DE69333622T2 - Neuartige, biologisch aktive polypeptide, ihre herstellung und diese polypeptide enthaltende pharmazeutische zusammensetzung - Google Patents

Neuartige, biologisch aktive polypeptide, ihre herstellung und diese polypeptide enthaltende pharmazeutische zusammensetzung Download PDF

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    • C07K2319/33Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf neue und biologisch aktive Polypeptide, deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
  • Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante Polypeptide, die im Wesentlichen aus einem aktiven Teil bestehen, der von einem natürlichen oder künstlichen Polypeptid mit therapeutischer Aktivität erhalten und an ein Albumin oder eine Albuminvariante gekoppelt ist. Es ist verständlich, dass die therapeutische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide entweder direkt (Behandlung von Krankheiten) oder indirekt (z. B. weil sie in der Prävention von Krankheiten, bei der Entwicklung von Impfstoffen, bei medizinischen Abbildungstechniken und dgl. Verwendbar sind) sein kann.
  • Es wird im folgenden Text verstanden, dass die Albuminvarianten jegliches Protein mit einer hohen Plasmahalbwertszeit bezeichnen, das durch Modifikation (Mutation, Auslöschung und/oder Addition) durch gentechnische Techniken von einem Gen erhalten wird, welches ein Isomorph zu humanem Serumalbumin codiert, so wie jegliches Makromolekül mit einer hohen Plasmahalbwertszeit, das durch in vitro Modifikation des Proteins erhalten wird, welches durch solche Gene codiert wird. Von Albumin, das hoch polymorph ist, sind zahlreiche natürliche Varianten identifiziert und klassifiziert worden [Weitkamp L. R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219].
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, künstliche Proteine herzustellen, die biologisch aktiv sind und pharmazeutisch verwendet werden können. Tatsächlich können zahlreiche Polypeptide, die eine oder mehrere potentiell therapeutische Aktivitäten besitzen, nicht pharmazeutisch genutzt werden. Dies kann verschiedene Gründe haben, so wie insbesondere ihre niedrige Stabilität in vivo, ihre komplexe oder fragile Struktur, die Schwierigkeit, sie in einem industriell akzeptablem Maßstab zu produzieren und dgl.. Gleichermaßen geben einige Polypeptide wegen Problemen der Verabreichung, Konditionierung, Pharmakokinetik usw. nicht die erwarteten Resultate in vivo.
  • Die EP 413 622 offenbart die Fusion von löslichem CD4 mit Serumalbumin. Die WO 90/13653 offenbart bestimmte spezifische Fusionskomponenten mit Albumin, insbesondere mit dem Ziel einer verbesserten Sekretion. Die WO 89/02922 offenbart die Fusion von löslichem CD4 mit einem strukturell verwandten Molekül, nämlich seine Fusion mit einer Kette von Immunglubolinen (Ig).
  • Die vorliegende Erfindung macht es möglich, diese Nachteile zu überwinden. Die vorliegende Erfindung stellt neue Moleküle bereit, die eine optimale therapeutische Ausnutzung der biologischen Eigenschaften dieser Polypeptide ermöglichen. Die vorliegende Erfindung resultiert konkret aus dem Nachweis, dass es möglich ist, jede aktive Struktur, die von einem biologisch aktiven Polypeptid erhalten wird, genetisch an eine andere Proteinstruktur, die aus Albumin besteht, anzukoppeln, ohne die genannten biologischen Eigenschaften zu verändern. Es resultiert auch aus den Nachweisen des Anmelders, dass es humanes Serumalbumin möglich macht, die aktive Struktur effizient an ihrem Wechselwirkungsort zu präsentieren, und dies sorgt für eine hohe Plasmastabilität für das erfindungsgemäße Polypeptid. Die erfindungsgemäßen Polypeptide machen es so möglich, eine gegebene biologische Aktivität für einen verlängerten Zeitraum im Organismus aufrecht zu erhalten. Sie machen es so möglich, die verabreichte Dosis zu reduzieren und in einigen Fällen, den therapeutischen Effekt auszunutzen, in dem z. B. die Nebenwirkungen reduziert werden, die die Folge einer höheren Verabreichung sind. Die erfindungsgemäßen Polypeptide machen es zusätzlich möglich, Strukturen zu erzeugen und zu verwenden, die von biologisch aktiven Polypeptiden erhalten werden, welche sehr klein und deshalb sehr spezifisch für einen gewünschten Effekt sind. Es ist verständlich, dass die Peptide mit einer biologischen Aktivität, welche von therapeutischem Interesse sind, auch nicht natürlichen Peptidsequenzen entsprechen können, die z. B. aus Banken mit zufällig zusammengestellten Peptiden isoliert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide besitzen darüber hinaus eine besonders vorteilhafte Verteilung im Organismus, was ihre pharmakokinetischen Eigenschaften modifiziert und vorteilhaft für die Entwicklung ihrer biologischen Aktivität und ihre Verwendung ist. Zusätzlich haben sie auch den Vorteil, dass sie für den Organismus, in dem sie verwendet werden, kaum eine oder keine Immunreaktion hervorrufen. Letztlich können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch rekombinante Organismen in Maßstäben, die ihre industrielle Ausbeutung ermöglichen, expressiviert (und vorzugsweise sekretiert) werden.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich deshalb auf Polypeptide, die einen aktiven Teil enthalten, der von einem Polypeptid mit einer therapeutischen Aktivität erhalten ist, gekoppelt an ein Albumin oder eine Albuminvariante.
  • In einer konkreten Ausführungsform sind die Peptide, die eine therapeutische Aktivität besitzen, nicht von humanem Ursprung.
  • Noch spezieller ist das Polypeptid mit einer therapeutischen Aktivität bei den erfindungsgemäßen Molekülen ein Polypeptid von humanem Ursprung oder eine molekulare Variante. Es ist ein gesamtes oder ein Teil eines Hormons, eines Interferons, eines Interleukins, von Erythropoietins, von G-CSF oder von Insulin.
  • Der aktive Teil des erfindungsgemäßen Polypeptids kann z. B. aus dem gesamten Polypeptid mit einer therapeutischen Aktivität bestehen oder aus einer Struktur, die davon erhalten wurde, oder alternativ aus einem nicht natürlichen Polypeptid, das aus einer Peptidbank isoliert wurde. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine abgeleitete Struktur so verstanden, dass sie jegliches Polypeptid bedeutet, das durch Modifizieren und Erhalten einer therapeutischen Aktivität erhalten wurde. Unter Modifikation sollte man jede Mutation, Substitution, Auslöschung, Addition oder Modifikation von genetischer und/oder chemischer Natur verstehen. Solche Derivate können aus unterschiedlichen Gründen erzeugt werden, wie beispielsweise insbesondere aus dem Grund des Erhöhens der Affinität des Moleküls zu seinem Bindungsplatz, aus dem Grund des Verbesserns des Niveaus seiner Erzeugung, aus dem Grund des Erhöhens seiner Beständigkeit gegenüber Proteasen, aus dem Grund des Erhöhens seiner therapeutischen Effizienz oder alternativ des Reduzierens seiner Nebenwirkungen oder aus dem Grund der Übertragung neuer biologischer Eigenschaften auf das Molekül. Z. B. besitzen die erfindungsgemäßen chimären Polypeptide pharmakokinetische Eigenschaften und eine biologische Aktivität, die für die Verhinderung oder Behandlung von Krankheiten genutzt werden können.
  • Besonders vorteilhafte erfindungsgemäße Polypeptide sind jene, bei denen der aktive Teil aufweist:
    • (a) die gesamte Peptidstruktur oder
    • (b) eine Struktur, die von (a) durch strukturelle Modifikation (Mutation, Substitution, Hinzufügung und/oder Entfernung von einem oder mehreren Resten) erhalten wurde und eine therapeutische Aktivität besitzt.
  • Von den Strukturen des (b)-Typs können die Moleküle besonders erwähnt werden, bei denen bestimmte N- oder O-Glykosylierungsplätze modifiziert oder unterdrückt worden sind, die Moleküle, bei denen ein oder mehrere Reste substituiert worden sind, oder die Moleküle, bei denen der Zysteinrest substituiert worden ist. Es können auch Moleküle erwähnt werden, die von (a) durch Entfernung von Regionen erhalten werden, die nicht oder nicht stark in die Wechselwirkung mit den betrachteten Bindungsplätzen eingebunden sind oder eine unerwünschte Aktivität entwickeln, und Moleküle, die verglichen mit (a) zusätzliche Reste aufweisen, wie z. B. ein N-terminales Methionin und/oder ein Sekretionssignal und/oder ein Verbindungspeptid.
  • Der aktive Teil der erfindungsgemäßen Moleküle kann entweder direkt oder über ein künstliches Peptid an das Albumin gebunden sein. Weiterhin kann es sowohl das N-terminale Ende als auch das C-terminale Ende des Moleküls ausbilden. Vorzugsweise bildet der aktive Teil bei den erfindungsgemäßen Molekülen den C-terminalen Teil der Chimäre aus. Es ist auch verständlich, dass der biologisch aktive Teil innerhalb der Chimäre wiederholt werden kann. Eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Moleküle ist in 1 wiedergegeben.
  • Ein anderer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen chimären Moleküle. Genauer besteht dieses Verfahren daraus, einen eukaryotischen oder prokaryotischen Zellwirt dazu zu bringen, eine Nukleotidsequenz zu expressivieren, die das gewünschte Polypeptid codiert, um das erzeugte Polypeptid zu ernten.
  • Unter den eukaryotischen Wirten, die innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, mögen Tierzellen, Hefen oder Pilze erwähnt werden. Insbesondere können in Bezug auf Hefen Hefen der Stämme Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces oder Hansenula erwähnt werden. In Bezug auf Tierzellen können COS-, CHO- und C127-Zellen und dergleichen erwähnt werden. Unter den Pilzen, die in der Lage sind, bei der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, können insbesondere Asperpillus-Untergattungen oder Trichoderma-Untergattungen besonders erwähnt werden. Bei den prokaryotischen Wirten ist die Verwendung von Bakterien, wie beispielsweise von Escherichia coli oder von solchen, die zu den Arten Corynebacterium, Bacillus oder Streptomyces gehören, bevorzugt.
  • Die Nukleotidsequenzen, die innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können auf verschiedene Weisen hergestellt werden. Allgemein werden sie durch Zusammenstellen der Sequenz, die jeden der funktionellen Teile des Polypeptids codiert, in der Lesephase erhalten. Das Polypeptid kann durch die Techniken des Fachmanns isoliert werden, beispielsweise direkt von zellulärer Messenger-RNA (mRNA) oder durch erneutes Klonen aus einer komplementären DNA-(cDNA-)Bank, oder alternativ können sie vollständig synthetische Nukleotidsequenzen sein. Es wird weiterhin verstanden, dass die Nukleotidsequenzen auch nachfolgend modifiziert werden können, beispielsweise durch Techniken der Gentechnik, um Derivate oder Varianten der genannten Sequenzen zu erhalten.
  • Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz bei dem erfindungsgemäßen Prozess Teil einer Expressionskassette, die eine Region zum Initiieren der Transkription (Promotorregion) aufweist, die in den Wirtszellen die Expression der Nukleotidsequenz, die unter ihrer Steuerung steht und die die erfindungsgemäßen Polypeptide codiert, erlaubt. Diese Region kann von Promotorregionen von Genen abstammen, die in den verwendeten Wirtszellen stark expressiviert werden, wobei die Expression konstitutiv oder regulierbar ist. In Bezug auf Hefe kann es der Promotor des Gens für Phosphoglyceratkinase (PGK), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD), Lactase (LAC4), Enolasen (ENO), Alkoholdehydrogenasen (ADH) und dergleichen sein. In Bezug auf Bakterien kann es der Promotor der Gene rechts oder links von der Lambda-Bacteriophage (PL, PR) oder alternativ können es die Promotoren der Gene für die Tryptophan-(Ptrp-) oder Lactose-(Plac-)Operone sein. Zusätzlich kann diese Steuerregion modifiziert sein, z. B. durch in vitro Mutationsgenierung, durch Einführung zusätzlicher Steuerelemente oder von synthetischen Sequenzen oder durch Auslöschungen oder Substitutionen der ursprünglichen Steuerelemente. Die Expressionskassette kann auch eine Region für die Beendigung der Transkription aufweisen, die in dem betrachteten Wirt funktional ist und die unmittelbar stromab der Nukleotidsequenz angeordnet ist, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform resultieren die erfindungsgemäßen Polypeptide von der Expression einer Nukleotidsequenz in einem eukaryotischen oder prokaryotischen Wirt und von der Sekretion des Produkts der Expression der genannten Sequenz in das Kulturmedium. Es ist tatsächlich besonders vorteilhaft, in der Lage zu sein, Moleküle über die rekombinante Route direkt in dem Kulturmedium zu erhalten. In diesem Fall geht der Nukleotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, eine "Führer"-Sequenz (oder eine Signalfrequenz) voran, die das entstehende Polypeptid in die Sekretionswege des verwendeten Wirts leitet. Diese "Führer"-Sequenz kann die natürliche Signalsequenz des biologisch aktiven Polypeptids in dem Fall, dass das letztere ein natürlich sekretiertes Protein ist, oder diejenige der stabilisierenden Struktur sein, aber sie kann auch jede andere funktionale "Führer"-Sequenz oder eine künstliche "Führer"-Sequenz sein. Die Wahl der einen oder anderen dieser Sequenzen wird insbesondere durch den verwendeten Wirt bestimmt. Beispiele von funktionalen Signalsequenzen umfassen jene der Gene der Sexualpheromone oder der "Killer"-Toxine von Hefen.
  • Zusätzlich zu der Expressionskassette können ein oder mehrere Marker, die es möglich machen, den rekombinanten Wirt zu selektieren, hinzugefügt werden, wie z. B. das URA3-Gen der Hefe S. cerevisiae oder Gene, die zur Beständigkeit gegenüber Antibiotika beitragen, wie beispielsweise Genitizin (G418), oder gegenüber jeder anderen toxischen Verbindung, wie gegenüber bestimmten Metallionen.
  • Die Einheit, die durch die Expressionskassette und durch die selektierbaren Marker gebildet wird, kann direkt in die betrachteten Wirtszellen eingeführt oder zuvor in einen funktionalen, sich selbst replizierenden Vektor eingesetzt werden. In dem ersten Fall werden dieser Einheit vorzugsweise Sequenzhomologe zu den Regionen, die in dem Genom der Wirtszellen vorliegen, hinzugefügt; die genannten Sequenzen werden dann auf jeder Seite der Expressionskassette und des selektierbaren Gens angeordnet, um so die Frequenz der Integration der Einheit in das Genom des Wirts durch Anstreben der Integration der Sequenzen durch homologe Rekombination zu erhöhen. In dem Fall, in dem die Expressionskassette in ein replikatives System eingesetzt wird, wird ein bevorzugtes Replikationssystem für Hefen der Art Kluyveromyces von dem Plasmid pKD1 erhalten, das ursprünglich von K. drosophilarum isoliert wurde; ein bevorzugtes Replikationssystem für Hefen der Art Saccharomyces wird von dem 2 μ-Plasmid von S. cerevisiae erhalten. Weiterhin können diese Expressionsplasmide das gesamte oder einen Teil des genannten Replikationssystems erhalten, oder sie können Elemente kombinieren, die sowohl von dem Plasmid pKD1 als auch dem 2 μ-Plasmid erhalten wurden.
  • Zusätzlich können die Expressionsplasmide Shuttle-Vektoren zwischen einem bakteriellen Wirt, wie beispielsweise Escherichia coli und der gewählten Wirtszelle sein. In diesem Fall sind ein Replikationsursprung und ein selektierbarer Marker, die in dem bakteriellen Wirt funktionieren, erforderlich. Es ist auch möglich, Restriktionsplätze, die die bakteriellen und einzigartigen Sequenzen umgeben, auf den Expressionsvektor zu platzieren: Dies macht es möglich, diese Sequenzen durch Schneiden und Neuligatur des Rumpfvektors in vitro vor der Transformation der Wirtszellen zu unterdrücken, was in einen Anstieg bei der Anzahl der Kopien resultieren kann und in eine erhöhte Stabilität des Expressionsplasmids in den genannten Wirten. Zum Beispiel können solche Restriktionsplätze Sequenzen entsprechen, wie beispielsweise 5'-GGCCNNNNNGGCC-3' (SfiI) oder 5'-GCGGCCGC-3' (NotI), da diese Plätze sehr selten sind und allgemein bei einem Expressionsvektor fehlen.
  • Nach der Konstruktion solcher Vektoren bzw. einer solchen Expressionskassette wird die letztere gemäß den konventionellen Techniken, die in der Literatur beschrieben sind, in die ausgewählten Wirtszellen eingeführt. Diesbezüglich kann jegliches Verfahren, das das Einführen einer fremden DNA in eine Zelle erlaubt, verwendet werden. Dies kann insbesondere Transformation, Elektroporation, Konjugation oder jede andere Technik, die dem Fachmann bekannt ist, sein. Als ein Beispiel für Wirte vom Hefetyp wurden die verschiedenen verwendeten Stämme von Kluyveromyces durch Behandeln der ganzen Zellen in der Anwesenheit von Lithiumacetat und Polyethylenglykol gemäß der Technik transformiert, die von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163] beschrieben wird. Die Transformationstechnik, die von Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990) 7] beschrieben wird und die Ethylenglykol und Dimethylsulphoxit verwendet, wurde ebenfalls angewendet. Es ist auch möglich, die Hefen gemäß dem Verfahren, das von Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 90] beschrieben wird, durch Elektroporation zu transformieren. Ein alternatives Protokoll wird auch im Detail bei den folgenden Beispielen beschrieben.
  • Nach der Selektion der transformierten Zellen werden Zellen, die die genannten Polypeptide expressivieren, beimpft und die Bergung der genannten Polypeptide kann ausgeführt werden, entweder während des Zellwachstums bei "kontinuierlichen" Prozessen oder am Ende des Wachstums bei "schlagweisen" Kulturen. Die Polypeptide, die das Objekt der vorliegenden Erfindung sind, werden dann für ihre molekulare, pharmakokinetische und biologische Charakterisierung aus dem Kulturüberstand aufgereinigt. Ein bevorzugtes Expressionssystem für die erfindungsgemäßen Polypeptide besteht in der Verwendung von Hefen der Art Kluyveromyces als Wirtszelle, die durch bestimmte Vektoren transformiert sind, welche von dem extrachromosonalen Replikon pKD1 erhalten werden, das ursprünglich von der K. marxianus Variante von Drosophilarum isoliert wurde. Diese Hefen und insbesondere K. lactis und K. fragilis sind allgemein in der Lage, die genannten Vektoren stabil zu replizieren, und besitzen zusätzlich den Vorteil, dass sie in der Liste der G. R. A. S.-("Generally Recognized As Safe" = Allgemein als sicher angesehenen) Organismen enthalten sind. Bevorzugte Hefen sind vorzugsweise industrielle Hefen der Art Kluyveromyces, die in der Lage sind, die genannten Plasmide, die von dem Plasmid pKD1 erhalten werden und in die ein selektierbarer Marker sowie eine Expressionskassette, die die Sekretion des erfindungsgemäßen Polypeptids auf hohem Niveau erlaubt, eingesetzt sind, stabil zu replizieren.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nukleotidsequenzen, die die oben beschriebenen chimären Polypeptide codieren, sowie auf die eukaryotischen oder prokaryotischen rekombinanten Zellen, die solche Sequenzen aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Anwendung der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung als medizinische Produkte. Genauer ist der Gegenstand der Erfindung jegliche pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrerer Polypeptide oder Nukleotidsequenzen enthält, wie sie oben beschrieben sind. Die Nukleotidsequenzen können konkret in der Gentherapie verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird vollständiger beschrieben werden mit Hilfe der folgenden Beispiele, die als illustrativ und nicht limitierend betrachtet werden sollten.
  • LISTE DER FIGUREN
  • Die Darstellungen der Plasmide, die in den folgenden Figuren wiedergegeben sind, sind nicht maßstabgerecht gezeichnet, und nur die Restriktionsplätze, die für das Verständnis der durchgeführten Klonungen wichtig sind, sind eingezeichnet worden.
  • 1: Schematische Wiedergabe der Chimären des SAH-PEPTID-Typs (A), des PEPTID-SAH-Typs (B) bzw. des PEPTID-SAH-PEPTID-Typs (C). Verwendete Abkürzungen: M/LP, Methioninrest als Übersetzungsinitiator, optional gefolgt von einer Signalsequenz für die Sekretion; SAH, reifes Albumin oder eine seiner molekularen Varianten; PEP, Peptid von natürlichem oder künstlichem Ursprung, das eine gegebene therapeutische Eigenschaft besitzt. Die PEP-Sequenz kann bei den Molekülen vom Typ A, B bzw. C mehrfach vorliegen. Der schwarze Pfeil zeigt das N-terminale Ende des reifen Proteins an.
  • SEQ ID No. 1: Beispiele von Nukleotidsequenzen eines HindIII-Restriktionsfragments, das ein chimäres Protein des Prepro-SAH-PEPTID-Typs codiert. Die schwarzen Pfeile zeigen das Ende der "Pre"- und "Pro"-Regionen von SAH an. Der MstII-Restriktionsplatz ist unterstrichen, und der Kodon, der die Beendigung der Übersetzung spezifiziert, steht in fetten Buchstaben.
  • 3: Restriktionsplan für das Plasmid pYG105 und die generische Strategie zum Konstruieren des Plasmids für die Expression des chimären Proteins der vorliegenden Erfindungen. Verwendete Abkürzungen: P, transkriptionaler Promotor; T, transkriptionaler Terminator; IR, invertierte Wiederholungssequenzen des Plasmids pKD1; LP, Signalsequenz für die Sekretion; Apr und Kmr bezeichnen die Gene für die Beständigkeit gegen Ampizillin (E. coli) bzw. gegenüber G418 (Hefen).
  • 4: Beispiele von Nukleotidsequenzen von MstII-HindIII-Restriktionsfragmenten, die von dem von Willebrand-Faktor erhalten werden. Wiedergabe der Struktur der MstII-HindIII-Fragmente der Plasmide pYG1248 (Tafel A), pYG1214 (Tafel B), pYG1206 [Tafel C, bei dieser speziellen Chimäre ist der Leu694-Rest des vWF auch der letzte Rest (Leu585) des SAH] und pYG1223 (Tafel D); die Nummerierung der Aminosäuren entspricht der Nummerierung des reifen vWF nach Titani et al. [Biochemistry 25 (1986) 3171–3184]. Die MstII- und HindIII-Restriktionsplätze sind unterstrichen und der Übersetzungsbeendigungskodon steht in fetten Buchstaben.
  • SEQ ID No. 2: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionssequenz des Plasmids pYG1248. Die Nummerierung der Aminosäuren (rechte Spalte) entspricht dem reifen chimären Protein SAH-vWF470→713 (829 Reste). Die Reste Thr470, Leu494, Asp498, Pro502, Tyr508, Leu694, Pro704 und Pro708 des reifen vWF sind unterstrichen.
  • 5: Charakterisierung des Materials, das nach vier Tagen (Erlenmeyer-)Kultur des Stamms CBS 293.91, der mit den Plasmiden pYG1248 (Plasmid für die Expression einer Chimäre des Typs SAH-vWF Thr470→Val713) und pKan707 (Steuerplasmid) transformiert war, sekretiert war. Bei diesem Experiment wurden die Resultate für die Tafeln A, B und C auf demselben Gel (8,5% SDS-PAGE) laufen gelassen und dann getrennt behandelt.
    A, Coomassie-Blaufärbung; Molekulargewichtstandard (Spur 2); Überstand äquivalent zu 50 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pKan707 in YPL-Medium (Spur 1) oder pYG1248 in YPD-Medium (Spur 3) oder YPL (Spur 4).
    B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials nach Anwendung von Mausantikörpern, die gegen humanes vWF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A, außer dass biotinilierte Molekulargewichtstandards verwendet wurden.
    C, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials nach Anwendung von Kaninchenantikörpern, die gegen humanes Albumin gerichtet sind: Überstand äquivalent zu 50 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pKan707 in YPL-Medium (Spur 1) oder pYG1248 in YPD-Medium (Spur 2) oder YPL (Spur 3).
  • 6: Kinetik der Sekretion einer erfindungsgemäßen Chimäre durch den Stamm CDS293.91, der mit dem Plasmid pYG1206 (SAH-vWF Leu694-Pro708) transformiert ist.
    A, Coomassie-Blaufärbung; Molekulargewichtstandard (Spur 1); Überstand äquivalent zu 2,5 μl einer "Schlagfütterungskultur" in YPD-Medium nach 24 Stunden (Spur 2), 40 Stunden (Spur 3) oder 46 Stunden (Spur 4) Wachstum.
    B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials nach Anwendung von Mausantikörpern, die gegen humanes vWF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A, außer dass biotinilierte Molekulargewichtstandards verwendet wurden.
  • 7: Charakterisierung des Materials, das von K. lactis sekretiert wurde, die mit den Plasmiden pKan707 (Steuerplasmid, Spur 2), pYG1206 (Spur 3), pYG1214 (Spur 4) und pYG1223 (Spur 5) transformiert war; Molekulargewichtstandard (Spur 1). Die Ablagerungen entsprechen 50 μl Überstand aus einer stationären Kultur nach Wachstum in YPD-Medium, Lauf auf einem 8,5% Akrylamidgel und Coomassie-Blaufärbung.
  • SEQ ID No. 3: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1341 (SAH-UK1→135). Auf die Grenze der EGF-artigen Domain (UK1→46), die bei dem MstII-HindIII-Restriktionsfragment des Plasmids pYG1340 vorliegt, ist hingewiesen. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein SAH-UK1→135 (720 Reste).
  • 9: Sekretion der SAH-UK1–46- und SAH-UK1-135-Chimären von dem Stamm CBS 293.91 transformiert mit dem Plasmid pYG1343 (SAH-UK1-46) bzw. pYG1345 (SAH-UK1-135) nach vier Tagen Wachstum (YPL + G418-Medium). Die Ablagerungen (äquivalent zu 50 μl Kultur) sind auf einem 8,5%-PAGE-SDS-Gel gelaufen und mit Coomassie-Blau gefärbt: Überstand eines Klons, der mit den Plasmid pKan707 (Spur 1), pYG1343 (Spur 3) oder pYG1345 (Spur 4) transformiert war; Molekulargewichtstandard (Spur 2).
  • SEQ ID No. 4: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1259 (SAH-G.CSF). Das Limit des G-CSF-Teils (174 Reste) ist angezeigt. Die ApaI- und SstI (SstI)-Restriktionsplätze sind unterstrichen. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein SAH-G.CSF (759 Reste).
  • SEQ ID No. 5: Nukleotidsequenz des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1301 (Chimäre G.CSF-Gly4-SAH). Die schwarzen Pfeile zeigen das Ende der "Pre"- und "Pro"-Regionen von SAH an. Die ApaI- und SstI (SacI)- und MstII-Restriktionsplätze sind unterstrichen. Die G.CSF- (174 Reste) und SAH-(585 Reste)Domänen sind durch zwei synthetische Linker GGGG getrennt. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein G.CSF-Gly4-SAH (763 Reste). Die Nukleotidsequenz zwischen dem Übersetzungsbeendigungskodon und dem HindIII-Platz kommt von der komplementären SAH-DNA (cDNA), wie es in der Patentanmeldung EP 361 991 beschrieben ist.
  • 12: Charakterisierung des Materials, das nach vier Tagen (Erlenmeyer-)Kultur des Stamms CBS 293.91 transformiert mit den Plasmiden pYG1266 (Plasmid für die Expression einer Chimäre des SAH-G.CSF-Typs) und pKan707 (Steuerplasmid) sekretiert wurde. In diesem Experiment sind die Resultate der Tafeln A, B und C auf demselben Gel (8,5% SDS-PAGE) gelaufen und dann getrennt behandelt worden.
    A, Coomassie-Blaufärbung; Molekulargewichtstandard (Spur 2); Überstand äquivalent zu 100 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pKan707 in YPL-Medium (Spur 1) oder pYG1266 in YPD-Medium (Spur 3) oder YPL (Spur 4).
    B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen humanes G-CSF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A.
    C, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen Humanalbumin gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A.
  • 13: Charakterisierung des Materials, das nach vier Tagen Kultur (Erlenmeyer in YPD-Medium) des Stamms CBS 293.91 transformiert mit den Plasmiden pYG1267 (Chimäre SAH-G.CSF), pYG1303 (Chimäre G.CSF-Gly4-SAH) und pYG1352 (Chimäre SAH-Gly4-G.CSF) sekretiert wurde, nach Laufen auf einem 8,5% SDS-PAGE-Gel.
    A, Coomassie-Blaufärbung: Überstand äquivalent zu 100 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pYG1303 (Spur 1), pYG1267 (Spur 2), pYG1352 (Spur 3); Molekulargewichtstandard (Spur 4).
    B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen humanes G-CSF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A.
  • SEQ ID No. 6: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1382 (SAH-Fv'). Die VH- (124 Reste) und VL-(107 Reste)Domänen des Fv'-Fragments sind durch den synthetischen Linker (GGGGS)x3 getrennt. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein SAH-Fv' (831 Reste).
  • 15: Sekretion der Chimäre SAH-Fv' durch den Stamm CBS 293.91 transformiert mit dem Plasmid pYG1382 (LAC4) nach vier Tagen Wachstum in Erlenmeyerkolben bei 28°C in YPD-Medium (Spur 2) oder YPL (Spur 3); Molekulargewichtsstandard (Spur 1). Die Ablagerungen, die äquivalent zu 200 μl Kultur (Präzipitation mit Ethanol) sind, sind auf einem PAGE-SDS-Gel (8,5%) gelaufen.
    A, Coomassie-Blaufärbung des Gels.
    B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen SAH gerichtet sind.
  • 16: Test der antagonistischen Aktivität bei der Agglutinierung von humanen Blutplättchen, die mit Formaldehyd fixiert sind, in vitro: IC50 der Hybride SAH-vWF694–708, [SAH-vWF470–713 C471G, C474G] und [SAH-vWF470–704 C471G, C474G] verglichen mit dem Standard RG12986. Die Bestimmung der dosisabhängigen Inhibierung der Plättchenagglutinierung wird gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von C. Prior et al. [Bio/Technology (1992) 10 66] beschrieben ist, unter Verwendung eines Aggregameters, das die Änderungen der optischen Transmission aufzeichnet, unter Rühren bei 37°C in der Anwesenheit von humanem vWF, Botrozetin (8,2 mg/ml) und des Testprodukts in verschiedenen Verdünnungen. Die Konzentration des Produkts, die es möglich macht, die kontrollierte Agglutinierung (in der Abwesenheit des Produkts) um die Hälfte zu inhibieren, wird dann bestimmt (IC50).
  • 17: Aktivität auf die Zellproliferation in vitro der Mauslinie NSF60. Die in den Zellkern nach sechs Stunden Inkubation eingebaut Radioaktivität (3H-Thymidin) ist auf der y-Achse wiedergegeben (min–1); die Quantität des Produkts, die auf der x-Achse angegeben ist, ist in seiner Molarität (willkürliche Einheiten) ausgedrückt.
  • 18: Aktivität auf die Granulozytenbildung in vivo bei Ratten. Die Anzahl an Neutrophilen (Mittel für sieben Tiere) ist auf der y-Achse als Funktion der Zeit angegeben. Die getesteten Produkte sind die Chimäre SAH-G.CSF (pYG1266, 4 oder 40 mg/Ratte/Tag), die Referenz G-CSF (10 mg/Ratte/Tag), das rekombinante SAH aufgereinigt von Kluyveromyces lactis-Überstand (SAH, 30 mg/Ratte/Tag, siehe EP 361 991 ) oder physiologische Kochsalzlösung.
  • BEISPIELE
  • ALLGEMEINE KLONIERUNGSTECHNIKEN
  • Die Verfahren, die üblicherweise in der Molekularbiologie angewendet werden, so wie die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA in Cäsiumchloridgradient, die Elektrophorese auf Agarose- oder Akrylamidgelen, die Aufreinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktionen von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, die DNA-Präzipitation in salzhaltivem Medium mit Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli und dergleichen, sind dem Fachmann wohl bekannt und in der Literatur [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Herausgeber), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987] umfangreich beschrieben.
  • Die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Amersham bereitgestellt und gemäß den Empfehlungen der Lieferanten verwendet.
  • Die Plasmide vom pBR322- und pUC-Typ und die Phagen der M13-Serien sind von kommerziellem Ursprung (Bethesda Research Laboratories).
  • Für die Ligatur werden die DNA-Fragmente durch Elektrophorese auf Agarose- oder Akrylamidgelen ihrer Größe nach getrennt, mit Phenol oder mit einer Phenol-/Chloroformmischung extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und dann in der Anwesenheit von Phage-T4-DNA-Ligase (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers inkubiert.
  • Die Füllung der vorstehenden 5'-Enden wird mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferanten durchgeführt. Die Zerstörung der vorstehenden 3'-Enden wird in der Anwesenheit von Phage-T4-DNA-Polymerase (Biolabs) durchgeführt, die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Die Zerstörung der vorstehenden 5' Enden wird durch eine kontrollierte Behandlung mit S1-Nuklease durchgeführt.
  • Platzgerichtete Mutationsgenierung in vitro mit synthetischen Oligodeoxynukleotiden wird gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt wurde, unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits.
  • Die enzymatische Verstärkung des DNA-Fragments durch die so genannte PCR-Technik (Polymerase-catalyzed Chain Reaction = Polymerase-katalysierte Kettenreaktion, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] wird unter Verwendung eines "DNA Thermal Cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt.
  • Die Verifikation der Nukleotidsequenzen wird durch das Verfahren durchgeführt, das von Sangen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, unter Verwendung des Kits, das von Amersham vertrieben wird.
  • Die Transformationen von K. lactis mit DNA der Plasmide für die Expression der Plasmide der vorliegenden Erfindung werden durch jede Technik, die dem Fachmann bekannt ist und für die ein Beispiel im Text gegeben wird, durchgeführt.
  • Soweit nicht anderweitig angegeben, sind die verwendeten Bakterienstämme E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, galK, strAr) oder E. coli TG1 (lac, proA, B, supE, thi, hsdD5/FtraD36, proA+B+, lacIq, lacZ, M15).
  • Die verwendeten Hefestämme gehören zu Knospen treibenden Hefen und spezieller zu den Hefen der Art Kluyveromyces. Insbesondere wurden die Stämme K. lactis MW98-8C (a, uraA, arg, lys, K+, pKD1°) und K. lactis CBS 293.91 verwendet; ein Beispiel des MW98-8C-Stamms wurde am 16. September 1988 beim Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) in Baarn (Niederlande) hinterlegt, wo er unter der Nummer CBS 579.88 registriert wurde.
  • Ein bakterieller Stamm (E. coli), der mit dem Plasmid pET-8c52K transformiert war, wurde am 17. April 1990 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 68306 hinterlegt.
  • Die Hefestämme, die mit den Expressionsplasmiden transformiert waren, die die Proteine der vorliegenden Erfindung codieren, werden in Erlenmeyerkolben oder in 21 Proben-Fermentern (SETRIC, Frankreich) bei 28°C in Nährmedium (YPD: 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Glukose; oder YPL: 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton; 2% Lactose) unter konstantem Rühren kultiviert.
  • BEISPIEL 1: KOPPLUNG AN DEN C-TERMINUS VON SAH
  • Das Plasmid pYG404 ist in der Patentanmeldung EP 361 991 beschrieben. Dieses Plasmid enthält ein HindIII-Restriktionsfragment, das das Prepro-SAH-Gen codiert, dem 21 Nukleotide vorausgehen, die natürlicherweise direkt stromauf des Initiators ATG für die Übersetzung des PGK-Gens von S. cerevisiae vorliegen. Die Nukleotidsequenz dieses Restriktionsfragments ist in der Sequenz ID No. 2 enthalten. Der MstII-Platz, der in der codierenden Sequenz drei Reste von dem Kodon, der das Ende der Übersetzung spezifiziert, entfernt vorliegt, ist insbesondere nützlich als Platz zum Klonen eines biologisch aktiven Peptides von dem gewünscht wird, dass es in der Übersetzungsphase an dem C-Terminus von SAH angekoppelt wird. In einer konkreten Ausführungsform ist es nützlich, Peptide zu verwenden, deren Frequenz durch ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment des Typs 5'-CCTTAGGCTTA [3 × N]pTAAGCTT-3', codiert ist, wobei die Sequenz, die das biologisch aktive Peptide (p Reste) codiert, [3 × N]p ist. Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der drei C-terminalen Aminosäuren (Leucin-Glyzin-Leucin-Reste) dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht, erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. In einer anderen Ausführungsform kann das biologisch aktive Peptid mehr als einmal bei der Chimäre vorliegen.
  • BEISPIEL 2: KOPPELN AN DEN N-TERMINUS VON SAH
  • Bei einer konkreten Ausführungsform machen es die kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung möglich, Hybridgene zu konstruieren, die ein chimäres Protein codieren, das aus der Übersetzungskopplung eines Signalpeptid (zum Beispiel der Prepro-Region von SAH), einer Sequenz, die das biologisch aktive Peptid umfasst, und der reifen Form von SAH oder einer ihrer molekularen Varianten resultiert. Diese Hybridgene werden vorzugsweise bei 5' des Übersetzungsinitiators ATG und bei 3' des Übersetzungsstopkodons durch HindIII-Restritionsplätze begrenzt und codieren chimäre Proteine des PEPTID-SAH-Typs (1, Tafel B). In einem noch konkreteren Ausführungsbeispiel kann das biologisch aktive Peptid mehr als einmal bei der Chimäre vorliegen.
  • BEISPIEL 3: KOPPELUNG AN DEN N- UND C-TERMINUS VON SAH
  • Die kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben sind, machen es möglich, Hybridgene zu konstruieren, die ein chimäres Protein codieren, das aus der Übersetzungskopplung der reifen Form von SAH oder einer seiner molekularen Varianten und eines biologisch aktiven Peptids gekoppelt an die N- und C-terminalen Enden von SAH resultiert. Diese Hybridgene werden vorzugsweise bei 5' des Übersetzungsinitiators ATG und bei 3' des Übersetzungsstopkodons durch HindIII-Restriktionsplätze begrenzt und codieren chimäre Proteine des PEPTID-SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel C) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH. In einem noch konkreteren Ausführungsbeispiel kann das biologisch aktive Peptid mehr als einmal bei der Chimäre vorliegen.
  • BEISPIEL 4: EXPRESSIONSPLASMIDE
  • Die chimären Proteine der vorangehenden Beispiele können unter Verwendung von funktionalen, regulierbaren oder konstitutiven Promotoren, wie beispielsweise jenen, die in den Plasmiden pYG105 (LAC4-Promotor von Kluyveromyces lactis), pYG106 (PGK-Promotor von Saccharomyces cerevisiae), pYG536 (PHO5-Promotor von S. cerevisiae) oder von Hybridpromotoren, wie beispielsweise jenen, die in der Patentanmeldung EP 361 991 beschrieben sind in Hefen expressiviert werden. Die Plasmide pYG105 und pYG106 sind hier insbesondere nützlich, weil sie die Expression der Gene ermöglichen, die durch die HindIII-Restriktionsfragmente, wie sie in den vorangehenden Beispielen beschrieben sind und wie sie in der produktiven Orientierung (definiert als die Orientierung, die die "Prepro"-Region von Albumin proximal relativ zu dem Promotor für die Übersetzung anordnet) in den HindIII-Platz geklont sind, codiert sind, unter Verwendung von Promotoren, die bei K. lactis funktional, regulierbar (pYG105) oder konstitutiv (pYG106) sind. Das Plasmid pYG105 entspricht dem Plasmid pKan707, das in der Patentanmeldung EP 361 991 beschrieben ist und bei dem der HindIII-Restriktionsplatz, welcher einmalig ist und in dem Gen für die Beständigkeit gegenüber Genetizin (G418) angeordnet ist, durch platzgerichtete Mutationsgenierung zerstört wurde, während ein unverändertes Protein bewahrt wurde (Oligodeoxynukleotid 5'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3'). Das SalI-SacI-Fragment, das das URA3-Gen des mutierten Plasmids codiert, wird dann durch ein SalI-SacI-Restriktionsfragment, das eine Expressionskassete bestehend aus dem LAC4-Promotor von K. lactis (in der Form eines SalI-HindIII-Fragments) und dem Terminator des PGK-Gens von S. cerevisiae (in der Form eines HindIII-SacI-Fragments) enthält, ersetzt. Das Plasmid pYG105 ist in den Kluyveromyces-Hefen mitotisch sehr stabil, und ein Restriktionsplan davon ist in 3 wiedergegeben. Die Plasmide pYG105 und pYG106 unterscheiden sich voneinander nur in der Natur des Promotors für die Transkription, der durch das SalI-HindIII-Fragment codiert wird.
  • BEISPIEL 5: TRANSFORMATION DER HEFEN
  • Die Transformation der Hefen, die zu der Art und Kluyveromyces gehören, und insbesondere derjenigen der Stämme MW98-8C und CBS 293,91 von K. lactis, wird beispielsweise durch die Technik der Behandlung ganzer Zellen mit Lithiumacetat [Ito N. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163–168] durchgeführt, die wie folgt angepasst war. Das Wachstum der Zellen wird bei 28°C in 50 ml YPD-Medium unter Rühren und bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) zwischen 0,6 und 0,8 durchgeführt; die Zellen werden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet, in einer sterilen Lösung von TE (10 mM Tris HCl ph 7,4; 1 mM EDTA) gewaschen, in 3 bis 5 ml Lithiumacetat (0,1 M in TE) resuspendiert, um eine Zelldichte von etwa 2 × 108 Zellen/ml zu erhalten, und dann bei 30°C für eine Stunde unter moderatem Rühren inkubiert. Aliquots der resultierenden Suspension von kompetenten Zellen von 0,1 ml werden bei 30°C für eine Stunde in der Anwesenheit von DNA und bei einer Endkonzentration von 35% Polyethylenglykol (PEG4000, Sigma) inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 5 min. bei 42°C werden die Zellen zweimal gewaschen, in 0,2 ml sterilem Wasser resuspendiert und für 16 Stunden bei 28°C in 2 ml YPD-Medium inkubiert, um die phenotypische Expression des Gens für die Beständigkeit gegenüber G418 zu ermöglichen, das unter der Steuerung des PK1-Promotors expressiviert wird (siehe EP 361 991 ); 200 μl der Zellsuspension werden dann auf selektive YPD-Schalen (G418, 200 μg/ml) aufgetragen. Die Schalen werden bei 28°C inkubiert, und die Transformanten erscheinen nach 2 bis 3 Tagen Zellwachstum.
  • BEISPIEL 6: SEKRETION DER CHIMÄREN
  • Nach der Selektion auf Nährmedium mit zugesetztem G418, werden die rekombinanten Klone auf ihre Kapazität getestet, die reife Form des chimären Proteins zu sekretieren. Einige Klone entsprechend dem Stamm CBS 293,91 oder MB98-8C transformiert durch die Plasmide für die Expression der Chimären von SAH und dem biologisch aktiven Teil werden in YPD- oder YPL-Medium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden durch Zentrifugation geborgen, wenn die Zellen die stationäre Wachstumsphase erreichen, optional 10-fach konzentriert durch Präzipitation für 30 min. bei –20°C in einer Endkonzentration von 60% Ethanol, und dann nach Elektrophorese in einem 8,5% SDS-PAGE-Gel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarkierung unter Verwendung primärer Antikörper, die gegen den biologisch aktiven Teil gerichtet sind, oder eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen SAH gerichtet ist. Während der Experimente für die immunologische Detektion wird der Nitrozellulosefilter zunächst in der Anwesenheit spezifischer primärer Antikörper inkubiert, mehrere Male gewaschen, in der Anwesenheit von Ziegenantikörpern, die gegen die primären Antikörper gerichtet sind, inkubiert und dann in der Anwesenheit eines Avidin-Peroxydase-Komplexes unter Verwendung des "ABC-Kits" inkubiert, das von Vectastain (Biosys S. A., Compiegne, Frankreich) vertrieben wird. Die Immunreaktion wird dann durch Zugabe von 3,3'-Diaminbenzidintetrahydrochlorid (Prolabo) in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxyd gemäß den Empfehlungen des Herstellers zum Vorschein gebracht.
  • BEISPIEL 7: VON DEM VON WILLEBRAND-FAKTOR ERHALTENE CHIMÄREN
  • E.7.1. Fragmente, die die Bindung von vWF an die Plättchen antagonisieren
  • E.7.1.1. Thr-470-Val713-Reste von vWF
  • Das Plasmid pET-8c52K enthält ein Fragment der vWF-cDNA-codierenden Reste 445–733 von humanem vWF und umfasst deshalb verschiedene wesentliche Determinanten der Wechselwirkung zwischen vWF und den Blutplättchen auf der einen Seite und bestimmten Elementen der basalen Membran und des sub-endothelialen Gewebes auf der anderen Seite und insbesondere die Peptide G10 und G5, die die Wechselwirkung zwischen vWF und GP1b antagonisieren [Mori H. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-17904]. Diese Peptidsequenz ist identisch mit der entsprechenden Sequenz, die von Titani et al. beschrieben wird [Biochemistry 25 (1986) 3171–3184]. Die Verstärkung dieser genetischen Determinanten kann unter Verwendung des Plasmids pET9c52K, z. B. durch die PCR-Verstärkungstechnik, unter Verwendung von Oligodeoxynukleotiden, die benachbarte Reste, welche auf beiden Seiten der zu verstärkenden Sequenz angeordnet sind, codieren, als Primer ausgeführt werden. Die verstärkten Fragmente werden dann in Vektoren des M13-Typs für ihre Verifikation durch Sequenzieren unter Verwendung entweder des universellen Primers, der auf irgendeiner Seite des mehrfachen Klonplatzes angeordnet ist, oder von Oligodeoxynukleotiden, die für die verstärkte Region des vWF-Gens spezifisch sind, von welcher die Sequenz von verschiedenen Isomorphen bekannt ist [Sadler J. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 6394–6398; Verweij C. L. et al., EMBO J. 5 (1986) 1839–1847; Shelton-Inloes B. B. et al., Biochemistry 25 (1986) 3164–3171; Bonthron D. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1986) 7125–7127] geklont. So erzeugt die PCR-Verstärkung des Plamids pET8c52K mit den Oligodeoxynukleotiden 5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCTGTGAAGCCTGC-3' (Sq1969, der MstII-Platz ist unterstrichen) und 5'-CCCGGGATCCAAGCTTAGACTTGTGCCATGTCG-3' (Sq2029, der HindIII-Platz ist unterstrichen) ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment einschließlich der Thr470 bis Va1713 Reste von vWF (SEQ ID No. 2). Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-NstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel A), direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1248 (SAH-vWF470–713) erzeugt.
  • E.7.1.2. Molekulare Varianten
  • In einer anderen Ausführungsform ist der Bindungsplatz von vWF ein Peptid, das die Thr470 bis Asp498-Reste des reifen vWF umfasst. Diese Sequenz umfasst das Peptid G10 (Cys474-Pro-488), das von Mori et al. [J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901–17904] beschrieben wird und das in der Lage ist, die Wechselwirkung von humanem vWF mit dem GP1b der humanen Blutplättchen zu antagonisieren. Die Sequenz entsprechend dem Peptid G10 wird zuerst, z. B. durch PCR-Verstärkung des Plasmids pET-8c52K mit den Oligodeoxynukleotiden Sq1969 und 5'-CCCGGGATCCAAGCTTAGTCCTCCACATACAG-3' (Sq1970, der HindIII-Platz ist unterstrichen), in ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment (4, Tafel B) eingebaut, was einen MstII-HindIII-Restriktionsfragment erzeugt, das das Peptid G10 umfasst und dessen Sequenz 5'CCTTAGGCTTAACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGACTAAGCTT-3' (die Sequenz, die das Peptid G10 codiert, steht in fetten Buchstaben) lautet. Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplamid pYG1214 erzeugt.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der Platz für das Binden von vWF an GP1b mit der Hilfe von synthetischen Oligodeoxynukleotiden, z. B. mit der Hilfe der Oligodeoxinukleotide 5'-TTAGGCCTCTGTGACCTTGCCCCTGAAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCTAAGCTTA-3' und 5'-GATCTAAGCTTAGGGGGGCAGAGTAGGAGGAGGGGCTTCAGGGGCAAGGTCACAGAGGCC-3, direkt vorgesehen. Diese Oligodeoxynukleotide formen durch Paarbildung ein MstII-BglII-Restriktionsfragment, das das MstII-HindIII-Fragment (4, Tafel C) umfasst, entsprechend dem Peptide D5, das von den Resten Leu694 bis Pro708 von vWF definiert wird. Die Ligatur des MstII-HindIII-Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgel enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von "SAH" codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1206 erzeugt.
  • Nützliche Varianten des Plasmids pET-8c52K werden durch platzgerichtete Mutationsgenierung zwischen den Peptiden G10 und G5 ausgelöscht, z. B. der Plätze für die Bindung an Collagen und/oder an Heparin und/oder an Botrozetin und/oder an Sulphatide und/oder an Ristozetrin. Ein Beispiel ist das Plasmid pMMB9, das durch platzgerichtete Mutationsgenierung zwischen Resten Cys509 und Ile662 zerstört wird. Die PCR-Verstärkung dieses Plasmids mit den Oligodeoxynukleotiden Sq1969 und Sq2029 erzeugt ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment (4, Tafel D), das die Reste Thr470 bis Tyr508 und Arg663 bis Val 713 umfasst und insbesondere die Peptide G10 und D5 von vWF und bei dem insbesondere seine Plätze für die Bindung an Collagen, die zwischen den Resten Glu542 und Met622 angeordnet sind [Roth G. J. et al. Biochemistry 25 (1986) 8357–8361], zerstört sind. Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1223 erzeugt.
  • In anderen Ausführungsformen macht es die Anwendung von kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung möglich, willkürlich Varianten des MstII-HindIII-Restriktionsfragments gemäß der Tafel A von 4 zu erzeugen, bei denen jedoch einer oder mehrere der Plätze für die Bindung an Sulphatide und/oder Botrozetin und/oder Heparin und/oder Collagen zerstört und/oder durch irgendeinen Rest substituiert sind, der mit dem vWF-assoziierten Auftritt von Pathologien vom IIB-Typ zu tun hat.
  • Bei anderen nützlichen Varianten des Plasmids Pet-8c52K werden Mutationen beispielsweise durch platzgerichtete Mutationsgenierung eingeführt, um den Satz von Zysteinen, die an den Positionen 471, 474, 509 und 695 des humanen vWF vorliegen, ganz oder teilweise zu ersetzen oder zu unterdrücken. Konkrete Beispiele sind die Plasmide p5E und p7E, bei denen die Zysteine, die an den Positionen 471 und 474 einerseits bzw. an den Positionen 471, 474, 509 und 695 andererseits vorliegen, durch Glyzinreste ersetzt worden sind. Die PCR-Verstärkung dieser Plasmide mit dem Oligodeoxynukleotiden Sq 2149 (5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCGGTGAAGCCGGC-3', der MstII-Platz ist unterstrichen) und Sq2029 macht es möglich, MstII-HindIII-Restriktionsfragemente zu erzeugen, die die Reste Thr470 bis Va1713 von natürlichem vWF umfassen, mit der Ausnahme, dass mindestens die Zysteinreste an den Positionen 471 und 474 in Glyzinreste mutiert werden. Die Ligatur dieser Fragmente mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, das ein chimäres Protein vom SAH-PEPTID-Typ (1, Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Diese Restriktionsfragmente werden in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was die Expressionsplasmide pYG1283 (Chimäre SAH-vWF470–713, C471G, C474G) und pYG1279 (Chimäre SAH-vWF470–713, C471G, C474G, C509G, C695G) erzeugt.
  • Andere besonders nützliche Mutationen wirken sich auf mindestens einen Rest aus, der mit den vWF-assoziierten Typ IIB-Pathologie (Anstieg der intrinsischen Affinität von vWF für GP1b) zu tun hat, wie beispielsweise die Reste Arg543, Arg545, Trp550, Val551, Val553, Pro574 oder Arg578. Die genetischen Rekombinationstechniken in vitro machen es auch möglich, willkürlich einen oder mehrere zusätzliche Reste in die Sequenz von vWF einzuführen, z. B. ein überzähliges Methionin zwischen den Positionen Asp539 und Glu542.
  • E.7.2. Fragmente, die die Bindung von vWF an das Subendothelium antagonisieren
  • In einer konkreten Ausführungsfunktion werden die Plätze für die Bindung von vWF an die Komponenten des subendothelialen Gewebes, z. B. an Collagen, durch PCR-Verstärkung des Plasmids pET-8C52K z. B. mit den Oligodeoxynukleotiden Sq2258 (5'-GGATCCTTAGGGCTGTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTC-3', der MstII-Platz ist unterstrichen) und Sq2259 (5'GAATTCAAGCTTAACAGAGTAGCTAACGATCTCGTCC-3', der HindIII-Platz ist unterstrichen) erzeugt, was ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment erzeugt, das die Reste Cys509 bis Cys695 von natürlichem vWF codiert. Molekulare Auslöschungsvarianten oder modifizierte Varianten, die jegliche gewünschte Kombination zwischen den Plätzen für die Bindung von vWF an Sulphatide und/oder an Botrozitin und/oder an Heparin und/oder an Collagen und/oder an jeden Rest, der für einem Modifikation der Affinität von vWF für GP1b verantwortlich ist (vWF-assoziierte Typ II-Pathologien), aufweisen, werden ebenfalls erzeugt. In einer anderen Ausführung kann die Domain, die in der Lage, ist, ein Collagen zu fixieren, auch von den vWF-Fragment kommen, das zwischen den Resten 911 und 1.114 liegt und von Pareti et al. [J. Biol. Chem. (1987) 262: 13835–13841] beschrieben ist. Die Ligatur dieser Fragmente mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt HindIII-Restriktionsfragmente, die ein Hybridgen enthalten, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1, Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Diese Restriktionsfragmente werden in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was die entsprechenden Expressionsplasmide erzeugt, z. B. das Plasmid pYG1277 (SAH-vWF509–695).
  • E.7.3. Reinigung und molekulare Charakterisierung der Chimären von SAH und vWF
  • Die Chimären, die in den Kulturüberständen entsprechend den z. B. mit den Expressionsplasmiden gemäß den Beispielen E.7.1. und E.7.2. transformierten CBS293.91-Stämmen vorliegen, werden zunächst mittels Antikörpern charakterisiert, die spezifisch für den SAH-Teil und für den vWF-Teil sind. Die Resultate der 5 und 7 zeigen, dass die Hefe K. lactis in der Lage ist, chimäre Proteine zwischen SAH und einem Fragment von vWF zu sekretieren, und dass diese Chimären immunologisch reaktiv sind. Es mag auch wünschenswert sein, einige dieser Chimären aufzureinigen. Die Kultur wird dann zentrifugiert (10.000 g, 30 min.), der Überstand wird durch ein 0,22 mm Filter (Millipore) hindurchgeführt und dann durch Ultrafiltration (Amicon) unter Verwendung einer Membran, deren Abscheidungsgrenzwert bei 30 kDa liegt, konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wird dann gegen eine Tris-HCl-Lösung (50 mN pH 8) dialysiert und dann auf einer Säule gereinigt. Z. B. wird das Konzentrat, das dem Kulturüberstand des CBS293.91-Stamms entspricht, der mit dem Plasmid pYG1206 transformiert wurde, durch Affinitätschromatographie auf Blau-Trisakryl (IBF) gereinigt. Eine Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie kann auch angewendet werden. Z. B. kann in dem Fall der Chimäre SAH-vWF470–713 das nach der Ultrafiltration erhaltene Konzentrat gegen eine Tris-HCl-Lösung (50 nM pH 8) dialysiert werden und dann in 20 ml Fraktionen auf eine Kationenaustauschsäule (5 ml) (S Fast Flow, Pharmacia) geladen werden, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Die Säule wird dann einige Male mit der Tris-HCl-Lösung (50 nM pH 8) gewaschen, und das chimäre Protein wird dann durch einen NaCl-Gradienden (0 bis 1 M) von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die das chimäre Protein enthalten, werden dann zusammengefasst und gegen eine 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 8) dialysiert und dann erneut auf die S Fast Flow-Säule geladen. Nach der Elution von der Säule, werden die Fraktionen, die das Protein enthalten, zusammengefasst, gegen Wasser dialysiert und dann vor der Charakterisierung gefriergetrocknet: Z. B. ergibt das Sequenzieren (Applied Biosystem) des Proteins [SAH-vWF470704 C471G, C474], das von der Hefe CBS 293,91 sekretiert wird, die N-terminale Sequenz, die für SAH erwartet wird (Asp-Ala-His ...), was eine korrekte Reifung der Chimäre direkt an den C-Terminus des Dubletts der Reste Arg-Arg der "Pro"-Region von SAH (SEQ ID No. 1) anzeigt. Der im Wesentlichen monomere Charakter der chimären Proteine zwischen SAH und vWF wird auch durch ihr Elutionsprofil auf einer TSK 3000 Säule [Toyo Soda Company, eingestellt mit einer Kakodylatlösung (pH7), die 0,2 M Na2SO4 enthält] bestätigt: Z. B. verhält sich die Chimäre [SAH-vWF 470–704 C471G, C474G] unter diesen Bedingungen wie ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 95 kDa, was auf ihren monomeren Charakter hinweist.
  • BEISPIEL 8: CHIMÄREN, DIE VON UROKINASE ERHALTEN WERDEN
  • E.8.1. Konstruktionen
  • Ein Fragment, das dem aminoterminalen Fragment von Urokinase entspricht (ATF = EGF-artige Domain plus Kringeldomain) kann von der entsprechenden Messenger-RNA aus Zellen bestimmter humaner Karzinome erhalten werden, z. B. unter Verwendung des RT-PCR-Kits, das von Pharmacia vertrieben wird. Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das dass ATF von humaner Urokinase umfasst, ist in SEQ ID No. 3 angegeben. Die Ligatur des HindIII-MstII-Fragments des Plasmids pYG404 mit diesem MstII-HindIII-Fragment macht es möglich, das HindIII-Fragment des Plasmids pYG1341 zu erzeugen, das ein chimäres Protein codiert, in dem das SAH-Molekül genetisch an das ATF gekoppelt ist (SAH-UK1→135). In gleicher Weise enthält das Plasmid pYG1340 ein HindIII-Fragment, das eine Chimäre codiert, die aus SAH direkt gefolgt von den ersten 46 Resten humaner Urokinase zusammengesetzt ist (SAH-UK1→46, siehe SEQ ID No. 3). Das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1340 (SAH-UK1→46) in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz der Plasmide pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) erzeugt die Expressionsplasmide pYG1343 bzw. pYG1342. In gleicher Weise erzeugt das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1341 (SAH-UK1→135) in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz der Plasmide pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) die Expressionsplasmide pYG1345 bzw. pYG1344.
  • E.8.2. Sekretion der Hybride
  • Nach Selektion auf Nährmedium, das mit G418 angereichert war, werden die rekombinanten Klone auf ihre Kapazität getestet, die reife Form des chimären Proteins SAH-UK zu sekretieren. Einige Klone, die dem Stamm K. lactis CBS 293.91 entsprechen, der mit den Expressionsplasmiden gemäß dem Beispiel E.9.1. transformiert ist, werden in selektivem flüssigen Komplettmedium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden dann nach Elektrophorese auf einem 8,5% Akrylamidgel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarkieren unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen Humanalbumin oder gegen humane Urokinase gerichtet ist, als Antikörper. Die Resultate von 9 zeigen, dass die Hybridproteine SAH-UK1→46 und SAH-UK1→135 besonders gut von der Hefe Kluyveromyces sekretiert werden.
  • E.8.3. Reinigung der Chimären von SAH und Urokinase
  • Nach der Zentrifugation einer Kultur des CBS 291.91-Stamms, der mit den Expressionsplasmiden gemäß Beispiel E.8.1 transformiert ist, wird der Kulturüberstand durch ein 0,22 mm Filter (Millipore) hindurchgeführt und dann durch Ultrafiltration (Amicon) unter Verwendung einer Membran konzentriert, deren Ausschlussgrenzwert bei 30 kDa liegt. Das erhaltene Konzentrat wird dann ausgehend von einer Stammlösung von 1 M Tris-HCl (pH 7) auf 50 nM Tris-HCl eingestellt und dann in 20 ml-Fraktionen auf eine Anionenaustauschsäule (3 ml) (D-Zephyr Sepracor) geladen, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Das chimäre Protein (SAH-UK1→46 oder SAH-UK1→135) wird dann durch einen NaCl-Gradienden (0 bis 1 M) von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die das chimäre Protein enthalten, werden dann zusammengefasst und gegen eine 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 6) dialysiert und erneut auf eine D-Zephyr-Säule geladen, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Nach der Elution von der Säule, werden die Fraktionen, die das Protein enthalten, zusammengefasst, gegen Wasser dialysiert und vor der Charakterisierung ihrer biologischen Aktivität und insbesondere bezüglich ihrer Fähigkeit, Urokinase von ihren Zellrezeptoren zu verdrängen, gefriergetrocknet.
  • BEISPIEL 9: CHIMÄREN, DIE VON G-CSF ERHALTEN WERDEN
  • E.9.1. Konstruktionen
  • E.9.1.1. Kopplung an den C-Terminus von SAH
  • Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das die reife Form von humanem G-CSF enthält, wird z. B. gemäß der folgenden Strategie erzeugt: Ein KpnI-HindIII-Restriktionsfragment wird zunächst durch die enzymatische PCR-Verstärkungstechnik unter Verwendung der Oligodeoxynukleotide Sq2291 (5'-CAAGGATCCAAGCTTCAGGGCTGCGCAAGGTGGCGTAG-3', wobei der HindIII-Platz unterstrichen ist) und Sq2292 (5'-CGGGGTACCTTAGGCTTAACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3', wobei der KpnI-Platz unterstrichen ist) als Primer auf dem Plasmid BBG13, das als Matrize diente, erhalten. Das Plasmid BBG13 enthält das Gen, das die B-Form (174 Aminosäuren) von reifem humanen B-CSF codiert, das von British Bio-technology Limited, Oxford, England erhalten wird. Das enzymatische Verstärkungsprodukt von ungefähr 550 Nukleotiden wird dann mit den Restriktionsenzymen KpnI und HindIII aufgeschlossen und in den Vektor pUC19 geklont, der mit denselben Enzymen geschnitten wurde, was das rekombinante Plasmid pYG1255 erzeugt. Dieses Plasmid ist die Quelle für ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das es möglich macht, G-CSF unmittelbar stromab von SAH zu fusionieren (Chimäre SAH-G.CSF) und dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID No. 4 angegeben ist.
  • Es mag auch wünschenswert sein, ein Linkerpeptid zwischen dem SAH-Teil und G-CSF einzusetzen, um beispielsweise eine bessere funktionelle Darstellung des übertragenden Teils zu ermöglichen. Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment wird beispielsweise durch Substitution des MstII-ApaI-Fragments des Plasmids pYG durch die Oligodeoxinukleotide Sq2742 (5'TTAGGCTTAGGTGGTGGCGGTACCCCCCTGGGCC-3', wobei die Kodons, die die Glyzinreste dieses speziellen Verbinders codieren, unterstrichen sind) und Sq2741 (5'-CAGGGGGGTACCGCCACCACCTAAGCC-3') erzeugt, die durch Paarbildung ein MstII-ApaI-Fragment bilden. Das so erzeugte Plasmid enthält deshalb ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, dessen Frequenz mit der Ausnahme des MstII-ApaI-Fragments identisch mit derjenigen von SEQ ID No. 4 ist.
  • Die Ligatur des HindIII-MstII-Fragments des Plasmids pYG404 mit dem MstII-HindIII-Fragment des Plasmids pYG1255 macht es möglich, dass HindIII-Fragment des Plasmids pYG1259 zu erzeugen, das ein chimäres Protein codiert, in dem die B-Form des reifen G-CSF durch kinetische Kopplung in der Übersetzungsphase an dem C-Terminus des SAH-Moleküls positioniert ist (SAH-E.CSF).
  • Ein mit der Ausnahme des MstII-ApaI-Fragments identisches HindIII-Restriktionsfragment kann auch leicht erzeugt werden, welches ein chimäres Protein, in dem die B-Form des reifen G-CSF durch genetische Kopplung in der Übersetzungsphase an dem C-Terminus des SAH-Moleküls und eines spezifischen Linkerpeptid positioniert ist, codiert. Z. B. besteht dieser Linker aus 4 Glyzinresten bei dem HindIII-Fragment des Plasmids pYG1336 (Chimäre SAH-Gly4-G.CSF).
  • Das HindIII-Restriktionsfragment des Plasmids pYG1259 wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Restriktionsplatz des Expressionsplasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1266 erzeugt (SAH-G.CSF). In einem anderen Beispiel erzeugt das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1259 in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG106 das Plasmid pYG1267. Die Plasmide pYG1266 und pYG1267 sind wechselseitig isogen mit der Ausnahme des SalI-HindIII-Restriktionsfragment, das den LAC4-Promotor von K. lactis (Plasmid pYG1226) bzw. des PGK-Promotors von S. cerevisiae (Plasmid pYG1267) codiert.
  • In einem anderen Beispiel erzeugt das Klonen des HindIII-Restrktionsfragments des Plamids pYG1336 (Chimäre SAH-Gly4-G.CSF) in der produktiven Orientierung in den HindIII-Patz des Plasmids pYG105 (LAC4) und von pYG106 (PGK) die Expressionsplasmide pYG1351 bzw. pYG1352.
  • E.9.1.2. Kopplung an den N-Terminus von SAH
  • In einer konkreten Ausführungsform machen es die kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung möglich, Hybridgene zu konstruieren, die ein chimäres Protein codieren, das aus der Übersetzungskopplung eines Signalpeptids (z. B. der Prepro-Region von SAH), einer Sequenz, die ein Gen mit einer G-CSF-Aktivität umfasst, und der reifen Form von SAH oder einer ihrer molekularen Varianten resultiert (s. Chimäre der Tafel B, 1). Diese Hybridgene sind vorzugsweise bei 5' des Übersetzungsinitiator-ATG und bei 3' des Übersetzungstoppkodons durch HindIII-Restriktionsplätze begrenzt. Z. B. macht es das Oligodeoxinukleotid Sq2369 (5'-GTTCTACGCCACCTTGCGCAGCCCGGTGGAGGCGGTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG G-3', die unterstrichenen (optionalen) Reste entsprechen bei dieser speziellen Chimäre einem Linkerpeptid, das aus 4 Glyzinresten zusammengesetzt ist) durch platzgerichtete Mutationsgenierung möglich, die reife Form des humanen G-CSF des Plasmids BBG13 in der Übersetzungsphase direkt stromauf der reifen Form von SAH anzubringen, was das Zwischenplasmid A erzeugt. In gleicher Weise macht es die Verwendung des Oligodeoxynukleotids Sq2338 [5'-CAGGGAGCTGGCAGGGCCCAGGGGGGTTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCT-3' (nicht codierender Strang), wobei die Nukleotide, die komplementär zu den Nukleotiden sind, die die ersten N-terminalen Reste der reifen Form des humanen G-CSF codieren, unterstrichen sind] durch platzgerichtete Mutationsgenierung möglich, die Prepro-Region von SAH in der Übersetzungslesephase direkt stromauf der reifen Form des humanen CSF anzukoppeln, was das Zwischenplasmid B erzeugt. Ein HindIII-Fragment, das ein chimäres Protein des PEPTID-SAH-Typs codiert (siehe 1, Tafel B), wird dann durch Kombinieren des HindIII-SstI-Fragments des Plasmids B (Verbindung Prepro-Region von SAH + N-terminales Fragment von reifem CSF) mit dem SstI-HindIII-Fragment des Plasmids A [Verbindung reifes G-CSF-(Glyzin)x4-reifes SAH] erzeugt. Das pYG1301 enthält dieses spezifische HindIII-Restriktionsfragment, das die Chimäre G.CSF-Gly4-SAH codiert, fusioniert direkt stromab der Prepro-Region von SAH (SEQ ID No. 5). Das Klonen dieses HindIII-Restriktionsfragments in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz der Plasmide pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) erzeugt die Expressionsplasmide pYG1302 bzw. pYG1303.
  • E.9.2. Sekretion der Hybride
  • Nach der Selektion auf Nährmedium, dem G418 zugesetzt war, werden die rekombinanten Klone auf ihre Fähigkeit getestet, die reife Form der chimären Proteine von SAH und G-CSF zu sekretieren. Einige Klone, die dem Stamm K. lactis CPS 293.91 entsprechen, der mit den Plasmiden pYG1266 oder pYG1267 (SAH-G.CSF), pYG1302 oder pYG1303 (G.CSF-Gly4-SAH) oder alternativ mit pYG1351 oder pYG1352 (SAH-Gly4-G.CSF) transformiert ist, werden in selektivem flüssigen Komplettmedium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden dann nach Elektroophorese auf einem 8,5% Akrylamidgel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarlierung unter Verwendung von polyklonalen Kaninchenantikörpern, die gegen das humane G-CSF gerichtet sind, oder eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen Humanalbumin gerichtet ist, als primäre Antikörper. Die Resultate gemäß 12 zeigen, dass das Hybridprotein SAH-G.CSF sowohl durch die Antikörper, die die gegen Humanalbumin (Tafel B) als auch gegen humanes G-CSF (Tafel B) gerichtet sind, erkannt werden. Die Resultate gemäß 13 zeigen an, dass die Chimäre SAH-Gly4-G.CSF (Spur 3) ausgesprochen gut durch die Hefe Kluyveromyces sekretiert wird, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass die Anwesenheit des Linkerpeptids zwischen dem SAH-Teil und dem G-CSF-Teil günstiger für ein unabhängiges Falten dieser beiden Teile während des Übergangs der Chimäre auf dem sekretorischen Pfad ist. Weiterhin wird die N-terminate Fusion (G.CSF-Gly4-SAH) ebenfalls durch die Hefe Kluyveromyces sekretiert (13, Spur 1).
  • E.9.3. Reinigung und molekulare Charakterisierung der Chimären von SAH und G-CSF
  • Nach der Zentrifugation einer Kultur des CBS 293.91-Stamms, der mit den Expressionsplasmiden gemäß Beispiel E.9.1. transformiert ist, wird der Kulturüberstand durch ein 0,22 mm Filter (Millipore) hindurchgeführt und dann durch Ultrafiltration (Amicon) unter Verwendung einer Membran, deren Ausschlussgrenzwert bei 30 kDa liegt, konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wird dann ausgehend von einer 1 M-Stammlösung von Tris-HCl (pH 6) auf 50 mM Tris-HCl eingestellt und dann in 20 ml Fraktionen auf eine Ionenaustauschsäule (5 ml) (Q Fast Flow, Pharmacia) geladen, die in demselben Puffer euquilibriert worden ist. Das chimäre Protein wird dann mit einem NaCl-Gradienden (0 bis 1 M) von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die das chimäre Protein enthalten, werden dann zusammengefasst und gegen eine 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 6) dialysiert und dann erneut auf eine Q Fast Flow Säule (1 ml) geladen, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Nach Elution von der Säule werden die das Protein enthaltenden Fraktionen zusammengefasst, gegen Wasser dialysiert und vor der Charakterisierung gefriergetrocknet: Z. B. ergibt das Sequenzieren (Applied Biosystem) des Protein SAH-G.CSF, das von der Hefe CBS293.91 sekretiert wird, die N-terminale Sequenz, die für SAH erwartet wird (Asp-Ala-His ...), was auf eine korrekte Reifung der Chimäre unmittelbar an dem C-Terminus des Dobletts der Reste Arg-Arg der "Pro"-Region von SAH (SEQ ID No. 1) hinweist.
  • BEISPIEL 10: CHIMÄREN DIE VON EINEM IMMUNGLUBOLIN ERHALTEN WERDEN
  • E.10.1. Konstruktionen
  • Ein Fv'-Fragment kann durch gentechnische Techniken konstruiert werden, welches die variablen Fragmente der schweren und leichten Ketten eines Immunglubolins (Ig) codiert, die miteinander durch ein Linkerpeptid verbunden sind [Bird et al., Science (1988) 242: 423; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879]. Schematisch werden die variablen Regionen (ungefähr 120 Reste) der schweren und leichten Ketten für ein gegebenes Ig von der Messenger-RNA des entsprechenden Hybridoms geklont z. B. unter Verwendung des RT-PCR-Kits, das von Pharmacia vertrieben wird (Maus-ScFv-Modul). In einer zweiten Stufe werden die variablen Regionen gentechnisch über ein synthetisches Linkerpeptid gekoppelt, beispielsweise durch den Linker (GGGS)x3. Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das das Fv'-Fragment eines Immunglubolins enthält, das von einem Maushybridom sekretiert wird, ist in SEQ ID No. 6 angegeben. Die Ligatur des HindIII-MstII-Fragments des Plasmids pYG404 mit diesem MstII-HindIII-Fragments macht es möglich, das HindIII-Fragment des Plasmids pYG1382 zu erzeugen, welches ein chimäres Protein codiert, in dem das SAH-Molekül genetisch an das Fv'-Fragment der SEQ ID No. 6 gekoppelt ist (Chimäre SAH-Fv'). Das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1382 in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) erzeugt die Expressionsplasmide pYG1383 bzw. pYG1384.
  • E.10.2. Sekretion der Hybride
  • Nach der Selektion auf Nährmedium, dem G408 hinzugesetzt war, werden die rekombinanten Klone auf ihre Fähigkeit getestet, die reife Form des chimären Proteins SAH-Fv' zu sekretieren. Einige Klone, die dem Stamm K. lactis CBS 293.91 entsprechen, der mit den Plasmiden pYG1383 oder pYG1384 (SAH-Fv') transformiert war, werden in selektivem flüssigen Komplettmedium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden dann nach Elektrophorese auf einem 8,5% Akrylamidgel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarkieren unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen Humanalbumin gerichtet ist, als primärer Antikörper oder direkt inkubiert mit biotinilierten Anitkörpern, die gegen Immungluboline von murinem Ursprung gerichtet sind. Die Resultate gemäß 15 zeigen, dass das Hybridprotein SRA-Fv' sowohl durch Antikörper erkannt wird, die gegen humanes Albumin gerichtet sind (Tafel C) als auch mit biotinilierten Ziegenantikörpern reagiert, die immunologisch reaktiv gegenüber Mausimmunglubolinen sind (Tafel B).
  • BEISPIEL 11: BIOLOGISCHE AKTIVITÄT DER CHIMÄREN
  • E.11.1. Biologische Aktivität in vitro
  • E.11.1.1. Chimären von SAH und vWF
  • Die antagonistische Aktivität der Produkte wird durch Messen der dosisabhängigen Inhibierung der Agglutinierung von humanen Blutplättchen, die mit Paraformaldehyd fixiert waren, gemäß dem Verfahren bestimmt, das durch Prior et al. [Bio/Technology (1992) 10: 66] beschrieben wurde. Die Messungen werden in einem Aggregameter (PAP-4, Bio Data Horsham, PA, USA) durchgeführt, das die Änderungen der optischen Transmission über der Zeit unter Rühren bei 37°C in der Anwesentheit von vWF, von Botrozytin (8,2 mg/ml) und von dem Testprodukt in verschiedenen Verdünnungen (Konzentrationen) aufzeichnet. Für jede Messung werden 400 ml (8 × 107 Blutplättchen) einer Suspension von humanen Blutplättchen, die mit Paraformaldehyd (0,5%) stabilisiert und dann in [NaCl (137 mM); MgCl2 (1 mM); NaH2PO4 (0,36 mM); NaHCO3 (10 mM); KCl (2,7 mM); Glukose (5,6 mM); SAH (3,5 mg/ml); HEPES-Puffer (10 mM, pH 7,35)] resuspendiert wurden, bei 37°C in dem zylindrischen Tank (8,75 × 50 mm, Wellcome Distriwell, 159 rue Nationale, Paris) des Aggregameters für 4 min. vorinkubiert und dann mit 30 ml der Lösung des Testprodukts bei verschiedenen Verdünnungen in einem nichtpyrogenen Formulierungsvehikel []mannitol (50 g/l); Zitronensäure (192 mg/l); L-Lysinmonohydrochlorid (182,6 mg/l); NaCl (88 mg/l); pH eingestellt auf 3,5 durch Zugabe von NaOH (1 N)] oder nur des Formulierungsvehikels (Kontrolle) versetzt. Die resultierende Suspension wird dann für eine Minute bei 37°C inkubiert, und 12,5 ml humanes vWF [American Bioproducts, Parsippany, NJ, USA; 11% von Willibrand-Aktivität gemessen gemäß den Empfehlungen für die Verwendung des PAP-4 (Platelet Aggregation Profiler®) mit Hilfe von mit Formaldehyd fixierten Blutplättchen (2 × 105 Plättchen/Milliliter), von humanem Plasma, das zu 0 bis 100% vWF enthält, und von Ristozetin (10 mg/ml), s. Seiten 36 bis 45: vW ProgramTM] werden zugegeben und bei 37°C für eine Minute inkubiert, bevor 12,5 ml der Botrozetinlösung [von gefriergetrocknetem Tiergift von Bothroos jararaca (Sigma) gemäß der Prozedur aufgereinigt, die von Sugimoto et al. Biochemistry (1991) 266: 18172 beschrieben wurde] zugegeben werden. Das Aufzeichnen der Messwerte der Transmission als Funktion der Zeit wird dann für zwei Minuten unter Rühren mittels eines magnetischen Balkens (Wellcome Distriwell), der in dem Tank angeordnet ist und der mit einem magnetischen Antrieb von 1.100 Umdrehungen pro Minute versehen ist, der von dem Aggregameter bereitgestellt wird, durchgeführt. Die mittlere Änderung der optischen Transmission (n35 für jede Lösung) über der Zeit ist deshalb eine Messung der Blutplättchenagglutinierung aufgrund der Anwesenheit von vWF und Botrozitin in der Abwesenheit oder in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des Testprodukts. Von solchen Aufzeichnungen wird dann die prozentuale Inhibierung der Blutplättchenagglutinierung aufgrund jeder Konzentration des Produkts bestimmt, und man trägt die Gerade, die die prozentuale Inhibierung als Funktion des Kehrwerts der Produktverdünnung angibt, in einem doppeltlogarithmischen Maßstab auf. Die IC50 (d. h. die Konzentration des Produkts, die 50 Inhibierung der Agglutination verursacht) wird dann anhand dieser Geraden bestimmt. Die Tabelle gemäß 6 vergleicht die IC50-Werte einiger der SAH-vWF-Chimären der vorliegenden Erfindung und zeigt, dass einige von ihnen bessere Antagonisten der Blutplättchenagglutinierung sind als das Produkt RG12986, das von Prior et al. beschrieben wird [Bio/Technology (1992) 10: 66] und das in den Tests als Standardwert berücksichtigt wird. Identische Tests für die Inhibierung der Agglutination von humanen Blutplättchen in der Anwesenheit von vWF von Schweineplasma (Sigma) machen es weiterhin möglich zu zeigen, dass einige der Hybride der vorliegenden Erfindung und insbesondere einige Typ IIB-Varianten sehr gute Antagonisten der Blutplättchenagglutinierung in der Abwesenheit von Cofaktoren des Botrozetin-Typs sind. Der Botrozetin-unabhängige Antagonismus dieser spezifischen Chimären kann auch gemäß der Prozedur gezeigt werden, die ursprünglich von Ware et al. beschrieben wurde [Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88: 2946], indem der monoklonale Antikörper125 I-LJ-IB1 (10 mg/ml), ein konkurrierender Inhibitor für die Bindung von vWF an die Blutplättchen-GPIb (Handa M. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 12579) nach 30 min. Inkubation bei 22°C in der Anwesenheit von frischen Blutplättchen (108 Blutplättchen/ml) verdrängt wird.
  • E.11.1.2. Chimären von SAH und G-CSF
  • Die gereinigten Chimären werden auf ihre Fähigkeit getestet, die in vitro-Proliferation der IL3-abhängigen Mauslinie NFS60 zu erlauben, indem der Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin im Wesentlichen gemäß der Prozedur, die von Tsuchija et al. beschrieben wurde [Proc. Natl. Acad. Sci (1986) 83 7633], gemessen wird. Für jede Chimäre werden die Messungen zwischen 3 und 6 Mal in einem drei Punkte Test (drei Verdünnungen des Produkts) in einer Zone durchgeführt, in der die Beziehung zwischen der Menge des aktiven Produkts und dem Einbau von markiertem Thymidin (Amersham) linear ist. In jeder Mikrotiter-Platte wird auch die Aktivität eines Referenzprodukts, das aus rekombinantem humanem G-CSF besteht, welches in Säugetierzellen expressiviert wurde, systematisch eingebaut. Die Resultate gemäß 17 zeigen, dass die Chimäre SAH-G.CSF (pYG1266), die von der Hefe Kluyveromyces sekretiert und gemäß dem Beispiel E.9.3. gereinigt wurde, in der Lage ist, in vitro ein Signal für die Zellproliferation der Linie NFS60 zu vermitteln. In diesem besonderen Fall war die spezifische Aktivität (min–1/Molarität) der Chimäre ungefähr siebenmal niedriger als diejenige der G-CSF-Referenz (ungekoppelt).
  • E.11.2. Biologische Aktivität in vivo
  • Die Aktivität der Stimulation der SAH/G-CSF-Chimären auf Granulozytenbildung in vivo wird nach subkutaner Injektion in Ratten (Sprague-Dawley/CD, 250–300 g, 8–9 Wochen) getestet und mit dem der G-CSF-Referenz verglichen, die unter Verwendung von Säugetierzellen expressiviert wurde. Jedes Produkt, das mit einer Rate von sieben Tieren getestet wird, wird subkutan in die Rücken-Schulter-Region in einer Rate von 100 ml für sieben aufeinander folgende Tage injiziert, (D1–D7). 500 ml Blut werden an den Tagen D-6, D2 (vor der zweiten Injektion); D5 (vor der fünften Injektion) und D8 gesammelt, und eine Blutzählung wird durchgeführt. Bei diesem Test ist die spezifische Aktivität (Einheiten der Leukozytenbildung/Mol injiziert) der Chimäre SAH-G.CSF (pYG1266) identisch mit derjenigen der G-CSF-Referenz (18). Da diese konkrete Chimäre in vitro eine spezifische Aktivität siebenmal niedriger als diejenige der G-CSF-Referenz aufweist (17), ist damit gezeigt, dass die genetische Kopplung des G-CSF an SAH in vorteilhafter Weise die pharmakokinetischen Eigenschaften modifiziert.
  • SEQUENCE LISTING
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Claims (22)

  1. Rekombinantes Polypeptid mit einem von einem Polypetid mit therapeutischer Aktivität erhaltenen aktiven Teil, der an ein Albumin oder eine Albuminvariante genetisch gekoppelt ist, wobei die Albuminvariante eine große Plasma-Halbwertszeit konserviert, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit therapeutischer Aktivität ausgewählt ist aus Hormonen, Interferonen, Interleukinen, Erythropoitin, G-CSF und Insulin.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit therapeutischer Aktivität ein Polypeptid menschlichen Ursprungs ist.
  3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil eine Struktur aufweist, die ausgewählt ist aus (a) einer vollständigen Peptidstruktur oder (b) einem Fragment von (a) oder einer durch strukturelle Modifikation (Mutation, Substitution und/oder Löschung von einem oder mehreren Rest(en)) und Konservierung der therapeutischen Aktivität von (a) erhaltenen Struktur.
  4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin oder die Albuminvariante eine Struktur aufweist, die ausgewählt ist von (a) reifem Albumin, (b) Albumin; und (c) einer von (a) oder (b) durch strukturelle Modifikation (Mutation, Substitution, Addition und/oder Löschung von einem oder mehreren Reten) und Konservierung der hohen Plasma-Halbwertszeit erhaltenen Struktur.
  5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein N-terminales Methionin aufweist.
  6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Linkerpeptid aufweist.
  7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Sekretionssignal aufweist.
  8. Polypeptid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Sekretionssignal das natürliche Sekretionssignal des biologisch aktiven Polypeptids ist.
  9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil an den N-Terminus des Albumins gekoppelt ist.
  10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil an den C-Terminus des Albumins gekoppelt ist.
  11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil mehrere Male vorhanden ist.
  12. Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
  13. Nukleotidsequenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist, die eine "Führer"-Sequenz kodiert, welche die Sekretion des expressivierten Polypeptids ermöglicht.
  14. Expressionskassette, welche eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 12 und 13 aufweist unter der Kontrolle eines Transkriptionsinitiierungsbereichs und optional eines Transkriptionsbeendigungsbereiches.
  15. Selbstreplizierendes Plasmid, welches eine Expressionskassette nach Anspruch 14 aufweist.
  16. Rekombinante eukaryotische oder prokaryotische Zelle, in welche eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 12 oder 13 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 14 oder ein Plasmid nach Anspruch 15 eingesetzt ist.
  17. Rekombinante Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hefezelle, eine Tierzelle, eine Pilzzelle oder eine bakterielle Zelle handelt.
  18. Rekombinante Zelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hefezelle handelt.
  19. Rekombinante Zelle nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Zelle der Art Saccharomyces oder Kluyveromyces handelt.
  20. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 16 bis 19 unter Expressionsbedingungen kultiviert wird und dass das Polypeptidprodukt geborgen wird.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem oder mehreren Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder hergestellt durch ein Verfahren nach Anspruch 20.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14, welche in der Gentherapie einsetzbar ist.
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Families Citing this family (517)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US20070202127A1 (en) * 1993-06-07 2007-08-30 Duke University Nucleic acids encoding DP-178 and other viral fusion inhibitor peptides useful for treating aids
US6479055B1 (en) * 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
FR2719593B1 (fr) * 1994-05-06 1996-05-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur préparation et composition pharmaceutique les contenant.
US7597886B2 (en) * 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US20030198640A1 (en) * 1994-11-07 2003-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for treating inflammatory bowel diseases relating to human tumor necrosis factor-gamma-beta
US7820798B2 (en) * 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
EP0793504B1 (de) * 1994-12-12 2005-06-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimäre zytokine und ihre verwendung
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US6423512B1 (en) 1996-07-26 2002-07-23 Novartis Ag Fusion polypeptides
US20040013664A1 (en) * 1997-01-14 2004-01-22 Gentz Reiner L. Tumor necrosis factor receptors 6 alpha & 6 beta
US7285267B2 (en) * 1997-01-14 2007-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptors 6α & 6β
AT406373B (de) 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
AT405403B (de) * 1997-02-27 1999-08-25 Immuno Ag Reinigung von von willebrand-faktor durch kationenaustauscherchromatographie
EP0979290A2 (de) 1997-04-28 2000-02-16 Aventis Pharma S.A. Adenoviren - vermittelte intratumorale verabreichung eines angiogenese - antagonists zur behandlung der tumoren
AT408443B (de) * 1998-02-27 2001-11-26 Immuno Ag Verfahren zur gewinnung von gereinigtem faktor viii:c/vwf-komplex
US6656906B1 (en) 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6605222B1 (en) * 1998-05-20 2003-08-12 Baxter Aktiengesellschaft Method for producing a factor VIII/von Willebrand factor complex
ATE339507T1 (de) * 1998-06-15 2006-10-15 Gtc Biotherapeutics Inc Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein
US20050181482A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
US7297544B2 (en) * 1998-10-02 2007-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20030215359A1 (en) * 1998-10-02 2003-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US6475743B1 (en) * 1998-10-02 2002-11-05 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US7449338B2 (en) 1998-10-02 2008-11-11 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US7070937B1 (en) 1998-10-02 2006-07-04 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US20030190740A1 (en) * 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
US20040266673A1 (en) * 2002-07-31 2004-12-30 Peter Bakis Long lasting natriuretic peptide derivatives
DE60043021D1 (de) * 1999-05-17 2009-11-05 Conjuchem Biotechnologies Inc Lang wirkende Peptidinhibitoren der Virusfusion mit Körperzellen bei viralen Infektionen
US7601691B2 (en) * 1999-05-17 2009-10-13 Conjuchem Biotechnologies Inc. Anti-obesity agents
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US6951738B2 (en) * 1999-07-16 2005-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptors TR13 and TR14
US20020048571A1 (en) * 1999-07-19 2002-04-25 Jeno Gyuris Chimeric polypeptides of serum albumin and uses related thereto
US6797695B1 (en) * 1999-10-22 2004-09-28 Kyoto University Human FGF-20 gene and gene expression products
PT1232264E (pt) 1999-11-18 2009-11-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Gene fgf-21 humano e produtos da expressão do gene
US6716626B1 (en) * 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
EP1267914B2 (de) * 2000-02-04 2013-11-06 Children's Hospital Research Foundation Verwendung von lysosomal acid lipase zur behandlung von atherosklerose und ähnlichen krankheiten
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2529300T3 (es) * 2000-04-12 2015-02-18 Novozymes Biopharma Dk A/S Proteínas de fusión de albúmina
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
EP1294949A4 (de) 2000-06-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc Menschlicher tumornekrosefaktor delta und epsilon
KR101287395B1 (ko) 2000-06-16 2014-11-04 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 면역특이적으로 BLyS에 결합하는 항체
US20020098163A1 (en) * 2000-07-24 2002-07-25 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptors TR21 and TR22
AU2001286688A1 (en) * 2000-08-25 2002-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptors 6alpha and 6beta
UA93662C2 (uk) * 2000-12-07 2011-03-10 Эли Лилли Энд Компани Гетерологічний пептидильований глюкагон-подібний білок та його застосування для виготовлення лікарського засобу для лікування пацієнтів, що страждають на ожиріння або інсулінонезалежний цукровий діабет
CA2437811A1 (en) 2001-02-09 2002-08-22 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10
MXPA03007619A (es) 2001-02-27 2003-12-04 Maxygen Aps Nuevas moleculas similares a interferon beta.
FR2822834B1 (fr) * 2001-04-02 2005-02-25 Flamel Tech Sa Suspension colloidale de nanoparticules a base de copolymeres amphiphile pour la vectorisation de principes actifs et leur mode de preparation
CN1558773A (zh) * 2001-04-06 2004-12-29 巴斯德研究院 由与破伤风类毒素结合的霍乱弧菌o139的脂多糖的多糖部分组成的缀合疫苗
US6887462B2 (en) 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US20060084794A1 (en) * 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050244931A1 (en) * 2001-04-12 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050054051A1 (en) * 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2444632A1 (en) 2001-04-13 2002-10-24 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
EP1572874B1 (de) 2001-05-25 2013-09-18 Human Genome Sciences, Inc. An trail-rezeptoren immunspezifisch bindende antikörper
EP1401477A4 (de) * 2001-05-25 2005-02-02 Human Genome Sciences Chemokin-beta-1-fusionsproteine
DK1479691T3 (da) * 2001-05-31 2007-03-12 John Erickson Langvarigt aktive fuionspeptidinhibitorer for HIV infektion
JP4319908B2 (ja) 2001-08-24 2009-08-26 ユニバーシティ オブ ビクトリア イノベーション アンド ディベロップメント コーポレーション プロテアーゼ活性化配列を含むプロアエロリシンおよび前立腺癌の治療のための使用方法
US20070031440A1 (en) * 2001-08-30 2007-02-08 Prior Christopher P Modified transferin-antibody fusion proteins
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
RU2004109222A (ru) * 2001-08-30 2005-10-20 Байорексис Фармасьютикал Корпорейшн (Us) Слитые белки модифицированного трансферрина
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US20030228298A1 (en) * 2001-09-04 2003-12-11 Mark Nesbit Abrogen polypeptides, nucleic acids encoding them and methods for using them to inhibit angiogenesis
US6797493B2 (en) * 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
WO2003030821A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR101271635B1 (ko) * 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20080167238A1 (en) * 2001-12-21 2008-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
CA2484556A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) * 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
EP2261250B1 (de) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin Fusionsproteine
KR100441384B1 (ko) * 2002-01-08 2004-07-21 주식회사 안지오랩 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질 발현시스템 및재조합 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질
US20060046249A1 (en) * 2002-01-18 2006-03-02 Fei Huang Identification of polynucleotides and polypetide for predicting activity of compounds that interact with protein tyrosine kinase and or protein tyrosine kinase pathways
US20060241027A1 (en) * 2002-02-07 2006-10-26 Hans-Peter Hauser Hiv inhibiting proteins
US20050222023A1 (en) * 2002-02-07 2005-10-06 Hans-Peter Hauser Albumin-fused kunitz domain peptides
CN1646154B (zh) * 2002-02-07 2010-12-01 诺维信生物制药英国有限公司 与白蛋白融合的抗-血管生成肽
AU2003218456A1 (en) * 2002-04-01 2003-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to gmad
WO2003086458A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
GEP20084387B (en) 2002-04-23 2008-06-10 Cargill Inc Method for production of monatin from tryptophan and indole-3-lactic acid
FR2840614B1 (fr) 2002-06-07 2004-08-27 Flamel Tech Sa Polyaminoacides fonctionnalises par de l'alpha-tocopherol et leurs applications notamment therapeutiques
EP1837031B1 (de) * 2002-06-07 2009-10-14 Waratah Pharmaceuticals, Inc. Methoden und Kompositionen um Diabetes zu behandeln
CN100418981C (zh) * 2002-06-10 2008-09-17 瓦西尼斯公司 在乳腺癌和膀胱癌中差异表达的基因及编码多肽
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
US7425618B2 (en) 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
AU2003256566A1 (en) * 2002-07-16 2004-02-02 Stuart Bussell Methods to construct multimeric dna and polymeric protein sequences as direct fusions or with linkers
FR2843117B1 (fr) * 2002-07-30 2004-10-15 Flamel Tech Sa Polyaminoacides fonctionnalises par au moins un groupement hydrophobe et leurs applications notamment therapeutiques
US20060105387A1 (en) * 2002-08-30 2006-05-18 Prior Christopher P Transferrin fusion proteins libraries
CN1713920A (zh) * 2002-08-30 2005-12-28 比奥雷克西斯药物公司 被修饰的转铁蛋白融合蛋白
AU2003252591A1 (en) 2002-08-30 2004-03-29 Japan Science And Technology Corporation Method of targeted gene disruption, genome of hyperthermostable bacterium and genome chip using the same
US20040052777A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-18 Mark Nesbit Kringle polypeptides and methods for using them to inhibit angiogenesis
US20040229810A1 (en) * 2002-10-22 2004-11-18 Antonio Cruz Gastrin compositions and formulations, and methods of use and preparation
US20060014248A1 (en) * 2003-01-06 2006-01-19 Xencor, Inc. TNF super family members with altered immunogenicity
US7553930B2 (en) * 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
US20050221443A1 (en) * 2003-01-06 2005-10-06 Xencor, Inc. Tumor necrosis factor super family agonists
EP1590458B1 (de) 2003-02-06 2012-10-31 Queen's University Of Belfast Ein auf den bradykinin b2-rezeptor antagonistisch wirkendes peptid aus amphibienhaut
US20070060512A1 (en) * 2003-03-04 2007-03-15 Homayoun Sadeghi Dipeptidyl-peptidase protected protein
KR20110094361A (ko) 2003-04-11 2011-08-23 메디뮨 엘엘씨 재조합 il­9 항체 및 그의 용도
WO2004101620A2 (en) * 2003-05-01 2004-11-25 Compound Therapeutics, Inc. Serum albumin scaffold-based proteins and uses thereof
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20080039379A1 (en) * 2003-05-27 2008-02-14 Waratah Pharmaceuticals, Inc. Compositions Comprising Gastrin Compounds and Their Use in Diabetes
FR2855521B1 (fr) * 2003-05-28 2005-08-05 Flamel Tech Sa Polyaminoacides fonctionnalises par au moins un groupement h ydrophobe et leurs applications notamment therapeutiques.
AU2004259727A1 (en) 2003-07-15 2005-02-03 Barros Research Institute Compositions and methods for immunotherapy of cancer and infectious diseases.
BRPI0412252A (pt) * 2003-07-25 2006-09-19 Conjuchem Inc derivados de insulina de longa duração e métodos dos mesmos
US20060205037A1 (en) * 2003-08-28 2006-09-14 Homayoun Sadeghi Modified transferrin fusion proteins
US20070275871A1 (en) * 2003-08-28 2007-11-29 Biorexis Technology, Inc. Epo Mimetic Peptides and Fusion Proteins
FR2860516B1 (fr) * 2003-10-03 2006-01-13 Flamel Tech Sa Homopolyaminoacides telecheliques fonctionnalises par des groupements hydrophobes et leurs applications notamment therapeutiques
WO2005035564A2 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
ES2383300T3 (es) 2003-11-13 2012-06-20 Hanmi Holdings Co., Ltd Fragmento Fc de IgG para un vehículo de fármacos y procedimiento para su preparación
FR2862535B1 (fr) * 2003-11-21 2007-11-23 Flamel Tech Sa Formulations pharmaceutiques pour la liberation prolongee d'interleukines et leurs applications therapeutiques
FR2862536B1 (fr) * 2003-11-21 2007-11-23 Flamel Tech Sa Formulations pharmaceutiques pour la liberation prolongee de principe(s) actif(s), ainsi que leurs applications notamment therapeutiques
WO2005055936A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 Vaccinex, Inc. Methods of killing tumor cells by targeting internal antigens exposed on apoptotic tumor cells
US7371381B2 (en) 2003-12-12 2008-05-13 Amgen Inc. Anti-galanin antibodies and uses thereof
AU2005207053A1 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 Virxsys Corporation Expression of ApoA-1 and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
SI1729795T1 (sl) * 2004-02-09 2016-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Albuminski fuzijski proteini
US7973139B2 (en) * 2004-03-26 2011-07-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
CA2563379A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Centocor, Inc. Human glp-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
WO2005108418A1 (en) * 2004-05-06 2005-11-17 Conjuchem Biotechnologies Inc. Compounds for specific viral target
CA2574654C (en) 2004-07-22 2014-02-18 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of use for mgd-csf in disease treatment
CA2574280A1 (en) 2004-07-30 2006-03-02 Cargill, Incorporated Alanine 2, 3 aminomutases
US7566701B2 (en) * 2004-09-07 2009-07-28 Archemix Corp. Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics
AU2005282380A1 (en) * 2004-09-07 2006-03-16 Archemix Corp. Aptamer medicinal chemistry
BRPI0514984A (pt) 2004-09-07 2008-07-01 Archemix Corp aptámeros para o fator de von willebrand e sua utilização como terapêuticos para doença trombótica
JP2008513540A (ja) 2004-09-21 2008-05-01 メディミューン,インコーポレーテッド 呼吸器合胞体ウイルスに対する抗体及び該ウイルス用のワクチンを製造する方法
AU2005286662B2 (en) 2004-09-23 2011-10-06 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
JP5017118B2 (ja) * 2004-10-08 2012-09-05 バークシス コーポレーション 組換えタンパク質をインビボ生産するための、非常に豊富な転写産物の標的化トランススプライシング
EP1831365B1 (de) * 2004-10-08 2013-08-07 VIRxSYS Corporation Verwendung von rns trans-splicing zum antikörper gen transfer und zur antikörperherstellung
JP5058822B2 (ja) 2005-01-25 2012-10-24 ファイブ プライム セラピューティクス, インコーポレイテッド 心臓の状態を処置するための組成物および方法
JP5651285B2 (ja) 2005-02-15 2015-01-07 デューク ユニバーシティ 抗cd19抗体および腫瘍学における使用
US7723472B2 (en) * 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Fc 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
EP2221316A1 (de) 2005-05-05 2010-08-25 Duke University CD19-Antikörper-Therapie für Autoimmunerkrankungen
WO2006122079A1 (en) 2005-05-06 2006-11-16 Zymogenetics, Inc. Il-31 monoclonal antibodies and methods of use
DOP2006000117A (es) * 2005-05-19 2007-11-30 Schering Ag Terapia génica de interferon-beta usando un sistema mejorado de expresión regulada
US20080076729A1 (en) * 2005-05-19 2008-03-27 Schering Aktiengesellachaft Interferon-beta gene therapy using an improved, regulated expression system
US20070179113A1 (en) * 2005-05-19 2007-08-02 Schering Aktiengesellachaft GM-CSF gene therapy for Crohn's disease using an improved regulated expression system
GT200600209A (es) * 2005-05-19 2007-01-03 Schering Ag Tratamiento de enfermedades usando un sistema mejorado de expresion regulada
JP2008546392A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレーション 固定されたトランスフェリン融合タンパク質ライブラリー
WO2007014123A2 (en) 2005-07-22 2007-02-01 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins
CA2618681C (en) 2005-08-10 2015-10-27 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
JP5905184B2 (ja) 2005-10-13 2016-04-20 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッドHuman Genome Sciences, Inc. 自己抗体陽性疾患を有する患者の処置に使用するための方法および組成物
CA2562249A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-20 University Of Ottawa Heart Institute Anf analogue
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
WO2007061896A1 (en) 2005-11-17 2007-05-31 Zogenix, Inc. Delivery of viscous formulations by needle-free injection
US20080280328A1 (en) * 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
ES2779992T3 (es) 2005-12-20 2020-08-21 Univ Duke Métodos y composiciones para suministrar agentes activos con propiedades farmacológicas potenciadas
US20070269863A1 (en) * 2005-12-22 2007-11-22 Bridon Dominique P Process for the production of preformed conjugates of albumin and a therapeutic agent
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1816201A1 (de) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modifizierter Koagulationsfaktor VIIa mit verbesserter 'half-life'-Stabiltät
WO2007103469A2 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Aeres Biomedical Ltd. Humanized anti-cd22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP1996716B1 (de) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting
CA2654055A1 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
GB0611405D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Univ Belfast FKBP-L: A novel inhibitor of angiogenesis
KR101193722B1 (ko) * 2006-07-24 2013-01-11 바이오렉시스 파마슈티칼 코포레이션 엑센딘 융합 단백질
TW200817438A (en) * 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
SI2594586T1 (sl) 2006-09-01 2014-11-28 Zymogenetics, Inc. IL-31 monoklonska protitelesa in metode uporabe
WO2008030735A2 (en) 2006-09-06 2008-03-13 Janssen Pharmaceutical N.V. Biomarkers for assessing response to c-met treatment
WO2008030558A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses
EP2114437A2 (de) * 2006-10-16 2009-11-11 ConjuChem Biotechnologies Inc. Modifizierte peptide mit corticotropinfreisetzungsfaktor und verwendungen davon
WO2008052043A2 (en) * 2006-10-24 2008-05-02 Cogenesys, Inc. Opioid receptor agonist fusion proteins
US8268347B1 (en) 2006-10-24 2012-09-18 Aradigm Corporation Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile
AR063384A1 (es) 2006-10-25 2009-01-28 Amgen Inc Agentes terapeuticos a base de peptidos derivados de toxinas
US20100173367A1 (en) * 2006-10-27 2010-07-08 Marner Ii Wesley D Functionalized molecules comprising an autosilification moiety and methods of making and using same
US8920808B2 (en) 2006-10-31 2014-12-30 East Carolina University Cytokine-based fusion proteins for treatment of multiple sclerosis
WO2008056961A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-15 Boryung Pharmaceutical Co., Ltd A novel fusion protein, cell lines expressing the same and preparation method thereof
JP2010510794A (ja) 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
US8754194B2 (en) * 2006-12-22 2014-06-17 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
US20090099074A1 (en) * 2007-01-10 2009-04-16 Conjuchem Biotechnologies Inc. Modulating food intake
US20090088378A1 (en) * 2007-01-12 2009-04-02 Omar Quraishi Long lasting inhibitors of viral infection
CA3001783C (en) 2007-01-30 2020-09-08 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
HUP0700203A2 (en) * 2007-03-08 2008-12-29 Univ Szegedi Sustained release, core-shell structure precipitated citokine bionanocomposit, a process for producing the same and use thereof
CN101678082B (zh) 2007-03-26 2013-06-19 再生医药有限公司 使用cxcl9和抗cxcl9抗体促进骨髓保护和再生的方法
CA2682147C (en) 2007-03-30 2017-08-08 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses
BRPI0810622A2 (pt) 2007-05-02 2020-10-13 Ambrx, Inc. polipeptídeos de interferon beta modificados e seus usos
WO2008136790A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Merial Limited Dna plasmids having improved expression and stability
EP2703011A3 (de) 2007-05-07 2014-03-26 MedImmune, LLC Anti-Icos-Antikörper und ihre Verwendung bei der Behandlung von Krebs, Transplantationen und Autoimmunerkrankungen
CN103223167B (zh) 2007-05-14 2015-06-17 米迪缪尼有限公司 降低嗜酸性粒细胞水平的方法
WO2008144584A2 (en) * 2007-05-16 2008-11-27 Conjuchem Biotechnologies Inc. Cysteic acid derivatives of anti-viral peptides
MX2009012609A (es) * 2007-05-22 2009-12-07 Amgen Inc Composiciones y metodos para producir proteinas de fusion bioactivas.
EP1997830A1 (de) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV-spezifische Bindemoleküle und Mittel zu ihrer Herstellung
US20090203766A1 (en) * 2007-06-01 2009-08-13 Archemix Corp. vWF aptamer formulations and methods for use
US20090054332A1 (en) * 2007-06-21 2009-02-26 Conjuchem Biotechnologies, Inc. Thombopoietin peptide conjugates
AR067536A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
US20090022720A1 (en) * 2007-07-20 2009-01-22 Stephan Fischer Conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
WO2009012600A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins
US20120003241A1 (en) * 2007-08-09 2012-01-05 University Of Rochester Vaccine against botulism
CN103298935A (zh) * 2007-08-15 2013-09-11 阿穆尼克斯公司 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法
CN111909273A (zh) 2007-08-29 2020-11-10 塞诺菲-安万特股份有限公司 人源化的抗-cxcr5抗体、其衍生物及它们的应用
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原(psca)抗体
US8273561B2 (en) * 2007-10-05 2012-09-25 Nuron Biotech, Inc. High pressure treatment of aggregated interferons
EP2050764A1 (de) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Neues polyvalentes bispezifisches Antikörperformat und Verwendung
JP5547083B2 (ja) 2007-11-20 2014-07-09 アンブルックス,インコーポレイテッド 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用
WO2009070642A1 (en) 2007-11-28 2009-06-04 Medimmune, Llc Protein formulation
HUE036548T2 (hu) 2007-12-07 2018-08-28 Zymogenetics Inc IL-31-re specifikus humanizált antitest molekulák
EP2245064B1 (de) 2007-12-21 2014-07-23 Medimmune Limited BINDUNGSELEMENTE FÜR INTERLEUKIN-4-REZEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha)
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
CN101932333A (zh) 2007-12-26 2010-12-29 瓦西尼斯公司 抗c35抗体联合疗法和方法
US20110020368A1 (en) 2008-03-25 2011-01-27 Nancy Hynes Treating cancer by down-regulating frizzled-4 and/or frizzled-1
EP2756756B1 (de) 2008-04-28 2016-01-06 Zogenix, Inc. Neuartige Formulierungen zur Behandlung von Migräne
BRPI0913007A2 (pt) 2008-05-02 2019-09-24 Novartis Ag moléculas de ligação aprimoradas à base de fibronectina e usos das mesmas
CN103739712B (zh) 2008-06-24 2016-10-05 德国杰特贝林生物制品有限公司 具有延长的体内半衰期的因子viii、冯·维勒布兰德因子或它们的复合物
US20100048488A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
CN102170906B (zh) 2008-08-05 2014-07-30 诺华股份有限公司 靶定补体蛋白c5的抗体的组合物和方法
KR101442323B1 (ko) 2008-09-07 2014-09-25 글라이코넥스 인코포레이티드 항-연장된 ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체, 이의 유도체 및 용도
US20120027743A1 (en) * 2008-11-03 2012-02-02 Bayer Healthcare Llc Method for the Treatment of Hemophilia
CN102438652B (zh) 2008-11-12 2014-08-13 米迪缪尼有限公司 抗体制剂
CN102282168A (zh) 2008-11-18 2011-12-14 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
WO2010078325A2 (en) 2008-12-29 2010-07-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Natriuretic polypeptides for reducing or preventing restenosis
CA2749802C (en) * 2009-01-16 2016-08-23 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. New stable formulations of recombinant human albumin-human granulocyte colony stimulating factor fusion protein
WO2010087927A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Medimmune, Llc Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
ES2630253T3 (es) 2009-02-11 2017-08-18 Albumedix A/S Variantes de albúmina y conjugados
ES2712732T3 (es) 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
US20110311521A1 (en) 2009-03-06 2011-12-22 Pico Caroni Novel therapy for anxiety
CA2757287C (en) 2009-03-31 2019-09-10 East Carolina University Cytokines and neuroantigens for treatment of immune disorders
EP2241323A1 (de) 2009-04-14 2010-10-20 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Tenascin-W und Hirnkrebs
KR101183262B1 (ko) 2009-04-22 2012-09-14 (주)알테오젠 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법
DK2427486T3 (en) 2009-05-07 2015-05-26 Novozymes Biopharma Dk As A process for purifying albumin
US11512326B2 (en) 2009-05-26 2022-11-29 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Small angiotensin peptide expression system in mammalian cells
US20120108514A1 (en) 2009-07-09 2012-05-03 University Of Iowa Research Foundation Long acting atrial natriuretic peptide (la-anp) and methods for use thereof
US8945895B2 (en) * 2009-07-31 2015-02-03 Baxter International Inc. Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof
CA2769822C (en) 2009-08-13 2019-02-19 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
EP2292266A1 (de) 2009-08-27 2011-03-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Behandlung von Krebs durch Modulation von Copine III
US8451450B2 (en) * 2009-09-14 2013-05-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Near real time optical phase conjugation
US20120244170A1 (en) 2009-09-22 2012-09-27 Rafal Ciosk Treating cancer by modulating mex-3
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
PL2486141T3 (pl) 2009-10-07 2018-07-31 Macrogenics, Inc. Polipeptydy zawierające regiony fc i mające w wyniku zmian w zakresie fukozylacji ulepszoną funkcję efektorową, i sposoby zastosowania tych polipeptydów
WO2011045352A2 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Novartis Forschungsstiftung Spleen tyrosine kinase and brain cancers
BR112012010110A2 (pt) 2009-10-30 2019-09-24 Boehringer Ingelheim Int regimes de dosagem para terapia combinada para hcv compreendendo bi201335, interferon alfa e ribavirina
US20120213801A1 (en) 2009-10-30 2012-08-23 Ekaterina Gresko Phosphorylated Twist1 and cancer
CN102741280B (zh) 2009-10-30 2015-12-02 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
US9051358B2 (en) 2009-11-19 2015-06-09 Zhejiang University Nonnatural collagen-like protein and use thereof
WO2011066362A1 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Syngenta Participations Ag Stable mixtures and related methods
CN102753194B (zh) 2009-12-02 2015-07-08 伊麦吉纳博公司 靶向人前列腺特异性膜抗原的j591微抗体和双抗体
PL3326643T3 (pl) 2009-12-06 2021-10-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeryczne i hybrydowe polipeptydy czynnika VIII-FC oraz sposoby ich zastosowania
ES2654102T3 (es) 2010-01-19 2018-02-12 Hanmi Science Co., Ltd. Formulaciones líquidas para conjugado de C-CSF de acción prolongada
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
US20130004519A1 (en) 2010-03-05 2013-01-03 Ruth Chiquet-Ehrismann Smoci, tenascin-c and brain cancers
US10233228B2 (en) 2010-04-09 2019-03-19 Albumedix Ltd Albumin derivatives and variants
GB201105584D0 (en) 2011-04-01 2011-05-18 Imp Innovations Ltd Cancer methods
EP2561076A1 (de) 2010-04-19 2013-02-27 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Modulation von xrn1
NZ603829A (en) 2010-05-06 2015-03-27 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein -related protein 6 (lrp6) antibodies
SG185415A1 (en) 2010-05-06 2012-12-28 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (lrp6) multivalent antibodies
US20130089538A1 (en) 2010-06-10 2013-04-11 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute forBiomedical Researh Treating cancer by modulating mammalian sterile 20-like kinase 3
JP2013529627A (ja) 2010-06-24 2013-07-22 パンメド リミテッド ヒドロキシクロロキンまたはヒドロキシクロロキンおよび抗ウイルス剤の組合せを使用するc型肝炎ウイルス関連疾患の処置
EP2585098B1 (de) 2010-06-28 2014-08-27 Five Prime Therapeutics, Inc. Extrazelluläre fzd8-domänen und fusionsmoleküle aus extrazellulären fzd8-domänen für verwendung in der behandlung von obesität und obesität-bedingten erkrankungen
EP3552619A1 (de) 2010-07-09 2019-10-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktor-ix-polypeptide und verfahren zur verwendung davon
WO2012006633A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Chimeric clotting factors
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
WO2012024452A2 (en) 2010-08-17 2012-02-23 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
SI2606070T1 (sl) 2010-08-20 2017-04-26 Novartis Ag Protitelesa za receptor 3 epidermalnega rastnega faktorja (HER3)
AU2011293127B2 (en) 2010-08-27 2016-05-12 Abbvie Stemcentrx Llc Notum protein modulators and methods of use
SG10201506959SA (en) 2010-09-03 2015-10-29 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
WO2012032143A1 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Phosphorylated twist1 and metastasis
PL2616101T3 (pl) 2010-09-14 2015-01-30 Hoffmann La Roche Sposób oczyszczania pegylowanej erytropoetyny
WO2012058768A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
US20140093506A1 (en) 2010-11-15 2014-04-03 Marc Buehler Anti-fungal-agents
NZ703919A (en) 2010-11-15 2016-04-29 Five Prime Therapeutics Inc Treatment of cancer with elevated dosages of soluble fgfr1 fusion proteins
US20130245233A1 (en) 2010-11-24 2013-09-19 Ming Lei Multispecific Molecules
CN103619879A (zh) 2010-12-01 2014-03-05 奥尔德生物控股有限责任公司 抗ngf组合物及其用途
RU2592672C9 (ru) 2010-12-08 2016-11-27 СтемСентРкс, Инк. Новые модуляторы и способы их применения
US20120171195A1 (en) 2011-01-03 2012-07-05 Ravindranath Mepur H Anti-hla-e antibodies, therapeutic immunomodulatory antibodies to human hla-e heavy chain, useful as ivig mimetics and methods of their use
CA2824143C (en) 2011-01-14 2018-12-18 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
EP2663578A2 (de) 2011-01-14 2013-11-20 Five Prime Therapeutics, Inc. Il-27 antagonisten zur behandlung von entzündungserkrankungen
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
EP2681245B1 (de) 2011-03-03 2018-05-09 Zymeworks Inc. Entwurf und konstrukte für ein multivalentes heteromultimeres gerüst
EP2686014A1 (de) 2011-03-16 2014-01-22 Sanofi Verwendung eines antikörperähnlichen proteins mit dualer v-region
NZ732875A (en) 2011-05-20 2022-08-26 H Lundbeck As Use of anti-cgrp or anti-cgrp-r antibodies or antibody fragments to treat or prevent chronic and acute forms of diarrhea
CA3048709A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Alderbio Holdings Llc Use of anti-cgrp antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
HUE055505T2 (hu) 2011-05-20 2021-11-29 H Lundbeck As Anti-CGRP készítmények és alkalmazásuk
WO2012168259A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (ptpn11) and triple-negative breast cancer
WO2012170740A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
WO2012170742A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with hmgb1 antagonists
PT2717898T (pt) 2011-06-10 2019-05-20 Bioverativ Therapeutics Inc Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização
WO2012172495A1 (en) 2011-06-14 2012-12-20 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting tem8
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
CN103649111B (zh) 2011-07-05 2018-03-13 阿尔布梅迪克斯医疗公司 白蛋白制剂和用途
RU2014104302A (ru) 2011-07-08 2015-08-20 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Слитые белки, высвобождающие релаксин, и их применение
LT3513804T (lt) 2011-07-08 2022-05-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Viii faktorius chimeriniai ir hibridiniai polipetidai bei jų panaudojimo būdai
US10656167B2 (en) 2011-07-25 2020-05-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Assays to monitor bleeding disorders
JP2014525439A (ja) 2011-08-30 2014-09-29 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ ナトリウム利尿ポリペプチド
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
CN116063509A (zh) 2011-10-11 2023-05-05 维埃拉生物股份有限公司 Cd40l-特异性tn3-衍生的支架及其使用方法
CN104053671A (zh) 2011-11-01 2014-09-17 生态学有限公司 治疗癌症的抗体和方法
EP2773373B1 (de) 2011-11-01 2018-08-22 Bionomics, Inc. Verfahren zur blockierung eines krebsstammzellenwachstums
WO2013067057A1 (en) 2011-11-01 2013-05-10 Bionomics, Inc. Anti-gpr49 antibodies
AU2012332593B2 (en) 2011-11-01 2016-11-17 Bionomics, Inc. Anti-GPR49 antibodies
CN104039830A (zh) 2011-11-04 2014-09-10 诺华股份有限公司 低密度脂蛋白相关蛋白6(lrp6)-半寿期延长物构建体
CN109897103A (zh) 2011-11-04 2019-06-18 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
US20140294732A1 (en) 2011-11-08 2014-10-02 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Early diagnostic of neurodegenerative diseases
US20140314787A1 (en) 2011-11-08 2014-10-23 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Treatment for neurodegenerative diseases
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
AU2012346056B2 (en) 2011-11-29 2018-02-22 Proclara Biosciences, Inc. Use of P3 of bacteriophage as amyloid binding agents
ES2758433T3 (es) 2011-12-05 2020-05-05 Novartis Ag Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3)
TW201328707A (zh) 2011-12-05 2013-07-16 Novartis Ag 針對表皮生長因子受體3(her3)之區域ii之her3抗體
MX2014007665A (es) 2011-12-21 2015-03-05 Novartis Ag Composiciones y metodos para anticuerpos dirigidos al factor p.
WO2013102825A1 (en) 2012-01-02 2013-07-11 Novartis Ag Cdcp1 and breast cancer
WO2013103896A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cardiovascular or renal diseases
US20130177574A1 (en) 2012-01-11 2013-07-11 Paul I. Terasaki Foundation Laboratory ANTI-HLA CLASS-Ib ANTIBODIES MIMIC IMMUNOREACTIVITY AND IMMUNOMODULATORY FUNCTIONS OF INTRAVENOUS IMMUNOGLOBULIN (IVIg) USEFUL AS THERAPEUTIC IVIg MIMETICS AND METHODS OF THEIR USE
US10800847B2 (en) 2012-01-11 2020-10-13 Dr. Mepur Ravindranath Anti-HLA class-IB antibodies mimic immunoreactivity and immunomodulatory functions of intravenous immunoglobulin (IVIG) useful as therapeutic IVIG mimetics and methods of their use
PL2817338T3 (pl) 2012-02-24 2017-12-29 Abbvie Stemcentrx Llc Modulatory DLL3 i sposoby zastosowania
WO2013137869A1 (en) 2012-03-14 2013-09-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population
EP2825556B1 (de) 2012-03-16 2018-01-03 Albumedix A/S Albuminvarianten
US9592289B2 (en) 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
EP2830646B1 (de) 2012-03-27 2018-03-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von stoffwechselerkrankungen
WO2013143581A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in specific patient subgenotype sub-population
US20150266961A1 (en) 2012-03-29 2015-09-24 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Fridrich Miescher Institute Inhibition of interleukin-8 and/or its receptor cxcr1 in the treatment of her2/her3-overexpressing breast cancer
US10064951B2 (en) 2012-03-30 2018-09-04 Hanmi Science Co., Ltd. Liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate
WO2013166290A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Abbvie Biotherapeutics Inc. P21 biomarker assay
EP2847230B1 (de) 2012-05-10 2020-08-12 Zymeworks Inc. Heteromultimerkonstrukte aus schweren immunoglobulinketten mit mutationen in der fc-domäne
KR102238317B1 (ko) 2012-05-17 2021-04-12 익스텐드 바이오사이언시즈, 인크. 개선된 약물 전달용 캐리어
WO2013177386A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Biotherapeutics Inc. Biomarkers for predicting response to tweak receptor (tweakr) agonist therapy
WO2013181454A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Biostrategies LC Plant lectins as carriers of associated drug substances into animal and human cells
US9902753B2 (en) 2012-06-05 2018-02-27 Cj Healthcare Corporation Method of purifying a long-acting human growth hormone
WO2014001482A1 (en) 2012-06-29 2014-01-03 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniererlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Treating diseases by modulating a specific isoform of mkl1
WO2014006114A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research New treatment for neurodegenerative diseases
US10656156B2 (en) 2012-07-05 2020-05-19 Mepur Ravindranath Diagnostic and therapeutic potential of HLA-E monospecific monoclonal IgG antibodies directed against tumor cell surface and soluble HLA-E
WO2014008480A2 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Biogen Idec Ma Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
IN2015DN01115A (de) 2012-07-13 2015-06-26 Zymeworks Inc
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
US20150202287A1 (en) 2012-08-30 2015-07-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
DK2892547T3 (da) 2012-09-10 2020-10-26 Xencor Inc Dominant, negativ tnf-alpha-hæmmer til anvendelse i behandling af neurologiske cns-forstyrrelser
TW201427685A (zh) 2012-09-25 2014-07-16 Biogen Idec Inc Fix多肽的應用
EP2906235B1 (de) 2012-10-02 2017-07-19 Proclara Biosciences, Inc. Verwendung von p3 aus bakteriophagenfusionsproteinen als amyloidbindemittel
WO2014070953A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
WO2014072481A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
WO2014084859A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Novartis Ag Molecules and methods for modulating tmem16a activities
RS61648B1 (sr) 2012-12-05 2021-04-29 Novartis Ag Kompozicije i metode za antitela koja ciljaju epo
EP2950807B1 (de) 2013-01-30 2018-03-28 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur verwendung bei der behandlung von stoffwechselerkrankungen
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
US20150376597A1 (en) 2013-02-08 2015-12-31 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research (Fmi) Novel methods for the targeted introduction of viruses into cells
JP6480872B2 (ja) 2013-02-15 2019-03-13 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ インスリン分泌性ポリペプチド
MX368730B (es) 2013-02-18 2019-10-14 Vegenics Pty Ltd Moleculas que unen ligando y usos de las mismas.
USRE48805E1 (en) * 2013-03-06 2021-11-02 Vision Global Holdings Ltd. Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein
US9255262B2 (en) * 2013-03-06 2016-02-09 Vision Global Holdings Ltd. Albumin-binding arginine deminase and the use thereof
CA2940513C (en) 2013-03-11 2023-08-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of card protein as therapy for ocular inflammation
EP3611189A1 (de) 2013-03-14 2020-02-19 Novartis AG Antikörper gegen notch 3
AR095527A1 (es) 2013-03-15 2015-10-21 Biogen Idec Inc Formulaciones de polipéptido fc-factor ix
WO2014147489A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Recombinant human albumin-human granulocyte colony stimulating factor for the prevention of neutropenia in pediatric patients
JP6330026B2 (ja) 2013-03-15 2018-05-23 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第viii因子ポリペプチド製剤
JP6505079B2 (ja) 2013-03-29 2019-04-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド 補体c5を標的とする治療薬の血清半減期を増加させるための組成物及び方法
CA2908198A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
DK2796145T3 (da) 2013-04-22 2018-01-29 Csl Ltd Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro
WO2014179448A2 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer
JP2016524611A (ja) 2013-05-23 2016-08-18 ファイヴ プライム セラピューティクス インク がんを治療する方法
US9988444B2 (en) 2013-05-28 2018-06-05 Proclara Biosciences, Inc. Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence with reduced immunogenicity
EP3010527B1 (de) 2013-06-17 2018-08-08 Armo Biosciences, Inc. Verfahren zur beurteilung der proteinidentität und -stabilität
AR096601A1 (es) 2013-06-21 2016-01-20 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso
US9562101B2 (en) 2013-06-21 2017-02-07 Novartis Ag Lectin-like oxidized LDL receptor 1 antibodies and methods of use
KR102476907B1 (ko) 2013-07-03 2022-12-13 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 항-cgrp 항체를 사용하는 글루코오스 대사의 조절
ES2761587T3 (es) 2013-08-07 2020-05-20 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Nuevo método de cribado para el tratamiento de la ataxia de Friedreich
WO2015031541A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Novel sez6 modulators and methods of use
EP3892294A1 (de) 2013-08-28 2021-10-13 AbbVie Stemcentrx LLC Konjugationsverfahren stellenspezifischer antikörper und zusammensetzungen
JP6509867B2 (ja) 2013-08-30 2019-05-08 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 疾患及び障害を治療するためにインターロイキン−10を使用する方法
EP3063275B1 (de) 2013-10-31 2019-09-25 Resolve Therapeutics, LLC Therapeutische nuklease-albumin-fusionen und verfahren
ES2862139T3 (es) 2013-11-11 2021-10-07 Armo Biosciences Inc Procedimientos de uso de Interleucina 10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos
EP4332839A2 (de) 2013-12-06 2024-03-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Pharmakokinetische werkzeuge für populationen und verwendungen davon
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
AU2015236340B2 (en) 2014-03-24 2020-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Lyophilized factor IX formulations
US9546214B2 (en) 2014-04-04 2017-01-17 Bionomics, Inc. Humanized antibodies that bind LGR5
WO2015168207A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Butyrylcholinesterases having an enhanced ability to hydrolyze acyl ghrelin
EP3137899A2 (de) 2014-05-02 2017-03-08 Cerenis Therapeutics Holding SA Hdl-therapiemarker
CN106573072A (zh) 2014-06-02 2017-04-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 降低血清胆固醇的方法
WO2015189816A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research New treatment against influenza virus
DK3173420T3 (da) * 2014-07-23 2021-10-18 Nat Ct Nanoscience & Technology China Polypeptid og polypeptidkompleks til undertrykkelse af tumormetastase og behandling af leukæmi samt fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelse deraf
MD20170020A2 (ro) 2014-07-30 2017-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compoziţii şi metode utilizate pentru tratamentul tulburărilor metabolice
CU24453B1 (es) 2014-08-07 2019-11-04 Novartis Ag Anticuerpos anti proteína similar a angiopoyetina 4
TW201613977A (en) 2014-08-07 2016-04-16 Novartis Ag Angiopoetin-like 4 (ANGPTL4) antibodies and methods of use
AU2015301753B2 (en) 2014-08-12 2021-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with IL-2 and integrin-binding-Fc-fusion protein
US20170216403A1 (en) 2014-08-12 2017-08-03 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker
US20170298360A1 (en) 2014-09-24 2017-10-19 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Lats and breast cancer
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
CA2909044A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-10 Queen's University At Kingston Rhomboid proteins and uses thereof
KR20170068553A (ko) 2014-10-14 2017-06-19 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 인터류킨-15 조성물 및 이의 용도
EP3220961B1 (de) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutische vitamin-d-konjugate
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
JP6675394B2 (ja) 2014-10-22 2020-04-01 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 疾患及び障害の治療のためにインターロイキン−10を使用する方法
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
CN107108711B (zh) 2014-10-23 2021-11-23 恩格姆生物制药公司 包含肽变异体的药物组合物及其使用方法
UY36370A (es) 2014-10-24 2016-04-29 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Polipéptidos fgf-21 modificados y sus usos
AU2015339130C1 (en) 2014-10-31 2021-03-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
CA2966964A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Michal Novak Humanized tau antibodies in alzheimer's disease
TW201632542A (zh) 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體g3p胺基酸序列的多肽
JP2017537926A (ja) * 2014-12-04 2017-12-21 ノバルティス アーゲー Klotho変種ポリペプチドを使用する方法および組成物
UY36449A (es) 2014-12-19 2016-07-29 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6
EP3233916A4 (de) 2014-12-19 2018-06-06 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Humanisierte anti-acth-antikörper und verwendungen davon
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
CA2977675A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Medimmune, Llc Method of purifying albumin-fusion proteins
KR20180005249A (ko) 2015-05-19 2018-01-15 예일 유니버시티 병리학적 석회화 병태를 치료하기 위한 조성물, 및 이의 사용 방법
KR20180020141A (ko) 2015-05-28 2018-02-27 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 암 치료에 사용되는 peg화된 인터류킨-10
WO2016196211A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
JP2018522540A (ja) 2015-06-05 2018-08-16 ノバルティス アーゲー 骨形成タンパク質9(bmp9)を標的とする抗体およびそれらのための方法
AU2016275149A1 (en) 2015-06-12 2018-01-04 Georgia State University Research Foundation Compositions and methods for treating opioid tolerance
KR20240025721A (ko) 2015-06-15 2024-02-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 노화와 연관된 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
CA2994516A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Novartis Ag Methods of treating fgf21-associated disorders
MX2018001566A (es) 2015-08-07 2019-04-25 Imaginab Inc Construcciones de union a antigeno para moleculas diana.
JP2018528191A (ja) 2015-08-19 2018-09-27 ラトガーズ, ザ ステイト ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー 抗体を生成する新規な方法
JP7007261B2 (ja) 2015-08-20 2022-01-24 アルブミディクス リミティド アルブミン変異体及びコンジュゲート
CN108025040A (zh) 2015-08-25 2018-05-11 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白介素-10治疗疾病和病症的方法
CA3183289A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Novel human serum albumin mutant
PT3347377T (pt) 2015-09-09 2021-04-30 Novartis Ag Anticorpos que se ligam à linfopoietina do estroma tímico (tslp) e métodos de utilização dos anticorpos
WO2017042701A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 Novartis Ag Thymic stromal lymphopoietin (tslp)-binding antibodies and methods of using the antibodies
WO2017058923A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 East Carolina University Aluminum based adjuvants for tolerogenic vaccination
US20180348224A1 (en) 2015-10-28 2018-12-06 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Resear Ch Tenascin-w and biliary tract cancers
JP6728352B2 (ja) 2015-11-09 2020-07-22 エヌジーエム バイオファーマシューティカルス,インコーポレーテッド 胆汁酸に関係した障害の治療方法
EP3389711A1 (de) 2015-12-18 2018-10-24 Novartis AG Auf cd32b gerichtete antikörper und verfahren zur verwendung davon
US10889643B2 (en) 2016-01-11 2021-01-12 Universität Zürich Immune-stimulating humanized monoclonal antibodies against human interleukin-2, and fusion proteins thereof
ES2847155T3 (es) 2016-01-21 2021-08-02 Novartis Ag Moléculas multiespecíficas que fijan como objetivo CLL-1
EP3431508A4 (de) 2016-03-14 2019-08-14 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Serumalbumin-20-k-wachstumshormonfusionprotein
CA3018081A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Bionomics Limited Administration of an anti-lgr5 monoclonal antibody
JP7021099B2 (ja) 2016-03-31 2022-02-18 エヌジーエム バイオファーマシューティカルス,インコーポレーテッド 結合タンパク質及びその使用方法
TWI770020B (zh) 2016-04-15 2022-07-11 丹麥商H朗德貝克公司 人類化抗pacap 抗體及其用途
JP7094223B2 (ja) 2016-04-25 2022-07-01 ファイブ プライム セラピューティクス, インコーポレイテッド 病的な筋肉減少および筋力低下の処置のためのnope
WO2017189432A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
JP7138567B2 (ja) 2016-04-27 2022-09-16 ノバルティス アーゲー 成長分化因子15に対する抗体およびそれらの使用
JP2019522962A (ja) * 2016-05-20 2019-08-22 オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト 改善された薬物動態を有する、グリコシル化vwf融合タンパク質
CN110381988A (zh) 2016-06-15 2019-10-25 诺华股份有限公司 使用骨形态发生蛋白6(bmp6)的抑制剂治疗疾病的方法
SI3484911T1 (sl) 2016-07-15 2021-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za čiščenje PEGiliranega eritropoetina
US11865163B2 (en) 2016-09-15 2024-01-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using butyrylcholinesterases to treat cancer
US11072642B2 (en) 2016-11-09 2021-07-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research MANP analogues
AU2017383232A1 (en) 2016-12-23 2019-06-27 Novartis Ag Factor XI antibodies and methods of use
CA3048157A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Novartis Ag Methods of treatment with anti-factor xi/xia antibodies
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
US10603358B2 (en) 2017-01-10 2020-03-31 Nodus Therapeutics Combination tumor treatment with an integrin-binding-Fc fusion protein and immune stimulator
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
BR112019016344A2 (pt) 2017-02-08 2020-04-07 Novartis Ag anticorpos miméticos fgf21 e usos dos mesmos
WO2018148507A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Vivibaba, Inc Compositions and methods for recombinant nerve growth factor
US20200131225A1 (en) * 2017-04-20 2020-04-30 Novo Nordisk A/S Methods of purification of albumin fusion proteins
US11203629B2 (en) 2017-04-22 2021-12-21 Immunomic Therapeutics, Inc. LAMP constructs
IL297073B2 (en) 2017-05-02 2023-12-01 Immunomic Therapeutics Inc LAMP constructs containing cancer antigens
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
EP3684811A2 (de) 2017-08-17 2020-07-29 Massachusetts Institute of Technology Multispezifitätsbinder von cxc-chemokinen und ihre verwendung
WO2019035001A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research NEW METHODS FOR TARGETED INTRODUCTION OF VIRUSES IN CELLS AND TISSUES
BR112020003670A2 (pt) 2017-08-22 2020-09-01 Sanabio, Llc receptores de interferon solúveis e usos dos mesmos
WO2019081983A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Novartis Ag CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CN111315398A (zh) 2017-11-10 2020-06-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 白介素-10与免疫检查点途径抑制剂的组合的组合物和使用方法
JP7165193B2 (ja) 2017-11-27 2022-11-02 パーデュー、ファーマ、リミテッド、パートナーシップ ヒト組織因子を標的とするヒト化抗体
KR20200120632A (ko) 2018-02-12 2020-10-21 비온테크 알엔에이 파마슈티컬스 게엠베하 사이토카인 인코딩 rna를 사용한 처리
WO2019186344A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Institut Pasteur De Tunis Anti-cancer and disintegrin scorpion venoms
WO2019185828A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Bioxodes Anticoagulant fusion proteins and uses thereof
AR126019A1 (es) 2018-05-30 2023-09-06 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
TW202016136A (zh) 2018-06-01 2020-05-01 瑞士商諾華公司 針對bcma之結合分子及其用途
CN112533629A (zh) 2018-06-19 2021-03-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 结合使用il-10药剂与嵌合抗原受体细胞疗法的组合物和方法
BR112021000811A8 (pt) 2018-07-24 2022-10-18 Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh Agonistas de il2
CN110818793A (zh) * 2018-08-14 2020-02-21 中山康方生物医药有限公司 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
CA3113618A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Collagen-localized immunomodulatory molecules and methods thereof
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
WO2020109978A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Novartis Ag Lpl-gpihbp1 fusion polypeptides
CA3124352A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Resolve Therapeutics, Llc Treatment of sjogren's disease with nuclease fusion proteins
US11235032B2 (en) 2019-01-23 2022-02-01 Massachusetts Institute Of Technology Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade
KR20210124236A (ko) 2019-02-08 2021-10-14 비온테크 쎌 & 제네 테라피스 게엠베하 Car-조작된 t 세포 및 사이토카인을 수반한 치료
CN113874389A (zh) 2019-03-18 2021-12-31 生物技术细胞和基因治疗公司 用于特异性活化免疫效应细胞的白介素-2受体(il2r)和白介素-2(il2)变体
US20220169706A1 (en) 2019-03-28 2022-06-02 Danisco Us Inc Engineered antibodies
WO2020200481A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn)
WO2020236797A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
CN113874398A (zh) 2019-05-21 2021-12-31 诺华股份有限公司 Cd19结合分子及其用途
EP3976181A1 (de) 2019-05-24 2022-04-06 Sanofi Verfahren zur behandlung von systemischer sklerose
TW202115105A (zh) 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Rna製藥有限公司 Il2激動劑
WO2020263399A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 Massachusetts Institute Of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
CN114502590A (zh) 2019-09-18 2022-05-13 诺华股份有限公司 Entpd2抗体、组合疗法、以及使用这些抗体和组合疗法的方法
TW202124446A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 瑞士商諾華公司 與entpd2抗體之組合療法
WO2021058091A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving therapeutic antibody and interleukin-2 (il2)
CN114641306A (zh) 2019-10-18 2022-06-17 免疫治疗有限公司 包含癌抗原的改良lamp构建物
US20230000774A1 (en) 2019-12-04 2023-01-05 Albumedix Limited Methods and compositions produced thereby
WO2021129927A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment with immune effector cells engineered to express an antigen receptor
JP2023512423A (ja) * 2019-12-24 2023-03-27 ジュベナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 再生性ポリペプチドおよびその使用
WO2021129945A1 (en) 2019-12-27 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh In vitro and in vivo gene delivery to immune effector cells using nanoparticles functionalized with designed ankyrin repeat proteins (darpins)
JP2023511274A (ja) 2020-01-14 2023-03-17 シンセカイン インコーポレイテッド Il2オルソログおよび使用法
JP2023518935A (ja) 2020-03-16 2023-05-09 バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハー 抗原特異的t細胞受容体およびt細胞エピトープ
WO2021202473A2 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Danisco Us Inc Engineered antibodies
WO2021197589A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination
AU2020202454A1 (en) 2020-04-06 2021-10-21 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (MBS) associated with migraine using anti-CGRP antibodies
CA3165342A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 James Arthur Posada Treatment of sjogren's syndrome with nuclease fusion proteins
WO2022032040A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il2rb/il2rg synthetic cytokines
US20230272091A1 (en) 2020-08-05 2023-08-31 Synthekine, Inc. Il10ra binding molecules and methods of use
WO2022032187A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis
JP2023540082A (ja) 2020-09-04 2023-09-21 ラトガース,ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー SARS-CoV-2ワクチン及び抗体
EP4229081A1 (de) 2020-10-15 2023-08-23 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Für sars-cov-2-rezeptor-bindungsdomäne spezifischer antikörper und therapeutische verfahren
WO2022087274A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that neutralize type-i interferon (ifn) activity
US20240025993A1 (en) 2020-11-06 2024-01-25 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2022115597A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性rna
CN117321076A (zh) 2021-02-19 2023-12-29 美国卫生及公众服务部代表 中和SARS-CoV-2的单结构域抗体
WO2022218891A2 (en) 2021-04-12 2022-10-20 BioNTech SE Rna compositions comprising a buffer substance and methods for preparing, storing and using the same
BR112023021654A2 (pt) 2021-04-20 2023-12-26 BioNTech SE Vacina contra vírus
CA3229059A1 (en) 2021-08-27 2023-03-02 H. Lundbeck A/S Treatment of cluster headache using anti-cgrp antibodies
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
WO2023066496A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023067193A2 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Compositions for administration of different doses of rna
WO2023083434A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
WO2023126053A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 BioNTech SE Lipid-based formulations for administration of rna
WO2023165681A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 BioNTech SE Rna lipid nanoparticles (lnps) comprising a polyoxazoline and/or polyoxazine polymer
WO2023193892A1 (en) 2022-04-05 2023-10-12 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising an inorganic polyphosphate and methods for preparing, storing and using the same
WO2023209568A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024015953A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Danisco Us Inc. Methods for producing monoclonal antibodies
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
WO2024028325A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising amphiphilic oligo ethylene glycol (oeg)-conjugated compounds and methods of using such compounds and compositions
WO2024027910A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024028445A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
US11773160B1 (en) 2022-08-05 2023-10-03 Anaveon AG Immune-stimulating IL-2 fusion proteins

Family Cites Families (291)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US507367A (en) * 1893-10-24 Electro-thermal bathing apparatus
US5625041A (en) * 1990-09-12 1997-04-29 Delta Biotechnology Limited Purification of proteins
DE2449885C3 (de) 1974-10-21 1980-04-30 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat
US4363877B1 (en) 1977-09-23 1998-05-26 Univ California Recombinant dna transfer vectors
US4440859A (en) * 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4264731A (en) * 1977-05-27 1981-04-28 The Regents Of The University Of California DNA Joining method
US4283489A (en) 1977-09-23 1981-08-11 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4407948A (en) 1977-09-23 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4652525A (en) 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4447538A (en) 1978-04-19 1984-05-08 Regents Of The University Of California Microorganism containing gene for human chorionic somatomammotropin
US5326859A (en) 1979-10-30 1994-07-05 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
US5514567A (en) 1979-01-30 1996-05-07 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US4342832A (en) 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4431740A (en) 1979-09-12 1984-02-14 The Regents Of The University Of California DNA Transfer vector and transformed microorganism containing human proinsulin and pre-proinsulin genes
AU538665B2 (en) 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US6610830B1 (en) 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
NZ198445A (en) 1980-09-25 1984-05-31 Genentech Inc Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
JPS57149228A (en) 1981-03-11 1982-09-14 Ajinomoto Co Inc Novel erythropoietin and its preparation
US4792602A (en) 1981-06-19 1988-12-20 Cornell Research Foundation, Inc. Adaptors, and synthesis and cloning of proinsulin genes
CA1204682A (en) 1981-06-19 1986-05-20 Saran A. Narang Adaptors, and synthesis and cloning of proinsulin genes
IL66614A (en) 1981-08-28 1985-09-29 Genentech Inc Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it
EP0079739A3 (de) 1981-11-12 1984-08-08 The Upjohn Company Auf Albumin basierende Nukleotiden, ihre Replikation und Verwendung und Plasmide zur Verwendung darin
EP0091527A3 (de) 1981-12-14 1984-07-25 The President And Fellows Of Harvard College DNS Sequenzen, rekombinante DNS Moleküle und Verfahren zur Herstellung von menschlichem Serum Albumin ähnlichen Polypeptiden
IT1167610B (it) 1982-01-19 1987-05-13 Cetus Corp Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione
US4450103A (en) 1982-03-01 1984-05-22 Cetus Corporation Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4670393A (en) 1982-03-22 1987-06-02 Genentech, Inc. DNA vectors encoding a novel human growth hormone-variant protein
EP0091539B2 (de) * 1982-03-31 1996-11-27 Ajinomoto Co., Inc. Das Polypeptid Interleukin-2 kodierendes Gen, rekombinante, dieses Gen enthaltende DNA, diese rekombinante DNA aufweisende Zelllinien und Verfahren zur Herstellung von Interleukin-2 unter Verwendung der genannten Zellen
US5824330A (en) * 1982-04-20 1998-10-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Highly purified interleukin-2 and method
US4925919A (en) * 1984-04-25 1990-05-15 Roland Mertelsmann Purified interleukin 2
US4778879A (en) * 1982-04-20 1988-10-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Highly purified human interleukin 2 and method
US4499188A (en) 1982-05-05 1985-02-12 Cetus Corporation Bacterial production of heterologous polypeptides under the control of a repressible promoter-operator
US4490289A (en) 1982-09-16 1984-12-25 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous human interleukin 2
US4462940A (en) 1982-09-23 1984-07-31 Cetus Corporation Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides
US4992271A (en) * 1982-09-23 1991-02-12 Cetus Corporation Formulation for lipophilic IL-2 proteins
US4853332A (en) * 1982-10-19 1989-08-01 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4966843A (en) 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US5618697A (en) * 1982-12-10 1997-04-08 Novo Nordisk A/S Process for preparing a desired protein
US5700913A (en) 1982-12-15 1997-12-23 Ajinomoto Co., Inc. Unglycosylated human interleukin-2 polypeptides
EP0116201B1 (de) 1983-01-12 1992-04-22 Chiron Corporation Sekretorische Expression in Eukaryoten
US4840934A (en) * 1983-01-25 1989-06-20 Eleanor Roosevelt Institute For Cancer Research, Inc. Therapeutic method using T cell growth factor
US5015575A (en) 1983-04-07 1991-05-14 Chiron Corporation Hybrid DNA synthesis of insulin
US4914026A (en) * 1983-04-07 1990-04-03 Chiron Corporation Alpha factor leader sequence directed secretion of insulin
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
WO1984004330A1 (en) 1983-04-22 1984-11-08 Amgen Secretion of exogenous polypeptides from yeast
US5010003A (en) * 1983-04-25 1991-04-23 Genentech, Inc. Use of yeast homologous signals to secrete heterologous proteins
NZ207926A (en) 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
CA1196863A (en) * 1983-06-08 1985-11-19 Mattheus F.A. Goosen Slow release injectable insulin composition
JPS6087792A (ja) 1983-09-23 1985-05-17 ジェネックス・コーポレイション 雑種制御領域
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
GB8334261D0 (en) 1983-12-22 1984-02-01 Bass Plc Fermentation processes
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
US4569790A (en) * 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US4908434A (en) * 1984-04-25 1990-03-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Process for preparing purified interleukin-2
US4908433A (en) * 1984-04-25 1990-03-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of interleukin-2
CA1213537A (en) 1984-05-01 1986-11-04 Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee Polypeptide expression method
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
JPS61227526A (ja) 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
US4716217A (en) 1984-08-31 1987-12-29 University Patents, Inc. Hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons
US4734491A (en) 1984-08-31 1988-03-29 University Patents, Inc. DNA sequences encoding hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons
JPS6191131A (ja) 1984-10-09 1986-05-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 医薬品の吸着防止方法および組成物
JPS6197229A (ja) 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
US4745099A (en) 1985-02-06 1988-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of malignant tumors
US4732889A (en) 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
GB8504099D0 (en) 1985-02-18 1985-03-20 Wellcome Found Physiologically active substances
FR2579224B1 (fr) 1985-03-25 1987-05-22 Genetica Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine
US5532341A (en) 1985-03-28 1996-07-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3679343D1 (de) 1985-03-28 1991-06-27 Chiron Corp Expression durch verwendung von fusionsgenen fuer proteinproduktion.
GB8510219D0 (en) 1985-04-22 1985-05-30 Bass Plc Isolation of fermentation products
JPS6229985A (ja) 1985-06-17 1987-02-07 ジエネツクス・コ−ポレ−シヨン クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子の製造方法
JPS63500636A (ja) 1985-08-23 1988-03-10 麒麟麦酒株式会社 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするdna
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US5102872A (en) * 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
US5641663A (en) 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
CA1295566C (en) 1987-07-21 1992-02-11 Robert T. Garvin Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus
US5013824A (en) * 1985-11-19 1991-05-07 Schering Corporation Human interleukin-4 peptides and conjugates thereof
FR2594846B1 (fr) 1986-02-21 1989-10-20 Genetica Procede de preparation de la serum albumine humaine mature
IT1203758B (it) 1986-03-27 1989-02-23 Univ Roma Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori
DK179286D0 (da) 1986-04-18 1986-04-18 Nordisk Gentofte Insulinpraeparat
US4765980A (en) 1986-04-28 1988-08-23 International Minerals & Chemical Corp. Stabilized porcine growth hormone
US4859609A (en) 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5120712A (en) * 1986-05-05 1992-06-09 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone
US5614492A (en) * 1986-05-05 1997-03-25 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone GLP-1 (7-36) and uses thereof
US5118666A (en) * 1986-05-05 1992-06-02 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone
US5028422A (en) 1986-05-27 1991-07-02 Schering Corporation Treatment of basal cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon
IT1196484B (it) 1986-07-11 1988-11-16 Sclavo Spa Vettore ad espressione e secrezione in lieviti,utile per la preparazione di proteine eterologhe
GR871067B (en) 1986-07-18 1987-11-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Process for producing stable pharmaceutical preparation containing granulocyte colony stimulating factor
US4801575A (en) 1986-07-30 1989-01-31 The Regents Of The University Of California Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5002764A (en) 1986-08-12 1991-03-26 Schering Corporation Treatment of actinic keratoses with alpha2 interferon
GB8620926D0 (en) 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
US4881175A (en) * 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US4929442A (en) * 1986-09-26 1990-05-29 Exovir, Inc. Compositions suitable for human topical application including a growth factor and/or related materials
US5508031A (en) * 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
WO1988008027A1 (en) * 1987-04-09 1988-10-20 Delta Biotechnology Limited Yeast vector
NO881507D0 (no) 1987-04-10 1988-04-07 Ortho Pharma Corp Fremgangsmaate for forhoeyning av hematokritnivaaet til et normalt pattedyr.
FI107939B (fi) 1987-07-28 2001-10-31 Dsm Nv Kluyveromyces isäntäkantana
SE459586B (sv) 1987-09-14 1989-07-17 Mta Szegedi Biolog Koezponti Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
PT88641B (pt) * 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JP2791418B2 (ja) 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体
PT89484B (pt) 1988-01-22 1994-03-31 Gen Hospital Corp Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao
JPH01240191A (ja) 1988-02-16 1989-09-25 Green Cross Corp:The 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現
JPH01215289A (ja) 1988-02-22 1989-08-29 Toa Nenryo Kogyo Kk 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンaの製造方法
US4999339A (en) * 1988-03-28 1991-03-12 Cetus Corporation Combination therapy of IL-2 and DTIC for the treatment of melanoma
US5066489A (en) 1988-03-28 1991-11-19 Cetus Corporation Combination therapy of IL-2 and DTIC for the treatment of melanoma
US5763394A (en) * 1988-04-15 1998-06-09 Genentech, Inc. Human growth hormone aqueous formulation
US5096707A (en) * 1988-04-15 1992-03-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Flavone-8-acetic acid and interleukin-2 in a method of treating certain cancers
US5096885A (en) * 1988-04-15 1992-03-17 Genentech, Inc. Human growth hormone formulation
US5061488A (en) * 1988-04-15 1991-10-29 The United States Of America As Represented Department Of Health & Human Services Flavone-8-acetic acid and interleukin-2 for cancer therapy
IL89992A0 (en) 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
US5126129A (en) * 1988-05-23 1992-06-30 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Cancer therapy using interleukin-2 and flavone compounds
JP3092811B2 (ja) 1988-07-23 2000-09-25 デルタ バイオテクノロジー リミテッド ペプチドおよびdna配列
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
FR2635115B1 (fr) 1988-08-05 1992-04-03 Rhone Poulenc Sante Procede de preparation de la serum albumine humaine a partir d'une levure
US5260202A (en) 1988-09-07 1993-11-09 Delta Biotechnology Limited Fermentation method
US5298243A (en) 1988-10-20 1994-03-29 Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Colony stimulating factor-gelatin conjugate
US5759802A (en) 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
US5256410A (en) 1988-12-01 1993-10-26 Schering Corporation Treatment of squamous cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon
EP0401384B1 (de) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5705363A (en) 1989-03-02 1998-01-06 The Women's Research Institute Recombinant production of human interferon τ polypeptides and nucleic acids
DE59000270D1 (de) 1989-04-11 1992-10-01 Boehringer Ingelheim Int Verwendung von mindestens ein cytokin zur herstellung eines arzneimittels zur systemischen behandlung von praeneoplastischen laesionen.
EP0395918A3 (de) 1989-04-13 1991-10-23 Vascular Laboratory, Inc. Plasminogen-Aktivatorkomplex von reiner Pro-Urokinase, kovalent gebunden durch eine Disulfidbrücke an menschlichem Serumalbumin
GB8909916D0 (en) * 1989-04-29 1989-06-14 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
US5330971A (en) 1989-06-09 1994-07-19 Gropep Pty. Ltd. Growth hormone fusion proteins, methods of production, and methods of treatment
DE3923963A1 (de) 1989-07-20 1991-01-31 Behringwerke Ag Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung
DE3924746A1 (de) * 1989-07-26 1991-01-31 Behringwerke Ag Erythropoietin (epo)-peptide und dagegen gerichtete antikoerper
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
CU22222A1 (es) 1989-08-03 1995-01-31 Cigb Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US6063373A (en) * 1989-09-19 2000-05-16 Maxim Pharmaceuticals, Inc. Enhanced activation of NK cells using an NK cell activator and a hydrogen peroxide scavenger or inhibitor
CA1340994C (en) 1989-09-21 2000-05-16 Rudolf Edgar Dr. Falk Treatment of conditions and disease
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
FR2653020B1 (fr) 1989-10-17 1993-03-26 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement des leucemies.
US5667986A (en) 1989-10-18 1997-09-16 Delta Biotechnology Limited Yeast promoter for expressing heterologous polypeptides
JPH03151399A (ja) 1989-11-07 1991-06-27 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 変異ヒトエリスロポエチン
US5116944A (en) 1989-12-29 1992-05-26 Neorx Corporation Conjugates having improved characteristics for in vivo administration
JPH03201987A (ja) * 1989-12-29 1991-09-03 Tonen Corp ヒト血清アルブミン断片
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
US5208018A (en) * 1990-03-19 1993-05-04 Brigham And Women's Hospital Treatment of cachexia with interleukin 2
FR2660863B1 (fr) * 1990-04-17 1994-01-21 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement de cancers primitifs de la plevre.
US5374620A (en) * 1990-06-07 1994-12-20 Genentech, Inc. Growth-promoting composition and its use
US5202239A (en) * 1990-08-07 1993-04-13 Scios Nova Inc. Expression of recombinant polypeptides with improved purification
US5071872A (en) 1990-08-14 1991-12-10 The Ohio State University Research Foundation Method for improving interleukin-2 activity using aci-reductone compounds
FR2668368B1 (fr) 1990-10-30 1995-03-10 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement des tumeurs malignes epitheliales.
US5830452A (en) 1990-11-20 1998-11-03 Chiron Corporation Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2
ATE254179T1 (de) 1990-11-29 2003-11-15 Agronomique Inst Nat Rech Neue type-i-interferon varianten, ihre verfahren zur herstellung, und ihre verwendungen
US5272070A (en) 1991-03-08 1993-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the preparation of cell lines producing Man3 GlcNac 2 asparagine-linked gylcans and cell lines produced thereby
EP0503583A1 (de) 1991-03-12 1992-09-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Erythropoietin enthaltendes Arzneimittel mit verzögerter Wirkstofffreigabe
JPH0748378B2 (ja) * 1991-03-28 1995-05-24 日本碍子株式会社 固体電解質燃料電池用空気電極及びこれを有する固体電解質燃料電池
EP0509841A3 (en) 1991-04-18 1993-08-18 Tonen Corporation Co-expression system of protein disulfide isomerase gene and useful polypeptide gene and process for producing the polypeptide using its system
CA2058820C (en) 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
FR2676070B1 (fr) 1991-04-30 1994-09-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisation.
US5646012A (en) 1991-04-30 1997-07-08 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Yeast promoter and use thereof
US5304473A (en) 1991-06-11 1994-04-19 Eli Lilly And Company A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
FR2677996B1 (fr) * 1991-06-21 1993-08-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs de clonage et/ou d'expression preparation et utilisation.
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5223408A (en) 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
PT101031B (pt) * 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
JP3426599B2 (ja) 1991-11-08 2003-07-14 ヘモゾル インコーポレイテッド 薬物担体としてのヘモグロビン
US5540923A (en) 1991-12-06 1996-07-30 Landsforeningen Til Kraeftens Bekaemplse Interferon proteins
US6348327B1 (en) * 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
GB9200417D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Bagshawe Kenneth D Cytotoxic drug therapy
FR2686620B1 (fr) 1992-01-27 1995-06-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Serum-albumine humaine, preparation et utilisation.
FR2686900B1 (fr) 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5230886A (en) 1992-03-18 1993-07-27 Trustees Of Boston University Tumor cell suppression
DK36392D0 (da) * 1992-03-19 1992-03-19 Novo Nordisk As Anvendelse af kemisk forbindelse
US5460954A (en) 1992-04-01 1995-10-24 Cheil Foods & Chemicals, Inc. Production of human proinsulin using a novel vector system
SE9201073D0 (sv) 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5686268A (en) 1992-06-19 1997-11-11 Pfizer Inc. Fused proteins
JP3269504B2 (ja) 1992-07-08 2002-03-25 三菱ウェルファーマ株式会社 ヒト血清アルブミンの製造方法
FR2694294B1 (fr) 1992-07-30 1994-09-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisateur.
DE4226971C2 (de) 1992-08-14 1997-01-16 Widmar Prof Dr Tanner Modifizierte Pilzzellen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte
US5728553A (en) 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
WO1994008599A1 (en) 1992-10-14 1994-04-28 The Regents Of The University Of Colorado Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery
FR2697752B1 (fr) * 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
US6221958B1 (en) * 1993-01-06 2001-04-24 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Ionic molecular conjugates of biodegradable polyesters and bioactive polypeptides
US5441734A (en) 1993-02-25 1995-08-15 Schering Corporation Metal-interferon-alpha crystals
US5780021A (en) 1993-03-05 1998-07-14 Georgetown University Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i
DK82893D0 (da) * 1993-07-08 1993-07-08 Novo Nordisk As Peptid
HUT74425A (en) * 1993-08-09 1996-12-30 Baral A method for sensitization of cancer for killer cell mediated lysis
US5521086A (en) * 1993-09-16 1996-05-28 Cephalon, Inc. Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast
US5459031A (en) 1993-11-05 1995-10-17 Amgen Inc. Methods for controlling sialic acid derivatives in recombinant glycoproteins
GB9404270D0 (en) 1994-03-05 1994-04-20 Delta Biotechnology Ltd Yeast strains and modified albumins
US5629286A (en) * 1994-03-31 1997-05-13 Brewitt; Barbara Homeopathic dilutions of growth factors
US5646113A (en) 1994-04-07 1997-07-08 Genentech, Inc. Treatment of partial growth hormone insensitivity syndrome
FR2719593B1 (fr) 1994-05-06 1996-05-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur préparation et composition pharmaceutique les contenant.
GB9411356D0 (en) * 1994-06-07 1994-07-27 Delta Biotechnology Ltd Yeast strains
US5639642A (en) * 1994-06-16 1997-06-17 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
US5574008A (en) 1994-08-30 1996-11-12 Eli Lilly And Company Biologically active fragments of glucagon-like insulinotropic peptide
US6071923A (en) * 1994-09-16 2000-06-06 Bar-Ilan University Retinoyloxy aryl-substituted alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases
US5512549A (en) * 1994-10-18 1996-04-30 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptide analogs, compositions, and methods of use
FR2726471B1 (fr) 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
US6387365B1 (en) 1995-05-19 2002-05-14 Schering Corporation Combination therapy for chronic hepatitis C infection
US5741815A (en) 1995-06-02 1998-04-21 Lai; Ching-San Methods for in vivo reduction of nitric oxide levels and compositions useful therefor
US5728707A (en) * 1995-07-21 1998-03-17 Constantia Gruppe Treatment and prevention of primary and metastatic neoplasms with salts of aminoimidazole carboxamide
US5840542A (en) 1995-07-28 1998-11-24 Mogam Biotechnology Research Institute Method for manufacture of proinsulin with high export yield
US5766620A (en) * 1995-10-23 1998-06-16 Theratech, Inc. Buccal delivery of glucagon-like insulinotropic peptides
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
JP2000507917A (ja) 1995-11-02 2000-06-27 シェーリング コーポレイション 持続的低用量サイトカイン注入治療
US5744095A (en) * 1995-11-14 1998-04-28 Smith; Henry J. Medical assay cassette
US6048964A (en) 1995-12-12 2000-04-11 Stryker Corporation Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US5767097A (en) * 1996-01-23 1998-06-16 Icn Pharmaceuticals, Inc. Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes
US6150337A (en) 1996-01-23 2000-11-21 Icn Pharmaceuticals, Inc. Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by Ribavirin in activated T-lymphocytes
US5616724A (en) * 1996-02-21 1997-04-01 Cephalon, Inc. Fused pyrrolo[2,3-c]carbazole-6-ones
US6045788A (en) * 1996-02-28 2000-04-04 Cornell Research Foundation, Inc. Method of stimulation of immune response with low doses of IL-2
US5912229A (en) * 1996-03-01 1999-06-15 Novo Nordisk Als Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide
JP3794748B2 (ja) * 1996-03-04 2006-07-12 第一アスビオファーマ株式会社 メタノール代謝系を有する微生物の培養法
DE69722391T2 (de) 1996-03-13 2004-04-22 Delta Biotechnology Ltd. Gärungs-steuerungssysteme
DK0914116T3 (da) * 1996-05-22 2000-11-20 Protarga Inc Kompositstoffer omfattende konjugater af cis-docosahexaensyre og Taxotere
US5919815A (en) * 1996-05-22 1999-07-06 Neuromedica, Inc. Taxane compounds and compositions
US6110891A (en) * 1996-06-21 2000-08-29 Alizyme Therapeutics Ltd. Lectin compositions and uses thereof
US5922761A (en) * 1996-09-06 1999-07-13 Medinox, Inc. Methods for in vivo reduction of iron levels and compositions useful therefor
US20020052309A1 (en) 1996-09-11 2002-05-02 Athanasius A. Anagnostou Method of treating endothelial injury
US5876774A (en) * 1996-10-11 1999-03-02 Nestec S.A. Method of making fat-based confection
US5955508A (en) * 1996-10-15 1999-09-21 Loyola University Of Chicago Method for the enhancement of lymphocyte activity against opportunistic microbial pathogens
US5908830A (en) * 1996-10-31 1999-06-01 Merck & Co., Inc. Combination therapy for the treatment of diabetes and obesity
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
EP0954589A1 (de) * 1997-01-24 1999-11-10 Novo Nordisk A/S Sythetische signalpeptid-sequenzen.
US5939455A (en) * 1997-03-11 1999-08-17 Beacon Laboratories, Inc. Therapeutic augmentation of oxyalkylene diesters and butyric acid derivatives
US6110970A (en) * 1997-03-11 2000-08-29 Beacon Laboratories, Inc. Nitrogen-containing oxyalkylene esters and uses thereof
US6030961A (en) * 1997-03-11 2000-02-29 Bar-Ilan Research & Development Co., Ltd. Oxyalkylene phosphate compounds and uses thereof
US6124495A (en) * 1997-03-11 2000-09-26 Beacon Laboratories, Inc. Unsaturated oxyalkylene esters and uses thereof
AR012448A1 (es) * 1997-04-18 2000-10-18 Ipsen Pharma Biotech Composicion en forma de microcapsulas o de implantes que comprende un excipiente biodegradable, polimero o co-polimero, o una mezcla de talesexcipientes, y una sustancia activa o una mezcla de sustancias activas, procedimiento para la preparacion de una sustancia soluble en agua de elevada
US5921996A (en) * 1997-05-02 1999-07-13 Cardio Thoracic Systems, Inc. Surgical clamp applier/remover and detachable clamp
JP3201987B2 (ja) 1997-09-09 2001-08-27 株式会社オーレック 草刈装置
US6472373B1 (en) 1997-09-21 2002-10-29 Schering Corporation Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection
US6172046B1 (en) 1997-09-21 2001-01-09 Schering Corporation Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic Hepatitis C infection
US6201072B1 (en) * 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6117949A (en) * 1998-10-01 2000-09-12 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly (lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
EP1037921B1 (de) 1997-12-03 2014-09-24 Roche Diagnostics GmbH Erythropoietin mit hoher spezifischer aktivität
WO1999029314A1 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Novel salts of metformin and method
DE69824039T2 (de) 1997-12-08 2005-08-18 Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
KR100253916B1 (ko) 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
US5951996A (en) 1998-02-04 1999-09-14 Czeizler Zaharia; Veronica L. Treatment of chronic diffuse GI bleeding with erythropoietin
US6221378B1 (en) * 1998-02-10 2001-04-24 Generex Pharmaceuticals Incorporated Mixed micellar delivery system and method of preparation
US6017545A (en) * 1998-02-10 2000-01-25 Modi; Pankaj Mixed micellar delivery system and method of preparation
CN1119352C (zh) 1998-05-15 2003-08-27 中国科学院上海生物化学研究所 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化
CN1105727C (zh) 1998-06-17 2003-04-16 上海海济医药生物工程有限公司 重组人血清白蛋白的生产方法
GB9817084D0 (en) 1998-08-06 1998-10-07 Wood Christopher B A method for promoting extra-heptic production of proteins for the correction of hypoalbuminaemia,anaemia,thrombocytopenia and/or coagulation disorders
US6346543B1 (en) * 1998-08-17 2002-02-12 Aventis Pharma S.A. Use of a taxoid to treat abnormal cell proliferation in the brain
US6193997B1 (en) * 1998-09-27 2001-02-27 Generex Pharmaceuticals Inc. Proteinic drug delivery system using membrane mimetics
DK1123313T3 (da) * 1998-10-23 2007-06-18 Amgen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til forebyggelse og behandling af anæmi
DE69936351T2 (de) * 1998-10-30 2008-02-21 Novozymes A/S Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität
US6245690B1 (en) * 1998-11-04 2001-06-12 Applied Materials, Inc. Method of improving moisture resistance of low dielectric constant films
CA2352538A1 (en) * 1998-11-30 2000-06-08 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
US6048891A (en) * 1998-12-17 2000-04-11 Loma Linda University Medical Center Use of γ-tocopherol and its oxidative metabolite LLU-α in the treatment of natriuretic disease
US6116964A (en) * 1999-03-08 2000-09-12 Lucent Technologies Inc. High frequency communications connector assembly with crosstalk compensation
US6348192B1 (en) * 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
US6514500B1 (en) * 1999-10-15 2003-02-04 Conjuchem, Inc. Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!}
US6319691B1 (en) * 1999-06-15 2001-11-20 Usa Universe Bioengineering, Inc. Fusion proteins comprising IFN-alpha2b and TM-alpha1
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US20020048571A1 (en) * 1999-07-19 2002-04-25 Jeno Gyuris Chimeric polypeptides of serum albumin and uses related thereto
CA2388432A1 (en) * 1999-10-21 2001-04-26 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants
AU1226901A (en) * 1999-10-22 2001-05-08 Amgen, Inc. Biodegradable microparticles with novel erythropoietin stimulating protein
AU2154401A (en) * 1999-11-12 2001-05-30 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
US6569832B1 (en) * 1999-11-12 2003-05-27 Novo Nordisk A/S Inhibition of beta cell degeneration
ES2529300T3 (es) * 2000-04-12 2015-02-18 Novozymes Biopharma Dk A/S Proteínas de fusión de albúmina
CA2406807C (en) * 2000-04-21 2010-04-06 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
JP3967594B2 (ja) * 2000-05-15 2007-08-29 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新しい薬剤組成物
US6580893B2 (en) * 2000-09-06 2003-06-17 Canon Kabushiki Kaisha Fixing device and image forming apparatus including the device
KR100399337B1 (ko) 2001-02-07 2003-09-26 드림바이오젠 주식회사 단백질의 무세포 번역후수식법
US20020169128A1 (en) * 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
WO2003030821A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
US6913890B2 (en) 2002-12-18 2005-07-05 Palo Alto Research Center Incorporated Process for preparing albumin protein conjugated oligonucleotide probes

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