DE69432300T2

DE69432300T2 - Biologische klebstoffzusammensetzung und verfahren zum fördern der haftung zwischen flächengewebe

Info

Publication number: DE69432300T2
Application number: DE69432300T
Authority: DE
Inventors: Dr. Kay JUERGENSEN; Daniel Aeschlimann; B. Ernst HUNZIKER
Original assignee: Orthogene Inc
Current assignee: Orthogene Inc
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2014-06-04
Also published as: ATE234643T1; AU8305598A; AU7051194A; EP0702572A1; ES2194869T3; US5549904A; US5736132A; JP3483255B2; WO1994028949A1; DE69432300D1; CA2163250A1; TW404836B; EP0702572B1; JPH08510943A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von biologischen Klebstoffen bei Operationen. Es gibt im Rahmen der unterschiedlichen operativen Besonderheiten zahlreiche Situationen, bei denen die Anwendung eines biologischen Klebstoffs vorteilhaft wäre. Ein biologischer Klebstoff kann verwendet werden, um bei allgemeinen Operationen Blutungen zu verhindern, um in der Neurochirurgie Nervenrupturen zu rekonstruieren, um in der plastischen Chirurgie Haut- und Knorpel-Transplantate und Defekte anzuhaften, in der allgemeinen oder Thorax-Chirurgie Pneumothorax und/oder Fisteln zu behandeln, in der vaskulären und allgemeinen Chirurgie vaskuläre und intestinale Verbindungen zu unterstützen, etc.
Bei orthopädischen Operationen beinhalten mögliche Verwendungen eines biologischen Klebstoffs die Behandlung von Knorpel- und Knochenfrakturen, die Transplantation von Knorpel- oder Knochen-Materialien, die Behandlung von Osteochondrosis dissecans, Gelenkfrakturen, Meniskus-Verletzungen sowie gerissenen Bändern, Sehnen, Muskel-Sehnen-Verbindungen oder Muskeln. Darüber hinaus die Polymerisation und Adhäsion von Biomatrix-Implantaten, die zusammengesetzt sind aus z. B. Kollagen, Gelatine, Fibrinogen, Fibrin oder auch Makromolekülen, die keine Gewebe-Transglutaminase-Substrate sind, wie Polyacetate etc. und die möglicherweise verschiedene Zusätze, wie Zell-Anheftungsproteine, Wachstumsfaktoren, Zellen etc. enthalten, um bei Gewebeschäden den Heilungsprozess zu verstärken und zu stimulieren. Diese letztere Anwendung der neuen biologischen Klebstoffe ist von besonderer Bedeutung.
Diese Erfindung betrifft eine formulierte biologische Klebstoffzusammensetzung, das Verfahren zu deren Herstellung und Anwendung. Die Klebstoffzusammensetzung begründet sich auf einer besonderen Art der Verwendung von Gewebe-Transglutaminase (tTG = Transglutaminase II = Transglutaminase Typ C) in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Der Nutzen der Erfindung wurde durch biomechanisches Testen der Haftfähigkeit zwischen Bindegewebsoberflächen belegt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Knorpel bedeckt alle mit Gelenken versehenen Oberflächen und stattet aufgrund seiner Struktur ein Gelenk mit nahezu reibungsloser Bewegung aus. Der Reibungskoeffizient, definiert als μ = Reibungskraft (F) pro aufgebrachte Last (W), beträgt für Gelenkknorpel in einem echten Gelenk (menschliches Knie) 0,005-0,02. Als ein Vergleich liegt der Reibungskoeffizient für Eis auf Eis etwa 5-mal höher (0,01-0,1), Mow, V. C., A. Ratcliffe and A. R. Poole "CARTILAGE AND DIATHRODIAL JOINTS AS PARADIGMS FOR HIERARCHICAL MATERIALS AND STRUCTURES" Biomaterials, 13(2): 67-97 (1992).
Die Matrix des Gelenkknorpels besteht aus 60-80 % Wasser (und gelösten Ionen und Gasen), in Bezug auf das Nassgewicht von Gelenkknorpel, und aus 20-40 % strukturellen Molekülen, wie Kollagen, Proteoglycanen, Glycosaminoglycanen und Glycoproteinen. Chondrocyten, die spezialisierten Zellen im Gelenkknorpel, sind in diese Matrix eingebettet und besetzen nur etwa 10 % des Volumens, und der Gelenkknorpel enthält weder Nerven, noch lymphatische Gefäße, noch Blutgefäße, Buckwalter, J. A., L. C. Rosenberg and E. B. Hunziker, "ARTICULAR CARTILAGE: COMPOSITION, STRUCTURE, RESPONSE TO INJURY, AND METHODS OF FACILITATING REPAIR", neu aufgelegt in ARTICULAR CARTILAGE AND KNEE JOINT FUNCTION: BASIC SCIENCE AND ARTHROSCOPY New York, Rauen Press (1990) und Hunziker, E. B. "STRUKTURMOLEKÜLE DES KNORPELGEWEBES, DER SEHNEN UND BÄNDER, Kniegelenk und Kreuzbänder, Berlin, Springer (1990).
Es können zwei Typen von Knorpelschäden unterschieden werden. Als erstes der Knorpel- oder Oberflächen-Schaden; dieser weitet sich nicht auf den subchondrialen Knochen aus oder beschädigt diesen. Der subchondriale Knochen ist innerviert, enthält Blutgefäße und verbindet den Knorpel mit dem Knochen und dem Knochenmark. Oberflächliche Knorpelschäden, die sich nicht auf den subchondrialen Knochen ausweiten (d. h. partielle Schädigungen des Vollknorpels), können als ein linearer Bruch-Typ, eine sternförmige Fraktur, ein glatter Typ, ein fibrillärer Typ auftreten, Bauer, M. and R. W. Jackson "CHONDRAL LESIONS OF THE FEMORAL CONDYLES: A SYSTEM OF ARTHROSCOPIC CLASSIFICATION" Arthroscopy, 4(2):97-102 (1988). Knorpelschädigungen sind häufig von traumatischem Ursprung, treten aber auch ohne eine offensichtliche Ursache auf. Aufgrund des Mangels an Versorgung mit Nerven, verursachen sie gewöhnlich keine Schmerzen. Falls Symptome auftreten, werden sie als verzögerte Schwellung des Synoviums (die innere Seite der Gelenkkapsel) nachgewiesen, mit einer periodischen Blockade als ein Ergebnis eines knorpeligen Fragments, oder als periodisch auftretende Ergüsse und Reibungsgeräusche, Scott, W. N. und J. N. Insall "INJURIES OF THE KNEE", neu aufgelegt in ROCKWOOD AND GREEN'S FRACTURES IN ADULTS, Philadelphia, J. B. Lippincott Company (1991). Solche Schäden sind notorisch, da sie nicht heilen, keine Neigung für Reparaturreaktionen zeigen und sie viele Gemeinsamkeiten mit den frühen Stadien von degenerativen Gelenkserkrankungen haben, wie Osteoarthritis. Als zweites der vollständige Vollknorpeldefekt; dieser weitet sich bis hin zum subchondrialen Knochen aus, der Nerven und Blutgefäße enthält.
Er resultiert zum Beispiel aufgrund starker Verletzungen als ein Sprengtrichter- oder Abbau-Typ (Bauer et al., vorstehend), oder tritt in späten Stadien degenerativer Gelenkserkrankungen auf, wie Osteoarthritis. Ein Symptom sind häufig starke Schmerzen. Blutungen und Reparatur-Reaktionen können auftreten, die in einem vaskularisiertn fibrösen Knorpeltyp resultieren, was jedoch nicht ausreichend ist, um die Gelenkfunktion zu unterstützen. Ein solches Reparaturgewebe bleibt sehr selten bestehen (Buckwalter et al., vorstehend).
Gegenwärtig werden noch immer verschiedene Versuche gemacht, um die Knorpelreparatur bei chondrialen und subchondrialen Schäden zu erleichtern. Ein Ansatz ist durch chondriale Schäden hindurch in den subchondrialen Knochen zu bohren, was eine Blutung induziert, Pridie, K. H. "A METHOD OF RESURFACING OSTEOARTHRITIC KNEE JOINTS" J Bone Joint Surg (Br) 41-B: 618-619 (1959). Durch das Bluten werden Reparatur-Reaktionen induziert und ein fibröser Knorpel (Faserknorpel) wird gebildet, doch dieses Gewebe zeigt unzulängliche biomechanische Eigenschaften und ermangelt einer Langzeit-Persistenz, Mitchell, N. and N. Shepard "THE RESURFACING OF ADULT RABBIT ARTICULAR CARTILAGE BY MULTIPLE PERFORATIONS THROUGH THE SUBCHONDRAL BONE" J Bone and Joint Surg 58-A: 230-233 (1976). Ein Wiederherstellen von Gelenkknorpel-Schäden mit periostalen und perichondrialen Transplantaten wurde ausgewertet, Coutts, R. D., S. L. Y. Woo, D. Amiel, H. P. Von Schroeder and M. K. Kwan "RIB PERICHONDRIAL AUTOGRAFTS IN FULL-THICKNESS ARTICULAR CARTILAGE DEFECTS IN RABBITS" Clin Orthop 263-273 (1992); Homminga, G. N., S. K. Bulstra, P. S. M. Bouwmeester and A. J. Van Der Linden "PERICHONDRAL GRAFTING FOR CARTILAGE LESIONS OF THE KNEE" J Bone Joint Surg (Br) 72-B(6): 1003-7 (1990); Homminga, G. N., T. J. van der Linden, E. A. W. Terwindt-Rouwenhorst and J. Drukker, "REPAIR OF ARTICULAR DEFECTS BY PERICHONDRIAL GRAFTS: EXPERIMENTS IN THE RABBIT" Acta Orthop Scand 69(3): 326-329 (1989) und O'Driscoll, S. W., F. W. Keeley and R. B. Salter "DURABILITY OF REGENERATED ARTICULAR CARTILAGE PRODUCED BY FREE AUTOGENOUS PERIOSTEAL GRAFTS IN MAJOR FULL-THICKNESS DEFECTS IN JOINT SURFALES UNDER THE INFLUENCE OF CONTINUOUS PASSIVE MOTION" J Bone and Joint Surg 70-A(4): 595-606 (1988). Die Knorpelhaut und die äußere Knochenhaut sind dünne Bindegewebsschichten, die den fibrösen Knorpel bzw. den Knochen bedecken. Die meisten Forscher nähen die Knorpelhaut oder Knochenhaut in einen subchondrialen Schaden hinein, wodurch zusätzliche Knorpelschädigungen erzeugt werden. Andere erhielten gute Ergebnisse, indem sie die Knorpelhaut auf Knorpelschäden von Kaninchen-Kniegelenken aufklebten, wobei ein handelsüblicher Fibrin-Kleber (Tissucoll) verwendet wurde, Homminga, G. N., T. J. van der Linden, E. A. W. Terwindt-Rouwenhorst and J. Drukker, "REPAIR OF ARTICULAR DEFECTS BY PERICHONDRIAL GRAFTS" Acta Orthop Scand 60(3): 326-329 (1989), ein Ansatz, der jedoch einer 2-wöchigen Immobilisation des Gelenks bedurfte. Eine Gelenk-Immobilisation wurde aufgrund der geringen Resistenz des Klebstoffs gegen Scherkräfte auch empfohlen, wenn ein Fibrin-Klebstoff für die Fixierung knorpeliger oder knöcheriger Fragmente verwendet wurde, Claes, L., C. Burri, G. Helbing und E. Lehner "BIOMECHANISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR FESTIGKEIT VERSCHIEDENER KNORPELKLEBUNGEN" Helv Chir Acta 48: 11-13 (1981). Ein hauptsächliches Argument gegen die Verwendung von Fibrin-Klebstoff ist die mögliche Übertragung menschlicher pathogener Viren, z. B. humanes Immundeffizienz-Virus (HIV) und Hepatitis B-Virus. Aus diesem Grund sind Fibrin-Klebstoffe, die aus ungereinigten Fraktionen menschlicher Blutplasma-Proteine zusammengesetzt sind, in den Vereinigten Staaten nicht zur Verwendung erlaubt.
Das Entfernen von fibrilliertem oder unregelmäßigem Knorpel (Abrasieren) wurde als ein therapeutischer Ansatz bewertet, es ist jedoch gezeigt worden, dass der abrasierte Gelenkknorpel des menschlichen Kniegelenks sich nicht regeneriert und sogar eine Zunahme der Fibrillierung und Zellnekrose verursachen kann, Schmid, A. und F. Schmid "RESULTS AFTER CARTILAGE SHAVING STUDIED BY ELECTRN MICROSCOPY" Am J Sports Med 15(4): 386-387 (1987). Das Abrasieren des Kniescheiben-Knorpels in Kaninchen führt nicht zu einer signifikanten Reparatur, Mitchell, N. und N. Shepard "EFFECT OF PATELLAR SHAVING IN THE RABBIT" J Orthop Res 5: 388-392 (1987).
Die Verwendung gezüchteter fötaler Chondrocyten, die in eine Biomatrix eingebettet sind, die Fibrinogen, Thrombin und zusätzliche Bestandteile enthält, Itay, S., A. Abramovici and Z. Nevo "USE OF CULTURED EMBRYONAL CHICK EPIPHYSEAL CHONDROCYTES AS GRAFTS FOR DEFECTS IN CHICK ARTICULAR CARTILAGE" Clin Orthop 220: 284-303 (1987), oder von Knochenmark-abstammenden mesenchymalen Stammzellen, Pineda, S. J., T. Goto, V. M. Goldberg and A. I. Caplan "OSTEOCHONDRAL PROGENITOR CELLS ENHANCE REPAIR OF LARGE DEFECTS IN RABBIT ARTICULAR CARTILAGE" Trans Orthop Res Soc 17(2): 598 (1992) als Transplantate ist in Hühnern erfolgreich verwendet worden und induzierte eine vollständige Reparatur des Vollknorpels. Es ist nicht bekannt ob eine erfolgreiche Transplantation von Chondrocyten in oberflächliche Schäden in Säugern oder Menschen durchgeführt worden ist. Die mechanische Fixierung (d. h. lokale Immobilisierung) von Transplantaten bleibt bei diesem Ansatz ein Problem.
Die gegenwärtige Behandlung von Knorpel-Frakturen wird häufig durch das Ausbleiben der spontanen Anheftung des Gewebes behindert. Die Stabilisation von Fragmenten mit Schrauben oder Kirschner-Draht erfordert wiederholte operative Eingriffe, die in zusätzlicher Verletzung und Zerstörung resultieren, und trotzdem wird eine stabile Fixierung häufig nicht erreicht. Knorpel-Frakturen müssen sehr genau entfernt werden (beste geometrische Annäherung), sonst heilen die Frakturen durch Bildung von Faserknorpel mit ungenügenden biomechanischen Eigenschaften, Mitchell, N. and N. Shepard "HEALING OF ARTICULAR CARTILAGE IN INTRA-ARTICULAR FRACTURES IN RABBITS" J Bone and Joint Surg 62-A: 628-634 (1990).
Osteochondrosis dissecans ist eine aus Knochen und Knorpel bestehende Läsion mit einer unbekannten, wahrscheinlich multifaktoriellen, Ethiologie. Die meisten Patienten mit einem lockeren Fragment aus Knochen und Knorpel im Gelenk müssen sich einer Operation unterziehen, da es sich zeigte, dass die nicht operative Behandlung die degenerative Arthritis beschleunigt, Federico, D. J., K. Lynch and P. Jokl "OSTEOCHONDRITIS DISSECANS OF THE KNEE: A HISTORICAL REVIEW OF ETIOLOGY AND TREATMENT" Arthroscopy 6(3): 190-197 (1990). Die Möglichkeiten zur Fixierung von Fragmenten aus Knochen und Knorpel beinhalten die Verwendung von Kompressionsschrauben, Kirschner-Drähten oder eines Kompressions-Drahtfixierungs-Systems (hakenförmige Drähte, Ankerschrauben und Bolzen), Jakob, R. P. "THE TREATMENT OF OSTEOCHONDRITIS DISSECANS OF THE KNEE JOINT USING A NEW COMPRESSION WIRE SYSTEM" Z Unfallchir Versicherungsmed. 83(2): 104-110 (1990); Scott, D. J. and C. A. Stevenson "OSTEOCHONDRITIS DISSECANS OF THE KNEE IN ADULTS" Clin Orthop 76: 82-86 (1990) and Smilie, I. "OSTEOCHONDRITIS DISSECANS", London, Livingston (1960). In den meisten Fällen ist eine zweite Operation erforderlich, um das Metall zu entfernen. Der Nutzen biologischer Klebstoffe bei der Behandlung von Osteochondrosis dissecans wurde bisher nicht bewertet.
Der menschliche Meniskus ist eine diskoidale oder halbmondförmige Scheibe aus Knorpel (hauptsächlich bestehend aus umlaufend orientierten Kollagenfasern). Er befindet sich zwischen den Gelenk-Oberflächen, verbessert die Gelenk- Kongruenz und verringert punktuellen Kontakt, wie z. B. im Kniegelenk (Scott, W. N. and J. N. Insall, "INJURIES OF THE KNEE", neu aufgelegt in ROCKWOOD AND GREEN'S FRACTURES IN ADULTS, Philadelphia, J. B. Lippincott Company (1991). Der zentrale und innere Teil des Meniskus besteht aus einem keine Gefäße, keine Nerven und kein lymphatisches Gewebe enthaltenden Faserknorpel, Arnoczky, S. P. and R. F. Warren "MICROVASCULATURE OF THE HUMAN MENISCUS" Am J Sports Med 10(2): 90-95 (1982). Nur den Meniskus betreffende Risse, die in der vaskulären Peripherie auftreten und die 3 cm lang oder kürzer sind, sprechen auf ein mechanisches Zunähen an. Bei anderen Typen von den Meniskus betreffenden Rissen werden die inneren Teile des Meniskus im Allgemeinen ausgeschnitten, eine Behandlung, die in den meisten Fällen zu einer degenerativen Gelenkserkrankung führt, (Scott, W. N. and J. N. Insall "INJURIES OF THE KNEE" neu aufgelegt in ROCKWOOD AND GREEN'S FRACTURES IN ADULTS Philadelphia, J. B. Lippincott Company (1992)). Ein Verfahren zur Reparatur aller Arten von den Meniskus betreffenden Rissen durch die Verwendung eines wirkungsvollen biologischen Klebstoffes würde von großem klinischen Wert sein. Dieser würde die hohe Frequenz an postoperativer degenerativer Gelenkserkrankung vermindern oder sogar verhindern.
Eine Vielzahl von Substanzen sind dafür bekannt, das Potential zu besitzen, die Knorpelbildung zu stimulieren. Zum Beispiel kann ein Kollagenschwamm-Implantat die Knorpel-Reparatur verbessern, Speer, D. P., M. Chvapil, R. G. Volz and M. D. Holmes "ENHANCEMENT OF HEALING IN OSTEOCHONDRAL DEFECTS BY COLLAGEN SPONGE IMPLANTS" Clin Orthop 144: 326-335 (1997). Eine Vielzahl von Proteinen kann die Knorpelbildung verstärken, wie der transformierende Wachstumsfaktor beta, Seyedin, S. M., A. Y. Thompson and H. Bentz "CARTILAGE-INDUCING FACTOR-α: APPARENT IDENTITY TO TRANSFORMING GROWTH FACTOR-(3" J Biol Chem. 261(13): 5693-5695 und Sporn, M. B., A. B. Roberts and L. M. Wakefieland R. K. Assoiand "TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β: BIOLOGICAL FUNCTION AND CHEMICAL STRUCTURE" Science 233: 532-534 (1986), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Zapf, J. and E. R. Froesch "INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS/SOMATOMEDINS: STRUCTUR, SECRETION, BIOLOGICAL ACTIONS AND PHYSIOLOGICAL ROLF" Horm Res 24: 121-130 (1986) und der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor, Hauschka, P. V., A. E. Mavrakos and M. D. Iafrati "GROWTH FACTORS IN BONE MATRIX: ISOLATION OF MULTIPLE TYPES BY AFFINITY CHROMATOGRAPHY ON HEPARIN-SEPHAROSE" J Biol Chem 261(27): 12665-12674 (1986). Weitere Anstrengung ist erforderlich, um die am meisten zweckmäßigen Faktoren zu identifizieren und Wege zu finden, um diese an die Stelle der Verletzung zu verabreichen und dort zu verankern (Buckwalter et al, vorstehend). Ein verbesserter biologischer Klebstoff könnte jedoch den Nutzen solcher bioaktiver Wirkstoffe außerordentlich fördern.
Taylor et al. Clinical Research Bd. 40 1992, S. 31a beschreibt einen möglichen Ersatz für Faktor XIII, wobei Serum-Transglutaminase in einem Multikomponenten-Gewebe-Klebstoff-System verwendet wird, das Fibrinogen und Thrombin beinhaltet.
Ein wirkungsvoller biologischer Klebstoff, der ohne das Risiko einer Virus-Übertragung verwendet werden kann, die zu Hepatitis B oder erworbenes Immundefizienz-Syndrom (AIDS) führt, würde in der Tat neue therapeutische Möglichkeiten für a11 die vorstehend beschriebenen Situationen eröffnen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird eine formulierte biologische Klebstoffzusammensetzung bereitgestellt, umfassend Gewebe-Transglutaminase und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die genannte Gewebe-Transglutaminase in einer wirkungsvollen Menge verabreicht wird, um die Gewebe-Adhäsion nach Behandlung von Gewebe in Anwesenheit eines bivalenten Metallions zu fördern.
Diese Erfindung betrifft eine formulierte biologische Klebstoffzusammensetzung. Die Zusammensetzung enthält Gewebe-Transglutaminase in einem pharmazeutisch akzeptablen wässrigen Träger. Bei ihrer Verwendung, wird die Zusammensetzung, die die Gewebe-Transglutaminase in einer wirkungsvollen katalytischen Menge (100 μg/ml bis 50 mg/ml) eingesetzt, um die Adhäsion zwischen Gewebe-Oberflächen nach deren Behandlung zu fördern, indem die Umsetzung zwischen Glutaminylresten und Amin-Donatoren des Gewebes oder in dem Enzym selbst katalysiert werden. Der Träger enthält vorzugsweise das bivalente Metallion, das die genannte Umsetzung fördert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die biologische Klebstoffzusammensetzung Gewebe-Transglutaminase in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, der einen pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8,5, einen Puffer und Calcium (Ca²⁺⁺)-Ionen besitzt. Weiterhin benötigt die Verwendung von Gewebe-Transglutaminase nicht die Einbeziehung eines proteolytischen Enzyms in die Formulierung und beschränkt somit das Risiko der Gewebeschädigung (wie sie zum Beispiel durch Thrombin und Plasmin induziert wird, die in Fibrin-Klebstoffen, etc. vorliegen). Die Klebstoffzusammensetzung kann gegebenenfalls eines oder mehrere Matrix-bildende Proteine enthalten, wie Fibronectin, oder einen Wachstumsfaktor, wie den transformierenden Wachstumsfaktor Beta.
Die Gewebe-Transglutaminase kann aus tierischen Zellen und aus zellulären Produkten erhalten werden. Gewebe als Quellen, aus denen Transglutaminase-Enzyme zur Verwendung in den biologischen Klebstoffzusammensetzungen hergestellt werden können, bestehen aus Zellen und zellulären Produkten, beinhaltend viele Organe und Zelltypen des menschlichen oder tierischen Körpers, wie Lunge, Leber, Milz, Niere, Herzmuskel, Skelettmuskel, Augenlinse, endotheliale Zellen, Erythrocyten, glatte Muskelzellen, Knochen und Macrophagen.
Die biologisch adhäsive Zusammensetzung ist besonders geeignet zur Verwendung zur Behandlung von Gewebe-Oberflächen bei orthopädischen oder traumatologischen Operationen. Zusammensetzungen können auch zur Behandlung von Biomatrices verwendet werden, die Zellen eingebettet in eine Matrix beinhalten, wobei die Matrix biodegradierbar oder nicht biodegradierbar sein kann. Die Biomatrices können auch natürlicherweise auftreten, oder synthetische Proteine enthalten, die Transglutaminase-Substratstellen besitzen. Die Adhäsion zwischen natürlichen Gewebe-Oberflächen und einem Biomatrix-beschichteten Implantat-Material kann verstärkt werden. Die Gewebe-Transglutaminase kann eine rekombinante DNA-Gewebe-Transglutaminase sein und im Besonderen dort, wo die rekombinante DNA molekulare Bereiche besitzt, die sich von einer natürlichen Gewebe-Transglutaminase unterscheiden, ohne deren Verstärkung der Adhäsion zu beeinflussen.
Die vorstehenden Merkmale dieser Erfindung und anderer Ausführungsformen der Klebstoffzusammensetzung und deren Verfahren zur Verwendung werden mit Bezugnahme zu der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den Figuren näher verstanden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird; Inkubationszeit: 10 Minuten.
2 zeigt den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird; relative Inkubationszeit: 15 Minuten.
3 zeigt den Einfluss der tTG-Konzentration auf die Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird.
4 zeigt den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % oder 80 % benötigt wird; Inkubationszeit: 15 Minuten.
5 zeigt den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird; Inkubationszeit: 10 Minuten; mit (tTG +CAC) oder ohne (tTG) vor der 5-minütigen Knorpelzylinder-Oberflächenbehandlung durch Chondroitinase AC (CAC).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

A. Gewebe-Transglutaminase
Quellen, von denen Transglumatinase-Enzyme hergestellt werden können, die in biologischen Klebstoffzusammensetzungen verwendet werden, bestehen aus Zellen und zellulären Produkten, die zahlreiche Organe und Zelltypen des menschlichen oder tierischen Körpers beinhalten, wie Lunge, Leber, Milz, Niere, Herzmuskel, Skelettmuskel, Augenlinse, Endothelzellen, Erythrocyten, glatte Muskelzellen, Knochen und Macrophagen. Die Gewebequelle für das Enzym kann für die jeweilige medizinische Indikation ausgewählt oder spezifisch angepasst werden. Der Begriff "Gewebe-Transglutaminase" (tTG = Transglutaminase II = Transglutaminase Typ C) oder Transglutaminase, wie hierin verwendet, spezifiziert diese Form des Enzyms unabhängig vom zellulären Ursprung oder von posttranslationalen Modifikationen, K. Ikura, T. Nasu, H.Yokata, Y. Tsuchiya, R. Sasaki, and H. Chiba "AMINO ACID SEQUENCE OF GUINEA PIG LIVER TRANSGLUTAMINASE FROM ITS cDNA SEQUENCE." Biochemistry 27: 2898-2905 (1988). Die Enzyme können mit Hilfe von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden und können in Bereichen verändert werden, die die aktive Stelle nicht beeinflussen, um bessere Bedingungen für die Anwendung (z. B. Aufbewahrungsstabilität, Verfahren zur Anwendung, Glutaminyl-Substrat-Qualität, etc.), höhere immunologische Toleranz oder in bestimmten Fällen enzymatische Kapazität zu erhalten.
B. Pharmazeutisch akzeptable Träger oder Medien
Die Gewebe-Transglutaminase wird in einem pharmazeutisch verträglichen wässrigen Träger oder Medium formuliert. Der Träger enthält einen puffernden Wirkstoff, um den pH-Wert in dem Bereich von etwa 7 bis etwa 8,5 zu erhalten. Ein Tris-Puffer oder HEPES-Puffer kann zum Einsatz kommen. Der bevorzugte Tris-Puffer ist Tris-(Hydroymethyl)-aminomethanhydrochlorid. Andere Typen von Puffern können verwendet werden, es ist jedoch wünschenswert Carbonat-, Acetat- und Phosphat-Puffer hoher Konzentrationen (oder im Überschuss über die Ca²⁺-Ionen), wegen der niedrigen Löslichkeit von Calcium-Ionen in solchen Puffern, auszuschließen. Bevorzugt sind Calcium (Ca²⁺)-Ionen ebenfalls in einer Konzentration oberhalb von 0,5 mM vorliegend, vorzugsweise etwa 50-100 mM für Knorpel, um die Reaktion zu verstärken. Strontium ist ein anderes Beispiel für ein bivalentes Metallion, das verwendet werden kann.
C. Matrix-Protein
Die biologische Klebstoffzusammensetzung kann gegebenenfalls ein Matrix-bildendes Protein enthalten. Das Protein kann hinsichtlich der Menge und der Natur der Inhaltsstoffe an eine besondere Verwendung angepasst sein und wird ausgewählt aus Kollagen, Fibrin, Fibrinogen, Fibronektin, Entactin, Osteonektin, Osteopontin, Thrombospondin, Vitronektin, β-Lactoglobin und Casein, und Gemischen davon. Im Allgemeinen kann wahlweise jedes Protein dort in der Klebstoffzusammensetzung zum Einsatz kommen, wo diese eine oder mehrere Amin-Akzeptorstellen für die Gewebe-Transglutaminase-katalysierte Reaktion besitzt.
D. Wachstumsfaktor
Die biologisch Klebstoffzusammensetzung kann. auch einen Wachstumsfaktor enthalten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren ß, der Transformations-Wachstumsfaktor-α-Familie, der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Familie, epidermalem Wachstumsfaktor, der aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor-Familie, der Tumor-Nekrose-Faktor-Familie, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Familie und Interleukin.
E. Orthopädische, traumatologische oder plastische Chirurgie-Verwendungen
Die biologische Klebstoffzusammensetzung kann zur Behandlung von Gewebeoberflächen bei orthopädischen oder traumatologischen Operationen zum Einsatz kommen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gelenkfrakturen, Knorpeldefekten, oberflächlichen Knorpeldefekten (Knorpeldefekten), Vollknorpeldefekten, Osteochondritis dissecans, Meniskusrissen, Ligamentrissen, Sehnenrissen, Muskelläsionen, Muskel-Sehnen-Verbindungsläsionen, Cartilago-Transplantation, Knochengewebe-Transplantation, Ligamenttransplantation, Sehnentransplantation, Knorpeltransplantation, Knorpel-Knochen-Transplantation, Hauttransplantatfixierung, Transplantieren (Reparieren) von Nerven und Blutgefäßen, Patching von Gefäßtransplantaten oder mikrovaskulärer Blutgefäß-Anastomose, und zur Behandlung von Kombinationen der genannten Gewebeoberflächen. (siehe Schlag, G. Rede, H. (Hrsg.) "FIBRINSEALANT IN OPERATIVE MEDICINE", Traumatology Orthopaedics Bd. 7. Springer Verlag, New York 1986).
F. Andere Verwendungen
Die biologische Klebstoffzusammensetzung kann bei anderen Verwendungen zum Einsatz kommen, wie Embryotransfer und Verwendungen wie für Fibrin-Klebstoff zur Verstärkung der Adhäsion zwischen einer Gewebe-Oberfläche und einem mit einer Biomatrix beschichteten Implantationsmateriai. Das Biomatrix-Implantat kann darüber hinaus ein natürlicherweise vorkommendes oder synthetisches Protein enthalten, das Transglutaminase-Substratstellen besitzt. Die Matrix kann biodegradierbar oder nicht biodegradierbar sein und der Klebstoff kann für die Verwendung von Zellen, die in die Matrix eingebettet sind (mesenchymale Zellen, Chondroblasten, Chondrocyten, Stammzellen etc.) eingesetzt werden. Eine Modifikation des Verfahrens kann die Vorbehandlung von Gewebe-Oberflächen mit Verdauungsenzymen beinhalten, die verwendet werden können, um die Haftung zu verstärken. Zum Beispiel die Vorbehandlung von Gewebe-Oberflächen mit Chondroitinase AC oder ABC und/oder anderen Verdauungsenzymen, um die Verfügbarkeit von Substraten für die Gewebe-Transglutaminase zu verstärken und deshalb die Klebfähigkeit zu erhöhen (siehe 4).

MOLEKULARE GRUNDLAGE FÜR DEN VORGESCHLAGENEN BIOLOGISCHEN KLEBSTOFF
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Zusammensetzung verwenden die Quervernetzung von Gewebe-Oberflächenproteinen durch Gewebe-Transglutaminase unter Bedingungen, die physiologische Ereignisse nachahmen und eine klebende Wirkung erlauben, sogar ohne die Zugabe von exogenen Substratproteinen. Es unterscheidet sich von Verfahren, die auf bekannten, kommerziell erhältlichen Klebstoffen begründet sind, durch die Verwendung von Gewebe-Transglutaminase anstelle von Faktor XIII, der Plasma-Transglutaminase. Die erfindungsgemäßen biologischen Klebstoffe stellen eine ausgedehnte Spezifität bereit und erlauben das Kleben von Gewebe-Oberflächen durch die Wirkung des Enzyms alleine, ohne irgendwelche anderen Proteinzusätze. Es wurde gefunden, dass der biologische Klebstoff Gewebe-Adhäsion bereitstellt, die gegenüber stärkeren Scherkräften stabil ist, als denjenigen, die mit handelsüblich erhältlichen Klebstoffen assoziiert sind, die den Faktor XIII enthalten.
Die Schlüsselsubstanz in dem erfindungsgemäßen biologischen Klebstoff ist Gewebe-Transglutaminase, ein Enzym, das eine chemische Reaktion katalysiert, bei der Proteine miteinander quervernetzt werden, um ein netzartiges Polymer zu bilden. Sie gehört zu einer großen Familie von Enzymen, als Transglutaminasen bezeichnet, von denen gezeigt wurde, dass sie eine weitreichende Verteilung unter Geweben und Körperflüssigkeiten besitzen. Proteine werden während zahlreicher physiologischer Prozesse durch Trangslutaminasen modifiziert, z. B. in Fibrin-Klumpen während der Hämostase und der Wundheilung, in Zellmembranen terminal differenzierter Zellen, in verschiedenen Typen von extrazellulären Matrices und bei der Bildung der verhornten Hülle der Epidermis. Während nur in einigen wenigen Fällen die biologische Funktion bekannt ist, ist der Mechanismus der Wirkung von Transglutaminase auf molekularer Ebene gut charakterisiert.
Transglutaminase (EC 2.3.2.13) katalysiert eine Ca²⁺abhängige Acyl-Transferreaktion, in der neue γ-Amid-Bindungen zwischen γ-Carboxamid-Gruppen der Peptid-gebundenen Glutaminreste und verschiedener primärer Amine gebildet werden (Folk, J. E. "TRANSGLUTAMINASES" Ann Rev Biochem 49: 517-531 (1980); Folk, J. E. and J. S. Finlayson "THE ε-(γ-GLUTAMYL)LYSINE CROSSLINK AND THE CATALYTIC ROLE OF TRANSGLUTAMINASES" Adv Protein Chem 31: 1-133 (1977) and Lorand, L. and S. M. Conrad "TRANSGLUTAMINASES" Mol Cell Biochem 58: 9-35 (1984). Ein Glutaminrest dient als Acyl-Donor und die am meisten gebräuchlichen Acyl-Akzeptoren sind ε-Aminogruppen von Peptid-gebundenen Lysinresten (Reaktionsschema I) oder primäre Aminogruppen von einigen natürlicherweise auftretenden (Poly)-Aminen, wie Putrescin oder Spermidin (Reaktionsschema II). Im ersten Fall resultiert die Reaktion in der Bildung von γ-Glutymal-ε-Lysin-Quervernetzungen, entweder innerhalb von oder zwischen Proteinen. Die Umsetzungen entsprechend dem zweiten Schema resultieren in Modifikationen, die möglicherweise die biologische Aktivität und die Umsetzung des Proteins beeinflussen, jedoch nicht in Polymer-Bildung. Reaktionsschema I
Reaktionsschema I
wobei P = Protein und R = organische Seitenkette von variabler Struktur bedeutet.
Die Anzahl von Proteinen, die als Glutaminyl-Substrate wirken, ist stark eingeschränkt, da sowohl die Primärstruktur als auch die Konformation bestimmen, ob ein Glutaminrest reaktiv ist oder nicht. Im Gegensatz dazu ist die Toleranz gegenüber strukturellen Unterschieden bei Acyl-Akzeptoren bemerkenswert, da die einzige Erfordernis die Anwesenheit einer -(CH₂)₄-NH₂-Gruppe ist. Dies erklärt warum sowohl Protein-gebundene Lysinreste als auch kleine primäre Amine als Amin-Donoren dienen können. Somit sind in einem bestimmten Gewebe nur eine kleine Untergruppe von Proteinen Glutaminyl-Substrate für das Enzym, wohingegen die meisten Proteine des Gewebes in der Lage sind, ε-Aminogruppen von Lysinresten beizusteuern, die als Acyl-Akzeptoren bei der Vernetzungsreaktion dienen sollen. Darüber hinaus variiert die Spezifität für unterschiedliche Glutaminyl-Substrate in Abhängigkeit von dem Typ von Transglutaminase. Mehrere Typen von Transglutaminase können ein einzelnes Protein als Substrat erkennen, jedoch häufig mit unterschiedlicher Affinität und/oder mit Spezifität für verschiedene Glutaminreste. Bestimmte Proteine können nur für ein einziges Mitglied der Transglutaminase-Familie als Substrate dienen. Faktor XIII, die Plasma-Transglutaminase, ist ein notwendiger Bestandteil der handelsüblich erhältlichen Fibrin-Klebstoffe, wirkt jedoch auf eine viel stärker eingeschränkte Gruppe von Proteingebundenen Glutaminen als die Gewebe-Transglutaminase, Gorman, J. J. and J. E. Folk "STRUCTURAL FEATURES OF GLUTAMINE SUBSTRATES FOR TRANSGLUTAMINASES" J Biol Chem 256(6): 2712-2715 (1981) und Gorman, J. J. and J. E. Folk "STRUCTURAL FEATURES OF GLUTAMINE SUBSTRATES FOR TRANSGLUTAMINASES" J Biol Chem 259(14): 9007-9010 (1984). Gewebe-Transglutaminase ist ein hauptsächlich intrazelluläres Enzym mit einer breiten Gewebeverteilung, Greenberg, C. S., P. J. Birckbichler and R. H. Rice "TRANSGLUTAMINASES: MULTIFUNCTIONAL CROSS-LINKING ENZYME THAT STABILIZES TISSUES" FASEB J5: 3071-3077 (1991).
Der erfindungsgemäße Klebstoff verwendet Gewebe-Transglutaminase eher als Faktor XIII, wobei ein hauptsächlicher Vorteil darin liegt, dass deren breit angelegte Substrat-Spezifität eine stärkere Haftung bereitstellt. Faktor XIII existiert als ein Tetramer, a₂b₂ (Mr~320.000), zusammengesetzt aus einem Dimer der katalytischen α-Untereinheit (Mr jeweils ~ 83.000) und zwei regulatorischen β-Untereinheiten (Mr ~ 80.000), wenn er im Blutplasma zirkuliert, oder als ein Dimer von ausschließlich der α-Untereinheit in z. B. Blutplättchen, Leukocyten und Placenta, Carrell, N. A., H. P. Erockson and J. McDonagh "ELECTRON MICROSCOPY AND HYDRODYNAMIC PROERTIES OF FACTOR XIII SUBUNITS" J Biol Chem 264(1): 551-556 (1989). Die α-Untereinheit von Faktor XIII hat einen hohen Grad an Sequenzhomologie mit Gewebe-Transglutaminase, die Proteine stammen jedoch von unterschiedlichen Genen ab, Ichinose, A., R. E. Bottenus and E. W. Davie "STRUCTURE OF TRANSGLUTAMINASES" J Biol Chem 265(23): 13411-13414 (1990). Faktor XIII ist ein Zymogen, das durch Thrombin-Spaltung und die nachfolgende Ca²⁺-abhängige Dissoziation in aktive α-Untereinheiten und inaktive β-Untereinheiten zum Faktor XIIIa aktiviert wird. Die handelsüblich erhältlichen Fibrin-Klebstoffe werden aus einer partiell gereinigten Fraktion von menschlichem Blutplasma hergestellt, das die aktiven Mittel (Substanzen) Faktor XIII, Fibrinogen, Fibronektin, Thrombin, CaCl₂ enthält.
Die reichlich vorhandene Gewebe-Transglutaminase ist ein monomeres globuläres Protein mit einer molekularen Masse von etwa 77.000 (Greenberg et al, vorstehend und Ichinose et al, vorstehend) und benötigt im Gegensatz zu Faktor XIII keine proteolytische Aktivierung. Diese Eigenschaft macht reproduzierbare Anwendungen leichter. Eine Anzahl von Mitteln, wie transformierende Wachstumsfaktor β und der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor sind zuvor beschrieben worden, die Knorpelbildung zu stimulieren und können gemeinsam mit dem erfinderischen Klebstoff verwendet werden, um eine optimale Regenerierung zu erreichen. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Gewebe-Transglutaminase in einer Vielzahl von Knorpeln exprimiert wird. Aeschlimann, D., Wetterwald, A., Fleisch, H., and Paulsson, M. "EXPRESSION OF TISSUE TRANSGLUTAMINASE IN SKELETAL TISSUES CORRELATES WITH EVENTS OF TERMINAL DIFFERENTIATION OF CHONDROCYTES", J Cell Biol, Bd. 120[6], Seite 1461 bis 1470 (1993). Gewebe-Transglutaminase katalysiert wahrscheinlich physiologisch auftretende Quervernetzungen im Knorpel und in dieser Hinsicht ahmt der erfinderische Klebstoff einen natürlicherweise vorkommenden Prozess nach. Als Konsequenz daraus kommen sowohl das Enzym als auch seine Reaktionsprodukte in normalem Knorpel vor und es ist unwahrscheinlich, dass sie toxisch sind. Transglutaminasen katalysieren Protein-Quervernetzung während der Bildung der verhornten Hülle, die die oberflächliche Schicht der Epidermis bildet, Thacher, S. M. and R. H. Rice "KERATINOCYTE-SPECIFIC TRANSGLUTAMINASE OF CULTURED HUMAN EPIDERMAL CELLS: RELATION TO CROSS-LINKED ENVELOPE FORMATION AND TERMINAL DIFFERENTIATION" Cell 40: 685-695 (1985). Da die gewaltige Produktion von Quervernetzungen in der Haut keine immunologische Antwort induziert, scheint es, dass die Produkte, die durch Gewebe-Transglutaminasen gebildet werden, nicht immunogen sind.
Als eine wichtige Voraussetzung für die Verwendung des (tTG)-Enzyms in den stark kollagenhaltigen skelettalen Geweben sind die Kollagene, die in Knochen und Sehne, Typ III (Bowness et al, 1987) und in Knorpel, Typ II (Aeschlimann et al, 1993, vorstehend), exprimiert werden, Substrate für das Gewebe-Transglutaminase-Enzym. Die Beobachtung, dass einige andere extrazelluläre Substratproteine eng mit dem vaskulären Endothel assoziiert sind, wie Entactin, Osteonektin, (Aeschlimann, D. and M. Paulsson "CROSS-LINKING OF LAMININ- NIDOGEN COMPLEXES BY TISSUE TRANSGLUTAMINASE" J Biol Chem 266: 15308-15317 (1991); Aeschlimann, D., Wetterwald, A., Fleisch, H., and Paulsson, M. "EXPRESSION OF TISSUE TRANSGLUTAMINASE IN SKELETAL TISSUES CORRELATES WITH EVENTS OF TERMINAL DIFFERENTIATION OF CHONDROCYTES", J Cell Biol (1993), in press), Vitronektin, Fibronektin und Fibrin ogen) (Greenberg, C. S., P. J. Birckbichler and R. H. Rice "TRANSGLUTAMINASES: MULTIFUNCTIONAL CROSS-LINKING ENZYMES THAT STABILIZE TISSUES" FASEB J. 5: 3071-3077 (1991)), erweitert den potenziellen Anwendungsbereich von Gewebe-Transglutaminase auf die Regenerierung (Reparatur) vaskularer Läsionen.
Beispiele
Ein in vitro-System zur quantitativen Bewertung der adhäsiven Stärke von biologischen Klebstoffen wurde entwickelt, um in der Lage zu sein, die adhäsive Stärke, die mit handelsüblich erhältlichen Formulierungen erhalten wird, mit der zu vergleichen, die anhand des erfindungsgemäßen biologischen Klebstoffs erzielt wird.
Gewebe-Transglutaminase (tTG) wurde aus Meerschweinchen-Leber mit Hilfe von DEAE-Cellulose-Chromatographie des Überstands aus Leberhomogenat, gefolgt von einer Protamin-Präzipitation des Enzyms, einer selektiven Extraktion mit Ammoniumsulfatlösung und einer erneuten Chromatographie über eine Molekularsieb-Säule, aufgereinigt, Connellan, J. M., S. I. Chung, N. K. Whetzel, L. M. Bradley and J. E. Folk "STRUCTURAL PROPERTIES OF GUINEA PIG LIVER TRANSGLUTAMINASE" J Biol Chem 246(4): 1093-1098 (1971). tTG wurde vereinigt (gepoolt) und in 10 mM Tris/Acetat (pH 6,0), enthaltend 1 mM EDTA und 150 mM NaCl auf 1 mg/ml konzentriert, Aeschlimann, D. and M. Paulsson "CROSS-LINKING OF LAMININ-NIDOGEN COMPLEXES BY TISSUE TRANSGLUTAMINASE" J Biol Chem 266: 15308-15317 (1991).
Gewebe-Transglutaminase wurde mit einem handelsüblich erhältlichen Fibrin-Klebstoff (Tissucol) und drei anderen Typen von Kontrollen (NaCl-Lösung, Tris-Reaktionspuffer und Inkubation ohne Behandlung) verglichen. Tissucol besteht aus zwei Lösungen, die vor der Verwendung vermischt werden. Ein Teil besteht aus 75-115 mg/ml Fibrinogen, 2-9 mg/ml Plasma-Fibronektin, 10-50 U/ml Faktor XIII und 40-120 μg/ml Plasminogen. Die andere wird in 53 mM CaCl₂ auf 4 IU Thrombin eingestellt. Nach Erwärmen auf 37° C und Vermischen werden die beiden Komponenten auf den Knorpeloberflächen verwendet. Gewebe-Transglutaminase-Klebstoff besteht aus zwei Lösungen: A) Gewebe-Transglutaminase (1 mg/ml in 10 mM Tris/Acetat, pH 6,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) und B) Tris-Reaktionspuffer (0,1 M CaCl₂ in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl), die auf getrennten Gewebe-Oberflächen verwendet werden und die vermischt werden, indem die beiden Gewebe-Oberflächen aneinandergefügt werden. Eine 0,9 % NaCl-Lösung, Tris-Reaktionspuffer und nicht behandelte Knorpeloberflächen wurden als Kontrollen verwendet.
Die Vorbehandlung mit 4 μl Chondroitinase AC (CAC) (Sigma), gelöst in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (GIBCO), in einer Aktivität von 1 U/ml, auf jeder der Knorpeloberflächen, wurde 5 Minuten bei 37° C in einer feuchten Kammer durchgeführt, gefolgt von einer gründlichen Spülung mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung und einem sorgfältigen Trocknen mit Zellwatte. Diese Vorbehandlung führte zu einer Depolymerisation von Glycosaminoglycanen (Chondroitin 4-Sulfat und Chondroitin 6-Sulfat) und hat deshalb wahrscheinlich mehr Substratstellen zugänglich gemacht, Carney, S. L. "PROTEOGLYCANS. CARBOHYDRATE ANALYSIS" Oxford, IRL Press (1986).
Mit einem Myelotomie-Bohrer (Institut Straumann, Schweiz) wurden aus der Schulter eines Rinds 10 bis 20 Stunden nach der Schlachtung Knorpel-Knochen-Zylinder mit einem Durchmesser von 3,9 mm erhalten. 50 % des Vollknorpels wurden senkrecht zur Längsachse des Zylinders mit einer Rasierklinge herausgeschnitten.
Die Oberflächen wurden mit 4 μl tTG-Lösung und 4 μl Tris-Reaktionspuffer, 1 Tropfen Fibrin-Klebstoff oder 8 μl der Kontroll-Lösungen behandelt oder unbehandelt belassen: Die beiden Knorpelzylinder wurden sofort mit ihren geschnittenen Oberflächen aneinandergefügt und ein 80 g-Gewicht wurde vertikal angebracht, während der Aufbau 10-15 Minuten bei 37° C in einer feuchten Kammer (relative Feuchte 50 oder 80 %) inkubiert wurde. Auf den oberen Knorpelzylinder wurde eine kontrollierte linear hochlaufende Schwerkraft eingesetzt (0,27 N/s). Die Schwerkraft wurde über einen Signalgenerator (Wavetech) und einen Verstärker reguliert, der durch eine elektromagnetische Spule und einen ferrimagnetischen Impuls eingesetzt wurde, und mit einer speziell entworfenen Kraftmesszelle gemessen (Präzision 1,0 × 10^-3 N). Die Kraftmesszelle war mit einem dynamischen Dehnmess-Streifen-Verstärker verbunden (DMD 20A, Hottinger Baldwin Messtechnik, Schweiz). 720 Werte in 3 Sekunden wurden auf einer Daten-Registriereinrichtung aufgezeichnet (Mikromec, Suprag, Schweiz), von wo sie auf einen Computer (Macintosh LC) übertragen wurden. Parallel dazu können durch die Digitalisierung der resultierenden Kraft das Eingabesignal (linearer Auflauf) und die gemessenen Werte mit einem Oscilloskop sichtbar gemacht werden.
Die Verwendung der tTG für exponierte Oberflächen von zylindrischen Knorpelgewebe-Beispielen ergab eine viel höhere adhäsive Wirkung, als in der Kontrollgruppe, wo ausschließlich NaCl-Lösung, Tris-Reaktionspuffer oder keine Lösung verwendet wurden (p < 0,01, Wilcoxon vorzeichenbehafteter Rangtest) (1).
Die gleiche Wirkung wurde verzeichnet nach Erhöhung der Inkubationszeit von 10 Minuten (1) auf 15 Minuten ( 2), obwohl die Scherkraft, insbesondere in der NaCl-Gruppe, eine Tendenz zeigte, zuzunehmen. Darüber hinaus war der produzierte adhäsive Effekt abhängig von der Konzentration an Gewebe-Transglutaminase (siehe 3).
Ein Vergleich von tTG mit Tissucol zeigte eine vergleichbare Haftungsfähigkeit bei 50 % relativer Feuchtigkeit, wohingegen viel der adhäsiven Wirkung von Tissucol (aber nicht von tTG) verloren ging, wenn die relative Feuchtigkeit auf 80 % erhöht wurde (4). Die Haftungswirkung von tTG bei vorheriger Verwendung von Chondroitinase AC ist in 5 gezeigt.

Claims

Formulierte biolögische Klebstoffzusammensetzung; umfassend Gewebe-Transglutaminase und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 mit einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8,5, einem bivalenten Metallion und einer Puffersubstanz in einem wässrigen Medium.
Biologische,Khebstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das genannte bivalente Metallion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, Calcium und Strontium.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch l oder Anspruch 2, wobei das genannte bivalente Metallion Calcium ist.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch 4; wobei das genannte Calcium in einer Menge zwischen etwa 0,5 mM und etwa 100 mM anwesend ist.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der. vorherigen Anspruche, wobei die genannte Gewebe-Transglutaminase in einer Menge zwischen etwa 100 μg/ml und etwa 50 mg/ml vorhanden ist.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche; die ein zusätzliches Protein enthält.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der. vorherigen Ansprüche für die Verwendung bei der Behandlung von Biomatrix-Implantaten, ferner umfassend ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Protein mit Transglutaminasesubstratstellen.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei das genannte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, Fibrin; Fibrinogen, Fibronektin, Entactin, Osteonektin, Osteopontin, Thrombospondin, Vitronektin, β-Lactoglobul, Casein und Gemischen davon.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, die einen Wachstumsfaktor enthält.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch 10 wobei der genannte Wachstumsfalέtor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Transformationswachstumsfaktor-β-Familie, der Transformationswachstumsfaktor-α-Familie, der. Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktorfamilie, epidermalem Wachstumsfaktor; der aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktorfamihie, der Tumor-Nekrose-Faktor-Familie, Fibroblastenwachstumsfaktorfamilie und Interleukinen.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche; wobei die genannte Gewebe-Transglutaminase von menschlichen oder nichtmenschlichen Zellen; Organen oder Zellprodukten gewonnen wird.
Biologische Klebststoffzusammensetzung nach einem der vorherigen Anspruche, wobei die genannte Gewebe-Transglutaminase von Gewebe gewonnen wird; ausgewählt aus Lunge, Leber, Milz, Niere, Herzmuskel, Skelettmuskel, Augenlinse, Endothelzellen, Erythrozyten, Eingeweidemuskelzellen, Knochen und Makrophagen.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis l1, wobei die genannte Gewebe-Transglutaminase eine rekombinante DNA-Gewebe-Transglutaminase ist.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die genannte rekombinante DNA Molekülregionen hat, die sich von einer natürlichen Gewebe-Transglütaminase unterscheiden, ohne dass ihre Adhäsionsförderung beeinträchtigt wird.
Biologische Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung kein , proteolytisches Enzym umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, für die Verwendung in der Chirurgie oder Therapie.
Verwendung einer biologischen Klebstoffzusammensetzung. nach einem der vorherigen Ansprüche, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Gelenkfrakturen, Knorpeldefekten, oberflächlichen Knorpeldefekten, Vollknorpeldefekten, Osteochondritis dissecans, Meniskusrissen, Ligamentrissen; Sehnenrissen, Muskelläsionen, Muskel-Sehnen-Verbindungsläsionen, Cartilago-Transplantation, Knochengewebstransplantation, Ligamenttransplantation, Sehnentransplantation, Knorpeltransplantation; Knorpel-Knochen-Transplantation, Hauttransplantatfixierung, Transplantieren oder Reparieren. von Nerven und Blutgefäßen, Patching von Gefäßtransplantaten oder mikrovaskulärer Blutgefäß-Anastomose. 19. Biologische Klebstoffzusammensetzng nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das genannte Gewebe eine Biomatrix umfasst, die Transglütaminase-Substratstellen hat und Zellen oder ein Embryotransfersystem enthält: 20: Biologische Khebstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Verwendung bei der Förderung der Adhasion zwischen Gewebe und einem biomatrixbeschichteten Implantatmaterial.