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Technisches Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft die Verwendung
von biologischen Klebstoffen bei Operationen. Es gibt im Rahmen
der unterschiedlichen operativen Besonderheiten zahlreiche Situationen,
bei denen die Anwendung eines biologischen Klebstoffs vorteilhaft
wäre. Ein
biologischer Klebstoff kann verwendet werden, um bei allgemeinen
Operationen Blutungen zu verhindern, um in der Neurochirurgie Nervenrupturen
zu rekonstruieren, um in der plastischen Chirurgie Haut- und Knorpel-Transplantate
und Defekte anzuhaften, in der allgemeinen oder Thorax-Chirurgie
Pneumothorax und/oder Fisteln zu behandeln, in der vaskulären und
allgemeinen Chirurgie vaskuläre
und intestinale Verbindungen zu unterstützen, etc.
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Bei orthopädischen Operationen beinhalten
mögliche
Verwendungen eines biologischen Klebstoffs die Behandlung von Knorpel-
und Knochenfrakturen, die Transplantation von Knorpel- oder Knochen-Materialien, die
Behandlung von Osteochondrosis dissecans, Gelenkfrakturen, Meniskus-Verletzungen sowie
gerissenen Bändern,
Sehnen, Muskel-Sehnen-Verbindungen
oder Muskeln. Darüber
hinaus die Polymerisation und Adhäsion von Biomatrix-Implantaten,
die zusammengesetzt sind aus z. B. Kollagen, Gelatine, Fibrinogen,
Fibrin oder auch Makromolekülen,
die keine Gewebe-Transglutaminase-Substrate sind, wie Polyacetate etc.
und die möglicherweise
verschiedene Zusätze,
wie Zell-Anheftungsproteine, Wachstumsfaktoren, Zellen etc. enthalten,
um bei Gewebeschäden
den Heilungsprozess zu verstärken
und zu stimulieren. Diese letztere Anwendung der neuen biologischen
Klebstoffe ist von besonderer Bedeutung.
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Diese Erfindung betrifft eine formulierte
biologische Klebstoffzusammensetzung, das Verfahren zu deren Herstellung
und Anwendung. Die Klebstoffzusammensetzung begründet sich auf einer besonderen
Art der Verwendung von Gewebe-Transglutaminase
(tTG = Transglutaminase II = Transglutaminase Typ C) in einem pharmazeutisch
akzeptablen Träger.
Der Nutzen der Erfindung wurde durch biomechanisches Testen der
Haftfähigkeit
zwischen Bindegewebsoberflächen
belegt.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Knorpel bedeckt alle mit Gelenken
versehenen Oberflächen
und stattet aufgrund seiner Struktur ein Gelenk mit nahezu reibungsloser
Bewegung aus. Der Reibungskoeffizient, definiert als μ = Reibungskraft
(F) pro aufgebrachte Last (W), beträgt für Gelenkknorpel in einem echten
Gelenk (menschliches Knie) 0,005-0,02. Als ein Vergleich liegt der
Reibungskoeffizient für
Eis auf Eis etwa 5-mal höher
(0,01-0,1), Mow, V. C., A. Ratcliffe and A. R. Poole "CARTILAGE
AND DIATHRODIAL JOINTS AS PARADIGMS FOR HIERARCHICAL MATERIALS AND
STRUCTURES" Biomaterials, 13(2): 67-97 (1992).
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Die Matrix des Gelenkknorpels besteht
aus 60-80 % Wasser (und gelösten
Ionen und Gasen), in Bezug auf das Nassgewicht von Gelenkknorpel,
und aus 20-40 % strukturellen Molekülen, wie Kollagen, Proteoglycanen,
Glycosaminoglycanen und Glycoproteinen. Chondrocyten, die spezialisierten
Zellen im Gelenkknorpel, sind in diese Matrix eingebettet und besetzen
nur etwa 10 % des Volumens, und der Gelenkknorpel enthält weder
Nerven, noch lymphatische Gefäße, noch
Blutgefäße, Buckwalter,
J. A., L. C. Rosenberg and E. B. Hunziker, "ARTICULAR CARTILAGE:
COMPOSITION, STRUCTURE, RESPONSE TO INJURY, AND METHODS OF FACILITATING
REPAIR", neu aufgelegt in ARTICULAR CARTILAGE AND KNEE JOINT FUNCTION: BASIC
SCIENCE AND ARTHROSCOPY New York, Rauen Press (1990) und Hunziker,
E. B. "STRUKTURMOLEKÜLE
DES KNORPELGEWEBES, DER SEHNEN UND BÄNDER, Kniegelenk und Kreuzbänder, Berlin, Springer
(1990).
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Es können zwei Typen von Knorpelschäden unterschieden
werden. Als erstes der Knorpel- oder Oberflächen-Schaden; dieser weitet
sich nicht auf den subchondrialen Knochen aus oder beschädigt diesen.
Der subchondriale Knochen ist innerviert, enthält Blutgefäße und verbindet den Knorpel
mit dem Knochen und dem Knochenmark. Oberflächliche Knorpelschäden, die
sich nicht auf den subchondrialen Knochen ausweiten (d. h. partielle
Schädigungen
des Vollknorpels), können
als ein linearer Bruch-Typ, eine sternförmige Fraktur, ein glatter
Typ, ein fibrillärer
Typ auftreten, Bauer, M. and R. W. Jackson "CHONDRAL LESIONS OF
THE FEMORAL CONDYLES: A SYSTEM OF ARTHROSCOPIC CLASSIFICATION" Arthroscopy,
4(2):97-102 (1988). Knorpelschädigungen
sind häufig
von traumatischem Ursprung, treten aber auch ohne eine offensichtliche
Ursache auf. Aufgrund des Mangels an Versorgung mit Nerven, verursachen
sie gewöhnlich
keine Schmerzen. Falls Symptome auftreten, werden sie als verzögerte Schwellung
des Synoviums (die innere Seite der Gelenkkapsel) nachgewiesen,
mit einer periodischen Blockade als ein Ergebnis eines knorpeligen
Fragments, oder als periodisch auftretende Ergüsse und Reibungsgeräusche, Scott,
W. N. und J. N. Insall "INJURIES OF THE KNEE", neu aufgelegt in
ROCKWOOD AND GREEN'S FRACTURES IN ADULTS, Philadelphia, J. B. Lippincott
Company (1991). Solche Schäden
sind notorisch, da sie nicht heilen, keine Neigung für Reparaturreaktionen
zeigen und sie viele Gemeinsamkeiten mit den frühen Stadien von degenerativen
Gelenkserkrankungen haben, wie Osteoarthritis. Als zweites der vollständige Vollknorpeldefekt;
dieser weitet sich bis hin zum subchondrialen Knochen aus, der Nerven
und Blutgefäße enthält.
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Er resultiert zum Beispiel aufgrund
starker Verletzungen als ein Sprengtrichter- oder Abbau-Typ (Bauer
et al., vorstehend), oder tritt in späten Stadien degenerativer Gelenkserkrankungen
auf, wie Osteoarthritis. Ein Symptom sind häufig starke Schmerzen. Blutungen
und Reparatur-Reaktionen können
auftreten, die in einem vaskularisiertn fibrösen Knorpeltyp resultieren,
was jedoch nicht ausreichend ist, um die Gelenkfunktion zu unterstützen. Ein
solches Reparaturgewebe bleibt sehr selten bestehen (Buckwalter
et al., vorstehend).
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Gegenwärtig werden noch immer verschiedene
Versuche gemacht, um die Knorpelreparatur bei chondrialen und subchondrialen
Schäden
zu erleichtern. Ein Ansatz ist durch chondriale Schäden hindurch
in den subchondrialen Knochen zu bohren, was eine Blutung induziert,
Pridie, K. H. "A METHOD OF RESURFACING OSTEOARTHRITIC KNEE JOINTS"
J Bone Joint Surg (Br) 41-B: 618-619 (1959). Durch das Bluten werden Reparatur-Reaktionen induziert
und ein fibröser
Knorpel (Faserknorpel) wird gebildet, doch dieses Gewebe zeigt unzulängliche
biomechanische Eigenschaften und ermangelt einer Langzeit-Persistenz, Mitchell,
N. and N. Shepard "THE RESURFACING OF ADULT RABBIT ARTICULAR CARTILAGE
BY MULTIPLE PERFORATIONS THROUGH THE SUBCHONDRAL BONE" J Bone and
Joint Surg 58-A: 230-233
(1976). Ein Wiederherstellen von Gelenkknorpel-Schäden mit
periostalen und perichondrialen Transplantaten wurde ausgewertet,
Coutts, R. D., S. L. Y. Woo, D. Amiel, H. P. Von Schroeder and M.
K. Kwan "RIB PERICHONDRIAL AUTOGRAFTS IN FULL-THICKNESS ARTICULAR
CARTILAGE DEFECTS IN RABBITS" Clin Orthop 263-273 (1992); Homminga,
G. N., S. K. Bulstra, P. S. M. Bouwmeester and A. J. Van Der Linden
"PERICHONDRAL GRAFTING FOR CARTILAGE LESIONS OF THE KNEE" J Bone
Joint Surg (Br) 72-B(6):
1003-7 (1990); Homminga, G. N., T. J. van der Linden, E. A. W. Terwindt-Rouwenhorst
and J. Drukker, "REPAIR OF ARTICULAR DEFECTS BY PERICHONDRIAL GRAFTS:
EXPERIMENTS IN THE RABBIT" Acta Orthop Scand 69(3): 326-329 (1989)
und O'Driscoll, S. W., F. W. Keeley and R. B. Salter "DURABILITY
OF REGENERATED ARTICULAR CARTILAGE PRODUCED BY FREE AUTOGENOUS PERIOSTEAL
GRAFTS IN MAJOR FULL-THICKNESS DEFECTS IN JOINT SURFALES UNDER THE
INFLUENCE OF CONTINUOUS PASSIVE MOTION" J Bone and Joint Surg 70-A(4):
595-606 (1988). Die Knorpelhaut und die äußere Knochenhaut sind dünne Bindegewebsschichten,
die den fibrösen
Knorpel bzw. den Knochen bedecken. Die meisten Forscher nähen die
Knorpelhaut oder Knochenhaut in einen subchondrialen Schaden hinein,
wodurch zusätzliche
Knorpelschädigungen
erzeugt werden. Andere erhielten gute Ergebnisse, indem sie die
Knorpelhaut auf Knorpelschäden
von Kaninchen-Kniegelenken aufklebten, wobei ein handelsüblicher
Fibrin-Kleber (Tissucoll) verwendet wurde, Homminga, G. N., T. J.
van der Linden, E. A. W. Terwindt-Rouwenhorst and J. Drukker, "REPAIR OF
ARTICULAR DEFECTS BY PERICHONDRIAL GRAFTS" Acta Orthop Scand 60(3):
326-329 (1989), ein Ansatz, der jedoch einer 2-wöchigen Immobilisation des Gelenks
bedurfte. Eine Gelenk-Immobilisation wurde aufgrund der geringen
Resistenz des Klebstoffs gegen Scherkräfte auch empfohlen, wenn ein
Fibrin-Klebstoff für
die Fixierung knorpeliger oder knöcheriger Fragmente verwendet
wurde, Claes, L., C. Burri, G. Helbing und E. Lehner "BIOMECHANISCHE
UNTERSUCHUNGEN ZUR FESTIGKEIT VERSCHIEDENER KNORPELKLEBUNGEN" Helv
Chir Acta 48: 11-13 (1981). Ein hauptsächliches Argument gegen die
Verwendung von Fibrin-Klebstoff ist die mögliche Übertragung menschlicher pathogener
Viren, z. B. humanes Immundeffizienz-Virus (HIV) und Hepatitis B-Virus. Aus
diesem Grund sind Fibrin-Klebstoffe, die aus ungereinigten Fraktionen
menschlicher Blutplasma-Proteine zusammengesetzt sind, in den Vereinigten
Staaten nicht zur Verwendung erlaubt.
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Das Entfernen von fibrilliertem oder
unregelmäßigem Knorpel
(Abrasieren) wurde als ein therapeutischer Ansatz bewertet, es ist
jedoch gezeigt worden, dass der abrasierte Gelenkknorpel des menschlichen Kniegelenks
sich nicht regeneriert und sogar eine Zunahme der Fibrillierung
und Zellnekrose verursachen kann, Schmid, A. und F. Schmid "RESULTS
AFTER CARTILAGE SHAVING STUDIED BY ELECTRN MICROSCOPY" Am J Sports
Med 15(4): 386-387 (1987). Das Abrasieren des Kniescheiben-Knorpels
in Kaninchen führt
nicht zu einer signifikanten Reparatur, Mitchell, N. und N. Shepard
"EFFECT OF PATELLAR SHAVING IN THE RABBIT" J Orthop Res 5: 388-392
(1987).
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Die Verwendung gezüchteter
fötaler
Chondrocyten, die in eine Biomatrix eingebettet sind, die Fibrinogen,
Thrombin und zusätzliche
Bestandteile enthält,
Itay, S., A. Abramovici and Z. Nevo "USE OF CULTURED EMBRYONAL CHICK
EPIPHYSEAL CHONDROCYTES AS GRAFTS FOR DEFECTS IN CHICK ARTICULAR CARTILAGE"
Clin Orthop 220: 284-303 (1987), oder von Knochenmark-abstammenden
mesenchymalen Stammzellen, Pineda, S. J., T. Goto, V. M. Goldberg
and A. I. Caplan "OSTEOCHONDRAL PROGENITOR CELLS ENHANCE REPAIR
OF LARGE DEFECTS IN RABBIT ARTICULAR CARTILAGE" Trans Orthop Res Soc
17(2): 598 (1992) als Transplantate ist in Hühnern erfolgreich verwendet
worden und induzierte eine vollständige Reparatur des Vollknorpels.
Es ist nicht bekannt ob eine erfolgreiche Transplantation von Chondrocyten
in oberflächliche
Schäden
in Säugern
oder Menschen durchgeführt
worden ist. Die mechanische Fixierung (d. h. lokale Immobilisierung)
von Transplantaten bleibt bei diesem Ansatz ein Problem.
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Die gegenwärtige Behandlung von Knorpel-Frakturen
wird häufig
durch das Ausbleiben der spontanen Anheftung des Gewebes behindert.
Die Stabilisation von Fragmenten mit Schrauben oder Kirschner-Draht
erfordert wiederholte operative Eingriffe, die in zusätzlicher
Verletzung und Zerstörung
resultieren, und trotzdem wird eine stabile Fixierung häufig nicht
erreicht. Knorpel-Frakturen müssen
sehr genau entfernt werden (beste geometrische Annäherung),
sonst heilen die Frakturen durch Bildung von Faserknorpel mit ungenügenden biomechanischen
Eigenschaften, Mitchell, N. and N. Shepard "HEALING OF ARTICULAR
CARTILAGE IN INTRA-ARTICULAR FRACTURES IN RABBITS" J Bone and Joint
Surg 62-A: 628-634 (1990).
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Osteochondrosis dissecans ist eine
aus Knochen und Knorpel bestehende Läsion mit einer unbekannten,
wahrscheinlich multifaktoriellen, Ethiologie. Die meisten Patienten
mit einem lockeren Fragment aus Knochen und Knorpel im Gelenk müssen sich
einer Operation unterziehen, da es sich zeigte, dass die nicht operative
Behandlung die degenerative Arthritis beschleunigt, Federico, D.
J., K. Lynch and P. Jokl "OSTEOCHONDRITIS DISSECANS OF THE KNEE:
A HISTORICAL REVIEW OF ETIOLOGY AND TREATMENT" Arthroscopy 6(3):
190-197 (1990). Die Möglichkeiten
zur Fixierung von Fragmenten aus Knochen und Knorpel beinhalten
die Verwendung von Kompressionsschrauben, Kirschner-Drähten oder
eines Kompressions-Drahtfixierungs-Systems (hakenförmige Drähte, Ankerschrauben und Bolzen),
Jakob, R. P. "THE TREATMENT OF OSTEOCHONDRITIS DISSECANS OF THE
KNEE JOINT USING A NEW COMPRESSION WIRE SYSTEM" Z Unfallchir Versicherungsmed.
83(2): 104-110 (1990); Scott, D. J. and C. A. Stevenson "OSTEOCHONDRITIS DISSECANS
OF THE KNEE IN ADULTS" Clin Orthop 76: 82-86 (1990) and Smilie,
I. "OSTEOCHONDRITIS DISSECANS", London, Livingston (1960). In den
meisten Fällen
ist eine zweite Operation erforderlich, um das Metall zu entfernen.
Der Nutzen biologischer Klebstoffe bei der Behandlung von Osteochondrosis
dissecans wurde bisher nicht bewertet.
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Der menschliche Meniskus ist eine
diskoidale oder halbmondförmige
Scheibe aus Knorpel (hauptsächlich
bestehend aus umlaufend orientierten Kollagenfasern). Er befindet
sich zwischen den Gelenk-Oberflächen,
verbessert die Gelenk- Kongruenz
und verringert punktuellen Kontakt, wie z. B. im Kniegelenk (Scott, W.
N. and J. N. Insall, "INJURIES OF THE KNEE", neu aufgelegt in ROCKWOOD
AND GREEN'S FRACTURES IN ADULTS, Philadelphia, J. B. Lippincott
Company (1991). Der zentrale und innere Teil des Meniskus besteht
aus einem keine Gefäße, keine
Nerven und kein lymphatisches Gewebe enthaltenden Faserknorpel, Arnoczky,
S. P. and R. F. Warren "MICROVASCULATURE OF THE HUMAN MENISCUS"
Am J Sports Med 10(2): 90-95 (1982). Nur den Meniskus betreffende
Risse, die in der vaskulären
Peripherie auftreten und die 3 cm lang oder kürzer sind, sprechen auf ein
mechanisches Zunähen
an. Bei anderen Typen von den Meniskus betreffenden Rissen werden
die inneren Teile des Meniskus im Allgemeinen ausgeschnitten, eine
Behandlung, die in den meisten Fällen
zu einer degenerativen Gelenkserkrankung führt, (Scott, W. N. and J. N.
Insall "INJURIES OF THE KNEE" neu aufgelegt in ROCKWOOD AND GREEN'S
FRACTURES IN ADULTS Philadelphia, J. B. Lippincott Company (1992)).
Ein Verfahren zur Reparatur aller Arten von den Meniskus betreffenden Rissen
durch die Verwendung eines wirkungsvollen biologischen Klebstoffes
würde von
großem
klinischen Wert sein. Dieser würde
die hohe Frequenz an postoperativer degenerativer Gelenkserkrankung
vermindern oder sogar verhindern.
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Eine Vielzahl von Substanzen sind
dafür bekannt,
das Potential zu besitzen, die Knorpelbildung zu stimulieren. Zum
Beispiel kann ein Kollagenschwamm-Implantat die Knorpel-Reparatur verbessern,
Speer, D. P., M. Chvapil, R. G. Volz and M. D. Holmes "ENHANCEMENT
OF HEALING IN OSTEOCHONDRAL DEFECTS BY COLLAGEN SPONGE IMPLANTS"
Clin Orthop 144: 326-335 (1997). Eine Vielzahl von Proteinen kann
die Knorpelbildung verstärken,
wie der transformierende Wachstumsfaktor beta, Seyedin, S. M., A.
Y. Thompson and H. Bentz "CARTILAGE-INDUCING FACTOR-α: APPARENT IDENTITY TO TRANSFORMING
GROWTH FACTOR-(3" J Biol Chem. 261(13): 5693-5695 und Sporn, M.
B., A. B. Roberts and L. M. Wakefieland R. K. Assoiand "TRANSFORMING
GROWTH FACTOR-β:
BIOLOGICAL FUNCTION AND CHEMICAL STRUCTURE" Science 233: 532-534
(1986), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Zapf, J. and E. R. Froesch
"INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS/SOMATOMEDINS: STRUCTUR, SECRETION,
BIOLOGICAL ACTIONS AND PHYSIOLOGICAL ROLF" Horm Res 24: 121-130
(1986) und der Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktor, Hauschka, P. V., A. E. Mavrakos and M. D. Iafrati
"GROWTH FACTORS IN BONE MATRIX: ISOLATION OF MULTIPLE TYPES BY AFFINITY
CHROMATOGRAPHY ON HEPARIN-SEPHAROSE" J Biol Chem 261(27): 12665-12674 (1986).
Weitere Anstrengung ist erforderlich, um die am meisten zweckmäßigen Faktoren
zu identifizieren und Wege zu finden, um diese an die Stelle der
Verletzung zu verabreichen und dort zu verankern (Buckwalter et al,
vorstehend). Ein verbesserter biologischer Klebstoff könnte jedoch
den Nutzen solcher bioaktiver Wirkstoffe außerordentlich fördern.
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Taylor et al. Clinical Research Bd.
40 1992, S. 31a beschreibt einen möglichen Ersatz für Faktor
XIII, wobei Serum-Transglutaminase in einem Multikomponenten-Gewebe-Klebstoff-System
verwendet wird, das Fibrinogen und Thrombin beinhaltet.
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Ein wirkungsvoller biologischer Klebstoff,
der ohne das Risiko einer Virus-Übertragung
verwendet werden kann, die zu Hepatitis B oder erworbenes Immundefizienz-Syndrom
(AIDS) führt,
würde in
der Tat neue therapeutische Möglichkeiten
für a11
die vorstehend beschriebenen Situationen eröffnen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In Übereinstimmung mit der Erfindung
wird eine formulierte biologische Klebstoffzusammensetzung bereitgestellt,
umfassend Gewebe-Transglutaminase und einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger,
wobei die genannte Gewebe-Transglutaminase in einer wirkungsvollen
Menge verabreicht wird, um die Gewebe-Adhäsion nach Behandlung von Gewebe
in Anwesenheit eines bivalenten Metallions zu fördern.
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Diese Erfindung betrifft eine formulierte
biologische Klebstoffzusammensetzung. Die Zusammensetzung enthält Gewebe-Transglutaminase
in einem pharmazeutisch akzeptablen wässrigen Träger. Bei ihrer Verwendung,
wird die Zusammensetzung, die die Gewebe-Transglutaminase in einer
wirkungsvollen katalytischen Menge (100 μg/ml bis 50 mg/ml) eingesetzt,
um die Adhäsion
zwischen Gewebe-Oberflächen
nach deren Behandlung zu fördern,
indem die Umsetzung zwischen Glutaminylresten und Amin-Donatoren
des Gewebes oder in dem Enzym selbst katalysiert werden. Der Träger enthält vorzugsweise
das bivalente Metallion, das die genannte Umsetzung fördert.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
die biologische Klebstoffzusammensetzung Gewebe-Transglutaminase
in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, der einen pH-Wert von
etwa 7 bis etwa 8,5, einen Puffer und Calcium (Ca2++)-Ionen
besitzt. Weiterhin benötigt
die Verwendung von Gewebe-Transglutaminase
nicht die Einbeziehung eines proteolytischen Enzyms in die Formulierung
und beschränkt
somit das Risiko der Gewebeschädigung
(wie sie zum Beispiel durch Thrombin und Plasmin induziert wird,
die in Fibrin-Klebstoffen, etc. vorliegen). Die Klebstoffzusammensetzung
kann gegebenenfalls eines oder mehrere Matrix-bildende Proteine
enthalten, wie Fibronectin, oder einen Wachstumsfaktor, wie den
transformierenden Wachstumsfaktor Beta.
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Die Gewebe-Transglutaminase kann
aus tierischen Zellen und aus zellulären Produkten erhalten werden.
Gewebe als Quellen, aus denen Transglutaminase-Enzyme zur Verwendung
in den biologischen Klebstoffzusammensetzungen hergestellt werden
können,
bestehen aus Zellen und zellulären
Produkten, beinhaltend viele Organe und Zelltypen des menschlichen
oder tierischen Körpers,
wie Lunge, Leber, Milz, Niere, Herzmuskel, Skelettmuskel, Augenlinse,
endotheliale Zellen, Erythrocyten, glatte Muskelzellen, Knochen
und Macrophagen.
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Die biologisch adhäsive Zusammensetzung
ist besonders geeignet zur Verwendung zur Behandlung von Gewebe-Oberflächen bei
orthopädischen
oder traumatologischen Operationen. Zusammensetzungen können auch
zur Behandlung von Biomatrices verwendet werden, die Zellen eingebettet
in eine Matrix beinhalten, wobei die Matrix biodegradierbar oder
nicht biodegradierbar sein kann. Die Biomatrices können auch natürlicherweise
auftreten, oder synthetische Proteine enthalten, die Transglutaminase-Substratstellen
besitzen. Die Adhäsion
zwischen natürlichen
Gewebe-Oberflächen
und einem Biomatrix-beschichteten Implantat-Material kann verstärkt werden.
Die Gewebe-Transglutaminase kann eine rekombinante DNA-Gewebe-Transglutaminase
sein und im Besonderen dort, wo die rekombinante DNA molekulare
Bereiche besitzt, die sich von einer natürlichen Gewebe-Transglutaminase
unterscheiden, ohne deren Verstärkung
der Adhäsion
zu beeinflussen.
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Die vorstehenden Merkmale dieser
Erfindung und anderer Ausführungsformen
der Klebstoffzusammensetzung und deren Verfahren zur Verwendung
werden mit Bezugnahme zu der nachfolgenden detaillierten Beschreibung
und den Figuren näher
verstanden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei
der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird;
Inkubationszeit: 10 Minuten.
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2 zeigt
den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei
der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird;
relative Inkubationszeit: 15 Minuten.
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3 zeigt
den Einfluss der tTG-Konzentration auf die Scherkraft, die für die Ablösung der
Knorpelzylinder bei der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50
% benötigt
wird.
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4 zeigt
den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei
der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % oder 80 % benötigt wird;
Inkubationszeit: 15 Minuten.
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5 zeigt
den Einfluss der Scherkraft, die für die Ablösung der Knorpelzylinder bei
der relativen Inkubationsfeuchtigkeit von 50 % benötigt wird;
Inkubationszeit: 10 Minuten; mit (tTG +CAC) oder ohne (tTG) vor der
5-minütigen
Knorpelzylinder-Oberflächenbehandlung
durch Chondroitinase AC (CAC).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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- A. Gewebe-Transglutaminase
- Quellen, von denen Transglumatinase-Enzyme hergestellt werden
können,
die in biologischen Klebstoffzusammensetzungen verwendet werden,
bestehen aus Zellen und zellulären
Produkten, die zahlreiche Organe und Zelltypen des menschlichen
oder tierischen Körpers
beinhalten, wie Lunge, Leber, Milz, Niere, Herzmuskel, Skelettmuskel,
Augenlinse, Endothelzellen, Erythrocyten, glatte Muskelzellen, Knochen
und Macrophagen. Die Gewebequelle für das Enzym kann für die jeweilige
medizinische Indikation ausgewählt
oder spezifisch angepasst werden. Der Begriff "Gewebe-Transglutaminase"
(tTG = Transglutaminase II = Transglutaminase Typ C) oder Transglutaminase,
wie hierin verwendet, spezifiziert diese Form des Enzyms unabhängig vom
zellulären
Ursprung oder von posttranslationalen Modifikationen, K. Ikura,
T. Nasu, H.Yokata, Y. Tsuchiya, R. Sasaki, and H. Chiba "AMINO ACID SEQUENCE
OF GUINEA PIG LIVER TRANSGLUTAMINASE FROM ITS cDNA SEQUENCE." Biochemistry
27: 2898-2905 (1988). Die Enzyme können mit Hilfe von rekombinanter DNA-Technologie
hergestellt werden und können
in Bereichen verändert
werden, die die aktive Stelle nicht beeinflussen, um bessere Bedingungen
für die
Anwendung (z. B. Aufbewahrungsstabilität, Verfahren zur Anwendung,
Glutaminyl-Substrat-Qualität,
etc.), höhere
immunologische Toleranz oder in bestimmten Fällen enzymatische Kapazität zu erhalten.
- B. Pharmazeutisch akzeptable Träger oder Medien
- Die Gewebe-Transglutaminase wird in einem pharmazeutisch verträglichen
wässrigen
Träger
oder Medium formuliert. Der Träger
enthält
einen puffernden Wirkstoff, um den pH-Wert in dem Bereich von etwa
7 bis etwa 8,5 zu erhalten. Ein Tris-Puffer oder HEPES-Puffer kann zum Einsatz
kommen. Der bevorzugte Tris-Puffer ist Tris-(Hydroymethyl)-aminomethanhydrochlorid.
Andere Typen von Puffern können
verwendet werden, es ist jedoch wünschenswert Carbonat-, Acetat-
und Phosphat-Puffer hoher Konzentrationen (oder im Überschuss über die
Ca2+-Ionen), wegen der niedrigen Löslichkeit
von Calcium-Ionen
in solchen Puffern, auszuschließen. Bevorzugt
sind Calcium (Ca2+)-Ionen ebenfalls in einer
Konzentration oberhalb von 0,5 mM vorliegend, vorzugsweise etwa
50-100 mM für
Knorpel, um die Reaktion zu verstärken. Strontium ist ein anderes
Beispiel für ein
bivalentes Metallion, das verwendet werden kann.
- C. Matrix-Protein
- Die biologische Klebstoffzusammensetzung kann gegebenenfalls
ein Matrix-bildendes Protein enthalten. Das Protein kann hinsichtlich
der Menge und der Natur der Inhaltsstoffe an eine besondere Verwendung
angepasst sein und wird ausgewählt
aus Kollagen, Fibrin, Fibrinogen, Fibronektin, Entactin, Osteonektin,
Osteopontin, Thrombospondin, Vitronektin, β-Lactoglobin und Casein, und
Gemischen davon. Im Allgemeinen kann wahlweise jedes Protein dort
in der Klebstoffzusammensetzung zum Einsatz kommen, wo diese eine
oder mehrere Amin-Akzeptorstellen für die Gewebe-Transglutaminase-katalysierte
Reaktion besitzt.
- D. Wachstumsfaktor
- Die biologisch Klebstoffzusammensetzung kann. auch einen Wachstumsfaktor
enthalten, der ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus der Familie der transformierenden
Wachstumsfaktoren ß,
der Transformations-Wachstumsfaktor-α-Familie, der Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktor-Familie, epidermalem Wachstumsfaktor, der aus Blutplättchen gewonnenen
Wachstumsfaktor-Familie, der Tumor-Nekrose-Faktor-Familie, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Familie
und Interleukin.
- E. Orthopädische,
traumatologische oder plastische Chirurgie-Verwendungen
- Die biologische Klebstoffzusammensetzung kann zur Behandlung
von Gewebeoberflächen
bei orthopädischen
oder traumatologischen Operationen zum Einsatz kommen, die ausgewählt sind
aus der Gruppe bestehend aus Gelenkfrakturen, Knorpeldefekten, oberflächlichen
Knorpeldefekten (Knorpeldefekten), Vollknorpeldefekten, Osteochondritis
dissecans, Meniskusrissen, Ligamentrissen, Sehnenrissen, Muskelläsionen,
Muskel-Sehnen-Verbindungsläsionen,
Cartilago-Transplantation, Knochengewebe-Transplantation, Ligamenttransplantation,
Sehnentransplantation, Knorpeltransplantation, Knorpel-Knochen-Transplantation,
Hauttransplantatfixierung, Transplantieren (Reparieren) von Nerven
und Blutgefäßen, Patching
von Gefäßtransplantaten
oder mikrovaskulärer
Blutgefäß-Anastomose, und
zur Behandlung von Kombinationen der genannten Gewebeoberflächen. (siehe
Schlag, G. Rede, H. (Hrsg.) "FIBRINSEALANT IN OPERATIVE MEDICINE",
Traumatology Orthopaedics Bd. 7. Springer Verlag, New York 1986).
- F. Andere Verwendungen
- Die biologische Klebstoffzusammensetzung kann bei anderen Verwendungen
zum Einsatz kommen, wie Embryotransfer und Verwendungen wie für Fibrin-Klebstoff
zur Verstärkung
der Adhäsion
zwischen einer Gewebe-Oberfläche
und einem mit einer Biomatrix beschichteten Implantationsmateriai.
Das Biomatrix-Implantat kann
darüber
hinaus ein natürlicherweise
vorkommendes oder synthetisches Protein enthalten, das Transglutaminase-Substratstellen
besitzt. Die Matrix kann biodegradierbar oder nicht biodegradierbar
sein und der Klebstoff kann für
die Verwendung von Zellen, die in die Matrix eingebettet sind (mesenchymale
Zellen, Chondroblasten, Chondrocyten, Stammzellen etc.) eingesetzt
werden. Eine Modifikation des Verfahrens kann die Vorbehandlung
von Gewebe-Oberflächen mit
Verdauungsenzymen beinhalten, die verwendet werden können, um
die Haftung zu verstärken.
Zum Beispiel die Vorbehandlung von Gewebe-Oberflächen mit Chondroitinase AC
oder ABC und/oder anderen Verdauungsenzymen, um die Verfügbarkeit
von Substraten für
die Gewebe-Transglutaminase zu verstärken und deshalb die Klebfähigkeit
zu erhöhen
(siehe 4).
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MOLEKULARE GRUNDLAGE FÜR DEN VORGESCHLAGENEN
BIOLOGISCHEN KLEBSTOFF
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Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Zusammensetzung
verwenden die Quervernetzung von Gewebe-Oberflächenproteinen durch Gewebe-Transglutaminase
unter Bedingungen, die physiologische Ereignisse nachahmen und eine klebende
Wirkung erlauben, sogar ohne die Zugabe von exogenen Substratproteinen.
Es unterscheidet sich von Verfahren, die auf bekannten, kommerziell
erhältlichen Klebstoffen
begründet
sind, durch die Verwendung von Gewebe-Transglutaminase anstelle
von Faktor XIII, der Plasma-Transglutaminase. Die erfindungsgemäßen biologischen
Klebstoffe stellen eine ausgedehnte Spezifität bereit und erlauben das Kleben
von Gewebe-Oberflächen
durch die Wirkung des Enzyms alleine, ohne irgendwelche anderen
Proteinzusätze.
Es wurde gefunden, dass der biologische Klebstoff Gewebe-Adhäsion bereitstellt,
die gegenüber
stärkeren
Scherkräften
stabil ist, als denjenigen, die mit handelsüblich erhältlichen Klebstoffen assoziiert
sind, die den Faktor XIII enthalten.
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Die Schlüsselsubstanz in dem erfindungsgemäßen biologischen
Klebstoff ist Gewebe-Transglutaminase, ein Enzym, das eine chemische
Reaktion katalysiert, bei der Proteine miteinander quervernetzt
werden, um ein netzartiges Polymer zu bilden. Sie gehört zu einer
großen
Familie von Enzymen, als Transglutaminasen bezeichnet, von denen
gezeigt wurde, dass sie eine weitreichende Verteilung unter Geweben
und Körperflüssigkeiten
besitzen. Proteine werden während
zahlreicher physiologischer Prozesse durch Trangslutaminasen modifiziert,
z. B. in Fibrin-Klumpen während
der Hämostase
und der Wundheilung, in Zellmembranen terminal differenzierter Zellen,
in verschiedenen Typen von extrazellulären Matrices und bei der Bildung
der verhornten Hülle
der Epidermis. Während
nur in einigen wenigen Fällen
die biologische Funktion bekannt ist, ist der Mechanismus der Wirkung
von Transglutaminase auf molekularer Ebene gut charakterisiert.
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Transglutaminase (EC 2.3.2.13) katalysiert
eine Ca
2+abhängige Acyl-Transferreaktion,
in der neue γ-Amid-Bindungen
zwischen γ-Carboxamid-Gruppen
der Peptid-gebundenen Glutaminreste und verschiedener primärer Amine
gebildet werden (Folk, J. E. "TRANSGLUTAMINASES" Ann Rev Biochem
49: 517-531 (1980); Folk, J. E. and J. S. Finlayson "THE ε-(γ-GLUTAMYL)LYSINE CROSSLINK
AND THE CATALYTIC ROLE OF TRANSGLUTAMINASES" Adv Protein Chem 31:
1-133 (1977) and Lorand, L. and S. M. Conrad "TRANSGLUTAMINASES"
Mol Cell Biochem 58: 9-35 (1984). Ein Glutaminrest dient als Acyl-Donor
und die am meisten gebräuchlichen
Acyl-Akzeptoren sind ε-Aminogruppen von
Peptid-gebundenen Lysinresten (Reaktionsschema I) oder primäre Aminogruppen
von einigen natürlicherweise
auftretenden (Poly)-Aminen, wie Putrescin oder Spermidin (Reaktionsschema
II). Im ersten Fall resultiert die Reaktion in der Bildung von γ-Glutymal-ε-Lysin-Quervernetzungen,
entweder innerhalb von oder zwischen Proteinen. Die Umsetzungen
entsprechend dem zweiten Schema resultieren in Modifikationen, die
möglicherweise
die biologische Aktivität
und die Umsetzung des Proteins beeinflussen, jedoch nicht in Polymer-Bildung. Reaktionsschema
I
Reaktionsschema
I
wobei P = Protein und R = organische Seitenkette
von variabler Struktur bedeutet.
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Die Anzahl von Proteinen, die als
Glutaminyl-Substrate wirken, ist stark eingeschränkt, da sowohl die Primärstruktur
als auch die Konformation bestimmen, ob ein Glutaminrest reaktiv
ist oder nicht. Im Gegensatz dazu ist die Toleranz gegenüber strukturellen
Unterschieden bei Acyl-Akzeptoren bemerkenswert, da die einzige
Erfordernis die Anwesenheit einer -(CH2)4-NH2-Gruppe ist.
Dies erklärt
warum sowohl Protein-gebundene Lysinreste als auch kleine primäre Amine
als Amin-Donoren dienen können.
Somit sind in einem bestimmten Gewebe nur eine kleine Untergruppe
von Proteinen Glutaminyl-Substrate
für das
Enzym, wohingegen die meisten Proteine des Gewebes in der Lage sind, ε-Aminogruppen
von Lysinresten beizusteuern, die als Acyl-Akzeptoren bei der Vernetzungsreaktion
dienen sollen. Darüber
hinaus variiert die Spezifität
für unterschiedliche
Glutaminyl-Substrate in Abhängigkeit
von dem Typ von Transglutaminase. Mehrere Typen von Transglutaminase
können
ein einzelnes Protein als Substrat erkennen, jedoch häufig mit
unterschiedlicher Affinität
und/oder mit Spezifität
für verschiedene
Glutaminreste. Bestimmte Proteine können nur für ein einziges Mitglied der
Transglutaminase-Familie als Substrate dienen. Faktor XIII, die
Plasma-Transglutaminase, ist ein notwendiger Bestandteil der handelsüblich erhältlichen
Fibrin-Klebstoffe, wirkt jedoch auf eine viel stärker eingeschränkte Gruppe
von Proteingebundenen Glutaminen als die Gewebe-Transglutaminase,
Gorman, J. J. and J. E. Folk "STRUCTURAL FEATURES OF GLUTAMINE SUBSTRATES
FOR TRANSGLUTAMINASES" J Biol Chem 256(6): 2712-2715 (1981) und Gorman, J. J. and J.
E. Folk "STRUCTURAL FEATURES OF GLUTAMINE SUBSTRATES FOR TRANSGLUTAMINASES"
J Biol Chem 259(14): 9007-9010 (1984). Gewebe-Transglutaminase ist
ein hauptsächlich
intrazelluläres
Enzym mit einer breiten Gewebeverteilung, Greenberg, C. S., P. J.
Birckbichler and R. H. Rice "TRANSGLUTAMINASES: MULTIFUNCTIONAL
CROSS-LINKING ENZYME THAT STABILIZES TISSUES" FASEB J5: 3071-3077
(1991).
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Der erfindungsgemäße Klebstoff verwendet Gewebe-Transglutaminase
eher als Faktor XIII, wobei ein hauptsächlicher Vorteil darin liegt,
dass deren breit angelegte Substrat-Spezifität eine stärkere Haftung bereitstellt.
Faktor XIII existiert als ein Tetramer, a2b2 (Mr~320.000), zusammengesetzt aus einem
Dimer der katalytischen α-Untereinheit
(Mr jeweils ~ 83.000) und zwei regulatorischen β-Untereinheiten (Mr ~ 80.000),
wenn er im Blutplasma zirkuliert, oder als ein Dimer von ausschließlich der α-Untereinheit
in z. B. Blutplättchen,
Leukocyten und Placenta, Carrell, N. A., H. P. Erockson and J. McDonagh
"ELECTRON MICROSCOPY AND HYDRODYNAMIC PROERTIES OF FACTOR XIII SUBUNITS"
J Biol Chem 264(1): 551-556 (1989). Die α-Untereinheit von Faktor XIII hat einen
hohen Grad an Sequenzhomologie mit Gewebe-Transglutaminase, die
Proteine stammen jedoch von unterschiedlichen Genen ab, Ichinose,
A., R. E. Bottenus and E. W. Davie "STRUCTURE OF TRANSGLUTAMINASES"
J Biol Chem 265(23): 13411-13414 (1990). Faktor XIII ist ein Zymogen, das
durch Thrombin-Spaltung und die nachfolgende Ca2+-abhängige Dissoziation
in aktive α-Untereinheiten und
inaktive β-Untereinheiten
zum Faktor XIIIa aktiviert wird. Die handelsüblich erhältlichen Fibrin-Klebstoffe werden
aus einer partiell gereinigten Fraktion von menschlichem Blutplasma
hergestellt, das die aktiven Mittel (Substanzen) Faktor XIII, Fibrinogen,
Fibronektin, Thrombin, CaCl2 enthält.
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Die reichlich vorhandene Gewebe-Transglutaminase
ist ein monomeres globuläres
Protein mit einer molekularen Masse von etwa 77.000 (Greenberg et
al, vorstehend und Ichinose et al, vorstehend) und benötigt im
Gegensatz zu Faktor XIII keine proteolytische Aktivierung. Diese
Eigenschaft macht reproduzierbare Anwendungen leichter. Eine Anzahl
von Mitteln, wie transformierende Wachstumsfaktor β und der
Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktor sind zuvor beschrieben worden, die Knorpelbildung
zu stimulieren und können
gemeinsam mit dem erfinderischen Klebstoff verwendet werden, um
eine optimale Regenerierung zu erreichen. Wir haben vor kurzem gezeigt,
dass Gewebe-Transglutaminase in einer Vielzahl von Knorpeln exprimiert
wird. Aeschlimann, D., Wetterwald, A., Fleisch, H., and Paulsson,
M. "EXPRESSION OF TISSUE TRANSGLUTAMINASE IN SKELETAL TISSUES CORRELATES
WITH EVENTS OF TERMINAL DIFFERENTIATION OF CHONDROCYTES", J Cell
Biol, Bd. 120[6], Seite 1461 bis 1470 (1993). Gewebe-Transglutaminase
katalysiert wahrscheinlich physiologisch auftretende Quervernetzungen
im Knorpel und in dieser Hinsicht ahmt der erfinderische Klebstoff
einen natürlicherweise
vorkommenden Prozess nach. Als Konsequenz daraus kommen sowohl das
Enzym als auch seine Reaktionsprodukte in normalem Knorpel vor und
es ist unwahrscheinlich, dass sie toxisch sind. Transglutaminasen
katalysieren Protein-Quervernetzung während der Bildung der verhornten Hülle, die
die oberflächliche
Schicht der Epidermis bildet, Thacher, S. M. and R. H. Rice "KERATINOCYTE-SPECIFIC
TRANSGLUTAMINASE OF CULTURED HUMAN EPIDERMAL CELLS: RELATION TO CROSS-LINKED
ENVELOPE FORMATION AND TERMINAL DIFFERENTIATION" Cell 40: 685-695
(1985). Da die gewaltige Produktion von Quervernetzungen in der
Haut keine immunologische Antwort induziert, scheint es, dass die
Produkte, die durch Gewebe-Transglutaminasen gebildet werden, nicht
immunogen sind.
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Als eine wichtige Voraussetzung für die Verwendung
des (tTG)-Enzyms in den stark kollagenhaltigen skelettalen Geweben
sind die Kollagene, die in Knochen und Sehne, Typ III (Bowness et
al, 1987) und in Knorpel, Typ II (Aeschlimann et al, 1993, vorstehend),
exprimiert werden, Substrate für
das Gewebe-Transglutaminase-Enzym.
Die Beobachtung, dass einige andere extrazelluläre Substratproteine eng mit
dem vaskulären Endothel
assoziiert sind, wie Entactin, Osteonektin, (Aeschlimann, D. and
M. Paulsson "CROSS-LINKING OF LAMININ- NIDOGEN COMPLEXES BY TISSUE TRANSGLUTAMINASE"
J Biol Chem 266: 15308-15317 (1991); Aeschlimann, D., Wetterwald,
A., Fleisch, H., and Paulsson, M. "EXPRESSION OF TISSUE TRANSGLUTAMINASE
IN SKELETAL TISSUES CORRELATES WITH EVENTS OF TERMINAL DIFFERENTIATION OF
CHONDROCYTES", J Cell Biol (1993), in press), Vitronektin, Fibronektin
und Fibrin ogen) (Greenberg, C. S., P. J. Birckbichler and R. H.
Rice "TRANSGLUTAMINASES: MULTIFUNCTIONAL CROSS-LINKING ENZYMES THAT
STABILIZE TISSUES" FASEB J. 5: 3071-3077 (1991)), erweitert den
potenziellen Anwendungsbereich von Gewebe-Transglutaminase auf die
Regenerierung (Reparatur) vaskularer Läsionen.
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Beispiele
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Ein in vitro-System zur quantitativen
Bewertung der adhäsiven
Stärke
von biologischen Klebstoffen wurde entwickelt, um in der Lage zu
sein, die adhäsive
Stärke,
die mit handelsüblich
erhältlichen
Formulierungen erhalten wird, mit der zu vergleichen, die anhand
des erfindungsgemäßen biologischen
Klebstoffs erzielt wird.
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Gewebe-Transglutaminase (tTG) wurde
aus Meerschweinchen-Leber
mit Hilfe von DEAE-Cellulose-Chromatographie des Überstands
aus Leberhomogenat, gefolgt von einer Protamin-Präzipitation
des Enzyms, einer selektiven Extraktion mit Ammoniumsulfatlösung und
einer erneuten Chromatographie über
eine Molekularsieb-Säule,
aufgereinigt, Connellan, J. M., S. I. Chung, N. K. Whetzel, L. M.
Bradley and J. E. Folk "STRUCTURAL PROPERTIES OF GUINEA PIG LIVER
TRANSGLUTAMINASE" J Biol Chem 246(4): 1093-1098 (1971). tTG wurde
vereinigt (gepoolt) und in 10 mM Tris/Acetat (pH 6,0), enthaltend
1 mM EDTA und 150 mM NaCl auf 1 mg/ml konzentriert, Aeschlimann,
D. and M. Paulsson "CROSS-LINKING OF LAMININ-NIDOGEN COMPLEXES BY
TISSUE TRANSGLUTAMINASE" J Biol Chem 266: 15308-15317 (1991).
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Gewebe-Transglutaminase wurde mit
einem handelsüblich
erhältlichen
Fibrin-Klebstoff (Tissucol) und drei anderen Typen von Kontrollen
(NaCl-Lösung,
Tris-Reaktionspuffer und Inkubation ohne Behandlung) verglichen.
Tissucol besteht aus zwei Lösungen,
die vor der Verwendung vermischt werden. Ein Teil besteht aus 75-115
mg/ml Fibrinogen, 2-9 mg/ml Plasma-Fibronektin, 10-50 U/ml Faktor XIII
und 40-120 μg/ml
Plasminogen. Die andere wird in 53 mM CaCl2 auf
4 IU Thrombin eingestellt. Nach Erwärmen auf 37° C und Vermischen werden die
beiden Komponenten auf den Knorpeloberflächen verwendet. Gewebe-Transglutaminase-Klebstoff
besteht aus zwei Lösungen:
A) Gewebe-Transglutaminase (1 mg/ml in 10 mM Tris/Acetat, pH 6,0,
150 mM NaCl, 1 mM EDTA) und B) Tris-Reaktionspuffer (0,1 M CaCl2 in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl), die
auf getrennten Gewebe-Oberflächen
verwendet werden und die vermischt werden, indem die beiden Gewebe-Oberflächen aneinandergefügt werden.
Eine 0,9 % NaCl-Lösung,
Tris-Reaktionspuffer
und nicht behandelte Knorpeloberflächen wurden als Kontrollen
verwendet.
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Die Vorbehandlung mit 4 μl Chondroitinase
AC (CAC) (Sigma), gelöst
in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (GIBCO),
in einer Aktivität
von 1 U/ml, auf jeder der Knorpeloberflächen, wurde 5 Minuten bei 37° C in einer
feuchten Kammer durchgeführt,
gefolgt von einer gründlichen
Spülung
mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung und
einem sorgfältigen
Trocknen mit Zellwatte. Diese Vorbehandlung führte zu einer Depolymerisation
von Glycosaminoglycanen (Chondroitin 4-Sulfat und Chondroitin 6-Sulfat) und hat deshalb
wahrscheinlich mehr Substratstellen zugänglich gemacht, Carney, S.
L. "PROTEOGLYCANS. CARBOHYDRATE ANALYSIS" Oxford, IRL Press (1986).
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Mit einem Myelotomie-Bohrer (Institut
Straumann, Schweiz) wurden aus der Schulter eines Rinds 10 bis 20
Stunden nach der Schlachtung Knorpel-Knochen-Zylinder mit einem
Durchmesser von 3,9 mm erhalten. 50 % des Vollknorpels wurden senkrecht
zur Längsachse
des Zylinders mit einer Rasierklinge herausgeschnitten.
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Die Oberflächen wurden mit 4 μl tTG-Lösung und
4 μl Tris-Reaktionspuffer,
1 Tropfen Fibrin-Klebstoff oder 8 μl der Kontroll-Lösungen behandelt
oder unbehandelt belassen: Die beiden Knorpelzylinder wurden sofort
mit ihren geschnittenen Oberflächen
aneinandergefügt
und ein 80 g-Gewicht wurde vertikal angebracht, während der
Aufbau 10-15 Minuten bei 37° C
in einer feuchten Kammer (relative Feuchte 50 oder 80 %)
inkubiert wurde. Auf den oberen Knorpelzylinder wurde eine kontrollierte
linear hochlaufende Schwerkraft eingesetzt (0,27 N/s). Die Schwerkraft
wurde über
einen Signalgenerator (Wavetech) und einen Verstärker reguliert, der durch eine
elektromagnetische Spule und einen ferrimagnetischen Impuls eingesetzt
wurde, und mit einer speziell entworfenen Kraftmesszelle gemessen
(Präzision
1,0 × 10-3 N). Die Kraftmesszelle war mit einem dynamischen
Dehnmess-Streifen-Verstärker verbunden
(DMD 20A, Hottinger Baldwin Messtechnik, Schweiz). 720
Werte in 3 Sekunden wurden auf einer Daten-Registriereinrichtung aufgezeichnet
(Mikromec, Suprag, Schweiz), von wo sie auf einen Computer (Macintosh
LC) übertragen
wurden. Parallel dazu können
durch die Digitalisierung der resultierenden Kraft das Eingabesignal
(linearer Auflauf) und die gemessenen Werte mit einem Oscilloskop
sichtbar gemacht werden.
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Die Verwendung der tTG für exponierte
Oberflächen
von zylindrischen Knorpelgewebe-Beispielen ergab eine viel höhere adhäsive Wirkung,
als in der Kontrollgruppe, wo ausschließlich NaCl-Lösung, Tris-Reaktionspuffer
oder keine Lösung
verwendet wurden (p < 0,01,
Wilcoxon vorzeichenbehafteter Rangtest) (1).
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Die gleiche Wirkung wurde verzeichnet
nach Erhöhung
der Inkubationszeit von 10 Minuten (1)
auf 15 Minuten ( 2),
obwohl die Scherkraft, insbesondere in der NaCl-Gruppe, eine Tendenz
zeigte, zuzunehmen. Darüber
hinaus war der produzierte adhäsive
Effekt abhängig
von der Konzentration an Gewebe-Transglutaminase (siehe 3).
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Ein Vergleich von tTG mit Tissucol
zeigte eine vergleichbare Haftungsfähigkeit bei 50 % relativer Feuchtigkeit,
wohingegen viel der adhäsiven
Wirkung von Tissucol (aber nicht von tTG) verloren ging, wenn die
relative Feuchtigkeit auf 80 % erhöht wurde (4). Die Haftungswirkung von tTG bei vorheriger
Verwendung von Chondroitinase AC ist in 5 gezeigt.