DE69333891T2

DE69333891T2 - Verfahren zur Nukleinsäurenamplifizierung, Zusammensetzung und Kit

Info

Publication number: DE69333891T2
Application number: DE69333891T
Authority: DE
Inventors: Daniel Louis Kacian; Diane Lisa Mcallister; Sherrol Hoffa Mcdonough; Nanibhushan Dattagupta
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1992-05-06
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2013-05-07
Also published as: ATE307898T1; TW360712B; EP0587266B1; ES2250960T3; KR950701393A; DE69333891D1; US5888729A; US5554516A; AU4222493A; JP4137996B2; CA2135073C; EP0587266A1; WO1993022461A1; JPH07506255A; KR100249110B1; AU681082B2; CA2135073A1; DK0587266T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Erhöhung der Kopienanzahl (oder Amplifizieren) einer spezifischen Nukleinsäuresequenz oder „Target-Sequenz". Die Targetsequenz kann entweder alleine oder als ein großer oder kleiner Bestandteil einer homogenen oder heterogenen Mischung von Nukleinsäuren vorliegen. Die Mischung von Nukleinsäuren kann so in einer Probe gefunden werden, welche zur diagnostischen Untersuchung, Umweltuntersuchung, zu Forschungsstudien, zur Bereitung von Reagenzien oder Materialien für andere Verfahren, so wie Klonieren, oder zu anderen Zwecken genommen wurde.
Die selektive Amplifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist von Wert bei der Erhöhung der Empfindlichkeit von Diagnose- und Umweltuntersuchungen und anderen Verwendungen, unter Erhaltung der Spezifität, Erhöhung der Empfindichkeit, Anwenderfreundlichkeit, Genauigkeit und Verlässlichkeit einer Vielzahl von Forschungsverfahren und Bereitstellung reichlicher Angebote spezifischer Oligonukleotide für verschiedene Zwecke.
Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet zur Verwendung bei Umwelt- und Diagnoseuntersuchung infolge der Anwenderfreundlichkeit, mit der sie durchgeführt werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Detektion und/oder Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist eine zunehmend wichtige Technik zur Identifizierung und Klassifizierung von Mikroorganismen, zum Diagnostizieren infektiöser Krankheiten, Detektion und Charakterisierung genetischer Abnormitäten, Identifizieren genetischer Veränderungen verbunden mit Krebs, Untersuchung genetischer Anfälligkeit für eine Krankheit und Messung der Reaktion auf verschiedene Arten der Behandlung. Solche Verfahren haben auch expandierende Anwendungen gefunden bei der Detektion und Quantifizierung von Mikroorganismen in Nahrungsmitteln, Umweltproben, Saatgutbeständen und anderen Arten von Material, bei denen die Gegenwart spezifischer Mikroorganismen möglicherweise überwacht werden muss. Andere Anwendungen werden bei den forensischen Wissenschaften, Anthropologie, Archäologie und Biologie gefunden, bei denen die Messung des Verwandtschaftsgrades von Nukleinsäuresequenzen verwendet worden ist, um kriminelle Verdächtige zu identifizieren, Vaterschaftsstreitigkeiten zu lösen, genealogische und phylogenetische Stammbäume zu konstruieren und bei der Klassifizierung einer Vielzahl von Lebensformen zu helfen.
Ein verbreitetes Verfahren zur Detektion und Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist Nukleinsäurehybridisierung. Dieses Verfahren basiert auf der Fähigkeit von zwei Nukleinsäuresträngen, die komplementäre oder im Wesentlichen komplementäre Sequenzen enthalten, spezifisch zu assoziieren unter geeigneten Bedingungen, um eine doppelsträngige Struktur zu bilden. Um eine spezifische Nukleinsäuresequenz (bekannt als „Target-Sequenz") zu detektieren und/oder zu quantifizieren, wird markiertes Oligonukleotid (bekannt als eine „Sonde") bereitet, welche Sequenzen enthält, die komplementär sind zu denen der Targetsequenz. In einem Verfahren, welches allgemein als „Screening" bekannt ist, wird die Sonde gemischt mit einer Probe, die mutmaßlich die Targetsequenz enthält, und es werden Bedingungen erzeugt, die geeignet sind zur Hybridbildung. Die Sonde hybridisiert mit der Targetsequenz, wenn diese in der Probe vorhanden ist. Die Sonden-Target-Hybride werden dann von der einzelsträngigen Sonde abgetrennt auf eine von einer Auswahl an Arten. Die Menge der mit den Hybriden assoziierten Markierung wird dann gemessen als ein Hinweis auf die Menge an Targetsequenz in der Probe.
Die Empfindlichkeit von Nukleinsäurehybridisierungsuntersuchungen wird hauptsächlich beschränkt durch die spezifische Aktivität der Sonde, die Rate und das Ausmaß der Hybridisierungsreaktion, die Leistung des Verfahrens zur Trennung hybridisierter und unhybridisierter Sonde und die Empfindlichkeit, mit welcher die Markierung detektiert werden kann. Bei besten Bedingungen können direkte Hybridisierungsmethoden, so wie die oben beschriebenen, etwa 1 × 10⁵ bis zu 1 × 10⁶ Targetmoleküle detektieren. Jedoch können den empfindlichsten Verfahren viele der Merkmale fehlen, die für Klinik- und Umwelt-Routineuntersuchungen benötigt werden, wie Schnelligkeit, Anwenderfreundlichkeit und Wirtschaftlichkeit. Überdies können selbst die Empfindlichkeiten der empfindlichsten Verfahren nicht ausreichend sein für viele der erwünschten Anwendungen.
Als Ergebnis der Interaktionen zwischen den verschiedenen Komponenten und der Teilschritte dieser Art von Untersuchung, gibt es fast immer ein umgekehrtes Verhältnis zwischen Empfindlichkeit und Spezifität. Somit können Schritte, die unternommen werden, um die Empfindlichkeit der Untersuchung zu steigern (wie Steigerung der spezifischen Aktivität der Sonde) eine höhere Prozentzahl falsch positiver Testergebnisse erzielen. Die Verknüpfung zwischen Empfindlichkeit und Spezifität ist ein bedeutendes Hemmnis für die Verbesserung der Empfindlichkeit von Hybridisierungsuntersuchungen gewesen. Eine Lösung für dieses Problems würde sein, die Menge an vorliegender Targetsequenz spezifisch zu erhöhen unter Verwendung eines Amplifizierungsverfahrens. Amplifizieren eines einzelnen Anteils der Targetsequenz ohne Amplifizierung eines bedeutenden Anteils der Information, für welche die verbleibenden Sequenzen der Probe codieren, könnte eine effektive Steigerung der Empfindlichkeit ergeben, während gleichzeitig die Spezifität nicht beeinträchtigt wird.
Ein Verfahren zur spezifischen Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, bezeichnet als "Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR", wurde beschrieben durch Mulllis et al. (siehe US-Patent Nr. 4.683.195, 4.683.202 und 4.800.159 und Europäische Patentanmeldungen 86302298.4, 86302299.2 und 87300203.4 und Methods in Enzymology, Band 155, 1987, S. 335–350). Das PCR-Verfahren verwendet wiederholte Zyklen Primer-abhängiger Nukleinsäuresynthese, die auftritt unter gleichzeitiger Verwendung des jeweiligen Stranges einer komplementären Sequenz als Matrize. Bei dem PCR-Verfahren werden Kopien beider Stränge einer komplementären Sequenz synthetisiert. Um PCR anwenderfreundlich zu machen, werden programmierbare Geräte für thermische Zyklen benötigt.
Das PCR-Verfahren wurde an RNA-Transkription gekoppelt durch Einfügung einer Promotor-Sequenz in einen der bei der PCR-Reaktion verwendeten Primer und anschließend, nach Amplifizierung durch PCR-Reaktion während einiger Zyklen, Verwendung der doppelsträngigen DNA als Matrize für die Transkription einzelsträngiger RNA (siehe z.B. Murakawa et al., DNA 7: 287–295 (1988)).
Andere Verfahren zur Amplifizierung einer spezifischen Nukleinsäuresequenz umfassen eine Serie an Zyklen von Primerhybridisierung, Extensionsschritten und Denaturierungsschritten, um ein intermediäres doppelsträngiges DNA-Molekül bereitzustellen, welches eine Promotorsequenz enthält, durch die Verwendung eines Primers, der eine Promotorsequenz enthält. Die doppelsträngige DNA wird verwendet, um vielfache RNA-Kopien der Targetsequenz herzustellen. Die resultierenden RNA-Kopien können als Targetsequenzen verwendet werden, um weitere Kopien herzustellen, und vielfache Zyklen können durchgeführt werden (siehe z.B. Burg et al., WO 89/1050; Gingeras et al., WO 88/10315 (wird manchmal auch "Transkriptions-Amplifizierungs-System" oder TAS genannt); EPA-Anmeldenummer 89313154 veröffentlicht als EP-A 0373960 (Gingeras et al.); EPA-Anmeldenununer 88113948.9 veröffentlicht als EP-A 0329822 (Davey und Malek); Malek et al. WO 91/02818; WO 89/06700 (Miller und Johnston); EPA-Anmeldenummer 90307503.4 veröffentlicht als EP-A 0408295 (Kacian und Fultz)).
Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89:392–396 (Jan 1992) beschreibt ein durch Oligonukleotid getriebenes Amplifizierungsverfahren zur Verwendung mit einer DNA-Matrize unter Verwendung einer Restriktions-Endonuklease zur Produktion der Initial-Target-Sequenzen und eines Enzyms zum Setzen von Brüchen („nicks") bei dem DNA/DNA-Komplex, um eine Extensionsreaktion und somit Amplifikation zu ermöglichen. Becker et al., EPA-Anmeldenummer 88306717.5 veröffentlicht als EP-A 0300796, beschreibt ein Amplifizierungsverfahren, bei welchem ein Primer hybridisiert wird mit einer Targetsequenz und der resultierende Doppelstrang vor der Extensionsreaktion und Amplifizierung gespalten wird; in dem Falle, dass sich der Primer über den Hybridisierungsbereich hinaus erstreckt, wird eine Spaltung vor der Extension erforderlich und der Primer muss an seinem 3'-Ende blockiert sein, um das Auftreten aller unerwünschten Extensionsreaktionen vor der Amplifizierung zu vermeiden. Kramer et al., US-Patent Nr. 4.786.600 beschreiben ein Verfahren zur Produktion einer hohen Kopienzahl von einer Sondensequenz bei einer RNA-Target-Sequenz unter Verwendung von Qβ-Replikase. Urdea, WO 91/10746 beschreibt ein Signal-Amplifizierungsverfahren, welches eine T7-Promotorsequenz einschließt.
Andere Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäure schließen die Ligase-Kettenreaktion (LCR) ein, beschrieben in der Europäischen Patentschrift 320.308, in welcher mindestens vier separate Oligosonden verwendet werden; zwei der Oligosonden hybridisieren mit entgegengesetzten Enden des gleichen Targetstranges in geeigneter Orientierung, so dass die dritte und vierte Oligosonde mit der ersten und zweiten Oligosonde hybridisieren können, um durch Ligation verbundene Sonden zu bilden, die denaturiert und detektiert werden können. Ein anderes Verfahren ist das in EPA-Veröffentlichung Nr. 0.427.073 A2, veröffentlicht am 15. Mai 1991, beschriebene, in welchem eine palindromische Sonde, befähigt, eine Haarnadelstruktur zu bilden, und mit einer funktionellen Promotorregion in der Haamadelstruktur, hybridisiert mit einer Targetsequenz, dann ligiert wird mit einem zweiten mit der Targetsequenz hybridisierten Oligonukleotid, so dass RNA-Transkripte gemacht werden können.
Noch weitere Verfahren schließen Oligonukleotidsynthese und Klonieren ein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Synthese vielfacher Kopien einer einzelsträngigen Ribonukleinsäure-Targetsequenz ohne die Notwendigkeit die Reaktionbedingungen, sowie Temperatur, pH oder Ionenstärke, zu modifizieren, und ohne die Notwendigkeit, vielfache verschiedene Primer oder Promotoren, oder auch andere Enzyme als Polymerasen, welche auch RNAse H-Aktivitäten haben können, hinzuzufügen.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden als eine Komponente von Untersuchungsverfahren, um spezifische Ribonukleinsäure-Targetsequenzen in klinischen, Umwelt-, forensischen und ähnlichen Proben zu detektieren und/oder zu quantifizieren oder um eine hohe Zahl RNA-Kopien von einer spezifischen Targetsequenz zu produzieren für eine Vielzahl an Verwendungen. Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um vielfache RNA-Kopien einer Nukleinsäure- Targetsequenz zum Klonieren zu produzieren oder um Sonden zu erzeugen oder um RNA-Kopien zum Sequenzieren herzustellen.
Das vorliegende Verfahren legt die Inkubation einer Mischung dar, welche im Wesentlichen besteht aus einer Ribonukleinsäure-Targetsequenz (RNA), mit einem oder mehreren Oligonukleotiden, bekannt als "Promotor-Primer", welche eine "komplexierende" Sequenz (d.h. einen Primer) haben, die ausreichend komplementär ist zum 3'-Ende einer Targetsequenz, um nur an oder nahe dem 3'-Ende der Targetsequenz zu hybridisieren. Der Promotor-Primer schließt ebenfalls, 5' von der komplexierenden Sequenz aus lokalisiert, einen Promotor für eine RNA-Polymerase ein.
"An oder nahe" will lediglich das 3'-Ende des Targets selbst anzeigen und nicht notwendigerweise das gesamte RNA-Molekül, welches detektiert werden muss. Beispielsweise kann das "Target" ein kleiner zentraler Anteil eines RNA-Moleküls sein, innerhalb eines ansonsten großen RNA-Moleküls.
Mit "ein oder mehrere" ist gemeint, dass die der Reaktionsmischung zugesetzten Promotor-Primer ausreichend ähnlich sind, so dass sie annähernd die gleiche Targetsequenz binden können an annähernd der gleichen Position (plus oder minus etwa 10 Basen, am gleichen Strang), so dass die Amplifizierung der momentanen Erfindung fortschreiten kann. Dies schließt die Bereitstellung von anderen Oligonukleotiden zu der Mischung, beispielsweise von "Helfer"-Oligonukleotiden, welche die Hybridisierung der Promotor-Primer unterstützen, nicht aus.
Mit "bestehend im Wesentlichen aus" wie es oben verwendet wird, ist gemeint, dass die Mischung alle nötigen Reaktanten und Reagenzien enthält. Jedoch kann eine solche Mischung auch Enzyme oder andere Substituenten enthalten, welche die Amplifizierung der Erfindung qualitativ nicht beeinflussen, und die Mischung kann "Helfer"-Oligonukleotide enthalten. Ein "Helfer"-Nukleotid ist eine Nukleinsäuresequenz, welche das Komplexieren zwischen dem Promotor-Primer oder einer anderen komplexierenden Nukleinsäure wie einer Sonde und der Targetsequenz unterstützt und wird bestimmt durch die tatsächliche Sequenz am 3'-Ende der Targetsequenz. Solche Helfer-Oligonukeotide werden in gleichwertiger Art verwendet wie die Hybridisierungs-Helfer-Oligonukleotide, beschrieben von Hogan et al., US-Patent 5.030.557, nämlich durch Unterstützung des Bindens des Promotor-Primers an seine Target-Nukleinsäure, selbst wenn diese Target-Nukleinsäure eine signifikante Sekundärstruktur besitzt. Trotz der Ähnlichkeit bei der Verwendung solcher Helfer-Oligonukleotide ist es überraschend, dass solche Helfer-Oligonukleotide bei einem Amplifizierungsprotokoll verwendet werden konnten ohne ungünstige Wirkung auf die Effizienz dieser Verfahren.
Der Promotor-Primer und die Targetsequenz werden Bedingungen unterworfen, bei denen ein Hybrid aus Promotor-Primer und Targetsequenz gebildet wird und DNA-Synthese initiiert werden kann. Es wird angenommen, dass bei dieser Reaktion das 3'-Ende der Targetsequenz verlängert wird bei einer DNA-Extensionsreaktion von einer Stelle aus, welche angrenzt an den hybridisierten Komplex zwischen der komplexierenden Sequenz und der Targetsequenz. Die Promotorsequenz ist die Matrize für diese Extensionreaktion, welche ein erstes DNA-Extensionprodukt produziert und dadurch eine doppelsträngige Promotorsequenz. Das 3'-Ende des Promotor-Primers kann auch als Primer dienen für eine zweite DNA-Extensionsreaktion, wobei die Reaktion die Targetsequenz als eine Matrize verwendet und einen doppelsträngigen Nukleinsäurekomplex ergibt; der Komplex ist ein DNA/RNA-Komplex.
Das erste DNA-Extensionsprodukt wird dann verwendet von einer RNA-Polymerase, welche den Promotor des Promotor-Primers erkennt, um vielfache RNA-Kopien der Targetsequenz herzustellen. Überraschenderweise kann im Falle eines RNA/DNA-Komplexes oder RNA allein, welche die Targetsequenz umfasst, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, so wie T7-RNA-Polymerase, den RNA/DNA-Komplex oder die RNA "lesen" und einzelsträngige RNA produzieren, und ist deshalb effektiv bei der vorliegenden Erfindung.
In bevorzugten Ausführungsformen hat der Promotor-Primer eine Modifikation, welche ein modifiziertes Nukleotid an oder nahe seinem 3'-Ende umfassen kann, welches Nukleinsäureextension in diese Richtung hemmt oder verhindert. Es überrascht, dass die Erfindung ausgeführt werden kann mit dem modifizierten 3'-Ende des Promotor-Primers, und es überrascht insbesondere, dass die Verwendung einer Mischung von modifiziertem und unmodifiziertem Promotor-Primer (oder von zwei unterschiedlich modifizierten Promotor-Primern) eine Amplifizierung von höherer Effizienz und daher eine höhere Kopienzahl ergibt als die Verwendung eines unmodifizierten oder modifizierten Promotor-Primers allein. Verfahren zur Schaffung solcher verwendbaren Modifikationen, um Primerextension zu verhindern oder zu vermindern, sind auf diesem Fachgebiet bekannt.
Wenn die Targetsequenz RNA ist, schließt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Erzeugung eines 3'-Endes der Targetsequenz durch chemische oder enzymatische Degradation oder Weiterverarbeitung ein, so dass Extension des 3'-Endes der Targetsequenz längsweiter der Promotorregion des Promotor-Primers fortschreiten kann. Eine solche Erzeugung kann duchgeführt werden beispielsweise durch Einwirkung von RNAse H auf ein RNA-DNA-Hybrid (z.B. ein DNA-Promotor-Primer und ein RNA-Target-Hybrid), Behandlung mit Exonukleasen und Verdau mit spezifischen Restriktionsendonukleasen oder Ribozymen.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen legt die vorliegende Erfindung das Einschließen von einem oder mehreren "Helfer"-Oligonukleotiden in die Reaktionszusammensetzung dar.
In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das 5'-Ende des Targetstranges der Nukleinsäure begrenzt werden, um so entweder die Extensionreaktion oder die Transkriptionsreaktion anzuhalten. Verfahren, um eine solche Begrenzung zu bewirken, sind auf diesem Fachgebiet bekannt und können das Komplexieren einer geeigneten Nukleinsäuresequenz (z.B. eines Oligonukleotids) mit dem 5'-Ende der Targetsequenz oder der Modifikation des 5'-Endes der Targetsequenz einschließen.
Eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Erfindung kann im Wesentlichen bestehen aus einer Targetsequenz, einem Promotor-Primer, einer RNA-Polymerase, einer DNA-Polymerase und/oder einer reversen Transkriptase, sowie Reagenz- und Pufferbedingungen, welche ausreichen, um Amplifizierung zu ermöglichen. Der Promotor-Primer kann sowohl modifizierte als auch unmodifizierte 3'-Enden einschließen.
Eine Zusammensetzung kann eine Mischung einschließen von modifizierten und unmodifizierten Promotor-Primern und/oder eine Mischung verschiedener Promotor-Primer, welche geeignet sind zur Verwendung bei dieser Erfindung.
Bei einem Beispiel einer typischen Untersuchung, welche die vorliegende Erfindung behandelt, wird eine Probe von Target-Nukleinsäure, welche amplifiziert werden soll, vermischt mit einem Pufferkonzentrat, welches geeigneten Puffer, Salze, Magnesium, Nukleotidtriphosphate, einen oder mehrere Promotor-Primer, Dithiothreitol und Spermidin enthält. Reverse Transkriptase und RNA-Polymerase werden zugefügt und der Reaktionsansatz wird inkubiert für eine Zeitspanne von Minuten bis zu Stunden bei einer geeigneten konstanten Temperatur zwischen z.B. 37°C bis 42°C, bei der die Enzyme aktiv sind. Der Reaktionsansatz kann dann untersucht werden durch Zusatz einer Sondenlösung, Inkubation für 10–30 Minuten bei 60°C, Zusatz einer Lösung zur selektiven Hydrolyse der unhybridisierten Sonde, Inkubation des Reaktionsansatzes für 5–10 Minuten bei 60°C und Messen der verbleibenden Chemolumineszenz in einem Luminometer wie es von Arnold et al., in der veröffentlichten Internationalen Anmeldenummer WO 89/02476 beschrieben wird, und als "HPA"-Verfahren bezeichnet wird. Die Produkte der Verfahren von vorliegender Erfindung können in vielen anderen Untersuchungssystemen verwendet werden oder für andere Verwendungen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung weist weiterhin ein Kit auf, das die Komponenten der Erfindung aufnimmt und eine bequeme Durchführung der Erfindung möglich macht. Solch ein Kit kann auch andere Materialien einschließen, welche die Erfindung zu einem Teil anderer Verfahren macht, und kann auch für Multiwell-Technologie angepasst werden.
DEFINITIONEN
So wie hier benutzt haben die folgenden Bezeichnungen die folgenden Bedeutungen, wenn nicht ausdrücklich das Gegenteil festgesetzt wird.
A. NUKLEINSÄURE
„Nukleinsäure" bedeutet entweder RNA oder DNA zusammen mit jeglichen Nukleotid-Analoga oder anderen Molekülen, welche in der Sequenz vorhanden sein können und welche nicht die Durchführung der vorliegenden Erfindung verhindern.
B. MATRIZE
Eine „Matrize" ist ein Nukleinsäuremolekül, das durch eine Nukleinsäurepolymerase kopiert werden kann. Eine Matrize kann RNA sein und kann jeweils entweder einzelsträngig, doppelsträngig oder teilweise doppelsträngig sein, abhängig von der Polymerase. Die synthetisierte Kopie ist komplementär zur Matrize.
C. PRIMER
Ein „Primer" ist ein Oligonukleotid, welches ausreichend komplementär ist zu einer Matrize, so dass es mit der Matrize hybridisiert (durch Wasserstoffbrückenbindung oder Hybridisierung unter Hybridisierungsbedingungen, z.B. stringenten Bedingungen), um einen Primer-Matrizen-Komplex zu ergeben, geeignet zur Initiation der Synthese durch eine DNA-Polymerase, wie eine reverse Transkriptase, und welches verlängert wird durch Addition von kovalent gebundenen Basen verknüpft mit seinem 3'-Ende, welche komplementär sind zur Matrize. Das Ergebnis ist ein Primer-Extensionsprodukt. Praktisch alle DNA-Polymerasen (einschließlich der reversen Transkriptase), die bekannt sind, benötigen das Komplexieren eines Oligonukleotids mit einer einzelsträngigen Matrize („Priming"), um DNA-Synthese zu initiieren. Unter angemessenen Umständen kann ein Primer Bestandteil eines Promotor-Primers sein. Solche Primer haben im Allgemeinen eine Länge zwischen 10 und 100 Basen, vorzugsweise eine Länge zwischen 20 und 50 Basen.
D. PROMOTOR ODER PROMOTORSEQUENZ
Ein „Promotor" oder eine „Promotorsequenz" ist eine spezifische Nukleinsäuresequenz, welche durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase („Transkriptase") erkannt wird als ein Signal, an ein Nukleinsäuremolekül zu binden und die Transkription von RNA an einer spezifischen Stelle zu beginnen. Zur Bindung benötigen solche Transkriptasen im Allgemeinen, dass der Promotor und sein Komplement doppelsträngig vorliegen; der Matrizenanteil muss nicht doppelsträngig sein. Individuelle DNA-abhängige RNA-Polymerasen erkennen eine Vielzahl verschiedener Promotorsequenzen, welche in ihrer Effizienz Transkription hervorzurufen deutlich variieren können. Wenn eine RNA-Polymerase an eine Promotorsequenz bindet, um Transkription zu initiieren, ist diese Promotorsequenz nicht Teil der transkribierten Sequenz. Somit werden die dadurch produzierten RNA-Transkripte nicht die Promotorsequenz einschließen.
E. PROMOTOR-PRIMER
Ein Promotor-Primer umfasst einen Promotor und einen Primer. Es handelt sich um ein Oligonukleotid, das ausreichend komplementär ist zum 3'-Ende einer Target-Nukleinsäuresequenz, um an oder nahe dem 3'-Ende dieser Target-Nukleinsäuresequenz zu komplexieren, was bedeutet, dass der Promotor-Primer nahe genug am Ende der Targetsequenz komplexiert, um Amplifizierung von der Targetsequenz ausreichend zu ermöglichen, um die Erfordernisse für Untersuchung, Prüfung, Klonieren oder andere Verwendung für die amplifizierte Nukleinsäure zu erfüllen. Der Promotor-Primer wird als Matrize verwendet, um eine komplementäre Nukleinsäuresequenz zu erzeugen, welche vom 3'-Ende (auch bekannt als 3'-Terminus) einer Target-Nukleinsäuresequenz her verlängert wird, um einen im Allgemeinen doppelsträngigen Promotor zu ergeben, unterworfen jeder denaturierenden oder enzymatischen Aktivität, welche den Doppelstrang spalten kann.
Eine DNA- oder RNA-abhängige DNA-Polymerase erzeugt ebenfalls einen komplementären Strang zum Target-Nukleinsäuremolekül unter Verwendung des Anteils der Targetsequenz, der 5' zum komplementären Bereich vom Promotor-Primer liegt, als Matrize.
Das 3'-Ende vom Promotor-Primer kann modifiziert oder blockiert sein, um so das Fortschreiten einer Extensionsreaktion von dort zu verhindern oder zu hemmen. Eine Lösung von Promotor-Primer, welche sowohl modifizierten wie unmodifizierten Promotor-Primer umfasst, besteht aus der im Wesentlichen gleichen Nukleinsäuresequenz für die Zwecke der vorliegenden Erfindung. Der modifizierte Promotor-Primer enthält weder einen anderen Promotor noch eine andere Erkennungssequenz als der unmodifizierte Promotor-Primer. Das bedeutet, dass innerhalb von etwa 10 Basen die modifizierten und unmodifizierten Promotor-Primer durch die gleiche RNA-Polymerase erkannt werden und die gleiche Targetsequenz (obgleich nicht notwendigerweise an genau der gleichen Position) erkennen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die modifizierten und unmodifizierten oder eine Mischung modifizierter Promotor-Primer identisch bis auf die Modifikation. Das 3'-Ende des Promotor-Primers kann auf vielfältige Arten blockiert werden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Solche Promotor-Primer haben im Allgemeinen eine Länge von zwischen 40 und 100 Basen, vorzugsweise zwischen 40 und 60 Basen.
F. TARGET-NUKLEINSÄURESEQUENZ, TARGETSEQUENZ
Eine „Target-Nukleinsäuresequenz" oder „Targetsequenz" hat eine erwünschte Ribonukleinsäuresequenz, welche amplifiziert werden soll, ist einzelsträngig und kann andere Sequenzen 5' oder 3' neben den zu amplifizierenden Sequenzen einschließen, welche entweder amplifiziert werden können oder nicht.
Die Target-Nukleinsäuresequenz schließt die komplexierenden Sequenzen ein, mit welchen der Promotor-Primer hybridisiert während der Durchführung der vorliegenden Erfindung. Wenn die Target-Nukleinsäuresequenz ursprünglich einzelsträngig ist, bezieht sich die Bezeichnung entweder auf den (+)- oder den (–)-Strang, und bezieht sich ebenfalls auf die zur Targetsequenz komplementären Sequenz. Wenn die Target-Nukleinsäuresequenz ursprünglich doppelsträngig ist, bezieht sich die Bezeichnung sowohl auf den (+)- wie auch auf den (–)-Strang.
G. PLUS (+)- UND MINUS (–)-STRANG BZW. -STRÄNGE
Diskussionen über Nukleinsäuresynthese werden sehr erleichtert und geklärt durch Anwendung von Bezeichnungen, um die zwei komplementären Stränge eines Nukleinsäure-Doppelstranges zu benennen. Traditionell wurde der Strang, welcher für die Sequenzen codiert, die für die Produktion von Proteinen oder Struktur-RNA verwendet werden, als „Plus"-Strang und sein Komplement als „Minus"-Strang bezeichnet. Inzwischen ist bekannt, dass in vielen Fällen beide Stränge funktionell sind und die Zuweisung der Bezeichnung „Plus" für den einen und „Minus" für den anderen dann willkürlich erfolgen muss. Trotzdem sind die Bezeichnungen sehr nützlich zum Bezeichnen der Sequenzorientierung von Nukleinsäuren und wird hier verwendet werden zu diesem Zweck, wobei der "Plus"-Strang den ursprünglichen Targetsequenz-Strang bezeichnet, welcher mit dem Promotor-Primer komplexiert.
H. DNA-ABHÄNGIGE DNA-POLYMERASE
Eine „DNA-abhängige DNA-Polymerase" ist ein Enzym, welches eine komplementäre DNA-Kopie von einer DNA-Matrize synthetisiert. Beispiele sind DNA-Polymesse I von E. coli und Bakteriophage-T7-DNA-Polymerse. Alle bekannten DNA-abhängigen DNA-Polymerasen benötigen einen komplementären Primer zur Initiation der Synthese. Es ist bekannt, dass unter geeigneten Bedingungen bestimmte DNA-abhängige DNA-Polymerasen eine komplementäre DNA-Kopie von einer RNA-Matrize synthetisieren können.
I. DNA-ABHÄNGIGE RNA-POLYMERASE (TRANSKRIPTASE)
Eine „DNA-abhängige RNA-Polymerse" oder „Transkriptase" ist ein Enzym, das vielfache RNA-Kopien synthetisiert von einem doppelsträngigen oder teilweise doppelsträngigen DNA-Molekül mit einer (für gewöhnlich doppelsträngigen) Promotor-Sequenz. Es sollte beachtet werden, dass die vorliegende Erfindung einzelsträngige Promotoren einschließt, zusammen mit den RNA-Polymerasen, welche sie erkennen. Die RNA-Moleküle („Transkripte") werden synthetisiert in der 5' → 3'-Richtung des RNA-Moleküls, beginnend an einer spezifischen Position unmittelbar stromabwärts von dem Promotor. Beispiele für Transkriptasen sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen von E. coli und von den Bakteriophagen T7, T3 und SP6. Unter geeigneten Bedingungen können, wie hierin gezeigt, manche Transkriptasen RNA oder ein RNA-DNA-Copolymer als eine Matrize verwenden.
J. RNA-ABHÄNGIGE DNA-POLYMERASE (REVERSE TRANSKRIPTASE)
Eine „RNA-abhängige DNA-Polymerase" oder „reverse Transkriptase" ist ein Enzym, welches eine komplementäre DNA-Kopie synthetisiert von einer RNA-Matrize. Alle bekannten reversen Transkriptasen haben ebenfalls die Fähigkeit, eine komplementäre DNA-Kopie von einer DNA-Matrize zu machen; somit sind sie sowohl RNA- als auch DNA-abhängige DNA-Polymerasen. Ein Primer wird benötigt, um Synthese entweder mit den RNA- oder den DNA-Matrizen zu initiieren.
K. RNAse H
Eine „RNAse H" ist ein Enzym, welches den RNA-Anteil eines RNA-DNA-Doppelstranges abbaut. RNAse H können Endonukleasen oder Exonukleasen sein. Die meisten Reverse-Transkriptase-Enzyme enthalten normalerweise eine RNAse H-Aktivität zusätzlich zu ihrer Polymerase-Aktivität. Jedoch stehen andere Quellen für RNAse H zur Verfügung ohne eine damit verbundene Polymerase-Aktivität. Der Abbau kann zur Abtrennung einer RNA von einem RNA-DNA-Komplex führen. Alternativ kann die RNAse H die RNA an verschiedenen Stellen lediglich schneiden, so dass Anteile der RNA abschmelzen oder Enzymen ermöglichen, Anteile der RNA zu entwinden, oder die erzeugten RNA-Fragmente als Primer für eine DNA-Polymerase dienen können.
L. HYBRIDISIEREN, KOMPLEXIEREN
Die Bezeichnungen „hybridisieren" und „komplexieren" beziehen sich auf die Bildung von Doppelsträngen zwischen Nukleotidsequenzen, welche ausreichend komplementär sind, um Doppelstränge (oder „Komplexe") zu bilden über Watson-Crick-Basenpaarung. Wenn ein Promotor-Primer oder Primer mit einem Target (einer Matrize) „hybridisiert", sind solche Komplexe (oder Hybride) ausreichend stabil, um die Priming-Funktion zu liefern, welche von einer DNA-Polymerase benötigt wird, um DNA-Synthese zu initiieren.
M. MODIFIZIERTER PRIMER ODER PROMOTOR-PRIMER
Das 3'-Ende des Primers oder des Promotor-Primers kann modifiziert oder blockiert sein, um so eine von dort ausgehende Extensionsreaktion zu verhindern oder zu hemmen. Sowohl ein Primer als auch ein Promotor-Primer, welche sowohl modifizierte als auch unmodifizierte Vertreter haben, bestehen im Wesentlichen aus der gleichen Nukleinsäuresequenz zu Zwecken der vorliegenden Erfindung. Mit anderen Worten enthält der modifizierte Primer oder Promotor-Primer nicht eine verschiedene komplexierende Sequenz (Primer) hinsichtlich ihrer Spezifität, da sowohl das modifizierte als auch das unmodifizierte Oligonukleotid an tatsächlich der gleichen Position (plus oder minus etwa 10 Basen) an die Target-Nukleinsäuresequenz hybridisieren, so dass Amplifizierung der Target-Sequenz nicht verhindert wird. Auch enthält der modifizierte Promotor-Primer keine von dem unmodifizierten Promotor-Primer verschiedene Erkennungsregion (Promotor). Dies bedeutet, dass innerhalb von etwa 10 Basen die modifizierten und unmodifizierten Primer oder Promotor-Primer gleich sind, von der gleichen RNA-Polymerase erkannt werden und die gleiche Target-Sequenz erkennen (obwohl nicht unbedingt an exakt der gleichen Position). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die modifizierten und unmodifizierten Primer oder Promotor-Primer identisch bis auf die Modifizierung.
Das 3'-Ende des Primers oder Promotor-Primers kann modifiziert werden auf eine Vielzahl verschiedener Arten, die den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Geeignete Modifizierungen eines Promotor-Primers können Addition von Ribonukleotiden, 3'-Desoxynukleotid-Resten (z.B. Cordycepin (CO, Glen Research)), 3', 2'-Didesoxynukleotid-Reste, modifizierte Nukleotide so wie Phosphorothioate und nicht-nukleotidische Bindungen so wie beschrieben bei Arnold et al. (PCT-US 88/03173) (RS) oder Alkandiol-Modifizierungen (Wilk et al., Nuc. Acids Res. 18:2065, 1990) (RP) einschließen, oder die Modifizierung kann lediglich bestehen aus einer Region, gelegen 3' zur Priming-Sequenz, welche nicht komplementär zur Target-Nukleinsäure ist. Natürlich sind auch andere effektive Modifikationen ebenso möglich.
Eine Mischung modifizierter und unmodifizierter Oligonukleotide kann bei einer Amplifizierungsreaktion verwendet werden, und Verhältnisse von blockiertem zu nicht blockiertem Oligonukleotid von 2:1 bis 1.000:1 sind erfolgreich verwendet worden. Eine Mischung von Oligonukleotiden mit verschiedenen 3'-Modifikationen kann ebenfalls verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die 1 veranschaulicht einen Promotor-Primer und eine Target-Nukleinsäure, welche ein begrenztes 3'-Ende hat und somit keine zusätzlichen Sequenzen 3' von der Targetsequenz, welche aber zusätzliche Sequenzen 5' von der Targetsequenz hat.
2 veranschaulicht eine RNA-Targetsequenz mit zusätzlichen Sequenzen 3' von der komplexierenden Region der Targetsequenz.
3 ist eine schematische Darstellung einer Alkandiol-Modifizierung oder RP an einem Oligonukleotid (Zickzack-Linie).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren, eine Zusammensetzung und ein Kit zur Amplifizierung spezifischer einzelsträngiger Ribonukleinsäure-Targetsequenzen. Solche amplifizierten Targetsequenzen sind nützlich bei Untersuchungen zur Detektion und/oder Quantifizierung der besagten spezifischen Nukleinsäure-Targetsequenzen oder zur Produktion großer Mengen an Kopien von DNA und/oder RNA spezifischer Targetsequenzen für eine Vielzahl an Verwendungen.
Unter Verwendung von Abbildung 1 als Erläuterung charakterisiert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, welches die Behandlung einer Nukleinsäure-Targetsequenz (2), welche eine RNA ist, mit einem Oligonukleotid (4) umfasst, welches einen Promotor-Primer umfasst, der einen Promotor (6) und einen Primer (8) hat, wobei der Primer (8) ausreichend komplementär ist zum 3'-Ende-Anteil (9) der Targetsequenz ist, um an oder nahe dem 3'-Ende (9) der Targetsequenz zu komplexieren. Der Promotor-Primer (4) besteht im Wesentlichen aus nur einer einzelnen Nukleinsäuresequenz, und keine anderen Promotor-Primer müssen zum Reaktionsgemisch zugeführt werden, um Amplifizierung zu erzielen. Geeignete Promotoren für den Promotor-Primer der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen (natürlich, synthetisch oder als ein Produkt eines Restriktionsverdaus hergestellt), welche spezifisch von einer RNA-Polymerase erkannt werden, welche an diese Sequenz bindet und den Transkriptionsvorgang initiiert, wodurch RNA-Transkripte produziert werden. Die Promotorsequenz kann wahlweise Nukleotidbasen einschließen, welche sich über die eigentliche Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase hinaus erstrecken, was zusätzliche Stabilität oder Anfälligkeit gegenüber Degradationsprozessen vermitteln kann oder erhöhte Transkriptionseffizienz. Promotorsequenzen, für welche es eine bekannte und erhältliche Polymerase gibt, sind insbesondere geeignet. Diese Promotoren schließen solche ein, welche durch RNA-Polymerasen von Bakteriophagen T3, T7 oder SP6 oder von E. coli erkannt werden.
Unter manchen Umständen kann es wünschenswert sein, „Helfer"-0ligonukleotide in die Mischung einzuführen, wobei diese Helfer-Oligonukleotide den Promotor-Primer unterstützen, mit der Targetsequenz zu komplexieren.
Der Promotor-Primer (4) und die Targetsequenz (2) werden Bedingungen unterworfen, wobei ein Promotor-Primer/Targetsequenz-Komplex (11) gebildet wird und DNA-Synthese initiiert werden kann. Dementsprechend wird die Reaktionsmischung inkubiert unter Bedingungen, wodurch ein Promotor-Primer/Targetsequenz-Komplex gebildet wird, einschließlich Bedingungen für DNA-Priming und Nukleinsäuresynthese (einschließlich Ribonukleotid-Triphosphaten und Desoxyribonukleotid-Triphosphaten) für eine ausreichende Zeitdauer, wodurch vielfache Kopien der Targetsequenzen produziert werden. Die Reaktion findet vorteilhafterweise statt unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Beibehaltung der Stabilität von den Reaktionsbestandteilen, so wie dem Bestandteil-Enzyme, und ohne Modifizierung oder Manipulation der Reaktionsbedingungen während des Verlaufs der Amplifizierungsreaktion zu erfordern. Dementsprechend kann die Reaktion stattfinden unter Bedingungen, welche im Wesentlichen isothermal sind und im Wesentlichen konstante Ionenstärke und konstanten pH einschließen. Mit anderen Worten können die Reaktionsbedingungen effektiv konstant sein, was bedeutet, dass Temperatur, ph-Wert und Ionenkonzentration nicht absichtlich signifikant geändert werden, um so die Reaktionsbedingungen zu beeinflussen. Die Bestandteile der Reaktionsmischung können schrittweise vereinigt werden oder auf einmal.
Während der Durchführung der Reaktion wird das 3'-Ende (9) der Targetsequenz verlängert durch eine geeignete DNA-Polymerase bei einer Extensionsreaktion unter Verwendung der Promotor-Sequenz des Promotor-Primers als eine Matrize, um ein DNA-Extensionsprodukt (10) zu ergeben, komplementär zur Promotorsequenz. Das 3'-Ende der Primer-Region vom Promotor-Primer wird ebenfalls bei einer Extensionsreaktion verlängert unter Verwendung einer geeigneten reversen Transkriptase, um einen zur Target-Nukleinsäuresequenz komplementären Strang (12) zu bilden. Der resultierende doppelsträngige Promotor wird dann verwendet, um die geeignete RNA-Polymerase zu binden, welche dann die resultierende doppelsträngige Target-Nukleinsäuresequenz verwendet, um vielfache Kopien einzelsträngiger RNA zu produzieren (welche komplementär zum (+)-Strang der Targetsequenz sein werden).
Die DNA-Polymerase zur Extension des Promotor-Primers kann eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (d.h. eine reverse Transkriptase) sein, da die Targetsequenz eine RNA ist.
Da jedoch alle bekannten reversen Transkriptasen ebenfalls DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität besitzen, ist es nicht notwendig, eine weitere DNA-abhängige DNA-Polymerase als die reverse Transkriptase hinzuzufügen, um die Extensionsreaktion durchzuführen, einschließlich dem Fall, wenn der Promotor-Primer DNA ist und die Targetsequenz RNA ist. Geeignete reverse Transkriptasen schließen AMV-Reverse Transkriptase und MMLV-Reverse Transkriptase ein.
Die für die vorliegende Erfindung benötigte RNA-Polymerase kann eine DNA-abhängige RNA-Polymerase sein, so wie die RNA-Polymerasen von E. coli und den Bakteriophagen T7, T3 und SP6; es ist überraschend, dass solch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase wirksam ist, wenn die Targetsequenz RNA ist.
Das 3'-Ende der Target-RNA-Sequenz kann begrenzt sein, wie in Abbildung 1, um annähernd übereinzustimmen mit dem 5'-Ende des Primers vom Promotor-Primer (d.h. die Targetsequenz darf keine Nukleotide haben, welche sich 3' über die mit dem Primer komplexierte Region hinaus erstrecken). Die Erzeugung eines solchen begrenzten 3'-Endes des Nukleinsäure-Targets durch chemische oder enzymatische Degradation oder Weiterverarbeitung ist auf diesem Fachgebiet bekannt.
Wie in Abbildung 2 abgebildet, kann die Amplifizierung überraschenderweise an einer RNA-Targetsequenz (14) durchgeführt werden, welche einen Strang von Nukleotiden (16) hat, welcher sich 3' über die mit dem Primer komplexierte Region (11) hinaus erstreckt.
Es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass vielfache Kopien von RNA erhalten werden können.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat der Promotor-Primer eine Modifikation an seinem 3'-Ende, um Extension von diesem Ende aus (entlang der Targetsequenz) zu verhindern oder zu vermindern Verfahren, um solche Modifikationen zu produzieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Es überrascht, dass die Amplifizierung durchgeführt werden kann mit dem derart modifizierten 3'-Ende, und es überrascht ebenfalls, dass die Verwendung einer Mischung von modifiziertem und unmodifiziertem Promotor-Primer eine Amplifizierung von höherer Effizienz ergibt. Beispielsweise wurde für ein Verhältnis von etwa 150 modifizierten Promotor-Primern zu einem unmodifizierten Promotor-Primer ermittelt, dass es die Effizienz und Effektivität der Amplifizierung außerordentlich erhöht. Jedoch wird sich dieses Verhältnis ändern gemäß den Reaktionsbedingungen und den Reagenzien, so wie dem Promotor-Primer und der Targetsequenz.
In noch einem weiteren Aspekt charakterisiert die Erfindung ein Kit, welches einige oder alle Reagenzien, Enzyme und Promotor-Primer umfasst, die notwendig sind, um die Erfindung durchzuführen. Die das Kit umfassenden Artikel können in separaten Gefäßen geliefert werden oder, wo es sachdienlich ist, zusammengemischt werden.
BEISPIELE
VORWORT
Die folgenden Beispiele demonstrieren den Mechanismus und den Nutzwert der vorliegenden Erfindung. Sie sind nicht einschränkend und sollten nicht als solche betrachtet werden.
Die bei den folgenden Beispielen verwendeten Enzyme sind Avian-Myeloblastose-Virus(AMV)-Reverse Transkriptase, T7-RNA-Polymerase, Moloney-Maus-Leukämie-Virus(MMLV)-Reverse Transkriptase und Superscript (RNAse H minus MMLV RT, „MMLV SC RT") von den Bethesda Forschungslaboratorien. Weitere Enzyme mit ähnlichen Aktivitäten und Enzyme von anderen Bezugsquellen können verwendet werden. Andere RNA-Polymerasen mit verschiedenen Promotorspezifitäten können ebenfalls zur Verwendung geeignet sein.
Wenn nicht anders angegeben, waren die bei den folgenden Beispielen verwendeten Bedingungen: 50mM Tris-HCl, pH 7,6, 25 mM KCl, 17,5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidin-Trihydrochlorid, 6,5 mM rATP, 2,5 mM rCTP, 6,5 mM rGTP, 2,5 mM rUTP, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 0,3 μM Promotor-Primer, 600 Einheiten MMLV-Reverse Transkriptase und 400 Einheiten T7 RNA-Polymerase und spezifizierte Mengen an Matrize in 100 μl Volumina. Jedoch werden die optimalen Reaktionsbedingungen variieren gemäß den Erfordernissen einer bestimmten Verwendung und den Gegebenheiten; unter der Voraussetzung der vorliegenden Offenbarung werden solche Bedingungen für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein. Die verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind exemplarisch und nicht einschränkend, da andere Sequenzen für diese und andere Targetsequenzen angewendet worden sind.
BEISPIEL 1
Um die Erfindung unter Verwendung einer Targetsequenz mit einem begrenzten 3'-Ende zu demonstrieren, wurde ein Promotor-Primer (SEQ ID NO. 1), welcher eine Sequenz enthält komplementär zum 3'-Ende der 5S-rRNA von Ureaplasma urealyticum, inkubiert mit RNA in der Gegenwart von T7-RNA-Polymerase und MMLV-Reverse Transkriptase für vier Stunden. Proben der Reaktion wurden entnommen zu bestimmten Zeitpunkten und analysiert durch Hybridisierung mit zwei Sonden der gleichen Leserichtung wie die Target-RNA (SEQ ID NOS. 2, 3) in der Gegenwart von Helfer-Sonden (SEQ ID NOS. 4, 5) wie in Hogan (US-Patent 5.030.557, Means for Enhancing Nucleic Acid Hybridization (Mittel zur Steigerung der Nukleinsäurehybridisierung)) beschrieben.
BEISPIEL 2
Um darzulegen, dass die Erfindung funktioniert mit einer Targetsequenz, welche Nukleotide 3' gelegen zur Promotor-Primer-Bindestelle enthält, wurde ein Promotor-Primer, welcher Sequenzen enthält komplementär zu 21 Basen von Streptococcus pneumoniae-16S-rRNA entsprechend den Basen 683–703 der E. coli-Referenzsequenz (SEQ ID NO. 6), inkubiert mit 1 fmol S. pneumoniae-rRNA in (+)-Leserichtung in der Gegenwart von den folgenden Enzymen. Zehn μl des Reaktionsgemisches wurden untersucht durch mit Acridiniumester markierten Sonden in beiden Leserichtungen (SEQ ID NO. 7), mittels Helfersonden (SEQ ID NOS. 8, 9), oder deren Komplementen. In einem separaten Experiment wurde ein Anteil des Reaktionsgemisches vor der Hybridisierung mit NaOH hydrolysiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Amplifizierung der vorliegenden Erfindung abhängig ist von der Reversen Transkriptase-, T7-RNA-Polymerase- und RNAse H-Aktivität, und dass das überwiegend hergestellte Produkt RNA ist, welche komplementär ist zu der Target-RNA.
BEISPIEL 3
Um zu bestimmen, ob Extension vom 3'-Ende des Promotor-Primers nötig ist zur Amplifizierung, wurde ein Promotor-Primer synthetisiert mit 3'-Modifikationen unter Verwendung von Standard-Chemie, wie beschrieben von Arnold et al. (RS; PCT-US 88/03173) oder Wilk et al. (RP; Abbildung 3 in Nucleic Acids Res. 18:2065, 1990) oder Cordycepin (CO, Glen Research). Die Auswirkung dieser Modifikationen auf die Extension durch reverse Transkriptase wurde in dem folgenden Experiment untersucht. Ein Promotor-Primer mit einer Sequenz, die komplementär ist zu S. pneumoniae-16S rRNA (SEQ ID NO. 6), wurde mit dem Target hybridisiert, dann in der Gegenwart von MMLV RT für 30 Minuten inkubiert. An dem Ende der Extensionsreaktion wurden RNA und cDNA bei 95°C für zwei Minuten denaturiert und durch eine Hybridisierungsschutz-Untersuchung mit einer Sonde der gleichen Leserichtung wie die rRNA (SEQ ID NO. 7) mit den Helfersonden (SEQ ID NOS. 8, 9) untersucht.
Die Ergebnisse zeigten an, dass die 3'-Modifikationen die Extension durch reverse Transkriptase bezogen auf den unmodifizierten Primer änderten.
BEISPIEL 4
Um zu bestimmen, ob Extension vom 3'-Ende nötig ist zur Amplifizierung einer Targetsequenz mit einem begrenzten 3'-Ende, wurde der Promotor-Primer, welcher komplementär ist zu dem 3'-Ende von Ureaplasma urealyticum-5S-rRNA (SEQ ID NO. 1), am 3'-Ende modifiziert mit RS und inkubiert mit 1 fmol der Target-RNA, MMLV-Reverse Transkriptase und T7 RNA-Polymerase. Hybridisierung mit Sonden, wie in Beispiel 1 beschrieben, zeigten an, dass effiziente Extension des Promotor-Primers nicht nötig war zur Amplifizierung. Reverse Transkriptase-Aktivität wurde benötigt, wie durch das Fehlen von Amplifizierung bei dem Reaktionsgemisch, welches nur T7 RNA-Polymerase enthält, gezeigt wird.
BEISPIEL 5
Zur Untersuchung der Auswirkung von 3'-Modifikationen auf die Amplifizierung eines Targets, welches Sequenzen 3' zu der Promotor-Primer-Bindestelle gelegen enthält, wurde ein Promotor-Primer, welcher Sequenzen komplementär zu S. pneumoniae-16S-rRNA (SEQ ID NO. 6) enthält, synthetisiert mit 3' RS-, 3' RP- oder 3' Cordycepin-Modifikation. Die modifizierten und unmodifizierten Promotor-Primer wurden inkubiert mit S. pneumoniae-rRNA, MMLV-Reverse Transkriptase und T7-RNA-Polymerase bei 37°C für 4 Stunden. Zehn μl des Reaktionsgemisches wurden untersucht mit einer Sonde der gleichen Leserichtung wie die Target-RNA.
Überraschenderweise zeigen die Daten, dass mit diesem Amplifizierungsmechanismus Modifikationen am 3'-Ende des Promotor-Primers das beobachtete Signal erhöhten.
BEISPIEL 6
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Kinetiken der Produktakkumulation für Promotor-Primer mit unmodifizierten oder modifizierten 3'-Enden zu demonstrieren. Ein Promotor-Primer, welcher Sequenzen komplementär zu M. tuberculosis-23S-rRNA enthält, wurde inkubiert mit 1 fmol M. tuberculosis-rRNA in der Gegenwart von MMLV-RT und T7-RNA-Polymerase. Zu den angezeigten Zeitpunkten wurden Proben entnommen und untersucht mit einer Acridiniumester-markierten Sonde von der gleichen Leserichtung wie die Target-RNA. Hintergrund-RLU von Target-freien Reaktionen wurden von den Daten subtrahiert.
Die Daten zeigen, dass die unmodifizierten und 3'-RS-modifizierten Promotor-Primer das Produkt auf lineare Weise akkumulieren, während der 3'-RP-Promotor-Primer das Produkt auf mehr exponentielle Weise zu akkumulieren scheint. Dieses Ergebnis war ebenfalls unerwartet und lässt auf einen einzigartigen Amplifizierungsmechanismus schließen, welcher bei im Wesentlichen konstanten Werten für Temperatur, pH und Ionenstärke auftritt.
BEISPIEL 7
Bei diesem Beispiel wurden verschiedene Promotor-Primer inkubiert mit S. pneumoniae-rRNA für 4 Stunden in der Gegenwart von 600 Einheiten AMV-Reverse Transkriptase und 400 Einheiten T7-RNA-Polymerase. Zehn μl der Probe wurden untersucht mit einer Acridiniumester-markierten Sonde der gleichen Leserichtung wie die Target-RNA.
Die Daten zeigen, dass die 3'-modifizierten Promotor-Primer höhere Signale erzielen als die unmodifizierte Version mit AMV-Reverse Transkriptase.
BEISPIEL 8
Das folgende Experiment demonstriert, dass Zusätze (DMSO und Glyzerin) die Effektivität (Empfindlichkeit) des Amplifizierungssystems erhöhen. Modifizierte oder unmodifizierte Promotor-Primer (SEQ ID NO. 6) wurden zu S. pneumoniae-rRNA zugesetzt in der Gegenwart von MMLV-Reverse Transkriptase und T7-RNA-Polymerase und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Zehn μl des Reaktionsgemisches wurden untersucht mit Acridiniumester-markierter Sonde der gleichen Leserichtung wie die Target-RNA, und negative Werte wurden subtrahiert.
Die Daten zeigen, dass die Zusätze einen nur geringen Effekt auf die Ergebnisse mit dem unmodifizierten Promotor-Primer hatten, aber die Signale signifikant erhöhten mit den 3'-modifizieren Promotor-Primern, mit dem am stärksten ausgeprägten Effekt bei der 3'-RP-Version.
BEISPIEL 9
Bei diesem Experiment wurden Promotor-Primer mit einer Sequenz komplementär zu der 235-rRNA von M. tuberculosis (SEQ ID NO. 10) synthetisiert mit einem (ribo) oder zwei (diribo) 3'-terminalen Desoxycytidinen ersetzt durch einen oder zwei 3'-Ribocytidin-Resten oder durch ein 3'-terminales Phosphorothioat(PS)-Desoxynukleotid. Diese modifizierten Promotor-Primer wurden verwendet um M. tuberculosis-rRNA zu amplifizieren in 50 mM TrisHCl, pH 8, 20 mM MgCl₂, 35 mM KCl, 4 mM jeweils von GTP, ATP, UTP, CTP und 1 mM jeweils von dTTP, dGTP, dCTP, dATP, 15 mM N-Acetylcystein, 10% Glyzerin, 10% DMSO, 600 Einheiten MMLV-Reverse Transkriptase und 400 Einheiten T7-RNA-Polymerase, bei 42°C für 4 Stunden. Fünf μl von jedem Reaktionsansatz wurden erhitzt auf 95°C für 2 Minuten und untersucht mit einer Sonde der gleichen Leserichtung wie das rRNA-Target (SEQ ID NO. 11) mit Helfer-Sonden (SEQ ID NOS. 12 und 13).
Die Ergebnisse zeigten, dass Promotor-Primer mit einem oder zwei Ribonukleotiden am 3'-Ende oder mit einer 3'-Phosphorothioat-Verknüpfung eine bessere Amplifizierung in diesem System ergeben als unmodifizierte Promotor-Primer.
BEISPIEL 10
Ein weiteres Verfahren zur Änderung der Extension vom Promotor-Primer durch reverse Transkriptase bestand darin, unmodifizierten Promotor-Primer mit blockiertem Cordycepin-modifiziertem Promotor-Primer zu mischen. Die Verwendung einer Mischung von Promotor-Primern würde die Produktion von cDNA, welche bei einer reversen Transkriptionsreaktion beobachtet wird, signifikant erniedrigen, so wie für andere 3'-Modifikationen beobachtet. Das folgende Experiment verwendete Promotor-Primer mit einer Sequenz komplementär zu M. tuberculosis-16S-rRNA (SEQ ID NO. 14), entweder modifiziert mit Cordycepin oder unmodifiziert. Die Promotor-Primer wurden inkubiert mit 3 tmol M. tuberculosis-rRNA, 300 Einheiten MMLV-Reverse Transkriptase und 200 Einheiten T7-RNA-Polymerase unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie bei Beispiel 9, außer dass 10 mM Trimethylammoniumchlorid vorhanden war. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 42°C wurden zwanzig μl des Reaktionsansatzes untersucht mit einer Sonde der gleichen Leserichtung wie die Target-RNA (SEQ ID NO. 15, mit Helfern SEQ ID NOS. 16, 17). Die Ergebnisse sind die Durchschnittwerte von 5 Wiederholungen.
Wie gesehen werden kann, wirkte eine Mischung von modifiziertem und unmodifiziertem Promotor-Primer besser als vollständig modifizierter Promotor-Primer. Veränderung des Verhältnisses (z.B. zwischen 1:1 bis 150:1) von modifiziertem zu unmodifiziertem Promotor-Primer erhöhte wirkungsvoll die Effizienz der Amplifizierung. Das optimale Verhältnis wird sich gemäß den Reaktionsbedingungen ändern, einschließlich den verwendeten Reagenzien, der Targetsequenz und dem Promotor-Primer. Die Auswahl angemessener Bedingungen für eine bestimmte Amplifizierung liegt innerhalb des Fachkönnens von einem Fachmann auf diesem Gebiet ohne unzumutbares Experimentieren.
Bei einem separaten Experiment wurden die erhaltenen Signale von der Amplifizierung verglichen mit bekannten Standards und der Grad der Amplifizierung als 2,6 × 10⁵-fach berechnet.
BEISPIEL 11
Bei diesem Beispiel wurden Reaktionen ausgeführt wie in Beispiel 10, außer dass die Promotor-Primer unmodifiziert waren oder modifiziert mit RP oder CO. Dreißig tmol Target wurde jedem Reaktionsansatz zugesetzt. Wie gezeigt ergibt eine Mischung von Promotor-Primern mit verschiedenen 3'-Modifikationen eine signifikante Amplifizierung.
Es wurde gezeigt, dass die erzeugte Menge nicht-spezifischen Produktes viel niedriger ist mit den modifizierten Primern, was auf einen anderen Vorteil der Erfindung hinweist.
BEISPIEL 12
Die Erhöhung der Anzahl komplementärer Kopien der Targetsequenz mit der Zeit erfordert reverse Transkriptase und T7-RNA-Polymerase. Wenn der Promotor-Primer an das 3'-Ende eines Targets hybridisiert, ergibt das Kopieren der T7-Promotorsequenz einen doppelsträngigen DNA-Promotor, welcher durch T7-RNA-Polymerase erkannt und zur Anfertigung von RNA-Kopien der Targetsequenz verwendet werden kann. Die Ergebnisse mit den 3'-modifizierten Promotor-Primern ließen darauf schließen, dass die T7-RNA-Polymerase RNA als eine Matrize für RNA-Synthese benutzte. Synthetische Oligonukleotide wurden hergestellt, um diese Hypothese zu prüfen. Das erste Oligonukleotid war ein DNA-Promotor-Primer, welcher eine 5'-T7-Promotor-Sequenz enthält, verknüpft mit einer 3'-Target-Bindesequenz. Ein anderes Oligonukleotid, welches nur die Promotorsequenz enthält, wurde ebenfalls synthetisiert. Die Targetsequenz bestand aus einem chimären RNA-DNA-Molekül, welches eine synthetische 5'-RNA-Targetsequenz enthält mit dem DNA-Komplement der T7-Promotorsequenz angefügt an das 3'-Ende.
Bei diesem Experiment wurden 10 oder 1 fmol des chimären RNA-DNA-Targets hybridisiert mit dem Promotor-Primer, welcher den T7-Promotor und eine Target-Bindesequenz enthält, oder mit der Promotorsequenz allein, wobei der RNA-Targetstrang einzelsträngig bleibt. Die Hybride wurden inkubiert mit oder ohne T7-RNA-Polymerase und die Produkte wurden hybridisiert mit einer Sonde der gleichen Leserichtung wie die RNA-Targetsequenz.
Überraschenderweise zeigen die Daten, dass ein RNA-Fragment verwendet werden kann durch T7-RNA-Polymerase als eine Matrize für RNA-Transkription.
BEISPIEL 13
Das folgende Experiment zeigte, dass ein RNA-Strang verwendet werden kann, um RNA in der Gegenwart von reverser Transkriptase und T7-RNA-Polymerase zu synthetisieren. Bei diesem Experiment wurde das chimäre RNA-DNA-Target verglichen mit einem synthetischen RNA-Fragment, welches nur die Targetsequenz enthält.
Die vorliegenden Ausführungsformen dieser Erfindung gelten in jeder Hinsicht als erläuternd und nicht als einschränkend, wobei der Schutzbereich der Erfindung durch die angefügten Ansprüche angezeigt wird, mehr als durch die vorangehende Beschreibung, und alle Änderungen, welche innerhalb der Bedeutung und des Äquivalenzbereiches der Ansprüche liegen, sind deshalb vorgesehen, darunter zu fallen.

Claims

Ein Verfahren zur Amplifizierung einer einzelsträngigen Target-Ribonukleinsäuresequenz umfassend: (a) Inkubation der Target-Ribonukleinsäuresequenz mit einer oder mehreren Promotor-Primer-Nukleinsäuresequenzen umfassend eine Promotorsequenz, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann, und eine Primer-Sequenz, die komplementär ist zu der Target-Ribonukleinsäuresequenz, wobei die Primer-Sequenz ausreichend komplementär ist, um mit der Target-Nukleinsäuresequenz einen Komplex zu bilden nur an oder nahe dem 3'-Ende der Target-Ribonukleinsäuresequenz, einer DNA-Polymerase, und der RNA-Polymerase, bei einer Temperatur und in einer Lösung, die wirksam ist, Amplifizierung der Target-Ribonukleinsäuresequenz zu ermöglichen; und (b) Produktion mehrfacher Kopien einer RNA-Sequenz, die komplementär sind zur Target-Ribonukleinsäuresequenz.
Ein Verfahren zur Amplifizierung einer einzelsträngigen Target-Ribonukleinsäuresequenz, bestehend aus: (a) Inkubation der Target-Ribonukleinsäuresequenz mit einer oder mehreren Promotor-Primer-Nukleinsäuresequenzen umfassend eine Promotorsequenz, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann, und eine Primer-Sequenz, die komplementär ist zu der Target-Ribonukleinsäuresequenz, wobei die Primer-Sequenz ausreichend komplementär ist, um mit der Target-Nukleinsäuresequenz einen Komplex nur an oder nahe dem 3'-Ende der Target-Ribonukleinsäuresequenz zu bilden, einer DNA-Polymerase, und der RNA-Polymerase, bei einer Temperatur und in einer Lösung, die wirksam ist, Amplifizierung der Target-Ribonukleinsäuresequenz zu ermöglichen; und (b) Produktion mehrfacher Kopien einer RNA-Sequenz, die komplementär sind zur Target-Ribonukleinsäuresequenz.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei ein oder mehrere Promotor-Primer mindestens einen unmodifizierten Promotor-Primer umfassen, der von der DNA-Polymerase verlängert werden kann, um ein Komplement zu der Target-Ribonukleinsäure zu bilden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens einer des einen Promotor-Primers oder der mehreren Promotor-Primer ein modifizierter Promotor-Primer ist, der ein modifiziertes Nukleotid an seinen 3'-Ende umfasst, um eine davon ausgehende Nukleinsäureextensions-Reaktion zu verhindern oder zu vermindern.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein oder mehrere Promotor-Primer einen oder mehrere modifizierte Promotor-Primer, welche ein modifiziertes Nukleotid an seinem 3'-Ende umfassen, um eine davon ausgehende Nukleinsäureextensions-Reaktion zu verhindern oder zu vermindern, und einen oder mehrere unmodifizierte Promotor-Primer umfassen, in einem Verhältnis zueinander, das wirksam ist Amplifizierung zu bewirken.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei ein oder mehrere Promotor-Primer einen oder mehrere modifizierte Promotor-Primer und einen oder mehrere unmodifizierte Promotor-Primer in einem Verhältnis von zwischen jeweils etwa 150:1 und 1:1 umfassen.
Das Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei ein oder mehrere modifizierte Promotor-Primer modifiziert wurden durch die Addition von einem oder mehreren Ribonukleotiden, 3'-terminalem Phosphorothioat-Desoxyribonukleotid, 3'-RS (nicht-nukleotidische Verknüpfung), einem 3'-Alkandiol-Rest oder 3'-Cordycepin.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches weiterhin die Bereitstellung eines Agens umfasst, um eine Begrenzung am 5'-Ende der Target-Ribonukleinsäuresequenz zu schaffen, so dass eine Extensionsreaktion, welche die Target-Ribonukleinsäure einschließt, an der Begrenzung endet.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Agens eine begrenzende Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausreichend komplementär ist zum 5'-Ende der Target-Ribonukleinsäuresequeuz, um mit dem 5'-Ende der Target-Ribonukleinsäuresequenz bei dieser Temperatur und in dieser Lösung komplexieren zu können.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide bereitgestellt werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz Nukleotide an ihrem 3'-Ende umfasst, die nicht innerhalb des Komplexes sind, der zwischen der Target-Ribonukleinsäuresequenz und einem oder mehreren Promotor-Primern gebildet wird.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das 3'-Ende der Target-Ribonukleinsäuresequenz durch chemische oder enzymatische Degradation oder Weiterverarbeitung erzeugt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die chemische oder enzymatische Degradation oder Weiterverarbeitung die Behandlung mit einer Exonuklease umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Amplifizierungsmischung weiterhin RNase H-Aktivität umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die reverse Transkriptase AMV-Reverse Transkriptase ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die reverse Transkriptase MMLV-Reverse Transkriptase ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Inkubation bei im Wesentlichen konstanter Temperatur erfolgt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 18, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz und einer oder mehrere Promotor-Primer zusammen inkubiert werden vor der Zugabe der DNA-Polymerase und der RNA-Polymerase.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die RNA-Polymerase eine DNA-abhängige RNA-Polymerase ist.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei die DNA-abhängige RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus T7-RNA-Polymerase, T3-RNA-Polymerase und SP6-RNA-Polymerase besteht.
Ein Verfahren zur Amplifizierung einer Target-Ribonukleinsäuresequenz, wobei die Sequenz amplifiziert wird in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 21 und die mehrfachen Kopien detektiert werden unter Verwendung einer Nukleinsäurehybridisierungssonde.
Ein Kit umfassend: (a) Promotor-Primer-Nukleinsäuresequenzen umfassend eine Promotorsequenz, welche durch eine RNA-Polymerase erkannt werden kann, und eine Primersequenz, welche relativ zu der Promotorsequenz 3' lokalisiert ist, wobei die Primersequenz nur an oder nahe dem 3'-Ende einer einzelsträngigen Target-Ribonukleinsäuresequenz komplexieren kann, wobei die Promotor-Primer einen oder mehrere Promotor-Primer, welche modifiziert sind wie in Anspruch 4 definiert, und einen oder mehrere unmodifizierte Promotor-Primer umfassen in einem Verhältnis, das wirksam ist um Amplifizierung zu bewirken (b) eine DNA-Polymerase, und (c) RNA-Polymerase.
Das Kit nach Anspruch 23, wobei die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase ist.
Das Kit nach Anspruch 23 oder Anspruch 24 weiterhin umfassend ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide.
Das Kit nach Anspruch 23, 24 oder 25 weiterhin umfassend eine Sonde geeignet für eine Nukleinsäurehybridisierungsuntersuchung
Das Kit nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die reverse Transkriptase AMV-Reverse Transkriptase oder MMLV-Reverse Transkriptase ist.
Das Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die RNA-Polymerase eine DNA-abhängige RNA-Polymesse vom Bakteriophagen T7, T3 oder SP6 ist.
Das Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 28, wobei ein oder mehrere modifizierte Promotor-Primer ein 3'-terminales Phosphorothioat-Desoxynukleotid, 3'-RS (nicht-nukleotidische Verknüpfung), einen 3'-Alkandiol-Rest oder 3'-Cordycepin umfassen.
Das Kit nach Anspruch 29, wobei ein oder mehrere modifizierte Promotor-Primer 3'-Alkandiole sind.
Das Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 30, wobei modifizierte und unmodifizierte Promotor-Primer in einem Verhältnis von jeweils etwa 1:1. bis 150:1 vorliegen.
Ein Kit umfassend: eine Vielzahl an Promotor-Primern, von denen jeder eine von einer RNA-Polymerase erkennbare Promotorsequenz und eine Primersequenz, die relativ zu der Promotorsequenz 3' lokalisiert ist, umfasst, und die Primersequenz nur an oder nahe dem 3'-Ende einer einzelsträngigen Target-Ribonukleinsäuresequenz komplexieren kann, und wobei mindestens einer der Promotor-Primer ein erster modifizierter Promotor-Primer ist und einer ein zweiter modifizierter Promotor-Primer ist, wobei jeder der ersten und zweiten modifizierten Promotor-Primer ein modifiziertes Nukleotid am 3'-Ende umfasst, um eine davon ausgehende Nukleinsäureextensionsreaktion zu verhindern oder zu vermindern, unter Bedingungen, die wirksam sind, um Amplifizierung des Targets zu ermöglichen, und das modifizierte Nukleotid im ersten und im zweiten Promotor-Primer verschieden ist.
Eine Nukleinsäure bestehend im Wesentlichen aus einer Sequenz gewählt aus SEQ ID NOS. 6, 10 und 14 bis 17, oder im Falle der SEQ ID NOS 15, 16 und 17, einer dazu komplementären Sequenz.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 33 bestehend aus der SEQ ID NO. 6.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 33 bestehend aus der SEQ ID NO. 10.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 33 bestehend aus der SEQ ID NO. 14.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 33 bestehend aus der SEQ ID NO. 15 oder einer dazu komplementären Sequenz.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 33 bestehend aus der SEQ ID NO. 16 oder einer dazu komplementären Sequenz.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 33 bestehend aus der SEQ ID NO. 17 oder einer dazu komplementären Sequenz.
Ein Kit umfassend Nukleinsäuren bestehend aus SEQ ID NOS. 6 bis 9.
Ein Kit umfassend Nukleinsäuren bestehend aus SEQ ID NOS. 10 bis 13.
Ein Kit umfassend Nukleinsäuren bestehend aus SEQ ID NOS. 14 bis 17.