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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase,
auf Nukleinsäuren,
die eine Kinase kodieren, und Vektoren umfassend diese Nukleinsäuren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Das
hematopoietische System von Säugetieren
umfasst rote und weiße
Blutkörperchen.
Diese Zellen sind die gereiften Zellen, die aus primitiveren, durch
ihre Abstammung beschränkten
Zellen entstammen. Die Zellen des hematopoietischen Systems wurden
von Dexter und Spooncer in der Zeitschrift Annual Review of Cell
Biology 3, 423–441
(1987) beschrieben.
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Die
roten Blutkörperchen
oder Erythrozyten entstammen primitiveren Zellen, die in bezug auf
Dexter und Spooncer als „Erythroid
burst-forming units" (BFU-E)
bezeichnet werden. Die unmittelbaren Nachkommen der Erythroid burst-forming
units werden als „Erythroid
colonyforming units" (CFU-E)
bezeichnet.
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Die
weißen
Blutkörperchen
enthalten die reifen Zellen des lymphoiden und myeloiden Systems.
Die lymphoiden Zellen schließen
B- und T-Lymphozyten mit ein. Die B- und T-Lymphozyten resultieren von früheren Vorläuferzellen,
die gemäß Dexter
und Spooncer als PreT- und preB-Zellen bezeichnet werden.
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Das
myeloide System umfasst eine Anzahl von Zellen einschließlich Granulozyten,
Blutplättchen,
Monozyten, Macrophagen und Megakaryozyten. Die Granulozyten können weiter
in neutrophile Zellen, eosinophile Zellen, basophile Zellen und
Mastzellen eingeteilt werden.
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Jede
der reifen hematopoietischen Zellen ist auf eine bestimmte Funktion
spezialisiert. Beispielsweise sind Erythrozyten für den Sauerstoff
und Kohlendioxidtransport zuständig.
T- und B-Lymphozyten
sind für
Zell- bzw. Antikörper-vermittelte
Immunantworten verantwortlich. Blutplättchen sind in die Blutgerinnung
involviert. Granulozyten und Macrophagen agieren grundsätzlich als
Fänger
und Hilfszellen in der Immunantwort gegen invasierende Organismen
und ihre Nebenprodukte.
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Im
Zentrum des hematopoietischen Systems liegen eine oder mehrere totipotente
hematopoietische Stammzellen, die eine Serie von Differenzierungsschritten
durchlaufen, was zu Vorläuferzellen
führt,
die durch ihre Abstammung immer weiter eingeschränkt sind. Die reiferen Vorläuferzellen
sind darauf beschränkt,
eine oder zwei Abstammungslinien zu bilden. Einige Beispiele von
abstammungsbeschränkten
Vorläuferzellen
werden durch Dexter und Spooncer erwähnt und schließen Granulozyten/Macrophagen
Kolonie-bildende Zellen (GM-CFC),
Megakaryozyten Kolonie-bildende Zellen (Meg-CFC), eosinophile Kolonie-bildende
Zellen (Eos-CFC) und basophile Kolonie-bildende Zellen (Bas-CFC)
mit ein. Andere Beispiele von Vorläuferzellen werden oben diskutiert.
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Das
hematopoietische System funktioniert mit Hilfe einer genau kontrollierten
Produktion der verschiedenen reifen Zelllinien. Die totipotenten
Stammzellen besitzen die Fähigkeit
sich einerseits zu erneuern und andererseits sich in festgelegte
Vorläuferzellen
für alle
hematopoietischen Zelllinien zu differenzieren. Diese primitivsten
der hematopoietischen Zellen sind sowohl notwendig wie auch ausreichend
für die
vollständige und
permanente hematopoietische Wiederherstellung eines durch Strahlung
geschwächten
hematopoietischen Systems in Säugetieren.
Die Fähigkeit
von Stammzellen, das gesamte hematopoietische System wieder aufzubauen,
ist die Basis der Therapie durch Knochenmarktransplantation.
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Es
ist bekannt, dass Wachstumsfaktoren eine wichtige Rolle in der Entwicklung
und Wirkungsweise des hematopoietischen Systems von Säugetieren
spielen. Die Rolle von Wachstumsfaktoren ist komplex, und gleichwohl
zum jetzigen Zeitpunkt nicht gut verstanden. Ein Grund für diese
Unsicherheit ist, dass vieles was über hematopoietische Wachstumsfaktoren
bekannt ist, aus in vitro Experimenten hervorgeht. Solche Experimente
reflektieren nicht notwendigerweise die Realität in vivo.
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Zusätzlich kann
in vitro, unter der Voraussetzung, dass Knochenmarkszellen dem Medium
zugesetzt werden, die Blutbildung in der Abwesenheit von zugefügten Wachstumsfaktoren
etabliert werden. Die Beziehung zwischen stromalen und hematopoietischen
Wachstums faktoren in vivo ist nicht verstanden. Nichts desto trotz
zeigen hematopoietische Wachstumsfaktoren in vivo eine hohe Aktivität.
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Von
dem was über
sie bekannt ist, scheinen hematopoietische Wachstumsfaktoren eine
Vielzahl von Aktivitäten
aufzuweisen. An einem Ende des Spektrums stehen Wachstumsfaktoren
wie Erythropoietin, von dem angenommen wird, dass es ausschließlich die
Proliferation von reifen erythroiden Vorläuferzellen fördert. In
der Mitte des Spektrums sind Wachstumsfaktoren, wie IL-3, von denen
angenommen wird, dass sie das Wachstum und die Entwicklung von frühen Stammzellen
sowie eine Anzahl von Vorläuferzellen
erleichtern. Einige Beispiele von Vorläuferzellen, die durch IL-3
induziert werden, schließen
solche mit ein, die auf Granulozyten/Macrophagen, eosinophile Zelllinien,
Megakaryozyten, erythroide Zellinien und Mastzelllinien beschränkt sind.
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An
dem anderen Ende des Spektrums befindet sich der hematopoietische
Wachstumsfaktor, der zusammen mit dem korrespondieren Rezeptor,
in einer Serie von Artikeln der Zeitschrift Cell der Ausgabe vom 5.
Oktober 1990 diskutiert wurde. Der Rezeptor ist das Produkt des
W Locus, c-kit, das ein Mitglied der Klasse von Rezeptor Protein
Tyrosin Kinasen ist. Von dem Liganden für c-kit, auf den mit verschiedenen
Namen, wie z. B. Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF) und Mastzellwachstumsfaktor
(mast cell growth factor, MGF) Bezug genommen wird, nimmt man an,
dass er für
die Entwicklung von frühen
hematopoietischen Stammzellen essentiell ist sowie für Zellen
wichtig ist, die auf erythroide Zellinien und Mastzelllinien in
Mäusen
beschränkt sind;
siehe z. B. Copeland et al., Cell 63, 175–183 (1990).
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Es
erscheint daher, dass es Wachstumsfaktoren gibt, die ausschließlich reife
Zellen beeinflussen. Es scheint ebenfalls Wachstumsfaktoren zu geben,
die beiderseits reife Zellen und Stammzellen beeinflussen. Die Wachstumsfaktoren,
die beide Zelltypen beeinflussen, können möglicherweise eine kleine Anzahl
oder eine große
Anzahl an reifen Zellen beeinflussen.
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Weiterhin
scheint es eine inverse Beziehung zu geben zwischen der Fähigkeit
eines Wachstumsfaktors, reife Zellen zu beeinflussen, und der Fähigkeit
des Wachstumsfaktors, Stammzellen zu beeinflussen. Beispielsweise
wird angenommen, dass der c-kit Ligand, der eine kleine Anzahl an
reifen Zellen beeinflusst, wichtiger in der Erneuerung und Entwicklung
von Stammzellen ist als IL-3, von dem berichtet wird, dass er die
Proliferation von vielen reifen Zellen stimuliert (siehe oben).
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Vor
der vorliegenden Beschreibung gab es keine Berichte über Wachstumsfaktoren,
die ausschließlich Stammzellen
ohne einen Effekt auf reife Zellen beeinflussen. Die Entdeckung
von solchen Wachstumsfaktoren wäre
von besonderer Signifikanz.
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Wie
oben erwähnt,
ist c-kit eine Protein Tyrosin Kinase (pTK). Es wird immer offensichtlicher,
dass Protein Tyrosin Kinasen eine wichtige Rolle als zelluläre Rezeptoren
für hematopoietische
Wachstumsfaktoren spielen. Andere Rezeptor pTKs schließen die
Rezeptoren des Kolonie stimulierenden Faktors 1 (colony stimulating
factor 1,CSF-1) und PDGF mit ein.
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Die
pTK-Familie kann durch die Anwesenheit verschiedener konservierter
Aminosäureregionen
in der katalytischen Domäne
erkannt werden. Diese konservierten Regionen werden durch Hanks
et al. in Science 241, 42–52
(1988) zusammengefasst, siehe 1 beginnend
auf Seite 46, und durch Wilks in Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607 (1989),
siehe 2 auf Seite 1605.
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Weitere
Protein Tyrosin Kinasen, die Rezeptoren hematopoietischer Wachstumsfaktoren
darstellen werden benötigt,
um die Selbsterneuerung der totipotenten hematopoietischen Stammzellen
in einer effektiveren Weise zu stimulieren und die Entwicklung aller
Zellen des hematopoietischen Systems beiderseits in vitro und in
vivo zu stimulieren. Neue Rezeptoren hematopoietischer Wachstumsfaktoren,
die nur auf primitiven Stammzellen vorhanden sind, jedoch nicht
auf reifen Vorläuferzellen
vorkommen, werden Insbesondere benötigt. Liganden für die neuen
Rezeptoren sind auch wünschenswert,
die als hematopoietischer Wachstumsfaktoren fungieren. Nukleinsäuresequenzen,
die die Liganden kodieren, werden benötigt, um rekombinante Rezeptoren
und Liganden herzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Diese
und andere Ziele, die einem Fachmann offensichtlich sind, werden
durch die Bereitstellung von isolierten Säugetier-Nukleinsäuremolekülen, welche
Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodieren, exprimiert in primitiven hematopoietischen
Zellen und nicht exprimiert in reifen hematopoietischen Zellen,
erreicht. Auch eingeschlossen sind die Rezeptoren, kodiert durch
solche Nukleinsäuremoleküle; die
Nukleinsäuremoleküle, welche solche
Rezeptor Protein Kinasen kodieren, welche die in 2 (flk-1)
gezeigten Sequenz aufweisen; und Rezeptor-Tyrosin-Kinasen mit den Aminosäure-Sequenzen,
gezeigt in 2 (flk-1).
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1a.1–1a.3 zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen muriner flk-2.
Die Aminosäurereste
erscheinen direkt unter den Nukleotiden im offenen Leseraster. Die
Aminosäuren
1–27 bilden
die hydrophobe Leitsequenz. Die Aminosäuren 28–544 bilden die extrazelluläre Rezeptordomäne. Die
Aminosäuren
545–564 bilden
die Transmembranregion. Die verbleibenden Aminosäuren bilden die intrazelluläre katalytische
Domäne.
Die in der intrazellulären
Domäne
folgenden Aminosäurereste
sind katalytische Sub-Domänen,
die durch Hanks (siehe oben) identifiziert wurden: 545–564, 618–623, 811–819, 832–834, 857–862, 872–878. Die
Sequenz bei den Resten 709–785
ist eine kennzeichnende Sequenz, die charakteristisch für flk-2
ist. Die Protein Tyrosin Kinasen haben grundsätzlich eine kennzeichnende
Sequenz in dieser Region.
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1b zeigt
die cDNA und Aminosäuresequenzen
eines Teils der humanen flk-2 aus der extrazellulären Domäne. Die
Aminosäuren
1–110
der humanen flk-2
korrespondieren zu den Aminosäuren
42–152
von muriner flk-2.
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1c zeigt
die cDNA und Aminosäuresequenzen
eines Teils humaner flk-2 aus der intrazellulären (Kinase) Domäne. Die
Aminosäuren
1–94 der
humanen flk-2 korrespondieren zu den Aminosäuren 751–849 von muriner flk-2.
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2–2.3 zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen von flk-1. Die
Aminosäurereste
763–784 bilden
die Transmembranregion von flk-1.
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3 zeigt
die zeitliche Antwort der Bindung zwischen einer murinen stromalen
Zelllinie (2018) und APtag-flk-2 wie auch APtag-flk-1. APtag ohne
Rezeptor (SEAP) wird als Kontrolle verwendet. Siehe Beispiel 8.
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4 zeigt
die Dosis-Antwort auf die Bindung zwischen stromalen Zellen (2018)
und APtag-flk-2 sowie APtag-flk-1. APtag ohne Rezeptor (SEAP) wird
als Kontrolle verwendet. Siehe Beispiel 8.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Rezeptoren
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Die
Erfindung betrifft in einer Ausführungsform
ein isoliertes Säugetier-Nukleinsäuremolekül aus Säugetieren,
das eine Rezeptor Protein Tyrosin Kinase kodiert, die in primitiven
hematopoietischen Zellen aus Säugetieren
exprimiert wird und nicht in reifen hematopoietischen Zellen exprimiert
wird.
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Das
Nukleinsäuremolekül kann ein
DNA-, cDNA- oder RNA-Molekül
sein. Das Säugetier,
in dem das Nukleinsäuremolekül existiert,
kann jedes Säugetier
sein, wie z. B. eine Maus, Ratte, Kaninchen oder Mensch.
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Das
Nukleinsäuremolekül kodiert
eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase (pTK). Mitglieder der pTK-Familie können an
den konservierten Aminosäure-Regionen
in der katalytischen Domäne
erkannt werden. Beispiele von pTK-Konsensus-Sequenzen wurden von
Hanks et al. in Science 241, 42–52
(1988) bereitgestellt; siehe beispielsweise 1 beginnend
auf Seite 46, und durch Wilks in Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607 (1989);
siehe insbesondere 2 auf Seite 1605. Ein Methioninrest
an Position 205 in der konservierten Sequenz WMAPES ist charakteristisch
für pTKs,
die Rezeptoren sind.
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Der
Artikel von Hanks et al. identifiziert elf katalytische Sub-Domänen, die
pTK-Konsensus-Reste
und -Sequenzen beinhalten. Die pTKs der vorliegenden Erfindung werden
die meisten oder alle dieser Konsensus-Reste und -Sequenzen aufweisen.
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Einige
besonders stark konservierte Reste und Sequenzen werden in Tabelle
1 gezeigt. TABELLE
1
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Eine
pTK der Erfindung kann alle dreizehn dieser hochkonservierten Reste
und Sequenzen beinhalten. Als ein Ergebnis natürlicher oder synthetischer
Mutationen können
pTKs der Erfindung weniger als alle dreizehn hochkonservierten Reste
und Sequenzen beinhalten, sowie z. B. 11, 9 oder 7 solcher Sequenzen, solange
die Bedingungen von Anspruch 1 erfüllt sind.
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Die
Rezeptoren der Erfindung gehören
grundsätzlich
zur gleichen Klasse der pTK-Sequenzen,
zu denen c-kit gehört.
Es wurde jedoch überraschend
festgestellt, eine neue funktionelle Klasse von Rezeptor pTKs exisitert.
Die neue funktionelle Klasse von Rezeptor pTKs wird in primitiven
hematopoietischen Zellen exprimiert, jedoch nicht in reifen hematopoietischen
Zellen.
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Zum
Zweck dieser Patentanmeldung ist eine primitive hematopoietische
Zelle totipotent, d. h. fähig, alle
hematopoietischen Blutzellen in vivo wieder zu bilden. Eine reife
hematopoietische Zelle ist nicht selbsterneuernd und besitzt begrenzte
proliferative Fähigkeiten,
z.B. eine begrenzte Fähigkeit
zur Entwicklung multipler Zelllinien. Zum Zweck dieser Patentanmeldung
sind reife hematopoietische Zellen grundsätzlich zur Entwicklung von
nur einer oder zwei Zelllinien in vitro oder in vivo fähig.
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Es
sollte selbstverständlich
sein, dass das hematopoietische System komplex ist und viele intermediäre Zellen
zwischen primitiven totipotenten hematopoietischen Stammzellen und
den oben definierten vollkommen entwickelten reifen hematopoietischen
Zellen enthält.
Sowie sich die Stammzelle in eine immer reifere, durch ihre Abstammung
beschränkte
Zelle entwickelt, verliert diese immer mehr ihre Fähigkeit
zur Selbsterneuerung.
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Die
Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, wie in diesem Patent beschrieben,
können
und können auch
nicht in diesen intermediären
Zellen exprimiert werden. Die notwendige und hinreichende Bedingung, welche
Mitglieder der neuen Klasse von Rezeptoren definiert, ist, dass
sie in den primitiven totipotenten Stammzellen oder in Zellen vorhanden
sind und nicht in auf eine oder zumeist zwei Zelllinien beschränkten reifen
Zellen.
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Ein
Beispiel der neuen Klasse an Rezeptor pTKs, wird fötale Leberkinase
2 (flk-2) genannt, nach dem Organ in dem es gefunden wurde. In der
Mitte der Trächtigkeit
(Tag 14) gibt es ungefähr
eine totipotente Stammzelle pro 104 Zellen
in der fötalen
Leber von Mäusen.
Zusätzlich
zur fötalen
Leber wird flk-2 ebenfalls in der fötalen Milz, fötalem Thymus,
adultem Hirn und adultem Knochenmark exprimiert.
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Beispielsweise
wird flk-2 in individuellen multipotenten CFU-Blast-Kolonien exprimiert,
die fähig
sind, zahlreiche Kolonien vielfältiger
Abstammung nach erneutem Ausplattieren zu erzeugen. Es ist daher
wahrscheinlich, dass flk-2 im gesamten primitiven (d. h. selbsterneuernden)
Anteil der hematopoietischen Hierarchie exprimiert werden. Diese
Entdeckung stimmt damit überein,
dass flk-2 in der Weiterleitung möglicher Signale zur Selbsterneuerung
aus der Umgebung wichtig ist.
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Es
ist besonders wichtig, dass die Expression von flk-2 mRNA in der
primitivsten thymozytischen Untereinheit stattfindet. Sogar in nahe
miteinander verbundenen unreifen Unterein heiten, die sich in der
Expression des IL-2-Rezeptors unterscheiden, segregiert die flk-2-Expression zu der
primitiveren Untereinheit, der ein IL-2-Rezeptor fehlt. Man nimmt
an, dass die früheste
thymozytische Untereinheit nicht entwickelt ist. Daher kann die
Thymozyte, die flk-2 exprimiert multipotent sein. Flk-2 ist die
erste Rezeptor Tyrosin Kinase von der bekannt ist, dass sie in der
T-lymphoiden Zelllinie exprimiert wird.
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Die
mRNA fötaler
Leber wandert relativ zu den ribosomalen Banden 285 und 185 auf
Formaldehyd-Agarose-Gel bei ungefähr 3,5 kb, während die
Nachricht des Gehirns erheblich größer ist. In adulten Geweben
wandert flk-2 mRNA sowohl vom Hirn wie auch vom Knochenmark bei
etwa 3,5 kb.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen zweiten Rezeptor, der fötale Leberkinase
1 (flk-1) genannt wird und kein Mitglied der gleichen Klasse an
Rezeptoren wie flk-2 ist, da flk-1 in ein paar mehr reifen hematopoietischen
Zellen gefunden werden kann. Die Aminosäuresequenz von flk-1 ist in 2 gezeigt.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
den flk-1 Rezeptor ein, wie auch DANN, cDNA und RNA, kodierend flk-1.Die
DNA-Sequenz von flk-1 ist ebenfalls in 2 gezeigt.
Flk-1 kann in den gleichen Organen wie flk-2 gefunden werden, sowie
auch in fötalem
Hirn, Magen, Niere, Lunge, Herz und Darm; und in adulter Niere, Herz,
Milz, Lunge, Muskeln und Lymphknoten.
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Es
ist bekannt, dass die Rezeptor Protein Tyrosin Kinasen der Erfindung
in einfach zu bestimmende Domänen
aufgeteilt werden können.
Die zur pTK korrespondierende DNA-Sequenz kodiert, beginnend mit ihrem
5'-Ende, eine hydrophobe
Leitsequenz, der eine hydrophile extrazelluläre Domäne folgt, die an einen spezifischen
Liganden bindet und durch diesen aktiviert wird. Unmittelbar stromabwärts der
extrazellulären
Rezeptor-Domäne
ist eine hydrophobe Transmembranregion. Auf die Transmembranregion
folgt unmittelbar eine basische katalytische Domäne, die in Bezug auf die oben
diskutierten Artikel von Hanks et al. und Wilks identifiziert werden
kann.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
die extrazelluläre
Rezeptor-Domäne
ein, der die Transmembranregion und die katalytische Domäne fehlt.
Vorzugsweise ist die hydrophobe Leitsequenz ebenfalls aus der extrazellulären Domäne entfernt.
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Diese
Regionen und Domänen
können
von einem durchschnittlichen Fachmann einfach visuell dadurch identifiziert
werden, dass die Aminosäuresequenz
einer vermutlichen pTK kontrolliert und mit bekannten pTKs verglichen
wird. In Bezug auf 1a wird beispielsweise
die Transmembranregion von flk-2, die die extrazelluläre Rezeptor-Domäne von der
katalytischen Domäne
abtrennt, durch die Nukleotide 1663 (T) bis 1722 (C) kodiert. Diese
Nukleotide korrespondieren zum Aminosäurerest 545 (Phe) bis 564 (Cys).
Die Aminosäure-Sequenz zwischen
der Transmembranregion und der katalytischen Sub-Domäne (Aminosäuren 618–623), die
durch Hanks et al. als Sub-Domäne
I (z. B. GXGXXG) identifiziert wurde, ist charakteristisch für Rezeptor Protein
Tyrosin Kinasen.
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Die
extrazelluläre
Domäne
kann ebenfalls durch allgemein anerkannte Kriterien für extrazelluläre Aminosäure-Sequenzen
identifiziert werden. Die Bestimmung von geeigneten Kriterien ist
einem Fachmann bekannt und wurde z. B. von Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
78, 3824–3828
(1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982); Emini, J. Virol.
55, 836–839
(1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181–186 (1988) und Karplus et
al. Naturwissenschaften 72, 212–213
(1985) beschrieben. Die anhand dieser Kriterien vorhergesagten Aminosäure-Domänen liegen
exponiert an der Oberfläche,
was charakteristisch für
extrazelluläre Domänen ist.
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Wie
weiter unten genauer diskutiert, können Nukleionsäure-Moleküle, die
die Rezeptoren der Erfindung kodieren, in bekannte Vektoren zur
Verwendung in Standardtechniken für rekombinante DNA verwendet werden.
Standardtechniken für
rekombinante DNA sind solche wie z. B. in Sambrook et al. beschrieben, "Molecular Cloning", Second Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und von Ausubel et al.,
Hrsg., "Current
Protocols in Molecular Biology",
Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York (1987).
Die Vektoren können
zirkulär
(z. B. Plasmide) oder nicht zirkulär sein. Zur Klonierung und
Expremierung in einem Wirt sind Standardvektoren verfügbar. Der
Wirt kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Prokaryotische Wirte
sind bevorzugt E. coli. Bevorzugte eukaryotische Wirte schließen Hefe-,
Insekten- und Säugetierzellen
mit ein. Bevorzugte Säugetierzellen
schließen
z. B. CHO-, COS- und humane Zellen mit ein.
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Funktionelle Äquivalente
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Die
Erfindung schließt
funktionelle Äquivalente
der pTK Rezeptoren und Rezeptor-Domämen, wie oben
beschrieben, ein, ebenso wie Nukleinsäuresequenzen, die diese kodieren.
Ein Protein wird dann als funktionelles Äquivalent eines anderen Proteins
für eine
bestimmte Funktion betrachtet, wenn das äquivalente Protein immunologisch
kreuzreaktiv mit den Rezeptoren der Erfindung ist und die gleiche
Funktion wie diese besitzt. Das Äquivalent
kann z. B. ein Fragment des Proteins oder eine Substitutions-, Additions-
oder Deletionsmutante des Proteins sein. Die Äquivalente, eingeschlossen
in der Erfindung sind diejenigen, die in Ansprüchen 1(ii) und 1(iii) definiert
sind.
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Beispielsweise
ist es möglich,
Aminosäuren
in einer Sequenz durch äquivalente
Aminosäuren
zu ersetzen. Gruppen von Aminosäuren,
von denen bekannt ist, dass sie gewöhnlicherweise zueinander äquivalent sind,
sind:
- (a) Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G);
- (b) Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);
- (c) His(H) Arg(R) Lys(K);
- (d) Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); und
- (e) Phe(F) Tyr(Y) Trp(W).
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Substitutionen,
Additionen und/oder Deletionen können
solange in den Rezeptoren durchgeführt werden, wie die entstehenden äquivalenten
Antikörper
immunologisch mit den nativen Antikörpern kreuzreaktiv sind und
die gleiche Funktion wie diese besitzen.
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Die äquivalenten
Rezeptoren werden gewöhnlicherweise
im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die nativen
Rezeptoren besitzen. Eine Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen mit einer anderen Sequenz gleich ist, sich jedoch
von der anderen Sequenz durch eine oder mehrere Substitutionen,
Additionen und/oder Deletionen unterscheidet, wird als äquivalente
Sequenz angesehen. Vorzugsweise sind weniger als 25%, noch bevorzugter
weniger als 10% und am meisten bevorzugt weniger als 5% der Anzahl
an Aminosäureresten
in der Aminosäuresequenz
der nativen Rezeptoren substituiert, addiert oder deletiert.
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Äquivalente
Nukleinsäuremoleküle schließen Nukleinsäuremoleküle mit ein,
die die oben definierten äquivalenten
Rezeptoren kodieren. Äquivalente
Nukleinsäuremoleküle schließen ebenfalls
Nukleinsäuresequenzen
mit ein, die sich von nativen Nukleinsäuresequenzen in einer Art unterscheiden,
die keinen Effekt auf die korrespondierenden Aminosäuresequenzen
ausübt.
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ISOLATION
VON NUKLEINSÄUREMOLEKÜLEN UND
PROTEINEN
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Isolation von Nukleinsäuremolekülen, die
Rezeptoren kodieren
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Um
Nukleinsäuremoleküle herzustellen,
die Stammzellenrezeptoren aus Säugetieren
kodieren, wird eine Quelle an Stammzellen bereitgestellt. Geeignete
Quellen schließen
fötale
Leber, Milz oder Thymuszellen oder adulte Knochenmarks- oder Hirnzellen
mit ein.
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Beispielsweise
können
geeignete fötale
Leberzellen aus Mäusen
am Tag 14 der Trächtigkeit
erhalten werden. Fötale
Thymuszellen aus Mäusen
können
am Tag 14–18
der Trächtigkeit,
vorzugsweise am Tag 15, erhalten werden. Geeignete fötale Zellen
anderer Säugetiere
können
zu den Zeiten erhalten werden, die mit der Trächtigkeit von Mäusen korrespondiert.
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Die
gesamte RNA wird mit Hilfe von Standardtechniken aus Gewebe präpariert,
das Stammzellrezeptoren beinhaltet. Die gesamte RNA wird zur direkten
cDNA-Synthese verwendet. Standardverfahren zur Isolierung von RNA
und zu Synthese von cDNA werden in Standardhandbüchern der Molekularbiologie
bereitgestellt, sowie in Sambrook et al., "Molecular Cloning," Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al., (Hrsg.), "Current Protocols
in Molecular Biology",
Greene Associates/Wiley Interscience, New York (1990).
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Die
cDNA des Rezeptors wird durch bekannte Verfahren amplifiziert. Zum
Beispiel kann die cDNA als ein Template für die Amplifikation mittels
der Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendet werden, siehe Saiki et
al., Science, 239, 487 (1988) oder Mullis et al., US-Patent 4,683,195.
Die Sequenzen der Oligonukleotid-Primer für die PCR-Amplifikation werden
aus der Sequenz bekannter Rezeptoren hergeleitet, wie z. B. aus
den in 1 und 2 angegebenen
Sequenzen für
flk-2 bzw. flk-1, vorzugsweise flk-2. Die Oligonukleotide werden durch
bekannte Standardverfahren hergestellt. Geeignete Verfahren schließen solche
mit ein, die von Caruthers in der Zeitschrift Science 230, 281–285 (1985)
beschrieben werden.
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Um
die gesamte, für
die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung proteinkodierenden Regionen
zu isolieren, ist das stromaufwärts
gelegene Oligonukleotid komplementär zur Sequenz am 5'-Ende, vorzugsweise das
ATG Startkodon umgebend und mindestens 5–10 Nukleotide stromaufwärts des
Start Kodons. Das stromabwärts
gelegene Oligonukleotid ist komplementär zur Sequenz am 3'-Ende, optional das
Stopkodon umgebend. Eine Mischung von stromaufwärts und stromabwärts gelegenen
Oligonukleotiden wird in der PCR-Amplifikation verwendet. Die Bedingungen
werden gemäß Standardverfahren
für jedes
einzelne Primer-Paar optimiert. Das PCR-Produkt wird mittels Elektrophorese
auf die korrekte Größe der cDNA
analysiert, die zu der Sequenz zwischen den Primern korrespondiert.
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Alternativ
kann die kodierende Region in zwei oder mehr überlappenden Fragmenten amplifiziert
werden. Die überlappenden
Fragmente werden so entworfen, dass sie eine Schnittstelle mit einschließen, die
eine Zusammenstellung der intakten cDNA aus den Fragmenten erlauben.
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Die
die Rezeptoren der Erfindung kodierende amplifizierte DNA kann in
einer großen
Anzahl an Klonierungsvektoren in einer großen Anzahl an Wirtszellen repliziert
werden. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Die DNA kann aus natürlichen
Quellen erhalten werden und optional, modifiziert werden, oder zum
Teil oder vollständig
synthetisiert werden.
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Der
Vektor, in dem die DNA gesplicet wird, kann Segmente chromosomaler,
nichtchromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen beinhalten. Einige
geeignete prokaryotische Klonierungsvektoren schließen Plasmide
von E. coli mit ein, wie z.B. colE1, pCR1, BpR322, pMB9, pUC, pKSM
und RP4. Prokaryotische Vektoren schließen ebenfalls Derivate von
Phagen-DNA mit ein, sowie M13 und andere filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen.
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Isolierung
von Rezeptoren
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Die
DNA, die die Rezeptoren der Erfindung kodiert, wird in einen geeigneten
Vektor eingeschleust und in einem geeigneten prokaryotischen oder
eukaryotischen Wirt exprimiert. Um Proteine in Bakterien zu exprimieren,
speziell in E. coli, sind Vektoren bekannt. Solche Vektoren schließen die
PATH-Vektoren mit ein, die durch Dieckmann und Tzagoloff in J. Biol.
Chem. 260, 1513–1520
(1985) beschrieben werden. Diese Vektoren enthalten den DNA-Sequenzen, die Anthranilat
Synthase (TrpE) kodieren, gefolgt von einem Polylinker am Carboxy-Terminus.
Andere Systeme von Expressionsvektoren basieren auf beta-Galactosidase
(pEX); lambda-PL; Maltose Bindungsprotein
(mMAL); und Glutathion S-Transferase (pGST) – siehe Gene 67, 31 (1988) und
Peptide Research 3, 167 (1990).
-
In
Hefe verwendbare Vektoren sind erhältlich. Ein geeignetes Beispiel
ist das 2μ Plasmid.
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Geeignete
Vektoren zur Verwendung in Säugetierzellen
sind ebenfalls bekannt. Solche Vektoren schließen gut bekannte Derivate mit
ein, die von SV-40, Adenovirus, von Retrovirus abgeleiteten DNA-Sequenzen
und Vektoren abstammen, die aus einer Kombination von Plasmiden
und Phagen DNA abgeleitet sind.
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Weitere
eukaryotische Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt
(z. B. P. J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327–341 (1982);
S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854–864 (1981); R. J. Kaufmann
und P. A. Sharp, "Amplification
And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate
Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601–621 (1982);
R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601–664 (1982);
S. I. Scahill et al., "Expression
And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon
DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654–4659 (1983);
G. Urlaub und L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220 (1980).
-
Verwendbare
Expressionsvektoren, geeignet in der vorliegenden Erfindung, beinhalten
mindestens eine Sequenzen zur Kontrolle der Expression, die operativ
mit der zu exprimierenden DNA-Sequenz oder dem Fragment verbunden
ist. Die Kontrollsequenz wird in den Vektor eingesetzt, um die Expression
der klonierten DNA-Sequenz zu kontrollieren und zu regulieren. Beispiele
verwendbarer Sequenzen zur Kontrolle der Expressions sind das lac- System, das trp-System,
das tac-System, das trc-System, die großen Operator- und Promotor-Regionen
des Lambda-Phagen, die Kontrollregion des fd-coat-Proteins, der
glycolytische Promotor aus Hefe, z. B., der Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase,
die Promotoren von Säurephosphatase
aus Hefe (yeast acid phosphatase), z. B., Pho5, die Promotoren des
alpha-mating Faktors aus Hefe, und Promotoren, die aus Polyoma,
Adenovirus, Retrovirus und Simianvirus abgeleitet sind, z. B., die
frühen
und späten
Promotoren oder SV40, und andere Sequenzen, von denen bekannt ist,
dass sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer
Zellen kontrollieren sowie deren Viren oder Kombinationen davon.
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Vektoren,
die die Rezeptor kodierende DNA und Kontrollsignale enthalten, werden
in einer Wirtszelle zur Expression des Rezeptors insertiert. Einige
zur Expression verwendbare Wirtszellen schließen gut bekannte prokaryotische
und eukaryotische Zellen mit ein. Einige geeignete prokaryotische
Wirtszellen schließen
z. B. mit ein, E. coli, wie z.B. E. coli SG-936, E. coli HB 101,
E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI und E.
coli MRCI, Pseudomonas, Bacillus, wie z.B. Bacillus subtilis und
Streptomyces. Geeignete eukaryotische Zellen schließen Hefe
und andere Pilze, Insekten, tierische Zellen wie z.B. COS-Zellen
und CHO-Zellen, humane Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekulturen
mit ein.
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Die
humanen Homologe der oben beschriebenen Mausrezeptoren werden mit
Hilfe einer ähnlichen Strategie
isoliert. RNA, die die Rezeptor kodiert, wird aus einer Quelle von
humanen Zellen gewonnen, die mit primitiven Stammzellen angereichert
ist. Geeignete humane Zellen schließen fötale Milz, Thymus- und Leberzellen,
und Nadelschnurblut sowie auch adulte Hirn- und Knochenmarkszellen
mit ein. Die humanen fötalen Zellen
werden vorzugsweise an dem Tag der Schwangerschaft gewonnen, der
vergleichbar ist zur Mitte der Trächtigkeit in Mäusen: Die
Aminosäuresequenzen
der humanen flk-Rezeptoren sowie deren kodierende Nukleinsäuresequenzen
sind homolog zu den Aminosäure-
und Nukleotidsequenzen der Mausrezeptoren.
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In
der vorliegenden Anmeldung wird die Sequenz eines ersten Proteins,
wie z. B. eines Proteins oder eine Liganden, oder eines Nukleinsäuremoleküls, das
das Protein kodiert, als homolog zu einem zweiten Protein oder einem
Nukleinsäuremolekül angesehen,
falls die Aminosäure
oder die Nukleotidsequenz des ersten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls mindestens
etwa 30% homolog, vorzugsweise mindestens 50% homolog, und am meisten bevorzugt
mindestens etwa 65% homolog zu der entsprechenden Sequenz des zweiten
Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls ist.
Im Falle von Proteinen, die eine hohe Homologie besitzen, ist die
Aminosäure
oder die Nukleotidsequenz des ersten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls mindestens etwa
75% homolog, vorzugsweise mindestens etwa 85% homolog und am meisten
bevorzugt mindestens etwa 95% homolog zu der Aminosäure oder
der Nukleotidsequenz des zweiten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls.
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Kombinationen
aus Oligonukleotid-Paaren aus Maus werden als PCR-Primer verwendet,
um das humane Homolog aus den Zellen zu amplifizieren, um Sequenzunterschiede
zu bestimmen. Der Rest der Prozedur zur Bestimmung der humanen flk-Homologe
ist ähnlich
zu den Prozeduren, die oben für
die Gewinnung der Maus flk-Rezeptoren beschrieben wurden. Die nicht
ganz perfekte Homologie zwischen den humanen flk-Homologen und den
Oligonukleotiden aus Maus wird bei der Bestimmung der Stringenz
der Hybridisierungsbedingungen mit in Betracht gezogen.
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Assay zur
Expression von Rezeptoren auf Stammzellen
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Um
die Expression von flk-1-Rezeptoren auf der Oberfläche von
primitiven hematopoietischen Stammzellen zu demonstrieren, werden
Antikörper
generiert, die den Rezeptor erkennen. Der Rezeptor kann dabei das
vollständige
Protein, so wie es in der Natur vorkommt, oder ein antigenes Fragment
des vollständige Proteins
sein. Vorzugsweise umfasst das Fragment den vorhergesagten extrazellulären Anteil
des Moleküls.
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Antigene
Fragmente können
durch Verfahren aus dem Stand der Technik identifiziert werden.
Fragmente, die antigene Sequenzen beinhalten, können auf der Basis von allgemein
anerkannten Kriterien für
potentielle Antigenizität
und/oder Exposition ausgewählt
werden. Solche Kriterien schließen
die Hyrophilizität
und den relativen antigenen Index mit ein, wie er durch die Analyse
der Oberflächenexposition
von Proteinen bestimmt wurde. Die Bestimmung von geeigneten Kriterien
sind einem Fachmann bekannt und wurden z. B. beschrieben durch Hopp
et al., in Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA 78, 3824–3828
(1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982); Emini, J. Virol.
55, 836-839 (1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181–186 (1988);
und Karplus et al., Naturwissenschaften 72, 212–213 (1985). Aminosäuredomänen, von
denen anhand dieser Kriterien vorhergesagt wurde, dass sie an der Oberfläche liegen,
werden vorzugsweise gegenüber
Domänen
ausgewählt, von
denen vorhergesagt wird, dass sie mehr hydrophob oder versteckt
sind.
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Die
Proteine und Fragmente der als Antigene zu verwendenden Rezeptoren
können
durch Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt werden. Solche
Verfahren schließen
die Isolierung oder Synthese von DNA mit ein, die die Proteine und
Fragmente kodieren, sowie die Verwendung der NDA zur Herstellung
der oben beschriebenen rekombinanten Proteine.
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Fragmente
von Proteinen und DNA, die diese Fragmente kodieren, können chemisch
durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, aus individuellen
Aminosäuren
und Nukleotiden synthetisiert werden. Geeignete Verfahren für die Synthese
von Proteinfragmenten werden durch Stuart und Young in "Solid Phase Peptide
Synthesis," Second
Edition, Pierce Chemical Company (1984) beschrieben. Geeignete Verfahren
zur Synthese von DNA-Fragmenten werden von Caruthers in Science
230, 281–285
(1985) beschrieben.
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Falls
das Rezeptorfragment ein Epitop definiert, dieses aber zu kurz ist,
um antigen zu sein, kann es für
die Herstellung von Antikörpern
mit einem Trägermolekül verbunden
werden. Einige geeignete Trägermoleküle schließen keyhole
limpet hemocyanin, Ig-Sequenzen, TrpE und humanes oder bovines Serumalbumin mit
ein. Die Konjugation kann durch Verfahren ausgeführt werden, die aus dem Stand
der Technik bekannt sind. Ein solches Verfahren ist die Kombinierung
eines Cystein-Restes des Fragments mit einem Cystein-Rest des Trägermoleküls.
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Die
Antikörper
sind vorzugsweise monoklonal. Monoklonale Antikörper können durch Verfahren hergestellt
werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Diese Verfahren schließen die
immunologischen Verfahren mit ein, die beschrieben wurden durch
Kohler und Milstein in Nature 256, 495–497 (1975) und Campbell in "Monoclonal Antibody
Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human
Hybridomas" in Burdon
et al., Hrsg., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, Band 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985);
wie auch durch die rekombinanten DNA-Verfahren, die durch Huse et
al. in Science 246, 1275–1281
(1989) beschrieben wurden.
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Polyklonale
oder monoklonale Antiseren, von denen gezeigt wurde, dass sie mit
Rezeptor kodierten nativen Proteinen reaktiv sind, z. B. mit flk-1
kodierten Proteinen, und auf der O- berfläche von lebensfähigen Zellen
exprimiert werden, werden verwendet, um Antikörper positive Zellen zu isolieren.
Ein Verfahren zur Isolierung solcher Zellen ist Durchflusszytometrie,
siehe z. B. Loken et al., Europäische
Patentanmeldung 317, 156. Die erhaltenen Zellen werden durch Verfahren,
die aus dem Stand der Technik bekannt sind, in mit Hilfe von Wirten
eingepflanzt, die mit Hilfe von Strahlung geschwächt wurden, und auf Stammzellen
geprüft;
siehe z. B. Joran et al., Cell 61, 953–963 (1990).
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Kriterien für eine neue
Stammzell Rezeptor Tyrosin Kinase, die in Stammzellen exprimiert
wird
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Zusätzliche
neue cDNAs von Rezeptor Tyrosin Kinasen werden durch die Amplifikation
von cDNAs aus Stammzellpopulationen durch die Verwendung von Oligonukleotiden
als PCR-Primer gewonnen;
siehe oben. Beispiele geeigneter Oligonukleotide sind PTK1 und PTK2,
die durch Wilks et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607 (1989)
beschrieben werden. Eine neue cDNA wird auf der Basis eines Screenings
mittels differenzieller Hybridisierung mit Proben ausgewählt, die
bekannte Kinasen repräsentieren.
Nur die bei geringer Stringenz hybridisierenden cDNA-Klone werden
ausgewählt
und sequenziert. Die Anwesenheit des Aminosäure-Triplets DFG bestätigt, dass
die Sequenzen eine Kinase darstellen. Der Erkennungsrest Methionin
im WMAPES-Motiv ist Anzeichen für
eine wie oben beschriebene Rezeptor ähnliche Kinase. Erhaltene potentiell neue
Sequenzen werden mit verfügbaren
Sequenzen durch die Verwendung von Datenbanken, wie Genbank, verglichen,
um deren Einzigartigkeit zu bestätigen.
Gen-spezifische Oligonukleotide werden wie oben beschrieben auf
der Basis der erhaltenen Sequenzen hergestellt. Die Oligonukleotide
werden verwendet, um mit Stammzellen angereicherte oder reduzierte
Populationen auf Expression zu analysieren. Solche Zellpopulationen
sind in Mäusen
beschrieben, z. B. durch Jordon et al., in Cell 61, 953–956 (1990);
Ikuta et al., in Cell 62, 863–864
(1990); Spangrude et al. in Science 241, 58–62 (1988); und Szilvassy et
al., in Blood 74, 930–939 (1989).
Beispiele solcher humaner Zellpopulationen werden als CD33–CD34+ von Andrews et al. im Journal of Experimental
Medicine 169, 1721–1731
(1989) beschrieben. Andere humane Stammzellpopulationen werden z.
B. in Civin et al., Europäische
Patentanmeldung 395,355 und in Loken et al., Europäische Patentanmeldung 317,156
beschrieben.
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BEISPIELE
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Beispiel 1.
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Zellen enthaltend Maus
flk-1 und flk-2 Liganden Murine stromale Zelllinie 2018
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Um
stromale Zelllinien zu etablieren werden fötale Leberzellen mit Hilfe
von Collagen vereinzelt und in einer Mischung von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und
10% hitzeinaktiviertem fötalem
Kälberserum
bei 37°C
wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Standardverfahren immortalisiert.
Ein geeignetes Verfahren schließt
das Einschleusen von DNA, die eine wachstumsregulierende oder Oncogen-kodierende
Sequenz kodiert, in eine Wirtszelle mit ein. Die DNA kann mit Hilfe
der Transduktion in einen rekombinanten viralen Partikel oder durch
Transfektion in einen Plasmid eingeschleust werden. Siehe z. B.
Hammerschmidt et al., Nature 340, 393–397 (1989) und Abcouwer et
al., Biotechnology 7, 939–946
(1989). Retroviren sind die bevorzugten viralen Vektoren, obwohl
SV40 und Epstein-Barr-Virus ebenfalls als Donor für die das Wachstum
verstärkenden
Sequenzen dienen kann. Ein geeigneter Retrovirus ist der ecotrope
Retrovirus, der ein temperatursensitives SV40 T-Antigen (tsA58)
und ein G418 Resistenzgen beinhaltet, das von McKay in Cell 66,
713–729
(1991) beschrieben wurde. Nach mehreren Tagen bei 37°C wird die
Temperatur des Mediums auf 32°C
gesenkt. Die Zellen werden mit G418 (0,5 mg/ml) ausgewählt. Die
ausgewählten
Zellen werden expandiert und aufbewahrt.
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Eine
stromale Zelllinie aus Maus, die durch dieses Verfahren hergestellt
wurde, wird 2018 genannt und wurde am 30. Oktober 1991 bei der American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC); Hinterlegungsnummer
CRL 10907 hinterlegt.
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Beispiel 2.
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Zellen die Liganden von
humanem flk-1 und flk-2 enthalten
-
Humane
fötale
Leber (18, 20 und 33 Wochen nach Abbruch der Schwangerschaft), Milz
(18 Wochen nach Abbruch der Schwangerschaft) oder Thymus (20 Wochen
nach Abbruch der Schwangerschaft) wird zum Zeitpunkt des Abbruchs
der Schwangerschaft entfernt und in einer ausgeglichenen Salzlösung aufbewahrt. Nach
Zerkleinerung in 1 mm große
Fragmen te und Pressen durch ein Drahtnetz wird das Gewebe einmal
in Hanks ausgeglichener Salzlösung
(HBSS) gewaschen.
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Das
zerrissene Gewebe wird bei 200 xg 15 Minuten lang bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird in 10–20 ml einer Trypsin-EDTA-Lösung in
einer Reinheit für
Gewebekulturen (Flow Laboratories) resuspendiert. Das resuspendierte
Gewebe wird in einen sterilen Kolben überführt und mit einem Rührer bei
Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. Zu einer finalen Konzentration
von 10% wird 1 ml hitzeinaktiviertes fötales bovines Kälberserum
(Hyclone) zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu inhibieren. Aus einer Stammlösung (10
mg/ml in HBSS) wird Collagenase Typ IV (Sigma) bis zu einer finalen
Konzentration von 100 μg/ml
zugegeben, um die stromalen Zellen zu zerreißen. Das Gewebe wird bei Raumtemperatur
für weitere 2,5
Stunden gerührt;
durch Zentrifugation (400 xg, 15 Minuten) gesammelt; und in "stromalem Medium" resuspendiert, das
Iscove's Modifikation
von DMEM beinhaltet, dem 10% hitzeinaktiviertes fötales Kalbsserum
zugesetzt wird sowie 5% hitzeinaktiviertes humanes Serum (Sigma),
4 mM L-Glutamin, 1x Natriumpyruvat (100fache Stammlösung, Sigma),
1x nicht-essentielle Aminosäuren
(100fache Stammlösung,
Flow) und eine Mischung der Antibiotika Kanomycin, Neomycin, Penicillin,
Streptomycin. Vor dem Resuspendieren des Pellets im stromalen Medium
wird das Pellet einmal mit HBSS gewaschen. Es ist angemessen, die
Zellen in 60 ml Medium zu suspendieren. Die Anzahl von Kulturen
hängt von
der Menge des Gewebes ab.
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Beispiel 3.
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Isolierung
stromaler Zellen
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Resuspendierte
Zellen (Beispiel 2), die bei 37°C
mit 5% Kohlendioxid inkubiert werden, beginnen innerhalb von 10–48 Stunden
an der Plastikplatte zu haften. Konfluente Monolayer-Schichten können innerhalb von
7–10 Tagen
beobachtet werden, abhängig
von der Anzahl der im anfänglichen
Impfmaterial ausplattierten Zellen. Nicht-haftende und hochrefraktile
Zellen, die an der Schicht aus stromalen Zellen als Kolonien haften, werden
getrennt durch Pipettieren entfernt und eingefroren. Nicht-haftende
Zellen sind wahrscheinlich Quellen für Populationen selbst erneuernder
Stammzellen, die flk-2 enthalten. Die haftenden Schichten stromaler
Zellen werden für
zukünftige
Studien in Aliquots eingefroren oder zum Wachstum in Kulturen expandiert.
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Für die Bindung
von APtag-flk-2 Fusionsprotein an fötalen Milzzellen wurde ein
unerwartet hoher Wert beobachtet. Zwei fötale Milzzelllinien werden
in "stromalem Medium" wachsen gelassen,
welches in Beispiel 2 beschrieben wird.
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Nicht-haftende
fötale
Stammzellen binden an die stromalen Zellen und bilden Kolonien (colony
forming unit – CFU).
Stromale Zellen und CFU werden durch die Verwendung von sterilen
Glaszylindern isoliert und in Kultur expandiert. Ein Klon, Fsp 62891
genannt, enthält
den flk-2 Liganden. Fsp 62891 wurde bei der American Type Culture
Collection, Rockville, Maryland, USA am 21. November 1991 unter
der Hinterlegungsnummer CRL 10935 hinterlegt.
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Fötale Leber-
und fötale
Thymuszellen werden auf ähnliche
Art präpariert.
Jede dieser beiden Zelltypen produziert Liganden von flk-1 und,
im Falle der Leber, etwas flk-2. Eine solche fötale Thymuszelllinie F.thy 62891
genannt, und eine solche Leberzelllinie, FL 62891 genannt, wurden
bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA
am 21. November 1991 bzw. am 2. April 1992 unter den Hinterlegungsnummern
CRL 10936 bzw. CRL 11005 hinterlegt.
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Stabile
humane Zelllinien werden aus fötalen
Zellen mit dem gleichen temperatursensitiven immortalisierenden
Virus hergestellt, der verwendet wurde, um die in Beispiel 1 beschriebene
murine Zelllinie herzustellen.
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Beispiel 4.
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Isolierung
humaner stromaler Zellklone
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Hoch
refraktile Zellen überwachsen
Flecken von stromalen Zellen, vermutlich, weil die stromalen Zelle Faktoren
produzieren, die die Bildung der CFUs erlauben. Um stromale Zellklone
zu isolieren, werden sterile Glaszylinder, die mit Vakuumschmiermittel
beschichtet wurden, über
den CFUs positioniert. Eine Trypsin-EDTA-Lösung (100 ml) wird zugegeben,
um die Zellen abzulösen.
Die Zellen werden zu 5 ml stromalen Mediums zugegeben und jeder
(Klon) in einer einzelnen Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen
ausplattiert.
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Beispiel 5.
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Plasmid (APtag) zur Expression
sekretierbarer alkalischer Phosphatase (SEAP)
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Plasmide,
die sekretierbare alkalische Phosphatase exprimieren, werden von
Flanagan und Leder in Cell 63, 185–194 (1990) beschrieben. Die
Plasmide enthalten einen Promotor, z.B. den LTR-Promotor; einen Polylinker,
enthaltend HindIII und BglII; DNA, die SEAP kodiert; ein Poly-A-Signal;
und ein Ampicillin-Resistenzgen, und eine Replikationsstelle.
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Beispiel 6.
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Plasmid zur Expression
von APtag-flk-2 und APtag-flk-1 Fusionsproteinen
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Plasmide,
die Fusionsproteine von SEAP und den extrazellulären Anteil von entweder flk-1
oder flk-2 exprimieren, werden in Übereinstimmung mit den Protokollen
exprimiert, die von Flanagan und Leder in Cell 63, 185–194 (1990)
und Berger et al., Gene 66, 1–10
(1988) beschrieben wurden. Kurz beschrieben wird ein HindIII-Bam
HI-Fragment hergestellt, das den extrazellulären Anteil von flk-1 oder flk-2
enthält,
und in die HindIII-BglII-Schnittstelle des in Beispiel 5 beschriebenen
Plasmids insertiert.
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Beispiel 7.
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Produktion von APtag-flk-1
oder -flk-2 Fusionsprotein
-
Die
Plasmide aus Beispiel 6 können
in COS-7-Zellen mittels DEAE-Dextran transfiziert (wie in Current Protocols
in Molecular Biology, Unit 16.13, "Transient Expression of Proteins Using
Cos Cells," 1991
beschrieben); und werden mit einem selektierbaren Marker, wie z.B.
pSV7neo, in NIH/3T3-Zellen durch Kalzium-Präzipitation cotransfiziert.
Die NIH/3T3-Zellen werden mit 600 μg/ml G418 in 100 mm Platten
selektiert. Über
300 Klone werden auf die Sekretion plazentaler alkalischer Phosphatase-Aktivität gescreent.
Der Assay wird durch Erhitzen eines Teils des Überstandes auf 65°C für 10 Minuten
durchgeführt,
um Phosphatase-Aktivität
im Hintergrund zu inaktivieren, und durch die Messung des OD405 nach der Inkubation mit 1 M-Diethanolamin
(pH 9,8), 0,5 mM MgCl2, 10 mM L-Homoarginin
(ein Phosphatase-Inhibitor), 0,5 mg/ml BSA und 12 mM p-Nitrophenylphosphat.
Humane plazentale alkaline Phosphatase wird verwendet, um eine Standardkurve
zu erstellen. Die APtagflk-1-Klone (F-1AP21-4) produzieren bis zu
10 μg alkalischer
Phosphatase-Aktivität/ml
und die APtag-flk-2-Klone (F-2AP26-0) produzieren bis zu 0,5 μg alkalischer
Phosphatase-Aktivität/ml.
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Beispiel 8.
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Assay zur Bildung von
APtag-flk-1- oder APtag-flk-2-Zellen
-
Die
Bindung von APtag-flk-1 oder APtag-flk-2-Zellen, die den geeigneten
Liganden enthalten, wird mit Hilfe von Standardverfahren geprüft. Siehe
beispielsweise Flanagan und Leder, Cell 63: 185–194 (1990). Zellen (z. B.
stromale Zellen aus Maus, humane fötale Leber-, Milz- oder Thymus-, oder
verschiedene Kontrollzellen) läßt man bis
zum Gleichgewicht in Platten mit 6 Vertiefungen wachsen wäscht sie
mit HBHA ("Hank's balanced salt solution" mit 0,5 mg/ml BSA,
0,02% NaN3, 20 mM HEPES, pH 7,0). Die Überstände von
transfizierten COS- oder
NIH/3T3-Zellen, die entweder Aptaq-flk-1-Fusionsprotein, APtag-flk-2
Fusionsprotein, oder APtag ohne einen Rezeptor (als Kontrolle) enthalten,
werden zu den Zell-Monolayer-Schichten
zugegeben und für
2 Stunden bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform inkubiert.
Die Konzentration des Aptag-flk-1 Fusionsproteins, APtag-flk-2 Fusionsproteins,
oder APtag ohne einen Rezeptor beträgt 60 ng/ml an alkalischer Phosphatase,
was mittels der Standardkurve für
alkalische Phosphatase bestimmt (siehe oben) wurde. Die Zellen werden
dann siebenmal mit HBHA gewaschen und in 350 μl 1%iger Triton X-100TM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) lysiert. Die
Lysate werden in ein Mikrofugen-Röhrchen überführt, zusammen mit weiteren
150 μl Waschlösung mit
der gleichen Lösung.
Nach kräftigen
Vortexen werden die Proben 5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugiert,
bei 65°C
für 12
Minuten erhitzt, um zelluläre
Phosphatase zu inaktivieren und auf Phosphatase-Aktivität wie vorher
beschrieben geprüft.
Die Ergebnisse der Experimente, die entworfen wurden, um die Zeit
und Dosis-Antworten der Bindung zwischen stromalen Zellen zu zeigen,
die die Liganden für
flk-2 und flk-1 (2018) und APtag-flk-2, APtag-flk-1 und APtag ohne
Rezeptor (als Kontrolle) enthalten, werden in den 3 bzw.4 gezeigt.
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Beispiel 8A.
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Plasmide zur Expression
von flk1/fms und flk2/fms Fusionsproteinen
-
Plasmide,
die Fusionsproteine des extrazellulären Anteils von entweder flk-1
oder flk-2 und den extrazellulären
Anteil von c-fms (ebenfalls bekannt als Kolonie stimulierender Faktor-1
Rezeptor) exprimieren, werden in einer ähnlichen Art hergestellt, wie
unter Beispiel 6 beschrieben, (Plasmide zur Expression von APtag-flk-2
und APtag-flk-1 Fusionsproteinen). Kurz gesagt, wird ein Hind III – Bam HI
Fragment hergestellt, das den extrazellulären Anteil von flk1 oder flk2
enthält,
und in die Hind III – Bgl
II Schnittstelle eines pLH Expressionsvektors insertiert, der den
intrazellulären
Anteil von c-fms enthält.
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Beispiel 8B.
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Expression von flk1/fms
oder flk2/fms in 3T3-Zellen
-
Die
Plasmide aus Beispiel 11 werden in NIH/3T3-Zellen mit Hilfe von
Kalzium transfiziert. Der intrazelluläre Anteil von c-fms wird über Western
Blot-Technik detektiert.
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Beispiel 9.
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Klonierung und Expression
einer cDNA, die für
den Liganden für
flk-1 und flk-2 Rezeptoren aus Maus kodiert
-
cDNA,
die den Mausliganden für
flk-1 und flk-2 exprimiert, wird über bekannte Verfahren hergestellt. Siehe
z. B. Seed, B., und Aruffo, A. PNAS 84: 3365–3369 (1987); Simmons, D. und
Seed, B. J. Immunol. 141:2797–2800;
und D'Andrea, A.
D., Lodish, H. F. und Wong, G. G. Cell 57:277–285 (1989).
-
Die
Protokolle werden unten in Reihen aufgeführt: (a) RNA Isolation; (b)
poly-A RNA Herstellung; (c) cDNA-Synthese; (d) cDNA-Größenfraktionierung;
(e) Vermehrung der Plasmide (Vektor); (f) Isolierung von Plasmid
DNA; (g) Herstellung des Vektors pSV SportTM (BRL
Gibco) zur Klonierung; (h) Kompilierung von Puffern für die oben
genannten Schritte; (i) Transfektion von cDNA, die Liganden in COS
7-Zellen kodiert; (j) Panning-Prozedur; (k) Expressionsklonierung
von flk-1 oder flk-2 Liganden durch Etablierung einer autokrinen Schleife.
-
9a. Guanidinthiocyanat/LiCl-Protokoll
zur RNA Isolation
-
Für jeden
ml der gewünschten
Mischung werden 0,5 g Guanidinthiocyanat (GuSCN) in 0,55 ml 25%igem
LiCl gelöst
(die Stammlösung
wird durch einen 0,45 mikron Filter filtriert). 20 μl Mercaptoethanol
wird zugesetzt. (Die erhaltene Lösung
hält sich
nicht länger
als eine Woche bei Raumtemperatur.)
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Die
2018 stromalen Zellen werden zentrifugiert, und 1 ml der oben beschriebenen
Lösung
wird bis zu einer Menge von 5 × 107 Zellen angereichert. Mit Hilfe eines Polytrons
werden die Zellen aufgetrennt, bis die Mischung nicht mehr viskos
ist. Für
Präparationen
in kleinem Maßstab
(<108 Zellen)
wird die aufgetrennte Mischung auf 1,5 ml eine 5,7 M CsCl-Lösung geschichtet
(RNase frei; 1,26 g CsCl wird zu jedem ml einer 10 mM EDTA-Lösung (pH
8) zugesetzt) und, falls notwendig, mit RNase-freiem Wasser überschichtet.
Die Mischung wird in einem SW55-Rotor bei 50 krpm für 2 Stunden
zentrifugiert. Bei Präparationen
in großem
Maßstab
werden 25 ml der Mischung auf 12 ml CsCl in einem SW28-Röhrchen geschichtet,
wie oben überschichtet
und bei 24 krpm für
8 Stunden zentrifugiert. Der Inhalt des Röhrchens wird vorsichtig mit
einer sterilen Pasteur-Pipette abgesaugt, die mit einer Vakuumflasche
verbunden ist. Ist das CsCl-Interface passiert, wird mit der Pipettenspitze
ein Band rund um das Röhrchen
gekratzt, um einem Kriechen der Schicht an der Wand des Röhrchens hinunter
vorzubeugen. Die verbleibende CsCl-Lösung wird abgesaugt. Das verbleibende
Pellet wird in Wasser aufgenommen aber nicht wieder aufgelöst. 1/10
Volumen an Natriumazetat und drei Volumina an Ethanol werden zur
Mischung zugesetzt und zentrifugiert. Das Pellet wird, falls notwendig,
in Wasser bei 70°C
resuspendiert. Die Konzentration der RNA wird auf 1 mg/ml eingestellt
und eingefroren.
-
Es
sollte festgehalten werden, dass kleine RNA-Moleküle (z. B.
5S) nicht ausfallen. Für
kleinere Mengen an Zellen werden die Volumina verkleinert und die
Mischung wird mit GuSCN in RNase-freiem Wasser auf einem Gradienten überschichtet
(eine Präzipitierung
ist nicht effizient, falls die RNA verdünnt vorliegt).
-
9b. Poly-A RNA Herstellung
-
(Alle erwähnten Puffer
werden unten getrennt aufgeführt)
-
Eine
Einwegsäule
aus Polypropylen wird durch Waschen mit 5M NaOH und anschließendem Spülen mit
RNase-freiem Wasser präpariert.
Für jedes
Milligramm an gesamter RNA werden ungefähr 0,3 ml (endgültiges gepacktes
Bett) an Oligo dT Zellulose zugesetzt. Die Oligo dT Zellulose wird
durch Resuspendieren von ungefähr
0,5 ml trockenem Pulver in 1 ml einer 0,1 M NaOH-Lösung hergestellt
und in die Säule
transferiert, oder durch Filtrieren einer 0,1 M NaOH-Lösung durch
eine kürzlich
verwendete Säule.
Die Säule
wird mit verschiedenen Säulenvolumina
an RNase-freiem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert neutral ist, und
mit 2–3
ml des Auftragpuffers gespült.
Das Säulenbett
wird in ein steriles 15 ml Röhrchen
durch die Verwendung von 4–6 ml
an Ladungspuffer überführt.
-
Die
gesamte RNA der 2018 Zelllinie wird für 2–3 Minuten auf 70°C erhitzt.
LiCl wird aus der RNase-freien Stammlösung bis zu einer endgültigen Konzentration
von 0,5 M zur Mischung zugesetzt. Die Mischung wird im 15 ml-Röhrchen mit
Oligo-dT-Zellulose kombiniert, die für 10 Minuten gevortexed oder
geschüttelt
wird. Die Mischung wird in die Säule
gegossen und mit 3 ml Ladungspuffer gewaschen, und anschließend mit
3 ml mittlerem Waschpuffers. Die mRNA wird direkt in ein SW55-Röhrchen mit
1,5 ml einer Lösung
von 2 mM EDTA und 0,1% SDS eluiert, wobei die ersten zwei oder drei
Tropfen verworfen werden.
-
Die
eluierte mRNA wird durch Zusetzen 1/10 Volumen einer 3M-Natriumazetatlösung und
Auffüllen des
Röhrchens
mit Ethanol präzipitiert.
Der Inhalt des Röhrchens
wird gemischt, für
30 Minuten bei 20°C
gekühlt
und bei 50 krpm bei 5°C
für 30
Minuten zentrifugiert. Nach Dekantierung des Ethanols und Lufttrocknen des
Röhrchens
wird das mRNA-Pellet in 50-100 μl an RNase-freiem
Wasser resuspendiert. 5 μl
der resuspendierten mRNA wird auf 70°C in MOPS/EDTA/Formaldehyd erhitzt
und auf einem RNase-freien 1 %igen Agarosegel untersucht.
-
9c. cDNA-Synthese
-
Das
verwendete Verfahren ist eine Variation des durch Gubler und Hoffman
beschriebenen Verfahrens in Gene 25, 263–270 (1983)
-
1. Erster Strang
-
4 μg an mRNA
wird in ein Mikrofugen-Röhrchen
gegeben, auf etwa 100°C
für 30
Sekunden erhitzt, und auf Eis abschreckt. Das Volumen wird auf 70 μl mit RNase-freiem
Wasser eingestellt. 20 μl
an RT1-Puffer, 2 μl
an RNase-Inhibitor (Boehringer 36 u/μl), 1 μl an 5 μg/μl Oligo dT (Collaborative Research),
2,5 μl an
20 mM dXTP's (ultrapure – US Biochemicals),
1 μl an
1 M DTT und μl
an RT-XL (Life Sciences, 24 μ/μl) werden zugesetzt.
Die Mischung wird bei 42°C
für 40
Minuten inkubiert, und durch Erhitzen bei 70°C für 10 Minuten inaktiviert.
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2. Zweiter Strang
-
320 μl an RNase-freiem
Wasser, 80 μl
an RT2-Puffer, 5 μl
an DNA Polymerase I (Boehringer, 5 μ/μl), 2 μl RNase H (BRL 2 μ/μl) werden
zur Lösung
zugesetzt, die den ersten Strang enthält. Die Lösung wird bei 15°C für eine Stunde
inkubiert und bei 22°C
für eine
weitere Stunde. Nach Zugabe von 20 μl einer Lösung von 0,5 M EDTA, pH 8,0,
wird die Lösung
mit Phenol extrahiert und durch die Zugabe von NaCl zu 0,5 M linearem Polyacrylamid
(Träger)
bis zu einem Wert von 20 μg/ml
und Auffüllen
des Röhrchens
mit EtOH präzipitiert.
Das Röhrchen
wird für
2–3 Minuten
in einer Mikrofuge zentrifugiert, gevortexed, um präzipitiertes
Material von der Röhrchenwand
zu entfernen, und für
eine weitere Minute zentrifugiert.
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3. Adaptoren
-
Adaptoren
stellen spezifische Restriktionsschnittstellen zur Verfügung, um
die Klonierung zu erleichtern und sind von BRL Gibco, New England
Biolabs, etc. erhältlich.
Die rohen Adaptoren werden bei einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert.
MgSO4 wird bis zu einer finalen Konzentration
von 10 mM zugegeben, gefolgt von einer 5fachen Volumeneinheit an
EtOH. Das resultierende Präzipitat
wird mit 70° EtOH
gespült
und in TE bei einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert. Zu der Kinase
werden 25 μl
an resuspendierten Adaptoren zu 3 μl 10X Kinase-Puffer und 20 Einheiten
an Kinase zugegeben. Die Mischung wird bei 37°C über Nacht inkubiert. Die präzipitierte
cDNA wird in 240 μl
TE (10/1) resuspendiert. Nach Zugabe von 30 μl eines 10X Niedrigsalz-Puffers,
30 ml eines 10X Ligations-Puffers mit 0,1 mM ATP, 3 μl (2,4 μg) an kinasierter
12-mer Adaptersequenz, 2 μl
(1,6 μg)
an kinasierter 8-mer Adaptersequenz, und 1 μl an T4 DNA Ligase (BioLabs,
400 μ/μl oder Boehringer,
1 Weiss'sche Einheit
ml), die Mischung wird bei 15°C über Nacht
inkubiert. Die cDNA wird mit Phenol extrahiert und wie oben beschrieben
präzipitiert,
mit der Ausnahme, dass der zusätzliche
Träger
ausgelassen wird, und in 100 μl
an TE resuspendiert.
-
9d cDNA-Größenfraktionierung
-
Eine
Lösung
mit 20% KOAc, 2 mM EDTA, 1 μg/ml
Ethidiumbromid-Lösung
und eine Lösung
aus 5% KOAc, 2 mM EDTA, 1 μg/ml
Ethidiumbromid-Lösung
werden hergestellt. 2,6 ml der 20%igen KOAc-Lösung werden zur hinteren Kammer
eines kleinen Gradientenerzeugers zugegeben. Luftblasen werden dadurch
vom Röhrchen
entfernt, das die beiden Kammern miteinander verbindet, dass man
die 20%ige Lösung
in die vordere Kammer fließen
lässt und
die Lösung
durch Kippen des Gradientenerzeugers zwingt, in die hintere Kammer
zurückzufließen. Der
Durchgang zwischen den Kammern wird geschlossen und 2,5 ml einer
5%igen Lösung
wird in die vordere Kammer zugegeben. Jegliche Flüssigkeit
im Röhrensystem
von einem vorherigen Lauf wird dadurch entfernt, dass man die 5%ige
Lösung
zum Ende des Röhrensystems
und dann in seine Kammer zurückkehren
lässt.
Der Apparat wird auf einen Rührer
gestellt und, bei schnellem Rühren,
werden der obere Hahn, der die beiden Kammern verbindet und der
vordere Stopphahn geöffnet.
Ein Polyallomer 5W55-Röhrchen
wird von Grund an mit der KOAc-Lösung
gefüllt.
Der Gradient wird mit 100 μl
einer cDNA-Lösung überschichtet
und für
3 Stunden bei 50 k rpm bei 22°C
zentrifugiert. Um Fraktionen des Gradienten zu sammeln, wird das
SW55-Röhrchen
nahe am Boden des Röhrchens
mit einem Butterfly-Infusionsset durchbohrt (mit entferntem Luer-Rädchen).
Drei 0,5 ml-Fraktionen
und anschließend
sechs 0,25 ml-Fraktionen werden in einem Mikrofugen-Röhrchen gesammelt (ungefähr 22, bzw.
11 Tropfen). Die Fraktionen werden durch Zugabe linearen Polyacrylamids
auf 20 μg/ml
und durch das Auffüllen
des Röhrchens
mit Ethanol bis zur Spitze präzipitiert.
Die Röhrchen
werden gekühlt,
in einer Mikrofuge für
3 Minuten zentrifugiert, gevortexed und wiederum für 1 Minute
zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets werden mit 70% Ethanol gespült und wiederum
zentrifugiert, wobei darauf geachtet wird, die Pellets nicht bis
zur Vollständigkeit
austrocknen zu lassen. Jede 0,25 ml Fraktion wird in 10 μl TE resuspendiert
und 1 μl
wird auf einem 1 %igen Agarose-Minigel analysiert. Die ersten drei
und die letzten sechs Fraktionen, die kein Material enthalten, das
kleiner als 1 kb ist, werden gesammelt.
-
9e. Vermehrung der Plasmide
-
SupF-Plasmide
werden in nicht-supprimierenden bakteriellen Wirtszellen selektiert,
die ein zweites Plasmid enthalten, p3, das Amber-mutiertes Ampicillin
und Resistentelemente des Wirkstoffs Tetracyclin enthält. Siehe
Seed, Nucleid Acids Res., 11, 2427–2445 (1983). Das p3-Plasmid
ist von RP1 abgeleitet, ist 57 kb lang, und ist ein stabil erhaltenes,
in einer einzelnen Kopie vorliegendes Episom. Die Ampicillin-Resistenz
dieses Plasmids kehrt sich bei einer hohen Rate um, so dass Amp-Plasmide
gewöhnlich
nicht in p3-enthaltenden Stämmen
eingesetzt werden können.
Die Selektion auf Tetracyclin-Resistenz allein ist beinahe genau
so gut wie die Selektion auf Ampicillin-Tetracylin-Resistenz. Wie
auch immer, spontanes Erscheinen von Mutationen chromosomaler Suppressor
tRNA stellt einen unvermeidbaren Hintergrund in diesem System dar
(Häufigkeit bei
etwa 10–9).
Kolonien, die aus spontanen Suppressormutationen entstehen, sind
gewöhnlich
größer als
Kolonien, die von Plasmidtransformationen ausgehend entstehen. Suppressorplasmide
werden in Luria Broth (LB) Medium selektiert, das 12,5 μg/ml Ampicillin
und 7,5 μg/ml
Tetracyclin enthält.
Für Plasmidpräparationen in
vergrößertem Maßstab wird
M9 Casamino-Aminosäure-Medium,
welches Glycerol (0,8%) enthält,
als Kohlenstoffquelle bereit gestellt. Die Bakterien wachsen bis
zur Sättigung.
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Alternativ
wird pSV SportTM (BRL, Gaithersberg, Maryland)
verwendet, um von SV40 abgeleitete Sequenzen zur Replikation, Transkription,
Initiierung und Terminierung in COS 7-Zellen bereit zu stellen, sowie solche
Sequenzen, die zur Replikation und Ampicillin-Resistenz in E. coli notwendig sind.
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9f. Isolation des Vektors
DNA/Plasmid
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Ein
Liter an gesättigten
bakteriellen Zellen wird in J6-Flaschen bei 4,2k rpm für 25 Minuten
abzentrifugiert. Die Zellen werden in 40 ml 10 mM EDTA, pH 8 resuspendiert.
80 ml 0,2M NaOH und 1 % SDS werden zugegeben und die Mischung wird
verwirbelt bis sie klar und viskos ist. 40 ml 5M KOAc, pH 4,7 (2,5M
KOAc, 2,5M HOAc) werden zugegeben, und die Mischung wird mäßig stark
geschüttelt,
bis die Größe der Klumpen ungefähr 2–3 mm beträgt. Die
Flasche wird bei 4,2k rpm für
5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wird durch ein Käsetuch
in eine 250 ml-Flaschen gegossen, welche dann mit Isopropylalkohol
aufgefüllt
und bei 4,2 k rpm für
5 Minuten zentrifugiert wird. Die Flasche wird sanft entwässert und
mit 70%igem Ethanol gespült,
wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht zerteilt wird.
Nach Umdrehen der Flasche und Entfernung der Spuren an Ethanol wird
die Mischung in 3,5 ml Tris-Base/EDTA (20 mM/10 mM) resuspendiert.
3,5 ml an resuspendiertem Pellet und 0,75 ml an 10 mg/ml Ethidiumbromid
werden zu 4,5 g CsCl zugesetzt. VTi80-Röhrchen werden mit der Lösung gefüllt und
für mindestens
2,5 Stunden bei 80k rpm zentrifugiert. Die Banden werden bei sichtbarem
Licht mit einer 1 ml Spritze und einer Nadel mit 20er-Nadelgröße oder
kleineren Nadeln extrahiert. Die Spitze des Röhrchens wird mit einer Schere
abgeschnitten und die Nadel wird aufwärts in das Röhrchen mit
einem Winkel von etwa 30 Grad in Bezug auf das Röhrchen bei einer Position von
etwa 3 mm neben der Bande eingeführt,
wobei die Nadel aufwärts
gerichtet ist. Nachdem die Bande entfernt ist, wird der Inhalt des
Röhrchens
in Bleiche gegeben. Die extrahierte Bande wird in einem 13 ml- Sarstedt-Röhrchen gelagert, das
danach bis zur Spitze mit n-Butanol aufgefüllt wird, das mit 1 M NaCl
Extrakt gesättigt
ist. Falls die Menge an DNA groß ist,
kann die Extraktionsprozedur wiederholt werden. Nach Absaugen des
Ethanols in eine Falle, die 5M NaOH enthält um Ethidium zu zerstören, wird
ein etwa gleiches Volumen an 1 M-Ammoniumazetat und ungefähr zwei
Volumina an 95%igem Ethanol zur DNA zugegeben, die dann bei 10k
rpm für
5 Minuten zentrifugiert wird. Das Pellet wird vorsichtig mit 70%
Ethanol gespült
und mit einem Tupfer oder Gefriertrockner getrocknet.
-
9g. Herstellung eines
Vektors zur Klonierung
-
20 μg des Vektors
werden in einer 200 μl
Reaktion mit 100 Einheiten an BstXl (New York Biolabs) bei 50°C über Nacht
in einem gut thermostatisierten, zirkulierenden Wasserbad geschnitten.
Kaliumazetat-Lösungen
(5 und 20%) werden im 5W55-Röhrchen
wie oben beschrieben hergestellt. 100 μl des verdauten Vektors werden
zu jedem Röhrchen
zugegeben und für
3 Stunden bei 50k rpm und bei 22°C
zentrifugiert. Unter 300 nm UV-Licht wird beobachtet, dass die gewünschte Bande
bei 2/3 der Länge
des Röhrchens
wandert. Ein Ausschweifen der Bande nach vorne deutet eine Überladung
des Gradienten an. Die Bande wird mit einer 1 ml-Spritze entfernt,
an die Nadel mit 20-er Nadelgröße befestigt
ist. Nach Zugabe linearem Polyacrylamids und Präzipitieren des Plasmids durch
Zugabe von drei Volumeneinheiten an Ethanol wird das Plasmid in
50 μl TE resuspendiert.
Probeligationen werden mit einer konstanten Menge an Vektor und
steigenden Mengen an cDNA durchgeführt. Ligationen in großem Maßstab werden
auf der Basis dieser Versuchslegationen durchgeführt. Gewöhnlich wird für die gesamte
cDNA-Präparation
1–2 μg an geschnittenem
Vektor benötigt. 9h.
Puffer
Ladepuffer: | 0.5M
LiCl; 10 mM Tris pH 7,5; 1 mM EDTA; 0.1% SDS. |
Mittlerer
Waschpuffer: | 0.15M
LiCl; 10 mM Tris pH 7,5; 1 mM EDTA; 0.1% SDS. |
RT1-Puffer: | 0.25M
Tris pH 8,8 (8,2 at 42); 0.25M KCl; 30 mM MgCl2. |
RT2-Puffer: | 0.1
M Tris pH 7,5; 25 mM MgCl2; 5M KCl; 0.25
mg/ml BSA; 50 mM Dithiothreitol (DTT). |
10X
Niedrigsalz: | 60
mM Tris pH 7,5; 60 mM MgCl2; 50 mM NaCl;
2,5 mg/ml BSA; 70 mM DME. |
10X
Ligationszusätze: | 1
mM ATP; 20 mM DTT; 1 mg/ml BSA 10 mM Spermidin. |
10X
Kinasierungs-Puffer: | 0.5M
Tris pH 7,5; 10 mM ATP; 20 mM DTT; 10 mM Spermidin; 1 mg/ml BSA
100 mM MgCl2. |
-
9i. Transfektion von cDNA,
die Liganden in COS 7-Zellen kodiert
-
COS
7-Zellen werden 1:5 auf 100 mm-Platten in Dulbecco's modifizierten Eagles-Medium
(DME)/10% fötalem
Kälberserum
(FCC) aufgeteilt und über
Nacht wachsen gelassen. 3 ml Tris/DME (0,039M Tris, pH 7,4 in DME),
die 400 μg/ml
DEAE-Dextran enthalten (Sigma, D-9885)
wird für
jede 100 mm-Platte an zu transfizierenden COS 7-Zelle hergestellt.
10 μg der
Plasmid-DNA-Präparation
werden pro Platte dazugegeben. Das Medium wird von den COS 7-Zellen
entfernt und die DNA/DEAE-Dextranmischung wird zugegeben. Die Zellen werden
für 4,5
Stunden inkubiert. Das Medium wird von den Zellen entfernt und durch
3 ml DME ersetzt, das 2% fötales
Kälberserum
(FCS) und 0,1 mM Chloroquin enthält.
Die Zellen werden für
1 Stunde inkubiert. Nach Entfernen des Chloroquins und Ersetzen
mit 1,5 ml 20% Glycerol in PBS, werden die Zellen bei Raumtemperatur
für 1 Minute
stehen gelassen. 3 ml Tris/DME werden zugegeben und die Mischung
wird abgesaugt und zweimal mit Tris/DME gewaschen. 10 DME/10% FCS
werden zugegeben und die Mischung wird über Nacht inkubiert. Die transfizierten
COS 7-Zellen werden 1:2 auf frische 100 mm-Platten (DME)/10% FCS
aufgeteilt und wachsen gelassen.
-
9i. Panning-Prozedur für COS 7-Zellen,
die einen Liganden exprimieren
-
1) Antikörper beschichtete
Platten:
-
Bakteriologische
100 mm-Platten werden für
1,5 Stunden mit anti-humaner plazentaler alkalischer Phosphatase
aus Kaninchen (Dako, Kalifornien) beschichtet, die 1:500 in 10 ml
50 mM Tris.HCl, pH 9,5 verdünnt
ist. Die Platten werden dreimal mit 0,15 M NaCl gewaschen und mit
3 mg BSA/ml PBS über
Nacht inkubiert. Die Blockerlösung
wird abgesaugt und die Platten werden sofort verwendet oder zur
späteren
Verwendung eingefroren.
-
2) Panning-Zellen
-
Das
Medium der transfizierten COS 7-Zellen wird abgesaugt und 3 ml PBS/0,5
mM ED-TA/0,02% Natriumazid
werden zugegeben. Die Platten werden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um
die Zellen abzulösen. Die
Zellen werden kräftig
mit einer Pasteur-Pipette zerrieben und in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt.
Die Platte wird mit weiteren 2 ml PBS/EDTA/Azid-Lösung gewaschen,
die dann zum Zentrifugenröhrchen hinzugegeben
wird. Nach Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten werden die Zellen
in 3 ml Aptaq-flk-1 (F-1AP21-4) oder flk-2 (F-2AP26-0) Überstand
von transfizierten NIH/3T3-Zellen
(siehe Beispiel 7.) resuspendiert, und für 1,5 Stunden auf Eis inkubiert.
Die Zellen werden wiederum bei 200 xg für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wird abgesaugt und die Zellen werden in 3 ml PBS/EDTA/Azid-Lösung resuspendiert.
Die Zellsuspension wird vorsichtig auf 3 ml PBS/EDTA/Azid/2% Ficoll
geschichtet und bei 200 xg für
4 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wird abgesaugt und die Zellen werden in 0,5 ml PB/EDTA/Azid-Lösung resuspendiert. Die
Zellen werden zu den mit Antikörper
beschichteten Platten, die 4 ml PBS/EDTA/Azid/5% FBS enthalten, zugegeben
und bei Raumtemperatur 1 bis 3 Stunden stehen gelassen. Nicht-haftende
Zellen werden durch zweimaliges oder dreimaliges sanftes Waschen
mit 3 ml PBS/5% FBS entfernt.
-
3) Hirt'scher Überstand
-
0,4
ml 0,6%iges SDS und 10 mM EDTA werden zu den gepannten Platten gegeben,
die 20 Minuten stehen gelassen werden. Die viskose Mischung wird
mit Hilfe einer Pipette in ein Mikrofugenröhrchen gegeben. 0,1 ml 5M NaCl
wird zum Röhrchen
zugegeben, gemischt und auf Eis für mindestens 5 Stunden abgekühlt. Das
Röhrchen
wird für
4 Minuten zentrifugiert, und der Überstand vorsichtig entfernt.
Der Inhalt des Röhrchens
wird mit Phenol einmal extrahiert, oder zweimal, wenn das erste
Interface nicht sauber ist. 10 mg linearen Polyacrylamids (oder
ein anderer Träger)
wird zugegeben und das Röhrchen
wird bis zur Spitze mit Ethanol aufgefüllt. Das erhaltene Präzipitat
wird in 0,1 ml Wasser oder TE resuspendiert. Nach Zugabe von 3 Volumina
an EtOH/NaOAc, werden die Zellen wieder präzipitiert und in 0,1 ml Wasser
oder TE resuspendiert. Die dadurch enthaltene cDNA wird in jeglichen
geeigneten E. coli Wirt mit Hilfe der Elektroporation transfiziert. Geeignete
Wirtszellen werden in verschiedenen Katalogen beschrieben und schließen MC1061/p3
oder Electromax DH10B-Zellen von BRL-Gibco mit ein. Die cDNA wird
durch konventionelle Verfahren extrahiert.
-
Die
oben aufgeführte
Panning-Prozedur wird so lange wiederholt bis ein reiner E. coli
Klon erhalten wird, der die cDNA als ein einziges rekombinantes
Plasmid beinhaltet, und fähig
ist, Säugetierzellen
zu transfizieren und einen positiven Panning-Assay zu erzielen.
Normal sind drei Wiederholungen ausreichend.
-
9k. Expressionsklonierung
von flk-1 oder flk-2 Liganden durch Etablierung einer autokrinen
Schleife
-
Zellen
die flk1/fms oder flk2/fms exprimieren (Beispiel 10) werden mit
20–30 μg einer cDNA-Bibliothek von entweder
flk1 Liganden oder flk2 Liganden exprimierenden stromalen Zellen
transfiziert. Die cDNA-Bibliothek wird wie oben beschrieben hergestellt
(a-h). Die Zellen werden mit 1 μg
pLTR neo cDNA kotransfiziert. Anschließend an auf die Transfektion
werden die Zellen 1:2 übergeimpft
und in 800 μg/ml
an G418 in Dulbecco's
Medium (DME) kultiviert, das mit 10% CS ergänzt ist. Ungefähr 12 Tage
später
werden die Zellkolonien übergeimpft
und auf Platten ausplattiert, die mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml) und
humanem Fibronectin (15 μg/ml) beschichtet
sind. Das Kulturmedium wird als Serum-freies Medium definiert, welches
eine Mischung (3:1) aus DME und Ham's F12 Medium ist. Die Zusätze zum
Medium sind 8 mM NaHCO3, 15 mM HEPES pH
7,4, 3 mM Histidin, 4 μM
MnCl2, 10 μM Ethanolamin, 0,1 μM Selensäure, 2 μM Hydrocortison,
5 μg/ml
Transferrin, 500 μg/ml
bovines Serum Albumin/Linolensäurekomplex,
und 20 μg/ml
Insulin (Ref. Zhan, X, et al. Oncogene 1: 369–376 (1987)). Die Kulturen
werden am nächsten
Tag wieder gefüttert
und jeden dritten Tag, bis ausschließlich die Zellen verbleiben,
die fähig
sind, unter den definierten Kulturbedingungen zu wachsen. Die verbleibenden
Zellkolonien werden expandiert und auf die Gegenwart des Liganden
durch einen Assay zur Bindung von APtag-flk1 oder APtag-flk2 an
die Zellen getestet (wie in Beispiel 8 beschrieben). Die DNA würde aus
den Zellen gewonnen werden, die die Anwesenheit von flk1 oder flk2
und der Sequenz zeigen.
-
Beispiel 10.
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Expression
der Liganden cDNA
-
Die
cDNA wird sequenziert und in einer geeigneten Wirtszelle, wie z.
B. einer Säugetierzelle,
vorzugsweise COS-, CHO- oder NIH/3T3-Zellen exprimiert. Die Anwesenheit
des Liganden wird dadurch bestätigt, dass
die Bindung des Liganden an APtag-flk2 Fusionsprotein (siehe oben)
gezeigt wird.
-
Beispiel 11.
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Chemisches
Crosslinking von Rezeptor und Ligand
-
Crosslinking-Experimente
werden an intakten Zellen unter Verwendung einer Modifikation des
Verfahrens durchgeführt,
das bei Blume-Jensen et al., EMBO J., 10, 4121–4128 (1991) beschrieben wurde.
Die Zellen werden in 100 mm Gewebekulturplatten bis zur Subkonfluenz
kultiviert und einmal mit PBS-0,1% BSA gewaschen.
-
Um
chemisches Crosslinking des löslichen
Rezeptors an den membrangebundenen Liganden zu untersuchen, werden
stromale Zellen der 2018 stromalen Zelllinie mit konditioniertem
Medium (CM) von transfizierten 3T3-Zellen inkubiert, die den löslichen
Rezeptor Flk2-APtag
exprimieren. Crosslinking-Studien von löslichen Liganden an den membrangebundenen
Rezeptor werden durch Inkubieren von konditioniertem Medium aus
2018 Zellen mit transfizierten 3T3-Zellen durchgeführt, die
ein Flk2-fms-Funsionskonstrukt exprimieren.
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Die
Bindung wird für
2 Stunden entweder bei Raumtemperatur mit CM, das 0,02% Natriumazid
enthält, um
einer Rezeptorinternalisierung vorzubeugen, oder bei 4°C mit CM
(und Puffern) ergänzt
mit Natriumvanadat, um eine Rezeptordephosphorylierung vorzubeugen.
Die Zellen werden zweimal mit PBS-0,1% BSA und viermal mit PBS gestoppt.
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Crosslinking
wird für
30 Minuten bei Raumtemperatur in PBS durchgeführt, das 250 mM Disuccinimidyl-Suberat
(DSS; Pierce) enthält.
Die Reaktion wird mit Tris-HCL, pH 7,4 auf eine finale Konzentration
von 50 mM gequenscht.
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Die
Zellen werden in Puffern, die die Löslichkeit erhöhen gelöst: 0,5%
Triton-X100TM, 0,5% Deoxycholinsäure, 20
mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMFS, 50 mg/ml Aprotinin,
2 mg/ml Bestatin, 2 mg/ml Pepstatin und 10 mg/ml Leupeptin. Die
lysierten Zellen werden umgehend in 1,5 ml Nalgen-Röhrchen überführt und
durch Rollen von Anfang bis Ende für 45 Minuten bei 4°C gelöst. Die
Lysate werden dann in einer Mikrofuge bei 14000 g für 10 Minuten
zentrifugiert. Die gelösten
gecrosslinkten Rezeptorkomplexe werden dann aus den Lysaten durch
Inkubieren der Überstände mit
10%iger (v/v) Lectin-SepharoseTM 6MB Beads
aus Weizenkeimen (Pharmacia) bei 4°C für 2 Stunden oder über Nacht
gewonnen.
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Die
Beads werden einmal mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) gewaschen und in
2X SDS-Polyacrylamid
nicht-reduzierendem Probenpuffer resuspendiert. Die gebundenen Komplexe
werden von den Beads durch 5-minütiges
Erhitzen bei 95°C
eluiert. Die Proben werden auf 4–12%igen Gradientengelen (NOVEX)
unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen (0,35 M
2-Mercaptoethanol) analysiert und anschließend auf PVDF-Membrane für 2 Stunden
durch die Verwendung einer Novex-Blotting-Apparatur überführt. Die Blotts
werden in TBS-3% BSA für
1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, gefolgt von einer Inkubation
mit einem geeigneten Antikörper.
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Gecrosslinkte
Flk2-APtag- und Flk2-fms-Rezeptoren werden durch die Verwendung
polyklonaler Antikörper
aus Kaninchen detektiert, die gegen humane alkalische Phosphatase
bzw. fms-Protein eingesetzt werden. Der Kern des Verfahrens wird
gemäß den im
ABC-Kit (Pierce) angegebenen Instruktionen ausgeführt. Der Kit
basiert auf der Verwendung eines biotinylierten sekundären Antikörpers und
eines Avidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidasekomplexes zur Detektion.
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ZUSÄTZLICHE
AUSFÜHRUNGSMÖGLICHKEITEN
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Die
Erfindungbefindet sich, so wie beansprucht, in Übereinstimmung mit der oben
aufgeführten
Beschreibung und den leicht verfügbaren
Referenzen und Startmaterialien. Nichts desto weniger haben die
Anmelder die unten aufgeführten
Zelllinien bei der American Type Culture Collection, Rockville,
Md., USA (ATCC) hinterlegt:
2018, ATCC Hinterlegungsnummer
CRL 10907, am 30. Oktober 1991 hinterlegt.
Fsp 62891, ATCC
Hinterlegungsnummer CRL 10935, am 21. November 1991 hinterlegt.
F.thy
62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10936, am 21. November 1991
hinterlegt.
FL 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 11005, am
2. April 1992 hinterlegt.
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Diese
Hinterlegungen wurden unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages
zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zum Zweck von Patentverfahren und den darunter fallenden Regelungen
gemacht (Budapester Vertrag). Diese sichern die Erhaltung einer
lebenden Kultur für
30 Jahre zu, ausgehend vom Datum der Hinterlegung. Die Organismen
werden von ATCC gemäß den Fristen
des Budapester Vertrages verfügbar
gemacht und unterliegen einer Übereinkunft
zwischen den Anmeldern und der ATCC, welche die uneingeschränkte Verfügbarkeit
nach Veröffentlichung
des zugehörigen
US-Patents gewährleistet..
Die Verfügbarkeit
der hinterlegten Stämme
ist nicht als eine Lizenz gedacht, um die Erfindung in Zuwiderhandlung
der unter der Autorität
einer jeden Regierung im Zusammenhang mit diesen Patentrechten erteilten
Rechten zu praktizieren. SEQUENZPROTOKOLL