DE69434377T2

DE69434377T2 - Verfahren zur herstellung von polyhydroxybutyrat und verwandten polyhydroxyalkanoaten in den plastiden hoeherer pflanzen

Info

Publication number: DE69434377T2
Application number: DE69434377T
Authority: DE
Inventors: Roland Christopher SOMERVILLE; Christiane Nawrath; Yves Poirier
Original assignee: Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2014-08-18
Also published as: EP0719342A1; WO1995005472A2; JPH09501832A; WO1995005472A3; US5610041A; AU7633094A; ES2240965T3; HK1013110A1; EP0719342B1; ATE295894T1; DE69434377D1

Description

Verweis auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung stellt eine Continuation-in-part-Anmeldung der US-Anmeldung SN 08/108,193 (Anmeldetag 17. August 1993) dar, die wiederum eine Continuation-in-part-Anmeldung von US-SN 07/732,243 (Anmeldetag 19. Juli 1991) ist.
Rechte der Regierung
Die hier beschriebene Erfindung wurde vom U.S. Department of Energy unter der Nummer DE-AC02-76ERO-1338 und von der National Science Foundation unter der Nummer DMB 9014037 gefördert. Die US-Regierung hält bestimmte Rechte an der Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
(1) Gebiet der Erfindung
Dieses Patent betrifft Erfindungen, die die Herstellung einer Klasse von Materialien mit der Bezeichnung Polyhydroxyalkanoate (PHA) in höheren Pflanzen verbessert. PHA stellt eine Gruppe von bakteriellen polymeren Materialien dar, die aus linearen Polyestern von Hydroxysäuren zusammengesetzt sind und thermoplastische Eigenschaften besitzen. Früher wurde gezeigt, dass Arabidopsis thaliana, das mit den bakteriellen Genen, die bei der PHA-Synthese beteiligt sind, transformiert worden ist, PHA in geringen Konzentrationen erzeugt (US-SN 07/732 243, Anmeldetag 19. Juli 1991). Um in höheren Pflanzen größere Mengen an PHAs zu erzeugen, müssen die Enzyme für die PHA-Erzeugung in einem subzellulären Kompartiment lokalisiert sein, das eine hohe Konzentration an einem Vorläufer für die PHA-Synthese, bei dem es sich um das Plastid handelt, aufweist. Die drei Gene von Alcaligenes eutrophus, die an der Synthese von PHA aus Acetyl-CoA beteiligt sind, wurden modifiziert, um die entsprechenden Enzyme zielgerichtet auf das Plasmid von Arabidopsis-Pflanzenzellen als spezielles Beispiel der vorliegenden Erfindung zu dirigieren.
(2) Beschreibung des Stands der Technik
Polyhydroxyalkanoate (PHA), Polyester von 3-Hydroxysäuren, werden als Kohlenstoff-Speicherreserven von einer großen Anzahl von Bakterien gebildet (A. J. Anderson, und E. A. Dawes, Microbiol. Rev., Bd. 54 (1990), S. 450-472). Poly-D-(-)-3-hydroxybutyrat (PHB) ist das am weitesten verbreitete und am gründlichsten charakterisierte PHA, bei dem es sich um ein biologisch abbaubares und biologisch verträgliches thermoplastisches Material handelt.
Forschungen über die PHA-Erzeugung haben sich hauptsächlich auf Alcaligenes eutrophus konzentriert, das kurzkettige PHAs (C₃- bis C₅-Einheiten) erzeugt. In A. eutrophus wird PHB aus Acetyl-CoA durch sequenzielles Einwirken von drei Enzymen synthetisiert (1) (A. Steinbüchel und H. G. Schlegel, Mol. Microbiol., Bd. 5 (1991), S. 535-542). Das erste Enzym des Stoffwechselweges, nämlich 3-Ketothiolase (E.C. 2.3.1.9), katalysiert die reversible Kondensation von zwei Acetyl-CoA-Resten zur Bildung von Acetoacetyl-CoA. Acetoacetyl-CoA-Reduktase (E.C. 1.1.1.36) reduziert anschließend Acetoacetyl-CoA zu D-(-)-3-Hydroxybutyryl-CoA, das sodann durch die Einwirkung von PHB-Synthase unter Bildung von PHB polymerisiert wird. PHB wird als ein Polymeres mit 10⁵-10⁶ Monomereinheiten gebildet und reichert sich in Granalien mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,5 μm an, wobei jede Granalie etwa 1 000 Polymerketten enthält (A. J. Anderson und E. A. Dawes, Microbiol. Rev., Bd. 54 (1990), S. 450-472). Bei Züchtung in einem Glucose enthaltenden Medium reichert A. eutrophus typischerweise PHB bis zu 80 % des Trockengewichts an. Die Gene, die für die drei vorstehend beschriebenen phb-Biosyntheseenzyme kodieren, wurden aus A. eutrophus kloniert (O. P. Peoples und A. J. Sinskey, J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 15293-15297, und J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 15298-15303; S. C. Slater, W. H. Voige und D. E. Dennis, J. Bacteriol., Bd. 170 (1988), S. 4431-4436; P. Schubert, A. Steinbüchel und H. G. Schlegel, J. Bacteriol., Bd. 170 (1988), S. 5837-5847).
Zusätzlich zum PHB-Homopolymeren können A. eutrophus und andere bakterielle Spezies Polymere erzeugen, die verschiedene Anteile einer Anzahl an unterschiedlichen C₃- bis C₅-Monomeren enthalten. Die Natur und das Verhältnis dieser Monomeren wird durch die im Wachstumsmedium bereitgestellte Kohlenstoffquelle beeinflusst. Wenn beispielsweise Propionsäure oder Pentansäure dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, wird ein statistisches Copolymeres, das sowohl 3-Hydroxybutyrat-Monomere (3HB) als auch 3-Hydroxyvalerat-Monomere (3HV) enthält, mit einem Maximum an 43- bis 90 Mol-% 3HV-Einheiten gebildet (A. J. Anderson und E. A. Dawes, Microbiol. Rev., Bd. 54 (1990), S. 450-472). Diese PHA-Copolymeren werden durch die gleiche PHB-Synthase unter Verwendung der Coenzym A-thioesterderivate der organischen C₃- bis C₅-Säuren synthetisiert. Zusätzlich zu PHB und Copolymeren mit einem Gehalt an PHB gibt es eine weitere Klasse von PHAs mit einem Gehalt an Monomereinheiten im Bereich von C₆ bis C₁₂. Pseudomonas olevorans stellt den Bakterium-Prototyp dar, der PHAs mit einem Gehalt an (D)-3-Hydroxysäuren von mittlerer Kettenlänge enthält, wenn n-Alkane oder n-Alkansäuren im Wachstumsmedium bereitgestellt werden. Unter diesen PHAs ist Polyhydroxyoctanoat am besten untersucht, das angereichert wird, wenn P. olevorans in einem Medium mit einem Gehalt an Octanoat gezüchtet wird (G. W. Huisman, O. de Leeuw, G. Eggink, und B. Witholt, Appl. Environ. Microbiol., Bd. 54 (1988), S. 2924). Ferner lassen sich besondere Polymere, die ungesättigte oder verzweigtkettige Monomere aufweisen und Chlorid- oder Fluorid-Seitengruppen besitzen, durch Manipulation des Fermentationsausgangsmaterials erhalten (Y. Doi, (Hrsg.) in: Microbial polyesters, Kapitel 3, VCH Publishers, New York, 1990).
PHB ist ein starres und relativ brüchiges thermoplastisches Material (Y. Doi (Hrsg.) in: Microbial Polyesters, Kapitel 6, VCH Publishers, New York (1990); P. A. Holmes, in: Developments in crystalline polymers-2., D. C. Basset (Hrsg.) (1988), S. 1-65). Durch Einverleibung von 3HV-Monomeren in das Polymere ergibt sich eine Verringerung der Kristallinität und des Schmelzpunkts im Vergleich zu PHB, was zu einer Verringerung der Steifigkeit und zu einer Zunahme der Zähigkeit des Polymeren führt, wodurch P(3HB-co-3HV) und andere verwandte Copolymere geeigneter für zahlreiche gewerbliche Anwendungsmöglichkeiten gemacht werden. Ferner ist es möglich, verschiedene Polymere und Weichmacher mit PHB zu vermischen, um deren physikalische Eigenschaften zu verbessern (P. A. Holmes, in: Developments in crystalline polymers-2, D. C. Basset (Hrsg.) (1988), S. 1-65). PHB weist eine gute UV-Beständigkeit auf, ist aber im allgemeinen wenig beständig gegen Säuren und Basen sowie gegen organische Lösungsmittel. PHB besitzt eine gute Sauerstoffundurchlässigkeit und ist gegen einen hydrolytischen Abbau in feuchter Luft beständig. Diese Eigenschaften machen PHB attraktiv als Kunststoffquelle für einen breiten Bereich von Gebrauchsgegenständen, wie Behälter, Tüten und Einwickelfolien für Haushaltszwecke. Im Gegensatz zu PHB handelt es sich bei langkettigen PHAs um Elastomere mit einem Schmelzpunktsbereich von 40-60 °C (R. A. Gross, C. De Mello, R. W. Lenz, H. Brandl und R. C. Fuller, Macromolecules, Bd. 22 (1989), S. 1106). Die physikalischen Eigenschaften dieser PHAs müssen noch vollständig charakterisiert werden.
PHB und verwandte Copolymere werden in Erdreich, Schlamm und Meerwasser leicht abgebaut. Beispielsweise werden in Erdreich von 30 °C Folien von P(3HB-co-4HB)-Copolymeren und PHB-Homopolymeren in 2 bzw. 10 Wochen zersetzt. (Y. Doi, (Hrsg.) in: Microbial Polyesters, Kapitel 1, VCH Publishers, New York, 1990). Von einer Anzahl von Bakterien und Pilzen wurde gezeigt, dass sie zu einem aktiven Abbau dieser Polymeren befähigt sind (E. A. Dawes und P. J. Senior, Adv. Microb. Physiol., Bd. 10 (1973), S. 135-266). Extrazelluläre PHB-Depolymerasen und -Hydrolasen wurden aus mehreren Bakterien, einschließlich Alcaligenes faecalis, isoliert. PHB kann somit zu monomeren 3HB-Einheiten abgebaut werden, die als Kohlenstoffquelle für das Wachstum von Bakterien und Pilzen verwendet werden können. Ferner ist PHB hochgradig biologisch verträglich, was es möglicherweise für medizinische Anwendungen, wie Nahtmaterial-Filamente und Arzneistoffträger, attraktiv macht (F. Koosha, R. H. Muller und S. S. Davis, in: Critical reviews in therapeutic drug carrier system, Bd. 6 (1989), S. 117-129). Der Abbau von PHB erzeugt D-3-Hydroxybuttersäure, einen Metaboliten, der normalerweise im Blut vorhanden ist. Der biologische Abbau von PHB stellt einen wichtigen Aspekt der Eignung als Kunststoff für Einmal-Gebrauchsartikel sowie für spezielle Anwendungen, beispielsweise beim landwirtschaftlichen Mulchen oder für medizinische Implantate, dar.
Das von A. eutrophus synthetisierte P(3HB-co-3HV)-Copolymere wird gewerblich von der Fa. Imperial Chemical Industries hergestellt und unter der Warenbezeichnung BIOPOL vertrieben. Die geschätzten Kosten auf der Basis einer Jahresproduktion des Polymeren von 500 000 kg betragen etwa $ 15 pro kg, im Gegensatz zu etwa $1 pro kg für von Petroleum abgeleitete Gebrauchskunststoffe, wie Polypropylen (R. Poole, Science, Bd. 245 (1989), S. 1187-1189). Zwei Hauptfaktoren, die zu den Herstellungskosten beitragen, sind die Kohlenstoffquelle, die dem Ausgangsmaterial zugesetzt wird (z. B. Saccharose, Glucose, Propionat) und die Ernte des Polymeren aus den Bakterien. Eine Anzahl von Strategien zur Verringerung der Herstellungskosten wird derzeit untersucht (Y. Poirier, D. E. Dennis, C. Nawrath und C. Somerville, Adv. Mater., Bd. 5 (1993), S. 30-36). Beispielsweise sind einige Bakterien zur Erzeugung von PHB bei Züchtung auf billigen, unraffinierten Zuckerquellen, wie Melassen und Maissirup, befähigt. Einige Stämme von Pseudomonas und Rhodococcus sind zur Erzeugung einer Anzahl von PHA-Copolymeren bei Züchtung auf Glucose befähigt, wodurch die Zugabe von teuren Substraten, wie Propionat, die normalerweise für die Copolymerbildung erforderlich sind, vermieden wird. Ferner wird erwartet, dass eine gentechnische Bearbeitung von Bakterien, einschließlich die Verwendung von E. coli, das PHB synthetisiert, einen Einfluss auf die Herstellungskosten von PHB ausübt. Jedoch ist man sich trotz dieser möglichen Verbesserungen im allgemeinen darüber einig, dass aufgrund der naturgegebenen Kosten, die mit einer bakteriellen Fermentation und der nachgeschalteten Verarbeitung verbunden sind, die Kosten für durch Bakterien erzeugtes PHA nicht unter etwa $ 3-5 pro kg liegen. Es ist unwahrscheinlich, dass es jemals möglich sein wird, eine bakterielle Biomasse zu Kosten herzustellen, die mit den Kosten für die Herstellung von Biomasse aus höheren Pflanzen vergleichbar sind. Beispielsweise können Kartoffeln etwa 20 000 kg Stärke pro Hektar liefern, wobei die Kartoffelknolle Stärke bis zu 80 % ihres Trockengewichts anreichert (J. H. Martin, W. H. Leonard und D. L. Stamp (Hrsg.), Kapitel 36, in: Principles of Field Crop Production, Macmillan, New York (1976), S. 898-932). Stärke stellt weltweit einen der kostengünstigsten (etwa $ 0,2/kg) und am reichlichsten vorhandenen Rohstoffe dar. Gleichermaßen erzeugen ölbildende Pflanzen, wie Raps, etwa 1 000 kg Öl pro Hektar mit einem Ölgehalt bis zu 44 des Trockengewichts (R. K. Downey und G. Röbbelen, in: Oil crops of the world, G. Röbbelen, R. K. Downey und A. Ashri, (Hrsg.), Kapitel 16, McGraw-Hill, New York, (1989)). Es wurde gezeigt, dass Pflanzen neben ihrer hohen Produktivität auch in sehr wirksamer Weise eine Anzahl von biologisch aktiven Fremdproteinen erzeugen, z. B. Antikörper (A. Hiatt, R. Cafferkey und K. Bowdish, Nature, Bd. 342 (1989), S. 76-78). Es besteht ein wachsendes Interesse an der Ausnutzung der hohen Produktivität und der Flexibilität von Pflanzen bei der Herstellung einer Vielzahl von organischen Materialien, einschließlich Proteinen und verschiedenen anderen Polymeren (A. S. Moffat, Science, Bd. 256 (1992), S. 770-771).
Es wurde nachgewiesen, dass Poly-D-(-)-3-hydroxybutyrat, ein Mitglied der Familie der PHAs, in der höheren Pflanze Arabidopsis thaliana gebildet wird (Y. Poirier, E. Dennis, K. Klomparens und C. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523; und US-Patentanmeldung SN 07/732,243). Von den drei Enzymen, die zur Herstellung von PHB aus Acetyl-CoA erforderlich sind, ist die 3-Ketothiolase endogen in Pflanzen vorhanden. Bei den anfänglichen Versuchen wurden die Gene aus dem Bakterium Alcaligenes eutrophus, die für 3-Ketothiolase (phbA), Acetoacetyl-CoA-Reduktase (phbB) und PHB-Synthase (phbC) kodieren, unter der transkriptionellen Kontrolle des konstitutiven CaMV-35S-Promotors in Arabidopsis übertragen und dort exprimiert (1). Bei diesen Experimenten wurden die Enzyme aufgrund der Abwesenheit von Organellen-Zielsignalen an den Genprodukten auf das Zytoplasma als Ziel gerichtet. Durch geeignete genetische Kreuzungen wurde eine hybride Pflanze erhalten, die sämtliche für die PHB-Synthese erforderlichen Enzyme enthielt. Eine Analyse der in Chloroform löslichen Verbindungen, die in der hybriden Pflanze vorhanden sind, durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS) ergab die Anwesenheit von PHB. 20 bis 100 μg PHB pro Gramm Frischgewicht Pflanzenmaterial konnten nachgewiesen werden. Eine elektronenmikroskopische Prüfung von Dünnschnitten von Pflanzengeweben, die PHB bilden, ergab die Anwesenheit von Agglomerationen von elektronenleuchtenden Granalien. Diese Granalien waren in Bezug auf Größe und Erscheinungsbild sehr ähnlich mit den in A. eutrophus und anderen PHB-anreichernden Bakterien. Überraschenderweise wurden PHB- Granalien in verschiedenen Kompartimenten, nämlich dem Kern, der Vakuole und dem Zytoplasma festgestellt. Keine PHB-Granalien konnten in den Mitochondrien oder Chlöroplasten nachgewiesen werden. Die Grundlage für diese Verteilung von Granalien ist unbekannt.
Der Nachweis der PHB-Bildung in gentechnisch bearbeiteten Arabidopsis-Pflanzen ergab verschiedene Probleme. Eines der Probleme ist die geringe Ausbeute an PHB. Ein zweites Problem ist der nachteilige Einfluss der Expression der phb-Gene auf das Pflanzenwachstum. Eine Expression von hohen Mengen an Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität in transgenen Pflanzen verursachte eine signifikante Verringerung des Wachstums und der Samenbildung im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen. Beispielsweise wurde in einer transgenen Linie, die etwa 9 Einheiten Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität pro mg Protein exprimiert (1 Einheit ist als 1 μmol Acetoacetyl-CoA, das pro Minute reduziert wird, definiert) das Frischgewicht von Schösslingen mit einem Alter von 22 Tagen auf 19 % des Werts des Wildtyps verringert (Y. Poirier, D. E. Dennis, K. Klomparens, C. Nawrath und C. Somerville, FEMS Microbiol. Lett., Bd. 103 (1992), S. 237-246). Die Samenbildung war etwa im gleichen Ausmaß vermindert. Dieser Phänotyp könnte das Ergebnis der Umlenkung einer signifikanten Menge an Acetyl-CoA und/oder Acetoacetyl-CoA weg von den wesentlichen biochemischen Wegen sein, was zu einer Abnahme der Bildung von Verbindungen, wie Phytohormonen, Carotinoiden, Sterolen, Chinonen, Flavonoiden und Lipiden führt (2). Alternativ kann eine Anreicherung von β-Hydroxybutyryl-CoA oder eines davon abgeleiteten Produkts für Pflanzenzellen schädlich sein. Das Schicksal des in transgenen Pflanzen gebildeten D-β-Hydroxybutyryl-CoA ist unbekannt. Eine Expression der PHB-Synthase selbst hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf das Wachstum oder die Vitalität von transgenen Pflanzen. Jedoch waren hybride Pflanzen, die beide Gene enthielten, in ihrem Wachstum stärker gehemmt als Pflanzen, die nur die Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität enthielten. Dies könnte entweder auf eine stärkere Verarmung des Substrats aus dem Mevalonat-Stoffwechselweg oder auf einen schädlichen Einfluss der PHB-Granalien, insbesondere der Granalien, die im Kern angereichert werden, zurückzuführen sein.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA, die für ein bakterielles Polypeptid kodiert, enthält, wobei dieses Polypeptid aus der Gruppe 3-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase und Polyhydroxyalkanoat (PHA)- synthase sowie Gemische davon ausgewählt ist, wobei das Polypeptid zur Erzeugung eines Polyhydroxyalkanoats im Plastid in der Pflanze führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein transgenes Pflanzenmaterial, das Plastide aufweist, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für ein Peptid, das 3-Ketothiolase-Aktivität aufweist, im Plastid in der Pflanze kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität im Plastid der Pflanze kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für ein Polypeptid, das PHA-Synthase-Aktivität aufweist, im Plastid der Pflanze kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für ein oder mehrere Enzyme kodiert, die zur Synthese eines Polyhydroxyalkanoats (PHA) aus Hydroxyacyl-CoA im Plastid der Pflanze führen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für ein oder mehrere Enzyme kodiert, die die Synthese von Hydroxyacyl-CoA im Plastid der Pflanze katalysieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine transgene Pflanze mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für ein oder mehrere Enzyme kodiert, die dazu führen, dass Acetoacetyl-CoA aus Produkten, die durch die fremde DNA kodiert werden, im Plastid der Pflanze erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial fremde DNA enthält, die für ein oder mehrere Enzyme kodieren, die dazu führen, dass 3-Hydroxybutyryl-CoA aus Produkten, die durch die fremde DNA kodiert werden, im Plastid der Pflanze gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zu Einführung von fremder DNA, die für Polypeptide kodieren, die zur Synthese eines Polyhydroxyalkanoats (PHA) im Plastid führen, in eine Pflanze, wobei das Verfahren die Paarung durch sexuelle Befruchtung von zwei Pflanzen umfasst, die kein PHA bilden und jeweils fremde DNA aus einem Bakterium, die für ein oder mehrere verschiedene Enzyme in einem Stoffwechselweg kodiert, der zur Polymerisation von Hydroxyacyl-CoA durch PHA-Synthase führt, wodurch eine Pflanze erzeugt wird, die PHA in einem Plastid der Pflanze synthetisiert.
Aufgaben
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein oder mehrere Enzyme bereitzustellen, die zur Anreicherung von PHA, insbesondere PHB, im Plastid führen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Pflanzen bereitzustellen, die ein gutes Wachstum und eine gute Samenbildung aufweisen. Diese und weitere Aufgaben ergeben sich noch klarer im Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung und den Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Fließdiagramm zur Darstellung des Stoffwechselwegs der PHB-Synthese im A. eutrophus. Die für die drei Enzyme kodierenden Gene sind in Klammern angegeben.
2 ist ein Fließdiagramm zur Darstellung der Stoffwechselwege unter Einsatz von Acetyl-CoA und Acetoacetyl-CoA in transgenen Pflanzen, die PHB bilden. Die hauptsächlichen Endprodukte der endogenen Stoffwechselwege der Pflanzen unter Verwendung von Acetyl-CoA und Acetoacetyl-CoA als Vorläufer sind im oberen Teil des Diagramms angegeben. Der zusätzliche Stoffwechselweg, der in transgenen Pflanzen durch die Expression der phbB- und phbC-Gene aus A. eutrophus geschaffen wird, ist eingerahmt.
3 ist eine schematische Darstellung der TPSS-phb-Genfusionen. a) TPSS-3-Ketothiolase-Genfusion, b) TPSS-Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Genfusion und c) TPSS-PHB-Synthase-Genfusion.
Alle diese Konstrukte sind aus vier verschiedenen Regionen, die eingerahmt sind, zusammengesetzt, nämlich das Transitpeptid mit 55 Aminosäuren und die ersten 23 Aminosäuren des reifen Proteins, die durch das 3,6-Gen der kleinen Untereinheit von Rubisco der Erbse kodiert werden, eine kurze Linker-Sequenz und die vollständige Kodierungsregion der phbA (A)-, phbB (B)- und phbC (C)-Gene von A. eutrophus mit Ausnahme der anfänglichen Methionine. Die Aminosäuresequenzen (Einbuchstabencode), die in Fettdruck dargestellt sind, und die an den Verbindungen der einzelnen Regionen vorhandenen DNA-Sequenzen sind angegeben. Strecken von Aminosäuren zwischen den Verbindungen, die durch Bindestriche angegeben sind, wurden früher veröffentlicht (A. R. Cashmore, in: Genetic engineering of plants (Hrsg. T. Kosuge, C. P. McRed ith und A. Hollaender), Plenum Press NY (1983), S. 29-38; B. Janes, J. Hollar und E. Dennis, E. A. Dawes (Hrsg.), Novel Biodegradable Microbial Polymers, (1990), S. 175-190). Die Sternchen bezeichnen Terminationscodons. Endonuclease-Restriktionsstellen, die durch PCR während der Subklonierungsverfahren eingeführt wurden, sind gekennzeichnet.
4 ist eine schematische Darstellung der Ti-Plasmide mit dem CaMV35S-Promotor und der TPSS-phb-Genfusion. Die Karten von pBI-TPSS-Thio (A), pBI- TPSS-Red (B) und pBI-TPSS-Syn (C) sind dargestellt. Bei den physikalischen Komponenten der einzelnen Konstrukte handelt es sich von links nach rechts um: LB, Sequenz am linken Rand; Kan, Neomycin-Phosphotransferase II-Gen; CaMV-35S, Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor; TPSS, Transitpeptid der kleinen Untereinheit (3,6-Gen) von Rubisco der Erbse; schraffiertes Kästchen, synthetischer Linker; 3-Ketothiolase-Gen (A), Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen (B) oder PHB-Synthase-Gen (C); Poly A, Polyadenylierungsstelle; RB, Sequenz am rechten Rand. Die Positionen der wichtigen Endonuclease-Restriktionsstellen sind angegeben.
5 ist eine schematische Darstellung der Ti-Plasmide, die den samenspezifischen Promotor und die TPSS-phb-Genfusion enthalten. Karten von pBIB-CCN-Thio (A), pBIB-KCN-Red (B) und pBIB-HCN-Syn (C) sind dargestellt. Für sämtliche Konstrukte wurde der samenspezifische Promotor des CRB-Gens des 12S-Samenlagerproteins von A. thaliana strangaufwärts von der TPSS-phb-Genfusion platziert. Die folgenden selektierbaren Marker wurden verwendet: ALS, das für Acetolactat-synthase kodiert (A), Kan, das für Neomycinphosphostransferase II kodiert; Hyg, Hygromycin-phosphotransferase. 4 zeigt eine ausführlichere Beschreibung.
6 ist ein Autoradiogramm einer Western-Blot-Analyse von transgenen A. thaliana-Pflanzen, die das Plasmid pBI-TPSS-Thio exprimieren, und von Kontrollpflanzen. Aliquotanteile von rohen Blattproteinextrakten, die 1,2 μg Protein enthielten, wurden an 10 % SDS-PAGE getrennt. Einem Elektroblotting an Nitrocellulose unterzogene Proteine wurden mit anti-3-Ketothiolase-Antikörper inkubiert. Bei den analysierten Proteinextrakten handelte es sich um T4-3A (Bahn C; C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN 07/732,243), TPSS-Thio GHI 1 (Bahn 1), TPSS-Thio L (Bahn 2), TPSS-Thio STU4 (Bahn 3) und TPSS-Red STU (Bahn U).
7 ist ein Autoradiogramm einer Western-Blot-Analyse von transgenen A. thaliana-Pflanzen, die das Plasmid pBI-TPSS-Red exprimieren, und von Kontrollpflanzen. Aliquotanteile von rohen Blattproteinextrakten, die 1,2 μg Protein enthielten, wurden an 12 % SDS-PAGE getrennt. Einem Elektroblotting an Nitrocellulose unterzogene Proteine wurden mit anti-Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Antikörper inkubiert. Bei den analysierten Proteinextrakten handelte es sich um Red B-2B (Bahn C; C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN 07/732,243), TPSS-Red DEF (Bahn 1), TPSS-Red GHI1 (Bahn 2), TPSS-Red GHI2 (Bahn 3), TPSS-Red MNO1 (Bahn 4), TPSS-Red MNO2 (Bahn 5), TPSS-Red STU (Bahn 6), TPSS-Red VXY (Bahn 7) und TPSS-Syn VXY (Bahn U).
8 ist ein Autoradiogramm einer Western-Blot-Analyse von transgenen A. thaliana-Pflanzen, die das Plasmid pBI-TPSS-Syn exprimieren, und von Kontrollpflanzen. Aliquotanteile von rohen Blattproteinextrakten mit einem Gehalt an 50 μg Protein wurden an 8 % SDS-PAGE getrennt. Einem Elektroblotting an Nitrocellulose unterzogene Proteine wurden mit anti-PHB-Synthase-Antikörper inkubiert. Bei den analysierten Proteinextrakten handelte es sich um S8-1-2C (Bahn C, C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN 07/732,243), TPSS-Red STU (Bahn U), TPSS-Syn GHI1 (Bahn 1), TPSS-Syn GHI2 (Bahn 2), TPSS-Syn JKL (Bahn 3) und TPSS-Syn VXY (Bahn 4).
9 ist ein Autoradiogramm einer Western-Blot-Analyse von transgenen A. thaliana-Pflanzen, die das Plasmid pBIB-CCN-Thio exprimieren, und von Kontrollpflanzen. Aliquotanteile von rohen Samenproteinextrakten mit einem Gehalt an 50 μg Protein wurden an 12 % SDS-PAGE getrennt. Einem Elektroblotting an Nitrocellulose unterzogene Proteine wurden mit anti-3-Ketothiolase-Antikörper inkubiert. Bei den analysierten Proteinextrakten handelte es sich um CN-Red 17-1 (Bahn C), CN-Thio 13-3 (Bahn 1) und CN-Thio 14-1 (Bahn 2).
10 ist ein Autoradiogramm einer Western-Blot-Analyse von transgenen A. thaliana-Pflanzen, die pBIB-KCN-Red exprimieren, und von Kontrollpflanzen. Aliquotanteile von rohen Proteinextrakten, die 50 μg Protein enthielten, wurden an 12 % SDS-PAGE getrennt. Einem Elektroblotting an Nitrocellulose unterzogene Proteine wurden mit anti-Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Antikörper inkubiert. Bei den analysierten Proteinextrakten handelte es sich um Red B-2B (Bahn LR; C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN 07/732,243). Bei den Samenproteinextrakten handelte es sich um CN-Syn 34-1H1 (Bahn U), CN-Red 17-3K (Bahn 1) und CN-Red 17-1 (Bahn 2).
11 ist ein Autoradiogramm einer Western-Blot-Analyse von transgenen A. thaliana-Pflanzen, die das Plasmid pBIB-HCN-Syn exprimieren, und von Kontrollpflanzen. Aliquotanteile von rohen Proteinextrakten, die 50 μg Protein enthielten, wurden an 12 % SDS-PAGE getrennt. Einem Elektroblotting an Nitrocellulose unterzogene Proteine wurden mit anti-PHB-Synthase-Antikörper inkubiert. Bei den analysierten Proteinextrakten handelte es sich um S8-1-2C (Bahn LS; C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN 07/732,243), Red B-2B (Bahn LR; C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis), US-Patentanmeldung SN 07/732,243), CN-Red 17-1 (Bahn C), CN-Syn 35-1 (Bahn 1), CN-Syn 35-1aA (Bahn 2), CN-Syn 35-G1 (Bahn 3), CN-Syn 34-1 Hb (Bahn 4), CN-Syn 34-1 Hc (Bahn 5), CN-Syn 34-1bA (Bahn 6), CN-Syn 34-1bA2 (Bahn 7), CN-Syn 34-1 bB (Bahn 8), CN-Syn 34-1B (Bahn 9) und CN-Syn 34-1 G (Bahn 10).
12 ist ein Autoradiogramm einer Southern-Blot-Analyse von untransformierten Kontrollpflanzen und transgenen A. thaliana-Pflanzen, die mit den Plasmid-pBI-TPSS-phb-Konstrukten transformiert waren. 1 μg genomische DNA aus der untransformierten A. thaliana-Rasse Rschew und von transgenen Pflanzen wurde jeweils mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut. Die Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Filter wurden mit ³²P-markierten DNA-Fragmenten aus den Genen (A) phbA, (B) phbB und (C) phbC hybridisiert. Bei den analysierten genomischen DNAs handelte es sich um TPSS-Thio GHI1 (Bahn Thio 1), TPSS-Thio L (Bahn Thio 2), TPSS-Thio STU4 (Bahn Thio 3), TPSS-Red DEF (Bahn Red 1), TPSS-Red GHI1 (Bahn Red 2), TPSS-Red GHI2 (Bahn Red 3), TPSS-Red MNO1 (Bahn Red 4), TPSS-Red MN02 (Bahn Red 5), TPSS-Red STU (Bahn Red 6), TPSS-Red VWX (Bahn Red 7), TPSS-Syn GHI1 (Bahn Syn 1), TPSS-Syn GHI2 (Bahn Syn 2), TPSS-Syn JKL (Bahn Syn 3), TPSS-Syn VWX (Bahn Syn 4) und untransformierten Wildtyp (Bahn C).
13 ist ein Autoradiogramm einer Southern-Blot-Analyse von untransformierten Kontrollpflanzen und transgenen A. thaliana-Pflanzen, die mit den Plasmid-pBIB-CN-phb-Konstrukten transformiert waren. Bei den analysierten genomischen DNAs handelte es sich um CN-Thio 13-3 (Bahn Thio 1), CN-Thio 14-1 (Bahn Thio 2), CN-Red 17-2 (Bahn Red 1), CN-Red 17-3 (Bahn Red 2), CN-Red 17-1 dA (Bahn Red 3), CN-Red 17-1 dB (Bahn Red 4), CN-Red 17-3K (Bahn Red 5), CN-Red 17-2K (Bahn Red 6), CN-Syn 34-1 bA (Bahn Syn 1), CN-Syn 34-1 bB (Bahn Syn 2), CN-Syn 34-1 Hb (Bahn Syn 3), CN-Syn34-1GI (Bahn Syn 4), CN-Syn 35-1 (Bahn Syn 5), CN-Syn35-1A (Bahn Syn 6) und untransformierten Wildtyp (Bahn C). Bezüglich einer ausführlicheren Beschreibung wird auf die Legende zu 12 verwiesen.
14 zeigt eine gaschromatographische (GC) Analyse von gereinigtem PHB und Pflanzenextrakten. (A) Gaschromatogramm von umgeestertem PHB, bezogen von der Fa. Sigma Chemical Company; (B) Gaschromatogramm von Chloroformextrakten von Blättern von untransformiertem Wildtyp A. thaliana, Rasse Rschew. Der Pfeil zeigt die Position, an der Ethylhydroxybutyrat aus dem Chromatogramm eluiert würde; (C) Gaschromatogramm von Chloroformextrakten von Blättern aus dem Hybrid TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1. Der Pfeil gibt die Position des Ethylhydroxybutyrat-Peaks an.
15 zeigt eine Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse von Ethylhydroxybutyrat, das aus einem PHB-Standard hergestellt worden ist, und von PHB aus Pflanzenextrakten. (A) Massenspektrum von umgeestertem handelsüblichem PHB; (B) Massenspektrum des GC-Peaks eines Blatt-Chloroformextrakts des Hybrids TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 mit einer Retentionszeit, die identisch mit der von Ethylhydroxybutyrat ist (wie in 14 C dargestellt).
16 zeigt Balkendiagramme zur Erläuterung der PHB-Anreicherung in Blättern verschiedener TPSS-Thio/TPSS-Red/TPSS-Syn-Hybridpflanzen. (A) Messungen an expandierenden Blättern (im Alter von 20-30 Tagen); (B) Messungen an reifen Blättern (im Alter von 50-60 Tagen).
17 zeigt vollständig entwickelte Rosetten von Wildtyp (WT) und transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die biosynthetische PHB-Enzyme im Plastid (A) und im Zytoplasma (B) exprimieren. Die Blätter des Hybrids TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn-GHI1, die PHB im Plastid erzeugen, enthielten etwa 1,2 mg PHB/g Frischgewicht (A, PHB+). Das Red/Syn-Hybrid, das die PHB-Enzyme im Zytoplasma exprimiert, enthielt etwa 100 μg PHB/g Frischgewicht (B/PHB+). Wildtyp- und transgene Pflanzen wurden unter identischen Bedingungen gezüchtet.
18 ist eine Darstellung zur Erläuterung des Einflusses einer hochgradigen Anreicherung von PHB im Plastid auf die Blattpigmentierung. (A) Blatt einer 50 Tage alten Wildtyppflanze; (B) Blatt eines 50 Tage alten, transgenen Arabidopsis-Hybrids, das 700 μg PHB/g Frischgewicht im Plastid von expandierenden Blättern erzeugt.
19 zeigt transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen von Dünnschnitten eines PHB erzeugenden Trihybrids, das die PHB-Enzyme im Plastid exprimiert (TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1). (A) Die Agglomeration von elektronendurchscheinenden Granalien in den Chloroplasten einer Mesophyllzelle ist durch Pfeile gekennzeichnet. Die Pflanze wurde 48 Stunden vor der Probennahme für die EM-Analyse an einen dunklen Ort gestellt, um die Stärke zu entfernen. Der Balken stellt 1 μm dar. (B) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten von Wildtypblättern, die nach 4-stündiger Belichtung in einer 12 h-Photoperiode gesammelt wurden. Die Stärkeanreicherung in den Plastiden in Form von eiförmigen einzelnen Granalien ist im Wildtyp mit großen Pfeilen bezeichnet; (C) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten von PHB-positiven TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1-Hybridblättern, die nach 4-stündiger Beleuchtung in einer 12 h-Photoperiode gesammelt wurden. Die Stärkeanreicherung in den Plastiden in Form von eiförmigen einzelnen Granalien ist durch große Pfeile bezeichnet. Agglomerationen von elektronenleuchtenden PHB-Granalien im Plastid des Trihybrids sind durch kleine Pfeile gekennzeichnet. Die Balken bedeuten 1 μm.
20 zeigt eine Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten von transgenen TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1-Pflanzen, die mit dem anti-PHB-Synthase-Antikörper inkubiert worden waren. Extrakte von löslichen Proteinen (Bahnen 1, 2) und von in Lösung gebrachten Proteinen der Membran und der teilchenförmigen Fraktion (Bahnen 3, 4) von zwei verschiedenen TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1-Pflanzen. Die Bahn C zeigt einen Extrakt von löslichen Proteinen einer TPSS-Syn GHI1-Pflanze.
Es erschein hilfreich, eine Definition für verschiedene Ausdrücke, die nachstehend verwendet werden, zu geben.
Unter Transformation ist der Vorgang zur Veränderung des Genotyps eines Empfängerorganismus durch die stabile Einführung von DNA mittels beliebiger Maßnahmen zu verstehen.
Eine transgene Pflanze ist eine Pflanze, die DNA-Sequenzen enthält, die normalerweise in der Spezies nicht vorhanden sind, die aber durch Transformation eingeführt wurden.
Unter Transkription ist die Bildung einer RNA-Kette gemäß der in der DNA enthaltenen genetischen Information zu verstehen.
Unter Translation ist der Vorgang zu verstehen, bei der die genetische Information in einem mRNA-Molekül die Reihenfolge von bestimmten Aminosäuren während der Proteinsynthese dirigiert.
Bei einem Promotor handelt es sich um ein DNA-Fragment, das die Transkription von genetischem Material hervorruft. Für die vorliegende Beschreibung wird der Ausdruck Promotor zur Bezeichnung von DNA-Fragmenten verwendet, die eine Transkription in Pflanzenzellen ermöglichen.
Eine poly-A-Additionsstelle ist eine Nucleotidsequenz, die bewirkt, dass bestimmte Enzyme mRNA an einer spezifischen Stelle spalten und eine Sequenz von Adenylsäureresten am 3'-Ende der mRNA addieren.
Bei phbC, phbA und phbB handelt es sich um die Gensymbole, mit denen die A. eutrophus-Gene für PHB-Polymerase, 3-Ketothiolase bzw. Acetoacetyl-CoA-Reduktase bezeichnet werden (O. P. Peoples und A. J. Sinskey, J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 15298-15303).
Ein Plastid ist eine selbstreplizierende Organelle, die sich in Mehrfachkopien im Zytoplasma unterschiedlicher Arten von Pflanzenzellen befindet. Diese Organelle ist von einer doppellagigen Membran umgeben und enthält ihre eigene DNA. Proteine, die sich im Plastid befinden, werden entweder von ihrer eigenen DNA kodiert und im Plastid synthetisiert oder werden durch den Kern der Pflanzenzelle kodiert, im Zytoplasma synthetisiert und in das Plastid transportiert.
Bei der Beschreibung der Nachkommenschaft von transgenen Pflanzen ist es wertvoll, eine Konvention anzuwenden, die angibt, wie viele Generationen der Selbstbestäubung seit der Einführung von DNA stattgefunden haben. Hier bezeichnen wir die ursprüngliche Transformante als T0-Generation. Die sich durch Selbstbestäubung dieser Generation ergebende Nachkommenschaft wird als die T1-Generation bezeichnet, usw.
Im Fall einer Kreuzbestäubung zwischen zwei verschiedenen parentalen Pflanzen wird die beim ersten Kreuzbestäubungsereignis erzielte Nachkommenschaft als die F1-Generation bezeichnet.
Die hier beschriebene Erfindung betrifft die Linderung der Wachstumsunterbrechung und der niedrigen PHB-Bildung, die bei der ersten Generation von PHB erzeugenden Pflanzen aufgrund der Veränderung der zellulären Lokalisierung der PHB-Biosyntheseenzyme und durch Regulierung der Gewebespezifität und des zeitlichen Ablaufs der Expression stattfindet.
Um sowohl die PHB-Erzeugung zu erhöhen als auch die mögliche Verarmung an essentiellen Produkten, die sich von Acetyl-CoA und/oder Acetoacetyl-CoA ableiten, zu verhindern, wurden die bakteriellen PHB-Biosyntheseenzyme zielgerichtet an ein subzelluläres Kompartiment mit einem hohen metabolischen Fluss durch Acetyl-CoA und/oder Acetoacetyl-CoA, nämlich das Plastid, abgegeben. Da das Plastid der Ort der Fettsäuresynthese in Pflanzen ist, zeigt es ein hohes Maß an Acetyl-CoA-Bildung (J. L. Harwood, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., Bd. 39 (1988), S. 101-138). In Lagergeweben sollte die Umleitung eines Teils dieser Plastid-Acetyl-CoA weg von der Fettsäure-Biosynthese zur PHB-Erzeugung für das Wachstum der Pflanze nicht nachteilig sein. Stärke, ein hochmolekulares Biopolymeres, das natürlicherweise in Pflanzen synthetisiert wird, reichert sich in großen Mengen in den Plastiden zahlreicher Lagergewebe (Amyloplasten) an (J. Preiss, Ann. Rev. Plant Physiol., Bd. 33 (1982), S. 431-454). In photosynthetischen Chloroplasten wird Stärke ferner vorübergehend während der täglichen Periode der CO₂-Fixierung angereichert. Das Plastid stellt daher ein Kompartiment dar, das seine Abmessungen variieren kann und eine große Speicherkapazität aufweist. Somit ist zu erwarten, dass die Anreicherung von PHB im Plastid nicht die Plastidfunktion stört oder ein mechanisches Aufbrechen bewirkt. Ferner führte die Expression des PHB-Biosynthesewegs im Zytoplasma zu einer PHB-Granalienanreicherung im Zytoplasma, im Kern und in der Vakuole, jedoch nicht im Plastid (Y. Poirier, E. Dennis, K. Klomparens und C. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523).
Dies ergibt die Möglichkeit, dass die Plastidhülle für das Eindringen von PHB-Granalien undurchlässig ist. Somit besteht ein zusätzlicher Vorteil der Plastid-PHB-Erzeugung darin, dass PHB-Granalien sich im Plastid anreichern und ausschließlich dort verbleiben können, wodurch ein mögliches mechanisches Aufbrechen anderer Organellen durch die Granalien verhindert wird.
Gemäß der hier beschriebenen Erfindung wurden die Gene phbA, phbB und phbC aus Alcaligenes eutrophus, die unter Zielrichtung der kodierten Enzyme auf das Plastid modifiziert waren, in Pflanzenzellen eingeführt. Sie wurden unter der transkriptionellen Kontrolle des CaMV35S-Promotors exprimiert, des gleichen Promotors, der früher zur Konstruktion von PHB erzeugenden Pflanzen verwendet wurde. Dieser Weg ermöglicht einen direkten Vergleich der Plastid- und Zytoplasma-Expression der Enzyme und der PHB-Erzeugungsniveaus.
In einem zweiten Abschnitt der hier beschriebenen Erfindung wurde die PHB-Erzeugung auf ein spezifisches Gewebe und auf ein spezifisches Stadium des Pflanzenlebenszyklus beschränkt, um die Möglichkeit von nachteiligen Einflüssen auf das Gesamtwachstum der Pflanzen zu verringern. Da der Fluss von Acetyl-CoA in den Plastiden besonders hoch in den Geweben ist, die normalerweise eine große Menge an Öl anreichern, z. B. in den Samen einer Ölpflanze, stellt der sich entwickelnde Samen ein geeignetes Gewebe für die PHB-Erzeugung dar. Die Umleitung eines Teils dieser Acetyl-CoA weg von der Fettsäuresynthese, die für die Lagerung von Lipiden eingesetzt wird, in Richtung zur PHB-Synthese sollte für das Wachstum der Pflanze nicht nachteilig sein. Daher wurden die auf das Plastid abzielenden phb-Enzyme spezifisch in den sich entwickelnden Samen unter Verwendung des Promotors eines Samen-Lagerproteingens von Arabidopsis thaliana exprimiert.
Die PHA-Erzeugung in landwirtschaftlichem Maßstab macht es erforderlich, dass die PHA erzeugenden Pflanzen von normaler Vitalität sind und dass die Konzentration des gebildeten PHA über einem bestimmten Mindestniveau liegt, das in früheren Generationen von transgenen Pflanzen noch nicht erreicht worden ist. Die Erfindung ist somit von großer Bedeutung für die erfolgreiche Entwicklung von PHA erzeugenden Pflanzen. Aufgrund der engen Verwandtschaft von Arabidopsis und Brassica napus können die in den nachstehenden Abschnitten beschriebenen Konstrukte direkt für die PHB-Erzeugung in Brassica verwendet werden. Ferner ist es aufgrund der Ähnlichkeit der Mechanismen der Genexpression und des primären Kohlenstoff-Stoffwechsels in verschiedenen Spezies höherer Pflanzen offensichtlich, dass der Kern der Erfindung, nämlich die Erzeugung von PHA in Plastiden, auch auf andere Pflanzenspezies anwendbar ist. Die Erzeugung von PHB in anderen ölerzeugenden Pflanzen, wie den Samen von Raps und Sonnenblumen oder im Mesocarp von Avocado oder Ölpalme ist von besonderer Attraktivität, da diese Pflanzenorgane auf die Bereitstellung des Vorläufers Acetyl-CoA für die Fettsäure-Biosynthese spezialisiert sind.
Obgleich die nachstehend erörterten Experimente die Pflanzenspezies Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold betreffen, ist das beschriebene Verfahren allgemein auf beliebige höhere Pflanzen anwendbar, für die ein Transformationsverfahren verfügbar ist. Gleichermaßen betrifft zwar das hier beschriebene Verfahren die Verwendung von Genen aus A. eutrophus, wobei das Verfahren aber allgemein auf die Verwendung von Genen aus beliebigen Organismen, die zur Synthese von PHB befähigt sind, anwendbar ist. Ferner ist ersichtlich, dass das beschriebene Verfahren zwar die Erzeugung von PHB betrifft, jedoch allgemein auf die Erzeugung beliebiger Polyhydroxyalkanoate anwendbar ist, die normalerweise in Mikroorganismen durch die Aktivität von PHA-Synthase (die PHB-Synthase umfasst) erzeugt werden und für die das entsprechende Hydroxyacyl-CoA-Substrat in der speziellen Pflanze erzeugt wird.
Die Erzeugung von PHB in den Plastiden in transgenen Pflanzen erfordert die Durchführung einer Sequenz von Stufen gemäß den nachstehenden Angaben:
1.) die Konstruktion eines oder mehrerer Plasmide, die Genfusionen der bakteriellen Gene für die PHB-Synthese mit Plastid-Zielsequenzen enthalten, die unter der Kontrolle eines Pflanzenpromotors in E. coli exprimiert werden; 2.) die Einführung dieser Plasmide in Agrobacterium tumefaciens; 3.) die Infektion von Pflanzen mit dem transformierten Agrobacterium tumefaciens, um Pflanzenzellen mit den modifizierten Genen zu transformieren (d. h. A. thaliana in diesem Beispiel): 4.) die Auswahl von Pflanzen, die mit den modifizierten Genen transformiert worden sind; 5.) die Auswahl von Pflanzen, die in Bezug auf die ektopischen Gene homozygot sind; 6.) die Analyse der transformierten Pflanzen bezüglich der Integration des Plasmids und der Expression der ektopischen Gene, um sicherzustellen, dass sie aktiv sind und dass die Genprodukte auf das Plastid abzielen, prozessiert werden und funktionell sind; 7.) die Erzeugung von hybriden Pflanzen, die zwei oder mehr verschiedene ektopische Gene enthalten, durch sexuelle Kreuzungen; 8.) die Analyse des hybriden Materials auf die Anwesenheit von PHB.
1. Konstruktion der Plasmide, die die Plastid-Zielsequenz-phb-Genfusionen unter der Kontrolle eines Pflanzenpromotors in E. coli enthalten.
1. 1. Fusion einer Signalsequenz mit den Kodierungsregionen der phb-Gene
Um ein Protein zielgerichtet zum Grundgewebe des Plastids in Pflanzenzellen abzugeben, muss das Protein ein Transitpeptid an seinem N-terminalen Ende enthalten (K. Keegstra und L. J. Olsen, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., Bd. 40 (1989), S. 471-501; E. K. Archer und K. Keegstra, J. Bioenerg. Biomem., Bd. 22 (1990), S. 789-810). Daher muss eine Signalsequenz, die für das Transitpeptid kodiert, im richtigen Leseraster an das 5'-Ende der Kodierungssequenz des Proteins fusioniert werden. Das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulose-1-5-bisphosphat-carboxylase (Rubisco) (TPSS) wurde ausführlich charakterisiert (C. Robinson und R. J. Ellis, Eur. J. Biochem., Bd. 142 (1984), S. 343-346; C. C. Wasmann, B. Reiss, S. G. Barlett und H. J. Bohnert, J. Mol. Gen. Genet., Bd. 205 (1986), S. 446-453; A. L. Friedmann und K. Keegstra, Plant Physiol., Bd. 89 (1988), S. 993-999; T. H. Lubben, A. A. Gatenby, P. Ahlquist und K. Keegstra, Plant Mol. Biol., Bd. 12 (1989), S. 1318; D. J. Schnell, G. Blobel und D. J. Pain, Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 3335-3342) und bereits früher in erfolgreicher Weise in einer Anzahl von Zielexperimenten verwendet (G. van de Broeck, M. P. Timko, A. P. Kausch, A. R. Cashmore, M. Van Montagu und L. Herrera-Estrella, Nature, Bd. 313 (1985), S. 358-363; P. H. Schreier, E. A. Seftor, J. Schell und H. J. Bohnert, EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 25-32; M. Boutry, F. Nagy, C. Poulsen, K. Aoyagi und N.-H. Chua, Nature, Bd. 328 (1987), S. 340-342; T. H. Lubben und K. Keegstra, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 83 (1986), S. 5502-5506; G. K. Lamppa, J. Biol. Chem., Bd. 263 (1988), S. 14996-14999; A. A. Gatenby, T. H. Lubben, P. Ahlquist und K. Keegstra, EMBO J., Bd. 7 (1988), S. 1307-1314; A. Y. Cheung, L. Bogorad, M. Van Montagu und J. Schell, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 85 (1988), S. 391-395; T. H. Lubben, S. M. Theg und K. Keegstra, Photosyn. Res., Bd. 17 (1988), S. 173-194). Die TPSS von Erbsen wurde daher in den folgenden Experimenten verwendet. Jedoch können auf analoge Weise auch eine Anzahl von unterschiedlichen Transitpeptiden, die beim Abzielen auf ein Plastid beteiligt sind, verwendet werden.
Da das Transitpeptid normalerweise während des Imports in das Plastid abgespalten wird, kann die dreidimensionale Struktur an der Verbindung zwischen dem Transitpeptid und dem Protein für die Wirksamkeit des Transports von Bedeutung sein (C. C. Wasmann, B. Reiss, S. G. Barlett und H. J. Bohnert, Mol. Gen. Genet., Bd. 205 (1986), S. 446-453; T. H. Lubben, A. A. Gatenby, P. Ahlquist und K. Keegstra, Plant Mol. Biol., Bd. 12 (1989), S. 13-18). Daher wurde die Sequenz des Gens, das für die ersten 23 Aminosäuren der reifen kleinen Untereinheit von Rubisco kodiert, in das Transitpeptid aufgenommen, das mit den bakteriellen Genen von A. eutrophus, die an der PHB-Erzeugung beteiligt sind, nämlich die phbA-, phbB- und phbC-Gene fusioniert sind.
Um die exakte Fusion zwischen den Signalsequenzen und den bakteriellen Genen zu erhalten, wurden die Sequenzen, die für die TPSS sowie für die phb-Gene kodieren, durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die neue synthetische Restriktionsstellen an jedem Ende der Sequenz erzeugten. Die Primer, die für die Amplifikation konzipiert wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1 PCR-Amplifikationen
In Tabelle 1 sind auch die Quelle der DNA, aus der die Fragmente amplifiziert wurden, und die Größe des amplifizierten Fragments angegeben. Die PCR-Fragmente wurden gereinigt, mit Enzymen, die die eingeführten Restriktionsstellen erkennen, gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt.
Das gereinigte 0,27kbp-XbaI-SmaI-Fragment mit einem Gehalt an dem DNA-Fragment der Signalsequenz, wurde mit dem Vektor pUC18, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten war, zur Herstellung des Plasmids pUC-TPSS verknüpft.
Das gereinigte 1,3 kbp-SmaI-SacI-Fragment des phbA-Gens und das 0,8 kbp-Fragment der phbB-Gene wurden in das SmaI- und SacI-geschnittene pUC-TPSS-Plasmid eingebunden, um die Plasmide pUC-TPSS-Thio und pUC-TPSS-Red zu erzeugen. Das 1,9 kbp-SmaI-Fragment des phbC-Gens wurde mit pUC-TPSS, das mit SmaI geschnitten war, verknüpft. Ein Klon, in dem die Synthase in der korrekten Orientierung hinter der Signalsequenz kloniert war, wurde ausgewählt und erhielt die Bezeichnung pUC-TPSS-Syn.
Zusammengefasst, enthält jedes der erzeugten Plasmide, nämlich pUC-TPSS-Thio, pUC-TPSS-Red und pUC-TPSS-Syn, einen Teil einer Kodierungsregion eines Pflanzengens und eines bakteriellen Gens, die so miteinander fusioniert sind, dass sie für ein synthetisches Polypeptid kodieren. An der Verbindungsstelle zwischen der Pflanzen- und der bakteriellen Sequenz wurde eine synthetische Sequenz gebildet, die für die drei Aminosäuren Serin-Arginin-Valin (S-R-V) kodiert. Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen, die an den Verbindungen zwischen den Signalsequenzen und den bakteriellen Genen vorliegen, sind in 3 dargestellt. Bei Expression in einer Pflanzenzelle ist zu erwarten, dass diese Polypeptide durch den Proteinimport-Mechanismus der Plastide erkannt werden und zum Grundgewebe der Plastide transportiert werden.
1. 2. Addition eines Pflanzenpromotors strangaufwärts von den modifizierten phb-Genen
Um eine Transkription von synthetischen Kodierungsregionen in höheren Pflanzen zu erreichen, müssen die Kodierungsregionen unter der Kontrolle eines Pflanzenpromotors, der sich in der Nähe des 5'-Endes der Kodierungsregion befindet, stehen. Zusätzlich ist es übliche Praxis, eine Polyadenylierungsstelle an das 3'-Ende der Kodierungsregion zu addieren, um eine einwandfreie Expression des Gens in höheren Pflanzen zu gewährleisten. Ferner muss für die Selektion von transformierten Pflanzen ein Gen vorhanden sein, das es nur transformierten Pflanzen ermöglicht, unter Selektionsbedingungen zu überleben. Ein derartiges Gen wird als selektierbarer Marker bezeichnet. Zwei verschiedene Promotoren wurden zur Expression der modifizierten phb-Gene verwendet: der CaMV 35S-Promotor und der CRB-Promotor.
Der CaMV 35S-Promotor (aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus) wird als ein konstitutiver Promotor angesehen, der zu relativ hohen Transkriptionsgraden in einer Vielzahl von Geweben zahlreicher Spezies höherer Pflanzen führt (P. N. Benfey und N.-H. Chua, Science, Bd. 250 (1990), S. 959-966). Im Gegensatz dazu fördert der CRB-Promotor, der aus dem CRB-Gen des 12S- Samenlagerproteins von Arabidopsis thaliana isoliert worden ist, hohe Transkriptionsgrade fast ausschließlich im Embryo von sich entwickelnden Samen (P. P. Pang, R. E. Pruitt und E. M. Meyerowitz, Plant Mol. Biol., Bd. 11 (1988), S. 805-820).
1.2.1. Addition des CaMV 35S-Promotors strangaufwärts von den modifizierten phb-Genen
Um den CaMV 35S-Promotor strangaufwärts von den modifizierten phbA-, phbB- und phbC-Genen zu platzieren und um die übrigen Erfordernisse für die Expression einer Kodierungsregion in höheren Pflanzen zu erfüllen, wurde der Plasmidvektor pBI121 (Clonetech, CA) verwendet. Dieser Vektor enthält das Neomycin 11-phosphotransferase-Gen als einen selektierbaren Marker.
Zur Konstruktion der CaMV 35S-TPSS-phbA- und der CaMV 35S-TPSS-phbB-Genfusionen wurden die Plasmide pUC-TPSS-Thio und pUC-TPSS-Red mit den Restriktionsenzymen XbaI und SacI verdaut. Das 1,6 kbp-Restriktionsfragment von pUC-TPSS-Thio und das 1,1 kbp-Fragment von pUC-TPSS-Red wurden von den übrigen Fragmenten durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden mit pBI121, das mit den gleichen Enzymen gespalten war, verknüpft und in E. coli kloniert. Die neu geschaffenen Plasmide pBI-TPSS-Thio und pBI-TPSS-Red enthalten das phbA-Gen bzw. das phbB-Gen, die zur Zielrichtung auf ein Plastid modifiziert sind und sich stromabwärts von einem Pflanzenpromotor befinden (4).
Zur Konstruktion der CaMV 35S-TPSS-phbC-Genfusion wurde das Plasmid pUC-TPSS-Syn mit EcoRI verdaut und die versetzten Enden wurden durch T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Anschließend wurde das Plasmid mit XbaI verdaut. Ein 2,2 kbp-DNA-Fragment wurde von den übrigen Fragmenten durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt. Das gereinigte DNA-Fragment wurde in pBI121, das mit dem Restriktionsenzym SmaI/XbaI gespalten worden war, kloniert. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pBI-TPSS-Syn (4) weist das phbC-Gen von A. eutrophus auf, das zum Abzielen auf das Plastid unter Klonierung in der richtigen Orientierung relativ zum CaMV-Promotor und zur Polyadenylierungsstelle von pBI121 modifiziert ist, so dass seine Expression in höheren Pflanzen zu erwarten ist.
Von diesen Konstrukten wird erwartet, dass sie sämtliche Anforderungen für eine hochgradige Expression der Gene und die Zielrichtung der entsprechenden Proteine, nämlich modifizierte 3-Ketothiolase, modifizierte Acetoacetyl-CoA-Reduktase und modifizierte phb-Synthase zum Grundgewebe des Plastids erfüllen.
1.2.2. Addition des samenspezifischen Promotors strangaufwärts von den modifizierten phb-Genen
Zur Klonierung der modifizierten phb-Kodierungsregionen strangabwärts vom CRB-Promotor wurden die pBIB-Vektoren (D. Becker, Nucleic Acids Res., Bd. 18 (1990), S. 203) verwendet. Diese Vektoren enthalten sämtliche Funktionen, die für die Pflanzentransformation notwendig sind. Es gibt zwei Versionen des Vektors: pBIB-Kan trägt das Neomycin 11-phosphotransferase-Gen als selektierbaren Marker und pBIB-Hyg trägt das Hygromycin-phosphotransferase-Gen.
Um das anschließende Klonierungsverfahren zu vereinfachen, musste der CRB-Promotor geringfügig durch Entfernen der XbaI-Restriktionsstelle an der Position -993 modifiziert werden. Daher wurde das Plasmid nAt4011 (P. P. Pang, R. E. Pruitt und E. M. Meyerowitz, Plant Mol. Biol., Bd. 11 (1988), S. 805-820) mit BamHI und EcoRI verdaut. Nach der Reinigung wurde das 3.5 kbp-Fragment in pBR322 (F. Bolivar, R. L. Rodriguez, P. J. Greene, M. C. Betlach, H. L. Heyneker und H. W. Boyer, Gene, Bd. 2 (1977), S. 95-113) kloniert, um pBR322-CRB zu erzeugen. Nach Schneiden der einzigen XbaI-Stelle von pBR322-CRB wurden die versetzten Enden mit Desoxyribonucleotiden durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und das Plasmid wurde religiert. Das erhaltene Plasmid enthielt keine XbaI-Stelle in der CRB-Promotorregion.
Um den CRB-Promotor mit geeigneten Restriktionsstellen an jedem Ende der Sequenz zu erhalten, wurde eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Oligonucleotid-Primer durchgeführt. Das 1,1 kb-XbaI-Fragment wurde in pK19 kloniert (R. D. Pridmore, Gene, Bd. 56 (1987), S. 309-312), um pK-CRB zu erzeugen.
Um die TPSS-phbA-Kodierungsregion hinter dem CRB-Promotor zu klonieren, wurde das Plasmid pUC-TPSS-Thio mit den Restriktionsenzymen XbaI und SacI verdaut und das 1,6 kbp-DNA-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pBIB-Hyg, der mit XbaI und SacI gespalten worden war, verknüpft. Da es sehr hilfreich ist, über verschiedene selektierbare Marker, die mit jedem der drei phb-Gene kombiniert sind, zu verfügen, wurde anschließend das Hygromycin II-phosphotransferase-Gen des pBIB-Hyg-Vektors durch das Acetolactat-synthase-Gen ersetzt, das den transformierten Pflanzen Resistenz gegen Chlorsulforon verleiht (G. W. Haughn, J. Smith, B. Mazur und C. R. Somerville, Mol. Gen. Genet., Bd. 211 (1988), S. 266-271). Um dies zu erreichen, wurde das erhaltene Plasmid durch HindIII und BamHI gespalten, um das Hygromycin II-phosphotransferase-Gen zu entfernen. Die versetzten Enden des Plasmids würden mit Desoxyribonucleotiden durch T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Das gereinigte 5,8 kbp XbaI-Fragment aus dem Plasmid pGHI (G. W. Haughn, J. Smith, B. Mazur und C. R. Somerville, Mol. Gen. Genet., Bd. 211 (1988), S. 266-271) wurde anschließend in das hergestellte Plasmid inseriert. Das erhaltene Konstrukt erhielt die Bezeichnung pBIB-C-TPSS-Thio. Der CRB-Promotor wurde sodann an das Konstrukt addiert, indem man das 1,1 kbp lange XbaI-Fragment von pK-CRB in die einzige XbaI-Stelle von pBIB-C-TPSS-Thio klonierte. Ein Klon, der den Promotor in der richtigen Orientierung für die einwandfreie Expression des modifizierten phbA enthielt, wurde als pBIB-CCN-Thio bezeichnet (5).
Um die TPSS-phbB-Kodierungsregion hinter dem CRB-Promotor zu klonieren, wurde das Plasmid pUC-TPSS-Red mit XbaI verdaut und das 1,1 kbp-XbaI-Fragment des Plasmids pK-CRB wurde inseriert. Ein Klon mit dem Promotor in der richtigen Orientierung wurde ausgewählt und erhielt die Bezeichnung pK-CN-Red. Das Plasmid pK-CN-Red wurde mit EcoRI und PstI verdaut, um das Promotor/Genfragment zu erhalten. Die Enden wurden mit Desoxyribonucleotiden durch T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Das 2,2 kbp-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in den mit SmaI verdauten Vektor pBIB-Kan ligiert. Ein Klon mit dem Fragment in der richtigen Orientierung für eine einwandfreie Genexpression in Pflanzen erhielt die Bezeichnung pBIB-KCN-Red (5).
Um die TPSS-phbC-Kodierungsregion hinter dem CRB-Promotor im pBIB-Hyg-Vektor zu klonieren, wurde das Plasmid pUC-TPSS-Syn mit EcoRI verdaut. Die versetzten Enden wurden durch T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Das linearisierte Plasmid wurde anschließend mit XbaI geschnitten. Ein 2,2 kbp-DNA-Fragment wurde von den übrigen Fragmenten durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt. Das gereinigte DNA-Fragment wurde in pBIB-Hyg, das mit den Restriktionsenzymen XbaI und SmaI verdaut worden war, kloniert. In diesem erhaltenen Plasmid, das mit XbaI verdaut worden war, wurde das 1,1 kbp-XbaI-Fragment, das den durch Spalten des Plasmids pk-CRB erhaltenen CRB-Promotor enthielt, kloniert. Ein Klon, der den Promotor in der richtigen Orientierung für eine einwandfreie Expression des modifizierten phbC-Gens aufwies, erhielt die Bezeichnung pBIB-HCN-Syn (5).
Zusammengefasst, die Plasmide pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red, pBIB-HCN-Syn werden so konstruiert, dass bei Transformation in Pflanzen die modifizierten Gene spezifisch in den sich entwickelnden Samen exprimiert werden, wobei die Proteine zielgerichtet auf das Grundgewebe eines Plastids in Samen abgegeben werden.
2. Einführung der Konstrukte in Agrobacterium tumefaciens
Um die Anwendung einer Pflanzentransformationsmethode, die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelt wird, zu ermöglichen, wurden die Plasmide von beiden Reihen von Konstrukten in Agrobacterium tumefaciens Stamm pGV3101 durch Elektroporation übertragen (C. Koncz und J. Schell, Mol. Gen. Genet., Bd. 204 (1986), S. 383-396; J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Bakterielle Kolonien, die mit den verschiedenen Plasmiden transformiert waren, wurden durch Selektion auf bakterielle Expression des Kanamycin-Resistenzgens, das an den Plasmiden pBI121 und pBIB vorhanden ist, gewonnen.
3. Transformation von Pflanzenzellen mit Agrobacterium tumefaciens
In den beschriebenen Experimenten wurde Arabidopsis thaliana als Modellpflanze verwendet, um die PHB-Erzeugung im Plastid zu belegen. A. thaliana kann durch ein Agrobacterium tumefaciens-vermitteltes Meristem-Transformationsverfahren transformiert werden (S. S. Chang, S. K. Perk und H.-G. Nam, Abstract in: Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Wien, 1990).
Arabidopsis thaliana-Pflanzen der Rasse Rschew wurden unter kontinuierlicher Belichtung gezüchtet, bis Sprossen entstanden (etwa 3 Wochen). Die Sprossen (etwa 2 cm) wurden an ihrer Basis zusammen mit den Hilfsknospen entfernt. Die verwundete Stelle wurde durch Agrobacterium, die das gewünschte Plasmid trug, infiziert. Die Pflanzen wurden gezüchtet, bis neue Sprossen entstanden (etwa 1 Woche). Die Sprossen wurden erneut entfernt und die verwundete Stelle wurde mit Agrobacterium infiziert. Die Pflanzen wurden bis zur vollständigen Reifung gezüchtet und die Samen wurden geerntet.
4. Auswahl von transformierten Pflanzen
Transformierte T0-Pflanzen wurden durch Verteilung der Samen, die aus den mit den verschiedenen Agrobacterium-Stämmen infizierten Pflanzen erhalten worden waren, auf mit Agar verfestigtes Pflanzenmedium, das die geeignete Selektionsverbindung enthielt, selektiert. Für die Selektion von transformierten Pflanzen mit der T-DNA von pBI-TPSS-Thio, -Red und -Syn und von pBIB-KCN-Red wurden 50 μg/ml Kanamycin zum Medium gegeben. Für die Selektion von transformierten Pflanzen mit der T-DNA von pBIB-CCN-Thio wurden 30 ng/ml Chlorsulforon zum Medium gegeben. 30 μg/ml Hygromycin wurden zur Selektion von Pflanzen mit pBIB-HCN-Syn gegeben. Die vorstehenden Konzentrationen der Selektionsverbindungen verhindern das Wachstum von nicht-transformierten A. thaliana-Pflanzen, ermöglichen aber den transformierten Pflanzen ein normales Wachstum. Durchschnittlich konnte aus den Samen von etwa 40 Pflanzen, die mit Agrobacterium infiziert worden waren, eine mutmaßliche Transformante isoliert werden. Gegen Kanamycin resistente Pflanzen wurden mit einer Buchstaben/Zahlen-Kombination bezeichnet.
Insgesamt 14 Kanamycin-resistente Pflanzen wurden aus Samen von Pflanzen, die mit A. tumefaciens mit dem Plasmid pBI-TPSS-Thio infiziert worden waren, gewonnen. Diese erhielten die Bezeichnungen TPSS-Thio GHI1, -GHI2, -GHI3, -GHI4, -L, -STU1, -STU2, -STU3, -STU4, -STU5, -STU6, -YZAA1, -YZAA2 und -YZAA3.
Insgesamt 10 Kanamycin-resistente Pflanzenlinien wurden aus Samen von Pflanzen, die mit A. tumefaciens mit pBI-TPSS-Red infiziert worden waren, gewonnen. Diese erhielten die Bezeichnungen TPSS-Red DEF, -GHI1, -GHI2, -MNO 1, -MNO 2, -P1, -P2, -QR, -STU, -VWX.
Insgesamt 6 Kanamycin-resistente Pflanzenlinien wurde aus Samen von Pflanzen, die mit A. tumefaciens mit dem Plasmid pBI-TPSS-Syn infiziert worden waren, gewonnen. Diese erhielten die Bezeichnungen TPSS-Syn-ABC, -GHI1, -GHI2, -JKL, -PQR, -VWX.
Insgesamt 2 Chlorsulforon-resistente Pflanzen wurden aus Samen von Pflanzen, die mit A. tumefaciens mit dem Plasmid pBI-CCN-Thio infiziert worden waren, gewonnen. Diese erhielten die Bezeichnungen CN-Thio 13-3 und -14-1.
Insgesamt 6 Kanamycin-resistente Pflanzen wurden aus Samen von Pflanzen, die mit A. tumefaciens mit dem Plasmid pBI-KCN-Red infiziert worden waren, gewonnen. Diese erhielten die Bezeichnungen CN-Red 17-1, -17-3, -17-1dA, -17-1dB, -17-2K, -17-3K.
Insgesamt 17 Hygromycin-resistente Pflanzen wurden aus Samen von Pflanzen, die mit A. tumefaciens mit dem Plasmid pBI-HCN-Syn infiziert worden waren, gewonnen. Diese erhielten die Bezeichnungen CN-Syn 34-1 bA, -34-1 bB, -34-2A, -34-2B, -34-1 Ha, -34-1 Hb, -34-1 Hc, -34-1 G1, -34-1 G2, -35-1, -35-1 aA, -35-1 aB, -35-2A, -35-2B, -35-2C, -35-3, -35-1 G1.
5. Isolierung von mutmaßlichen homozygoten transgenen Linien
Ein Mindestkriterium, das zur Erzeugung von homozygoten, transgenen Linien herangezogen wurde, bestand darin, dass von der gesamten Nachkommenschaft einer homozygoten Pflanze Resistenz gegen den Selektionsmarker erwartet wurde. Da das Vorliegen von mehrfachen ektopischen Kopien der inserierten T-DNA an verschiedenen Positionen im Genom einen ähnlichen Phänotyp hervorrufen kann, ist dieses Kriterium besonders hilfreich, wenn das primäre Transformationsereignis die Insertion von T-DNA in nur eine einzige chromosomale Position beinhaltet.
Um mutmaßliche homozygote Linien zu identifizieren, wurden die resistenten T0-Pflanzen in reproduktiver Isolierung bis zur Reife gezogen. Anschließend wurden mehrere T1-Pflanzen, die sich als resistent gegenüber dem Selektionsmedium erwiesen, erneut bis zur Reife gezogen. Die Resistenzfrequenz gegenüber dem selektierbaren Marker wurde sodann in Proben von etwa 100 T2-Samen einer jeden Linie bestimmt. Wenn sämtliche T2-Samen einer bestimmten Pflanze gegen den selektierbaren Marker resistent waren, wurde die Linie provisorisch als homozygot angesehen.
6. Analyse der erhaltenen transgenen Pflanzen
6.1. Analyse der Expression und der Plastid-Zielrichtung der phb-Enzyme und ihrer Zielrichtung zum Plastid
6.1.1. Analyse von mutmaßlichen transgenen Pflanzen, die nach Transformation mit pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red und pBI-TPSS-Syn erhalten worden sind.
Um festzustellen, ob die mit pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red und pBI-TPSS-Syn transformierten transgenen Pflanzen funktionelle Enzyme, die sich in den Chloroplasten befinden, erzeugten, wurden Proteine der gegen Kanamycin resistenten transgenen Pflanzen durch Western-Blot-Analyse analysiert. Western-Blots von Proteinen von transgenen Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Thio transformiert waren, wurden mit Antikörpern gegen die 3-Ketothiolase von A. eutrophus inkubiert. Western-Blots von Proteinen von transgenen Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Red transformiert waren, wurden mit Antikörpern gegen die Acetoacetyl-CoA-Reduktase inkubiert und die Proteine von transgenen Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Syn transformiert waren, wurden mit polyklonalen Antikörpern aus Kaninchen gegen die PHB-Synthase inkubiert. Als negative Kontrolle wurde eine Analyse eines Proteinextrakts einer transgenen Pflanze, die nicht das mutmaßlich erzeugte Enzym enthielt, in die Analyse aufgenommen. Als positive Kontrolle wurde ein Extrakt einer transgenen Pflanze, die das Enzym im Zytoplasma erzeugt, aufgenommen.
Von den 14 mutmaßlichen transgenen Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Thio transformiert waren, zeigten die Proteinextrakte von 3 Pflanzen, nämlich TPSS-Thio GHI1, -L und -STU4 ein starkes Signal für die Erzeugung von 3-Ketothiolase (6). Das Enzym trat beim Western-Blot als Triplett mit Banden von 45, 46,5 und 48 kDa auf. Diese Banden repräsentieren das korrekt prozessierte Protein und ungenau prozessierte Produkte. Die nicht-modifizierte 3-Ketothiolase, die sich im Zytoplasma befindet, tritt bei 44 kDa auf. Daher wird erwartet, dass die auf die Chloroplasten zielgerichtete, korrekt prozessierte TPSS-3-Ketothiolase ein Molekulargewicht von etwa 47 kDa aufweist, da 23 Aminosäuren von der kleinen Rubisco-Untereinheit addiert worden sind. Das nicht-prozessierte Protein, das immer noch das gesamte Transitpeptid enthält, hätte ein Molekulargewicht von etwa 53 kDa.
Von den 10 mutmaßlichen transgenen Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Red transformiert waren, zeigten alle Pflanzen mit Ausnahme von P1 und P2 ein Signal für die Erzeugung der Acetoacetyl-CoA-Reduktase. Die Intensität dieser Signale variierte und war in TPSS-Red -DEF und -STU am stärksten (7). Das Signal trat immer als Triplett mit Banden von 28,5, 29,0 und 30,5 kDa auf, die die korrekt prozessierte Form und ungenau prozessierte Formen des Proteins repräsentieren. Das nicht-modifizierte Protein wandert mit 26,5 kDa. Daher wäre für eine nicht-prozessierte TPSS-Acetoacetyl-CoA-Reduktase ein Molekulargewicht von 35 kDa und für eine korrekt prozessierte Form des Proteins ein Molekulargewicht von etwa 29 kDa zu erwarten.
Sämtliche 6 mutmaßlichen transgenen Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Syn transformiert waren, zeigten mit Ausnahme von TPSS-Syn-ABC und -PQR ein Signal. Die Intensität dieser Signale variierte und war bei der Pflanze TPSS-Syn-VWX am stärksten (8). Das Signal trat als Triplettbande mit der Größe des korrekt prozessierten TPSS-Syn-Proteins (63 kDa) und einer prozessierten Version, die geringfügig kürzer als erwartet war (60 und 61 kDa), auf. Die nichtmodifizierte PHB-Synthase wandert mit 60 kDa.
In sämtlichen durchgeführten Western-Blot-Analysen zeigten Proteine von nicht-transformierten Pflanzen kein Signal. Pflanzen, die die phb-Enzyme im Zytoplasma exprimieren, zeigten ein starkes Signal mit der erwarteten Größe. Die PHB-Enzyme, die mit einem Transitpeptid zur Zielrichtung auf das Plasmid modifiziert waren, wurden auf die erwartete Größe prozessiert und daher großenteils in das Plastid inseriert. Ferner traten auch Banden von geringfügig höherer oder geringerer Beweglichkeit auf. Proteine, deren Beweglichkeit geringfügig höher als erwartet war, werden möglicherweise durch eine Protease-Aktivität auf die 23 Aminosäuren des reifen Proteins der kleinen Rubisco-Untereinheit, die an die bakteriellen Enzyme addiert war, erzeugt. Die künstlich geschaffene Erweiterung könnte gegenüber Proteasen besonders empfindlich sein.
Diese Ergebnisse zeigen, dass für jedes Konstrukt, das den CaMV-Promotor enthält, transformierte Pflanzen erhalten werden konnten, die hohe Konzentrationen der erwarteten Enzyme erzeugen. Das Auftreten von jedem dieser Enzyme bei den Western-Blot-Analysen als Dublett oder Triplett der erwarteten Größen zeigt, dass die Enzyme zum Plastid transportiert und auf die erwartete Weise prozessiert werden.
Durch Transformation mit pBI-TPSS-Thio erhaltene transgene Pflanzen wurden auf 3-Ketothiolase-Aktivität unter geringfügiger Modifikation des Tests von P. J. Senior und E. A. Dawes, Biochem. J., Bd. 134 (1973), S. 225-238, getestet. Gefrorene Blattgewebe von Kanamycin-resistenten heterozygoten T1-Pflanzen wurden in Tris-Puffer homogenisiert. Die geklärten rohen Extrakte wurden auf 3-Ketothiolase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 Niveaus der 3-Ketothiolase-Aktivität in transgenen A, thaliana-Pflanzen
Extrakte von nicht-transformierten Pflanzen, mit pBI-TPSS-Red transformierten, transgenen Pflanzen und mit pBI-TPSS-Thio transformierten, transgenen Pflanzen, die nicht das durch Western-Blot-Analyse nachgewiesene Gen exprimierten, zeigten unter den Testbedingungen sehr niedrige Niveaus der 3-Ketothiolase-Aktivität. Im Gegensatz dazu wurde bei jeder der transgenen Pflanzen, bei denen bei der Western-Blot-Analyse eine hohe 3-Ketothiolase-Erzeugung festgestellt worden war, auch ein erhöhtes Niveau der 3-Ketothiolase-Aktivität festgestellt. Dies zeigt, dass die modifizierte, bakterielle 3-Ketothiolase in Pflanzen funktionell ist. Die spezifische Aktivität der modifizierten 3-Ketothiolase war ebenso aktiv wie die nicht-modifizierte bakterielle 3-Ketothiolase, die im Zytoplasma von Arabidopsis-Pflanzen exprimiert wird.
Durch Transformation mit pBI-TPSS-Red erhaltene transgene Pflanzen wurden auf Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität mit dem geringfügig modifizierten Test von P. J. Senior und E. A. Dawes, Biochem. J., Bd. 134 (1973), S. 225-238, getestet. Blätter von Kanamycin-resistenten, heterozygoten T1-Pflanzen wurden in Kaliumphosphatpuffer homogenisiert. Die geklärten Extrakte wurden auf Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse für diese Experimente sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3 Niveaus der Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität in transgenen A. thaliana-Pflanzen
Extrakte von Pflanzen, die nicht transformiert waren, von Pflanzen, die mit pBI-TPSS-Thio transformiert waren, oder von transformierten Pflanzen, die bei der Western-Blot-Analyse keinen Nachweis auf das Gen ergaben, wiesen nichtnachweisbare Niveaus an Acetoacetyl-CoA-Reduktase auf. Im Gegensatz dazu zeigte jede der transgenen Pflanzen, von denen bei der Western-Blot-Analyse die Erzeugung der Acetoacetyl-CoA-Reduktase festgestellt wurde, Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität. Das Niveau der Aktivität korrelierte mit dem Niveau der beim Western-Blot festgestellten Erzeugung. Dies zeigt, dass die modifizierte, bakterielle Acetoacetyl-CoA-Reduktase in Pflanzen funktionell ist.
Transgene Pflanzen, die durch Transformation mit dem Konstrukt pBI-TPSS-Syn erhalten worden waren, wurden nicht auf die Anwesenheit von PHB-Synthase-Aktivität getestet, was auf technische Schwierigkeiten bei der Messung der Aktivität dieses Enzyms in Abwesenheit von Thiolase- und Reduktase-Aktivitäten zurückzuführen war (O. P. Peoples und A. J. Sinskey, J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 15298-15303). Zusammengefasst, zeigen die Ergebnisse dieser Experimente, dass alle drei bei der PHB-Synthese beteiligten Enzyme, die in Bezug auf die Plastid-Zielrichtung modifiziert waren, in signifikanten Niveaus in Pflanzen gebildet wurden, in der für den Transport zum Plastid erwarteten Art und Weise prozessiert wurden und enzymatisch aktiv waren.
6.1.2. Analyse von mutmaßlichen transgenen Pflanzen, die nach Transformation mit pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red und pBIB-HCN-Syn erhalten worden sind.
Um festzustellen, ob die mutmaßlichen transgenen Pflanzen, die mit pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red und pBIB-HCN-Syn transformiert waren, das geeignete Enzym erzeugen, wurden die Proteine in den unreifen Samen analysiert. Da Pang et al. zeigten, dass der in diesen Experimenten verwendete samenspezifische Promotor eine hochgradige Genexpression zwischen dem 6. und 14. Tag nach der Befruchtung der Blüten dirigiert, wurden die Samen in diesem Zeitraum gesammelt (P. P. Pang, R. E. Pruitt und E. M. Meyerowitz, Plant Mol. Biol., Bd. 11 (1988), S. 805-820). Gefrorene unreife Samen wurden in Puffer homogenisiert und die in der wässrigen Phase vorhandenen Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Die Proteine wurden auf die vorstehend beschriebene Weise auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern inkubiert.
Beide Pflanzen, die nach Transformation mit pBIB-CCN-Thio erhalten worden waren, zeigten ein hohes Niveau der Expression des Enzyms im Western-Blot. Das Enzym trat als Quadruplett mit Größen von 43 bis 47 KDa auf. Die Bande bei 47 KDa stellt die erwartete Größe für die korrekt prozessierte Form des modifizierten Enzyms dar (9).
In der Western-Blot-Analyse der 6 Kanamycin-resistenten Pflanzen reagierte nur der Proteinextrakt von Pflanze 17-3K mit dem Antikörper gegen Acetoacetyl-CoA-Reduktase. Das Signal trat als Doppelbande mit der Größe der korrekt prozessierten Form des Proteins (29 KDa) und eines geringfügig größeren Proteins (31 KDa) auf (10).
13 der 17 Pflanzen, die nach Transformation mit pBIB-HCN-Syn erhalten worden waren, wurden analysiert. Darunter zeigten 11 Pflanzen ein geringes Niveau der Expression der modifizierten bakteriellen Synthase. Die transgene Pflanze TPSS-Syn 34-1G1 weist ein etwa 5-fach höheres Expressionsniveau als die übrigen transgenen Pflanzen auf. Das Signal tritt als einzelne Bande mit der Größe des prozessierten Enzyms auf (63 KDa) (11).
Die vorläufigen Ergebnisse der modifizierten PHB-Enzyme, die unter der Kontrolle des samenspezifischen Promotors exprimiert worden sind, zeigen, dass sie in den Samen in der Art und Weise synthetisiert und prozessiert werden, wie es für die Zielrichtung auf das Plastid erwartet wird.
Nach Erhalt der homozygoten Linien der transformierten Pflanzen, die die entsprechenden phb-Enzyme mit einem hohen Niveau exprimieren, werden Immunolokalisationsstudien unternommen, um ferner zu zeigen, dass sich die Enzyme in den Plastiden befinden.
6. 2. Analyse der Integration der phb-Gene in transgenen Pflanzen
Um die einwandfreie Integration der phb-Gene in den verschiedenen erzeugten transgenen Pflanzenlinien zu verifizieren, wurde die genomische DNA der transgenen Pflanzen analysiert. Hochmolekulare DNA aus nichttransformierten Kontrollpflanzen und aus transgenen T2-Pflanzen, die mit den Plasmiden pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red und pBI-TPSS-Syn oder pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red und pBIB-HCN-Syn transformiert worden waren, wurde isoliert. Die DNAs wurden mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut. Die Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und auf ein Nylonfilter übertragen. In den Konstrukten pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red und pBI-TPSS-Syn schnitt das Restriktionsenzym HindIII nur 1-mal am 5'-Ende des CaMV 35S-Promotors (4). In den Konstrukten pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red und pBIB-HCN-Syn schnitt das Restriktionsenzym HindIII mehrmals, jedoch nur in 5'-Stellung zur Kodierungsregion der phb-Gene. Fragmente, die unter Verwendung von phb-genspezifischen Sonden nachgewiesen wurden, sollten daher Verbindungsfragmente der Ti-Vektoren mit der genomischen Pflanzen-DNA oder interne Fragmente von konkatemerisierten Ti-Vektoren darstellen. Die Inserts in den Plasmiden pUC-THIO, pUC-RED und pUC-SYN wurden durch Behandlung mit EcoRI und HindIII ausgeschnitten, durch Elektrophorese gereinigt und mit 32P-Desoxyribonucleotiden durch statistisches Priming markiert. Die markierten phb-Genfragmente wurden sodann zur Sondenbehandlung der Nylonfilter verwendet. Die Filter wurden hybridisiert und anschließend unter hochstringenten Bedingungen gewaschen. Das Ergebnis dieser Filterhybridisierungen ist in 12 für die pBI-TPSS-phb-Konstrukte und in 13 für die pBIB-CN-phb-Konstrukte dargestellt. Keines der drei phb-Gene kann in nicht-transformierten Kontrollpflanzen nachgewiesen werden (12a, b, c und 13a, b, c, Bahn C).
Das phbA-Gen wurde in den drei transgenen Linien nachgewiesen, die durch Transformation mit dem Plasmid pBI-TPSS-Thio (12a, Bahn Thio 1-3) erzeugt worden waren, sowie in den 2 transgenen Linien, die durch Transformation mit dem Plasmid pBIB-CCN-Thio erzeugt worden waren (13a, Bahn Thio1-2).
Das phbB-Gen wurde in den transgenen Pflanzen nachgewiesen, die durch Transformation mit dem Plasmid pBI-TPSS-Red (12b, Bahnen Red 1-7) erzeugt worden waren, sowie in 2 der 6 transgenen Linien, die durch Transformation mit dem Plasmid pBIB-KCN-Red erzeugt worden waren (13b, Bahn Red 1 und 5). Obgleich die Pflanzenlinien CN-Red 17-3, -17-1dA, 17-1dB und -17-2K gegenüber 50 μg/ml Kanamycin resistent waren, was auf die Integration des NPTII-Gens schließen lässt, konnte kein phbB-Gen nachgewiesen werden. Es ist wahrscheinlich, dass nur das Fragment des Ti-Vektors, der das NPTII-Gen enthält, und nicht das phbB-Gen, in die genomische DNA dieser Linien integriert worden war (13b, Bahn Red 2, 3, 4, 6).
Das phbC-Gen wurde in den 4 transgenen Pflanzenlinien die durch Transformation mit pBI-TPSS-Syn (12c, Bahn Syn 1-4) erzeugt worden waren, sowie in den 6 transgenen Pflanzenlinien, die durch Transformation mit dem Plasmid pBIB-HCN-TPSS-Syn erzeugt worden waren und analysiert wurden (13c, Bahn Syn 1-6), nachgewiesen. Die transgenen Pflanzenlinien CN-Syn 34-1 bA und CN-Syn 34-1 bB sind identisch, da sie beim Southern-Blot das gleiche Bandenmuster aufweisen (13c, Bahn Syn 1 und 2). Die gleiche Erscheinung ist für die Pflanzen CN-Syn 34-1 Hb und CN-Syn 34-1G1 (13c, Bahn Syn 3 und 4) und die Pflanzen CN-Syn 35-1 und CN-Syn 35-1a (13c, Bahn Syn 5 und 6) ersichtlich und steht im Zusammenhang mit dem Transformationsverfahren.
Eine Reihe von sexuellen Kreuzungen wurde zur Konstruktion von Pflanzenlinien mit einem Gehalt an allen drei phb-Enzymen im Plastid sämtlicher Gewebe herangezogen. Drei transgene Linien, die große Mengen an Acetoacetyl-CoA-Reduktase im Plastid exprimieren (Linien TPSS-Red DEF, MNO1 und STU) wurden mit transgenen Pflanzen, die große Mengen an PHB-Synthase im Plastid erzeugen (Linien TPSS-Syn GHI1, GHI2 und VWX), kreuzbestäubt. Die erhaltenen TPSS-Red/TPSS-Syn-Hybridpflanzen, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase und PHB-Synthase im Plastid exprimieren, erzeugten keine messbaren Mengen an PHB in expandierenden Blättern, wie durch Gaschromatographie analysiert wurde (<20 μg/g Frischgewicht PHB). Zum Vergleich erzeugten transgene Pflanzen, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase und PHB-Synthase in einem ähnlichen Niveau im Zytoplasma bilden, PHB (Y. Poirier, D. E. Dennis, K. Klomparens und C. R. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523; und US-Patentanmeldung SN 07/732,243). Ein möglicher Grund für diesen Unterschied besteht darin, dass Plastide möglicherweise nicht in ausreichendem Maße über 3-Ketothiolase verfügen, um die PHB-Erzeugung zu unterstützen. Dies stimmt damit überein, dass die frühen Stufen des Mevalonat-Stoffwechselweges, die von Acetyl-CoA zu Isopentenylpyrophosphat führen, in differenzierten Plastiden fehlen (K. Kreuz & H. Kleinig, Eur. J. Biochem., Bd. 141 (1984), S. 531-535; G. Schultz & D. Schulze-Siebert, in Biological Role of Plant Lipids, Hrsg. P. A. Biacs, K. Gruiz & T. Kremmer, (Plenum Publishing Corporation, New York, NY) (1989), S. 313-319).
Um einen vollständigen biosynthetischen PHB-Stoffwechselweg in Plastiden sämtlicher Gewebe zu erreichen, wurden transgene A. thaliana-Pflanzen mit einer großen Menge an Thiolase (Bahn TPSS-Thio L) mit den TPSS-Red/TPSS-Syn-Hybriden kreuzbestäubt. Von 5 Kreuzungskombinationen wurde eine Anzahl von Hybriden erhalten, die PHB erzeugen und daher sämtliche 3 Enzyme, die für die PHB-Erzeugung erforderlich sind, aufweisen (TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn-GHI2, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn VWX, TPSS-Thio L/TPSS-Red MNO1/TPSS-Syn VWX). Hybride, die PHB erzeugen, wurden zunächst durch Epifluoreszenzmikroskopie von Geweben, die mit Nilblau A gefärbt waren, identifiziert. Pflanzen mit hohen Fluoreszenzniveaus wiesen höhere Niveaus an PHB auf als Pflanzen mit vergleichsweise niedrigeren Fluoreszenzniveaus. Das in diesen Hybriden erzeugte PHB wurde quantitativ durch Gaschromatographie bestimmt und durch GC-MS-Analyse identifiziert (14, 15). Die Menge an PHB in expandierenden Blättern mit einem Alter von 20 bis 30 Tagen lag im Bereich von 20 μg PHB/g Frischgewicht bis 700 μg PHB/g Frischgewicht (16A). Die Dreifachhybride reicherten weiterhin PHB während der gesamten Lebensdauer der Pflanzen an, so dass in den Blättern von alten Pflanzen die PHB-Niveaus 8- bis 13-fach höher als die Menge in expandierenden Blättern war (d. h. bis zu 7 mg PHB/g Frischgewicht) (16B). Diese Zunahme der PHB-Anreicherung im Laufe der Zeit wurde in Pflanzen mit einem geringen anfänglichen PHB-Gehalt (100 μg/g Frischgewicht in expandierenden Blättern unter Erreichen von 1,1 mg/g in präseneszierenden Blättern) sowie in Pflanzen mit einem hohen anfänglichen PHB-Gehalt (700 μg/g Frischgewicht in expandierenden Blättern unter Erreichen von 7 mg/g Frischgewicht in präseneszierenden Blättern) beobachtet. In einem TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1-Hybrid betrug die maximale Menge an PHB, das in seneszierenden Blättern gemessen wurde, etwa 14 % ihres Trockengewichts (10 mg/g Frischgewicht).
Pflanzen, die PHB im Plastid erzeugten, zeigten Wildtyp-Wachstum und Fruchtbarkeit auch beim höchsten Niveau der PHB-Anreicherung (17). Keine Unterschiede wurden zum Wildtyp in der Geschwindigkeit der Keimung von Samen von Hybriden, die hohe PHB-Niveaus erzeugen, festgestellt. Jedoch konnten Pflanzen, die mehr als 300-400 μg PHB/g Frischgewicht in expandierenden Blättern erzeugten, vom Wildtyp durch visuelle Inspektion während der späteren Wachstumsstadien unterschieden werden. In diesen Pflanzen zeigten die Blätter eine leichte Chlorose nach einem Wachstum von etwa 50-60 Tagen, was zeigt, dass bei sehr hohen Niveaus der PHB-Anreicherung (>3 mg PHB/g Frischgewicht) irgendein Aspekt des Chloroplasten-Stoffwechsels beeinträchtigt sein kann (18).
Eine Transmissionselektronenmikroskopie von Blattproben von PHB erzeugenden Hybriden ergab, dass PHB in Form von Agglomerationen von elektronenleuchtenden Granalien von etwa 0,2 bis 0,7 μm sich anreicherte und von einer dünnen Schicht von elektronendichtem Material umgeben war (19 A). Granalien mit einem ähnlichen Erscheinungsbild wurden für bakterielles PHB (D. G. Lundgren, R. M. Pfister und J. M. Merrick, J. Gen. Microbiol., Bd. 34 (1964), S. 441-446) oder für PHB im Zytoplasma, dem Kern und der Vakuole von Pflanzenzellen (Y. Poirier, D. E. Dennis, K. Klomparens und C. R. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523; und US-Patentanmeldung SN 07/732,243) beschrieben. In Pflanzen, die phb-Enzyme mit Plastid-Zielrichtung exprimieren, waren diese Granalienagglomerationen ausschließlich in den Plastiden positioniert. Dies steht im Gegensatz zu transgenen Pflanzen, die den PHB-Biosyntheseweg im Zytoplasma exprimieren, was zur Anreicherung von PHB im Kern, in der Vakuole und im Zytoplasma, jedoch nicht im Plastid führt (Y. Poirier, D. E. Dennis, K. Klomparens und C. R. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523; und US-Patentanmeldung SN 07/732,243). PHB-Granalien wurden klar von Stärkegranalien in Bezug auf Form, Erscheinungsbild und Organisation der Granalien bei Betrachtung durch ein herkömmliches elektronenmikroskopisches Fixierungsverfahren unterschieden. PHB-Granalien sind kleine, runde, elektronendurchscheinende Granalien, die dichte Agglomerationen bilden (17a). Zum Vergleich handelt es sich bei Stärke um singuläre, elektronendichtere Granalien von Eiform, die von einem diffusen Bereich umgeben sind (19B). In Trihybriden, die nur eine sehr geringe Menge an PHB in expandierenden Blättern erzeugen, ergab sich durch eine elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht alle Chloroplasten PHB angereichert hatten. Der Grund hierfür ist nicht bekannt. Es gab keine Anzeichen für eine differentielle Expression der Transgene in verschiedenen Geweben. Eine Erklärungsmöglichkeit besteht darin, dass dies lediglich die Tatsache wiederspiegelt, dass die elektronenmikroskopische Analyse nur eine Inspektion kleiner Bereiche des gesamten Plastidvolumens ermöglicht. Möglicherweise spiegelt dies auch die Wirkung einer Cosuppression wieder, die zu einem Mosaik einer differentiellen Expression führen kann, wie bei der Petunie festgestellt wurde (R. Jorgensen, Trends in Biotechnology, Bd. 8 (1990), S. 340-344). In alten Blättern von Trihybriden, die hohe Konzentrationen an PHB anreichern, enthielten fast sämtliche Chloroplasten PHB.
Um Erkenntnisse über die Mechanismen zu gewinnen, die für die unterschiedlichen Mengen an PHB, die in den verschiedenen Hybriden erzeugt werden, verantwortlich sind, zu gewinnen, wurde das Niveau der 3-Ketothiolase- und Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität, die in PHB erzeugenden Pflanzen vorhanden ist, in geklärten, rohen Blattproteinextrakten gemessen. Die PHB-Synthase wurde durch Western-Blot-Analyse analysiert. Die 3-Ketothiolase- Aktivität in TPSS-Thio L/TPSS-Red/TPSS-Syn-Hybridpflanzen lag im Bereich von 0,001 bis 0,8 U/mg Protein. Im Gegensatz dazu betrug die 3-Ketothiolase-Aktivität in den parentalen TPSS-Thio L-Pflanzen 0,84 ± 0,15 U/mg Protein. Eine Southern-Blot-Analyse der TPSS-Thio L-Linie ergab 4 Banden, die mit dem phbA-Gen hybridisierten, vermutlich in Entsprechung zu mehreren unabhängigen Integrationen des Konstrukts (12A, TPSS-Thio Bahn 2). Daher kann eine Segregation der verschiedenen pBI-TPSS-Thio-Konstrukte den Bereich von 3-Ketothiolase-Aktivitäten in der F1-Generation verursacht haben. Eine derartige Variation kann leicht unter üblichen Pflanzenzüchtungsverfahren beseitigt werden, um echte Züchtungslinien zu entwickeln, die in Bezug auf die verschiedenen Transgene von Interesse homozygot sind. Die Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität in TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1-Hybridpflanzen lag im Bereich von 0,007 bis 0,78 U/mg Protein. Die Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität im TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1-Hybrid, das als Elternteil bei der Kreuzung mit TPSS-Thio L diente, betrug 2,09 ± 0,23 U/mg Protein. Eine Southern-Blot-Analyse und Analyse des Segregationsverhältnisses des selektierbaren Markers in der F1-Generation zeigte, dass TPSS-Red DEF-Pflanzen das Konstrukt pBI-TPSS-Red an einer einzelnen Integrationsstelle enthalten (12b, TPSS-Red Bahn 1). Eine Western-Blot-Analyse zeigte, dass die reduzierte Aktivität mit einer etwa 10-fachen Verringerung der Proteinmenge in den geklärten Extrakten von PHB erzeugenden Pflanzen korrelierte. Gleichermaßen wiesen auch die PHB erzeugenden Hybridpflanzen TPSS-Thio L/TPSS Red STU/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI2, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn VWX und TPSS Thio L/TPSS-Red MNO1/TPSS-Syn VWX stark variierende und unerwartet niedrige Reduktase-Aktivitäten im Vergleich zu ihren parentalen Pflanzen auf, was mit den geringen Mengen an Protein bei der Western-Blot-Analyse korrelierte. Der Grund für die variable und ungewöhnlich geringe Menge an Reduktase-Aktivität in Trihybriden kann nicht durch Änderungen der Kopienzahl des pBI-TPSS-Red -Konstrukts erklärt werden. Diese Variabilität ist somit auf die Tatsache zurückzuführen, dass sämtliche Transkripte der modifizierten phb-Gene eine gemeinsame Sequenz von 243 bp nämlich die Kodierungsregion des Transitpeptids (TPSS) enthalten (3). Die Erzielung einer Modifikation von einem oder mehreren Thiolase-Genen mit der Kodierungsregion von TPSS könnte andere TPSS enthaltende Gene, wie TPSS-Red, durch den Mechanismus der Cosuppression herunterregulieren (R. Jorgensen, Trends in Biotechnology, Bd. 8 (1990), S. 340-344; G. B. Seymour, G. R. Fray, P. Hill & G. A. Tucker, Plant Mol. Biol., Bd. 23 (1993), S. 1-9). Eine Cosuppression kann auch eine Erklärung dafür liefern, warum bei Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie einige Zellen als mit PHB gefüllt erschienen, während benachbarte Zellen kein PHB aufwiesen. Um daher eine Cosuppression zu vermeiden und die variable und geringe Expression der phb-Gene in PHB erzeugenden Pflanzen zu lindern, sollen sämtliche phb-Gene durch Addition eines unterschiedlichen Transitpeptids für jedes der eingeführten phb-Gene für die Plastid-Zielrichtung modifiziert werden. Es stehen nunmehr Sequenzen für Dutzende von unterschiedlichen, in Chloroplasten lokalisierten Proteinen zur Verfügung, einschließlich die Sequenzen von deren Transitpeptiden. Daher ergeben sich Verfahren zur Verbesserung der vorliegenden Erfindung durch Ersatz eines Teils oder der Gesamtheit der aminoterminalen Transitpeptide in diesem Beispiel durch das Transitpeptid eines normalerweise in Chloroplasten lokalisierten Proteins für den Fachmann in offensichtlicher Weise.
Das Vorliegen von PHB-Synthase wurde durch Western-Blot-Analyse von Blattproteinextrakten von PHB erzeugenden Pflanzen untersucht. In TPSS-Thio/TPSS-Red/TPSS-Syn-Hybridpflanzen konnte PHB-Synthase nie in der löslichen Proteinfraktion nachgewiesen werden. Jedoch war PHB-Synthase leicht im Western-Blot von solubilisierten Membran- und Teilchenfraktionen von Pflanzenextrakten nachweisbar. Im Gegensatz dazu konnte in Pflanzen, die nur mit pBI-TPSS-Syn transformiert waren, PHB-Synthase in der löslichen Fraktion nachgewiesen werden (20). Dieser Befund lässt darauf schließen, dass PHB-Synthase eng mit den PHB-Granalien, die in Pflanzen gefunden werden, assoziiert ist, wie für die PHB-Synthase in Bakterien gezeigt wurde (T. Fukui, A. Yoshimoto, M. Matsumoto, S. Hosokawa, T. Saito, H. Nishikawa & K. Tomita, Arch. Microbiol., Bd. 110 (1976), S. 149-156, G. W. Haywood, A. J. Anderson und E. A. Dawes FEMS Microbiol. Lett., Bd. 57 (1989), S. 1-6).
Im allgemeinen hatten transgene Pflanzen mit den höchsten Niveaus sowohl an 3-Ketothiolase- als auch an Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivitäten die höchsten Niveaus an PHB, und Pflanzen mit niedrigen Niveaus beider Aktivitäten hatten die niedrigsten Niveaus an PHB. Es bestand kein offensichtliches Plateau der PHB-Erzeugung bei den höchsten Niveaus von messbarer Enzymaktivität. Es hatte daher den Anschein, dass die PHB-Anreicherung durch den Betrag der Enzymaktivität und nicht durch die Verfügbarkeit von Acetyl-CoA begrenzt war. Daher sollte es möglich sein, die Menge des in transgenen Pflanzen erzeugten PHB über die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebene Menge hinaus zu steigern, indem man die Menge der verschiedenen phb-Enzyme, die in Pflanzen erzeugt werden, erhöht. Ein Weg, um dies zu erreichen, besteht darin, die Erscheinung der Cosuppression von modifizierten phb-Genen, die das gleiche Transitpeptid aufweisen (zur Zielrichtung auf das Plastid), zu vermeiden, indem man eine unterschiedliche Plastid-Zielrichtungssequenz für jedes der in Pflanzen eingeführten phb-Gene verwendet. Ferner kann es möglich sein, die Menge der in transgenen Pflanzen erzeugten phb-Enzyme zu erhöhen, indem man starke Promotoren verwendet, die zu einem höheren Expressionsniveau führen, als es mit den CaMV- oder CRB-Promotoren, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, möglich war. Da die Codonverwendung der bakteriellen Codierungssequenzen der phb-Gene für höhere Pflanzen nicht typisch ist, sollte es ferner möglich sein, die Expression der Enzyme durch Veränderung der Kodierungssequenz der bakteriellen Gene zu erhöhen, so dass die Aminosäuresequenz durch Codons kodiert wird, deren Verwendung durch höhere Pflanzen, in denen die Gene zu exprimieren sind, am gebräuchlichsten ist.
Zusammengefasst, Pflanzen, die zur Expression des PHB-Biosynthesewegs in ihren Plastiden manipuliert sind, reichern PHB in großen Mengen an. Durch Veränderung des Orts der PHB-Erzeugung aus einem zellulären Kompartiment mit einem geringen Fluss durch Acetyl-CoA (Zytoplasma) zu einem Kompartiment mit einem hohen Fluss durch Acetyl-CoA (Plastid) wurde das maximale Niveau der PHB-Erzeugung bis zum 100-fachen erhöht (von etwa 100 μg pro Gramm Frischgewicht für die zytoplasmatische Expression gemäß den Angaben von Y. Poirier, D. E. Dennis, K. Klomparens und C. R. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523; und US-Patentanmeldung SN-07/732,243, bis zu etwa 10 mg pro Gramm Frischgewicht für die Plastidexpression gemäß den Angaben in der vorliegenden Anmeldung). Pflanzen, die hohe Niveaus an PHB in den Plastiden erzeugen, verhielten sich in Bezug auf Wachstum und Vitalität normal. Dies zeigt, dass PHB für Pflanzen nicht toxisch ist und dass es offensichtlich keine biologische Barriere für die PHB-Erzeugung in Plastiden gibt. Eine Verarmung von Metaboliten aus wesentlichen Stoffwechselwegen des Zytoplasmas scheint der Grund für den nachteiligen Einfluss der PHB-Erzeugung in Pflanzen, die PHB-Enzyme im Zytoplasma exprimieren, zu sein (Y. Poirier, D. E. Dennis, K. Klomparens und C. R. Somerville, Science, Bd. 256 (1992), S. 520-523 und US-Patentanmeldung SN-07/732,243). Da jedoch PHB-Granalien sich auch im Kern befinden, könnte es möglich sein, dass die Wechselwirkung der PHB-Granalien mit Kernbestandteilen ebenfalls eine Ursache des nachteiligen Einflusses der PHB-Erzeugung in diesen Pflanzen war.
Eine ähnliche Analyse wird zukünftig mit transgenen Pflanzen durchgeführt, die die modifizierten phb-Gene unter der Kontrolle des samenspezifischen Promotors CRB exprimieren. Mit pBIB-KCN-Red transformierte Pflanzen, die eine erhebliche Menge an Acetoacetyl-CoA-Reduktase im Plastid von sich entwickelnden Samen erzeugen, werden mit Pflanzen, die mit pBIB-HCN-Syn transformiert sind und eine erhebliche Menge an PHB-Synthase im Plasmid von sich entwickelnden Samen bilden, kreuzbestäubt. Die erhaltenen Hybride werden auf die PHB-Erzeugung in den Samen durch GC-MS-Analyse und Elektronenmikroskopie analysiert. Da es nicht offensichtlich ist, dass die Menge an endogenem Acetoacetyl-CoA im Plastid des sich entwickelnden Samens ausreicht, um eine PHB-Erzeugung zu ermöglichen, wird die 3-Ketothiolase, die in Bezug auf eine Plastid-Zielrichtung im Plastid des sich entwickelnden Samens modifiziert ist, eingeführt, um ein Trihybrid zu schaffen. Um ein Trihybrid zu schaffen, das sämtliche drei Enzyme erzeugt, werden Reduktase/Synthase-Doppelhybride mit transgenen Pflanzen, die 3-Ketothiolase im Plastid der sich entwickelnden Samen exprimieren, kreuzbestäubt. Die große Menge an in den Samen der erhaltenen Thiolase/Reduktase/Synthase-Trihybride erzeugtem PHB wird durch GC-MS und Elektronenmikroskopie analysiert.
Dieses Verfahren zur Erzeugung von PHB in Plastiden ist nicht auf die Verwendung von hybriden Pflanzen, die durch Kreuzen verschiedener transgener Linien erzeugt worden sind, beschränkt. Eine bevorzugte alternative Anwendung dieses Verfahrens besteht darin, sämtliche 3 Gene an einem kolinearen DNA-Molekül zur simultanen Einführung in die Wirtspflanze zu platzieren. Es kommt ferner in Betracht, dass das allgemeine Verfahren zur Herbeiführung der hier beschriebenen hohen Niveaus der PHB-Erzeugung ein allgemein auf alle höheren Pflanzen anwendbares Verfahren darstellt und dass geringfügige Modifikationen der Verfahren, die zur Einführung der Gene und zur Herbeiführung ihrer Expression und zum Transport der Proteine in die Plastide in anderen Spezies von höheren Pflanzen erforderlich sind, für den Fachmann offensichtlich sind.
Materialien und Methoden
Konstruktion von DNA-Rekombinanten
E. coli Stamm DH5α, der Plasmide enthält, wurde in LB-Brühe, die mit Kanamycin (50 μg/ml) oder Ampicillin (50 μg/ml) ergänzt war, gezüchtet. Präparationen von Plasmid-DNA wurden durch das alkalische Lysisverfahren gemäß den Angaben von J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), durchgeführt und gegebenenfalls wurde eine Reinigung mit den "magic mini"-DNA-Affinitätssäulen (Promega Corp., WI) vorgenommen. Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsendonucleasen gemäß den Empfehlungen der Hersteller gespalten (New England Biolabs, Mass; Promega Corp., WI; Boehringer Mannhein Biochemicals, IN; StrataGen, CA), durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung gemäß den Angaben von J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), sichtbar gemacht. Die DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel durch ein Einfrier-Auftau-Verfahren und Phenolextraktion gewonnen. Kurz zusammengefasst, das Agarosefragment wird mit einer Rasierklinge in sehr kleine Stücke geschnitten, mit dem gleichen Volumen an Phenol (hergestellt gemäß den Angaben in J. Sambrook, E. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) versetzt und gründlich aufgewirbelt. Die Suspension wird 2-mal eingefroren und aufgetaut und anschließend zentrifugiert. Der das Fragment enthaltende Überstand wird ferner durch Phenol-Chloroform-Extraktionen und Ethanolfällung gereinigt. In einigen Experimenten wurden die versetzten 3'-Termini von DNA-Fragmenten mit T4-DNA-Polymerase gemäß dem Verfahren von J. Sambrook, E. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), in stumpfe Enden umgewandelt. Eine Ligation von DNA-Fragmenten mit kohäsiven oder stumpfen Enden wurde 16 Stunden bei 14 °C in Puffer mit einem Gehalt an 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 5 mM MgCl₂, 5 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol 8000, 0,5 mM ATP und 5 mM Dithiothreit gemäß den Angaben von J. Sambrook, E. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), durchgeführt. Eine Fraktion des Ligationsreaktionsgemisches wurde durch das Rubidiumchlorid-Verfahren gemäß den Angaben von D. Hanahan, J. Mol. Biol., Bd. 166 (1983), S. 557-580, übertragen. Die transformierten Bakterien wurden auf Agarplatten mit einem Gehalt an LB-Brühe und entweder 50 μg/ml Kanamycin oder 50 μg/ml Ampicillin ausgestrichen. Die Präparation von radioaktiv markierten DNA-Sonden und die Hybridisierung werden in einem nachstehenden Abschnitt beschrieben.
Oligonucleotide wurden von der biochemischen Abteilung der Michigan State University synthetisiert.
Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) wurden unter Verwendung eines Perkin-Eimer Cetus DNA-Thermocyclers (Perkin-Eimer, CT) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt 200 pmol von 2 Oligonucleotid- PCR-Primern (Tabelle 1), 200 ng Plasmid (Tabelle 1) und 2,5 Einheiten Vent-Polymerase unter vom Hersteller empfohlenen Pufferbedingungen (New England Biolabs Inc., Mass.). Nachstehend ist das DNA-Thermocyclerprogramm für die Amplifikationen der bakteriellen PHB-Enzyme angegeben: 4 min bei 95 °C, 30 Zyklen der Sequenz: 1,5 min bei 97 °C – 2 min bei 65 °C – 3 min bei 72 °C und schließlich 7 min bei 72 °C. Für das TPSS-Fragment: 4 min bei 95 °C, 30 Zyklen der Sequenz: 1,5 min bei 95 °C – 2 min bei 60 °C – 2 min bei 72 °C und schließlich 7 min bei 72 °C. Für den CRB-Promotor: 4 min bei 95 °C, 30 Zyklen der Sequenz: 1,5 min bei 95 °C – 2 min bei 58 °C – 2 min bei 72 °C und schließlich 7 min bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden auf die vorstehend beschriebene Art und Weise durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert und gereinigt.
Extraktion und Restriktionsendonuclease-Spaltung von genomischer DNA
Wildtyp- und transgene Pflanzen wurden 2-3 Wochen in Erdreich gezüchtet. Etwa 5 g Blattmaterial wurde gewonnen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Hochmolekulare DNA wurde aus den gefrorenen Pflanzengeweben gemäß den Angaben von S. C. Rogers und A. J. Bendich, Plant Molecular Biology Manual, A6 (1988), S. 1-10, extrahiert. Eine Restriktionsendonuclease-Spaltung mit dem Enzym HindIII an 1 μg DNA wurde unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt (New England Biolabs Inc., Mass.).
Agarose-Gelelektrophorese und Hybridisierungsverfahren
Die DNA-Analyse durch Agarose-Gelelektrophorese und die Übertragung auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham II) wurden unter Anwendung eingeführter Verfahren gemäß Southern et al. (1975) und J. Sambrook, E. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), durchgeführt. Spezifisch klonierte DNA-Fragmente, die als Sonden zu verwenden sind, wurden aus dem Vektor mit entsprechenden Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten. Die Inserts wurden vom Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution gereinigt. Fragmente wurden mit 32P-Desoxyribonucleotiden durch das statistische Primererweiterungsverfahren unter Verwendung von Hexameren gemäß den Angaben von A. P. Feinberg und B. Volgelstein, Anal. Biochem., Bd. 132 (1983), S. 6-13, markiert. Nylonfilter wurden gemäß den Angaben von Y. Poirier und P. Jolicoeur, J. Virol., Bd. 63 (1989), S. 2088-2098, mit markierten Sonden hybridisiert und auf einen Film gelegt.
Konstruktion von Fusionsproteinen und Bildung von Antikörpern
Zur Bildung von Antikörpern gegen 3-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase und PHB-Synthase von A. eutrophus wurden Fusionsproteine mit dem Maltose-Bindungsprotein malE von E. coli unter Verwendung des pIH821-Vektors (New England Biolabs Inc., Mass) konstruiert. Das MALE-Thiolase-Fusionsprotein wurde durch Reinigen des 1,2 kbp-XholI-EcoRI-Fragments des pUC-Thio-Plasmids konstruiert (C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN-07/732,243), wobei die Enden durch T4-DNA-Polymerase aufgefüllt wurden und eine Klonierung in pIH821 vorgenommen wurde. Der Vektor war durch Verdau mit XbaI und Auffüllen am Ende mit T4-DNA-Polymerase hergestellt worden. Klone, die das Insert in der angestrebten Orientierung tragen, enthalten die Genfusion in der Weise, dass der Leseraster korrekt ist, um die MALE-Thiolase-Fusion zu erhalten. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pmaIE-Thio.
Um das MALE-Reduktase-Fusionsprotein zu erhalten, wurde das pUC-Red – Plasmid (C. R. Somerville, Y. Poirier und D. E. Dennis, US-Patentanmeldung SN 07/732,243) mit DdeI und SacI verdaut. Nach Reinigung des 0,7 kbp-Fragments wurden die Enden mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Das stumpfendige Fragment wurde in den XbaI-verdauten und stumpfendigen pIH821-Vektor gemäß den vorstehenden Angaben kloniert. Der Klon, der das Fragment in der exakten Orientierung für die Expression der MALE-Reduktase enthielt, wurde als pmaIE-Red bezeichnet.
Für die Konstruktion des MALE-Synthase-Fusionsproteins wurde pUC-Syn mit NcoI verdaut und die Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Anschließend wurde das Plasmid mit HindIII verdaut. Das 1,6 kbp-Fragment wurde in pIH821 kloniert. Der Vektor war durch Verdau mit XbaI und Auffüllen am Ende mit T4-DNA-Polymerase und anschließenden Verdau mit HindIII hergestellt worden. Die Klone erhielten die Bezeichnung pmaIE-Syn.
Die pmaIE-Thio, -Red und -Syn-Plasmide wurden in DH5α transformiert. Die Fusionsproteine wurden gemäß den Angaben des Herstellers (New England Biolabs Inc., Mass) exprimiert und gereinigt. Die Fusionsproteine wurden Kaninchen injiziert, um polyklonale Antikörper zu erzeugen, wobei Freund-Adjuvans als Immunostimulanz verwendet wurde.
Test auf 3-Ketothiolase-Aktivität
Gefrorene Blattproben (0,1 g) wurden in 200 μl eiskaltem Thiolase-Puffer mit einem Gehalt an 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 40 mM MgCl₂ und 5 mM (3-Mercaptoethanol homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g geklärt. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen übertragen. Der Proteinanteil des Extrakts wurde mit dem Bradford-Test unter Verwendung der Proteintestpackung von Bio Rad (Bio Rad Laboratories, CA) gemessen. 3 bis 30 μg Pflanzenproteinextrakt wurden pro Test eingesetzt. Die Aktivität des 3-Ketothiolase-Enzyms in verschiedenen Extrakten wurde gemäß dem Verfahren von P. J. Senior, und E. A. Dawes, Biochem. J., Bd. 134 (1973), S. 225-238, bestimmt.
Test auf Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität
Gefrorene Blattproben (0,1 g) wurden in 200 μl eiskaltem Reduktase-Puffer mit einem Gehalt an 100 mM KH₂PO₄ (pH-Wert 5,5), 0,02 mM MgCl₂ und 4,0 mM β-Mercaptoethanol homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g geklärt. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen übertragen. Der Proteinanteil des Extrakts wurde gemäß dem Bradford-Test unter Verwendung der Proteintestpackung von Bio Rad gemessen. 0,8 bis 10 μg Pflanzenproteinextrakt wurden pro Test eingesetzt. Die Aktivität des Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Enzyms wurde gemäß dem Verfahren von P. J.
Senior, und E. A. Dawes, Biochem. J., Bd. 134 (1973), S. 225-238, bestimmt.
Western-Biot-Analyse
Für die Western-Blot-Analyse wurden rohe Proteinextrakte, die gemäß den vorstehenden Angaben für die Tests auf die Enzymaktivität hergestellt worden waren, verwendet. Für die Analyse der Expression von PHB-Synthase wurden gefrorene Blattproben (0,1 g) in 200 μl eiskaltem Puffer mit einem Gehalt an 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 5 mM EDTA und 4 mM β-Mercaptoethanol homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g geklärt. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen übertragen. Bei einigen Experimenten wurden die Membran- und Teilchenfraktionen teilweise im Extraktionspuffer mit einem Gehalt an 1 % SDS in Lösung gebracht und erneut durch Zentrifugation geklärt. Der Proteingehalt dieser Proben wurde nach einem modifizierten Lowry-Verfahren (M. A. K. Markwell, M. Haas, L. L. Bieber und N. E. Tolbert, Anal. Biochemistry, Bd. 87 (1978), S. 206-210) gemessen.
Aliquotanteile der Überstände wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gemäß Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680-685, aufgetrennt. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Western-Blot-Analyse wurde gemäß den Empfehlungen im ECL Western-Bloting-Verfahren (Amersham International plc, Amersham UK) durchgeführt. Für die Blockierung der Filter wurde TBS (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 137 mM NaCl) mit 5 % fettfreiem Milchpulver/0,12 % Tween 20 gewählt. Der erste Antikörper wurde vor Inkubation der Filter in Blockierungslösung 1:1 000 verdünnt. Die Antikörperreaktion wurde durch das ECL Western-Blotting-Nachweissystem (Amersham International plc, Amersham, UK) nachgewiesen.
Analyse von Polyhydroxybutyrat
Für gaschromatographische Analysen wurden 20-100 mg Blattmaterial 3-4-mal mit 50 % Ethanol und anschließend 45 Minuten bis 1 Stunde bei 55 C mit 100 % Methanol extrahiert. Trockene Rückstände wurden bei 55 °C mit 0,5 ml Chloroform mindestens 12 Stunden extrahiert und 4 bis 6 Stunden in 0,8 M HCl in Ethanol bei 100 °C umgeestert. Nach Extraktion mit 0,9 M NaCl wurde die Chloroformphase an einem Hewlett Packard 5890-Series II-Gaschromatograph analysiert. Bakterielles PHB (Sigma) wurde als Standard verwendet. Um die PHB-Granalien durch Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, wurden Blattproben in 2 % Glutaraldehyd in 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 2 Stunden fixiert. Gewebe wurde in Wasser gespült und 5 Minuten in 1 % Nilblau A gefärbt. Sodann wurden die Gewebe mehrmals in Wasser gespült und 1 Minute in 8 % Essigsäure eingeweicht und schließlich einer letzten Spülung mit Wasser unterworfen. PHB-Granalien wurden durch Epifluoreszenzmikroskopie bei einer Anregungswellenlänge von 546 oder 565 nm sichtbar gemacht (A. G. Ostle und J. G. Holt, Appl. Environ. Microbiol., Bd. 44 (1982), S. 238-241).
Transmissionselektronenmikroskopie
Gewebeproben wurden in 0,8 % Glutaraldehyd/2 % Paraformaldehyd in 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 2 Stunden unter leichtem Vakuum fixiert. Nach 4 Waschvorgängen mit Phosphatpuffer wurden die Proben 40 bis 60 Minuten mit 1 % Osmiumtetroxid behandelt. Die Proben wurden in einer abgestuften Ethanolserie dehydratisiert und in Spurr-Harz (Ted Pella Inc.) eingebettet. Schnitte von 80-90 nm wurden vorgenommen, auf Kupfernetze gelegt und 30-45 Minuten mit 5 % Uranylacetat gefärbt. Anschließend wurde eine 3- bis 4-minütige Färbung mit Reynold-Bleicitrat durchgeführt. Die Schnitte wurden in einem JEOL100CX II-Transmissionselektronenmikroskop, das mit 80 kV betrieben wurde, betrachtet.
Obgleich das hier beschriebene erfindungsgemäße spezielle Beispiel die Pflanzen Arabidopsis thaliana, Gene von Alcaligenes eutrophus und ein Transitpeptid der Erbse betrifft, ist die Erfindung allgemein anwendbar. Die Ansprüche, die sich auf die Herstellung von Poly-D-(-)-3-hydroxybutyrat und/oder Polyhydroxyalkanoat in den Plastiden von Pflanzen beziehen, sind nicht auf Arabidopsis thaliana beschränkt oder speziell mit der Verwendung von Genen aus Alcaligenes eutrophus oder des beschriebenen Transitpeptids für die Plastid-Zielrichtung verbunden. Die nachstehenden Ansprüche beschreiben ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten im Plastid von Pflanzen durch Einführung von fremdem DNA-Material in Pflanzenzellen.
Folgende Verbesserungen lassen sich erfindungsgemäß erzielen:

1 – Transformation von Pflanzenzellen mit fremdem DNA-Material, das für Informationen kodiert, die zur Erzeugung eines Enzyms mit 3-Ketothiolase-Aktivität im Plastid führen. Der Ausdruck "fremdes DNA-Material" bezieht sich auf DNA-Material, das normalerweise in einem Organismus nicht vorhanden ist, das aber in eine Zelle eingeführt wird und entweder integriert im Chromosom sitzt oder in extrachromosomaler Form vorliegt. Eine Zunahme an 3-Ketothiolase-Aktivität in den Plastiden von Pflanzenzellen ergibt sich durch die Einführung von fremdem DNA-Material in Pflanzenzellen.
2 – Transformation von Pflanzenzellen mit fremdem DNA-Material, das für Informationen kodiert, die zur Erzeugung eines Enzyms mit Acetoacetyl-CoA- Reduktase-Aktivität in den Plastiden führen. Eine Zunahme an Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität in den Plastiden ergibt sich aus der Einführung von fremdem DNA-Material in Pflanzenzellen.
3 – Transformation von Pflanzenzellen mit fremdem DNA-Material, das zur Erzeugung von Hydroxyacyl-CoA, das für die Pflanzenzelle ein Fremdmaterial darstellt, in den Plastiden führt. Transformation von Pflanzenzellen mit fremdem DNA-Material, das zur Erzeugung eines erhöhten Niveaus an Hydroxyacyl-CoA in den Plastiden von Pflanzenzellen führt.
4 – Transformation von Pflanzenzellen mit fremdem DNA-Material, das für Informationen kodiert, die zur Erzeugung eines Enzyms mit der Fähigkeit zur Polymerisation von Hydroxyacyl-CoA von Pflanzenzellen in den Plastiden führt. Eine Zunahme einer Enzymaktivität, die zur Polymerisation von Hydroxyacyl-CoA in den Plastiden von Pflanzenzellen führt, ergibt sich aus der Einführung von fremdem DNA-Material in Pflanzenzellen.
5 – Erzeugung eines Polyhydroxyalkanoats, einschließlich Poly-D-(-)-3-hydroxybutyrat, in den Plastiden von Pflanzenzellen durch Einführung von fremdem DNA-Material in Pflanzenzellen.
6 – Die Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat in den Plastiden von Pflanzenzellen erfolgt vorzugsweise auf einem Niveau von mehr als 2 μg Polyhydroxyalkanoat pro Gramm frisches Pflanzenmaterial.
7 – Die Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat in Plastiden erfolgt vorzugsweise auf einem Niveau von mehr als 2 μg Polyhydroxyalkanoat pro Gramm frischem Pflanzenmaterial in beliebigen Pflanzenzellen, bei denen es möglich ist, fremdes DNA-Material einzuführen.
8 – Die Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat in den Plastiden von hybriden Pflanzen erfolgt vorzugsweise auf einem Niveau von mehr als 2 μg Polyhydroxyalkanoat pro Gramm frischem Pflanzenmaterial, das sich aus einer Kreuzbestäubung zwischen zwei parentalen Pflanzenlinien ergibt, die mit fremdem DNA-Material transformiert worden sind, die aber selbst in den Plastiden kein Polyhydroxyalkanoat bilden oder Polyhydroxyalkanoat in einem niedrigeren Niveau als in der hybriden Pflanze bilden.
9 – Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat in Form von Granalien im Inneren der Plastide von Pflanzenzellen.

Samen, die Gene der 3 und 4 enthalten, werden bei der Michigan State University, East Lansing, Michigan, aufbewahrt.
Die vorstehende Beschreibung dient lediglich der Erläuterung der Erfindung. Die Erfindung ist nur durch die nachstehenden Patentansprüche beschränkt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transgenes Pflanzenmaterial mit Plastiden, wobei das Pflanzenmaterial dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein erstes Gensegment, das für ein modifiziertes 3-Ketothiolase-Gen zum Abzielen auf das Plastid der Pflanze kodiert, ein zweites Gensegment, das für ein modifiziertes Acetoacetyl-CoA-reduktase-Gen zum Abzielen auf das Plastid der Pflanze kodiert, und ein drittes Gensegment, das für ein modifiziertes Polyhydroxybutyrat (PHB)-synthase-Gen zum Abzielen auf das Plastid der Pflanze kodiert, enthält, wobei die Gensegmente die Bildung von Polyhydroxyalkanoat (PHA) im Plastid der Pflanze ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass jedes einzelne Gen eine Kodierungssequenz für ein Transitpeptid aufweist und die einzelnen Transitpeptide unterschiedlich sind.
Pflanzenmaterial nach Anspruch 1, wobei es sich beim PHA um Polyhydroxybutyrat (PHB) handelt und wobei die Kodierungssequenz der DNA und RNA für die 3-Ketothiolase wie in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, für die Acetoacetyl-CoA-reduktase wie in SEQ ID NO:2 gezeigt ist und für die PHA-Synthase wie in SEQ ID NO:3 gezeigt ist.
Pflanzenmaterial nach Anspruch 1 oder 2 als Embryo, Samen oder Propagulum des Samens.