DE69333886T2

DE69333886T2 - Adenovirus-gelenkter Gen-Transfer zum Herz-und glattem vaskulären Muskel

Info

Publication number: DE69333886T2
Application number: DE69333886T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey M. Chicago Leiden; Eliav St. Davids Barr
Original assignee: Arch Development Corp
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1992-11-18
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2013-11-17
Also published as: WO1994011506A1; JP2003102474A; AU694097B2; EP0957172B1; EP0957172A3; EP0668913A1; US6436907B1; DE69331526D1; DE69331526T2; EP1321526A3; JP2006212034A; EP0957172A2; DE69333886D1; JP2004313198A; EP1321526A2; AU5609394A; EP0668913B1; CA2149771A1; JPH08506008A; ATE212665T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung der Gentranskription und der Genproduktexpression im Herzen und im Muskel. Genauer betrifft ein Verfahren der vorliegenden Erfindung die Adenovirusvektor-vermittelte Zuführung von Genen, die einen angiogenen Faktor für Herzmuskeln kodieren.
Hintergrund der Erfindung
Somatische Gentherapie kann definiert werden als die Fähigkeit, die Expression von fremden Genen in nicht-Keimlinien (d.h. nicht Keim und Ei) -Zellen eines Tieres zu programmieren. Verfahren der somatischen Gentherapie können unterteilt werden in zwei Kategorien. Die Ex-vivo-Gentherapie, einschließlich der Entfernung von Zellen von einem Wirtsorganismus, der Transfektion eines fremden Gens in diese Zellen, und der Reimplantation oder Transplantation der transformierten oder transgenen Zellen zurück in einen Empfängerwirt. Im Gegensatz dazu schließt die In-vivo-Gentherapie die Transfektion eines fremden Gens direkt in Zellen eines Empfängerwirts ein, ohne die Notwendigkeit der vorherigen Entfernung dieser Zellen von dem Wirt.
Die Nützlichkeit der somatischen Gentherapie für menschliche Patienten hängt ab von einer Anzahl von Faktoren. Zunächst muß das Transfektionsverfahren effizient sein. Als zweites sollte die Expression des fremden Gens auf spezifische Zielgewebe örtlich begrenzt sein. Drittens sollte ein gegebenes Transfektionsverfahren mit einem minimalen Risiko die Wirtszellen zu mutieren und eine persistierende Infektion des Wirtsorganismus zu bewirken verbunden sein.
Verschiedene mögliche Strategien, um Gene in Gewebe des Körpers einzuführen, wurden in der Vergangenheit verwendet (Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rosenfeld et al., 1992; Wolfe et al., 1992). Verfahren, um fremde Gene in Zellen einzuführen schließen die direkte Transfektion (Davis et al., 1986) und den retroviralen Gentransfer (Dichek et al., 1991; Wilson et al., 1988a; Wilson et al., 1988b; Kay et al., 1992) ein. In einigen Fällen wurden genetisch veränderte Zellen wieder in Tiere eingeführt (Dichek et al., 1991; Roy Chowdhury et al., 1991), wo ihre fortgesetzte Funktion für variable Zeiträume überwacht wurden.
In jüngster Zeit wurde Adenovirus-vermittelter Gentransfer als ein Mittel der somatischen Gentherapie in eukaryotische Zellen und in ganze Tiere untersucht (van Doren et al., 1984a; van doren et al., 1984b; Ghosh-Choudhury und Graham, 1987; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992). Ein Problem mit Adenovirus-vermitteltem Gentransfer ist der niedrige Spiegel an Genproduktexpression in Zielzellen und daraus folgend ein Fehlen eines funktionellen Effekts.
Obwohl Adenovirus-vermittelter Gentransfer verwendet wurde, um einen Ornithintranscarbamylase (OTC)-Mangel in neugeborenen Mäusen zu behandeln, war die Expression des Ornithintranscarbamylaseenzyms in den Virus-infizierten Mäusen typischerweise bei oder unterhalb der Expressionsspiegel in normalen Mäusen, mit dem Ergebnis, daß der Defekt nur teilweise korrigiert wurde (Stratford-Perricaudet et al., 1990). Auf der Basis von solchen Daten würde man nicht erwarten, daß Adenovirus-vermittelter Gentransfer geeignet wäre für die Behandlung einer Erkrankung, die eine Überexpression eines Genprodukts erfordert.
Adenovirus-vermittelter Transfer des Gens für den cystischen Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) in das Lungenepithel von Baumwollratten wurde versucht, obwohl es nicht möglich war, die biologische Aktivität des überführten Gens zu beurteilen, da es keinen physiologischen Effekt des Gentransfers gab, außer der Expression des CFTR-Proteins in Lungenatemwegszellen (Rosenfeld et al., 1992). Weiter war die Lungenexpression von α1-Antitrypsinprotein nicht mit einem physiologischen Effekt assoziiert (Rosenfeld et al., 1991). Zusammengenommen zeigen diese Daten nicht, daß Adenovirus Gene in Zellen überführen kann und die Expression von ausreichend Protein steuern kann, um einen physiologisch relevanten Effekt zu erzielen.
Die Anwendung der somatischen Gentherapie auf Herzgewebe kann in der Behandlung einer Anzahl von geerbten und erworbenen Herzerkrankungen verwendet werden, wie zum Beispiel genetischen Störungen der Myokardzellen. Als Beispiel kann die Injektion der normalen Dystrophin cDNA verwendet werden, um die Defekte in der Herzkontraktilität, die in Patienten mit Duchenne's Muskeldystrophie beobachtet werden, zu korrigieren. Als ein weiteres Beispiel kann die Injektion direkt in die linke ventrikuläre Wand von Plasmiden, die rekombinante Angiogenesefaktoren kodieren, verwendet werden, um neue kollaterale Zirkulation in Gebieten von chronisch ischaemischem Myokard zu stimulieren. Somatische Gentherapie kann auch verwendet werden, um direkt die molekularen Mechanismen zu studieren, die die Herzmyocytengenexpression regulieren sowohl während der Herzmyogenese als auch in einer Vielzahl von pathophysiologischen Stadien, wie zum Beispiel Herzhypertrophie.
Nicht weniger als 1,5 Millionen Patienten pro Jahr in den U.S. erleiden einen Myokardinfarkt (MI). Viele Millionen mehr leiden an den Syndromen von chronischer Myokardischaemie aufgrund großer und kleiner Gefäß Koronar-Artherosklerose. Viele dieser Patienten werden einen Nutzen ziehen aus der Fähigkeit, kollaterale Gefäßbildung in Gebieten von ischaemischen Myokard zu stimulieren. Adenovirusmediator-Gentransferverfahren stellen einen alternativen Versuch dar zu den derzeitigen Verfahren von Koronararterienbypass und perkutaner transluminaler Koronarangioplastik. Insbesondere haben viele Patienten eine solch starke und diffuse Atherosklerose, daß sie für CABG oder PTCA nicht in Frage kommen. So weit gibt es keine Annäherung, welche erfolgreich die kollaterale Gefäßbildung in Gebieten von ischaemischen Myokard stimuliert hat.
Vorhergehende Annäherungen haben alle in vitro Transfektionsprotokolle in neonatale Kardiozyten oder transgene Versuche in Mäusen verwendet. Solche Studien werden verkompliziert durch die Tatsache, daß neonatale Kardiozyten nicht die in vivo Situation widerspiegeln können, und durch die Tatsache, daß neonatale Kardiozyten eine extrem eingeschränkte Lebensdauer in Gewebekultur haben und nicht in das Herz eingelagert werden können.
Desweiteren sind transgene Versuche langwierig (erfordern 6 Monate bis 1 Jahr), technisch schwierig und teuer. Der Gentransferweg der vorliegenden Erfindung stellt eine Lösung für diese Probleme bereit und liefert die stabile Expression von rekombinanten angiogenen Faktoren in Herzmyozyten in vivo.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Adenovirusvektors, der eine kodierende Sequenz umfaßt, die einen angiogenen Faktor kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Herzerkrankung durch Stimulierung der Kollateralblutgefäßbildung im Herzen oder im Myokard, worin das Medikament für die Infusion in ein Blutgefäß ist, das das Herz oder einen Koronarsinus durchströmt, oder für die Injektion in das Myokard. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kollateralblutgefäßbildung in ischaemischem Myokard stimuliert. Die Expression eines angiogenen Faktors in eine Herzmuskelzelle wird durch ein Verfahren geregelt, das die folgenden Schritte umfaßt:

a) Infundieren eines Adenovirus in ein Blutgefäß, das das Herz oder einen Koronarsinus durchströmt, oder Injizieren eines solchen Adenovirusvektors in das Myokard, um der Muskelzelle ein Adenovirusvektorkonstrukt zuzuführen, das eine kodierende Sequenz umfaßt, die einen angiogenen Faktor kodiert, wobei der Vektor die Expression des angiogenen Faktors in die Muskelzelle antreibt; und
b) Aufrechterhalten der Muskelzelle unter physiologischen Bedingungen, die ausreichend sind, daß der angiogene Faktor in der Muskelzelle exprimiert wird.

Ein Adenovirus, der in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist Replikations-defekt. Vorzugsweise fehlt einem Replikations-defekten Adenovirus die frühe Genregion E1 oder die frühen Genregionen E1 und E3. Ein bevorzugter Adenovirus ist ein Typ 5 Adenovirus und eine kodierende Sequenz ist vorzugsweise umgeben von Adenovirus Typ 5 Sequenzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine kodierende Sequenz operativ geknüpft an einen Enhancer-Promoter, der kein Adenovirus-Enhancer-Promoter ist. Ein bevorzugter Enhancer-Promoter ist ein CMV-Promoter, ein SV40 früher Promoter, ein RSV-Promoter oder ein MCK-Enhancer. Bevorzugter ist ein Enhancer-Promoter ein Herzmuskel spezifischer Enhancer-Promoter. Ein bevorzugter Herzmuskel spezifischer Enhancer-Promoter ist ein cTNC-Promoter.
Eine kodierende Sequenz ist operativ an eine Transkriptions-beendende Region geknüpft. Eine bevorzugte Transkriptions-beendende Region umfaßt ein SV40 oder Protamin-Gen Polyadenylierungssignal. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine kodierende Sequenz ein cDNA Insert.
Ein bevorzugter angiogener Faktor ist ein Wachstumsfaktor. Ein bevorzugter solcher Wachstumsfaktor ist FGF-5, saures FGF, basisches FGF oder PDGF.
Die Zuführung ist vorzugsweise die Injektion eines Adenovirusvektorkonstrukts direkt in eine Herzmuskelzelle in dem Myokard. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zuführung Infundieren eines Adenovirusvektors in ein Blutgefäß, das das Herz durchströmt.
Ein Adenovirusvektorkonstrukt wird typischerweise als eine pharmazeutische Zusammensetzung zugeführt. Eine solche Zusammensetzung umfaßt einen physiologisch verträglichen Träger und eine wirksame Expressions-induzierende Menge eines Adenovirusvektorkonstrukts.
Wie hierin offenbart, umfaßt ein Verfahren zur Herstellung eines Adenovirusvektorkonstrukts zur Verwendung in der Transfizierung einer Herzmuskelzelle die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines Adenovirus; und
b) Einschließen einer kodierenden Sequenz in diesen Adenovirus, die einen angiogenen Faktor kodiert, der für die Einführung in eine Herzmuskelzelle erwünscht ist.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Die Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf einen oder mehrere Mängel im Stand der Technik. Ein Adenovirusvektorkonstrukt wird verwendet, um ein Gen, das einen angiogenen Faktor kodiert, Herzmuskelzellen zuzuführen, und somit die Expression dieses angiogenen Faktors zu beeinflussen. Die Expression des angiogenen Faktors verändert dabei die Funktion dieser Zellen und erzielt einen physiologisch wünschenswerten Effekt.
Die Expression einer Herzmuskelzelle kann in dieser Art und Weise geregelt werden, egal ob diese Zelle in situ oder in vivo in einem lebenden Organismus ist.
A. Verfahren zur Regulierung der Genproduktexpression in Herzmuskelzellen
In einem Aspekt wird hierdurch ein Verfahren zur Regulierung der Genproduktexpression in einer Muskelzelle des Herzen (d.h. einer Herzmuskelzelle oder eines Herzmyocyten) offenbart. Gemäß diesem Verfahren wird ein Adenovirusvektorkonstrukt, das eine kodierende Sequenz umfaßt, die das Genprodukt kodiert, welches ein angiogener Faktor ist, an eine Herzmuskelzelle zugeführt. Die Herzmuskelzelle wird dann unter physiologischen Bedingungen und für einen Zeitraum gehalten, der ausreichend ist, daß das Gen die Herzmuskelzelle durchdringen kann, daß das Gen transkribiert wird und daß das Produkt dieses Gens exprimiert wird.
1. Adenovirusvektor
Die Verwendung von Adenovirus als ein Vektor für die Zelltransfektion ist im Fachgebiet wohl bekannt. Adenovirusvektor-vermittelte Zelltransfektion wurde für verschiedene Zellen berichtet (Stratford-Perricaudet, et al., 1992).
Ein Adenovirusvektor, der in dem hierin offenbarten Verfahren verwendet wird, ist Replikations-defekt.
Ein Virus wird Replikations-defekt gemacht durch Deletion der viralen frühen Genregion 1 (E1). Ein Adenovirus, dem eine E1 Region fehlt, kann nur in Zellen replizieren, wie zum Beispiel menschlichen 293 Zellen, welche Adenovirus frühe Genregion 1 Gene aus ihrem zellulären Genom exprimieren. Somit kann ein solcher Adenovirus keine Zellen töten, die nicht das frühe Genprodukt exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform fehlt einem Adenovirusvektor, der in dem Verfahren verwendet wird, sowohl die E1 als auch die E3 frühe Genregion. Techniken zur Herstellung von Replikations-defekten Adenoviren sind im Fachgebiet wohl bekannt (Siehe z.B., McGrory et al., 1988, und Gluzman et al., 1982).
Es wird geglaubt, daß jeder Adenovirusvektor in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Somit kann ein Adenovirusvektor aus irgendwelchen der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder Subgruppen A–F bestehen. Adenovirus Typ 5 der Subgruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Replikations-defekten Adenovirusvektors.
Ein Adenovirus wird bearbeitet, um eine kodierende DNA Sequenz zur Verwendung als ein Vektor zu enthalten. Ein solcher rekombinanter Adenovirus wurde durch Gluzman et al., 1982, beschrieben. Einzelne DNA Sequenzen wie zum Beispiel cDNAs, welche ein Genprodukt kodieren, werden in den Adenovirus eingefügt, um ein Vektorkonstrukt zu bilden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird deshalb eine kodierende Sequenz für ein Genprodukt in einen Adenovirus eingeführt oder eingeschlossen an der Stelle, von welcher die E1 kodierenden Sequenzen entfernt wurden. Jedoch ist die Position der Einfügung innerhalb der Adenovirussequenzen nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Eine kodierende Sequenz kann auch anstelle der deletierten E3 Region in E3 Ersetzungsvektoren eingefügt werden, wie zuvor beschrieben durch Karlsson et al. (1986). Vorzugsweise wird die E1 Region eines Adenovirus ersetzt durch die kodierende DNA Sequenz oder das Gen.
Der resultierende Adenovirusvektor wird kotransfiziert in 293 Zellen zusammen mit einem Plasmid, das ein komplettes Adenovirusgenom trägt, um den Adenovirus zu vermehren. Ein beispielhaftes solches Plasmid ist pJM17. Die Kotransfektion wird durchgeführt gemäß Standardverfahren, die im Fachgebiet wohl bekannt sind. Als ein Beispiel werden 293 Zellen in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium kultiviert, das fötales Kälberserum enthält. Zusammenfließende Kulturen werden am Tag vor der Kalziumphosphatkotransfektion der Plasmide zerteilt. Nach der Zugabe der DNA zu den Zellen werden die Zellen erschüttert (z.B., ein 15% Glycerolschock), um die Transfektionseffizienz zu steigern, und die Zellen werden mit Agar in DMEM, das fötales Kälberserum, Penizilin, Streptomycisulfat und andere Antibiotika oder antifungale Wirkstoffe wie benötigt enthält, überschichtet. Monoschichten werden inkubiert bis virale Plaques erscheinen (ungefähr 5–15 Tage).
Diese Plaques werden ausgelesen, in Medium suspendiert, das fötales Kälberserum enthielt, und verwendet um eine neue Monoschicht von 293 Zellen zu infizieren. Wenn mehr als 90% der Zellen eine Infektion zeigten, wurden virale Lysate einem Frier-/Tauzyklus unterworfen und als primäre Stocks bezeichnet. Die Anwesenheit von rekombinantem Virus wird bestätigt durch Zubereitung von viraler DNA aus infizierten 293 Zellen, Restriktionsanalyse und Southern Blotting. Sekundäre Stocks werden danach erzeugt durch Infizieren von 293 Zellen mit primärem Virusstock bei einer Menge von Infektion von 0,01 und Inkubation bis zur Lyse.
Die spezielle verwendete Zell-Linie, um die rekombinanten Adenoviren zu vermehren, ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Rekombinante Adenovirusvektoren können vermehrt werden auf z.B., menschlichen 293 Zellen, oder in anderen Zell-Linien, die die bedingungsgemäße replikationsdefekte Adenovirusinfektion zulassen, z.B., denjenigen, welche Adenovirus E1 Genprodukte "in trans" exprimieren, um den Defekt in einem bedingungsgemäßen replikationsdefekten Vektor zu vervollständigen. Desweiteren können die Zellen entweder auf Plastikscheiben oder in Suspensionskultur vermehrt werden, um Virusstocks davon zu erhalten.
2. Kodierende Sequenz
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "Polypeptid" ein Polymer von Aminosäuren, die durch Amidbindungen verbunden sind, worin die Anzahl der Aminosäurereste im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr einer Million liegen kann. Vorzugsweise hat ein Polypeptid von ungefähr 10 bis ungefähr 1000 Aminosäurereste und, noch bevorzugter von ungefähr 20 bis ungefähr 500 Aminoreste. Somit schließt, wie hierin verwendet, ein Polypeptid ein was oft im Fachgebiet als ein Oligopeptid bezeichnet wird (5–10 Aminosäurereste), ein Polypeptid (11–100 Aminosäurereste) und ein Protein (> 100 Aminosäurereste).
Ein Polypeptid, das durch eine kodierende Sequenz kodiert wird, kann eine posttranslationale Modifikation erfahren, um Konjugate zu bilden mit Kohlenhydraten, Lipiden, Nukleinsäuren und dergleichen, um Glycopolypeptide (z.B. Glycoproteine), Lipopolypeptide (z.B. Lipoproteine) und andere ähnliche Konjugate zu bilden.
Ein Polypeptid, das durch eine kodierende Sequenz eines Adenovirus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kodiert wird, ist ein angiogener Faktor. Eine kodierende Sequenz kann Introns und Exons umfassen, so lange wie die kodierende Sequenz mindestens einen offenen Leserahmen für die Transkription, Translation und Expression dieses Polypeptids umfaßt. Somit kann eine kodierende Sequenz ein Gen, ein zerteiltes Gen oder ein cDNA Molekül umfassen. In dem Fall, daß die kodierende Sequenz ein zerteiltes Gen umfaßt (enthält ein oder mehrere Introns) muß eine Zelle, die mit einem DNA Molekül, das das zerteilte Gen enthält, transformiert oder transfiziert wurde, ein Mittel zum Entfernen dieser Introns und zum Zusammensplicen der Exons in das RNA Transkript von dem DNA Molekül haben, wenn die Expression dieses Genprodukts gewünscht ist.
Ein Polypeptid, das durch eine kodierende Sequenz eines Adenovirusvektorkonstrukts, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, kodiert wird, verändert die Funktion einer Herz- oder glatten Gefäßmuskelzelle, die dem Polypeptid ausgesetzt ist. Beispielhafte und bevorzugte Polypeptide sind Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel ein endothelialer Wachstumsfaktor oder ein glatter Gefäßmuskelwachstumsfaktor; oder ein Wachstumsfaktorrezeptor.
Ein bevorzugter Wachstumsfaktor ist ein Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) wie zum Beispiel FGF-5, saures FGF und basisches FGF; oder ein Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (platelet derived growth factor, PDGF).
Ein bevorzugter Rezeptor ist der mutante PDGF Rezeptor (Siehe z.B., Fantl et al., 1989; Coughlin et al., 1990 und Escobedo et al., 1988) oder ein mutanter FGF Rezeptor (Siehe z.B., Peters et al., 1991; Mohammadi et al., 1992; Amaya et al, 1991 und Bellot et al, 1991).
3. Enhancer-Promoter
Eine kodierende Sequenz eines Adenovirusvektorkonstrukts ist vorzugsweise operativ verknüpft mit einem Enhancer-Promoter, der kein Adenovirus Enhancer-Promoter ist. Ein Promoter ist eine Region eines DNA Moleküls, typischerweise innerhalb ungefähr 100 Nukleotidpaaren vor (stromaufwärts von) dem Punkt, bei welchem die Transkription beginnt (d.h., einer Transkriptionsstartstelle). Diese Region enthält typischerweise verschiedene Typen von DNA Sequenzelementen, welche in ähnlichen relativen Positionen in unterschiedlichen Genen angeordnet sind. Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "Promoter" das ein, was im Fachgebiet als eine stromaufwärts Promoterregion bezeichnet wird, eine Promoterregion oder einen Promoter einer generalisierten eukaryotischen RNA Polymerase II Transkriptionseinheit.
Ein anderer Typ eines einzelnen Transkriptionsregulatorischen Sequenzelements ist ein Enhancer. Ein Enhancer stellt Spezifität in der Zeit, dem Ort und dem Expressionsspiegel für eine spezielle kodierende Region (z.B. einem Gen) bereit. Eine Hauptfunktion eines Enhancers ist es, den Spiegel der Transkription einer kodierenden Sequenz in einer Zelle zu erhöhen, die einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren enthält, die an den Enhancer binden. Im Gegensatz zu einem Promoter kann ein Enhancer funktionieren, wenn er an veränderlichen Entfernungen von Transkriptionsstartstellen angeordnet ist, solange ein Promoter anwesend ist.
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "Enhancer-Promoter" eine zusammengesetzte Einheit, die sowohl Enhancer- als auch Promoterelemente enthält. Ein Enhancer-Promoter ist operativ geknüpft an eine kodierende Sequenz, welche mindestens ein Genprodukt kodiert. Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "operativ verknüpft", daß ein Enhancer-Promoter an eine kodierende Sequenz in der Art gebunden ist, daß die Transkription der kodierenden Sequenz durch den Enhancer-Promoter gesteuert und reguliert wird. Mittel zur operativen Verknüpfung eines Enhancer-Promoters an eine kodierende Sequenz sind im Fachgebiet wohl bekannt. Wie es ebenfalls im Fachgebiet wohl bekannt ist, ist die genaue Orientierung und Anordnung relativ zu einer kodierenden Sequenz, deren Transkription gesteuert wird, inter alia abhängig von der spezifischen Natur des Enhancer-Promoters. Somit ist ein TATA Box minimaler Promoter typischerweise von ungefähr 25 bis ungefähr 30 Basenpaaren stromaufwärts von einer Transkriptionsinitiationsstelle angeordnet und ein Stromaufwärtspromoterelement ist typischerweise von ungefähr 100 bis ungefähr 200 Basenpaaren stromaufwärts von einer Transkriptionsinitiationsstelle angeordnet. Im Gegensatz dazu kann ein Enhancer stromabwärts von der Initiationsstelle angeordnet sein und kann in einem erheblichen Abstand von dieser Stelle liegen.
Ein Enhancer-Promoter, der in einem Vektorkonstrukt verwendet wird, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jeder Enhancer-Promoter sein, der die Expression in einer Herzmuskelzelle antreibt. In einem hiernach bekannt gemachten Beispiel wurde der menschliche Cytomegalievirus (CMV) unmittelbare frühe Genpromoter verwendet, um zu einer Hochniveau-Expression eines Gens zu führen. Jedoch ist die Verwendung von anderen viralen oder Säugetier-zellulären Promotern, welche im Fachgebiet wohl bekannt sind, auch geeignet um die Expression des Genprodukts zu erreichen, vorausgesetzt, daß die Spiegel der Expression ausreichend sind, um einen physiologischen Effekt zu erzielen. Beispielhafte und bevorzugte Enhancer-Promoter sind der CMV Promoter, der Rous Sarkoma Virus (RSV) Promoter und der Muskel-spezifische Creatinkinase (MCK) Enhancer (Zambetti et al., 1992; Yi et al., 1991 und Sternberg et al., 1988).
Durch Verwenden eines Enhancer-Promoters mit wohl bekannten Eigenschaften kann der Spiegel und das Muster der Genproduktexpression optimiert werden. Zum Beispiel erlaubt die Auswahl eines Enhancer-Promoters, der spezifisch in Herzzellen aktiv ist, die Gewebe-spezifische Expression des Genprodukts. Ein bevorzugter Herzmuskel-spezifischer Enhancer-Promoter ist ein Herz-isoformer Troponin C (cTNC) Promoter (Siehe z.B., Parmacek et al., 1992 und Parmacek et al., 1990). Desweiteren kann die Auswahl eines Enhancer-Promoters, der als Reaktion auf ein spezifisches physiologisches Signal gesteuert wird, eine induzierbare Genproduktexpression erlauben.
4. Transkriptions-beendende Region
Eine kodierende Sequenz eines Adenovirusvektorskonstrukts wird operativ an eine Transkriptions-beendende Region geknüpft. RNA Polymerase transkribiert eine kodierende DNA Sequenz durch eine Stelle, wo Polyadenylierung stattfindet. Typischerweise dienen DNA Sequenzen, die einige hundert Basenpaare stromabwärts von der Polyadenylierungsstelle lokalisiert sind, dazu die Transkription zu beenden. Solche DNA Sequenzen werden hierin als Transkriptions-beendende Regionen bezeichnet. Solche Regionen sind erforderlich für eine effiziente Polyadenylierung von transkribierter Messenger RNA (mRNA).
Transkriptions-beendende Regionen sind im Fachgebiet wohl bekannt. Eine bevorzugte Transkriptions-beendende Region, die in einem Adenovirusvektorskonstrukt der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt ein Polyadenylierungssignal von SV40 oder dem Protamingen.
5. Zuführung
Mittel, durch welche ein Adenovirusvektorskonstrukt zu einer Herzmuskelzelle zugeführt wird, hängen davon ab, ob die Herzmuskelzelle in situ oder in vivo angeordnet ist. Wo eine Herzmuskelzelle in situ angeordnet ist (z.B., in einem intakten Herzen), wird die Zuführung vorzugsweise erreicht durch (1) Durchströmen der in situ Zubereitung mit einer Lösung, die einen Adenovirusvektor enthält, oder (2) Injizieren eines solchen Vektors in einen Herzmuskel (z.B., Ventrikelwand, Vorhofwand). Gemäß einer unveröffentlichten Studie führte die Injektion eines rekombinanten DNA Moleküls in das Myokard zu der Expression des Genprodukts, das durch das Molekül kodiert wird. Ein rekombinantes bakterielles β-Galaktosidasegen unter der Kontrolle eines Rous Sarcoma Virus Promoters wurde in erwachsene Ratten-Herzmyozyten in vivo durch die Injektion von gereinigter Plasmid DNA direkt in die linke Ventrikelwand eingeführt und exprimiert. Herzmyozyten, die die rekombinante β-Galactosidaseaktivität exprimierten, wurden histochemisch für mindestens sechs Monate im Rattenherz detektiert nach der Injektion des rekombinanten β-Galactosidasegens.
Es wurde herausgefunden, daß nur Herzmuskelzellen den Vektor aufgenommen und β-Gal exprimiert hatten. Es wurde keine Expression von β-Gal in anderen Zellen in dem Herzen wie zum Beispiel Fibroblasten oder den Zellen, die die Herzblutgefäße auskleiden, beobachtet. Mehr als ungefähr 75 Prozent der Herzen, die die injizierte DNA erhielten, exprimierten das fremde Gen, und diese Expression war für Zeiträume von mindestens sechs Monaten stabil.
Als ein weiteres Beispiel war in der oben genannten unveröffentlichten Studie die direkte Injektion eines Gens für Fibroblastenwachstumsfaktor 5 (ein Angiogenesefaktorgen) assoziiert mit einem Anstieg in der Kapillarenanzahl in dem injizierten Herz. Nach der Injektion eines rekombinanten Plasmids, das FGF-5 DNA umfaßte, wurde ein 30–40 prozentiger Anstieg in der Zahl der Kapillaren in der injizierten Herzwand beobachtet verglichen mit Herzen, denen Kontroll-DNA-Lösungen injiziert worden waren. Eine mikroskopische Untersuchung brachte hervor, daß die Struktur der Kapillaren in den injizierten Herzen normal war.
Ratten wurde ein Plasmid-kodierender menschlicher Fibroblastenwachstumsfaktor 5 (hFGF-5) injiziert in einem Versuch, die Angiogenese oder den beidseitigen Blutfluß in dem erwachsenen Rattenherz zu stimulieren. Die Ratten wurden 3 Wochen nach der Injektion getötet und die kapillare Dichte wurde gemessen durch Computer-gesteutere Lichtmikroskopie. Ratten, denen Kontrollvektoren injiziert worden waren, zeigten ungefähr 2300 Kapillaren/mm² (p < 0,001). Somit stimuliert die direkte Injektion eines Fibroblastenwachstumsfaktor 5 Expressionsvektors die kollaterale Gefäßbildung in Gebieten von injiziertem Myodard.
Wo eine Herzmuskelzelle in vivo angeordnet ist, wird die Zuführung vorzugsweise durch (1) Infundieren eines Adenovirusvektors in ein Blutgefäß, das das Herz durchströmt, oder (2) Injizieren eines Adenovirusvektors direkt in einen Herzmuskel, wie zum Beispiel eine Ventrikel- oder Vorhofwand, erzielt. In einer insbesondere bevorzugten in vivo Ausführungsform wird ein Katheter in ein Blutgefäß im Nacken eines Organismus eingeführt und die Spitze des innewohnenden Katheters wird mit fluoroskopischer Führung bis zu einer Position in einer Koronararterie oder einem Koronarsinsus vorgeschoben, die einen Teil des Myokards durchströmt. Es wird bevorzugt, daß die Spitze eines innewohnenden Katheters in der Nähe zu einem Gebiet des Herzens platziert wird, welches zu transfizierende Herzzellen enthält. Somit wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein innewohnender Katheter in entweder eine externe Drosselader oder eine Halsschlagader eingeführt und der Katheter wird vorgeschoben bis die Spitze des Katheters am Eingang des Koronarsinus oder der linken Kornoararterie angeordnet ist. Als ein Beispiel exprimierten Herzmuskelzellen β-Gal, wo Herzmuskelzellen mit einem Adenovirusvektorkonstrukt transfiziert wurden, das eine kodierende Sequenz für β-Galactosidase (β-Gal) umfaßte, durch Infundieren des Vektors über einen Katheter, der in die linke Koronararterie oder den Eingang des Koronarsinus platziert war (siehe Beispiele 1 und 2 hiernach).
Nach der Zuführung eines Adenovirusvektorkonstrukts zu einer Herzmuskelzelle wird diese Zelle unter physiologischen Bedingungen und für einen Zeitraum gehalten, der ausreichend ist, daß das Adenovirusvektorkonstrukt die Herzzelle infiziert und dass eine kodierende Sequenz, die in dem Konstrukt enthalten ist, zellulär exprimiert wird.
Physiologische Bedingungen sind diejenigen, die notwendig sind für das Überleben der Herzmuskelzelle und sie schließen Bedingungen der Temperatur, des pH, der Osmolalität und dergleichen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Temperatur von ungefähr 20°C bis ungefähr 50°C, bevorzugter von ungefähr 30°C bis ungefähr 40°C und noch bevorzugter ungefähr 37°C.
Der pH ist vorzugsweise von ungefähr einem Wert von 6,0 bis zu einem Wert von ungefähr 8,0, bevorzugter von ungefähr einem Wert von ungefähr 6,8 bis zu einem Wert von ungefähr 7,8 und, am meisten bevorzugt ungefähr 7,4. Die Osmolalität ist vorzugsweise von ungefähr 200 Milliosmol pro Liter (mosm/L) bis ungefähr 400 mosm/L und, noch bevorzugter von ungefähr 290 mosm/L bis ungefähr 310 mosm/L. Andere physiologische Bedingungen, die erforderlich sind, um das Überleben der Herzmuskelzelle zu stützen, sind im Fachgebiet wohl bekannt.
Ein Zeitraum, der ausreichend ist für die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Herzzelle variiert inter alia, wie es im Fachgebiet wohl bekannt ist, abhängig vom Typ Adenovirusvektor, der verwendet wird, und vom Zuführungsverfahren. Wo der Adenovirusvektor vom Typ 5 Adenovirus abgeleitet wurde und der Virusvektor in eine Koronararterie infundiert wurde, wurde die Expression 3 bis 5 Tage nach der Infusion beobachtet. (Siehe Beispiel 2 hiernach).
Es soll auch herausgestellt werden, daß weil der verwendete Adenovirusvektor defekt ist, er nicht in der Lage ist in den Zellen zu replizieren, die letztlich infiziert werden.
Desweiteren wurde herausgefunden, daß die genomische Integrationsfrequenz von Adenovirus üblicherweise ziehmlich gering ist. Somit kann es notwendig sein, wo eine andauernde Behandlung erforderlich ist, den Virus alle 6 Monate bis ein Jahr wieder einzuführen. Unter diesen Umständen kann es deshalb notwendig sein, eine Langzeittherapie durchzuführen, wo Expressionsspiegel zu ausgewählten Intervallen beobachtet werden.
Ein Adenovirusvektorkonstrukt wird typischerweise in der Form einer pharmakologischen Zusammensetzung zugeführt, die einen physiologisch verträglichen Träger und den Adenovirusvektor umfaßt. Eine effektive Expressions-induzierende Menge eines Adenovirusvektorkonstrukts wird zugefüht. Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "effektive Expressions-induzierende Menge" die Anzahl an Virusvektorpartikeln, die notwendig ist, um die Expression eines Genprodukts zu bewirken, das durch eine kodierende Sequenz, die in dem Vektor enthalten ist, kodiert wird. Mittel zur Bestimmung einer effektiven Expressions-induzierenden Menge eines Adenovirusvektorkonstrukts sind im Fachgebiet wohl bekannt. Eine effektive Expressions-induzierende Menge ist typischerweise von ungefähr 10⁷ Plaque-bildenden Einheiten (plaque forming units, pfu) bis ungefähr 10¹⁵ pfu, vorzugsweise von ungefähr 10⁸ pfu bis ungefähr 10¹⁴ pfu, und noch bevorzugter von ungefähr 10⁹ bis ungefähr 10¹² pfu.
Wie im Fachgebiet wohl bekannt ist, hängt ein spezifischer Dosisspiegel für jeden speziellen Patienten von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Infektiosität des Adenovirusvektors, dem Alter, dem Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Ernährung, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate und der Schwere der speziellen Krankheit, die therapiert wird.
Weil ein Adenovirus ein Virus ist, der Menschen infiziert, kann es bestimmte Personen geben, welche Antikörper gegen bestimmte Adenovirusproteine entwickelt haben. Unter diesen Umständen ist es möglich, daß solche Personen eine immunologische Reaktion gegen den Virus entwickeln. Somit kann man, wo eine immunologische Reaktion für möglich gehalten wird, zuerst den Patienten testen, um die Existenz von Antikörpern zu bestimmen. Ein solcher Test kann in einer Vielzahl von anerkannten Art und Weisen durchgeführt werden, zum Beispiel durch einen einfachen Hauttest oder durch einen Test der zirkulierenden Blutspiegel von Adenovirus neutralisierenden Antikörpern. In der Tat könnte es unter solchen Umständen wünschenswert sein, eine Testdosis in der Größe von × 10⁶ bis 1 × 10⁶ o.ä. Viruspartikel einzuführen. Dann wird, wenn keine ungünstige Reaktion gesehen wird, die Dosis über einen Zeitraum erhöht, bis die gewünschte Dosis erreicht ist, wie zum Beispiel durch die Verabreichung von wachsenden Dosierungen von ungefähr einer Größenordnung.
C. Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird, wird der Adenovirusvektor in einer physiologisch verträglichen Lösung oder einem Puffer dispergiert.
Die Zusammensetzung wird typischerweise parenteral verabreicht, wie oben offenbart, in Dosiseinheitsformulierungen, die übliche, wohl bekannte, nicht toxische physiologisch verträgliche Träger, Hilfsstoffe und Vehikel, wie gewünscht, enthalten.
Injizierbare Zubereitungen, zum Beispiel sterile injizierbare wässerige oder ölige Suspensionen, werden gemäß dem Stand der Technik formuliert unter Verwendung von geeigneten Dispersions- oder Befeuchtungsmitteln und Suspendiermitteln. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension sein in einem nicht toxischen parenteral verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, zum Beispiel als eine Lösung in 1,3-Butandiol.
Unter den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer Lösung, und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile fette Öle üblicherweise als ein Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes reine fette Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer mono- oder di-Glyceride. Zusätzlich finden Fettsäuren, wie zum Beispiel Ölsäure, Verwendung in der Herstellung von Injektabilia.
Bevorzugte Träger schließen neutrale Salzlösungen, gepuffert mit Phosphat, Lactat, Tris und dergleichen ein. Natürlich reinigt man den Vektor ausreichend, um ihn im wesentlichen frei von unerwünschten Kontaminanten zu machen, wie zum Beispiel defekten störenden Adenoviruspartikeln oder Endotoxinen und anderen Pyrogenen, so daß sie keine ungünstigen Reaktionen in dem Patienten bewirken, der das Vektorkonstrukt erhält. Ein bevorzugtes Mittel zur Reinigung des Vektors schließt die Verwendung von Schwimmdichte-Gradienten ein, wie zum Beispiel die Caesiumchloridgradienten-Zentrifugation.
D. Verfahren zur Herstellung eines Adenovirusvektorkonstrukts
Das Verfahren zur Herstellung eines Adenovirusvektorkonstrukts zur Verwendung bei der Regulierung der Genproduktexpression in einem Herzmuskel umfaßt folgende Schritte:

a) Bereitstellen eines Adenovirus; und
b) Einschließen in den Adenovirus einer kodierenden Sequenz, die einen angiogenen Faktor kodiert, der erwünscht ist für die Einführung in eine Herzmuskelzelle.

Eine kodierende Sequenz wird in einen Adenovirus eingeschlossen unter Verwendung von Standardtechniken, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, so daß das Genprodukt, das durch diese Sequenz kodiert wird, in einer Muskelzelle exprimiert wird, die mit dem Adenovirusvektorkonstrukt infiziert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine kodierende Sequenz operativ gebunden an einen nicht-Adenovirus Enhancer-Promoter. Beispielhafte und bevorzugte solche Enhancer-Promoter sind oben bekannt gemacht.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Adenovirusvektoren und deren Verwendung bei der Zuführung eines Gens an Herzmuskelzellen in vivo.
BEISPIEL 1: Herstellung eines Adenovirusvektorkonstrukts
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von rekombinanten Replikations-defekten Adenoviren in der Herstellung von Virusvektorkonstrukten, die eine kodierende DNA Sequenz umfassen.
Rekombinanter Adenovirus (Gluzman et al., 1982), der unterschiedliche cDNAs enthält (AdCMV-cDNA) wurde hergestellt in Übereinstimmung mit Standardtechniken, die im Fachgebiet wohl bekannt sind. E. coli β-Galactosidase cDNA, die das SV40 T Antigen Kernzielsignal trägt (Bonnerot et al.,, 1987) wurde in pAdCMV eingefügt, um ein unterschiedliches Konstrukt zu erzeugen, das den Cytomegalievirus (CMV) Promoter, die β-Gal cDNA und ein Polyadenylierungssignal von entweder dem SV40 Virus oder dem Mausprotamingen umfaßt, und von Adenovirus Typ 5 Sequenzen umgeben ist. In diesem Konstrukt wurden die E1 und E3 Region von Adenovirus deletiert und die E1 Region wurde ersetzt durch die β-Gal kodierende Sequenz.
Das resultierende Plasmid, bezeichnet als AdCMVβ-Gal, wurde in 293 Zellen co-transfiziert. Die Co-Transfektion wurde wie folgt durchgeführt: 293 Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) kultiviert, das 2% fötales Kälberserum enthielt. Zusammenfließende Platten wurden in nicht zusammenfließende Kolben aufgeteilt am Tag vor der Co-Transfektion mit pAdCMVβ-Gal. Monoschichten wurden inkubiert bis virale Plaques erschienen.
Dieses Plaques wurden herausgepickt, in DMEM suspendiert, welches 2% fötales Kälberserum enthielt, und dafür verwendet, um eine neue Monoschicht von 293 Zellen zu infizieren. Wenn mehr als 90% der Zellen eine Infektion zeigten, wurden die viralen Lysate einem Frier-/Tauzyklus unterworfen und als primäre Stocks bezeichnet. Rekombinanter Virus mit der korrekten Struktur wurde bestätigt durch Herstellung von viraler DNA aus produktiv infizierten 293 Zellen, Restritktionsanalyse, und Southern Blotting. Sekundäre Stocks wurden danach erzeugt durch Infizieren von 293 Zellen mit primärem Virusstock und Inkubation bis zur Lyse.
Die großformatige Produktion von rekombinantem Adenovirus wurde in 293 Zellen durchgeführt. Infizierte Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion lysiert. Virus-enthaltende Extrakte wurden zentrifugiert, um die Debris zu entfernen vor der Ausfällung des Virus. Virus wurde durch Zentrifugation gesammelt, in isotonischem Medium resuspendiert, gereinigt, und sterilisiert.
Alternativ kann ausgefallener Virus in 50 mM Tris-HCl pH 7,8, enthaltend CsCl (d = 1,10 g/ml) resuspendiert werden, über einen schrittweisen Gradienten, gebildet aus 2 ml CsCl (d = 1,40) und 3 ml CsCl (d = 1,30), geschichtet werden, und 2 Stunden bei 20,000 rpm bei 10°C in einem Sorvall TH641 Rotor zentrifugiert werden. Virus wird von der unteren Grenzfläche gesammelt und über Nacht bei 4°C gegen isotonische Salzlösung dialysiert.
BEISPIEL 2: Funktionale Expression von AdCMVβ-Gal
Erwachsene Kaninchen wurden betäubt und ein Katheter wurde in die rechte Carotisarterie oder die innere Drosselvene eingeführt. Die Spitze des Katheters wurde unter fluoroskopischer Führung zu der linken Koronararterie oder dem Eingang des Koronarsinus vorgeschoben.
Ungefähr 1000 μg bis 1500 μg des Adenovirusvektorkonstrukts pAdCMVβ-Gal, hergestellt in Übereinstimmung mit den Verfahren von Beispiel 1, wurden in physiologisch gepufferter Salzlösung suspendiert. Ungefähr 2 × 10⁹ Plaque bildende Einheiten (pfu) von pAdCMVβ-Gal wurden in den innewohnenden Katheter infundiert. Der Katheter wurde entfernt, alle Einschnitte wurden geschlossen und man erlaubte den Kaninchen sich zu erholen. Die Kaninchen wurden 5 bis ungefähr 21 Tage nach der Injektion getötet. Das Herz und die damit assoziierte Gefäßversorgung wurde entfernt und histochemisch auf β-Gal-Aktivität untersucht, wie unten bekannt gemacht.
Drei Millimeter Querschnitte des linkten Ventrikels wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 1,25 Glutaraldehyd in PBS fixiert, drei mal bei Raumtemperatur in PBS gewaschen, und auf β-Galactosidaseaktivität mit X-Gal (Biorad) für 4–16 Stunden gefärbt, wie durch Nabel et al. beschrieben (Nabel, et al., (1989). Die 3 mm Abschnitte wurden mit Glycomethocyrlat eingebettet, und 4–7 μm Abschnitte wurden geschnitten und gegengefärbt mit Hematoxylin und Eosin wie zuvor beschrieben. (Nabel, et al., 1989).
Photomikroskopie wurde durchgeführt unter Verwendung von Kodak Ektachrome 200 Faden und Leitz Laborlux D und Wild M8 Mikroskopen. β-Gal-Aktivität wurde beobachtet in glatten Gefäßmuskeln des Herzens und in Herzmuskelzellen.
REFERENZEN
Die Referenzen, die unten aufgelistet sind, sind hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen bis zu dem Ausmaß, daß sie ergänzen, erklären, einen Hintergrund liefern oder Methodiken, Techniken und/oder Zusammensetzungen, die hierin verwendet werden, lehren.

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Claims

Verwendung eines Adenovirus-Vektors, der eine kodierende Sequenz umfasst, die einen angiogenen Faktor kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Herzerkrankung durch Stimulierung der kollateralen Blutgefäß-Bildung in dem Herz oder dem Myocard, worin das Medikament für die Infusion in ein Blutgefäß, welches das Herz oder einen Koronar-Sinus durchströmt, oder für die Injektion in das Myocard ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die kollaterale Blutgefäß-Bildung in dem ischaemischen Myocard auftritt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Infusion durch Katheter-Perfusion erfolgt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Blutgefäß eine Koronar-Arterie ist.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin der angiogene Faktor ein Wachstums-Faktor ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 5, worin der Wachstums-Faktor FGF-5, saures FGF, basisches FGF, PDGF, ein endothelialer Wachstums-Faktor oder ein glatter Gefäßmuskel-Wachstums-Faktor ist.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Adenovirus Adenovirus-Serotyp 5 ist.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin dem Adenovirus die frühe Genregion E1 fehlt.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin dem Adenovirus die frühe Genregion E3 fehlt.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Menge des Vektors im Bereich von 10⁷ bis 10¹⁵ Plaque-bildenden Einheiten, vorzugsweise von 10⁸ bis 10¹⁴ Plaque-bildenden Einheiten und noch bevorzugter von 10⁹ bis 10¹² Plaque-bildenden Einheiten liegt.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die kodierende Sequenz durch cDNA oder genomische DNA kodiert wird.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die kodierende Sequenz operativ an einen Verstärker-Promoter gebunden ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 12, worin der Verstärker-Promoter ein Cytomegalievirus-Promoter, ein SV40 früher Promoter, ein RSV-Promoter oder ein MCK-Verstärker ist.
Die Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin die kodierende Sequenz operativ an einen Herzmuskel-spezifischen Verstärker-Promoter gebunden ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 14, worin der Herzmuskel-spezifische Verstärker-Promoter ein cTNC-Promoter ist.