DE69432636T2

DE69432636T2 - Pyrimidinderivate als markierte bindungspartner

Info

Publication number: DE69432636T2
Application number: DE69432636T
Authority: DE
Inventors: D. Mark MATTEUCCI; J. Robert JONES; Kuei-Ying Lin
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2014-09-17
Also published as: ATE239752T1; US6967079B2; WO1995007918A2; US6617437B1; US5763588A; US6005096A; EP0719272A1; EP0719272B1; WO1995007918A3; JPH09506859A; US20030207824A1; US5502177A; DE69432636D1; JP4098356B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Markern und speziell von Markern zur Verwendung in der Diagnostik. Speziell betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die zur Verstärkung der Bindungsaffinität der Oligonukleotide zu komplementären Sequenzen modifiziert sind und die zusätzlich eine leicht detektierbare Charakteristik haben.
Das Sequenz-spezifische Binden von Oligonukleotiden sowohl an einsträngige RNA und DNA als auch an zweisträngige DNA ist weithin bekannt. Dieses Phänomen ist in einer großen Vielzahl von diagnostischen, präparativen und therapeutischen Aufgaben genutzt worden. Ein Forschungsthema auf diesem Gebiet war bisher die Erhöhung der Affinität solcher Oligonukleotide zu ihren komplementären Sequenzen. Beispielsweise haben Froehler et al. Oligonukleotide beschrieben, die 5-substituierte Pyrimidin-Basen enthalten und die das Tm für das Oligonukleotid-Binden an komplementären Basen wesentlich verstärken (Internationale Patentanmeldung Nr. 93/10820).
Fluoreszente Cytosin-Derivate sind für ihre Verwendung bei der Herstellung markierter DNA-Sonden bekannt. Siehe hierzu Inoue et al., Jpn Kokai JP 62059293 ,, (1987). Darüber hinaus sind fluoreszente, markierte Nukleotide in der DNA-Sequenzierung eingesetzt worden. Siehe hierzu Prober et al., "Science" 238: 336–341 (1987).
1,3-Dihydro-2H-imidazo[4,5-b]-chinolin-2-on-Derivate sind Phosphodiesterase-Inhibitoren, die von Raeymaekers et al. (EP-P-541 153) offenbart wurden.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Erhöhung der Affinität von Oligonukleotiden zu ihren komplementären Sequenzen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung verbesserter detektierbarer Marker zur Verwendung in Diagnoseassays.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verstärkung von Diagnoseassays, bei denen Oligonukleotide eingesetzt werden.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit von Oligonukleotiden.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden unter Hinzunahme der Patentbeschreibung als Ganzes offensichtlich.
STRUKTURFORMELN
Die Strukturformeln sind mit in Klammern gesetzten Zahlen bezeichnet. Es ist selbstverständlich, dass die Bezeichnung des aromatischen Charakters im Bezug auf Carbocyclen und Heterocyclen hierin jede beliebige resonante, ungesättigte Ringstruktur einbezieht. Andererseits stellt die Angabe von Doppelbindungen, sofern angegeben, eine der möglichen Strukturen für die dargestellte Verbindung dar, wobei jedoch als selbstverständlich gilt, dass andere Resonanzzustände der Verbindung sowie protonierte und geladene Vertreter mit einbezogen sind, von denen lediglich einer dargestellt ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß den Aufgaben wird hierin eine Verbindung gewährt, die die Struktur hat:
worin R¹ ein Bindungspartner ist, ein Linker oder H;
a und b sind Null oder 1 unter der Voraussetzung, dass die Summe von a und b Null oder 1 ist;
A ist N oder C;
X ist S, O, -C(O)-, NH oder NCH₂R⁶;
Y ist -C(O)-;
Z bildet zusammengenommen mit C-A eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, die 5 oder 6 Ringatome aufweist und worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom aufweist, eine einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, zwei N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder drei N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens 2 durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ringkohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens 1 nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶ oder =O;
R³ ist eine schützende Gruppe oder H;
R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂,
C=N oder Halogen, oder ein R⁶ bildet zusammen mit einem angrenzenden R⁶ einen Ring, der 5 oder 6 Ringatome enthält; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon; und unter der Voraussetzung, dass, wenn a Null ist, b 1 ist und R¹ die Formel hat:
worin D² unabhängig Hydroxyl ist, geblocktes Hydroxyl, Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Oligodesoxyribonukleotid, das ansonsten lediglich die Basen A, G, T und C enthält; und
D³ ist H oder OH;
sodann bildet Z zusammen mit C-A ein nicht substituiertes Phenyl.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen bildet Z zusammen mit C-A einen Aryl-Ring, der substituiert ist mit C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R^3')₂, C=N oder Halogen und R¹ die Formel hat
D ist eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe;
D¹ ist unabhängig F, H, O-Alkyl, S-Alkyl oder eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe, wobei lediglich eines der D¹ eine koppelnde Gruppe ist.
Wenn der Bindungspartner R¹ ein Oligomer ist, haben Ausführungsformen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Struktur (8).
worin D OH ist oder geblocktes OH;
D¹ ist eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe oder OH;
X¹ ist unabhängig eine Phosphodiester-Verknüpfung oder eine substituierte Phosphodiester-Verknüpfung, die in Stellung 2' oder 3' an einem Furanose-Ring gebunden ist, wobei die verbleibende 2'- oder 3'-Stellung mit R²¹ substituiert ist;
R²¹ ist H, OH, F, -O-Alkyl(C₁-C₁₂), -S-Alkyl(C₁-C₁₂), OC₃H₅ oder SC₃H₅;
n ist eine ganze Zahl von Null bis 98; und
B ist eine Purin- oder Pyrimidin-Base oder ein Analog davon unter der Voraussetzung, dass mindestens eines der B die folgende Struktur hat:
worin a, b, A, X, Y, Z und die Bedingungen gleich wie in der Struktur (1) sind.
Die Verbindungen der Struktur (1) werden über mehrere neuartige Intermediate hergestellt. Die 4-Pyridone werden aus einem Intermediat erhalten, das die Struktur (2) hat:
worin R¹ H oder einer Linker-Gruppe ist;
J ist eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, die 5 oder 6 Ringatome aufweist, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes Sund ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder zwei N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ringkohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens ein nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶; und
R⁶ wie vorstehend festgelegt;
und Tautomere, Salze und Solvate davon.
Die 2-Pyridone werden synthetisch dargestellt aus den Intermediaten der Strukturen (3) und (6):
worin R¹ H oder einer Linker-Gruppe ist;
R²² ist ein C₁-C₃-Alkyl; und
J' ist eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, die 5 oder 6 Kohlenstoffatome aufweist und worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder zwei N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ringkohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens ein nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoffatom substituiert ist mit C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R^3')₂ oder Halogen;
R³ ist eine schützende Gruppe oder H; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon;
worin A unabhängig S, O, N oder CR⁶ ist;
R⁶ ist wie vorstehend festgelegt; und
R²⁶ ist C₁-C₄-Alkyl; sowie Tautomere, Salze und Solvate davon.
Phenoxazine und Oxadiazine werden ebenfalls aus dem neuartigen Intermediat (5) hergestellt, wie beispielsweise Pyridinopyrroline, Thiazine und Oxazine.
worin R¹ H oder einer Linker-Gruppe ist;
R²⁴ ist unabhängig Halogen oder C₁-C₂-Halogenalkyl;
R²⁵ ist unabhängig -SH, -OH, =S oder =O;
A ist unabhängig N oder C; und
M bildet zusammengenommen mit dem Rest -A-C(-R²⁵) eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, die 5 oder 6 Ringatome aufweist und worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, zwei N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind oder drei N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens zwei durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ringkohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens ein nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶; und
R6 wie vorstehend festgelegt;
sowie Tautomere, Solvate und Salze davon.
Die Phenopyrroline werden hergestellt unter Verwendung des Intermediats der Struktur (4)
worin R¹ H oder einer Linker-Gruppe ist;
J ist eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, die 5 oder 6 Ringatome aufweist, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes Sund ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder zwei N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ringkohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens ein nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶; und
R⁶ wie vorstehend festgelegt;
R²³ ist eine schützende Gruppe;
und Tautomere, Salze und Solvate davon.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Zeichnungen bezeichnen pR^l die R¹-Gruppen, in. denen die Hydroxyl-Gruppen geschützt sind, z. B. durch Acetylsubstitution, und in denen die verbleibenden Substituenten wie vorstehend festgelegt sind. Normalerweise werden die Reaktionsschemen in 1 bis 10 mit R¹ als eine Linker-Gruppe oder H ausgeführt; optional wird eine kovalente Bindung an dem Polymer nach den in den Reaktionsschemen dargestellten Schritten erreicht, wie eingehender nachfolgend beschrieben wird.
1 bis 10 zeigen jeweils Methoden für die Darstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Aus Gründen der Einfachheit sind die Reaktionsschemen für die gesamte Ringstruktur oder Teilringstruktur, kondensiert mit dem Pyrimidinyl-Rest bezeichnet. 1 bis 10 zeigen Methoden für: die Diazin- (1), Triazin- (2), 2-Pyridon- (3), 4-Pyridon- (4, 4-2 und 4-3), Phenopyrrolin- (5), Pyridinopyrrolin- (6), Thiazin- und Oxazin- (7), Phenoxazin- (8-1 und 8-2), Naphthyloxazin- (9) und Oxadiazin- (10-1 und 10-2)-Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
11 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung eines Linker-substituierten Thiazin-Derivats.
12-1 und 12-2 zeigen Syntheseverfahren für die Herstellung von Oligomeren der vorliegenden Erfindung, die derivatisierte Phosphodiester-Verknüpfungen enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verbindungen der Struktur (1) enthalten zwei interfunktionelle Abschnitte. Der Abschnitt der Struktur (1), der anders ist als R¹, bezieht sich auf eine polycyclische Substruktur; er ist fluoreszent und nimmt Teil an der Watson-Crick-Base-Paarung sowie an Stapel-Wechselwirkungen. Der verbleibende Abschnitt der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, R¹, stellt ein H-Atom dar, eine verknüpfende Gruppe oder einen Bindungspartner. Die polycyclische Substruktur, die verknüpfende Gruppe und der Bindungspartner werden nachfolgend nacheinander beschrieben.
VERBINDUNGEN DER STRUKTUR (1) – POLYCYCLISCHE SUBSTRUKTUR
Die polycyclische Substruktur ist eine weitgehend planare, kondensierte Heteroaryl- oder Arylfunktionalität, die im Allgemeinen als ein Cytosin-Austausch für die Basen-Paarung dient und die Fähigkeit besitzt, am Energieaustausch entweder mit anderen Verbindungen teilzunehmen, die eine polycyclische Substruktur haben, oder mit fluoreszierenden Gruppen oder Chromogenen, die keine polycyclische Substruktur besitzen. Die polycyclische Substruktur bildet ein Basenpaar mit Guanosin und fungiert im Allgemeinen als Cytosin bei der Hybridisierung mit Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden. Darüber hinaus sind Tautomere der nachfolgenden Diazin-Substruktur (9) in der Lage, entweder als Cytosin-Analoge (bei denen N^• protoniert ist) oder als Thymin-Analoge (worin N³ protoniert ist) zu dienen.
In der Struktur (9) sind X, a und R¹ wie vorstehend festgelegt und beide R^3'-Gruppen sind zur Bildung einer Heteroaryl-Ringstruktur cyclisiert, die 5 oder 6 Ringatome aufweist, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom; die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, zwei N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind oder drei N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens zwei durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ringkohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens 1 nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶; und
R⁶ wie vorstehend festgelegt ist.
Die polycyclische Substruktur besteht aus einem Pyrimidin-Rest, der mit zwei oder mehreren heterocyclischen oder Aryl-Ringen kondensiert ist. Im typischen Fall sind Ringstrukturen mit dem Pyrimidin-Rest kondensiert und umfassen die folgenden Strukturen (10) bis (17):

worin (N) die Bindung an das Pyrimidinyl-N darstellt:
Die kondensierte Ringstruktur, die Z aufweist, ist nicht entscheidend. Im typischen Fall ist Z zusammengenommen mit C-C oder C-N der angrenzende Ring, vervollständigt einen Einzelring-Aryl- oder Heteroaryl-Rest, der 5 oder 6 Ringatome enthält, obgleich in anderen Ausführungsformen R⁶-Gruppen an angrenzenden Ringkohlenstoffatomen zusammengenommen einen zusätzlichen Ring vervollständigen können, der 5- oder 6-Ringatome hat, normalerweise Phenyl, woraus eine kondensierte bicyclische Verbindung resultiert. In denjenigen Ausführungsformen, in denen Z zusammengenommen mit C-C oder C-N ein Heteroaryl-Rest ist, werden die Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1 bis 3 N-Atomen, 1 Sauerstoffatom, 1 S-Atom, 1 Sauerstoff und 1 N-Atom, die getrennt sind durch mindestens 1 Kohlenstoffatom, und 1 N-Atom und 1 S-Atom, die mindestens durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind. Die Z-Ringstruktur ist entweder unsubstituiert oder mindestens 1 nichtbrückenbildendes Ringkohlenstoff ist substituiert mit =O (oder seinem Tautomer) oder R⁶.
Normalerweise wird Z mit CH-A zusammengenommen, um eine der Folgenden Strukturen (18) bis (20):
worin R⁶ wie vorstehend festgelegt ist;
A¹ ist N oder CR⁶; und
G ist CH, S, O oder NR⁴, worin R⁴ wie vorstehend festgelegt ist. Eine Ausführungsform der Struktur (19) ist die Struktur (21):
worin R⁴ H ist oder C₁-C₆-Alkyl; und
R⁵ ist H, NO₂ oder C₁-C₆-Alkyl.
Eine Ausführungsform von Struktur (18) ist die Struktur (22):
worin R² C₁-C₆-Alkyl und R⁶ H ist.
Ausführungsformen von Struktur (20) sind Strukturen (23) bis (25):
worin A und R⁶ wie vorstehend festgelegt sind.
Normalerweise sind in den vorangegangenen Strukturen R⁶ H, C₁-C₆-Alkyl (n, s oder t), NO₂, NH₂, CN oder Halogen oder angrenzende R⁶ werden zusammengenommen, um ein Phenyl zu bilden, obgleich angrenzende R⁶ auch zusammengenommen werden, um einen Thiazol-, Imidazol-, Oxazol-, Pyridin- oder Pyrimidin-Ring zu bilden. Die R⁶-Amino-Gruppen sind gegen Elektrophile unter Verwendung einer schützenden Gruppe (im typischen Fall Basen-labil) geschützt, wenn die polycyclische Substruktur als ein Intermediat eingesetzt werden soll und speziell in solchen Fällen, wo R¹ ein Linker ist, der zur Verwendung in der Herstellung eines Oligonukleotids vorgesehen ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung der Formel (1) derart, dass Z zusammen mit C-A einen Aryl-Ring mit 6 Ringatomen oder einen Heteroaryl-Ring mit 1 Ring-N-Atom, 2 Ring-N-Atome, 1 Ring-Sauerstoffatom, 1 Ring-Stickstoff- und 1 Ring-Schwefelatome bildet, die durch mindestens 1 Kohlenstoffatom getrennt sind; und 3 Ring-Atome, von denen zwei mindestens durch 1 Kohlenstoffatom getrennt sind.
SUBSTITUENT R¹-LINKER
R¹-Linker-Gruppen werden verwendet, um die polycyclische Substruktur mit dem ausgewählten Bindungspartner kovalent zu binden, obgleich als selbstverständlich gilt, dass dieses nicht der einzige Zweck für die Linkerfunktionalität sein muss. So dient eine in den R¹-Linkern vorhandene Gruppe hauptsächlich als die Stelle für die kovalente Bindung der polycyclischen Substruktur mit einem Bindungspartner normalerweise durch Einbau der polycyclischen Substruktur über den Linker-Rest in einen polymeren Bindungspartner durch Pfropfen oder Copolymerisation.
R¹-Linker werden auch wahlweise substituiert mit Gruppen, die normalerweise an der Bindung zum Bindungspartner nicht teilnehmen, z. B. Halogen, Azido und geschütztes Hydroxyl. Im Allgemeinen wird die Linker-Gruppe 2 bis etwa 50 Atome enthalten. Wenn sie. einen Ring enthält, wird die Funktionalität im typischen Fall eine Sauerstoff-, Schwefel- oder Phosphor-enthaltende gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Verbindung sein, die insgesamt etwa 5 bis 7 Ringatome und 1 bis 3 Heteroatome hat. Zum größten Teil wird der Ring ein Zucker sein und im typischen Fall Furanose oder Furanose, die mit Phosphat, geschütztem Phosphat, Hydroxyl oder geschütztem Hydroxyl substituiert ist. Normalerweise ist R¹ ein abasischer Nukleotid-Rest oder ein solcher Rest, der so derivatisiert ist, dass er in ein Oligonukleotid eingebaut werden kann. Damit weist der R¹-Linker häufig eine aktivierte Gruppe oder andere Gruppe auf , die mit einem Polymer oder anderen Bindungspartner, der mit der polycyclischen Substruktur markiert werden soll, reagieren kann. Beispielsweise sind die nachfolgend bestehenden Gruppen verwendbar, die mit dem üblichen verfügbaren Oligonukleotid der Synthesechemie kompatibel sind. Andere Beispiele für Reaktanten-Gruppen zum kovalenten Markieren sind auf dem Gebiet der Diagnostik gut bekannt und bisher üblicherweise als Markerproteine und Oligonukleotid-Sonden verwendet worden, wie nachfolgend eingehender diskutiert wird.
In einer der Ausführungsformen ist R¹ eine organische Linker-Gruppe, wie beispielsweise Alkyl, Alken, Alkin, Alkoxyalkyl, Alkylthioalkyl, Alkoxy, eine gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Verbindung und dergleichen, die wahlweise mit mindestens einer Gruppe substituiert ist, die mit einem Polymer vernetzt oder in dieses eingebaut sein kann, z. B. Gruppen, wie beispielsweise Hydroxy, Amino, Carboxyl, Vinyl, Phosphat oder Phosphonat. Typische Beispiele für derartige Linker schließen ein:
E-CHR⁷-R¹¹-(CH₂)_m1-C(R⁸)((CH₂)_m1(R⁹))-(CH₂)_m1-R¹⁰(CH₂)_m1-,
E-Q-C₆H₄-CH₂-,
E-CHR⁷-O-CHR⁷-O-CHR⁷-,
E-CHR⁷-(CHR¹ ³)_m1-CHR¹⁴-R¹⁰-,
H(CH₂)_m1CH(COOR²⁰)(CH₂)_m1-,
worin D eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe ist;
D¹ ist unabhängig F, H, O-Alkyl, S-Alkyl oder eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe, wobei lediglich eines von D¹ eine koppelnde Gruppe ist;
Q ist -C(R¹²)₂-CH₂-, C(R¹²)₂-O-, -CR¹²=CR¹²- oder -C=C-;
R⁷ ist unabhängig H oder C₁-C₆-Alkyl;
R⁸ ist H oder C₁-C₄-Alkyl, C₂-C₄-Alkenyl oder Azidomethyl;
R⁹ ist Halogen, H oder OR²⁰
R¹⁰ ist O, CH₂ oder eine kovalente Bindung;
R¹¹ ist O, S, CH₂, CHF oder CF₂;
R¹² ist unabhängig H oder Halogen;
R¹³ ist H, Halogen, OR²⁰, CH₃, CH₂OR²⁰ oder C₃-C₆-Acyloxyalkyl;
R¹⁴ ist H, Halogen, OR²⁰, CH₃, CH₂OR²⁰, C₃-C₆-Acyloxyalkyl oder C₂-C₆-Acyloxy,
R¹⁵ ist CH₂, CHF oder O;
R¹⁶ ist CH oder S unter der Voraussetzung, dass, wenn R¹⁹ O oder S ist, oder R¹⁵ CH ist, dann R¹⁶ nicht S ist;
R¹⁷ ist H, OR²⁰, Halogen, N₃, C₁-C₄-Alkyl oder C₁-C₄-Alkoxy oder fehlt, wenn
R¹⁶ S ist;
R¹⁸ ist H, OR²⁰, Halogen, N₃, C₁-C₄-Alkyl oder C₁-C₄-Alkoxy;
R¹⁹ ist O, S, CH₂, CHF oder CF₂;
R²⁰ ist H oder eine schützende Gruppe;
ml ist unabhängig Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 4; und
E ist OH, OR²⁰, -PO₂ oder -OP(O)₂.
In einigen Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Linker-Gruppe HOCH(CHR¹³)CH₂- oder ECH₂OCH(CHR¹³)CH₂-. In den Ausführungsformen der Erfindung, in denen die Struktur (1) als ein Monomer in der Herstellung von Oligonukleotiden verwendet werden soll, ist R¹ die vorgenannte Substruktur (29), in der D oder D¹ Oligonukleotid-koppelnde Gruppen sind. Der hierin verwendete Begriff „koppelnde Gruppe" bedeutet jede beliebige Gruppe, die zum Erzeugen einer Verknüpfung oder einer substituierten Phosphodiester-Verknüpfung zwischen den Nukleotid-Basen und ihren Analoga geeignet ist. Diese koppelnden Gruppen sind konventionell und für die Herstellung von Oligonukleotiden gut bekannt und werden hier in der gleichen Weise hergestellt und angewendet. Sie können als die beta-Anomere konfiguriert sein, bezeichnet als Substruktur (29), oder als die alpha-Anomere. Im Allgemeinen enthält jede die Substruktur (29) aufweisende Verbindung zwei koppelnde Gruppen: D oder D¹, wobei jedoch lediglich eines von D¹ eine koppelnde Gruppe ist. Die koppelnden Gruppen werden als Intermediate in der Herstellung von 3'-5', 5'-3', 5'-2' und 2'-5'-Internukleotid-Verknüpfungen nach den bekannten Methoden verwendet werden.
Geeignete koppelnde Gruppen für Phosphodiester-Verknüpfungen schließen OH, H-Phosphonat (12-1); (bei der Amidit-Chemie) Alkylphosphonamidite oder Phosphoramidite ein, wie beispielsweise beta-Cyanoethylphosphoramidit (12-2 und 12-3), N,N-Diisopropylamino-Beta-cyanoethoxyphosphin, N,N-Diisopropylaminomethoxyphosphin, N,N-Diethylamino-methoxyphosphin, N,N-Diethylamino-betacyanoethoxyphosphin, N-Morpholino-Beta-cyanoethoxyphosphin, N-Morpholinomethoxyphosphin, Bis-morpholino-phosphin, N,N-Dimethylamino-betacyanoethylmercapto-phosphin, N,N-Dimethylamino-2,4-dichlorbenzylmercapto-phosphin und Bis(N,N-diisopropylamino)-phosphin; und (für die Triester-Chemie) 2- oder 4-Chlorphenylphosphat, 2,4-Dichlorphenylphosphat oder 2,4-Dibromphenylphosphat. Siehe hierzu beispielsweise die US-P-4 725 677; 4 415 732, 4 458 066 und 4 959 463 und PCT 92/07864. Wenn D¹ eine koppelnde Gruppe ist, dann wird D im typischen Fall ein mit einer Gruppe geblocktes Hydroxyl sein, die geeignet ist, um zu gewährleisten, dass das Monomer an dem Oligomer addiert und nicht dimerisiert wird. Derartige Gruppen sind gut bekannt und schließen ein: DMT, MMT, FMOC (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), PAC (Phenoxyacetyl), Silylether, wie beispielsweise TBDMS (tert-Butyldiphenylsilyl) und TMS (Trimethylsilyl). Wie ersichtlich ist, wird das Gegenteil gelten, wenn man ein Oligomer in der entgegengesetzten Richtung synthetisch darstellen will (5'→ 3'). Normalerweise ist D DMT, D¹ befindet sich am 3'-Kohlenstoff, die übrigen D¹ sind H und die D¹-Gruppen befinden sich in der Konfiguration eines alpha-Anomers.
SUBSTITUENT R¹-BINDUNGSPARTNER
Ein Bindungspartner ist eine beliebige Substanz, von der angestrebt wird, dass sie detektiert wird (Analyte), oder sie ist eine Substanz, die an dem Analyten nichtkovalent gebunden ist. Bindungspartner sind auf dem Gebiet des Immunoassays gut bekannt und schließen Hapten-Antikörper-Paare ein, wie beispielsweise solche, die in den Medikamentenimmunoassays unter Anwendung der EMIT- oder ELISA-Technologie genutzt werden. Bindungspartner werden analytisch in der Enzymologie eingesetzt, wo das Substrat oder das Enzym markiert ist. Bindungspartner sind auch von dem Gebiet der Oligonukleotid-Hybridisierung bekannt, einschließlich Oligonukleotid-Nukleinsäwebindende Partner (wie beispielsweise in Diagnostik-Sonden oder therapeutischen Antisense-Oligonukleotiden) oder Oligonukleotid-Protein-Bindungspartner (Aptamere). Nach der vorliegenden Erfindung ist die polycyclische Substruktur bei R¹ durch einen beliebigen Bindungspartner substituiert. Während der Bindungspartner ein kleines Molekül sein kann, wie beispielsweise ein Medikament, Hapten, Substrat oder dergleichen, ist er im normalen Fall ein Polymer.
Verbindungen der Struktur (1), worin R¹ ein Polymer ist, sind ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung. Zum größten Teil wird, wenn R¹ ein Polymer ist, eine R¹-Linker-Gruppe in die Polymerstruktur einbezogen entweder als eine Monomereinheit oder durch Pfropfen auf ein bereits vorhandenes Polymer. Wenn R¹ ein Polymer ist, gilt daher als selbstverständlich, dass das Polymer den Rest einer verknüpfenden Gruppe aufweisen kann, worin der Linker-Rest von einer monomeren Subeinheit kommt oder nicht zu den monomeren Subeinheiten des Polymers gehört. Alles, was notwendig ist, ist, dass die polycyclische Substruktur kovalent an dem Polymer gebunden ist.
Die Beschaffenheit des Polymers ist nicht entscheidend. Im typischen Fall sind in die R¹-Polymere ein Biopolymer einbezogen, wie beispielsweise ein Oligonukleotid, ein Protein (einschließlich Antikörper, Enzyme, Zellmembranproteine, Glykoproteine, Glykolipide, Lipoproteine und Nukleoproteine), ein Peptid, Nukleinsäure oder Glykan oder andere Polysaccharide oder Kohlenhydrat. In bestimmten Ausführungsformen ist das Polymer ein Oligonukleotid-Analog, bei dem eines oder beide Zucker- oder Phospodiester-Subeinheiten substituiert sind durch Gruppen, die weiterhin eine Basen-Paarung durch die polycyclische Substruktur ermöglichen, die jedoch andere angestrebte Merkmale besitzen, die von den natürlichen Substituenten nicht geteilt werden, z. B. solche mit Maskierung der negativen Ladungen der Phospodiester-Verknüpfungen oder solche, bei denen die Phosphodiester-Verknüpfung durch eine andere Gruppe ersetzt ist.
Die Stelle der Polymersubstitution durch die Struktur (1) der polycyclischen Verbindung ist nicht entscheidend. Im Allgemeinen ist jede beliebige reaktionsfähige Gruppe an dem Polymer zufriedenstellend, wenn es darauf ankommt, die Linkersubstituierte polycyclische Substruktur auf ein bereits vorhandenes Polymer aufzupfropfen. Sollte sich die Substitutionsstelle nicht in einer Stelle befinden, in der die polycyclische Substruktur die vorgesehene Funktion für das Polymer stört, z. B. eine enzymaktive Stelle, Antikörper-CDR und dergleichen, was für den Fachmann auf dem Gebiet als selbstverständlich gilt. Eine Aminosäure-Seitenkette, wie beispielsweise die von Lysin, Glutaminsäure, Senn, Asparagin und dergleichen, wird für das Pfropfen auf Protein R¹ zufriedenstellend sein, was auch für alpha-Aminosäure-Gruppen unter der Voraussetzung gilt, dass die Aminosäuren, die in Frage kommen, nicht in dem Bindungspartner oder an der Liganden/Substrat-Wechselwirkung teilnehmen, die in dem Assay beteiligt sind, in dem das markierte Protein verwendet werden soll. Die gleichen Betrachtungen lassen sich bei der Auswahl einer Bindungsstelle oder mehrerer Bindungsstellen an anderen Analyten anwenden, wie beispielsweise Zucker, Glykane, Lipide und dergleichen. Beispielsweise ist die 1'-Stellung von Ribose oder Desoxyribose als die Stelle für die Substitution eines Oligonukleotids durch die polycyclische Substruktur zufriedenstellend. Geeignete Stellen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und speziell in solchen Fällen, wo die polycyclische Substtruktur andere Fluoreszens-Marker ersetzen soll, die bisher eingesetzt wurden.
Der Substitutionsgrad durch die polycyclische. Base der vorliegenden Erfindung ist nicht entscheidend. Der Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, die Reaktionsbedingungen so zu wählen, dass das resultierende markierte Polymer in einem zufriedenstellenden molaren Anteil der polycyclischen Substruktur substituiert wird, um dessen Verwendung in der gewünschten analytischen, therapeutischen oder präparativen Prozedur zu erleichtern. Dieses wird dadurch erreicht, dass die markierten Polymere unter einer Vielzahl bisher konventioneller Bedingungen hergestellt werden, z. B. Zeitpunkt, Temperatur oder Dauer der Markierungsreaktion, um eine Matrix von mehrfach markierten Polymeren zu liefern. Diese werden dann auf ihre Eignung in der vorgesehenen Anwendung gescreent. Im Allgemeinen sind Molanteile von etwa 1 : 1 bis 10 : 1 Marker zu Polymer geeignet. Wo das markierte Polymer mit Hilfe des Einbaus eines Monomers hergestellt wird, kann das resultierende Polymer etwa 1% bis 100% Substitution einer polycyclischen Substruktur enthalten. In dieser Ausführungsform wird jede polycyclische Base der vorliegenden Erfindung als eine Monomereinheit angesehen (selbst dann, wenn das Polymer aus Intermediat-Synthonen zusammengesetzt ist, die 2 oder mehrere erfindungsgemäße polycyclische Substrukturen pro Synthon enthalten).
Oligomere sind Polymere, die mindestens 2 Nukleotide oder Nukleotid-Analoga enthalten, von denen mindestens eines eine polycyclische Substruktur der vorliegenden Erfindung aufweist. In den meisten Ausführungsformen der vorliegenden. Erfindung ist mindestens eine polycyclische Substruktur kovalent an einer Nukleotid-Base gebunden oder an der gleichen oder einer verschiedenen polycyclischen Substruktur, und zwar durch einen organischen Teil, der ausreichend flexibel ist, um ein Hybridisieren der Basen und Substrukturen) zu komplementären Basen zu ermöglichen. Diese Verknüpfung kann eine konventionelle Phosphodiester-Verknüpfung sein, in der ein Nukleotid-Analog, das die polycyclische Substruktur enthält (worin R1 Desoxyribosyl oder Ribosyl ist), das in ein Oligonukleotid mit Hilfe konventioneller Methoden eingebaut ist. Alternativ werden andere Gruppen verwendet, um die Phosphodiester-Verknüpfung zu ersetzen oder in einigen Fällen beide Phosphodiester-Verknüpfungen und die Zuckergruppe. Diese Austauschgruppen werden für die Aufgaben hierin als Substitutions-Verknüpfungen bezeichnet.
Substitutions-Verknüpfungen sind aus der älteren Literatur gut bekannt. Sie schließen beispielsweise Phosphordithioate ein (Marshal, "Science" 259: 1564, 1993), Phosphorthioate und Alkylphosphonate (Kibler-Herzog, "Nucleic Acids Research" [nachfolgend "NAR"] 19: 2979, 1991; PCT 92/01020; EP 288 163 ; 12-1), Phosphoramidate (Froehler, "NAR" 16: 4831, 1988), Phosphortriester (Marcus-Sekura, "NAR" 15: 5749, 1987), Boranophosphate (Sood, "J. Am. Chem. Soc.2 [nachfolgend "JACS"] 112: 9000, 1991), 3'-O-5'-S-Phosphorthioate (Mag, "NAR" 19: 1437, 1991), 3'-S-5'-O-Phosphorthioate (Kyle, "Biochemistry" 31: 3012, 1992), 3'-CH₂-5'-O-Phosphonate (Heinemann, "NAR" 19: 427, 1991), 3'-NH-5'-O-Phosphonate (Mag, "Tet. Ltt." 33: 7323, 1992), Sulfonate und Sulfonamide (Reynolds, "J. Org. Chem." [nachfolgend "JOC"] 57: 2983, 1992), Sulfone (Huie, "JOC" 57: 4519, 1992), Sulfoxide (Huang, "JOC" 56: 3869, 1991), Sulfide (Schneider, "Tet Ltt." 30: 335, 1989), Sulfamate, Ketale und Formacetale (Matteucci, 'JACS" 113: 7767, 1991, PCT 92/03385 und PCT 90/06110), 3'-Thioformacetale (Jones, "JOC" 58: 2983, 1993), 5'-S-Thioether (Kawai, "Nucleosides Nucleotides" 10: 1485, 1991), Carbonate (Gait, "J. Chem. Soc. Perkin Trans 1" 1389, 1979), Carbamate (Stirchak "JOC" 52: 4202, 1987), Hydroxylamine (Vasseur, „JACS" 114: 4006, 1992), Methylamine (Methylimine) und Methylenoxy (Methylimino) (Debart, "Bioorg. Med. Chem. Lett." 2: 1479, 1992) und Amino (PCT 91/06855). Ebenfalls von Interesse sind Hydrazino- und Siloxan-Verknüpfungen (US-P-S 214 134).
Geeignete Verknüpfungen an sich sind auch für den Austausch der gesamten Phosphoribosyl-Verknüpfung konventioneller Oligonukleotide bekannt. Diese schließen beispielsweise Morpholinocarbamate ein (Stirchak, "NAR" 17: 6129, 1989), Peptide (Nielsen et al., "Science" 254: 1497, 1991; U.S.S.N. 07/892 902 und 07/894 397) sowie Riboacetal-Verknüpfungen (PCT 92/10793).
Eine weitere Offenbarung von Substitutions-Verknüpfungen findet sich in PCT 91/08213, 90/15065, 91/15500, 92/20702, 92/20822, 92/20823, 92/04292, 89/12060 und 91/03680; Mertes "J. Med. Chem." 12: 154, 1969; Mungall, "JOC" 42: 703, 1977; Wang, "et Lett" 32: 7385, 1991; Stirchak, "NAR" 17: 6129, 1989; Hewitt, "Nucleosides and Nucleotides" 11: 1661, 1992; und US-P-S 034 506 und 5 142 047.
Die Phosphodiester- oder Substitutions-Verknüpfungen werden hierin verwendet, um die 2'- oder 3'-Kohlenstoffatome von Ribose oder Ribose-Analoga an den 5'-Kohlenstoffatomen der angrenzenden Ribose oder Ribose-Analoga zu binden. Normalerweise werden die Verknüpfungen in Oligonukleotiden verwendet, um das 3'-Atom der 5'-terminalen Oligonukleotids an dem 5'-Kohlenstoffatom des nächsten angrenzenden Nukleotids in 3'-Stellung oder dessen Analog zu binden.
In Tabelle 1 sind nachfolgend verschiedene Beispiele geeigneter Substitutions-Verknüpfungen zur Verwendung mit den Analogen polycyclischen Polynukleotid-Basen der vorliegenden Erfindung zusammengestellt. Die mit D (5') und D¹ (3' oder 2') bezeichneten Spalten beschreiben die Substruktur (29) der Substituenten, die zur Erzeugung der X¹-Verknüpfung der Struktur (8) verwendet wurden, in der rechten Spalte sind die auf dem Gebiet an sich bekannten Anwendungsmethoden gezeigt, die in der U.S.S.N. 07/892 902 und in anderen vorstehend gegebenen Fundstellen beschrieben wurden. Die Ausgangsmaterialien in Tabelle 1 oder solche, die zur Herstellung der Ausgangsmaterialien der Tabelle 1 verwendet wurden, besitzen im Allgemeinen die Struktur (1), worin R¹ Ribose oder ein Ribose-Analog ist, die eine 5'-Hydroxyl-Gruppe aufweisen und eine 3'- oder 2'-Hydroxyl-Gruppe, die entsprechend der Beschreibung hierin oder in den Fundstellen hergestellt sind, wobei die polycyclische Base mit den Basen substituiert ist, die in den Fundstellen verwendet wurden. Sequentiell verwendbare Ausgangsmaterialien sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. In Klammern gesetzte Monomere wurden zur Erzeugung von Dinukleotid-Analoga mit der X¹-Substitutions-Verknüpfung umgesetzt. Die Reaktionen. wurden mit Phosphodiester-Verknüpfungen wiederholt oder zusammengefasst, um Trimere, Tetramere oder größere Oligomere zu erzeugen, einschließlich bis zu etwa 98 Basen.
B1 bedeutet eine blockierende Gruppe. Wie hierin verwendet wird, bedeutet "blockierende Gruppe" ein Substituent, der nicht H ist, der konventionell an Oligomeren oder Nukleotidmonomeren entweder als eine schützende Gruppe, eine koppelnde Gruppe für die Synthese, PO₃ ^–2, oder anderes konventionelles Konjugat angebracht ist, wie beispielsweise ein fester Träger. Wie hierin verwendet, soll "blockierende Gruppe" nicht ausschließlich als eine Nukleotid-schützende Gruppe ausgelegt werden, sondern soll beispielsweise koppelnde Gruppen einbeziehen, wie beispielsweise Wasserstoffphosphonat, Phosphoramidit und andere, wie sie vorstehend ausgeführt wurden. Dementsprechend sind blockierende Gruppen von der Art von "schützenden Gruppen", die hierin verwendet wird jede beliebige Gruppe bedeuten, die in der Lage ist, das O-Atom oder N-Atom, an dem es angebracht ist, von der Teilnahme in einer Reaktion abzuhalten, bei der eine Intermediat-Verbindung der Struktur (1) beteiligt ist oder auf andere Weise eine unerwünschte kovalente Bindung erzeugt. Derartige schützende Gruppen für O- und N-Atome in Nukleotid-Monomeren sind Nukleosidmonomere werden beschrieben, und die Methoden zu ihrer Einführung sind auf dem Gebiet konventionell bekannt. Schützende Gruppen sind auch zur Vermeidung von Reaktionen und des Bindens an Carbonsäuren, Thiolen und dergleichen verwendbar, was für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich ist.
Tabelle 1 Substitutions-Verknüpfungen
Die Oligomere der vorliegenden Erfindung enthalten natürlich vorkommende Nukleotide oder Derivate davon. In einigen Oligonukleotid-Ausfährungsformen enthalten die begleitenden Nukleotidreste Pyrimidin-Nukleotide, substituiert in der 5-Stellung mit einem Kohlenstoffatom, das distal mit einem anderen Atom eine Pi-Bindung eingeht, wie beispielsweise 1-Alkenyl, 1-Alkinyl, heteroaromatische und 1-Alkinyl-heteroaromatische Gruppen, wie beispielsweise 5-Propinylcytosin-nukleotide. Andere Analogsubstanzen von natürlichen Basen zur Verwendung hierin schließen alkylierte Purine oder Pyrimidine ein, acylierte Purine oder Pyrimidine oder andere Analogsubstanzen von Purin- oder Pyrimidin-Basen und deren Aza- und Deaza-Analogsubstanzen. Diese schließen beispielsweise ein: N⁴,N⁴-Ethanocytosin, 7-Deazaxanthosin, 7-Deazaguanosin, 8-Oxo-N⁶-methyladenin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Fluorouracil, 5-Bromuracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Inosin, N⁶-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 2-Methylguanin, 5-Methylcytosin, N⁶-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-Methoxywacil, Pseudouracil, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-(1-Propinyl)-4-thiouracil, 5-(1-Propinyl)-2-thiouracil, 5-(1-Propinyl)-2-thiocytosin, 2-Thiothymidin und 2,6-Diaminopurin. Zusätzlich zu diesen Basen-Analogsubstanzen lassen sich mühelos in die erfindungsgemäßen Oligomere Pyrimidin-Analogsubstanzen einbeziehen, einschließlich 6-Azacytosin, 6-Azathymidin und 5-Trifluormethyluracil, wie sie in Cook, D. P. et al., Internationale Patentanmeldung Nr. WO 92/02258 beschrieben wurden.
Bevorzugte Basen schließen ein: Adenin, Guanin, Thymin, Uracil, Cytosin, 5-Methylcytosin, 5-(1-Propinyl)uracil, 5-(1-Propinyl)cytosin, 8-Oxo-N⁶-methyladenin, 7-Deaza-7methylguanin, 7-Deaza-7-methyladenin und 7-Deazaxanthosin.
Ausführungsformen der Oligomere der Erfindung umfassen einen Teil, der in der Lage ist, mindestens eine kovalente Bindung zwischen dem Oligomer und einem Nukleinsäure-Duplex oder -Strang herzustellen. Es können auch mehrfache kovalente Bindungen erzeugt werden, indem eine Vielzahl solcher vernetzenden Teile bereitgestellt wird. Die kovalente Bindung ist vorzugsweise eine Baserest im Target-Strang, kann aber auch mit anderen Abschnitten des Targets erzeugt werden, einschließlich das Saccharid oder den Phosphodiester. Bevorzugte vernetzende Teile schließen Mittel zum Acylieren oder Alkylieren ein und speziell solche, die im Bezug auf den sequenzspezifischen Abschnitt so angeordnet sind, dass sie die Reaktion mit der Target-Stelle in dem Strang erlauben. Exemplarische vernetzende Teile wurden offenbart und beansprucht in der PCT 91/03680. Siehe ebenfalls Praseuth ("P.N.A.S. USA" 85: 1349, 1988), Fedorova („FEBS" 228: 273, 1988), Meyer ("J. Am. Chem. Soc." 111: 8517, 1989), Lee ("Biochemistry" 27: 3197, 1988), Horne ("J. Am. Chem. Soc." 112: 2435, 1990), Shaw ("J. Am. Chem. Soc." 113: 7765, 1991).
Oligomere mit umgekehrter Polarität fallen ebenfalls in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. "Umgekehrte Polarität" bedeutet, dass das Oligomer Tandem- Sequenzen enthält, die über eine entgegengesetzte Polarität verfügen, d. h. eine, deren Polarität 5' → 3' ist, gefolgt von einer anderen mit der Polarität 3' → 5' oder umgekehrt. Diese Sequenzen werden auf diese Weise über Verknüpfungen verbunden, die man sich als effektive 3'-3'-Internukleosid-Verbindung vorstellen kann (allerdings ist die Verknüpfung ausgeführt) oder effektiv als eine 5'-5'-Internukleosid-Verbindung. Für eine eingehendere Beschreibung geeigneter Methoden zur Herstellung derartiger Oligomere siehe die PCT 92/10115. Zusammensetzungen von "parallel-strängiger DNA", die zur Erzeugung von Haarnadeln konzipiert sind die mit AT-Verknüpfungen entweder unter Verwendung einer 3'-3'-Inversion oder einer 5'-5'-Inversion gesichert sind, sind von van de Sande ("Science" 241: 551, 1988) synthetisch dargestellt worden. Außerdem sind Oligomere, die 3'-3'-Verknüpfungen enthalten, beschrieben worden (Horne, op. cit.; und Froehler "Biochemistry" 31: 1603, 1992). Diese Oligomere sind als Bindungspartner für doppelsträngige Nukleinsäuren zur Erzeugung von Dreifachhelix (oder Triplex)-Komplexen als ein Mittel zur Hemmung der Expression der Target-Genexpression verwendbar (PCT 89/05769 und 91/09321).
SYNTHESEMETHODEN
Die Verbindungen der Struktur (1), worin R¹ ein Linker oder H ist, werden mit Hilfe auf dem Gebiet bekannter Methoden hergestellt und werden nachfolgend eingehender beschrieben. Im typischen Fall werden derartige Verbindungen hergestellt aus Cytosin- oder Cytosin-1-yl-Linker-substituierten Derivaten, wie sie in den Syntheseschemen von 1 bis 10 gezeigt sind, wobei das Ausgangsmaterial bereits mit R¹ substituiert ist und die nachfolgenden Reaktionen darauf gerichtet sind, den polycyclischen Ring zu schließen. In diesen Ausführungsformen sind die Hydroxyl-, Amino- und beliebigen anderen labilen Gruppen von R¹ nach Erfordernis mit Hilfe der Reaktionsschemen geschützt. Bei einem anderen Vorgehen ist das R¹ des Ausgangsmaterials H und der Linker wird nach den Schritten des Ringschlusses hinzugefügt, wie sie in den Reaktionsschemen ausgeführt sind, und zwar in der gleichen Weise wie sie bisher bei der Alkylierung von Pyrimidin-Basen eingesetzt wurden, die zur Verwendung als antivirale Verbindungen vorgesehen sind. Es gibt beispielsweise konventionelle Prozeduren zum Alkylieren von Pyrimidin-Basen mit einem geeigneten Organophosphor-Synthon, das über eine vorgeformte R¹-Substruktur verfügt. Diese Chemie ist im Stand der Technik bereits gut bekannt für die Herstellung von acyclischen und cyclischen Nukleosiden, Nukleotiden und Nukleotid-Phosphonat-Analogsubstanzen. Sie lassen sich mühelos zur Verwendung mit den hierin beschriebenen Reaktionsschemen für die Herstellung von Verbindungen der Struktur (1) anpassen, worin R¹ ein Linker oder H ist.
Das Reaktionsschema von 6 wird für kondensierte Pyrrolin-Verbindungen bevorzugt, in denen der Ring, der unmittelbar an dem Pyrimidinyl-Rest kondensiert ist, eine N-enthaltende heterocyclische Verbindung ist; sofern der Ring Aryl ist, wird das Reaktionsschema von 5 bevorzugt.
Das Reaktionsschema von 11 wird zur Herstellung von Ausgangsmaterialien für die Peptid-Substitutions-Verknüpfungen der Sorte angewendet, wie sie bei Nielsen et al., op. cit., offenbart wurden, oder für die Herstellung von Carboxyalkyl-Linkern zum Vernetzen mit Proteinen oder Polypeptiden oder zum Einbau darin.
In denjenigen Ausführungsformen, in denen R¹ ein Bindungspartner ist, wie beispielsweise ein Polymer, werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung synthetisch durch kovalentes Vernetzen der Linker-modifizierten polycyclischen Base der vorliegenden Erfindung mit dem Bindungspartner hergestellt oder (wo es sich bei dem Bindungspartner um ein Polymer handelt) durch Einbau in das Polymer einer Monomereinheit, die durch eine polycyclische Base der vorliegenden Erfindung substituiert ist.
In der ersten Ausführungsform (Polymer-Pfropfen) ist eine Linker-substituierte polycyclische Substruktur kovalent mit Hilfe eines beliebigen konventionellen Vernetzungsmittels an dem Polymer gebunden. Am einfachsten werden Verbindungen der Struktur (1), in denen R¹ Hydroxyl- oder Amino-substituiertes Alkyl ist, mühelos mit den reaktionsfähigen Gruppen vernetzt, die in dem zu markierenden Molekül entsprechend der vorstehenden Beschreibung vorhanden sind. Typische Vernetzungsmittel schließen Succinsäureanhydrid, DCC, EDC, BOP und Glutaraldehyd ein. Ebenfalls werden Cyanbromid-aktivierte Kohlenhydrate verwendet. Die Vernetzungsmittel werden verwendet, um die Linker-substituierte polycyclische Verbindung mit dem Polymer in der gleichen Weise zu verbinden, wie bisher Polymere mit Liganden vernetzt wurden, z. B. mit Hydroxyl- oder Amino-tragenden Teilen. Ein Beispiel für eine geeignete Methode ist von Cook et al. in der US-P-S 218 105 beschrieben worden. Diese Methode lasst sich mühelos anwenden, um einen Aminosubstituierten R¹-Linker mit dem 5'-Terminus eines Oligonukleotids kovalent zu binden.
In der zweiten Ausführungsform (Copolymerisation) ist der Linker in der Lage, als ein Monomer für die Copolymerisation mit anderen Monomereinheiten zu fungieren, die unter Umständen mit der polycyclischen Substruktur von Struktur (1) substituiert sein können. In einigen Ausführungsformen ist der R¹-Linker ein Alkylcarboxylat, ein Alkylamin oder eine Aminosäure zum Einbau in Peptide mit Hilfe von in vitro-Methoden. Allerdings ist die typische Ausführungsform des R^l-polymeren Bindungspartners ein Oligonukleotid, wie er in der Struktur (8) dargestellt ist, die sich mühelos durch Copolymerisation mit einer Nukleotid-Analogsubstanz herstellen lassen, die mit der polycyclischen Substruktur substituiert ist. Die Ausgangsmaterialien für die Synthese der Struktur (8) sind in der Regel Verbindungen der Struktur (1), in der R¹ Ribose oder Desoxyribose ist, substituiert mit geeigneten blockierenden oder koppelnden Gruppen, wie sie nachfolgend eingehender beschrieben werden. Geeignete Ausgangsmonomere für Oligonukleotide mit Substitutions-Verknüpfungen sind in Tabelle 1 zusammengestellt, die in der gleichen Weise wie andere analoge Nukleotid-Basen hergestellt werden, die in der Literatur beschrieben wurden. In ähnlicher Weise werden konventionelle Phosphodiester-Verknüpfungen aus Nukleotid-Analogsubstanzen hergestellt, die koppelnde Gruppen D und D¹ entsprechend der vorstehenden Beschreibung enthalten. Die Verbindungen dieser Erfindung werden dann in das gewünschte Oligonukleotid mit Hilfe bekannter Methoden der in vitro-Synthese eingebaut, wie sie in den Methoden der Fundstellen beschrieben wurden. Alternativ können mit polycyclischer Substruktur substituierte Nukleotid-Triphosphate in Oligonukleotide als Cytosin-Analoga mit Hilfe der DNA-Polymerase oder reverser Transkriptase in vivo oder in vitro eingebaut werden (siehe Ward, US-P-4 711 955). In diesem Fall ist R¹ Ribosyl- oder Desoxyribosyltriphosphat oder eine triphosphorylierte Analogsubstanz davon, die von der DNA-Polymerase oder reversen Transkriptase erkannt wird und die dann in ein Oligonukleotid mit Hilfe der Matrix-gerichteten Transkription eingebaut wird.
Die Synthese von Oligomeren, die etwa 3 oder mehrere Nukleotidreste enthalten, wird vorzugsweise unter Verwendung von Synthonen erreicht, wie beispielsweise Dimere (die Substitutions- oder Diester-Verknüpfungen enthalten) oder Trimere (von denen jedes eine terminal koppelnde Gruppe trägt, die zur Verwendung mit Amidit, H-Phosphonat oder Triester geeignet ist). Das Synthon wird sodann mit dem Oligomer oder einem anderen Synthon über eine Phosphodiester- oder Phosphor-enthaltende Substitutions-Verknüpfung verknüpft.
Oligomere, die Methylphosphonat- und Phosphodiester-Verknüpfungen erhalten, lassen sich leicht mit Hilfe der Methoden der Oligomersynthese in fester Phase herstellen. Eine Beschreibung von Modifikationen, die bei der Synthese von Phosphorthioatverknüpften Oligomeren geeignet ist, findet sich beispielsweise in der EP-P 288 163, worin die Oxidationsstufe in der automatischen Festphasensynthese unter Anwendung der Amidit-Chemie unabhängig bei jedem Schritt so eingestellt werden kann, dass Phosphorthioat erhalten wird. Eine andere Methode zur Synthese von Oligomeren mit Phosphorthioat-Verknüpfungen über die Wasserstoff Phosphonat-Chemie ist ebenfalls beschrieben worden (Froehler "NAR" 14: 5399). Die Sulfurierung wird unter Verwendung von Reagenzien erreicht, wie beispielsweise Tetraethylthiuramdisulfid, Dibenzoyltetrasulfid, Thiophosphorsäuredisulfid, 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid und dergleichen, wie sie beschrieben wurden bei (Vu, "Tet Lett" 26: 3005, 1991; Rao, "Tet Lett" 33: 4839, 1992; US-P-S 151 510; Iyer, "JOC" 55: 4693, 1990; Dahl, "Sulfat Reports" 11: 167, 1991). Diese Reagenzien zur Sulfurierung werden entweder mit der Phosphoramidit- oder Wasserstoff Phosphonat-Chemie angewendet. Die Synthese von Phosphorthioatoligomeren, die über eine kontrollierte Stereochemie verfügen, wird verwendet, um stereoreguläre, erfindungsgemäße Oligomere entsprechend der Beschreibung in der EP-P-506 242 zu erzeugen. Thionomethylphosphonat wird mit Methylphosphonamidit gefolgt von einer Sulfurierung entsprechend der Beschreibung bei (Roelen, "Tel Lett2 33: 2357, 1992) oder mit Mitteln zur Sulfurierung hergestellt, wie sie vorstehend beschrieben wurden.
VERWENDUNG DER VERBINDUNGEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung finden Anwendungen auf den Gebieten der Diagnostik und Analytik und Therapie oder als Intermediate bei der Herstellung von Verbindungen, die auf diesen Gebieten verwendbar sind.
Die Linker-substituierten Verbindungen der Struktur (1) sind als Intermediate bei der Herstellung markierter Biopolymere der Struktur (1) verwendbar, worin ein Biopolymer, das fluoreszent oder auf andere Weise detektierbar gemacht wurde, mit Hilfe einer Verknüpfung zu der polycyclischen Substruktur markiert wird. Besonders vorteilhaft ist jedoch die Verwendung von Verbindungen der entsprechenden Struktur (1) als Monomere in der Herstellung von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden der Struktur (1). Die markierten Biopolymere werden in Diagnostikassays oder in präparativen Verfahren in der gleichen Weise wie andere Fluorophor-markierte Biopolymere eingesetzt, z. B. in Methoden der Fluoreszens-Polarisation, Fluoreszens-aktiviertes Zellsortieren, EMIT-Immunoassays vom kompetitiven Typ und dergleichen.
Die Monomere sind besonders nützlich bei der Herstellung von Oligonukleotiden zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung. Da Oligonukleotide die über 2 oder mehrere angrenzende Nukleotide oder Nukleotid-Analogsubtanzen verfügen, die die polycyclische Substruktur tragen, ein stark erhöhtes Tm zeigen, sind derartige Oligonukleotide besonders verwendbar in therapeutischen und diagnostischen Geräten, bei denen hochstabile Duplex-Hybridisierungsstrukturen angestrebt werden. Da diese Oligonukleotide fluoreszent sind, lassen sich Änderungen in der Oligonukleotid-Fluoreszens verfolgen, wenn das Oligonukleotid sich mit der komplementären Nukleinsäure oder Oligonukleotid-Sequenzen verbindet. Diese Änderungen sind als Modifikationen in Energietransfer detektierbar, z. B. Fluoreszens-Löschung oder Verschiebungen in den Anregungs- oder Emissionswellenlängen.
Die mit der polycyclischen Substruktur markierten Oligonukleotide werden in diagnostischen oder analytischen Methoden in der gleichen Weise wie andere markierte Oligonukleotide eingesetzt. Beispielsweise werden die Oligonukleotide in Hybridisierungsmethoden verwendet, in denen ein Antikörper, der sich mit einer Basengepaarten Struktur (1) binden kann, verwendet, um die Bindung des Oligonukleotids an einer Target-Nukleinsäure-Sequenz zu detektieren. Darüber hinaus lassen sich Änderungen im Fluoreszens-Charakter entsprechend der vorstehenden Beschreibung assayieren. Nach der allgemeinen Methode in der EP-P-70 685 werden in einem Hybridisierungsassay mindestens 2 mit polycyclischer Substruktur markierte Oligonukleotide verwendet. Das eine Oligonukleotid ist an seinem 3'-Ende mit einer polycyclischen Substruktur markiert, die ein Nukleotid enthält, während das andere Nukleotid an seinem 5'-Ende mit der gleichen oder einer anderen polycyclischen Substruktur oder einem anderen Fluorophor markiert ist, wie beispielsweise Fluorescein oder Rhodamin, die zum Energietransfer in der Lage sind. Die 2 Oligonukleotide erkennen eine komplementäre Sequenz, in der das 3'-Ende der Target-Sequenz das Oligonukleotid bindet, welches das 3'-terminale Fluorophor trägt, während die angrenzende 5'-Sequenz des Targets das Oligonukleotid bindet, welches das 5'-terminale Fluorophor trägt. Das Binden wird assayiert, indem eine Änderung der Fluoreszens eines der Oligomere oder beider Oligomere gemessen wird, wenn diese sich in Tandem entsprechend dem veranschaulichten Modell binden. In anderen Ausführungsformen wird lediglich ein einzelnes markiertes Oligonukleotid in der Hybridisierungsmethode eingesetzt. Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind damit in der Hybridisierungsdiagnostik in Lösungsphase verwendbar, d. h. es ist nicht erforderlich, eine Phasentrennung auszuführen, um das Binden des markierten Oligonukleotids zu detektieren.
Monomere der Struktur (1) sind, wenn sie triphosphoryliert sind und R¹-Riboseoder -Desoxyribose-Derivate enthalten, bei denen es sich um Kettenabbruchmittel handelt (z. B. wo R¹⁷, R¹⁸ und beide D¹ nicht Hydroxyl sind), in Methoden zum Fluoreszens-Kettenabbruch des Didesoxynukleotid-Sequenzierens in der gleichen allgemeinen Weise verwendbar, wie ddNTP's mit anderen Linker-angebrachten Fluorophoren.
Da die Verbindungen der Struktur (1) in der Lage sind, an der Watson-Crick-Basen-Paarung teilzunehmen, binden sie sich an Nukleinsäuren und sind daher beim Detektieren des Vorhandenseins von Nukleinsäure-enthaltendem Guanosin verwendbar.
Oligonukleotide der Struktur (1), die in der Lage sind, hochschmelzende Duplexe mit komplementären Sequenzen zu erzeugen, sind in zahlreichen Prozessen verwendbar, einschließlich in Antisense- oder Code-blockierende Einrichtungen in vivo oder in vitro sowie in der Diagnostik. Hochschmelzende Duplexe sind solche, die über hohe Schmelztemperaturen weit oberhalb der Schmelztemperaturen von Oligonukleotid- oder Nukleinsäure-Duplexen der gleichen Sequenz verfügen, die normale, natürlich auftretende Basen enthalten, z. B. Adenosin, Cytidin, Uridin, Guanosin, Thymidin und dergleichen. "Weit oberhalb" bedeutet, dass das Oligonukleotid-Derivat, wenn es in seiner komplementären Sequenz hybridisiert ist, so lange nicht von dem Duplex dissoziiert, bis die Temperatur von etwa 2° bis 40°C und üblicherweise etwa 8° bis 40°C oberhalb der Dissoziationstemperatur des selben Oligonukleotids erhöht ist,. das die analogen normalen A-, C-, U-, G- oder T-Basen aufweist, wobei die Temperatur jedoch nicht höher als etwa 95°C ist. Dieses ist als die ΔTm bekannt. Normalerweise wird das ΔTm gemessen, indem das Binden eines Kontroll-Oligonukleotids an komplementärer RNA mit dem Binden von Test-Oligonukleotid an der gleichen RNA verglichen wird, wobei die von Jones et al., "JOC" 58: 2983 (1993) beschriebene Methode angewendet wird.
Die Fähigkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung hochschmelzender Duplexe wird in den folgenden Daten gezeigt. Die polycyclischen Cytidin-Derivate der vorliegenden Erfindung werden in 2 15-mere Test-Oligonukleotide mit Hilfe der konventionellen Phosphodiester-Chemie eingebaut. Die Test-Sequenz ist komplementär zur Sequenz der "Verbindung 26"-RNA, die in Jones et al., "JOC" op cit. beschrieben wurde. In einem der Test-Oligonukleotide ("Homo-3") wurden 3 der angegebenen polycyclischen Substanzen in das Oligonukleotid in Tandem insertiert, d. h. als XXX (das C-Triplett in dem Test-Oligo). In dem anderen ("Alt-3") standen die 3 polycyclischen Substanzen nicht in einer benachbarten Stellung, sondern wurden statt dessen von 1- bis 5-Basen abgetrennt (die nicht angrenzenden Cytidin-Basen in dem Test-Oligo). Der Rest der Basen waren C und T, was aus der Referenz-Sequenz geschlussfolgert wurde. Es wurde ein Vergleichs-Oligonukleotid hergestellt, das ein 5-Propin-desoxy-C-Triplett enthielt (analog zu dem Homo-3-Oligonukleotid, das die erfindungsgemäßen Basen enthält, "5-Propin-dC (homoC)") und in dem gleichen Assaysystem getestet. Der Wert für ΔTm wurde gegenüber dem Tm eines Kontroll-Oligonukleotids berechnet, das die gleiche Sequenz enthielt, jedoch mit 5-Methyl-desoxy-C anstelle der Cytidin-Basen der Test-Oligonukleotide. Die Strukturen der polycyclischen Testsubstanzen sind nachfolgend dargestellt wie auch ihre Bezeichnungen (z. B. "Benzoltricyclisches C") für die in der folgenden Tabelle angegebenen Tm-Werte ("dR" bedeutet Desoxyribose).
Tabelle II Tricyclische Cytidin-Derivate für erhöhte RNA-Affinität
Der Wert für Tm der in der Tabelle angegebenen Oligonukleotide wird durch Addition von 62,5°C zu dem ΔTm-Wert erhalten.
* Beispiel F.3.
Diese Daten demonstrieren die Erhöhung des Schmelzpunktes, die durch die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung und speziell solcher herbeigeführt wird, die über die Tandem-Anordnungen der neuartigen Basen verfügen. In der Regel werden derartige Tandem-Anordnungen 2 bis etwa 10 polycyclische Basen enthalten, die gleiche oder verschiedene polycyclische Substanzen sind, in der Regel jedoch gleiche polycyclische Substanzen sind. Wahlweise sind sie außerdem copolymerisiert mit Purinoder Pyrimidin-Basen, die bekannte Alkinyl-Substitutionen enthalten (PCT 92/10115 und USSN 08/050 698) und speziell Pyrimidin-Basen, die in der 5-Stellung mit einem Kohlenstoffatom substituiert sind, das an einem anderen Atom über eine Pi-Bindung gebunden ist, oder die fluoreszenten Cytosin-Derivate von Inoue et al. (op. cit.).
Die Phenotiazin- und Phenoxazin-Desoxyribosid-Verbindungen haben Anregungs- und Emissionswellenlängen von Ex380nM/EM 492nM und Ex360nM/EM450nM und sind intensiv fluoreszent. Diese Verbindungen bleiben bei Einbau in Oligonukleotide fluoreszent und sind intrazellular sichtbar, wenn sie an den Target-Sequenzen nach direkter Injektion nach bekannten Methoden gebunden sind. Die Test-Phenoxazin-Oligonukleotide binden an dem Target bei direkter Injektion bei einer ICso von 5–10μM mit einer Beta-Galactosidase-Kontrolle, die unbeeinflusst bleibt und daher in Antisense-Methoden für die Hemmung der Translation von Target-RNA's verwendbar ist.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder andere Oligonukleotide, die zur Bildung hochschmelzender Duplexe in der Lage sind (z. B. die Pi-gebundenen Basen, die vorstehend diskutiert wurden), sind in verbesserten Methoden für die Polymerase-Kettenreaktion ("PCR")- oder Ligase-Kettenreaktion ("LCR")-Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren verwendbar. In einer der Ausführungsformen werden die hochschmelzenden Oligonukleotide als der eine oder die beiden Primer in der klassischen PCR verwendet oder als Sonden in der LCR. Insbesondere vermeidet die erhöhte Schmelztemperatur von Duplexen mit hochschmelzenden Primern in PCR-Prozessen die Notwendigkeit, die Reaktion zyklisch zu wiederholen, da bei diesen erhöhten Temperaturen (etwa 68° bis 95°C und bevorzugt höher als etwa 75°C) der Derivat-Primer weiterhin an mindestens einem gewissen Abschnitt reassoziiert, was das Extensionsprodukt jedoch nicht tut. Normale Primer werden keine Hybridisierung eingehen und die Polymerase wird eine Transkription so lange nicht initiieren, wie das Reaktionsgemisch bis zu einer Temperaturhöhe gekühlt ist, bei der der Primer mit der Target-Sequenz reassozüert (in der Regel etwa 55°C). Die erhöhte Temperatur, die zur Verwendung mit den hochschmelzenden derivierten Oligonukleotiden gewählt wird (eine Temperatur, die insgesamt zum Reassoziieren, zur Extension und zum Schmelzen geeignet ist), ist eine solche Temperatur, bei der ein wesentlicher Anteil der extendierten Primer-Population (etwa 10% bis 90 Molprozent) von dem Target dissoziiert angetroffen wird, während ausreichend nicht extendierter Primer gebunden ist, um eine Extension zu ermöglichen. Im optimalen Fall erfolgt dieses bei 85° bis 95°C und normalerweise 92° bis 95°C. Alternativ wird die optimale Temperatur empirisch ermittelt, indem einfach ein Temperaturbereich innerhalb des Schmelzbereich der extendierten Sequenz ausgewählt wird, jedoch innerhalb des Reassoziierungsbereichs der derivierten Primer, und die Menge an Amplifikationsprodukt gemessen wird, um zufriedenstellende Werte für die diagnostischen oder präparativen Prozesse zu erzielen, die in Frage kommen.
Selbstverständlich hängt die optimale Temperatur in starkem Maße von den gewählten derivierten Basen ab unabhängig davon, ob sie nachbarständig ist oder durch andere Basen separiert sind; von der Zahl der Basen in den Primern (die höchsten Reassoziierungstemperatur finden sich bei Primern, die über mehr als etwa 18 Basen oder Basen-Analoga verfügen); von den Anteilen von Pyrimidinen und Pannen und dergleichen. Die in diesem System verwendbare wärmestabile Polymerase ist beispielsweise Taq-Polymerase oder ein anderes geeignetes wärmestabiles Enzym. Unabhängig davon, welche optimale Temperatur gewählt wird, werden die Reaktionen der Amplifikation und der Primer-Anlagerung konventionell ausgeführt, jedoch bei einer im Wesentlichen konstanten Temperatur: Nicht nur, dass die Oligomere der vorliegenden Erfindung die PCR- oder LCR-Prozesse erleichtern, die Fluoreszenseigenschaften der Primer erleichtern auch die Detektion der Verlängerungsprodukte. Die Verlängerungsprodukte lassen sich leicht von den nicht verlängerten Primern abtrennen, z. B. auf der Grundlage der Mohnasse, und anhand ihrer Fluoreszens detektieren, wodurch ein Anfärben mit Mitteln vermieden wird, wie beispielsweise Ethidiumbromid. In einigen Ausführungsformen wird die Fluoreszens durch Verwendung von NTP's verstärkt, die die fluoreszenten Substrukturen der vorliegenden Erfindung in Primer-Verlängerung aufweisen, so dass die fluoreszenten NTP's genauso in die Verlängerungsprodukte eingebaut werden. Die in den NTP's verwendete polycyclische Substruktur kann gleich sein oder von derjenigen verschieden sein, die in die Primer eingebaut ist.
Alle hierin angegebenen Fundstellen sind als Hintergrund zitiert. Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend und schränken den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung nicht ein.
BEISPIEL 1
REPRÄSENTATIVE ANWENDUNG DES REAKTIONSSCHEMAS VON 5
A. 5-(2-N-TERT-BUTOXYCARBONYLANILIN)-5'-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXYURIDIN (DMT-AU)
Die Synthese von N-(tert-Butoxycarbonyl)-2-(trimethylstannyl)anilin (BocSnA) wurde veröffentlicht von Salituro und McDonald, J. Org. Chem. 53, 6138–6139, 1988.
Es wurden 1,5g 5-Iod-2'-desoxyuridin, 5g BocSnA und 50mg Palladiumdichlorid-Bistriphenylphosphin in 5ml DMF aufgelöst und unter N₂ abgeschlossen gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde für 16 Stunden bei 50°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, mit EtOH verdünnt, 1 ml Triethylamin zugesetzt und durch Celite filtriert. Die klare Lösung wurde sodann unter vermindertem Druck eingeengt und einer Flash-Chromatographie auf Silicagel mit einem Gradienten von Methanol in Dichlormethan (0%–10%) unterzogen. Bei dem Einengen wurde das Nukleosid durch Zusatz von Pyridin wasserfrei gemacht und einer Verdampfung unterzogen und nachfolgend umgesetzt mit 880 mg Dimethoxytritylchlorid in 10 ml Pyridin für 1 Stunde bei 20°C. Die Reaktion wurde mit Methanol abgeschreckt und das Gemisch in Dichlormethan und H₂O aufgeteilt. Die organische Phase wurde unter vermindertem Druck eingeengt und durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Eluieren mit einem Gradienten von Isopropanol in Dichlormethan (0%–4%) gereinigt. Die Ausbeute betrug 720 mg DMT-AU.
B. DIMETHOXYTRITYL-BENZ0PYRIMIDIN-POLYCYCLISCHES NUKLEOSID
Es wurden 700mg DMT-AU mit 3m1 Trimethylsilyldimethylamin in 3 ml CH₃CN für 2 Stunden bei 20°C gefolgt von einer Verdampfung bei verminderten Drücken und einem neuen Auflösen in CH₃CN und anschließender zweimaliger Verdampfung behandelt. Der Rückstand wurde sodann in 7 ml CH₃CN aufgelöst und 0,67 ml Triethylamin, 11 mg 4-Dimethylaminopyridin und 420mg Mesitylensulfonylchlorid unter N₂ zugesetzt und für 4 Stunden bei 20°C gerührt. Es wurden 0,72 ml 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]-undec-7-en zugesetzt und 30 min bei 20°C gerührt, gefolgt von 0,015 ml H₂O unter Rühren für 1 Stunde. Die Verarbeitung bestand aus einer Aufteilung zwischen Dichlormethan und 0,5 M wässrigem zweibasischem Natriumphosphat. Das Eindampfen der organischen Phase unter vermindertem Druck, gefolgt von einer Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Isopropanol-Gradienten in Dichlormethan (0%–5%) lieferte 300 mg tricyclisches Nukleosid. Das Nukleosid wurde in sein 3'-Wasserstoff-Phosphonat-Derivat überführt und in die Oligonukleotide nach Standardprozeduren (siehe Jones et al., J. Org: Chem. 58, 2983–2991, 1993) eingearbeitet.
BEISPIEL 2
REPRÄSENTATIVE ANWENDUNG DES REAKTIONSSCHEMAS VON 6
A. 2-FLUOR-3-TRIMETHYLSTANNYLPYRIDIN (FSNP)
Die Metallierung von 2-Fluorpyridin wurde entsprechend der Beschreibung von Estel, Marsais und Queguiner, J. Org. Chem. 53, 2740–2744, 1988 ausgeführt. Das Lithium-Anion wurde mit 1 val Trimethylzinnchlorid in THF (1 M) bei –78°C gelöscht und für 30 min gerührt, mit 1 M Natriumhydrogencarbonat gelöscht und mit Ethylacetat extrahiert. Nach dem Trocknen mit Na₂SO₄ und dem Eindampfen unter vermindertem Druck wurde das resultierende Öl ohne weitere Reinigung verwendet.
B. DESOXYCYTIDIN-S-(3-(2-FLUORPYRIDIN))-5'-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXYCYTIDIN (DMT-FPDC)
Es wurden 5OO mg 5-Iod-2'-desoxycytidin bei 100°C in 4 ml DMF und 2 ml DMF-Dimethylacetal erhitzt. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch gekühlt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 4 ml DMF aufgelöst und 2 ml FSnP und Palladiumchlorid-Bistriphenylphosphin unter N₂ zugesetzt und für 16 Stunden bei 50°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und 4m1 Ammoniak-gesättigtes Methanol zugesetzt und für 4 Stunden bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt und in wasserfreiem Ethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde getrocknet und in Pyridin aufgelöst, unter vermindertem Druck eingedampft und erneut in 4m1 Pyridin aufgelöst. Es wurden 400 mg Dimethoxytritylchlorid zugesetzt und nach 30 min bei 20°C das Reaktionsgemisch mit MeOH gemischt, mit Dichlormethan und H₂O extrahiert. Die organische Schicht wurde eingeengt und mit Hilfe der Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Anwendung eines Methanol-Gradienten in Dichlormethan (5–10%) gereinigt.
C. DIMETHOXYTRITYL-2-PYRIDIN-POLYCYCLISCHES NUKLEOSID
Es wurden 0,3 ml wasserfreies Diisopropylamin mit 4 ml wasserfreiem THF unter N₂ vereinigt und bis 0°C gekühlt. Es wurden 1,2 ml 1,7 M Butyllithium in THF tropfenweise zugesetzt und das Reaktionsgemisch für 5 min gerührt. Sodann wurden 200 mg DMT-FPdC in 10 ml wasserfreiem THF tropfenweise zugesetzt. Nach 1 Stunde bei 0°C wurde das Reaktionsgemisch mit 1 M Natriumhydrogencarbonat gelöscht und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Na₂SO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt und mit Hilfe der Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol (5–10%) in Dichlormethan gereinigt. Nach dem Einengen unter vermindertem Druck wurde die Verbindung in das H-Phosphonat-Derivat mit Hilfe von Standardprozeduren überführt (siehe Jones, et al., "JOC" 58, 2983–2991, 1993).
BEISPIEL 3
REPRÄSENTATIVE ANWENDUNG DES REAKTIONSSCHEMAS VON 8-1 UND 8-2
A. 3'-5'-DIACETYL-S-BROM-2'-DES OXYURIDIN
Es wurde 5-Brom-2'-desoxyuridin (7,3 g; 23,7 mMol) in Pyridin (30 ml) aufgelöst und mit Acetanhydrid (10 g; 95 mMol) bei Raumtemperatur für 3 Stunden behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methanol gelöscht und eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl₂ und gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung aufgeteilt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über MgSO₄ getrocknet und danach eingeengt, um quantitativ die Titelverbindung zu ergeben.
B.1. 5-BROM-3',5'-DIACETYL-N⁴-(2-HYDROXYPHENYL)-2'-DESOXYCYTIDIN
Zu einer Lösung von 3',5'-Diacetyl-5-brom-2'desoxyuridin (8,5 g; 21,7 mMol), Dichlormethan (100 ml), Triethylamin (8,8 g; 87 mMol) und DMAP (0,13 g) wurde 2-Mesitylsulfonylchlorid (9,5 g; 43,4 mMol) zugegeben. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 18 Stunden wurden DBU (6,6 g; 43,5 mMol) und 2-Aminophenol (9,5 g; 87 mMol) zugesetzt und die Lösung für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und der Rückstand zwischen Ethylacetat und gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
B.2. 5-BROM-3',5'-DIACETYL-N⁴-{2-HYDROXY-M-NITROPHENYL)-2'-DESOXYCYTIDIN
Zu einer Lösung von 3',5'-Diacetyl-5-brom-2'-desoxyuridin (4,8 g; 12 mMol), Dichlormethan (50 ml), Triethylamin (5,0 g; 50 mMol) und DMAP (0,10 g) wurde 2-Mesitylsulfonylchlorid (5,2 g; 24 mMol) zugesetzt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 4 Stunden wurden DBU (3,6 g; 24 mMol) und 2-Amino-4-nitrophenol (7,4 g; 48 mMol) zugesetzt und die Lösung für 3 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und der Rückstand zwischen Ethylacetat und gesättigtem Natriumhydrogencarbonat aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt. Das isolierte Produkt hatte eine gewisse Unreinheit und wurde mit Ethylacetat angerieben. Der gelbliche Niederschlag abfiltriert und mit Dichlormethan gewaschen, um die Titelverbindung zu ergeben.
B.3. 5-BROM-3',5'-DIACETYL-N⁴-(2-HYDROXY-3,5-DIMETHYLPHENYL)-2'-DESOXYCYTIDIN
Die Titelverbindung wurde synthetisch mit Hilfe der Synthese von Verbindung 3.B.1. mit der Ausnahme dargestellt, dass die Reaktion 2-Amino-4,6-dimethylphenol anstelle von 2-Amino-4-nitrophenol verwendete. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die gewünschte Verbindung zu ergeben, die eine gewisse Verunreinigung enthielt und für die nächste Reaktion ohne weitere Reinigung weiter verwendet wurde.
B.4. 5-BROM-3',5'-DIACETYL-N⁴-[2-(3-HYDROXYNAPHTHYL)]-2'-DESOXYCYTIDIN
Zu einer Lösung von 3',5'-Diacetyl-S-Brom-2'-desoxyuridin (4,0 g; 10 mMol), Dichlormethan (50 ml), Triethylamin (4,0 g; 40 mMol) und DMAP (0,1 g) wurde 2-Mesitylsulfonylchlorid (4,4 g; 20 mMol) zugesetzt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 6 Stunden wurden DBU (3,0 g; 20 mMol) und 3-Amino-2-naphthol (6,4 g; 40 mMol) zugesetzt und die Lösung für 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat aufgelöst und mit gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, und die Titelverbindung aus der Lösung ausgefällt. Die Niederschläge wurden abfiltriert und gründlich mit Ethylacetat und danach mit Dichlormethan gewaschen und getrocknet. Eine kleine Menge der Titelverbindung wurde auch aus dem Filtrat erhalten.
C.1. 5-BROM-N⁴-(2-HYDROXYPHENYL)-2'-DESOXYCYTIDIN
5-Brom-3',5'-diacetyl-N⁴-(2-hydroxyphenyl)-2'-desoxycytidin (Beisp. 3.B.) (4,3 g; 8,9 mMol) wurde mit gesättigtem Ammoniak in Methanol bei Raumtemperatur für 3 Stunden behandelt und bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan/Hexan (1/1) angerieben. Der weißliche Feststoff wurde abfiltriert, gründlich mit Dichlormethan/Hexan gewaschen und getrocknet.
C.2. 5-BROM-N⁴-(2-HYDROXY-M-NITROPHENYL)-2'-DESOXYCYTIDIN
Die Titelverbindung wurde aus der Verbindung 3.B.2. mit Hilfe der Synthese von Verbindung 3.C.1. hergestellt.
C.3. 5-BROM-N⁴-(2-HYDROXY-3,5-DIMETHYLPHENYL)-2'-DESOXYCYTIDIN
Die rohe Verbindung von 3.C.2. wurde mit 100 ml gesättigtem NH₃ in Methanol bei Raumtemperatur für 5 Stunden behandelt und danach bis zur Trockene eingeengt. Der Rest wurde zwischen Dichlormethan und gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung aufgeteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet und mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
C.4. 5-BROM-N⁴-[2-(3-HYDROXYNAPHTHYL)]-2'-DESOXYCYTIDIN
Die Verbindung, die in Beispiel 3.B.4. (3,1 g; 5,8 mMol) erzeugt wurde, wurde mit gesättigtem NH₃ in Methanol (150 ml) bei Raumtemperatur für 6 Stunden behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan/Ethylacetat angerieben. Der Niederschlag wurde abfiltriert, gründlich mit Dichlormethan gewaschen, getrocknet und ergab 2,5 g, 96%.
D.1. 2'-DESOXYPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Es wurde Kaliumfluorid (4,3 g; 75 mMol) zu einer Ethanol-Lösung (150 ml) der Verbindung zugegeben, die in Beispiel 3.C.1 (3,0 g; 7,5 mMol) hergestellt wurde. Die resultierende Lösung wurde für 3 Tage refluxiert. Die Lösung wurde bis Raumtemperatur gekühlt, etwas Niederschlag abfiltriert und das Filtrat bis zur Trockene eingeengt und für Beispiel 3.F.1. ohne weitere Reinigung verwendet.
D.2. 2'-DESOXY-P-NITROPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Es wurde eine Lösung der Verbindung von Beispiel 3.C.2. (2,4 g; 5,4 mMol), Kaliumfluorid (3,1 g; 54 mMol), Ethanol (100 ml) und DMSO (30 ml) in eine Bombe gegeben und für 3 Tage bei 120°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt. Das Rohprodukt wurde für Beispiel 3.E. ohne weitere Reinigung weiter verwendet.
D.3. 2'-DESOXY-2,4-DIMETHYLPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Die Titelverbindung wurde nach der gleichen Prozedur wie in Beispiel 3.D.1. mit der Ausnahme synthetisch dargestellt, dass die Dimethylphenyl-Verbindung von Beispiel 3.C.3. als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
D.4. 2'-DESOXY-NAPHTHOXAZEN-TRICYCLISCHES DC
Die Verbindung von Beispiel 3.C.4. (2,4 g; 5,3 mMol) und Kaliumfluorid (3,1 g; 53 mMol) wurden in Ethanol (100 ml) für 4 Tage refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde bis Raumtemperatur gekühlt und bis zur Trockene eingeengt, um die Titelverbindung zu ergeben.
E. 3',5'-DIACETYL-2'-DESOXY-P-NITROPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Das Rohprodukt von Beispiel 3.D.2. (0,3 g) wurde in Pyridin (10 ml) aufgelöst und mit Acetanhydrid (3 ml) bei Raumtemperatur für 3 Stunden umgesetzt. Das Gemisch wurde mit Methanol gelöscht, eingeengt und zwischen Dichlormethan und gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung aufgeteilt. Die organische Phase wurde mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
F.1. 5'-O-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXYPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Das Rohprodukt von Beispiel 3.D.1. wurde in Pyridin (35m1) aufgelöst und mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (5 g; 14,7 mMol) bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden behandelt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgelöst und mit gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet, eingeengt und danach mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben. Das Nukleosid wurde in sein 3'-Wasserstoff Phosphonat-Derivat überfuhrt und mit Hilfe von Standardprozeduren in Oligonukleotide eingebaut.
F.2. 5'-O-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXY-4-NITROPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Die Verbindung von Beispiel 3.E. (0,27 g; 0,608 mMol) wurde mit gesättigtem NH₃ in Methanol (20 ml) bei Raumtemperatur für 4 Stunden behandelt und danach eingeengt. Der Rest wwde in Pyridin (10 ml) aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 4-4'-Dimethoxytritylchlorid (0,25 g; 0,73 mMol). Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und danach zwischen Dichlormethan und gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung aufgeteilt. Die organische Phase wurde getrocknet und mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt um die Titelverbindung zu ergeben.
F.3. 5'-O-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXY-2,4-DIMETHYLPHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Die Verbindung von Beispiel 3.D.3. (0,3 g; 0,87 mMol) wurde in Pyridin (5 ml) aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,4 g; 1,2 mMol) und DMAP (10 mg). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, eingeengt und sodann zwischen Dichlormethan und gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung aufgeteilt. Die organische Phase wurde isoliert, getrocknet und mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben. Die nicht umgesetzte Verbindung (85 mg) wurde aus wässriger Lösung gewonnen.
F.4. 5'-O-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXY-2-NAPHTHOXAZEN-TRICYCLISCHES DC
Die Verbindung von Beispiel 3.D.4. wurde in Pyridin (15 ml) aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (3,1 g; 9,1 mMol) und DMAP (15 mg). Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und sodann zwischen Dichlormethan und gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung aufgeteilt. Die organische Lösung wwde abgetrennt, über MgSO₄ getrocknet, mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
G. 5'-O-DIMETHOXYTRITYL-2'-DESOXY-PHENOXAZIN-TRICYCLISCHES DC
Die Nukleoside (3.F.1., 3.F.2., 3.F.3., 3.F.4.) wurden in ihre 3'-Wasserstoff-Phosphonat-Derivate überführt und in Oligonukleotide mit Hilfe von Standardprozeduren eingebaut.
BEISPIEL 4
REPRÄSENTATIVE ANWENDUNG DES REAKTIONSSCHEMAS VON 7
A.1. 5-IOD-3',5'-DIACETYL-N⁴-(2-MERCAPTOPHENYL)-2'-DES OXYCYTIDIN
Zu einer Lösung von 3',5'-Diacetyl-5-iod-2'-desoxyuridin (2,19 g, 5,00 mMol), Acetonitril (ACN, 75 ml), Triethylamin (TEA, 6,96 ml, 50,0 mMol) und DMAP (0,15 g, 1,25 mMol) wurde Mesitylsulfonylchlorid (2,19 g, 10,0 mMol) zugesetzt. Nach dem Rühren bei Umgebungstemperatur für 18 Stunden wurden DBU (2,14 ml, 10,0 mMol) und 2-Aminothiophenol (2,14g, 20,0 mMol) zugesetzt und die Lösung für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und das rohe Produkt zwischen Ethylacetat (EA, 200 ml) und gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (SASB, 200 ml) aufgeteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und auf dem Rotationsverdampfer eingeengt. Das rohe Produkt wurde mit Hilfe der Flash-Chromatographie auf Silicagel [1-5% 2-PropanoUDichlormethan (DCM)] gereinigt, um das Produkt zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃) δ 2,10 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 2,17 (s, 3H), 2,77 (ddd, 1 H, J = 2,2, 5,2, 15,1 Hz), 4,14 (bs, 1H), 4,35 (m, 3H), 5,20 (m, 1H), 6,13 (t, 1H, J = 6,5 Hz), 6,78 (m, 2H), 7,30 (m, 2H), 8,05 (s, 1H).
A.2. 5-BROM-3',5'-DIACETYL-N⁴-(2-HYDROXYPHENYL)-2'-DES OXYCYTIDIN
Zu einer Lösung von 3',5'-Diacetyl-S-Brom-2'-desoxyuridin (1,79g, 5,00 mMol), Acetonitril (ACN, 75 ml), Triethylamin (TEA, 6,96 ml, 50,0 mMol) und DMAP (0,15 g, 1,25 mMol) wurde Mesitylsulfonylchlorid (2,19 g, 10,0 mMol) zugesetzt. Nach dem Rühren bei Umgebungstemperatur für 1 Stunden wurden DBU (2,14 ml, 10,0 mMol) und 2-Aminophenol (2,18 g, 20,0 mMol) zugesetzt und die Lösung für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und das rohe Produkt zwischen Ethylacetat (EA, 200 ml) und gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (SASB, 200 ml) aufgeteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und auf dem Rotationsverdampfer eingeengt. Das rohe Produkt wurde mit Hilfe der Flash-Chromatographie auf Silicagel [20-40-60-80-100% EA/Hexane] gereinigt. Die Produktfraktionen wurden eingeengt und das Produkt aus EA angerieben
B. 2'-DESOXYPHENOTHIAZIN
Es wurde eine Lösung des Diacetats von Schritt A (600 mg, 1,10 mMol), Kaliumtert-butoxid (1,0 M in THF, 2,20 ml, 2,20 mMol) und absolutem Ethanol (25 ml) am Rückfluss für 0,5 Stunden erhitzt. Die Lösung ließ man bis Umgebungstemperatur kühlen und behandelte mit Essigsäure (0,5 ml). Die Lösung wurde eingeengt; Toluol (50 ml) zugesetzt und die Lösung wiederum eingeengt. Das rohe Produkt wurde mit Hilfe der Flash-Chromatographie auf Silicagel (2–10% Methanol (Me)/DCM) gereinigt, um das Phenothiazin zu ergeben. ¹H NMR (d₆-DMSO) δ 2,02 (m, 1H), 2,11 (m, 1H), 3,56 (dq, 2H, J = 3,5, 12,0 Hz), 3,77 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 6,06 (t, 1H, J = 6,3 Hz), 6,92 (m, 2H), 7,06 (m, 2H), 7,82 (s, 1H).
Diese Verbindungen wurden dimethoxytrityliert C und phosphityliert D mit Hilfe von Standardprozeduren.
C. 5'-O-DMT-2'-DESOXYPHENOTHIAZIN (AUS 7)
¹H NMR (d₆-DMSO) δ 2,17 (m, 2H), 3,14 (dd, 1H, J = 1,6, 9,7 Hz), 3,23 (dd, 1H, J = 4,6, 10,4 Hz), 3,74 (s, 6H), 3,91 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 5,31 (d, 1H, J = 4,4 Hz), 6,09 (t, 1H, J = 6,4 Hz) 6,91 (m, 4H), 7,07 (m, 1H), 7,20–7,41 (m, 12H), 7,59 (s, 1H), 10,46 (s, 1 H).
D. 5'-O-DMT-3'-H-PHOSPHONAT-2'-DESOXYPHENOTHIAZIN, TRIETHYLAMMONIUM-SALZ
¹H NMR (d₆-DMSO) δ 1,15 (t, 9H, J = 7,23 Hz), 2,23 (m, 1H), 2,36 (m, 1H), 3,00 (q, 6H, J = 7,2 Hz), 3,15 (dd, 1H, J = 2,0, 9,95 Hz), 3,27 (dd, J = 4,4, 10,5 Hz), 3,72 (s, 6H), 4,08 (m, 1H) 4,70 (m, 1H), 6,09 (t, 1H, J = 6,4 Hz), 6,60 (d, 1H, J = 584 Hz), 6,92 (m, 4H), 7,06 (m, 1H), 7,20–7,41 (m, 12H), 7,57 (s, 1H), 10,5 (bs, 1H), 10,6 (bs, 1H). ³¹P NMR (d₆-DMSO) 0,45 (dd, JA = 8,6 Hz, J = P-H = 584 Hz).
Die beigefügten Patentansprüche sind so auszulegen, dass jeglicher Sachverhalt ausgeschlossen ist, der zum Anmeldetag der vorliegenden Erfindung unter geltendem Recht nicht patentfähig war.

Claims

Verbindung mit der Struktur:
worin R¹ ein Bindungspartner, ein Linker oder H ist; a und b sind unabhängig 0 oder 1 unter der Voraussetzung, dass die Summe von a und b 0 oder 1 ist; A ist unabhängig N oder C; X ist unabhängig S, O, -C(O)-, NH oder NCH₂R⁶; Y ist -C(O)-; Z ist zusammengenommen mit C-A eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, aufweisend 5 oder 6 Ringatome, worin der Heteroaryl-Ring ein O-Ring-Heteroatom aufweist, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 3 N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens 2 durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ring-Kohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens 1 nichtbrückenbildendes Ring-Kohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶ oder =O; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; R³ ist eine schützende Gruppe oder H, und Tautomere, Solvate und Salze davon; unter der Voraussetzung, dass, wo a 0 beträgt, b 1 ist und R¹ ist:
worin D² unabhängig Hydroxyl ist, geblocktes Hydroxyl, Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Oligodesoxyribonukleotid, das ansonsten lediglich die Basen A, G, T und C enthält; sowie D³ ist H oder OH; dann ist Z zusammengenommen mit C-A nicht ein unsubstituiertes Phenyl.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Z zusammengenommen mit C-A einen Aryl-Ring bildet, substituiert mit C₂-C₆-Alkenyl, C2-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, und R¹ ist
D ist eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe; D¹ ist unabhängig F, H, O-A1kyl, S-Alkyl oder eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe, wobei lediglich eines der D¹ eine koppelnde Gruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, bei welcher Z zusammengenommen mit C-A bildet:
A¹ ist N oder CR⁶; sowie G ist CH, S, O oder NR⁴; sowie R⁴ ist H oder C₁-C₆-Alkyl.
Verbindung nach Anspruch 3, worin nachbarständige R⁶ zusammengenommen einen Phenyl-, Thiazol-, Imidazol-, Oxazol-, Pyridin- oder Pyrimidin-Ring vervollständigen.
Verbindung nach Anspruch 3, worin G S, O oder NR⁴ ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin b 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin a 1 beträgt und X 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin b 1 beträgt und a 0 beträgt.
Verbindung nach Anspruch 1, worin A C ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin A N ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Z gemeinsam mit C-A einen Aryl-Ring vervollständigt, der 6 Ringatome enthält, oder einen Heteroaryl-Ring vervollständigt, der 1 N-Ringatom, 2 N-Ringatome, 1 Sauerstoff Ringatome, 1 Stickstoff Ringatom und 1 Schwefel-Ringatom, die durch mindestens ein Kohlenstoffatom getrennt sind, und 3 N-Ringatome, von denen 2 durch mindestens 1 Kohlenstoffatom getrennt sind.
Verbindung nach Anspruch 11, worin Z zusammen mit C-A einen Heteroaryl-Ring vervollständigen, der 5 Ringatome enthält, von denen eines N ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin A C ist, b 0 beträgt, a beträgt 1 und X ist 0, C(O) oder S.
Verbindung nach Anspruch 1, worin a und b beide 0 sind.
Verbindung nach Anspruch 1, worin A N ist, b beträgt 0, a beträgt 1 und X ist 0.
Verbindung nach Anspruch 1, worin a 0 ist, b beträgt 1 und Y ist C(O).
Verbindung mit der Struktur
worin R¹ H oder eine Linker-Gruppe ist; J ist eine Ary1- oder Heteroaryl-Ringstruktur mit 5 oder 6 Ringatomen, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom aufweist, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl-oder Heteroaryl-Kohlenstoffiingatome unsubstituiert mit anderen als H sind oder mindestens 1 nichtüberbrückendes Kohlenstoff-Ringatom mit R⁶ substituiert ist; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; sowie Tautomere, Salze und Solvate davon;
Verbindung mit der Struktur
worin R¹ H oder eine Linker-Gruppe ist; R²² ist C₁-C₃-Alkyl; J' ist eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur mit 5 oder 6 Ringatomen, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Kohlenstoffringatome unsubstituiert mit anderen als H sind oder mindestens 1 nichtüberbrückendes Kohlenstoff-Ringatom mit R⁶ substituiert ist; R⁶ ist unabhängig C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂ oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; sowie R³ ist eine Schutzgruppe oder H; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon.
Verbindung mit der Struktur:
worin R¹ H oder eine Linker-Gruppe ist; J ist eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur mit 5 oder 6 Ringatomen, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Kohlenstoffringatome unsubstituiert sind oder mindestens 1 nichtüberbrückendes Kohlenstoff-Ringatom mit R⁶ substituiert ist; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; R²³ ist eine Schutzgruppe; R³ ist eine Schutzgruppe oder H; sowie Tautomere, Salze und Solvate davon.
Verbindung mit der Struktur
worin R¹ H ist oder eine Linker-Gruppe; R²⁴ ist unabhängig Halogen oder C₁-C₂-Halogenalkyl; R²⁵ ist unabhängig -SH, -OH, =S oder =O; A ist unabhängig N oder C; und M vervollständigt gemeinsam mit dem Rest -A-C(-R²⁵) eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur mit 5 oder 6 Ringatomen, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom aufweist, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 3 N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens 2 durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Kohlenstof&ingatome ursubstituiert sind oder mindestens 1 nichtüberbrückendes Kohlenstoff-Ringatom mit R⁶ substituiert ist; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; und R³ ist eine Schutzgruppe oder H; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon.
Verbindung mit der Struktur
worin A unabhängig S, O, N oder CR⁶ ist; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; R²⁶ ist C₁-C₄-Alkyl; und R³ ist eine Schutzgruppe oder H; sowie Tautomere, Salze und Solvate davon.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Struktur
worin D OH ist oder geblocktes OH; D¹ ist eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe oder OH; X¹ ist unabhängig eine Phosphodiester-Verknüpfung oder eine Phosphodiestersubstituierte Verknüpfung, gebunden in der 2'- oder 3'-Stellung an einen Furanose-Ring, wobei die verbleibende 2'- oder 3'-Stellung mit R²¹ substituiert ist; R²¹ ist H, OH, F, -O-Alkyl(C₁-C₁ ₂), -S-Alkyl(C₁-C₁ ₂), OC₃H₅ oder SC₃H₅; n ist eine ganze Zahl von 0 bis 98; sowie B ist eine Purin- oder Pyrimidin-Base oder ein Analog davon unter der Voraussetzung, dass mindestens eines der B die Substruktur hat:
worin a und b 0 oder 1 unter der Voraussetzung sind, dass die Summe von a und b 0 oder 1 ist; A ist N oder C; X ist S, O, -C(O)-, NH oder NCH₂R⁶; Y ist -C(O)-; Z ist zusammengenommen mit C-A eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, aufweisend 5 oder 6 Ringatome, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom aufweist, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 3 N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens 2 durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ring-Kohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens 1 nichtbrückenbildendes Ring-Kohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶ oder =0; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C6-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C6-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen, oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; R³ ist eine schützende Gruppe oder H; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon und unter der Voraussetzung, dass, wo a 0 beträgt, b 1 beträgt und R¹ ist:
worin D² unabhängig Hydroxyl ist, geblocktes Hydroxyl, Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Oligodesoxyribonukleotid, das ansonsten lediglich die Basen A, G, T und C enthält; sowie D³ ist H oder OH; dann ist Z zusammengenommen mit C-A nicht ein unsubstituiertes Phenyl.
Verbindung nach Anspruch 22, worin X¹ -P(S)(O)-, -P(O)(O)-, -P(Me)(O)- oder – P(Me)(S)-ist.
Verbindung nach Anspruch 22, worin Z gemeinsam mit CH-A die folgenden bildet:
A¹ ist N oder CR⁶; G ist CH, S, 0 oder NR⁴; und R⁴ ist H oder C₁-C₆-Alkyl; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 22, worin nachbarständige R⁶ zusammengenommen Phenyl-, Thiazol-, Imidazol-, Oxazol-, Pyridin- oder Pyrimidin-Reste bilden.
Verbindung nach Anspruch 22, worin nachbarständige B-Gruppen die Substruktur (30) haben.
Verbindung nach Anspruch 22, worin eine einzelne B-Gruppe mit der Substruktur (30) sich am 5'- oder 3'-Ende des Oligomer befindet.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren einer Nucleinsäure mit der Verbindung nach Anspruch 22.
Verbindung nach Anspruch 22, worin Z gemeinsam mit C-A einen Aryl-Ring bildet, der substituiert ist mit C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren einer Target-Nucleinsäure-Sequenz mit einem Oligonukleotid, das ausreichend komplementär ist zur Target-Sequenz, um einen Duplex zu bilden, wobei das Oligonukleotid die
Erwärmen des Duplex bis zu einem Bereich von 85° bis 95°C sowie Kontaktieren des Duplex mit einer DNA-Polymerase; worin D OH ist oder geblocktes OH; D1 ist eine Oligonukleotid-koppelnde Gruppe oder OH; X1 ist unabhängig eine Phosphodiester-Verknüpfung oder eine Phosphodiestersubstituierte Verknüpfung, gebunden in der 2'- oder 3'-Stellung an einen Furanose-Ring, wobei die verbleibende 2'- oder 3'-Stellung mit R²¹ substituiert ist; R²¹,ist H, OH, F, -O-Alkyl(C₁-C₁₂), -S-Alkyl(C₁-C₁ ₂), OC₃H₅ oder SC₃H₅; n ist eine ganze Zahl von 0 bis 98; sowie B ist eine Purin- oder Pyrimidin-Base oder ein Analog davon unter der Voraussetzung, dass mindestens eines der B die Substruktur hat:
worin a und b 0 oder 1 unter der Voraussetzung sind, dass die Summe von a und b 0 oder 1 ist; A ist N oder C; X ist S, O, -C(O)-, NH oder NCH₂R⁶; Y ist -C(O)-; Z ist zusammengenommen mit C-A eine Aryl- oder Heteroaryl-Ringstruktur, aufweisend 5 oder 6 Ringatome, worin der Heteroaryl-Ring ein einzelnes O-Ring-Heteroatom aufweist, ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, ein einzelnes S-Ring-Heteroatom, ein einzelnes O- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, ein einzelnes S- und ein einzelnes N-Ring-Heteroatom, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, 2 N-Ring-Heteroatome, die durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind, oder 3 N-Ring-Heteroatome, von denen mindestens 2 durch ein Kohlenstoffatom getrennt sind; und worin die Aryl- oder Heteroaryl-Ring-Kohlenstoffatome unsubstituiert sind oder mindestens 1 nichtbrückenbildendes Ring-Kohlenstoffatom substituiert ist mit R⁶ oder =O; R⁶ ist unabhängig H, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, NO₂, N(R³)₂, C=N oder Halogen; oder ein R⁶ zusammengenommen mit einem nachbarständigen R⁶ einen 5 oder 6 Ringatome enthaltenden Ring; R³ ist eine schützende Gruppe oder H; sowie Tautomere, Solvate und Salze davon und unter der Voraussetzung, dass, wo a 0 beträgt, b 1 beträgt und R¹ ist:
worin D² unabhängig Hydroxyl ist, geblocktes Hydroxyl, Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Oligodesoxyribonukleotid, das ansonsten lediglich die Basen A, G, T und C enthält; sowie D³ ist H oder OH; dann ist Z zusammengenommen mit C-A nicht ein unsubstituiertes Phenyl.
Verfahren nach Anspruch 30, bei welchem das Oligonukleotid ein Primer zur Verwendung in der Amplifikation der Target-Nucleinsäure-Sequenz unter Verwendung von PCR ist.
Verfahren nach Anspruch 30, bei welchem das Oligonukleotid eine Sonde zur Verwendung in einer Ligase-Kettenreaktion ist.
Verfahren nach Anspruch 32, bei welchem die Amplifikation bei weitgehend konstanter Temperatur ausgeführt wird.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Z zusammen mit C-A einen Heteroaryl-Ring bilden.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Z zusammen mit C-A einen Heteroaryl- oder Aryl-Ring bilden, der mit Oxo substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Z zusammen mit C-A einen Heteroaryl- oder Aryl-Ring bilden, der mit Nitro substituiert ist.