harris untersucht, und die Kollagenablagerung in den Wunden wurde durch Färben von Gefrierschnitten mit Trichrom nach Masson und Modifikation der Mallory-Trichromfärbungen nach Hughesdon untersucht.
Für die biochemischen Analysen wurden die Wunden unter dem Mikroskop zusammen mit einem Stück der unverletzten Dorsalhaut aus jeder Wunde seziert und sofort einer Gefriernocknung bis zur Gewichtskonstanz unterzogen. Das Gewebe wurde in 1 ml 1 M Guanidinhydrochlorid, 0,15 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, pH-Wert 5, 8, 24 Stunden bei 4°C zur Extrahierung des Glykosaminglykans homogenisiert. Das Homogenat wurde daraufhin 1 Stunde bei 18.000 g zentrifugiert. Das Granulat wurde zweimal mit 0,5 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeiten wurden daraufhin der überstehenden Flüssigkeit zugeben. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 5 mM EDTA, pH-Wert 6,5, gegen 100 mM Phosphatpuffer dialysiert, gefolgt von einer Aufschließung mit 2,5 mg/ml Papain. Die Glykosaminglykane wurden mit 2% CPC ausgefällt und mit Hilfe der Methode nach Cappelletti et al., 1979 getrennt.
Nach dem Waschen wurde das Granulat mit 100 μg/ml Pepsin in 0,5 M Essigsäure 24 Stunden bei 4°C aufgeschlossen. Daraufhin erfolgte ein einstündiges Zentrifugieren bei 18.000 g. Das auf diese Weise erhaltene Granulat wurde einer Hydroxyprolinanalyse, wie von Stegman und Stadler (1987) beschrieben, unterzogen. Ein Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde ebenfalls für diese Analyse verwendet. Zur Bestimmung des Verhältnisses des Kollagens vom Typ I/III wurde die überstehende Flüssigkeit unter Zuhilfenahme der Methode nach Sykes et al (1976) einer SDS-PAGE unterzogen.
Die bei diesen Versuchen verwendeten Wachstumsfaktoren bestanden aus im Handel erhältlichen Reagentien, die von R & D Systems (Mineapolis, USA) oder British Biotechnology (Großbritannien) oder Serotec (Großbritannien) erhältlich waren, unter anderem aus:

1. dem von Blutblättchen des Schweins sezernierten transformierenden Wachstumsfaktor Beta-1 (TGF-β1)-Dosis: 10 ng/Injektion.
2. dem von den Blutblättchen des Schweins sezernierten Wachstumsfaktor (PDGF)-Dosis: 10 ng/Injektion.
3. dem von der Speicheldrüse der Maus sezernierten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Dosis: 10 ng/Injektion.
4. dem aus Rindergehirn sezernierten basischen Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF)-Dosis: 10 ng/Injektion.
5. dem aus Rindergehirn sezernierten sauren Fibroblastwachstumsfaktor (aFGF)-Dosis: 10 ng/Injektion.

Die bei diesen Versuchen verwendeten Wachstumsfaktor-Neutralisierungsantikörper bestanden ebenfalls aus wie oben angegeben im Handel erhältlichen Reagentien und hatten eine bekannte neutralisierende Wirkung. Sie umfaßten unter anderem:

1. den TGF-Beta neutralisierenden Antikörper (in Kaninchen gegen den TGF-β1 nativer Schweineblutblättchen gezüchtet-neutralisiert sowohl TGF-β1 als auch TGF-β2), Dosis: 50 μg/Injektion.
2. den PDGF neutralisierenden Antikörper (in Ziegen gegen nativen menschlichen PDGF gezüchtet)-Dosis: 20 μg/Injektion.
3. den EGF neutralisierenden Antikörper (in der Maus gegen menschlichen EGF gezüchteten polyklonalen Antikörper)-Dosis: 10 μg/Injektion.
4. den basischen FGF neutralisierenden Antikörper (in Kaninchen gegennatives basisches Rindergehirn-FGF gezüchtet)-Dosis: 30 μg/Injektion.
5. den sauren FGF-neutralisierendere Antikörper (in Kaninchen gegen natives saures Rindergehirn-FGF gezüchtet)-Dosis: 30 μg/Injektion.

Die bei den Scheinkontrollwunden verwendeten irrelevanten Antikörper bestanden entweder aus Kaninchen-IgG oder Ziegen-IgG, je nach dem Wirtstier, in dem der neutralisierende Antikörper gegen den Wachstumsfaktor gezüchtet wurde. Die Dosis des irrelevanten Antikörpers war ähnlich der des neutralisierenden Antikörpers.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE
Bei keinem der durchgeführten Versuche wurden zu keinem der Zeitpunkte, an dem die Wunden untersucht wurden, irgendwelche Unterschiede zwischen den Kontrollund den Scheinkontrollwunden festgestellt, was auf die Abwesenheit irgendwelcher, durch die Einführung fremder Proteine verursachter Auswirkungen hinweist. Auch wurde bei keinen Wunden eine beeinträchtigte Heilung festgestellt und die Epithelisierungsrate war bei allen Behandlungen ähnlich.
Zumindest im Fall der mit den neutralisierenden Antikörpern gegen PDGF behandelten Versuchswunden wurden jedoch beträchtliche Wirkungen erzielt, vorausgesetzt, die Behandlung wurde begonnen, während die Wunden noch frisch waren, bevorzugt zur Zeit oder kurz nach dem Einbringung der Wunden, vor oder während der Granulierungsphase. Obgleich keine großen Unterschiede beobachtet wurden zwischen den Kontrollwunden und den Versuchswunden, wenn die Behandlung erst am 19. Tag nach der Einbringung der Wunden begonnen wurde, enthielten die Versuchswunden in anderen Fällen, besonders wenn die Behandlung am gleichen Tag wie die Einbringung der Wunden oder am folgenden Tag begonnen wurde, viel weniger Kollagen I und III, im Vergleich mit den anderen drei Wunden im gleichen Tier, gleichgültig zu welchem Zeitpunkt. Die Kollagenfibrillen lagen viel weiter auseinander, ihre Orientierung war jedoch derjenigen in normaler Haut fast identisch. Bei den mit neutralisierendem Antikörper behandelten Wunden war es in der Tat oft schwierig, den Ort letzterer festzustellen (mit Ausnahme des Verlusts ektodermaler Haarfollikel), in krassem Gegensatz zu den anderen Wunden, die eine deutliche Narbe mit vertikal orientierten, parallelen, dicht zusammengepackten Kollagenfibrillen aufwiesen. Diese Effekte waren in der Papillardermis und den subkutanen Geweben am deutlichsten. Mit neutralisierenden Antikörpern gegen PDGF behandelte Wunden wiesen ebenfalls eine deutliche Abnahme an Fibronectin auf, besonders in der Retikulardermis, in Verbindung mit einem Orientierungstyp ähnlich dem der Kollagenfibrillen. Obgleich die Fibronectinfärbung durch die ganze Wunde hindurch merklich reduziert war, war sie an der dermalen/epidermalen Verbindungsstelle immer noch am deutlichsten. Durch die Behandlung mit neutralisierenden Antikörpern gegen PDGF wurde auch die Anzahl von Blutgefäßen, Monocyten und Makrophagen innerhalb der abheilenden Wunde reduziert. Im Gegensatz dazu wiesen die positiven, mit PDGF behandelten Kontrollwunden eine deutliche Erhöhung der extrazellulären Matrixakkumulation, der Dichte der extrazellulären Matrixpackung und der Anzahl von Blutgefäßen, Monocyten und Makrophagen auf. Die Vernarbung war bei diesen mit Wachstumsfaktor behandelten Wunden im Vergleich mit den Kontrollen auffallender.
Diese Ergebnisse beweisen die Fähigkeit neutralisierender Antikörper gegen ausgewählte Wachstumsfaktoren, die Narbengewebebildung bei der Adulthautwundenheilung wesentlich zu reduzieren. Am wichtigsten ist dabei, daß diese vorteilhafte Auswirkung nicht durch damit verbundene Probleme einer verzögerten Wundheilung oder einer verzögerten Epithelisierung und einer geringen Wundenstärke begleitet war.
Eine gewisse Verbesserung in Bezug auf die Reduzierung der Narbengewebebildung wurde auch nach der Verabreichung neutralisierender Antikörper gegen Fibroblastwachstumsfaktoren (FGF) beobachtet, obwohl dies in den Vorversuchsarbeiten weniger ausgeprägt war als im Fall neutralisierender PDGF. Interessanterweise schienen exogene saure oder basische FGF allein die Vernarbung zu verbessern. Man glaubt jedoch, daß durch Verabreichen neutralisierender Mittel gegen andere Wachstumsfaktoren in geeigneten Dosen unter geeigneten Bedingungen ähnliche Ergebnisse erzielt werden können wie bei TGF-β und PDGF, jedoch vielleicht in etwas geringerem Umfang.
Im Falle von TGF-β zumindest, der im Zusammenhang mit der Bildung und Organisation von Kollagen, insbesondere von Kollagen I, äußerst aktiv zu sein scheint, was zur Bildung von Narbengewebe führt, glaubt man, daß nach der anfänglichen Verletzung die Konzentration dieses Wachstumsfaktors im Bereich der Wunde gewöhnlich eventuell ziemlich schnell durch einen selbstkatalytischen Kaskadeneffekt erhöht wird. So wirkt das innerhalb einer anfänglichen Wunde aus dem Blättchenabbau vorliegende TGF-β nicht nur in steigenden Konzentrationen als chemisch anziehend für Monocyten, Makrophagen und Fibroplaste, sondern es bietet auch ein Feedback für seinen eigenen Promotor zur Anregung seiner eigenen Synthese, so daß hohe Spiegel desselben bald auftreten können. Die entzündlichen Zellen, insbesondere die Makrophagen, setzen TGF-β frei und weisen diese selbstinduzierende Wirkung auf die TGF-β-Synthese auf. Der TGF-β regt auch die Synthese anderer Wachstumsfaktoren, z.B. TGF-α, PDGF, EGF an und setzt sie frei. Der TGF-β und diese anderen Wachstumsfaktoren regen die Synthese extrazellulärer Matrixmoleküle, z.B. Kollagene und Glykosaminglykane durch die Wundenfibroblaste an und beeinflussen außerdem den Grad des proteolytischen Umbaus und der Organisation dieser extrazellulären Matrixmoleküle. Da das anfängliche Fibrinkoagulum eine hohe Dichte aufweist, wandern Fibroblaste aus der anliegenden normalen Haut anfänglich zwischen dem Koagulum und dem Wundenrand in ungefähr senkrechter Richtung zur Basahnembran hin und her. Das Kollagen und andere extrazelluläre Matrixmoleküle werden ebenfalls in dieser anormalen Orientierung abgesetzt und dies führt schließlich zur Narbenbildung.
Es kann angenommen werden, daß die normale Wundheilung bei Erwachsenen unter ungünstigen Heilungsbedingungen bezüglich einer schnellen Wundenschließung phylogenetisch optimiert wird. Aus diesem Grunde sind die Mengen an freigesetztem Wachstumsfaktor im allgemeinen übermäßig groß, so daß die Geschwindigkeit des Abheilungsprozesses eine beträchtliche Abpufferung gegen externe schädliche Faktoren erfährt, jedoch in Verbindung mit dem Nachteil einer bleibenden Vernarbung. Moderne Methoden zur Wundpflege, z.B. Verbände, und die Verminderung des Infektionsrisikos haben die Notwendigkeit dieses Übermaßes an Wachstumsfaktor weitgehend aus dem Weg geräumt, so daß die Behandlung zur Reduzierung des aktiven Wachstumsfaktorprofils gestattet ist und die darauffolgende Vernarbung auf ein Minimum reduziert wird.
Die oben für TGF-β beschriebene selbstkatalytische Kaskade von Vorkommnissen wird durch frühzeitige Behandlung mit einem Neutralisierungsmittel reduziert. Letzteres wird jedoch nicht in einer Menge angewandt, die zum Neutralisieren des gesamten Wachstumsfaktors ausreicht, wodurch derselbe in genügender Menge verbleibt, damit die Wundheilung ohne schwerwiegende Hemmung vor sich gehen kann. Eine ähnliche Erklärung trifft auch zumindest auf PDGF zu.
PRAKTISCHE VERWENDUNG
Man wird sich im Klaren darüber sein, daß die Ergebnisse, die bei den bei der Entwicklung dieser Erfindung durchgeführten Untersuchungen erhalten wurden, direkte praktische Anwendung für klinische Zwecke zum unter Kontrolle halten der Narbengewebebildung bei der Wundheilung entweder auf dem Gebiet der Therapeutik oder der Kosmetik finden. Für die praktische Anwendung wird im allgemeinen eine geeignete Menge an Wachstumsfaktorantikörper oder -antikörpern oder anderen wachstumsfaktorhemmenden Mittel(n), der bzw. die das Material darstellen, das die Neutralisierung und/oder Modifizierung des Profils der entsprechenden Wachstumsfaktoren – die bei der Narbengewebebildung bei der Wundheilung aktiv oder dafür verantwortlich sind – bewirkt, mittels einer der im Stand der pharmazeutischen Technik gut bekannten Methoden als pharmazeutische Rezeptur oder Zubereitung für die Verabreichung auf geeignete Weise an einen der Wundbehandlung bedürftigen Patienten zubereitet. Derartige pharmazeutische Rezepturen oder Zubereitungen können des weiteren nicht nur einzeln für klinische Zwecke sondern auch als Bestandteile beispielsweise von Sanitätskästen für nichtklinische Notfälle vorgelegt werden.
Mit Bezug auf PDGF, zum Beispiel, sollte der bzw. die Antikörper oder andere(n) Neutralisierungsmittel im allgemeinen (zumindest bei Inzisionswunden) so verabreicht werden, daß 1 pg bis 1 μg PDGF (bevorzugt jedoch eine Menge zwischen 100 pg und 10 ng) pro cm lineare Inzision pro Verabreichung wirksam neutralisiert werden. Wie oben angegeben, ist eine Anwendung in einem frühen Stadium des Wundheilprozesses unerläßlich. Normalerweise findet dies vor, während oder vor und während der Phase der Granulationsgewebebildung statt, und zwar innerhalb von 14 Tagen, jedoch bevorzugt innerhalb von 7 oder 3 Tagen oder weniger auf die Verletzung/Einbringung der Wunde hin.
Die pharmazeutischen Zubereitungen können bequemerweise zum Zeitpunkt der Verletzung/Einbringung der Wunde oder kurz darauf topisch verabreicht werden durch Auftragen auf die Oberfläche um die Wunde in Flüssig, Gel-, Aerosol-, Creme- oder Puderform oder in Form eines Verbands, eines biologisch abbaubaren Pflasters oder eines Depot-Implantats. Der parenteralen Verabreichung, insbesondere der subkutanen Einspritzung, kann auch oft der Vorzug gegeben werden, so daß der bzw. die neutralisierende(n) Antikörper oder das bzw. die andere(n) Mittel zur maximalen Wirksamkeit direkt in den Bereich der Wunde eingebracht werden können. Zu diesem Zweck können die zubereiteten pharmazeutischen Rezepturen sterile flüssige Zubereitungen (z.B. in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung) einer vorbestimmten Menge des aktiven Materials, z.B. des entsprechenden Antikörpers oder der entsprechenden Antikörper umfassen, die in Form von Dosiseinheiten vorgelegt und in gebrauchsfertige Ampullen abgefüllt sind. Für die alternative topische Verabreichungsmethode, die in einigen Fällen zu bevorzugen ist, werden die Rezepturen jedoch mit dem aktiven Material in Vereinigung oder Mischung mit mindestens einem anderen Bestandteil zubereitet, der einen verträglichen, pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein derartiges Verdünnungsmittel oder Bindemittel darstellt, um eine Zusammensetzung wie eine Creme, ein Gel, eine Salbe oder dergleichen bereitzustellen, die bzw. das für die topische Anwendung äußerst geeignet ist. Die Rezeptur läßt sich auf einen sterilen Verband, auf biologisch abbaubare Pflaster oder Verbände für die topische Anwendung oder auf Depot-Implantatsysteme mit einer hohen anfänglichen Freigabe, die auf eine langsame Freigabe abfällt, aufbringen.
Die Rezeptur kann auch aus einem neutralisierenden Mittel, beispielsweise einem entsprechenden Antikörper oder entsprechenden Antikörpern bestehen, der bzw. die auf einen Träger, beispielsweise ein Biopolymer von Kollagen oder Hyaluronsäure oder ein Polymer, beispielsweise PVC, aufgebracht ist bzw. sind, von dem sie anfänglich schnell und über längere Zeit langsamer freigesetzt wird, wenn er auf die Wunde oder in das Loch im Gewebe aufgebracht bzw. darin implantiert wird.

Claims

Verwendung einer wirksamen aktivitätshemmenden Menge eines Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittels, das spezifisch nur gegen PDGF wirkt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden zur Hemmung der Narbengewebebildung bei der Heilung.
Verwendung eines Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittels nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel um einen wachstumsfaktorneutralisierenden Antikörper handelt.
Verwendung eines Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden zur Hemmung der Narbengewebebildung bei der Heilung, die eine wirksame aktivitätshemmende Menge mindestens eines Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittels umfasst, das spezifisch nur gegen den fibrotischen Wachstumsfaktor PDGF wirkt.