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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein Verfahren und Zusammensetzungen zur Überwachung der Prozessierung
von β-Amyloidvorläuferprotein.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung derartiger
Verfahren und Zusammensetzungen für die Diagnose, Prognose und Überwachung
der Reaktion auf eine Therapie der Alzheimer-Krankheit, und zum
Screenen und Bewerten von potentiellen Arzneimitteln für die Behandlung
der Alzheimer-Krankheit.
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Die Alzheimer-Krankheit ist durch
die Gegenwart von zahlreichen amyloiden Plaques und neurofibrillären Bündeln (in
hohen Maße
unlöslichen
Proteinaggregaten) gekennzeichnet, welche in den Gehirnen von Alzheimer
Krankheit-Patienten vorhanden sind, insbesondere in denjenigen Bereichen,
die an Gedächtnis
und Wahrnehmung beteiligt sind. Während es in der Vergangenheit
eine erhebliche wissenschaftliche Debatte gab, ob die Plaques und
Bündel
eine Ursache oder lediglich die Folge der Alzheimer-Krankheit sind,
deuten neuere Entdeckungen darauf hin, dass der amyloide Plaque
ein verursachender Vorläufer
oder Faktor ist. Insbesondere wurde entdeckt, dass die Produktion
von β-Amyloidpeptid,
einem Hauptbestandteil des amyloiden Plaque, aus Mutationen in dem
Gen resultieren kann, welches für
Amyloidvorläuferprotein
kodiert, ein Protein, das bei normaler Prozessierung das β-Amyloidpeptid
nicht erzeugt. Es wird derzeit angenommen, dass eine normale (nicht
pathogene) Prozessierung des β-Amyloidvorläuferproteins über Spaltung
durch eine putative "α-Secretase"
erfolgt, welche zwischen den Aminosäuren 16 und 17 des Proteins
spaltet. Es wird weiter angenommen, dass pathogene Prozessierung über eine
putative "β-Secretase"
am Aminoterminus des β-Amyloidpeptids
innerhalb des Vorläuferproteins
erfolgt.
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Die Identifikation von Mutationen
im Amyloidvorläuferprotein-Gen,
welche familiäre,
früh einsetzende Alzheimer-Krankheit
verursachen, ist der stärkste
Hinweis darauf, dass der Amyloidmetabolismus das zentrale Ereignis
in dem der Krankheit zugrunde liegenden pathogenen Prozess ist.
Vier veröffentlichte
Mutationen, welche die Krankheit hervorrufen, umfassen bezogen auf
die 770-Isoform, Valin717 zu Isoleucin (Goate
et al. (1991) Nature 349: 704-706), Valin717 zu
Glycin (Chartier Harlan et al. (1991) Nature 353: 844-846), Valin717 zu Phenylalanin (Murrell et al. (1991)
Science 254: 97-99), und bezogen auf die 695-Isoform, eine Doppelmutation,
welche Lysin595-Methionin596 zu
Asparagin595-Leucin596 verändert (Mullan
et al. (1992) Nature Genet. 1: 345-347), bezeichnet als die Schwedische
Mutation. Darüber
hinaus scheint β-Amyloidpeptid für Hirnneuronen toxisch
zu sein, und neuronaler Zelltod ist mit der Krankheit assoziiert.
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Somit wäre es von erheblichem Wert
für die
Diagnose, Prognose und therapeutische Überwachung der Alzheimer-Krankheit,
die zelluläre
Prozessierung von Amyloidvorläuferprotein überwachen
zu können.
Insbesondere wäre
es wünschenswert,
minimal invasive Vorgehensweisen zum Screenen und Bewerten von nachweisbaren
diagnostischen Markern in leicht erhältlichen Patientenproben, wie
etwa Serum, Zerebrospinalfluid (CSF) und dergleichen, zu identifizieren.
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Eine Reihe von potentiellen diagnostischen
Markern für
Alzheimer-Krankheit ist vorgeschlagen worden. Von besonderem Interesse
für die
vorliegende Erfindung sind bestimmte Fragmente des Amyloidvorläuferproteins,
umfassend Carboxyterminale Fragmente (wie etwa das β-Amyloidpeptid
selbst und Fragmente davon) und Amino-terminale Fragmente (wie etwa
bestimmte 25 kD, 105 kD und 125 kD Fragmente). Bisher hat sich keiner
der vorgeschlagenen Marker als verlässlich für die Diagnose vor dem Tod
oder die Überwachung von
Alzheimer-Krankheit erwiesen.
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Es wäre somit wünschenswert, zusätzliche
und alternative diagnostische Marker für die Alzheimer-Krankheit zu
identifizieren. Derartige Marker sollten selbst und/oder in Kombination
mit anderen diagnostischen Markern und Verfahren geeignet sein.
Bevorzugt sollten die diagnostischen Marker in Körperfluiden, wie etwa CSF,
Blut, Plasma, Serum, Urin, Gewebe und dergleichen nachweisbar sein,
so dass minimal invasive diagnostische Verfahren verwendet werden
können.
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Von weiterem Interesse für die vorliegende
Erfindung sind in vitro und in vivo Systeme und Verfahren zum Screenen
von Arzneimittelkandidaten auf die Fähigkeit, die Produktion von β-Amyloidplaques
zu inhibieren oder zu verhindern. Es wäre wünschenswert, Verfahren und
Systeme zum Screenen von Testverbindungen auf die Fähigkeit,
Amyloidvorläuferprotein
in β-Amyloidpeptid
zu überführen, bereitzustellen.
Insbesondere wäre
es wünschenswert,
derartige Methoden und Systeme auf metabolischen Wegen zu basieren,
deren Beteiligung an einer derartigen Überführung festgestellt worden ist,
wobei die Testverbindungen fähig
wären, den
metabolischen Weg, welcher zu der Überführung führt, zu unterbrechen oder zu
stören.
Derartige Verfahren und Systeme sollten rasch, wirtschaftlich, und
zum Screenen einer großen
Anzahl von Testverbindungen geeignet sein.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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β-Amyloidpeptid
(auch bezeichnet als A4, βAP,
Aβ oder
AβP; siehe
US Patent Nr. 4,666,829, und Glenner and Wong (1984) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 120: 1131–1135)
stammt von β-Amyloidvorläuferprotein
(βAPP) ab,
das in differenziell gespleissten Formen von 695, 751 und 770 Aminosäuren exprimiert wird.
Siehe Kang et al. (1987) Nature 325: 773–776; Ponte et al. (1988) Nature
331: 525–527;
und Kitaguchi et al. (1988) Nature 331: 530-532. Die normale Prozessierung
des Amyloidvorläuferproteins
beinhaltet eine proteolytische Spaltung an einer Stelle zwischen
den Resten Lys16 und Leu17 (nummeriert
wie in Kang et al. (1987), Nature 325: 773–776, für die νAP-Region, bei der Asp597 Rest 1 ist), nahe der Transmembrandomäne, was
zu einer konstitutiven Sezernierung einer extrazellulären Domäne führt, welche
den Rest der β-Amyloidpeptidsequenz
enthält
(Esch et al. (1990) Science 248: 1122–1124). Dieser Weg scheint
zwischen vielen Spezies konserviert und in vielen Zelltypen vorhanden
zu sein. Siehe Weidemann et al. (1989) Cell 57: 115–126, und
Oltersdort et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 4492-4497. Dieser normale Weg spaltet innerhalb
der Region des Vorläuferproteins,
welche dem β-Amyloidpeptid
entspricht, wodurch dessen Bildung anscheinend ausgeschlossen wird.
Es wurde eine andere konstitutiv sezernierte Form von βAPP festgestellt
(Robakis et al., Soc. Neurosci., October 26, 1993, Abstract No.
15.4, Anaheim, CA.), welche Carboxy-terminal mehr von der βAP-Sequenz
enthält
als die von Esch et al. (1990) Science 248: 1122–1124, beschriebene Form.
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Golde et al. (1992), Science 255:
728–730,
stellten eine Reihe von Deletionsmutanten von Amyloidvorläuferprotein
her und beobachteten eine einzige Spaltstelle innerhalb der β-Amyloidpeptidregion.
Auf Basis dieser Beobachtung wurde postuliert, dass die Bildung
von β-Amyloidpeptid
keinen Sezernierungsweg umfasst. Estus et al. (1992), Science 255:
726–728,
lehren, dass die zwei größten in
Hirnzellen aufgefundenen Carboxy-terminalen proteolytischen Fragmente
von Amyloidvorläuferprotein
die gesamte β-Amyloidpeptidregion
enthalten.
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Die PCT-Anmeldung WO 92/00521 beschreibt
Verfahren zur Bewertung von Alzheimer-Krankheit auf Basis einer
Messung der Mengen von bestimmten löslichen 25 kD, 105 kD und 125
kD Derivaten von Amyloidvorläuferprotein
in Zerebrospinalfluid aus einem Patienten. 3 von WO 92/00521 legt nahe, dass eine Spaltung
von Amyloidvorläuferprotein
angrenzend an den Aminoterminus von β-Amyloidpeptid vorkommen könnte, wobei
ein lösliches
Amino-terminales Fragment produziert wird, aber in der Anmeldung
wird kein Nachweis oder eine Diskussion einer derartigen Spaltung
präsentiert.
Kennedy et al. (1992), Neurodegeneration 1: 59–64, präsentieren Daten für eine Form
von sezerniertem βAPP,
welche durch ihre Reaktivität
mit Antikörpern gegen
die Reste 527–540
von βAPP
und ein Fehlen von Reaktivität
mit Antikörpern
gegen die ersten fünfzehn Reste
von βAP
gekennzeichnet war. Es wurde kein direkter Nachweis bereitgestellt
um die Spaltstelle oder die Identität der Carboxyterminus der βAPP-Form
nahe zu legen. Die PCT-Anmeldung WO 91/16628 beschreibt Verfahren
zur Diagnostizierung der Krankheit auf Basis eines Nachweises von
Amyloidvorläuferproteinen
und Fragmenten davon unter Verwendung von Antikörpern gegen die Protease Nexin-2
oder Amyloidvorläuferprotein.
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Neuere Veröffentlichungen zeigen, dass
lösliches β-Amyloidpeptid
von gesunden Zellen produziert wird, in Kulturmedien hinein (Haass
et al. (1992) Nature 359: 322-325),
und in CSF von Mensch und Tier (Seubert et al. (1992) Nature 359:
325–327).
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Palmert et al. (1989) Biochem. Biophys.
Res. Comm. 165: 182–188
beschreiben drei mögliche
Spaltmechanismen für βAPP und präsentieren
einen Nachweis, dass die Spaltung von βAPP bei der Produktion von löslichen βAPP-Derivaten
nicht an Methionin596 stattfindet. US Patent
Nr. 5,200,339 diskutiert die Existenz von einem oder mehreren bestimmten
proteolytischen Faktoren, die mutmaßlich βAPP an einer Stelle nahe des βAPP-Aminoterminus
spalten können.
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Sahasrabudhe et al (1993) J. Biol.
Chem. 268: 16699–16705
betrifft die enzymatische Erzeugung des Aminoterminus des β-Amyloidpeptids
und diskutiert Experimente, die darauf abzielen, Enzyme zu identifizieren,
welche bestimmte synthetische Peptide spalten können.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es werden Verfahren und Zusammensetzungen
zum Nachweis und der Überwachung
eines Amino-terminalen Fragments von β-Amyloidvorläuferprotein (βAPP), welches
aus β-Secretase-Spaltung
resultiert, bereitgestellt. Das resultierende Fragment, nachstehend
hierin als ATF-βAPP
bezeichnet, kann in biologischen Proben nachgewiesen werden und
ist zur Überwachung
der Prozessierung von βAPP
in Tiermodellen geeignet. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung
eine Überwachung
der Prozessierung von βAPP
in vivo bereit, wobei die Gegenwart von ATF-βAPP in einer Probe aus einem
von Mensch verschiedenen Tier nachgewiesen wird, das transformiert
worden ist, so dass es die Schwedische Mutation von humanem βAPP exprimiert,
und wobei das ATF-βAPP
zwischen LEU596 und ASP597 in
der 695 Aminosäuren-Isoform,
bezogen auf die Nummerierung von Kang et al. (1987) Nature 325:
773–776,
gespalten worden ist. Die Schwedische Mutation resultiert aus einer
Substitution von LYS595-MET596,
die in der 695 Wildtypisoform von βAPP vorhanden sind, durch ASN595-LEU596.
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Es wurde festgestellt, dass die von
Mensch verschiedenen Tiermodelle, welche die humane Schwedische
Mutation des βAPP-Gens
exprimieren, besonders produktive Erzeuger des Amino-terminalen
Fragments davon sind. Das bedeutet, von Mensch verschiedene Tiermodelle
können
die humane Schwedische Mutation mit einer höheren Häufigkeit spalten, als sowohl
das endogene βAPP
oder das humane Wildtyp-βAPP
gespalten werden. Es wird weiterhin angenommen, dass die intrazelluläre Prozessierung
der Schwedischen Mutation von humanem βAPP zu einer höheren Produktion
von ATF-βAPP
führt als
durch andere Mutationen des βAPP-Gens
produziert wird. Somit sind von Mensch verschiedene transgene Tiersysteme,
wie etwa transgene Mäuse,
welche die Schwedische Mutation von βAPP exprimieren, besonders geeignet
als Modelle zur Überwachung
der intrazellulären
Prozessierung von βAPP
sowie zum Screening nach Verbindungen auf die Fähigkeit, die Spaltung von βAPP in Folge
von β-Secretaseaktivität, die anscheinend
pathogene Form der βAPP-Prozessierung,
zu inhibieren oder zu modulieren.
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Die Erfindung stellt auch ein Verfahren
zur Identifizierung von Inhibitoren der β-Amyloidproduktion bereit, wobei das
Verfahren umfasst das Verabreichen einer Testverbindung einem von
Mensch verschiedenen Tier, welches transformiert worden ist, so
dass es die Schwedische Mutation von humanem β-Amyloidvorläuferprotein (βAPP) exprimiert,
das Nachweisen der Menge eines zwischen Leu596 und
Asp597 gespaltenen Amino-terminalen Fragments
von βAPP
(ATF-βAPP)
in einer Probe aus dem von Mensch verschiedenen Tier, und das Vergleichen
der nachgewiesenen Menge an ATF-βAPP
mit einer in Abwesenheit der Testverbindung produzierten Kontrollmenge
an ATF-βAPP.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Amino-terminalen Fragments
der Schwedischen Mutation von β-Amyloidvorläuferprotein
(βAPP) in
einer biologischen Probe bereit, wobei das Verfahren umfasst das
in Kontakt Bringen der Probe mit einer Bindesubstanz, welche spezifisch an
ein Epitop bindet, umfassend ein C-terminales Leucin596,
das durch Spaltung von β-Amyloidpeptid
(βAP) aus
der Schwedischen Mutation von βAPP
freigelegt worden ist, und das Nachweisen einer Bindung zwischen der
Substanz und dem Amino-terminalen Fragment.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das durch β-Secretasespaltung der Schwedischen Mutation
von βAPP
produzierte ATF-βAPP
durch eine Bindesubstanz nachgewiesen, welche spezifisch an ein
Epitop bindet, das an oder in der Nähe des Carboxyterminus von
ATF-βAPP
vorhanden ist, wobei das Epitop den Carboxy-terminalen Rest (LEU596), und bevorzugt die fünf Aminosäurereste, die am Carboxyterminus
von ATF-βAPP
vorhanden sind, umfasst. Es wurde festgestellt, dass die Bindung
zwischen Bindesubstanzen, wie etwa Antikörpern, gegen ein derartiges
C-terminales Epitop für
einen Nachweis der Schwedischen Form von ATF-βAPP in hoher Spezifität sorgt.
Bevorzugte Antikörper
werden gegen ein Peptid erzeugt, umfassend die fünf Reste des Carboxyterminus,
der durch β-Sectretasespaltung
des Schwedischen βAPP
freigelegt ist.
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In einem anderen Aspekt stellt die
Erfindung ein Verfahren zum Screening nach Testverbindungen auf die
Fähigkeit,
die Spaltung von βAPP
zu inhibieren oder zu modulieren bereit, wobei das Verfahren das
Verabreichen einer Testverbindung an eine Maus, die transformiert
worden ist, so dass sie die Schwedische Mutation von humanem βAPP exprimiert,
wobei das humane βAPP
in einer ausreichenden Menge zu ATF-βAPP prozessiert wird, um in
einem Hirnhomogenat der transformierten Maus nachgewiesen werden
zu können,
und das Nachweisen einer Änderung
der Prozessierung von βAPP
in der transformierten Maus, im Vergleich zu der Prozessierung in
Abwesenheit der Testverbindung, umfasst.
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In einem nochmals weiteren Aspekt
der vorliegenden Erfindung werden Antikörper bereitgestellt, die für den C-Terminus
des Amino-terminalen Fragments von Schwedischem βAPP spezifisch sind. Die Antikörper werden
bevorzugt gegen ein Peptid, umfassend den C-Terminus des Amino-terminalen
Fragments von Schwedischem βAPP
erzeugt, und die Antikörper
können
polyklonal oder monoklonal sein.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A und 1B erläutern
die verschiedenen Isoformen von normalem βAPP bzw. die entsprechenden
Isoformen von ATF-βAPP.
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Die 2A, 2B und 2C sind chemilumineszierende Gelmuster
von Material, welches aus konditioniertem Medium einer humanen fötalen Hirnzellkultur
stammt. Die Bahnen 1, 2 und 3 von jedem Gel stellen das unbehandelte
konditionierte Medium, das durch Reaktion mit einem Antikörper, welcher
ein Epitop innerhalb der Reste 1–16 des β-Amyloidpeptids erkennt, abgereicherte
konditionierte Medium, bzw. das von diesem Antikörper entfernte Material dar.
Die Gelmuster A, B und C stellen die nachfolgenden Sonden dar: Antikörper anti-5
(der Stellen Amino-terminal zu der β-Amyloidpeptidregion auf βAPP erkennt);
Antikörper
92 (der gegen ein synthetisches Peptid erzeugt worden war, das in
dem C-terminalen Methionin endet, welches durch Spaltung von βAP aus βAPP freigelegt
worden ist); bzw. Antikörper
10D5 (ein monoklonaler Antikörper,
der ein Epitop von βAP
innerhalb der Reste 1-16 erkennt).
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3 ist
ein chemilumineszierendes Gelmuster, das durch Untersuchung von
humanem Lumbal-CSF erhalten wurde. Das CSF wurde mit Antikörper 92
getestet, entweder alleine (Bahn 1) oder nach Präinkubation mit verschiedenen
Peptiden, welche Variationen des C-Terminus von ATF-βAPP darstellen.
Eine signifikante Kompetition (Bindungsverringerung) wurde mit Peptiden
beobachtet, die mit dem Cterminalen Methionin enden (Bahnen 3, 4,
6 und 7). Die Peptide waren wie folgt: Bahn 1, kein kompetierendes
Peptid zugegeben; Bahn 2, GSGLTNIKTEEISEVK; Bahn 3, YSGLTNIKTEEISEVKM;
Bahn 4, ISEVKM; Bahn 5 EISEVKMD; Bahn 6, CISEVKM; Bahn 7, YISEVKM.
MW = Molekulargewichtsmarker (angegeben in Kilodalton).
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4 ist
ein Autoradiogramm, das Elektrophoresegelmuster darstellt, die durch
Immunpräzipitation von
konditioniertem Medium aus verschiedenen Zelllinien erhalten wurden.
Das Material, das von humanen fötalen
Hirnkulturen sezerniert und mittels Antikörper 92 immunpräzipitiert
worden war (Bahn 11, am Pfeil) ist anscheinend kleiner als das von
Antikörper
C6C präzipitierte
Material (Bahn 10 am Pfeil). Antikörper C6C erkennt ein Epitop
innerhalb der Reste 1–16
von βAP.
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5 ist
ein Autoradiogramm, das Elektrophoresegelmuster darstellt, die durch
Immunpräzipitation von
konditioniertem Medium aus der humanen Zelllinie 293, welche mit
cDNA transfiziert worden war, die für sowohl normales als auch
Schwedisches βAPP
kodiert, erhalten wurden. Die Menge an ATF-βAPP Material, welche durch die
Schwedisch transfizierten Zellen sezerniert wird (Bahnen 11 und 12),
ist qualitativ größer als die
von normalen βAPP
Transfektanten (Bahnen 9 und 10) produzierte Menge.
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6 ist
ein Immunblot, der die Spezifität
eines gegen die Schwedische Mutation von ATF-βAPP erzeugten monoklonalen Antikörpers zeigt
(nachstehend hierin als der Antikörper Schwedisch 192 bezeichnet).
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7A ist
eine Karte des Plasmids pNSEAPPswΔ3'.
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7B ist
eine Karte des Plasmids pNSEAPPsw.
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8 ist
ein Western Blot von löslichen
Fraktionen von Hirnhomogenaten von transgenen und nicht transgenen
(Kontrolle) Mäusen,
welche auf die Gegenwart von βAPP-Fragmenten
untersucht wurden.
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9 sind
Western Blots von Hirnhomogenaten von transgenen und nicht transgenen
(Kontrolle) Mäusen,
welche zeigen, dass der Antikörper
Schwedisch 192 nicht mit βAPP-Fragmenten
kreuzreagiert, die an der α-Secretasestelle
gespalten sind.
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BESCHREIBUNG
DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die vorliegende Erfindung resultiert
aus der Identifikation eines neuen sezernierten Fragments von β-Amyloidvorläuferprotein
(βAPP).
das aus der Spaltung einer intakten β-Amyloidpeptidregion (βAP) aus dem Vorläuferprotein
resultiert. Die neuen sezernierten Fragmente umfassen den Amino-terminalen
Abschnitt von βAPP,
welcher nach einer derartigen Spaltung übrig bleibt und hierin nachstehend
als die Amino-terminale Fragmentform von βAPP (ATF-βAPP) bezeichnet wird. Es wird
angenommen, dass ATF-βAPP
das Produkt eines alternativen sezernierenden Prozessierungswegs
für βAPP ist,
der sogar in normalen (nicht erkrankten) Zellen vorhanden ist. Es
wird weiterhin angenommen, dass der alternative Sezernierungsweg
jedoch für
ein essentielles Ereignis in der Produktion von βAP in erkrankten Zellen von
Patienten verantwortlich sein kann, und dass abnormale Produktion
von ATF-βAPP
an Krankheiten in Zusammenhang mit βAP-Plaques beteiligt sein kann,
insbesondere Alzheimer-Krankheit und Down Syndrom. Somit stellt
die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zur Überwachung
der zellulären
Prozessierung von βAPP
auf Basis des Nachweises und der Messung von ATF-βAPP in biologischen
Proben bereit.
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ATF-βAPP wird identifiziert und erkannt
durch spezifische Bindung an Antikörper, welche gegen Peptide
erzeugt wurden, die bestimmte Reste von βAPP umfassen, die unmittelbar
an die βAP-Region
angrenzen und für
normales βAPP
das Carboxyterminale Methionin (in der 695-Isoform als Methionin596 nummeriert, wie nachstehend ausgeführt) umfassen.
Die Peptide umfassen üblicherweise
mindestens fünf
aufeinander folgende Reste bis zu und einschließlich Rest596,
und spezifische Verfahren zur Herstellung derartiger Antikörper sind nachstehend
ausgeführt.
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Nunmehr unter Bezugnahme auf die 1A und 1B wird βAPP in drei
Isoformen aufgefunden, umfassend 695, 751 bzw. 770 Aminosäuren. Die
Isoform 695 ist die häufigste
in neuronalen Zellen, wobei die Isoformen 751 und 770 aus Insertionen
an Rest 289 der Isoform 695 resultieren (alle Nummerierungen der
Isoform 695 sind gemäß Kang et
al (1987) Nature 325: 733–736).
ATF-βAPP
resultiert anscheinend aus einer proteolytischen Spaltung der verschiedenen βAPP-Isoformen
an oder innerhalb der fünf
Reste an der Amino-terminalen Seite des Aminoterminus der β-Amyloidpeptidregion
(βAP), der
zwischen den Resten 596 und 597 der Isoform 695 gelegen ist. Eine
derartige Spaltung führt
zu der Freilegung eines C-terminalen Rests, der üblicherweise Methionin596, Lysin595 oder
Leucin596, zumeist Methionin596 oder
Leucin596 ist, gezeigt als MET596 und LEU596 in 1B.
Das Freilegen von LEU596 findet mit der β-Secretasespaltung
der Schwedischen Mutation von humanem βAPP in sowohl Mensch als auch
in Tiermodellen statt, wie nachstehend ausführlicher beschrieben. Es wird
erkannt werden, dass die C-terminalen Reste natürlich eine unterschiedliche
Nummerierung haben würden,
wenn das ATF-βAPP
von einer unterschiedlichen βAPP-Isoform
stammt. Insbesondere wäre
in den βAPP-Isoformen 751 bzw.
770 das C-terminale Methionin MET652 und
MET671, und das Cterminale Leucin wäre LEU651 und LEU670. Wie
hierin nachstehend und in den Ansprüchen verwendet bezeichnen Methionin596, Lysin595 und
Leucin596 allgemein die entsprechenden Reste
in allen anderen Isoformen oder Varianten von βAPP. Es wird derzeit angenommen,
dass der N-terminale Rest von ATF-βAPP in allen Isoformen LEU18 ist (basierend auf Prozessierung des Aminoterminus
von βAPP
in sezernierten Formen, die innerhalb der βAP-Region gespalten werden).
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
kann ATF-βAPP
in einer Vielzahl von biologischen Proben nachgewiesen und/oder
gemessen werden, umfassend in vitro Proben, wie etwa konditioniertes
Medium aus kultivierten Zellen, und Proben aus Patienten und Tiermodellen,
typischerweise CSF, Blut, Serum, Plasma, Urin, Gewebe und dergleichen.
Nachweis und Messung können
durch jede Technik bewirkt werden, welche ATF-βAPP von anderen βAPP-Fragmenten,
die in der Probe gefunden werden könnten, unterscheiden kann. Günstig können immunologische
Nachweistechniken verwendet werden, die Antikörper, Antikörperfragmente oder andere äquivalente
spezifische Bindesubstanzen verwenden, welche an ein für ATFβAPP charakteristisches
Epitop binden und im Wesentlich frei von Kreuzreaktivität mit anderen βAPP-Fragmenten
sind. Besonders geeignet sind Antikörper und andere Bindesubstanzen,
welche an ein Epitop binden, das den C-terminalen Rest von ATF-βAPP umfasst,
der nach β-Secretasespaltung
der βAP-Region
freigelegt ist, z. B. Methionin596, Leucin596 oder Lysin595,
Es wurde herausgefunden, dass derartige C-terminal-spezifische Antikörper zwischen
dem ATF-βAPP
und verwandten βAPP-Fragmenten
unterscheiden können.
Alternativ können immunologische
Nachweistechniken auf isoliertem und gereinigtem ATF-βAPP unter
Verwendung herkömmlicher
Techniken basieren. Die Herstellung von sowohl Antikörpern, die
für C-terminale
Reste spezifisch sind, als auch von gereinigtem und isoliertem ATF-βAPP werden
nachfolgend hierin beschrieben. Insbesondere geeignete Nachweistechniken
umfassen ELISA, Western Blotting, Radioimmunassay und dergleichen.
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Andere Techniken zum Nachweis von
ATF-βAPP,
welche nicht die Verwendung von ATF-βAPP-spezifischen Antikörpern und/oder
kompetierendem Antigen erfordern, können ebenfalls verwendet werden.
Beispielsweise kann zweidimensionale Gelelektrophorese verwendet
werden, um nah verwandte lösliche
Fragmente von βAPP
aufzutrennen. Antikörper,
die mit vielen oder all den Fragmenten kreuzreaktiv sind, können danach
verwendet werden, um die Gele zu untersuchen, wobei die Gegenwart
von ATF-βAPP
auf Basis seiner genauen Position auf dem Gel identifiziert wird.
Andere Techniken zum Nachweis von ATF-βAPP sind ebenfalls dem Fachwissen
zuzurechnen. Beispielsweise können
die sezernierten βAPP-Spezies, welche die
Amino-terminale Region von βAP
enthalten, immunologisch aus einer Probe entfernt werden, um ATF-βAPP zu isolieren
(siehe 2A, Bahn 2, und 5, Bahnen 11 und 12), welches
danach durch eine beliebige von verschiedenen Methoden, wie vorstehend
diskutiert, nachgewiesen werden kann.
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Antikörper, die für ein Epitop spezifisch sind,
das für
das Wildtyp ATF-βAPP
charakteristisch ist, können
gegen ein geeignetes Antigen oder Hapten, umfassend die C-terminale
ATF-βAPP-Sequenz
einschließlich
des Methioninrests, hergestellt werden. Antikörper, die für ein Epitop spezifisch sind,
das für
die Schwedische Mutation von ATF-βAPP
charakteristisch ist, können
gegen ein geeignetes Antigen oder Hapten, umfassend die C-terminale
ATF-βAPP-Sequenz
einschließlich
des Leucinrests an Position 596, hergestellt werden. Synthetische
Peptide können
günstig
durch herkömmliche
Festphasetechniken hergestellt, an ein geeignetes Immunogen gekoppelt,
und zur Herstellung von Antiseren oder monoklonalen Antikörpern durch
herkömmliche Techniken
verwendet werden. Ein geeignetes synthetisches Peptid besteht aus
sechs Resten von ATF-βAPP (ISEVKM),
die an der unmittelbaren Amino-terminalen Seite von βAP gelegen
sind, und an ein Immunogen gekoppelt und zur Herstellung von spezifischen
Antikörpern,
wie im experimentellen Abschnitt ausführlich beschrieben, verwendet
werden können.
Andere geeignete Peptidhaptene umfassen üblicherweise mindestens fünf aufeinander
folgende Reste innerhalb von βAPP
an der unmittelbaren Amino-terminalen Seite von βAP, und können mehr als sechs Reste umfassen
(obwohl herausgefunden wurde, dass ein Peptid, das sechzehn Amino-terminale
Reste umfasste, Antiseren ergab, die unspezifischer waren). Die
25 Carboxy-terminalen Reste des normalen ATF-βAPP sind wie folgt (unter Verwendung
der Ein-Buchstaben Aminosäurebezeichnungen).
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Die 25 Carboxy-terminalen Reste der
Schwedischen Mutation von βAPP
sind wie folgt:
Synthetische Polypeptidhaptene
können
mittels der gut bekannten Merrifield Festphase-Synthesetechnik hergestellt
werden, bei der Aminosäuren
nacheinander zu einer wachsenden Kette hinzugefügt werden (Merrifield (1963)
J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156).
Die Aminosäuresequenzen
können
auf der vorstehend angegebenen Sequenz von ATF-βAPP beruhen, oder sie können natürlich vorkommende
oder konstruierte mutierte Sequenzen verwenden. Beispielsweise hätten die
Peptide, welche die Schwedische Mutante nachahmen, Lysin
595-Methionin
596 durch
Asparagin
595-Leucin
596 substituiert,
und eine andere Substitution könnte
lediglich die Substitution von Methionin
596 durch
Leucin
596 umfassen. Ein bevorzugtes Peptid
umfasst die Carboxy-terminalen fünf
Aminosäuren
von Schwedischem ATF-βAPP:
SEVNL.
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Sobald eine ausreichende Menge an
Polypeptidhapten erhalten worden ist, kann es an einen geeigneten
immunogenen Träger
konjugiert werden, wie etwa Serumalbumin, Keyhole Limpet Hämocyanin,
oder andere geeignete Proteinträger,
wie allgemein beschrieben in Hudson and Hay, Practical Immunology,
Blackwell Scientific Publications, Oxford, Kapitel 1.3, 1980, dessen
Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird.
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Sobald eine ausreichende Menge des
Immunogens erhalten worden ist, können durch in vitro oder in vivo
Techniken Antikörper
hergestellt werden, die für
den nach Abspaltung von βAP
aus ATF-βAPP
freigelegten C-terminalen Rest spezifisch sind. In vitro Techniken
umfassen das in Kontakt Bringen von Lymphozyten mit den Immunogenen,
während
in vivo Techniken die Injektion der Immunogene in einen geeigneten
Wirbeltierwirt erfordern. Geeignete Wirbeltierwirte sind nicht-human,
umfassend Mäuse,
Ratten Kaninchen, Schafe, Ziegen und dergleichen. Immunogene werden
dem Tier nach einem vorbestimmten Behandlungsplan injiziert, und
den Tieren wird in regelmäßigen Abständen Blut
entnommen, wobei das entnommene Blut nachfolgender Entnahmen verbesserten
Titer und verbesserte Spezifität
hat. Die Injektionen können
intramuskulär,
intraperitoneal, subkutan oder dergleichen erfolgen, und ein Adjuvans,
wie etwa inkomplettes Freund Adjuvans, wird verwendet werden.
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Falls gewünscht, können monoklonale Antikörper erhalten
werden durch Herstellung immortalisierter Zelllinien, welche Antikörper mit
der gewünschten
Spezifität
produzieren können.
Derartige immortalisierte Zelllinien können auf verschiedene Weisen
hergestellt werden. Auf günstige
Weise wird ein kleines Wirbeltier wie etwa eine Maus durch das oben
beschriebene Verfahren mit dem gewünschten Immunogen hyperimmunisiert.
Das Wirbeltier wird danach getötet, üblicherweise
mehrere Tage nach der Schlussimmunisierung, die Milzzellen werden
entfernt, und die Milzzellen werden immortalisiert. Die Art der
Immortalisierung ist nicht kritisch. Die derzeit gebräuchlichste
Technik ist Fusion mit einem Myelomzell-Fusionspartner, wie zuerst
von Kohler und Milstein (1975) Nature 256: 495–497 beschrieben. Andere Techniken
umfassen EBV-Transformation, Transformation mit nackter DNA, z.
B. Onkogenen, Retroviren, etc., oder jedes andere Verfahren, das
für Stabilität der Zelllinie
und Produktion von monoklonalen Antikörpern sorgt. Spezifische Techniken
zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind beschrieben in Antibodies:
A Laboratory Manual, Hrsg. Harlow und Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,
1988.
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Zusätzlich zu monoklonalen Antikörpern und
polyklonalen Antikörpern
(Antiseren) werden die Nachweistechniken der vorliegenden Erfindung
auch Antikörperfragmente
verwenden können,
wie etwa F(ab), Fv, VL, VH und
andere Fragmente. Es wird auch möglich
sein, rekombinant hergestellte Antikörper (Immunglobuline) und Variationen
davon, wie nunmehr in der Patentliteratur und der wissenschaftlichen
Literatur gut beschrieben, zu verwenden. Siehe beispielsweise EPO
8430268.0; EPO 85102665.8; EPO 85305604.2; PCT/GB85/00392; EPO 85115311.4;
PCT/US86/002269 und die japanische Anmeldung 85239543.
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Es wäre auch möglich, andere rekombinante
Proteine herzustellen, welche die Bindespezifität von Antikörpern, hergestellt wie oben
beschrieben, nachahmen.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
weiter isoliertes und gereinigtes ATF-βAPP, das üblicherweise in einer im Wesentlichen
reinen Form erhalten wird. "Im Wesentlichen rein" bedeutet mindestens
etwa 50% w/w (Gewicht/Gewicht) oder eine höhere Reinheit, wobei im Wesentlichen
keine störenden
Proteine und Kontaminationen vorhanden sind. Bevorzugt wird das
ATF-βAPP
in einer Reinheit von größer 50%
w/w, bevorzugt von 80% w/w oder darüber isoliert oder synthetisiert.
Das ATF-βAPP
kann aus einer natürlichen
Quelle mittels herkömmlicher
Proteinreinigungstechniken gereinigt werden, wobei homogene Zusammensetzungen
mit einer Reinheit von mindestens etwa 50% w/w durch die Verwendung
von Antikörpern,
hergestellt wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von herkömmlichen
Immunaffinität-Trenntechniken gereinigt
werden. Geeignete natürliche
Ausgangsmaterialien umfassen konditioniertes Medium aus ATF-βAPP produzierenden
Zelllinien, wie etwa fötalen
Hirnzellkulturen, und dergleichen. Alternativ kann das ATF-βAPP aus biologischen
Proben, die aus einem humanen Wirt erhalten werden, wie etwa CSF,
Serum und dergleichen isoliert werden. Geeignete Proteinreinigungstechniken
sind beschrieben in Methods in Enzymology, Vol. 182, Hrsg, Deutcher,
Academic Press Inc., San Diego, 1990.
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Antikörper und gereinigtes ATF-βAPP, hergestellt
wie vorstehend beschrieben, können
in verschiedenen herkömmlichen
immunologischen Techniken zum Nachweis von ATF-βAPP in biologischen Proben verwendet
werden, insbesondere in Proben aus Patienten und in Tierproben,
zur Überwachung
von Krankheiten in Zusammenhang mit β-Amyloid und zum Arzneimittel-Screening,
und in konditionierten Medien aus Zellkultur zur Überwachung
der intrazellulären
Prozessierung von βAPP.
Geeignete immunologische Techniken umfassen Immunassays, wie etwa
ELISA, Western Blot-Analysen und dergleichen. Zahlreiche spezifische
immunologische Nachweistechniken sind in Antibodies: A Laboratory
Manual, Hrsg. Harlow und Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,
beschrieben.
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Ein Nachweis von ATF-βAPP in Proben
aus Patienten kann zur Diagnose und Überwachung von Alzheimer-Krankheit
und anderen Krankheiten, die mit einer Ablagerung von β-amyloiden
Plaques in Zusammenhang stehen, wie etwa Down Syndrom, verwendet
werden. Geeignete Proben aus Patienten umfassen CSF, Blut, Serum,
Plasma, Urin, Gewebe und dergleichen. Die Gegenwart der Krankheit
wird im Allgemeinen mit erhöhten
Gehalten an ATF-βAPP
assoziiert sein, oder erhöhten
Verhältnissen
der Menge an ATF-βAPP
zu den Mengen anderer sezernierter βAPP-Fragmente (d. h. denjenigen βAPP-Fragmenten,
die in der oder Carboxy-terminal zu der βAP-Region gespalten werden),
im Vergleich zu den Werten in normalen Individuen, d. h. Individuen,
die nicht an Alzheimer-Krankheit oder einer anderen Krankheit in
Zusammenhang mit β-Amyloid leiden.
Die Menge an ATF-βAPP
kann mit der Menge einer anderen APP-Spezies verglichen werden,
entweder einer Isoform (z. B. 695, 751 oder 770) und/oder einer
durch ihren Carboxyterminus weiter definierten Form (z. B. Formen,
die an und/oder Carboxy-terminal zu der von Esch et al. (1990) Science
248: 1122–1124
beschriebenen Stelle geschnitten sind). Zusätzlich zu anfänglichen
diagnostischen Verfahren können
die ATF-βAPP
Gehalte überwacht
werden, um das Fortschreiten der Krankheit zu verfolgen, und potentiell
die Wirksamkeit einer Behandlung zu verfolgen. Es würde erwartet
werden, dass die ATF-βAPP
Gehalte bei einem wirksamen Behandlungsschema abnehmen würden.
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Eine in vitro Überwachung von ATF-βAPP Gehalten
in kultiviertem Medium aus einer geeigneten Zellkultur kann zum
Arzneimittel-Screening verwendet werden. Durch Züchten von Zellen unter Bedingungen,
welche zu einer Sezernierung von ATFβAPP in das Kulturmedium führen, und
in Kontakt Bringen der Zellen mit Testverbindungen, kann die Wirkung
dieser Testverbindungen auf die Sezernierung von ATF-βAPP beobachtet werden.
Es würde
erwartet werden, dass Testverbindungen, welche die Menge an ATF-βAPP verringern
können,
Kandidaten zum Testen als Inhibitoren der βAP-Bildung wären. Geeignete Zelllinien umfassen
humane und tierische Zelllinien, wie etwa die humane Nierenzelllinie
293, humane Neurogliomzelllinien, humane HeLa Zellen, primäre Endothelzellen
(z. B. HUVEC Zellen), primäre
humane Fibroblasten oder Lymphoblasten (einschließlich endogenen
Zellen, die aus Patienten mit βAPP-Mutationen
stammen), primäre
humane Hirnzellgemische (umfassend Neuronen, Astrozyten und Neuroglia),
Eierstockzellen aus chinesischem Hamster (CHO), und dergleichen.
Zelllinien, die präferentiell
die Gehalte oder Verhältnisse
von ATF-βAPP
erhöhen,
wären für die erfindungsgemäßen Verfahren
besonders geeignet.
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In ähnlicher Weise kann auch eine
in vitro Überwachung
von ATF-βAPP
in Tiermodellen der Alzheimer-Krankheit, wie etwa dem in WO 91/19810
offenbarten Mausmodell, zum Screening von Testverbindungen im Hinblick
auf therapeutische Wirksamkeit verwendet werden (üblicherweise
zum Testen von Verbindungen, die zuvor in einem in vitro Screening
identifiziert wurden). Die Testverbindung bzw. die Testverbindungen
werden dem Tier verabreicht, und der Gehalt an ATF-βAPP oder
das Verhältnis
von ATF-βAPP
zu anderen βAPP-Fragmenten
wird beobachtet. Diejenigen Verbindungen, die den Gehalt an ATF-βAPP oder
das Verhältnis
von ATF-βAPP
zu anderen βAPP-Fragmenten
verringern, würden
als Kandidaten für
eine weitergehende Bewertung erachtet.
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Besonders bevorzugte Tiermodelle
für die β-Sectretasespaltung
von βAPP
sind von Mensch verschiedene transgene Tiere, welche die Schwedische
Mutation des βAPP-Gens exprimieren,
wie vorstehend beschrieben. Es wurde festgestellt, das derartige
transgene Tiere, insbesondere transgene Mäuse, große Mengen an ATF-βAPP produzieren,
welche mittels der erfindungsgemäßen Verfahren
nachgewiesen werden können.
Insbesondere wurde festgestellt, dass die Schwedische βAPP-Mutation Mengen an
ATF-βAPP
produziert, die üblicherweise
mindestens zweifach höher
sind als bei humanem Wildtyp-βAPP,
das in Tieren exprimiert wird. Üblicherweise
ist die Produktion signifikant höher,
wobei sie typischerweise mindestens zweifach höher ist. Mit derart erhöhten Gehalten
der ATF-βAPP-Produktion wird die Überwachung
der β-Secretaseaktivität unter
verschiedenen Bedingungen erheblich erleichtert. Insbesondere wird
ein Screening nach Arzneimitteln und anderen Therapien zur Inhibition
der β-Secretaseaktivität (und somit
zur Inhibition der βAPP-Produktion)
in von Mensch verschiedenen Tiermodellen, welche die Schwedische
Mutation von humanem βAPP
exprimieren, erheblich vereinfacht.
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Die Verwendung von Tiermodellen zum
Screening nach Arzneimitteln auf eine Inhibitionsaktivität der β-Secretase
wird oftmals durchgeführt
werden, nachdem in vitro Zellkultur-Screeningtechniken, wie vorstehend
beschrieben, durchgeführt
worden sind. Arzneimittel, welche in in vitro Screening als viel
versprechend erschienen sind, können
dann Testtieren, die von Mensch verschieden sind, wie etwa Testmäusen, die
transgen sind und die Schwedische Mutation von humanem βAPP exprimieren,
verabreicht werden. Besondere Techniken zur Herstellung von transgenen
Mäusen,
welche die Schwedische Form von βAPP
exprimieren, sind nachstehend hierin im experimentellen Abschnitt
beschrieben. Es wird erkannt werden, dass die Herstellung von anderen,
von Mensch verschiedenen transgenen Tieren, welche das Schwedische
humane βAPP
exprimieren, in einfacher Weise bewirkt werden kann, umfassend Ratten,
Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen und dergleichen.
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Die Wirkung der Testverbindung auf
die ATF-βAPP-Produktion
in Testtieren kann in verschiedenen Proben aus den Testtieren gemessen
werden. Im experimentellen Abschnitt ist der Nachweis von ATF-βAPP in Hirnhomogenaten
ausführlich
beschrieben. Der Nachweis von ATF-βAPP in Hirnhomogenaten ist beispielhaft,
aber nicht notwendigerweise bevorzugt. In manchen Fällen wird
es vorteilhaft sein, das ATF-βAPP
in anderen Proben zu messen, wie etwa Zerebrospinalfluid, Blut und
dergleichen, die aus dem Testtier erhalten werden können ohne
das Tier zu opfern.
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In allen Fällen wird es notwendig sein,
einen Kontrollwert zu erhalten, der charakteristisch für das Niveau
der ATF-βAPP-Produktion
in dem Testtier in der Abwesenheit einer (oder mehrerer) Testverbindungen ist.
In Fällen,
bei denen das Tier geopfert wird, wird es notwendig sein, einen
Mittelwert oder einen typischen Wert von anderen, von Mensch verschiedenen
Testtieren, die transgen modifiziert worden sind, so dass sie die Schwedische
Mutante von humanem βAPP
exprimieren, die jedoch keine Testverbindung oder irgendwelche andere
Substanzen verabreicht bekommen haben, von denen erwartet würde, dass
sie das Niveau der ATF-βAPP-Produktion
beeinflussen, als derartige Kontrollwerte zugrunde zu legen. Sobald
ein derartiges Kontrollniveau bestimmt worden ist, können Testverbindungen
zusätzlichen
Testtieren verabreicht werden, wobei eine Abweichung vom mittleren
Kontrollwert darauf hindeutet, dass die Testverbindung eine Wirkung
auf die β-Secretaseaktivität in dem
Tier hat. Testverbindungen, die als positiv eingestuft werden, d.
h. mit einer vermutlich vorteilhaften Wirkung bei der Behandlung
von Alzheimer-Krankheit oder anderen Zuständen in Zusammenhang mit β-Amyloid,
werden diejenigen sein, welche das Niveau der ATF-βAPP-Produktion
um bevorzugt mindestens 20%, stärker
bevorzugt um mindestens 50% und am meisten bevorzugt um mindestens
80% erniedrigen können.
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Die Testverbindungen können jedes
Molekül,
jede Verbindung oder andere Substanz sein, welche zu der Zellkultur
zugegeben oder dem Testtier verabreicht werden kann ohne die Lebensfähigkeit
der Zellen oder des Tiers wesentlich zu beinträchtigen. Geeignete Testverbindungen
können
kleine Moleküle,
biologische Polymere, wie etwa Polypeptide, Polysaccharide, Polynukleotide
und dergleichen sein. Die Testverbindungen werden dem Kulturmedium
typischerweise in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 nM bis
1 mM, üblicherweise
von etwa 10 μM
bis 1 mM zugesetzt. Die Testverbindungen werden typischerweise in
einer Dosierung im Bereich von 1 ng/kg bis 10 mg/kg, üblicherweise
von 10 μg/kg
bis 1 mg/kg verabreicht.
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Testverbindungen, welche die Sezernierung
oder die tierische Produktion von ATFβAPP inhibieren können, werden
als Kandidaten für
weitere Bestimmungen bezüglich
der Fähigkeit,
die β-Amyloidproduktion in
Tieren und Menschen zu blockieren, erachtet. Eine Inhibition der
Sezernierung oder Produktion deutet darauf hin, dass die Spaltung
von βAPP
am Aminoterminus von βAP
wahrscheinlich mindestens zum Teil blockiert wurde, wodurch die
Menge eines zur Überführung in β-Amyloidpeptid
zur Verfügung
stehenden Prozessierungsintermediats verringert wird.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
weiterhin Verfahren zur Inhibition der β-Amyloidproduktion in Zellen, wobei das
Verfahren umfasst, den Zellen Verbindungen zu verabreichen, welche
durch das vorstehend beschriebene Verfahren ausgewählt wurden.
Die Verbindungen können
zu einer Zellkultur zugegeben werden, um die βAP-Produktion durch die kultivierten
Zellen zu inhibieren. Die Verbindungen können auch einem Patienten verabreicht
werden, um die Ablagerung von amyloiden Plaques, welche mit Alzheimer
oder anderen Krankheiten in Zusammenhang mit βAP assoziiert ist, zu inhibieren.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine durch
das vorstehend beschriebene Verfahren ausgewählte Verbindung und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger.
Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen sollten eine therapeutische
oder prophylaktische Menge mindestens einer durch das erfindungsgemäße Verfahren
identifizierten Verbindung enthalten. Der pharmazeutisch akzeptable
Träger
kann jede kompatible, nicht toxische Substanz sein, welche geeignet
ist die Verbindungen einem vorgesehenen Wirt zu verabreichen. Steriles
Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können als
der Träger
verwendet werden. Pharmazeutisch akzeptable Adjuvantien, Puffersubstanzen,
Dispergiermittel und dergleichen können ebenfalls in den pharmazeutischen
Zusammensetzungen vorhanden sein. Die Herstellung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die Wirkstoffe enthalten, ist in der medizinischen
und wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe beispielsweise
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton,
Pennsylvania, 16. Auflage, 1982.
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Die oben beschriebenen pharmazeutischen
Zusammensetzungen sind zur systemischen Verabreichung an einen Wirt,
umfassend sowohl parenterale, topische, als auch orale Verabreichung,
geeignet. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können parenteral,
d. h. subkutan, intramuskulär
oder intravenös verabreicht
werden. Somit umfasst die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen
zur Verabreichung an einen Wirt, wobei die Zusammensetzungen eine
pharmazeutisch akzeptable Lösung
der identifizierten Verbindung in einem akzeptablen Träger umfassen,
wie vorstehend beschrieben.
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Es wird häufig erwünscht oder notwendig sein,
die pharmazeutischen Zusammensetzungen direkt oder indirekt in das
Gehirn einzubringen. Direkte Techniken umfassen üblicherweise das Anlegen eines
Arzneimittelverabreichungskatheters in das Ventrikelsystem des Wirts,
um die Blut-Hirn-Schranke
zu umgehen. Indirekte Techniken, die im Allgemeinen bevorzugt sind,
umfassen das Formulieren der Zusammensetzungen, umfassend ein Verborgenmachen
(latentiation) des Arzneimittels durch die Überführung von hydrophilen Arzneimitteln
in fettlösliche
Arzneimittel. Das Verborgenmachen wird im Allgemeinen erreicht durch
Blockieren der in dem Arzneimittel vorhandenen Hydroxyl-, Carboxyl-
und primären
Amingruppen, um das Arzneimittel besser fettlöslich und für den Transport über die
Blut-Hirn-Schranke zugänglich
zu machen.
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Alternativ kann der Transport von
hydrophilen Arzneimitteln durch intraarterielle Infusion von hypertonischen
Lösungen,
welche die Blut-Hirn-Schranke vorübergehend öffnen können, verbessert werden.
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Die Konzentration der Verbindung
in dem pharmazeutischen Träger
kann über
einen breiten Bereich variieren, d. h. von kleiner als etwa 0,1
Gew.-% der pharmazeutischen Zusammensetzung bis etwa 20 Gew.-% oder
darüber.
Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intramuskulären Injektion
würde so
hergestellt werden, dass sie beispielsweise ein bis 4 ml steriles,
gepuffertes Wasser und ein μg
bis ein mg der durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierten
Verbindung enthält.
Die typische Zusammensetzung für intravenöse Infusion
könnte
so hergestellt sein, dass sie 100 bis 500 ml sterile Ringer-Lösung und
etwa 1 bis 100 mg der Verbindung enthält.
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Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung können
für eine
prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von Krankheiten
verabreicht werden, welche mit der Ablagerung von βAP in Zusammenhang
stehen, wie etwa Alzheimer-Krankheit oder Down Syndrom. In therapeutischen Anwendungen
werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen einem Wirt verabreicht,
der bereits an der Krankheit leidet. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
werden in einer ausreichenden Menge verabreicht, um eine weitere
Ablagerung von βAP-Plaques
zu inhibieren. Eine adäquate
Menge, um dies zu erreichen, ist als eine "therapeutisch wirksame
Dosis" definiert. Eine derartige wirksame Dosis wird von der Schwere
der Krankheit, der Größe des Wirts
und dergleichen abhängen,
wird aber im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,01 μg bis 10
mg der Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht des Wirts liegen,
wobei üblicherweise Dosen
von 0,1 μg
bis 1 mg/kg verwendet werden.
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Für
prophylaktische Anwendungen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung einem Wirt verabreicht, der für die βAP-Krankheit
anfällig
ist, aber nicht bereits an einer derartigen Krankheit leidet. Derartige
Wirte können
durch genetisches Screening und klinische Analyse identifiziert
werden, wie in der medizinischen Literatur beschrieben. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen werden eine Ablagerung von βAP-Plaques in einem sehr frühen Stadium
inhibieren oder verhindern können, bevorzugt
werden sie sogar die Anfangsstadien der β-Amyloidkrankheit verhindern.
Die für
eine derartige prophylaktische Behandlung erforderliche Menge der
Verbindung, bezeichnet als eine prophylaktisch wirksame Dosis, ist
im Allgemeinen die gleiche wie vorstehend für die therapeutische Behandlung
beschriebene.
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Die nachfolgenden Beispiele werden
als Erläuterung,
nicht als Einschränkung
präsentiert.
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EXPERIMENTELLER TEIL
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Materialien und Methoden
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1. Herstellung
von Antikörper
und Affinitätsmatrix
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Der monoklonale Antikörper 6C6
wurde auf die gleiche Weise erzeugt und gescreent wie der Antikörper 10D5
(Hyman et al. (1992) J. Neuropath. Exp. Neurol. 51: 76), unter Verwendung
eines synthetischen, die βAP-Reste
1–28 enthaltenden
Peptids, konjugiert an Serumalbumin aus Kaninchen als dem Immunogen.
Sowohl 10D5 als auch 6C6 erkennen ein Epitop innerhalb der ersten
16 Aminosäuren
der βAP-Sequenz. 6C6 war
in Immunpräzipitation
wirksamer als 10D5 und wurde als ein Abfangantikörper verwendet. Zur Herstellung von
6C6-Harz wurden 4 ml Affigel®10 (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA) mit kaltem Wasser gewaschen und mit 3 ml 6C6 (12,5
mg/ml in PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM NaH2PO4, 137 mM NaCl, pH 7,5), 0,5 M NaCl) kombiniert.
Die Kopplung erfolgte über
Nacht bei 4°C
unter sanftem Schütteln.
Danach wurden 400 μl
1 M Tris, pH 8,0, zugegeben und das Schütteln wurde 40 Minuten fortgesetzt.
Das Harz wurde danach vor Verwendung ausgiebig mit TTBS (137 mM
NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Tris, 0,5% Tween®20,
pH 7,5) gewaschen. Der Antikörper
7H5 ist ebenfalls in Hyman et al (1992) J. Neuropath. Exp. Neurol.
51: 76 beschrieben. Antikörper
anti-5 wurden gegen βAPP
444–592
(Oldersdorf et al. (1989) Natrue 341: 144–147 und (1990) J. Biol. Chem.
265: 4492–4497
erzeugt.
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Antikörper (bezeichnet als Antikörper 92)
wurden gegen ein synthetisches Peptid erzeugt, welches die Reste
591-596 von βAPP
(wie in Kang et al. (1987), Nature 325: 773–776 nummeriert) umfasste.
Das Peptid (N-acetyl-CISEVKM) wurde an Serumalbumin aus Kaninchen
konjugiert, das mit Sulfomaleimidobenzoyl-Nhydroxysuccinimidester
aktiviert worden war, wobei ein Immunogen gebildet wurde. Mittels
Standardmethodiken wurden in Kaninchen Antikörper gegen das Immunogen erzeugt.
Während
jeder Animpfung erhielten die Kaninchen subkutan 5 μg Immunogen
in 0,1 ml Injektionen an etwa 10 Stellen (50 μg/Boost). Das gleiche Peptid wurde
an Sulfo-linkTM-Gel (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) gekoppelt, für
die Affinitätsreinigung
von Antikörpern
aus der IgG-Fraktion.
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Eine ausführlichere Beschreibung der
Herstellung von Antikörper
92 ist wie folgt. Kaninchen-Serumalbumin (12,3 g) wurde 20 min bei
0°C mit
13 mg Sulfomaleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester in 1,25 ml 0,05
M KH2PO4, pH 7,0
inkubiert. Das Gemisch wurde unmittelbar danach einer Gelfiltration über eine
1 × 75 cm
Säule SephadexTM G-10, die mit Phosphatpuffer äquilibriert
war, unterzogen. Der Proteineluent im Ausschlussvolumen wurde gepoolt
und sofort mit 30 mg N-acetyl-CISEVKM-Peptid
kombiniert, das mittels automatisierter Festphase-Standardmethodiken
synthetisiert worden war. Die Kopplungsreaktion (Volumen 20 ml) wurde über Nacht
laufen gelassen und wurde danach für die Erzeugung von Antikörpern an
eine kommerzielle Einrichtung gesandt. Das Injektionsprotokoll bestand
darin, das Antigen in einem gleichen Volumen von komplettem Freund
Adjuvans zu emulgieren, und insgesamt 50 μg Antigen in 0,1 ml Aliquots
an etwa 10 Stellen subkutan zu injizieren. Alle drei Wochen danach
wurde mittels eines identischen Protokolls, außer dass inkomplettes Freund
Adjuvans als der Emulgator verwendet wurde, eine Boosterinjektion
verabreicht. Eine Woche nach jeder Injektion wurde den Kaninchen
Blut entnommen und das Serum durch Reaktion auf Peptid in einem ELISA
auf den Titer untersucht. Das IgG aus den positiv reagierenden Seren
wurde durch Präzipitation
mit 50% (NH4)2SO4 (zweimal) gereinigt und gegen PBS dialysiert.
Das Peptid N-acetyl-CISEVKM wurde unter Verwendung der Empfehlungen
des Herstellers an Sulfo-linkTM-Gel (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL) gekoppelt, um ein Affinitätsharz für die Reinigung
der Peptid-spezifischen Antikörper
zu erzeugen. Die IgG-Fraktion wurde auf die Säule aufgetragen, und nach Durchwaschen
des nicht spezifisch gebundenen Materials mit PBS wurden die Antikörper mit
0,1 M Glycin, pH 2,5, 0,5 M NaCl, eluiert und danach vor dem Einfrieren
gegen PBS dialysiert.
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Der Antikörper Schwedisch 192 wurde gegen
ein synthetisches Peptid, das aus den Resten 590–596 der Schwedischen βAPP-Sequenz
zusammengesetzt war, erzeugt. Zusätzlich zu der βAPP-Sequenz
wurden zwei Glycine und ein Cystein als ein Abstandhalter und ein
Linker hinzugefügt,
was die nachfolgende Sequenz ergibt: CGGEISEVNL. Das Peptid wurde
an ein kommerziell erhältliches,
Maleimidaktiviertes kationisiertes Rinderserumalbumin (Pierce Imject
Supercarrier Immune Modulator, nachstehend hierin als cBSA bezeichnet) konjugiert.
Antiserum wurde erzeugt unter Befolgung des vorstehend für den Antikörper 92
beschriebenen Injektionsschemas.
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Im Allgemeinen wurde cBSA in entionisiertem
Wasser auf eine Konzentration von 10 mg/ml resuspendiert. Eine gleiche
Milligramm-Menge Peptid wurde zu dem Träger zugegeben, und es wurde
vier Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Das Konjugat wurde danach
ausgiebig gegen Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne
Calcium und Magnesium dialysiert.
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Das Konjugat wurde auf einem vorgegossenen
6% Novex Tris-Glycin-Gel mit dem Ausgangs-cBSA verglichen. Die erfolgreiche
Konjugation wurde durch eine sichtbare Verschiebung zu einem höheren Molekulargewicht
hin angezeigt.
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2. Humane fötale Hirnzellkultur
-
Fötale
Nervengewebeproben wurden aus 12–14 Wochen alten toten Föten erhalten.
Proben der Großhirnrinde
wurden zweimal mit Hank's ausgewogener Salzlösung (Hank's Balanced Saline
Solution, HBSS) gewaschen. Hirnrindengewebe (2–3 Gramm) wurde in 10 ml kalte
HBSS gegeben, wozu 1 mg DNase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
D3427) zugegeben wurde. Die verriebene Suspension wurde durch Nitex
Nylonfilter von 210 μm
und danach 130 μm
filtriert, wie von Pulliam et al. (1984) J. Virol. Met. 9: 301 beschrieben.
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Zellen wurden mittels Zentrifugation
geerntet und in Nervenmedium (MEM mit einem Zusatz von 10% fötalem Rinderserum,
1% Glucose, 1 mM NaPyruvat, 1 mM Glutamin, 20 mM KCl) resuspendiert.
Polyethylenimin-beschichtete 100 mm Schalen wurden mit 1,5 × 107 Zellen in 8 ml Nervenmedium angeimpft.
Das Medium wurde zwei Mal pro Woche ausgetauscht. Alle Kulturen
in dieser Untersuchung wurden mindestens 30 Tage in vitro wachsen
gelassen. Für
Serum-freie Wachstumsbedingungen wurden Kulturen in definiertes
Medium (DMEM, ergänzt
mit 5 μg/ml
Rinderinsulin, 0,1 mg/ml Humantransferrin, 0,1 mg/ml BSA Fraktion
V, 0,062 μg/ml
Progesteron, 1,6 μg/ml
Putrescin, 0,039 μg/ml
Natriumselenit, 0,042 μg/ml
Thyroxin und 0,033 μg/ml
Trijod-L-thyronin) überführt und
nach 3 Tagen wurde der Überstand
geerntet.
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Konditioniertes Medium (10 ml) von
den Zellen wurde geentet. EDTA (5 mM), Leupeptin (10 μg/ml) und Tris-HCl
(20 mM, pH 8,0) wurden in der angegebenen Endkonzentration zu jeder
10 ml Probe zugegeben, und die Probe wurde 20 Minuten bei 4°C mit 30.000
G zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde in zwei gleiche
Aliquots aufgeteilt, zu einem der Aliquots wurde 6C6-Harz zugegeben
(200 μl
Harz mit etwa 5 mg/ml gebundenem 6C6). Beide Aliquots wurden 6 Stunden
bei 4°C
sanft gemischt, das Harz wurde pelletiert und ein zweites 200 μl Aliquot
Harz wurde zugegeben. Die Proben wurden über Nacht bei 4°C weiter
gemischt. Die vereinigten Harze wurden zweimal mit TTBS gewaschen,
danach zweimal kurz extrahiert, mit ein-ml Aliquots von 0,1 M Glycin,
0,1 M NaCl, pH 2,8.
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Das aus dem Harz extrahierte Material,
das durch das Harz abgereicherte Medium und das Ausgangsmedium wurden
einzeln mit 10% TCA (Trichloressigsäure) eine Stunde bei 0°C präzipitiert,
die Pellets mit Aceton gewaschen und danach in 150 μl SDS-PAGE
Probenpuffer unter reduzierenden Bedingungen resuspendiert und gekocht.
Jede Probe (25 μl)
wurde einer SDS-PAGE unter Verwendung von 10–20% Tricingelen (Novex) unterzogen.
Die Proteine wurden über
Nacht bei 40 V auf ProBlot PVDF-Membranen transferiert. Die Sichtbarmachung
der immunreaktiven Proteine verwendete das TROPIX Chemilumineszenzsystem
gemäß den Herstellerangaben
für das
AMPPD-Substrat. Verwendete Konzentrationen für Primärantikörper waren: anti-5, 0,1 μg/ml; 92,
2 μg/ml;
10D5, 2 μg/ml.
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3. Kultur von humanen
293 Zellen
-
Humane 293 Zellen (ATCC No. CRL-1573)
wurden modifiziert, so dass sie APP überexprimierten (Selkoe et
al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7341). Zellen wurden vor
Verwendung in 10 cm Schalen bis zur Subkonfluenz wachsen gelassen.
Metabolische Markierung und Immunpräzipitation wurden im Wesentlichen durchgeführt wie
früher
in Oltersdorf et al. (1989) Nature 341: 144 und (1990) J. Biol.
Chem. 265: 4492 beschrieben. In kurzen Worten, wurde die Markierung
in 10 cm Schalen durchgeführt.
Zellen wurden in Methionin-freiem Medium gewaschen, 20 Minuten in
2 ml Methionin-freiem Medium, das mit 0,5 mCi 35S-Methionin ergänzt war,
inkubiert, in Vollmedium gewaschen, und 2 Stunden in 3 ml Vollmedium
inkubiert. Konditioniertes Medium wurde gesammelt und mit 3000 G
während
10 Minuten, gefolgt von Präabsorption
mit Protein A-Sepharose® (Pharmacia, Piscataway,
NJ) geklärt.
Die Immunpräzipitation
wurde mit 1,5 mg Protein A-Sepharose® pro Probe
durchgeführt.
Antikörper
anti-5 wurde in einer Menge von 2 μg pro Probe verwendet, 6C6,
7H5 und 92 wurden in einer Menge von 10 μg pro Probe verwendet. 5 mg
anti-Maus IgG aus Kaninchen wurden mit 6C6 und 7H5 sowie in den
Kontrollproben verwendet. Präzipitate
wurden vier Mal in TBS (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Tris, pH 7,5),
0,1% NP40, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Leupeptin gewaschen. SDS-PAGE
wurde auf 5% Laemmli-Gelen durchgeführt.
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4. Kultur von humanen,
mit der Schwedischen Mutation transfizierten 293 Zellen
-
Zwei Vertiefungen mit humanen 293
Nierenzellen in einer Schale mit 6 Vertiefungen wurden transient mit
Plasmidvektoren transfiziert, die entweder normales humanes βAPP oder
die Schwedische Mutationsvariante von βAPP exprimierten, unter Verwendung
von DOTAP-vermittelter Transfektion wie vom Hersteller (Boehringer
Mannheim) beschrieben. Nach 40 Stunden wurden die Zellen in Methionin-freies
DME, enthaltend 10% fötales
Kälberserum,
eingebracht und 20 Minuten später
wurden sie 35 Minuten mit 200 μCi/ml 35S-Methionin markiert. Die Zellen wurden
danach zurück
in normales DME Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, gebracht und weitere
2,5 Stunden inkubiert. Das Medium wurde von den Zellen abgenommen
und 15 Minuten bei 1000 G zentrifugiert, um alle Zellen zu entfernen.
Die Überstände wurden
in zwei Hälften
aufgeteilt, und eine Hälfte
wurde gemäß Standardmethoden
mit dem Antikörper
anti-5 immunpräzipitiert.
Die andere Hälfte
wurde über
Nacht mit 6C6 Antikörper,
an Agarose gekoppelt, inkubiert und das an die 6C6-Agarose gebundene
Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das verbleibende
Material wurde danach mit Antikörper anti-5
immunpräzipitiert.
Die gesamten anti-5 Immunpräzipitate
(α5+), 6C6-gebundenen
Präzipitate
(6C6+) und 6C6 nicht-reaktiven, anti-5 reaktiven Immunpräzipitate
(6C6-, α5+)
wurden auf einem 5% Laemmli-Gel gefahren und immunreaktive Proteine
wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.
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5. Spezifität des Antikörpers Schwedisch
192
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Konditioniertes Medium von 293 Nierenzellen,
die stabil transfiziert worden waren, so dass sie das Schwedische βAPP-Protein überexprimieren,
wurde gesammelt. Ein-Milliliter
Aliquots wurden zu entweder 100 μl
immobilisiertem 6C6-Affinitätsharz
(siehe oben) oder 100 μl
Heparin-Agarose (Sigma) zugegeben. Die Reaktion mit dem 6C6-Harz
war 5 Stunden bei 4°C,
die Heparin-Agarose wurde 30 Minuten bei 4°C reagiert. Nach der Inkubation
wurden die Harze mit TTBS gewaschen und danach wurden 100 μl 2 × SDS-PAGE
Probenpuffer zu jeder Probe zugegeben, die Proben wurden gekocht
(5 Minuten) und kurz zentrifugiert. Zwanzig μl der Proben wurden auf 6% SDS-Polyacrylamidgele
aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden
wie vorstehend beschrieben auf ProBlot® Membranen
transferiert. Die Proben wurden mit den nachfolgenden Antikörpern getestet:
6C6 (vorstehend beschrieben), Schwedisch 192 (siehe oben) oder 8E5 (ein
monoklonaler Antikörper,
der ein Epitop von βAPP
in der Region der Aminosäuren
444–592
erkennt, unter Verwendung der Nummerierung der 695-Form). Alle Antikörper wurden
bei der Untersuchung des Immunblots in einer Konzentration von 2 μg/ml verwendet.
Die Sichtbarmachung von immunreaktivem Material wurde erreicht unter
Verwendung des Amersham ECL®-Systems gemäß den Empfehlungen
des Herstellers. Blockieren und Antikörperverdünnungen wurden unter Verwendung
von 5% Magermilchpulver (Carnation) in TTBS gemacht.
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6. Transgene
Mäuse
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Transgene Mäuse wurden unter Verwendung
der in 7 gezeigten Plasmide (NSEAPPsw
und NSEAPPswΔ3')
erzeugt. Diese Plasmide enthalten die 751-Form von βAPP, welche
die Schwedische Mutation (KM zu NL an den Positionen 595 und 596
der 695-Form) enthält.
Der Nerven-spezifische Enolase-Promotor treibt die Expression an
und stellt eine Spleißsequenz
bereit. Die Ratte-NSE-Promotor- und Spleißsequenzen stammten von pNSE6
(Okayama and Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 161–170). Dieser Vektor enthält das 4,2 kb
BgIII-Fragment der Ratte-NSE-Promotorregion
(das stromaufwärts
der BgIII-Stelle beginnt und sich bis zu der BgIII-Stelle im zweiten
Intron fortsetzt), kloniert in die BamHI-Stelle des Vektors pSP65
(Promega). Die vom Vektor stammende XbaI-Stelle am 5'-Ende des Promotors
definierte das 5'-Ende des verwendeten Promotors, und das die NSE-Translation
initiierende ATG, das im zweiten Intron liegt, wurde an das βAPP-initiierende
ATG fusioniert.
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NSEAPPsw enthält auch eine Spleißsequenz
aus SV40 in der 3'-Region des Gens. Diese Spleißsequenz stammte von dem Okayama/Berg-Vektor
pL1, und ist eine Fusion der späten
16s und 19s Messagespleißsequenzen
(Forss-Petter et al. (1990) Neuron 5: 187–197). Polyadenylierung wird
von SV40-Sequenzen bereitgestellt.
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Transgene Mäuse, welche diese Plasmidsequenzen
enthielten, wurden unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt.
Das NotI-Fragment, das die vorstehend beschriebene Expressionskassette
enthält, wurde
gereinigt und in Eier injiziert, die von einer C57B1/DBA Hybridmaus
erhalten worden waren. Die Eier wurden pseudoschwangeren Mäusen implantiert
und der Nachwuchs wurde danach mittels PCR, Slot Blot und Southern-Analyse
auf die Gegenwart von Plasmidsequenzen in Schwanz-DNA gescreent.
Die derart erzeugten Gründermäuse wurden
auf Expression von humanem βAPP
durch Analyse ihres F1 transgenen Nachwuchses gescreent. Hirne von
den F1-Tieren wurden mit einem Hand-Homogenisator (Polytron PT122B, Kinematica
AG) homogenisiert, entweder in SDS-Puffer (2% SDS, 20 mM Tris pH 8,0, 150
mM NaCl, 10 mM EDTA), oder in NP40-Puffer (1% NP40, 50 mM Tris, pH 7,5,
10 mM EDTA, und ein Cocktail von Proteaseinhibitoren, enthaltend
5–10 μg/ml Leupeptin,
2–4 μg/ml Pepstatin
A, 5–10 μg/ml Aprotinin
und 1–2
mM PMSF) homogenisiert. Die SDS-Lysate wurden für eine Western-Analyse direkt
auf Gele aufgetragen. Die NP40-Homogenate wurden 10 Minuten bei
55.000 UpM in einer Beckmann Ultrazentrifuge (Rotor T1100.3) zentrifugiert, und
die Überstände wurden
für eine
Western-Analyse auf Gele aufgetragen. Die Western-Analyse wurde
nach Standardverfahren durchgeführt,
entweder unter Verwendung von Antikörper anti-5 (0,4 μg/ml) oder
von Antikörper
8E5 (5 μg/ml),
um das humanspezifische βAPP
nachzuweisen. Diejenigen Linien, die relativ hohe βAPP-Gehalte
exprimierten, wurden für
weitere Analyse ausgewählt.
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Dies umfasste die Linien Hillary
14, Chelsea 32 und Chelsea 58. Die hierin beschriebenen Experimente
wurden mit heterozygoten Tieren dieser Linien durchgeführt, welche
durch Kreuzen von Tieren, die das Transgen enthielten, mit Wildtyp-Tieren,
und Screenen des Nachwuchses auf die Gegenwart des Transgens, erhalten
wurden. In ähnlicher
Weise können
homozygote Tiere aus einer ausgewählten Anzahl von Linien verwendet
werden.
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Beschreibung
der experimentellen Figuren
-
2:
Nachweis von verkürztem βAPP in konditioniertem
Medium aus humanen Hirnzellgemischkulturen.
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Probe 1 ist das konditionierte Medium
aus Kultur; Probe 2 ist das an 6C6-reaktivem βAPP abgereicherte Medium; und
Probe 3 ist das aus dem 6C6-Harz extrahierte Material.
Gelmuster A wurde mit anti-5 Antikörpern getestet, die gegen die βAPP-Sequenz 444–592 erzeugt
worden waren (ltersdorf et al. (1989) Nature 341: 144-147, und (1990) J.
Biol. Chem. 265: 4492–4497).
Gelmuster B wurde mit Antikörper
92, beschrieben im Abschnitt Materialien und Methoden, getestet.
Gelmuster C wurde mit 10D5 getestet, einem monoklonalen Antikörper, der
ein Epitop innerhalb der βAP-Reste
1–16 erkennt,
wie im Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Die in C2
und C3 auftretenden Banden mit niedrigerem Molekulargewicht wurden
in C1 nicht beobachtet und stammen aus dem 6C6-Harz und werden von
einem Ziege-anti-Maus IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat erkannt,
unabhängig
von einem Primärantikörper (Daten
nicht gezeigt).
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3: Spezifität von Antikörper 92.
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Ein Milliliter einer humanen Lumbal-CSF-Probe,
die von einem 75 Jahre alten Mann erhalten worden war, wurde mit
10% TCA präzipitiert,
um eine zehnfache Aufkonzentrierung zu bewirken, und wurde wie in 2 beschrieben weiter bearbeitet, außer dass
die Geltasche ein 4 cm Schlitz war. Der Antikörper 92 wurde in 0,5 ml TTBS
auf 6,7 μg/ml
verdünnt,
in der Gegenwart von verschiedenen potentiell kompetierenden Peptiden,
jedes mit einer annähernden
Konzentration von 60 μM,
während
10 Stunden bei 4°C
unter sanftem Mischen. Der Antikörper
wurde danach vor Inkubation mit Streifen des Blots von aus CSF stammendem
Material achtfach in 1% Gelatine/TTBS verdünnt und weiter bearbeitet wie
in 2 beschrieben. Die kompetierenden Peptide
waren wie folgt: Bahn 1, kein kompetierendes Peptid zugegeben; Bahn
2, GSGLTNIKTEEISEVK; Bahn 3, YSGLTNIKTEEISEVKM; Bahn 4, ISEVKM;
Bahn 5 EISEVKMD; Bahn 6, CISEVKM; Bahn 7, YISEVKM. MW = Molekulargewichtsmarker
(angegeben in Kilodalton).
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4: Molekulargewichtsheterogenität von sezernierten
Formen von APP in Immunpräzipitation,
nachgewiesen durch Antikörper
gegen unterschiedliche C-Termini in Zelllinien und primären humanen
fötalen
Hirnkulturen.
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Antikörper: anti-5: Bahnen 3, 6,
9; 6C6 (gerichtet gegen βAP-Peptidreste
1–16):
Bahnen 4, 7, 10; Antikörper
92 (gegen die APP-Aminosäuren
591–596):
Bahnen 5, 8, 11; 7N5 (gegen APP-KPI): Bahn 12. Zellen: linkes Gelmuster
(Bahnen 1 und 3–5):
stabil mit APP 695 transfizierte 293 Zellen; mittleres Gelmuster
(Bahnen 2 und 6–8):
stabil mit APP 751 transfizierte 293 Zellen; rechtes Gelmuster (Bahnen
9–13):
humane fötale
Hirnkulturen. Kontrollen: Bahnen 1, 2 und 13: Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper. Pfeile:
ein Beispiel eines Molekulargewichtsunterschieds zwischen sezernierten
Formenvon APP, die von den Antikörpern
6C6 und 92 erkannt werden. SDS-PAGE wurde auf einem 5% Laemmli-Gel
durchgeführt.
MW = Molekulargewichtsmarker (angegeben in Kilodalton).
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5: Nachweis von verkürztem βAPP in konditioniertem Medium
aus humanen, mit der Schwedischen Mutation transfizierten 293 Zellen.
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5 zeigt
die Ergebnisse von doppelten Transfektionen für sowohl die normale als auch
die Schwedische Form. Die Bahnen 1–4 sind α5+; die Bahnen 5–8 sind
6C6+; und die Bahnen 9–12
sind 6C6-, α5+
Proben. Die Bahnen 1, 2, 5, 6, 9 und 10 sind von normalem βAPP; die
Bahnen 3, 4, 7, 8, 11 und 12 sind von Schwedischem βAPP. Die
Schwedische Mutation führt
zu einer erhöhten
Produktion von ATF-βAPP,
da die Bahnen 11 und 12 mehr ATF-βAPP
Material enthalten als die Bahnen 9 und 10.
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6: Immunblot, der die Spezifität des Antikörpers Schwedisch
192 zeigt.
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6 zeigt
einen Immunblot, der die Spezifität des Antikörpers Schwedisch 192 zeigt.
Die Bahnen 1, 3, 5 enthalten aus Heparin-Agarose eluiertes Material.
Die Bahnen 2, 4, 6 enthalten aus dem 6C6-Harz eluiertes Material.
Die Bahnen 1 und 2 wurden mit Antikörper 8E5 getestet; die Bahnen
3 und 4 wurden mit dem Antikörper
Schwedisch 192 getestet; die Bahnen 5 und 6 wurden mit Antikörper 6C6
getestet.
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7A und 7B:
Plasmidkarten.
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Die 7A und 7B sind Plasmidkarten von
pNSEAPPswΔ3'
bzw. pNSEAPPsw, welche zur Herstellung von transgenen Mäusen verwendet
werden, wie vorstehend beschrieben.
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8: Western Blot.
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8 ist
ein Western Blot von löslichen
Fraktionen von transgenen und Kontrolltierhirnen, welche auf die
Gegenwart von sezernierten, mit dem Antikörper Schwedisch 192 reaktiven βAPP-Fragmenten
getestet wurden. Bahn 1: Molekulargewichtsmarker; Bahn 2: nicht-transgene
Linie; Bahn 3: transgene Linie.
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9: Western Blot.
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9 sind
Western Blots von Hirnhomogenaten von transgenen (+) und nichttransgenen
(-) Tieren, an βAPP-Formen
abgereichert, welche mit dem Antikörper 6C6 reaktiv sind, getestet
mit Antikörper
8E5 (Gelmuster A) und Antikörper
Schwedisch 192 (Gelmuster B).
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Ergebnisse
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Der monoklonale Antikörper 6C6,
der ein βAP-Epitop
innerhalb der Reste 1–16
erkennt, wurde dazu verwendet, um bestimmte βAPP-Fragmente aus verschiedenen
Proben auf immunologische Weise zu entfernen. Der monoklonale Antikörper 6C6
wurde an ein Harz gekoppelt (wie vorstehend beschrieben) und wurde mit
dem konditionierten Medium von humanen fötalen Hirnzellkulturen wie
vorstehend beschrieben inkubiert. Wie ersichtlich ist (2, Bahn C2) entfernt dieses Harz das βAP 1–6 enthaltende βAPP wirksam
aus dem konditionierten Medium der Zellkultur. Es wird jedoch eine
erhebliche βAPP-Immunreaktivität nicht
durch das Harz abgefangen, wie durch den Antikörper anti-5 nachgewiesen, der
gegen ein Epitop Nterminal zu der βAP-Region gerichtet ist (2, Bahn A2).
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Um diese anscheinend neue Form von βAPP zu charakterisieren,
erzeugten wir Antikörper
gegen ein synthetisches Peptid, welches die βAPP-Reste 591–596 umfasste
(wie vorstehend beschrieben). Es wurde festgestellt, dass dieser
Antikörper
(bezeichnet als 92) die von dem Harz nicht abgefangenen βAPP-Spezies erkennt
(2, Bahn B2), aber überraschenderweise
nicht mit der sezernierten Form von βAPP, welche die βAP-Sequenz
1–16 enthält, reagierte
(Bahn B3).
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Die Erklärung für dieses Fehlen an Kreuzreaktivität scheint
darin zu liegen, dass der Antikörper
92 ein Epitop in βAPP,
umfassend das Carboxy-terminale Methionin, entsprechend Rest 596,
erkennt. Demgemäß untersuchten
wir die Fähigkeit
von verschiedenen synthetischen Peptiden, die mit 92 erzeugte Immunreaktivität zu blockieren.
Wie aus 3 ersichtlich
ist, blockieren Peptide mit einer Sequenz auf Basis von βAPP, welche
mit dem Äquivalent
von Methionin 596 enden, im Wesentlichen die Reaktion von 92, während Peptide,
die an ihren Carboxytermini eine Aminosäure länger oder kürzer sind, eine vergleichsweise
unwirksame Kompetition zeigen. In Zellkulturüberständen (Daten nicht gezeigt)
und in CSF wurde das gleiche Peptidkompetitionsmuster beobachtet.
Eine Reihe von Pulse-Chase-Experimenten
zeigte, dass nachweisbare Mengen eines von Antikörper 92 immunpräzipitierbaren
Materials von 293 Zellen produziert werden, die entweder die 695
oder die 751 Isoform von βAPP überexprimieren
(4, Bahnen 5 und 8). Ähnliche
Experimente an humanen fötalen
Hirnzellkulturen zeigen, dass durch 92 immunpräzipitierbares Material von
6C6-reaktivem βAPP
durch niederprozentige (5%) SDS-PAGE aufgetrennt werden kann (4, Bahnen 9–11). In
den fötalen
Hirnzellkulturen tritt die alternative Prozessierung von Kunitz-Protease
inhibitorische Domäne
(KPI)-enthaltenden βAPP-Formen
in geringerem Umfang auf, obwohl bei den Immunpräzipitationen von Antikörper 92
und dem anti-KPI-Antikörper
7H5 schwache comigrierende Banden beobachtet werden (Bahnen 11,
12).
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Die Fähigkeit, die von den Antikörpern 92
und 6C6 präzipitierbaren
Materialien in Hirngemischkulturen aufzutrennen, beruht zumindest
zum Teil darauf, dass nahezu gleiche Mengen der jeweiligen Formen
produziert werden, im Vergleich zu der Situation in 293 Zellen.
Estus et al. (1992) Science 255: 726–728, beobachteten, dass Humanhirn
im Vergleich zu anderen Geweben eine relativ höhere Menge des potentiell amyloidogenen
Carboxy-terminalen Fragments enthält, welches auf Basis seiner
Größe anscheinend
am oder in der Nähe
des Aminoterminus von βAP
beginnt.
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Die zeitliche Übereinstimmung des Auftretens
von βAPP-Materialien,
welche von Antikörper
92 und 6C6 präzipitierbar
sind, spricht gegen die Wahrscheinlichkeit eines zweiten proteolytischen
Ereignisses nach der Sezernierung, insbesondere da längere Chase-Zeiträume nicht
zu einer bemerkbaren Veränderung
des Verhältnisses
der 92- und der 6C6-reaktiven Spezies führen (Daten nicht gezeigt).
Die Auflösung
der sezernierten Formen mittels SDS-PAGE, gekoppelt mit dem vollständigen Fehlen
einer immunologischen Kreuzreaktivität dieser Spezies, demonstriert
weiter die Existenz eines alternativen Sezernierungswegs. Die alternative
Spaltstelle wurde als die β-Secretase-Stelle
bezeichnet, um hervorzuheben, dass die Spaltung Amino-terminal von βAP stattfindet,
im Gegensatz zu der von Esch et al. (1990) Science 248: 1122–1124, beschriebenen Spaltung,
welche innerhalb des βAP
stattfindet.
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Wie aus 6, Bahn 4, ersichtlich ist, erkennt der
Antikörper
Schwedisch 192 die 6C6-reaktive Form von βAPP nicht nennenswert, trotz
der Tatsache, dass in Bahn 4, verglichen mit Bahn 3, insgesamt mehr βAPP vorhanden
ist (vergleiche die Bahnen 1 und 2). Dieses Fehlen von Reaktivität mit βAPP-Formen,
welche die βAP-Teilsequenz (6C6-reaktiv)
enthalten, legt nahe, dass der Antikörper Schwedisch 192 βAPP erkennt,
das am oder in der Nähe
des Aminoterminus von βAP
gespalten ist, aber nicht, wenn βAPP
sich über
diese Region hinaus erstreckt.
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Um die Eignung dieses Ansatzes als
ein Tiermodell zu verifizieren, wurden lösliche Fraktionen von transgenen
Tierhirnen auf die Gegenwart der "92"-Form des sezernierten βAPP getestet
(8). Diese Form wird
als ein Nebenprodukt der βAP-Produktion produziert,
und eine Inhibition der Produktion dieser Form in kultivierten Zellen
geht einher mit einer Inhibition der Spaltung am N-Terminus von βAP, der von β-Secretase gespaltenen
Stelle.
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Hirne von transgenen (Hillary 14,
Schwedisch) oder nicht-transgenen Mäusen wurden zusammen mit dem
vorstehend beschriebenen Proteaseinhibitor-Cocktail in 50 mM Tris,
10 mM EDTA homogenisiert und 10 min bei 55.000 UpM zentrifugiert,
wie vorstehend beschrieben. Der Überstand
wurde mittels Western Blot analysiert, unter Verwendung des Antikörpers Schwedisch
"192", der nur mit der von β-Secretase produzierten
sezernierten Form von βAPP
reagiert. Für
die Western-Analyse
wurden Proteine auf einem 6% SDS-PAGE Gel (von Novex) aufgetrennt
und danach mittels Standardtechniken auf ImmobilonP transferiert.
Der Filter wurde unter Verwendung von Standardtechniken mit 2 μg/ml Antikörper Schwedisch
"192" inkubiert, und der gebundene Antikörper wurde unter Verwendung
des Amersham ECL-Kits sichtbar gemacht. Wie in 8, Bahn 3, gezeigt gab es in dem Überstand
von dem transgenen Tier eine ganze Menge nachweisbares, "192"-reaktives Material.
Das Hirnhomogenat des nicht-transgenen Tiers enthielt eine geringe
Menge an immunreaktivem Material mit einer geringfügig höheren Mobilität auf dem
Gel als das für
das transgene Tier spezifische Material (Bahn 1). Dieses Material
ist vermutlich nicht βAPP-verwandt,
da es nicht mit anderen βAPP-Antikörpern (z. B.
anti-5) hybridisiert.
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In Gewebskultursystemen kreuzreagiert
der Antikörper
Schwedisch 192 nicht mit sezerniertem βAPP, das an der α-Secretasestelle
an Position 17 in der Mitte der βAP-Sequenz
gespalten ist. Um nachzuweisen, dass dies auch für die Mausmodelle zutrifft,
wurden Hirnhomogenate an den α-Secretase-gespaltenen βAPP-Formen
abgereichert, unter Verwendung von Harz-gebundenem 6C6-Antikörper, der
für die
ersten 16 Aminosäuren
von βAP
spezifisch ist und daher mit dem Amino-terminalen Fragment des α-Secretase-gespaltenen
sezernierten βAPP-Fragments
reagiert, aber nicht mit dem kürzeren β-Secretase-gespaltenen
sezernierten βAPP-Fragment.
Das Harz wurde hergestellt unter Verwendung von Actigel-ALS, gekoppelt
in Suspension wie vom Hersteller (Sterogene) beschrieben. Ein Überschuss
an Harz-Antikörper
wurde mit den Hirnhomogenaten von Tieren, die das Transgen enthielten
oder nicht, für
eine anfängliche
Inkubation von 3 Stunden bei 4°C
unter Schütteln
inkubiert, und gebundenes und ungebundenes Material wurden mittels
einminütiger Zentrifugation
bei 14.000 UpM voneinander abgetrennt. Der Überstand wurde nochmals 16
Stunden bei 4°C mit
einem Überschuss
an Harz-gekoppeltem 6C6 inkubiert, und erneut zentrifugiert um das
ungebundene Material abzutrennen. Material, das während der
ersten Inkubation band, und Material, das nicht an den Harzgekoppelten
6C6 band, wurden mittels Western Blot unter Verwendung der Antikörper 8E5
und Schwedisch 192 analysiert (9).
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Homogenate von transgenen (+) oder
nicht-transgenen (-) Mäusen
wurden mit 8E5 (Gelmuster A) oder Schwedisch 192 (Gelmuster B) getestet.
Bahn 1 bezeichnet Gesamthomogenat, Bahn 2 bezeichnet die Fraktion,
die nicht an das 6C6-Harz band (d. h. die an dem α-Secretase-gespaltenen βAPP-Fragment
abgereichert ist), und Bahn 3 bezeichnet die Fraktion, die an den
Harz-gekoppeltem 6Cf3 band (d. h. die das α-Secretase-gespaltene βAPP-Fragment
beinhaltet). Keines der gebundenen βAPP, identifiziert durch ihre
Reaktion mit Antikörper
anti-5, jreuzregierte mit dem Antikörper Schwedisch 192. Ungebundenes
Material, identifiziert durch Reaktivität mit anti-5, reagierte mit
dem Antikörper
Schwedisch 192.
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Somit stellt die vorliegende Erfindung
ein brauchbares Tiermodell bereit, um die Prozessierung von βAPP zu βAP und verwandten
Fragmenten zu untersuchen, und stellt weiterhin ein günstiges
System zum Screening nach Inhibitoren der β-Secretaseaktivität und/oder Arzneimitteln, welche β-Secretaseaktivität modulieren,
bereit.
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Obwohl die vorstehende Erfindung
im Detail beschrieben wurde um das Verständnis zu erleichtern, wird
offensichtlich sein, dass bestimmte Modifikationen innerhalb des
Umfangs der beigefügten
Ansprüche vorgenommen
werden können.
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