DE69333622T2 - Neuartige, biologisch aktive polypeptide, ihre herstellung und diese polypeptide enthaltende pharmazeutische zusammensetzung - Google Patents
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf neue und biologisch aktive Polypeptide, deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
- Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante Polypeptide, die im Wesentlichen aus einem aktiven Teil bestehen, der von einem natürlichen oder künstlichen Polypeptid mit therapeutischer Aktivität erhalten und an ein Albumin oder eine Albuminvariante gekoppelt ist. Es ist verständlich, dass die therapeutische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide entweder direkt (Behandlung von Krankheiten) oder indirekt (z. B. weil sie in der Prävention von Krankheiten, bei der Entwicklung von Impfstoffen, bei medizinischen Abbildungstechniken und dgl. Verwendbar sind) sein kann.
- Es wird im folgenden Text verstanden, dass die Albuminvarianten jegliches Protein mit einer hohen Plasmahalbwertszeit bezeichnen, das durch Modifikation (Mutation, Auslöschung und/oder Addition) durch gentechnische Techniken von einem Gen erhalten wird, welches ein Isomorph zu humanem Serumalbumin codiert, so wie jegliches Makromolekül mit einer hohen Plasmahalbwertszeit, das durch in vitro Modifikation des Proteins erhalten wird, welches durch solche Gene codiert wird. Von Albumin, das hoch polymorph ist, sind zahlreiche natürliche Varianten identifiziert und klassifiziert worden [Weitkamp L. R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219].
- Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, künstliche Proteine herzustellen, die biologisch aktiv sind und pharmazeutisch verwendet werden können. Tatsächlich können zahlreiche Polypeptide, die eine oder mehrere potentiell therapeutische Aktivitäten besitzen, nicht pharmazeutisch genutzt werden. Dies kann verschiedene Gründe haben, so wie insbesondere ihre niedrige Stabilität in vivo, ihre komplexe oder fragile Struktur, die Schwierigkeit, sie in einem industriell akzeptablem Maßstab zu produzieren und dgl.. Gleichermaßen geben einige Polypeptide wegen Problemen der Verabreichung, Konditionierung, Pharmakokinetik usw. nicht die erwarteten Resultate in vivo.
- Die
EP 413 622 - Die vorliegende Erfindung macht es möglich, diese Nachteile zu überwinden. Die vorliegende Erfindung stellt neue Moleküle bereit, die eine optimale therapeutische Ausnutzung der biologischen Eigenschaften dieser Polypeptide ermöglichen. Die vorliegende Erfindung resultiert konkret aus dem Nachweis, dass es möglich ist, jede aktive Struktur, die von einem biologisch aktiven Polypeptid erhalten wird, genetisch an eine andere Proteinstruktur, die aus Albumin besteht, anzukoppeln, ohne die genannten biologischen Eigenschaften zu verändern. Es resultiert auch aus den Nachweisen des Anmelders, dass es humanes Serumalbumin möglich macht, die aktive Struktur effizient an ihrem Wechselwirkungsort zu präsentieren, und dies sorgt für eine hohe Plasmastabilität für das erfindungsgemäße Polypeptid. Die erfindungsgemäßen Polypeptide machen es so möglich, eine gegebene biologische Aktivität für einen verlängerten Zeitraum im Organismus aufrecht zu erhalten. Sie machen es so möglich, die verabreichte Dosis zu reduzieren und in einigen Fällen, den therapeutischen Effekt auszunutzen, in dem z. B. die Nebenwirkungen reduziert werden, die die Folge einer höheren Verabreichung sind. Die erfindungsgemäßen Polypeptide machen es zusätzlich möglich, Strukturen zu erzeugen und zu verwenden, die von biologisch aktiven Polypeptiden erhalten werden, welche sehr klein und deshalb sehr spezifisch für einen gewünschten Effekt sind. Es ist verständlich, dass die Peptide mit einer biologischen Aktivität, welche von therapeutischem Interesse sind, auch nicht natürlichen Peptidsequenzen entsprechen können, die z. B. aus Banken mit zufällig zusammengestellten Peptiden isoliert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide besitzen darüber hinaus eine besonders vorteilhafte Verteilung im Organismus, was ihre pharmakokinetischen Eigenschaften modifiziert und vorteilhaft für die Entwicklung ihrer biologischen Aktivität und ihre Verwendung ist. Zusätzlich haben sie auch den Vorteil, dass sie für den Organismus, in dem sie verwendet werden, kaum eine oder keine Immunreaktion hervorrufen. Letztlich können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch rekombinante Organismen in Maßstäben, die ihre industrielle Ausbeutung ermöglichen, expressiviert (und vorzugsweise sekretiert) werden.
- Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich deshalb auf Polypeptide, die einen aktiven Teil enthalten, der von einem Polypeptid mit einer therapeutischen Aktivität erhalten ist, gekoppelt an ein Albumin oder eine Albuminvariante.
- In einer konkreten Ausführungsform sind die Peptide, die eine therapeutische Aktivität besitzen, nicht von humanem Ursprung.
- Noch spezieller ist das Polypeptid mit einer therapeutischen Aktivität bei den erfindungsgemäßen Molekülen ein Polypeptid von humanem Ursprung oder eine molekulare Variante. Es ist ein gesamtes oder ein Teil eines Hormons, eines Interferons, eines Interleukins, von Erythropoietins, von G-CSF oder von Insulin.
- Der aktive Teil des erfindungsgemäßen Polypeptids kann z. B. aus dem gesamten Polypeptid mit einer therapeutischen Aktivität bestehen oder aus einer Struktur, die davon erhalten wurde, oder alternativ aus einem nicht natürlichen Polypeptid, das aus einer Peptidbank isoliert wurde. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine abgeleitete Struktur so verstanden, dass sie jegliches Polypeptid bedeutet, das durch Modifizieren und Erhalten einer therapeutischen Aktivität erhalten wurde. Unter Modifikation sollte man jede Mutation, Substitution, Auslöschung, Addition oder Modifikation von genetischer und/oder chemischer Natur verstehen. Solche Derivate können aus unterschiedlichen Gründen erzeugt werden, wie beispielsweise insbesondere aus dem Grund des Erhöhens der Affinität des Moleküls zu seinem Bindungsplatz, aus dem Grund des Verbesserns des Niveaus seiner Erzeugung, aus dem Grund des Erhöhens seiner Beständigkeit gegenüber Proteasen, aus dem Grund des Erhöhens seiner therapeutischen Effizienz oder alternativ des Reduzierens seiner Nebenwirkungen oder aus dem Grund der Übertragung neuer biologischer Eigenschaften auf das Molekül. Z. B. besitzen die erfindungsgemäßen chimären Polypeptide pharmakokinetische Eigenschaften und eine biologische Aktivität, die für die Verhinderung oder Behandlung von Krankheiten genutzt werden können.
- Besonders vorteilhafte erfindungsgemäße Polypeptide sind jene, bei denen der aktive Teil aufweist:
- (a) die gesamte Peptidstruktur oder
- (b) eine Struktur, die von (a) durch strukturelle Modifikation (Mutation, Substitution, Hinzufügung und/oder Entfernung von einem oder mehreren Resten) erhalten wurde und eine therapeutische Aktivität besitzt.
- Von den Strukturen des (b)-Typs können die Moleküle besonders erwähnt werden, bei denen bestimmte N- oder O-Glykosylierungsplätze modifiziert oder unterdrückt worden sind, die Moleküle, bei denen ein oder mehrere Reste substituiert worden sind, oder die Moleküle, bei denen der Zysteinrest substituiert worden ist. Es können auch Moleküle erwähnt werden, die von (a) durch Entfernung von Regionen erhalten werden, die nicht oder nicht stark in die Wechselwirkung mit den betrachteten Bindungsplätzen eingebunden sind oder eine unerwünschte Aktivität entwickeln, und Moleküle, die verglichen mit (a) zusätzliche Reste aufweisen, wie z. B. ein N-terminales Methionin und/oder ein Sekretionssignal und/oder ein Verbindungspeptid.
- Der aktive Teil der erfindungsgemäßen Moleküle kann entweder direkt oder über ein künstliches Peptid an das Albumin gebunden sein. Weiterhin kann es sowohl das N-terminale Ende als auch das C-terminale Ende des Moleküls ausbilden. Vorzugsweise bildet der aktive Teil bei den erfindungsgemäßen Molekülen den C-terminalen Teil der Chimäre aus. Es ist auch verständlich, dass der biologisch aktive Teil innerhalb der Chimäre wiederholt werden kann. Eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Moleküle ist in
1 wiedergegeben. - Ein anderer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen chimären Moleküle. Genauer besteht dieses Verfahren daraus, einen eukaryotischen oder prokaryotischen Zellwirt dazu zu bringen, eine Nukleotidsequenz zu expressivieren, die das gewünschte Polypeptid codiert, um das erzeugte Polypeptid zu ernten.
- Unter den eukaryotischen Wirten, die innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, mögen Tierzellen, Hefen oder Pilze erwähnt werden. Insbesondere können in Bezug auf Hefen Hefen der Stämme Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces oder Hansenula erwähnt werden. In Bezug auf Tierzellen können COS-, CHO- und C127-Zellen und dergleichen erwähnt werden. Unter den Pilzen, die in der Lage sind, bei der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, können insbesondere Asperpillus-Untergattungen oder Trichoderma-Untergattungen besonders erwähnt werden. Bei den prokaryotischen Wirten ist die Verwendung von Bakterien, wie beispielsweise von Escherichia coli oder von solchen, die zu den Arten Corynebacterium, Bacillus oder Streptomyces gehören, bevorzugt.
- Die Nukleotidsequenzen, die innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können auf verschiedene Weisen hergestellt werden. Allgemein werden sie durch Zusammenstellen der Sequenz, die jeden der funktionellen Teile des Polypeptids codiert, in der Lesephase erhalten. Das Polypeptid kann durch die Techniken des Fachmanns isoliert werden, beispielsweise direkt von zellulärer Messenger-RNA (mRNA) oder durch erneutes Klonen aus einer komplementären DNA-(cDNA-)Bank, oder alternativ können sie vollständig synthetische Nukleotidsequenzen sein. Es wird weiterhin verstanden, dass die Nukleotidsequenzen auch nachfolgend modifiziert werden können, beispielsweise durch Techniken der Gentechnik, um Derivate oder Varianten der genannten Sequenzen zu erhalten.
- Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz bei dem erfindungsgemäßen Prozess Teil einer Expressionskassette, die eine Region zum Initiieren der Transkription (Promotorregion) aufweist, die in den Wirtszellen die Expression der Nukleotidsequenz, die unter ihrer Steuerung steht und die die erfindungsgemäßen Polypeptide codiert, erlaubt. Diese Region kann von Promotorregionen von Genen abstammen, die in den verwendeten Wirtszellen stark expressiviert werden, wobei die Expression konstitutiv oder regulierbar ist. In Bezug auf Hefe kann es der Promotor des Gens für Phosphoglyceratkinase (PGK), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD), Lactase (LAC4), Enolasen (ENO), Alkoholdehydrogenasen (ADH) und dergleichen sein. In Bezug auf Bakterien kann es der Promotor der Gene rechts oder links von der Lambda-Bacteriophage (PL, PR) oder alternativ können es die Promotoren der Gene für die Tryptophan-(Ptrp-) oder Lactose-(Plac-)Operone sein. Zusätzlich kann diese Steuerregion modifiziert sein, z. B. durch in vitro Mutationsgenierung, durch Einführung zusätzlicher Steuerelemente oder von synthetischen Sequenzen oder durch Auslöschungen oder Substitutionen der ursprünglichen Steuerelemente. Die Expressionskassette kann auch eine Region für die Beendigung der Transkription aufweisen, die in dem betrachteten Wirt funktional ist und die unmittelbar stromab der Nukleotidsequenz angeordnet ist, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert.
- In einer bevorzugten Ausführungsform resultieren die erfindungsgemäßen Polypeptide von der Expression einer Nukleotidsequenz in einem eukaryotischen oder prokaryotischen Wirt und von der Sekretion des Produkts der Expression der genannten Sequenz in das Kulturmedium. Es ist tatsächlich besonders vorteilhaft, in der Lage zu sein, Moleküle über die rekombinante Route direkt in dem Kulturmedium zu erhalten. In diesem Fall geht der Nukleotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, eine "Führer"-Sequenz (oder eine Signalfrequenz) voran, die das entstehende Polypeptid in die Sekretionswege des verwendeten Wirts leitet. Diese "Führer"-Sequenz kann die natürliche Signalsequenz des biologisch aktiven Polypeptids in dem Fall, dass das letztere ein natürlich sekretiertes Protein ist, oder diejenige der stabilisierenden Struktur sein, aber sie kann auch jede andere funktionale "Führer"-Sequenz oder eine künstliche "Führer"-Sequenz sein. Die Wahl der einen oder anderen dieser Sequenzen wird insbesondere durch den verwendeten Wirt bestimmt. Beispiele von funktionalen Signalsequenzen umfassen jene der Gene der Sexualpheromone oder der "Killer"-Toxine von Hefen.
- Zusätzlich zu der Expressionskassette können ein oder mehrere Marker, die es möglich machen, den rekombinanten Wirt zu selektieren, hinzugefügt werden, wie z. B. das URA3-Gen der Hefe S. cerevisiae oder Gene, die zur Beständigkeit gegenüber Antibiotika beitragen, wie beispielsweise Genitizin (G418), oder gegenüber jeder anderen toxischen Verbindung, wie gegenüber bestimmten Metallionen.
- Die Einheit, die durch die Expressionskassette und durch die selektierbaren Marker gebildet wird, kann direkt in die betrachteten Wirtszellen eingeführt oder zuvor in einen funktionalen, sich selbst replizierenden Vektor eingesetzt werden. In dem ersten Fall werden dieser Einheit vorzugsweise Sequenzhomologe zu den Regionen, die in dem Genom der Wirtszellen vorliegen, hinzugefügt; die genannten Sequenzen werden dann auf jeder Seite der Expressionskassette und des selektierbaren Gens angeordnet, um so die Frequenz der Integration der Einheit in das Genom des Wirts durch Anstreben der Integration der Sequenzen durch homologe Rekombination zu erhöhen. In dem Fall, in dem die Expressionskassette in ein replikatives System eingesetzt wird, wird ein bevorzugtes Replikationssystem für Hefen der Art Kluyveromyces von dem Plasmid pKD1 erhalten, das ursprünglich von K. drosophilarum isoliert wurde; ein bevorzugtes Replikationssystem für Hefen der Art Saccharomyces wird von dem 2 μ-Plasmid von S. cerevisiae erhalten. Weiterhin können diese Expressionsplasmide das gesamte oder einen Teil des genannten Replikationssystems erhalten, oder sie können Elemente kombinieren, die sowohl von dem Plasmid pKD1 als auch dem 2 μ-Plasmid erhalten wurden.
- Zusätzlich können die Expressionsplasmide Shuttle-Vektoren zwischen einem bakteriellen Wirt, wie beispielsweise Escherichia coli und der gewählten Wirtszelle sein. In diesem Fall sind ein Replikationsursprung und ein selektierbarer Marker, die in dem bakteriellen Wirt funktionieren, erforderlich. Es ist auch möglich, Restriktionsplätze, die die bakteriellen und einzigartigen Sequenzen umgeben, auf den Expressionsvektor zu platzieren: Dies macht es möglich, diese Sequenzen durch Schneiden und Neuligatur des Rumpfvektors in vitro vor der Transformation der Wirtszellen zu unterdrücken, was in einen Anstieg bei der Anzahl der Kopien resultieren kann und in eine erhöhte Stabilität des Expressionsplasmids in den genannten Wirten. Zum Beispiel können solche Restriktionsplätze Sequenzen entsprechen, wie beispielsweise 5'-GGCCNNNNNGGCC-3' (SfiI) oder 5'-GCGGCCGC-3' (NotI), da diese Plätze sehr selten sind und allgemein bei einem Expressionsvektor fehlen.
- Nach der Konstruktion solcher Vektoren bzw. einer solchen Expressionskassette wird die letztere gemäß den konventionellen Techniken, die in der Literatur beschrieben sind, in die ausgewählten Wirtszellen eingeführt. Diesbezüglich kann jegliches Verfahren, das das Einführen einer fremden DNA in eine Zelle erlaubt, verwendet werden. Dies kann insbesondere Transformation, Elektroporation, Konjugation oder jede andere Technik, die dem Fachmann bekannt ist, sein. Als ein Beispiel für Wirte vom Hefetyp wurden die verschiedenen verwendeten Stämme von Kluyveromyces durch Behandeln der ganzen Zellen in der Anwesenheit von Lithiumacetat und Polyethylenglykol gemäß der Technik transformiert, die von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163] beschrieben wird. Die Transformationstechnik, die von Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990) 7] beschrieben wird und die Ethylenglykol und Dimethylsulphoxit verwendet, wurde ebenfalls angewendet. Es ist auch möglich, die Hefen gemäß dem Verfahren, das von Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 90] beschrieben wird, durch Elektroporation zu transformieren. Ein alternatives Protokoll wird auch im Detail bei den folgenden Beispielen beschrieben.
- Nach der Selektion der transformierten Zellen werden Zellen, die die genannten Polypeptide expressivieren, beimpft und die Bergung der genannten Polypeptide kann ausgeführt werden, entweder während des Zellwachstums bei "kontinuierlichen" Prozessen oder am Ende des Wachstums bei "schlagweisen" Kulturen. Die Polypeptide, die das Objekt der vorliegenden Erfindung sind, werden dann für ihre molekulare, pharmakokinetische und biologische Charakterisierung aus dem Kulturüberstand aufgereinigt. Ein bevorzugtes Expressionssystem für die erfindungsgemäßen Polypeptide besteht in der Verwendung von Hefen der Art Kluyveromyces als Wirtszelle, die durch bestimmte Vektoren transformiert sind, welche von dem extrachromosonalen Replikon pKD1 erhalten werden, das ursprünglich von der K. marxianus Variante von Drosophilarum isoliert wurde. Diese Hefen und insbesondere K. lactis und K. fragilis sind allgemein in der Lage, die genannten Vektoren stabil zu replizieren, und besitzen zusätzlich den Vorteil, dass sie in der Liste der G. R. A. S.-("Generally Recognized As Safe" = Allgemein als sicher angesehenen) Organismen enthalten sind. Bevorzugte Hefen sind vorzugsweise industrielle Hefen der Art Kluyveromyces, die in der Lage sind, die genannten Plasmide, die von dem Plasmid pKD1 erhalten werden und in die ein selektierbarer Marker sowie eine Expressionskassette, die die Sekretion des erfindungsgemäßen Polypeptids auf hohem Niveau erlaubt, eingesetzt sind, stabil zu replizieren.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nukleotidsequenzen, die die oben beschriebenen chimären Polypeptide codieren, sowie auf die eukaryotischen oder prokaryotischen rekombinanten Zellen, die solche Sequenzen aufweisen.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Anwendung der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung als medizinische Produkte. Genauer ist der Gegenstand der Erfindung jegliche pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrerer Polypeptide oder Nukleotidsequenzen enthält, wie sie oben beschrieben sind. Die Nukleotidsequenzen können konkret in der Gentherapie verwendet werden.
- Die vorliegende Erfindung wird vollständiger beschrieben werden mit Hilfe der folgenden Beispiele, die als illustrativ und nicht limitierend betrachtet werden sollten.
- LISTE DER FIGUREN
- Die Darstellungen der Plasmide, die in den folgenden Figuren wiedergegeben sind, sind nicht maßstabgerecht gezeichnet, und nur die Restriktionsplätze, die für das Verständnis der durchgeführten Klonungen wichtig sind, sind eingezeichnet worden.
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1 : Schematische Wiedergabe der Chimären des SAH-PEPTID-Typs (A), des PEPTID-SAH-Typs (B) bzw. des PEPTID-SAH-PEPTID-Typs (C). Verwendete Abkürzungen: M/LP, Methioninrest als Übersetzungsinitiator, optional gefolgt von einer Signalsequenz für die Sekretion; SAH, reifes Albumin oder eine seiner molekularen Varianten; PEP, Peptid von natürlichem oder künstlichem Ursprung, das eine gegebene therapeutische Eigenschaft besitzt. Die PEP-Sequenz kann bei den Molekülen vom Typ A, B bzw. C mehrfach vorliegen. Der schwarze Pfeil zeigt das N-terminale Ende des reifen Proteins an. - SEQ ID No. 1: Beispiele von Nukleotidsequenzen eines HindIII-Restriktionsfragments, das ein chimäres Protein des Prepro-SAH-PEPTID-Typs codiert. Die schwarzen Pfeile zeigen das Ende der "Pre"- und "Pro"-Regionen von SAH an. Der MstII-Restriktionsplatz ist unterstrichen, und der Kodon, der die Beendigung der Übersetzung spezifiziert, steht in fetten Buchstaben.
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3 : Restriktionsplan für das Plasmid pYG105 und die generische Strategie zum Konstruieren des Plasmids für die Expression des chimären Proteins der vorliegenden Erfindungen. Verwendete Abkürzungen: P, transkriptionaler Promotor; T, transkriptionaler Terminator; IR, invertierte Wiederholungssequenzen des Plasmids pKD1; LP, Signalsequenz für die Sekretion; Apr und Kmr bezeichnen die Gene für die Beständigkeit gegen Ampizillin (E. coli) bzw. gegenüber G418 (Hefen). -
4 : Beispiele von Nukleotidsequenzen von MstII-HindIII-Restriktionsfragmenten, die von dem von Willebrand-Faktor erhalten werden. Wiedergabe der Struktur der MstII-HindIII-Fragmente der Plasmide pYG1248 (Tafel A), pYG1214 (Tafel B), pYG1206 [Tafel C, bei dieser speziellen Chimäre ist der Leu694-Rest des vWF auch der letzte Rest (Leu585) des SAH] und pYG1223 (Tafel D); die Nummerierung der Aminosäuren entspricht der Nummerierung des reifen vWF nach Titani et al. [Biochemistry 25 (1986) 3171–3184]. Die MstII- und HindIII-Restriktionsplätze sind unterstrichen und der Übersetzungsbeendigungskodon steht in fetten Buchstaben. - SEQ ID No. 2: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionssequenz des Plasmids pYG1248. Die Nummerierung der Aminosäuren (rechte Spalte) entspricht dem reifen chimären Protein SAH-vWF470→713 (829 Reste). Die Reste Thr470, Leu494, Asp498, Pro502, Tyr508, Leu694, Pro704 und Pro708 des reifen vWF sind unterstrichen.
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5 : Charakterisierung des Materials, das nach vier Tagen (Erlenmeyer-)Kultur des Stamms CBS 293.91, der mit den Plasmiden pYG1248 (Plasmid für die Expression einer Chimäre des Typs SAH-vWF Thr470→Val713) und pKan707 (Steuerplasmid) transformiert war, sekretiert war. Bei diesem Experiment wurden die Resultate für die Tafeln A, B und C auf demselben Gel (8,5% SDS-PAGE) laufen gelassen und dann getrennt behandelt.
A, Coomassie-Blaufärbung; Molekulargewichtstandard (Spur 2); Überstand äquivalent zu 50 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pKan707 in YPL-Medium (Spur 1) oder pYG1248 in YPD-Medium (Spur 3) oder YPL (Spur 4).
B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials nach Anwendung von Mausantikörpern, die gegen humanes vWF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A, außer dass biotinilierte Molekulargewichtstandards verwendet wurden.
C, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials nach Anwendung von Kaninchenantikörpern, die gegen humanes Albumin gerichtet sind: Überstand äquivalent zu 50 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pKan707 in YPL-Medium (Spur 1) oder pYG1248 in YPD-Medium (Spur 2) oder YPL (Spur 3). -
6 : Kinetik der Sekretion einer erfindungsgemäßen Chimäre durch den Stamm CDS293.91, der mit dem Plasmid pYG1206 (SAH-vWF Leu694-Pro708) transformiert ist.
A, Coomassie-Blaufärbung; Molekulargewichtstandard (Spur 1); Überstand äquivalent zu 2,5 μl einer "Schlagfütterungskultur" in YPD-Medium nach 24 Stunden (Spur 2), 40 Stunden (Spur 3) oder 46 Stunden (Spur 4) Wachstum.
B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials nach Anwendung von Mausantikörpern, die gegen humanes vWF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A, außer dass biotinilierte Molekulargewichtstandards verwendet wurden. -
7 : Charakterisierung des Materials, das von K. lactis sekretiert wurde, die mit den Plasmiden pKan707 (Steuerplasmid, Spur 2), pYG1206 (Spur 3), pYG1214 (Spur 4) und pYG1223 (Spur 5) transformiert war; Molekulargewichtstandard (Spur 1). Die Ablagerungen entsprechen 50 μl Überstand aus einer stationären Kultur nach Wachstum in YPD-Medium, Lauf auf einem 8,5% Akrylamidgel und Coomassie-Blaufärbung. - SEQ ID No. 3: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1341 (SAH-UK1→135). Auf die Grenze der EGF-artigen Domain (UK1→46), die bei dem MstII-HindIII-Restriktionsfragment des Plasmids pYG1340 vorliegt, ist hingewiesen. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein SAH-UK1→135 (720 Reste).
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9 : Sekretion der SAH-UK1–46- und SAH-UK1-135-Chimären von dem Stamm CBS 293.91 transformiert mit dem Plasmid pYG1343 (SAH-UK1-46) bzw. pYG1345 (SAH-UK1-135) nach vier Tagen Wachstum (YPL + G418-Medium). Die Ablagerungen (äquivalent zu 50 μl Kultur) sind auf einem 8,5%-PAGE-SDS-Gel gelaufen und mit Coomassie-Blau gefärbt: Überstand eines Klons, der mit den Plasmid pKan707 (Spur 1), pYG1343 (Spur 3) oder pYG1345 (Spur 4) transformiert war; Molekulargewichtstandard (Spur 2). - SEQ ID No. 4: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1259 (SAH-G.CSF). Das Limit des G-CSF-Teils (174 Reste) ist angezeigt. Die ApaI- und SstI (SstI)-Restriktionsplätze sind unterstrichen. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein SAH-G.CSF (759 Reste).
- SEQ ID No. 5: Nukleotidsequenz des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1301 (Chimäre G.CSF-Gly4-SAH). Die schwarzen Pfeile zeigen das Ende der "Pre"- und "Pro"-Regionen von SAH an. Die ApaI- und SstI (SacI)- und MstII-Restriktionsplätze sind unterstrichen. Die G.CSF- (174 Reste) und SAH-(585 Reste)Domänen sind durch zwei synthetische Linker GGGG getrennt. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein G.CSF-Gly4-SAH (763 Reste). Die Nukleotidsequenz zwischen dem Übersetzungsbeendigungskodon und dem HindIII-Platz kommt von der komplementären SAH-DNA (cDNA), wie es in der Patentanmeldung
EP 361 991 -
12 : Charakterisierung des Materials, das nach vier Tagen (Erlenmeyer-)Kultur des Stamms CBS 293.91 transformiert mit den Plasmiden pYG1266 (Plasmid für die Expression einer Chimäre des SAH-G.CSF-Typs) und pKan707 (Steuerplasmid) sekretiert wurde. In diesem Experiment sind die Resultate der Tafeln A, B und C auf demselben Gel (8,5% SDS-PAGE) gelaufen und dann getrennt behandelt worden.
A, Coomassie-Blaufärbung; Molekulargewichtstandard (Spur 2); Überstand äquivalent zu 100 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pKan707 in YPL-Medium (Spur 1) oder pYG1266 in YPD-Medium (Spur 3) oder YPL (Spur 4).
B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen humanes G-CSF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A.
C, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen Humanalbumin gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A. -
13 : Charakterisierung des Materials, das nach vier Tagen Kultur (Erlenmeyer in YPD-Medium) des Stamms CBS 293.91 transformiert mit den Plasmiden pYG1267 (Chimäre SAH-G.CSF), pYG1303 (Chimäre G.CSF-Gly4-SAH) und pYG1352 (Chimäre SAH-Gly4-G.CSF) sekretiert wurde, nach Laufen auf einem 8,5% SDS-PAGE-Gel.
A, Coomassie-Blaufärbung: Überstand äquivalent zu 100 μl der Kultur transformiert mit dem Plasmid pYG1303 (Spur 1), pYG1267 (Spur 2), pYG1352 (Spur 3); Molekulargewichtstandard (Spur 4).
B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen humanes G-CSF gerichtet sind: Dieselbe Legende wie bei A. - SEQ ID No. 6: Nukleotidsequenz des MstII-HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1382 (SAH-Fv'). Die VH- (124 Reste) und VL-(107 Reste)Domänen des Fv'-Fragments sind durch den synthetischen Linker (GGGGS)x3 getrennt. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem reifen chimären Protein SAH-Fv' (831 Reste).
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15 : Sekretion der Chimäre SAH-Fv' durch den Stamm CBS 293.91 transformiert mit dem Plasmid pYG1382 (LAC4) nach vier Tagen Wachstum in Erlenmeyerkolben bei 28°C in YPD-Medium (Spur 2) oder YPL (Spur 3); Molekulargewichtsstandard (Spur 1). Die Ablagerungen, die äquivalent zu 200 μl Kultur (Präzipitation mit Ethanol) sind, sind auf einem PAGE-SDS-Gel (8,5%) gelaufen.
A, Coomassie-Blaufärbung des Gels.
B, immunologische Charakterisierung des sekretierten Materials, nach Anwendung primärer Antikörper, die gegen SAH gerichtet sind. -
16 : Test der antagonistischen Aktivität bei der Agglutinierung von humanen Blutplättchen, die mit Formaldehyd fixiert sind, in vitro: IC50 der Hybride SAH-vWF694–708, [SAH-vWF470–713 C471G, C474G] und [SAH-vWF470–704 C471G, C474G] verglichen mit dem Standard RG12986. Die Bestimmung der dosisabhängigen Inhibierung der Plättchenagglutinierung wird gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von C. Prior et al. [Bio/Technology (1992) 10 66] beschrieben ist, unter Verwendung eines Aggregameters, das die Änderungen der optischen Transmission aufzeichnet, unter Rühren bei 37°C in der Anwesenheit von humanem vWF, Botrozetin (8,2 mg/ml) und des Testprodukts in verschiedenen Verdünnungen. Die Konzentration des Produkts, die es möglich macht, die kontrollierte Agglutinierung (in der Abwesenheit des Produkts) um die Hälfte zu inhibieren, wird dann bestimmt (IC50). -
17 : Aktivität auf die Zellproliferation in vitro der Mauslinie NSF60. Die in den Zellkern nach sechs Stunden Inkubation eingebaut Radioaktivität (3H-Thymidin) ist auf der y-Achse wiedergegeben (min–1); die Quantität des Produkts, die auf der x-Achse angegeben ist, ist in seiner Molarität (willkürliche Einheiten) ausgedrückt. -
18 : Aktivität auf die Granulozytenbildung in vivo bei Ratten. Die Anzahl an Neutrophilen (Mittel für sieben Tiere) ist auf der y-Achse als Funktion der Zeit angegeben. Die getesteten Produkte sind die Chimäre SAH-G.CSF (pYG1266, 4 oder 40 mg/Ratte/Tag), die Referenz G-CSF (10 mg/Ratte/Tag), das rekombinante SAH aufgereinigt von Kluyveromyces lactis-Überstand (SAH, 30 mg/Ratte/Tag, sieheEP 361 991 - BEISPIELE
- ALLGEMEINE KLONIERUNGSTECHNIKEN
- Die Verfahren, die üblicherweise in der Molekularbiologie angewendet werden, so wie die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA in Cäsiumchloridgradient, die Elektrophorese auf Agarose- oder Akrylamidgelen, die Aufreinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktionen von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, die DNA-Präzipitation in salzhaltivem Medium mit Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli und dergleichen, sind dem Fachmann wohl bekannt und in der Literatur [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Herausgeber), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987] umfangreich beschrieben.
- Die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Amersham bereitgestellt und gemäß den Empfehlungen der Lieferanten verwendet.
- Die Plasmide vom pBR322- und pUC-Typ und die Phagen der M13-Serien sind von kommerziellem Ursprung (Bethesda Research Laboratories).
- Für die Ligatur werden die DNA-Fragmente durch Elektrophorese auf Agarose- oder Akrylamidgelen ihrer Größe nach getrennt, mit Phenol oder mit einer Phenol-/Chloroformmischung extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und dann in der Anwesenheit von Phage-T4-DNA-Ligase (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers inkubiert.
- Die Füllung der vorstehenden 5'-Enden wird mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferanten durchgeführt. Die Zerstörung der vorstehenden 3'-Enden wird in der Anwesenheit von Phage-T4-DNA-Polymerase (Biolabs) durchgeführt, die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Die Zerstörung der vorstehenden 5' Enden wird durch eine kontrollierte Behandlung mit S1-Nuklease durchgeführt.
- Platzgerichtete Mutationsgenierung in vitro mit synthetischen Oligodeoxynukleotiden wird gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt wurde, unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits.
- Die enzymatische Verstärkung des DNA-Fragments durch die so genannte PCR-Technik (Polymerase-catalyzed Chain Reaction = Polymerase-katalysierte Kettenreaktion, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] wird unter Verwendung eines "DNA Thermal Cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt.
- Die Verifikation der Nukleotidsequenzen wird durch das Verfahren durchgeführt, das von Sangen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, unter Verwendung des Kits, das von Amersham vertrieben wird.
- Die Transformationen von K. lactis mit DNA der Plasmide für die Expression der Plasmide der vorliegenden Erfindung werden durch jede Technik, die dem Fachmann bekannt ist und für die ein Beispiel im Text gegeben wird, durchgeführt.
- Soweit nicht anderweitig angegeben, sind die verwendeten Bakterienstämme E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, galK, strAr) oder E. coli TG1 (lac, proA, B, supE, thi, hsdD5/FtraD36, proA+B+, lacIq, lacZ, M15).
- Die verwendeten Hefestämme gehören zu Knospen treibenden Hefen und spezieller zu den Hefen der Art Kluyveromyces. Insbesondere wurden die Stämme K. lactis MW98-8C (a, uraA, arg, lys, K+, pKD1°) und K. lactis CBS 293.91 verwendet; ein Beispiel des MW98-8C-Stamms wurde am 16. September 1988 beim Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) in Baarn (Niederlande) hinterlegt, wo er unter der Nummer CBS 579.88 registriert wurde.
- Ein bakterieller Stamm (E. coli), der mit dem Plasmid pET-8c52K transformiert war, wurde am 17. April 1990 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 68306 hinterlegt.
- Die Hefestämme, die mit den Expressionsplasmiden transformiert waren, die die Proteine der vorliegenden Erfindung codieren, werden in Erlenmeyerkolben oder in 21 Proben-Fermentern (SETRIC, Frankreich) bei 28°C in Nährmedium (YPD: 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Glukose; oder YPL: 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton; 2% Lactose) unter konstantem Rühren kultiviert.
- BEISPIEL 1: KOPPLUNG AN DEN C-TERMINUS VON SAH
- Das Plasmid pYG404 ist in der Patentanmeldung
EP 361 991 1 , Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. In einer anderen Ausführungsform kann das biologisch aktive Peptid mehr als einmal bei der Chimäre vorliegen. - BEISPIEL 2: KOPPELN AN DEN N-TERMINUS VON SAH
- Bei einer konkreten Ausführungsform machen es die kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung möglich, Hybridgene zu konstruieren, die ein chimäres Protein codieren, das aus der Übersetzungskopplung eines Signalpeptid (zum Beispiel der Prepro-Region von SAH), einer Sequenz, die das biologisch aktive Peptid umfasst, und der reifen Form von SAH oder einer ihrer molekularen Varianten resultiert. Diese Hybridgene werden vorzugsweise bei 5' des Übersetzungsinitiators ATG und bei 3' des Übersetzungsstopkodons durch HindIII-Restritionsplätze begrenzt und codieren chimäre Proteine des PEPTID-SAH-Typs (
1 , Tafel B). In einem noch konkreteren Ausführungsbeispiel kann das biologisch aktive Peptid mehr als einmal bei der Chimäre vorliegen. - BEISPIEL 3: KOPPELUNG AN DEN N- UND C-TERMINUS VON SAH
- Die kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben sind, machen es möglich, Hybridgene zu konstruieren, die ein chimäres Protein codieren, das aus der Übersetzungskopplung der reifen Form von SAH oder einer seiner molekularen Varianten und eines biologisch aktiven Peptids gekoppelt an die N- und C-terminalen Enden von SAH resultiert. Diese Hybridgene werden vorzugsweise bei 5' des Übersetzungsinitiators ATG und bei 3' des Übersetzungsstopkodons durch HindIII-Restriktionsplätze begrenzt und codieren chimäre Proteine des PEPTID-SAH-PEPTID-Typs (
1 , Tafel C) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH. In einem noch konkreteren Ausführungsbeispiel kann das biologisch aktive Peptid mehr als einmal bei der Chimäre vorliegen. - BEISPIEL 4: EXPRESSIONSPLASMIDE
- Die chimären Proteine der vorangehenden Beispiele können unter Verwendung von funktionalen, regulierbaren oder konstitutiven Promotoren, wie beispielsweise jenen, die in den Plasmiden pYG105 (LAC4-Promotor von Kluyveromyces lactis), pYG106 (PGK-Promotor von Saccharomyces cerevisiae), pYG536 (PHO5-Promotor von S. cerevisiae) oder von Hybridpromotoren, wie beispielsweise jenen, die in der Patentanmeldung
EP 361 991 EP 361 991 3 wiedergegeben. Die Plasmide pYG105 und pYG106 unterscheiden sich voneinander nur in der Natur des Promotors für die Transkription, der durch das SalI-HindIII-Fragment codiert wird. - BEISPIEL 5: TRANSFORMATION DER HEFEN
- Die Transformation der Hefen, die zu der Art und Kluyveromyces gehören, und insbesondere derjenigen der Stämme MW98-8C und CBS 293,91 von K. lactis, wird beispielsweise durch die Technik der Behandlung ganzer Zellen mit Lithiumacetat [Ito N. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163–168] durchgeführt, die wie folgt angepasst war. Das Wachstum der Zellen wird bei 28°C in 50 ml YPD-Medium unter Rühren und bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) zwischen 0,6 und 0,8 durchgeführt; die Zellen werden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet, in einer sterilen Lösung von TE (10 mM Tris HCl ph 7,4; 1 mM EDTA) gewaschen, in 3 bis 5 ml Lithiumacetat (0,1 M in TE) resuspendiert, um eine Zelldichte von etwa 2 × 108 Zellen/ml zu erhalten, und dann bei 30°C für eine Stunde unter moderatem Rühren inkubiert. Aliquots der resultierenden Suspension von kompetenten Zellen von 0,1 ml werden bei 30°C für eine Stunde in der Anwesenheit von DNA und bei einer Endkonzentration von 35% Polyethylenglykol (PEG4000, Sigma) inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 5 min. bei 42°C werden die Zellen zweimal gewaschen, in 0,2 ml sterilem Wasser resuspendiert und für 16 Stunden bei 28°C in 2 ml YPD-Medium inkubiert, um die phenotypische Expression des Gens für die Beständigkeit gegenüber G418 zu ermöglichen, das unter der Steuerung des PK1-Promotors expressiviert wird (siehe
EP 361 991 - BEISPIEL 6: SEKRETION DER CHIMÄREN
- Nach der Selektion auf Nährmedium mit zugesetztem G418, werden die rekombinanten Klone auf ihre Kapazität getestet, die reife Form des chimären Proteins zu sekretieren. Einige Klone entsprechend dem Stamm CBS 293,91 oder MB98-8C transformiert durch die Plasmide für die Expression der Chimären von SAH und dem biologisch aktiven Teil werden in YPD- oder YPL-Medium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden durch Zentrifugation geborgen, wenn die Zellen die stationäre Wachstumsphase erreichen, optional 10-fach konzentriert durch Präzipitation für 30 min. bei –20°C in einer Endkonzentration von 60% Ethanol, und dann nach Elektrophorese in einem 8,5% SDS-PAGE-Gel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarkierung unter Verwendung primärer Antikörper, die gegen den biologisch aktiven Teil gerichtet sind, oder eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen SAH gerichtet ist. Während der Experimente für die immunologische Detektion wird der Nitrozellulosefilter zunächst in der Anwesenheit spezifischer primärer Antikörper inkubiert, mehrere Male gewaschen, in der Anwesenheit von Ziegenantikörpern, die gegen die primären Antikörper gerichtet sind, inkubiert und dann in der Anwesenheit eines Avidin-Peroxydase-Komplexes unter Verwendung des "ABC-Kits" inkubiert, das von Vectastain (Biosys S. A., Compiegne, Frankreich) vertrieben wird. Die Immunreaktion wird dann durch Zugabe von 3,3'-Diaminbenzidintetrahydrochlorid (Prolabo) in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxyd gemäß den Empfehlungen des Herstellers zum Vorschein gebracht.
- BEISPIEL 7: VON DEM VON WILLEBRAND-FAKTOR ERHALTENE CHIMÄREN
- E.7.1. Fragmente, die die Bindung von vWF an die Plättchen antagonisieren
- E.7.1.1. Thr-470-Val713-Reste von vWF
- Das Plasmid pET-8c52K enthält ein Fragment der vWF-cDNA-codierenden Reste 445–733 von humanem vWF und umfasst deshalb verschiedene wesentliche Determinanten der Wechselwirkung zwischen vWF und den Blutplättchen auf der einen Seite und bestimmten Elementen der basalen Membran und des sub-endothelialen Gewebes auf der anderen Seite und insbesondere die Peptide G10 und G5, die die Wechselwirkung zwischen vWF und GP1b antagonisieren [Mori H. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-17904]. Diese Peptidsequenz ist identisch mit der entsprechenden Sequenz, die von Titani et al. beschrieben wird [Biochemistry 25 (1986) 3171–3184]. Die Verstärkung dieser genetischen Determinanten kann unter Verwendung des Plasmids pET9c52K, z. B. durch die PCR-Verstärkungstechnik, unter Verwendung von Oligodeoxynukleotiden, die benachbarte Reste, welche auf beiden Seiten der zu verstärkenden Sequenz angeordnet sind, codieren, als Primer ausgeführt werden. Die verstärkten Fragmente werden dann in Vektoren des M13-Typs für ihre Verifikation durch Sequenzieren unter Verwendung entweder des universellen Primers, der auf irgendeiner Seite des mehrfachen Klonplatzes angeordnet ist, oder von Oligodeoxynukleotiden, die für die verstärkte Region des vWF-Gens spezifisch sind, von welcher die Sequenz von verschiedenen Isomorphen bekannt ist [Sadler J. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 6394–6398; Verweij C. L. et al., EMBO J. 5 (1986) 1839–1847; Shelton-Inloes B. B. et al., Biochemistry 25 (1986) 3164–3171; Bonthron D. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1986) 7125–7127] geklont. So erzeugt die PCR-Verstärkung des Plamids pET8c52K mit den Oligodeoxynukleotiden 5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCTGTGAAGCCTGC-3' (Sq1969, der MstII-Platz ist unterstrichen) und 5'-CCCGGGATCCAAGCTTAGACTTGTGCCATGTCG-3' (Sq2029, der HindIII-Platz ist unterstrichen) ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment einschließlich der Thr470 bis Va1713 Reste von vWF (SEQ ID No. 2). Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-NstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (
1 , Tafel A), direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1248 (SAH-vWF470–713) erzeugt. - E.7.1.2. Molekulare Varianten
- In einer anderen Ausführungsform ist der Bindungsplatz von vWF ein Peptid, das die Thr470 bis Asp498-Reste des reifen vWF umfasst. Diese Sequenz umfasst das Peptid G10 (Cys474-Pro-488), das von Mori et al. [J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901–17904] beschrieben wird und das in der Lage ist, die Wechselwirkung von humanem vWF mit dem GP1b der humanen Blutplättchen zu antagonisieren. Die Sequenz entsprechend dem Peptid G10 wird zuerst, z. B. durch PCR-Verstärkung des Plasmids pET-8c52K mit den Oligodeoxynukleotiden Sq1969 und 5'-CCCGGGATCCAAGCTTAGTCCTCCACATACAG-3' (Sq1970, der HindIII-Platz ist unterstrichen), in ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment (
4 , Tafel B) eingebaut, was einen MstII-HindIII-Restriktionsfragment erzeugt, das das Peptid G10 umfasst und dessen Sequenz 5'CCTTAGGCTTAACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGACTAAGCTT-3' (die Sequenz, die das Peptid G10 codiert, steht in fetten Buchstaben) lautet. Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1 , Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplamid pYG1214 erzeugt. - In einer anderen Ausführungsform ist der Platz für das Binden von vWF an GP1b mit der Hilfe von synthetischen Oligodeoxynukleotiden, z. B. mit der Hilfe der Oligodeoxinukleotide 5'-TTAGGCCTCTGTGACCTTGCCCCTGAAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCTAAGCTTA-3' und 5'-GATCTAAGCTTAGGGGGGCAGAGTAGGAGGAGGGGCTTCAGGGGCAAGGTCACAGAGGCC-3, direkt vorgesehen. Diese Oligodeoxynukleotide formen durch Paarbildung ein MstII-BglII-Restriktionsfragment, das das MstII-HindIII-Fragment (
4 , Tafel C) umfasst, entsprechend dem Peptide D5, das von den Resten Leu694 bis Pro708 von vWF definiert wird. Die Ligatur des MstII-HindIII-Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgel enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1 , Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von "SAH" codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1206 erzeugt. - Nützliche Varianten des Plasmids pET-8c52K werden durch platzgerichtete Mutationsgenierung zwischen den Peptiden G10 und G5 ausgelöscht, z. B. der Plätze für die Bindung an Collagen und/oder an Heparin und/oder an Botrozetin und/oder an Sulphatide und/oder an Ristozetrin. Ein Beispiel ist das Plasmid pMMB9, das durch platzgerichtete Mutationsgenierung zwischen Resten Cys509 und Ile662 zerstört wird. Die PCR-Verstärkung dieses Plasmids mit den Oligodeoxynukleotiden Sq1969 und Sq2029 erzeugt ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment (
4 , Tafel D), das die Reste Thr470 bis Tyr508 und Arg663 bis Val 713 umfasst und insbesondere die Peptide G10 und D5 von vWF und bei dem insbesondere seine Plätze für die Bindung an Collagen, die zwischen den Resten Glu542 und Met622 angeordnet sind [Roth G. J. et al. Biochemistry 25 (1986) 8357–8361], zerstört sind. Die Ligatur dieses Fragments mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (1 , Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Dieses Restriktionsfragment wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1223 erzeugt. - In anderen Ausführungsformen macht es die Anwendung von kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung möglich, willkürlich Varianten des MstII-HindIII-Restriktionsfragments gemäß der Tafel A von
4 zu erzeugen, bei denen jedoch einer oder mehrere der Plätze für die Bindung an Sulphatide und/oder Botrozetin und/oder Heparin und/oder Collagen zerstört und/oder durch irgendeinen Rest substituiert sind, der mit dem vWF-assoziierten Auftritt von Pathologien vom IIB-Typ zu tun hat. - Bei anderen nützlichen Varianten des Plasmids Pet-8c52K werden Mutationen beispielsweise durch platzgerichtete Mutationsgenierung eingeführt, um den Satz von Zysteinen, die an den Positionen 471, 474, 509 und 695 des humanen vWF vorliegen, ganz oder teilweise zu ersetzen oder zu unterdrücken. Konkrete Beispiele sind die Plasmide p5E und p7E, bei denen die Zysteine, die an den Positionen 471 und 474 einerseits bzw. an den Positionen 471, 474, 509 und 695 andererseits vorliegen, durch Glyzinreste ersetzt worden sind. Die PCR-Verstärkung dieser Plasmide mit dem Oligodeoxynukleotiden Sq 2149 (5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCGGTGAAGCCGGC-3', der MstII-Platz ist unterstrichen) und Sq2029 macht es möglich, MstII-HindIII-Restriktionsfragemente zu erzeugen, die die Reste Thr470 bis Va1713 von natürlichem vWF umfassen, mit der Ausnahme, dass mindestens die Zysteinreste an den Positionen 471 und 474 in Glyzinreste mutiert werden. Die Ligatur dieser Fragmente mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt ein HindIII-Restriktionsfragment, das ein Hybridgen enthält, das ein chimäres Protein vom SAH-PEPTID-Typ (
1 , Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Diese Restriktionsfragmente werden in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was die Expressionsplasmide pYG1283 (Chimäre SAH-vWF470–713, C471G, C474G) und pYG1279 (Chimäre SAH-vWF470–713, C471G, C474G, C509G, C695G) erzeugt. - Andere besonders nützliche Mutationen wirken sich auf mindestens einen Rest aus, der mit den vWF-assoziierten Typ IIB-Pathologie (Anstieg der intrinsischen Affinität von vWF für GP1b) zu tun hat, wie beispielsweise die Reste Arg543, Arg545, Trp550, Val551, Val553, Pro574 oder Arg578. Die genetischen Rekombinationstechniken in vitro machen es auch möglich, willkürlich einen oder mehrere zusätzliche Reste in die Sequenz von vWF einzuführen, z. B. ein überzähliges Methionin zwischen den Positionen Asp539 und Glu542.
- E.7.2. Fragmente, die die Bindung von vWF an das Subendothelium antagonisieren
- In einer konkreten Ausführungsfunktion werden die Plätze für die Bindung von vWF an die Komponenten des subendothelialen Gewebes, z. B. an Collagen, durch PCR-Verstärkung des Plasmids pET-8C52K z. B. mit den Oligodeoxynukleotiden Sq2258 (5'-GGATCCTTAGGGCTGTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTC-3', der MstII-Platz ist unterstrichen) und Sq2259 (5'GAATTCAAGCTTAACAGAGTAGCTAACGATCTCGTCC-3', der HindIII-Platz ist unterstrichen) erzeugt, was ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment erzeugt, das die Reste Cys509 bis Cys695 von natürlichem vWF codiert. Molekulare Auslöschungsvarianten oder modifizierte Varianten, die jegliche gewünschte Kombination zwischen den Plätzen für die Bindung von vWF an Sulphatide und/oder an Botrozitin und/oder an Heparin und/oder an Collagen und/oder an jeden Rest, der für einem Modifikation der Affinität von vWF für GP1b verantwortlich ist (vWF-assoziierte Typ II-Pathologien), aufweisen, werden ebenfalls erzeugt. In einer anderen Ausführung kann die Domain, die in der Lage, ist, ein Collagen zu fixieren, auch von den vWF-Fragment kommen, das zwischen den Resten 911 und 1.114 liegt und von Pareti et al. [J. Biol. Chem. (1987) 262: 13835–13841] beschrieben ist. Die Ligatur dieser Fragmente mit dem HindIII-MstII-Restriktionsfragment, das mit der Ausnahme der 3 C-terminalen Aminosäuren dem gesamten SAH codierenden Gen entspricht (siehe SEQ ID No. 1), erzeugt HindIII-Restriktionsfragmente, die ein Hybridgen enthalten, welches ein chimäres Protein des SAH-PEPTID-Typs (
1 , Tafel A) direkt nach der "Prepro"-Exportregion von SAH codiert. Diese Restriktionsfragmente werden in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 geklont, was die entsprechenden Expressionsplasmide erzeugt, z. B. das Plasmid pYG1277 (SAH-vWF509–695). - E.7.3. Reinigung und molekulare Charakterisierung der Chimären von SAH und vWF
- Die Chimären, die in den Kulturüberständen entsprechend den z. B. mit den Expressionsplasmiden gemäß den Beispielen E.7.1. und E.7.2. transformierten CBS293.91-Stämmen vorliegen, werden zunächst mittels Antikörpern charakterisiert, die spezifisch für den SAH-Teil und für den vWF-Teil sind. Die Resultate der
5 und7 zeigen, dass die Hefe K. lactis in der Lage ist, chimäre Proteine zwischen SAH und einem Fragment von vWF zu sekretieren, und dass diese Chimären immunologisch reaktiv sind. Es mag auch wünschenswert sein, einige dieser Chimären aufzureinigen. Die Kultur wird dann zentrifugiert (10.000 g, 30 min.), der Überstand wird durch ein 0,22 mm Filter (Millipore) hindurchgeführt und dann durch Ultrafiltration (Amicon) unter Verwendung einer Membran, deren Abscheidungsgrenzwert bei 30 kDa liegt, konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wird dann gegen eine Tris-HCl-Lösung (50 mN pH 8) dialysiert und dann auf einer Säule gereinigt. Z. B. wird das Konzentrat, das dem Kulturüberstand des CBS293.91-Stamms entspricht, der mit dem Plasmid pYG1206 transformiert wurde, durch Affinitätschromatographie auf Blau-Trisakryl (IBF) gereinigt. Eine Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie kann auch angewendet werden. Z. B. kann in dem Fall der Chimäre SAH-vWF470–713 das nach der Ultrafiltration erhaltene Konzentrat gegen eine Tris-HCl-Lösung (50 nM pH 8) dialysiert werden und dann in 20 ml Fraktionen auf eine Kationenaustauschsäule (5 ml) (S Fast Flow, Pharmacia) geladen werden, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Die Säule wird dann einige Male mit der Tris-HCl-Lösung (50 nM pH 8) gewaschen, und das chimäre Protein wird dann durch einen NaCl-Gradienden (0 bis 1 M) von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die das chimäre Protein enthalten, werden dann zusammengefasst und gegen eine 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 8) dialysiert und dann erneut auf die S Fast Flow-Säule geladen. Nach der Elution von der Säule, werden die Fraktionen, die das Protein enthalten, zusammengefasst, gegen Wasser dialysiert und dann vor der Charakterisierung gefriergetrocknet: Z. B. ergibt das Sequenzieren (Applied Biosystem) des Proteins [SAH-vWF470704 C471G, C474], das von der Hefe CBS 293,91 sekretiert wird, die N-terminale Sequenz, die für SAH erwartet wird (Asp-Ala-His ...), was eine korrekte Reifung der Chimäre direkt an den C-Terminus des Dubletts der Reste Arg-Arg der "Pro"-Region von SAH (SEQ ID No. 1) anzeigt. Der im Wesentlichen monomere Charakter der chimären Proteine zwischen SAH und vWF wird auch durch ihr Elutionsprofil auf einer TSK 3000 Säule [Toyo Soda Company, eingestellt mit einer Kakodylatlösung (pH7), die 0,2 M Na2SO4 enthält] bestätigt: Z. B. verhält sich die Chimäre [SAH-vWF 470–704 C471G, C474G] unter diesen Bedingungen wie ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 95 kDa, was auf ihren monomeren Charakter hinweist. - BEISPIEL 8: CHIMÄREN, DIE VON UROKINASE ERHALTEN WERDEN
- E.8.1. Konstruktionen
- Ein Fragment, das dem aminoterminalen Fragment von Urokinase entspricht (ATF = EGF-artige Domain plus Kringeldomain) kann von der entsprechenden Messenger-RNA aus Zellen bestimmter humaner Karzinome erhalten werden, z. B. unter Verwendung des RT-PCR-Kits, das von Pharmacia vertrieben wird. Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das dass ATF von humaner Urokinase umfasst, ist in SEQ ID No. 3 angegeben. Die Ligatur des HindIII-MstII-Fragments des Plasmids pYG404 mit diesem MstII-HindIII-Fragment macht es möglich, das HindIII-Fragment des Plasmids pYG1341 zu erzeugen, das ein chimäres Protein codiert, in dem das SAH-Molekül genetisch an das ATF gekoppelt ist (SAH-UK1→135). In gleicher Weise enthält das Plasmid pYG1340 ein HindIII-Fragment, das eine Chimäre codiert, die aus SAH direkt gefolgt von den ersten 46 Resten humaner Urokinase zusammengesetzt ist (SAH-UK1→46, siehe SEQ ID No. 3). Das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1340 (SAH-UK1→46) in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz der Plasmide pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) erzeugt die Expressionsplasmide pYG1343 bzw. pYG1342. In gleicher Weise erzeugt das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1341 (SAH-UK1→135) in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz der Plasmide pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) die Expressionsplasmide pYG1345 bzw. pYG1344.
- E.8.2. Sekretion der Hybride
- Nach Selektion auf Nährmedium, das mit G418 angereichert war, werden die rekombinanten Klone auf ihre Kapazität getestet, die reife Form des chimären Proteins SAH-UK zu sekretieren. Einige Klone, die dem Stamm K. lactis CBS 293.91 entsprechen, der mit den Expressionsplasmiden gemäß dem Beispiel E.9.1. transformiert ist, werden in selektivem flüssigen Komplettmedium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden dann nach Elektrophorese auf einem 8,5% Akrylamidgel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarkieren unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen Humanalbumin oder gegen humane Urokinase gerichtet ist, als Antikörper. Die Resultate von
9 zeigen, dass die Hybridproteine SAH-UK1→46 und SAH-UK1→135 besonders gut von der Hefe Kluyveromyces sekretiert werden. - E.8.3. Reinigung der Chimären von SAH und Urokinase
- Nach der Zentrifugation einer Kultur des CBS 291.91-Stamms, der mit den Expressionsplasmiden gemäß Beispiel E.8.1 transformiert ist, wird der Kulturüberstand durch ein 0,22 mm Filter (Millipore) hindurchgeführt und dann durch Ultrafiltration (Amicon) unter Verwendung einer Membran konzentriert, deren Ausschlussgrenzwert bei 30 kDa liegt. Das erhaltene Konzentrat wird dann ausgehend von einer Stammlösung von 1 M Tris-HCl (pH 7) auf 50 nM Tris-HCl eingestellt und dann in 20 ml-Fraktionen auf eine Anionenaustauschsäule (3 ml) (D-Zephyr Sepracor) geladen, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Das chimäre Protein (SAH-UK1→46 oder SAH-UK1→135) wird dann durch einen NaCl-Gradienden (0 bis 1 M) von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die das chimäre Protein enthalten, werden dann zusammengefasst und gegen eine 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 6) dialysiert und erneut auf eine D-Zephyr-Säule geladen, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Nach der Elution von der Säule, werden die Fraktionen, die das Protein enthalten, zusammengefasst, gegen Wasser dialysiert und vor der Charakterisierung ihrer biologischen Aktivität und insbesondere bezüglich ihrer Fähigkeit, Urokinase von ihren Zellrezeptoren zu verdrängen, gefriergetrocknet.
- BEISPIEL 9: CHIMÄREN, DIE VON G-CSF ERHALTEN WERDEN
- E.9.1. Konstruktionen
- E.9.1.1. Kopplung an den C-Terminus von SAH
- Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das die reife Form von humanem G-CSF enthält, wird z. B. gemäß der folgenden Strategie erzeugt: Ein KpnI-HindIII-Restriktionsfragment wird zunächst durch die enzymatische PCR-Verstärkungstechnik unter Verwendung der Oligodeoxynukleotide Sq2291 (5'-CAAGGATCCAAGCTTCAGGGCTGCGCAAGGTGGCGTAG-3', wobei der HindIII-Platz unterstrichen ist) und Sq2292 (5'-CGGGGTACCTTAGGCTTAACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3', wobei der KpnI-Platz unterstrichen ist) als Primer auf dem Plasmid BBG13, das als Matrize diente, erhalten. Das Plasmid BBG13 enthält das Gen, das die B-Form (174 Aminosäuren) von reifem humanen B-CSF codiert, das von British Bio-technology Limited, Oxford, England erhalten wird. Das enzymatische Verstärkungsprodukt von ungefähr 550 Nukleotiden wird dann mit den Restriktionsenzymen KpnI und HindIII aufgeschlossen und in den Vektor pUC19 geklont, der mit denselben Enzymen geschnitten wurde, was das rekombinante Plasmid pYG1255 erzeugt. Dieses Plasmid ist die Quelle für ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das es möglich macht, G-CSF unmittelbar stromab von SAH zu fusionieren (Chimäre SAH-G.CSF) und dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID No. 4 angegeben ist.
- Es mag auch wünschenswert sein, ein Linkerpeptid zwischen dem SAH-Teil und G-CSF einzusetzen, um beispielsweise eine bessere funktionelle Darstellung des übertragenden Teils zu ermöglichen. Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment wird beispielsweise durch Substitution des MstII-ApaI-Fragments des Plasmids pYG durch die Oligodeoxinukleotide Sq2742 (5'TTAGGCTTAGGTGGTGGCGGTACCCCCCTGGGCC-3', wobei die Kodons, die die Glyzinreste dieses speziellen Verbinders codieren, unterstrichen sind) und Sq2741 (5'-CAGGGGGGTACCGCCACCACCTAAGCC-3') erzeugt, die durch Paarbildung ein MstII-ApaI-Fragment bilden. Das so erzeugte Plasmid enthält deshalb ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, dessen Frequenz mit der Ausnahme des MstII-ApaI-Fragments identisch mit derjenigen von SEQ ID No. 4 ist.
- Die Ligatur des HindIII-MstII-Fragments des Plasmids pYG404 mit dem MstII-HindIII-Fragment des Plasmids pYG1255 macht es möglich, dass HindIII-Fragment des Plasmids pYG1259 zu erzeugen, das ein chimäres Protein codiert, in dem die B-Form des reifen G-CSF durch kinetische Kopplung in der Übersetzungsphase an dem C-Terminus des SAH-Moleküls positioniert ist (SAH-E.CSF).
- Ein mit der Ausnahme des MstII-ApaI-Fragments identisches HindIII-Restriktionsfragment kann auch leicht erzeugt werden, welches ein chimäres Protein, in dem die B-Form des reifen G-CSF durch genetische Kopplung in der Übersetzungsphase an dem C-Terminus des SAH-Moleküls und eines spezifischen Linkerpeptid positioniert ist, codiert. Z. B. besteht dieser Linker aus 4 Glyzinresten bei dem HindIII-Fragment des Plasmids pYG1336 (Chimäre SAH-Gly4-G.CSF).
- Das HindIII-Restriktionsfragment des Plasmids pYG1259 wird in der produktiven Orientierung in den HindIII-Restriktionsplatz des Expressionsplasmids pYG105 geklont, was das Expressionsplasmid pYG1266 erzeugt (SAH-G.CSF). In einem anderen Beispiel erzeugt das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1259 in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG106 das Plasmid pYG1267. Die Plasmide pYG1266 und pYG1267 sind wechselseitig isogen mit der Ausnahme des SalI-HindIII-Restriktionsfragment, das den LAC4-Promotor von K. lactis (Plasmid pYG1226) bzw. des PGK-Promotors von S. cerevisiae (Plasmid pYG1267) codiert.
- In einem anderen Beispiel erzeugt das Klonen des HindIII-Restrktionsfragments des Plamids pYG1336 (Chimäre SAH-Gly4-G.CSF) in der produktiven Orientierung in den HindIII-Patz des Plasmids pYG105 (LAC4) und von pYG106 (PGK) die Expressionsplasmide pYG1351 bzw. pYG1352.
- E.9.1.2. Kopplung an den N-Terminus von SAH
- In einer konkreten Ausführungsform machen es die kombinierten Techniken der platzgerichteten Mutationsgenierung und der PCR-Verstärkung möglich, Hybridgene zu konstruieren, die ein chimäres Protein codieren, das aus der Übersetzungskopplung eines Signalpeptids (z. B. der Prepro-Region von SAH), einer Sequenz, die ein Gen mit einer G-CSF-Aktivität umfasst, und der reifen Form von SAH oder einer ihrer molekularen Varianten resultiert (s. Chimäre der Tafel B,
1 ). Diese Hybridgene sind vorzugsweise bei 5' des Übersetzungsinitiator-ATG und bei 3' des Übersetzungstoppkodons durch HindIII-Restriktionsplätze begrenzt. Z. B. macht es das Oligodeoxinukleotid Sq2369 (5'-GTTCTACGCCACCTTGCGCAGCCCGGTGGAGGCGGTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG G-3', die unterstrichenen (optionalen) Reste entsprechen bei dieser speziellen Chimäre einem Linkerpeptid, das aus 4 Glyzinresten zusammengesetzt ist) durch platzgerichtete Mutationsgenierung möglich, die reife Form des humanen G-CSF des Plasmids BBG13 in der Übersetzungsphase direkt stromauf der reifen Form von SAH anzubringen, was das Zwischenplasmid A erzeugt. In gleicher Weise macht es die Verwendung des Oligodeoxynukleotids Sq2338 [5'-CAGGGAGCTGGCAGGGCCCAGGGGGGTTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCT-3' (nicht codierender Strang), wobei die Nukleotide, die komplementär zu den Nukleotiden sind, die die ersten N-terminalen Reste der reifen Form des humanen G-CSF codieren, unterstrichen sind] durch platzgerichtete Mutationsgenierung möglich, die Prepro-Region von SAH in der Übersetzungslesephase direkt stromauf der reifen Form des humanen CSF anzukoppeln, was das Zwischenplasmid B erzeugt. Ein HindIII-Fragment, das ein chimäres Protein des PEPTID-SAH-Typs codiert (siehe1 , Tafel B), wird dann durch Kombinieren des HindIII-SstI-Fragments des Plasmids B (Verbindung Prepro-Region von SAH + N-terminales Fragment von reifem CSF) mit dem SstI-HindIII-Fragment des Plasmids A [Verbindung reifes G-CSF-(Glyzin)x4-reifes SAH] erzeugt. Das pYG1301 enthält dieses spezifische HindIII-Restriktionsfragment, das die Chimäre G.CSF-Gly4-SAH codiert, fusioniert direkt stromab der Prepro-Region von SAH (SEQ ID No. 5). Das Klonen dieses HindIII-Restriktionsfragments in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz der Plasmide pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) erzeugt die Expressionsplasmide pYG1302 bzw. pYG1303. - E.9.2. Sekretion der Hybride
- Nach der Selektion auf Nährmedium, dem G418 zugesetzt war, werden die rekombinanten Klone auf ihre Fähigkeit getestet, die reife Form der chimären Proteine von SAH und G-CSF zu sekretieren. Einige Klone, die dem Stamm K. lactis CPS 293.91 entsprechen, der mit den Plasmiden pYG1266 oder pYG1267 (SAH-G.CSF), pYG1302 oder pYG1303 (G.CSF-Gly4-SAH) oder alternativ mit pYG1351 oder pYG1352 (SAH-Gly4-G.CSF) transformiert ist, werden in selektivem flüssigen Komplettmedium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden dann nach Elektroophorese auf einem 8,5% Akrylamidgel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarlierung unter Verwendung von polyklonalen Kaninchenantikörpern, die gegen das humane G-CSF gerichtet sind, oder eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen Humanalbumin gerichtet ist, als primäre Antikörper. Die Resultate gemäß
12 zeigen, dass das Hybridprotein SAH-G.CSF sowohl durch die Antikörper, die die gegen Humanalbumin (Tafel B) als auch gegen humanes G-CSF (Tafel B) gerichtet sind, erkannt werden. Die Resultate gemäß13 zeigen an, dass die Chimäre SAH-Gly4-G.CSF (Spur 3) ausgesprochen gut durch die Hefe Kluyveromyces sekretiert wird, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass die Anwesenheit des Linkerpeptids zwischen dem SAH-Teil und dem G-CSF-Teil günstiger für ein unabhängiges Falten dieser beiden Teile während des Übergangs der Chimäre auf dem sekretorischen Pfad ist. Weiterhin wird die N-terminate Fusion (G.CSF-Gly4-SAH) ebenfalls durch die Hefe Kluyveromyces sekretiert (13 , Spur 1). - E.9.3. Reinigung und molekulare Charakterisierung der Chimären von SAH und G-CSF
- Nach der Zentrifugation einer Kultur des CBS 293.91-Stamms, der mit den Expressionsplasmiden gemäß Beispiel E.9.1. transformiert ist, wird der Kulturüberstand durch ein 0,22 mm Filter (Millipore) hindurchgeführt und dann durch Ultrafiltration (Amicon) unter Verwendung einer Membran, deren Ausschlussgrenzwert bei 30 kDa liegt, konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wird dann ausgehend von einer 1 M-Stammlösung von Tris-HCl (pH 6) auf 50 mM Tris-HCl eingestellt und dann in 20 ml Fraktionen auf eine Ionenaustauschsäule (5 ml) (Q Fast Flow, Pharmacia) geladen, die in demselben Puffer euquilibriert worden ist. Das chimäre Protein wird dann mit einem NaCl-Gradienden (0 bis 1 M) von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die das chimäre Protein enthalten, werden dann zusammengefasst und gegen eine 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 6) dialysiert und dann erneut auf eine Q Fast Flow Säule (1 ml) geladen, die in demselben Puffer eingestellt worden ist. Nach Elution von der Säule werden die das Protein enthaltenden Fraktionen zusammengefasst, gegen Wasser dialysiert und vor der Charakterisierung gefriergetrocknet: Z. B. ergibt das Sequenzieren (Applied Biosystem) des Protein SAH-G.CSF, das von der Hefe CBS293.91 sekretiert wird, die N-terminale Sequenz, die für SAH erwartet wird (Asp-Ala-His ...), was auf eine korrekte Reifung der Chimäre unmittelbar an dem C-Terminus des Dobletts der Reste Arg-Arg der "Pro"-Region von SAH (SEQ ID No. 1) hinweist.
- BEISPIEL 10: CHIMÄREN DIE VON EINEM IMMUNGLUBOLIN ERHALTEN WERDEN
- E.10.1. Konstruktionen
- Ein Fv'-Fragment kann durch gentechnische Techniken konstruiert werden, welches die variablen Fragmente der schweren und leichten Ketten eines Immunglubolins (Ig) codiert, die miteinander durch ein Linkerpeptid verbunden sind [Bird et al., Science (1988) 242: 423; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879]. Schematisch werden die variablen Regionen (ungefähr 120 Reste) der schweren und leichten Ketten für ein gegebenes Ig von der Messenger-RNA des entsprechenden Hybridoms geklont z. B. unter Verwendung des RT-PCR-Kits, das von Pharmacia vertrieben wird (Maus-ScFv-Modul). In einer zweiten Stufe werden die variablen Regionen gentechnisch über ein synthetisches Linkerpeptid gekoppelt, beispielsweise durch den Linker (GGGS)x3. Ein MstII-HindIII-Restriktionsfragment, das das Fv'-Fragment eines Immunglubolins enthält, das von einem Maushybridom sekretiert wird, ist in SEQ ID No. 6 angegeben. Die Ligatur des HindIII-MstII-Fragments des Plasmids pYG404 mit diesem MstII-HindIII-Fragments macht es möglich, das HindIII-Fragment des Plasmids pYG1382 zu erzeugen, welches ein chimäres Protein codiert, in dem das SAH-Molekül genetisch an das Fv'-Fragment der SEQ ID No. 6 gekoppelt ist (Chimäre SAH-Fv'). Das Klonen des HindIII-Restriktionsfragments des Plasmids pYG1382 in der produktiven Orientierung in den HindIII-Platz des Plasmids pYG105 (LAC4) und pYG106 (PGK) erzeugt die Expressionsplasmide pYG1383 bzw. pYG1384.
- E.10.2. Sekretion der Hybride
- Nach der Selektion auf Nährmedium, dem G408 hinzugesetzt war, werden die rekombinanten Klone auf ihre Fähigkeit getestet, die reife Form des chimären Proteins SAH-Fv' zu sekretieren. Einige Klone, die dem Stamm K. lactis CBS 293.91 entsprechen, der mit den Plasmiden pYG1383 oder pYG1384 (SAH-Fv') transformiert war, werden in selektivem flüssigen Komplettmedium bei 28°C inkubiert. Die Zellüberstände werden dann nach Elektrophorese auf einem 8,5% Akrylamidgel getestet, entweder direkt durch Färben des Gels mit Coomassie-Blau oder nach Immunmarkieren unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenserums, das gegen Humanalbumin gerichtet ist, als primärer Antikörper oder direkt inkubiert mit biotinilierten Anitkörpern, die gegen Immungluboline von murinem Ursprung gerichtet sind. Die Resultate gemäß
15 zeigen, dass das Hybridprotein SRA-Fv' sowohl durch Antikörper erkannt wird, die gegen humanes Albumin gerichtet sind (Tafel C) als auch mit biotinilierten Ziegenantikörpern reagiert, die immunologisch reaktiv gegenüber Mausimmunglubolinen sind (Tafel B). - BEISPIEL 11: BIOLOGISCHE AKTIVITÄT DER CHIMÄREN
- E.11.1. Biologische Aktivität in vitro
- E.11.1.1. Chimären von SAH und vWF
- Die antagonistische Aktivität der Produkte wird durch Messen der dosisabhängigen Inhibierung der Agglutinierung von humanen Blutplättchen, die mit Paraformaldehyd fixiert waren, gemäß dem Verfahren bestimmt, das durch Prior et al. [Bio/Technology (1992) 10: 66] beschrieben wurde. Die Messungen werden in einem Aggregameter (PAP-4, Bio Data Horsham, PA, USA) durchgeführt, das die Änderungen der optischen Transmission über der Zeit unter Rühren bei 37°C in der Anwesentheit von vWF, von Botrozytin (8,2 mg/ml) und von dem Testprodukt in verschiedenen Verdünnungen (Konzentrationen) aufzeichnet. Für jede Messung werden 400 ml (8 × 107 Blutplättchen) einer Suspension von humanen Blutplättchen, die mit Paraformaldehyd (0,5%) stabilisiert und dann in [NaCl (137 mM); MgCl2 (1 mM); NaH2PO4 (0,36 mM); NaHCO3 (10 mM); KCl (2,7 mM); Glukose (5,6 mM); SAH (3,5 mg/ml); HEPES-Puffer (10 mM, pH 7,35)] resuspendiert wurden, bei 37°C in dem zylindrischen Tank (8,75 × 50 mm, Wellcome Distriwell, 159 rue Nationale, Paris) des Aggregameters für 4 min. vorinkubiert und dann mit 30 ml der Lösung des Testprodukts bei verschiedenen Verdünnungen in einem nichtpyrogenen Formulierungsvehikel []mannitol (50 g/l); Zitronensäure (192 mg/l); L-Lysinmonohydrochlorid (182,6 mg/l); NaCl (88 mg/l); pH eingestellt auf 3,5 durch Zugabe von NaOH (1 N)] oder nur des Formulierungsvehikels (Kontrolle) versetzt. Die resultierende Suspension wird dann für eine Minute bei 37°C inkubiert, und 12,5 ml humanes vWF [American Bioproducts, Parsippany, NJ, USA; 11% von Willibrand-Aktivität gemessen gemäß den Empfehlungen für die Verwendung des PAP-4 (Platelet Aggregation Profiler®) mit Hilfe von mit Formaldehyd fixierten Blutplättchen (2 × 105 Plättchen/Milliliter), von humanem Plasma, das zu 0 bis 100% vWF enthält, und von Ristozetin (10 mg/ml), s. Seiten 36 bis 45: vW ProgramTM] werden zugegeben und bei 37°C für eine Minute inkubiert, bevor 12,5 ml der Botrozetinlösung [von gefriergetrocknetem Tiergift von Bothroos jararaca (Sigma) gemäß der Prozedur aufgereinigt, die von Sugimoto et al. Biochemistry (1991) 266: 18172 beschrieben wurde] zugegeben werden. Das Aufzeichnen der Messwerte der Transmission als Funktion der Zeit wird dann für zwei Minuten unter Rühren mittels eines magnetischen Balkens (Wellcome Distriwell), der in dem Tank angeordnet ist und der mit einem magnetischen Antrieb von 1.100 Umdrehungen pro Minute versehen ist, der von dem Aggregameter bereitgestellt wird, durchgeführt. Die mittlere Änderung der optischen Transmission (n35 für jede Lösung) über der Zeit ist deshalb eine Messung der Blutplättchenagglutinierung aufgrund der Anwesenheit von vWF und Botrozitin in der Abwesenheit oder in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des Testprodukts. Von solchen Aufzeichnungen wird dann die prozentuale Inhibierung der Blutplättchenagglutinierung aufgrund jeder Konzentration des Produkts bestimmt, und man trägt die Gerade, die die prozentuale Inhibierung als Funktion des Kehrwerts der Produktverdünnung angibt, in einem doppeltlogarithmischen Maßstab auf. Die IC50 (d. h. die Konzentration des Produkts, die 50 Inhibierung der Agglutination verursacht) wird dann anhand dieser Geraden bestimmt. Die Tabelle gemäß
6 vergleicht die IC50-Werte einiger der SAH-vWF-Chimären der vorliegenden Erfindung und zeigt, dass einige von ihnen bessere Antagonisten der Blutplättchenagglutinierung sind als das Produkt RG12986, das von Prior et al. beschrieben wird [Bio/Technology (1992) 10: 66] und das in den Tests als Standardwert berücksichtigt wird. Identische Tests für die Inhibierung der Agglutination von humanen Blutplättchen in der Anwesenheit von vWF von Schweineplasma (Sigma) machen es weiterhin möglich zu zeigen, dass einige der Hybride der vorliegenden Erfindung und insbesondere einige Typ IIB-Varianten sehr gute Antagonisten der Blutplättchenagglutinierung in der Abwesenheit von Cofaktoren des Botrozetin-Typs sind. Der Botrozetin-unabhängige Antagonismus dieser spezifischen Chimären kann auch gemäß der Prozedur gezeigt werden, die ursprünglich von Ware et al. beschrieben wurde [Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88: 2946], indem der monoklonale Antikörper125 I-LJ-IB1 (10 mg/ml), ein konkurrierender Inhibitor für die Bindung von vWF an die Blutplättchen-GPIb (Handa M. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 12579) nach 30 min. Inkubation bei 22°C in der Anwesenheit von frischen Blutplättchen (108 Blutplättchen/ml) verdrängt wird. - E.11.1.2. Chimären von SAH und G-CSF
- Die gereinigten Chimären werden auf ihre Fähigkeit getestet, die in vitro-Proliferation der IL3-abhängigen Mauslinie NFS60 zu erlauben, indem der Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin im Wesentlichen gemäß der Prozedur, die von Tsuchija et al. beschrieben wurde [Proc. Natl. Acad. Sci (1986) 83 7633], gemessen wird. Für jede Chimäre werden die Messungen zwischen 3 und 6 Mal in einem drei Punkte Test (drei Verdünnungen des Produkts) in einer Zone durchgeführt, in der die Beziehung zwischen der Menge des aktiven Produkts und dem Einbau von markiertem Thymidin (Amersham) linear ist. In jeder Mikrotiter-Platte wird auch die Aktivität eines Referenzprodukts, das aus rekombinantem humanem G-CSF besteht, welches in Säugetierzellen expressiviert wurde, systematisch eingebaut. Die Resultate gemäß
17 zeigen, dass die Chimäre SAH-G.CSF (pYG1266), die von der Hefe Kluyveromyces sekretiert und gemäß dem Beispiel E.9.3. gereinigt wurde, in der Lage ist, in vitro ein Signal für die Zellproliferation der Linie NFS60 zu vermitteln. In diesem besonderen Fall war die spezifische Aktivität (min–1/Molarität) der Chimäre ungefähr siebenmal niedriger als diejenige der G-CSF-Referenz (ungekoppelt). - E.11.2. Biologische Aktivität in vivo
- Die Aktivität der Stimulation der SAH/G-CSF-Chimären auf Granulozytenbildung in vivo wird nach subkutaner Injektion in Ratten (Sprague-Dawley/CD, 250–300 g, 8–9 Wochen) getestet und mit dem der G-CSF-Referenz verglichen, die unter Verwendung von Säugetierzellen expressiviert wurde. Jedes Produkt, das mit einer Rate von sieben Tieren getestet wird, wird subkutan in die Rücken-Schulter-Region in einer Rate von 100 ml für sieben aufeinander folgende Tage injiziert, (D1–D7). 500 ml Blut werden an den Tagen D-6, D2 (vor der zweiten Injektion); D5 (vor der fünften Injektion) und D8 gesammelt, und eine Blutzählung wird durchgeführt. Bei diesem Test ist die spezifische Aktivität (Einheiten der Leukozytenbildung/Mol injiziert) der Chimäre SAH-G.CSF (pYG1266) identisch mit derjenigen der G-CSF-Referenz (
18 ). Da diese konkrete Chimäre in vitro eine spezifische Aktivität siebenmal niedriger als diejenige der G-CSF-Referenz aufweist (17 ), ist damit gezeigt, dass die genetische Kopplung des G-CSF an SAH in vorteilhafter Weise die pharmakokinetischen Eigenschaften modifiziert.
Claims (22)
- Rekombinantes Polypeptid mit einem von einem Polypetid mit therapeutischer Aktivität erhaltenen aktiven Teil, der an ein Albumin oder eine Albuminvariante genetisch gekoppelt ist, wobei die Albuminvariante eine große Plasma-Halbwertszeit konserviert, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit therapeutischer Aktivität ausgewählt ist aus Hormonen, Interferonen, Interleukinen, Erythropoitin, G-CSF und Insulin.
- Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit therapeutischer Aktivität ein Polypeptid menschlichen Ursprungs ist.
- Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil eine Struktur aufweist, die ausgewählt ist aus (a) einer vollständigen Peptidstruktur oder (b) einem Fragment von (a) oder einer durch strukturelle Modifikation (Mutation, Substitution und/oder Löschung von einem oder mehreren Rest(en)) und Konservierung der therapeutischen Aktivität von (a) erhaltenen Struktur.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin oder die Albuminvariante eine Struktur aufweist, die ausgewählt ist von (a) reifem Albumin, (b) Albumin; und (c) einer von (a) oder (b) durch strukturelle Modifikation (Mutation, Substitution, Addition und/oder Löschung von einem oder mehreren Reten) und Konservierung der hohen Plasma-Halbwertszeit erhaltenen Struktur.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein N-terminales Methionin aufweist.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Linkerpeptid aufweist.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Sekretionssignal aufweist.
- Polypeptid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Sekretionssignal das natürliche Sekretionssignal des biologisch aktiven Polypeptids ist.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil an den N-Terminus des Albumins gekoppelt ist.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil an den C-Terminus des Albumins gekoppelt ist.
- Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Teil mehrere Male vorhanden ist.
- Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
- Nukleotidsequenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist, die eine "Führer"-Sequenz kodiert, welche die Sekretion des expressivierten Polypeptids ermöglicht.
- Expressionskassette, welche eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 12 und 13 aufweist unter der Kontrolle eines Transkriptionsinitiierungsbereichs und optional eines Transkriptionsbeendigungsbereiches.
- Selbstreplizierendes Plasmid, welches eine Expressionskassette nach Anspruch 14 aufweist.
- Rekombinante eukaryotische oder prokaryotische Zelle, in welche eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 12 oder 13 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 14 oder ein Plasmid nach Anspruch 15 eingesetzt ist.
- Rekombinante Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hefezelle, eine Tierzelle, eine Pilzzelle oder eine bakterielle Zelle handelt.
- Rekombinante Zelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hefezelle handelt.
- Rekombinante Zelle nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Zelle der Art Saccharomyces oder Kluyveromyces handelt.
- Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 16 bis 19 unter Expressionsbedingungen kultiviert wird und dass das Polypeptidprodukt geborgen wird.
- Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem oder mehreren Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder hergestellt durch ein Verfahren nach Anspruch 20.
- Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14, welche in der Gentherapie einsetzbar ist.
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