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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beschichtung und/oder
Verkapselung von Oberflächen und
dreidimensionalen Objekten mit Netzwerken aus wasserlöslichen
Polymeren.
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Die
Mikroverkapselungstechnologie bietet der Medizin auf vielen Gebieten
große
Möglichkeiten.
Einige wichtige Anwendungen sind z.B. die Verkapselung von Zellen
für die
Behandlung des Diabetes (Lim, F., Sun, A.M., „Microencapsulated islets
as bioartificial endocrine pancreas", (1980) Science 210: 908–910), die Verkapselung
von Hämoglobin
für den
Ersatz von roten Blutzellen sowie die verzögerte Freisetzung von Arzneimitteln.
Beim Einsatz der Techniken nach dem bisherigen Stande der Technik
werden die Materialien, die verkapselt werden sollen, jedoch häufig Verarbeitungsbedingungen
ausgesetzt, einschließlich
von Wärme,
organischen Lösemitteln
und nicht-physiologischen pH-Werten, die Zellen abtöten oder
in ihrer Funktion beeinträchtigen
oder Proteine denaturieren können,
was zu einem Verlust der biologischen Aktivität führt. Weiterhin beschränken, selbst
wenn die Zellen die Verarbeitungsbedingungen überleben, die strengen Anforderungen, die
hinsichtlich der Biokompatibilität,
der chemischen Stabilität,
des Schutzes vor dem Immunsystem und der Widerstandsfähigkeit
gegen eine Überwachsung
durch die Zellen an die Verkapselungsmaterialien gestellt werden
müssen,
die Anwendbarkeit der Verfahren nach dem bisherigen Stand der Technik.
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Zum
Beispiel bietet das Verkapselungsverfahren, das auf der ionischen
Vernetzung von Alginat (einem Polyanion) mit Polylysin oder Polyornithin
(Polykationen) beruht (Goosen et al., (1985) Biotechnology and Bioengineering
27: 146), relativ milde Verkapselungsbedingungen, aber die langfristige
mechanische und chemische Stabilität derartiger ionisch vernetzter
Polymere erscheint zweifelhaft. Darüber hinaus können diese Polymere,
wenn sie in vivo implantiert werden, von den Zellen überwachsen
werden (McMahon et al., (1990) J. Nat. Cancer Inst. 82(22): 1761–1765),
was mit der Zeit die Durchlässigkeit
der Mikrokapsel für
Nährstoffe, Metaboliten
und Transportproteine aus der Umgebung einschränkt. Das hat zum Nährstoffmangel
und zum Absterben verkapselter Langerhansscher Inseln geführt (O'Shea, G. M. et al.
(1986) Diabetes, 35: 943–946).
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Es
besteht somit weiterhin ein Bedarf an einem relativ milden Verfahren
zur Zellverkapselung, das eine Steuerung der Eigenschaften des verkapselnden
Polymers ermöglicht
und in Gegenwart von Zellen zu Membranen führt, die selektiv bezüglich der
Permeabilität,
chemisch stabil und äußerst biokompatibel
sind. Ein ähnlicher
Bedarf besteht bezüglich
der Verkapselung biologischer Materialien, die keine Zellen und
Gewebe sind, sowie von Materialien, die mit biologischen Materialien
in Berührung
kommen.
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Materialien
werden als biokompatibel angesehen, wenn das Material entweder eine
reduzierte spezifische humorale oder zelluläre Immunantwort hervorruft,
oder wenn es keine unspezifische Reaktion auf einen Fremdkörper hervorruft,
die das Material daran hindert, die vorgesehene Funktion auszuüben, und
wenn das Material nach einer oralen Aufnahme oder nach einer Implantation
nicht toxisch ist. Das Material darf auch keine spezifische Reaktion,
wie eine Thrombose, hervorrufen, wenn es sich in Kontakt mit dem
Blut befindet.
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Von
Gelen, die aus Polymeren hergestellt wurden, die in Wasser unter
Bildung eines Hydrogels quellen, wie Poly(hydroxyethylmethacrylat)
(Poly(HEMA)), wasserunlöslichen
Polyacrylaten und Agarose, wurde gezeigt, dass sie für die Verkapselung
von Inseln und anderem tierischen Gewebe nützlich sind (Iwata et al., (1989)
Diabetes 38: 224–225;
Lamberti et al., (1984) Appl. Biochem. Biotech. 10: 101–105). Allerdings
haben diese Gele unerwünschte
mechanische Eigenschaften. Agarose bildet ein schwaches Gel, und
die Polyacrylate müssen
aus organischen Lösemitteln
gefällt
werden, die potenziell zytotoxisch sind. Dupuy et al. (1988) haben über die
Mikroverkapselung von Inseln durch die Polymerisation von Acrylamid
unter Bildung von Polyacrylamidgelen berichtet. Allerdings erfordert
der Polymerisationsprozess die Gegenwart toxischer Monomere wie
Acrylamid und von Quervernetzern, und sie erzeugt, wenn man sie
schnell vollständig
ablaufen lässt,
lokal Wärme.
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Mikrokapseln,
die durch die Koazervierung von Alginat und Poly-L-lysin gebildet
wurden, haben sich als immunprotektiv erwiesen, wie es beispielsweise
von O'Shea et al.,
1986, beschrieben wurde. Es wurde allerdings eine schwerwiegende
fibröse Überwachsung
dieser Mikrokapseln nach der Implantation beobachtet (McMahon et
al., 1990; O'Shea
et al., 1986). Die Verwendung von Poly(ethylenoxid) (PEO) zur Erhöhung der Biokompatibilität ist in
der Literatur gut dokumentiert. Es wurde berichtet, dass die Biokompatibilität von Mikrokapseln
aus Algin-poly(L-Lysin) durch die Einarbeitung eines Pfropfcopolymers
von PLL und PEO auf der Oberfläche
der Mikrokapsel beträchtlich
verbessert wurde (Sawhney et al., „Poly(ethylene oxide)-Graft-Poly-L-lysine)
Copolymers to Enhance the Biocompatibility of Poly-L-lysine)-Alginate Microcapsule
Membranes," (1991)
Biomaterials 13: 863–870).
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Die
PEO-Kette ist sehr gut wasserlöslich
und sehr flexibel. PEO-Ketten zeigen eine extrem hohe Beweglichkeit
in Wasser und haben eine im wesentlichen nicht-ionische Struktur.
Die Immobilisierung von PEO auf einer Oberfläche erfolgte im wesentlichen über die
Synthese von Pfropfcopolymeren mit PEO-Seitenketten (Sawhney et
al.; Miyama et al., 1988; Nagoaka et al.). Dieser Prozess beinhaltet
eine an die jeweilige Anwendung angepasste Synthese von Monomeren
und Polymeren. Die Verwendung von Pfropfcopolymeren garantiert jedoch
immer noch nicht, dass die Oberfläche, die von einem Makromolekül „gesehen" wird, ausschließlich aus
PEO besteht.
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Es
wurde eine Elektronenstrahlvernetzung zur Synthese von PEO-Hydrogelen
eingesetzt, von denen berichtet wurde, dass sie nicht thrombogen
sind (Sun et al., (1987) Polymer Prepr., 28: 292–294; Dennison, K. A., (1986)
Doktorarbeit, Massachusetts Institute of Technology). Die Verwendung
eines Elektronenstrahls schließt
es allerdings aus, irgendein lebendes Gewebe in das Polymer einzuschließen, da
die Strahlung zytotoxisch ist. Außerdem ist es wegen der durch
den Elektronenstrahl induzierten unspezifischen Vernetzung schwierig,
die mit diesem Verfahren erzeugten Netzwerke zu charakterisieren.
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Eine
Photopolymerisation von PEG-Diacrylaten über eine Initiation durch kurzwelliges
ultraviolettes Licht wurde dazu verwendet, Hefezellen für eine Fermentierung
und chemische Konvertierung einzuschließen (Kimura et al. (1981), „Some properties
of immobilized glycolysis system of yeast in fermentative phosphorylation
of nucleotides," Eur.
J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 11: 78–80; Omata et al. (1981), „Steroselectic
hydrolysis of dl-methyl succinate by gel-entrapped Rhodotorula minuta
uzr. texensis cells in organic solvent", Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.
11: 199–204;
Okada, T. et al., „Application
of Entrapped Growing Yeast Cells to Peptide Secretion System", Appl. Microbiol.
Biotechnol. 26: 112–116
(1987)). Andere Verfahren zur Verkapselung von Zellen in Materialien,
die mit kurzwelligem ultraviolettem Licht photopolymerisierbar sind,
wurden auf Mikroorganismen angewendet (Kimura et al, 1981; Omata
et al., 1981; Okada et al., 1987; Tanaka et al., 1977; Omata et
al., 1979a; Omata et al., 1979b; Chun et al., 1981; Fukui et al.,
1976; Fukui et al., 1984). Allerdings sind Hefezellen und einige
Bakterienzellen viel härter
und widerstandsfähiger
gegenüber
ungünstigen
Umgebungen, erhöhten
Temperaturen und kurzwelliger ultravioletter Strahlung als Säugetierzellen
und humane Gewebe.
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Das
US-Patent Nr. 4 298 002 betrifft ein synthetisches, hydrophiles,
Polymermaterial für
die Verkapselung von biologisch aktivem Gewebe. Das hydrophile Material
ist unlöslich
in Wasser, und das biologisch aktive Gewebe wird entweder in eine
vorgeformte Kammer aus dem polymeren Material injiziert oder im
polymeren Material verteilt, das anschließend polymerisiert wird.
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Mit
diesen Verfahren sind mehrere Probleme verbunden, zu denen der Einsatz
von Methoden und/oder Materialien gehört, die thrombogen oder instabil
in vivo sind oder die Polymerisationsbedingungen erfordern, die
dazu neigen, lebendes Säugetiergewebe
oder biologisch aktive Moleküle
zu zerstören,
beispielsweise kurzwellige ultraviolette Strahlung. Zur Verkapselung
von lebendem Gewebe für
eine Implantation in einen Menschen oder ein anderes Säugetier
dürfen
die Polymerisationsbedingungen das lebende Gewebe nicht zerstören, und
die resultierenden, mit dem Polymer beschichteten Zellen müssen biokompatibel
sein.
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Es
besteht auch ein Bedarf daran, Materialien im Inneren einer sehr
dünnen
Materialschicht zu verkapseln, die durchlässig für Nährstoffe und Gase ist, die
aber stabil und nicht immunogen ist. Zum Beispiel wurden in der
Vergangenheit für
die Transplantation von Langerhansschen Inseln die Inseln, die einen
Durchmesser von 100 bis 200 Mikrometer haben, in Mikrokügelchen
verkapselt, die einen Durchmesser von 400 bis 1000 Mikrometer haben.
Dieser große
Durchmesser kann zu einer verlangsamten Diffusion von Nährstoffmolekülen und
zu großen
Transplantationsvolumina führen.
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Es
besteht also, um das ganze zusammen zu fassen, ein Bedarf an Materialien
sowie Verfahren zu ihrer Verwendung, die zur Verkapselung von Zellen
und Geweben oder biologisch aktiven Molekülen verwendet werden können und
die biokompatibel sind, keine spezifischen oder unspezifischen Immunreaktionen
auslösen
und in Kontakt mit lebenden Zellen oder lebendem Gewebe polymerisiert
werden können,
ohne dass die Zellen geschädigt
oder abgetötet
werden, und zwar innerhalb eines sehr kurzen Zeitrahmens und in
Form einer sehr dünnen
Schicht. Ein wichtiger Aspekt bei der Verwendung dieser Materialien
in vivo besteht darin, dass sie innerhalb des Zeitrahmens eines
kurzen chirurgischen Eingriffes oder ehe sich das Material, das
verkapselt werden soll, auflöst,
beschädigt
wird oder abstirbt, polymerisiert werden können.
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Es
ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Polymermaterial
bereit zu stellen, das im Kontakt mit lebenden Zellen oder Geweben
polymerisiert werden kann, und zwar innerhalb eines sehr kurzen
Zeitraumes.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Polymermaterial
bereit zu stellen, das biokompatibel und widerstandsfähig gegenüber einem
Abbau über
einen bestimmten Zeitraum ist.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Polymermaterial
bereit zu stellen, das durchlässig
für Nährstoffe
und Gase ist und trotzdem Zellen und Gewebe vor einem Angriff durch
andere Zellen in vivo schützen
kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
wird hier ein Verfahren zur Polymerisation von Makromeren mittels
sichtbaren Lichtes oder mittels langwelligen ultravioletten Lichtes
(Iw UV-Licht, 320 nm oder darüber)
für die
direkte oder indirekte Verkapselung oder Beschichtung von lebendem
Gewebe mit polymeren Überzügen, die
sich an die Oberflächen
der Zellen der Gewebe oder deren Träger unter den Bedingungen einer
schnellen und milden Polymerisation anpassen, offenbart. Aspekte
der Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen 1, 2, 31, 32, 33 und 34
definiert. Die Polymere werden aus nicht-toxischen Präpolymeren,
die hier als Makromere bezeichnet werden, gebildet, die wasserlöslich oder
im wesentlich wasserlöslich
sind und zu groß,
als dass sie in die Zellen, die beschichtet werden sollen, diffundieren
könnten.
Beispiele für
die Makromere sind die sehr biokompatiblen PEG-Hydrogele, die schnell
in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff gebildet werden können, und
zwar ohne die Verwendung toxischer Polymerisationsinitiatoren, bei
Raumtemperatur oder physiologischen Temperaturen und bei physiologischem
pH. Die Polymerisation kann mittels nicht-toxischer Farbstoffe initiiert
werden, beispielsweise mit Methylenblau oder Eosin Y, die mit sichtbarem
Licht oder langwelligem UV-Licht
photopolymerisiert werden können.
Es können
auch andere Farbstoffe verwendet werden, die in die Zellen diffundieren,
aber nicht toxisch sind, wie Ethyleosin. Der Prozess ist nicht zytotoxisch,
da in Abwesenheit des geeigneten Chromophors nur wenig Licht von
den Zellen absorbiert wird. Die Zellen sind für dieses Licht im wesentlichen
transparent, im Gegensatz zu kurzwelligem UV-Licht, das von zellulären Proteinen
und Nukleinsäuren
stark absorbiert wird und zytotoxisch sein kann. Es reichen gewöhnlich für die meisten
Makromere niedrige Bestrahlungsintensitäten (5–500 mW) zur Induktion der
Polymerisation in einem Zeitraum von Millisekunden bis zu wenigen
Sekunden aus. Ein zweiter Grund für das Fehlen einer Zytotoxizität besteht
darin, dass die polymerisierbaren Spezies nicht in Zellen diffundieren.
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Die
resultierenden Polymere können
als semipermeable Membranen wirken, als Klebstoffe, als Gewebeträger, als
Stöpsel,
als Barrieren zur Veränderung
der Wechselwirkung einer Zelle oder eines Gewebes mit einer anderen
Zelle oder anderem Gewebe sowie als Träger für bioaktive Spezies. Es kann
eine große
Vielzahl von Oberflächen
mit unterschiedlichen Abmessungen mit einem dreidimensional vernetzten
Netzwerk aus diesen polymeren Materialien beschichtet werden. Die
Polymere können
als eine Matrix für
die Bereitstellung biologisch aktiver Materialien, zu denen Proteine,
Polysaccharide, organische Verbindungen mit Arzneimittelaktivität und Nukleinsäuren gehören, ausgebildet
werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Polymer zur Bildung einer Schicht auf der Innenseite des
Lumens eines Blutgefässes
verwendet, entweder für
die Bereitstellung einer Stützwirkung,
für eine
Verhinderung einer Thrombose oder Entzündungsreaktionen an der Oberfläche des
Lumens und/oder für
die Abgabe therapeutischer Mittel in das Blutgefäss. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
wird das Polymer dazu eingesetzt, eine semipermeable Sperre um Zellen
herum zu bilden, beispielsweise um Langerhanssche Inseln, um die
Zellen durch eine Verhinderung des Durchtretens von Immunglobulinmolekülen oder Zellen
zu schützen,
während
es den freien Durchtritt von Nährstoffen,
Gasen oder kleinen Zellprodukten ermöglicht. Derartige behandelte
Inseln können
für die
Behandlung von Krankheiten nützlich
sein, die aus Störungen
der metabolischen Verarbeitung resultieren, oder von Erkrankungen
wie Diabetes, die aus unzureichenden Konzentrationen biologischer
Regulatormoleküle
resultieren.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
ein Reaktionsschema für
eine durch Ethyleosin initiierte Polymerisation.
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2a ist
eine schematische Darstellung einer Farbstoff-initiierten Polymerisation
einer PEG-Schicht um Mikrokügelchen
aus vernetztem Alginat.
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2b ist
eine mikroskopische Aufnahme der Mikrokügelchen aus Alginat/Poly-L-lysin,
die menschliche Langerhanssche Inseln enthalten, die mittels des
in der 2A dargestellten Farbstoffbindungsverfahrens mit
einem Hydrogel aus PEG-18,5K-Tetraacrylat beschichtet wurden.
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3 ist
eine schematische Darstellung einer Photopolymerisation einer PEG-Beschichtung auf
in Mineralöl
suspendierten Mikrokügelchen
aus Alginat/Poly-L-lysin.
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4 ist
eine mikroskopische Aufnahme von Langerhansschen Inseln, die aus
einem menschlichen Pankreas isoliert und in einem Hydrogel aus PEG-18,5K-Tetraacrylat
verkapselt wurden.
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5 ist
eine schematische Darstellung der Coextrusionsapparatur, die für die Mikroverkapselung mittels
Laserpolymerisation verwendet wurde.
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6 ist
eine mikroskopische Aufnahme von Mikrokügelchen, die über eine
Laserpolymerisation von PEG-400-Diacrylat um Zellen herum erzeugt
wurden.
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7a ist
eine mikroskopische Aufnahme von Mikrokügelchen aus Alginat-PLL, die
4 Tage nach einer i.p.-Implantation in Mäuse wiedergewonnen wurden.
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7b ist
eine mikroskopische Aufnahme von Mikrokügelchen aus Alginat-PLL, die
mittels der in 1 dargestellten Farbstoffdiffusionsmethode
mit einem PEG-18,5K- Tetraacrylat
beschichtet wurden.
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8a–f ist jeweils
eine grafische Darstellung der Zellzahl in Abhängigkeit von der Gelzusammensetzung
für die
nicht angehafteten Zellen, die über
einer Lavage der Bauchfellhöhle
von Mäusen
erhalten wurden für
unterschiedlichen Zusammensetzungen eines PEO-Gels als Überzug:
a – 18,5
K; b – 10%
0,5 K, 90% 18,5 k; c – 50%
18,5 K, 50% 0,4 K; d – 10%
0,4 K, 90% 35 K; e – 50%
0,4 K, 50% 35 K; und f – Alginat-Poly-L-lysin (Kontrolle).
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9 ist eine grafische Darstellung des Proteinanteils
(in %), freigesetzt in Abhängigkeit
von der Zeit in Minuten, für
die Diffusion von Rinderserumalbumin (offene Quadrate), humanes
IgG (Dreiecke) und humanes Fibrinogen (ausgefüllte Quadrate) durch ein Gel
aus PEO-Tetraacrylat.
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10 ist
eine grafische Darstellung der Diffusion (in %) von Rinderserumalbumin
in Abhängigkeit
von der Zeit in Minuten durch Gele aus PEO-400-Diacrylat (offene
Quadrate) und PEG-18,5K-Tetraacrylat (Dreiecke).
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11a ist eine grafische Darstellung der Länge (in
mm) eines mittels einer Argonionenlaser-induzierten Polymerisation
unter Verwendung eines Initiationssystems aus einem Amin und Ethyleosin
aus Trimethylolpropan gebildeten Gels in Abhängigkeit vom Logarithmus der
Zeit (ms).
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11b ist eine mikroskopische Aufnahme der als Ergebnis
der Laserbestrahlung von ethoxyliertem Trimethylolpropantriacrylat
für Zeiträume von
67 ms, 125 ms, 250 ms, 500 ms und 1 s erzeugten Spikes.
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12a ist eine mikroskopische Aufnahme menschlicher
Vorhautfibroblasten, die 6 Stunden auf einem mit einem Gel aus PEG-Tetraacrylat
beschichteten Deckgläschen
kultiviert wurden.
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12b ist eine mikroskopische Aufnahme menschlicher
Vorhautfibroblasten, die 6 Stunden auf einem Glas, das nicht mit
PEG beschichtet war, kultiviert wurden.
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13 ist
eine mikroskopische Aufnahme von Gelen aus PEG-18,5K-Tetraacrylat,
die Mäusen
implantiert und nach 4 Tagen explantiert wurden und eine sehr geringe
fibröse Überwachsung
zeigen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Es
werden, wie hier beschrieben wird, biokompatible Polymermaterialien
für eine
Verwendung in direktem Kontakt mit biologisch aktiven Materialien
oder Zellen und Gewebe gebildet, und zwar über eine über freie Radikale verlaufende
Polymerisation biokompatibler, wasserlöslicher Makromere, die wenigstens
zwei polymerisierbare Substituenten aufweisen.
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Diese
polymeren Überzugsmaterialien
können
entweder Homopolymere, Copolymere oder Blockcopolymere sein. Ein
Polymer ist, so wie der Begriff hier verwendet wird, eine gebildete
Einheit, die einen Polymerisationsgrad von über 10 hat, und ein Oligomer
hat einen Polymerisationsgrad von 2 bis 10, wobei „Polymerisationsgrad" („degree
of polymerisation", „d.p.") die Zahl der sich
wiederholenden Einheiten in der Struktur bedeutet; z.B. bezieht
sich d.p. = 3 auf ein Trimer. Die Polymerisation einer Komponente,
die wenigstens zwei polymerisierbare Substituenten aufweist, entspricht
einer Gelbildung; die Polymerisation läuft unter Bildung eines dreidimensionalen
vernetzten Gels ab.
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Präpolymere(Makromere), die für die Herstellung
von Gelen nützlich
sind
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Die
generellen Kriterien für
Präpolymere
(die hier als Makromere bezeichnet werden), die in Kontakt mit biologischen
Materialien oder Zellen polymerisiert werden können, sind die folgenden: sie
sind wasserlöslich
oder im wesentlichen wasserlöslich,
sie können über eine
Polymerisation, die über
freie Radikale verläuft, weiter
polymerisiert oder vernetzt werden, sie sind nicht toxisch, und
sie sind zu groß,
als dass sie in Zellen diffundieren könnten, d.h. sie haben ein Molekulargewicht
von über
200. „Im
wesentlichen wasserlöslich" ist hier so definiert,
dass es löslich
in einer Mischung aus Wasser und einem organischen Lösemittel
oder organischen Lösemitteln
bedeutet, wobei Wasser den Hauptanteil der Mischung der Lösemittel
ausmacht.
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Die
Makromere, die hier verwendet werden, müssen mit Licht allein oder
in Gegenwart eines Initiators und/oder Katalysators, beispielsweise
eines Initiators einer freien Radikalreaktion, photopolymerisierbar
sein, wobei das Licht im sichtbaren Bereich oder im langwelligen
ultravioletten Bereich liegt, d.h. eine Wellenlänge gleich oder größer 320
nm hat. Es können
andere Reaktionsbedingungen zur Initiation der Polymerisation über freie
Radikale geeignet sein, sofern sie die Vitalität des lebenden Gewebes, das
verkapselt werden soll, nicht beeinträchtigen. Die Makromere dürfen auch
während
der Polymerisation keine Produkte oder Wärmemengen erzeugen, die für lebendes
Gewebe toxisch sind. Der Katalysator oder der Initiator der freien
Radikalreaktion darf unter den gewählten Bedingungen ebenfalls
nicht toxisch sein.
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Es
existiert eine große
Vielzahl im wesentlichen wasserlöslicher
Polymere, von denen einige schematisch unten dargestellt sind. (______)
repräsentiert
einen im wesentlichen wasserlöslichen
Bereich des Polymers und (=) repräsentiert eine über freie
Radikale polymerisierbare Spezies. Die folgenden Strukturen stellen Beispiele
dar:
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Beispiele
für A sind
PEG-Diacrylat aus einem PEG-Diol; für B ist es PEG-Triacrylat,
gebildet aus einem PEG-Triol; für
C ist es PEG-Cyclodextrintetraacrylat, gebildet durch das Pfropfen
von PEG auf einem zentralen Cyclodextrin-Ring und eine weitere Acrylierung;
für D ist
es PEG-Tetraacrylat, gebildet durch das Pfropfen von zwei PEG-Diolen
auf ein Bis-Epoxid und eine weitere Acrylierung; für E ist
es Hyaluronsäuremethacrylat,
gebildet durch das Acrylieren vieler Stellen einer Hyaluronsäurekette;
für F ist
es PEG-Hyaluronsäuremultiacrylat, gebildet
durch das Pfropfen von PEG auf Hyaluronsäure und weiteres Acrylieren;
für G ist
es ein ungesättigter Disäureester
von PEG, gebildet durch das Verestern eines PEG-Diols mit einer
ungesättigten
Disäure.
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Zu
Polysacchariden gehören
beispielsweise Alginat, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dextran,
Dextransulfat, Heparin, Heparinsulfat, Heparansulfat, Chitosan,
Gellangummi, Xanthangummi, Guargummi und κ-Carrageenan. Zu Proteinen gehören beispielsweise
Gelatine, Collagen, Elastin und Albumin, unabhängig davon, ob sie aus natürlichen
oder gentechnologischen Quellen stammen.
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Zu
photopolymerisierbaren Substituenten gehören vorzugsweise Acrylate,
Diacrylate, Oligoacrylate, Dimethacrylate oder Oligomethacrylate
sowie andere, biologisch annehmbare, photopolymerisierbare Gruppen.
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Synthetische polymere Makromere
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Das
wasserlösliche
Makromer kann aus wasserlöslichen
Polymeren abgeleitet sein, zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein,
Poly(ethylenoxid) (PEO), Poly(ethylenglycol) (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA),
Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(ethyloxazolin) (PEOX), Polyaminosäuren, Pseudopolyaminosäuren und
Polyethyloxazolin gehören,
sowie aus Copolymeren von diesen miteinander oder mit anderen wasserlöslichen
Polymeren oder wasserunlöslichen
Polymeren, mit der Maßgabe,
dass das Konjugat wasserlöslich
ist. Ein Beispiel für
ein wasserlösliches
Konjugat ist ein Blockcopolymer von Polyethylenglycol und Polypropylenoxid,
das im Handel als ein PluronicTM-Tensid
erhältlich
ist.
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Polysaccharid-Makromere
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Polysaccharide,
wie Alginat, Hyaluronsäure,
Chondroitinsulfat, Dextran, Dextransulfat, Heparin, Heparinsulfat,
Heparansulfat, Chitosan, Gellangummi, Xanthangummi, Guargummi, wasserlösliche Cellulosederivate
und Carrageenan, die über
eine Reaktion mit Hydroxygruppen oder Aminen auf den Polysacchariden
verknüpft
sind, können
ebenfalls zur Bildung der Makromerlösung verwendet werden.
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Protein-Makromere
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Proteine
wie Gelatine, Collagen, Elastin, Zein und Albumin, unabhängig davon,
ob sie aus natürlichen oder
gentechnologisch veränderten
Quellen stammen, wobei die Proteine über die Einführung von
Gruppen, die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppel- oder -Dreifachbindungen
enthalten, über
freie Radikale polymerisierbar gemacht werden, wobei zu diesen Gruppen
Acrylat, Diacrylat, Methacrylat, Ethacrylat, 2-Phenylacrylat, 2-Chloracrylat,
2-Bromacrylat, Itaconat, Oligoacrylat, Dimethacrylat, Oligomethacrylat,
Acrylamid, Methacrylamid, Styrolgruppen sowie andere, biologisch
annehmbare, photopolymerisierbare Gruppen gehören, können ebenfalls zur Bildung
der Makromerlösung
verwendet werden.
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Farbstoff-sensibilisierte
Polymerisation
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Die
Farbstoff-sensibilisierte Polymerisation ist in der chemischen Literatur
gut bekannt. Zum Beispiel dient Licht eines Argonionenlasers (514
nm), in Gegenwart eines Xanthin-Farbstoffes
und eines Elektronendonors wie Triethanolamin zur Katalyse der Initiation,
zur Induktion einer über
freie Radikale verlaufenden Polymerisation der Acrylgruppen in einer
Reaktionsmischung (Neckers et al., (1989) Polym. Materials Sci.
Eng. 60: 15; Fouassier et. al., (1991) Makromol. Chem. 192:245–260). Nach
dem Absorbieren des Laserlichtes wird der Farbstoff in einen Triplett-Zustand
angeregt. Der Triplett-Zustand reagiert mit einem tertiären Amin
wie Triethanolamin unter Bildung eines freien Radikals, das die
Polymerisationsreaktion initiiert. Die Polymerisation erfolgt extrem
schnell und hängt
von der Funktionalität
des Makromers und dessen Konzentration, von der Lichtintensität und den
Konzentrationen des Farbstoffes und des Amins ab.
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Photoinitiierende Farbstoffe
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Es
kann jeder beliebige Farbstoff verwendet werden, der Licht mit einer
Wellenlänge
zwischen 320 nm und 900 nm absorbiert, freie Radikale bilden kann,
wenigstens zum Teil wasserlöslich
ist und für
das biologische Material in der Konzentration, die für die Polymerisation
verwendet wird, nicht toxisch ist. Es gibt eine große Zahl
durch Licht anregbarer Farbstoffe, die für eine optische Initiation
der Polymerisation verwendet werden können, beispielsweise Ethyleosin,
Eosin Y, Fluorescein, 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon, 2-Methoxy-2-phenylacetoephenon,
Kampferchinon, Bengalrosa, Methylenblau, Erythrosin, Phloxim, Thionin,
Riboflavin, Methylengrün,
Acridinorange, Xanthin-Farbstoff und Thioxanthin-Farbstoffe.
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Der
bevorzugte Initiatorfarbstoff ist aufgrund seiner spektralen Eigenschaften
in wässriger
Lösung Ethyleosin
(Absorptionsmaximum = 528 nm, Extinktionskoeffizient = 1,1 × 105 M–1 cm–1,
Fluoreszenzmaximum = 547 nm, Quantenausbeute = 0,59). Ein Reaktionsschema
für die
Verwendung von Ethyleosin ist beispielhaft in der 1 gezeigt.
Der Farbstoff bleicht nach der Belichtung und der Reaktion mit einem
Amin zu einem farblosen Produkt aus, was ein weiteres Eindringen
des Strahls in das Reaktionssystem ermöglicht.
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Cokatalysator
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Die
Cokatalysatoren, die zusammen mit den photoinitiierenden Farbstoffen
nützlich
sind, sind auf Stickstoff basierende Verbindungen, die im Stande
sind, die freie Radikalreaktion zu stimulieren. Primäre, sekundäre, tertiäre oder
quaternäre
Amine sind geeignete Cokatalysatoren, wie auch beliebige andere
Moleküle, die
Stickstoffatome enthalten und elektronenreich sind. Zu Cokatalysatoren
gehören,
ohne aber auf sie beschränkt
zu sein, Triethanolamin, Triethylamin, Ethanolamin, N-Methyldiethanolamin,
N,N-Dimethylbenzylamin, Dibenzylamin, N-Benzylethanolamin, N-Isopropylbenzylamin,
Tetramethylethylendiamin, Kaliumpersulfat, Tetramethylethylendiamin,
Lysin, Ornithin, Histidin und Arginin.
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Beispiele
für Systeme
aus Farbstoff und Photoinitiator sind Ethyleosin mit einem Amin,
Eosin Y mit einem Amin, 2,2-Dimethoxy-2-phenoxyacetophenon, 2-Methoxy-2-phenoxyacetophenon,
Kampferchinon mit einem Amin und Bengalrosa mit einem Amin.
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In
bestimmten Fällen
kann der Farbstoff ohne irgend einen zusätzlichen Initiator, wie das
Amin, Licht absorbieren und die Polymerisation initiieren. In diesen
Fällen
brauchen nur der Farbstoff und das Makromer vorhanden zu sein, damit
die Polymerisation bei einer Exposition gegen Licht beginnt. Die
Erzeugung der freien Radikale hört
auf, wenn das Laserlicht entfernt wird. Einige Photoinitiatoren,
wie 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon, brauchen keinerlei unterstützendes
Amin für
die Induktion der Photopolymerisation; in diesen Fällen wird
nur die Anwesenheit des Farbstoffes, des Makromers und von Licht
geeigneter Wellenlänge
benötigt.
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Mittel zur Pelymerisation
-
Photopolymerisation
-
Zu
bevorzugten Lichtquellen gehören
verschiedene Lampen und Laser, wie diejenigen, die in den folgenden
Beispielen beschrieben werden, die eine Wellenlänge von ungefähr 320–800 nm,
am bevorzugtesten ungefähr
365 nm oder 514 nm, erzeugen.
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Dieses
Licht kann von jeder beliebigen geeigneten Quelle bereit gestellt
werden, die im Stande ist, die gewünschte Strahlung zu erzeugen,
beispielsweise einer Quecksilberlampe, einer Lampe für langwelliges UV-Licht,
einem He-Ne-Laser oder einem Argonionenlaser oder über die
Verwendung eines Lichtwellenleiters.
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Andere Mittel zur Polymerisation
-
Es
können
andere Mittel als Licht für
die Polymerisation eingesetzt werden. Beispiele sind die Initiation über thermische
Initiatoren, die freie Radikale bei mäßigen Temperaturen bilden,
wie Benzoylperoxid, mit oder ohne Triethanolamin, Kaliumpersulfat,
mit oder ohne Tetramethylethylendiamin, und Ammoniumpersulfat mit Natriumbisulfit.
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Inkorporation biologisch
aktiver Materialien
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Die
wasserlöslichen
Makromere können
um biologisch aktive Moleküle
herum polymerisiert werden, so dass ein Abgabesystem für die Moleküle gebildet
wird, oder sie können
um Zellen, Gewebe, subzelluläre Organellen
oder andere subzellulären
Komponenten herum polymerisiert werden, um das biologische Material zu
verkapseln. Die wasserlöslichen
Makromere können
auch so polymerisiert werden, dass sie biologisch aktive Moleküle inkorporiert
enthalten, so dass dem Polymer zusätzliche Eigenschaften verliehen
werden, wie eine Widerstandsfähigkeit
gegenüber
einem Wachstum von Bakterien oder eine Verminderung einer Entzündungsreaktion,
und auch zur Verkapselung von Geweben dienen. Es kann eine große Vielzahl
biologisch aktiver Materialien verkapselt oder inkorporiert werden,
zu denen Proteine, Peptide, Polysaccharide, organische oder anorganische
Arzneimittel, Nukleinsäuren,
Zucker, Zellen und Gewebe gehören.
-
Beispiele
für Zellen,
die verkapselt werden können,
sind Primärkulturen
sowie etablierte Zelllinien einschließlich transformierter Zellen.
Zu diesen gehören,
ohne aber auf sie beschränkt
zu sein, Inselzellen des Pankreas, menschliche Vorhautfibroblasten,
Chinese-Hamster-Ovary-Zellen,
Betazell-Insulome, Zellen der lymphoblastischen Leukämie, 3T3-Mausfibroblasten,
Dopamin-sekretierende Zellen des ventralen Mesencephalons, neuroblastoide
Zellen, Zellen des Nebennierenmarks und T-Zellen. Wie aus dieser
unvollständigen Liste
hervor geht, können
Zellen jedes Typs, einschließlich
dermaler und neuraler Zellen, Blutzellen, Zellen von Organen, Muskeln,
Drüsen
und des Immunsystems sowie von unterschiedlichen Spezies mittels
dieses Verfahrens erfolgreich verkapselt werden. Beispiele für Proteine,
die verkapselt werden können,
sind Hämoglobin, Enzyme
wie die Adenosindesaminase, Enzymsysteme, Blutgerinnungsfaktoren,
Inhibitoren oder Gerinnsel-auflösende
Mittel wie die Streptokinase und der Gewebe-Plasminogenaktivator,
Antigene für
eine Immunisierung, und es können
Hormone, Polysaccharide wie Heparin, Oligonukleotide wie Antisense-Nukleinsäuren, Bakterien
und andere mikrobielle Organismen, einschließlich von Viren, Vitamine,
Cofaktoren und Retroviren für
eine Gentherapie mittels dieser Techniken verkapselt werden.
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Das
biologische Material kann zunächst
in einer Struktur wie einem Polysaccharidgel eingeschlossen werden
(Lim, US-Patent Nr. 4 352 883; Lim, US-Patent Nr. 4 391 909; Lim,
US-Patent Nr. 4
409 331; Tsang et al., US-Patent Nr. 4 663 286; Goosen et al., US-Patent
Nr. 4 673 556; Goosen et al., US-Patent Nr. 4 689 293; Goosen et
al., US-Patent Nr. 4 806 355; Rha et al., US-Patent Nr. 4 744 933;
Rha et al., US-Patent Nr. 4 749 620). Solche Gele können einen
zusätzlichen
Schutz sowie eine sekundäre
Ebene einer Selektivität
hinsichtlich der Permeabilität
bereit stellen.
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Polymerisation
-
Die
Makromere werden vorzugsweise mit dem Initiator gemischt, zu dem
Material oder der Stelle, wo sie polymerisiert werden sollen, gegeben
und dem initiierenden Mittel, beispielsweise Licht oder Wärme, ausgesetzt.
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Bei
einem bevorzugten Verfahren wird ein photoinitiierendes System einer
wässrigen
Lösung
eines photopolymerisierbaren Makromers zugesetzt, um eine wässrige Mischung
zu erzeugen; es wird das biologisch aktive Material zugesetzt; und
die wässrige
Lösung
wird mit Licht bestrahlt. Das Makromer besteht vorzugsweise aus
einem wasserlöslichen
Polymer mit photopolymerisierbaren Substituenten. Eine Absorption von
Licht durch das System aus Farbstoff und Initiator führt zur
Bildung freier Radikale, die die Polymerisation initiieren.
-
Bei
einem zweiten bevorzugten Verfahren wird das Makromer auf die Oberfläche eines
dreidimensionalen Gegenstandes aufgetragen, der biologischen Ursprungs
sein kann oder der ein synthetischer Träger für eine Implantation in ein
Tier sein kann. Das wasserlösliche
Makromer wird mit einem photoinitiierenden System gemischt, um eine
wässrige
Mischung zu erzeugen; die Mischung wird auf eine Oberfläche aufgetragen, die
beschichtet werden soll, so dass eine beschichtete Oberfläche gebildet
wird; und die beschichtete Oberfläche wird mit Licht bestrahlt,
um die Polymerisation des Makromers zu initiieren.
-
Bei
einer Variante dieser Ausführungsform
kann der synthetische Träger
ein hydrophiles Mikrokügelchen,
eine Mikrokapsel oder ein Kügelchen
sein. Die hydrophilen Mikrokügelchen
werden mit der Lösung
eines wasserlöslichen
Makromers zusammen mit dem Photoinitiatorsystem unter Bildung einer
wässrigen
Mischung gemischt; die Mikrokügelchen
werden unter Rühren
mit dem Makromer in Öl
unter Bildung einer Ölsuspension gemischt,
und die Mikrokügelchen
werden mit Licht bestrahlt.
-
Bei
einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein lichtempfindlicher
Farbstoff an eine Gewebeoberfläche
adsorbiert, die behandelt werden soll, der nichtadsorbierte Farbstoff
wird durch Verdünnen
entfernt oder vom Gewebe abgespült,
die Makromerlösung
wird auf die Farbstoff-gekoppelte Oberfläche aufgetragen und die Polymerisation
wird initiiert, was zu einer Grenzflächenpolymerisation führt.
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Die
Polymerisation kann über
mindestens fünf
unterschiedliche Verfahren bewirkt werden, und zwar unter Einsatz
entweder einer Polymerisation der gesamten Masse oder einer Grenzflächenpolymerisation. Diese
Ausführungsformen
werden unten unter Bezugnahme auf spezifische Anwendungen des Materials
und der Verfahren zu ihrer Polymerisation weiter beschrieben.
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Massenpolymerisation
-
Bei
der Massenpolymerisation wird das Material, das beschichtet werden
soll, in Kontakt mit einer Lösung
des Makromers, des Photoinitiators und gegebenenfalls des Cokatalysators
gebracht, und dann wird die Polymerisation induziert, beispielsweise
durch eine Exposition gegen Strahlung. Es folgen drei Beispiele
für eine
Massenpolymerisation:
-
Verfahren einer
Massen-Suspensionspolymerisation zur Verkapselung von Materialien
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Das
biologische Material, das verkapselt werden soll, wird mit einer
wässrigen
Lösung
des Makromers, die das Makromer, den Cokatalysator und gegebenenfalls
einen Beschleuniger enthält,
sowie einem Initiator gemischt. Es werden kleine Strukturen von
globulärer
Form, wie Kügelchen
und Ovoide, oder Rechtecke gebildet, vorzugsweise entweder über eine
Coextrusion der wässrigen
Lösung
mit Luft oder einer nicht-mischbaren Substanz wie Öl, vorzugsweise
Mineralöl,
oder über
ein Rühren
der wässrigen
Phase in Kontakt mit einer nicht-mischbaren Phase, beispielsweise
einer Ölphase,
unter Bildung kleiner Tröpfchen.
Das Makromer in den globulären
Strukturen wird dann durch eine Exposition gegen Strahlung polymerisiert.
Dalton das Makromer und der Initiator auf die Kügelchen begrenzt sind, ist
die Struktur, die aus der Polymerisation resultiert, eine Kapsel,
in der das biologische Material eingeschlossen ist. Das ist eine „Suspensionspolymerisation", durch die der gesamte
wässrige
Anteil des Kügelchens
unter Ausbildung einer dicken Membran um das zelluläre Material
herum polymerisiert.
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Verfahren einer Mikrokapsel-Suspensionspolymerisation
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Bei
einer Variante des Massen-Suspensionsverfahrens wird mikroverkapseltes
Material als ein Kern verwendet, um den das Makromer in einer Suspensionspolymerisationsreaktion
polymerisiert wird. Das biologische Material wird zuerst im Inneren
eines Mikrokügelchens,
einer Mikrokapsel oder eines Mikroteilchens (die hier gemeinsam
als Mikrokapseln bezeichnet werden) verkapselt, beispielsweise in
Mikrokapseln aus Alginat. Die Mikrokapseln werden dann mit der Makromerlösung und
dem Initiator gemischt, und die Makromerlösung wird polymerisiert.
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Dieses
Verfahren ist besonders für
eine Verwendung mit PEG-Makromeren geeignet, wobei die extreme Hydrophilie
der PEG-Makromere ausgenützt
wird, und sie ist besonders gut für eine Verwendung mit Mikrokapseln
aus einem Hydrogel wie Alginat-Poly-L-lysin ausgelegt. Das Mikrokügelchen
wird in Wasser gequollen. Wenn eine Makromerlösung, die einen Katalysator
und/oder einen Initiator oder Beschleuniger enthält, in einem hydrophoben Medium,
beispielsweise in Mineralöl,
zu einer Phasentrennung gezwungen wird, dann bleibt die PEG-Makromerlösung bevorzugt
auf der hydrophilen Oberfläche
der Mikrokapsel aus Alginat. Wenn diese Suspension bestrahlt wird
durchläuft
das PEG-Makromer eine Polymerisation und Gelbildung, wobei sich
eine dünne
Schicht eines polymeren, wasserunlöslichen Gels um das Mikrokügelchen
ausbildet.
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Diese
Technik umfasst vorzugsweise die Coextrusion der Mikrokapsel in
einer Lösung
aus dem Makromer und dem Initiator, wobei die Lösung in Kontakt mit Luft oder
einer Flüssigkeit,
die nicht mit Wasser mischbar ist, vorliegt, so dass sich Tröpfchen bilden,
die in eine Lösung,
beispielsweise Mineralöl,
fallen, mit der die Tröpfchen
nicht mischbar sind. Die nicht-mischbare Flüssigkeit wird hinsichtlich
ihrer Fähigkeit,
die Tröpfchenbildung
aufrecht zu erhalten, ausgewählt.
Außerdem
sollte, wenn das membranverkapselte Material in ein Tier injiziert
oder diesem implantiert werden soll, jeder Rest nicht-toxisch und
nicht-immunogen sein. Mineralöl
ist eine bevorzugte nicht-mischbare Flüssigkeit. Sobald die Tröpfchen mit
der nichtmischbaren Flüssigkeit
in Kontakt gekommen sind, werden sie polymerisiert.
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Diese
Coextrusionstechnik führt
zu einer Beschichtung aus einem vernetzten Polymer mit einer Dicke von über 50 Mikrometer.
Alternativ können
die Mikrokapseln in einer Lösung
eines Makromers und eines Initiators suspendiert werden, die in
Kontakt mit einer nichtmischbaren Phase, wie einer Ölphase,
gerührt
wird. Die resultierende Emulsion wird unter Bildung eines Polymerüberzuges,
ebenfalls mit einer Dicke von über
50 Mikrometer, um die Mikrokapseln herum polymerisiert.
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Verfahren einer Massenpolymerisation
für die
Gewebeadhäsion
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Das
Polymermaterial kann auch für
die Anheftung von Gewebe verwendet werden. Es wird ein wasserlösliches,
polymerisierbares Makromer zusammen mit einem Photoinitiator auf
eine Gewebeoberfläche
aufgetragen, für
die eine Gewebsadhäsion
gewünscht
ist; die Gewebeoberfläche
wird mit dem Gewebe in Kontakt gebracht, an das eine Adhäsion gewünscht wird,
wodurch eine Gewebeverbindung erzeugt wird; und die Gewebeverbindung
wird mit Licht bestrahlt, bis die Makromere polymerisiert sind.
Bei der bevorzugten Ausführungsform
wird das innerhalb von Sekunden bis Minuten erreicht, am bevorzugtesten
innerhalb von Sekunden.
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Bei
der bevorzugten Ausführungsform
ist die Makromermischung eine wässrige
Lösung, wie
diejenige von PEG-400-Diacrylat oder PEG-18,5K-Tetraacrylat. Wenn
diese Lösung
mit Gewebe in Kontakt kommt, das eine feuchte Schicht aus Schleim
oder Flüssigkeit,
die es bedeckt, aufweist, dann vermischt sie sich mit der Feuchtigkeit
des Gewebes. Die Schleimschicht auf dem Gewebe enthält wasserlösliche Polysaccharide,
die in engem Kontakt mit Zelloberflächen stehen. Diese wiederum
sind reich an Glycoproteinen und Proteoglycanen. Somit sind eine
physikalische Vermischung und Kräfte
einer Oberflächendurchdringung
aufgrund einer Penetration in Spalten einige der Kräfte, die
für die
Adhäsion
des PEG-Gels an einer Gewebeoberfläche nach der Vernetzung verantwortlich
sind.
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Zu
spezifischen Anwendungen für
derartige Klebstoffe können
Anastomosen von Blutgefässen
gehören,
eine Wiederverbindung von weichem Gewebe, Verbände für Verbrennungen und eine Wiederbefestigung der
Netzhaut.
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Massenpolymerisation zur
Bildung von Gewebebarrieren
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Wenn
das PEG-Gel entfernt vom Gewebe polymerisiert wird, dann bietet
es Zellen und generell Gewebe eine ausgesprochen nicht-adhäsive Oberfläche, und
zwar aufgrund der äußerst hydrophilen
Natur des Materials.
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Dieses
Merkmal kann zur Ausbildung von Barrieren auf Geweben zur Verhinderung
der Anheftung von Zellen auf dem beschichteten Gewebe ausgenützt werden.
Beispiele für
diese Anwendung sind die Bildung von Barrieren auf Langerhansschen
Inseln oder auf dem Lumen von Blutgefässen zur Verhinderung einer Thrombose
oder von Gefäßspasmen
oder einer Kollabierung von Gefäßen; und
zwar unabhängig
davon, ob sie über
eine Massenpolymerisation (bei der der Initiator der Polymerisation
mit dem Makromer vermischt ist) oder über eine Grenzflächenpolymerisation
(bei der der Initiator an die Oberfläche adsorbiert ist) erfolgt.
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Grenzflächenpolymerisation
-
Für die Grenzflächenpolymerisation
wird der Initiator der Radikalreaktion an die Oberfläche des
Materials, das beschichtet werden soll, adsorbiert, der nicht-adsorbierte
Initiator wird durch Verdünnen
entfernt oder mittels einer Waschlösung oder durch die Anwendung
der Makromerlösung
abgespült,
und die Makromerlösung,
die gegebenenfalls einen Cokatalysator enthält, wird auf das Material aufgetragen,
das dann polymerisiert wird. Es folgen zwei Beispiele für eine Grenzflächenpolymerisation:
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Verfahren der Mikrokapsel-Grenzflächenpolymerisation
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Ein
biologisches Material kann, wie oben unter Bezugnahme auf eine Suspensionspolymerisation
beschrieben wurde, verkapselt werden, wobei jedoch eine Grenzflächenpolymerisation
zur Bildung der Membran auf der Oberfläche des biologischen Materials
oder der Mikrokapsel eingesetzt wird. Das beinhaltet das Beschichten
des biologischen Materials oder der Mikrokapsel mit dem Photoinitiator,
das Suspendieren des biologischen Materials oder der Mikrokapseln
in der Makromerlösung
und das sofortige Polymerisieren, beispielsweise durch Bestrahlung.
Es wird ein dünner
Polymerüberzug
von weniger als 50 μm
Dicke um die biologischen Materialien oder die Mikrokapseln herum
gebildet, da der Photoinitiator lediglich an der Oberfläche der Mikrokapsel
vorhanden ist und keine Zeit bekommt, weit in die Makromerlösung hinein
zu diffundieren.
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In
den meisten Fällen
dringt der Initiator, beispielsweise ein Farbstoff, neben der Adsorption
an die Oberfläche
auch in das Innere des biologischen Materials oder der Mikrokapsel
ein. Wenn die Makromerlösung,
die gegebenenfalls einen Cokatalysator wie Triethanolamin enthält, auf
die Oberfläche
aufgetragen und einem Initiationsmittel wie Laserlicht ausgesetzt
wird, sind alle essentiellen Komponenten der Reaktion nur an oder
knapp innerhalb der Grenzfläche
zwischen dem biologischen Material oder der Mikrokapsel und der
Makromerlösung
vorhanden. Somit erfolgen die Polymerisation und die Gelbildung
(wenn ein multifunktionelles Makromer verwendet wird), die typischerweise
innerhalb von ungefähr
100 ms erfolgt, zunächst
lediglich an der Grenzfläche,
knapp unterhalb von ihr und knapp jenseits von ihr. Wenn man längere Zeiträume zulässt, dann
beginnt der Initiator, aus dem inneren Kern des Mikrokügelchens
in die Lösung
zu diffundieren. Ganz ähnlich
beginnen die Makromere, in das Innere des Kerns zu diffundieren,
und es wird eine dickere Schicht des Polymers gebildet.
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Direktes Verfahren der Grenzflächenpolymerisation
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Grenzflächenpolymerisation
zur Bildung einer Membran direkt auf der Oberfläche von Geweben. Das Gewebe
wird direkt mit dem Initiator beschichtet, überschüssiger Initiator wird entfernt,
und die Makromerlösung
wird auf das Gewebe aufgetragen und polymerisiert.
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Steuerung der Permeabilität des Pelymere
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Die
Permeabilität
der Beschichtung wird zum Teil vom Molekulargewicht und der Vernetzung
des Polymers bestimmt. Zum Beispiel hat im Falle kurzer PEG-Ketten
zwischen den Vernetzungen die erzeugte „Pore" im Netzwerk relativ starre Grenzen
und ist relativ klein, so dass ein Makromolekül, das versucht, durch dieses
Gel zu diffundieren, in erster Linie durch einen Siebeffekt behindert
wird. Wenn die Kettenlänge
zwischen den Vernetzungen lang ist, dann kann sich die Kette falten
und mit hoher Beweglichkeit umher bewegen, so dass sich diffundierende
Makromoleküle
sowohl einer Volumenausschlusswirkung als auch einem Siebeffekt gegenüber sehen.
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Aufgrund
dieser beiden unterschiedlichen Wirkungen lässt sich eine direkte Beziehung
zwischen der Ausschlussgrenze des Molekulargewichts bezüglich der
Diffusion und dem Molekulargewicht des Ausgangsoligomers nicht vollständig definieren.
Trotzdem kann ein gewünschtes
Freisetzungsprofil für
ein bestimmtes Protein oder ein Arzneimittel, wie ein Peptid, über eine
Einstellung der Vernetzungsdichte und der Länge der PEG-Segmente erzielt
werden. Dementsprechend kann ein gewünschtes Profil der Proteinpermeabilität entworfen
werden, um die Diffusion von Nährstoffen,
Sauerstoff, Kohlendioxid, Abfallprodukten, Hormonen, Wachstumsfaktoren,
Transportproteinen und sekretierten, in der Zelle synthetisierten
Produkten, wie Proteinen, zu gewährleisten
und gleichzeitig die Diffusion von Immunmodulatoren, wie Antikörpern und
Komplementproteinen, sowie das Eintreten von Zellen in das Gel im
Inneren des Gels zu begrenzen, um die transplantierten Zellen oder
das transplantierte Gewebe zu schützen. Das dreidimensional vernetzte,
kovalent verknüpfte
polymere Netzwerk ist bei langfristigen In-vivo-Anwendungen stabil.
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Für eine Verkapselung
von Zellen und Gewebe auf eine Weise, die den Durchtritt von Antikörpern durch
die Membran verhindert, aber den Durchtritt von Nährstoffen,
die für
den Zellmetabolismus essentiell sind, ermöglicht, liegt die bevorzugte
Ausgangsgröße des Monomers
im Bereich zwischen 10 000 Dalton und 18 500 Dalton, wobei die bevorzugteste
Größe bei ungefähr 18 500
Dalton liegt. Kleinere Makromere führen zu Polymermembranen höherer Dichte
mit kleineren Poren.
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Dicke und Konformation
der Polymerschicht
-
Die
Membrandicke beeinflusst verschiedene Parameter, einschließlich der
Selektivität
bezüglich
der Permeabilität,
der Steifheit und der Größe der Membran.
Die Dicke kann über
die Auswahl der Reaktionskomponenten und/oder der Reaktionsbedingungen
variiert werden. Beispielsweise kann die Makromerkonzentration von
wenigen Prozent bis zu 100% variiert werden, und zwar in Abhängigkeit
vom Makromer. Ähnlich
führen
intensivere Belichtungen und längere
Belichtungen zu dickeren Filmen, als es weniger intensive oder kürzere Belichtungen
tun. Es können
auch Beschleuniger in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt
werden, um die Dicke zu steuern. Zum Beispiel kann N-Vinylpyrrolidinon
als Beschleuniger zugesetzt werden, wobei höhere Konzentrationen zu dickeren
Schichten führen
als niedrigere Konzentrationen, wenn alle anderen Bedingungen gleich
bleiben. Die Konzentrationen von N-Vinylpyrrolidinon können, um
ein Beispiel zu nennen, im Bereich von 0 bis 0,5% liegen.
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Beim
Verfahren der Grenzflächenpolymerisaton
kann die Dauer der Polymerisation variiert werden, um die Dicke
der gebildeten Polymermembran einzustellen. Diese Korrelation zwischen
der Membrandicke und der Dauer der Bestrahlung besteht, weil der
Photoinitiator mit konstanter Geschwindigkeit diffundiert, wobei
die Diffusion ein kontinuierlich ablaufender Prozess ist. Je länger demnach
die Bestrahlung dauert, desto mehr Photoinitiator initiiert die
Polymerisation in der Makromermischung, desto mehr Makromer polymerisiert und
desto dicker wird die resultierende Membran. Weitere Faktoren, die
die Membrandicke beeinflussen, sind die Zahl der reaktiven Gruppen
pro Makromer und die Konzentration an Beschleunigern in der Makromerlösung. Diese
Technik ermöglicht
die Erzeugung sehr dünner
Membranen, da der Photoinitiator zuerst in einer sehr dünnen Schicht
auf der Oberfläche
des biologischen Materials vorliegt und die Polymerisation nur dort erfolgt,
wo der Photoinitiator vorhanden ist.
-
Beim
Verfahren der Suspensionspolymerisation wird eine etwas dickere
Membran gebildet als mit dem Verfahren der Grenzflächenpolymerisation,
da beim Suspensionsverfahren die Polymerisation in der gesamten
Makromerlösung
erfolgt. Die Dicke der mittels des Suspensionsverfahrens erzeugten
Membranen wird zum Teil durch die Viskosität der Makromerlösung, die
Konzentration des Makromers in dieser Lösung, die fluide mechanische
Umgebung der Suspension sowie oberflächenaktive Agenzien in der
Suspension bestimmt. Diese Membranen variieren in ihrer Dicke zwischen
50 und 300 Mikrometer.
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Nicht-biologische Oberflächen
-
Die
Makromerlösung
und der Initiator können
auch auf eine nicht-biologische Oberfläche aufgetragen werden, die
in Kontakt mit einer biologischen Umgebung gebracht werden soll.
Zu derartigen Oberflächen
gehören
beispielsweise Gefäßtransplantate,
Kontaktlinsen, im Auge befindliche Linsen, Ultrafiltrationsmembranen
und Behälter
für biologische
Materialien.
-
Es
ist im allgemeinen schwierig, eine gute Adhäsion zwischen Polymeren mit
stark unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften zu erzielen.
Das Konzept einer Oberfläche
aus einem sich physikalisch interpenetierenden Netzwerk wurde von
Desai und Hubbel (N.P. Desai et al. (1992)) vorgelegt. Dieser Ansatz zur
Inkorporation einer vollständigen
Beschichtung aus einem Polymer in die Oberfläche eines anderen Polymers
mit deutlich anderen Eigenschaften beinhaltete das Quellen der Oberfläche des
Polymers, das modifiziert werden sollte (Basispolymer), in einem
gemeinsamen Lösemittel
oder einem Quelllösemittel
für das
Basispolymer und für
das Polymer, das inkorporiert werden sollte (eindringendes Polymer).
Das eindringende Polymer diffundierte in die Oberfläche des
Basispolymers. Diese Grenzfläche
wurde über
ein schnelles Ausfällen oder
eine Entquellung der Oberfläche
durch das Transferieren des Basispolymers in ein Bad aus einem Nicht-Lösemittel
stabilisiert. Das führte
zu einem Festhalten des eingedrungenen Polymers in der Matrix des Basispolymers
an dessen Oberfläche
in Form einer Struktur, die eine Oberfläche aus einem sich physikalisch interpenetierenden
Netzwerk genannt wurde.
-
Dieser
Ansatz kann durch das Photopolymerisieren des eindringenden Polymers
auf der Oberfläche des
Basispolymers im gequollenen Zustand weiter verbessert werden. Das
führt zu
einer Stabilität,
die gegenüber
derjenigen des vorhergehenden Ansatzes stark verbessert ist, und
zur Verbesserung der biologischen Reaktionen auf diese Materialien.
Das eindringende Agens kann chemisch so modifiziert sein, dass er
ein Präpolymer-Makromer
ist, d.h. im Stande ist, selbst polymerisiert zu werden. Diese Polymerisation
kann thermisch oder durch eine Exposition gegen sichtbares oder
ultraviolettes Licht oder Infrarotlicht, gegen Gammastrahlen oder
durch Bestrahlung mit einem Elektronenstrahl oder eine Exposition
gegen Plasmabedingungen initiiert werden. Im Falle der relativ unspezifischen
Reaktion auf Gammastrahlen oder eine Bestrahlung mit einem Elektronenstrahl
kann es sein, dass eine chemische Inkorporation besonders reaktiver
Stellen nicht erforderlich ist.
-
Polyethylenglycol
(PEG) ist ein besonders nützliches
eindringendes Polymer für
biomedizinische Anwendungen, bei denen das Fehlen einer Zelladhäsion gewünscht ist.
Die früheren
Arbeiten hatten ein optimales Funktionieren bei einem Molekulargewicht
von 18 500 Dalton, ohne eine chemische Vernetzung, gezeigt. PEG-Präpolymere
können
leicht durch eine Acrylierung der Hydroxygruppen an ihren Enden
oder an anderer Stelle innerhalb der Kette gebildet werden. Diese
Präpolymere
können
leicht polymerisiert werden. Eine photoinitiierte Polymerisation
dieser Präpolymere
ist besonders bequem und schnell. Es gibt verschiedene, durch sichtbares
Licht initiierte und durch ultraviolettes Licht initiierte Reaktionen,
die über
die Absorption von Licht durch spezifisch photochemisch reaktive
Farbstoffe initiiert werden. Der gleiche Ansatz kann für andere
wasserlösliche
Polymere eingesetzt werden, beispielsweise Poly(N-vinylpyrrolidinon),
Poly(N-isopropylacrylamid), Poly(ethyloxazolin) und viele andere.
-
Verfahren zur Herstellung
von Polymermaterialien
-
Polymere
Objekte werden mittels Standardverfahren, die Fachleuten auf diesem
Gebiet bekannt sind, in eine gewünschte
Form gebracht, wobei die Makromerlösung, die vorzugsweise einen
Katalysator und einen Initiator enthält, geformt und dann polymerisiert
wird. Zum Beispiel können
Platten über
das Giessen auf eine flache Oberfläche geformt werden, und runde
Scheiben können über das
Giessen in Behälter
mit der Form runder Scheiben erhalten werden. Zylinder und Röhren können über eine
Extrusion gebildet werden. Kugeln können mittels Emulsionsöl, über eine
Coextrusion mit Öl
oder über
eine Coextrusion mit Luft, einem anderen Gas oder mit Dampf gebildet
werden. Das Makromer wird dann Bedingungen zur Initiation der Polymerisation, wie
einer Bestrahlung mit Licht, ausgesetzt. Eine derartige Bestrahlung
kann anschließend
an die Formgebungsschritte oder, wenn es gewünscht wird, gleichzeitig mit
ihnen erfolgen.
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Das
Makromer kann auch unter Bezugnahme auf eine interne oder externe
Stützstruktur
ausgeformt werden. Zu internen Stützstrukturen gehören siebartige
Netzwerke aus stabilen oder abbaubaren Polymeren oder nicht-toxischen
Metallen. Zu externen Strukturen gehört beispielsweise das Giessen
des Gels in das Innere eines Zylinders, so dass die innere Oberfläche des
Zylinders mit dem Gel, das die biologischen Materialien enthält, ausgekleidet
ist.
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Verfahren zur Oberflächenbeschichtung
-
Diese
Materialien können
für die
Behandlung makrokapsulärer
Oberflächen
eingesetzt werden, beispielsweise derjenigen, die für eine Ultrafiltration,
Hämodialyse
und eine nichtmikroverkapselte Immunisolierung von tierischem Gewebe
verwendet werden. Die Mikrokapsel ist in diesem Falle üblicherweise
mikroporös, mit
einem Ausschlussmolekulargewicht von unter 70 000 Dalton. Sie kann
in Form einer Hohlfaser, eines spiralförmigen Bauteils, eines flachen
Bogens oder in einer anderen Konfiguration vorliegen. Die Oberfläche einer derartigen
Mikrokapsel kann mittels eines Polymers wie PEG modifiziert werden,
um eine nichtverderbliche, nicht-thrombogene und nicht-zelladhäsive Oberfläche zu erzeugen.
Die Beschichtung dient zur Verbesserung der Biokompatibilität und zur
Bereitstellung einer zusätzlichen
Immunprotektion. Zu Materialien, die auf diese Weise modifiziert
werden können,
gehören
Polysulfone, Zellulosemembranen, Polycarbonate, Polyamide, Polyimide,
Polybenzimidazole, Nylons, Poly(acrylnitril-co-vinylchlorid)-Copolymere,
Polyurethane, Polystyrol, Poly(styrol-co-acrylnitrile), Poly(vinylchlorid)
und Poly(ethylenterephthalat).
-
Es
können
verschiedene Verfahren zur Bildung biokompatibler Überzüge eingesetzt
werden, und zwar in Abhängigkeit
von der physikalischen und der chemischen Natur der Oberfläche. Hydrophile
Oberflächen können durch
das Auftragen einer dünnen
Schicht (von z.B. 50 bis 300 Mikrometer Dicke) aus einer polymerisierbaren
Lösung,
wie von PEG-Diacrylat, die geeignete Mengen an Farbstoff und Amin
enthält,
beschichtet werden. Hydrophobe Oberflächen können zuerst durch die Behandlung
mittels einer Gasplasmaentladung hydrophil gemacht werden, und die
resultierende Oberfläche
kann dann ganz ähnlich
beschichtet werden, oder sie können
ganz einfach vor oder während
der Behandlung mit der PEG-Diacrylatlösung mit
einem Tensid behandelt werden. Zum Beispiel könnte eine hydrophobe Polystyroloberfläche zuerst
mittels einer Exposition gegen ein O2-Plasma
oder ein N2-Plasma behandelt werden. Das
führt dazu,
dass die Oberfläche
durch die Erzeugung sauerstoffhaltiger bzw. stickstoffhaltiger Oberflächenspezies
hydrophiler gemacht wird. Diese Spezies könnten weiter durch das Umsetzen
mit einer Substanz wie Acryloylchlorid behandelt werden, die im
Stande ist, oberflächlich
gebundene, gegenüber
freien Radikalen empfindliche Spezies zu erzeugen. Alternativ könnte eine
hydrophobe Polystyroloberfläche
zuerst mit einem Tensid behandelt werden, wie einem Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Blockcopolymer,
das anschließend
acryliert werden könnte,
wenn es gewünscht
wird. Derartige Behandlungen würden
zu einer verbesserten Adhäsion
zwischen den hydrophilen Überzugsschichten
und dem hydrophoben Material, das behandelt wird, führen.
-
Behandlung von texturierten
Materialien und Hydrogelen
-
Die
Oberfläche
von Materialien, die ein gewisses Ausmaß an Oberflächentextur zeigen, wie gewebtes Dacron,
Dacronvelour und expandierte Poly(tetrafluorethylen)-Membranen (ePTFE-Membranen),
kann mit dem Hydrogel behandelt werden. Texturierte und makroporöse Oberflächen ermöglichen
eine stärkere
Adhäsion
des PEG-Gels an die Oberfläche
des Materials, was die Beschichtung relativ hydrophober Materialien, wie
PTFE und Poly(ethylenterephthalat) (PET), ermöglicht.
-
Implantierbare
Materialien, wie enzymatische oder ionensensitive Elektroden, die
ein Hydrogel (beispielsweise Poly(HEMA), vernetzten Poly(vinylalkohol)
und Poly(vinylpyrrolidinon)) auf ihrer Oberfläche tragen, werden mit dem
stärker
biokompatiblen PEO-Gel auf eine Weise beschichtet, die der Technik
der Farbstoffadsorption und Polymerisation ähnlich ist, die für die Mikrokügelchen
aus Alginat-PLL in den folgenden Beispielen eingesetzt wird.
-
Behandlung dichter
Materialien
-
Gelbeschichtungen
können
auf die Oberflächen
dichter (z.B. nicht-texturierter, nichtgelförmiger) Materialien, wie von
Polymeren, einschließlich
von PET, PTFE, Polycarbonaten, Polyamiden, Polysulfonen, Polyurethanen,
Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Glas und Keramik, aufgetragen
werden. Hydrophobe Oberflächen
werden zunächst
mittels einer Gasplasmaentladung oder mit einem Tensid behandelt,
um die Oberfläche
hydrophil zu machen. Das stellt eine bessere Adhäsion der Gelbeschichtung an
die Oberfläche
sicher. Alternativ können
Kopplungsagenzien zur Erhöhung
der Adhäsion
verbessert werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Polymersynthese
und der Oberflächenmodifizierung
ohne weiteres klar sein dürfte.
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Dünne, oberflächlich polymerisierte Beschichtungen
in Blutgefässen
und auf anderen Geweben
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Die
oben beschriebene Methodik kann auch dazu verwendet werden, sehr
dünne Filme
aus nicht-abbaubaren Polymerbeschichtungen auf Blutgefässen zu
photopolymerisieren, um die Wechselwirkung von Blutplättchen mit
der Gefäßwand zu
verändern
und um Therapeutika, wie Enzyme und andere Proteine, Polysaccharide
wie Hyaluronsäure,
Nukleinsäuren
wie Antisense-Nukleinsäuren
und Ribozyme sowie andere organische und anorganische Arzneimittel,
mittels der oben beschriebenen Verfahren zuzuführen.
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Die
unmittelbare Wirkung der Polymerisation des Polymers im Inneren
von Blutgefässen
ist die Verminderung der Thrombogenität der Oberfläche eines
verletzten Blutgefässes.
Das lässt
sich gut zur Verbesserung der Ergebnisse der Ballon-Angioplastie über eine
Verminderung der Thrombogenität
des Gefäßes und eine
Verminderung der Häufigkeit
von Schäden,
die durch die Ballon-Dilatation erzeugt werden, einsetzen. Eine
weitere Wirkung dieser Modifikation kann eine Verminderung einer
Hyperplasie von glatten Muskelzellen sein. Das wird aus zwei Gründen erwartet.
Erstens enthalten Blutplättchen
einen potenten Wachstumsfaktor, den Platelet-Derived Growth Factor
(PDGF), von dem angenommen wird, dass er in die Hyperplasie nach
einer Angioplastie verwickelt ist. Die Unterbrechung der Zufuhr
von PDGF stellt selbst einen pharmakologischen Eingriff dar, und
zwar insofern als ein „Wirkstoff", der durch die Blutplättchen zugeführt worden
wäre, daran gehindert
wird, zugeführt
zu werden. Eine Thrombose führt
zur Erzeugung von Thrombin, das ein bekanntes Mitogen für glatte
Muskelzellen ist. Die Unterbrechung der Bildung von Thrombin und
seiner Zufuhr zur Gefäßwand stellt
ebenfalls einen pharmakologischen Eingriff dar. Außerdem liegen
weitere Wachstumsfaktoren im Plasma gelöst vor, von denen bekannt ist,
dass sie Mitogene für
glatte Muskelzellen sind. Die Gelschicht stellt eine bezüglich der
Permeabilität
selektive Barriere auf der Oberfläche des Gewebes dar, und somit
wird von der Gelschicht erwartet, dass sie eine Hyperplasie nach
einer Angioplastie vermindert. Weiterhin kann das Gel durch einen
Schutz des Gefäßes vor
einer Exposition gegen Vasokonstriktoren wie Thrombin Vasospasmen vermindern,
und es kann die Häufigkeit
eines erneuten akuten Verschlusses vermindern.
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Die
Beschränkung
der Polymerisation auf eine Grenzfläche ist ein sehr wichtiger
Vorteil. Durch Krankheiten induzierte Schäden im Inneren eines Blutgefässes haben
eine äußerst unregelmäßige Form.
Deshalb ist es sehr schwierig, ein vorgeformtes Objekt wie einen
Ballon zur Herstellung einer Form zu verwenden, die das polymerisierende
Material direkt an das Blutgefäss
angrenzend enthalten soll.
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Es
gibt weitere andere Organe, bei denen man die Wechselwirkung von
Zellen mit Geweben kontrollieren muss, oder bei denen man ähnliche
Barrieren über
eine Massenpolymerisation oder eine Grenzflächenpolymerisation erzeugen
muss. Diese Methodik ist genauso auf andere Organe sowie auf die
Verkapselung spezifischer Zelltypen oder biologisch aktiver Materialien,
wie Enzymen, für
z.B. die Behandlung verschiedener metabolischer Defekte oder Erkrankungen
anwendbar, wie es unten beschrieben wird,.
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(i) Verkapselung von Neurotransmitter-freisetzenden
Zellen
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Die
Paralysis agitans, häufiger
Parkinson-Krankheit genannt, ist durch einen Mangel des Neurotransmitters
Dopamin im Striatum des Gehirns gekennzeichnet. Dopaminsekretierende
Zellen, wie Zellen des ventralen Mesencephalons, von neuroblastoiden
Zelllinien oder aus dem Nebennierenmark, können mittels der hier beschriebenen
Verfahren und Materialien verkapselt werden. Zellen, einschließlich gentechnologisch
veränderter
Zellen, die einen Vorläufer
eines Neurotransmitters, einen Agonisten, ein Derivat oder ein Mimetikum eines
bestimmten Neurotransmitters oder Analoge sekretieren, können ebenfalls
verkapselt werden.
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(ii) Verkapselung von Hämoglobin
für synthetische
Erythrozyten
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Hämoglobin
in seiner freien Form kann in PEG-Gelen verkapselt und über eine
Auswahl der PEG-Kettenlänge
und der Dichte der Vernetzung, die eine Diffusion verhindert, zurück gehalten
werden. Die Diffusion von Hämoglobin
aus den Gelen kann weiter durch die Verwendung von Polyhämoglobin,
das eine vernetzte Form von Hämoglobin
ist, verhindert werden. Das Polyhämoglobinmolekül ist zu
groß,
als dass es aus dem PEG-Gel diffundieren könnte. Es kann eine geeignete
Verkapselung von entweder nativem oder vernetztem Hämoglobin
zur Herstellung von synthetischen Erythrozyten verwendet werden.
Das Einschließen
von Hämoglobin
in kleinen Kügelchen
mit einem Durchmesser von weniger als 5 Mikrometer aus diesen äußerst biokompatiblen
Materialien würde
zu verlängerten
Zirkulationszeiten, im Vergleich zu denjenigen von vernetztem Hämoglobin
oder in Liposomen verkapseltem Hämoglobin,
führen.
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(iii) Einschluss von Enzymen
für eine
Korrektur von Metabolismusstörungen
und für
die Chemotherapie
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Es
gibt viele Erkrankungen und Defekte, die aus einem Enzymmangel resultieren.
Zum Beispiel verursacht der angeborene Mangel am Enzym Katalase
die Akatalasämie.
Eine Immobilisierung von Katalase in PEG-Gelnetzwerken könnte ein
Verfahren für
einen Enzymersatz zur Behandlung dieser Krankheit bereit stellen.
Ein Einschluss von Glucosidase könnte
auf ähnliche
Weise für
die Behandlung der Gaucher-Krankheit nützlich sein. PEG-Gele in Form
von Mikrokügelchen,
die Urease einschließen,
könnte
in extrakorporalem Blut zur Umwandlung von Harnstoff in Ammoniak
eingesetzt werden. Enzyme wie Asparaginase können Aminosäuren abbauen, die von Tumorzellen
benötigt
werden. Die Immunogenität
dieser Enzyme verhindert ihren direkten Einsatz in der Chemotherapie.
Der Einschluss solcher Enzyme in immunprotektiven PEG-Gelen kann jedoch
eine erfolgreiche Chemotherapie unterstützen. Es kann eine geeignete
Formulierung, entweder für
eine langsame Freisetzung oder keine Freisetzung des Enzyms, konstruiert
werden.
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(iv) Mikroverkapselung von
Zellen für
die Untersuchung von Arzneimitteln gegen das humane AIDS-Virus in vivo
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HIV-infizierte
oder nicht-infizierte humane T-lymphoblastoide Zellen können in
PEG-Gelen verkapselt werden,
wie es oben für
andere Zellen beschrieben wurde. Diese Mikrokapseln können in
ein Tier, das kein Mensch ist, implantiert und dann mit den zu testenden
Arzneimitteln behandelt werden. Nach der Behandlung können die
Mikrokapseln wiedergewonnen werden, und die verkapselten Zellen
können
bezüglich
ihrer Vitalität
und ihrer funktionellen Normalität
untersucht werden. Das Überleben
infizierter T-Zellen zeigt eine erfolgreiche Wirkung des Arzneimittels
an. Eine fehlende Biokompatibilität ist ein dokumentiertes Problem
bei diesem Ansatz zur Bewertung von Arzneimitteln, aber die hier
beschriebenen, äußerst biokompatiblen
Gele sollten dieses Problem lösen.
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(v) Polymerisation stützender
Beschichtungen in Blutgefässen
und anderen Gewebehohlräumen
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So
wie sehr dünne
intravaskuläre
Beschichtungen in Blutgefäßen polymerisiert
werden können,
können
auch dickere Schichten aus stützenden
Gelen in Gefäßen polymerisiert
werden. Diese können
dazu verwendet werden, einen plötzlichen
Wiederverschluss zu vermindern, getrennte Gefäßwände voneinander fern zu halten,
Schutz vor einem Vasospasmus bereit zu stellen oder eine Hyperplasie
glatter Muskelzellen zu vermindern. Diese Gele können über eine Massenpolymerisation
oder eine Grenzflächenpolymerisation
erzeugt werden, und je dicker das Material und je höher die
Vernetzungsdichte des Materials ist, desto stabiler ist die Struktur
im Inneren der Gefäßwand. Dieses
Verfahren könnte
innerhalb vieler Organe des Körpers
durchgeführt
werden.
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Die
folgenden Beispiele werden gebracht, um bevorzugte Ausführungsformen
und Einsatzmöglichkeiten
der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, und sie sind nicht so
gemeint, dass sie die Erfindung einschränken sollen, es sei denn, es
wird in den hier beigefügten
Ansprüchen
etwas anderes festgestellt. Insgesamt veranschaulichen die Beispiele
repräsentative
Formen des besten Verfahrens zur Implementierung der Erfindung nach
dem derzeitigen Verständnis.
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Beispiel 1: Synthese von
PEG-6K-Diacrylat
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PEG-Acrylate
mit Molekulargewichten von 400 Dalton und 1 000 Dalton sind im Handel
bei Sartomer bzw. Dajac Inc. erhältlich.
Es wurden 20 g PEG-6K-Diol in 200 ml Dichlormethan in einem 250-ml-Rundkolben gelöst. Der
Kolben wurde auf 0°C
gekühlt,
und es wurden 1,44 ml Triethylamin und 1,3 ml Acryloylchlorid unter konstantem
Rühren
unter einer Atmosphäre
aus trockenem Stickstoff zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde
dann auf Raumtemperatur gebracht und 12 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Sie
wurde dann filtriert, und das Filtrat wurde durch den Zusatz eines
großen Überschusses
an Hexan gefällt.
Das rohe Monomer wurde durch Auflösen in Dichlormethan und Ausfällen in
Hexan gereinigt. Ausbeute 60%.
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Beispiel 2: Synthese von
PEG-18,5K-Tetraacrylat
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30
g eines wasserlöslichen
Tetrahydroxy-PEG (Molekulargewicht 18 500) (PEG 18,5 K) wurden bei Polysciences
Inc. gekauft.
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Das
PEG wurde durch Auflösen
in Benzol und Abdestillieren des Wasser-Benzol-Azeotrops getrocknet. 59 g des PEG 18,5
K wurden in 300 ml Benzol in einem 500 ml Kolben gelöst. Dazu
wurden 3,6 ml Triethylamin und 2,2 ml Acryloylchlorid unter einer
Stickstoffatmosphäre
gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang unter Rückfluss
erhitzt. Sie wurde dann abgekühlt
und über
Nacht gerührt.
Das Triethylaminhydrochlorid wurde durch Filtrieren abgetrennt,
und das Copolymer wurde aus dem Filtrat durch Ausfällen in
einem großen Überschuss
Hexan gewonnen. Das Polymer wurde durch Auflösen in Methylenchlorid und erneutes
Fällen
in Hexan weiter gereinigt. Das Polymer wurde bei 50°C im Vakuum
1 Tag lang getrocknet. Ausbeute 68%.
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Beispiel 3: Beschichtung
von Insel-haltigen Mikrokügelchen
aus Alginat-PLL durch Oberflächen-Farbstoffadsorption
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Das
Verfahren der Mikrokapsel-Grenzflächenpolymerisation wurde zur
Bildung von Membranen um Mikrokapseln aus Alginat-PLL, die Inseln
enthielten, verwendet. Koazervierte Alginat-PLL-Mikrokügelchen,
die jeweils eine oder zwei menschliche Insel(n) aus dem Pankreas
enthielten, wurden in einer Lösung
von 1,1 % CaCl2 suspendiert, und überschüssige Lösung wurde
von ihnen abgesaugt, um einen dichten Pfropfen aus Mikrokügelchen
zu erhalten. Es wurde eine Lösung
von Ethyleosin (0,04% Gew./Vol.) in einer 1,1%igen CaCl2-Lösung hergestellt. Diese Lösung wurde
mittels eines Filters von 0,45 μm
filtersterilisiert. Der Pfropfen aus den Mikrokügelchen wurde 2 min in 10 ml
der Eosinlösung
suspendiert, um ihnen die Aufnahme des Farbstoffes zu ermöglichen.
Die Mikrokügelchen
wurden dann viermal mit frischem 1,1%igem CaCl2 gewaschen, um überschüssigen Farbstoff
zu entfernen. 2 ml einer Lösung
(23% Gew./Vol.) von PEG-18,5K-Tetraacrylat, die 100 μl einer 3,5%igen
(Gew./Vol.) Lösung
von Triethanolamin in mit Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure (HEPES)
gepufferter Saline enthielt, wurde zu 0,5 ml dieser Mikrokügelchen
gegeben. Die Mikrokügelchen wurden
dem Licht eines Argonionenlasers 30 Sekunden lang unter regelmäßigem Rühren ausgesetzt.
Die Suspension der Mikrokügelchen
wurde während
dieses Zeitraums gleichmäßig mit
dem Licht gescannt. Die Mikrokügelchen
wurden dann mit Kalziumlösung
gewaschen, und der Prozess wurde wiederholt, um die Beschichtung
weiter zu stabilisieren.
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Mikrokügelchen
aus Alginat/PLL, die Inseln enthalten, die mittels dieser Technik
beschichtet wurden, sind in der 2b gezeigt.
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Es
wurde ein statischer Glucosestimulationstest (SGS) mit Inseln durchgeführt, die
in den mit dem PEG-Gel beschichteten Mikrokügelchen verkapselt waren. Daten
bezüglich
der Insulinsekretion als Reaktion auf diesen Stimulus sind in der
Tabelle 1 gezeigt. Von den Inseln wurde mittels einer Färbung mit
Dithizon gezeigt, dass sie vital sind.
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Die
Daten des SGS-Testes bestätigen
die Vitalität
und die Funktionalität
der Inseln.
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TABELLE
1: Funktion verkapselter Inselzellen (SGS)
-
Die
PEG-Diacrylat-Makromere können
genauso wie das PEG-Tetraacrylat-Makromer, das in diesem Beispiel
beschrieben wurde, polymerisiert werden.
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Beispiel 4: Beschichtung
von Insel-haltigen Mikrokügelchen
aus Alginat-PLL Verfahren der Suspensionspolymerisation
-
Dieses
Verfahren nützt
die hydrophile Natur der PEG-Monomere aus. Es wurden 2 ml der Mikrokügelchen
aus Alginat/PLL, die jeweils eine oder zwei humane Pankreas-Insel(n)
enthielten, mit einer Lösung
des PEG-Tetraacrylat-Monomers (Molekulargewicht des PEG 18,5 Kilodalton,
23%ige Lösung
in Saline) in einem transparenten Zentrifugenröhrchen von 50 ml gemischt.
Es wurden Triethanolamin (0,1 M) und 0,5 mM Ethyleosin mit der Makromerlösung gemischt.
Die überschüssige Makromerlösung wurde
abgegossen, es wurden 20 ml Mineralöl zu dem Röhrchen gegeben, und die Reaktionsmischung
wurde gründlich
5 Minuten lang gemischt. Silikonöl
funktioniert in dieser Synthese genauso gut, aber seine Eigenschaften
als Adjuvans können schlechter
sein, wenn es zu irgend einem Übertrag
kommt. Es kann jede beliebige andere, nicht mit Wasser mischbare
Flüssigkeit
als die „Öl"-Phase verwendet
werden. Akzeptable Konzentrationen des Triethanolamins liegen im
Bereich von ungefähr
1 mM bis ungefähr
100 mM. Akzeptable Konzentrationen des Ethyleosins liegen im Bereich
von ungefähr
0,01 mM bis über
10 mM.
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Die
Kügelchen
waren aufgrund des dünnen Überzugs
aus der Lösung
aus Makromer und Farbstoff leicht rot, und sie wurden 20 – 50 s mit
einem Argonionenlaser (Energie 50 – 500 mW) bestrahlt. Das Bleichen der
(roten) Farbe des Ethyleosins deutet auf das Ende der Reaktion hin.
Die Kügelchen
wurden dann vom Mineralöl
abgetrennt und mehrfach mit einer Salinelösung gewaschen. Die gesamte
Prozedur wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
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Eine
schematische Darstellung des Prozesses der Beschichtung der Makrokügelchen
in Öl ist
in der 3 gezeigt. Kapseln aus Alginat/Polylysin sind
in Natriumcitrat bei pH 12 löslich.
Wenn diese beschichteten Mikrokügelchen
bei pH 12 mit Natriumcitrat in Kontakt kommen, dann löst sich
das innere Koazervat aus Alginat/Polylysin auf, und man kann immer
noch eine polymere Membran aus PEG sehen (Gele aus vernetztem PEG
sind in allen Lösemitteln,
einschließlich
von Wasser und Natriumcitrat von pH 12 im wesentlichen unlöslich).
Die nicht beschichteten Kontroll-Mikrokügelchen lösen sich in der gleichen Lösung vollständig und schnell
auf.
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Es
wurde eine statische Glucoseprovokation mit den Inseln wie im Beispiel
3 durchgeführt.
Die Daten sind ebenfalls in der Tabelle 1 gezeigt. Die Inseln waren
vital und funktional.
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Beispiel 5: Verkapselung
von Langerhansschen Inseln
-
Dieses
Beispiel setzt die direkte Grenzflächenpolymerisation ein. Langerhanssche
Inseln, die aus einem menschlichen Pankreas isoliert worden waren,
wurden in Makromergelen aus PEG-Tetraacrylat verkapselt. 500 Inseln,
die in RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt,
suspendiert waren, wurden durch Zentrifugieren bei 100 g für 3 min
pelletiert. Das Pellet wurde in 1 ml einer 23%igen (Gew./Vol.) Lösung des
PEG-18,5K-Tetraacrylat-Makromers
in HEPES-gepufferter Saline resuspendiert. 5 μl einer Ethyleosin-Lösung in Vinylpyrrolidon (in
einer Konzentration von 0,5%) wurden zusammen mit 100 μl einer 5
M Lösung
von Triethanolamin in Saline dieser Lösung zugesetzt. 20 ml eines
Mineralöls
wurden dann zu dem Röhrchen
gegeben, das kräftig
gerührt
wurde, um eine Dispersion von Tröpfchen
von 200 – 500 μm Größe zu erzeugen. Diese
Dispersion wurde dann 30 s einem Argonionenlaser mit einer Energie
von 250 mW und einer Emissionswellenlänge von 514 nm ausgesetzt.
Das Mineralöl
wurde dann abgetrennt, indem man die Mikrokügelchen absitzen ließ, und die
resultierenden Mikrokügelchen
wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS), einmal mit
Hexan und dreimal mit Medium gewaschen.
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Die 4 zeigt
Langerhanssche Inseln, die in einem Gel aus PEG-Tetraacrylat verkapselt
sind. Die Vitalität
der Inseln wurde über
eine Färbung
mit Acridinorange und Propidiumiodid sowie durch eine Färbung mit
Dithizon verifiziert. Zur Testung der funktionellen Normalität wurde
ein SGS-Test mit diesen Inseln durchgeführt. Die Reaktion der verkapselten
Inseln wurde mit derjenigen der freien Inseln verglichen, die über den gleichen
Zeitraum in Kultur gehalten wurden. Alle Inseln wurden eine Woche
lang in Kultur gehalten, ehe der SGS- Test durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind
in der Tabelle 2 zusammengefasst. Man kann sehen, dass die verkapselten
Inseln signifikant (p<0,05)
höhere
Mengen an Insulin sekretierten als die freien Inseln. Der Prozess
der Verkapselung im PEG-Tetraacrylat-Gel beeinträchtigte die Funktion der Inseln
nicht und half diesen sogar, ihre Funktion in Kultur besser zu bewahren,
als wenn sie nicht verkapselt worden wären.
-
TABELLE
2: Sekretion von Insulin durch Inselzellen
-
Beispiel 6: Mikroverkapselung
tierischer Zellen
-
Es
wurden PEG-Diacrylate mit unterschiedlichem Molekulargewicht über eine
Reaktion von Acryloylchlorid mit PEG wie in Beispiel 1 hergestellt.
Eine 20–30%ige
Lösung
des Makromers wurde mit einer Zellsuspension und dem Initiationssystem
aus Ethyleosin und Triethanolamin gemischt, ehe es durch eine Coextrusionsapparatur
mit einem Luftstromeinrichtung, die in der 5 gezeigt
ist, Laserlicht ausgesetzt wurde. Die Mikrokügelchen wurden über einen
Luftzerstäubungsprozess
hergestellt, bei dem ein Strom des Makromers durch einen ringförmigen Luftstrom
zerstäubt
wurde. Die Geschwindigkeit des verwendeten Luftstroms betrug 1 600
cm3/min, und die Geschwindigkeit des Makromerstromes
betrug 0,5 ml/min. Man ließ die
Tröpfchen
in eine Petrischale mit Mineralöl
fallen, und dann wurden sie jeweils ungefähr 0,15 s Laserlicht ausgesetzt,
um die Mikrokügelchen
zu polymerisieren und sie unlöslich
in Wasser zu machen. Die Mikrokügelchen
wurden vom Öl
abgetrennt und gründlich
mit PBS-Puffer gewaschen, um nicht-umgesetztes Makromer und restlichen Initiator
zu entfernen. Die Größe und die
Form der Mikrokügelchen
hing von der Extrusionsgeschwindigkeit (0,05 bis 0,1 ml/min) und
dem Durchmesser der extrudierenden Kapillare (18 Gauge bis 25 Gauge)
ab. Die Polymerisationszeiten hingen von der Konzentration des Initiators
ab (der Konzentration des Ethyleosins (5 μM bis 0,5 mM), der Konzentration
des Vinylpyrrolidons (0,0% bis 0,1%), der Konzentration des Triethanolamins (5
bis 100 mM), der Laserenergie (10 mW bis 1 W) und der Konzentration
des Makromers (über
10% Gew./Vol.).
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Ein
PEG-Diacrylat-Makromer mit dem Molekulargewicht 400 Dalton wurde
als eine 30%ige Lösung
in PBS verwendet, die 0,1 M Triethanolamin als Cokatalysator und
0,5 mM Ethyleosin als Photoinitiator enthielt. Kügelchen, die mittels dieses
Verfahrens erhalten wurden, sind in der 6 gezeigt.
Die Polymerisationen wurden bei physiologischem pH in Gegenwart
von Luft durchgeführt.
Das ist wichtig, da Radikalpolymerisationen durch die Gegenwart
von Sauerstoff beeinflusst werden können und die Acrylatpolymerisation
trotzdem noch schnell genug ist, um wirkungsvoll ablaufen zu können.
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Der
Prozess funktioniert auch bei niedrigeren Temperaturen. Für die Verkapselung
von Zellen wurde eine 23%ige Lösung
von PEG-Diacrylat unter Initiations- und Polymerisationsbedingungen,
wie sie in der Luftzerstäubungstechnik
eingesetzt wurden, verwendet. Die Zellvitalität nach der Verkapselung wurde
mit Hilfe des Trypanblau-Ausschlusstestes
kontrolliert. Es wurde gefunden, dass menschliche Vorhautfibroblasten (HFF),
Chinese-Hamster-Ovary-Zellen (CHO-K1) und eine Betazell-Insulom-Linie
(RiN5F) nach der Verkapselung zu über 95% vital waren. Es kann
ein breiter Bereich an PEG-Diacrylat-Konzentrationen von über 10% genauso wirkungsvoll
eingesetzt werden wie PEG-Tetraacrylat-Makromere.
-
Beispiel 7: Beschichtung
von Mikrokügelchen
aus Alginat-PLL, die tierische Zellen enthalten, sowie individueller
Zellen mittels der Oberflächenfarbstoffadsorption
-
Koazervierte
Mikrokügelchen
aus Alginat-PLL, die tierische Zellen enthielten, wurden in einer
Lösung von
1,1% CaCl2 suspendiert, und überschüssige Lösung wurde
von ihnen abgesaugt, um einen dichten Pfropfen aus Mikrokügelchen
zu erhalten. Der Pfropfen aus den Mikrokügelchen wurde 2 min in 10 ml
der Eosinlösung
suspendiert, um ihnen die Aufnahme des Farbstoffes zu ermöglichen.
2 ml einer Lösung
(23% Gew./Vol.) von PEG-18,5K-Tetraacrylat,
die 100 μl
einer 3,5%igen (Gew./Vol.) Lösung
von Triethanolamin in HEPESgepufferter Saline enthielt, wurde zu
0,5 ml dieser Mikrokügelchen
gegeben. Die Mikrokügelchen
wurden dem Licht eines Argonionenlasers 30 Sekunden lang unter regelmäßigem Rühren ausgesetzt.
Die Suspension der Mikrokügelchen
wurde während
dieses Zeitraums gleichmäßig mit
dem Licht gescannt. Die Mikrokügelchen wurden
dann mit Kalziumlösung
gewaschen, und der Prozess wurde wiederholt, um eine stabile Beschichtung zu
erhalten.
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Um
das Überleben
der Zellen nach dem Beschichtungsprozess zu verifizieren wurden Zellen
in Suspension ohne die Mikrokapsel aus Alginat/PLL ähnlichen
Polymerisationsbedingungen ausgesetzt. 1 ml der Zellen der lymphoblastischen
Leukämie
(RAJI) (5 × 105 Zellen) wurde 3 min bei 300 g zentrifugiert.
Es wurde 1 ml einer 0,04%igen filtersterilisierten Lösung von
Ethyleosin in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zugegeben, und das
Pellet wurde resuspendiert. Die Zellen wurden dem Farbstoff 1 min
lang ausgesetzt, zweimal mit PBS gewaschen und dann abzentrifugiert.
10 μl Triethanolaminlösung (0,1
M) wurden zum Pellet gegeben, und das Röhrchen wurde gemischt, um die
Zellen zu resuspendieren. Dann wurden 0,5 ml des PEG-18,5K-Tetraacrylat-Makromers
in diese Suspension eingemischt, und die resultierende Mischung
wurde 45 s einem Argonionenlaser ausgesetzt (514 nm, 50 mW). Die
Zellen wurden dann zweimal mit 10 ml Saline und einmal mit Medium
(RPMI 1640 mit 10% FKS und 1 % Antibiotika und Antimykotica) gewaschen.
Es wurde beobachtet, dass sich eine dünne Membran aus PEG-Tetraacrylat-Gel
um jede einzelne Zelle bildete.
-
Es
wurde mittels des Trypanblau-Ausschlusstestes kein signifikanter
Unterschied bezüglich
der Vitalität
zwischen der Kontrollpopulation (93% vital) und den behandelten
Zellen (95% vital) gesehen. Es wurde ein Test auf die Vitalität und die
Funktion der Zellen durchgeführt,
indem der MTT-Formazan-Test an die RAJI-Zellen adaptiert wurde.
Dieser Test zeigte ein Überleben
von über
90% an. Ähnliche
Tests wurden mit zwei anderen Modellzelllinien durchgeführt. Chinese-Hamster-Ovary-Zellen
(CHO-K1) zeigten keinen signifikanten Unterschied (p<0,05) bezüglich der
metabolischen Aktivität
im MTT-Formazan-Test.
3T3-Mausfibroblasten zeigen ebenfalls keine signifikante Verminderung
(p>0,50) der metabolischen
Aktivität.
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Beispiel 8: Beschichtung
von Mikrokügelchen
aus Alginat-PLL, die tierische Zellen enthalten
-
Verfahren der Suspensionspolymerisation
-
Unter
Einsatz des im Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens wurden RAJI-Zellen,
die in Mikrokügelchen aus
Alginat-PLL verkapselt waren, mit einer polymeren Membran aus PEG-18,5K-Tetraacrylat
beschichtet. Die Vitalität
dieser Zellen wurde mittels des Trypanblau-Ausschlusstestes geprüft, und
es zeigte sich, dass mehr als 95% vital waren.
-
Beispiel 9: Beschichtung
einzelner Langerhansscher Inseln mittels der Oberflächenfarbstoffadsorption
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Unter
Einsatz des im Beispiel 7 beschriebenen Verfahrens wurde Ethyleosin
an die Oberflächen
von Inseln adsorbiert, es wurde eine Lösung des PEG-Makromers mit
Triethanolamin den Farbstoff-beschichteten Zellen zugegeben, und
die Zellen wurden dem Lichte eines Argonionenlasers ausgesetzt,
um eine dicke polymere Membran aus PEG auf der Oberfläche der
Inseln zu bilden. Die Vitalität
der Inseln wurde anhand des Fehlens einer Anfärbung mit Propidiumiodid demonstriert.
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Beispiel 10: Biokompatibilität des PEG
auf Mikrokügelchen
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Eine
In-vivo-Untersuchung des Ausmaßes
der Entzündungsreaktion
auf Mikrokügelchen,
die in den Beispielen 7 und 8 hergestellt worden waren, wurde über eine
Implantation in die Bauchfellhöhle
von Mäusen durchgeführt. Ungefähr 0,5 ml
der Mikrokügelchen
wurden in 5 ml steriler, mit HEPES gepufferter Saline suspendiert.
2,5 ml dieser Suspension wurden in die Bauchfellhöhle männlicher
weißer
ICR-Swiss-Mäuse
injiziert. Die Mikrokügelchen
wurden nach 4 Tagen über
ein Lavage der Bauchfellhöhle
mit 5 ml einer Lösung
von 10 U Heparin/ml in PBS wiedergewonnen. Das Ausmaß des Zellwachstums
auf den Mikrokügelchen
wurde visuell unter einem Phasenkontrastmikroskop beurteilt. Die
Zahl der nicht angehefteten Zellen, die in der gewonnenen Lavageflüssigkeit
vorhanden waren, wurde mittels eines Coulter-Counters gezählt.
-
Die 7a zeigt
eine Fotografie von Mikrokügelchen
aus Alginat-Poly-L-lysin, die nach 4 Tagen wiedergewonnen wurden,
während
die 7b ähnliche
Kügelchen
zeigt, die vor der Implantation mit einem PEG-Gel mittels der Farbstoffdiffusionsmethode
beschichtet worden waren. Wie erwartet, waren die doppelschichtigen
Alginat-Polylysin-Kapseln, die keine äußere Alginatschicht enthielten,
aufgrund der stark zelladhäsiven
Natur der PLL-Oberfläche
vollständig
mit Zellen bedeckt, während
die mit PEG beschichteten Mikrokügelchen
praktisch frei von angehefteten Zellen waren. Die nahezu vollständige Bedeckung
des Alginat-Poly-L-lysins
war erwartet worden, da Polylysin Aminogruppen auf der Oberfläche trägt, und
positiv geladene Amine der Oberfläche können mit Proteoglycanen der
Zelloberfläche
in Wechselwirkung treten und das Zellwachstum unterstützen (Reuveny
et al., (1983) Biotechnol. Bioeng. 25: 469-480). Die Fotografien
in der 7b zeigen deutlich, dass die
hoch geladene und zelladhäsive
Oberfläche
von PLL mit einer stabilen Schicht des PEG-Gels bedeckt ist. Die
Integrität
des Gels war offenbar nicht beeinträchtigt.
-
Die
nicht-zelladhäsive
Tendenz dieser Mikrokügelchen
wurde anhand des prozentualen Anteils der Gesamtfläche der
Mikrokügelchen
beurteilt, der durch ein Überwachsen
von Zellen bedeckt war. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. TABELLE
3: Bedeckung der Mikrokügelchen
durch auf diesen gewachsene Zellen nach einer intraperitonealen Implantation
für 4 Tage
Zusammensetzung des PEG-Gels | % Bedeckung mit Zellen |
18,5
K | <1 |
18,5
K 90% : 0,4 K 10% | <1 |
18,5
K 50% : 0,4 K 50% | <1 |
35
K 90% : 0,4 K 10% | 5–7 |
35
K 50% : 0,4 K 50% | <1 |
Alginat-Poly-L-lysin | 60–80 |
-
Eine
Zunahme der Zellzahl ist eine Folge der Aktivierung residenter Makrophagen,
die chemische Faktoren wie Interleukine sekretieren und nicht-residente
Makrophagen dazu bringen, zur Implantationsstelle zu wandern. Die
Faktoren ziehen auch Fibroblasten an, die für die Collagensynthese verantwortlich
sind. Die Abhängigkeit
der Zellzahlen von der chemischen Zusammensetzung des Überzuges
ist in der 8(a-f) gezeigt. Aus der Figur
geht hervor, dass alle PEG-beschichteten Kügelchen wesentlich reduzierte
Zellzahlen aufweisen. Das steht in Übereinstimmung damit, dass
der PEG-Überzug
im allgemeinen keine Reizung der Bauchfellhöhle verursacht.
-
Allerdings
hat die PEG-Zusammensetzung einen Einfluss auf die Biokompatibilität, und zunehmende Molekulargewichte
sind mit einer Verminderung der Zellzahlen assoziiert. Das könnte darauf
beruhen, dass die Gele, die aus Oligomeren mit höherem Molekulargewicht hergestellt
wurden, aufgrund der höheren
Kettenlängen
ein stärkeres
Potenzial bezüglich
einer sterischen Abstoßung
zeigen.
-
Beispiel 11: Permeabilität von PEG-Gelen
-
Es
wurden 20 mg von Rinderserumalbumin, humanem IgG oder humanem Fibrinogen
in 2 ml einer 23%igen (Gew./Vol.) Lösung von oligomerem PEG-18,5K-Tetraacrylat
in PBS gelöst.
-
Diese
Lösung
wurde laserpolymerisiert, um ein Gel von 2 cm × 2 cm × 0,5 cm Größe zu erzeugen. Die Diffusion
des Rinderserumalbumins, des humanen IgG und des humanen Fibrinogens
(Molekulargewichte 66 Kilodalton, 150 Kilodalton bzw. 350 Kilodalton)
durch die Fläche
dieser Gele von 2 cm × 2
cm wurde mittels eines Reagens zur Erfassung der Gesamtproteinmenge
(Biorad) verfolgt. Ein typisches Freisetzungsprofil für ein PEG-18,5K-Gel
ist in der 9 gezeigt. Dieses Gel ermöglichte
einen langsamen Transport von Albumin, aber es ermöglichte
keine Diffusion von IgG und Fibrinogen. Das zeigt, dass diese Gele
als immunprotektive Barrieren verwendet werden können. Das ist eine grundlegende
Anforderung an ein Material für
eine erfolgreiche Mikroverkapselung von tierischem Gewebe.
-
Es
wurde gefunden, dass das Freisetzungsprofil eine Funktion der Dichte
der Vernetzung und des Molekulargewichtes des Polyethylenglycol-Segments
des Monomers ist. Die 10 zeigt die Freisetzung von Rinderserumalbumin
(BSA) durch Gele, die aus 23%igen Lösungen von PEO-Diacrylaten
und Tetraacrylaten von 0,4 K bzw. 18,5 K hergestellt wurden. Es
ist offensichtlich, dass das 18,5K-Gel für Albumin frei permeabel war,
während
das 0,4K-Gel die Diffusion von Albumin beschränkte. Die Freisetzung beliebiger
Substanzen aus diesen Gelen hängt
von der Vernetzungsdichte des Netzwerkes ab und auch von der Beweglichkeit
der PEG-Segmente im Netzwerk. Diese Wirkung hing auch von der Funktionalität des Makromers
ab. Zum Beispiel war die Permeabilität eines Gels aus PEG-18,5K-Tetraacrylat
geringer als diejenige eines ansonsten ähnlichen Gels aus PEG-20K-Diacrylat.
-
Beispiel 12: Behandlung
von Silikongummi zur Bildung einer Schicht aus einem PEG-Gel zur Verbesserung der
Biokompatibilität
-
Stücke von
2 × 2
cm aus Silikongummi medizinischer Reinheit wurden 1 Stunde lang
in Benzol eingeweicht, das 23% 0,4 K PEG-Diacrylat und 0,5% 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon
enthielt. Der gequollene Gummi wurde 15 min mit einer Lampe für langwelliges
UV-Licht (365 nm) bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde die Probe
in Benzol gespült
und getrocknet. Die Luftkontaktwinkel des Silikongummis unter Wasser
wurden vor und nach der Behandlung gemessen. Der verringerte Kontaktwinkel
von 50° nach
der Behandlung im Vergleich zum Ausgangskontaktwinkel von 63° für unbehandelten
Silikongummi spiegelt eine erhöhte
Hydrophilie aufgrund der Anwesenheit des PEG-Gels auf der Gummioberfläche wieder.
-
Diese
Technik zeigt, dass eine Makromerpolymerisation dazu verwendet werden
kann, eine Polymeroberfläche
so zu modifizieren, dass die Biokompatibilität verbessert wird. Zum Beispiel
kann ein Katheter aus Polyurethan mittels dieses Verfahrens behandelt
werden, um eine implantierbare Vorrichtung zu erhalten, die mit
PEG beschichtet ist. Das PEG war fest auf der Oberfläche des
Polyurethan-Katheters verankert, da man das Makromer während der
Einweichphase vor der Photopolymerisation in die Oberfläche des
Katheters eindringen ließ (bis
zu einer Tiefe von 1 – 2 μm). Bei der
Bestrahlung kommt es zu einem interpenetrierenden Netzwerk aus PEG
und Polyurethan. Das PEG wurde dadurch untrennbar mit dem Polyurethan
verbunden.
-
Beispiel 13: Polymerisationsgeschwindigkeit
-
Es
wurde die Kinetik einer typischen Reaktion bestimmt, um die Schnelligkeit
der Gelbildung bei der Laser-initiierten Polymerisationen multifunktioneller
Acrylmonomere zu zeigen. Trimethylolpropyltriacrylat, das 5 × 10–4 M
Ethyleosin als Photoinitiator in 10 μmol N-Vinylpyrrolidon pro ml
der Makromermischung und 0,1 M Triethanolamin als Cokatalysator
enthielt, wurde mit einem Argonionenlaser von 500 mW (Wellenlänge 514 nm,
Energie 3,05 × 105 W/m2, Strahldurchmesser
1 mm, durchschnittlicher Durchmesser des erzeugten Gels 1 mm) bestrahlt.
Eine grafische Darstellung der Länge
des Gel-Spikes, der durch das Eindringen des Laserstrahls in das
Gel der Laserbestrahlung gebildet wurde, in Abhängigkeit von der Zeit ist in
der 11a gezeigt. Die als Ergebnis
des Eindringens des Laserlichts in das Makromer gebildeten Spikes
kann man in der 11b sehen.
-
Es
wurden 100 μl
einer 23%igen (Gew./Gew.) Lösung
verschiedener Makromere in HEPES-gepufferter Saline, die 3 μl einer Initiatorlösung (300
mg/ml 2,2-Dimethoxy-2-phenoxyacetophenon
in N-Vinylpyrrolidon) enthielten, auf ein Deckgläschen aus Glas gegeben und
mit einer Lampe für
langwelliges UV-Licht niedriger Intensität (LWUV) (Black-Ray, Modell
3 – 100A,
mit Strahler). Die Zeiten, die für
den Ablauf der Gelbildung benötigt
wurde, wurden registriert und sind in der Tabelle 4 wiedergegeben.
Diese Zeiten liegen typischerweise im Bereich von 10 Sekunden. TABELLE
4: Gelbildungszeiten des bestrahlten Polymers
Polymergröße | Gelierzeit (s) |
| (Mittelwert ± S.D.) |
0,4
K | 6,9 ± 0,5 |
1 K | 21,3 ± 2,4 |
6K | 14,2 ± 0,5 |
10
K | 8,3 ± 0,2 |
18,5
K | 6,9 ± 0,1 |
20
K | 9,0 ± 0,4 |
-
Zeiträume von
ungefähr
10 – 100
ms reichen aus, um ein Tröpfchen
von 300 μm
Durchmesser, eine typische Gelgröße, die
in der Mikroverkapselungstechnologie eingesetzt wird, zu gelieren.
Diese schnelle Gelbildung kann, wenn sie zusammen mit geeignet gewählten Makromeren
eingesetzt wird, zum Einschluss lebender Zellen in einem dreidimensionalen,
kovalent verbundenen Polymernetzwerk führen. Monochromatisches Laserlicht
wird von den Zellen nicht absorbiert, es sei denn, es ist ein geeignetes
Chromophor vorhanden, und es wird angenommen, dass es unschädlich ist,
wenn die Wellenlänge über ungefähr 400 nm
liegt. Eine Exposition gegen langwelliges ultraviolettes Licht,
mit einer Wellenlänge
von über
360 nm, ist bei den in der Praxis eingesetzten Intensitäten und
Zeiträumen
unschädlich.
-
Die
Polymerisationsgeschwindigkeit des Makromers hängt von der Makromerkonzentration,
der Initiatorkonzentration und der Funktionalität des Makromers, z. B. der
Difunktionalität
eines PEG-Diacrylats oder der Tetrafunktionalität eines PEG-Tetraacrylats,
sowie vom Ausmaß der
Acrylierung des Materials ab.
-
Beispiel 14: Wechselwirkungendes
PEG-Gels
-
Die
Biokompatibilität
mit HFF-Zellen (human foreskin fibroblasts, menschlichen Vorhautfibroblasten) wurde
wie folgt demonstriert. HFF-Zellen wurden auf Gelen aus PEG-18,5K-Tetraacrylat
in einer Dichte von 18 000 Zellen/cm2 in
Dulbeccos Modikikation von Eagles Medium, das 10% fötales Kälberserum
enthielt, ausgesät.
Die Gele wurden dann bei 37°C
in einer Atmosphäre
von 5% CO2 4 Stunden inkubiert. Nach dieser
Zeit wurden die Gele mit PBS gewaschen, um alle nicht angehefteten
Zellen zu entfernen, und dann unter einem Phasenkontrastmikroskop
bei einer Vergrößerung von
200 × betrachtet.
-
Die 12a zeigt das Wachstum dieser Zellen auf einem
typischen PEG-Gel im Vergleich zu dem auf einer Glasoberfläche (12b). Es wurde gefunden, dass die Zahl der auf
der Geloberfläche
angehefteten Zellen/cm2 bei 510 ± 170 lag,
im Vergleich zu 13 200 ± 3
910 für
eine als Kontrolle dienende Glasoberfläche. Die Zellen auf diesen
Gelen sahen abgerundet aus und zeigten nicht ihre normale ausgebreitete
Morphologie, was deutlich darauf hinwies, dass diese Gele die Anheftung
von Zellen nicht förderten.
-
Die
Biokompatibilität
auf Mikrokügelchen
wurde wie folgt demonstriert. Die
13 zeigt
eine Fotografie von Mikrokügelchen,
die aus Mäusen
wie im Beispiel 10 explantiert wurden; nach 4 Tagen sieht man nur eine
sehr geringe fibröse Überwachsung.
Die Widerstandsfähigkeit
der PEG-Ketten gegenüber
einer Proteinadsorption und somit einem Zellwachstum ist gut dokumentiert.
Die Tabelle 5 fasst das Ausmaß des Überwachsens
der Zellen zusammen, das man auf diesen Mikrokügelchen aus Gelen aus verschiedenen
PEG-Diacrylaten
nach einer viertägigen
intraperitonealen Implantation sieht. Tabelle
5: Ausmaß der Überwachsung
von Gelen mit Zellen
PEG-Diacrylat
der Gele (Molekulargewicht, Dalton) | Ausmaß der Überwachsung
mit Zellen |
400 | 5 – 10% |
1 000 | 15 – 25% |
5 000 | 3 – 5% |
6 000 | 2 – 15% |
10
000 | 10 – 20% |
18
500 | 4 – 10% |
-
Beispiel 15: Charakterisierung
und mechanische Analyse von PEG-Gelen
-
Es
wurden 10 μl
einer Initiatorlösung,
die 30 mg/ml an 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon
in Vinyl-2-pyrrolidon enthielt, pro ml zu 23%igen (Gew./Vol.) Lösungen von
PEG-Diacrylaten (0,4 K, 6 K, 10 K) und PEG-Tetraacrylaten (18,5
K) gegeben. Die Lösung
des den Initiator enthaltenden Makromers wurde in eine Form von
4,0 × 1,0 × 0,5 cm
gegeben und ungefähr
10 Sekunden einer Lampe für
langwelliges ultraviolettes Licht (365 nm) ausgesetzt, um die Gelbildung
zu induzieren. Man ließ die
Proben in Phosphat-gepufferter Saline (pH 7,4) eine Woche äquilibrieren,
ehe die Analyse durchgeführt
wurde.
-
Eine
Reihe von „Hundeknochen"-Proben (Proben,
die aus einer Platte in Form eines Hundeknochens geschnitten worden
waren, mit breiten Bereichen an beiden Enden und einem schmaleren
langen Bereich in der Mitte) wurde für Tests der Reißfestigkeit
geschnitten. Die Dicke der Proben war durch die Dicke der Probe, von
der sie ausgeschnitten wurden, definiert.
-
Diese
Dicken lagen im Bereich zwischen ungefähr 0,5 mm bis 1,75 mm. Die
Proben waren 20 mm lang und im Bereich des schmalen „Halses" 2 mm breit. Die
Spannungs-Dehnungs-Tests
wurden bei kontrollierter Länge
mit einer Geschwindigkeit von 4% pro Sekunde durchgeführt. Nach
jedem Test wurde die Querschnittsfläche bestimmt. Die Tabelle 6
zeigt die Daten zur Reissfestigkeit. Man sieht, dass die Makromere
mit niedrigerem Molekulargewicht im allgemeinen zu stabileren Gelen
führen,
die weniger dehnbar sind als diejenigen, die aus den Makromeren
mit höherem
Molekulargewicht hergestellt wurden. Man sieht, dass sich das Gel
aus PEG-18,5K-Tetraacrylat in dieser Reihe abnormal verhält, was
aus der Multifunktionalität
des Makromers und der entsprechenden höheren Vernetzungsdichte des
resultierenden Gels resultiert. Dieser Typ einer Verstärkungswirkung
könnte
ganz ähnlich
mit Makromeren erhalten werden, die vier andere, gegenüber freien
Radikalen empfindliche Gruppen als Acrylatgruppen aufweisen.
-
Tabelle
6: Tests der Gelstabilität
-
Für die Kriechversuche
wurden acht Proben von ungefähr
0,2 × 0,4 × 2 cm geladen,
wobei sie in einer Salinelösung
untergetaucht waren. Sie wurden 1 Stunde lang mit einer konstanten,
einmaligen, vorher festgelegten Belastung und mit einer kleinen
Erholungsbelastung 10 min lang getestet. Es wurden Gele in dieser
Studie eingesetzt, die aus PEG-Diacrylaten mit Molekulargewichten
von 1 K, 6 K und 10 K und aus PEG-Tetraacrylaten von 18,5 K hergestellt
worden waren. Der Test mit der 10K-Probe wurde aufgrund eines Begrenzungsfehlers
abgebrochen (die Probe dehnte sich über die Wanderungsstrecke des
Laderahmens). Die 1K-Probe wurde mit einer Belastung von 10 g und
einer Erholungsbelastung von 0,2 g getestet. Die 6K-Probe wurde
mit einer Belastung von 13 g und einer Erholungsbelastung von 0,5
g getestet. Die 18,5K-Probe wurde mit einer Belastung von 13 g und
einer Erholungsbelastung von 0,2 g getestet. Die Wahl der Belastungen
für diese
Proben führte
zu klassischen Kriechkurven mit primären und sekundären Bereichen.
Die Kriechspuren für
die 1K-, 6K- und 18,5K-Probe finden sich in den 14a–c.
-
Beispiel 16: Wassergehalt
der PEG-Gele
-
Es
wurden Lösungen
verschiedener Makromere wie oben beschrieben hergestellt. Gele in
Form runder Scheiben wurden mittels einer Form hergestellt. Es wurden
400 μl Lösung für jede Scheibe
verwendet. Die Lösungen
wurden 2 min bestrahlt, um eine gründliche Gelbildung sicher zu
stellen. Die zu runden Scheiben geformten Gele wurden entnommen
und bei 60°C
2 Tage im Vakuum getrocknet. Die Scheiben wurden gewogen (G1) und
dann 1 Tag lang mehrmals mit Chloroform extrahiert. Die Scheiben
wurden erneut getrocknet und gewogen (G2). Der Gelanteil wurde als
G2/G1 berechnet. Die Daten finden sich in der Tabelle 7.
-
Nach
der Extraktion wurden die runden 6 Stunden lang mit HBS äquilibriert
und gewogen (G3), nachdem überschüssiges Wasser
sorgfältig
abgewischt worden war. Der gesamte Wassergehalt wurde als (G3–G2) × 100/G3
berechnet. Die Daten für
die Wassergehalte der Gele sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
-
Tabelle
7: Daten zum Wassergehalt der Gele
-
Beispiel 17: Mechanische
Stabilität
von PEG-Gelen nach der Implantation
-
PEG-Diacrylat
(10 K) und PEG-Tetraacrylat (Molekulargewicht 18,5 K) wurden, wie
in Beispiel 15 beschrieben, in Hundeknochen-artige Formen gegossen.
Eine Lösung
von 23% (Gew./Gew.) PEG-Diacrylat oder -Tetraacrylat in steriler
HEPES-gepufferter Saline (HBS) (0,9% NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4),
die 900 ppm 2,2-Dimethoxy-2-phenoxyacetophenon als Initiator enthielt,
wurde in eine Aluminiumform gegossen und 1 min lang mit einer LWUV-Lampe (Black ray)
bestrahlt. Die Anfangsgewichte dieser Proben wurden erhalten, nachdem
diese Gele in einem Ofen bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet
worden waren. Die Proben wurden in einem Soxhlet-Extraktor 36 Stunden
mit Methylenchlorid extrahiert, um möglicherweise vorhandenes, nicht umgesetztes
Präpolymer
aus der Gelmatrix vor der Testung auszulaugen(Sol-Laugung). Der
Extraktionsprozess wurde fortgesetzt, bis die getrockneten Gele
ein konstantes Gewicht hatten.
-
Männliche
weiße
ICR-Swiss-Mäuse,
6–8 Wochen
alt (Sprague-Dawley), wurden mittels einer intraperitonealen Injektion
von Natriumpentobarbital betäubt.
Der Unterleibsbereich der Maus wurde rasiert und mit Betadin behandelt.
Es wurde ein Einschnitt von 10 – 15
mm Länge
längs der
ventralen Mittellinie vorgenommen. Die Polymerprobe, die vollständig in
steriler PBS (Phosphat-gepufferter Saline) oder HEPES-gepufferter Saline
(für Kalzifizierungsstudien)
hydriert worden war, wurde durch den Einschnitt eingeführt und über dem Mesenterium,
entfernt vom Ort der Wunde, placiert. Die Wand der Bauchhöhle wurde
mit einer Steppstich-Naht (4,0-Seide,
Ethicon) geschlossen. Die Haut wurde mit Klammern aus rostfreiem
Stahl geschlossen, und es wurde ein topisches Antibiotikum (Furacin)
auf den Schnitt aufgetragen. Drei Tiere wurden für jeden Zeitpunkt verwendet.
Es wurde eine Hundeknochen-förmige
Probe pro Maus implantiert und am Ende der 1. Woche, nach 3 Wochen,
nach 6 Wochen und nach 8 Wochen explantiert. Die explantierten Gele
wurden zweimal in HBS gespült
und dann mit 0,3 mg/ml Pronase (Calbiochem) behandelt, um alle möglicherweise
anhaftenden Zellen sowie Gewebe zu entfernen. Die Proben wurden
dann bis zu einem konstanten Gewicht im Ofen getrocknet, extrahiert
und wie zuvor erwähnt
erneut gequollen.
-
Zugspannungs-Dehnungs-Tests
wurden sowohl mit Kontrollen (nicht-implantierten) und den explantierten
Hundeknochen in einer kleinen horizontalen, Instron-artigen Vorrichtung
durchgeführt.
Die Vorrichtung ist eine Aluminiumplattform, die aus zwei Klammern
besteht, die flach auf einem Holzbrett zwischen zwei parallelen
Aluminiumführungen
montiert sind. Die obere Klammer ist stationär, während die untere Klammer bewegt
werden kann. Die Reibungsoberfläche
der sich bewegenden Klammer und auch diejenige der Plattform sind
mit Aluminium-gestütztem
Teflon (Cole-Parmer) beschichtet, um den Reibungswiderstand zu minimieren. Die
sich bewegende Klammer ist an einer Vorrichtung befestigt, die eine
sich allmählich
steigernde Belastung ausüben
kann. Der gesamte Aufbau ist horizontal unter einem Präpariermikroskop
(Reichert) angeordnet, und die Dehnung der Probe wird mittels einer
Videokamera verfolgt. Das Bild der Kamera wird von einem Bildverarbeitungssystem
(Argus-10, Hamamatsu) verarbeitet und auf einen Monitor geschickt.
Nach dem Reißen
wird die gerissene Oberfläche
quer geschnitten, und es wird die Fläche gemessen. Die Belastung
beim Reißen
wird durch diese Querschnittsfläche
geteilt, um die Reißfestrigkeit
zu ermitteln. Die Tabelle 8 führt
die Spannung beim Reißen
der Hydrogele aus PEG-Tetraacrylat (18,5 K) auf, die zu verschiedenen
Zeitpunkten explantiert worden waren. Es zeigt sich keine signifikante
Veränderung
der Reißfestigkeit
in Abhängigkeit
von der Zeit. Somit sind die Gele offenbar über den maximalen Zeitraum
der Implantation in Mäuse
gegenüber
einem biologischen Abbau in vivo stabil.
-
TABELLE
8: Widerstandsfähigkeit
von Polymerimplantaten gegenüber
einem Abbau
-
Beispiel 18: Verfolgung
der Kalzifizierung von PEG-Gelen
-
Hydrogele
aus PEG-Tetraacrylat (Molekulargewicht 18,5 K) in Form runder Scheiben
wurden für
Zeiträume
von 1 Woche, 3 Wochen, 6 Wochen oder 8 Wochen intraperitoneal Mäusen implantiert,
wie es oben beschrieben wurde,. Die explantierten Gele wurden zweimal
mit HBS gespült
und mit Pronase (Calbiochem) behandelt, um Zellen und Zelltrümmer zu
entfernen. Die Proben wurden dann in HBS äquilibriert, um freies Ca++ aus der Gelmatrix heraus diffundieren
zu lassen. Die Gele wurden dann in einem Ofen (Blue-M) bis zu einem
konstanten Gewicht getrocknet und in Schiffchen aus Aluminiumoxid
(COORS, widerstandsfähig
gegenüber
hohen Temperaturen) gegeben. Sie wurden in einem Ofen bei 700°C wenigstens
18 Stunden lang verbrannt. Die Schiffchen wurden bezüglich einer
vollständigen
Verbrennung untersucht, und wenn noch etwas restliches Material
oder Trümmer
vorhanden warfen), dann wurden sie für weitere 12 Stunden geglüht. Anschließend wurden
die Schiffchen mit 2 ml 0,5 M HCl gefüllt, um Ca++-Salze
und andere Mineralien in der Probe zu lösen. Diese Lösung wurde
filtriert und mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AA) bezüglich des Kalziumgehaltes
untersucht.
-
Die
Kalzifizierungsdaten der Implantate aus dem PEG-Tetraacrylat (Molekulargewicht
18,5 K) sind in der Tabelle 9 angegeben. Es wurde bis zu einer Implantationsdauer
in Mäuse
von 8 Wochen keine signifikante Zunahme der Kalzifizierung beobachtet. TABELLE
9: Kalzifizierungsdaten für
Gelimplantate aus PEG-Tetraacrylat (Molekulargewicht 18,5 K)
ZEIT | KALZIFIZIERUNG
(Mittelwert ± Fehler) |
(Tage) | (mg
Kalzium/g Gel-Trockengewicht) |
7 | 2,33 ± 0,20 |
21 | 0,88 ± 0,009 |
42 | 1,
08 ± 0,30 |
56 | 1,17 ± 0,26 |
-
Beispiel 19: Verwendung
von PEG-Gelen als Klebstoff zur Wiederverbindung durchtrennter Nerven
-
Es
wurde eine Formulierung von PEG-Tetraacrylat (10%, 18,5 K) als Klebstoff
zur Stabilisierung der nahtlosen Verbindung der Enden der durchschnittenen
Ischiasnerven der Ratte verwendet. Die Ratten standen während der
sterilen chirurgischen Eingriffe unter einer Pentobarbital-Narkose.
Der Ischiasnerv wurde von der Seite her durch das Wegbiegen der
Köpfe des
Biceps femoralis auf Höhe
des mittleren Schenkels frei gelegt. Der Ischiasnerv wurde über eine
Strecke von ungefähr
1 cm gelockert und mit einer Iridektomie-Schere ungefähr 3 mm
proximal zur Schienbein-Wadenbein-Bifurkation durchtrennt. Die Lücke zwischen
den Enden der durchtrennten Nerven betrug 2 – 3 mm. Die Wunde wurde mit
Saline gespült
und sanft ausgetupft, um überschüssige Saline
zu entfernen. Es wurde eine sterile Lösung von nicht-polymerisiertem
PEG-Tetraacrylat in die Wunde eingebracht. Mittels einer feinen
Pinzette für
das Halten der Adventitia oder des Perineuriums wurden die Nervenenden
aneinander gefügt,
die Makromerlösung,
die 2,2-Dimethoxy-2-phenoxyacetophenon als Photoinitiator enthielt,
wurde auf die Nervenenden aufgetragen, und die Wunde wurde ungefähr 10 s
langwelligem UV-Licht (365 nm) ausgesetzt, um den Klebstoff zu polymerisieren.
Die Pinzette wurde sanft weggezogen. Es wurde darauf geachtet zu
vermeiden, dass die Makromerlösung
zwischen die beiden Nervenstümpfe floss.
Als Alternative wurde die Verbindung der Nervenstümpfe vor
der Beleuchtung abgeschirmt, z.B. mit einer Metallfolie, um eine
Gelbildung der Makromerlösung
zwischen den Stümpfen
zu verhindern; die verbleibende Makromerlösung wurde dann einfach abgewaschen.
-
Bei
einem alternativen Ansatz können
beide Enden des durchtrennten Nervens mit einem Paar Pinzetten zusammengehalten
werden. Die Spitzen der Pinzetten werden leicht mit Petrolatum beschichtet,
um eine Reaktion mit dem Klebstoff zu verhindern.
-
Der
polymerisierte Klebstoff dient zur Verkapselung der Wunde und zur
Anheftung des Nerven auf dem darunter liegenden Muskel. Die Anastomose
der Nervenenden widersteht einer sanften Bewegung der Verbindung,
was ein gewisses Ausmaß an
Stabilisierung anzeigt. Der Muskel und die Haut wurden mit Nähten geschlossen.
Eine erneute Untersuchung nach einem Monat zeigt, dass die getrennten
Nerven trotz der ungehinderten Aktivität der Tiere verbunden blieben.
-
Beispiel 20: Chirurgischer
Klebstoff
-
Es
wurden Muskellappen aus dem Unterleib weiblicher weißer Neuseeland-Kaninchen
geschnitten und zu Streifen von 1 cm × 5 cm zugeschnitten. Die Lappen
waren ungefähr
0,5 bis 0,8 cm dick. Die Verbindung der Lappen, 1 cm × 1 cm,
wurde mit Hilfe von zwei derartigen Lappen hergestellt. Es wurden
zwei verschiedene Makromerzusammensetzungen aus PEO-Di- und -Tetraacrylat,
0,4K (Di-) und 18,5K (Tetra-), verglichen. Die 0,4K-Zusammensetzung
war eine visköse
Flüssigkeit
und wurde ohne weitere Verdünnung
verwendet. Die 18,5K-Zusammensetzung
wurde als eine 23%ige (Gew./Gew.) Lösung in HBS verwendet. 125 μl einer Ethyleosinlösung in
N-Vinylpyrrolidon (20 mg/ml) wurden zusammen mit 50 μl Triethanolamin
zu jedem ml der Klebstofflösung
gegeben. 100 μl
der Klebstofflösung
wurden auf jeden der einander überlappenden Lappen
aufgetragen. Die Verbindung der Lappen wurde dann durch ein Scannen
mit einem 2-W-Argonionenlaser für
30 s von jeder Seite bestrahlt. Die Festigkeit der resultierenden
Verbindungen wurde über
das Bestimmen der Kraft gemessen, die für das Scheren der Verbindung
benötigt
wurde. Das eine Ende der Verbindung wurde festgeklammert, und es
wurde eine zunehmende Belastung auf das andere Ende ausgeübt, wobei
die Verbindung waagerecht gehalten wurde, bis sie riss. Es wurden
vier Verbindungen für
jede Zusammensetzung getestet. Die 0,4K-Verbindungen hatten eine
Festigkeit von 12,0 ± 6,9
kPa (Mittelwert ± S.D.),
während
die 18,5K-Verbindungen eine Festigkeit von 2,7 ± 0,5 kPa hatten. Es ist wichtig
anzumerken, dass es möglich
war, eine Photopolymerisation und eine annehmbare Festigkeit der
Verbindung zu erzielen, obwohl das Gewebe 6 – 8 mm dick war. Eine spektralphotometrische
Abschätzung
unter Verwendung von Licht von 514 nm zeigte eine Transmission von
unter 1 % durch dieses Muskelgewebe.
-
Beispiel 21: Modifizierung
von Polyvinylalkohol
-
2
g Polyvinylalkohol (Molekulargewicht 100 000 – 110 000) wurden in 20 ml
heißem
DMSO gelöst.
Die Lösung
wurde auf Raumtemperatur abgekühlt,
und es wurden 0,2 ml Triethylamin und 0,2 ml Acryloylchlorid unter
heftigem Rühren
unter einer Argonatmosphäre
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang auf 70°C erhitzt
und abgekühlt.
Das Polymer wurde in Aceton ausgefällt, in heißem Wasser wieder gelöst und erneut
in Aceton ausgefällt.
Schließlich
wurde es im Vakuum 12 Stunden lang bei 60°C getrocknet. Eine 5–10%ige
(Gew./Vol.) Lösung
dieses Polymers in PBS wurde mit dem UV-Photoinitiator gemischt
und unter Verwendung von langwelligem UV-Licht polymerisiert, um
Mikrokügelchen
von 200 – 1
000 μm Größe herzustellen.
-
Diese
Mikrokügelchen
waren stabil gegenüber
einem Autoklavieren in Wasser, was anzeigt, dass das Gel kovalent
vernetzt ist. Das Gel ist extrem elastisch. Dieses Makromer, PVA-Multiacrylat,
kann zur Erhöhung der
Vernetzungsdichte in Gelen aus PEG-Diacrylat verwendet werden, was
zu entsprechenden Veränderungen
hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften und der Permeabilität führt. Dieser
Ansatz könnte
mit einer beliebigen Zahl wasserlöslicher Polymere, die chemisch
mit photopolymerisierbaren Gruppen modifiziert sind, verfolgt werden,
z.B. mit wasserlöslichen
Polymeren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Polyvinylpyrrolidon,
Polyethyloxazolin, Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Copolymeren, Polysacchariden
wie Dextran, Alginat, Hyaluronsäure,
Chondroitinsulfat, Heparin, Heparinsulfat, Heparansulfat, Guargummi,
Gellangummi, Xanthangummi, Carrageenangummi sowie Proteinen wie
Albumin, Collagen und Gelatine.
-
Beispiel 22: Verwendung
alternativer photopolymerisierbarer Gruppen
-
Es
können
viele photopolymerisierbare Gruppen verwendet werden, um eine Gelbildung
zu ermöglichen.
Zur Veranschaulichung einer typischen alternativen Synthese wird
im Folgenden eine Synthese von PEG-1K-Urethanmethacrylat beschrieben:
-
Es
wurden 10 g PEG-1K-Diol in einem Rundkolben von 250 ml in 150 ml
Benzol gelöst.
Es wurden langsam 3,38 g 2-Isocyanatoethylmethacrylat und 20 μl Dibutylzinndilaurat
in den Kolben gegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rückfluss
6 Stunden gekocht, abgekühlt
und in 1 000 ml Hexan gegossen. Das Präzipitat wurde dann abfiltriert
und im Vakuum bei 60°C
24 Stunden getrocknet. In diesem Falle war eine über freie Radikale polymerisierbare
Methacrylatgruppe über
eine Urethanbindung am Polymer befestigt statt über eine Esterbindung, wie
sie z.B. erhalten wird, wenn es mit Aryloxylchlorid umgesetzt wird.
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Beispiel 23: Bildung von
Mikrokapseln aus Alginat-PLL-Alginat mit photopolymerisierbaren
Polykationen
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Mikrokapseln
aus Alginat-Polylysin-Alginat werden über das Adsorbieren oder Koazervieren
eines Polykations wie Polylysin (PLL) auf einem gelierten Mikrokügelchen
aus Alginat hergestellt. Die resultierende Membran wird über Wechselwirkungen
zwischen Ladungen zusammengehalten und hat somit eine begrenzte Stabilität. Um diese
Stabilität
zu erhöhen,
kann das Polykation z.B. über
die Einführung
einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung
photopolymerisierbar gemacht werden. Dies kann zur Erhöhung der
Stabilität
der Membran ohne weitere Prozesse oder für eine Reaktion mit beispielsweise
photopolymerisierbarem PEG zur Verbesserung der Biokompatibilität eingesetzt
werden.
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Es
wurden, um die Synthese eines derartigen photopolymerisierbaren
Polykations zu veranschaulichen, 1 g Polyallylaminhydrochlorid in
ein Becherglas von 100 ml eingewogen und in 10 ml destilliertem
Wasser (DW) gelöst.
Der pH der Polymerlösung
wurde mittels 0,2 M Natriumhydroxidlösung auf 7 eingestellt. Das Polymer
wurde dann durch die Ausfällung
in einem großen Überschuss
Aceton abgetrennt. Es wurde dann erneut in 10 ml DW aufgelöst, und
die Lösung
wurde in einen Rundkolben von 50 ml gegeben. Es wurden langsam 0,2
ml Glycidylmethacrylat in das Reaktionsgefäß gegeben, und die Reaktionsmischung
wurde 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde in 200 ml Aceton
gegossen, und das Präzipitat
wurde durch Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet. Dieses
Makromer ist für
die photochemische Stabilisierung eines Alginat-PLL-Alginats nützlich,
sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit einer zweiten polymerisierbaren
Spezies, wie eines PEG-Diacrylats.
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Zusätzlich zur
Verwendung bei der Verkapselung von Zellen in Materialien wie Alginat
könnten
derartige photopolymerisierbare Polykationen als ein Primer oder
Kopplungsagens zur Erhöhung
der Polymeradhäsion
an Zellen, Zellaggregaten, Geweben und synthetischen Materialien
nützlich
sein, und zwar aufgrund einer Adsorption des photopolymerisierbaren
Polymers, das an das photopolymerisierbare PEG-Gel bindet.
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Beispiel 24: Verkapselung
von Hämoglobin
für synthetische
Erythrozyten
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Hämoglobin
kann in seiner freien Form in PEG-Gelen verkapselt werden und durch
die Auswahl einer PEG-Kettenlänge
und einer Vernetzungsdichte, die eine Diffusion verhindern, zurück gehalten
werden. Die Diffusion von Hämoglobin
aus den Gelen kann weiter durch die Verwendung von Polyhämoglobin,
das eine vernetzte Form von Hämoglobin
ist, verhindert werden. Das Polyhämoglobinmolekül ist zu
groß,
als dass es aus dem PEG-Gel diffundieren könnte. Eine geeignete Verkapselung
von entweder nativem oder vernetztem Hämoglobin kann für die Herstellung
synthetischer Erythrozyten eingesetzt werden. Das Einschließen von
Hämoglobin
in kleinen Kugeln von weniger als 5 μm aus diesen äußerst biokompatiblen
Materialien sollte zu verbesserten Zirkulationszeiten im Vergleich
zu vernetztem Hämoglobin
oder in Liposomen verkapseltem Hämoglobin
führen.
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Hämoglobin
in PBS wird mit dem Präpolymer
in der folgenden Formulierung gemischt:
Hämoglobin
in der gewünschten
Menge | |
PEG-DA
(MG 10 000) | 35% |
PEG-DA
(MG 1 000) | 5% |
und 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon in einer
Menge von 1,6% der obigen Lösung.
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Diese
Lösung
wird in einem Verhältnis
von 1 Teil Hämoglobin/Präpolymerlösung zu
5 Teilen Mineralöl in
Mineralöl
gegeben und schnell mit einem motorisierten Mischer zur Bildung
eine Emulsion gemischt, die dann mit langwelligem ultraviolettem
Licht (360 nm) 5 min belichtet wird, um das PEG-Präpolymer
unter Bildung eines Gels zu vernetzen. Das Molekulargewicht des
Präpolymers
kann so gewählt
werden, dass es eine Diffusion des Hämoglobins aus dem Gel verhindert,
wobei niedrigere Molekulargewichte des PEG zu einer geringeren Diffusion
führen.
PEG-DA mit einem Molekulargewicht von 100 000, das außerdem mit
PEG-DA mit einem Molekulargewicht von 1 000 vernetzt ist, sollte
die geeignete Selektivität
bezüglich
der Permeabilität
besitzen, um eine Diffusion des Hämoglobins zu begrenzen, und
es sollte die geeignete Biokompatibilität aufweisen, um im Blutstrom
zirkulieren zu können.
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Beispiel 25: Einschluss
von Enzymen für
die Korrektur metabolischer Erkrankungen und für die Chemotherapie
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Der
angeborene Mangel des Enzyms Katalase verursacht die Akatalasämie. Die
Immobilisierung von Katalase in Netzwerken aus einem PEG-Gel könnte ein
Verfahren eines Enzymersatzes zur Behandlung dieser Krankheit bereit
stellen. Der Einschluss von Glucosidase kann ganz ähnlich für die Behandlung
der Gaucher-Krankheit nützlich
sein. PEG-Gele in
Form von Mikrokügelchen,
die Urease einschließen,
kann in extrakorporalem Blut zur Umwandlung von Harnstoff in Ammoniak
eingesetzt werden. Enzyme wie Asparaginase können Aminosäuren abbauen, die von Tumorzellen
benötigt
werden. Die Immunogenität
dieser Enzyme verhindert den direkten Einsatz in der Chemotherapie.
Der Einschluss solcher Enzyme in PEG kann jedoch eine erfolgreiche
Chemotherapie unterstützen.
Es kann eine geeignete Formulierung für entweder eine langsame Freisetzung
oder gar keine Freisetzung des Enzyms entwickelt werden.
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Katalase
in PBS wird mit dem Präpolymer
in der folgenden Formulierung gemischt:
Katalase
in der gewünschten
Menge | |
PEG-DA
(MG 10 000) | 35% |
PEG-DA
(MG 1 000) | 5% |
PBS | 60% |
und 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon in einer
Menge von 1,6% der obigen Lösung.
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Diese
Lösung
wird in einem Verhältnis
von 1 Teil Katalase/Präpolymerlösung zu
5 Teilen Mineralöl
in Mineralöl
gegeben und schnell mit einem motorisierten Mischer gerührt, um
eine Emulsion zu bilden. Diese Emulsion wird mit langwelligem ultraviolettem
Licht (360 nm) 5 min belichtet, um das PEG-Präpolymer unter Bildung eines
Gels zu vernetzen. Das Molekulargewicht des Präpolymers kann so ausgewählt werden,
dass es die Diffusion der Katalase aus dem Gel verhindert, wobei
kleinere Molekulargewichte des PEG-DA zu einer geringeren Diffusion
führen.
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PEG-DA
mit einem MG von 10 000, das ferner mit PEG-DA mit einem MG von
1 000 vernetzt ist, sollte die geeignete Selektivität bezüglich der
Permeabilität
aufweisen, um die Diffusion der Katalase zu einzuschränken, und
es sollte die geeignete Selektivität bezüglich der Permeabilität aufweisen,
um die Diffusion von Wasserstoffperoxid zu der im Gel eingeschlossenen
Katalase zu erlauben, um die enzymatische Entfernung des Wasserstoffperoxids
aus dem Blutstrom zu ermöglichen.
Weiterhin sollte es die geeignete Biokompatibilität aufweisen,
um im Blutstrom zirkulieren zu können.
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Auf
diese Weise wird das Gel zur kontrollierten Aufnahme eines biologisch
aktiven Agens im Körper verwendet.
Das aktive Agens (Enzym) ist groß und wird im Gel zurück gehalten,
und das Agens, auf das es einwirkt (Substrat), ist klein und kann
in das enzymreiche Kompartiment diffundieren. Das aktive Agens wird jedoch
am Verlassen des Körpers
oder des gewünschten
Körperkompartiments
gehindert, da es nicht aus dem Gelkompartiment diffundieren kann.
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Beispiel 26: Mikroverkapselung
von Zellen zur Untersuchung von Arzneimitteln gegen das humane AIDS-Virus in
vivo
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HIV-infizierte
oder nicht-infizierte humane lymphoblastoide T-Zellen können in
PEG-Gelen, wie es
für andere
Zellen oben beschrieben wurde, verkapselt werden. Diese Mikrokapseln
können
in ein Tier, das kein Mensch ist, implantiert werden, um ein Testsystem
für Arzneimittel
gegen HIV bereit zu stellen, und dann mit den zu testenden Arzneimitteln,
wie AZT oder DDI, behandelt werden. Nach der Behandlung können die
Mikrokapseln wiedergewonnen werden, und die verkapselten Zellen
können
bezüglich
ihrer Vitalität
und funktionellen Normalität
mittels eines Testes mit Fluoresceindiacetat / Ethidiumbromid zur
Unterscheidung lebender und toter Zellen untersucht werden. Das Überleben
der infizierten Zellen zeigt die erfolgreiche Wirkung des Arzneimittels
an. Das Fehlen einer Biokompatibilität ist ein dokumentiertes Problem
bei diesem Ansatz zur Untersuchung von Arzneimitteln, aber es kann
durch die Verwendung der hier beschriebenen Gele überwunden werden.