DE69434998T2

DE69434998T2 - Topologisch getrennte, kodierende Festphasen-Bibliotheken

Info

Publication number: DE69434998T2
Application number: DE69434998T
Authority: DE
Inventors: Michal Lebl; Kit S. Tucson Lam; Sudney E. Tucson Salmon; Victor Krchnak; Nikolai Sepetov; Peter Kocis
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2014-05-28
Also published as: PT705279E; DE69434998D1; ATE366741T1; AU7048694A; ATE232882T1; NZ267843A; JP3394777B2; DE69432147D1; EP0705279B1; EP0705279A1; CA2163637A1; WO1994028028A1; US6090912A; ES2289194T3; ES2204921T3; CA2163637C; DK1310510T3; DK0705279T3; DE69432147T2; EP0705279A4

Description

1. TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Bibliotheken aus an in separater Phase vorliegende Syntheseträger gebundenen synthetischen Testverbindungen. Insbesondere betrifft die Erfindung Bibliotheken aus an in separater Phase vorliegende Syntheseträger gebundenen synthetischen Testverbindungen, die auch codierende polymere Sequenzen enthalten, welche für die Struktur der synthetischen Testverbindung codieren. Die Festphasensyntheseträgerkügelchen enthalten jeweils eine einzige Art synthetische Testverbindung sowie eine einzige, einmalige und leicht bestimmbare codierende polymere Sequenz, die für die Struktur der synthetischen Testverbindung codiert. Dabei kann die synthetische Testverbindung Grundgerüststrukturen mit Verknüpfungen, wie beispielsweise Amid-, Harnstoff-, Carbamat- (d.h. Urethan-), Ester-, Amino-, Sulfid-, Disulfid- oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verknüpfungen, die beispielsweise Alkan- und Alkenverknüpfungen, oder einer beliebigen Kombination daraus, aufweisen. Ebenso kann es sich bei der synthetischen Testverbindung um molekulare Gerüste handeln, wie beispielsweise Derivate monocyclischer oder bicyclischer Kohlenhydrate, Steroide, Zucker, heterocyclische Strukturen, polyaromatische Strukturen oder andere Strukturen, die als Gerüst fungieren können. Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren zur Synthese derartiger Bibliotheken sowie die Verwendung derartiger Bibliotheken zur Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen von Interesse aus der Bibliothek synthetischer Testverbindung.
2. STAND DER TECHNIK
Fast alle biologischen Vorgänge, einschließlich Immunerkennung, zelluläre Signalgebung und Kommunikation, Transkription und Translation, intrazelluläre Signalgebung sowie enzymatische Katalyse, werden durch Ligandenerkennung und -bindung reguliert. Daher besteht im Fachgebiet seit langem ein Interesse an der Identifizierung von Molekülen, die sich wie folgt nutzen lassen: zur Verwendung als Agonisten oder Antagonisten von Liganden, wie beispielsweise Hormonen, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmittern; zur Induktion der B-Zellen-(antikörpervermittelten) oder T-Zellen-(zellvermittelten) Immunität; zur Induktion der Katalyse chemischer Reaktionen und zur Regulation der Genexpression auf der Transkriptions- oder Translationsebene. Ein Hauptgrund für dieses Interesse besteht in dem Wunsch einer direkten Verwendung dieser biologisch aktiven Moleküle als Arzneistoffe oder, falls notwendig, einer Umwandlung dieser Moleküle zu Derivaten, die als Arzneistoffe wirken können.
Bei vielen biologischen Liganden handelt es sich um Proteine oder Peptide. Zu dieser Aufzählung gehört die Mehrzahl der Hormone, Wachstumsfaktoren, neuroaktiven Moleküle und Immunepitope. Daher beinhalteten erste Ansätze zur Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten rezeptor- oder enzymvermittelter biologischer Aktivitäten die Konstruktion und Synthese von Peptiden. Allerdings sind Peptide, bei denen wünschenswerte biologische Aktivitäten festgestellt wurden, häufig als Arzneistoffe ungeeignet. Um zu Arzneistoffen zu werden, müssen die Peptide häufig zu Derivaten oder Strukturanalogen, d.h. Peptidmimetika, umgewandelt werden, welche im Gegensatz zu den meisten Peptiden zufrieden stellende pharmakokinetische und Stabilitätseigenschaften besitzen. Es sind viele Veröffentlichungen schienen, die die Entwicklung medizinisch geeigneter oder vielversprechender Peptidomimetika beschreiben; zu jüngeren Veröffentlichungen dieser Art gehören beispielsweise Rudy Baum, in Chemical & Engineering News, 18. Januar, 1993, Seite 33; Hirschmann, R. et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 9699-9701; Hirschmann, R. et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 9217-9218.
Die Entdeckung biologisch aktiver Verbindungen kann sich schwierig, zeitraubend und äußerst kostenintensiv erweisen. Ein Hauptproblem auf diesem Gebiet besteht in der Identifizierung einer einzelnen chemischen Struktur aus einer großen Anzahl möglicher relevanter Strukturen, die die gewünschten Eigenschaften besitzt. Wird bei dem Entdeckungsverfahren eine Abfolge von Strategien von Strukturentwurf, Synthese und biologischem Testen eingesetzt, so wird die Identifizierung einer wünschenswerten chemischen Struktur äußerst arbeitsaufwendig. Zur Umgehung dieser hohe Anforderungen stellenden Aufgabe lassen sich Bibliotheken mit einer großen Anzahl von Molekülen verschiedener Strukturen herstellen. Idealerweise können solche Bibliotheken schnell durchsucht und bewertet werden.
Ein Großteil der Arbeit auf diesem Gebiet der Bibliothekssynthese und -suche wurde mit Peptiden durchgeführt, beispielsweise bei den Ansätzen von Geysen (Geysen et al., Molecular Immunology, 1986, 23, 709-715; Geysen et al., J. Immunologic Methods, 1987, 102, 259-274), Fodor (Fodor et al., Science, 1991, 251, 767-773) und Houghten (Houghten et al., Nature, 1991, 354, 84-86). Allerdings sind derartige Bibliotheken hinsichtlich der Anzahl möglicher Strukturvarianten, die hergestellt, getestet und in einem gegebenen Experiment identifiziert werden können, beschränkt.
Die Erfindung echter Zufallsbibliotheken polymerer synthetischer Testverbindungen, bei denen eine aus einer Kombination von Untereinheiten entstandene einzelne Polymerspezies an einen einzelnen festen Träger gebunden wird, bezeichnete einen Durchbruch bei der Entdeckung biologisch aktiver Verbindungen, bei denen es sich um Peptide oder in ganz wichtiger Weise um Peptidmimetika handelt (siehe die Anmeldung WO-A-9200091 ).
Nichtpeptidische organische Verbindungen, wie beispielsweise Peptidmimetika, sind häufig in der Lage, Peptidliganden hinsichtlich der Affinität für einen bestimmten Rezeptor oder ein bestimmtes Enzym zu übertreffen. So beinhaltet die stärkste jemals aufgezeichnete Bindung, nämlich die von Biotin und Avidin, die Anlagerung einer nichtpeptidischen organischen Struktur (Biotin) an ein Protein (Avidin). Eine wirksame Strategie zur raschen Identifizierung hochaffiner biologischer Liganden und damit letztendlich neuer und wichtiger Arzneistoffe erfordert die schnelle Konstruktion und das schnelle Absuchen verschiedenartiger Bibliotheken nichtpeptidischer Strukturen, die verschiedene Struktureinheiten enthalten, die zur Realisierung einer oder mehrerer Arten von Wechselwirkungen mit einem biologischen Akzeptor (z.B. einem Rezeptor oder Enzym) in der Lage sind, wie beispielsweise Wasserstoffbrückenbindungen Salzbrücken, π-Komplexierung, hydrophobe Effekte usw. Allerdings stecken die Arbeiten an der Erzeugung sowie der Absuche von nichtpeptidische Moleküle enthaltenden Bibliotheken synthetischer Testverbindungen noch in ihren Anfängen. Ein Beispiel aus diesem Gebiet ist die Arbeit von Ellman und Bunin an einer kombinatorischen Synthese von Benzodiazepinen auf einem festen Träger (J. Am. Chem. Soc. 114, 10997, (1992); siehe Chemical and Engineering News, 18. Januar, 1993, Seite 33).
Ein bislang nicht gelöstes Hauptproblem auf dem Gebiet der Erzeugung und Verwendung nichtpeptidischer Bibliotheken besteht in der Aufklärung der Struktur von aus einer Bibliothek ausgewählten Molekülen, die eine viel versprechende biologische Aktivität zeigen.
Kürzlich wurde von Brenner und Lerner (Brenner, S. und Lerner, R.A. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5381-5383) ein Versuch zur Aufdeckung der Strukturen von aus einer Bibliothek ausgewählten Peptiden beschrieben, bei dem einmalige Nukleotidsequenzcodes, die parallel zur Peptidbibliothek synthetisiert werden, verwendet werden. Die Nukleotidsequenz des jeweils zum Peptid gehörenden Codes muss über die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizierbar sein. Allerdings sind die Nukleotidsynthesetechniken nicht mit allen für die Synthese vieler Arten von Molekülbibliotheken benötigten Synthesetechniken kompatibel. Weiterhin wird dieser Ansatz auch durch die enge Nachbarschaft von Nukleotid und synthetischer Testverbindung in der Bibliothek, die zu Wechselwirkungen zwischen diesen Molekülen führen kann, wodurch die Bindung des Liganden mit einem Zielrezeptor oder Enzym während des biologischen Tests gestört wird, eingeschränkt. Die Nukleotidkomponente der Bibliothek kann auch auf verschiedene andere Weisen während biologischer Tests stören.
Dower et al. ( WO 93/06121 ) betrifft ein stochastisches Verfahren zur Synthese von Bibliotheken aus Zufallsoligomeren. Die Zufallsoligomere werden dabei auf festen Trägern bzw. Partikeln synthetisiert, können jedoch von diesen Trägern abgespalten werden, um so eine lösliche Bibliothek bereitzustellen. Die Oligomere setzen sich aus einer Abfolge von Monomeren zusammen, wobei es sich bei den Monomeren um beliebige Mitglieder des Satzes von Molekülen, die unter Bildung eines Oligomers oder Polymers zusammengefügt werden können, d.h. Aminosäuren, Carbamate, Sulfone, Sulfoxide, Nukleoside, Kohlenhydrate, Harnstoffe, Phosphonate, Lipide, Ester, Kombinationen daraus und dergleichen, handelt. Zur Identifizierung der Abfolge von Monomeren im Oligomer wird ein Identifizierungs-Tag verwendet. Dabei kann das Identifizierungs-Tag irgendein erkennbares Merkmal sein, das auf irgendeine Weise die benötigte Information trägt und die auf dem Niveau eines oder einiger weniger festen Träger entziffert werden kann. Die festen Träger können mit den Oligomeren und dem Identifizierungs-Tag mittels einem oder mehrerer Linker-Moleküle verbunden werden.
Von Kerr et al. (J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 2520-2531) wurde über die Synthese von Lösungsphasenbibliotheken von Peptiden mit nichtnatürlichen Aminosäureresten parallel zu peptidcodierenden Strängen berichtet. Der Peptidligand und sein codierender Strang sind in dieser Bibliothek kovalent miteinander verbunden, was die paarweise Isolierung und Sequenzbestimmung der synthetischen Testverbindung und ihres entsprechenden Codes gestattet. Allerdings kann wie bei der von Brenner und Lerner, supra, beschriebenen nukleinsäurecodierten Bibliothek das codierende Peptid den Suchtest [„Screening Assay"] stören. Zudem wird durch die Notwendigkeit zur Aufreinigung ausreichender Mengen an Material aus der Bibliothek beim Affinitätsselektionsverfahren, um die Sequenz der codierenden Peptide zu erhalten, die Synthese von Bibliotheken mit mehr als einigen tausend Spezies ausgeschlossen.
Somit besteht im Fachgebiet ein Bedarf an neuen, allgemeinen und vielseitigen Verfahren zur Erzeugung und Durchsuchung von Bibliotheken von Verbindungen, die zu verschiedenen chemischen Klassen gehören. Ferner besteht ein Bedarf an wirkungsvollen Verfahren zur Aufklärung der Strukturen von aus der Bibliothek als Ergebnis der Suche ausgewählten Verbindungen, deren Strukturen sich mit traditionellen Techniken, z.B. Edman-Abbau oder Massenspektrometrie, allein nicht bestimmen lassen. Weiterhin besteht im Fachgebiet auch noch ein Bedarf an einem molekularen Codierungssystem, das weder die Suchtests stört noch die Bindung der synthetischen Testverbindung über Nachbarschaftseffekte beeinflusst.
Die Angabe bzw. Identifizierung der Literaturstellen im vorliegenden Text soll nicht als Eingeständnis, dass diese Literaturstellen als Stand der Technik der vorliegenden Erfindung verfügbar sind, verstanden werden.
3. KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Von der Anmelderin wurde eine Bibliothek zur Identifizierung und Analyse eines Liganden eines Akzeptors entdeckt. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Bibliothek, die eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst, an denen jeweils eine Testverbindung sowie ein oder mehrere codierende Moleküle gebunden ist bzw. sind. Dabei umfasst die Testverbindung eine Sequenz von Untereinheiten und ist jeweils über einen spaltbaren Linker an den Festphasenträger gebunden.
Die codierenden Moleküle sind über einen nichtspaltbaren oder getrennt spaltbaren Linker an jeden Festphasenträger gebunden.
Die codierenden Moleküle umfassen α-Aminosäuren. Weiterhin unterscheidet sich jede Spezies codierendes Molekül von der Spezies der Testverbindung, wird die Sequenz der Untereinheiten der Testverbindung durch die Spezies von codierenden Molekülen codiert und weisen die codierenden Moleküle Untereinheiten auf, die in einem nichtsequenziellen Code angeordnet und topologisch von der Testverbindung, die an den Träger gebunden ist, getrennt sind, so dass sich das codierende Molekül im Inneren des Trägers befindet und sich die Testverbindung auf der Außenseite des Trägers befindet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Bibliothek zur Identifizierung eines Liganden oder eines Akzeptors von Interesse, wobei die Bibliothek eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst, an deren Oberfläche jeweils ein Linker gebunden ist, der eine einzige Spezies einer Testverbindung mit einer Sequenz von Untereinheiten umfasst, und wobei im Inneren jedes Trägers ein codierendes Molekül gebunden ist, das die Sequenz von Untereinheiten der Testverbindung codiert, wobei der Linker eine Bindung aufweist, die durch ein Enzym spaltbar ist, das nicht eine Bindung des codierenden Moleküls spaltet und wobei das codierende Molekül α-Aminosäuren umfasst.
Ebenso wird durch die vorliegende Erfindung eine Bibliothek zur Identifizierung eines Liganden oder eines Akzeptors von Interesse bereitgestellt, wobei die Bibliothek eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst, wobei auf der Oberfläche jedes Trägers ein Linker gebunden ist, der eine einzige Spezies einer Testverbindung umfasst, die eine Sequenz von Untereinheiten umfasst, an die eine erste Schutzgruppe gebunden ist, und wobei im Inneren jedes Trägers ein codierendes Molekül gebunden ist, das die Sequenz von Untereinheiten codiert und an das eine zweite Schutzgruppe gebunden ist, wobei die erste Schutzgruppe von der zweiten Schutzgruppe verschieden ist und wobei das codierende Molekül α-Aminosäuren umfasst.
Ebenso befasst sich die vorliegende Erfindung mit Suchtests zur Suche nach den Verbindungen, wie beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Enzymaktivität, Elektronentransportaktivität und Photoaktivität, um nur einige zu erwähnen.
Feste Träger, die Verbindungen enthalten, welche die Aktivität von Interesse im Suchtest demonstrieren, werden ausgewählt. Die Struktur der Verbindung wird bestimmt, beispielsweise mittels Massenspektrometrie, Kernmagnetresonanzspektrometrie oder anderen spektrometrischen Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei der Bibliothek um eine codierte Bibliothek, wobei in diesem Fall die Struktur der Verbindung von der Sequenz des codierenden Moleküls codiert wird, welche sich leicht bestimmen lässt.
Durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich Leitverbindungen für therapeutische oder diagnostische Mittel bereitstellen. Insbesondere kann es sich bei den Verbindungen selbst um geeignete Therapeutika oder Diagnostika handeln. Die Verbindungen auf Trägern in separater Phase können auch für den Elektronentransport, z.B. als Transistoren oder Halbleiter, geeignet sein.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Strategien zur Anbindung codierter Bibliotheken einer synthetischen Testverbindung. Untereinheiten der synthetischen Testverbindung sind als [NONSEQ] bezeichnet; das codierende Molekül ist durch A-B-C gekennzeichnet. (A) Die Testverbindung und das codierende Molekül lassen sich separat direkt oder über einen Linker an den Träger binden, und zwar mit einer statistischen Verteilung, die sich bezogen auf die Massenwirkung und die innewohnende Reaktivität verändern lässt. (B) Die synthetische Testverbindung und das codierende Molekül lassen sich an den gleichen Linker auf dem Träger in separater Phase binden, und zwar in einem definierten Molverhältnis. (C) Die synthetische Testverbindung wird auf der Oberfläche und das codierende Molekül im Inneren eines Trägers in separater Phase, wie beispielsweise eines Harzkügelchens, gebunden. Als Alternative kann sich bei (C) das codierende Molekül auf der Oberfläche und die Testverbindung im Inneren befinden.
2. Drei Formen einer modellcodierten Bibliothek, wobei es sich sowohl bei der „Test"-Verbindung (Ala-Phe-Val) als auch beim codierenden Molekül (Gly-Tyr- Leu) um ein Peptid handelt. (A) Die „Test"-Verbindung wurde unter Verwendung der Fmoc-Schutzgruppe und das codierende Molekül mit der Boc-Schutzgruppe synthetisiert. Bei Fmoc und Boc handelt es sich um orthogonale Schutzgruppen. (B) Die Fmoc-entschützte „Test"-Verbindung wurde acetyliert, so dass lediglich das codierende Peptid mittels Edman-Abbau sequenziert würde. (C) Das codierende Peptid wurde mit Trifluoracetyl (TFA) blockiert, was die Edman-Sequenzierung der „Test"-Verbindung gestattete, wonach TFA abgetrennt und das codierende Peptid sequenziert wurde. Die Peptide wurden an das TantaGel (TG)-Harz über einen „Safety-Catch"-Amidlinker (SCAL; Patek und Lebl, 1991, Tetrehedron Lett. 32:3891-3894) mit Lysinverzweigungen gebunden.
3. Modellbibliotheken mit verzweigten Gerüsten, wobei verschiedene mögliche chemische Verknüpfungsprozesse dargestellt sind, einschließlich der Umsetzung eines Amins mit einer Carbonsäure unter Bildung eines Amids; der Umsetzung einer Carbonsäure mit einem Amin unter Bildung eines Amids; der Umsetzung eines Thiols mit einem Alkylhalogenid unter Bildung eines Sulfids.
4. Modell der Wechselwirkung einer synthetischen Testgerüstverbindung mit einem Akzeptormolekül. (A) Die am Gerüst gebundenen funktionellen Gruppen besitzen die Freiheit, eine geeignete Bindungskonformation einzunehmen. (B) Die funktionellen Gruppen auf dem Gerüst sind hinsichtlich der geeigneten Bindungskonformation eingeschränkt.
5. Strukturen einiger der Untereinheiten, die sich chemisch in Zufallsstrukturen unter Ausbildung der Bibliotheken der synthetischen Testverbindung chemisch verknüpfen lassen.
6. Aus wiederholten Kondensationsreaktionen mit Boc- und Fmoc-blockierten Untereinheiten gebildete cyclische Modelbibliothek.
7. Schema zur Herstellung einer Gerüstbibliothek an TentaGel-Harz, wobei es sich bei dem Gerüst um Cyclopentan handelt.
8. Strukturen von zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Gerüstbibliothek verwendeten Untereinheiten. Der Zwei-Buchstaben-Aminosäuredipeptid-Code für die Untereinheiten ist jeweils unterhalb der entsprechenden Untereinheit angegeben. Die Herstellung und Verwendung dieser Bibliothek ist in Abschnitt 9 unten beschrieben.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Bibliotheken synthetischer Testverbindungen, die an Trägern in separater Phase gebunden sind, wobei jeder Träger in separater Phase jeweils eine einzige Spezies einer synthetischen Testverbindung enthält, sowie Verfahren zur Synthese und Verwendung derartiger Bibliotheken. Dabei bezieht sich der Begriff „Träger in separater Phase" auf eine Matrix, an die die synthetische Testverbindung gebunden werden kann und die in einer Flüssigkeit nicht löslich ist oder mit einer Flüssigkeit ein Zweiphasensystem bildet. Vorzugsweise handelt es sich bei der separaten Phase um eine Festphase, obwohl separate Phasen, wie etwa Hydrogele und Aerogele, auch in Betracht gezogen werden.
Der Begriff „Bibliothek einer synthetischen Testverbindung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Sammlungen synthetischer Testverbindungen auf Trägerpartikeln in separater Phase, wobei die Trägerpartikel in separater Phase jeweils eine einzige Strukturspezies der synthetischen Testverbindung enthalten. Jeder Träger enthält viele Kopien der einzigen Strukturspezies. So enthält beispielsweise ein typischer Harzträger für die Festphasenpeptidsynthese etwa 50-250 pmol Peptid. Die Strukturen der synthetischen Testverbindung leiten sich von einer im Wesentlichen zufälligen chemischen Kombination von „Untereinheiten" ab.
Der Begriff „synthetische Testverbindung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf kleine Moleküle, die aus 2 bis 100 und stärker bevorzugt 2-20 Untereinheiten mit einem oder ohne einem Gerüst bestehen. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der synthetischen Testverbindung um ein aus Untereinheiten, die über solche Verknüpfungen wie etwa Amid-, Harnstoff-, Ester-, Ether-, Carbamat-, Amin-, Sulfid-, Disulfid-, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verknüpfungen, wie z.B. Alkan-, Alken- und Alkinverknüpfungen, und dergleichen, verknüpft sind, gebildetes Polymer; insbesondere können zu der Verbindung, ohne darauf beschränkt zu sein, Polycarbamat, Polyharnstoff, Polyamid, Polyester, Polyether usw. oder eine beliebige Kombination daraus, wie ausführlich unten beschrieben, gezählt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei einer synthetischen Testverbindung um ein zufällig funktionalisiertes molekulares Gerüst handeln, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Steroidstruktur, heterocyclische Struktur, ein polyaromatischer Ring oder eine Kohlenhydratstruktur und dergleichen, wie ausführlich unten beschrieben.
Der Begriff „Untereinheit", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische Teilkomponente, womit die synthetische Testverbindung über die Verknüpfung der chemischen Teilkomponenten mittels einer definierten Chemie gebildet wird. So handelt es sich beispielsweise bei einer „Bibliothek von Peptiden" um eine Sammlung von Peptiden (der synthetischen Testverbindung), d.h. aus 2-100 α-Aminosäureresten (den Untereinheiten) bestehenden Ketten, deren Sequenzen einen beliebigen Aminosäurerest enthalten, der einem anderen beliebigen Aminosäurerest vorangeht oder diesem folgt. Eine „Bibliothek von Steroidderivaten" ist beispielsweise eine Sammlung von Steroidderivaten, die jeweils eine funktionelle Gruppe aus einem Satz funktioneller Gruppen, den Untereinheiten, an spezifischen Positionen des Steroidkerns tragen.
Besonders bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung codierte Bibliotheken synthetischer Testverbindungen. Dabei bezieht sich der Begriff „codierte Bibliothek", wie er hier verwendet wird, auf eine Bibliothek, bei der jede unterschiedliche Spezies der Verbindung auf jedem Träger in separater Phase mit einem codierenden Molekül gepaart ist, dessen Struktur leicht bestimmbar ist und eine einmalige Struktur für seinen gepaarten Partner in der Bibliothek codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform einer codierten molekularen Bibliothek handelt es sich bei dem codierenden Polymermolekül um ein Peptid. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem codierenden Polymermolekül um ein Oligonukleotid.
Zu Ausführungsformen von Bibliotheken gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die folgenden:
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyamide handelt, d.h. die synthetische Testverbindung besteht aus Ketten von 2-100 Aminosäuren, die über Amidbindungen verknüpft sind;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyester handelt, d.h. Ketten von 2-100 Hydroxysäuren, die über Esterbindungen verknüpft sind;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyether handelt, d.h. Ketten von 2- 100 Hydroxyalkoholen, die über Etherbindungen verknüpft sind;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyharnstoffe handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyurethane handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polycarbonate handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyamine handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyalkane, Polyalkene oder Polyalkohole, einschließlich deren Halogenderivate, handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polysulfide handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polydisulfide handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polymere handelt, deren Strukturen zufällig angeordnete Segmente aus zwei oder mehr der in den obigen Ausführungsformen beschriebenen polymeren Strukturen enthalten;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Derivate einer Steroidstruktur handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Derivate eines Zuckers, wie z.B. β-D-Glukose, handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Derivate einer heterocyclischen Struktur, wie beispielsweise Benzodiazepin, handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Derivate einer Struktur handelt, die als Gerüst dienen kann, an das eine Vielzahl von Strukturen, wie beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Carbonsäuren, Amine und Halogenderivate, auf definierte Weise gebunden werden können;
Bibliotheken, bei denen es sich bei den Molekülen um chimäre Strukturen handelt, die einen oder mehrere Sequenzen variabler Länge enthalten, die chemisch über aus einer oder mehreren Amiden, Estern, Ethern, Carbonsäureestern, Sulfiden, Disulfiden, Alkenen und Aminen sowie einer oder mehreren Strukturen, die als Gerüst fungieren können, wie beispielsweise einer Steroid-, einer Zucker-, einer aromatischen oder polyaromatischen Struktur, ausgewählte Verbindungen verknüpft sind.
Viele verschiedene Untereinheiten der unterschiedlichen Klassen synthetischer Testverbindungen sind im Handel von Lieferfirmen, wie beispielsweise Sigma, Aldrich, ICI Chemicals usw., erhältlich. Als Alternative können Untereinheiten synthetisch mit chemischen Standardsynthesetechniken hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den oben aufgeführten Bibliotheken um codierte Bibliotheken, bei denen jeder Träger in separater Phase eine synthetische Testverbindung sowie eine für die Struktur der synthetischen Testverbindung codierende polymere Sequenz enthält. Vorzugsweise handelt es sich bei der codierenden polymeren Sequenz um ein Peptid.
5.1 CODIERUNGSSTRATEGIEN
Wie oben angemerkt, handelt es sich in einem bevorzugten Aspekt bei den erfindungsgemäßen Bibliotheken um codierte Bibliotheken, bei denen die Sequenz eines codierenden Moleküls auf jedem Träger jeweils der Struktur der synthetischen Testverbindung auf jedem Träger entspricht. Somit wird jede einmalige synthetische Testverbindungsstruktur von einer einmaligen codierenden Molekülsequenz codiert. Wie oben angemerkt, handelt es sich bei dem codierenden Molekül vorzugsweise um ein Peptid, doch umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren oder eines beliebigen sequenzierbaren Polymers als codierende Sequenz.
Das Paradigma einer codierenden Sequenz ist der genetische Code, bei dem Nukleotidtriplettsequenzen in einem Gen einer spezifischen Aminosäure in einem von dem Gen codierten Protein entsprechen. Die Anordnung von Codons in einem Gen entspricht der Sequenz von Aminosäuren in einem Protein. Somit codiert das Gen für das Protein.
Nach dieser Analogie lässt sich die Codierung der Sequenz einer Bibliothek einer synthetischen Testverbindung, wie beispielsweise eines Polyamids, dessen Sequenz nicht mit herkömmlichen Verfahren (z.B. Edman-Abbau) ermittelt werden kann, mit einem codierenden Molekül leicht unter Verwendung eines analogen Codes bewerkstelligen. Dabei ist die Wahl des Codes rein willkürlich, einschließlich davon, ob Einfach-, Zweifach- oder Dreifachkombinationen (oder höhere Kombinationen) von Untereinheiten des codierenden Moleküls einer jeden Untereinheit der synthetischen Testverbindung entsprechen.
So kann es sich beispielsweise bei dem codierenden Molekül um ein Peptid handeln. In diesem Fall werden Codes, die aus einem oder mehreren Aminosäureresten bestehen, die sich leicht mit dem Edman-Abbau nachweisen lassen und von denen man auch weiß, dass sie in der Festphasenpeptidsynthese in wirksamer Weise kuppeln, ohne dass sie einen Seitenkettenschutz benötigen, als ganz besonders geeignet angesehen. Wird beispielsweise ein Triplettcode auf der Grundlage der Aminosäuren Leucin (Leu), Glycin (Gly), Alanin (Ala) und Phenylalanin (Phe) (die alle keinen Seitenkettenschutz benötigen und während der Peptidsynthese auf wirksame Weise kuppeln und weiterhin leicht durch Edman-Abbau nachweisbar sind) verwendet, so können mit geeigneten chemischen Reaktionen Bibliotheken synthetischer Testverbindungen synthetisiert werden, die bis zu 64 strukturell unterschiedliche Untereinheiten enthalten, wobei jede Untereinheit mit einem einmaligen, die Tripletts von Leu, Gly, Ala bzw. Phe (wobei jedes Triplett einer und tatsächlich nur einer Untereinheit im Polyamid entspricht) enthaltenden Peptid gepaart ist. Zu weiteren bevorzugten Aminosäuren, d.h. solchen, die keinen Seitenkettenschutz benötigen, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Isoleucin, Valin, Cyclohexyl-L-alanin, Norleucin, Norvalin, Prolin und dergleichen. Weniger bevorzugt sind Asparagin und Glutamin. In einer weiteren Ausführungsform kann jede der 20 natürlichen Aminosäuren für eine spezifische Untereinheit codieren. Eine einzige codierende Sequenzuntereinheit bzw. ein einziges Codon kann dabei für mehr als eine Untereinheit der synthetischen Testverbindung codieren, wodurch sich ein degenerierter Code ergibt, obwohl dies nicht notwendig ist.
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Strategien bereit, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass in Screening-Tests eine aktive synthetische Testverbindung statt der codierenden Moleküle auf einem gegebenen Träger erkannt wird, was im Abschnitt 5.3 unten erörtert wird.
5.2 VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG EINER BIBLIOTHEK SYNTHETISCHER TESTVERBINDUNGEN
Wie oben angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek synthetischer Testverbindungen an Trägern in separater Phase. Vorzugsweise handelt es sich bei der Bibliothek um eine, bei der jede synthetische Testverbindung mit einem einmaligen codierenden Molekül, z.B. einem Peptid, dessen Sequenz für die Struktur der am gleichen Träger gebundenen synthetischen Testverbindung codiert und leicht mit traditionellen Analysetechniken, z.B. Edman-Abbau, bestimmt werden kann, gepaart ist.
Falls es sich bei der synthetischen Testverbindung um funktionalisierte molekulare Gerüste handelt, so wird das Gerüst oder eine Vorstufe zu dem Gerüst vor dem Beginn der Synthese an den Festphasenträger gebunden.
Die Synthese von Bibliotheken synthetischer Testverbindungen umfasst die Wiederholung der folgenden Schritte:

(i) Teilen des ausgewählten Trägers in eine Anzahl von Anteilen, die mindestens gleich der Anzahl an zu verknüpfenden unterschiedlichen Untereinheiten ist;
(ii) Chemische Verknüpfung einer und nur einer der Untereinheiten der synthetischen Testverbindung mit einem und nur einem der Anteile des festen Trägers aus Schritt (i), wobei vorzugsweise sichergestellt wird, dass. die die chemische Verknüpfung bildende Reaktion so vollständig wie möglich durchgeführt wird;
(iii) Gründliches Mischen der Festträgeranteile, die die wachsende synthetische Testverbindung enthalten;
(iv) Wiederholung der Schritte (i) bis (iii), und zwar so viele Male wie die Anzahl an Untereinheiten in jeder der synthetischen Testverbindungen der gewünschten Bibliothek, womit die synthetische Testverbindung wächst;
(v) Abtrennen eventuell vorhandener Schutzgruppen, die während des Zusammenbaus der synthetischen Testverbindung am festen Träger verwendet wurden.

Vorzugsweise wird ein codierendes Molekül parallel mit der synthetischen Testverbindung synthetisiert. In diesem Fall wird bzw. werden vor oder nach Verknüpfung der Untereinheit der synthetischen Testverbindung mit dem Träger in Schritt (ii) eine Untereinheit bzw. mehrere Untereinheiten des codierenden Moleküls, die der hinzugefügten Untereinheit der synthetischen Testverbindung entspricht bzw. entsprechen, mit dem wachsenden codierenden Molekül so verknüpft, dass ein einmaliger Strukturcode (siehe Abschnitt 5.1 oben), der der Struktur der wachsenden synthetischen Testverbindung entspricht, auf jedem Träger erzeugt wird. Dabei ist leicht ersichtlich, dass bei der Herstellung einer codierten Bibliothek die Synthese der codierenden Untereinheit bzw. codierenden Untereinheiten dem Mischungsschritt (iii) vorangehen muss.
Die Wiederholung der Schritte (i)-(iii) (siehe Schritt (iv)) führt natürlicherweise zum Wachstum der synthetischen Testverbindung und, falls das Verfahren modifiziert wird, um die Synthese eines codierenden Moleküls mit einzubeziehen, des codierenden Moleküls parallel mit der Testverbindung. Dabei werden die Begriffe Testarm und codierender Arm hier zur Bezeichnung der am Träger synthetisierten synthetischen Testverbindung bzw. falls vorhanden, des am Träger synthetisierten codierenden Moleküls verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Veränderung aller Schritte der obigen Verfahrensweise. So erhält man beispielsweise eine andere, und gelegentlich wünschenswerte, Bibliothek, falls Schritt (ii) so abgeändert wird, dass darin die gleiche Polymeruntereinheit mit allen Anteilen des festen Trägers verknüpft wird. In diesem Fall muss die Verlängerung des codierenden Polymers in analoger Weise modifiziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform braucht, falls das gleiche Polymer am Testarm wie am codierenden Arm verlängert wird, der codierende Arm nicht über den Punkt, der für die Codierung einer nicht sequenzierbaren Untereinheit der synthetischen Testverbindung benötigt wird, hinaus verlängert zu werden, solange die Geschichte der Synthese, z.B. die Anzahl an Untereinheiten, bekannt ist.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der zur Durchführung der Synthese einer synthetischen Testverbindung, bei der es sich um ein kurzes Polymer handelt, verwendete feste Träger mit einer oder mehreren der Untereinheiten des Polymers vor seiner Verwendung bei der Synthese einer Bibliothek derivatisiert.
In einer Ausführungsform werden genügend Trägerpartikel verwendet, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass alle möglichen Strukturen der synthetischen Testverbindung in der Bibliothek vorhanden sind. Eine solche Bibliothek wird als „vollständige" Bibliothek bezeichnet. Zur Gewährleistung einer hohen Wahrscheinlichkeit einer Repräsentation aller Strukturen ist die Verwendung einer Reihe von Trägern im Überschuss, z.B. im fünffachen, zwanzigfachen usw. Überschuss, gemäß der Statistik, wie beispielsweise der Poisson-Statistik, der Anzahl möglicher Spezies von Verbindungen erforderlich. In einer weiteren Ausführungsform ist vor allem dann, wenn die Anzahl möglicher Strukturen die Anzahl an Trägern übersteigt, nicht jede mögliche Struktur in der Bibliothek repräsentiert. Derartige „unvollständige" Bibliotheken sind ebenso von sehr großem Nutzen.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Bibliothek eine synthetische Testverbindung aufweisen, zu deren Strukturen eine wünschenswerte, als Ergebnis des Absuchens einer anderen vor Erzeugung der Bibliothek oder am Ende der Erzeugung der Bibliothek hinzugefügten Bibliothek gefundene polymere Sequenz gehört. Eine solche Bibliothek wird hergestellt, indem man einen die wünschenswerte polymere Sequenz enthaltenden festen Träger synthetisiert und diesen derivatisierten Träger als festen Träger für die Synthese der neuen Bibliothek verwendet. Als Alternative kann ein Teil der Bibliothek der synthetischen Testverbindung synthetisiert werden, woran sich die Synthese der wünschenswerten Polymersequenz als Erweiterung der Testverbindungen auf allen Trägern in separater Phase folgt. Als Alternative kann die wünschenswerte Sequenz diskontinuierlich und in der Zufallsbibliothek enthalten sein.
5.3 ENTWICKLUNG UND VERWENDUNG VON SYNTHESETRÄGERN IN SEPARATER PHASE UND LINKERN BEI SYNTHESEN CODIERTER MOLEKULARER BIBLIOTHEKEN
5.3.1 BEI DER SYNTHESE EINER CODIERTEN MOLEKULAREN BIBLIOTHEK GEEIGNETE TRÄGER UND LINKER
Ein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneter Träger in separater Phase ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet: (1) Unlöslichkeit in flüssigen Phasen, die zur Synthese oder zur Suche verwendet werden; (2) Fähigkeit zur Mobilität in drei Dimensionen, unabhängig von allen anderen Trägern; (3) Vorliegen vieler Kopien jeder einzelnen synthetischen Testverbindung und, falls vorhanden, der am Träger gebundenen codierenden Sequenz; (4) Kompatibilität mit Suchtestbedingungen; und (5) Inertheit gegenüber den Reaktionsbedingungen für die Synthese einer Testverbindung und die Synthese des codierenden Moleküls. Ein bevorzugter Träger weist ebenso reaktive funktionelle Gruppen, wie beispielsweise Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Thiolgruppen usw. zur Anbindung einer Untereinheit auf, die eine Vorstufe zu jeder der synthetischen Testverbindung und codierenden Moleküle darstellt, oder zur Anbindung eines Linkers, der eine oder mehrere reaktive Gruppen zur Anbindung des Monomers oder einer anderen Untereinheitsvorstufe enthält.
Der Träger in separater Phase, wie er hier verwendet wird, ist nicht auf einen bestimmten Typ von Träger beschränkt. Vielmehr stehen zahlreiche Träger zur Verfügung, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. In einem bevorzugten Aspekt handelt es sich bei dem Träger in separater Phase um einen Festphasenträger, obwohl die vorliegende Erfindung die Verwendung halbfester Stoffe, wie beispielsweise Aerogele und Hydrogele, umfasst. Zu Festphasenträgern gehören Kieselgele, Harze, derivatisierte Plastikfolien, Glaskügelchen, Baumwolle, Plastikkügelchen, Aluminiumoxidgele, Polysaccharide, wie beispielsweise Sepharose und dergleichen, usw. Ein geeigneter Festphasenträger kann auf der Grundlage der gewünschten Endverwendung und der Eignung für verschiedene Synthesevorschriften ausgewählt werden. So können beispielsweise bei der Polyamidsynthese als Festphasenträger Harze, wie beispielsweise Polystyrol (z.B. PAM-Harz, bezogen von Bachem Inc., Peninsula Laboratories, usw.), POLYHIPE^®-Harz (bezogen von Aminotech, Kanada), Polyamidharz (bezogen von Peninsula Laboratories), Polystyrolharz mit aufgepfropftem Polyethylenglykol (TentaGel^®, Rapp Polymer, Tubingen, Deutschland) oder Polydimethyl-Acrylamidharz (bezogen von Milligen/Biosearch, Kalifornien) geeignet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform für Peptid- und andere Polyamidsynthesen ist als Festphasenträger Polydimethyl-Acrylamidharz bevorzugt. Bevorzugte Festphasensyntheseträger für spezifische Synthesen sind nachfolgend beschrieben. So lässt sich beispielsweise in einem spezifischen Ausführungsmodell, siehe unten, ein Träger, wie er etwa in der Merrifield-Peptidsynthese verwendet wird, nacheinander mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure, die über nachfolgende Synthesezyklen unter Erhalt des „synthetische Testverbindung"-Polyamids verlängert wird, und einer Ddz- oder Boc-geschützten Aminosäure, die unter Erhalt des codierenden Peptids verlängert wird, derivatisieren. Andere hintereinander erfolgende Derivatisierungen sind nachfolgend beschrieben. Somit wird jedes Harzkügelchen so funktionalisiert, dass es sowohl die synthetische Testverbindung als auch die entsprechenden codierenden Strukturen enthält, wobei deren relative Mengen von den Reaktionsbedingungen zur Anbindung der ersten Fmoc- bzw. Ddz- (oder Boc-) geschützten Aminosäuren abhängt. In einer Variation dieses Ansatzes werden die synthetische Testverbindung und codierenden Moleküle über Linker, wie beispielsweise den unten beschriebenen, an den festen Träger gebunden.
Die erfindungsgemäßen Träger können auch Linker oder eine Anordnung von Linkern umfassen. Dabei bezieht sich ein Linker, wie er hier verwendet wird, auf ein beliebiges Molekül, das eine Kette von Atomen, z.B. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff usw., enthält und zur Verknüpfung der am Träger zu synthetisierenden Moleküle mit dem Träger dient. Der Linker wird an den Träger üblicherweise über eine kovalente Bindung gebunden, und zwar vor Beginn der Synthese am Träger, und stellt eine oder mehrere Stellen für die Anbindung von Vorstufen der am Träger zu synthetisierenden Moleküle bereit. Zur Bindung der Vorstufen von zu synthetisierenden Molekülen an den Festphasenträger lassen sich verschiedene Linker einsetzen. Zu Linkern gehören beispielsweise Aminobuttersäure, Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure, 8-Aminocaprylsäure, Lysin, Iminodiessigsäure, Polyoxyethylen, Glutaminsäure usw. In einer weiteren Ausführungsform können Linker zusätzlich ein oder mehrere β-Alanine oder andere Aminosäuren als „Spacer" [Abstandhalter] umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform wird der „Safety-Catchamidlinker" (SCAL) (siehe Patek, M. und Lebl, M. 1991, Tetrahedron Letters 32:3891-3894; Internationale Patentveröffentlichung WO 92/18144 , veröffentlicht am 29. Oktober 1992) am Träger eingeführt.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Linkern können selektiv spaltbare Linker eingesetzt werden, vorzugsweise zur Anbindung des synthetischen Testverbindungsmoleküls. Ein Beispiel ist der von Barany und Albericio (1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942) beschriebene gegenüber ultraviolettem Licht empfindliche Linker ONb. Weitere Beispiele für photospaltbare Linker finden sich bei Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer et al. (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45) und Kreib-Cordonier et al. (1990, in „Peptides – Chemistry, Structure and Biology", Rivier und Marschall, Hrsg., S. 895-897). Von Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-149) wurde wässrige Ameisensäure zur Spaltung von Asp-Pro-Bindungen verwendet; dieser Ansatz wurde zur Charakterisierung von T-Zelldeterminanten in Verbindung mit dem „Pin"-Syntheseverfahren nach Geysen verwendet (Van der Zee et al., 1989, Eur. J. Immunol. 191:43-47). Zu weiteren potenziellen Linkern, die unter basischen Bedingungen spaltbar sind, gehören solche, die auf p-(Hydroxymethyl)benzoesäure (Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I:538-546) und Hydroxyessigsäure (Baleaux et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28) beruhen. Von Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33; Internationale Veröffentlichung WO 90/09395 , veröffentlicht am 23. August 1990) wird die Peptidspaltung über einen Diketopiperazinmechanismus beschrieben. Bevorzugte Diketopiperazinverknüpfungen sind in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/919,454 , eingereicht am 24. Juli 1992, offenbart, die hiermit durch Bezugnahme voll inhaltlich aufgenommen wird. Ebenso können enzymspaltbare Linker geeignet sein. Dabei kann ein Enzym einen Linker, der eine von dem Enzym erkannte Sequenz umfasst, spezifisch spalten. Somit können geeignete Peptidsequenzen enthaltende Linker von einer Protease und geeignete Nukleotidsequenzen enthaltende Linker von einer Endonuklease gespalten werden. In bestimmten Fällen kann man einen Teil (z.B. 10-90%) der verfügbaren funktionellen Harzgruppen mit einem spaltbaren Linker unter Verwendung bestimmter Reaktionsbedingungen sowie die restlichen funktionellen Harzgruppen mit einem Linker, der gegenüber den Spaltungsbedingungen stabil ist, derivatisieren, so dass sichergestellt wird, dass nach der Abspaltung genügend Material auf dem Harz für weitere Untersuchungen verbleibt. Diese Anordnung ist insbesondere dann bevorzugt, wenn kein codierendes Molekül vorhanden ist. Kombinationen von unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen spaltbaren Linkern können ebenso verwendet werden, um die selektive Abspaltung von Molekülen von einem einzigen Festträgerkügelchen zu gestatten.
Vorzugsweise lässt sich ein spaltbarer Linker zur Freisetzung der synthetischen Testverbindungen oder eines Teils davon, zum Testen in einem Suchtest verwenden. In diesem Fall wird die codierende Sequenz, falls vorhanden, über einen nicht spaltbaren Linker an den Festphasenträger gebunden.
Ein Ansatz zur Synthese codierter Bibliotheken beinhaltet die Verknüpfung der Vorstufen der synthetischen Testverbindung und der codierenden Moleküle der Bibliothek zusammen über einen verzweigten Linker, der auch zur Verknüpfung beider Vorstufen mit dem festen Träger dient. Je nach der Struktur des Linkers kann eines der beiden Moleküle oder können beide Moleküle vom festen Träger zur weiteren Untersuchung abgelöst werden. Ein Beispiel für diesen Ansatz der Verankerung der synthetischen Testverbindung und der codierenden Moleküle besteht in der Verwendung von Lys(SCAL)-derivatisiertem TentaGel.
Ferner kann ein Festphasenträger-Linker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ein Molekül von Interesse umfassen, das unter Erhalt einer molekularen Bibliothek weiter derivatisiert werden kann. Das vorgebundene Molekül kann gemäß den hier beschriebenen Verfahren ausgewählt werden oder kann eine Struktur umfassen, von der man weiß, dass sie die gewünschten Eigenschaften verkörpert.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines Arrays von Linkern, die in einer von vielen Anordnungen am festen Träger gebunden sind. So kann beispielsweise eine Lysincarboxylgruppe mit einem SCAL-Linker verknüpft werden, der mit dem Festphasenträger verknüpft ist, womit ein mit einem Lysin-SCAL-Linker funktionalisierter Träger produziert wird. In einer anderen Ausführungsform lässt sich ein Lysin mit dem Festphasenträger über einen Polyethylenglykol-Linker verknüpfen. Ein SCAL-Linker an einem festen Träger lässt sich auch mit einer Aminogruppe eines Diamin-Linkers verknüpfen, während die andere Aminogruppe direkt zur weiteren Kupplung verwendet werden kann. In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein spaltbarer Linker an eine der Aminogruppen eines mit einem Träger verknüpften Lysins gebunden werden, während die andere Aminogruppe ohne weitere Modifikation verwendet wird. Spezifische Kupplungen an die einzelnen Aminogruppen eines Lysin-Linkers lassen sich jeweils durch Verwendung orthogonaler Schutzgruppen bewerkstelligen.
In einer spezifischen Ausführungsform, siehe unten, kann ein mit TentaGel verknüpfter SCAL mit Lysin acyliert werden, dessen Aminogruppen mit Fmoc und Boc geschützt sind; als Ergebnis erhält man als Träger TentaGel mit dem Linker Boc-Lys(Fmoc)-SCAL, der nacheinander entschützt werden kann, so dass zwei einmalige Aminogruppen bereitgestellt werden, die beispielsweise nach Acylierungen mit zwei unterschiedlichen Sätzen von Aminosäuren zu Ankern für zwei Polyamide werden können. Die Acylierung einer der Aminogruppen der Lysingruppierung des Linkers mit Boc-Lys (Fmoc) ergibt einen neuen Linker mit insgesamt drei potenziellen Aminoankern (bei nacheinander erfolgter Entschützung), wobei die Acylierung beider Aminogruppen des Linker-Lysins durch Boc-Lys (Fmoc) einen neuen Linker mit insgesamt vier potenziellen Aminoankern bereitstellt.
5.3.2 TOPOLOGIE DER VERANKERUNG SYNTHETISCHER TESTVERBINDUNGEN UND CODIERENDER MOLEKÜLE AUF OBERFLÄCHEN FESTER TRÄGER
Verschiedene Ansätze zur topologischen Trennung der synthetischen Testverbindung und der codierenden Moleküle auf einem festen Träger zur Erzeugung von Bibliotheken werden in Betracht gezogen.
Die topologische Trennung der synthetischen Testverbindung und des codierenden Moleküls bezieht sich auf die räumliche Trennung für einen Träger. So kann beispielsweise, falls es sich bei dem Träger um ein Harzkügelchen handelt, die Trennung einer signifikanten Anzahl der Ligandenkandidatenmoleküle von einer signifikanten Anzahl der codierenden Moleküle zwischen der Oberfläche und dem Inneren des Harzkügelchens erfolgen. Vorzugsweise enthält die Oberfläche des Trägers in erster Linie synthetische Testverbindungsmoleküle und nur sehr wenige codierende Moleküle. Besonders bevorzugt enthält die Oberfläche des Trägers mehr als 90% synthetische Testverbindung. Noch stärker bevorzugt enthält die Oberfläche des Trägers mehr als 99% synthetische Testverbindungsmoleküle; am stärksten bevorzugt enthält sie mehr als 99,9% synthetische Testverbindung. Der Vorteil einer solchen Anordnung besteht darin, dass dadurch die Störung des codierenden Moleküls in einem Bindungssuchtest (siehe Abschnitt 5.6, unten) in Grenzen gehalten wird. Dabei ist es nicht notwendig, dass die topologische Fläche, die die codierende Sequenz enthält, d.h. das Innere eines Harzkügelchens, frei von der synthetischen Testverbindung ist.
Im oben genannten Beispiel wird das codierende Molekül im Inneren des Trägerpartikels segregiert. Ebenso wird in Betracht gezogen, dass das codierende Molekül zur Oberfläche eines Trägerpartikels oder zu einer Seite eines Trägerpartikels segregiert werden kann.
Ein allgemeiner Ansatz zur topologischen Trennung der synthetischen Testverbindung von codierenden Molekülen beinhaltet die selektive Derivatisierung reaktiver Stellen auf dem Träger, die auf der unterschiedlichen Zugänglichkeit der Kupplungsstellen für Reagenzien und Lösungsmittel beruht. So stellen beispielsweise das Innere des Kügelchens, z.B. verschiedene Kanäle und andere Höhlungen, Bereiche mit geringer Zugänglichkeit in einem Harzkügelchen dar. Die Oberfläche eines Harzkügelchens, die mit den Molekülen der Lösung, in der das Kügelchen suspendiert ist, in Kontakt steht, stellt einen Bereich mit relativ hoher Zugänglichkeit dar. Verfahren zur Realisierung der selektiven Verknüpfung von Vorstufen codierender Moleküle und synthetischer Testverbindungen mit einem geeigneten Festphasenträger umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, das Folgende.

(i) Selektive Derivatisierung von Oberflächen fester Träger über kontrollierte Photolyse: zwei Ansätze können verwendet werden. Bei einem wird ein funktionalisierter fester Träger mit einer photospaltbaren Schutzgruppe, z.B. Nitroveratryloxycarbonyl (Nvoc) geschützt (Patchornik et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92:6333). Die Nvoc-derivatisierten Trägerpartikel werden in einer Monolager-Formation auf einer geeigneten Oberfläche angeordnet. Der Monolager wird unter Verwendung von Licht kontrollierter Intensität so photolysiert, dass es sich bei der Zone des Kügelchens, das am wahrscheinlichsten durch Licht entschützt wird, um denjenigen Bereich des Kügelchens handelt, der am stärksten mit dem Licht in direktem Kontakt steht, d.h. die äußere Oberfläche des Kügelchens. Die erhaltenen teilentschützten Kügelchen werden gründlich gewaschen und mit einer Vorstufe der synthetischen Testverbindung, die eine lichtstabile Schutzgruppe enthält, reagiert. Beispielsweise könnte es sich im Fall der Synthese einer codierten Bibliothek von Polyamiden bei dieser Vorstufe um eine Boc-geschützte Aminosäure handeln, die über weitere Synthesezyklen zur synthetischen Polyamidtestverbindung umgewandelt wird. Nach der Reaktion mit der Vorstufe der synthetischen Testverbindung werden die Kügelchen einer quantitativen Photolyse unterzogen, um die verbliebenen lichtempfindlichen Schutzgruppen zu entfernen, womit funktionelle Gruppen in weniger lichtzugänglichen Umgebungen, z.B. im Inneren eines Harzkügelchens, freigelegt werden. Nach dieser quantitativen Photolyse werden die Trägerpartikel weiter mit einer orthogonal-geschützten Vorstufe des codierenden Moleküls, z.B. Fmoc-geschützter Aminosäure, derivatisiert. Das erhaltene Festträgerkügelchen enthält schließlich vorwiegend auf der äußeren Oberfläche segregierte synthetische Testverbindungen sowie im Inneren des Festphasenträgerkügelchens lokalisierte codierende Moleküle. Eine alternative Photolysetechnik zur Segregierung codierender Moleküle und synthetischer Testverbindungsmoleküle auf einem Träger beinhaltet die Derivatisierung des Trägers mit einem verzweigten Linker, dessen einer Zweig photospaltbar ist, und die Bindung der Vorstufe des codierenden Moleküls an dem photoempfindlichen Zweig des Linkers. Nach Beendigung der Synthese werden die Trägerkügelchen in einer Monolayerformation angeordnet und wie oben beschrieben photolysiert. Durch diese Photolyse werden Kügelchen bereitgestellt, die Flecken mit synthetischen Testverbindungsmolekülen für die selektive Suche mit minimaler Störung durch die codierenden Moleküle enthalten.
(ii) Selektive Derivatisierung von Oberflächen fester Träger unter Verwendung chemischer oder biochemischer Ansätze. Die Wirksamkeit dieser chemischen und biochemischen Derivatisierungen hängt von der Fähigkeit der exponierten funktionellen Gruppen auf der äußeren Oberfläche ab, schneller als andere, im Inneren liegende Gruppen, die nicht exponiert sind, zu reagieren. Beispielsweise konnte man beobachten, dass Antikörper nicht an Peptidliganden im Inneren eines Festphasenträgerharzes binden können. Daher können unter Verwendung von durch die Struktur des Trägers oder durch Modulation des Aufquellens eines Kügelchens über die Wahl des Reaktionslösungsmittels aufgezwungenen Unterschieden in der sterischen Hinderung reaktive Gruppen auf der Außenseite des Kügelchens, die für Makromoleküle oder bestimmte Reagenzien zugänglich sind, selektiv in Bezug auf reaktive Gruppen im Inneren des Kügelchens umgesetzt werden. Daher lassen sich die auf der Außenseite des Kügelchens liegenden reaktiven Gruppen für die Synthese der synthetischen Testverbindung modifizieren, während innen liegende reaktive Gruppen für die Verlängerung der codierenden Moleküle oder sowohl der codierenden Moleküle als auch der synthetischen Testverbindung modifiziert werden können. Da die Anzahl reaktiver Gruppen im Inneren eines Harzkügelchens wesentlich größer ist als die Anzahl von Gruppen auf der äußeren Oberfläche, ist die tatsächliche Anzahl codierender Moleküle sehr groß, wodurch genügend codierende Moleküle für eine genaue Sequenzanalyse und somit die Entschlüsselung der Struktur der synthetischen Testverbindung bereitgestellt werden. Dabei werden verschiedene chemische und biochemische Ansätze, einschließlich der folgenden, in Betracht gezogen:
(a)Verwendung polymerer Entschützungsagenzien zur selektiven Entschützung von Teilen der Außenseite eines geschützte funktionelle Gruppen tragenden Festträgerkügelchens. Dabei werden die entschützten funktionellen Gruppen als Anker für die synthetische Testverbindung verwendet. Die noch geschützten funktionellen Gruppen werden anschließend unter Verwendung eines nicht polymeren Entschützungsagenz entschützt und als Anker für die Anbindung der codierenden Moleküle verwendet. In einer spezifischen Ausführungsform beinhaltet dieses Verfahren die Verwendung von Enzymen zur selektiven Aktivierung von auf der Außenseite der Kügelchen liegenden Gruppen, die mit einem geeigneten Enzymsubstrat derivatisiert wurden. Aufgrund ihrer Größe sind Enzyme vom Inneren des Kügelchens ausgeschlossen. In einem Beispiel, siehe unten, wird ein Substrat durch ein Enzym vollständig von der Oberfläche eines Harzkügelchens entfernt, ohne dass dabei die Gesamtmenge an am Kügelchen, d.h. der Innenseite des Kügelchens, gebundenem Substrat in signifikanter Weise betroffen ist. Durch die Abtrennung von Substrat wird eine reaktive Stelle auf dem Kügelchen freigelegt und somit aktiviert. Die enzymmodifizierten Gruppen des festen Trägers werden zur Verankerung der synthetischen Testverbindung verwendet, wobei diejenigen Gruppen, die keine Modifikation durchliefen, zur Verankerung der Mehrzahl der codierenden Moleküle verwendet werden.
(b)Verwendung einer polymeren Schutzgruppe zur selektiven Blockierung exponierter ungeschützter funktioneller Gruppen auf der Außenseite eines Trägerkügelchens. Die ungeschützten funktionellen Gruppen im Inneren des Trägers werden zur Verankerung des codierenden Moleküls verwendet. Die verbliebenen geschützten funktionellen Gruppen werden dann entschützt und als Anker für die synthetische Testverbindung der Bibliothek verwendet. In einem besonderen Beispiel, siehe unten, werden zugängliche funktionelle Gruppen auf der Oberfläche durch das Polymer Polyglutaminsäure mit einem Molekulargewicht (MW) von 30 kD vollständig blockiert, ohne dass davon die Gesamtmenge an am Kügelchen gebundenem Peptid betroffen ist. Falls das zur Blockierung verwendete Polymer über seine α-Carboxylgruppe gebunden ist, so kann durch einen nach Entschützung der x-Aminogruppe des Polymers in einem einzigen Schritt durchgeführten Edman-Abbau eine Regeneration der Oberflächenaminogruppen erfolgen.
(c)Erzeugung eines anderen Zustands im Innern des Kügelchens, beispielsweise durch Gefrieren von Wasser im Inneren der Kügelchen und anschließende Umsetzung der Kügelchen in einem organischen Lösungsmittel bei geringer Temperatur, um das Wasser im gefrorenen Zustand zu halten. Somit kann eine spezifische Reaktion auf der Oberfläche des Kügelchens, jedoch nicht in dessen Innern, erfolgen.

5.4 STRATEGIE ZUR DURCHFÜHRUNG SICH ABWECHSELNDER SYNTHESEN DER CODIERENDEN MOLEKÜLE BZW. DER SYNTHETISCHEN TESTVERBINDUNGSMOLEKÜLE WÄHREND DER ERZEUGUNG CODIERTER BIBLIOTHEKEN
Eine wichtige Synthesearbeit während der Synthese einer codierten Bibliothek beinhaltet die Verwendung orthogonaler Schutzgruppen. Zur effizienten Synthese der codierenden Moleküle parallel zur Synthese der synthetischen Testverbindung der Bibliothek auf dem gleichen Festträgerpartikel müssen die für die Synthesen verwendeten Schutzgruppen jeweils orthogonal sein, d.h. während aller Synthesearbeiten an einem Molekül müssen die Schutzgruppen am anderen Molekül intakt bleiben.
Es lassen sich mehrere orthogonale Kombinationen von Schutzgruppen für die Konstruktion der synthetischen Testverbindung und der codierenden Moleküle einer molekularen Bibliothek verwenden. Geeignete Schutzgruppen sind bei Geiger und Konig, 1981, „The Peptides" (Gross und Meinhofer, Hrsg.) S. 3-101, Academic Press: New York) beschrieben. Eine besonders geeignete Kombination beinhaltet durch Base und Säure abspaltbare Schutzgruppen. So können beispielsweise bei der Synthese einer codierten Bibliothek von Polyamiden die basenempfindliche Schutzgruppe N^α-[(9-Fluorenylmethyl)oxy]carbonyl (Fmoc) zum Zusammenbau der synthetischen Testverbindungsmoleküle und die säurelabile Schutzgruppe N^α-[[2-(3,5-Dimethoxyphenyl)prop-2-yl]oxy]carbonyl (Ddz) zum Zusammenbau der codierenden Peptidmoleküle verwendet werden. Fmoc-Schutzgruppen und ihre Verwendung in der Peptidsynthese sind bei Carpino und Han (1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409) und Ddz-Schutzgruppen bei Voss und Birr (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1981, 362, 717-725) beschrieben. Beide Arten von Schutzgruppen wurden traditionell zur Blockierung der α-Aminogruppen von α-Aminosäuren während der Peptidsynthese eingesetzt; es können jedoch auch andere geeignete Aminogruppen von diesen Gruppen während der Synthese eines Polyamids geschützt werden. Falls die Polyamide von Interesse Seitenketten mit reaktiven funktionellen Gruppen enthalten, kann ein Schutz der reaktiven Gruppen in Form von t-Butoxycarbonyl- (Boc) und t-Butyl (t-Bu)-Derivaten oder vorzugsweise in Form der säurestabileren Benzyl- und Benzyloxycarbonylderivate sinnvoll sein. Falls die reaktiven Seitenkettengruppen unter Verwendung von Gruppen des t-Butyl-Typs geschützt werden, so kann das codierende Peptid unter Verwendung einer Schutzgruppe, die säurelabiler als Ddz ist, wie z.B. Nps (Zervas et al., 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:3660) oder Trt (Zervas et al., 1956, J. Am. Chem. Soc. 78:1359), synthetisiert werden.
Eine alternative Kombination von orthogonalen Schutzgruppen bei der Synthese einer codierten Bibliothek von Polyamiden beinhaltet die Verwendung von Fmoc oder anderen basenlabilen Gruppen zum Zusammenbau der codierenden Peptide, sowie Ddz oder anderer säurelabiler Gruppen zum Zusammenbau der Ligandenbindungskandidaten.
Eine alternative orthogonale Kombination von Schutzgruppen zur abwechselnden und parallelen Synthese codierender Moleküle und der synthetischen Testverbindung beinhaltet Trichlorethoxycarbonyl als Aminoschutzgruppe sowie Trichlorethyl als Hydroxylschutzgruppe, die sich unter Verwendung eines Reduktionsmittels, wie z.B. Zink in Essigsäure, abtrennen lassen, zur Synthese von z.B. Polyestern in einer codierten Bibliothek von Polyestern, sowie Boc und t-Bu oder eine andere säurespaltbare Gruppe zur Synthese der codierenden Peptide. Wie zuvor können die beiden Sätze orthogonaler Schutzgruppen gegeneinander austauschbar sein, d.h. N^α-Trichlorethoxycarbonyl-geschützte Aminosäuren werden zur Herstellung der codierenden Peptide und N^α-Boc-geschützte Monomere zur Herstellung der synthetischen Testverbindungspolyamide verwendet.
Eine weitere geeignete Kombination orthogonaler Schutzgruppen beinhaltet die Trimethylsilylethoxycarbonylgruppe, die mit Fluoridionen abgetrennt werden kann, sowie eine hoch säureempfindliche Schutzgruppe, wie z.B. Ddz oder Bpoc (2-Biphenyl-2-propoxycarbonyl). Beide Arten von Schutzgruppen lassen sich für den N-Schutz während des Zusammenbaus entweder des Polyamids, in einer Synthese einer codierten Polyamidbibliothek, oder des codierenden Peptids verwenden.
Für die Synthese der peptidcodierenden Moleküle in bevorzugten codierten Bibliotheken werden allgemein bekannte Techniken der Festphasenpeptidsynthese, einschließlich geeigneter Schutzgruppenstrategien, verwendet. Der relevante veröffentlichte Stand der Technik der Peptidsynthese ist ziemlich umfangreich und umfasst unter anderem Stewart und Young, 1984, „Solid Phase Synthesis" 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford Il; Bodanszky, Y. Klausner, und M. Ondetti „Peptide Synthesis" 2. Ausgabe, Wiley, New York, 1976; E. Gross und J. Meienhofer (Herausgeber) „The Peptides", Bd. 1, fortlaufende Reihe, Academic Press, New York, 1979.
5.5 SPEZIFISCHE BIBLIOTHEKEN VON TESTVERBINDUNGEN SOWIE VERFAHREN ZU DEREN SYNTHESE
Spezifische Arten von Verknüpfungen für die in Abschnitt 5 aufgeführten Bibliotheken werden nachfolgend ebenso wie synthetische Reaktionen, die zur Erzeugung dieser Bibliotheken verwendet werden können, d.h. Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt (ii) der allgemeinen Vorschrift zur Erzeugung von Bibliotheken (siehe Abschnitt 5.2) verwendet werden können, beschrieben. Wie dem Durchschnittsfachmann aus der vorangegangenen Diskussion und dem folgenden beispielhaften Material leicht ersichtlich ist, lässt sich zur Herstellung der erfindungsgemäßen Bibliotheken jede der zahlreichen, in der Synthesechemie bekannten Kondensationsreaktionen verwenden, die mit entsprechenden Schutzgruppen schrittweise ablaufen kann. Die Liste von Untereinheiten, die zur Herstellung solcher Bibliotheken verwendet werden können, ist enorm; viele geeignete Reagenzien sind kommerziell erhältlich oder lassen sich mit allgemein bekannten Vorschriften synthetisieren. Eine Teilliste von Strukturen geeigneter Untereinheiten ist in 5 dargestellt. Beispiele für Synthesereaktionen sind in den folgenden Unterabschnitten und dem Schema beschrieben.
Bei den hier abgegebenen Schemen steht Z für eine beliebige Alkyl-, Aryl-, Heteroalkyl- oder Heteroarylgruppe mit einer oder mehreren Gruppen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, H, -NH₂, -OH, CO₂H, -CO₂R, -CONHR und dergleichen. Dabei bedeutet Alkyl einen gesättigten oder ungesättigten C₁-C₂₀-Kohlenwasserstoff. Aryl bedeutet einen aromatischen C₅-C₂₀-Kohlenwasserstoff. P mit einem Kreis bezieht sich auf einen Träger in separater Phase, z.B. ein Harzkügelchen. P (ohne Kreis) bezieht sich auf eine Schutzgruppe. Die restlichen Symbole besitzen ihre übliche Bedeutung.
Diese Strategien lassen sich zur Herstellung codierter Bibliotheken durch Verwendung geeigneter orthogonaler Schutzgruppen, wie oben beschrieben, einsetzen.
5.5.1 AMIDBINDUNGEN ENTHALTENDE BIBLIOTHEKEN MIT ANDEREN UNTEREINHEITEN ALS α-AMINOSÄUREN
Verschiedene Bibliotheken mit einer oder mehreren Amidbindungen, einschließlich Bibliotheken von Polyamiden, deren Strukturen andere Aminosäuren als α- Aminosäuren enthalten, werden in Betracht gezogen. Schema 1 zeigt eine Synthesestrategie für Polyamide: Schema 1
Ein geeigneter fester Träger, wie beispielsweise einer der in Abschnitt 5.2 beschriebenen Träger, wird mit einem Carbonsäureanhydrid in einem geeigneten Lösungsmittel unter Erhalt eines Carbonsäureamidträgers gekuppelt. Das geträgerte Säureamid wird weiter durch Aktivierung der Carboxylgruppe unter Verwendung einer Verbindung, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart von Hydroxybenzotriazol (HOBt), mit anschließender Kondensation mit einem eine geschützte Aminogruppe enthaltenden Diamin verlängert, wobei die Entschützung des Kondensationsprodukts ein Diamid-Amin am festen Träger ergibt. Die Wiederholung dieses Synthesezyklus, d.h. nacheinander erfolgende Umsetzung mit einem Anhydrid, Kondensation mit einem einzelnen geschützten Diamin und Entschützung, führt zu einem wachsenden Polyamid am festen Träger. Falls die vervollständigte Polyamidsequenz Schutzgruppen enthält, so wird sie ohne Ablösung vom festen Träger entschützt.
Ein alternativer Syntheseansatz für Polyamide beinhaltet die Modifikation der obigen Synthese durch Austausch des Anhydrids gegen eine teilweise geschützte Dicarbonsäure, z.B. einen geeigneten Dicarbonsäurehalbester. Das erhaltene Esteramidharz wird entschützt und mit z.B. DCC/HOBt vor der Kondensation mit dem Diamin aktiviert.
Zur Synthese von synthetischen Testverbindungspolyamiden, deren Strukturen α-Aminosäuren enthalten, wie z.B. Peptide und Peptidmimetika, können die bereits beschriebenen Peptidsynthesetechniken verwendet werden.
In einer Ausführungsform kann als N-terminaler Rest der synthetischen Testpolyamide der Bibliothek Pyroglutamat einbezogen werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden zum Einbau in eine synthetische Testpolyamidsequenz Untereinheiten gewählt, die nützliche chemische und strukturelle Eigenschaften verleihen. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Bibliotheken von Polyamiden vor, die besser definierte strukturelle Eigenschaften als native Peptide aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Polyamidbibliothek erzeugt werden, die eine reduzierte Peptidbindung enthält, d.h. R₁-CH₂-NH-R₂, worin R₁ und R₂ für Aminosäurereste oder -sequenzen stehen. Eine reduzierte Peptidbindung kann in Form einer Dipeptiduntereinheit eingeführt werden. Ein solches Molekül wäre gegenüber Peptidbindungshydrolyse, z.B. Proteaseaktivität, resistent. Derartige Bibliotheken könnten Liganden mit einmaliger Funktion und Aktivität im Vergleich mit denen der entsprechenden nativen Peptide, wie beispielsweise verlängerte Halbwertzeiten in vivo aufgrund der Resistenz gegenüber metabolischem Abbau oder Proteaseaktivität, bereitstellen.
Ein Polyamid mit erzwungener, cyclischer oder starrer Struktur kann nach dem bereits beschriebenen Verfahren hergestellt werden, vorausgesetzt, dass an wenigstens zwei Positionen in der Sequenz der gesamten synthetischen Testverbindung Untereinheiten, z.B. Aminosäuren, eingefügt werden, die zur Quervernetzung fähige chemische funktionelle Gruppen bereitstellen, so dass nach Behandlung zur Ausbildung einer Quervernetzung das Polyamid eine erzwungene Struktur einnimmt, cyclisisert wird oder starr gemacht wird. Zu zur Quervernetzung eines Peptids fähigen Aminosäuren gehören beispielsweise Cystein zur Ausbildung von Disulfiden, Asparaginsäure zur Ausbildung eines Lactons oder eines Lactams sowie ein Chelator, wie z.B. γ-Carboxylglutaminsäure (Gla) (im Handel z.B. von der Firma Bachem erhältlich) zur Chelatierung eines Übergangsmetalls und Ausbildung einer Quervernetzung. Eine geschützte γ-Carboxylglutaminsäure kann durch Abänderung der von Zee-Cheng und Olson (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94:1128-1132) beschriebenen Synthese hergestellt werden. Eine Bibliothek, in der die Polyamidsequenz wenigstens zwei zur Quervernetzung fähige Untereinheiten umfasst, kann beispielsweise durch Oxidation von Cysteinresten unter Ausbildung eines Disulfids oder Addition eines Metallions unter Ausbildung eines Chelats behandelt werden, um das Peptid querzuvernetzen und ein Peptid mit erzwungener, cyclischer oder starrer Struktur zu bilden. Cyclische Motive sind ausführlich in der US-Anmeldung mit der Seriennr. 07/717,454 , eingereicht am 19. Juni 1991, offenbart.
Einige einfache Aminosäuren, die sich als Untereinheiten für den Einbau in eine Bibliothek verwenden lassen, umfassen die folgenden Verbindungen:
Nichtklassische Aminosäuren können bei der Synthese von Polyamiden verwendet werden. Die folgenden nichtklassischen Aminosäuren können in eine Polyamidbibliothek eingebaut werden, um bestimmte Konformationsmotive einzuführen: 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carboxylat (Kazmierski et al., 1991, J. Am. Chem. Soc., 113:2275-2283); (2S,3S)-Methylphenylalanin, (2S,3R)-Methyl-phenylalanin, (2R,3S)-Methylphenylalanin und (2R,3R)-Methylphenylalanin (Kazmierski und Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); 2-Aminotetrahydronaphthalin-2-carbonsäure (Landis, 1989, Ph.D. Thesis, University of Arizona); Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carboxylat (Miyake et al., 1984, J. Takeda Res. Labs., 43:53-76); β-Carbolin (D und L) (Kazmierski, 1988, Ph.D. Thesis, University of Arizona); HIC (Histidin-isochinolincarbonsäure) (Zechel et al., 1991, Int. J. Pep. Protein Res., 38:131-138).
Die folgenden Aminosäureanaloge und Peptidomimetika können in die Bibliothek einer synthetischen Testverbindung eingebaut werden, um spezifische Sekundärstrukturen zu induzieren oder zu begünstigen: LL-Acp (LL-3-Amino-2-propenidon-6-carbonsäure), ein eine β-Schleife induzierendes Dipeptidanalog (Kemp et al., 1985, J. Org. Chem., 50:5834-5838); β-Faltblatt induzierende Analoge (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:5081-5082); β-Schleifen induzierende Analoge (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:5057-5060); α-Helix induzierende Analoge (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:4935-4938); γ-Schleife induzierende Analoge (Kemp et al., 1989, J. Org. Chem., 54:109:115) sowie Analoge, die von den folgenden Literaturstellen bereitgestellt werden: Nagai und Sato, 1985, Tetrahedron Lett., 26:647-650; DiMaio et al., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans., S. 1687; ebenso ein Gly-Ala-Schleife-Analog (Kahn et al., 1989, Tetrahedron Lett., 30:2317); Amidbindungsisostere (Jones et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:3853-3856); Tetrazol (Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soc., 110:5875-5880); DTC (Samanen et al., 1990, Int. J. Protein Pep. Res., 35:501-509) sowie bei Olson et al., 1990, J. Am. Chem. Soc., 112:323-333 und Garvey et al., 1990, J. Org. Chem., 56:436 gelehrte Analoge.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner die Modifikation oder Derivatisierung von synthetischen Testverbindungspolyamiden in einer Bibliothek, wie beispielsweise in der US-Anmeldung mit der Seriennr. 07/717,454 , eingerichtet am 19 Juni 1991, beschrieben, vor. Modifikationen von Peptiden sind dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt und umfassen die Phosphorylierung, Sulfatierung, Carboxymethylierung und Acylierung. Die Modifikationen können mit chemischen oder enzymatischen Mitteln realisiert werden. Da derartige Modifikationen zu nichtsequenzierbaren Peptiden führen können, ist die Verwendung eines codierenden Moleküls in solchen Bibliotheken bevorzugt.
In einem weiteren Aspekt können glykosylierte oder fettsäureacylierte Peptidderivate hergestellt werden. Die Herstellung glykosylierter oder fettsäureacylierter Peptide ist im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z.B. US-Anmeldung mit der Seriennr. 07/717,454 ).
Ebenso können Fettsäurepolyamidderivate hergestellt werden. Dabei kann beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, eine freie Aminogruppe acyliert, z.B. myristoyliert werden. Diese und weitere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Peptid-Fettsäure-Konjugate sind im Britischen Patent GB-8809162.4 , Internationale Patentanmeldung PCT/AU89/00166 , offenbart.
5.5.2 BIBLIOTHEKEN MIT CARBAMATBINDUNGEN
Die vorliegende Erfindung umfasst synthetische Testverbindungen, die eine oder mehrere Carbamat (d.h. Polyurethan)-Bindungen enthalten, einschließlich Polycarbamate Zwei Strategien zur Bildung von Carbamaten sind im Schema II dargestellt Schema II
Zur Synthese der beiden unterschiedlichen Arten von Carbamaten lassen sich Kupplungen von Isocyanaten und Diolen oder Aminoalkoholen verwenden. So wird beispielsweise ein geeignetes Harz, wie z.B. das für die Synthese von Polyamiden oben verwendete funktionalisierte Harz, durch Umsetzung mit Phosgen zum Isocyanat umgewandelt, woraufhin das Isocyanat mit einem aminogeschützten Aminoalkohol unter Erhalt des geschützten Carbamats gekuppelt wird. Die Entschützung des Harzurethans führt zu einem Aminourethanharz, das zur Wiederholung des gleichen Synthesezyklus verwendet wird, wobei ein Polyurethan entsteht, d.h. Umsetzung mit Phosgen mit anschließender Kupplung mit einem N-geschützten Aminoalkohol und Entschützung ergibt ein Aminodiurethanharz usw.
Eine zweite Art von geträgertem Carbamat wird durch Abänderung der obigen Synthesevorschrift wie folgt erhalten. Das Ausgangsaminoharz wird zum Isocyanat umgewandelt, das Isocyanat wird durch Umsetzung mit teilweise geschütztem Diol zu einem geschützten Carbamat umgewandelt, das geschützte Carbamatharz wird unter Erhalt eines Hydroxycarbamats entschützt, das Hydroxycarbamat wird durch Umsetzung mit einem aminogeschützten Aminoalkylisocyanat zu einem Aminodicarbamat umgewandelt, wonach die Entschützung erfolgt.
5.5.3 BIBLIOTHEKEN MIT HARNSTOFFBINDUNGEN
Eine Strategie zur Synthese verschiedener Härnstoffbindungen enthaltender Strukturen ist in Schema III dargestellt.
Schema III
Ein geeignetes, mit Isocyanatgruppen funktionalisiertes Harz, wie beispielsweise das bei der Synthese der oben beschriebenen Carbamate verwendete Harz, wird durch Umsetzung mit einem teilweise geschützten Diamin und anschließender Entschützung zu einem Aminoharnstoff und das Aminoharnstoffharz unter Verwendung von Phosgen zu einem Isocyanat umgewandelt. Das Isocyanatharnstoffharz wird dann der gewünschten Anzahl an den obigen, aus drei Schritten bestehenden Synthesezyklen unterzogen, so dass Polyharnstoffe gebildet werden.
5.5.4 BIBLIOTHEKEN MIT ESTERBINDUNGEN
Eine Strategie für die Synthese von Bibliotheken mit Esterbindungen ist in Schema IV dargestellt.
Schema IV
Ein geeignetes Harz, wie beispielsweise das in der Festphasenpeptidsynthese nach Merrifield verwendete Hydroxyalkylharz, in einem Lösungsmittel zum Aufquellen, wie z.B. Methylenchlorid, wird mit einer in geeigneter Weise geschützten Hydroxycarbonsäure, vorzugsweise in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, wie z.B. DCC, kondensiert, so dass nach Entschützung ein geträgerter Hydroxyester erhalten wird, der unter Verwendung der gleichen Acylierungs-Entschützungszyklen weiter verlängert wird.
5.5.5 BIBLIOTHEKEN MIT AMINBINDUNGEN
Eine Strategie zur Synthese von Aminen ist in Schema V dargestellt:
Schema V
Ein geeignetes Harz, wie beispielsweise das in der Amidsynthese oben verwendete Harz, wird zu einem Nitroalkylaminharz über reduktive Aminierung unter Verwendung eines Nitroaldehyds umgewandelt und weiter zum primären Amin reduziert, und zwar unter Verwendung einer der zahlreichen bekannten Reaktionen zur Reduktion von Nitroalkaminen zu primären Aminen (z.B. Reduktion mittels Lithiumaluminiumhydrid). Das auf dem Harz vorliegende primäre Amin wird durch Wiederholung der Abfolge reduktive Alkylierung-Reduktion unter Erhalt des gewünschten Polyamins verlängert.
Die Reduktion eines Nitroalkylaminharzes im obigen Verfahren lässt sich durch Austauschen des Nitroaldehyds der reduktiven Aminierung gegen ein N-geschütztes Aminoaldehyd und Abtrennen der Schutzgruppe des erhaltenen Produkts in einem separaten Syntheseschritt vermeiden.
5.5.6 BIBLIOTHEKEN MIT SULFIDEN UND DISULFIDBINDUNGEN
Eine Strategie zur Synthese verschiedener Polysulfid- und Polydisulfidstrukturen ist im Schema VI dargestellt:
SCHEMA VI
Ein geeignetes Harz, z.B. ein in der Festphasenpeptidsynthese nach Merrifield verwendetes Harz, wird funktionalisiert, so dass es freie Thiolgruppen aufweist. Das Thiolharz wird mit einem geschützten Thioalkylhalogenid alkyliert und das Produkt unter Erhalt eines Thioalkylharzsulfids entschützt. Die geträgerte Thioalkylsulfidokette wird weiter durch Wiederholung des Alkylierungs-Entschützungszyklus verlängert, so dass sich ein geträgertes Polysulfid ergibt.
Mit der obigen Synthese lassen sich geträgerte Disulfide erhalten, falls das geschützte Thioalkylhalogenid durch ein geschütztes Thioalkylchlorsulfenat oder Thioalkylmethoxycarbonylsulfenat ersetzt wird.
5.5.7 BIBLIOTHEKEN MIT KOHLENSTOFF-KOHLENSTOFFBINDUNGEN
Verschiedene Polyalkane, Polyalkene, Polyhalogenalkene und Polyole werden in Betracht gezogen. Strategien zur Synthese solcher Bibliotheken sind in Schema VII dargestellt:
SCHEMA VII
Ein geeignetes Harz wird mit Carbonylgruppen funktionalisiert (z.B. durch kontrollierte Oxidation von Hydroxyalkylträgergruppen), mit einem Wittig-Reagens kondensiert, das aus Triphenylphosphin und einem Halogenalkyldialkylacetal dargestellt wird, und unter Erhalt eines eine ungesättigte Aldehydkette enthaltenden Harzes entschützt. Diese Kette kann zu einem Polyenaldehyd unter Verwendung der gleichen Abfolge aus Wittig-Kondensation und Entschützung verlängert werden. Die Behandlung des geträgerten Polyens mit einem molekularen Halogen, wie beispielsweise Chlor oder Brom, führt zu einem Halogenalkan an einem Harz. Die Umwandlung dieser Halogenalkane in ihre vollständig dehalogenierten reduzierten Derivate durch Umsetzung mit Tributylzinnhydrid oder einem elektropositiven Metall, wie z.B. Zink, in Gegenwart einer schwachen Säure wird ebenso in Betracht gezogen. Durch vorsichtige Behandlung des geträgerten Polyens mit einem Oxidierungsmittel, z.B. Permanganat oder Periodat, erhält man Polyole. Weitere Polyole können produziert werden, indem man das Polyen einer Abfolge aus Hydroborierung und Oxidation, einer Abfolge aus Epoxidierung (über eine Persäure, wie z.B. m-Chlorperbenzoesäure) und Hydrolyse oder einer Abfolge von Quecksilberacetat und alkalischem Borhydrid aussetzt.
5.5.8 BIBLIOTHEKEN POLYCYCLISCHER VERBINDUNGEN UND FUNKTIONALISIERTER POLYCYCLISCHER VERBINDUNGEN
Verschiedene polycyclische und funktionalisierte polycyclische Verbindungen werden in Betracht gezogen. Eine Strategie zur Synthese polycyclischer und verwandter Strukturen ist in Schema VIII dargestellt, in dem R₁, R₂ und R₃ für verschiedene substituierte Alkyl- oder Arylgruppen mit der oben angegebenen Bedeutung stehen:
SCHEMA VIII
Schema VIII zeigt die Darstellung eines gesättigten Kohlenwasserstoffs. Als Alternative lassen sich auch ungesättigte Strukturen darstellen. Ein geeignetes Harz, wie beispielsweise das oben beschriebene Carbonylharz, wird zu einem Alkenharz, z.B. mittels einer Wittig-Kondensation, umgewandelt und dieses Harz in einer percyclischen Umsetzung vom Diels-Alder-Typ mit einem in geeigneter Weise aktivierten, z.B. elektrophilen, Diendimethylacetal verwendet, so dass man nach Hydrolyse der Acetalgruppe einen geträgerten funktionalisierten Cyclohexenylaldehyd erhält. Diese geträgerte Struktur lässt sich weiter durch Wiederholung der Abfolge aus Wittig-Kondensation, Cycloaddition und Entschützung unter Erhalt eines geträgerten Polycyclohexenaldehyds verlängern, der wie folgt weiter funktionalisiert werden kann: (i) durch Halogenierung, z.B. Bromierung oder Chlorierung, unter Erhalt eines Polyhalogencyclohexanylaldehyds, (ii) durch Reduktion des Polyhalogencyclohexanylaldehyds, z.B. unter Verwendung von Tributylzinnhydrid oder einem elektropositiven Metall (z.B. Zn) und einer schwachen Säure, wobei ein Polycyclohexanaldehyd oder -alkohol erhalten wird, und (iii) durch kontrollierte Oxidation des Polycyclohexanaldehyds unter Verwendung von Permanganat, einer Abfolge von Hydroborierung und Oxidation, einer Abfolge von Epoxidierung und Hydrolyse oder einer Abfolge von Epoxidierung und Reduktion (z.B. Epoxidierung mittels m-Chlorperbenzoesäure und anschließender Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid), wobei ein funktionalisiertes Polyol erhalten wird.
Ein weiteres Beispiel für eine cyclische Bibliothek ist in 6 dargestellt. Diese Bibliothek wird durch Binden von Brompropionsäure an einen Träger und Binden von Boc-geschütztem Cysteinmethylester an den Träger über Substitution von Brom mit der Schwefelseitenkette unter Bildung einer Sulfidverknüpfung hergestellt. Boc/Fmoc-geschützte Diaminosäuren, wie z.B. Diaminobuttersäure oder Lysin, können addiert werden. Die Entschützung der einen Schutzgruppe gestattet die Substitution mit einer beliebigen Carbonsäure. Die Entschützung der anderen Aminogruppe gestattet die Addition einer weiteren Diaminosäure. Diese Schrittfolge wird so viele Male wie gewünscht wiederholt. Schließlich wird die Methylestergruppe vom Cystein hydrolysiert, was die Umsetzung mit einer entschützten Aminogruppe unter Cyclisierung der Struktur gestattet.
5.5.9 BIBLIOTHEKEN POLYSUBSTITUIERTER RINGSTRUKTUREN, DIE ALS GERÜST DIENEN KÖNNEN
Verschiedene polysubstituierte Strukturen, die als Gerüst dienen können, werden in Betracht gezogen. Eine allgemeine Strategie zur Synthese einer solchen Struktur ist in Schema IX dargestellt: SCHEMA IX
Eine allgemeine Strategie zur Herstellung eines spezifischen Typs von Gerüstbibliotheken ist in Schema X dargestellt:
SCHEMA X
Zu geeigneten Gerüsten gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Cyclopentan, Kemps Trisäure (Kemp und Petrakis, 1981, J. Org. Chem. 46:5140-5143), ein durch aufeinander folgende Kupplung von Diaminocarbonsäuren hergestelltes verzweigtes Konstrukt, cyclische Matrizen, wie beispielsweise die von Mutter et al. (1992, J. Am. Chem. Soc. 114-1463-1470) beschriebenen, Steroide, Benzodiazepine und dergleichen.
Ein Ansatz zur Bindung eines Derivats von cis-1,3,5- Cyclohexantricarbonsäure an ein Harz vom Merrifield-Typ mit anschließender Derivatisierung jeder der drei Carbonsäuren der Trisäure ist in Abschnitt 9 unten als ein Beispiel für eine Synthese einer geträgerten polysubstituierten Ringstruktur, die als Gerüst dienen kann, beschrieben (siehe Schema XIV, unten).
Als zweites Beispiel für eine Synthese einer polysubstituierten Ringstruktur, die als Gerüst dienen kann, ist der Zusammenbau und die Derivatisierung von 1,4-Benzodiazepinen auf der Grundlage der veröffentlichten Arbeit von Ellman und Bunin (Chemical & Engineering News, 18. Januar, 1993, S. 33) nachfolgend angegeben. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein geeignetes Harz, wie etwa ein mit einem 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure-Linker funktionalisiertes Harz vom Merrifield-Typ, mit einem 2-Amino-4'-hydroxybenzophenon, dessen Aminogruppe mit der Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe geschützt ist, weiter funktionalisiert. Nach Abtrennen des Fmoc, Kupplung des erhaltenen Anilins mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure unter Erhalt eines Anilids, Abtrennen des Fmoc vom Anilid und Cyclisierung wird ein geträgertes 1,4-Benzodiazepin erhalten, das am Anilidstickstoff mit verschiedenen Elektrophilen weiter alkyliert werden kann, so dass man verschiedene Benzodiazepinderivate für die weitere Untersuchung erhält.
Eine der kleinsten möglichen Ringstrukturen zur Verwendung als Gerüst ist der Cyclopentanring (7).
Codierte Versionen der oben beschriebenen Bibliotheken von polysubstituierten Ringstrukturen sind bevorzugte Ausführungsformen. Am stärksten bevorzugt sind codierte Bibliotheken, bei denen es sich bei den codierenden Molekülen um Peptide handelt. Für die Synthese der peptidcodierten Bibliotheken werden die allgemeine Vorgehensweise in Abschnitt 5.1 sowie die in Abschnitten 5.2 und 5.3 umrissenen Synthesestrategien verwendet.
5.5.10 BIBLIOTHEKEN AUF DER GRUNDLAGE VON AUS AMINOSÄUREN KONSTRUIERTEN GERÜSTSTRUKTUREN
Eine Gerüststruktur, die einen größeren Konformationsraum kartiert und bei der es sich um eine einfache verzweigte Anbindung handelt, wird durch aufeinander folgende Kupplung von Diaminocarbonsäuren konstruiert (siehe 3). Bei verschiedenen Arten der einen ausgedehnten Raum kartierenden Gerüststrukturen handelt es sich um flexible cyclische oder verzweigte Gerüststrukturen. Die Prinzipien dieser Bibliotheken sind in 3 dargestellt. Als Beispiel für die Konstruktion einer Gerüstbibliothek zeigen wir hier die Synthese einer verzweigten Bibliothek (Schema XV, Abschnitt 9 unten).
5.6 VERFAHREN ZUM NACHWEIS UND ZUR IDENTIFIZIERUNG VON LIGANDEN IN BIBLIOTHEKEN VON TESTVERBINDUNGEN
Zusätzlich zur Bereitstellung von Bibliotheken vieler verschiedener chemischer Strukturen als synthetische Testverbindung sowie Verfahren zu deren Synthese umfasst die vorliegende Erfindung ferner Verfahren zur Absuche der Testverbindungen einer Bibliothek, um Liganden in der Bibliothek zu identifizieren, die eine biologische Aktivität von Interesse, wie z.B. Bindung, Stimulierung, Hemmung, Toxizität, Geschmack usw. zeigen. Andere Bibliotheken können gemäß den unten beschriebenen Verfahren nach Enzymaktivität, enzymhemmender Aktivität sowie chemischen und physikalischen Eigenschaften von Interesse abgesucht werden. Viele Suchtests sind im Fachgebiet allgemein bekannt; zahlreiche Suchtests sind ebenso in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/717,454 , eingereicht am 19. Juni 1991, beschrieben).
Es kann passieren, dass es sich bei den während einer ersten Suche entdeckten Liganden nicht um die optimalen Liganden handelt. Tatsächlich ist die Synthese einer zweiten Bibliothek auf der Grundlage der während der ersten Suche ausgewählten Liganden häufig bevorzugt. Auf diese Weise kann man Liganden mit höherer Aktivität identifizieren.
5.6.1 BINDUNGSTESTS
Die vorliegende Erfindung gestattet die Identifizierung synthetischer Testverbindungen, die an Akzeptormoleküle binden. Dabei bezieht sich der Begriff „Akzeptormolekül", wie er hier verwendet wird, auf ein beliebiges Molekül, das an einen Liganden bindet. Bei Akzeptormolekülen kann es sich um biologische Makromoleküle, wie etwa Antikörper, Rezeptoren, Enzyme, Nukleinsäuren, oder um kleinere Moleküle, wie etwa bestimmte Kohlenhydrate, Lipide, organische Verbindungen, die als Arzneistoffe dienen, Metalle usw., handeln.
Die synthetische Testverbindung in erfindungsgemäßen Bibliotheken kann potenziell mit vielen unterschiedlichen Akzeptormolekülen Wechselwirken. Durch Identifizierung der jeweiligen Ligandenspezies, an die ein spezifisches Akzeptormolekül bindet, wird es möglich, die Ligandenspezies von Interesse physikalisch zu isolieren.
Da während eines jeden Such-/Nachweis-/Isolierungsschritts nur eine geringe Anzahl Festträgerkügelchen abgetrennt wird, verbleibt die Mehrzahl der Kügelchen im Kügelchenreservoir. Daher kann die Bibliothek mehrere Male wieder verwendet werden. Werden unterschiedliche Farb- oder Identifizierungsschemata für unterschiedliche Akzeptormoleküle (z.B. mit Fluoreszenzreportergruppen, wie z.B. Fluoreszein (grün), Texas Red (rot), DAPI (blau) und BODIPI, die jeweils als Tag auf den Akzeptoren vorliegen) sowie geeignete Exitationsfilter im Fluoreszensmikroskop oder dem Fluoreszenzdetektor verwendet, so lassen sich unterschiedliche Akzeptoren (Rezeptoren) zu einer Bibliothek hinzufügen und gleichzeitig auswerten, so dass die schnelle Suche nach spezifischen Zielen erleichtert wird. Durch diese Strategien werden nicht nur die Kosten verringert, sondern auch die Anzahl der Akzeptormoleküle, die abgesucht werden können, erhöht.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Akzeptormolekül von Interesse in einer Bibliothek eingeführt, worin es eine oder mehrere Ligandenspezies in der Bibliothek erkennt und daran bindet. Dabei findet sich jede Ligandenspezies, an die das Akzeptormolekül bindet, jeweils auf einem einzelnen Festphasenträger wieder, so dass der Träger und somit der Ligand sich leicht identifizieren und isolieren lässt.
Der gewünschte Ligand kann mit allen dem Durchschnittsfachmann bekannten herkömmlichen Mitteln isoliert werden, wobei die Erfindung hinsichtlich des Isolierungsverfahrens nicht beschränkt ist. So ist es beispielsweise, und ohne darauf beschränkt zu sein, möglich, eine Festträgerkügelchen-Ligandenkombination physikalisch zu isolieren, die die stärkste physikalisch-chemische Wechselwirkung mit dem spezifischen Akzeptormolekül zeigt. Dabei wird in einer Ausführungsform eine Lösung spezifischer Akzeptormoleküle zu einer Bibliothek gegeben, die 10⁵ bis 10⁷ Festphasenträgerkügelchen enthält. Das Akzeptormolekül wird mit den Kügelchen hinreichend lange inkubiert, so dass eine Bindung stattfinden kann. Anschließend wird der Komplex des Akzeptormoleküls und des an das Trägerkügelchen gebundenen Liganden isoliert. Weitere spezifische Ausführungsformen sind in den folgenden Verfahren aufgeführt, die die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers als lösliches Akzeptormolekül zur Bindung eines Liganden, bei dem es sich um ein Peptid handelt, beschreiben. Dabei ist ersichtlich, dass sich diese Verfahren leicht an den Nachweis der Bindung eines beliebigen Akzeptormoleküls anpassen lassen.
Zusätzlich zur Verwendung löslicher Akzeptormoleküle besteht in einer weiteren Ausführungsform die Möglichkeit, Liganden nachzuweisen, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, und zwar unter Verwendung intakter Zellen. Die Verwendung intakter Zellen ist dabei für die Verwendung mit Rezeptoren, die aus mehreren Untereinheiten bestehen oder labil sind, oder mit Rezeptoren, die eine funktionsfähige Lipiddomäne der Zellmembran benötigen, bevorzugt. Bei den bei dieser Technik verwendeten Zellen kann es sich entweder um lebende oder fixierte Zellen handeln. Die Zellen werden mit der Bibliothek inkubiert und binden an bestimmte Peptide in der Bibliothek unter Ausbildung einer „Rosette" zwischen den Zielzellen und dem relevanten Kügelchen-Peptid. Die Rosette lässt sich anschließend über differenzielle Zentrifugation isolieren oder physikalisch unter einem Präparationsmikroskop abtrennen.
Als Alternative kann man die Bibliothek unter Verwendung eines „Panning"-Verfahrens [etwa: Abfahrverfahren] mit Zelllinien, wie beispielsweise (i) einer „Eltern"-Zelllinie, auf deren Zelloberfläche der Rezeptor von Interesse fehlt, und (ii) einer rezeptorpositiven Zelllinie, z.B. einer Zelllinie, die durch Transfektion der Elternlinie mit dem für den Rezeptor von Interesse codierenden Gen abgeleitet ist, absuchen. Es besteht dann die Möglichkeit, die Bibliothek mit der folgenden Strategie abzusuchen:
(i) Die Bibliothek wird zunächst an ihren nichtspezifischen Kügelchen, die an die Zellen ohne den Rezeptor binden, abgereichert, indem ein Monolager der Elternzelllinie über die Standard-„Panning-Technik” eingeführt wird, so dass rezeptorspezifische nichtbindende Kügelchen oder irrelevante nichtbindende Kügelchen verbleiben; (ii) die nichtbindenden Kügelchen, die sowohl rezeptorspezifische als auch irrelevante Kügelchen umfassen, werden abgetrennt und auf ein Monolager der rezeptorpositiven Zelllinie aufgebracht, wobei das rezeptorspezifische Kügelchen an die rezeptorpositive Zelllinie bindet; (iii) die verbleibenden irrelevanten nichtbindenden Kügelchen werden durch vorsichtiges Waschen und Dekantieren abgetrennt, und (iv) das bzw. die rezeptorspezifische(n) Kügelchen wird bzw. werden mit einem Mikromanipulator, wie etwa einer Mikropipette, abgetrennt.
Als Alternative zu Tests mit ganzen Zellen für membrangebundene Rezeptoren oder Rezeptoren, die eine funktionsfähige Lipiddomäne der Zellmembran benötigen, lassen sich die Rezeptormoleküle in Liposomen rekonstituieren, wo die Reportergruppe oder das Reporterenzym gebunden werden kann.
Die vorangegangenen Beispiele beziehen sich auf die synthetische Testverbindung, wobei alle in den obigen Abschnitten beschriebenen Verbindungen bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. So kann ein Akzeptormolekül an eine Verbindung aus einer Vielfalt von Polyamiden, Polyurethanen, Polyestern, mehrfach funktionalisierten Strukturen, die als Gerüst fungieren, usw. binden.
In einer Ausführungsform kann das Akzeptormolekül direkt markiert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann ein markiertes sekundäres Reagenz zum Nachweis der Bindung eines Akzeptormoleküls an ein einen Liganden von Interesse enthaltendes Festphasenträgerpartikel verwendet werden. Die Bindung kann über die in-situ-Bildung eines Chromophors mit einer Enzymmarkierung nachgewiesen werden. Zu geeigneten Enzymen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Zweifarbentest unter Verwendung von zwei chromogenen Substraten mit zwei Enzymmarkierungen auf unterschiedlichen Akzeptormolekülen von Interesse eingesetzt werden. Dabei können mit einem Zweifarbentest sowohl kreuzreaktive als auch einfachreaktive Liganden identifiziert werden.
Zu weiteren Markierungen für die erfindungsgemäße Verwendung zählen gefärbte Latexkügelchen, magnetische Kügelchen, Fluoreszenzmarkierungen (z.B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Texas rot (TR), Rhodamin, freie oder chelatierte Salze der Lanthanidenreihe, vor allem Eu³⁺, um nur einige wenige Fluorophore zu nennen), Chemilumineszenzmoleküle, Radioisotope oder Markierungen für die Abbildung mittels Magnetresonanz. Zweifarbentests können mit zwei oder mehr gefärbten Latexkügelchen oder Fluorophoren, die bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, durchgeführt werden. Dabei können markierte Kügelchen manuell oder mit mechanischen Mitteln isoliert werden. Zu mechanischen Mitteln gehören das Fluoreszenz-aktivierte Sortieren, d.h. analog zu FACS, sowie Mittel zur Abtrennung mittels Mikromanipulator.
In spezifischen, unten aufgeführten Beispielen, werden Enzym-Chromogen-Markierungen und Fluoreszenzmarkierungen (FITC-Markierungen) verwendet.
Reaktive Kügelchen können auf der Grundlage der Intensität der Markierung, z.B. Farbintensität, Fluoreszenzintensität, magnetische Stärke oder Radioaktivität, um nur einige wenige Kriterien zu nennen, isoliert werden. Die am stärksten markierten Kügelchen können ausgewählt und der am Kügelchen gebundene Ligand entweder direkt, z.B. durch Edman-Sequenzierung oder, falls anwendbar, durch Massenspektrumanalyse, oder indirekt durch Sequenzieren des dem Liganden von Interesse entsprechenden codierenden Peptids strukturell charakterisiert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine willkürliche Auswahl von Kügelchen mit einer Markierungsstärke oberhalb einer willkürlichen Ausschlussgrenze ausgewählt und der Strukturanalyse unterzogen werden. Dabei kann man zur Quantifizierung der Farbintensität potenziell die moderne Bildanalysemikroskopie verwenden und somit die relative Affinität des Liganden für das Akzeptormolekül vor der Strukturanalyse des Kügelchenliganden präzise definieren. Auf ähnliche Weise lässt sich die quantitative Immunfluoreszenzmikroskopie anwenden, falls der Akzeptor mit einer Fluoreszenzmarkierung als Tag versehen ist. In noch einer weiteren Ausführungsform werden eine gewisse Markierungsstärke zeigende Kügelchen für die Zusammensetzungsanalyse, z.B. die Analyse der Aminosäurezusammensetzung im Fall von Peptidliganden, ausgewählt. Anschließend kann eine verfeinerte Bibliothek, die einen beschränkten Satz von in der Aminosäureanalyse als wichtig identifizierten Aminosäureuntereinheiten umfasst, hergestellt und abgesucht werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Ligand bzw. können die Liganden mit der größten Bindungsaffinität identifiziert werden, indem man das Akzeptormolekül von Interesse fortlaufend verdünnt, bis eine Bindung an lediglich einige wenige Festphasenträgerkügelchen der Bibliothek nachgewiesen wird. Als Alternative kann die Stringenz der Bindung mit dem Akzeptormolekül erhöht werden. Dem Fachmann wäre bewusst, dass die Stringenz der Bindung durch (i) Erhöhen der Innenstärke der Lösung, (ii) Erhöhen der Konzentration denaturierender Verbindungen, wie etwa Harnstoff, (iii) Erhöhen oder Absenken des pH-Werts der Testlösung, (iii) Verwendung eines einwertigen Akzeptormoleküls, (iv) Einschluss einer definierten Konzentration eines bekannten Konkurrenzmoleküls in das Reaktionsgemisch und (v) Verringern der Akzeptorkonzentration gesteigert werden kann. Andere Mittel zur Veränderung von Lösungsbestandteilen zur Veränderung von Bindungswechselwirkungen sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform können Liganden interessant sein, die eine Bindung mit geringer Affinität zeigen. Diese können ausgewählt werden, indem man zunächst alle hochaffinen Liganden abtrennt und anschließend die Bindung unter Bedingungen geringer Stringenz oder niedrigerer Verdünnung nachweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Doppelmarkierungstest verwendet werden. Dabei kann die erste Markierung zum Nachweis nichtspezifischer Bindung eines Akzeptormoleküls von Interesse an Kügelchen in Gegenwart von löslichen Liganden verwendet werden. Markierte Kügelchen werden dann aus der Bibliothek abgetrennt und der lösliche Ligand entfernt. Anschließend wird die spezifische Bindung des Akzeptormoleküls an die verbliebenen Kügelchen nachgewiesen. Dabei kann man erwarten, dass Liganden auf solchen Kügelchen das Akzeptormolekül an der gleichen Bindungsstelle wie der Ligand von Interesse binden und somit den Liganden von Interesse imitieren. Der Doppelmarkierungstest bietet den Vorteil, dass das Akzeptormolekül von Interesse nicht aufgereinigt werden muss, da der erste Schritt des Tests die Abtrennung nichtspezifischer positiv reagierender Kügelchen gestattet. In einer bevorzugten Ausführungsform können fluoreszenzmarkierte Akzeptormoleküle als Sonde zum Absuchen einer synthetischen Testbibliothek, z.B. unter Verwendung von FACS, eingesetzt werden.
5.6.2 BIOAKTIVITÄTSTESTS
Mit der vorliegenden Erfindung werden ferner Tests für die biologische Aktivität eines Ligandenkandidaten aus einer Bibliothek, die so behandelt wurde, dass eventuell verbliebene toxische Moleküle aus der Synthese abgetrennt wurden, beispielsweise durch Neutralisierung und ausgiebiges Waschen mit Lösungsmittel, sterilem Wasser und Kulturmedium, bereitgestellt. Zu den biologischen Aktivitäten, die getestet werden können, gehören Toxizität und Abtöten, Stimulierung und Wachstumsförderung, Signalweiterleitung, biochemische und biophysikalische Änderungen sowie physiologische Änderungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die synthetischen Testverbindungen der Bibliothek vom Festphasenträger, der hier auch als „Kügelchen" („bead") bezeichnet wird, selektiv abspaltbar. Vorzugsweise werden die synthetischen Testverbindungen an den Träger in separater Phase über mehrere spaltbare Linker gebunden, um mehr als einen Freisetzungs- und Suchtest zu gestatten. In einer Ausführungsform werden Kügelchen so hergestellt, dass nur ein Teil der synthetischen Testverbindung selektiv abspaltbar ist. Selektiv spaltbare Ligandenkanditaten, Linker und Kügelchen werden in Abschnitt 5.3.2 oben erörtert. Eine Bibliothek wird mit einem Spaltungsmittel behandelt, so dass die Spaltung eines Teils der synthetischen Testverbindung erfolgt. Zu Spaltungsmitteln gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, UV-Licht, Säure, Base, Enzym oder Katalysator. In einer Ausführungsform wird die Bibliothek so behandelt, dass 10-90% der synthetischen Testverbindung freigesetzt werden. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden 25-50% der synthetischen Testverbindung freigesetzt. Falls alle synthetischen Testverbindungsmoleküle spaltbar sind, so lässt sich eine nicht quantitative Spaltung durch Limitieren des Spaltungsmittels erreichen. In einem Aspekt ist die Expositionszeit bzw. Intensität von UV-Licht limitiert. In einer weiteren Ausführungsform ist die Konzentration an Reagenz limitiert. Nach Behandlung zur Erreichung der Spaltung kann die Bibliothek weiter behandelt werden, z.B. mittels Neutralisierung, um sie mit dem gewünschten Test biologisch kompatibel zu machen. In der Praxis wäre ein Durchschnittsfachmann leicht in der Lage, entsprechende Spaltungsbedingungen für die teilweise Abspaltung zu bestimmen, wenn alle synthetischen Testverbindungsmoleküle der Bibliothek über spaltbare Linker oder Bindungen an die feste Phase gebunden sind. Ferner wäre dem Durchschnittsfachmann verständlich, dass die relative Konzentration an freigesetzter synthetischer Testverbindung durch Variieren der Spaltungsbedingungen beeinflusst werden kann.
Da die Kügelchen der Bibliothek immobilisiert sind, bildet sich ein Konzentrationsgradient eines bestimmten Liganden-Kandidaten aus. Dabei finden sich hohe Konzentrationen an synthetischer Testverbindung in der Nähe des Kügelchens, von dem sie freigesetzt wurde. Somit gestatten Hinweise auf die biologische Aktivität von Interesse in der Nähe zu einem Kügelchen die Identifizierung und Isolierung eines Kügelchens sowie die strukturelle Charakterisierung durch Sequenzieren des der synthetischen Testverbindung entsprechenden codierenden Moleküls oder eine andere Technik. Die Identifizierung der synthetischen Testverbindung ist möglich, da nach der teilweisen Abspaltung für die Sequenzierung oder andere Charakterisierung genug auf dem Kügelchen übrig bleibt. In einer weiteren Ausführungsform können die Kügelchen in Mikrotitervertiefungen aufgeteilt werden (z.B. 10 Kügelchen/Vertiefung), wobei eine Fraktion des Liganden-Kandidaten freigesetzt und auf biologische Aktivität getestet werden kann, womit das potentielle Problem der Diffusion wegfällt. Unterschiedliche Teile der synthetischen Testverbindung können über unterschiedliche spaltbare Linker für nacheinander erfolgende Tests an einen Festphasenträger bzw. ein Festphasenkügelchen gebunden werden. Innerhalb dieser Beispiele bezieht sich der Begriff „Kügelchen" auf ein Trägerpartikel in separater Phase.
Ebenso sind biologische Tests mit ungespaltener synthetischer Testverbindung vorgesehen. Die biologische Aktivität von mit einer ganzen synthetischen Testverbindung beschichteten Kügelchen kann dann abgesucht werden. In einem Aspekt kann eine Bibliothek in ein Tier eingeführt werden. Kügelchen von Interesse können aus einem spezifischen Gewebe isoliert werden. Dabei können Kügelchen isoliert werden, die nach oraler, nasaler oder kutaner Verabreichung spezifisch absorbiert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind derartige Kügelchen magnetisch oder besitzen ein gewisses anderes identifizierendes Merkmal und sind somit leicht aus dem Gewebe zu isolieren. In einer weiteren Ausführungsform kann der immobilisierte Ligand selbst biochemische Änderungen mit entsprechenden Oberflächenrezeptoren hervorrufen.
Ferner ist dem Durchschnittsfachmann bewusst, dass in einem biologischen Test alle Zellen, die in Gewebekultur sowohl kurzzeitig als auch langzeitig gehalten werden können, verwendet werden können. Dabei soll der Begriff „Zelle", wie er hier verwendet wird, prokaryontische (z.B. bakterielle) und eukaryontische Zellen, Hefe, Schimmel und Pilze umfassen. Es können Primärzellen oder in Kultur gehaltene Linien verwendet werden. Weiterhin ist in der Anmeldung vorgesehen, dass biologische Tests an Viren durch Infektion oder Transformation von Zellen mit Virus durchgeführt werden können. So kann beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, die Fähigkeit eines Liganden zur Hemmung lysogener Aktivität von λ-Bakteriophage getestet werden, indem man transfizierte E. coli-Kolonien, die bei der Infektion keine klaren Plaques bilden, identifiziert.
Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Testen der Aktivität eines synthetischen Testverbindungsmoleküls einer Bibliothek sind nicht auf die vorstehenden Beispiele beschränkt; die Anmeldung sieht vor, dass ein beliebiges Testsystem modifiziert werden kann, um die vorliegend offenbarte Erfindung einzubauen. Dabei ist in der Anmeldung vorgesehen, dass solche Systeme im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
5.6.3 ENZYMMIMETIKA/ENZYMINHIBITOREN
Die vorliegende Erfindung umfasst weitere Bibliotheken, die zur Katalyse von Reaktionen fähig sind, d.h. Enzymbibliotheken, Bibliotheken von Molekülen, die als Koenzyme dienen, sowie Bibliotheken von Molekülen, die Enzymreaktionen hemmen können. Somit werden durch die Erfindung auch Verfahren bereitgestellt, die zum Testen auf Enzym- oder Koenzymaktivität oder auf die Hemmung von Enzymaktivität verwendet werden können.
Eine Enzymaktivität kann über die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts beobachtet werden. In einer besonderen Ausführungsform katalysiert ein Enzym aus einer Enzymbibliothek die durch alkalische Phosphatase katalysierte Reaktion, z.B. die Hydrolyse von 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (BCIP), und bildet ein blaues, unlösliches Reaktionsprodukt auf dem Festphasenträger (siehe Beispiel 13 unten).
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Zone mit einem beobachtbaren Produkt, z.B. Farbe oder Fluoreszenz, in einer halbfesten Matrix ausgebildet werden. Eine Bibliothek wird dabei in eine halbfeste Matrix, z.B. ein Agarosegel, schichtweise eingetragen und mit einem chromogenen oder anderen Indikatorsubstrat versetzt. Dort, wo ein Enzym- Kügelchen-Komplex aus einer Enzymbibliothek die gewünschte Enzymaktivität zeigt, bildet sich eine Zone mit Produkt. So kann beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Molekül aus einer Bibliothek, bei dem es sich um ein Analog von Meerrettich-Peroxidase handelt, durch Zugabe einer Lösung von Aminoantipyren (0,25 mg/ml; Kodak), Phenol (8 mg/ml) und H₂O (0,005%) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 identifiziert werden. Dabei bilden Kügelchen mit Enzymaktivität eine violette Farbzone. In einer anderen Ausführungsform können Kügelchen mit Proteaseaktivität durch Zugabe der allgemein bekannten kolorimetrischen Proteasesubstrate identifiziert werden.
Koenzymaktivität kann beobachtet werden, indem auf die von einem Koenzym vermittelte Enzymaktivität bei Fehlen des natürlichen oder gemeinen Koenzyms getestet wird.
Enzymhemmende Aktivität lässt sich mit einer teilweise freigesetzten synthetischen Testverbindung nachweisen. Dabei wird in einem Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Bibliothek in einer halbfesten Matrix, die ein Enzym enthält, schichtweise eingetragen. Die Bibliothek wird zur teilweisen Freisetzung von Liganden-Kandidatenmolekülen behandelt. Dort, wo das Molekül die Enzymaktivität hemmt, kann eine Zone ohne Produkt identifiziert werden. In einer Ausführungsform ist das Enzymsubstrat chromogen, wobei ein gefärbtes Produkt gebildet wird. Somit würde das Vorhandensein eines Enzyminhibitors eine Zone ohne Farbe ergeben. In einer weiteren Ausführungsform kann die Hemmung der Proteolyse von Hämoglobin oder eines Indikatorenzyms, wie z.B. alkalischer Phosphatase, über das Vorhandensein einer undurchsichtigen Zone in der halbfesten Matrix nachgewiesen werden. Dies liegt daran, dass das Vorhandensein eines Proteolyseinhibitors den Abbau des Hämoglobins oder Indikatorenzyms verhindert.
Dem Durchschnittsfachmann ist allgemein bekannt, dass ein synthetisches Testverbindungsmolekül, das Enzymaktivität, Koenzymaktivität zeigt oder das Enzymaktivität hemmt, ein Peptid, ein Peptidmimetikum, eines von verschiedenen Polymeren oder eine der in Abschnitt 5 beschriebenen Verbindungen sein kann. Von besonderem Interesse sind dabei die Polymere mit erzwungener Struktur, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, cyclischer, bicyclischer oder tricyclischer Strukturen, oder erzwungene Strukturen mit bestimmter Gerüststruktur, durch die eine einmalige katalytische Bindungstasche oder Oberfläche erzeugt werden kann.
5.6.4 TOPOLOGISCHE SEGREGATION
Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zum Segregieren des codierenden Moleküls im Inneren des festen Trägers sowie der Testverbindung auf der Außenseite, die für ein makromolekulares Akzeptormolekül von Interesse zugänglich ist. Das Verfahren umfasst dabei die Schritte der Synthese eines Linkers, bei dem es sich in der bevorzugten Ausführungsform um ein Peptid handelt. Der Linker enthält eine Sequenz, die sich mit einem leicht erhältlichen Enzym, wie beispielsweise Chymotrypsin oder einer anderen Endopeptidase, hydrolysieren lässt. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um Chymotrypsin und der Linker enthält ein Phenylalanin. Nach der Synthese des Linkers liegt die N^α-Aminofunktion geschützt vor und der Träger ist der Endopeptidase ausgesetzt. Die Endopeptidase wirkt dabei nur auf Linker, die für andere Makromoleküle, wie etwa Akzeptoren, zugänglich wären.
Nach der enzymatischen Hydrolyse des Peptidlinkers können die Testverbindung und die codierenden Verbindungen unter Verwendung beliebiger orthogonaler Schutzgruppen synthetisiert werden.
5.7 VERFAHREN ZUR CHARAKTERISIERUNG EINER SYNTHETISCHEN TESTVERBINDUNG AUS EINER BIBLIOTHEK
Sobald ein Träger mit einem Liganden von Interesse nach einem der Verfahren in Abschnitt 5.6 oben ausgewählt ist, wird durch die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Bestimmung der Struktur des Liganden bereitgestellt.
Dabei gibt es zwei allgemeine Ansätze zur Bestimmung der Struktur einer Testverbindung: die Struktur des Polymers kann direkt mit herkömmlichen Techniken, z.B. Edman-Abbau oder Massenspektrometrie, analysiert werden; als Alternative kann ein zweites Molekül oder eine zweite Gruppe von Molekülen während der Konstruktion der Bibliothek synthetisiert werden, so dass die Struktur(en) der zweiten molekularen Spezies die Struktur der am gleichen Träger gebundenen Testverbindung eindeutig anzeigt (codiert). Mit dieser zweiten Technik lässt sich die Struktur von Polymeren, die selbst einer Sequenzierung nicht zugänglich sind, leicht bestimmen.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine dritte Codierungstechnik mit der Bezeichnung „fraktionelle Codierung", die sich von den vorhergehenden Ausführungsformen dahingehend unterscheidet, dass kein eigenständiges, von der Testverbindung verschiedenes codierendes Molekül vorliegt. Die funktionelle Codierung wird dann verwendet, wenn spezifische Untereinheiten der Testverbindung in der herkömmlichen Analyse nicht aufgelöst werden können, z.B. die D- und L-Stereoisomeren einer Aminosäure. Durch die fraktionelle Codierung wird ein Verfahren bereitgestellt, wodurch sich die Untereinheiten unterscheiden lassen, indem man eine geringe Menge einer anderen Untereinheit 1, die nicht anderweitig bei der Konstruktion der Bibliothek genutzt wird, während der Synthese der Bibliothek zumischt. Somit wird durch die fraktionelle Codierung ein kleinerer, nachweisbarer Grad an Heterogenität der Testverbindung des Trägers bei Verwendung einer der beiden ununterscheidbaren Untereinheiten erzeugt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein solcher Grad an Heterogenität, der typischerweise etwa 5% beträgt, mit der Lehre der Anmeldung, dass nämlich auf jedem Träger nur eine einzige Spezies einer Testverbindung vorliegen kann, vereinbar.
5.7.1 CHARAKTERISIERUNG MITTELS EINES EINZELNEN CODES UND MEHRERER AUFEINANDERFOLGENDER CODES
In einer bevorzugten Ausführungsform der codierten molekularen Bibliotheken enthält der Träger in separater Phase mit der synthetischen Testverbindung von Interesse auch ein Molekül, vorzugsweise ein Peptid, dessen Sequenz für die Struktur des Liganden codiert; z.B. wird durch die Bestimmung der Sequenz des codierenden Peptids die Identität des Liganden enthüllt. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Peptidsequenzierung ist der Edman-Abbau. Dabei wird bei einem besonders bevorzugten Verfahren der Applied Biosystems 477A Protein Sequencer eingesetzt. Die Aminosäuresequenz von Peptiden lässt sich auch entweder mit der FAB (Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopie (FAB-MS) oder unter Verwendung anderer Analysetechniken bestimmen.
Die codierenden Peptide können entweder in am festen Träger gebundener Form oder in davon abgespaltener Form sequenziert werden. Zur Abspaltung der Peptide werden die isolierten Kügelchen mit herkömmlichen Spaltungsmitteln, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, behandelt, um Peptide von Festphasenträgern zu trennen. Die Wahl des ausgewählten Spaltungsmittels hängt dabei vom eingesetzten Festphasenträger ab.
Als Alternative besteht in einer weiteren Ausführungsform im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, ein einzelnes Festphasenträgerpartikel, wie z.B. ein Kügelchen, mit seiner an ihn gebundenen codierenden Peptidsequenz zu isolieren und das Kügelchen in ein Sequenziergerät für die Peptidsequenzierung einzuführen, ohne vorher das codierende Peptid vom Kügelchen abzuspalten. Man schätzt, dass ein einzelnes Harzkügelchen mit einem Durchmesser von 100 μm und mit 0,5 mEq/Gramm funktionalisierbaren Stellen ungefähr 100 pmol Peptid enthält, wenn die Hälfte der Stellen zur Verknüpfung codierender Peptide verwendet werden. Bei einem ähnlichen Grad an Substitution mit codierenden Peptiden enthält ein einzelnes PAM-Harzkügelchen mit einem Durchmesser von 250 μm und mit 0,5 mEq/Gramm Harz funktionalisierbaren Stellen ungefähr 1500 pmol codierendes Peptid. Mit einem Peptidsequenziergerät des Standes der Technik benötigt man lediglich 5-10 pmol für eine angemessene Sequenzierung. Daher kann bei einem Standard-PAM-Harz ein einzelnes Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 μm so beladen werden, dass es mehr als eine angemessene Menge codierendes Peptid für die Sequenzierung enthält.
Neben der Edman-Sequenzierung stellt die Massenspektrometrie mit schnellem Innenbeschuss ein sehr leistungsfähiges Analysewerkzeug dar, das häufig auf wirksame Weise zur Analyse der Strukturen von Peptiden und verschiedener anderer Moleküle verwendet werden kann. Ebenso kann die Elektrospray-Hochleistungsmassenspektrometrie bei der Strukturanalyse sehr nützlich sein. Vorzugsweise wird die Massenspektrometrie zur Bestimmung der Struktur eines codierenden Moleküls wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/939,811 , eingereicht am 3. September 1992, beschrieben durchgeführt.
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Anzahl an Untereinheitsspezies an einer beliebigen Position der Testverbindung manchmal größer ist als die Anzahl an zur Konstruktion des codierenden Polymers verwendeten Monomeren. So lässt sich beispielsweise ein codierendes Peptid mit einem begrenzten Satz von Aminosäuren konstruieren, die nach dem Edman-Abbau leicht unterschieden werden. Unter diesen Umständen kann das codierende Molekül auch über die Einführung eines Gemisches von Aminosäuren an einer gegebenen Position konstruiert werden. So kann beispielsweise ein Singulett/Dublett-Code, d.h. mit einer bzw. zwei codierenden Gruppierung(en) pro Position der Testverbindung, wobei das codierende Polypeptid lediglich acht Aminosäuren enthält, für bis zu 36 Untereinheiten codieren; ein Triplett/Dublett/Singulett-Code mit der gleichen Anzahl an Gruppierungen codiert für 84 Untereinheiten pro Position.
Die Analyse der Edman-Abbauprodukte solcher codierender Peptide zeigt entweder ein bzw. zwei oder ein, zwei bzw. drei Aminosäuren an jeder Position der codierenden Sequenz.
5.7.2 CHARAKTERISIERUNG MITTELS EINES NICHTSEQUENZIELLEN CODES
Eine alternative bevorzugte Ausführungsform mit der Bezeichnung nichtsequenzielle Codierung berücksichtigt das „Lesen" des codierenden Moleküls ohne eine Bestimmung der Sequenz seiner Untereinheiten. Sequenzielle Codes sind von Natur aus mühsam zu entschlüsseln. Die Sequenzierung eines Moleküls erfordert wiederholte Abbauschritte. Im Gegensatz dazu lässt sich die Analyse der Zusammensetzung eines polymeren Moleküls über einen einzigen Abbau und eine einzige Analyse der erhaltenen Untereinheiten oder ihrer Derivate durchführen.
Ferner besteht der zeitaufwendigste Schritt, der für die Sequenzierung eines peptidcodierenden Moleküls erforderlich ist, in der chromatographischen Analyse eines jeden der abgespaltenen Phenylthiohydantoine. Auch wenn die gesamte Information in der einmaligen Retentionszeit des einzigen Elutionsspitzenwerts vorliegt, so muss dennoch an den Produkten eines jeden schrittweisen Abbaus jeweils ein getrennter Chromatographieschritt durchgeführt werden. Somit wird die meiste Zeit der Gradientenanalyse durch das Warten auf das Erscheinen des einzigen Spitzenwerts, der dem Rest an jener Position entspricht, „verschwendet". Der Fortgang ist eindeutig nicht so effizient wie möglich. Falls anstelle des sequenziellen Edman-Abbaus mit anschließender HPLC-Analyse die Möglichkeit bestünde, alle codierenden Untereinheiten gleichzeitig abzuspalten, zwischen diesen in einem einzigen HPLC-Lauf zu unterscheiden und anschließend die Ergebnisse zur Bestimmung der Testverbindungsidentität zu entschlüsseln, so könnte der Vorgang stark beschleunigt werden.
Für das Lesen eines nichtsequenziellen Codes ist es lediglich erforderlich, zu bestimmen, ob ein gegebenes Signal vorhanden ist oder nicht. Die Auflösung an der Grundlinie zweier Spitzenwerte, die sich um etwa 0,3 Minuten in ihrer Retentionszeit unterscheiden, lässt sich unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC-Standardanalyse mit Gradientenelution erreichen. Somit kann ein 45-Minuten-Gradient zwischen 150 Verbindungen unterscheiden. Ein aus aus einer Gruppe von 150 verschiedenen Codierungsgruppierungen ausgewählten Untereinheiten bestehendes Codierungsmolekül entspricht einer Binärzahl mit 150 Stellen. Somit könnten 2¹⁵⁰ oder etwa 10⁴⁵ verschiedene Spezies der Testverbindung auf diese Weise codiert werden. Somit reichen nichtsequenzielle Codes leicht aus, sowohl die Sequenz als auch die Identität der Untereinheiten der Testverbindungen selbst der größten praktischen Bibliotheken zu codieren.
Ein nichtsequenzieller Code lässt sich wie folgt konstruieren. C000 bis C099 seien die Elemente des Satzes aus 100 codierenden Gruppierungen, die für die Codierung der Struktur einer Testverbindung mit bis zu 20, aus bis zu 32 unterschiedlichen Untereinheiten, die hier mit S00-S31 bezeichnet werden, ausgewählten Resten, verwendet werden. In diesem Schema wird die Identität des Rests an der ersten Position durch das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit der codierenden Elemente C000-C004 bestimmt; falls keine vorhanden sind, so liegt S00 an der ersten Position der Testverbindung vor und, falls alle vorhanden sind, so liegt S31 an Position 1 vor. Nachfolgende Positionen werden von den Gruppierungen C005-C009, C010-C014 ... C095-C099 codiert. Dem Durchschnittsfachmann ist dabei ersichtlich, dass in dem häufigen Fall, bei dem Bibliotheken, die deutlich kleiner als die maximale Codierungskapazität eines 100-stelligen Codes sind, benötigt werden, die Treue des Codes dadurch erhöht werden kann, dass man entweder die Größe des Satzes codierender Moleküle verringert, d.h. das Intervall zwischen Gruppierungen in der chromatographischen Analyse erhöht, oder indem man redundante Codierung verwendet; z.B. kann eine „Paritäts"-Gruppierung für jede codierte Position in dem Code eingeführt werden.
Am häufigsten werden zwischen 4 und 8 codierende Gruppierungen, die zwischen 16 Untereinheiten und 128 Untdreinheiten plus einer Paritätsgruppierung entsprechen, für die Codierung jeder einzelnen Position in der Testverbindung benötigt.
Die codierenden Gruppierungen müssen in der codierenden Struktur so angeordnet sein, dass dadurch ihre gleichzeitige Abspaltung und Analyse gestattet wird.
Eine offensichtliche Möglichkeit besteht in einer Totalhydrolyse mit anschließender selektiver Modifikation und Analyse des Gemischs. In diesem Fall ist die Struktur der codierenden Verbindung nicht wichtig. Codierende Gruppierungen können miteinander verbunden oder an separate Zweige einer verzweigten Struktur oder eine beliebige Kombination gebunden werden, so lange die Bindung zu jeder Gruppierung hydrolysierbar ist. Allerdings könnte dieser Ansatz durch das Vorhandensein von Hydrolyseprodukten von der Testverbindung gefährdet sein. Daher schien die Verwendung des von Edman, 1950, ACTA CHEM SCAND, 4:283-293; Edman, et al., 1967, EURO J BIOCHEM, 1:80-91 entwickelten sehr selektiven Abbauverfahrens die optimale Wahl darzustellen.
Beim Edman-Abbau wird die N-terminale Aminosäure selektiv von der Peptidkette abgespalten. Falls eine angemessene Anzahl von Aminosäuren und Aminosäurederivaten, die die oben definierten chromatographischen Erfordernisse erfüllen, identifiziert werden könnten und diese in Form einer codierenden Struktur in einer Anordnung, die ihre gleichzeitige Abspaltung gestattet, synthetisiert würden, so wäre es möglich, die Zusammensetzung einer nichtpeptidischen Struktur in nur einem Zyklus aus Edman-Abbau und HPLC-Analyse zu analysieren.
Die Retentionszeit von Aminosäurephenylthiohydantoinen an der Umkehrphase folgt der Lipophilizität der Seitenkette der Aminosäure. Somit ist es für die Konstruktion eines Satzes von Aminosäurederivaten mit den entsprechenden Retentionszeiten lediglich notwendig, die Seitenkette der einzelnen Aminosäuren jeweils mit entsprechenden Unterschieden in der Lipophilizität zu konstruieren. Ein einfacher Weg zur Erreichung der entsprechenden Unterschiede besteht in der Substitution der funktionellen Gruppe der Seitenketten trifunktioneller Aminosäuren durch entsprechende Substituenten. Dementsprechend wurde von uns der Effekt der Acylierung der Seitenkettenaminogruppe von Diaminocarbonsäuren – Diaminopropionsäure, Diaminobuttersäure, Ornithin und Lysin – untersucht. Alternative Sätze codierender Gruppierungen, wie etwa Derivate von Dicarboxyaminosäuren und SH-haltiger Aminosäuren, sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Die oben beschriebene Gruppierung ist nur dahingehend bevorzugt, dass sie sich von Personen, die leichten Zugang zur Festphasenpeptidsynthese haben, zweckmäßig synthetisieren lässt.
Eine Ausführungsform zur Erreichung der gleichzeitigen Abspaltung codierender Gruppierungen sieht vor, dass es sich bei allen codierenden Gruppierungen jeweils um eine α-Aminosäure handelt, die als N-terminale Aminosäure gebunden ist, wobei ihre Aminogruppe frei vorliegt. Das Gerüst einer solchen codierenden Struktur lässt sich aus Diaminocarbonsäuren (Daa), Dicarboxyaminosäuren oder anderen trifunktionellen Untereinheiten konstruieren. Die Aminogruppen dieser Aminosäuren werden von den für die Codierung verwendeten N-geschützten Aminosäuren acyliert. Die Acylierung wird unter Verwendung eines Gemischs der als Code für die gegebene Untereinheit und deren Position in der Testverbindung definierten Gruppierungen durchgeführt. Wie im Schema XIC unten dargestellt ist, braucht die Positionschemie der Umsetzungen der Diaminocarbonsäuren nicht angegeben zu werden. Das Polymer und die codierenden Gruppierungen können an eine der beiden Aminogruppen der Diaminosäuren, die das codierende Molekülpolymer bilden, gekuppelt werden.
Im Fall der in Beispiel 13 unten beschriebenen und dargestellten substituierten Diaminocarbonsäuren waren die Kupplungsreaktivitäten von Seitenkettensubstitutionen unabhängig. Sollten allerdings andere codierende Untereinheiten verwendet werden, so gibt es zwei Verfahren, mit denen sich ein äquimolarer Einbau der codierenden Gruppierungen erzielen lässt, obwohl diese signifikant unterschiedlichen Reaktivitäten aufweisen können, z.B. Alanin und Isoleucin. Das erste Verfahren beruht auf dem Ausgleichen der Unterschiede in der Reaktivität durch Verwendung einer höheren Konzentration der langsamer reagierenden Aminosäure (z.B. Eichler J. & Houghten, R., 1993, Biochemistry 32:11035; Rutter US-Patent Nr. 5,010,175 ). Als Alternative kann wiederholt eine subäquimolare Menge des Gemischs eingesetzt werden, so dass, obwohl eine Gruppierung schneller reagieren könnte, genügend Kupplungsstellen für die langsamer reagierende Aminosäure zur Kupplung übrig blieben, bis nach genügend Wiederholungen der Kupplungsreaktion alle reaktiven Stellen aufgebraucht sind. Andrews et al., 1994, TECHNIQUES IN PROTEIN CHEMISTRY, 5:485-492.
Es gibt mehrere Grundstrategien zur Konstruktion eines wie oben beschriebenen codierenden Moleküls. Zwei von diesen sind in Schema XIA dargestellt. Das erste beruht auf der Verwendung der Alloc-Schutzgruppe (Loffet A. & Zhang H., 1993, Int. Pep. & Prot. Res. 42:346); (Stevens & Watanabe, 1950, J. Am. Chem. Soc. 72:725); (Guibe, F. & Saint M'Leux Y., 1981, Tet. Lett. 21:3591) zum Aufbau der codierenden Struktur und der Fmoc- oder Fmoc-ähnlichen Gruppe (Carpino & Han, 1972, J. Org. Chem., 37:3404) zum Schutz funktioneller Gruppen auf der Testverbindung. In diesem Fall lässt sich die Boc-Gruppe als permanente Schutzgruppe sowohl für die Testverbindungssynthese als auch die Codierungssynthese verwenden. Dabei ist es vorteilhaft, vorgeformte codierende Untereinheiten der allgemeinen Form des in Schema XIA dargestellten „Block A" zu verwenden. Als Alternative wird eine weitere Orthogonalitätsstufe während der Synthese benötigt, falls keine vorgeformten codierenden Untereinheiten verwendet werden. Dies lässt sich durch Verwendung von Alloc/Ddz-geschützten Diaminocarbonsäuren für den Aufbau des codierenden Grundgerüsts erreichen, da die Ddz-Gruppe durch 2% Trifluoressigsäure in Dichlormethan selektiv abspaltbar ist (Birr C., et al., 1972, Liebigs Ann. Chem., 763:162-73). Allerdings wird dieser Ansatz durch die Notwendigkeit, unterschiedliche Kupplungsreaktivitäten der als Gemisch gebundenen codierenden Aminosäuren auszugleichen, kompliziert. Eine zweite Strategie beruht auf der Verwendung einer Kombination aus Fmoc- und Boc-Gruppen für den zeitweisen orthogonalen Schutz funktioneller Gruppen in der Testverbindung und den codierenden Molekülen sowie der Verwendung von Benzoxycarbonyl (Z) oder Z-ähnlichen Gruppen für einen permanenten Schutz. Die codierende Untereinheit kann während der Synthese unter Verwendung von Fmoc/Dde- (oder Fmoc/Alloc oder Fmoc/Ddz-) geschützten Diaminocarbonsäuren aufgebaut werden, da die Dde-Gruppe durch eine Lösung von Hydrazin in Dimethylformamid abgespalten wird und unter zur Abtrennung der Boc- bzw. Fmoc-Gruppe verwendeten Bedingungen stabil ist (Hone, N.D. et al., Poster 263 beim 22. Eur. Pept. Symp., Interlaken, Schweiz, September 1992).
Ein alternativer Ansatz für die Codierung ist in Schema XIB dargestellt. In diesem Fall wird ein Bruchteil der für die Codierung zur Verfügung stehenden Aminogruppen durch das codierende Gemisch acyliert, wobei die verbleibenden Aminogruppen vor der Durchführung des nächsten Schritts der Randomisierung erneut durch eine orthogonal abspaltbare Gruppe (z.B. Alloc) geschützt werden. Bei diesem Schema ist es vorteilhaft, das codierende Gemisch vor der Testverbindungsuntereinheit zu kuppeln, da die Entschützung von Alloc auf der rekombinierten Stufe durchgeführt werden kann.
Eine dritte alternative Ausführungsform wird im Schema XIC bereitgestellt. Bei diesem Schema brauchen die codierenden Elemente nicht mit einer Grundgerüst-Diaminocarbonsäure vorgeformt werden, wie in Schema XIA, noch muss eine repetitive Blockierung und Deblockierung wie in Schema XIB vorhanden sein. Das Schema sieht eine Fmoc-geschützte Testverbindung sowie ein Alloc-geschütztes codierendes Molekül vor, wobei die reaktiven Gruppen sowohl der codierenden als auch der Testverbindung während der Synthese mit Boc permanent geschützt sind. Das codierende Molekül wird durch aufeinander folgende Schritte aus Entfernen des Alloc-Schutzes sowohl von der N^α- als auch der N^ε-Funktionalität des Lysins, Zugabe und Kupplung eines Gemischs der codierenden Elemente Boc-Caa₁₁ und Boc-Caa₁₂ jeweils in einer Menge von 0,5 Äquivalent, Zugabe und Kupplung von 1,0 Äquivalent Alloc-Lys(Alloc) synthetisiert. Dabei ist zu beachten, dass in dieser Ausführungsform die codierenden Elemente, d.h. die Boc-Caa's, entweder an das N^α und/oder das N^ε irgendeines bestimmten Lysins im Grundgerüst des codierenden Moleküls kuppeln können. Trotzdem bewirkt weder die Stereochemie noch die Stöchiometrie der Kupplung die Durchführbarkeit der Ausführungsform, da die N^α- und N^ε-Funktionalitäten von Lysin für alle erfindungsgemäßen Zwecke äquivalent sind.
Noch eine weitere alternative Ausführungsform der Erfindung umfasst das Lesen eines nichtsequenziellen Codes durch Massenspektrometrie. Dabei werden die codierenden Moleküle vom Festphasenträger durch spezifische Spaltung eines Linkers freigesetzt. Die Moleküle können weiter durch Elektro/Spray oder Innenbeschuss fragmentiert und die einzelnen codierenden Gruppierungen über ihre Molekulargewichte identifiziert werden.
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Verwendung von Massenspektrometrie zum Lesen eines nichtsequenziellen Codes impliziert, dass die codierenden Gruppierungen mit den codierenden Molekülen über verschiedene andere chemische Bindungen als die, die gegenüber einem spezifischen Abbau empfindlich sind, wie beispielsweise Peptidbindungen, verknüpft sein können.
Es folgen die Schemata XIA, XIB und XIC:
5.7.3 NICHTCODIERTE BIBLIOTHEKEN
Zur Analyse der Struktur von aus Bibliotheken, die keine codierenden Moleküle enthalten, ausgewählten Liganden kann die zur Analyse der Struktur codierender Peptide (oben beschrieben) verwendete Technik, falls anwendbar, eingesetzt werden. Als Alternative lässt sich die Massenspektrometrie, insbesondere unter Verwendung von in der US-Anmeldung mit der Seriennr. 07/939,811 , eingereicht am 3. September 1992, beschriebenen Techniken, oder andere Analysetechniken (Dünnschichtchromatographie, HPLC, NMR, IR, Elementaranalyse und dergleichen) zur Bestimmung der Struktur einer gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählten synthetischen Testverbindung verwenden.
5.8 THERAPEUTISCHE UND DIAGNOSTISCHE MITTEL AUS BIBLIOTHEKEN EINER synthetischen Testverbindung
Nach der Bestimmung der Struktur eines ausgewählten Liganden kann eine große Menge der Verbindung chemisch oder biologisch zur Bestätigung der Ergebnisse der Struktur und Suchexperimente sowie anderer Untersuchungen synthetisiert werden. Nachdem einmal eine molekulare Struktur von Interesse über Bibliothekssuche und Strukturanalyse aktiver Liganden identifiziert wurde, werden durch die vorliegende Erfindung Moleküle, die die molekulare Struktur umfassen, für die Verwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krankheiten bereitgestellt. Dabei kann das durch die Suche identifizierte Molekül entweder allein ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel bereitstellen oder kann in ein größeres Molekül eingebaut werden. Ein eine Struktur mit biologischer oder Bindungsaktivität umfassendes Molekül kann als „Effektormolekül" bezeichnet werden. Ferner werden durch die Erfindung Bibliotheken zur Verwendung bei verschiedenen Anwendungen bereitgestellt. Bei der „Effektor"-Funktion des Effektormoleküls kann es sich um eine der hier beschriebenen oder im Fachgebiet bekannten Funktionen handeln.
Durch das hier beschriebene Verfahren wird nicht nur ein neues Werkzeug zur Suche nach spezifischen Liganden mit potenziellen diagnostischem oder therapeutischem Wert, sondern auch wichtige Informationen über eine Reihe von Liganden mit potenziell enorm unterschiedlicher Struktur, die nichts desto weniger mit dem gleichen Akzeptormolekül Wechselwirken können, bereitgestellt. Die Integration derartiger Informationen mit der Erstellung molekularer Modelle und modernen Rechnertechniken sorgt wahrscheinlich für ein neues grundlegendes Verständnis von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel umfassen Effektormoleküle, die an das biologisch aktive Zentrum von Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder Hormonstoffen binden und dadurch deren Wirkung verstärken oder neutralisieren und die die Transkription und/oder Translation blockieren oder verstärken.
Zu den erfindungsgemäßen therapeutischen Mitteln gehören beispielsweise Effektormoleküle, die an einen Rezeptor von pharmakologischem Interesse, wie z.B. Wachstumsfaktorrezeptoren, Neurotransmitterrezeptoren oder Hormonrezeptoren, binden. Diese Effektormoleküle können entweder als Agonisten oder Antagonisten der Wirkung des natürlichen Rezeptorliganden verwendet werden.
Eine weitere Anwendung von Effektormolekülen, die an Rezeptoren binden, würde darin bestehen, die Bindung zur Blockierung der Anbindung von Viren oder Mikroben, die sich Zugang zu einer Zelle verschaffen, indem sie an einen normalen zellulären Rezeptor binden und dann ins Innere transportiert werden, zu verwenden. Zu diesem Phänomen zählen beispielsweise die Bindung des menschlichen Immunschwächevirus an den CD4-Rezeptor und des Herpes-Simplex-Virus an den Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor. Effektormoleküle, die den Rezeptor belegen, könnten als pharmakologische Mittel zur Blockierung einer viralen Infektion von Zielzellen verwendet werden. Die Einwanderung von Parasiten in Zellen könnte auf ähnliche Weise gehemmt werden, nachdem geeignete Effektormoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Effektormolekül mit einer Struktur, die an ein Akzeptormolekül von Interesse bindet, zum Abzielen auf einen Arzneistoff oder ein Toxin verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Akzeptormolekül von Interesse um einen Rezeptor oder ein Antigen, der bzw. das auf der Oberfläche einer Tumorzelle angetroffen wird, einen Tierparasiten oder eine Mikrobe, z.B. ein Bakterium, ein Virus, einen einzelligen Parasiten, einen einzelligen Krankheitserreger, Pilz oder Schimmelpilz. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Zielstoff um einen intrazellulären Rezeptor.
Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass einige der Millionen von synthetischen Testverbindungsmolekülen im Reservoir Strukturen mit biologischer Aktivität bereitstellen können. Man kann dabei Moleküle isolieren, die gegen Tumore, Tierparasiten oder Mikroben gerichtete Aktivitäten, z.B. gegen Unkraut, Pflanzenparasiten, Pilze, Bakterien, einzellige Parasiten, einzellige Krankheitserreger oder Viren gerichtete Aktivitäten, besitzen. Darüber hinaus können einige dieser Liganden als Agonisten oder Antagonisten von Wachstumsfaktoren, z.B. Erythropoetin, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Tumorwachstumsfaktoren, um nur einige zu nennen, ebenso wie Hormone, Neurotransmitter, Agonisten für die Rezeptoren, Immunmodulatoren oder andere regulatorische Moleküle wirken.
Zu den erfindungsgemäßen therapeutischen Mitteln zählen auch Effektormoleküle mit einer Struktur, die eine hohe Affinität für Arzneistoffe bzw. Drogen, z.B. Digoxin, Benzodiazepan, Heroin, Kokain oder Theophyllin, aufweist. Derartige Moleküle lassen sich als Gegenmittel für Überdosen solcher Arzneistoffe bzw. Drogen verwenden. In ähnlicher Weise gehören zu therapeutischen Mitteln Effektormoleküle, die an kleine Moleküle oder Metallionen, einschließlich Schwermetallen, binden. Moleküle mit hoher Affinität für Bilirubin sind für die Behandlung von Neugeborenen mit Hyperbilirubinämie geeignet.
Die vorliegende Erfindung sieht allgemein die Bereitstellung von Verfahren zur Identifizierung von Molekülen für die Therapie von Krankheiten oder Erkrankungen, wie beispielsweise den im Product Category Index of The Physicians Desk Reference (PDR, 1993, 47. Ausgabe, Medical Economics Data: Oradell, NJ, S. 201-202) aufgeführt sind, vor. So kann beispielsweise ein Effektormoleküle mit Aktivität gegen Krebs und Parasiten, mit Antikoagulanzaktivität, mit Aktivität als Antagonist von Antikoagulanzien, als Antidiabetikum, als Anticonvulsivum, als Antidepressivum, als Antidiarrhoikum, als Antidot, als Antigonadotropin, als Antihistamin, als Antihypertonikum, als entzündungshemmendes Mittel, als gegen Nausea wirkendes Mittel, als gegen Migräne wirkendes Mittel, als gegen Morbus Parkinson wirkendes Mittel, als gegen Blutplättchen gerichtetes Mittel, als Mittel gegen Juckreiz, als Antipsychotikum, als Antipyretikum, als Antitoxin (z.B. Antivenin), als Bronchodilatans, als Vasodilatans, als Chelator, als Verhütungsmittel, als Muskelrelaxans, als Mittel gegen Glaukom oder als Sedativum identifiziert werden.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel können auch entsprechende pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel und Adjuvanzien enthalten. Bei solchen pharmazeutischen Trägerstoffen kann es sich um sterile Flüssigkeiten, wie z.B. Wasser und Öle, einschließlich den aus Petroleum, Tieren, Pflanzen stammenden Ölen oder synthetischer Öle, wie z.B. Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen handeln. Dabei ist Wasser als Trägerstoff bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Als flüssige Trägerstoffe können auch Kochsalzlösungen und wässrige Dextrose- und Glyzerinlösungen eingesetzt werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Zu pharmazeutischen Hilfsstoffen zählen Stärke, Glukose, Laktose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselgel, Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glyzerinmonostearat, Talkum, Natriumchlorid, Magermilch in getrockneter Form, Glyzerin, Propylen, Glykol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit kontinuierlicher Freisetzung und dergleichen einnehmen. Geeignete pharmazeutische Trägerstoffe sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben. Derartige Zusammensetzungen enthalten eine wirksame therapeutische Menge des Wirkstoffs zusammen mit einer geeigneten Menge an Trägerstoff, um so die Form für die korrekte Verabreichung an den Patienten bereitzustellen. Zwar handelt es sich bei der intravenösen Injektion um eine sehr wirksame Form der Verabreichung, doch können auch andere Arten eingesetzt werden, beispielsweise mittels Injektion oder über orale, nasale oder parenterale Verabreichung.
Ein eine gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmte Struktur umfassendes Molekül kann auch zur Bildung diagnostischer Mittel verwendet werden. Das diagnostische Mittel kann auch ein Molekül sein, das eine oder mehrere als Ergebnis der Bibliothekssuche identifizierte Strukturen, z.B. mehr als eine Polyamidsequenz oder Polyalkansequenz, umfasst. Darüber hinaus kann das diagnostische Mittel einen der oben für die therapeutischen Mittel beschriebenen Trägerstoffe enthalten.
Der Begriff „diagnostisches Mittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Mittel, das zum Nachweis von Leiden wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Krebs, wie z.B. T- oder B-Zellenlymphom, sowie Infektionskrankheiten, wie oben angegeben, verwendet werden kann. Dabei wird der Begriff Nachweis im weitesten Sinne verwendet, so dass er die Indikation des Bestehens eines Leidens, die Lokalisierung des von dem Leiden betroffenen Körperteils oder die Indikation der Schwere des Leidens umfasst. Sc könnte beispielsweise ein Peptid-Meerrettich-Immunperoxidase-Komplex oder ein verwandtes immunhistochemisches Mittel zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Rezeptor- oder Antikörpermoleküle in Geweben, Serum oder Körperflüssigkeiten verwendet werden. Diagnostische/Mittel können zur Verwendung sowohl in vitro als auch in vivo geeignet sein. Insbesondere werden durch die vorliegende Erfindung geeignete diagnostische Reagenzien zur Verwendung in Immuntests, Southern- oder Northern-Hydridisierung und in-situ-Assays bereitgestellt.
Darüber hinaus kann das diagnostische Mittel einen oder mehrere Marker, wie z.B., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Radioisotop-, Fluoreszenz-Tags, paramagnetische Substanzen oder andere, die Abbildung verbessernde Stoffe, enthalten. Dem Durchschnittsfachmann wäre die Bandbreite an Markern und Verfahren geläufig, so dass er sie in das Mittel zur Bildung diagnostischer Mittel einbauen würde.
Die therapeutischen Mittel und diagnostischen Mittel der vorliegenden Erfindung können für die Behandlung und/oder Diagnose von Tieren und stärker bevorzugt Säugern, einschließlich Menschen, Hunden, Katzen, Pferden, Rindern, Schweinen, Meerschweinchen, Mäusen und Ratten, verwendet werden. Therapeutische oder diagnostische Mittel können auch zur Behandlung und/oder Diagnose von Pflanzenkrankheiten verwendet werden.
Die einer Therapie oder Diagnose mit gemäß der vorliegenden Erfindung entdeckten Molekülen zugänglichen Krankheiten und Leiden sind genauso vielfältig und breit gefächert wie die Permutationen der Strukturen in einer Bibliothek.
In einer weiteren Ausführungsform können mit geringer Affinität bindende Kügelchen ausgewählt und eine limitierte Bibliothek auf der Grundlage der Strukturen der Liganden auf dem Kügelchen hergestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann ein spezieller niedrigaffiner oder hochaffiner Träger, der einen oder einige wenige von den von der Erfindung bereitgestellten Millionen synthetischen Testverbindungen identifizierten Liganden umfasst, bei chromatographischen Trennungen eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, bei denen es sich ausschließlich um Beispiele für die Erfindung handeln soll, näher erklärt.
6. BEISPIEL: EINE CODIERTE MODELLBIBLIOTHEK
Im vorliegenden Beispiel wird gezeigt, dass zwei Moleküle, nämlich eine „synthetische Testverbindung" und ein „codierendes Molekül", gleichzeitig auf einem einzigen Harzkügelchen hergestellt werden können. Weiterhin lässt sich eine Bibliothek solcher Verbindungen herstellen, wobei jedes Harzkügelchen in der Bibliothek eine einzelne Spezies der „synthetischen Testverbindung" sowie eine einzelne Spezies des „codierenden Moleküls" enthält. In diesem Beispiel liegen sie in einem molaren Verhältnis von 2:1 vor. Die Sequenz des „codierenden Moleküls" entspricht der Sequenz der „synthetischen Testverbindungen".
Für dieses Modellsystem handelt es sich sowohl bei der „synthetischen Testverbindung" als auch dem „codierenden Molekül" um Peptide. Dabei wurde die parallele Synthese des Testpeptids und des codierenden Peptids unter Verwendung der orthogonalen Blockierungsgruppen Boc und Fmoc durchgeführt.
6.1 MATERIAL UND METHODEN
Die Festphasensynthese wurde manuell in Polypropylenspritzen, wie von Krchnak und Vagner (1990, Peptide Res. 3:102-193) beschrieben durchgeführt. Synthesen wurden an mit einem SCAL-Stiel (Patek und Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894) (Safety-Catch-Amidlinker) oder mit einem entsprechenden Linker modifiziertem TentaGel (TG) (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland, 130 oder 80 μm, 0,23 mmol/g) durchgeführt. Die Abspaltungen der Fmoc-Schutzgruppen erfolgten mit 50% Piperidin/DMF über einen Zeitraum von 1 × 10 min. Die Boc-Schutzgruppe wurde mit 30% TFA/DCM mit 3% Anisol 20 min. abgespalten. Für die Neutralisierung nach der Boc-Abspaltung wurde eine Lösung von DIEA/DCM (10%) verwendet. Für die Aktivierung sowohl von Nα-Fmoc- als auch Boc-Aminosäuren wurde ein Gemisch aus BOP/HOBt/DIEA (1:1:2 Äq.) in DMF verwendet. Die Vollständigkeit der einzelnen Kondensationsreaktionen (1,5-40 Std.) wurde jeweils mit dem Ninhydrintest oder bei Kupplung an sekundäre Aminogruppen mit dem Chloraniltest überprüft. Die Kupplungsvorschrift beinhaltete das Waschen mit DMF (6-8 mal) (mit anschließendem Waschen mit DCM bei Boc-geschützten Aminosäuren) zwischen der Kupplung und der Entschützung sowie zwischen der Entschützung und der Kupplung. Die Reduktion des SCAL-Linkers wurde über 2 Stunden mit 20% (EtO)₂P(S)SH in DMPU durchgeführt. Die endgültige Spaltung erfolgte mit einem Gemisch aus 95% TFA und 5% Wasser.
Es wurden Lösungsmittel im handelsüblichen Reinheitsgrad ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Geschützte Aminosäuren wurden von Bachem (Torrance, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY) oder Propeptide (Vert-le-Petit, Frankreich) bezogen.
6.2 ERGEBNISSE
6.2.1 SYNTHESE DER MODELLBIBLIOTHEK UND ENTSCHÜTZUNG BEIDER SCHUTZGRUPPEN
Boc-Lys(Fmoc)-OH wurde als erste Aminosäure an SCAL-TG gekuppelt, die Nε-Fmoc-Gruppe entschützt und Fmoc-Lys(Fmoc)-OH an die Seitenkette des ersten Lysins gekuppelt. Die Nα- und Nε-Fmoc-Gruppen des Lysins wurden abgespalten und das Harz in drei Teile geteilt. Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH bzw. Fmoc-Val-OH wurden jeweils an jeden Anteil des Harzes gekuppelt. Entsprechende Boc-Aminosäuren (Gly, Tyr und Leu-Boc-Tyr-OH wurde mit einer nichtgeschützten Hydroxylgruppe verwendet) wurden im nächsten Schritt an die α-Aminogruppe des Lysins nach Boc-Entschützung gekuppelt, während der „Fmoc-Zweig" geschützt blieb. Nach Beendigung der Boc-Aminosäurekondensationen wurden alle drei Anteile des Harzes miteinander vereinigt und der „Fmoc-Zweig" entschützt. Die folgende Randomisierung wurde genauso wie die erste nach Aufteilen des Harzes in die drei gleichen Anteile durchgeführt. Nach der Randomisierung von drei Positionen (Kupplung von drei unterschiedlichen Aminosäuren in jeder Position) wurde das Harz zur nachfolgenden Analyse in getrennte Portionen geteilt.
Zwei zufällig ausgewählte vollständig entschützte Kügelchen wurden separaten Sequenzanalysen unterzogen. Dabei fanden sich in allen drei Zyklen korrekte „komplementäre" Aminosäuren im erwarteten Verhältnis von 2:1. Ergebnisse (Werte in pmol): 1. Kügelchen: 1. Zyklus: V 251, L 146, 2. Zyklus: V 244, L 147, 3. Zyklus: V 245, L 119; 2. Kügelchen: 1. Zyklus: A 102, G 39, 2. Zyklus: V 121, L 59, 3. Zyklus: F 125, Y 50.
Ein Teil des Harzes (etwa 100 mg) wurde mit 20% Diethyldithiophosphat in DMPU (2 × 1 h Schütteln) versetzt, um den SCAL-Stiel zu reduzieren. Das Gemisch von Peptiden wurde vom reduzierten SCAL 1 h mit TFA/H₂O (95:5) abgespalten. Das abgespaltene Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und mit Et₂O gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und getrocknet. Das Peptidgemisch wurde in 0,1% TFA/H₂O gelöst und mittels HPLC analysiert. Die erwarteten 27 Spitzenwerte wurden mit einem langsamen Gradienten von 0-50% Acetonitril und 0,1% TFA über 200 min. eluiert. Es wurden mehrere zusätzliche kleinere Spitzen identifiziert, deren Bildung auf die Verwendung von Tyrosin mit ungeschützter Seitenkette während der Synthese zurückgeführt wurde. Da die Gefahr des Ausschlusses (oder wenigstens der Abnahme des Gehalts) einiger Sequenzen durch die Etherfällung bestand, wurde bei der zweiten Spaltung des Gemisches dieser Schritt umgangen. Das Spaltungsgemisch aus TFA und Wasser wurde mit zusätzlichem Wasser verdünnt, eingeengt und im Vakuum zentrifugiert und lyophilisiert. Die HPLC-Auswertung des Gemischs zeigte eine etwa äquimolare Repräsentation aller erwarteten Spitzenwerte.
6.2.2 ENTSCHÜTZUNG DER N-TERMINALEN FMOC-GRUPPE UND ACETYLIERUNG DES „FMOC-ZWEIGS"
An die Entschützung der Fmoc-Gruppe schloss sich die Acetylierung freier N-terminaler Aminogruppen an. Die Acetylierung wurde mit einer Lösung von 0,3 M N-Acetylimidazol in DMF 20 min. durchgeführt (Ninhydrintest negativ). Die N-terminalen Boc-Gruppen auf dem anderen Zweig wurden nach der Acetylierung entschützt. Drei willkürlich gewählte Kügelchen wurden sequenziert und ergaben die folgenden abgelesenen Werte (in pmol): 1. Zyklus: Y 213, (Kügelchen 1), G 161 (Kügelchen 2), Y 201 (Kügelchen 3), 2. Zyklus: L 165 (1), Y 166 (2), Y 205 (3), 3. Zyklus: Y 188 (1), L 128 (2), G 162 (3). Die abgelesenen Werte waren durch die im acetylierten Arm vorliegenden Aminosäuren nicht kontaminiert.
Ein Teil der acetylierten Kügelchen (etwa 100 mg) wurde wie oben beschrieben behandelt (Fällung des Gemischs mit Ethylether und/oder Eindampfen des Spaltungsgemischs und Lyophilisierung), um den Stiel zu reduzieren und die acetylierten Peptide abzuspalten. Durch HPLC-Analyse unter den gleichen Bedingungen konnte gezeigt werden, dass während der Etherfällung ein beträchtlicher Anteil der Bibliothek aufgrund ihrer Löslichkeit in Ether verloren ging. Die eingeengte und lyophilisierte Probe ergab die gleiche Anzahl an Spitzenwerten mit ungefähr dem gleichen Muster wie im Fall der entschützten Bibliothek, obwohl die Retentionszeiten aufgrund der Acetylierung des Fmoc-„Zweigs" zu höheren Werten hin verschoben waren.
6.2.3 AUSTAUSCH DER BOC-SCHUTZGRUPPE GEGEN DIE TFA-GRUPPE
Die Boc-Gruppe am N-Terminus wurde gegen die Trifluoracetylgruppe ausgetauscht, um ein schrittweises Sequenzierexperiment zu gestatten. Zunächst wurde dabei die N-terminale Boc-Gruppe von einer Harzprobe (50 mg) abgespalten, während der „Fmoc-Zweig" geschützt blieb. Die freien Aminogruppen wurden mit Trifluoracetyl durch Versetzen mit 10 Äquivalenten (0,14 mmol, 21 μl) Trifluoressigsäureanhydrid in Dichlormethan (0,5 ml) in Gegenwart von DIEA (0,16 mmol, 28 μl) geschützt. Die Umsetzung war nach 1 h beendet (Ninhydrintest negativ). Nach der Trifluoracetylierung wurde die Fmoc-Gruppe auf dem anderen Zweig abgetrennt und drei Kügelchen wurden der Sequenzierung unterzogen. Die Sequenz des Fmoc-Zweigs wurde bestimmt. Nach Sequenzierung des FmocZweigs wurde das sequenzierte Kügelchen aus dem Sequenziergerät genommen und mit einer Lösung von 0,2 M NaOH versetzt (3 h, 20°C), getrocknet und weiteren drei Sequenzierungszyklen unterzogen. Die entsprechenden, von der Sequenzierung des Fmoc-Zweigs her vorhergesagten Sequenzen des Boc-Zweigs wurden erhalten. 1. Kügelchen (Werte in pmol): 1. F (735), 2. V (643), 3. A (837); nach TFA-Abtrennung: 1. Y (207), 2. L (187), 3. G (76), Sequenz FVA/YLG; 2. Kügelchen: 1. A (215), 2. A (230), 3. F (193); nach TFA-Abtrennung: 1. G (88), 2. G (86), 2. Y (80), Sequenz AAF/GGY; 3. Kügelchen: 1. F (63), 2. F (67), 3. V (41); nach TFA-Abtrennung: 1. Y (15), 2. Y (12), 3. L (4), Sequenz FFV/YYL.
6.2.4 ABSPALTUNG EINES PEPTIDS VON EINEM KÜGELCHEN
Mehrere Kügelchen aus Harz mit vollständig entschützten Sequenzen am reduzierten SCAL-Stiel wurden getrennt in kleine Glasfläschchen gegeben und über Nacht mit 30 μl reiner TFA versetzt. Es wurden Portionen von jeweils 3 μl entnommen und mit H₂O auf ein Gesamtvolumen von 20 μl verdünnt und mittels HPLC an einem Microbore-HPLC-Gerät (Michrom Apparatus) (Gradient von 5-60% Acetonitril in 0,1% TFA in Wasser über 20 min.) analysiert. Durch Berechnungen auf der Grundlage des mittleren Extinktionskoeffizienten von Peptiden bei 215 nm konnte gezeigt werden, dass etwa 100-200 pmol Peptid von einem Polymerkügelchen freigesetzt wurden.
6.3 DISKUSSION
Die codierte Modellbibliothek ist in 2 dargestellt. Das synthetische Testverbindungspeptid und das codierende Peptid sind über einen sich verzweigenden Linker an den Festphasenträger gebunden. Im Allgemeinen kann es sich bei der synthetischen Testverbindung um eine Verbindung handeln, die keinen Edman-Abbau durchläuft, womit die Sequenzangaben von der codierenden Sequenz für die Strukturbestimmung der Testverbindung sorgen. Die einzelnen Untereinheiten der synthetischen Testverbindung sind jeweils eindeutig mit einer Aminosäure im codierenden Arm in positionsspezifischer Weise assoziiert, was die Strukturanalyse gestattet.
Es gibt mehrer Ansätze zum Aufbau der codierenden Sequenz. Eine Verfahrensweise (1A) verwendet eine statistische Verteilung beider Strukturen auf dem Polymerkügelchen. In diesem Fall lassen sich alle möglichen Verhältnisse erzielen, und die Möglichkeit der Erzeugung eines kooperativen Effekts beider Sequenzen kann minimiert werden. Bei der zweiten Verfahrensweise (1B) werden sowohl die Such- als auch die codierende Struktur auf der am festen Träger hängenden verzweigten Struktur, die beispielsweise von einer Diaminocarbonsäure (Lysin) realisiert ist, aufgebaut. Beide „Sequenzen" liegen in einem definierten Molverhältnis sowie einer definierten speziellen Anordnung vor, die für das Akzeptormolekül, nach dem gesucht wird, zugänglich ist. Bei denjenigen Anwendungen, bei denen die Freisetzung des gesuchten Peptids in die Lösung verwendet wird, spielt die Lokalisierung der Suchverbindung bzw. codierenden Verbindung auf dem Kügelchen keine Rolle, da aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Linker die codierende Sequenz nie in die Lösung freigesetzt wird.
Um die chemische Synthese der synthetischen Testverbindung und der codierenden Sequenzen überzeugend zu demonstrieren, wurde ein einfaches Schema verfolgt. Eine „synthetische Testverbindung" wurde aus A, F und V aufgebaut. Diese Aminosäuren wurden mit G, Y bzw. L in der „codierenden" Sequenz codiert. Die synthetische Testverbindung wurde auf „Test"-Zweigen aufgebaut, d.h. beide Aminogruppen von Lysin, gebunden an eine weitere Lysinseitenkette, unter Verwendung von Fmoc-Chemie (siehe 2). Das Harz Wurde in drei Teile geteilt und Nα-Fmoc-geschützte Aminosäuren wurden auf den Testzweigen gekuppelt und im geschützten Zustand belassen. Die entsprechenden Nα-Boc-(codierenden) Aminosäuren wurden auf den codierenden Zweig gekuppelt. Der gesamte Harzträger wurde vermischt und wiederum in drei Teile geteilt. Die Entschützung der Nα-Fmoc-Gruppe und Kupplung der nächsten Nα-Fmoc-Aminosäure wurde in Gegenwart eines Boc-Schutzes auf dem anderen Zweig durchgeführt. Die Boc-Schutzgruppe ist unter diesen Bedingungen stabil. Im nächsten Schritt wurde die Nα-Boc-Gruppe abgespalten und die der am Testzweig gekuppelten Fmoc-Aminosäure entsprechende Nα-Boc-Aminosäure in den einzelnen Reaktionen jeweils auf dem codierenden Zweig gekuppelt. Das Verfahren aus Mischen, Spalten und getrennter Kupplung von Fmoc- und Boc-Aminosäuren wurde noch einmal wiederholt. Die Synthese wurde an einem SCAL-Stiel durchgeführt, der unter den Bedingungen sowohl der Boc- als auch der Fmoc-Strategie stabil ist. Dieser Stiel lässt sich allerdings unter relativ milden acidolytischen Bedingungen nach Reduktion seiner Sulfoxidgruppierungen abspalten (Patek und Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894).
Die Sequenzierung von auf diese Weise präparierten Kügelchen zeigte ein Molverhältnis von 2:1 von Such- zu codierender Sequenz und die entsprechende Übereinstimmung bestimmter Aminosäuren (2A). Unter Verwendung einer Portion von Kügelchen wurde die „Such"-Sequenz acetyliert und eine reine Sequenz von der „codierenden" Sequenz abgelesen (2B). Unter Verwendung einer anderen Portion von Kügelchen wurde die „codierende" Sequenz von einer Trifluoracetylgruppe blockiert, die Sequenzierung des „Such"-Zweigs durchgeführt, die Trifluoracetylgruppe von den sequenzierten Kügelchen abgespalten und die Sequenz des „codierenden" Peptids bestimmt, wodurch die Ergebnisse von der Sequenzierung des „Such"-Peptids bestätigt wurden (2C).
Um zu verifizieren, dass die Synthesestrategie das vorhergesagte äquimolare Verhältnis einer definierten Anzahl von Strukturen erzeugt, wurde die in einer Portion repräsentierte „Minibibliothek" vom Träger abgespalten. Mittels Umkehrphasen-HPLC wurde das Vorhandensein 27 unterschiedlicher Peptide bestätigt. Die als Spuren identifizierten Spitzenwerte wurden gesammelt und der Sequenzanalyse unterzogen, wodurch die Reinheit eines jeden Peptids sowie seine Zusammensetzung bestätigt wurden. Ebenso wurde die Abspaltung von Peptiden von den Einzelkügelchen durchgeführt, wobei die Möglichkeit der Analyse von von nur einem Kügelchen freigesetzten Peptiden bestätigt wurde.
7. BEISPIEL: VON EINER PEPTIDSTRUKTUR CODIERTE NICHTPEPTID-BIBLIOTHEKEN
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass ein codierendes Peptidmolekül eindeutig für eine nichtpeptidische Testverbindung codieren kann, wenn beide parallel auf einem einzigen Kügelchen synthetisiert werden. In diesem Beispiel wurden die Untereinheiten der Testverbindung so gewählt, dass jede Verbindung ein einzigartiges Molekulargewicht aufweist. Durch Vergleichen des beobachteten Molekulargewichts der Testverbindung mit der Sequenz des codierenden Peptids wird gezeigt, dass ein codierendes Peptid für eine einzige Testverbindung codiert.
7.1 MATERIAL UND METHODEN
Die Kupplungen der Aminosäuren wurden nach einem manuellen Verfahren unter Verwendung einer Standardvorschrift bei Raumtemperatur durchgeführt; geschützte Aminosäure (3 Aq.) in DMF wurde mit DIC (3 Äq.) oder DIC und HOBt (jeweils 3 Äq.) mit dem Harz gemischt, wobei auf die Kupplung analytische Tests folgten. Dort, wo angegeben, wurden symmetrische Anhydride verwendet.
Die zur Herstellung der nicht-Peptid-Bibliothek verwendeten Untereinheiten sind in Schema XII dargestellt:
SCHEMA XII
Fmoc-SCAL-Linker und Boc-Lys(Fmoc) wurden zunächst unter Verwendung von DIC und HOBt an das Harz (TentaGel S NH₂, 1 g) gekuppelt. Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe wurde Fmoc-Trp gekuppelt und die neue Fmoc-Gruppe entschützt. Das Peptidharz wurde in drei gleiche Teile geteilt, und drei unterschiedliche Bromsäuren (jeweils eine pro Reaktionsgefäß, jeweils 3 Äq.) wurden durch Verwendung von DIC in DMF (3 Äq.) gekuppelt. Bei den drei Säuren handelte es sich um α-Bromessigsäure, α-Bromvaleriansäure und Bromtoluolsäure. Die Kupplung der letzten Säure wurde aufgrund ihrer geringen Reaktivität wiederholt, wobei jeweils ein sechsfacher Überschuss der Säure und von DIC verwendet wurde. Der Boc-Schutz der α-Aminogruppe von Lys wurde mit TFA abgetrennt, und die ersten Boc-geschützten Aminosäuren der codierenden Sequenz (Gly, Ala, Leu) wurden durch DIC gekuppelt. Die codierenden Aminosäuren wurden dabei nach dem Molekulargewicht der nicht-Peptid-Bausteine gewählt, so dass der leichteste Baustein (in diesem Fall Bromessigsäure) von Gly, der schwerste (Bromtoluolsäure) von Leu und der mittlere (α-Bromvaleriansäure) von Ala codiert wurde.
Die drei Harzteile wurden miteinander vereinigt, gründlich mit DCM gewaschen und als Vorbereitung für die Kupplung der nächsten codierenden Aminosäuren durch TFA/DCM entschützt. Nach der Entschützung wurde das Harz wiederum in drei Teile geteilt. Die Kupplungen der Boc-geschützten Aminosäuren (wiederum Gly, Ala und Leu) wurden wie üblich mittels DIC durchgeführt. Nach der Kupplung der Aminosäuren des codierenden Peptids wurden die nicht-Peptidyl-Untereinheiten zugegeben. Zwei Teile des Harzes wurden mit 2 M Lösungen von Aminen (Benzylamin und 1-Amino-4-methylpiperazin) in DMF über Nacht versetzt. Der dritte Teil wurde mit einer Lösung von 2 M Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethylthiol versetzt, und die Fmoc-Gruppe wurde nach Beendigung der Reaktion abgetrennt. Die Codierung der Amine beruhte wiederum auf ihren Molekulargewichten.
Das Harz wurde wiederum vereinigt, gemischt und in drei Teile für die letzten Kupplungen geteilt. Carbonsäuren (Cyclohexylessigsäure, Phenyloxyessigsäure und 4-Pyridylthioessigsäure) wurden an die erhaltenen (primären und sekundären) Amine mittels DIC gekuppelt und die Kupplungsreaktionen zweimal wiederholt, wobei vorgeformte symmetrische Anhydride in einem 3-5fachen Überschuss eingesetzt wurden. Nachdem ein Chloraniltest ein negatives Ergebnis ergab, wurden die drei Harzansätze getrennt mit TFA versetzt, neutralisiert, und die letzten codierenden Boc-geschützten Aminosäuren wurden unter Verwendung von DIC und HOBt gekuppelt. Die Codierung der letzten Carbonsäuren beruhte auf dem gleichen Schema wie zuvor. Schließlich wurde das gesamte Harz vereinigt.
FAB (Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopiemessungen wurden am ZAB EQ-Spektrometer (VG Analytical Ltd, Manchester, UK) durchgeführt. ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem General Electric QE 300-Gerät gewonnen. Die Sequenzierung mittels Edman-Abbau wurde am Proteinsequenziergerät ABI 4778 (Applied Biosystems, Foster City, CA) und einem Porton PI 3010-Gerät (Porton Instruments, Tarzana, CA) durchgeführt. Sowohl die analytische als auch die präparative HPLC wurden am System 625 LC von Waters mit einem Waters 490E Programmable Multiwavelength Detector unter Verwendung von Vydac Peptide und Protein C18 analytischen (0,46 × 250 mm, 5 μm, 1 ml/min.) bzw. präparativen (10 × 250 mm, 10 μm, 3 ml/min.) Säulen durchgeführt. Die Analysen von von einem einzigen Kügelchen freigesetzten Gemischen wurden am Ultrafast Microprotein Analyzer (Michrom BioResources, Pleasanton, CA) unter Verwendung einer Reliasil C18-Säule (5 μm, 300 A, 1 × 150 mm) durchgeführt. Alle Spektren sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (δ) mit entweder CDCl₃ oder CD₃SOCD₃ als Lösungsmittel angegeben. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden am HP 8452A Diode-Array-Spektrophotometer von Hewlett Packard unter Verwendung einer 1-cm-Quarzcuvette aufgezeichnet. Die Aminosäureanalysen wurden am System D-500 (Durrum Corp., Palo Alto, CA) durchgeführt.
7.2 ERGEBNISSE
7.2.1 SYNTHESE VON ZWEI FORMEN CODIERTER BIBLIOTHEK
Mit diesem allgemeinen Ansatz wurden zwei Formate für die Bibliotheken komplettiert. Der einzige Unterschied zwischen diesen beiden Formaten besteht in der Lokalisierung des SCAL-Linkers, wie in Schema XIII gezeigt.
SCHEMA XIII
ERSATZBLATT (REGEL 26)
Die erste Bibliothek (A) enthielt den SCAL-Linker am N-ε von Lys, der direkt am Harz gebunden war, wodurch bei allen Verbindungen dieser Bibliothek die letzte Aminosäure Trp-Amid war. In dieser Bibliothek verblieben codierende Peptide nach der Spaltung auf den Harzkügelchen. In der zweiten Bibliothek (B) wurde der SCAL-Linker an das Harz gebunden, wobei die letzte Aminosäure in allen Verbindungen Lys war. Die von dieser Bibliothek freigesetzten Verbindungen enthielten jeweils die synthetische Verbindung und Peptid mit codierender Sequenz.

Die zur Konstruktion der synthetischen Testverbindung verwendeten nicht-Aminosäure-Bausteine sind oben in Schema XII dargestellt. Diese Bausteine wurden zur Bildung von Testverbindungen mit einzigartigem Molekulargewicht gewählt. Die Testverbindungen, Molekulargewichte und codierenden Sequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

Kombination von bei der Konstruktion einer Nichtpeptid-Modellbibliothek verwendeten Bausteinen
M.W.
Kombination	ohne Codierung	mit Codierung*	codierende Sequenz
167	444,6	743,9	GGG
168	454,5	767,9	AGG
169	471,6	827,0	LGG
147	474,6	787,9	GAG
148	484,5	811,9	AAG
149	501,6	871,1	LAG
157	482,6	838,0	GLG
158	492,6	862,0	ALG
159	509,6	921,2	LLG

267	486,7	800,0	GGA
268	496,6	824,0	AGA
269	513,7	883,1	LGA
247	516,7	844,1	GAA
248	526,6	868,0	AAA
249	543,7	927,2	LAA
257	524,7	894,1	GLA
258	534,7	918,1	ALA
259	551,7	977,3	LLA

367	520,7	876,1	GGL
368	530,6	900,1	AGL
369	547,7	959,2	LGL
347	550,7	920,1	GAL
348	560,6	944,1	AAL
349	577,7	1003,3	LAL
357	558,7	970,2	GLL
358	568,7	994,2	ALL
359	585,7	1053,3	LLL

* M.W. der die Testverbindung und das codierende Peptid enthaltenden verzweigten Verbindung

Kügelchen aus der ersten Bibliothek (Schema XIII, obere Reihe) wurden mit Reduktionsmittel versetzt und einzelne Kügelchen für getrennte Spaltung und Sequenzanalysen aufgenommen. Fünf Kügelchen wurden untersucht. Nach Abspaltung des nicht-Peptid-Teils wurden die Kügelchen erfolgreich sequenziert (siehe Tabelle 2), wobei die Struktur der nicht-Peptid-Verbindung abgeleitet werden konnte. Die abgespalteten Verbindungen enthaltende Lösungen wurden am Mikro-HPLC-System analysiert. Tabelle 2

Auf willkürlich ausgewählten Kügelchen aus einer Bibliothek von nicht-Peptid-Strukturen enthaltene Strukturen
				nachgewiesene Aminosäure (pmol)
Kügelchen Nr.	Untereinheitkombination	M.W. (m/z)	1. Zyklus	2. Zyklus	3. Zyklus
1	149	501,6	L (50)	A (55)	G (72)
2	169	471,6	L (34)	G (31)	G (29)
3	258	534,7	A(101)	L (83)	A (98)
4	147	474,6	G (45)	A (41)	G (25)
5	157	444,6	G (39)	G (30)	G (22)

Eine Probe (800 mg) der zweiten Bibliothek (Schema XIII, untere Reihe) wurde mit 95% TFA nach Reduktion des SCAL-Linkers versetzt, gefriergetrocknet, in Wasser gelöst und auf einer halbpräparativen HPLC-Säule in 44 Spitzenwerte unter Verwendung eines Gradienten von 0-60% Acetonitril in 0,1% TFA in Wasser über einen Zeitraum von 200 min. getrennt. Die Fraktionen wurden lyophilisiert und mehrere Spitzenwerte mittels FAB-MS analysiert und sequenziert, um die Entsprechung zwischen der von der codierenden Aminosäuresequenz vorhergesagten Struktur und dem Molekulargewicht des Konstrukts aufzuzeigen. Es folgen Beispiele von Spitzenwerten, die für die weitere Analyse zufällig gewählt wurden: Spitze 4: RT 25,31 min, Sequenzierung: 1. Leu (364 pmol), 2. Gly (139), 3. Gly (422); FAB MS – 827,0 (Bausteinkombination 169); Spitze 8: RT 28,69 min, Sequenzierung: 1. Gly (261), 2. Leu (176), 3. Ala (225); FAB MS – 770,2 (Bausteinkombination 257 ohne Baustein 7); Spitze 13: RT 31,47 min, Sequenzierung: 1. Leu (792), 2. Leu (551), 3. Gly (128); FAB MS – 921,0 (Bausteinkombination 159); Spitze 14: RT 32,27 min, Sequenzierung: 1. Leu (7930), 2. Gly (1810), 3. Ala (1763); FAB MS – 883,0 (Bausteinkombination 269); Spitze 15: RT 32,77 min, Sequenzierung: 1. Leu (784), 2. Ala (447), 3. Ala (360); FAB MS – 776,2 (Bausteinkombination 249 ohne Baustein 9); Spitze 16: RT 33,16 min, Sequenzierung: 1. Leu (1286), 2. Ala (918), 3. Ala (688); FAB MS – 776,2 (Bausteinkombination 249 ohne Baustein 9); Spitze 17: RT 33,51 min, Sequenzierung: 1. Leu (298), 2. Leu (280), 3. Ala (202); FAB MS – 826,2 (Bausteinkombination 259 ohne Baustein 9); Spitze 19: RT 34,80 min, Sequenzierung: 1. Leu (641), 2. Gly (412), 3. Ala (460); FAB MS – 883,1. (Bausteinkombination 269); Spitze 20: RT 36,66 min, Sequenzierung: 1. Leu (150), 2. Leu (119), 3. Leu (80); FAB MS – 902,2 (Bausteinkombination 359 ohne Baustein 9); Spitze 26: RT 41,77 min, Sequenzierung: 1. Gly (39), 2. Gly (38), 3. Gly (23); FAB MS – 744,1 (Bausteinkombination 167); Spitze 31: RT 48,86 min, Sequenzierung: 1. Ala (180), 2. Gly (98), 3. Ala (106); FAB MS – 824,0 (Bausteinkombination 268); Spitze 32: RT 49,46 min, Sequenzierung: 1. Leu (234), 2. Leu (320), 3. Ala (277); FAB MS – 826,1 (Bausteinkombination 259 ohne Baustein 9); Spitze 33: RT 50,70 min, Sequenzierung: 1. Gly (152), 2. Gly (120), 3. Ala (94); FAB MS – 800,1 (Bausteinkombination 267).
7.2.2 SYNTHESE REPRÄSENTATIVER VERBINDUNGEN AUS DER NICHT-PEPTID-BIBLIOTHEK
Ein Bestandteil der ersten Bibliothek (A), Verbindung I:
wurde an 0,23 g Knorr-Harz (0,5 mÄq./g) synthetisiert. Fmoc-Trp wurde zunächst nach der allgemeinen Vorschrift unter Verwendung von DIC und HOBt gekuppelt. Nach Entschützung der Aminogruppe wurde α-Bromessigsäure (50 mg) unter Verwendung von DIC (50 μl) in DMF (0,5 ml) gekuppelt. Benzylamin (100 μl) wurde in 0,5 ml DMSO gelöst und Bromharz mit dieser Lösung über Nacht versetzt. Die letzte Carbonsäure, 4-Pyridylthioessigsäure (80 mg), wurde in 0,85 ml DMPT gelöst und mit DIC (80 μl) und HOBt (80 mg) voraktiviert und 10 Stunden an Aminoharz gekuppelt. Die Kupplung wurde zur Aktivierung mit PyBrop und DIEA wiederholt. Die Abspaltung der Verbindung I wurde in 95% TFA erreicht. Nach der Abspaltung wurde TFA im Vakuum verdampft und der Rest in 30% wässrigem Acetonitril gelöst und lyophilisiert. Das nach dem Trocknen erhaltene Produkt wurde wieder in reinem Acetonitril gelöst und mit Ether gefällt. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, wobei ein fast weißer Niederschlag erhalten wurde. Das Produkt zeigte zwei Spitzenwerte bei der Umkehrphasen (RP [Reverse Phase])-HPLC. Der zweite Spitzenwert ergab das erwartete Massenspektrum der Verbindung I. Die Ausbeute an Bestandteil I nach Aufreinigung an halbpräparativer RP-HPLC betrug 18 mg. Formel: C₂₇H₂₇N₅O₃S, MS erwartet 501,6, MS gefunden – 502,2 (M + H)⁺. ¹H NMR-Daten (DMSO-d6): 10,804 d (1H, NⁱⁿH); B. 49 d (2H, Pyridyl C₂H und C₆H); 8,35 d (1H, NH); 7,62 d (2H, Pyridyl C₃H und C₅H); 6,9-7,7 mm (Bzl und Trp aromatische Protonen); 4,59 m (1H, Trp C^αH); 3,75-4,65 m (aliphatische Protonen); 3,19 dd und 2,91 dd (2H, Trp C^βH).
Ein zweiter Bestandteil der ersten Bibliothek (Schema XII, A), Verbindung II:
wurde nach dem gleichen Schema wie Verbindung I synthetisiert, wobei als Untereinheiten α-Bromvaleriansäure (40 μl), 4-Methylaminopiperazin (100 μl) und Cyclohexylessigsäure (80 mg) verwendet wurden. Formel: C₂₉H₄₄N₆O₃, MS erwartet – 524,7, MS gefunden – 525,3 (M + H)⁺ 558,2 (M + Na)⁺ und 573,2 (M + K)⁺.
Der dritte Bestandteil der ersten Bibliothek (A), Verbindung III:
wurde nach ähnlichem Schema wie Verbindung I synthetisiert, wobei als Bausteine α-Bromtoluolsäure (120 mg), Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethylmercaptan (280 mg) (Entschützung nach Kupplung mit Piperidin/DMF) und Phenoxyessigsäure (80 mg). Formel: C₂₉H₃₀N₄O₄S, MS erwartet 530,6, MS gefunden – 553,0 (M + Na)⁺.
7.3 DISKUSSION
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit zur Konstruktion von nicht-Peptid-Strukturen parallel zur codierenden Sequenz. Der Unterschied in den Bibliotheken bestand in der Platzierung des SCAL-Linkers, was die selektive Spaltung des Produkts gestattete. Im ersten Fall (Schema XIII, obere Reihe) führt die Spaltung des Linkers zur Freisetzung der nicht-Peptid-Verbindung X₃-X₂-X₁-Trp (Trp ist zum Zweck der spektroskopischen Beobachtung angebunden), die über eine Lysingruppierung mit ihrer codierenden peptidischen Struktur verbunden ist. Die Spaltung des Linkers im zweiten Fall (Schema XIII, untere Reihe) führt zur Freisetzung der nicht-Peptid-Verbindung X₃-X₂-X₁-Trp ohne irgendein gebundenes codierendes Peptid. Die Konstruktion der nicht-Peptid-Verbindung beinhaltete (i) die Bindung von α-Brom-substituierter Carbonsäure oder Brommethylbenzoesäure an die verfügbare Aminogruppe am festen Träger, (ii) Alkylierung einer Amino- (Zuckerman et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:10646-10647) oder Thiolgruppe eines Amins oder N-geschützten Aminomercaptans und (iii) Acylierung einer erzeugten Aminogruppe durch ein Carbonsäurederivat. Für dieses Experiment wurden die Bausteine so ausgewählt, dass dadurch die Zuordnung der Struktur der konstruierten Suchmoleküle allein auf dem Molekulargewicht des Konstrukts beruht (siehe Tabelle I). Der Einführung jedes nicht natürlichen Bausteins in die Suchstruktur folgte (bzw. ging voraus) die Kupplung einer codierenden Aminosäure an den anderen Arm des Moleküls. Für die Codierung wurden von uns lediglich Glycin, Alanin und Leucin verwendet (diese Aminosäuren codierten daher bei jedem Schritt der Randomisierung für ein anderes Strukturelement). Die Zuordnung dieser Aminosäuren zu dem jeweiligen Strukturelement ist in Schema IX angegeben. Die Alkylierung von in diesem Experiment verwendeten Aminen oder Thiol durch an die Polymermatrix gebundene 2-Brompentansäure führt zur Erzeugung von Verbindungen mit einem chiralen Zentrum, wodurch die Anzahl der Strukturkombinationen 36 statt 27 beträgt. Allerdings werden nur 27 verschiedene Arten von Kügelchen erzeugt (mit Suchsequenzen von unterschiedlichem Molekulargewicht), von denen 9 ein Gemisch von diastereoisomeren Verbindungen enthalten. Zur Vereinfachung der Analyse der Gemische und um die Fähigkeit zur Durchführung dieser Art von Synthese am polymeren Träger aufzuzeigen, wurden drei der möglichen Strukturen als Einzelverbindungen neu synthetisiert, wobei die gleiche Chemie und der gleiche Polymerträger wie bei der Synthese der Modellbibliothek verwendet wurden.
Die erzeugten Gemische wurden vom Träger nach Reduktion des SCAL-Linkers abgespalten und mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die erhaltene Anzahl von Spitzenwerten entspricht ungefähr der vorhergesagten Anzahl 36. Einzelne Spitzenwerte vom ersten Bibliothekstyp wurden gesammelt. Ein Teil jeder gesammelt Fraktion wurde dem Edman-Abbau unterzogen und ein Teil wurde durch Massenspektroskopie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen die Korrelation der Sequenzbestimmung mit der Molekulargewichtsbestimmung mittels Massenspektroskopie, wodurch die Realisierbarkeit des Prinzips der Codierung mittels Peptidsequenz bestätigt wird (Tabelle 2).
Eine alternative Analyse wurde an zufällig ausgewählten Kügelchen aus der zweiten Bibliothek durchgeführt. Einzelne Kügelchen wurden dabei mit einem Reduktionsmittel versetzt, um den SCAL-Linker labil zu machen, und die nicht-Peptid-Struktur wurde durch ein TFA/Wasser-Gemisch gespalten. Nach dieser Behandlung wurden die Kügelchen erfolgreich sequenziert (siehe Tabelle 2), und die Struktur der nicht-Peptid-Verbindung konnte abgeleitet werden. Die abgespaltenen Verbindungen wurden an einem Mikro-HPLC-System analysiert.
8. BEISPIEL: BIBLIOTHEK: XXXX-Lys(XXXX)-Lys(ZZ)-βAla-Gly-βAla-Gly-TG
Im vorliegenden Beispiel wird die Verwendung eines codierenden Peptids zur Codierung eines nichtsequenzierbaren Teils eines Peptids gleichzeitig mit dem sequenzierbaren Teil des Testverbindungspeptids demonstriert.
8.1 MATERIAL UND METHODEN
8.1.1 SYNTHESE DER BIBLIOTHEK
Die Bibliothek wurde nach der folgenden Vorschrift synthetisiert. 1. Kupplung von Fmoc-Lys(Boc) an H-βAla-Gly-βAla-Gly-TG; 2. Fmoc-Spaltung; 3. Kupplung von Fmoc-Lys(Fmoc); 4. Boc-Abspaltung; 5. Nach Aufteilung des Harzes in neun Teile wurden die folgenden Ddz-geschützten Aminosäuren in getrennten Reaktionen gekuppelt: A, D, I, K, M, N, S, T, V; 6. Fmoc-Spaltung; 7. Kupplung von neun Fmoc-geschützten Aminosäuren: Y, G, F, L, H, P, Q, R, E (Y wurde an denjenigen Teil des Harzes gekuppelt, an den bereits A gebunden war, usw.); 8. Harz vereinigt und Ddz abgespalten; 9. Wiederholung der Schritte 5-7; 10. Fmoc-Abspaltung; 11. Kupplung von neun Fmoc-geschützten Aminosäuren: Y, G, F, L, H, P, Q, R, E; 12. Wiederholung der Schritte 10-11; 13. Fmoc-Abspaltung; 14. Seitenkettenschutzgruppen und Ddz durch Gemisch K abgetrennt (King et al., 1990, Int. J. Pep. Protein Res. 36:255-266).
Ein Kügelchen wurde 4 Zyklen Edman-Abbau unterzogen: 1. Zyklus: Arg (64), Ile (67); 2. Zyklus: Gly (45), Thr (14); 3. Zyklus: Phe (42); 4. Zyklus. Arg (35). Ile war für die Kupplung Ddz-geschützt und fand sich im ersten Zyklus. Es codierte für Phe, das im dritten Zyklus nachgewiesen wurde. Im zweiten Zyklus wurde Thr als diejenige Aminosäure, die in Ddz-geschützter Form gekuppelt worden war, nachgewiesen. Entsprechend wurde Arg, das von Thr codiert wurde, im vierten Zyklus der Sequenzierung gefunden.
8.1.2 VORSCHRIFT ZUM ABSUCHEN DER BIBLIOTHEK
Die Peptidbibliothek wurde gemäß veröffentlichten Verfahrensweisen abgesucht (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15). Die Peptidkügelchen wurden zunächst mit doppelt destilliertem Wasser zur Abtrennung des DMF gemischt. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7,2) wurden die Kügelchen mit 0,05% Gelatine (w/v) beschichtet, um eine eventuelle nichtspezifische Bindung zu blockieren. Die Kügelchen wurden dann mit einer 1:100.000 verdünnten Lösung von 2 mg/ml Streptavidin-alkalische Phosphatase 2 mg/ml (Pierce; Rockford, IL) in 2 × PBS/Tween/Gelatine (2 × PBS, 0,1% Tween-20 (v/v) und 0,05% Gelatine (w/v)) inkubiert. Anschließend wurden die Kügelchen gründlich mit TBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 25 mM Tris-Base, pH 7,4) gewaschen und mit dem Standardsubstrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat versetzt. Die Kügelchen wurden dann zusammen mit dem Substrat auf Petrischalen zur Farbentwicklung überführt. Nach 30 Minuten bis 1 Stunde wurden die gefärbten Kügelchen gesammelt, und zwar mit Hilfe einer Mikropipette, mit 6 M Guanidinhydrochlorid, pH 1,0, gewaschen und wie beschrieben der Sequenzierung unterzogen.
Die verbliebene Bibliothek aus farblosen Kügelchen wurde dann mit 8 M Guanidinhydrochlorid, pH 2,0, wiederaufbereitet, gründlich mit PBS gewaschen und mit 60 pM biotinyliertem anti-β-Endorphin (Klon 3-E 7, Boehringer Mannheim) über Nacht in 2 × PBS/Tween/Gelatine inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurde Streptavidin-alkalische Phosphatase zugegeben. Eine Stunde später wurden die Kügelchen gewaschen, mit Substrat versetzt, woraufhin die Farbentwicklung wie oben beschrieben erfolgte. Die gefärbten Kügelchen wurden dann physikalisch isoliert und der Sequenzierung unterzogen. Bei diesen beiden Experimenten wurden lediglich die dunkelsten Kügelchen sequenziert.
8.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
In den Abschnitten 6 und 7 oben wird gezeigt, dass eine „Testverbindung" von einer „codierenden" Peptidsequenz codiert werden kann. Dieses Prinzip lässt sich auch zur Bestimmung der Struktur von Peptiden, die eine nichtsequenzierbare Komponente innerhalb ihrer Peptidkette enthalten, verwenden. In diesem Fall muss nur für die am Carboxylterminus des Moleküls nach dem nichtsequenzierbaren Teil lokalisierten Aminosäurereste codiert werden. Von uns wurde eine Bibliothek konstruiert, die diese Situation nachahmt, obwohl die „Testverbindung" tatsächlich keine nichtsequenzierbare Komponente enthält. Die Struktur der Bibliothek ist in Schema XIV angegeben.
SCHEMA XIV

Die Aminosäurereste X₄ und X₃ im „Testverbindungs"-Arm werden von keinem Gegenstück im „codierenden" Arm codiert. Die Aminosäuren Z₁ und Z₂ codieren für den Rest X₁ und X₂ und liegen mit einer halb so hohen Konzentration wie die Aminosäuren in der „Test"-Sequenz vor. Die Struktur des Peptids von Interesse lässt sich mit zwei Zyklen Edman-Abbau aufdecken. Die in größerer Menge nachgewiesene Aminosäure ist der Rest von Position 1 oder 2 der „Test"-Sequenz. Bei der in geringerer Menge nachgewiesenen Aminosäure handelt es sich um den für Position 4 oder 3 dieser Sequenz codierenden Rest. Bei der codierenden Aminosäure kann es sich um die gleiche handeln, für die sie codiert, oder sie kann von dieser verschieden sein. Der codierende Satz und der Suchsatz der Aminosäuren, die in diesem Beispiel verwendet wurden, sind in Schema XIV angegeben. Tabelle 3

Ergebnisse der Sequenzierung
1. Zyklus	2. Zyklus	abgeleitete Sequenz	Ziel
Y,D	G,I	YGGF	anti-β-Endorphin
Y,N	G,I	YGPF	anti-β-Endorphin
Y,D	G,K	YGGL (3×)	anti-β-Endorphin
H,S	P,I	HPQF (5×)	Streptavidin

Die Synthese der Bibliothek wurde unter Verwendung einer Kombination aus drei Aminoschutzgruppen durchgeführt. Ein zeitweiliger Schutz der α-Aminogruppe in der „Such"-Sequenz wurde von der Fmoc-Gruppe bereitgestellt, die durch Piperidin in Dimethylformamid abgespalten werden kann. Ein zeitweiser Schutz der „codierenden" Sequenz wurde durch Verwendung der Ddz-Gruppe (Birr et al., 1972, Liebig's Ann. Chem. 763:162-173), die mit verdünnter Trifluoressigsäure (2%) abgespalten werden kann, erreicht. Die funktionellen Seitenkettengruppen wurden durch Schutzgruppen vom tert.-Butyl-Typ geschützt, die mit Trifluoressigsäure höherer Konzentration (50%) abgespalten werden können. Ein Zyklus der Randomisierung mit Sequenz-Tagging bestand aus (i) der Aufteilung des Harzes auf die Anzahl Reaktionsgefäße, die der Anzahl der in diesem Schritt randomisierten Aminosäuren entspricht, (ii) Kupplung Fmoc-geschützter Aminosäuren (Y, G, F, L, H, P, Q, R, E), (iii) Waschen, Abspaltung der Ddz-Gruppe und Neutralisierung, (iv) Kupplung der entsprechenden Ddz-geschützten Aminosäuren (A, D, I, K, M, N, S, T, V), (v) Mischen des festen Trägers und Entschützung der Fmoc-Gruppe.
Diese Bibliothek wurde bei der Suche gegen zwei Modellziele, nämlich monoklonaler anti-β-Endorphin-Antikörper und Streptavidin, verwendet. Positive Kügelchen wurden dabei mittels Standardfärbetechnik (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods, 1:11-15; Lam et al., 1991, Nature 354:82-85) identifiziert, wobei die bei dieser Suche identifizierten Kügelchen (jeweils 5 pro Ziel) dann zwei Zyklen Edman-Abbau unterzogen wurden. Die Ergebnisse der zwei Zyklen Edman-Abbau sind in Tabelle 3 angegeben. Wie man sieht, ergaben Streptavidin-positive Kügelchen in allen Fällen H (X₁) und S (Z₁) (für Q, X₃ codierend) im ersten Zyklus und P (X₂) und I (Z₂) (für F, X₄ codierend) im zweiten Zyklus. Daher ließ sich die Sequenz des Sucharms HPQF leicht entschlüsseln. Bei der anti-β-Endorphin-Suche identifizierte Kügelchen ergaben unterschiedlichere Ergebnisse. Neben Y (X₁) und D (Z₁) (für G, X₃ codierend) wurde auch N (Z₁) (für P, X₃ codierend) im ersten Zyklus gefunden, wobei G (X₂) und I (Z₂) (für F, X₄ codierend) und K (Z₂) (für L, X₄ codierend) im zweiten Zyklus gefunden wurden. Daher ließen sich die Sequenzen YGGL (3×), YGGF und YGPF aus diesen Daten konstruieren. Die Sequenzen sind mit den bereits früher erhaltenen Daten vereinbar (Lam und Lebl, unten; Lam et al., 1991, unten; Lam et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:419-429).
Diese Experimente zeigen eindeutig, dass Peptide zur Codierung anderer Strukturen, die teilweise oder vollständig unsequenzierbar sind, verwendet werden können. Diese Technologie besitzt aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit auf die Untersuchung von molekularen Liganden-Akzeptor-Wechselwirkungen und auf die Entwicklung von Arzneistoffen große Signifikanz. Codierte Bibliotheken öffnen die Tür zur Anwendung breiter paralleler Ansätze zur Wirkstoffsynthese und zum Durchsuchen von nicht-Peptid-Bibliotheken.
9. BEISPIEL: BIBLIOTHEKEN VON NICHT-PEPTID-STRUKTUREN AUF DER GRUNDLAGE DER FESTPHASENPEPTIDSYNTHESECHEMIE
Im vorliegenden Beispiel wird die Einfachheit der Synthese von Peptidstrukturen mit der bei Verwendung alternativer Untereinheiten neben den Standardaminosäuren verfügbaren Vielfältigkeit kombiniert. Die einfachsten Untereinheiten für die Konstruktion der Bibliothek werden in Abschnitt 5.5.9 oben erörtert.
Die Synthese der vorliegenden Bibliothek beinhaltet die Verwendung trifunktioneller Aminosäuren und die Modifikation einer Seitenkette zur Erzielung der strukturellen Vielfältigkeit. Dabei stellen Aminosäuren wie etwa Diaminobuttersäure, Asparaginsäure, Cystin und/oder Iminodiessigsäure die kleinsten Untereinheiten dar, an deren Seitenketten Carbonsäuren, Amine, Isocyanate oder Halogenide (aliphatisch, aromatisch, heterocyclisch) gebunden werden können. Diese Aminosäuren können selbst als Gerüst für die weitere Derivatisierung dienen.
Zur Erreichung einer angemessenen Bindung an einen Akzeptor (z.B. Rezeptor, Antikörper, Enzym, Nukleinsäure usw.) muss die entsprechende räumliche Anordnung der wechselwirkenden Strukturen realisiert werden. Die lineare Präsentation von Aminosäureseitenketten in Peptidbibliotheken dürfte dabei kein optimales Format für die Auswahl der am besten bindenden Strukturen darstellen. Die optimale Strategie zur Präsentation der wechselwirkenden Strukturen dürfte ihre Platzierung auf einem molekularen Gerüst sein, wodurch der entsprechende Konformationsraum kartiert würde. Die Beziehungen der gleichen einzelnen Bausteine untereinander in der Gerüststrukturanordnung lassen sich durch Verwendung unterschiedlicher Gerüststrukturen ebenso wie unterschiedlicher Seitenketten variieren.
9.1 MATERIAL UND METHODEN
9.1.1 GERÄTE
FAB (Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopiemessungen wurden am ZAB EQ-Spektrometer (VG Analytical Ltd, Manchester, UK) durchgeführt. ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem General Electric (Fullerton, CA)-QE 300-Gerät gewonnen. Die Sequenzierung mittels Edman-Abbau wurde am Proteinsequenziergerät ABI 4778 (Applied Biosystems Foster City, CA) und einem Porton PI 3010-Gerät (Porton Instruments, Tarzana, CA) durchgeführt. Sowohl die analytische als auch die präparative HPLC wurden am System 625 LC von Waters mit einem Waters 490E Programmable Multiwavelength Detector unter Verwendung von Vydac Peptide und Protein C18 analytischen (4,6 × 250 mm, 5 μm, 1 ml/min.) bzw. präparativen (10 × 250 mm, 10 μm, 3 ml/min.) Säulen durchgeführt. Die Analysen von von einem einzigen Kügelchen freigesetzten Gemischen wurden am Ultrafast Microprotein Analyzer (Michrom BioResources, Pleasanton, CA) unter Verwendung einer Reliasil C18-Säule (5 μM, 300 A, 1 × 150 mm) durchgeführt. Alle Spektren sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (δ) mit entweder CDCl₃ oder CD₃SOCD₃ als Lösungsmittel angegeben. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden am HP 8452A Diode-Array-Spektrophotometer von Hewlett Packard unter Verwendung einer 1-cm-Quarzcuvette aufgezeichnet. Die Aminosäureanalysen wurden am System D-500 (Durrum Corp., Palo Alto, CA) durchgeführt.
9.1.2. VERFAHRENSWEISEN
Die Festphasensynthese wurde manuell in Polypropylenspritzen, wie von Krchnak und Vagner (1990, Peptide Res. 3:182-193) beschrieben durchgeführt. Synthesen wurden an mit einem SCAL-Stiel (Patek und Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894) (Safety-Catch-Amidlinker) oder mit einem entsprechenden Linker modifiziertem TentaGel S NH₂ (TG)-Harz (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland, 130 oder 80 μm, 0,23 mmol/g) durchgeführt. Die Abspaltungen der Fmoc-Schutzgruppen erfolgten mit 50% Piperidin/DMF über einen Zeitraum von 1 × 10 min., TFA-Gruppen durch wiederholte Behandlung (3 × 1 min. + 90 min.) mit 10% Piperidin/Wasser. Npys-Gruppen wurden mit einer Lösung von 0,3 M HCl in Dioxan 5 + 30 min. abgetrennt, die Aloc-Gruppe mit (Ph₃P)₄Pd in DMF/AcOH/N-Me-Morpholin (10:2:1) und Boc-Gruppen wurden mit 30% TFA/DCM mit 3% Anisol 20 min. abgespalten. Für die Neutralisierung nach der Boc-Abspaltung wurde eine Lösung von DIEA/DCM (10%) verwendet. Für die Aktivierung sowohl von Nα-Fmoc- als auch Boc-Aminosäuren wurde ein Gemisch aus BOP/HOBt/DIEA (1:1:2 Äq.) in DMF verwendet. Die Vollständigkeit der einzelnen Kondensationsreaktionen (1,5-40 Std.) wurde jeweils mit dem Ninhydrintest oder bei Kupplung an sekundäre Aminogruppen dem Chloraniltest überprüft. Die Kupplungsvorschrift beinhaltete das Waschen mit DMF (6-8 mal) (mit anschließendem Waschen mit DCM bei Boc-geschützten Aminosäuren) zwischen der Kupplung und der Entschützung sowie zwischen der Entschützung und der Kupplung. Die Reduktion des SCAL-Linkers wurde über 2 Stunden mit 20% (EtO)₂P(S)SH in DMPU durchgeführt. Die endgültige Spaltung erfolgte mit einem Gemisch aus 95% TFA und 5% Wasser.
9.1.3 REAGENZIEN
Es wurden Lösungsmittel im handelsüblichen Reinheitsgrad ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Geschützte Aminosäuren wurden von Bachem (Torrance, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY) oder Propeptide Vert-le-Petit, Frankreich) bezogen. Amine und Carbonsäuren wurden von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen.
9.1.4 SYNTHESE EINER NICHTPEPTIDISCHEN BIBLIOTHEK AN NICHTPEPTIDISCHEN GERÜSTSTRUKTUREN
Mono-tert.-butyloxycarbonylethylendiamin.
Diese Verbindung wurde wie bereits beschrieben dargestellt (Krapcho et al., 1990, Synthetic Commun. 20:2559-2564). Kurz gesagt wurde dabei eine Lösung von tert.-Butyldicarbonat (5,0 g, 0,023 mol) in Dioxan (50 ml) langsam zu Ethylendiamin (11,0 ml, 0,165 mol) in Dioxan (60 ml) gegeben. Nach 24 Stunden Rühren wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in Wasser (80 ml) gelöst, unlösliches Nebenprodukt abfiltriert und das Filtrat mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde das Produkt aus einem Lösungsmittelgemisch aus Diethylether-Petrolether oder Essigester-Petrolether kristallisiert. Ausbeute: 2,6 g (71%). NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) d: 1,39 (s, 9H, tBu), 2,83 (m, 2H, C^aH₂), 3,16 (q, 2H, C^bH₂), 6,93 (t, 1H, NH), 7,77 (br, 2H, NH₂). Fp. 75°C.
N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin.
Eine Lösung von Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (31,0 g, 0,092 mol) in Acetonitril (300,0 ml) wurde langsam zu mono-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin (10,0 g, 0,063 mol), gelöst in 10% aq. Na₂CO₃ (250 ml), gegeben. Acetonitril wurde abgezogen und das Produkt mit Essigester extrahiert, die organische Phase über Na₂CO₃ getrocknet, eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Petrolether auskristallisieren gelassen. Das Produkt wurde auf einem Filter gesammelt und mit Petrolether gewaschen. Ausbeute: 20,0 g (84%). DC mit Petrolether – Diethylether 88:12 R_f 0,64. NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) d: 1,37 (s, 9H, tBu), 2,99 (m, 4H, CH₂CH₂), 4,20-4,29 (m, 3H, Fmoc OCH₂CH–), 6,76 (t, 1H, NH), 7,25 (t, 1H, NH), 7,33-7,89 (m, 8H, Fmoc). Fp. 146-148°C.
mono-N-Fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin-trifluoracetat.
N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin (20,0 g, 0,052 mol) wurde mit Trifluoressigsäure und Anisol in Dichlormethan (10:10:1) 1 Stunde bei Raumtemperatur versetzt. Nach Einengen bis zur Trockne wurde das Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch von Essigester-N-hexan kristallisiert. Ausbeute: 15,0 g (73%). NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) d: 2,85 (m, 2H, C^aH₂), 3,22 (m, 2H, C^bH₂), 4,23-4,36 (m, 3H, Fmoc OCH₂CH–), 7,37 (m, 1H, NH), 7,34-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,77 (br, 2H, NH₂). Fp. 128-129°C.
cis,cis-1,3,5-Trimethylcyclohexan-5-carbonsäure-1,3-dicarbonsäureanhydrid (1).
Verbindung (1) wurde wie beschrieben dargetellt (Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc., 111:1082-1090). Kurz gesagt wurde dabei cis,cis-1,3,5-Trimethylcyclohexan-1,3,5-tricarbonsäure (1,0 g, 0,004 mol) in Xylol (50 ml) unter Stickstoff 19 h am Rückfluss erhitzt, und zwar unter Verwendung eines Firestone-Ventils und einer Dean-Stark-Falle. Die erhaltene Lösung wurde im Vakuum eingeengt und das Produkt kristallisieren gelassen. Nach Sammeln auf einem Filter wurde das Produkt im Vakuum 1 h bei 70°C getrocknet. Ausbeute: 0,78 g (82%). NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) d: 1,10 (s, 3H, CH₃), 1,16 (s, 6H, 2CH₃), 1,33, 2,39 (d, d, 4H, 2CH₂), 1,33, 2,15 (d, d, 2H, CH₂), 12,60 (s, 1H, COOH). Fp. 252-253°C, Lit. (32) Fp. 252-254°C.
5-(N-tert.-Butyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-cis,cis-1,3,5-trimethylcyclohexan-1,3-dicarbonsäure (2).
Das Säureanhydrid (1) (0,5 g, 0,002 mol) wurde in DMF (4 ml) gelöst und mit in DMF (4 ml) gelöstem Mono-tert.-butyloxycarbonylethylendiamin (0,33 g, 0,002 mol) unter Stickstoff versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde etwa 5 Stunden (Verfolgen mit DC) gerührt und das DMF anschließend abgezogen. Das Produkt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch von Essigester-Petrolether kristallisiert. Ausbeute: 0,38 g (47%). NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) d: 1,08 (s, 3H, CH₃), 1,13 (s, 6H, 2CH₃), 1,34 (s, 9H, tBu), 1,07, 2,51 (d, d, 4H, 2CH₂), 2,43 (d, 2H, CH₂), 2,96 (m, 4H, 2CH₂), 6,70 (t, 1 h, NH), 7,71 (t, 1H, NH), 12,10 (s, 1H, COOH). Fp. 161-164°C.
5-(N-tert.-Butyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-cis,cis-1,3,5-trimethylcyclohexan-1,3-dicarbonsäureanhydrid (3).
Dicyclohexylcarbodiimid (0,55 g, 0,002 mol) wurde unter Stickstoff zu der Lösung von Disäure (2) (1,0 g, 0,0025 mol) in DCM (70 ml) gegeben. Nach 4 stündigem Rühren wurde der Reaktionsansatz eingeengt und Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wurde bis. zur Trockne eingeengt und der Rückstand aus einem Lösungsmittelgemisch von Essigester-Petrolether kristallisiert und im Exsikkator (KOH, P₂O₅) im Vakuum getrocknet. Ausbeute 0,9 g (95%).
5-(N-tert.-Butyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-3-(N-fluorenylmethyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-cis,cis-1,3,5-trimethylcyclohexan-1-carbonsäure (4).
Das Anhydrid (3) (0,85 g, 0,002 mol) wurde in DMF (10 ml) gelöst und mit einer Lösung von Mono-N-fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamintrifluoracetat (0,88 g, 0,002 mol) in DMF (15 ml) in Gegenwart von Triethylamin (auf pH 8,5 eingestellt) unter Stickstoff versetzt. Der Reaktionsansatz wurde 4 Stunden gerührt (Verfolgen mit DC) und danach zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde einer Flash-Chromatographie (Silica Gel Merck 60, 230-400 mesh) im Lösungsmittelsystem DCM-MeOH 25:1 unterzogen. Reines Produkt enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockne eingeengt und das Produkt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch von Essigester-Petrolether kristallisiert. Ausbeute: 0,32 g (24%). NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) d: 1,08 (s, 6H, 2CH₃), 1,14 (s, 3H, CH₃), 1,35 (s, 9H, tBu), 4,25 (m, 3H, Fmoc OCH₂CH–), 6,86 (t, 1H, NH), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc). Fp. 118-121.
Nichtpeptidische Bibliothek an nichtpeptidischer Gerüststruktur.

Die Verbindung (4) wurde als Gerüststruktur für eine nichtpeptidische Bibliothek verwendet. An TentaGel S NH₂ (0,4 g, Substitution 0,21 mÄquiv. NH₂/g) wurde eine Festphasensynthese nach der folgenden Vorschrift durchgeführt:

Schritt Reagenz		Zeit
1	5% DIEA/DMF	2 × 5 min.
2	DMF-Waschschritt	10 × 2 min.
3	Fmoc-Lys(Boc)/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
4	Wiederholung von Schritt 2
5	DCM	10 × 2 mm.
6	TFA/DCM/Anisol	1 × 30 min.
7	Wiederholung von Schritt 5
8	5% DIEA/DCM	3 × 2 min.
9	Wiederholung von Schritt 2
10	Harz wurde in 20 Portionen eingeteilt und die unten angegebenen Säuren gekuppelt. Dabei wurden Anhydride als solche verwendet und andere Carbonsäuren unter Verwendung des BOP-Reagenz gekuppelt. Pivalinsäure Phenylessigsäure Diphenylessigsäure 1-Adamantanessigsäure Z-Gly ClZ-β-Ala ClZ-Aminocapronsäure diBoc-Guanidinessigsäure diBoc-ε-Guanidinpentansäure Succinamidsäure Furan-2-carbonsäure p-Hydroxybenzoesäure Isonicotinsäure 4-Phenylbuttersäure Essigsäureanhydrid n-Buttersäureanhydrid n-Capronsäureanhydrid Benzoesäureanhydrid Bernsteinsäureanhydrid Glutarsäureanhydrid
11	Wiederholung von Schritt 2
12	50% Piperidin/DMF	10 min.
13	Wiederholung von Schritt 2
14a	Verbindung 4/DIC/HOBt	30 min. (Voraktivierung)
14b	Produkt aus Schritt 14a	bis Kaiser Test negativ ist
15	Wiederholung von Schritt 11-13
16	Harz in 20 Portionen geteilt und die in Schritt 10 definierten Säuren gekuppelt. Anhydride wurden als solche verwendet, und andere Carbonsäuren wurden zunächst durch ein DIC/HOBt-Gemisch voraktiviert.
17	DMF-Waschschritt	10 × 2 min.
18	DCM	3 × 2 min.
19	TFA/DCM/Anisol	1 × 30 min.
25	DCM	5 × 2 min.
26	5% DIEA/DCM	3 × 2 min.
27	DMF-Waschschritt	4 × 2 min.
28	Harz in 20 Portionen geteilt und die in Schritt 10 definierten Säuren gekuppelt. Anhydride wurden als solche verwendet, und andere Carbonsäuren wurden zunächst durch ein DIC/HOBt-Gemisch voraktiviert.
29	DMF-Waschschritt	10 × 2 min.
30	DCM-Waschschritt	3 × 2 min.
31	TFA/TFMSA/TA	30 min.
32	DCM-Waschschritt	3 × 2 min.
33	DMF-Waschschritt	5 × 2 min.

9.1.5 VERZWEIGTE BIBLIOTHEK AN TENTAGEL

TentaGel S NH₂ (5 g, 0,23 mmol/g, Kügelchengröße: 130 μm) wurde in DMF vorgequollen und die verzweigte Bibliothek gemäß der folgenden Vorschrift aufgebaut: (1) Kupplung von SCAL-Linker; (2) Entschützung von Fmoc; (3) Kupplung von Fmoc-Lys(Tfa); (4) Entschützung von Fmoc; (5) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (6) Entschützung von Fmoc; (7) Kupplung von Fmoc-Lys(Boc); (8) Entschützung von Fmoc; (9) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (10) Entschützung von Boc; (11) Erste Randomisierung; (12) Entschützung von Fmoc; (13) zweite Randomisierung; (14) Entschützung von Tfa; (15) Kupplung von Fmoc-Lys(Tfa); (16) Entschützung von Fmoc; (17) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (18) Entschützung von Fmoc; (19) dritte Randomisierung; (20) Entschützung von Tfa; (21) vierte Randomisierung; (22) Entschützung von Seitenketten. Bei jeder Randomisierung wurden die folgenden Säuren gekuppelt: Essigsäure, n-Buttersäure, Pivalinsäure, n-Capronsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Phenylbuttersäure, Diphenylessigsäure, 1-Adamantanessigsäure, Bersteinsäure, Glutarsäure, Glycin, β-Alanin, epsilon-Amino-n-capronsäure, Guanidinessigsäure, gamma-Guanidinbuttersäure, Succinamidsäure, p-Hydoxybenzoesäure, Furan-2-carbonsäure und Isonicotinsäure. Diese Untereinheiten sowie die entsprechenden, jeweils dafür codierenden Aminosäuren sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Aminosäuren wurden, wenn im Handel erhältlich, wie Anhydride gekuppelt (10 Äq. Anhydrid, 1,2 Äq. DIEA) oder 20 min. voraktiviert (Säure 12 Äq., DIC 10 Äq., HOBt 10 Äq.). Aufgrund ihrer sehr schlechten Löslichkeit in DMF wurden Guanidinsäuren (12 Äq.) in DMF mit HOBt und LiCl gelöst und durch DIC aktiviert. Allerdings wurde in einem Kontrollexperiment unter diesen Bedingungen nur ca. 70 bis 80% Kupplung beobachtet. Nach Beendigung der Synthese wurde die Bibliothek mit TFA (3×), DCM (5×), DMF (5×), DMF/0,1% HCl (1:1) (3×) und 0,02% HCl gewaschen. Tabelle 4

Schutz, Aktivierung und Codierungsschema für Säuren
Säure	Schutz	Aktivierung	codiert durch
Essigsäure		Anhydr.	Ala
n-Buttersäure		Anhydr.	Asn
Pivalinsäure		Anhydr.	Asp
n-Capronsäure		Anhydr.	Glu
Benzoesäure		Anhydr.	Gln
Phenylessigsäure		DIC, HOBt	Gly
4-Phenylbuttersäure		DIC, HOBt	His
Diphenylessigsäure		DIC, HOBt	Ile
1-Adamantanessigsäure		DIC, HOBt	Leu
Bernsteinsäure		Anhydr.	Lys
Glutarsäure		Anhydr.	Met
Glycin	Boc	DIC, HOBt	Orn
beta-Alanin	Boc	DIC, HOBt	Phe
ε-Amino-n-capronsäure	Boc	DIC, HOBt	Pro
Guanidinessigsäure	diBoc	DIC, HOBt	Ser
γ-Guanidinpentansäure	diBoc	DIC, HOBt	Thr
Succinamidsäure		DIC, HOBt	Trp
p-Hydroxybenzoesäure		DIC, HOBt	Tyr
Furan-2-carbonsäure		DIC, HOBt	Val
Isonicotinsäure		DIC, HOBt1	Nva

9.1.6 VERZWEIGTE CODIERTE BIBLIOTHEK AN TENTAGEL
TentaGel S NH₂ (5 g, 0,23 mmol/g, Kügelchengröße: 130 μm) wurde in DMF vorgequollen und die verzweigte Bibliothek mit codierender Sequenz nach der folgenden Vorschrift aufgebaut: (1) Kupplung von Fmoc-Lys(Ddz-Gly); (2) Entschützung von Fmoc; (3) Kupplung von Fmoc-Lys(Tfa); (4) Entschützung von Fmoc; (5) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (6) Entschützung von Fmoc; (7) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (8) Entschützung von Fmoc; (9) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (10) Entschützung von Fmoc; (11) erste Randomisierung; (12) Entschützung von Ddz getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (13) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (14) Entschützung von Npys; (15) zweite Randomisierung; (16) Entschützung von Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (17) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (18) Entschützung von Fmoc vom codierenden Arm; (19) Kupplung von Ddz-Phe; (20) Entschützung von Tfa; (21) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (22) Entschützung von Fmoc; (23) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (24) Entschützung von Fmoc; (25) dritte Randomisierung; (26) Entschützung von Ddz getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (27) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (28) Entschützung von Npys; (29) vierte Randomisierung; (30) Entschützung von Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (31) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (32) Entschützung von Fmoc; (33) Entschützung von Seitenketten. Die Bibliothek wurde mit TFA (3×), DCM (5×), DMF (5×), DMF/0,1% HCl (1:1) (3×) und 0,02% HCl gewaschen.
9.1.7 VERZWEIGTE BIBLIOTHEK MIT CODIERUNG AN FAST FLOW SEPHAROSE (FFS)
Um eine engere Verteilung der Teilchengröße (Kügelchengröße 85-125 μm) zu erhalten, wurde FFS gesiebt und dann für die Peptidsynthese in ein Reaktionsgefäß gegeben und 10 mal mit DMF gewaschen. Fmoc-Gly (2,97 g) in DMF wurde durch DIC (1,57 ml) und HOBt (1,35 g) aktiviert und zu 10 ml FFS gegeben. Die Umsetzung wurde durch 0,25 g Dimethylaminopyridin katalysiert und die Suspension über Nacht geschüttelt. Fmoc-Gly-FFS wurde 10 mal mit DMF gewaschen, Fmoc abgespalten, das Harz mit DMF gewaschen und die Substitution gemäß der Absorption der Entschützungslösung bei 302 nm berechnet. Die Substitution betrug typischerweise 0,1 mmol/ml. Anschließend wurde das Gemisch aus Fmoc-β-Ala und Boc-β-Ala (Molverhältnis 3:1) durch DIC und HOBt aktiviert und an Gly-FFS im dreifachen molaren Überschuss gekuppelt. FFS wurde 10 mal mit DMF gewaschen, die Fmoc-Gruppen wurden abgetrennt und die freien Aminogruppen 10 min. mit Ac₂O/Py (1:1) acetyliert. Nach 10 maligem Waschen mit DMF und DCM wurde Boc durch TFA/DCM/Anisol (45:45:10) über 5 + 30 min. abgetrennt, FFS mit DCM (10 mal) gewaschen, mit 2% DIEA/DCM (3 mal 1 min.) neutralisiert und 10 mal mit DMF gewaschen.
Die verzweigte Bibliothek mit codierender Sequenz wurde nach der folgenden Vorschrift aufgebaut: (1) Kupplung von Fmoc-Lys(Ddz-Gly); (2) Entschützung von Fmoc; (3) Kupplung von Fmoc-Lys(Alloc); (4) Entschützung von Fmoc; (5) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (6) Entschützung von Fmoc; (7) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (8) Entschützung von Fmoc; (9) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (10) Entschützung von Fmoc; (11) erste Randomisierung; (12) Entschützung von Ddz getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (13) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (14) Entschützung von Npys; (15) zweite Randomisierung; (16) Entschützung von Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (17) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (18) Entschützung von Fmoc vom codierenden Arm; (19) Kupplung von Ddz-Phe; (20) Entschützung von Alloc; (21) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (22) Entschützung von Fmoc; (23) Kupplung von Fmoc-β-Ala; (24) Entschützung von Fmoc; (25) dritte Randomisierung; (26) Entschützung von Ddz getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (27) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (28) Entschützung von Npys; (29) vierte Randomisierung; (30) Entschützung von Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (31) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (32) Entschützung von Fmoc; (33) Entschützung von Seitenketten. Die Bibliothek wurde mit TFA (3×), DCM (5×), DMF (5×), DMF/0,1% HCl (1:1) (3×) und 0,02% HCl gewaschen.
9.1.8 BIBLIOTHEK GEMISCHTER PEPTID- UND NICHTPEPTIDUNTEREINHEITEN
Die Bibliothek wurde an TentaGel S NH₂, 90 μm (Rapp Polymere, Deutschland) (2 g, Substitution 0,25 mmol/g, 0,5 mmol) synthetisiert. Dabei wurde zunächst die für alle Sequenzen identische Sequenz Gly-βAla-Gly-βAla-Gly-Lys(Tfa)-TG unter Verwendung eines Überschusses (5 Äq.) an aktivierten Fmoc-Aminosäuren (DIC/HOBt-Aktivierung) synthetisiert. Nach der N-terminalen Fmoc-Entschützung wurde das Harz in 9 Portionen im Verhältnis 17:8:5:1:1:1:1:1:1 (36 Teile, 0,014 mmol pro Teil) geteilt. Die Strukturen der in dieser Bibliothek verwendeten Untereinheiten sind in 8 dargestellt, und zwar zusammen mit dem Aminosäuredipeptidcode für jede der Untereinheiten. Die jeweils zu den einzelnen Portionen gegebenen Untereinheiten sind in Klammern angegeben. Diese Portionen wurden weiter wie folgt behandelt:
17-Teile-Portion (X₂ = 1-17): Fmoc-Dab(Boc)-OH wurde gekuppelt (5 Äq. Überschuss), die Boc-Seitenkettenschutzgruppe durch TFA/DCM/Anisol (50:50:2, 15 min.) abgetrennt, und diese Portion wurde nach den Waschschritten in 17 Teile geteilt. Die entsprechenden Säuren wurden an die freie Seitenkettenaminogruppe über Standard-DIC/HOBt-Aktivierung gekuppelt.
8-Teile-Portion (X₁ = 18-25): Fmoc-Asp(OBu^t)-OH wurde gekuppelt (5 Äq. Überschuss), die Bu^t-Seitenkettenschutzgruppe durch TFA/DCM/Anisol (50:50:2, 15 min) abgetrennt, und nach den Waschschritten wurde diese Portion in 8 Teile geteilt. Die entsprechenden Amine wurden an die Seitenketten gemäß der unten beschriebenen Verfahrensweise gekuppelt.
5-Teile-Portion (X₂ = 30-34): Eine Lösung von Fmoc-IDA-Anhydrid (10 Äq., 0,7 mmol in 2 ml DMF) wurde zum Harz gegeben und 30 min. geschüttelt. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt, das Harz mit DMF gewaschen und in 5 Teile geteilt. Die Amine wurden gemäß der folgenden Vorgehensweise gekuppelt.
Es folgt die allgemeine Vorgehensweise zur Kupplung von Aminen in der Seitenkette, die für die Verknüpfung der Strukturen 18-25 und 30-34 verwendet wird: die harzgebundenen Carboxygruppen (0,014 mmol pro Teil) wurden durch ein Gemisch von DIC/HOBt (10 Äq.) in 0,4 ml DMF 30 min. aktiviert. Dieses Gemisch wurde ohne Waschen abgetrennt, wonach 30 Äq. des entsprechenden Amins in 0,2 ml DMF zugegeben wurden. Im Fall von p-Toluidin wurde für die Neutralisierung des Hydrochlorids eine äquimolare Menge DIEA zugegeben. Das Harz wurde 1 Stunde geschüttelt und mit DMF gewaschen.
1-Teil-(Einzel-)Portionen (X₃ = 26-29, 35, 36): Die N-Fmoc-geschützten Monoamide der Iminodiessigsäure (für Strukturen 26-29) (10 Äq., 0,014 mmol pro Teil) sowie Fmoc-Cys(Bzl)-OH bzw. Fmoc-D-Pen(Bzl)-OH (5 Äq., 0,07 mmol) wurden über DIC/HOBt-Aktivierung an die Einzelportionen gekuppelt.
Weitere Vorgehensweisen für alle 36 Portionen: Die N-terminale Fmoc-Gruppe wurde durch Piperidin/DMF abgespalten. Boc-Gly-OH wurde an die Untereinheiten 1-25, 35, 36 über DIC/HOBt-Aktivierung (5 Äq., 0,07 mmol pro Teil) gekuppelt. Die Untereinheiten 26-34 wurden mit symmetrischem Anhydrid von Boc-Gly-OH (10 Äq., 0,12 mmol pro Teil) in DMF über Nacht umgesetzt.
Codierungsverfahren: Abspaltung der Lys(Tfa)-Schutzgruppe (identisch für alle 36 Teile): Das Harz wurde mit Wasser gewaschen und mit 20% Piperidin/H₂O (zweimal, 10 + 30 min.) versetzt. Die Harze wurden dann mit Wasser und DMF gewaschen. Anschließend wurde das Tag für alle Sequenzen mit der Fmoc-Strategie (DIC/HOBt-Aktivierung, 10 Äq., 0,14 mmol pro Teil) ohne Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe des Tag synthetisiert. Die codierenden Sequenzen für das Tag sind in 8 dargestellt. Anschließend wurden alle 36 Portionen gesammelt, gemischt und in zwei Portionen geteilt. Boc-Gly wurde nach der Boc-Gruppen-Entschützung in der Hauptkette ausschließlich an eine Hälfte gekuppelt. Beide Portionen wurden dann gemischt, die Boc-Schutzgruppe abgetrennt und das Harz in 13 Portionen geteilt. Fmoc-Tyr(Bu^t)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(Bu^t)-O, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Ser(Bu^t)-OH, Fmoc-Glu(OBu^t)-OH, Fmoc-Asp(OBu^t)-OH und Fmoc-Gln-OH (10 Äq., 0,38 mmol) wurden über DIC/HOBt-Aktivierung an diese 13 Portionen gekuppelt. Seitenkettenentschützung: Die Boc- und Bu^t-Seitenkettenschutzgruppen wurden durch TFA/DCM/Anisol (50:50:2) abgespalten (Kontaktzeit: 15 min.), wobei die Trt-Gruppe durch das gleiche Gemisch mit Zugabe von einem Tropfen ¹Pr₃SiH 15 min. abgespalten wurde. Die Pmc-Gruppe wurde durch Gemisch K 1 Stunde abgespalten. Nach den Wasch- und Neutralisierungsschritten (DCM, 7% DIEA/DCM, DMF) und alle 13 Portions gesammelt und die N-terminale Fmoc-Gruppe abgespalten. Anschließend wurde die Bibliothek mit DMF gewaschen und in 0,1% wässrige HCL überführt.
9.1.9 SUCHVORSCHRIFT FÜR DIE BIBLIOTHEK
Die Peptidbibliothek wurde gemäß der veröffentlichten Verfahrensweise (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15) durchsucht. Dabei wurden die Peptidkügelchen zunächst mit doppelt destilliertem Wasser gemischt, um das DMF abzutrennen. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7,2) wurden die Kügelchen mit 0,05% Gelatine (w/v) beschichtet, um jede nichtspezifische Bindung zu blockieren. Die Kügelchen wurden dann mit 60 pM biotinuiertem Anti-β-Endorphin-Antikörper (Klon 3-E7, Boehringer Mannheim) in 2 × PBS/Tween/Gelatine über Nacht inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurde Streptavidin-alkalische Phosphatase zugegeben. 1 Stunde später wurden die Kügelchen gewaschen, mit Substrat versetzt, und die Farbentwicklung erfolgte wie oben beschrieben. Anschließend wurden die gefärbten Kügelchen physikalisch isoliert und der Sequenzierung unterzogen.
9.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Eine alternative nichtpeptidische Gerüststruktur beruht auf der Verwendung von Kemps Trisäure (Kemp und Petrakis, 1981, J. Org. Chem. 46:5140-5143) (Schema XV).
Schema XV
In dieser Struktur werden die drei Carboxylgruppen in die triaxiale Konfirmation gezwungen. Anhydridsäure 1 wurde mit einem Dehydratisierungsverfahren (Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090) unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle unter Stickstoff dargestellt. Dieses Säureanhydrid wurde mittels nukleophilem Angriff durch Mono-tert-butyloxycarbonylethylendiamin geöffnet, wobei die Amiddisäure 2 erhalten wurde. Das gleiche Dehydratisierungsverfahren kann bei dieser Amiddisäure nicht angewandt werden, und zwar wegen der Instabilität der Boc-Schutzgruppe unter diesen Bedingungen. Eine milde Alternative zur Darstellung des Amidanhydrids 3, die der Peptidchemie eigen ist, bestand in der Verwendung des allgemeinen Dicyclohexylcarbodiimidverfahrens in Methylenchlorid. Das Amidanhydrid 3 wurde anschließend mit Fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin zur entsprechenden Diamidsäure 4 geöffnet. Einfach geschützte Ethylendiamine wurden dargestellt, indem von Boc-Ethylendiamin ausgegangen wurde, das durch Bocylierung von Ethylendiamin unter Verwendung von Dicarbonsäure-tert-butylester dargestellt wurde (Krapcho et al., 1990, Synthesis Commun. 20:2559-2564). Mono-Boc-ethylendiamin wurde als solches verwendet und diente ebenso als Ausgangsverbindung für die Darstellung von Monofluorenylmethyloxycarbonylethylendiamintrifluoracetat über N-Boc-N'-Fmoc-Ethylendiamin.
Die Diamidsäure 4 kann entweder für die Synthese der die dritte Kette mit orthogonaler Schutzgruppe (Ddz, Alloc) und Carboxylfunktion tragenden Gerüststruktur oder selbst als Gerüst verwendet werden, vorausgesetzt, dass die dritte Randomisierung separat durchgeführt wird. Die Verwendung von 1 als Gerüststruktur wurde zur Synthese der vollständig nichtpeptidischen Bibliothek gewählt. Die erste Randomisierung wurde dabei an der Lysinseitenkette durchgeführt, obwohl für diesen Zweck alle trifunktionalen Aminosäuren verwendet werden können, und die zweite und dritte Randomisierung wurden an der Gerüststruktur durchgeführt. Unter Verwendung dieser Gerüststruktur mit erzwungener Konformation wurde eine mit 20 verschiedenen Carbonsäuren randomisierte Nichtpeptidbibliothek aufgebaut.
Bei einer einen größeren Konformationsraum kartierenden Gerüststruktur handelt es sich um eine durch aufeinanderfolgende Kupplung von Diaminocarbonsäuren konstruierte einfache verzweigte angebundene Struktur. Verschiedene Typen des weiten Gerüststrukturkartierungsraums stellen flexible cyclische oder verzweigte Gerüststrukturen dar. Die Grundlagen dieser Bibliotheken sind allgemein in 4 dargestellt.
Schema XVI zeigt ein spezifisches Beispiel für eine solche Bibliothek:
Schema XVI
Die Synthese dieser Gerüststruktur erforderte die Verwendung von vier unabhängigen (orthogonalen) Schutzgruppen. Dabei wurde von uns die Verwendung der Trifluoracetylgruppe getestet, die in den 50er Jahren in die Peptidchemie eingeführt wurde (Schallenbert und Calvin, 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:2779), jedoch aufgrund der für ihre Entschützung benötigten harschen Bedingungen ebenso wie aufgrund ihrer. Unwirksamkeit als Schutz gegen Razemisierung bei Verwendung als α-Aminogruppenschutz nicht verwendet würde. Wir stellten fest, dass diese Gruppe während der Fmoc-Entschützung unter Verwendung von 50% Piperidin in Dimethylformamid nicht abgespalten wird, jedoch durch 1 bis 2 h Kontakt mit Piperidinlösung (20%) in Wasser vollständig abgespalten wird, wobei allerdings auch die Fmoc-Gruppe abgespalten wird. Die bei der Konstruktion dieser Bibliothek verwendete Strategie wird aus Schema XV ersichtlich.
Untereinheiten, bei denen es sich nicht um Aminosäuren handelt, können mit Standardaminosäuren kombiniert werden. Wir konnten zeigen, dass dieser Ansatz zu sinnvollen Bindungsstrukturen führen kann, indem wir die Minibibliothek aus 936 Mitgliedern konstruierten, die in Position 1 randomisierte ausgewählte Aminosäuren, in Position 2 und 3 ein oder zwei Glycine und in Position 4 einen Satz aromatischer, an die β-Carboxylgruppe von Asparaginsäure oder Seitenketten-modifizierte Iminodicarbonsäure gekuppelter aromatischer Amine oder an die Seitenkette von Diaminobuttersäure gekuppelte aromatische Säuren, oder an die Seitenkette von schwefelhaltigen Aminosäuren (Cystein und Penicillamin) gekuppelte Benzylhalogenide aufweisen. Die Struktur der Bibliothek ist in Schema XVII gezeigt: Schema XVII

Gesamtzahl an Permutationen: 936

Position 4, die die Nichtaminosäure-Untereinheit enthält, kann während der Sequenzierung Probleme bereiten, weshalb diese Position codiert wurde. Da bei der Randomisierung mehr als 20 Bausteine verwendet wurden, wurde eine Dublettaminosäuren-Codierungs strategie verwendet (8). Um Komplikationen bei der Strukturbestimmung zu vermeiden, überlappen die für die Codierung verwendeten Aminosäuren nicht mit dem für die Randomisierung der Position 1 verwendeten Satz und der Aminosäure in Position 2. Unter Verwendung eines Dublettcodons aus sechs Aminosäuren könnten bis zu 36 unterschiedliche Bausteine codiert werden.
Diese Minibibliothek wurde gegen ein Modellsystem, nämlich monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper, abgesucht. Positiv reagierende Kügelchen wurden drei Zyklen Edman-Abbau unterzogen, wobei die von den erhaltenen Daten abgeleiteten wechselwirkenden Strukturen in Schema XVII angegeben sind. Die Struktur des natürlichen Liganden für den monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper ist ebenso in Schema XVIII dargestellt:
Schema XVIII
Verbindungen, die auf der Grundlage der Bindung mit dem monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper ausgewählt wurden, wurden in an die Kügelchen gebundener Form sowie in freier Form synthetisiert und ihre Bindungsaffinitäten bestimmt. An Kügelchen gebundene Sequenzen zeigten spezifische Bindung (mit Leucin-Enkephalin kompetierbar). Wie man sieht (Schema XVIII), erfordert die Bindung an den Antikörper zwei aromatische Gruppen im passenden Abstand. Die diese beiden aromatischen Gruppen verbindende Struktur ist trotzdem für die Bindungsaffinität sehr wichtig.
10. BEISPIEL: SELEKTIVE AKTIVIERUNG FUNKTIONELLER GRUPPEN AUF DER OBERFLÄCHE EINES HARZKÜGELCHENS
Im vorliegenden Beispiel wird die Herstellung eines Festphasenträgerpartikels mit einer Partikel"oberfläche", die vom "Inneren" des Trägers physikalisch getrennt ist, sowie die Synthese der Suchstruktur auf der Oberfläche und des codierenden Moleküls im Inneren des Kügelchens beschrieben. In diesem Sinne sollte man die Oberfläche als denjenigen Teil des Kügelchens verstehen, der für das makromolekulare Akzeptormolekül zugänglich ist. Bei einem Akzeptormolekül mit extrem hohem Molekulargewicht entspricht die verfügbare Oberfläche des Kügelchens ungefähr dem auf der Grundlage der Abmessungen des Kügelchens berechneten Oberflächenbereich. Als Alternative lässt sich bei Akzeptormolekülen mit geringem Molekulargewicht der Oberflächenbereich mit verschiedenen Verfahren unter Nutzung des Eindringens in ein Material (einschließlich der inneren Oberfläche aller Poren im Polymerkügelchen) bestimmen. Verständlicherweise werden eventuelle Unterschiede zwischen der Oberfläche und dem Inneren des Polymerpartikels von Akzeptormolekülen, die das Polymernetzwerk frei durchdringen können, nicht erkannt. Die verfügbare Oberfläche des Partikels umfasst ebenso eine dynamische Komponente.
10.1 MATERIAL UND METHODEN
10.1.1 ENTFERNEN DES OBERFLÄCHENGEHALTS DES PEPTIDS VOM FESTPHASENKÜGELCHEN
Modellpeptide (YGGFL, LHPQF, LHPQYG) wurden an TentaGel AM (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland, 0,21 mmol/g), mit dem daran gebundenen Linker β-Ala-Gly-β-Ala-Gly synthetisiert. Die Synthese wurde mit der Standard-Festphasentechnik unter Nutzung von Fmoc-geschützten Aminosäuren und von Diisopropylcarbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol als Kupplungsreagenz durchgeführt. Die Peptide wurden in zwei Schritten unter Verwendung von Trifluoressigsäure mit "Scavenger"-Molekülen (Ethandithiol, Wasser und Thioanisol) sowie Piperidin (20%) in Dimethylformamid entschützt. Die Kügelchen wurden sorgfältig gewaschen und in 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer mit pH 7,7 überführt. Nach Zugabe von Chymotrypsin (1 mg) wurde die Suspension 20 Stunden bei 37°C geschüttelt. Die gleiche Behandlung wurde noch zweimal für jeweils 4 Stunden wiederholt. Durch Sequenzierung willkürlich ausgewählter Kügelchen aus jeder Gruppe wurde gezeigt, dass der Peptidgehalt auf den Kügelchen sich nicht signifikant änderte.
10.1.2 SYNTHESE UNTERSCHIEDLICHER PEPTIDE AUF DER OBERFLÄCHE UND IM INNEREN DES POLYMERKÜGELCHENS
TentaGel AM-Harz (0,21 mmol/g, 1 g) wurde durch Ankondensation von Boc-Phe modifiziert. Das Harz wurde gewaschen und in 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer, pH 7,7, überführt. Die Chymotrypsinbehandlung wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchgeführt. Nach vorsichtigem Waschen mit dem gleichen Puffer und Wasser wurde das Harz mit Dimethylformamid gewaschen, und für die Synthese der YGGFL-Sequenz wurde das Standard-Festphasensyntheseschema unter Verwendung von Fmoc-Schutzgruppen und Diisopropylcarbodiimid sowie N-Hydroxybenzotriazol als Kupplungsreagenz verwendet. Nach der Kupplung von Fmoc-Tyr(But) im letzten Kupplungsschritt wurde die Fmoc-Gruppe nicht abgetrennt und das Harz mit 50% Trifluoressigsäure in Dichlormethan versetzt. In den nächsten Syntheseschritten wurden Bocgeschützte Aminosäuren eingesetzt. Die Kupplung wurde mit dem gleichen Reagenz wie oben durchgeführt, die Boc-Gruppe nach jedem Schritt durch 50% Trifluoressigsäure abgetrennt und die protonierte Aminogruppe durch Behandlung mit Diisopropylethylaminlösung in Dimethylformamid (5%) für die Kupplung verfügbar gemacht. Die Peptide wurden in zwei Schritten unter Verwendung von Trifluoressigsäure mit Scavenger-Molekülen (Ethandithiol, Wasser und Thioanisol) sowie Piperidin (20%) in Dimethylformamid entschützt. Die Kügelchen wurden vorsichtig gewaschen und für die Anfärbung mit Anti-β-Endorphin wie bereits beschrieben vorbereitet. Die Färbung der Kügelchen war von der Färbung der lediglich die YGGFL-Sequenz enthaltenen Kügelchen nicht zu unterscheiden.
10.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Zur selektiven Abspaltung eines Peptids von der Oberfläche eines Kügelchens wurde ein Enzym verwendet. Die Testsequenzen YGGFL und LHPQFYG wurden hergestellt und mit Chymotrypsin inkubiert und die Reaktivität der Kügelchen wurde getestet.

Die behandelten Kügelchen wurden auf Bindung an Anti-β-Endorphin und Streptavidin getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5

Bindung der Kügelchen nach Behandlung mit Chymotrypsin

Peptid an Kügelchen	Bindung an Antikörper	Streptavidin
	kein CT	+ CT	kein CT	+ CT
YGGFL	3+	-	-	-
LHPQF	-	-	3+	2+
LHPQFYG	-	-	3+	-

CT = Chymotrypsin

Kügelchen mit YGGFL gingen die Bindungsaktivität an Anti-β-Endorphin-Antikörrer vollständig verloren (Tabelle 5). Ebenso gingen den Kügelchen mit LHPQF-YG die Aktivität mit Streptavidin vollständig verloren. Allerdings war die Abnahme der Gesamtmenge an LHPQF-YG bzw. YGGFL minimal, was auf keine Auswirkung auf das Innere des Kügelchens hindeutet. In diesem Fall wurde der YG-Linker verwendet, da es sich bei LHFQF um ein schlechtes Substrat für Chymotrypsin handelte. Der Edman-Abbau zeigte, dass sich der Peptidgehalt auf den Kügelchen nicht signifikant änderte.
Aufgrund dieser vorläufigen Ergebnisse wurde Chymotrypsin als selektives Entschützungsreagenz verwendet. Ein einfaches Substrat für Chymotrypsin, Boc-Phe, wurde an allen verfügbaren Aminogruppen des festen Trägers synthetisiert. Die Inkubation dieses modifizierten Harzes unter verschiedenen Bedingungen führte zur Freisetzung ungefähr der gleichen Menge an Boc-Phe: 1,1%. Die entschützte Aminogruppe wurde für die Synthese von YGGFL unter Verwendung der Fmoc-Strategie verwendet. Der Synthese folgte die quantitative Messung der Fmoc-Freisetzung, wobei die abgelesenen Werte bestätigten, dass ungefähr 1% der verfügbaren Aminogruppen für die Synthese verwendet wurden. Die Boc-Schutzgruppe wurde von den auf jedem Kügelchen verbliebenen Aminogruppen durch TFA abgespalten und die Sequenz LHPQF unter Verwendung der Boc-Synthese zusammengebaut. Alle Schutzgruppen wurden abgetrennt, und die Tests zeigten eine positive Reaktion sowohl mit Anti-β-Endorphin als auch Streptavidin.
Willkürlich ausgewählte Kügelchen wurden dem Edman-Abbau unterzogen, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden (Werte in pmol): 1. Zyklus: L 114, Y < 1; 2. Zyklus: H 86, G < 1; 3. Zyklus: P 94, G < 1; 4. Zyklus: Q 78, F 4 (Vorschau); 5. Zyklus: F 73, L < 1. Die Analyse des Edman-Abbaus zeigte, dass die Sequenz LHPQF auf einem Niveau von 100-120 pmol pro Zyklus vorlag und der Gehalt an für die YGGFL-Sequenz erwarteten Aminosäure vernachlässigbar war. Dies bedeutet, dass YGGFL zwar im Großteil des Kügelchens nicht vorhanden ist, jedoch auf der Oberfläche des Kügelchens für die Wechselwirkung mit dem relevanten Akzeptor zur Verfügung steht.
LHPQF ist auch noch für die Wechselwirkung mit Streptavidin verfügbar. Dies liegt wahrscheinlich am geringeren Molekulargewicht von Streptavidin, was dessen Eindringen ins Innere des Polymerkügelchens gestattet.
10.3 DISKUSSION
Durch das vorliegende Beispiel wird eindeutig gezeigt, dass ein Enzym die Oberfläche, jedoch nicht das Innere, eines Harzkügelchens selektiv entschützen kann. In diesem Fall verlief die Chymotrypsinspaltung der Sequenz LHPQFYG effizient. Die Bindung des für LHPQF spezifischen Streptavidins wurde vollständig aufgehoben.
Anschließende Experimente mit einem Boc-Phe-Substrat derivatisierten Kügelchen zeigte, dass sich zwei unterschiedliche Peptide auf einem Kügelchen synthetisieren lassen, wobei das eine Peptid hauptsächlich zur Oberfläche und das andere Peptid hauptsächlich zum Inneren segregiert wird.
11. BEISPIEL: BEVORZUGTE BLOCKIERUNG DER FREIEN AMINOGRUPPEN AUF DER OBERFLÄCHE EINES TENTAGELKÜGELCHENS
Durch das vorliegende Beispiel wird die Durchführbarkeit der Blockierung der Oberfläche eines Harzkügelchens, während die funktionellen Gruppen im Inneren des Kügelchens für die Reaktion und Synthese einer Verbindung, beispielsweise eines codierenden Moleküls, frei bleiben, demonstriert.
11.1 MATERIALE UND METHODEN
TentaGel-Amid AM-Harz (0,3 mÄq./g Substitution) wurde mehrere Stunden in H₂O hydratisiert und mit 0,1 M 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES)-Puffer, pH 5,7, gewaschen. Verschiedene Mengen (0 bis 10 mg) Polyglutaminsäure (Mr 30 000, Sigma Chemical) wurden jeweils zu den 0,2 ml abgesetzten Kügelchen gegeben. Anschließend wurde jedes Röhrchen mit 60 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl (EDC) versetzt. Die Reaktionsansätze wurden über Nacht leicht geschüttelt. Die Kügelchen wurden anschließend in doppelt destilliertem (dd) H₂O gewaschen, und jede Probe wurde mit jeweils 0,24 mmol Ethanolamin plus 60 mg EDC in MES-Puffer versetzt. Nach 4 Stunden leichtem Schütteln wurde das Harz ausgiebig mit dd H₂O gewaschen. Anschließend wurde das Harz zur Trockne lyophilisiert. Das behandelte Harz wurde in Dimethylformamid (DMF) gequollen. Mittels Fmoc-Chemie wurde das Peptid YGGFLGGG auf jeder der behandelten Harzproben unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert. Die N-terminale Fmoc-Gruppe sowie die Seitenkettenschutzgruppen wurden mit Piperidin und Trifluoressigsäure wie beschrieben (Lam et al., 1991, Nature, 354:82-84) abgetrennt. Nach der Neutralisierung mit Diisopropylethylamin (DIEA) wurden die Harzkügelchen ausgiebig gewaschen und für die Anfärbung mit Anti-β-Endorphin wie in Abschnitt 10 oben beschrieben vorbereitet.
11.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die Fähigkeit zur Blockierung funktioneller Gruppen auf einem Harzkügelchen mit Polyglutaminsäure war zur Menge an verwendeter Polyglutaminsäure direkt proportional (Tabelle 6). Signifikanterweise wurde das Polyglutaminsäure-blockierte Harz nur schwach gefärbt, was darauf schließen lässt, dass die meisten der Oberflächenaminogruppen vor der Synthese des YGGFLGGG-Peptids blockiert waren. Noch wichtiger war jedoch, dass die Menge an Peptid sowohol im blockierten als auch im unblockierten Harz etwa gleich war (Tabelle 7), was darauf hindeutet, dass die Blockierung durch Polyglutaminsäure lediglich auf der Oberfläche des Kügelchens stattfand und dass die im Inneren der Kügelchen vorhandenen freien Aminogruppen für die nachfolgende Peptidsynthese intakt blieben. Tabelle 6

Halbquantitative Anfärbung von Peptidkügelchen
Ausmaß der Blockierung: Polyglutaminsäure mg pro 0,2 ml Harz	Markierung mit Biotinyl-Anti-β-Endorphin und danach mit Streptavidin-AP	Markierung mit Streptavidin-AP allein
0	3+	-
0,016	3+	-
0,08	2+	-
0,04	1+	-
2,0	1+	-
10	Spur	-

Tabelle 7

Mikrosequenzierung
pmol Aminosäure (10 Kügelchen/Experiment)*
			Y	G	G	F	L	G	G	G
Polyglutaminsäure (10 mg)	I	609	615	692	665	579	657	675	655
Polyglutaminsäure (10 mg)	II	996	885	839	772	696	522	550	506
Ohne Blockierung	I	876	752	752	774	680	733	707	717
Ohne Blockierung	II	519	534	332	559	471	540	550	335

Zusätzliche Experimente beinhalteten die reversible Kupplung von Polymer, an das Boc-Glu über seine α-Carboxylgruppe gebunden war. Nach der Kupplung dieses modifizierten Polymers an die Kügelchenoberfläche und der entsprechenden Modifikation der "inneren" Aminogruppe wurde die Boc-Gruppe von der Glutaminsäure abgespalten. Anschließend wurden die Kügelchen einem Zyklus Edman-Abbau unterzogen, wodurch Aminogruppen, die durch das Glutaminsäure-Polymerreagenz geschützt worden waren, regeneriert wurden. Unterschiedliche Peptide wurden an getrennten Teilen des Kügelchens, d.h. auf der Oberfläche und im Inneren synthetisiert.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen nicht beschränkt. Tatsächlich werden dem Fachmann aus der vorangegangenen Beschreibung und den beigefügten Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen ersichtlich. Dabei ist vorgesehen, dass derartige Modifikationen unter den Schutzumfang der anhängigen Ansprüche fallen.
Vorliegend sind verschiedene Veröffentlichungen zitiert, deren Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme voll inhaltlich aufgenommen sind.
12. BEISPIEL: ZUR KONSTRUKTION NICHTPEPTIDISCHER BIBLIOTHEKEN GEEIGNETE UNTEREINHEITEN
Die Konstruktion nichtpeptidischer Bibliotheken erfordert die Auswahl von für die Einbeziehung in die Festphasensynthese geeigneten Untereinheiten. Das vorliegende Beispiel beschäftigt sich mit der Auswahl von für drei unterschiedliche chemische Methoden geeigneten Untereinheiten.
12.1 ACYLIERUNG EINER PRIMÄREN AMINOGRUPPE
Experimentelle Vorschrift: 1 mmol Säure wurde in 2 ml DMF gelöst, mit 0,5 mmol DIC (1 mmol im Fall von Dicarbonsäuren) versetzt und mit ungefähr 100 mg Trp-RAM-TG über Nacht umgesetzt. Die Vollständigkeit der Umsetzung wurde mit dem Kaiser-Test beurteilt. Anschließend wurde das Harz mit DMF und DCM gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde durch einstündigen Kontakt mit 1 ml 95% TFA, 5% Wasser gespalten. Danach wurde der Reaktionsansatz mit 5 ml Wasser verdünnt und mittels HPLC und MS analysiert.
Für ihre Akzeptanz war erforderlich, dass die Produkte das erwartete M.W. (Molekulargewicht) besitzen und der Gehalt des Hauptprodukts in einem Rohgemisch mehr als 80% der Gesamtfläche unterhalb der Kurve des HPLC-Chromatograms beträgt und dass das Hauptprodukt das erwartete Molekulargewicht aufweist. In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Tests von 33 Säuren dargestellt. Von den 33 wurden 7 als zur Verwendung ungeeignet zurückgewiesen. Zwei weitere Verbindungen, 4-Hydroxybenzoesäure und 4-Hydroxyphenylessigsäure, waren mit der Monosynthese unter Verwendung von Tryptophan inkompatibel, doch stellte sich heraus, dass sie in anderen Modellexperimenten unter Verwendung der N^α-Aminogruppe von Lysin (Fmoc) verwendbar waren.
12.2 NUKLEOPHILE VERDRÄNGUNG VON HALOGEN DURCH AMINE
Experimentelle Vorschrift: Bromessigsäure (5facher molarer Überschuss) wurde über symmetrische Anhydride 10 min. an TG130 gekuppelt und dann unter Verwendung des gleichen Verfahrens noch mal 10 min. gekuppelt. Das Testamin wurde unter Verwendung einer 1 M-Lösung in DMSO über Nacht gekuppelt. Nach einem geeigneten Waschschritt wurde Fmoc-Gly eine Stunde gekuppelt (HOBt, DIC), die Fmoc-Gruppe abgetrennt und die Fmoc-Freisetzung berechnet sowie mit einer theoretischen Freisetzung von 45 μmol/ml verglichen. In einem zweiten Satz von Experimenten wurden die Reinheit und Identität von Produkten über die Synthese der Modellverbindungen R-NH-CH₂-CO-Gly-Trp-RAM-TG getestet, die nach einer ähnlichen Vorschrift synthetisiert und vom Harz mit 1 ml 95% TFA, 5% Wasser 1 Stunde abgespalten und danach zur Durchführung von analytischer HPLC und MS mit etwa 5 ml Wasser verdünnt wurden.
Insgesamt wurden 33 Amine getestet, von denen sich bei 21 herausstellte, dass sie für die Einbeziehung in die Festphasensynthese akzeptierbar sind. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nachfolgend angegeben.
12.3 REDUKTIVE ALKYLIERUNG
12.3.1 VERALLGEMEINERTE VERFAHREN
Experimentelle Vorschrift: Ein 20facher molarer Überschuss der Testaldehyde wurde zu etwa 100 mg H-Gly-RAM-TG (Exp. A) oder H-βAla-Gly-Trp-RAM-TG (Exp. B), vorgequollen in 1 ml MeOH-DCM-AcOH 40:10:1, gegeben, wonach man die Reaktion über Nacht ablaufen ließ. Das Harz wurde mit 1% AcOH in DMF gewaschen und dann nochmals mit einem 20fachen molaren Überschuss des Testaldehyds über Nacht in Kontakt gebracht. Danach wurde das Harz mit MeOH-DCM-AcOH 40:10:1 gewaschen und 1 ml dieses Ansatzes mit einem 20fachen molaren Überschuss NaBH₃CN versetzt und über Nacht reagieren gelassen. Das Harz wurde anschließend mit DMF/1% AcOH gewaschen und mit einem zweiten 20fachen molaren Überschuss NaBh₃CN für eine Reaktion über Nacht versetzt. Nach dem Waschen wurden alle Proben mit Fmoc-Gly acyliert. Im Exp. A wurde das Produkt nach Abtrennen des Fmoc mit Fmoc-Trp acyliert. Anschließend wurde das Harz zur Abtrennung des Fmoc behandelt, mit DMF und DCM gewaschen, getrocknet und das Produkt anschließend mit 1 ml 95% TFA, 5% Wasser 1 Stunde abgespalten. Nach Verdünnung mit etwa 5 ml Wasser wurden analytische HPLC und MS durchgeführt.
Insgesamt wurden 31 Testaldehyde getestet, um deren Eignung für die Einbeziehung in die Festphasensynthese zu bestimmen. Die in Tabelle 10 angegebenen Ergebnisse deuten an, dass 19 von diesen akzeptierbar waren.
12.3.2 SPEZIFISCHE VERFAHREN
Im Folgenden sind Verfahrensweisen angegeben, die sich spezifisch für die hinzuzufügende Untereinheit eignen.
Die Sequenz β-Ala-Gly-Trp wurde an RAM-TG (Subst. 0,2 mmol/g) konstruiert. Die terminale Aminogruppe wurde dann unter Verwendung des reduktiven Aminierungsverfahrens mit einem Satz aliphatischer, aromatischer und heterocyclischer Aldehyde alkyliert. Die N-alkylierten Peptide wurden vom Harz mit 95% TFA – 5% H₂O abgespalten und die Reinheit sowie das korrekte Molekulargewicht der erhaltenen Verbindungen unter Verwendung von HPLC und Massenspektroskopie bestätigt.
Verfahren 1

Lösungsmittelgemisch 1 Dichlormethan-Methanol-Essigsäure 80:20:1
Lösungsmittelgemisch 2 Dimethylformamid-Essigsäure 100:1

Bildung der Schiff-Base: 50 mg H-β-Ala-Gly-Trp-TentaGel S RAM, 3× mit Lösungsmittelgemisch 1 gewaschen, wurden mit 200 μl dieses Gemischs sowie 0,2 mmol Aldehyd versetzt. Das Harz wurde 2 Stunden geschüttelt, dann 3× mit Lösungsmittelgemisch 2 gewaschen. Danach wurden weitere 0,2 mmol Aldehyd zusammen mit 200 μl Lösungsmittelgemisch 2 zugegeben, und nach 2 Stunden Schütteln wurde das Harz 3× mit Lösungsmittelgemisch 2 und 3× mit Lösungsmittelgemisch 1 gewaschen.
Reduktion der Schiff-Base: Ein gewaschenes Peptidharz wurde mit 200 μl Lösungsmittelgemisch 1 und 200 μl einer Lösung von 1 M NaBH₃CN Dimethylformamid versetzt. Das Harz wurde 2 Stunden geschüttelt, anschließend mit Lösungsmittelgemisch 2 gewaschen und die Reduktion in diesem Gemisch mit 200 μl einer Lösung von 1 M NaBH₃CN in DMF nochmals 2 Stunden wiederholt. Das Harz wurde dann mit DMF und DCM gewaschen, getrocknet und das Peptid mit TFA-5% H₂O gespalten.
Vorschrift 1

Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 1 Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 1 Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd Schütteln, 2 h Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2 Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 2 Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd Schütteln, 2 h Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2 Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 1 Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 1 Zugabe von 200 μl 1 M NaBH₃CN in DMF Schütteln, 2 h Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2 Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 2 Zugabe von 200 μl 1 M NaBH₃CN in DMF Schütteln, 2 h.

Verfahrensweise 2
Die Bildung der Schiff-Base folgt Verfahrensweise A. Die Reduktion der Schiff-Base folgt Verfahrensweise A, mit dem Unterschied, dass während der beiden Reduktionsschritte 0,01 mmol Aldehyd zusammen mit dem Reduktionsmittel zugegeben wurde.
Vorschrift 2
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 1
Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 1
Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2
Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 2
Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2
waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 1
Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 1
Zugabe von 200 μl 1 M NaBH₃CN in DMF
Zugabe von 0,01 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2
Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 2
Zugabe von 200 μl 1 M NaBH₃CN in DMF
Zugabe von 0,01 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Verfahrensweise 3 (Ein-Topf-Reaktion)
50 mg mit Lösungsmittellgemisch 2 gewaschenes Peptidharz wurden mit 200 μl dieses Gemischs sowie 0,05 mmol Aldehyd versetzt. Nach 1 Stunde Schütteln wurden 50 μl einer Lösung von 1 M NaBH₃ in DMF zugegeben, und man ließ das Harz 2 Stunden schütteln. Anschließend wurden weitere 50 μl Reduktionsreagenz zugegeben, und nach 2 Stunden Schütteln wurde der dritte Teil (50 μl) der Lösung von 1 M NaBH₃CN in DMF zugegeben. Das Harz wurde über Nacht geschüttelt und anschließend wie oben aufgearbeitet.
Vorschrift 3

Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch 2 Zugabe von 200 μl Lösungsmittelgemisch 2 Zugabe von 0,05 mmol Aldehyd Schütteln, 1 h Zugabe von 50 μl 1 M NaBH₃CN in DMF Schütteln, 2 h Zugabe von 50 μl 1 M NaBH₃CN in DMF Schütteln, 2 h Zugabe von 50 μl 1 M NaBH₃CN Schütteln über Nacht

Tabelle 11 Reduktive Aminierungng
Aldehyd (M.W.)	Vorschrift	MS (MH+)
Benzaldehyd (421,2)	1	OK (422,2)
2-Hydroxybenzaldehyd (437,2)	1	OK (438,2)
4-Hydroxybenzaldehyd (437,2)	1	OK (438,2)
4-Hydroxybenzaldehyd (451,2)	3	OK (438,2)
3-Methyoxy-4-hydroxybenzaldehyd (467,2)	1	OK (468,2)
4-Nitrobenzaldehyd (466,3)	1	OK (467,3)
2-Naphtaldehyd (471,3)	1	OK (472,3)
3-Phenoxybenzaldehyd (513,3)	1	OK (514,3)
4-Phenylbenzaldehyd (497,3)	1	OK (498,3)
2-Tolualdehyd (435,2)	1	OK (436,2)
2-Trifluormethylbenzaldehyd (489,3)	2	OK (490,3)
1,3,5-Trimethoxybenzaldehyd (511,3)	1	OK (512,3)
Cyclohexancarboxaldehyd (427,2)	2	OK (428,2)
2-Ethylbutyraldehyd (415,2)	2	OK (416,2)
2-Methylbutyraldehyd (401,2)	2	OK (402,2)
2-Methylpropionaldehyd (387,2)	2	OK (388,2)
2-Methyvaleraldehyd (415,2)	2	OK (416,2)
Trimethylacetaldehyd (401,2)	2	OK (402,2)
Chinolin-4-carboxaldehyd (472,3)	3	OK (402,2)
Thiophen-2-carboxaldehyd (427,2)	3	OK (428,2)

13. BEISPIEL: NICHTSEQUENZIELLE CODIERUNG EINER BIBLIOTHEK
Wir testeten die nichtsequenzielle Codierung unter Verwendung sowohl einer Modelltestverbindung als auch durch Konstruktion einer nichtpeptidischen Bibliothek.
13.1 GERÄTE, MATERIAL UND VERFAHRENSWEISEN
Gerätschaft: Sowohl analytische als auch präparative HPLC wurde am modularen Hitachi-System unter Verwendung von Vydac (0,46 × 250 mm, 5 μm, Fließgeschwindigkeit 1 ml/min.) bzw. Vydac (10 × 250 mm, 10 μl, Fließgeschwindigkeit 3 ml/min.) C-18-Säulen durchgeführt.
Material: Falls nicht anders angegeben, wurden Lösungsmittel mit handelsüblichem Reinheitsgrad ohne weitere Aufreinigung verwendet. TentaGel(TG)-Harz (0,21 mmol/g) wurde von Rapp-Polymere (Tübingen) bezogen. Geschützte Aminosäuren wurden von Bachem (Torrance, Kalifornien), Advanced ChemTech (Louisville, Kentucky) oder Propeptide (Vert-le-Petit, Frankreich) erhalten.
Mehr als 100 codierende Untereinheiten wurden am Festphasenträger synthetisiert. Dabei wurden als Grundbausteine Lysin, Ornithin, Diaminobuttersäure und Diaminopropionsäure verwendet. Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Orn(Boc), Fmoc-Dab(Boc) und Boc-Dap(Fmoc) wurden zunächst mit den üblichen DIC/HOBt-Verfahren an Amino-TentaGel (0,21 mmol/g) gekuppelt. Nach Entfernen des Seitenkettenschutzes wurden modifizierende Carbonsäuren an die ungeschützten Seitenketten unter Verwendung des DIC/HOBt-Verfahrens, symmetrische Anhydride oder Acylchloride gekuppelt. Alle neu synthetisierten codierenden Aminosäuren wurden vollständig entschützt und einem Edman-Abbau im Proteinsequenziergerät Applied Biosystems ABI 477A unterzogen. Die Retentionszeiten neuer PTH-AS wurden unter Verwendung des Analysegeräts Applied Biosystems ABI 120A mit einer PTH-222 Brownlee-Säule (PTH C-18, 5 Micron, 220 × 2,1 mm) bestimmt. HPLC-Puffer: A – 0,01 M NaOAc, B – Acetonitril; Gradient: 0,0-0,4 min. – 8% B, 0,4-38,0 min. – 8-60% B, 38,0-40,0 min. – 60-90% B; Fließgeschwindigkeit 230 μl/min. Die Spitzenwerte wurden bei 269 nm nachgewiesen. In Tabelle 14 sind die einzelnen codierenden Untereinheiten aufgeführt sowie das Nummerierungssystem, mit dem sie hier bezeichnet werden, angegeben.
13.2 SYNTHESE VON MODELLSEQUENZEN
Bei den hergestellten Testverbindungssequenzen handelt es sich um Tyr-Gly-Ala-Phe und Phe-Gly-Ala-Phe, codiert durch Dubletts von Aminosäuren (siehe Schema XIC), sowie Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu und Phe(Cl)-Gly-Gly-Phe-Leu (codiert durch die Codierung nach Schema XIB). Diese Sequenzen wurden ausgewählt, da Tyr-Gly-Ala-Phe unter Verwendung eines Anti-β-Endorphin-Antikörpers als Akzeptormolekül nachgewiesen werden kann, wobei es sich bei Phe-Gly-Ala-Phe um eine Negativkontrolle handelt. Zudem könnten die Treue und Codierung durch direkte Sequenzierung der Testpeptide bestätigt werden.
13.2.1 MATERIAL UND METHODEN
Der Zweck der Synthese der Modellpeptide bestand nicht in einer Demonstration eines Verfahrens zur Bibliothekssynthese, sondern eher der Treue der Codierung. Daher wurde die Synthese nicht in aufeinanderfolgenden Schritten von Kupplung der Test-AS-Untereinheit und danach eines Paars codierender Untereinheiten, sondern stattdessen unter Verwendung des nachfolgend• beschriebenen zweckmäßigeren Schemas durchgeführt. Der Polymerträger (TentaGel, 100 mg, 0,21 mmol/g, 90 um mittlere Teilchengröße), an den zuvor die Sequenz Boc-Ala-Gly-Val-Phe-bAla-Gly-bAla-Gly synthetisiert wurde und der einer Chymotrypsinbehandlung zur Unterscheidung der Oberfläche vom Inneren durch Abspaltung von Phe unterzogen worden war (7 mg Chymotrypsin in 30 ml 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,6, in 0,1 M CaCl₂, 14 h bei 37°C), wurde in Dimethylformamid (DMF) gequollen (Quellvolumen 0,5 ml), in zwei Polypropylenspritzen mit daran angebrachten Polypropylenfritten (Krchnak & Vagner, 1990, J. Pept. Res., 3:182-193) aufgeteilt, wonach Fmoc-Phe (3 Äquivalente in Bezug auf alle theoretisch verfügbaren Aminogruppen) durch Diisopropylcarbodiimid (DIC) (3 Äquivalente) in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol (HOBT) (3 Äquivalente) in DMF gekuppelt wurde. Nach dem Verschwinden der Blaufärbung (Krchnak et al., 1988 Coll. Czech. Chem. Commun., 53:2542) wurde das Harz gewaschen (5× DMF) und die Fmoc-Gruppe durch Behandlung mit 50% Piperidin in DMF (10 min.) abgetrennt. Nach Waschen mit DMF (5×) und 2% HOBT in DMF (1×) wurde die nächste Aminosäure gekuppelt. Auf diese Weise wurden Alanin, Glycin und Tyrosin an das Harz in der ersten Spritze und Alanin, Glycin und Phenylalanin an das Harz in der zweiten Spritze gebunden. Die Fmoc-Gruppe wurde wie oben abgetrennt und das Harz nach Waschen mit DMF mit der Lösung (0,4 M) von 2-Chlorbenzyloxycarbonylsuccinimid in DMF über Nacht behandelt (wobei nach 3 h ein Äquivalent Diisopropylethylamin zugegeben wurde). Die Boc-Gruppe wurde mit 50% Trifluoressigsäure (TFA) in DCM abgespalten (1 plus 20 min.). Nach dem Waschen mit DCM (3×) und DMF (4×) wurde das Harz durch Waschen mit 10% Diisopropylethylamin in DMF neutralisiert, mit DMF (3×) gewaschen und Fmoc-Lys(Dde) (3 Äq.) durch die Wirkungsweise von DIC und HOBT (jeweils 3 Äq.) in DMF gekuppelt (2 h). Das Harz wurde mit DMF (5×) gewaschen und die Fmoc-Gruppe durch 50% Piperidin in DMF (20 min.) abgespalten und das Harz mit DMF (3×) gewaschen. Das Gemisch der für Phenylalanin in Position 4 der Testverbindungsstruktur codierenden Aminosäuren (Boc-Sar und Boc-Asp(OBzl) in einem Molverhältnis von 1:1 (was ihre relativ gleichwertige Kupplungsreaktivität, die zuvor experimentell bestimmt worden war, widerspiegelt) wurde unter Verwendung von DIC und HOBT (jeweils 3 Äq.) gekuppelt. Die Reaktion wurde mit dem Bromphenolblauverfahren verfolgt. Das Harz wurde mit DMF (5×) gewaschen und die Dde-Gruppe durch 2% Hydrazinhydrat in DMF (10 min.) entschützt. Das Harz wurde mit DMF (5×), 2% HOBT in DMF gewaschen, und Fmoc-Lys(Dde) gekuppelt und die Fmoc-Gruppe abgetrennt. Der Vorgang der Kupplung von Gemischen von Boc-Aminosäuren und Fmoc-Lys(Dde) wurde zweimal wiederholt (Kupplung der codierenden Untereinheitsgemische von Ile und Val (2:1) und Lys(ClZ) und Glu(OBzl) (1,5:1)), und nach Entschützung der Dde-Gruppe wurde Boc-Lys(Fmoc) in beiden Spritzen an das Harz gekuppelt. Die Fmoc-Gruppe wurde wie oben entschützt, und nach Waschen mit DMF (5×) wurde das Gemisch aus Buttersäure- und Propionsäureanhydriden (1:1 in Gegenwart eines Äquivalents Triethylamin) zur Acylierung der freien Aminogruppe in der ersten Spritze verwendet und das Gemisch aus 4-Phenylbuttersäure und 3-Phenylpropionsäure an das Harz in der zweiten Spritze über die Wirkung von DIC und HOBT gekuppelt. Anschließend wurde das Harz durch Applikation des Gemischs aus TFA (82,5%), p-Kresol (5%), Thioanisol (5%), Wasser (5%) und Ethandithiol (2,5%) (Gemisch K, (King, D. et al., 1990, Int. J. Pep. Prot. Res., 36:255-266)) 2 h entschützt und mit DMF (4×) und 0,1% HCl in Wasser (5×) gewaschen.
13.2.2 MIT CODIERUNG KONSTRUIERTE MODELLVERBINDUNGEN YGAF UND FGAF
Die beiden Modelpeptide wurden auf der Oberfläche eines "rasierten" ("shaved") Polyoxyethylen-gepfropften Polystyrolfestphasenträgers (TentaGel) synthetisiert. Die codierenden Moleküle wurden im Inneren des TentaGel-Trägers synthetisiert, womit sie in der Lage waren, an den Anti-β-Endorphin-Antikörper zu binden. Die unterschiedlich selektive Bindung der positiven Kontrolltestverbindung wurde unter Verwendung der Testverbindung/des Kügelchenkonstrukts jeweils für sich allein oder als Gemisch beider Sequenzen oder nach Zugabe einer geringen Anzahl spezifischer Kügelchen zu einer Bibliothek von Verbindungen validiert.
Ein nichtsequenzieller Code wurde auf einem Polylysingrundgerüst konstruiert.
Der Code war wie folgt:

Schritt Untereinheit Codierende Gruppierung

4 Phe Butyryllysin, Proprionyllysin

4 Tyr φ-Butyryllysin, φ-Propionyllysin

3 Gly Glu, Lys

2 Ala Val, Ile

1 Phe Asp, Sar
Die positiven Träger wurden nach Kontakt mit dem Anti-β-Endorphin-Antikörper ausgewählt. Durch einen Zyklus Edman-Abbau wurden die positiven Kügelchen als YGAF identifiziert, und zwar aufgrund der Freisetzung der φ-Butyryllysin-, φ-Propionyllysin-Derivate. Da die Testverbindungssequenz nur auf der Oberfläche des Kügelchens vorhanden war und diese Menge etwa 2% der Gesamtmenge von am Kügelchen gebundenen Molekülen ausmachte, war das Signal des im ersten Zyklus (in dem alle codierenden Aminosäureuntereinheiten ebenso gespalten wurden) nachgewiesenen Tyrosins äußerst gering. Zur Bestätigung davon, dass tatsächlich die korrekten Kügelchen nachgewiesen worden waren, wurde die Sequenzierung mit 30 vereinigten Kügelchen zur Amplifikation des Signals wiederholt. In diesem Fall zeigten vier Zyklen Sequenzierung direkt die YGAF-Testverbindungssequenz.
13.3 SYNTHESE DER AUF DIAMINOBENZOESÄURE RUHENDEN BIBLIOTHEK MIT DIGITALER CODIERUNG
Eine auf der Diaminobenzoesäure beruhende Bibliothek wurde synthetisiert und mit einem nichtsequenziellen Code codiert. Das Syntheseschema für diese Bibliothek ist im nachfolgenden Schema angegeben. Eine Liste der im ersten Kupplungsschritt verwendeten Aminosäuren und der in den Kupplungsschritten 2 und 3 verwendeten Säuren bis zu den Aminogruppen des Diaminobenzoesäuregerüsts ist in Tabellen 12 bzw. 13 angegeben. In den beiden Tabellen sind auch jeweils die jeder Speziesuntereinheit der Testverbindung entsprechenden codierenden Gruppierungen angegeben. Die codierenden Gruppierungen in Tabelle 13 sind dabei durch zweistellige Nummern, z.B. 3/1 bezeichnet, deren chemische Bedeutungen in Tabelle 14 definiert sind.
Die Sequenzierung mehrerer willkürlich gewählter Kügelchen dieser Bibliothek bestätigt die Möglichkeit der einstufigen Entschlüsselung durch Edman-Abbau.
13.3.1 MATERIAL UND METHODEN
Die Synthese wurde an TentaGel-Harz (90 μm, 0,2 mmol/g) durchgeführt. Fmoc-Entschützung: 50% Piperidin in DMF, 10 min. Waschen mit DMF (6 mal), alle Waschlösungen sammeln, Messen der Absorption bei 302 nm, Fmoc-Freisetzung berechnen.
Alloc-Entschützung: Waschen mit 3× DMF (jeweils 2 min.) und Zugabe des Gemischs von DMF/AcOH/NMM (5 ml, 1 ml, 0,5 ml) und Einblasen unter Argon (15 Minuten). Zugabe von 150 mg Tetrakis(triphenylphosphin)palladium und Einblasen von Argon (3 Stunden). 3× Waschen mit DMF. 5× Waschen mit DCM.
Dde-Entschützung: Das gewaschene Peptidharz wurde mit einer 3%igen Lösung von Hydrazin in DMF 5 min. und 30 min. behandelt, wonach sich ein DMF-Waschschritt anschloss.
Ddz-Entschützung: Das Peptidharz wurde mit DMF und danach mit DCM gewaschen und 2× mit 3% TFA in DCM jeweils 5 min. vorbehandelt. Die dritte Behandlung mit 3% TFA/DCM wird 30 min. durchgeführt. Nach gründlichem Waschen mit DCM folgt die Neutralisierung durch 5% DIEA in DCM und das Waschen mit DCM und DMF.
Npys-Entschützung: das gewaschene Peptidharz wurde mit 0,3 M HCL in Dioxan 5 min. und anschließend 30 min. behandelt. Das entschützte Peptidharz wurde mit Dioxan und DCM gewaschen, mit 5% DIEA in DCM neutralisiert und mit DCM und DMF gewaschen.
Kupplung der Aminosäuren: Dreifachen molaren Überschuss geschützter Aminosäure durch BOP (Molverhältnis 1:1) in DMF aktivieren. Vollständigkeit der Kondensationsreaktionen (1,5–40 h) jeweils durch Ninhydrintest bzw. durch Chloraniltest bei Kupplung an sekundäre Aminogruppen überprüfen.
Seitenkettenentschützung: Dreimal Waschen mit DCM und Entschützen unter Verwendung von Gemisch K (82,5% TFA, 5% p-Kresol, 5% Thioanisol, 5% Wasser, 2,5% Ethandithiol) 5 + 120 min.
Letzte Waschschritte: reines TFA (3×), DCM (5×), DMF (10×), DMF/0,1% HCl (5×), 0,1% HCl (3×) und 0,01% HCl (4×).
13.3.2 SYNTHESE DER BIBLIOTHEK

Synthese: TentaGel S NH₂ (10 g) wurde in DMF vorgequollen und 5 mal mit DMF gewaschen und danach der Festphasensynthese unter Verwendung der folgenden Vorschrift, die schematisch dargestellt ist, unterzogen:

Schritt	Reagenz
1	5% DIEA/DMF	2 × 5 min.
2	DMF-Waschschritt	10 × 2 min.
3	Fmoc-Lys(Dde)/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
4	50% Piperidin/DMF	10 min.
5	Fmoc-Lys(Alloc)/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
6	Wiederholung von Schritt 4
7	Boc-Gly/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
8	Pd-Katalysator
9	Wiederholung von Schritt 7
10	Fmoc-Gly/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
11	Wiederholung von Schritt 4
12	Fmoc-β-Ala/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
13	Wiederholung von Schritt 4
14	Wiederholung von Schritt 10
15	Wiederholung von Schritt 4
16	Wiederholung von Schritt 12
17	TFA/DCM
18	Randomisierung und Code 1 (Tabelle 3) Aminosäuren/BOP
19	Wiederholung von Schritt 4
20	Ddz-Gly/BOP
21	3% Hydrazin/DMF
22	Fmoc-Lys(Dde)/BOP	Bis Ninhydrintest negativ ist
23	Chlorameisensäure allylester	Bis Ninhydrintest negativ ist
24	3% TFA/DCM
25	Fmoc-Aminosäure R1/BOP (Tabelle 3)
26	Wiederholung von Schritt 4
27	Gerüst I/TBTU	Bis Ninhydrintest negativ ist
28	Pd-Katalysator
29	Randomisierung + Code 2 (Tabelle 4)/BOP
30	HCl/Dioxan
31	47 Säuren R 2 (Tabelle 4)/sym. Anhydride
32	Wiederholung von Schritt 4
33	Randomiserung + Code 3
34	50 Säuren R 3 (Tabelle 4)/sym. Anhydride
35	Wiederholung von Schritt 21
36	Code 3 (Tabelle 4)/BOP
37	Gemisch K
38	Letzter Waschschritt

Die geschützte Bibliothek wurde in DMA/0,3% HOBt, die entschützte Bibliothek in 0,01% wässriger HCl gelagert. Schema 5 Schema der Synthese einer Diaminobenzoesäure (DABA)-Bibliothek mit digitalem Code
Durchsuchen der durch Bar-Code codierten Bibliothek

Die Bibliothek wurde gemäß einer veröffentlichten Verfahrensweise (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods, 1:11-15) durchsucht. Dabei wurden die Kügelchen der Bibliothek zunächst mit stufenweise größeren Mengen an doppelt destilliertem Wasser gemischt. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7,2) mit 0,1% Tween-20 wurden die Kügelchen in 0,05% Gelatine (w/v) zur Blockierung jeglicher nichtspezifischer Bindung inkubiert. Anschließend wurden die Kügelchen mit 60 pM biotinyliertem Anti-β-Endorphin (Klon 3-E 7, Boehringer Mannheim) in 2 × PBS/Tween/Gelatine über Nacht inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurde Streptavidin-alkalische Phosphatase zugegeben. Eine Stunde später wurden die Kügelchen gewaschen und mit dem Standardsubstrat für alkalische Phosphatase, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, versetzt. Die Kügelchen wurden dann zusammen mit dem Substrat in Petrischalen zur Farbentwicklung überführt. Nach 30 Minuten bis 1 Stunde wurden die positiv gefärbten Kügelchen mit einer Mikropipette gesammelt, mit 6 M Guanidinhydrochlorid, pH 1,0, gewaschen und der Sequenzierung des Bar-Codes unterzogen. Tabelle 12 Für die Codierung von Block R1 verwendete Aminosäuredubletts R1 = 29 Aminosäuren

Aminosäure	Code-Elemente
Gly	Ala Phe
Ala	Ala Ile
Dap	Aib Val
Pro	Aib Phe
Val	Aib Ile
Pipecolinsäure	Val Phe
Leu	Val Ile
Asn	Phe Ile
Asp	Asn Gln
Orn	Asn Gly
Gln	Asn Ala
Glu	Asn Aib
2-Pyridyl-Ala	Asn Val
Chg	Asn Phe
Phe	Asn Ile
Cha	Gln Gly
Arg	Gln Ala
Citrulin	Gln Aib
Tetrahydroisochinolincarbonsäure	Gln Val
homoPhe	Gln Phe
N-Me-Gly	Gln Ile
Phe (p-F)	Gly Ala
Phe(p-Cl)	Gly Aib
Trp	Gly Val
Phe(p-NO2)	Gly Phe
Ala(1-Naph)	Gly Ile
3,4-Dichlor-Phe	Ala Aib
Lys(TFA)	Ala Val
Phe(p-Bz)	Ala Phe

Aib = Aminoisobuttersäure

14. BEISPIEL: MOLEKULARE GERÜSTE
In Schema XIX sind die chemischen Strukturen von 19 Verbindungen angegeben, die zur Konstruktion von Testverbindungen verwendet werden können. Das Schema bezeichnet dabei die Stelle der Bindung der Untereinheiten der Testverbindungen mit R_n. Schema XIX:

In Tabelle 15 unten finden sich Anleitungen hinsichtlich der Arten von Untereinheiten und der Chemie ihrer Bindung an das molekulare Gerüst.

Gerüst Nr.	Untereinheiten	Chemie der Kupplung
1. Aminosäure-aldehyd/ Organometal	Aminosäure Homoserinaldehydalkyl-arylmetall	CO-NH-Kupplung Ausbildung einer C-C-Bindung
2. Diketopiperazin	Aminosäuren N-Alkylaminosäuren	CO-NH-Kupplung Reduktive Aminierung
3. Substituiertes Thioprolin	Aminosäuren Cystein Aminosäurealdehyd Alkyl- oder Arylsäuren	CO-NH-Kupplung Reduktive Aminierung
4. Substituiertes Triazin	Aminosäure Trichlortriazin Alkyl- oder Arylamine	CO-NH-Kupplung Reduktive Aminierung
5. Substituiertes Thioprolindioxid	Aminosäuren N-Alkylaminosäuren Cystein Aldehyd, Keton	CO-NH-Kupplung Bildung von Thioaminal Oxidation C-Alkylierung
6. Acyliertes Polyethylendiamin	Aminosäuren Glycinal Alkyl- oder Arylsäuren	CO-NH-Kupplung Reduktive Aminierung
7. Benzoltricarbonsäure	Aminosäuren N-Alkylaminosäuren 1, 2, 4-Benzoltricarboxylsäure	CO-NH-Kupplung
8. 2-S-Alkyl(aryl)isoindol	Subst. Phthalanhydrid Alkyl- oder Arylamine Alkyl- oder Arylmercaptane	Isoindolsyntese
9. Cyclopentan	N-Alkylaminosäuren Primäre oder sekundäre Amine Cyclopentantricarbonsäure	CO-NH-Kupplung
10. Diacyldialkyldiaminosäure	Aminosäuren Aldehyde Alkyl- oder Arylsäuren	CO-NI-Kupplung Reduktive Aminierung
11. Erweiterte Kemps-Trisäure	Aminosäuren Kemps-Trisäure und geschützte Diamine	CO-NH-Kupplung
12. Kemps-Trisäure	Aminosäuren Kemps-Trisäure Alkyl- oder Arylsäuren	CO-NH-Kupplung
13. Alkylacylaminosäure	Aminosäuren Aldehyde Alkyl- oder Arylsäuren	CO-NH-Kupplung
14. Diaminobenzoesäure	Aminosäuren 3,5-Diaminobenzoesäure Alkyl- oder Arylsäuren	CO-NH-Kupplung
15. Steroid	Steroidgerüst Aldehyde	Reduktive Aminierung CO-NH-Kupplung
16. Bis-iminodiessigsäure	Glycin t-Butylbromacetatt Alkyl- oder Arylamine
17. N-Alkylierte Iminodiessigsäure	Diaminobutanon-säure t-Butylbromacetat Alkyl- oder Arylamine	CO-NH-Kupplung N-Alkylierung
18. α,β,γ-Peptidomimetikum	Diaminosäure Alkyl- oder Arylsäuren	CO-N-Kupplung
19. N-substituiertes Glycinpeptidomimetikum	Aminosäuren Aldehyde	CO-NH-Kupplung Reduktive Aminierung

Claims

Bibliothek zur Identifizierung und Analyse eines Liganden eines Akzeptors von Interesse, umfassend: eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern, an denen jeweils gebunden ist: a) eine Spezies einer Testverbindung, wobei die Testverbindung eine Sequenz von Untereinheiten umfasst, wobei Spezies einer Testverbindung über einen spaltbaren Linker an jeden Träger gebunden ist; und b) eine oder mehrere Spezies von codierenden Molekülen, wobei die codierenden Moleküle über einen nicht spaltbaren oder getrennt spaltbaren Linker an jeden Träger gebunden sind und α-Aminosäuren umfassen und topologisch von der Testverbindung getrennt sind, die an den Träger gebunden ist, sodass sich das codierende Molekül im Inneren des Trägers befindet und sich die Testverbindung auf der Außenseite des Trägers befindet, wobei auf jedem Träger: – sich jede Spezies codierendes Molekül von der Spezies der Testverbindung unterscheidet; die Sequenz der Untereinheiten der Testverbindung durch die Spezies von codierenden Molekülen codiert wird; und die codierenden Moleküle Untereinheiten aufweisen, die in einem nicht sequenziellen Code angeordnet sind.
Die Die Bibliothek nach Anspruch 1, bei der die Testverbindung nicht sequenzierbar ist.
Die Die Bibliothek nach Anspruch 2, bei der die Testverbindung ein Polymer ist.
Die Die Bibliothek nach Anspruch 3, bei der die Testverbindung ein Polymer ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polyamid, Polyester, Polyharnstoff, Polyurethan, Polycarbonat, Polyamin, Polyalkan, Polyalken, Polyalkohol, Polysulfid und Polydisulfid.
Die Die Bibliothek nach Anspruch 2, bei der die Untereinheiten der Testverbindung durch chemische Bindungen verknüpft sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Amid-, Ester-, Harnstoff-, Urethan-, Carbonat-, Amin-, Alkan-, Alken-, Sulfid- und Disulfidbindungen.
Die Bibliothek nach Anspruch 2, bei der die Testverbindung ein molekulares Gerüst ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 6, bei der das molekulare Gerüst ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Steroidstruktur, einem Zucker, einer heterocyclischen Struktur und einer polyaromatischen Verbindung.
Die Bibliothek nach Anspruch 6, bei der das molekulare Gerüst ein Aminosäurealdehyde/Organometall, ein Diketopiperazin, ein substituiertes Thio-prolin, ein substituiertes Triazin, ein substituiertes Thio-prolindioxid, ein acyliertes Polyethylendiamin, eine Benzoltricarbonsäure, ein 2-S-Alkyl(aryl)isoindol, ein Cyclopentan, eine Diacyldialkyldiaminosäure, eine gestreckte Kemps-Trisäure, eine Kemps-Trisäure, eine Alkylacylaminosäure, eine Diaminobenzoesäure, ein Steroid, eine Bis-Iminodiessigsäure, eine N-alkylierte Iminodiessigsäure, ein α,β,γ-Peptidmimetikum oder ein N-substituiertes Glycin-Peptidmimetikum ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 1, bei der das codierende Molekül ein verzweigtes Polypeptid ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 1, bei der die Struktur der Testverbindung auf jedem Träger durch eine Vielzahl von Spezies von codierenden Molekülen codiert wird.
Die Bibliothek nach Anspruch 1, bei der das codierende Molekül ein Polymer aus Diaminosäuren mit einer ersten und einer zweiten Aminoeinheit umfasst, bei der a) die erste Aminosäureeinheit eine Peptidbindung bildet, die die Diaminosäuren miteinander verknüpft; und b) die zweite Aminoeinheit an eine einer Vielzahl von Spezies von α-Aminosäuren gekuppelt ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 1, bei der die codierenden Moleküle ein Derivat von α,β-Diaminopropionsäure, α,γ-Diaminobuttersäure, Ornithin und Lysin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Cystein oder Penicillamin umfassen, wobei das Derivat durch Reaktion einer Carbonsäure mit einer N-β-, N-γ- oder N-ε-Aminoeinheit gebildet wird.
Die Bibliothek nach Anspruch 12, bei der das Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Caproyl, Pivaloyl, c-Hexyl, Trichloracetyl, Phenylacetyl, 2,2-Diphenylacetyl, Phenylbutyryl, 1-Naphthylacetyl, 2-Naphthylacetyl, 1-Adamantylcarbonyl, 1-Adamantylacetyl, Tosylglycyl, Dansylglycyl, Benzoyl, Succinamyl, Succinyl, Glutaryl, Isobutyryl, 4-Chlorbenzoyl, 2,2-Diphenylpropionyl, N,N-Dimethylglycyl, Heptanoyl, Octanoyl, 3,3-Diphenylpropionyl, N,N-Dimethylaminobutyryl, 3-Phenylpropionyl, 4-Bi-phenylcarbonyl, 4-Bi-phenylacetyl und Crotonyl.
Die Bibliothek nach Anspruch 2, bei der eine Untereinheit der Spezies der Testverbindung durch nukleophile Substitution gebunden und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ethylamin, i-Propylamin, Butylamin, i-Butylamin, Cyclopentylamin, Cyclohexylamin, Ethanolamin, 3-Aminopropanol, 1-Amino-2-propanol, 2-Methoxyethylamin, β-Ala-OtBu, Ethylendiamine (Boc), 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin, Benzylamin, Naphthalinmethylamin, 4-(Trifluormethyl)benzylamin, 2-Amino-1-phenyl-ethanol, Tyramin, 4-Methoxybenzylamin, 3,5-Dimethoxybenzylamin und 4-(Dimethylamino)benzylamin.
Die Bibliothek nach Anspruch 2, bei der eine Untereinheit der Spezies der Testverbindung durch Acylierung eines primären Amins gebunden und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus γ-Guanidinbuttersäure, Succinaminsäure, 1-Naphthylessigsäure, Diphenylessigsäure, Biphenylessigsäure, Pentafluorphenylessigsäure, 4- Trifluormethylbenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 4-Aminophenylessigsäure, 3-Nitro-phenylessigsäure, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzoesäure, 3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propionsäure, 4-Guanidinbenzoesäure, 4-Dimethylaminobenzoesäure, 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure, 1,4-Dimethyl-2,3-pyrroldicarbonsäure, 2-Methyl-4-nitro-1-imidazolpropionsäure, 2-Amino-1-imidazolessigsäure, 3-Amino-1,2,4-triazol-5-carbonsäure, 4-Imidazolessigsäure, 2,3-Pyridindicarbonsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 2,3-Pyrazindicarbonsäure, 1-Methylindol-2-carbonsäure, 2-Methyl-3-indolessigsäure und Indol-4-carbonsäure.
Die Bibliothek nach Anspruch 2, bei der eine Untereinheit der Spezies der Testverbindung durch Reduktionsalkylierung gebunden und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Methylbutyraldehyd, 2-Ethylbutyraldehyd, Trimethylacetaldehyd, 2-Methylvaleraldehyd, Cyclohexancarboxaldehyd, Benzal-dehyd, 4-Nitrobenzaldehyd, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillin, 2-Thiophen-carboxaldehyd, Pyridin-4-carboxaldehyd, α,α,α-Trifluor-o-tolualdehyd, 4-Methoxybenzaldehyd, 1-Acetylindol-3-carboxaldehyd, 4-Carboxybenzaldehyd, β-Naphthaldehyd, 4-Phenylbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd und 2-Hydroxy-benzaldehyd.
Bibliothek zur Identifizierung eines Liganden oder eines Akzeptors von Interesse, wobei die Bibliothek eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst, wobei auf der Oberfläche jedes Trägers ein Linker gebunden ist, der eine einzige Spezies einer Testverbindung mit einer Sequenz von Untereinheiten umfasst, und wobei im Inneren jedes Trägers ein codierendes Molekül gebunden ist, da die Sequenz von Untereinheiten der Testverbindung codiert, wobei der Linker eine Bindung aufweist, die durch ein Enzym spaltbar ist, das nicht eine Bindung des codierenden Moleküls spaltet und wobei das codierende Molekül α-Aminosäuren umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei der Linker ein Peptid ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei der Linker Phenylalanin umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei das Enzym eine Endopeptidase ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 20, wobei die Endopeptidase Chymotrypsin ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei die Testverbindung ein Polymer ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 22, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polyamid, Polyester, Polyharnstoff, Polyurethan, Polycarbonat, Polyamin, Polyalkan, Polyalken, Polyalkohol, Polysulfid und Polydisulfid.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei die Untereinheiten der Testverbindung durch chemische Bindungen verknüpft sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Amid-, Ester-, Harnstoff-, Urethan-, Carbonat-, Amin-, Alkan-, Alken-, Sulfid- und bisulfidbindungen.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei die Testverbindung ferner ein molekulares Gerüst umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 25, wobei das molekulare Gerüst ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Steroidstruktur, einem Zucker, einer heterocyclischen Struktur und einer polyaromatischen Verbindung.
Die Bibliothek nach Anspruch 25, wobei das molekulare Gerüst ein Aminosäurealdehyde/Organometall, ein Diketopiperazin, ein substituiertes Thioprolin, ein substituiertes Triazin, ein substituiertes Thioprolindioxid, ein acyliertes Polyethylendiamin, eine Benzoltricarbonsäure, ein 2-S-Alkyl(aryl)-isoindol, ein Cyclopentan, eine Diacyldialkyldiaminosäure, eine gestreckte Kemps-Trisäure, eine Kemps-Trisäure, eine Alkylacylaminosäure, eine Diamino-benzoesäure, ein Steroid, eine Bis-Iminodiessigsäure, eine N-alkylierte Iminodiessigsäure, ein α,β,γ-Peptidmimetikum oder ein N-substituiertes Glycin-Peptidmimetikum ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei das codierende Molekül ein verzweigtes Polypeptid ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei das codierende Molekül ein Polymer aus Diaminosäuren mit einer ersten und einer zweiten Aminoeinheit umfasst, bei der: a) die erste Aminosäureeinheit eine Peptidbindung bildet, die die Diaminosäuren miteinander verknüpft; und b) die zweite Aminoeinheit an eine einer Vielzahl von Spezies von α-Aminosäuren gekuppelt ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei das codierende Molekül ein Derivat von jeweils α,β-Diaminopropionsäure, α,γ-Diaminobuttersäure und Ornithin umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 30, wobei das Derivat durch Umsetzen einer Carbonsäure mit einer N-β-, N-γ-, N-δ- oder N-ε-Aminogruppe unter Bildung einer Acylgruppe gebildet wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Caproyl, Pivaloyl, c-Hexyl, Trichloracetyl, Phenylacetyl, 2,2-Diphenylacetyl, Phenylbutyryl, 1-Naphthylacetyl, 2-Naphthyl-acetyl, 1-Adamantylcarbonyl, 1-Adamantylacetyl, Tosylglycyl, Dansylglycyl, Benzoyl, Succinamyl, Succinyl, Glutaryl, Isobutyryl, 4-Chlorbenzoyl, 2,2-Diphenylpropionyl, N,N-Dimethylglycyl, Heptanoyl, Octanoyl, 3,3-Diphenylpropionyl, N,N-Dimethylaminobutyryl, 3-Phenylpropionyl, 4-Bi-phenylcarbonyl, 4-Bi-phenylacetyl und Crotonyl.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei eine der Untereinheiten ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ethylamin, i-Propylamin, Butylamin, i-Butylamin, Cyclopentylamin, Cyclohexylamin, Ethanolamin, 3-Aminopropanol, 1-Amino-2-propanol, 2-Methoxyethylamin, β-Ala-OtBu, Ethylendiamine (Boc), 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin, Benzylamin, Naphthalinmethylamin, 4-(Trifluor-methyl)benzylamin, 2- Amino-1-phenyl-ethanol, Tyramin, 4-Methoxybenzylamin, 3,5-Dimethoxybenzylamin und 4-(Dimethylamino)benzylamin.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei eine der Untereinheiten eine Säure ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus γ-Guanidinbuttersäure, Succinaminsäure, 1-Naphthylessigsäure, Diphenylessigsäure, Biphenylessigsäure, Penta-fluorphenylessigsäure, 4-Trifluormethylbenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 4-Aminophenylessigsäure, 3-Nitrophenylessigsäure, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzoesäure, 3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propionsäure, 4-Guanidinbenzoesäure, 4-Dimethylaminobenzoesäure, 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure, 1,4-Dimethyl-2,3-pyrroldicarbonsäure, 2-Methyl-4-nitro-1-imidazolpropionsäure, 2-Amino-1-imidazolessigsäure, 3-Amino-1,2,4-triazlo-5-carbonsäure, 4-Imidazolessigsäure, 2,3-Pyridindicarbonsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 2,3-Pyrazindicarbonsäure, 1-Methylindol-2-carbonsäure, 2-Methyl-3-indolessigsäure und Indol-4-carbonsäure.
Die Bibliothek nach Anspruch 17, wobei eine der Untereinheiten ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Methylbutyraldehyd, 2-Ethylbutyraldehyd, Trimethylacetaldehyd, 2-Methylvaleraldehyd, Cyclohexancarboxaldehyd, Benzaldehyd, 4-Nitrobenzaldehyd, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillin, 2-Thiophencarboxaldehyd, Pyridin-4-carboxaldehyd, α,α,α-Trifluor-o-tolualdehyd, 4-Methoxybenzaldehyd, 1-Acetylindol-3-carboxaldehyd, 4-Carboxy-benzaldehyd, β-Naphthaldehyd, 4-Phenylbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd und 2-Hydroxybenzaldehyd.
Bibliothek zur Identifizierung eines Liganden oder eines Akzeptors von Interesse, wobei die Bibliothek eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst, wobei auf der Oberfläche jedes Trägers ein Linker gebunden ist, der eine einzige Spezies einer Testverbindung umfasst, die eine Sequenz von Untereinheiten umfasst, an die eine erste Schutzgruppe gebunden ist, und wobei im Inneren jedes Trägers ein codierendes Molekül gebunden ist, das die Sequenz von Untereinheiten codiert und an das eine zweite Schutzgruppe gebunden ist, wobei die erste Schutzgruppe von der zweiten Schutzgruppe verschieden ist und wobei das codierende Molekül α-Aminosäuren umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei der Linker ein Peptid ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei die Testverbindung ein Polymer ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 37, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polyamid, Polyester, Polyharnstoff, Polyurethan, Polycarbonat, Polyamin, Polyalkan, Polyalken, Polyalkohol, Polysulfid und Polydisulfid.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei die Untereinheiten der Testverbindung durch chemische Bindungen verknüpft sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Amid-, Ester-, Harnstoff-, Urethan-, Carbonat-, Amin-, Alkan-, Alken-, Sulfid- und Disulfidbindungen.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei die Testverbindung ferner ein molekulares Gerüst umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 40, wobei das molekulare Gerüst ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Steroidstruktur, einem Zucker, einer heterocyclischen Struktur und einer polyaromatischen Verbindung.
Die Bibliothek nach Anspruch 40, wobei das molekulare Gerüst ein Aminosäurealdehyde/Organometall, ein Diketopiperazin, ein substituiertes Thio-prolin, ein substituiertes Triazin, ein substituiertes Thioprolindioxid, ein acyliertes Polyethylendiamin, eine Benzoltricarbonsäure, ein 2-S-Alkyl(aryl)isoindol, ein Cyclopentan, eine Diacyldialkyldiaminosäure, eine gestreckte Kemps-Trisäure, eine Kemps-Trisäure, eine Alkylacylaminosäure, eine Diaminobenzoesäure, ein Steroid, eine Bis-Iminodiessigsäure, eine N-alkylierte Iminodiessigsäure, ein α,β,γ-Peptidmimetikum oder ein N-substituiertes Glycin-Peptidmimetikum ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei das codierende Molekül ein verzweigtes Polypeptid ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei das codierende Molekül ein Polymer aus Diaminosäuren mit einer ersten und einer zweiten Aminoeinheit umfasst, bei der: a) die erste Aminosäureeinheit eine Peptidbindung bildet, die die Diaminosäuren miteinander verknüpft; und b) die zweite Aminoeinheit an eine einer Vielzahl von Spezies von α-Aminosäuren gekuppelt ist.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei das codierende Molekül ein Derivat von jeweils α,β-Diaminopropionsäure, α,γ-Diaminobuttersäure und Ornithin umfasst.
Die Bibliothek nach Anspruch 45, wobei das Derivat durch Umsetzen einer Carbonsäure mit einer N-β-, N-γ-, N-δ- oder N-ε-Aminogruppe unter Bildung einer Acylgruppe gebildet wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Caproyl, Pivaloyl, c-Hexyl, Trichloracetyl, Phenylacetyl, 2,2-Diphenylacetyl, Phenylbutyryl, 1-Naphthylacetyl, 2-Naphthyl-acetyl, 1-Adamantylcarbonyl, 1-Adamantylacetyl, Tosylglycyl, Dansylglycyl, Benzoyl, Succinamyl, Succinyl, Glutaryl, Isobutyryl, 4-Chlorbenzoyl, 2,2-Diphenylpropionyl, N,N-Dimethylglycyl, Heptanoyl, Octanoyl, 3,3-Diphenylpropionyl, N,N-Dimethylaminobutyryl, 3-Phenylpropionyl, 4-Bi-phenylcarbonyl, 4-Bi-phenylacetyl und Crotonyl.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei eine der Untereinheiten ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ethylamin, i-Propylamin, Butylamin, i-Butylamin, Cyclopentylamin, Cyclohexylamin, Ethanolamin, 3-Aminopropanol, 1-Amino-2-propanol, 2- Methoxyethylamin, β-Ala-OtBu, Ethylendiamine (Boc), 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin, Benzylamin, Naphthalinmethylamin, 4-(Trifluormethyl)benzylamin, 2-Amino-1-phenyl-ethanol, Tyramin, 4-Methoxy-benzylamin, 3,5-Dimethoxybenzylamin und 4-(Dimethylamino)benzylamin.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei eine der Untereinheiten eine Säure ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus γ-Guanidinbuttersäure, Succinaminsäure, 1-Naphthylessigsäure, Diphenylessigsäure, Biphenylessigsäure, Pentafluorphenylessigsäure, 4-Trifluormethylbenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 4-Aminophenylessigsäure, 3-Nitrophenylessigsäure, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzoesäure, 3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propionsäure, 4-Guanidinbenzoesäure, 4-Dimethylaminobenzoesäure, 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure, 1,4-Dimethyl-2,3-pyrroldicarbonsäure, 2-Methyl-4-nitro-1-imidazolpropionsäure, 2-Amino-1-imidazolessigsäure, 3-Amino-1,2,4-triazol-5-carbonsäure, 4-Imidazolessigsäure, 2,3-Pyridindicarbonsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 2,3-Pyrazindicarbonsäure, 1-Methylindol-2-carbonsäure, 2-Methyl-3-indolessigsäure und Indol-4-carbonsäure.
Die Bibliothek nach Anspruch 35, wobei eine der Untereinheiten ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Methylbutyraldehyd, 2-Ethylbutyraldehyd, Trimethylacetaldehyd, 2-Methylvaleraldehyd, Cyclohexancarboxaldehyd, Benzaldehyd, 4-Nitrobenzaldehyd, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillin, 2-Thiophencarboxaldehyd, Pyridin-4-carboxaldehyd, α,α,α-Trifluor-o-tolualdehyd, 4-Methoxybenzaldehyd, 1-Acetylindol-3-carboxaldehyd, 4-Carboxy-benzaldehyd, β-Naphthaldehyd, 4-Phenylbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd und 2-Hydroxybenzaldehyd.