DE69233331T3

DE69233331T3 - Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese

Info

Publication number: DE69233331T3
Application number: DE69233331T
Authority: DE
Inventors: Christopher J. Ann Arbor Buchko; Debra A. Fremont Ross; Lois San Mateo Aldwin; Douglas N. Palo Alto Modlin; James L. Palo Alto Winkler; Stephan P. A. Palo Alto Fodor
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1991-11-22
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2012-11-21
Also published as: DE69233501D1; JP2003061657A; EP0916396B1; DE69233087T2; DE69233501T2; ATE262374T1; EP1086742B1; HK1025278A1; CA2124087A1; AU3148193A; DE69233331T2; CA2124087C; EP1086742A1; EP0624059A4; JP3939338B2; US6040193A; EP0972564A2; US6136269A; EP1588761A3; AU675054B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Feld der Polymersynthese und des Screenings. Genauer gesagt, stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein verbessertes Verfahren und System für Synthesearrays von diversen Polymersequenzen zur Verfügung. Gemäß einem speziellen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese diverser Polymersequenzen, wie z.B. von Peptiden oder Oligonukleotiden, zur Verfügung gestellt. Die diversen Polymersequenzen können beispielsweise im Rahmen von Screeninguntersuchungen zur Bestimmung von Bindungsaffinität verwendet werden.
Verfahren zur Synthese gewünschter Polymersequenzen, wie z.B. von Peptidsequenzen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt. Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden werden beispielsweise in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gate, ed., IRL Press, Oxford (1984) offenbart. Die so genannte "Marrifield"-Festphasen-Peptid-Synthese wurde über Jahre hinaus allgemein verwendet und wird in Marrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 2149-2154 beschrieben. Festphasensynthesetechniken wurden für die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen beispielsweise auf einer Anzahl von "Pins" zur Verfügung gestellt. Dazu siehe Geysen et al., J. Immun. Meth. (1987) 102: 259-274. Andere Festphasen-Techniken schließen beispielsweise die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen auf verschiedenen Cellulosescheiben unterstützt in einer Säule ein. Dazu siehe Frank und Doring, Tetrahedron (1988) 44: 6031-6040. Noch andere Festphasentechniken sind im US-Patent Nr. 4,728,502, im Namen von Hamill, und in WO 90/00626 (Erfinder: Beattie) beschrieben.
Jede der oben genannten Techniken stellt nur ein Array von Polymeren von relativ geringer Dichte her. So ist die Technik, wie sie in Geysen et al. beschrieben wird, limitiert auf die Produktion von 96 verschiedenen Polymeren auf Pins, zwischen welchen Abstände in den Dimensionen einer Standardmikrotiterplatte liegen.
Verbesserte Verfahren zum Ausbilden großer Arrays von Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Polymersequenzen sind in einem kurzen Zeitraum umgesetzt worden. Besonders zu erwähnen ist Pirrung et al., US-Patent Nr. 5,143,854 (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. WO 90/15070) und Fodor et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092, welche Verfahren zum Ausbilden großer Arrays von Peptiden und weiteren Polymersequenzen offenbaren, die beispielsweise lichtinduzierte Synthesetechniken verwenden. Dazu siehe auch Fodor et al., Science (1991) 251: 767-777.
Einige Arbeit wurde bislang in die Automatisiersynthese von Polymerarrays gesteckt. Beispielsweise beschreibt Southern, PCT-Anmeldung Nr. WO 89/10977, die Verwendung eines herkömmlichen Tintenplotters, um drei verschiedene Monomere ab zwölf verschiedene Stellen auf einem Substrat abzulagern. Diese Monomere wurden anschließend zur Reaktion gebracht, um drei verschiedene Polymere auszubiden, die jeweils zwölf Monomere lang waren. Die Southern-Anmeldung erwähnt auch die Möglichkeit der Verwendung eines Tintenstrahldruckers, um Monomere auf einem Substrat abzuscheiden. Des Weiteren ist in der oben zitierten PCT-Anmeldung von Fodor et al. ein elegantes Verfahren beschrieben, indem ein Computer-gesteuertes System zur Steuerung der VLSIPS^®-Prozedur verwendet wird. Verwendet man diese Anordnung, wird ein heterogenes Array von Polymeren durch gleichzeitiges Koppeln an eine Anzahl von Reaktionsplätzen in verschiedene heterogene Arrays konvertiert. Dieser Ansatz wird im Allgemeinen als "kombinatorische" Synthese bezeichnet.
Die VLSIPS^®-Techniken haben substanziellen Erfolg gebracht. Jedoch ist es in einigen Fällen wünschenswert, alternative/zusätzliche Verfahren zum Ausbilden von Polymersequenzen zur Verfügung zu haben, welche beispielsweise nicht Licht als einen Aktivator verwenden bzw. welche nicht ausschließlich Licht verwenden.
Zusammenfassung der Erfindung
Verfahren und Einheiten zur Synthese von hoch-dichten Arrays von diversen Polymersequenzen, wie z.B. verschiedenen Peptiden und Oligonukletiden, werden kraft der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden Verfahren und Einheiten zum Anliefern (und in einigen Fällen zum Immobilisieren) verfügbarer Bibliotheken von Verbindungen auf speziellen Regionen eines Substrates durch diese Erfindung bereitgestellt. In speziellen Ausführungsformen werden verschiedene Monomere und andere Reaktanten an eine Vielzahl von Reaktionsplätzen auf einem einzelnen Substrat angeliefert, wo sie parallel zur Reaktion gebracht werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von begrenzenden Mitteln auf einem einzelnen Substrat zur physikalischen Definition von Regionen des Substrats, welche verfügbar sind, um mit einer Eduktlösung zu reagieren, und
zum Begrenzen besagter Eduktlösung auf diese Regionen, in der Herstellung eines Polymerarrays, durch sukzessives Spotting von Monomeren oder durch Zufuhr von Polymeren an diese Regionen,
wobei besagtes Array besagtes Substrat umfasst und 100 oder mehr Gruppen von Polymeren mit verschiedenen, bekannten Sequenzen, gekoppelt auf die Oberfläche davon in separaten, bekannten Stellen, wobei die Dichte von besagten Gruppen zumindest 1000/cm² ist, und
wobei das begrenzende Mittel Inseln (Spots) umfasst, getrennt voneinander durch inerte, nicht benetzende Regionen auf dem Substrat bereitgestellt.
Des Weiteren wird auch ein System zum Durchführen einer Vielzahl von Reaktionen auf einem einzelnen Substrat, wobei das System folgendes umfasst:
Zumindest 100 Reaktionsregionen auf einem einzelnen Substrat, wobei jede Reaktionsregion in der Lage ist, eine separate und unterschiedliche Reaktion durchzufügen, und die Dichte der Reaktionsregionen zumindest 1000/cm² ist,
Mittel zum Anliefern durch sukzessives Spotting von Monomeren oder durch Anliefern von Polymeren an diese Regionen von einer oder mehreren Reaktionslösungen zu einer oder mehreren der Reaktionsregionen; und
Mittel zum Begrenzen von zumindest einigen der Reaktionslösungen vor dem Kontaktieren von zumindest einigen der Reaktionsregionen, wobei das besagte Mittel (Inseln) (Spotts) umfasst, getrennt voneinander durch inerte nicht benetzende Regionen auf dem Substrat bereitgestellt.
Es wird ein Substrat zur Verfügung gestellt, welches ein Array von unterschiedlichen Reaktionsreaktionen, welche voneinander durch inerte Regionen getrennt sind, aufweist. In einer Ausführungsform wird eine erste Monomerlösung auf einem ersten Satz von Reaktionsregionen eines geeignet derivatisierten Substrates platziert. Anschließend wird eine zweite Monomerlösung auf einem zweiten Satz von Regionen platziert, eine dritte Mo nomerlösung auf einen dritten Satz platziert usw.; letztendlich hat eine Anzahl der Regionen jeweils eine darin befindliche Monomerspezies. Diese Monomere werden mit der Oberfläche zur Reaktion gebracht und das Substrat wird anschließend gewaschen und für die Reaktion mit einem neuen Satz von Monomeren präpariert. Dimere, Trimere und größere Polymere von kontrollierter Länge und Monomersequenz werden durch Wiederholen der oben genannten Schritte mit verschiedenen Gruppierungen der Reaktionsregionen und Monomerlösungen hergestellt. In alternativen Ausführungsformen werden die Polymere oder andere Verbindungen des Arrays an die Regionen als komplette Spezies angeliefert und folglich sind die oben genannten Schritte der Polymersynthese nicht notwendig.
Eine Vielzahl von Reaktionsregionen auf der Substratoberfläche sind von einer begrenzenden Region umgeben, nämlich einer nicht-benetzbaren Region, welche den Transport der Reaktanten zwischen benachbarten Reaktionsregionen verhindert. Folglich können die Reaktanten in einer Region nicht in andere Regionen fließen, wo sie die Reaktion kontaminieren könnten. In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden die Regionen des Arrays durch selektive Bestrahlung einer Substratoberfläche definiert, welche fotolabile hydrophobe Schutzgruppen enthält. In Flächen, wo die Oberfläche bestrahlt wird, werden die hydrophoben Schutzgruppen entfernt, um die Reaktionsregionen zu definieren. Wenn eine wässrige Lösung oder eine Lösung von einem anderen polaren Reaktanten in der Reaktionslösung abgeschieden wird, wird sie einen relativ großen Benetzungswinkel mit dem Substrat aufweisen, so dass durch Einstellen der abgeschiedenen Menge sichergestellt werden kann, dass kein Fließen zu benachbarten Regionen auftritt.
Ein weiteres Verständnis der Natur und der Vorteile der Erfindungen, die hier vorliegen, kann unter Bezug auf die verbleibenden Teile der Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen erhalten werden.
1a ist eine Aufsicht von oben und 1b ein Querschnitt einer ersten Ausführungsform einer Einheit, welche verwendet wird, um Arrays von Polymersequenzen zu synthetisieren;
2 ist ein Querschnitt einer Ausführungsform, welche eine Druckkammer zum Festhalten eines Substraten gegen einen Kanalblock enthält;
3a und 3b sind Ansichten von oben von zwei verschiedenen aufgefächerten Array-(„fanned Array") Kanalblöcken;
4 ist ein Querschnitt eines Kanalblocks und assoziierter Zuflussanschlüsse gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
5 ist ein detaillierter Querschnitt des Zuflussanschlusses in einem Kanalblock;
6a und 6b zeigen einen Apparat, welcher verwendet wird, um ein Substrat von einem Kanalblock zum anderen zu transferieren;
7 ist ein Diagramm eines Vielkanal-Festphasen-Synthetisierers;
8a und 8b illustrieren alternative Anordnungen der Rillen in einem Kanalblock;
9 ist eine schematische Illustration der Reaktionspfade, welche verwendet werden, um einige hydrophobe Gruppen der vorliegenden Erfindung herzustellen;
10 ist eine Kartierung der erwarteten Fluoreszenzintensitäten mit einem Substrat, welches selektiv Fluoreszenzfarbstoffen ausgesetzt wird.

I. Glossar
II. Allgemeines
III. Verfahren zur mechanischen Anlieferung von Reagenzien
IV. Fließkanalausführugsformen
V. Platzierende Ausführungsformen
VI. Alternative Ausführungsformen
VII. Beispiele A. Dichtheitstest B. Ausbildung von YGGFL C. 100-μm-Kanalblock D. Kanal-Matrix-Hybridisierungs-Assay
VIII. Schlussfolgerung

I. Glossar
Im Folgenden sind die Begriffe so gedacht, dass sie die folgenden allgemeinen Bedeutungen haben, wenn sie im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden:

1. Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, welches von einem Rezeptor erkannt wird. Beispiele von Liganden, welche im Rahmen dieser Erfindung untersucht werden können, schließen Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Toxine und Gifte (venoms), virale Epitope, Hormone, Opiate, Steroide, Peptide, Enzymsubstrate, Co-Faktoren, Arzneimittel (drugs), Lectine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide und Proteine ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
2. Monomer: Ein Monomer ist ein Mitglied des Satzes von kleinen Molekülen, welche entweder miteinander verknüpft sind oder untereinander verknüpft werden können, um ein Polymer auszubilden oder eine Verbindung bestehend aus zwei oder mehreren Mitgliedern. Der Satz an Monomeren schließt beispielsweise den Satz von allgemeinen L-Aminosäuren, den Satz von D-Aminosäuren, den Satz von synthetischen und/oder natürlichen Aminosäuren, den Satz von Nukleotiden und den Satz von Pentosen und Hexosen ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Die spezielle Reihenfolge der Monomere innerhalb eines Polymers wird hier als die "Sequenz" des Polymers bezeichnet. Wie hier verwendet, bezeichnen Monomere jegliche Art eines Mitgliedes eines Basissatzes zur Synthese eines Polymers. Beispielsweise Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren bilden einen Basissatz von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden aus. Verschiedene Basissätze von Monomeren können in nachfolgenden Schritten in der Synthese eines Polymers verwendet werden. Des Weiteren kann ein jeder der Sätze geschützte Mitglieder enthalten, welche nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung wird hier primär im Hinblick auf die Herstellung von Molekülen beschrieben, welche Sequenzen von Monomeren, wie z.B. Aminosäuren, aufweisen, kann jedoch sofort in der Herstellung von anderen Polymeren verwendet werden. Solche Polymere schließen beispielsweise sowohl lineare als auch zyklische Polymere von Nukleinsäuren, Polysacchariden, Phospholipiden und Peptiden, welche entweder α-, β- oder ω-Aminosäuren aufweisen, Heteropolymere, in welchen ein bekanntes Arzneimittel kovalent an jeden der oben genannten Vertreter gebunden ist, Polynukleotide, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate und andere Polymere ein, die nach Studium dieser Offenbarung offensichtlich sein werden. Solche Polymere sind "verschieden", wenn die Polymere, welche unterschiedliche Monomersequenz haben, an verschiedenen vordefinierten Regionen eines Substrates ausgebildet werden. Verfahren zur Zyklisierung und zum Polymerabbau von Polymeren werden in US-A-5,742,974 (serielle Anmelde-Nr. 796,727, eingereicht am 22. November 1991) mit dem Titel "POLYMER-ABBAU AUF FESTEN OBERFLÄCHEN" offenbart.
3. Peptide: Ein Peptid ist ein Polymer, in welchen die Monomere α-Aminosäuren sind, und diese untereinander durch Amidbindung verknüpft sind; sie werden alternativ auch als Polypeptide bezeichnet. Aminosäuren können das L-optische Isomer oder das D-optische Isomer darstellen. Peptide sind zwei oder mehrere Aminosäuremonomere lang und sind oft mehr als 20 Aminosäuremonomere lang. Übliche Abkürzungen von Aminosäuren werden verwendet (beispielsweise P für Prolin). Diese Abkürzungen sind in Stryer, Biochemistry, Third Ed., 1988 enthalten.
4. Rezeptor: Ein Rezeptor ist ein Molekül, das eine Affinität für einen Liganden hat. Rezeptoren können natürlich auftretende oder synthetisierte Moleküle sein. Sie können in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit weiteren Spezies verwendet werden. Rezeptoren können an ein bindendes Mitglied angebunden werden, sei es kovalent oder nicht-kovalent, entweder direkt oder über eine spezifisch bindende Substanz. Beispiele von Rezeptoren, welche in dieser Erfindung verwendet werden können, schließen Antikörper, Zellmembranrezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren ein, welche mit spezifischen Antigenen-Determinanten reaktiv sind, sowie Viren, Zellen, Arzneimittel (drugs), Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Co-Faktoren, Lectine, Zucker, Polysaccharide, zelluläre Membrane und Organelle, sind aber nicht darauf beschränkt. Rezeptoren werden manchmal im Stand der Technik als Anti-Liganden bezeichnet. Wenn die Be zeichnung Rezeptoren hier verwendet wird, ist keine andere Bedeutung beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptorpaar" wird ausgebildet, wenn zwei Moleküle durch Molekülerkennung sich miteinander kombiniert haben, um einen Komplex auszubilden. Spezielle Beispiele von Rezeptoren, welche von dieser Erfindung untersucht werden können, schließen folgende Substanzen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: a) Mikroorganismus-Rezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, welche Rezeptoren von Mikroorganismen binden, wie z.B. spezifische Transportproteine, oder Enzyme, welche zum Überleben der Mikroorganismen essentiell sind, würde ein geeignetes Hilfsmittel zum Entdecken neuer Klassen von Antibiotika darstellen. Von besonderem Wert würden Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Einzeller und Bakterien sein, welche resistent gegen die derzeit gebräuchlichen Antibiotika sind. b) Enzyme: Beispielsweise kann ein Rezeptor eine Bindungsstelle eines Enzyms umfassen, beispielsweise eines Enzyms, welches für das Schneiden eines Neurotransmitters verantwortlich ist; die Bestimmung von Liganden für diesen Typ an Rezeptor, und die Aktivität eines Enzyms zu modulieren, welches einen Neurotransmitter schneidet, ist hilfreich zur Entwicklung von Arzneimitteln, welche in der Behandlung von Krankheiten der Neurotransmission verwendet werden können. c) Antikörper: Beispielsweise kann die Erfindung hilfreich für die Untersuchung des Rezeptors sein, welcher eine Liganden bindende Stelle auf einem Antikörpermolekül umfasst, welches mit einem Epitop eines Antigens von Interesse kombiniert; die Bestimmung einer Sequenz, welche ein Antigenepitop mimt, kann zu der Entwicklung von Vakzinen führen, in welchen das Immunogen auf einer oder mehrerer solcher Sequenzen basiert, oder zu der Entwicklung von verwandten diagnostischen Agenzien von Verbindungen, welche in therapeutischen Behandlungen, wie z.B. für Autoimmunerkrankungen hilfreich sind (beispielsweise durch Blockade der Bindung der Selbst-Antikörper). d) Nukleinsäuren: Sequenzen von Nukleinsäuren können synthetisiert werden, um DNA- oder RNA-bindende Sequenzen zu etablieren, welche als Rezeptoren für synthetisierte Sequenzen agieren. e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Antikörper, welche in der Lage sind, chemische Reaktionen voranzutreiben, welche die Konversion von einem oder mehreren Reaktanten in ein oder mehrere Produkte einschließen. Solche Peptide schließen generell eine Bindungsstelle, welche spezifisch für zumindest einen Reaktanten oder ein Reaktionszwischenprodukt ist, ein sowie eine aktive Funktionalität benachbart zu der Bindungsstelle, wobei diese Funktionalität in der Lage ist, den gebundenen Reaktanten chemisch zu modifizieren. Katalytische Polypeptide und andere sind beispielsweise in den PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 90/05746, WO 90/05749 und WO 90/05785 beschrieben. f) Hormonrezeptoren: Die Bestimmung der Liganden, welche mit hoher Affinität einen Rezeptor, wie z.B. den Rezeptor für Insulin und Wachstumshormon binden, ist hilfreich in der Entwicklung beispielsweise eines oralen Substituts für die tägliche Injektion, die Diabetiker empfangen müssen, um die Symptome der Diabetes zu mildem oder ein Substitut für ein Wachstumshormon. Weitere Beispiele für Hormonrezeptoren schließen die vasokonstriktiven Hormonrezeptoren ein; die Bestimmung von Liganden für diese Rezeptoren kann zu der Entwicklung von Arzneimitteln zur Kontrolle des Blutdrucks führen. g) Opiatrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, welche an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist hilfreich für die Entwicklung von weniger süchtig machenden Substituten für Morphin und verwandten Arzneimitteln.
5. Substrat: Ein Material, welches eine rigide oder semi-rigide Oberfläche aufweist. In vielen Ausführungsformen wird zumindest eine Oberfläche des Substrates substanziell eben sein, obwohl in einigen Ausführungsformen es wünschenswert sein kann, physikalisch Syntheseregionen für viele Polymer beispielsweise mit Wänden, erhöhten Regionen, geätzten Rinnen oder dergleichen abzutrennen. In einigen Ausführungsformen enthält das Substrat selbst Wände, Rinnen, Fließpfade durch Regionen, etc., welche die gesamte oder Teile der Syntheseregionen ausbilden. Gemäß anderen Ausführungsformen können kleine Beats an der Oberfläche bereitgestellt werden, und Verbindungen, welche daran synthetisiert werden, können nach Vervollständigungen der Synthese entfernt werden.
6. Kanalblock: Ein Material, welches eine Vielzahl von Rillen oder begrenzten Regionen auf seiner Oberfläche aufweist. Die Rillen oder begrenzten Regionen können eine Vielzahl von geometrischen Konfigurationen einnehmen, einschließlich, aber nicht limitiert auf Streifen, Kreise, serpentinartige Pfade oder dergleichen. Kanalblöcke können in einer Vielzahl von Arten hergestellt werden, einschließend das Ätzen von Siliziumblöcken, das Gießen oder Pressen von Polymeren etc.
7. Schutzgruppe: Ein Material, welches an eine Monomereinheit gebunden ist, und welches selektiv von dieser entfernt werden kann, um eine aktive Stelle zu exponieren, wie z.B. in dem speziellen Beispiel einer Aminosäure eine Aminogruppe. Spezielle Beispiele von fotolabilen Schutzgruppen werden in Fodor et al., PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 92/10092 diskutiert.
8. Vordefinierte Region: Eine vordefinierte Region ist eine lokalisierte Fläche auf einem Substrat, welche zur Ausbildung eines ausgewählten Polymers verwendet wird, wurde oder beabsichtigt wird, dafür verwendet zu werden; und sie wird hier auch alternativ als "Reaktions"-Region, eine "ausgewählte" Region, oder einfach als "Region" bezeichnet. Die vordefinierte Region kann jede Art einer günstigen Form aufweisen, z.B. kann sie kreisrund, rechtwinklig, ellipsoid, keilförmig, etc., sein. In einigen Ausführungsformen ist die vordefinierte Region und deshalb auch die Region, innerhalb welcher eine ausgewählte Polymersequenz synthetisiert wird, kleiner als etwa 1 cm², mehr bevorzugt kleiner als 1 mm² und noch mehr bevorzugt weniger als 0,5 mm². In den meist bevorzugten Ausführungsformen weisen die Regionen eine Fläche von weniger als ungefähr 10 000 μm² oder mehr bevorzugt, weniger als 100 μm² auf. Innerhalb dieser Regionen wird das darin synthetisierte Polymer vorzugsweise in einer substanziell reinen Form synthetisiert.
9. Substanziell rein: Ein Polymer wird als "substanziell rein" innerhalb einer vordefinierten Region eines Substrates betrachtet, wenn es Charakteristika zeigt, welche es von anderen vordefinierten Regionen unterscheiden. Typischerweise wird die Reinheit mit Hilfe der biologischen Aktivität oder Funktion als ein Resultat einer einheitlichen Sequenz gemessen. Solche Charakteristika werden typischerweise mit Hilfe des Anbindens an einen ausgewählten Liganden oder Rezeptor gemessen. Vorzugsweise ist die Region hinreichend rein, so dass die vorherrschende Spezies in einer vordefinierten Region die gewünschte Sequenz ist. Gemäß den bevorzugten Aspekten der Erfindung ist das Polymer zumindest 5% rein, mehr bevorzugt mehr als 10 bis 20% rein, mehr bevorzugt mehr als 80 bis 90% rein und am meisten bevorzugt mehr als 95% rein, wobei die Reinheit zu diesem Zweck sich auf das Verhältnis der Anzahl der Ligandenmolekülen, welche in einer vordefinierten Region ausgebildet werden, die eine gewünschte Sequenz aufweisen, zu der Gesamtzahl der Moleküle, welche in der vordefinierten Region ausgebildet werden, bezieht.

II. Allgemeines
Die Erfindung kann in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Beispielsweise kann die Erfindung als Synthesewerkzeug verwendet werden (wie z.B. in der Peptidsynthese), als Screeningwerkzeug (wie z.B. zum Screenen von Verbindungsbibliotheken zur Wirkstoffaktivität), oder als überwachendes/diagnostisches Werkzeug (wie z.B. in medizinischen oder umweltanalytischen Tests). In einer spezifischen Ausführungsform wird die Erfindung für Diagnosen auf Nukleinsäurebasis verwendet.
Als ein Synthesewerkzeug stellt die vorliegende Erfindung zum Ausbilden von Arrays eine große Anzahl von verschiedenen Polymersequenzen bereit. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Synthese eines Arrays von verschiedenen Peptiden oder Oligonukleotiden in ausgewählten Regionen auf dem Substrat bereit. Solche Substrate, welche die verschiedenen Sequenzen ausgebildet darauf aufweisen, können beispielsweise in Screeninguntersuchungen zur Bewertung ihrer Interaktion mit Rezeptoren, wie z.B. Antikörpern und Nukleinsäuren, verwendet werden. Beispielsweise stellt die Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen das Screenen von Peptiden zur Verfügung, um zu bestimmen, welcher – wenn überhaupt einer – der verschiedenen Sätze von Peptiden eine starke Bindungsaffinität mit einem Rezeptor aufweist, und, in besonders bevorzugten Ausführungsformen, um die relative Bindungsaffinität von verschiedenen Peptiden mit einem Rezeptor von Interesse zu bestimmen.
Solch unterschiedliche Polymersequenzen werden bevorzugterweise auf einem einzigen Substrat synthetisiert. Durch die Synthese der unterschiedlichen Polymersequenzen auf einem einzigen Substrat kann die Verarbeitung der Sequenzen, im Hinblick auf die Bewertung ihrer Eigenschaften, wie z.B. die relative Bindungsaffinität, wesentlich einfacher durchgeführt werden. Um an einem Beispiel zu verdeutlichen, wenn ein Array von Peptidsequenzen (oder eine Bibliothek von anderen Verbindungen) ausgewertet wird, um die relative Bindungsaffinität der Peptide an einem Rezeptor zu bestimmen, kann das gesamte Substrat und damit alle oder eine Gruppe der Polymersequenzen einem geeignet gelabelten Rezeptor ausgesetzt werden und gleichzeitig ausgewertet zu werden.
In einigen Ausführungsformen kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, um große Kollektionen von synthetischen chemischen Verbindungen oder natürlichen Produktextrakten zu lokalisieren und – in einigen Fällen – zu immobilisieren. In solchen Verfahren werden Verbindungen auf vordefinierten Regionen auf einem Substrat abgeschieden. Die Reaktion der immobilisierten Verbindung (oder der immobilisierten Verbindungen) mit verschiedenen Testzusammensetzungen, wie z.B. den Vertretern der chemischen Bibliothek oder einem biologischen Extrakt werden durch Dispergieren von kleinen Aliquots von jedem Mitglied der Bibliothek oder des Extraktes auf verschiedene Regionen getestet. Kompetitive Arrays oder wohl bekannte Techniken können verwendet werden, um die gewünschte Aktivität zu identifizieren. Als ein Beispiel wird eine große Kollektion von menschlichen Rezeptoren auf einem Substrat abgeschieden und zwar einer in jeder Region, um ein Array aufzubilden. Ein Pflanzen/tierischer Extrakt wird dann gescreent hinsichtlich des Bindens an verschiedene Rezeptoren des Arrays.
Die vorliegende Erfindung weist bestimmte Merkmale in Übereinstimmung mit den "lichtinduzierten" Verfahren, welche in US-Patent Nr. 5,143,854 beschrieben werden, auf. Die lichtinduzierten Verfahren, welche in dem '854-Patent diskutiert werden, involvieren das Aktivieren von vordefinierten Regionen des Substrates und das anschließende Inkontaktbringen des Substrates mit einer vorausgewählten Monomerlösung. Die vordefinierten Regionen können mit einer Lichtquelle, welche durch eine Maske scheint, aktiviert werden (in sehr ähnlicher Weise zu fotolithografischen Techniken, welche in der integrierten Schaltkreisfabrikation verwendet werden). Weitere Regionen des Substrates bleiben inaktiv, da sie durch die Maske gegen Bestrahlung blockiert sind. Folglich definiert ein beleuchtetes Muster, welche Regionen des Substrats mit einem gegebenen Monomer reagieren. Durch wiederholtes Aktivieren verschiedener Sätze von vordefinierten Regionen und Kontaktieren verschiedener Monomerlösungen mit dem Substrat wird ein unterschiedliches Array von Polymeren auf dem Substrat produziert. Natürlich können andere Schritte, wie z.B. das Waschen von unreagierter Monomerlösung gegen das Substrat als notwendig verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen agiert die Menge der Monomer-(oder anderen) Lösung, welche abgeschieden wurde, und die Zusammensetzung des Substrates so, dass verschiedene Monomerlösungen auf dem Substrat getrennt werden. Dies ermöglicht, dass verschiedene Monomere zugeführt und an verschiedene Regionen gleichzeitig angebunden werden können (oder annähernd simultan) und reduziert die Anzahl von separaten Wasch- und anderen Reaktionsschritten, die notwendig sind, um ein Array aus Polymeren auszubilden. Des Weiteren können die Reaktionsbedingungen in verschiedenen aktivierten Regionen unabhängig voneinander kontrolliert werden. Folglich können Kon zentrationen von Reaktanten und andere Parameter unabhängig voneinander von Reaktionsstelle zu Reaktionsstelle variiert werden, um das Vorgehen zu optimieren.
III. Verfahren zur mechanischen Zufuhr von Reagenzien
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Reagenzien dem Substrat zugeführt, entweder durch (1) Fließen innerhalb eines Kanals definiert auf einer vordefinierten Region oder (2) "Platzieren" (spotting) in vordefinierten Regionen. Jedoch können andere Ansätze, wie auch Kombinationen von Platzieren und Fließen verwendet werden. In jedem Fall werden bestimmte aktivierte Regionen des Substrates mechanisch von anderen Regionen separiert, wenn die Monomerlösungen in verschiedenen Reaktionsplätzen zugeführt werden.
Die "Platzierenden"-Ausführungsformen der Erfindung können sehr in derselben Art und Weise wie die Fließkanal-Ausführungsformen implementiert werden. Beispielsweise kann ein Monomer A an eine erste Gruppe von Reaktionsregionen, welche geeignet aktiviert worden sind, angeliefert und angebunden werden. Anschließend kann ein Monomer B an eine zweite Gruppe von aktivierten Reaktionsregionen angeliefert und mit diesem zur Reaktion gebracht werden. Im Gegensatz zu den Fließkanal-Ausführungsformen, wie sie oben beschrieben werden, werden die Reaktanten durch direktes Abscheiden (anstelle des Zuflusses) relativ kleiner Mengen von ihnen in ausgewählten Regionen angeliefert. In einigen Schritten kann die gesamte Substratoberfläche besprüht oder anderweitig mit einer Lösung gewatet werden. In bevorzugten Ausführungsformen bewegt sich ein Spender von Region zu Region, und scheidet nur soviel Monomer ab, wie bei jedem Stopp notwendig ist. Typische Spender schließen eine Mikropipette ein, um die Monomerlösung an das Substrat anzuliefern und ein Robotersystem, um die Position der Mikropipette relativ zu dem Substrat gesehen, zu kontrollieren. In anderen Ausführungsformen schließt der Spender eine Reihe von Schläuchen, einen Verteiler, ein Array von Pipetten oder dergleichen ein, so dass verschiedene Reagenzien gleichzeitig an die Reaktionsregionen angeliefert werden können.
IV. Fließkanal-Techniken
1a und 1b illustrieren Details einer ersten Ausführungsform einer Einheit, welche zum Durchführen der Syntheseschritte, wie sie oben beschrieben werden, verwendet wird. Insbesondere 1a illustriert die Einheit in einer Ansicht von oben, wohingegen 1 die Einheit in einer Seitenansicht im Querschnitt illustriert. In der besonderen Ausführungsform, welche in 1 gezeigt ist, könnte die Einheit verwendet werden um die Polymersequenzen auf Substrat 401 zu synthetisieren. Substrat 401 ist an eine rotierende Ebene 402 gekoppelt und reversibel mit einer Klammer 405 an dem Kanalblock 407 fixiert. Kanalblock 407 weist eine Vielzahl von darin eingeätzten Kanälen 409 in Form von Streifen auf. Jeder Kanal ist mit einem Fließeinlass 411 und einem Fließauslass 413 versehen. Eine Vakuumquelle 415 ist auf einem oder mehreren der Auslasse 413 angebracht, wohingegen eine Pipettiereinheit 417 gleitbar auf einem Arm 419 montiert ist, um ausgewählte Reagenzien von dem Reservoir (den Reservoiren) 421 an ausgewählte Flusseinlässe 411 zu geleiten.
Die Details einer zweiten bevorzugten Ausführungsform sind in den 2 bis 6 dargestellt. 2 zeigt einen Apparat zum Fixieren eines Substrats 111 gegen einen Kanalblock 109 durch gleichmäßiges Verteilen von Druck über das Substrat in einer Druckkammer 101. Gas unter Druck wird durch einen Gasdruckeinlass 103 zugeführt, um den Klemmdruck zur Verfügung zu stellen und danach das Substrat zu immobilisieren, während Flüssigkeiten vom Flüssigkeitsflusseinlass 115 durch den Kanal 123 und aus dem Fließauslass 117 gebracht werden. Die oberen und unteren Teile des Druckkammergehäuses 104 und 125 werden durch Muttern 121 und Bolzen 104 zusammengehalten. Selbstverständlich können auch andere Mittel, wie z.B. Klammem, verwendet werden, um die Teile des Druckkammergehäuses zusammenzuhalten.
3 illustriert bevorzugte Konfigurationen von Fließpfaden in Kanalblöcken der vorliegenden Erfindung. Wie in 3a dargestellt, sind die Flüssigkeitszufuhrstellen 127, 129, 131, 133, 135 und 137 mit Kanälen verknüpft, welche zur Reaktionsregion 141 führen. Eine ähnliche Anordnung ist für Vergleichszwecke in 3b dargestellt, wo die Orientierung der Fließkanäle in den Reaktionsregionen um 90° auf einem rechtwinkligen Kanalblock gedreht ist. Vakuumcodes 145 und 146 zur externen Vakuumzufuhr werden bereitgestellt, so dass die Substratposition während dem Flüssigkeitsfluss beibehalten wird.
Die Kanäle, welche in den 3a und 3b gezeigt sind, bilden ein gefächertes ("fanned") Kanalarray auf dem Kanalblock 139 in einer Art aus, welche analog zu der von Leitstrukturen, die in integrierten Schaltkreisen verwendet werden, ist. Dies stellt signifikant vergrößerte Trennung der Flüssigkeitszulieferungspunkte im Vergleich zu der hohen Dichte der Kanäle in der Reaktionsregion zur Verfügung. In einem 50,8 mm (2 Inch) × 76,2 mm (3 Inch)-Substrat kann typischerweise zumindest eine 4:1-Vergrößerung in der räumlichen Trennung durch die gefächerte Anordnung erzielt werden. Folglich können die Zufuhrports um 0,8 mm getrennt werden, wenn die Kanäle in den Reaktionsregionen um 200 μm getrennt sind.
Die räumliche Trennung kann des Weiteren durch Staffeln der Zufuhrports – wie für die Ports 127, 129 und 133 gezeigt – vergrößert werden. Dies kann eine zusätzliche Kanaltrennung von zumindest etwa 3:1 zur Verfügung stellen. Folglich stellt ein gestaffeltes gefächertes Array eine 2,4 mm-Trennung zwischen den Zufuhrports zur Verfügung für Kanäle, die um 200 μm getrennt sind. Folglich kann Flüssigkeit durch ein hoch dichtes Array von Kanälen in der Reaktionsregion ausgehend von 1,6 mm Teflon^®-Rohmaterial geliefert werden. Falls zusätzliche räumliche Aufweitung notwendig ist, kann die Substratgröße vergrößert werden, während die Reaktionsregionsgröße beibehalten wird.
Wie in 4 gezeigt, werden die Flüssigkeits-Zufuhrports von Löchern in der rückwärtigen Oberfläche auf der stabilisierenden Platte 108 auf dem Kanalblock erreicht. Die stabilisierende Platte, welche vorzugsweise aus Fused-Pyrex besteht, stellt strukturelle Integrität des Kanalblocks während des Einklemmens in die Druckkammer zur Verfügung. Sie kann auch ein Mittel zur Verfügung stellen, um die Kanalblockports zu erreichen und das Lecken zwischen Ports oder Kanälen reduzieren. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Kanäle des Kanalblocks auf einem Wafer 106 ausgebildet, welcher generell jegliche Art eines ver- oder bearbeitbaren Materials sein kann und vorzugsweise geätztes Silizium oder eine mikromaschinell bearbeitete Keramik sein kann. In anderen Ausführungsformen ist der Kanalblock Druck- geformt oder durch Injektion aus einem geeigneten Polymers formgepresst. Die gesamte Anordnung des Kanalblocks wird auf einer festen Unterplatte für den Kanalblock 110 montiert, welcher eine Vakuumzufuhr 112 enthält, so wie Ports für die Flüssigkeits-Zulieferungs-Leitungen 115, Ports für die Flüssigkeits-Abfuhrleitungen 117 und erniedrigte Regionen für die Dübel-Enden 151 und 153. Mit dieser Anordnung kann das Substrat gegen die obere Oberfläche des Kanalblocks geklemmt werden (durch Vakuum oder Druckgas, wie in der Ausführungs form von 2), während die Flüssigkeit von unten ein- und austritt. Vorzugsweise wird die Unterplatte aus einem steifen Material, wie z.B. rostfreiem Stahl oder anodisiertern Aluminium, bestehen.
Individuelle Verknüpfungen aus Mikrorohrwerk können für jeden der Kanäle, wie in 5 gezeigt, erstellt werden. Dübelenden 151 mit einer konischen oberen Oberfläche, die mit einer konischen Einkerbung 118 in einer Pyrex-stabilisierenden Platte 108 zusammenpassen, werden bereitgestellt. Dübelenden 151 weisen auch eine zylindrische untere Oberfläche auf, welche mit der zylindrischen Einkerbung 116 in der Unterplatte 110 zusammenpasst. Die Unterplatte und die stabilisierende Platte werden von einem Bolzen 114 und einem Gewindeinsert 112 oder anderen geeigneten Verbindungsmitteln zusammengehalten.
Das gefächerte Kanalarray-Design, das in 3 gezeigt ist, stellt zwei separate Kanalblöcke, welche in aufeinanderfolgenden Prozessschritten verwendet werden sollen, während einer chemischen Synthese zur Verfügung. Ein Block bildet ein horizontales Array auf dem festen Substrat aus, wohingegen der andere Block ein vertikales Array ausbildet. Um eine Matrix von sich kreuzenden Reihen und Säulen von chemischen Verbindungen zu erzeugen, wird das feste Substrat von einem Block auf den anderen während der aufeinanderfolgenden Prozessschritte übertragen. Während viele Experimente nur einen einzigen Transfer von einem Block auf den anderen während einer Reihe von Prozessschritten verlangen, stellt die gefächerte Kanalanordnung des Transferblocks 75, wie in 6a und 6b dargestellt, eine Einheit zur Beibewahrung der akkuraten Registration des festen Substrates 71 relativ zu den Kanalblöcken 79 während wiederholtem Transfer zur Verfügung. In einigen Ausführungsformen kann ein einzelner Kanalblock für horizontale und vertikale Arrays durch einfaches Rotieren um 90° wie nötig verwendet werden.
Der Transferblock wird im Hinblick auf den Kanalblock so positioniert, dass die dimensionalen Eigenschaften des festen Substrates für die Ausrichtung nicht verwendet werden. Der Transferblock 75 wird durch den kinematischen Mount 81 an dem Kanalblock ausgerichtet, während das Vakuum von der Vakuumleitung 83 auf dem Kanalblock zur Vakuumleitung 77 auf dem Transferblock (während der normalen Operation hält ein Vakuum das Substrat gegen den Kanalblock) geschaltet wird. Das Substrat und der Transferblock werden dann bewegt und relativ gegen den zweiten Kanalblock neu positioniert. Vakuum wird dann auf dem zweiten Kanalblock geschaltet, wobei das Substrat in geeigneter Ausrichtung gehalten wird. Auf diese Weise kann akkurate Registration zwischen Prozessschritten unabhängig der Variation in den Dimensionen des individuellen Substrates gewährleistet werden. Das Transferblocksystem behält auch die Ausrichtung der Matrixfläche während des Transfers zu und von der Fließzelle während Experimenten, die sowohl mechanische als auch lichtinduzierte Prozessschritte verwenden, bei.
In einigen Ausführungsformen ist es nicht notwendig, den Kanalblock zu verwenden. Stattdessen werden in einigen Ausführungsformen kleine "Streifen" des Reagens auf das Substrat, beispielsweise durch Streifenbildung auf dem Substrat bzw. das Einbringen von Kanälen mit einer Pipettiereinheit, appliziert. Solche Ausführungsformen bergen gewisse Ähnlichkeit mit den Inseln-(spot) bildenden Ausführugsformen dieser Erfindung. Gemäß den anderen Ausführungsformen werden die Kanäle durch Abscheiden eines Fotolacks, wie er z.B. extensiv in der Halbleiterindustrie verwendet wird, ausgebildet. Solche Materialien schließen Polymethylmethacrylat (PMMA) und seine Derivate und Elektronenstrahl-resistente Substanzen, wie z.B. Poly (olefinsulfone) und dergleichen (detaillierter beschrieben in Ghandi, "VLSI Fabrication Prinicples", Wiley (1983) Chapter 10) ein. Gemäß diesen Ausführungsformen wird ein Lack abgeschieden, selektiv exponiert und geätzt, wobei ein Teil des Substrates exponiert zum Ankoppeln zurückgelassen wird. Diese Schritte des Abscheidens des Lackes, des selektiven Entfernens des Lackes und des Monomeranbindens werden wiederholt, um Polymere in einer gewünschten Sequenz an gewünschten Stellen auszubilden.
In einigen Ausführungsformen kann ein Lack verwendet werden, um bestimmte Regionen des Substrates zu aktivieren. Bestimmte Lackmaterialien, wie z.B. Säure-generierende Polymere, werden Protonen infolge von Bestrahlung freisetzen. Gemäß diesen Ausführungsformen wird ein Substrat mit einem solchen Material durch eine Maske oder in anderer Weise selektiv bestrahlt, so dass die bestrahlten Regionen des Substrates den sauren Bedingungen ausgesetzt werden. Eine Säure-labile Schutzgruppe auf dem Substrat oder Oligomere auf dem Substrat werden entfernt und hinterlassen eine aktivierte Region. An diesem Punkt kann der gesamte oder ein Teil des Lackes entfernt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Lack nur in den aktivierten Regionen entfernt, so dass die Kanäle in den aktivierten Regionen ausgebildet werden. Alternativ kann der Lack von dem gesamten Substrat entfernt werden. In diesem Fall kann ein separater Kanalblock mit dem Substrat in Kontakt gebracht werden, um Fließkanäle zu definieren oder es kann eine konventionelle VLSIPS^®-Prozedur eingesetzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat konventionelles Glas, Pyrex, Quarz, irgendeines der Vielzahl von polymeren Materialien oder dergleichen. Selbstverständlich kann das Substrat auch von irgendeinem der Vielzahl von Materialien, wie z.B. Silizium, Polystyrol, Polycarbonat oder dergleichen sein. In bevorzugten Ausführungsformen besteht der Kanalblock aus Silizium oder Polychlorotrifluorethylen, wie z.B. ein Material, das unter dem Handelsnamen KeIF^® 80, hergestellt von 3M bekannt ist, obwohl eine große Vielzahl von Materialien, wie z.B. Polystyrol, Polycarbonat, Glas, Elastomere, wie z.B. Kalrez, hergestellt von DuPont, verschiedene Keramiken, Edelstahl oder dergleichen verwendet werden können.
Die Kanäle in dem Kanalblock werden vorzugsweise maschinell hergestellt, durch Druckformgießen, durch Injektionsformen, durch Lithografie, durch Laserschneiden oder dergleichen, je nachdem, welches Material von Interesse ist. In einigen Ausführungsformen, welche größere Kanalblöcke einsetzen, werden die erhöhten Teile des Kanals im Kanalblock durch Läppen mit einem Läppingfilm (0,3 μm Gitter) behandelt. Solche glatten Oberflächen stellen gute Versiegelungen für das Substrat bereit, ohne dass ein Versiegelungsmittel dafür verwendet werden muss, und daher ohne dass die Möglichkeit besteht, dass versiegelndes Materials auf dem Substrat beim Rotieren des Kanalblocks zurückbleibt. Vorzugsweise werden alle Arbeitsschritte substanziell bei Umgebungstemperaturen und Umgebungsdrücken durchgeführt.
Ein besonders bevorzugter Kanalblock wird durch chemisches Ätzen von polierten Silizium-Wafern hergestellt. Chemisches Ätzen ist eine weitverbreitete Technik, welche in der integrierten Schaltkreisherstellung verwendet wird. Damit können leicht 60 oder mehr 100 μm große Kanäle auf einer 12,8 μm-Region eines polierten Siliziumwafers bereitgestellt werden. Sogar nach dem Ätzen bewahrt die oberen (ungeätzten) Oberflächenregionen des Wafers das sehr flache Profil des ungeätzten Wafers. Folglich ist enger Kontakt mit dem Substrat während dem Fließzellarbeitsschritt gewährleistet.
Während des Arbeitsvorgangs wird die Oberfläche des Substrates in geeigneter Form durch Reinigen beispielsweise mit organischen Lösungsmitteln, Methylchlorid, DMF, Ethylalkohol oder dergleichen behandelt. Optional kann das Substrat mit geeignetem Lin kermolekül auf seiner Oberfläche versehen werden. Die Linkermoleküle können beispielsweise Arylacetylen, Ethylenglykol-Oligomere, welche zwischen 2 und 10 Monomere oder mehr enthalten, Diamine, Diazide, Aminosäuren oder Kombinationen davon sein. Im Anschluss wird die Oberfläche mit geschützten oberflächenaktiven Gruppen, wie z.B. TBOC- oder FMOC-geschützten Aminosäuren versehen. Solche Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt.
Anschließend werden der Kanalblock und das Substrat in Kontakt gebracht, wobei Flüssigkeits- enge Kanäle ausgebildet werden, die durch die Rillen in dem Kanalblock und das Substrat abgegrenzt werden. Wenn der Kanalblock und das Substrat in Kontakt stehen, wird anschließend ein Agens, welches die Schutzgruppen entfernt, durch einen ersten ausgewählten Kanal geleitet oder durch Gruppen von Kanälen durch Platzieren der Pipettierhilfe auf dem Fließeinlass des gewählten Kanals und optional der Vakuumquelle am Auslass des Kanals. Im Fall beispielsweise von TBOC-geschützten Aminosäuren kann das die Schutzgruppen entfernende Agens beispielsweise Trifluoroessigsäure (trifluoroacetic acid, TFA) sein. Auf diesen Schritt können optional Schritte folgen, in welchen der Überschuss an TFA beispielsweise mit Dichloromethan (DCM) gewaschen wird.
Die Lösungen, welche an die individuellen Reaktionsregionen der Unterlagenmatrix zugeführt werden, fließen durch die Reaktionsregionen zu Abfallentsorgungsregionen, Recyclingtank(s), Separatoren, etc. In einigen Ausführungsformen können die Reaktionslösungen einfach durch die Reaktionsregionen unter dem Einfluss der Schwerkraft fließen, wohingegen in anderen Ausführungsformen die Lösungen durch die Reaktionsregionen gezogen oder geschoben werden, durch Vakuum oder Druck.
Die individuelle Reaktionsregion 1 004 der Unterlagenmatrix werden voneinander durch eine Wand oder Dichtung 1 006 getrennt. Diese verhindern, dass die Reaktionslösung in einer Reaktionsregion in benachbarte Reaktionsregionen fließt und dort zu Verunreinigungen führt. In einer Ausführungsform werden die Reaktionsregionen durch Röhren definiert, welche mit Harz oder einer Reaktionsmischung gefüllt sein können. Die Dichtungen ermöglichen engen Kontakt zwischen der Unterlagenmatrix 1 002 und einer "Maske" 2 (nicht gezeigt). Die Maske dient dazu, die Zufuhr einer ersten Gruppe von Reaktionslösungen durch vorbestimmte Leitungen (Röhren) in Richtung eines ersten Satzes von Reaktionsregionen zu steuern. Dadurch, dass enger Kontakt zwischen den Zufuhrröhren 1 000, der Maske und der Unterlagenmatrix 1 002 gewährleistet wird, ist die Wahrscheinlichkeit, dass Reaktionslösungen versehentlich zum falschen Reaktionsplatz hinzugefügt werden, reduziert.
Durch Einstellen der Dicke der Synthese-Unterlagenmatrix kann die Quantität des immobilisierten Materials in den Reaktionsregionen kontrolliert werden. Beispielsweise können dünne Synthese-Unterlagenmatrizen verwendet werden, um kleine Mengen von oberflächengebundenen Oligomeren zur Analyse zu produzieren, wohingegen dicke Unterlagenmatrizen verwendet werden können, um relativ große Mengen an Oligomeren zu synthetisieren, welche von der Unterlage zur weiteren Verwendung abgespalten werden können. In der letztgenannten Ausführungsform kann ein Kollektor, welcher Dimensionen aufweist, die an individuellen Syntheseunterlagen angepasst sind, verwendet werden, um Oligomere zu sammeln, welche ultimativ von der Reaktionsmatrix freigesetzt werden.
Während lineare Rillen hier in den bevorzugten Aspekten der Erfindung gezeigt werden, werden andere Ausführungsformen der Erfindung zirkulare Ringe oder andere Anordnungen, wie z.B. zirkulare Ringe mit radialen Rillen, welche zwischen ausgewählten Ringen hin- und herlaufen, bereitstellen. Entsprechend einiger Ausführungsformen werden Kanalblöcke in verschiedenen geometrischen Konfigurationen von einem Schritt auf den anderen verwendet, beispielsweise zirkulare Ringe in einem Schritt und lineare Streifen in dem nächsten. 13a illustriert eine der möglichen Anordnungen, in welchen die Kanäle 409 in einer serpentinenartigen Anordnung in dem Kanalblock 407 angeordnet sind.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden die verschiedenen Reagenzien, nicht durch die Öffnungen 413 gepumpt. Stattdessen wird das Reagens in eine der Rillen, wie beispielsweise die Rillen 409, dargestellt in 8b, unter Befüllen der Rille platziert. Das Substrat wird dann oben auf dem Kanalblock platziert, und es wird ermöglicht, dass die exponierten Teile des Substrates mit den Materialien in den Rillen reagieren. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Kanäle von der gleichen Breite wie die erhöhten Regionen zwischen den Kanälen. Gemäß dieser Ausführungsformen kann das Substrat dann lateral um eine Kanalbreite oder ein ganzteiliges Vielfalt der Kanalbreite verschoben werden.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen wird das Array von Polymersequenzen in einer oder mehreren einer Vielzahl von Screeningverfahren verwendet; ein solches wird in US-A-5242974 (US-Anmeldung Serien-Nr. 796,947), eingereicht am 22. November 1991, beschrieben. So wird beispielsweise gemäß einer Ausführungsform das Substrat dann einem Rezeptor von Interesse exponiert, beispielsweise einem Enzym oder einem Antikörper. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen wird der Rezeptor mit Fluorescin gelabelt oder in anderer Weise gelabelt, so dass einfache Detektion der Stelle, an welche der Rezeptor bindet, ermöglicht wird. Gemäß einigen Ausführungsformen wird der Kanalblock verwendet, um Lösungen, welche einen Rezeptor enthalten, über ein synthetisiertes Array von Polymeren zu leiten. Beispielsweise wird gemäß einigen Ausführungsformen der Kanalblock verwendet, um Rezeptorlösungen, welche verschiedene Rezeptorkonzentrationen aufweisen, über Regionen des Substrates zu leiten.
Gemäß der meist bevorzugtesten Ausführungsformen wird die Amplifikation des durch Fluorescinlabeling bereitgestellten Signals durch Exponieren des Substrates gegenüber dem Antikörper von Interesse zur Verfügung gestellt und anschließend des Exponieren des Substrates gegen ein gelabeltes Material, welches komplementär zum gewünschten Antikörper ist, und welches vorzugsweise an vielen Stellen des Antikörpers von Interesse bindet. Beispielsweise kann in einer speziellen Ausführungsform, falls ein Mausantikörper untersucht werden soll, ein gelabelter zweiter Antikörper dem Substrat ausgesetzt werden, welcher beispielsweise ein Ziege-anti-Maus-Antikörper ist. Solche Techniken sind in PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092 beschrieben.
V. Platzierende (Abscheidungs-) Ausführungsformen (Spotting Embodiments)
Monomere (oder andere Reaktanten) werden durch einen Spender in Tropfen, die vordefinierte Regionen befüllen, abgeschieden. Beispielsweise scheidet der Spender in einem einzigen Kopplungsschritt ein erstes Monomer in einer Reihe von vordefinierten Regionen durch Bewegen über eine erste Region, Abscheiden eines Tropfens und Bewegen zu einer zweiten Region, Abscheiden eines Tropfens, usw., bis jede der gewählten Regionen das Monomer aufgenommen hat, ab. Anschließend scheidet der nächste Spender ein zweites Monomer in einer zweiten Serie von vordefinierten Regionen in der gleichen Art und Weise ab. In einigen Ausführungsformen können mehr als ein Spender verwendet werden, so dass mehr als ein Monomer gleichzeitig abgeschieden wird. Die Mono mere können sofort nach Kontakt mit den Reaktionsregionen reagieren oder können einen weiteren Aktivierungsschritt erforderlich machen, beispielsweise die Zufuhr eines Katalysators. Nach der Abscheidung einer Reihe von Monomeren und die Reaktionen vordefinierter Regionen über das gesamte Substrat hinweg, wird die Lösung von unreagiertem Monomer von dem Substrat entfernt. Dies schließt einen ersten Verfahrensschritt ab.
Für Zwecke dieser Ausführungsform wird der Raum zwischen den einzelnen Reaktionsregionen des Substrates vorzugsweise weniger als 3 mm sein und noch mehr bevorzugt zwischen 5 und 100 μm. Des Weiteren wird der relative Winkel zwischen den Regionen vorzugsweise innerhalb 1°, mehr bevorzugt innerhalb 0,1° liegen. Vorzugsweise wird das Substrat zumindest ungefähr 100 Reaktionsregionen einschließen und mehr bevorzugt mindestens ungefähr 1 000 Reaktionsregionen und am meisten bevorzugt zumindest ungefähr 10 000 Reaktionsregionen. Selbstverständlich wird die Dichte der Reaktionsregionen auf dem Substrat variieren. In bevorzugten Ausführungsformen existieren zumindest ungefähr 1 000 Reaktionsregionen pro cm² des Substrates, und mehr bevorzugt ungefähr 10 000 Reaktionsregionen pro cm².
Um Reaktionstropfen konsistent an präzise spezifizierte Regionen abzuscheiden, ist ein Referenz-Rahmen, welcher dem Zufuhrinstrument und dem Substrat gemeinsam ist, vonnöten. In anderen Worten, müssen die Referenzkoordinaten des Instrumentes akkurat auf die Referenzkoordinaten des Substrates passen. Idealerweise sind nur zwei Referenzpunkte auf dem Substrat notwendig, um das Array der Polymerregionen komplett anzupassen. Das Spenderinstrument lokalisiert diese Referenzpunkte und stellt dann seine internen Referenzkoordinaten ein, um den notwendigen Abgleich bereitzustellen. Danach kann sich der Spender um eine bestimmte Distanz in einer speziellen Richtung bewegen und kann direkt über einer bekannten Region positioniert werden. Selbstverständlich muss das Spenderinstrument präzise wiederholbare Bewegungen durchführen können. Des Weiteren dürfen die individuellen Regionen des Arrays sich nicht in Bezug auf die Referenzmarkierungen auf dem Substrat, nachdem diese Referenzmarkierungen ausgebildet wurden, bewegen. Unglücklicherweise können das Pressen oder andere mechanische Operationen, welche allgemein in der Fabrikation auftreten, wie auch die Verwendung eines Substrates, das Substrat verformen, so dass die Übereinstimmung zwischen den Referenzmarkierungen und den Reaktionsregionen verändert wird.
Folglich wird in bevorzugten Ausführungsformen ein Substrat verwendet, welches sowohl "globale" wie auch "lokale" Referenzmarkierungen enthält. In bevorzugten Ausführungsformen sind die beiden globalen Referenzmarkierungen günstig auf dem Substrat lokalisiert, um den ursprünglichen Referenzrahmen zu definieren. Wenn diese Punkte lokalisiert werden, weist das Spenderinstrument einen geeigneten Abgleich des Substrats und den vordefinierten Regionen darauf auf. Um in der Lokalisierung der exakten Position der Regionen zu assistieren, wird das Substrat weiter in lokale Referenzrahmen unterteilt. Auf diese Weise wird in einem anfänglichen "Kurs" Einstellungsverfahren der Spender innerhalb einer der lokalen Referenzrahmen positioniert. Sobald es in der lokalen Region ist, sucht das Spenderinstrument lokale Referenzmarkierungen, um weiter einen lokalen Referenzrahmen zu definieren. Ausgehend von diesem bewegt sich der Spender exakt zu der Reaktionsregion, wo das Monomer abgeschieden wird. Auf diese Art und Weise können die Effekte von Wölbungen oder anderen Deformationen minimiert werden. Die Anzahl an lokalen Referenzmarkierungen wird durch die Menge der Deformationen, welche für das Substrat zu erwarten sind, bestimmt. Wenn das Substrat hinreichend steif ist, so dass kaum oder keine Deformation auftreten wird, sind nur sehr wenige lokale Referenzmarkierungen notwendig. Wenn substanzielle Deformation erwartet wird, sind jedoch mehrere lokale Referenzmarkierungen vonnöten.
Um geeignete Referenzpunkte anfänglich zu lokalisieren und den Spender im Hinblick darauf abzugleichen, kann ein bildgebendes oder verdunkelndes System eingesetzt werden. In einem bildgebenden System wird eine Kamera fest auf der Spenderdüse montiert. Wenn die Kamera den Referenzpunkt (die Referenzpunkte) lokalisiert, weiß man, dass der Spender um einen fixen Abstand in einer fixen Richtung von dem Punkt entfernt ist, und ein Referenzrahmen wird etabliert. Verdunkelungssysteme der vorliegenden Erfindung lokalisieren den Referenzpunkt (die Referenzpunkte) beispielsweise durch kapazitive, resistive oder optische Techniken. In einem Beispiel einer optischen Technik wird ein Laserstrahl durch das Substrat transmittiert oder von dem Substrat reflektiert. Wenn der Strahl auf eine Referenzmarkierung stößt, wird eine Veränderung der Lichtintensität von einem Sensor detektiert. Kapazitive und resistive Techniken werden auf ähnliche Art und Weise verwendet. Ein Sensor registriert eine Veränderung hinsichtilich der Kapazität oder des Widerstandes, wenn ein Referenzpunkt getroffen wird.
Ausgehend von einem einzelnen Referenzpunkt wird der Spender von einer Reaktionsregion zu anderen Reaktionsregionen des Substrates um eine korrekte Distanz in der korrekten Richtung translatiert (man nennt dies "Dead Reckoning"-Navigierungstechnik). An jedem Haltepunkt scheidet der Spender korrekt abgemessene Mengen von Monomer ab. Analoge Systeme, welche weit verbreitet in der Herstellung mikroelektronischer Einheiten verwendet werden und in testenden Wissenschaften, können sich in Geschwindigkeiten von bis zu 3 bis 10 Haltepunkten pro Sekunde bewegen. Die translatorische (X-Y) Genauigkeit solcher Systeme liegt gut innerhalb 1 μm.
Translatorische Mechanismen zum Bewegen des Spenders werden vorzugsweise mit geschlossenen Wiederholungs-Positionierungs-Feedback-Mechanismen (Impulsgebern) ausgerüstet, und haben unsignifikanten Totgang (backlash) und unsignifikante Hysterese. In bevorzugten Ausführungsformen weist der Translationsmechanismus eine hohe Auflösung auf, d.h., besser als ein Bewegungsschritt pro Impulsgebertakt. Des Weiteren weist der elektromechanische Mechanismus vorzugsweise eine hohe Wiederholbarkeit relativ bezogen auf die Reaktionsregionen-Durchmesser-Weglänge auf (typischerweise = ± 1 μm oder besser).
Um einen Tropfen der Monomerlösung akkurat auf dem Substrat abzuscheiden, muss die Spenderdüse in einem korrekten Abstand über der Oberfläche platziert werden. In einer Ausführungsform wird die Spenderspitze vorzugsweise von 5 bis 15 μm oberhalb der Oberfläche lokalisiert werden, wenn ein fünf Nanoliter Tropfen freigesetzt wird. Mehr bevorzugt wird der Tropfen etwa 10 μm über der Substratoberfläche sein, wenn der Tropfen freigesetzt wird. Der Grad der Steuerung, die notwendig ist, um solch eine Genauigkeit zu erzielen, wird mit einem wiederholbaren hochauflösenden Translationsmechanismus von dem oben beschriebenen Typus erreicht. In einer Ausführungsform wird die Höhe über dem Substrat durch Bewegen des Spenders in Richtung des Substrates in kleinen Inkrementen bestimmt, so lange, bis die Spenderspitze das Substrat berührt. An diesem Punkt wird der Spender von der Oberfläche um eine festgesetzte Anzahl von Inkrementen wegbewegt, was mit einem speziellen Abstand korrespondiert. Von dort wird der Tropfen auf die Zelle unterhalb freigesetzt. Vorzugsweise liegen die Inkremente, in denen der Spender sich bewegt, bei weniger als etwa 5 μm und mehr bevorzugt bei weniger als etwa 2 μm.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Spenderdüse von einer Ummantelung umgeben, welche sich um einen fixierten Abstand über die Spenderspitze ausdehnt. Vorzugsweise korrespondiert dieser Abstand mit dem Abstand, um den der Tropfen fal len wird, wenn er auf die ausgewählte Reaktionsregion angeliefert wird. Wenn also die Ummantelung die Substratoberfläche kontaktiert, wird die Bewegung des Spenders unterbrochen und der Tropfen wird freigesetzt. Es ist nicht notwendig, in dieser Ausführungsform die Spitze zurück, weg von dem Substrat, bewegen, nachdem ein Kontakt hergestellt wurde. Der Punkt des Kontakts mit der Oberfläche kann mit einer Vielzahl von Techniken bestimmt werden, beispielsweise durch Aufzeichnen der Kapazität oder des Widerstandes zwischen der Spitze des Spenders (oder der Ummantelung) und dem Substrat unterhalb. Eine rapide Veränderung in irgendeiner dieser Eigenschaften wird nach Kontakt mit der Oberfläche festgestellt.
Bis zu diesem Punkt wurde das platzierende Systems nur mit Blick auf translatorische Bewegungen beschrieben. Jedoch können andere Systeme ebenso eingesetzt werden. In einer Ausführungsform wird der Spender im Hinblick auf die Region von Interesse durch ein System, das analog zu einem solchen ist, welches auf den Gebieten der magnetischen und optischen Speichermedien eingesetzt wird, angepasst. Beispielsweise wird die Region, in welcher ein Monomer abgeschieden werden soll, durch eine Spur- und Sektorlokalisierung auf der Scheibe (Disk) identifiziert. Der Spender wird dann in Richtung einer geeigneten Spur bewegt, während das scheibenförmige Substrat rotiert. Wenn die geeignete Zelle unterhalb des Spenders positioniert ist (wie durch den geeigneten Sektor auf der geeigneten Spur angegeben), wird ein Tropfen der Monomerlösung freigesetzt.
Die Steuerung der Tropfengröße kann durch verschiedene Techniken bewerkstelligt werden. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform ein herkömmliches Mikropipettierinstrument angepasst, um Tropfen von fünf Nanolitern oder weniger aus einer Kapillare zu spenden. Solche Tropfen passen in Regionen, weiche einen Durchmesser von 300 μm oder weniger aufweisen, wenn eine nicht-benetzbare Maske der Erfindung eingesetzt wird.
In einer anderen Ausführungsform ist der Spender eine piezoelektrische Pumpe, welche geladene Tropfen generiert und sie in die Reaktionsregionen durch ein elektrisches Feld in einer Art und Weise dirigiert, welche analog zu konventionellen Tintenstrahldruckern ist. Tatsächlich können einige Tintenstrahldrucker mit kleiner Modifikation durch einfaches Ersetzen einer Monomer enthaltenden Lösung anstelle der Tinte eingesetzt werden. So beschreiben beispielsweise Wong et al., EP-A-0260965, die Verwendung ei nes herkömmlichen Druckers, um einen Antikörper auf eine feste Matrix zu applizieren. In dem Verfahren wird eine Lösung, die den Antikörper enthält, durch eine kleine Bohrungsdüse, die vibriert, gezwungen, und zwar in einer Art und Weise, dass die Lösung in verschiedene diskrete Tropfen aufgeteilt wird. Die Tropfen werden nacheinander durch Passieren durch ein elektrisches Feld geladen und dann auf das Matrixmaterial abgelenkt.
Ein herkömmlicher Tintentropfendrucker enthält ein Reservoir, in welchem die Tinte unter Druck gehalten wird. Das Tintenreservoir befüllt eine Leitung, welche mit einer Düse verknüpft ist. Ein elektromechanischer Wandler wird eingesetzt, um die Düse bei einer gewissen geeigneten hohen Frequenz vibrieren zu lassen. Die tatsächliche Struktur der Düse kann eine Vielzahl von verschiedenen Konstruktionen haben, einschließend eine ausgezogene Glasröhre, welche durch einen externen Wandler zum Vibrieren gebracht wird, oder eine Metallröhre, welche von einem externen Wandler (z.B. einem piezoelektrischen Kristall) vibriert wird, oder ein magnetostriktives Metallrohr, welches magnetostriktiv vibriert wird. Die Tinte wird dementsprechend aus der Düse in einem Strahl ausgeschleudert, welcher kurz danach in individuelle Tropfen zerfällt. Eine Elektrode kann in der Nähe der Düse vorhanden sein, um eine Ladung auf die Tropfen zu übertragen. Konventionelle Tintentropfenspender werden in US-Patent Nrn. 3,281,860 und 4,121,222 beschrieben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Reaktionslösungen von einem Reservoir auf das Substrat durch eine elektrophoretische Pumpe zugeführt. In dieser Einheit verbindet eine dünne Kapillare ein Reservoir des Reaktanten mit der Düse des Spenders. An beiden Enden der Kapillare liegen Elektroden vor, um eine Potenzialdifferenz aufzubauen. Wie im Stand der Technik bekannt ist, ist die Geschwindigkeit, mit welcher eine chemische Spezies in einem Potenzialgradienten eines elektrophoretischen Mediums wandert, durch eine Vielzahl von physikalischen Eigenschaften bestimmt, unter diesen die Ladungsdichte, die Größe, die Form der Spezies, welche transportiert werden soll, wie auch die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Transportmediums selbst. Unter geeigneten Bedingungen des Potenzialgradienten der Kapillardimensionen und der Rheologie des Transportmediums, ein hydrodynamischer Fluss innerhalb der Kapillare eingestellt werden. Folglich wird in einer elektrophoretischen Pumpe in der vorliegenden Erfindung der Großteil der Flüssigkeit, die den gewünschten Reaktanten enthält, von einem Reservoir zu einem Substrat gepumpt. Durch Einstellen der geeigneten Position des Substrates mit Bezug auf die Düse der elektrophoretischen Pumpe wird die Reaktionslösung präzise an vordefinierte Reaktionsregionen angeliefert.
In einer speziell hilfreichen Anwendung wird die elektrophoretische Pumpe verwendet, um ein Array zu produzieren, das verschiedene Fraktionen von unbekannten Reaktionslösungen enthält. Beispielsweise kann ein Extrakt eines biologischen Materials, wie z.B. eines Blattes oder einer Zellkultur verschiedene unbekannte Materialien enthalten, einschließlich Rezeptoren, Liganden, Alkaloide, Nukleinsäuren und sogar biologische Zellen, von denen einige eine gewünschte Aktivität aufweisen. Wenn ein Reservoir eines solchen Extraktes elektrophoretisch gepumpt wird, werden die verschiedenen Spezies, welche darin enthalten sind, durch die Kapillare mit verschiedenen Geschwindigkeiten wandern. Selbstverständlich sollten die verschiedenen zu pumpenden Komponenten eine gewisse Ladung tragen, so dass sie getrennt werden können. Falls das Substrat im Hinblick auf den Spender bewegt wird, während die Extraktkomponenten elektrophoretisch getrennt werden, wird ein Array produziert, welches verschiedene unabhängige Spezies enthält. Dieses Array wird dann hinsichtlich seiner Aktivität in einem Bindungs-Assay oder in einem anderen geeigneten Test untersucht. Die Elemente des Arrays, welche vielversprechende Aktivität zeigen, werden mit einer Fraktion des Extraktes korreliert, welche anschließend aus anderer Quelle zum Zwecke weiterer Untersuchungen isoliert wird. In einigen Ausführungsformen werden die Komponenten in der Extraktlösung beispielsweise mit einem Fluoreszenzlabel markiert. In diesem Fall detektiert während des Verfahrens der Zufuhr der Lösung mit der elektrophoretischen Pumpe, ein Fluoreszenzdetektor, wann eine gelabelte Spezies auf dem Substrat abgeschieden wird. In einigen Ausführungsformen bindet die Markierung selektiv an bestimmte Typen von Verbindungen innerhalb des Extraktes und verleiht diesen Verbindungen eine Ladung.
Andere geeignete Zufuhrverfahren schließen osmotische Pumpen und Zell-(biologische)-Sortierer ein. Eine osmotische Pumpe liefert einen stetigen Fluss der Lösung über einen relativ langen Zeitraum. Die Konstruktion solcher Pumpen ist im Stand der Technik wohl bekannt, wobei allgemein eine Lösung des Extrakts von Interesse in einen für die Lösung permeablen Beutel eingebracht wird. Osmotischer Druck wird auf die Extraktlösung von den Lösungsmittelmolekülen ausgeübt, welche durch den Beutel diffundieren, um den Konzentrationsausgleich herzustellen. Der Extrakt wird auf diese Weise durch eine Düse in dem Beutel mit einer konstanten Geschwindigkeit gezwungen. Zellsortierer sind im Stand der Technik wohl bekannt und können in Anwendungen verwen det werden, wo es wünschenswert ist, einzelne biologische Zellen auf verschiedene Stellen auf dem Substrat aufzubringen.
Obwohl die oben genannten Ausführungsformen auf Systeme gerichtet sind, die flüssige Tropfen einsetzen, können kleinere Mengen von jeder Testsubstanz auch zu der Zelle in Form von Miniaturpellets geliefert werden. Solche Pellets können von der Verbindung von Interesse (beispielsweise Liganden, die Anwendungen in einem Affinitätsassay) ausgebildet werden und von einem oder mehreren Arten von inertem bindenden Material. Die Zusammensetzung solcher Bindemittel und Verfahren für die Herstellung der Pellets werden den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein. Solche "Minipellets" werden kompatibel mit einer großen Vielzahl von Testsubstanzen sein, über einen langen Zeitraum stabil sein, geeignet für die leichte Rückgewinnung vom Aufbewahrungsbehälter und dispergierbar (d.h. nicht klebrig, vorzugsweise in einer Flüssigkeit, wie einem physiologischen Puffer suspendierbar) sowie inert im Hinblick auf die Bindungsaktivität des Rezeptors sein.
Die Reaktantenlösungen werden in jeder vordefinierten Region vom Bewegen in benachbarte Regionen durch begrenzende Regionen gehindert. Beispielsweise wird zur Begrenzung von wässrigen Monomerlösungen ein hydrophiles Material verwendet, um die Reaktionsregionen zu coaten, während hydrophobes Material in bevorzugten Ausführungsformen verwendet wird, um die Region, welche die individuellen Reaktionsreaktionen umgibt, zu coaten. Selbstverständlich sind, wenn nicht-wässrige oder nicht-polare Lösungsmittel eingesetzt werden, verschiedene Oberflächencoatings im Allgemeinen bevorzugt. Durch Wahl der geeigneten Materialien (Substrate, hydrophobe Coatings und Reaktantenlösungsmitteln) wird der Kontaktwinkel zwischen dem Tropfen und dem Substrat in vorteilhafter Weise kontrolliert. Große Kontaktwinkel zwischen den Reaktantentropfen und dem Substrat sind gewünscht, da die Lösung dann eine relativ kleine Reaktionsregion benetzt; mit kleinen Kontaktwinkeln benetzt der Tropfen auf der anderen Seite eine größere Fläche. In extremen Fällen werden die Tropfen verteilt, so dass sie die ganze Oberfläche bedecken.
Der Kontaktwinkel wird durch den folgenden Ausdruck, welcher als Youngs Gleichung bekannt ist, bestimmt: cosθ = (σsg – σsl)/σlg wobei θ der Benetzungswinkel, σ_sg die Fest-zu-Gasförmig-Grenzflächenspannung, σ_sl die Fest-zu-Flüssig-Grenzflächenspannung und σ_lg die Flüssig-zu-Gasförmig-Grenzflächenspannung ist. Die Werte dieser Oberflächenspannungen werden durch thermodynamische Betrachtungen, einschließend die chemischen Komponenten und das flüssige bzw. feste Substrat bestimmt. Die Flüssig-zu-Gasförmig-Grenzflächenspannung für verschiedene Chemikalien kann einfach durch eine Vielzahl von Techniken gemessen werden, beispielsweise durch diejenigen, welche in Adamson, Physical Chemistry of Surfaces, John Wiley and Sons, 5th. Ed. (1990), beschrieben werden. Der Unterschied der Fest-zu-Flüssig- und der Fest-zu-Gasförmig-Spannung kann für ein bekanntes System empirisch aus einem Zisman-Plot bestimmt werden. In diesem Ansatz werden die Kontaktwinkel für eine homologe Serie von Flüssigkeiten auf einer gegebenen festen Oberfläche gemessen. Für einige Flüssigkeiten in der Serie wird ein "kritischer Kontaktwinkel" beobachtet, unterhalb welchem Flüssigkeiten von geringerer Oberflächenspannung die Oberflächen benetzen. Die Flüssig-zu-gasförmig-Oberflächenspannung der Flüssigkeit an diesem kritischen Kontaktwinkel wird als die Oberflächenspannung der festen Phase angenommen. Dieser Ansatz hat sich für Feststoffe von niedriger Energie, wie z.B. Teflon, Polyethylen, Kohlenwasserstoffe, etc., als recht vernünftige Resultate liefernd herausgestellt. Die Information, die aus solchen Untersuchungen erhalten wird, wird verwendet, um Substratzusammensetzungen zu optimieren und Benetzungswinkel für bekannte Lösungen von Reaktanten in dem Array zu vergrößern.
Verfahren zur Kontrolle chemischer Zusammensetzung und damit der lokalen freien Oberflächenenergie einer Substratoberfläche schließen eine Vielzahl von Techniken ein, die dem Fachmann offensichtlich sind. Chemische Gasphasenabscheidung und andere Techniken, welche in der Herstellung von integrierten Schaltkreisen angewandt werden, können eingesetzt werden, um hocheinheitliche Schichten auf ausgewählten Regionen einer Oberfläche abzuscheiden. Als ein spezielles Beispiel wurde die Benetzbarkeit eines Siliziumwafers auf der Mikrometerskala durch eine Kombination von Abscheidungen einer selbst-organisierenden Monoschicht und Feinstzerspanung (micro machining) Manipuliert. Siehe Abbott et al., "Manipulation of the Wettability of Surfaces on the .1 to 1 Micrometer Scale Through Micromachining and Molecular Self-Assembly", Science, 257 (4. Sept., 1992).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Umgebungen der individuellen Regionen auf einem hydrophilen Substrat, welches durch das selektive Entfernen hydrophober Schutzgruppen von der Substratoberfläche definiert ist, ausgebildet. Beispielsweise kann eine Monoschicht von hydrophoben fotoschützenden Gruppen beispielsweise an Linkermoleküle gekoppelt werden, die an die Substratoberfläche angebunden sind. Die Oberfläche wird dann selektiv (oder auf andere Weise, beispielsweise durch Säure aktiviert) durch eine Maske bestrahlt, um diejenigen Flächen zu exponieren, in welchen die Reaktionsregionen lokalisiert sind. Dies trennt die Schutzgruppen von der Substratoberfläche ab, und verursacht dabei, dass die Reaktionsregionen weniger hydrophob als die Umgebungsfläche sind. Dieses Verfahren erzeugt eine hohe Dichte von Reaktionsregionen auf der Substratoberfläche. Da hydrophobe Materialien niedrigere freie Oberflächenenergien (Oberflächenspannungen) als Wasser aufweisen, zieht sich der Lösungstropfen in der Zelle eher zusammen, als dass er sich verteilt.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das Substrat zunächst durch kovalentes Anbinden einer Monoschicht aus gewünschten funktionellen Gruppen (z.B. Amin, Hydroxyl, Carboxyl, Thiol, etc.), die durch eine hydrophile fotolabile Schutzgruppen geschützt ist, hergestellt. Falls das Substrat eine Glasoberfläche bereitstellt, kann die Monoschicht in einer Silanisierungsreaktion, wie unten gezeigt, abgeschieden werden.
In den oben abgebildeten Strukturen ist Y eine überbrückende Gruppe, wie z.B. eine Polymethylenkette, X ist eine reaktive geschützte Gruppe, wie z.B. NH, C(O)O, O, S, etc., und Pr ist eine hydrophobe fotolabile Schutzgruppe.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform, wie unten gezeigt, werden die Substratoberfläche zuerst beispielsweise durch eine Silanisierungsreaktion mit geeigneten Agenzien derivatisiert, um eine Aminschicht bereitzustellen. Ein Molekül, welches einen Spacer enthält, eine reaktive Gruppe und eine fotolabile Gruppe wird dann auf der Oberfläche angebunden.
Die fotolabile Schutzgruppe sollte hinreichend hydrophob sein, um die Substratoberfläche substanziell nicht benetzbar zu machen. Die Entfernung der Schutzgruppe in speziellen Flächen durch Exposition gegen Licht durch eine geeignete Maske setzt die reaktiven funktionellen Gruppen frei. Da diese Gruppen hydrophil ihrem Charakter nach sind, werden sie das Substrat in den exponierten Regionen benetzbar machen.
Die Klasse der Nitrobenzyl-Schutzgruppen, weiche durch eine Nitroveratryl-Gruppe beispielhaft dargestellt wird, vermittelt den Glasoberflächen, an welche ein Mitglied der Klasse angebunden wird, hinreichend Hydrophobizität. Die Hydrophobizität der Basisschutzgruppe aus Nitrobenzyl wird durch Anhängen von einer Gruppe aus einem kettenförmigen Kohlenwasserstoff-Substituenten verstärkt. Beispiele für hydrophobe Ketten schließen C₁₂H₂₅ (Lauryl)- oder C₁₈H₃₇ (Stearyl)-Substituenten ein. Die Synthese von geeignet aktivierten Formen (Bromid, Chloromethylether und Oxycarbonylchlorid) einer typischen Schutzgruppe ist schematisch in 14 dargestellt.
Die Abstandshaltergruppe ("Y") verleiht dem Netz die hydrophobe oder hydrophile Natur der Oberfläche. Beispielsweise tendieren diejenigen Spacer, die in erster Linie aus Kohlenwasserstoffketten bestehen, wie z.B. -(CH₂)_n-, dazu, die Benetzbarkeit herabzusetzen. Abstandshalter, welche Polyoxyethylen-(-(CH₂CH₂O)_n)- oder Polyamid-(-(CH₂CONH)_n--Ketten enthalten, tendieren dazu, die Oberfläche hydrophiler zu machen. Einen sogar noch größeren Effekt kann man erzielen, wenn Abstandshaltergruppen verwendet werden, die über die schützenden funktionellen Gruppen hinaus mehrere "maskierte" hydrophile Gruppen besitzen. Dies wird unten illustriert.
In bevorzugten Ausführungsformen stellen die hydrophilen Reaktionsregionen einen zweidimensionalen Kreis und eine andere Form dar, die ein Seitenverhältnis in der Nähe von 1 aufweisen (d.h. die Länge ist substanziell größer oder kleiner als die Breite). Jedoch in anderen Ausführungsformen kann die hydrophile Region die Form eines langen Kanals einnehmen, welcher verwendet wird, um die fließenden Reaktanten in Art und Weise wie oben beschrieben zu leiten.
In noch anderen Ausführungsformen sind die Reaktionsregionen dreidimensionale Flächen, welche beispielsweise durch Dichtungsringe oder Vertiefungen definiert werden. Die Vertiefungen oder Dichtungsringe können auch als Identifikationsmarkierungen zum Dirigieren des Spenders in Richtung der Region von Interesse fungieren.
Falls das Lösungsmittel (oder eine andere Flüssigkeit, welche zum Anliefern des Reaktanten verwendet wird) einen hinreichend hohen Dampfdruck aufweist, kann das Verdampfen verursachen, dass die Reaktantenkonzentration vergrößert wird. Wenn das nicht kontrolliert wird, verursacht dieser Prozess letztendlich das Ausfallen des gelösten Stoffes aus der Lösung. Die Effekte des Verdampfens können durch Versiegeln ausgewählter Regionen des Substrates eliminiert werden, wenn sie nicht zugänglich sein müssen. Alternativ kann der Partial-Druck der volatilen Reagenzien eingestellt werden, so dass die flüssige und die Gasphase in ihrer Fugazität angeglichen werden und die thermodynamische Kraft, welche die Verdampfung treibt, reduziert wird. Der Partialdruck der Reagenzien kann durch die Bereitstellung eines relativ großen Reservoirs an volatilen Reagenzien in einer versiegelten Kammer vergrößert werden. Beispielsweise können Lösungsmittel, die einen niedrigen Dampfdruck unter den gewünschten Bedingungen aufweisen, verwendet werden. In einigen Fällen kann die Verdampfung weiter kontrolliert werden durch die Anwendung eines Films oder einer Abdeckplatte, die ein reverses Arraymuster aufweist. Andere Verfahren zum Verhindern des Verdampfens sind im Fachbereich der physikalischen Chemie wohl bekannt und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird Verdampfen in vorteilhafter Weise eingesetzt, um die Hybridisierung von Targetoligonukleotiden mit immobilisierten Nukleotiden in den Reaktionsregionen zu beschleunigen. In einer speziellen Ausführungsform werden fluoreszenzmarkierte oder in anderer Form gelabelte Targetoligonukleotide in Lösung (beispielsweise eine Lösung, welche ein Salz, wie z.B. Ammoniumacetat oder Magnesiumchlorid enthält) an die Reaktionsregionen angeliefert, die immobilisierte Sondenoligonukleotide enthalten. Da die volatile Salzlösung aus dem Reaktanten-Tropfen verdampft (in der gleichen Art und Weise wie das Lösungsmittel aus einem Tintentropfen abgeschieden bei einem Tintenstrahldrucker verdampft), resultiert ein lokal hohes Konzentrationsverhältnis von Target- zu Sondenoligonukleotid, was die Hybridisierung beschleunigt. Falls die Hybridisierung bei Raumtemperatur durchgeführt wird, sind typischerweise 10 Minuten bis wenige Stunden notwendig, um die Reaktion zu vervollständigen. Nach hinreichender Zeit wird die unhybridisierte DNA gewaschen oder in anderer Form vom Substrat entfernt. Schließlich wird das Substrat abgebildet, um die Regionen zu detektieren, in welchen die Sonde und die Target-DNA hybridisiert haben. Selbstverständlich kann das Verdampfen in vorteilhafter Weise eingesetzt werden, um die lokale Konzentration von Nicht-DNA-Lösungen in einer Vielzahl von Reaktionen, abgesehen von Hybridisierung, zu vergrößern. Beispielsweise sind in einigen Ausführungsformen Rezeptorlösungen hinreichend volatil, so dass die lokale Rezeptorkonzentration in den Reaktionsregionen, welche beispielsweise zu screenende Peptide enthält, ansteigt.
Die Arrays, welche gemäß den oben genannten platzierenden Ausführungsformen hergestellt werden, werden allgemein stark in der gleichen Art und Weise verwendet, wie diejenigen Arrays, welche von den Fließkanal-Ausführungsformen oben beschrieben, hergestellt werden. Beispielsweise können die Arrays beim Screening in Fluorescin- ge labelten Rezeptoren, wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092 beschrieben, verwendet werden.
VI. Illustration von Techniken
A. Lecktest
Ein erstes Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung einer Fließkanaleinheit, um sicherzustellen, dass Lösungen an ausgewählte Stellen eines Substrates angeliefert werden könnten und davon abgehalten werden können, mit anderen Flächen in Kontakt zu treten. Darüber hinaus wurde das Experiment verwendet, um zu demonstrieren, dass Reagenzien in einer einheitlichen Weise angeliefert werden können.
Dementsprechend wurde ein flaches Stück von konventionellem Glas, welches Abmessungen von ungefähr 42 mm × 42 mm aufwies, mit Aminopropyltriethoxysilan derivatisiert. Die gesamte Oberfläche wurde von Schutz-Gruppen befreit und mit herkömmlichen Techniken gewaschen. Ein Fluorescinmarker aus FITC wurde dann in die Fließkanäle injiziert, welche ausgebildet wurden, wenn ein Block von KeIF^® 81 mit 10 Kanälen von 1 mm Tiefe und 1 mm Breite in Kontakt mit dem Substrat gebracht wurde. Der Fluorescinmarker lag in einer Lösung von DMF vor und wurde durch die Kanäle durch Injizieren des Materials in die Rillen mit einer manuellen Pipette geleitet.
Fluorescinfarbstoff wurde in ähnlicher Weise in jeden anderen Kanal in dem Block injiziert, der Block wurde rotiert und das Verfahren wurde wiederholt. Der erwartete resultierende Klotz an Fluoreszenzintensität gegen Lokalisierung ist schematisch in 17 dargestellt. Dunkle Regionen sind an den Überschneidungen von vertikalen und horizontalen Streifen gezeigt, während hellere graue Regionen an nicht-überschneidenden Regionen des Streifens sich zeigen. Die dunklen grauen Regionen zeigen erwartete Regionen von hoher Farbstoffkonzentrationen an, wohingegen die hellen Regionen Regionen von erwarteter niedriger Farbstoffkonzentration anzeigen.
Eine Kartierung der Fluoreszenzintensität eines Teiles eines aktuellen Objektträgers mit Intensitätsdaten, erhalten gemäß dem Verfahren von PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092, wurde erstellt. Die Resultate stimmen sehr gut mit den erwarteten Ergebnissen überein, zeigen hohe Fluoreszenzintensität an den Überschneidungen der Kanäle (etwa 50% höher als in den nicht-überschneidenden Regionen der Streifen) und niedrige Fluoreszenzintensitäten an anderen Regionen der Kanäle. Regionen, welche nicht dem Fluoreszenzfarbstoff ausgesetzt worden waren, zeigen geringe Aktivität, was auf ein gutes Signal-zu-Untergrund-Verhältnis hindeutet. Schnittstellen weisen eine Fluoreszenzintensität von etwa 9 × so hoch wie der Hintergrund auf. Regionen innerhalb der Kanäle zeigen auch geringe Variationen in der Fluoreszenzintensität, was darauf hindeutet, dass Regionen gleichförmig innerhalb der Kanäle behandelt wurden.
B. Ausbildung von YGGFL
Das System wurde verwendet, um vier verschiedene Peptide zu synthetisieren: YGGFL (SEQ. ID NR: 1), YpGFL (SEQ. ID NR: 2), pGGFL (SEQ. ID NR: 3) und ppGFL (die Abkürzungen sind in Stryer, Biochemistry, Third Ed. (1988) enthalten; die Kleinbuchstaben deuten auf D-optische Isomere hin und die Großbuchstaben auf L-optische Isomere). Ein vollständiges Glassubstrat wurde mit TBOC-geschütztem Aminopropyltriethoxysilan derivatisiert, die Schutzgruppen wurden mit TFA entfernt, das Substrat mit FMOC-geschützter Capronsäure (einem Linker) gewatet, mit Piperidin von der Schutzgruppe befreit, und mit FMOC-geschütztem Glycin-Phenylalanin-Leucin (GFL) gewatet.
Diese FMOC-GFL-gewatete Oberfläche wurde mit dem Kanalblock versiegelt und alle 10 Rillen wurden mit Piperidin in DMF von den Schutzgruppen befreit. Nach dem Waschen der Rillen wurde FMOC-Glycin (G) in die ungeradzahligen Rillen injiziert und FMOC-d-Prolin (p) wurde in die geradzahligen Rillen injiziert. Nach einer Dauer von zwei Stunden Kopplungszeit unter Verwendung von Standardkopplungschemie wurden alle Rillen mit DMF gewaschen. Die Rillen wurden in Vakuum getrocknet, der Block entfernt und um 90° gedreht. Nach erneutem Versiegeln wurden alle Rillen mit Piperidin in DMF von den Schutzgruppen befreit und gewaschen. FMOC-Tyrosin (Y) wurde in die ungeradzahligen Rillen injiziert und FMOC-p in die geradzahligen Rillen. Nach dem Koppeln wurden die Gruppen gewaschen und im Vakuum getrocknet. Dementsprechend wurden 25 Regionen jeweils der Verbindungen YGGFL, YpGFL, pGGFL und ppGFL auf dem Substrat synthetisiert. Das Substrat wurde entfernt und mit FITC-gelabelten Antikörpern angefärbt (Herz-Antikörper 3E7).
Die resultierende Oberfläche zeigte helle Regionen von hoher Fluoreszenz. Weiße Quadrate lagen an den Stellen von YGGFL. Die dunkelsten Regionen sind pGGFL und ppGFL. Die YGGFL-Stellen waren die am meisten intensiven, gefolgt von den YpGFL-Stellen. Die pGGFL- und ppGFL-Intensitäten waren annähernd auf dem Niveau des Hintergrundes, was konsistent mit den erwarteten Resultaten für die Herz-Antikörper war.
Die quantitative Analyse der Ergebnisse zeigte GesamtiIntensitäts-Verhältnisse für YGGFL:YpGFL:pGGFL:ppGFL von 1,7:1,5:1,1:1,0. Da allerdings eine große Standardabweichung auf dem YGGFL und YpGFL auftritt, kann das Vergleichen aller dieser Stellen miteinander nicht akkurat die aktuellen Kontraste repräsentieren. Der Vergleich der Intensitäten der Stellen innerhalb des gleichen "Streifen" führt zu größeren Kontrasten, obwohl sie in der Größenordnung von 2:1 bleiben.
C. 100-Mikrometer-Kanalblock
Ein Gittermuster von Fluorescin-Isothiocyanat, gekoppelt an ein Substrat, wurde unter Verwendung einer Fließzelle der Erfindung hergestellt. Ein 2 × 3 Inch großes NVOC-derivatisiertes Substrat wurde fotolysiert durch eine Maske, um 400 μm große aktivierte Bänder entlang einer Achse herzustellen. Ein geätzter Siliziumkanalblock mit 64 parallelen 100 Mikrometer großen Kanälen getrennt durch 100 Mikrometer große Wände wurde dann auf das Substrat auf der anderen Achse geklemmt (d.h. senkrecht zu der Achse der 400 Mikrometer großen aktivierten Bänder). Die Klemmvorrichtung, bestehend aus einer Aluminium-Oberseite und Klemm-Bodenplatten, wurde verwendet. Druck wurde durch Zusammendrücken der beiden Bolzen mit einem Schraubstock auf 2760 kPa (400 psi) aufgebaut. Eine 7 mM Fluorescin-Isothiocyanatlösung wurde durch die Kanäle durch das Pipettieren direkt auf die exponierten Kanalenden zum Fließen gebracht.
Ein Bild des Substrates zeigt Regionen von hoher Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass Fluorescin an das Substrat gebunden hatte. Weiße Flächen, welche darauf hindeuten, dass Fluorescin bindet, waren als 400 Mikrometer breite horizontale Streifen auf den fotolysierten Regionen innerhalb der 100 Mikrometer vertikalen Fließpfade vorhanden. Kontrast-Verhältnisse von 8:1 wurden zwischen den Kanälen und den Kanalzwischenräumen beobachtet. Dies demonstriert die annähernd vollständige physikalische Isolation der Flüssigkeit, welche durch die 100 Mikrometer-Kanäle unter 2760 kPa (400 psi) Klemmdruck passiert wird.
D. Kanalmatrix-Hybridisierungsassay
Eine mittlere Region eines 2 × 3 Inch großen Objektträgers wurde mit bis (2-Hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilan derivatisiert. Sechs Nukleotide wurden dann auf die gesamte Reaktionsregion unter Verwendung eines Syntheseverfahrens, bestehend aus Deprotonierung, Koppeln und Oxidationsschritten für jedes applizierte Monomer gekoppelt. Diese ersten sechs Nukleotide wurden in einer Reaktionsregion angebunden, welche durch ein 21,3 mm (0,84 Inch) Durchmesser großes kreisförmiges Well definiert war, in einem Aluminiumtemplat, welches an dem 50,8 × 76,2 mm (2 × 3 Inch)-Träger geklemmt war.
Das siebte und achte Monomer wurden auf das Substrat per Fließen der Monomerlösungen durch 100 Mikrometer große Kanäle in einem geätzten Siliziumkanalblock (eingesetzt in Beispiel C oben) aufgebracht. Die siebte Base wurde entlang der Längsachse (vertikal) des 50,8 × 76,2 mm (2 Inch × 3 Inch)-Trägers gekoppelt und die achte Base senkrecht zu der siebten, entlang der kurzen Achse (horizontal) zum Träger. Dies definierte eine aktive Matrixregion von 1,28 × 1,28 cm mit einer Dichte von 2 500 Reaktionsregionen pro cm².
Der Kanalblock wurde zentral oberhalb der Reaktionsregion aufgebracht und auf das Substrat unter Verwendung einer Klemmvorrichtung, bestehend aus bearbeitetem Aluminiumplatten geklemmt. Dies passt das 50,8 × 76,2 mm (2 Inch × 3 Inch)-Substrat relativ, bezogen auf den Kanalblock in der gewünschten Orientierung an. Rotation der oberen Klemmplatte und des Kanalblocks relativ zur unteren Klemmplatte und dem Substrat zwischen dem siebten und dem achten Kopplungsschritt stellten die Matrix von sich schneidenden Reihen und Spalten zur Verfügung.
In der oberen Klemmplatte wurden Flüssigkeitszufuhrwells mit Laser-gebohrten Löchern verbunden, welche in einzelne Kanäle von der rückwärtigen Oberfläche des Kanalblocks eintreten. Diese Zufuhrwells wurden benutzt, um Kopplungsreagenzien in Kanäle zu pipettieren, während der Kanalblock auf das Substrat geklemmt war. Korrespondierende Flüssigkeits-rückgewinnende Wells wurden mit Vakuum an der am Ende des Flusses gelegenen Stelle des Kanalblocks verbunden, was die Flüssigkeit durch den Kanalblock zog und aus diesem heraus in einen Abfallbehälter. Folglich wurde ein kontinuierlicher Flüssigkeitsfluss über das Substrat in die Kanalregion während der Kopplungsschritte erreicht.
Das komplette Oktamer, welches an den Kanalschnittstellen synthetisiert wurde, ausgebildet durch den siebten und achten Kopplungsschritt, wies folgende Sequenz auf:
Substrat--(3') CGCAGCCG(5') (SEQ. ID NR: 4)
Nach Vervollständigen des Syntheseprozesses wurde das Abschneiden der exozyklischen Amine durch Immersion der Reaktionsregionen in konzentriertem Ammoniumhydroxid durchgeführt. Die Reaktionsregion wurde dann bei 15°C für eine Stunde in einer 10 nM-Lösung der komplementären Basissequenz 5' GCGTCGGC-F (SEQ. ID NR: 5) inkubiert, wobei "F" ein Fluorescinmolekül ist, das an das 3'-Ende des Oligonucleotids gekoppelt ist. Die Targetketten-Lösung wurde dann aus der Reaktionsregion gespült und mit Neat 6 × SSPE-Puffer, auch bei 15°C, ersetzt. Letztendlich wurde die Reaktonsregion dann unter Verwendung des Laserfluoreszenz-Detektionssystems während der Immersion in dem Puffer gescannt.
Die hellsten Regionen in dem resultierenden Bild korrespondieren mit den Kanalüberschneidungen, wo ein komplettes Oktamer auf der Substratoberfläche synthetisiert wurde. Vertikale Säulen auf dem Bild zeigten die Kanalregionen an, wo die siebte Base angebunden wurde, wohingegen horizontale Reihen die Kanalregionen anzeigen, wo die achte Base angekoppelt wurde. Helligkeit in den Kanalüberschneidungsregionen zeigte die Hybridisierung zwischen der fluoreszierenden Targetkette und der komplementären Kette, synthetisiert und gebunden an das Substrat in diesen Regionen an. Die vertikalen Streifen des Bildes zeigten eine konsistente Helligkeit mit Regionen von signifikant größerer Helligkeit an den Querschnittsregionen. Die horizontalen Streifen enthielten die konsistente Helligkeit der vertikalen Streifen nicht, wiesen aber Regionen von Helligkeit an den Querschnitten mit den vertikalen Streifen auf. Die konsistente Helligkeit entlang der Achse des siebten Monomers (vertikal) deutete auf teilweise Hybridisierung der Targetkette in Flächen hin, wo sieben der acht komplementären Basen an der Substratoberfläche angebunden waren. Die nicht-auftretende Helligkeit entlang der Achse des achten Monomers (horizontal) ist konsistent mit der Erwartung, dass eine Kette von sechs stimmenden Basen gebunden an die Substratoberfläche nicht effekiv an ein Oktamer in Lösung hybridisieren wird (Heptamere mit sechs stimmenden Basen, gefolgt von einem Mismatch an der Position sieben). Der dunklere Hintergrund besteht aus Hexameren, welche aus sechs Monomeren gebunden an die gesamte Reaktionsregion bestehen.
VII. Zusammenfassung
Die Beschreibung oben ist illustrativ und nicht beschränkend. Viele Variationen der Erfindung werden für den Fachmann nach Studium der Offenbarung offensichtlich. Lediglich kann mit Hilfe von Beispielen eine Vielzahl von Substraten, Rezeptoren, Liganden und anderen Materialien ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung verwendet werden.

Claims

Verwendung von begrenzenden Mitteln auf einem einzelnen Substrat zur physikalischen Definition von Regionen des Substrates, welche verfügbar sind, um mit einer Eduktlösung zu reagieren, und zum Begrenzen besagter Eduktlösung auf diese Regionen, in der Herstellung eines Polymerarrays, durch sukzessives Spotting von Monomeren oder durch Zufuhr von Polymeren an diese Regionen, wobei besagtes Array besagtes Substrat umfasst und 100 oder mehr Gruppen von Polymeren mit verschiedenen, bekannten Sequenzen, gekoppelt auf die Oberfläche davon in separaten, bekannten Stellen, wobei die Dichte von besagten Gruppen zumindest 1000/cm² ist, und wobei das begrenzende Mittel Inseln (Spots) umfasst, getrennt voneinander durch inerte, nicht benetzende Regionen auf dem Substrat.
Ein System zum Durchführen einer Vielzahl von Reaktionen auf einem einzelnen Substrat, wobei das System folgendes umfasst: zumindest 100 Reaktionsregionen auf einem einzelnen Substrat, wobei jede Reaktionsregion in der Lage ist, eine separate und unterschiedliche Reaktion Durchzuführen, und die Dichte der Reaktionsregionen zumindest 1000/cm² ist, Mittel zum Anliefern durch sukzessives Spotting von Monomeren oder durch Anliefern von Polymeren an diese Regionen von einer oder mehreren Reaktionslösungen zu einer oder mehreren der Reaktionsregionen; und Mittel zum Begrenzen von zumindest einigen der Reaktionslösungen vor dem Kontaktieren von zumindest einigen der Reaktionsregionen, wobei das besagte Mittel Inseln (Spotts) umfasst, getrennt voneinander durch inerte nicht benetzende Regionen auf dem Substrat.
Das System, wie in Anspruch 2 zitiert, wobei das Mittel zum Begrenzen von zumindest einigen der Edukte des weiteren eine hydrophobe Schicht auf der Oberfläche des Substrates umfasst.