DE69530086T2

DE69530086T2 - Aufnahme von biologisch aktiven molekülen in bioaktives glas

Info

Publication number: DE69530086T2
Application number: DE69530086T
Authority: DE
Inventors: Paul Ducheyne; Shulamith Radin; Erick Manuel Santos
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1994-07-27
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: DE69530086D1; IL114770A0; US5591453A; ATE235230T1; IL114770A; ES2194919T3; EP0772436B1; CA2195680A1; JPH10503210A; EP0772436A4; WO1996003117A1; EP0772436A1; TW448051B; AU3147095A

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Einlagerung von biologisch aktiven Molekülen in eine Matrix aus Glas, insbesondere bioaktivem Glas, unter Verwendung eines von Sol-Gel abgeleiteten Verfahrens zur Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
Muskel-Skelettverletzungen haben einen wesentlichen Einfluss auf die Gesundheit und die Lebensqualität von Millionen von Amerikanern. Die verzögerte Heilung und das Nicht-Zusammenwachsen von Knochenbrüchen stellen eine ständige orthopädische Herausforderung dar. Der herkömmliche Weg, diese Probleme zu behandeln, ist die Verwendung von Knochenplatten und Schrauben in Verbindung mit autologem Knochentransplantat.
Für autologes Knochentransplantat als ein natürlich zusammengesetztes Material konnte gezeigt werden, dass es sowohl osteokonduktive als auch osteoinduktive Eigenschaften aufweist. Darüber hinaus ist es ein steriles, nicht immunogenes und nicht toxisches Material, das die Fähigkeit besitzt, vollständig in die Bruchstelle eingelagert zu werden. Ungeachtet des langen Zeitraums bis sich ihre Aktivität entwickelt, sind autologe Knochentransplantate der Gold-Standard, mit dem synthetische Zusammensetzungen verglichen werden. Weil es außerdem nur einen begrenzten Nachschub und Morbidität an der Entnahmestelle des autologen Knochentransplantatmaterials gibt, besteht ein wesentlicher Anreiz, synthetische Zusammensetzungen zu entwickeln. Bis heute hat keines der synthetischen Ersatzknochentransplantate die Eigenschaften eines autologen Knochentransplantats vollständig erreicht.
Die Steigerung der Geschwindigkeit und der Wahrscheinlichkeit von Knochenbruchheilung und die Förderung von Knochenbildung sowie die Heilung von Knochenbrüchen mit verzögerter Heilung und Knochenbrüchen, die nicht zusammenwachsen, sind von großer klinischer Bedeutung. (NIH/AAOS sponsored workshop. Bone Formation and Bone Regeneration. Tampa, FL: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1993). Die große Gruppe von Patienten mit verzögertem und Nicht-Zusammenwachsen von Knochen, die großen direkten medizinischen Kosten und die gesellschaftlichen Kosten, die mit ihrer Langzeitinvalidität in Zusammenhang stehen unterstreichen die Notwendigkeit für wirksame und verbesserte Behandlungsverfahren.
Fortschritte in den Materialwissenschaften und die Identifizierung von osteogenetischen und osteoinduktiven Wachstumsfaktoren haben die Untersuchung von neueren Alternativen für autologe Knochentransplantationen angeregt. Osteogenese, was der Vorgang der Knochenbildung ist, schließt sowohl Osteokonduktion als auch Osteoinduktion ein. Osteokonduktion ist der Vorgang, in dem differenzierte knochenbildende Zellen eine Knochenmatrix auf einem existierenden Substrat bilden. Materialien, die diesen Vorgang fördern, werden als osteokonduktiv bezeichnet. Osteoinduktion ist der Vorgang, durch den undifferenzierte mesenchymale Vorläuferzellen in differenzierte knochenbildende Zellen umgewandelt werden. Faktoren oder Materialien, die diesen Vorgang fördern, werden als osteoinduktiv bezeichnet.
Wachstumsfaktoren, die durch biologisch aktive Träger mit kontrollierter Freisetzung (engl.: „controlled release carriers") herangeführt werden, haben das Potenzial für verbesserte Knochenbruchheilung und geringere Morbidität, was zu einer verbesserten Patientenbehandlung und einer Verringerung der Gesamtkosten, die mit der Knochenbruchbehandlung einhergehen, führt. Ebenso wird das Heranführen von Antibiotika durch solche Träger, entweder alleine oder zusätzlich zu Wachstumsfaktoren, helfen, das Auftreten von Infektionen zu verringern, die zu weiteren Verzögerungen in der Heilung beitragen. Bei Knochenbrüchen, die beispielsweise die Wirbelsäule betreffen, wird die Einlagerung von entzündungshemmenden Mitteln und Analgetika (Schmerzmittel} helfen, Entzündungen zu kontrollieren, die ebenfalls den Heilungsvorgang verzögern können, und zum Wohlbefinden des Patienten während des Heilungsvorgang beitragen.
Darüber hinaus würde die kontrollierte Freisetzung solcher Materialien, ungeachtet der Bioaktivität des Trägers, einen eindeutigen Vorteil gegenüber den gegenwärtigen Abgabeverfahren darstellen und würde bei der Fixierung von Implantaten helfen.
Das ideale synthetische Transplantat wäre ein Gerüstmaterial, welches das Wachstum von Knochengewebe an der Stelle des Gerüsts anregen würde, während dieses degradiert. (Damien et al., J. Applied Biomater. (1991) 2: 187–200). Synthetische Materialien, die als Ersatzknochentransplantat verwendet werden sollen, sollten mechanische und andere Eigenschaften ähnlich jenen von Knochen haben, und sie sollten mit den umgebenden Geweben bioverträglich sein. Um eine Verbindung über die Bruchstelle liefern zu können, müssen sie nicht nur als Gerüstmaterialien dienen, sondern auch, ähnlich wie natürliche Knochen, eine stimulatorische Wirkung auf die Knochengewebsregeneration haben.
Die gegenwärtig verwendeten synthetischen Knochentransplantatmaterialien werden als osteokonduktiv erachtet, dahingehend, dass sie die Bildung von Knochenmatrix an ihren Oberflächen auslösen. Weiterhin führen sie zu einer angrenzenden Schnittstelle bzw. Grenzfläche mit Knochen, oder sie werden durch Knochengewebe ersetzt. Solche Eigenschaften legen eine chemische Wechselwirkung zwischen diesen bioaktiven Materialien und der Knochenumgebung nahe. Zellen, die in der Knochenmatrixumgebung vorkommen, üben eine vorteilhafte Antwort auf diese Materialien aus.
Die Materialien, die für die Verwendung als synthetische Transplantate am meisten untersucht wurden, waren Calciumphosphatkeramiken und bioaktive Gläser. Calciumphosphatkeramiken (CPCs) (engl.: „calcium phosphate ceramics") sind in ihrer Zusammensetzung der mineralischen Phase des Knochens sehr ähnlich. Bioaktive Gläser besitzen die Fähigkeit, eine Hydroxyapatitschicht auf ihrer Oberfläche zu bilden, welche die mineralische Phase des Knochens nachahmt.
Die am häufigsten verwendeten Calciumphosphatkeramiken schließen ein: Hydroxyapatit (HA), in entweder dichten oder porösen Formen, und β-Tricalciumphosphat (β-TCP). Nydroxyapatit besitzt nur begrenzte Wirksamkeit als Transplantatmaterial. Als HA-Feststoffe in poröser und dichter Form als Transplantatmaterial im Alveolarkamm untersucht wurden, wurde gefunden, dass sich faserige Verkapselungen bzw. Einkapselungen in den durch den Knochen übertragenen (perossalen) Stellen bilde ten. Außerdem wurde gefunden, dass die Wanderung (Migration) der Partikel ein Problem darstellt. (Ducheyne P., J. Biomed. Mater. Res. (1987) 21(A2 Suppl): 219.). Außerdem kann HA nicht als Gerüstmaterial verwendet werden, weil seine Degradationsgeschwindigkeit langsam ist. (Cornell et al., Clin. Orthop. (1992) 297; und Radin et al., J. Biomed. Mater. Res. (1993) 27: 35–45).
Andererseits ist β-TCP ein biologisch abbaubares Material, das osteokonduktiv ist. Jedoch wurde gefunden, dass seine Degradationsgeschwindigkeit zu schnell ist, um als ein wirksames synthetisches Transplantatmaterial in Kraft- bzw. gewichttragenden Situationen dienen zu können. (Damien et al., supra.). Daher haben klinische Bewertungen und Anwendungen der HA- und β-TCP-Materialien, entweder dicht oder porös, gezeigt, dass beide Materialien durch einen Mangel an kontrollierter Reaktionsgeschwindigkeit eingeschränkt sind.
Für bioaktive Gläser konnte erstmals in den späten Sechzigerjahren des 20. Jahrhunderts durch Dr. Larry Hench gezeigt werden, dass sie an lebenden Knochen binden. Seit dieser Zeit haben mehr als zehn Gruppen auf der Welt gezeigt, dass Gläser, die SiO₂, CaO, P₂O₅, Na₂O und andere geringe Mengen an Oxiden in verschiedenen Verbindungen an Knochen binden. (Ducheyne P., J. Biomed. Mater Res. (1987) 21(A2 Suppl.): 219; Hench, L. L., Ann. N. Y. Acad. Sci. (1988) 523: 54; Andersson et al., J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25: 1019–1030; Andersson et al., J. Non-Cryst Solids (1991) 129: 145–151 ; Boone et al., J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23(A2 Suppl.): 183; Ducheyne et al., Clin. Orthop. Rel. Res. (1992) 76: 102–114; Hench, L. L., J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23: 685–703; Kokubo, T., Biomaterials (1991) 12(2): 155; und Rawlings, R. D., J. Mater. Sci. Letters (1992) 11: 1340–1343.).
Bioaktive Glaskeramiken werden Oberflächenkorrosionsreaktionen unterzogen, wenn sie Körperflüssigkeiten ausgesetzt sind. Diese Korrosionsreaktionen bilden ein Siliziumoxid-(Kieselerde bzw. Kieselsäure bzw. Silica)-reiche Oberflächenschicht. Diese Schicht dient als Ort der Keimbildung für die Ablagerung von Calciumphosphat, das sich zu einer dicken Hydroxyapatitschicht entwickelt. Wenn sie in Kontakt mit knochenbildenden Zellen kommt, wird diese Schicht die Grundlage für die chemische Bindung zwischen dem Glas und der Knochenmatrix bilden. (Ducheyne, supra; Hench (1988), supra; und Hench (1989), supra.). Das bioaktive Glas 45S5 von Dr. Hench ist die am besten untersuchte bioaktive Glaskeramik. Ihre Zusammensetzung in Gewichtsprozent beträgt: 45% SiO₂, 24,5%·CaO, 6% P₂O₅ und 24,5% Na₂O.
In dem U.S. Patent Nr. 5,204,106 wurde 45S5-Glas in fester Form in einem engen Größenbereich als wirksames Ersatzknochentransplantat im Alveolarkammmodell und als gut in den umgebenden Knochen eingelagert beschrieben. Für die Glaskörnchen wurde beschrieben, dass sie die Hochregulation von Osteovorläuferzellen zu Osteoblasten bewirken, die aktiv Knochengewebe begründen. (Schepers et al., J. Oral Rehabil. (1991) 18: 439–452.).
Die folgenden Parameter sind wichtig für knochenbioaktive Ersatztransplantate: kontrollierte Resorption und Reaktivität, durch Einsenken bzw. Eintauchen induzierte Transformation der Oberfläche des synthetischen Materials in ein biologisch äguivalentes hydroxyapatitähnliches Material, relativ großer Oberflächenbereich und Porosität (um ein Netzwerk für osteoblastische Aktivität zu bilden). Bioaktives Glas kann potentiell so zugeschnitten werden, dass es diese Parameter erfüllt. Zusätzlich sind die folgenden Voraussetzungen wichtig für ein erfolgreiches Abgabesystem für biologisch aktive Moleküle: 1) kontrollierte Freisetzung der Moleküle; 2) Abgabe von adäquaten Mengen der Moleküle; 3) rasches Wachstum des Knochengewebes in den Träger; 4) Bioverträglichkeit, Osteokonduktivität und Osteoinduktivität des Implantatmaterials; und 5) Resorption des Trägers, wenn sich Knochengewebe vollständig gebildet hat. (Lucas et al., J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23 (A1 Suppl.): 23.). Kein derzeit verfügbares Abgabesystem erfüllt all diese Kriterien. (Damien et al., supra; und Cornell und Lane, Clin. Orth. Rel. Res. (1992) 277: 297–311.). Gewiss kein Abgabesystem führt zu kontrollierter Abgabe.
Es wurden Versuche wurden unternommen, in denen versucht wurde Calciumphosphatkeramiken zu verbessern, indem sie als Abgabevehikel für Knochenwachstumsfaktoren verwendet wurden. Bis heute war es nicht erfolgreich, Wachstumsfaktoren in Calciumphosphatkeramiken so einzulagern, dass dies zu einer nachhaltigen Abgabe des hinzugefügten Wachstumsfaktors führt. Meistens erreicht man eine plötzliche Freisetzung (engl.: „burst release"), was eine schnelle anfäng liche Freisetzung des Großteils des Materials über eine kurze Zeitspanne darstellt. (Campbell et al., Trans. Orthop. Res. Soc., 40: 775, 1994.).
Träger, die aus β-TCP oder einem nicht löslichen Kollagen hergestellt ist, waren in Kombination mit knochenmorphogenetischem Protein mäßig erfolgreich im Erreichen einer guten Beschleunigung von Knochengewebsheilung. (Damien et al., J. Dental Res. (1989) 68: 1355–1359). Jedoch waren diese Systeme nicht fähig, eine messbare kontrollierte Freisetzung von Wachstumsfaktoren über Zeitspannen zu liefern, die an jene für Knochengewebsregeneration benötigte hinkommen, um einen großen Knochenfülldefekt zu überbrücken. In einer Studie wurden große Mengen an Wachstumsfaktoren, d. h. größer als 50 mg, benötigt, um Defekte größer als drei (3) Zentimeter aufzufüllen. (Johnson et al., Clin. Orthop. (1992) 277: 229–237).
In den meisten untersuchten Systemen, in denen osteokonduktive Materialien als Träger verwendet wurden, betraf das Einlagerungsverfahren jenes des einfachen Eintauchens des Materials in eine Wachstumsfaktorlösung. Der Wachstumsfaktor wird anschließend entweder auf der Materialoberfläche oder in die Porenstruktur adsorbiert, aber er wird anschließend beim Eintauchen in eine wässrige Lösung in einem plötzlichen Effekt freigesetzt. (Campbell et al., Trans. Orthop. Res. Soc., 40: 775, 1994.)
Die veröffentlichte Anmeldung WO 92107554 berichtet von einem Material, das in lebendes Gewebe implantiert werden kann, das eine Biodegenerationsgeschwindigkeit aufweist, die der Geschwindigkeit entspricht, mit der das Gewebe regeneriert. Es wird berichtet, dass das Material eine aktive Substanz einschließen kann, die eine erweiterte bzw. verlängerte therapeutische Wirksamkeit liefert. Das Material schließt ein Calciumphosphat, ein biologisch abbaubares Oxid oder Polyoxid und eine aktive Substanz mit Amingruppen wie Netilmicin und/oder Gentamicin in Sulfatform ein.
Die veröffentlichte Anmeldung WO 93105823 berichtet über eine Zusammensetzung zur Stimulation von Knochenwachstum umfassend wenigstens eines von FGF, TGF-β, IGF-II, PDGF und ihre biologisch aktiven Mutanten und Fragmente, oder Knochenextrakte mit entsprechender Aktivität, oder Knochenextrakte mit BMP-Aktivität und ein geeignetes Verabreichungsmaterial.
Die Patentanmeldung des Vereinigten Königreichs GB 2255907 A berichtet von einem Abgabesystem für biologisch aktive Wachstums- und morphogenetische Faktoren umfassend ein festes Adsorptionsmittel, das hinsichtlich seiner spezifischen Affinität bezüglich des Faktors und des daran adsorbierten Faktors ausgewählt ist. In einer Ausführungsform wird poröses Hydroxyapatit als das feste Adsorptionsmittel beschrieben.
Das U.S. Patent Nr. 4,869,906 beschreibt ein resorbierbares poröses Tricalciumphosphat, in dem die Poren mit einer Füllmischung aus einem Antibiotikum und einem Füllstoff verschlossen sind.
U.S. Patent Nrs. 5,108,436 und 5,207,710 beschreiben belastungsbeständige Prothesen mit einem porösen Bereich in Kombination mit einem Extrakt eines osteogenen Faktors oder einem gereinigten osteogenen induktiven Protein, wahlweise in Kombination mit einem TGF-β-Kofaktor in einem pharmazeutisch geeigneten Träger. Der Träger ist entweder eine Kollagenzusammensetzung oder eine Keramik. Der Extrakt des osteogenen Faktors ist in dem porösen Bereich verteilt. Andere Verfahren für die Verbindung des belastungsbeständigen Mittels mit dem osteokonduktiven Material schließen Beschichten, Sättigung, Anlegen von Vakuumkraft um das Material in die Poren zu bringen und Lufttrocknen oder Gefriertrocknen des Materials auf dem Mittel ein. Es wird weiter beschrieben, dass die pharmazeutisch geeigneten Träger vorzugsweise eine Matrix umfassen, die fähig ist, eine Struktur zur Entwicklung von Knochen und Knorpel zu liefern. Einige aufgeführte bevorzugte pharmazeutisch geeignete Träger schließen Kollagen, Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat und bioaktives Glas ein. Jedoch gibt es keine Beschreibung einer Zubereitung, die bioaktives Glas als einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.
U.S. Patent Nr. 4,772,203 beschreibt Implantate mit einem Kern und einer Matrix, wobei die Matrix wenigstens teilweise resorbierbar ist. Die resorbierbare Matrix ist bioaktiv und/oder osteogeneseinduzierend. Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit [sic] und bioaktives Glas sind als solche Matrices aufgeführt. Es wird weiterhin ausgeführt, dass, falls eine resorbierbare Matrix verwendet wird, es weiterhin möglich ist, Antibiotika in die Matrix einzubetten.
Das U.S. Patent Nr. 4,976,736 beschreibt Biomaterialien, die nützlich sind für orthopädische und Zahnanwendungen mit einem Grundanteil aus Calciumkarbonat und einer Oberflächenschicht aus einem synthetischen Phosphat, wie Hydroxyapatit. Ein für Hydroxyapatit behaupteter Vorteil ist sein Absorptionsvermögen. Es wird weiterhin beschrieben, dass Antibiotika oder Wachstumsfaktoren in die Porenräume des Implantats eingeführt bzw. daran angelagert werden können. Alternativ dazu kann das Antibiotikum oder der Wachstumsfaktor mit einem vorzugsweise biologisch abbaubaren Polymer vermischt werden und in die Porosität eingespritzt oder auf die Porosität des phosphatbeschichteten Materials durch Vakuumfiltration aufgebracht werden.
Gombotz et al., J. App. Biomat., (1994) 5: 141–150 beschreiben die Einlagerung des transformierenden Wachstumsfaktors-β in ein zusammengesetztes Implantat, das aus Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) und demineralisierter Knochenmatrix hergestellt ist. Es wurde berichtet, dass die Implantate eine Entzündungsantwort mit geringer Mineralisation oder Knochenbildung zeigten. Ähnliche Ergebnisse wurden berichtet in Meikle et al., Biomaterials, (1994) 15(7): 513–521 mit Poly-DL-Milch-Co-Glykol-Scheiben (engl.: „poly DL-lactide-co-glycolide discs") mit eingelagertem Knochenmatrixextrakt.
U.S. Patent Nr. 4,563,350 beschreibt eine Zusammensetzung, die geeignet ist für induktive Knochentransplantate, die eine gereinigte Form eines osteogenen Faktors als Beimischung zu einem Träger aufweist, der einen prozentualen Anteil an nicht faserigem Kollagen besitzt. Der Faktor wird zu dem Kollagen entweder in Lösung oder in Gelatineform hinzugefügt und in verdünnter Mineralsäure für 1–2 Stunden bei ca. 4°C gerührt. Das Material wird anschließend dialysiert und lyophilisiert.
Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 5253286 beschreibt ein Material zur Wiederherstellung von Knochen umfassend Ca-enthaltendes Glaspulver und/oder kristalli siertes Glaspulver, eine wässrige Lösung, die hauptsächlich aus Phosphat besteht, und eine medizinische Substanz in Form einer kontrollierten Freisetzung. Die medizinische Substanz wird als in Feststoffform vorliegend beschrieben, und sie kann mit Mineralien beschichtet werden, die fähig sind, die Freisetzung der Substanz zeitweise zu unterdrücken.
Wie aus dem Vorangegangenen ersichtlich ist, wird ein Träger benötigt, der eine kontrollierte Freisetzung von biologisch aktiven Molekülen erlaubt. Solche Materialien, die zusätzlich osteokonduktiv und/oder osteoinduktiv sind, werden ebenfalls benötigt.
Bioaktive Gläser sind osteokonduktiv, aber sie werden für gewöhnlich hergestellt durch Vermischen der verschiedenen Oxide in einem Platinschmelztiegel und Schmelzen der Mischung bei einer Temperatur von 1300–1400°C. Dies ist das vom Schmelzen abgeleitete oder konventionelle Verfahren, um bioaktive Gläser zu erhalten. Solche Temperaturen würden jedoch die Funktion der meisten biologisch aktiven Moleküle während der Herstellung zerstören.
Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, um bioaktives Glas zu synthetisieren, ist jenes der Sol-Gel-Verarbeitung. Sol-Gel-Synthese von Gläsern wird erreicht durch Mischen eines Metallalkoxidvorläufers wie Tetraethylorthosilan (TEOS, Si(OC₂H₅)₄ im Falle von Siliziumdioxid) mit Wasser und einem Säurekatalysator, um eine Hydrolysereaktion zu bilden mit anschließender Polymerisation der Metallalkoxidspezies und Herstellung eines Gels. Dieses Gel wird, wenn es getrocknet ist, hauptsächlich aus dem Metalloxid bestehen, und es wird die Konsistenz von Glas erreichen.
Einige Forscher haben über die Einlagerung von Proteinen in ein Glas des Sol-Gel-Typs berichtet, das unter Verwendung von Siliziumalkoxidvorläufern und Wasser unter Beibehalten der Funktion hergestellt wurde. (Braun et al., J. of Non-Crystalline Solids, (1992) 147 und 148: 739–743 ; Yamanaka et al., Chemistry of Matenals, (1992) 4(3): 495–497; Ellerby et al., Science, (1992) 255: 1113–1115; und Avnir et al., Encapsulation of Organic Molecules and Enzymes Ch. 27, S. 385–404, American Chemical Society, 1992).
Verfahren zum Synthetisieren von Niedrigtemperatur-, Niedrigalkohol- und Niedrigprotonkonzentration-Sol-Gelen für Enzymeinlagerung werden beschrieben. Die eingelagerten Proteine behielten ihre Funktionalität bei. Jedoch lag das Hauptaugenmerk solcher Verfahren auf der Immobilisierung des Proteins innerhalb des Sol-Gels in einer Weise, die das interessierende Protein in dem Gel zurückhält. Wenn das Sol-Gel-Material als ein Sensor fungiert, können sehr kleine Moleküle, wie Glukose, durch die Poren zur Untersuchung hindurchtreten. Die Einlagerung innerhalb des Sol-Gels erlaubt die wiederholte Verwendung des Proteins. Die Freisetzung des Proteins aus dem Sol-Gel war nicht gewünscht und wäre sogar gegenläufig zu der Aufrechterhaltung einer langfristigen Aktivität.
In dem U.S. Patent Nr. 5,074,916 werden alkalifreie bioaktive Sol-Gel-Zusammensetzungen basierend auf SiO₂, CaO und P₂O₅ beschrieben. Zusammensetzungsbereiche sind jeweils 44–86, 4–46 und 3–15 Gewichtsprozent. Calciumnitrat wurde als die Calciumquelle und Tetraethoxysilan (TEOS) wurde als die Siliziumalkoxidquelle verwendet. Jedoch verwendet das beschriebene Verfahren Temperaturen um ca. 600–800°C und ein Säure zu Wasser Volumenverhältnis von 1/6. Ein solches Verfahren ist völlig ungeeignet zur Einlagerung von biologischen Molekülen.
U.S. Patent Nr. 5,292,801 offenbart das dauerhafte Einschließen eines oder mehrerer Reagenzien in einen Sol-Gel-Glasträger als ein Mittel, um eine Wechselwirkung zwischen den eingeschlossenen Reagenzien und wenigstens einem diffundierbaren gelösten Stoff oder Bestandteil in eine angrenzende Flüssig- oder Gasphase zu erhalten.
Die veröffentlichte Anmeldung WO 94/04657 beschreibt ein poröses bioaktives Glassubstrat, das die in vitro Bildung von Knochengewebe erlaubt.
U.S. Patent Nr. 5,200,334 beschreibt ein poröses, durchsichtiges Sol-Gel-Glas, das Siliziumdioxid mit einem biologischen Molekül, das dauerhaft in seine Poren eingeschlossen ist, aufweist.
U.S. Patent Nr. 4,772,203 beschreibt Implantate für Knochen- und Zahnwurzelprothesen, die einen Kern und eine Matrix aufweisen. Die Matrix kann Bioglas aufweisen, und sie kann darin eingebettete Partikel enthalten.
Schepers et al., J. Oral Rehabil. (1991) 18: 439–452 beschreibt die Herstellung von Körnchen aus bioaktivem Glas.
Cornell et al., J. of Orthopaedic Research, (1993) 11(5): 619–626 beschreibt Hydroxyapatitkügelchen (engl.: „beads„), die mit Gentamicinsulfat beschichtet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Träger mit kontrollierter Freisetzung. In den erfindungsgemäßen Trägern sind biologisch aktive Moleküle überall in die Matrix eines Glases auf Siliziumdioxid-Basis eingelagert. Wir haben herausgefunden, dass eine Abwandlung der Sol-Gel-Technik eine solche Einlagerung erleichtert, ohne die anschließende Aktivität der Moleküle negativ zu beeinflussen. Im Fall von reinem Siliziumdioxidglas wird die Freisetzung der biologischen Moleküle aus dem Träger primär durch Diffusion durch die Porenstruktur bewirkt. Für den Fall, dass das Glas zusätzlich zu Silizium Oxide enthält, wird die Freisetzung von biologischen Molekülen durch Diffusion und Reaktion bewirkt, wenn es in Flüssigkeiten wie beispielsweise Körperflüssigkeiten eingetaucht wird.
Die Sol-Gel-abgeleitete Technik erlaubt weitgehende Kontrolle der Glasultrastruktur und daher weitere Kontrolle über die Zeit und Quantität der Freisetzung der biologisch aktiven Moleküle, wie Arzneistoffe und Wachstumsfaktoren. Solche Träger können sowohl osteokonduktiv als auch osteoinduktiv sein durch die Bildung einer Calciumphosphatoberflächenschicht (d. h. bioaktiv) und die Freisetzung von Proteinfaktoren, die mesenchymale Zellen anlocken und stimulieren, in knochenbildende Zellen auf der Trägeroberfläche zu differenzieren, ebenso wie die Proliferation von Osteoblasten der Umgebung zu steigern. Der Endeffekt kann die Beschleunigung der Regeneration von Knochengewebe und die Verringerung des Auftretens von Infektionen in den Bereichen sein, die an die Trägerzusammensetzung des Sol-Gel/biologisch aktiven Moleküls angrenzen, was die Trägerzusammensetzung insbesondere für Implantate attraktiv macht. Die bioaktiven Composit-Materialien bzw. zusammengesetzten Materialien haben eine synergistische Wirkung, die Knochenbildung zu fördern, und sie selbst können als ein geeigneter Ersatz für autologes Knochentransplantatmaterial dienen.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Träger zur kontrollierten Freisetzung von biologisch aktiven Molekülen über die Zeit, umfassend Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit überall in die Matrix des Glases eingelagerten biologisch aktiven Molekülen.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit in die Matrix eingelagerten biologisch aktiven Molekülen, umfassend Reagieren eines Siliziummetallalkoxids mit Wasser und Methanol in einem molaren Verhältnis von 6 : 1 bis 20 : 1 Wasser/Alkoxid, Einstellen des pH auf einen Wert zwischen 1 und 4,5, Hinzufügen des biologisch aktiven Moleküls, Gelieren des Gels und Altern bei Temperaturen von 0°C bis 40°C und anschließend Trocknen des gealterten Gels bei Temperaturen von 15°C bis 40°C.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit in die Matrix eingelagerten biologisch aktiven Molekülen, umfassend Reagieren eines Siliziummetallalkoxids und anderer Alkoxide mit Wasser und Methanol, Einstellen des pH auf einen Wert zwischen 1 und 4,5, Hinzufügen des biologisch aktiven Moleküls, Bildenlassen des Gels und Altern bei Temperaturen von 0°C bis 40°C und anschließend Trocknen des gealterten Gels bei Temperaturen von 15°C bis 40°C.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit in die Matrix eingelagerten biologisch aktiven Molekülen, umfassend Reagieren eines Siliziummetallalkoxids mit Wasser, Einstellen des pH auf einen Wert zwischen 1 und 4,5, Hinzufügen eines Calciumsalzes und, gegebenenfalls Phosphorpentoxid, Hinzufügen des biologisch aktiven Moleküls, Bildenlassen des Gels und Altern bei Temperaturen von 0°C bis 40°C und anschließend Trocknen des gealterten Gels bei Temperaturen von 15°C bis 40°C.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung reinen Siliziumdioxidglases mit in die Matrix eingelagerten biologisch aktiven Molekülen, umfassend Reagieren eines Siliziummetallalkoxids mit Wasser und Methanol in einem molaren Verhältnis von ca. 10 : 1 Wasser/Alkoxid, einem Methanol/Alkoxid molaren Verhältnis von ca. 1 : 1, Einstellen des pH auf einen Wert zwischen 1,5 und 3, Hinzufügen des biologisch aktiven Moleküls, Bildenlassen des Gels und Altern bei Temperaturen von 0°C bis 40°C und anschließend Trocknen des gealterten Gels bei Temperaturen von 15°C bis 40°C.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden in einem Verfahren zum Transport von biologischen Molekülen zu einem Knochendefekt, umfassend Implantieren eines Materials, umfassend einen Träger aus Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit kontrollierter Freisetzung mit in die Matrix des Glases eingelagerten biologischen Molekülen in den Knochendefekt.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden in einem Verfahren zum Transport von Antibiotika in situ, umfassend In-Kontakt-Bringen einer Probe mit Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit in die Matrix des Glases eingelagerten Antibiotika.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, umfassend Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und überall in die Matrix eingelagerten biologisch aktiven Molekülen, in der Herstellung eines Trägers für den Transport biologischer Moleküle zu einem Knochendefekt.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, umfassend Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und in die Matrix eingelagerten biologisch akti ven Molekülen, umfassend Zusammenbringen eines Siliziumalkoxids und Calciumalkoxids und Mischen unter einer Argonatmosphäre für bis zu 15 Minuten, ohne dass Wasser, Alkohol oder Säure hinzugefügt werden. Anschließend werden die biologisch aktiven Moleküle zu der Mischung in Säure hinzugefügt, die Mischung geliert und altert bei Temperaturen von 0°C bis 40°C und wird anschließend getrocknet bei Temperaturen von 15°C bis 40°C bis ein Gewichtsverlust von 50%–80% erreicht ist.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen vorbehandelten Träger, umfassend Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit überall in die Matrix des Glases eingelagerten biologisch aktiven Molekülen. Der Träger wurde durch Eintauchen in eine Lösung mit Ionen, wie sie typisch sind für interstitielle Flüssigkeit, für eine Zeitspanne von bis zu ca. 7 Tagen vor der Verwendung behandelt.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Implantat zum Auffüllen eines Knochendefekts. Das verbesserte Implantat umfasst eine Beschichtung aus einem Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung für verschiedene Freisetzungsgeschwindigkeiten von biologisch aktiven Molekülen, umfassend Trägerkörnchen mit kontrollierter Freisetzung von biologisch aktiven Molekülen über die Zeit, umfassend Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind. Um die verschiedenen Freisetzungsgeschwindigkeiten zu bewirken, werden Körnchen verschiedener Größen im Bereich von 500 μm bis 5 mm eingeschlossen.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend verschiedene Gruppen von Trägerkörnchen mit kontrollierter Freisetzung von verschiedenen biologisch aktiven Molekülen über die Zeit. Die Zusammensetzung umfasst Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, wobei jede Gruppe ein darin eingeschlossenes unterschiedliches biologisch aktives Molekül aufweist.
Weitere und bevorzugt Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen aufgeführt.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Glas auf Siliziumdioxid-Basis, eingetaucht in eine simulierte physiologische Lösung.
2 zeigt eine energiedispergierende Röntgenanalyse einer Blase, die in Glas auf Siliziumdioxid-Basis, eingetaucht in eine simulierte physiologische Lösung, nachgewiesen wurde.
3 zeigt die Freisetzung von Vancomycin über die Zeit, aus Körnchen und Scheiben aus reinem Siliziumdioxidglas, eingetaucht in eine simulierte physiologische Lösung.
4 zeigt den Konzentrationseffekt auf die Vancomycinfreisetzung gegenüber der Zeit.
5 zeigt einen Vergleich der Zonen der Bakterieninhibition durch Vancomycin, gelöst in einer simulierten physiologischen Lösung, und der Vancomycinfreisetzung aus reinem Siliziumdioxidglas.
6 zeigt die Zone der Bakterieninhibitionsgröße gegenüber Eintauchzeit und Konzentration von Vancomycin, das aus reinem Glas auf Siliziumdioxid-Basis freigesetzt wurde.
7a und b zeigen das Verhältnis zwischen Trypsininhibitorkonzentration und -freisetzung jeweils über 7 bzw. 4 Wochen.
8 zeigt den Effekt von eingelagertem Inhalt, 0,5 gegenüber 1,0 μg, auf die gesamte Freisetzung von aktivem TGF-β1 aus Körnchen, die auf 50% Gewichtsverlust getrocknet wurden.
9 zeigt den Effekt auf den Grad der Trocknung, 50% gegenüber 70% Gewichtsverlust, aus Körnchen, die mit 1,0 μg TGF-β1 beladen wurden.
10 zeigt den Effekt von SA/V, Körnchen gegenüber Scheiben, die mit 1 μg TGF-β1 beladen und auf 50% Gewichtsverlust getrocknet wurden.
11 zeigt die Freisetzung von aktivem TGF-β1 pro Zeiteinheit und gesamt, aus Scheiben, die mit 0,5 μg beladen und auf 57% Gewichtsverlust (n = 3) getrocknet wurden.
12 zeigt eine Absorptionsisotherme von Glas auf Siliziumdioxid-Basis, das andere Oxide enthält.
13 zeigt FTIR-Spektren von Glas auf Siliziumdioxid-Basis, das andere Oxide enthält, vor (unteres Spektrum) und nach (oberes Spektrum) Eintauchen in SPS.
14 zeigt die Freisetzung von Trypsininhibitor aus Sol-Gelen, enthaltend Ca und P.
15 ist ein FTIR-Spektrum eines Ca-P Sol-Gels, enthaltend Trypsininhibitor, vor und nach Eintauchen in eine tris- bzw. dreifach gepufferte Elektrolytlösung.
Detaillierte Beschreibung
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Proteine und andere biologisch aktive Moleküle in Glasträger auf Siliziumdioxid-Basis in einer Weise eingelagert werden, die zu einer anhaltenden Freisetzung der hinzugefügten Moleküle führt und ihre Funktion nicht zerstört. Ein solches Transportsystem mit kontrollierter Freisetzung kann beispielsweise in Implantatmaterialien verwendet werden, um Knochendefekte aufzufüllen, einschließlich Defekten, die größer als drei Zentimeter sind, ohne dass eine übermäßige Menge an Wachstumsfaktoren benötigt wird. Ein solches Transportsystem mit kontrollierter Freisetzung findet auch Verwendung in anderen Anwendungen mit der Notwendigkeit ortsspezifischer Ziele (engl.: „sitespecific targeting needs"), wie beispielsweise in der die Chemotherapie. Die Träger können unter sterilen Bedingungen synthetisiert werden, oder sie können anschließend unter Verwendung von herkömmlichen Sterilisationsverfahren sterilisiert werden.
Träger mit kontrollierter Freisetzung in einer Ausführungsform der Erfindung, die Antibiotika umfassen, können in Zellkultur verwendet werden, um Kontaminationen zu verhindern, insbesondere jene, die sich entwickeln nach dem Verbrauch des Antibiotikums, das zu dem Medium hinzugefügt wurde, durch In-Kontakt-Bringen des Trägers mit der Kultur durch beispielsweise Eintauchen.
Träger mit kontrollierter Freisetzung in einer Ausführungsform der Erfindung, die Wachstumsfaktoren umfassen, insbesondere Knochenwachstumsfaktoren, können verwendet werden, um die Wirkung der ständigen kontrollierten Freisetzung von verschiedenen Faktoren auf Knochenzellen in vitro zu untersuchen. Es ist ebenfalls vorgesehen, dass solche Träger für die Entwicklung von unsterblichen Knochenzelllinien in vitro verwendet werden.
Sol-Gel-abgeleitete Verarbeitung kann bei niedrigen Temperaturen – d. h. 40°C oder niedriger – und niedrigem pH durchgeführt werden. Diese beiden Bedingungen können wichtig sein für das Aufrechterhalten der Funktionalität von biologisch aktiven Molekülen, die in die Sol-Gel-Matrix eingelagert sind.
Die Vorteile von Sol-Gel-abgeleiteter Verarbeitung schließen die Folgenden ein: 1) ein Sol, das eine Suspension von Körnchen kolloidaler Größe ist, liegt in flüssiger Form vor, bevor es geliert; 2) die gesamte Reaktion kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden; und 3) die Mikroporosität des Sol-Gel-Glases kann kontrolliert werden durch beispielsweise unterschiedlichen Wassergehalt, die Zeit der Protonenzugabe, Protonenkonzentration, Alterungszeit und Trocknungszeit. Die Porengrößen, die durch Sol-Gel-Verarbeitung im allgemeinen erreichbar sind, liegen im Nanometerbereich. Während der Flüssigphase der Reaktion können Proteine und andere biologisch aktive Moleküle zu dem Flüssigsol hinzugefügt werden, bevor es geliert. Diese Moleküle werden dann in die feste Matrix eingeschlossen. Durch die kontrol lierbare Mikroporosität wird eine anschließende kontrollierte Freisetzung des Moleküls erreicht.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Träger mit kontrollierter Freisetzung" auf Träger für biologisch aktive Moleküle, wie unten definiert, welche die Freisetzung der biologisch aktiven Moleküle über die Zeit erlauben, wenn sie in Lösungen mit beispielsweise Ionen, die für interstitielle Flüssigkeit typisch sind, eingetaucht sind. Ein Beispiel für eine solche Lösung ist eine simulierte physiologische Lösung (SPS) (engl.: „simulated physiologic solution"), die in einigen der unten beschriebenen Beispiele verwendet wird. SPS wird hergestellt durch Lösen von analysenreinem NaCl, KCl, NaHCO₃, K₂HPO₄, CaCl₂, MgCl₂ und MgSO₄ in einer 0,05 M Tris[hydroxymethyl]-aminomethanhydrochlorid(tris)-gepufferten Lösung (pH 7,3 bei 37°C), was zu lonenkonzentrationen ähnlich dem Plasma führt: Na⁺ = 142 mM, K⁺ = 5 mM, Ca²⁺ = 2,5 mM, Mg²⁺ = 1,5 mM, HCO₃ = 27 mM, HPO₄ ^2– = 1 mM und 0,5 mM SO₄ ^2–. Ein anderes Beispiel ist ein Gewebekulturmedium.
So wie hier verwendet, bezieht sich „bioaktiv" auf ein knochenbioaktives Material mit einer bereits vorhandenen calciumphosphatreichen Schicht, oder die sich während geeigneter in vitro oder in vivo Bedingungen bildet. Wie von Pereira et al., J. of Biomed. Mat. Res., (1994) 28: 693–698 beobachtet, besitzt reines Siliziumdioxidgel mit einer porösen hydrierten Schicht die Fähigkeit, eine Kohlenstoffhydroxyapatitschicht zu bilden, wenn es in einer simulierten Körperflüssigkeit enthaltend Calcium- und Phosphationen getränkt wird. Reine Siliziumdioxidhydrogele, die hergestellt wurden unter Verwendung von TEOS und Trockentemperaturen von ca. 400°C, wurden in simulierte Körperflüssigkeiten mit verschiedenen Magnesium-, Calcium- und Phosphationen eingetaucht. Es wurde berichtet, dass die Apatitkerninduktionszeiträume beim Hinzufügen von kleinen Mengen an Calcium- und Phosphationen zu den Flüssigkeiten, ebenso wie bei einem Anstieg des pH herabgesetzt wurden. (Li et al., J. Appl. Biomater., (1993) 4: 221–229 und Li et al., J. Amer. Ceram. Soc., (1993) 75: 2094–2097.).
Wie hier verwendet, bezieht sich „auf Siliziumdioxid-Basis" auf den Einschluss eines Siliziumoxids in die Zusammensetzung des Glases. Andere Oxide können ebenfalls anwesend sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich „biologisch aktive Moleküle" auf jene organischen Moleküle, die eine Wirkung in einem biologischen System besitzen, egal ob ein solches System in vitro, in vivo oder in situ ist. Biologisch aktive Moleküle schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die folgenden Kategorien: Wachstumsfaktoren, vorzugsweise Knochenwachstumsfaktoren, Zytokine, Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Schmerzmittel und andere Arzneimittel. Der Begriff „Typ", so wie er im Folgenden in Bezug auf biologisch aktive Moleküle verwendet wird, bezieht sich auf biologisch aktive Moleküle der zuvor aufgelisteten Kategorien, ebenso wie auf spezifische Verbindungen, z. B. Vancomycin, TGF-β, etc. Diese spezifischen Verbindungen können in derselben oder in verschiedenen Kategorien sein.
Der Begriff „Matrix" schließt das feste Netzwerk der bioaktiven Glasstruktur selbst ebenso wie die Poren ein. Der Begriff „eingelagert in die Matrix" bedeutet, dass die Moleküle überall in dem Glasnetzwerk eingelagert sind.
Der Begriff „Knochendefekt" bezieht sich auf Regionen, die eine Reparatur benötigen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt; Brüche, Verschleißbereiche, Löcher, die von dem Entfernen von Schrauben und Nägeln herrühren, Austausche, periodontale Anwendungen und Zersetzung des Knochens auf Grund hohen Alters oder Krankheit.
Der Begriff „Implantat" bezieht sich auf ein Material zum Auffüllen von Knochendefekten, wie oben beschrieben. Das Implantat umfasst vorzugsweise ein Glas auf Siliziumdioxid-Basis, das weiterhin Calcium enthält. Das Implantat kann in Form von Körnchen, Scheiben, Blöcken oder Monolithen vorliegen, und es kann den Träger mit kontrollierter Freisetzung umfassen oder einfach mit dem Träger beschichtet sein. Das Implantat kann außerdem poröse Materialien zur Verwendung in der Knochenchirurgie, wie poröses Hydroxyapatit oder, wie in der WO 94/04657 beschrieben, poröses bioaktives Glas, umfassen. Der Begriff schließt auch Prothesenvorrichtungen ein, die erfindungsgemäß eine Beschichtung oder eine teilweise Beschichtung aufweisen können, aus Glas oder bioaktivem Glas mit biologisch aktiven Molekülen, die in die Matrix eingelagert sind. Beispiele solcher Prothesenvorrichtungen schließen Hüft- und Gelenksprothesen ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Das Implantat kann einen „Cocktail" umfassen, der eine Kombination von Materialien und/oder Freisetzungsgeschwindigkeiten liefert. Der Cocktail kann eine Gruppe von Körnchen verschiedener Größen, die alle denselben Typ von biologisch aktiven Molekülen enthalten, einschließen. Alternativ dazu können Körnchen, die verschiedene Typen von biologisch aktiven Molekülen enthalten, kombiniert werden. Die Körnchen in solch einem Cocktail können dieselbe Größe oder verschiedene Größen aufweisen, wodurch sie die Freisetzung von verschiedenen Molekülen mit verschiedenen Geschwindigkeiten erlauben. Beispielsweise kann ein Cocktail hergestellt werden, der Antibiotika, entzündungshemmende Mittel und Wachstumsfaktoren enthält.
Es ist ebenfalls vorgesehen, dass zwei oder mehrere Typen von biologisch aktiven Molekülen in jedem Implantatmaterial, so wie es hier definiert ist, enthalten sein können. Dies kann bewirkt werden durch gleichzeitiges Hinzufügen der Moleküle in die Lösung. Alternativ dazu können Implantate, die ein oder mehrere biologisch aktive Moleküle enthalten, hergestellt werden, und anschließend können diese Implantate selbst beschichtet werden mit oder eingelagert werden in eine Lösung, enthaltend eine oder mehrere verschiedene Typen von biologisch aktiven Molekülen und/oder bei verschiedenen Konzentrationen.
Der Begriff „Antibiotikum" schließt Bakterizide, Fungizide und infektionsverhindernde Arzneimittel ein, die im Wesentlichen wasserlöslich sind, wie beispielsweise Gentamycin, Vancomycin, Penicillin und Cephalosporine.
Der Begriff „Wachstumsfaktoren" schließt Wachstumsfaktoren ein, von denen bekannt ist, dass sie osteogene oder osteoinduktive Eigenschaften besitzen. Eingeschlossen in die vielen Faktoren, deren Kontrolle bei der Knochenbildung bekannt ist, sind Plättchenwachstumsfaktoren („platelet derived growth factors") (PDGF), „transforming growth factors" (TGF-β), insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), „fibroblast growth factors" (FGFs) und „bone morphogenetic proteins" (BMPs). Diese Wachstumsfaktoren kommen am Ort der Knochenbruchheilung in vivo vor, und sie werden zu der Zeit der Verletzung durch Lyse von Blutplättchen (PDGF und TGF-β) und durch die Resorption von Knochenmatrix (TGF-β und BMPs) gebildet. Die einzelnen Faktoren werden detaillierter weiter unten beschrieben.
Der Begriff „in Verbindung bringen" schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf das In-Kontakt-Bringen des Trägers mit einer Probe, für welche die Freisetzung der biologisch aktiven Moleküle beispielsweise durch Eintauchen, Implantation und Einbetten erzielt wird.
Die Identifizierung von osteogenen und osteokonduktiven Wachstumsfaktoren hat die Suche nach neuen Transplantatsubstanzen, die durch Gentechnikkonzepte erhalten werden, hervorgebracht. Der kontrollierte Transport dieser rekombinanten Moleküle ist jedoch wichtig. Wachstumsfaktoren mit bekannter Wirkung auf Knochengewebe müssen zu dem Ort in ausreichenden Mengen transportiert werden, um die Heilung zu stimulieren. Gläser, die mittels eines Sol-Gel-abgeleiteten Verfahrens bei Raumtemperatur synthetisiert werden, sind hervorragende Kandidatenmaterialien für die kontrollierte Freisetzung solcher osteoinduktiver Moleküle. Die Verarbeitung des Glases ermöglicht es, die Ultrastruktur des Glases zu kontrollieren, so dass die Zeit und die Menge der Freisetzung auf spezifische therapeutische Bedürfnisse zugeschnitten sind. Zusätzlich können diese Gläser osteokonduktiv sein, wodurch sie ein Substrat für Knochengewebsentwicklung liefern.
Die Wirkungen der Wachstumsfaktoren haben ihre biologischen Eigenschaften gezeigt, als sie äußerlich in in vitro und in vivo Versuchsmodellen zur Knochenentwicklung verwendet wurden. (Cornell et al., supra; und Mohan et al., supra.). Folglich ist jedes Material, das den dauerhaften Transport solcher Faktoren leisten kann, vorteilhaft. Obwohl die meisten der vorhergehenden Untersuchungen klar die osteogenen und osteoinduktiven Wirkungen dieser Proteine zeigten, werden die exakten biologischen Eigenschaften dieser Wachstumsfaktoren bezüglich des Grades der Knochenbildung stark durch die folgenden Faktoren beeinflusst: die Umgebungsbedingungen des Versuchsmodells, die Zeit, Verfahren und Dosis des Transports des Wachstumsfaktors, das hormonelle Milieu und die Synergie zwischen den verschiedenen Wachstumsfaktoren. Daher liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die Wirkungen dieser Wachstumsfaktoren aufklären kann.
Von einem Entwicklungsgesichtspunkt aus betrachtet, verläuft die Bildung von Knochen in einer Reihe von einzelnen Schritten. Zunächst gibt es eine proliferative Phase, die gefolgt wird von zellulärer Differenzierung und Ablagerung einer Kollagenmatrix, die in sich selbst die anschließende Expression von Knochenproteinen beeinflusst. (NIH/AAOS gesponserter Workshop, supra.). Einige Wissenschaftler betrachten die Synthese der kollagenen Matrix als eine Reihe von zeitlichen Ereignissen, in denen es eine anfängliche kollagene Phase gibt, die gefolgt wird von einem Anstieg in alkalischer Phosphataseaktivität und der Expression von Osteonektin, Knochensialoprotein und Osteocalcin. Die Osteopontinexpression und -synthesen wurde zeitlich weiter aufgegliedert hinsichtlich Sulfatierung, Phosphorylierung und molekularer Größe. Neben den oben aufgeführten Proteinen haben andere Untersuchungen gezeigt, dass mindestens zwei Formen von Chondroitinsulfatproteoglukan ebenfalls durch den Osteoblasten synthetisiert werden. Diese Parameter können alle durch Verfahren, die dem Stand der Technik bekannt sind, gemessen werden. Einige Wachstumsfaktoren werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
Die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs) (engl.: „insulin-like growth factor„) I und II werden durch Knochenzellen ebenso wie durch andere Gewebe im Körper gebildet. Sie wurden in der Knochenmatrix gefunden und werden vermutlich durch Knochenzellen sekretiert. (Canalis et al., Calcified Tissue Int. (1993) 53: S90–S93; und Canalis et al., J. Bone Miner. Res. (1993) 8: S237.). In vitro wurde für IGFs gezeigt, dass sie die Knochenkollagen- und Matrixsynthese steigern, die Osteoblastenvorläuferreplikation steigern und den Knochenkollagenabbau verzögern. (Hock et al., Endocrinology (1988) 122 (1) :254; und McCarthy et al., Endocrinology (1989) 124 (1): 301).
Es wird angenommen, dass das Wachstumshormon durch IGF die Stimulation des Knochenwachstums bewirkt, aber es wurde ebenfalls gezeigt, dass es örtliche Auswirkungen auf die mesenchymale Zellproliferation und -differenzierung besitzt. (Downes et al., J. Mater. Sci.: Mater. Med., (1991) 2: 176–180; und Silbermann, M.; Biomaterials, (1990) 11: 47–49.). Humanes Wachstumshormon hat zwei Molekulargewichtsspezies, eine mit 20.000 und die vorwiegende mit 22.000.
Der „platelet derived growth factor" (PDGF), ein Polypeptid mit ca. 30 kD Molekulargewicht existiert als ein Dimer, das aus zwei Untereinheiten A oder zwei Untereinheiten B oder als ein Heterodimer aus einer A- und einer B-Untereinheit zusammengesetzt ist, wodurch drei getrennte Formen von PDGF gebildet werden. Diese Untereinheiten sind die Produkte von zwei getrennten Genen. Während alle drei Formen in der Knochenmatrix vorkommen, wird nur PDGF AA in vitro von Knochenzellen gebildet und sekretiert. Von PDGF BB wurde gezeigt, dass es die aktivste der drei Formen ist. (Mohan et al., supra.).
Für PDGF wurde gezeigt, dass es knochenresorbierende Aktivität in vitro besitzt; eine Reihe von Wissenschaftlern haben von gesteigerter Knochenresorption als Antwort auf die Gabe von physiologischen Dosen von PDGF berichtet. (Tashjian et al., Endocrinology (1982) 111: 118–124.). Ferner wurde gezeigt, dass PDGF die Replikation von Osteovorläuferzellen steigert.
Der „transforming growth factor-beta" (TGF-β) ist eine Familie von Molekülen, die knochenfördernde Eigenschaften bei Knochenbrüchen haben könnte. TGF-β ist eine heterodimeres Peptid mit einem Molekulargewicht von 25 kD. Die häufigste Quelle dieses Moleküls sind Blutplättchen und Knochen. Dieses multifunktionale Peptid hat einen breiten Bereich von zellulären Aktivitäten einschließlich der Kontrolle der Proliferation und Expression des differenzierten Phänotyps von einigen Zelltypen, die knochenspezifisch sind, darunter mesenchymale Vorläuferzellen, Chondrozyten, Osteoblasten und Osteoklasten. (Beck et al., J. Bone Miner. Res. (1991) 6(9): 961; Joyce et al., Orthop Clin. North Am. (1990) 21(1): 199; Joyce et al., J. Cell Biol. (1990) 110(6): 2195.). Obwohl es in verschiedenen einzelnen Formen vorkommt, wurden zwei von diesen TGF-β1 und 2 aus Knochen in ungefähr einem 4 : 1 Verhältnis isoliert. In vivo Untersuchungen basierend auf sowohl immunhistochemischer Färbung als auch in situ Hybridisierung haben die Synthese von TGF-β sowohl durch Chondrozyten als auch durch Osteoblasten und die Anreicherung von TGF-β in Modellen für endochondrale Knochenbildung gezeigt. (Joyce et al., Orthop. Clin. North Am. (1990) 21(1): 199; und Joyce et al., J. Cell Biol. (1990) 110(6): 2195.). In einer Studie, in der TGF-β1 oder 2 durch tägliche Injektion in den Bereich unter die Knochenhaut in Oberschenkelknochen von neugeborenen Ratten (Joyce et al., J. Cell Biol. (1990) 110(6): 2195) eingeführt wurde, wurde gezeigt, dass mesenchymale Vorläuferzellen in der Knochenhaut durch TGF-β stimuliert wurden und in sehr ähnlicher Weise proliferierten und differenzierten, wie sie in der embryonalen Knochenbildung und der frühen Knochenbruchheilung beobachtet wird. Nach der Beendigung der Injektionen trat ebenfalls endochondrale Knochenbildung auf, was zum Austausch von Knorpel gegen Knochen führte.
Die Implantation einer „bone morphogenic protein„ (BMP)-Lösung führt zu einer Reihe von Entwicklungsvorgängen einschließlich Chemotaxis, Proliferation und Differenzierung, die zu der transienten Bildung von Knorpel und seines Austausches gegen lebendes Knochengewebe mit hämatopoetischem Mark führt. (Urist, M. R., Science (1965) 150: 893–899.). Einige neuentdeckte Faktoren, BMP-1 bis 7 und der osteoinduktive Faktor (OIF) wurden mit dem BMP-Vorgang in Verbindung gebracht. BMP-2 bis 7 sind alle Mitglieder der TGF-β Superfamilie von Molekülen und sind nahe verwandt zu zwei Faktoren Vg1 und DPP, die in einer Reihe von Entwicklungsvoängen während der Embryogenese involviert sind. Sowohl BMP-2A als auch BMP-7 wurden als rekombinante Proteine exprimiert, von beiden wurde gezeigt, dass sie eindeutig die gesamten Knorpel- und Knochenbildungsvorgänge induzieren, die mit vom Knochen abgeleiteten BMP-Lösungen beobachtet wurden. (Wozney, J. M., Prog. Growth Facfor Res. (1989) 1(4): 267.). Bis heute wurde für zwei BMPs: BMP-2A (Gerhart et al., Clin. Orthop. (1993) 317; Wozney et al., Science (1988) 242(4885): 1528; und Yasko et al., J. Bone Joint Surg. <Am> (Aug. 1992) 74(7): 1111 und J. Bone Joint Surg. <Am> (1992) 74(5): 659) und BMP-7 (Sampath et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(28): 20352) (auch als OP-1 bekannt) gezeigt, dass sie die Knochenbildung an Stellen außerhalb des Knochens steigern und die Knochenbruchheilung verstärken. (Gerhart et al., Clin. Orthop. (1993) 317.). Gereinigtes BMP wurde beim Nichtzusammenwachsen von Oberschenkel- und Schienbeinknochenbrüchen in unkontrollierten klinischen Studien verwendet. (Johnson et al., Clin. Orthop. (1988) 230: 257–265; Johnson et al., Clin. Orthop. (1988) 236: 249–257; und Johnson et al., Clin. Orthop. (1990) 234.).
Der gegenwärtige Wissensstand legt nahe, dass die örtlichen Wachstumsfaktoren, die am wahrscheinlichsten die Knochenbruchheilung signifikant steigern, PDGF, TGF-β und BMP-2 sind.
Die Aufrechterhaltung der Funktion der Wachstumsfaktoren nach der Einlagerung in die Gläser auf Siliziumdioxid-Basis kann unter Verwendung der zuvor genannten Techniken untersucht werden, um die Knochendifferenzierung zu bestimmen. Die Aufrechterhaltung der Funktion von Antibiotika kann sichergestellt werden durch Verwendung von Standard-Scheiben Aufnahmefähigkeitstests, so wie sie beschrieben sind in Antibiotics in Laboratory Medicine, 3. Aufl., V. Lorian, Hrsg., Kapitel 2, Williams und Wilkins, Baltimore, MD, 1991. Die Funktion von eingelagerten entzündungshemmenden Mitteln und Schmerzmitteln kann sichergestellt werden beispielsweise durch Untersuchungen hinsichtlich der Inhibition der Prostaglandinsynthese in Zellkultur.
Synthese eines Sol-Gel-abgeleiteten Glases
Es wurden reine Siliziumdioxid und Calcium enthaltende Gläser mit darin eingelagerten biologisch aktiven Molekülen synthetisiert. Kurz gesagt wurde ein Siliziumalkoxidvorläufer, vorzugsweise Tetramethylorthosilan (TMOS) in reiner Lösung mit entionisiertem Wasser vermischt und durch magnetische Mittel oder Ultraschallmittel gerührt. Das molare Verhältnis von Wasser zu TMOS beeinflusst die Porosität und den spezifischen Oberflächenbereich der Gele, die wiederum die Bioaktivität beeinflussen. Wenn beide ansteigen, tut dies auch die Bioaktivität. Um beide zu steigern, wird Wasser in Mengen, welche die Stöchiometrie übersteigen, zur Verfügung gestellt, oder in einem H₂O/TMOS-molaren Verhältnis, das von ca. 6 : 1 bis ca. 20 : 1 reicht. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das molare Verhältnis von H₂O/TMOS 10 : 1. Alkohol, vorzugsweise Methanol, kann in einem Alkohol/TMOS-molaren Verhältnis von ca. 0 : 1 bis ca. 1 : 1 hinzugefügt werden.
Essigsäure (0,1 N) oder HCl (0,1 N) kann als ein Katalysator für die Hydrolysereaktion verwendet werden, und wird hinzugefügt, um den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten, wie im Folgenden offenbart wird.
Calciummethoxyethoxid (20%ige Lösung in Methoxyethanol, Gelest Inc., Tullytown, PA) kann als eine Calciumalkoxidquelle verwendet werden. Calciummethoxyethoxid (CME) wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreichend ist, um einen prozentualen Anteil am Ende von bis zu 40 Gewichtsprozent Calciumoxid nach dem Trocknen des Gels zu erreichen. Triethylphosphat kann als eine Quelle für Phosphorpentoxid verwendet werden. Triethylphosphat (TEP) kann hinzugefügt werden, um eine Endkonzentration von Phosphorpentoxid, P₂O₅, von bis zu 10 Gewichtsprozent nach dem Trocknen zu erreichen. Die Gewichtsprozentangaben werden durchgängig berechnet auf der Basis der abgeschlossenen Reaktionen und vollständiger Trocknung. Das Wasser, TMOS und die Säure werden vermischt unter Verwendung von Ultraschall in einem Eisbad oder magnetischem Rühren oder einer Kombination von beiden. Wenn ein Calciumalkoxid anwesend ist, werden das TMOS, das Calciumalkoxid und zusätzliche Alkoxide, falls vorhanden, vorzugsweise unter nicht-wässrigen Bedingungen unter einer Argonatmosphäre gemischt unter Verwendung von entweder magnetischem Rühren oder Ultraschall für bis zu ca. einer Stunde.
Alternativ dazu kann ein Calciumsalz an Stelle eines Calciumalkoxids verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung eines Calciumsalzes die Gelierzeit verlängern kann, wodurch eine längere Zeit für die Einlagerung der biologisch aktiven Moleküle und begleitend dazu für eine gleichmäßige Verteilung der biologisch aktiven Moleküle benötigt wird. Eine verlängerte Gelierzeit ist auch für die Beschichtung der Implantatmaterialien mit dem Träger nützlich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Calciumsalz CaCl₂. Das Calciumsalz wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreichend ist für einen prozentualen Anteil am Ende von bis zu 40 Gewichtsprozent Calciumoxid nach dem Trocknen des Gels.
Weil die einzulagernden biologisch aktiven Moleküle ihre biologischen Aktivitäten nach der Behandlung in mäßig bis stark sauren Bedingungen beibehalten, wird eine Menge an Säure verwendet, die notwendig ist, um den Säuregrad in einem Bereich eines pH-Wertes von 1–4,5 vorzugsweise 1,5–3 vor oder nach der Einlagerung der biologisch aktiven Moleküle zu halten.
Die einzulagernden biologisch aktiven Moleküle werden geeigneterweise in Konzentrationen hinzugefügt, die zu Endkonzentrationen im Bereich von 0,0001 bis 10 Gewichtsprozent des Glases führen.
Es können Gläser mit Zusammensetzungen von Silizium im Bereich von 60–100% (des Gewichts) mit einem Rest anderer Oxiden hergestellt werden. Das flüssige Sol kann in einen Polystyrolbehälter gegossen werden. Das Sol wird gealtert und geliert in einem verschlossenen Behälter. Das Altern kann von ca. einem (1) Tag bis ca. vier (4) Wochen dauern. Das Trocknen kann für eine Zeit von etwa 1 bis etwa 14 Tagen durchgeführt werden.
Damit ein Sol-Gel-abgeleitetes Glas ein wirksamer Träger für biologisch aktive Moleküle ist, sollte das Verfahren bei niedrigen Temperaturen (ca. 2 bis 40°C) durchgeführt werden und im Falle von reinem Siliziumdioxidglas sollte die Acidität des Sols zwischen pH 1 und 4,5 liegen. Die Temperatur, der Sol-pH, der prozentuale Calciumgehalt, das molare Verhältnis von Wasser zu TMOS und andere Faktoren beeinflussen die Gelierzeit des Sols. Jedoch sollte die Gelierzeit des Sols, wenn biologisch aktive Moleküle eingelagert werden, genügend Zeit im flüssigen Zustand erlauben, um das Hinzufügen der Lösung aus einzulagernden biologisch aktiven Molekülen, das Gießen und die gleichmäßige Mischung des Sols zu ermöglichen. Das Gelieren tritt auf, wenn sich genügend Querverbindungen bzw. Vernetzungen gebildet haben, sodass das Netzwerk die Länge des Behälters überspannt. Eine grobe Beobachtung zeigt wenig bis keine Bewegung des gegossenen Materials nach Inversion.
Ein niedrigerer pH-Wert steigert die Gelierzeit. Ein höherer Calciumgehalt verringert die Gelierzeit. Eine längere Gelierzeit ist wünschenswert, um mehr der Sol-Gel-Reaktionen zu beenden, was zu einem Endmaterial mit weniger-Porosität und geringerer Porengröße führt. Weniger Porosität bedeutet außerdem ein mechanisch stärkeres Material mit längeren Proteinfreisetzungszeiten. Jedoch gibt es Situationen, in denen eine größere Porosität wünschenswert sein kann, beispielsweise zum Erreichen einer schnelleren Freisetzung von Molekülen oder einem schnelleren Abbau des Trägers. Größere Porengrößen erleichtern die Freisetzung von größeren Molekülen durch Diffusion.
Eine niedrigere Temperatur steigert ebenfalls die Gelierzeit. Um niedrigere Temperaturen zu erreichen, wird die Reaktion anschließend in einem eisgekühlten Wasserbad durchgeführt. Ein höherer Wassergehalt wird die Gelierzeit für die meisten Metallalkoxide verringern, obwohl die Porosität hoch bleiben kann, um die Wasserverdampfung aus dem Material zu steigern. Die Bedingungen werden so gewählt, dass das Gelieren optimal in einer Zeitspanne auftritt, die im Bereich von wenigstens ca. 30 Minuten bis ca. 48 Stunden für die Einlagerung der biologisch aktiven Moleküle liegt. Das Gelieren kann bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis 40°C durchgeführt werden.
Das Altern des Sol-Gels findet nach dem Gießen statt und wird durchgeführt, indem der Gießbehälter verschlossen bleibt. Die Sol-Gel-Reaktionen laufen während dieser Zeit ungehindert weiter. Das Altern kann bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis 40°C durchgeführt werden. Längere Alterungsszeiten (von bis zu einem Monat) führen zu einem mechanisch festeren Material, das weniger Sprünge bzw. Brüche aufweist als Materialien, die für kürzere Zeitspannen gealtert wurden. Altern bei einer geringeren Temperatur, wie 4°C, verlängert ebenfalls die Gelierzeit.
Die Trockentemperatur und -zeit können ebenfalls die Materialeigenschaften am Ende beeinflussen. Eine schnelle Trocknungsgeschwindigkeit kann zu Brüchen im Endmaterial führen. Das Endmaterial verliert ca. 50–80% seines Gewichts zwischen dem Gießen und dem abschließenden Trocknen auf Grund der Verdampfung von Wasser und Alkoholen, die als Nebenprodukte der Reaktion gebildet werden. Das Trocknen wird durchgeführt bei Temperaturen im Bereich von ca. 15°C bis 40°C, indem der Gießbehälter geöffnet wird; und es kann bei atmosphärischem Druck oder Drücken unterhalb des atmosphärischen Drucks durchgeführt werden.
Wie aus den 3, 7, 8 und 14 ersichtlich ist, sind die Freisetzungskinetiken der biologisch aktiven Moleküle in den frühen Phasen des Eintauchens, d. h. ca. vom ersten bis zum siebten Tag, höher als jene in den späten Phasen. Etwa sieben Tage nach dem Eintauchen wird eine wesentliche Veränderung in der Steigung der Kurven beobachtet, was eine wesentliche Änderung in der Freisetzungsrate bzw. – geschwindigkeit bedeutet. Die frühe höhere Freisetzung ist kein plötzlicher Effekt, wie zuvor durch verschiedene Autoren (oben zitiert) berichtet wurde. Diese höhere frühe Freisetzung ist vorteilhaft, wenn eine duale Behandlungsabfolge durchgeführt wird – eine akute Behandlung bei einer hohen Dosis gefolgt von einer „chronischen" niedrigeren Dosis. In Fällen, in denen eine gleichbleibende Freisetzung gleich von Beginn der medizinischen Behandlung an gewünscht wird, d. h. eine Freisetzung ohne wesentliche Änderungen in der Rate bzw. Geschwindigkeit, können die Sol-Gel-Träger durch Eintauchen zur Zeit der Herstellung behandelt werden, so dass die anfängliche höhere Freisetzungsphase vor der aktuellen Verwendung beim Patienten stattgefunden hat.
Beispiel 1
Synthese eines Sol-Gel/Vancomycin-Composits
Ein Sol-Gel-abgeleitetes Siliziumdioxid-Basis-Matrix-Vancomycin-Composit wurde unter Verwendung eines Verfahrens bei Raumtemperatur, geringer Acidität und niedriger Alkoholkonzentration synthetisiert. Vancomycin wurde als das freizusetzende Arzneimittel ausgewählt wegen seiner bewiesenen Wirksamkeit gegenüber Gram-positiven Kokken, insbesondere Staphylokokken, welche eine Hauptursache für Knochenmarksentzündungen darstellen. Vancomycin ist ein wasserlösliches (bis zu 100 mg/ml) tricyclisches Glyceropeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 3.300.
Das Material wurde wie folgt hergestellt: 19,6 ml Tetramethylorthosilicat (TMOS, Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.), 14,2 ml Wasser, 5,2 ml Methanol und 0,01 ml einer 1 N HCl wurden in einem Glasbecher in einem Eisbad für 30 Minuten mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurden 4 ml des Sols in 23 mm-Durchmesser-Polystyrolgefäße (Sarstedt, Princeton, NJ) gegossen, und 1 ml einer 10 mg/ml Vancomycin-HCl (Lederle, Carolina, Puerto Rico) wurde zu den Solen in den Gefäßen hinzuge fügt, und die Proben wurden gemischt. Dieselbe Menge an Wasser, d. h. 1 ml wurde zu den Kontrollproben hinzugefügt. Das Gesamt-H₂O/TMOS-Verhältnis betrug 10 : 1. Das Methanol/TMOS-Verhältnis betrug 1 : 1. Die Menge des eingelagerten Vancomycins gegenüber dem Probengewicht betrug ca. 1%. Die Gefäße wurden mit luftdichten Kappen verschlossen, gelierten, alterten und wurden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Gelierzeit variierte zwischen 15 und 25 Stunden. Das Hinzufügen der Vancomycinlösungen änderte die Gelierzeit nicht signifikant.
Nach 2 Wochen Altern in den verschlossenen Behältern wurden die Sole zum Trocknen Luft ausgesetzt. Während des Trocknens führte das Verdampfen von Flüssigkeit aus dem Gelporennetzwerk zu einem Gewichtsverlust und zum Schrumpfen der Gele. Der Gewichtsverlust dauerte für 2 Wochen an. Das Trocknen wurde als abgeschlossen betrachtet, sobald der Gewichtsverlust 75–78% erreicht hatte. Der signifikante Gewichtsverlust und das Schrumpfen führten nicht zu sichtbaren Brüchen. Die resultierenden Produkte waren durchsichtige Monolithe in einer Größe von 11 mm Durchmesser und 8 mm hohen Zylindern mit einem Gewicht von 1,1 Gramm. Die Dichte des getrockneten Gelmaterials entsprach 1,5 g/cm³. Da 10 mg Vancomycin in jede der Scheiben eingelagert war, betrug der Vancomycingehalt in dem Material 0,91%. Es besteht kein Grund zu der Annahme, dass sich andere wasserlösliche Antibiotika unterschiedlich verhalten.
Beispiel 2
Vancomycin-Freisetzungsuntersuchung
Für die in vitro Vancomycin-Elutionsuntersuchung wurde ein Teil der Monolithe zerdrückt, gemahlen und gesiebt, um entweder kleine Körnchen in einem Größenbereich von ca. 500–700 μm oder größere Körnchen von ca. 5 × 5 × 2 mm zu erhalten. Die restlichen Monolithe wurden als Scheiben untersucht.
Das synthetisierte Vancomycin-Composit wurde in eine simulierte physiologische Lösung (SPS) mit einem lonengehalt ähnlich dem von Plasma, wie zuvor beschrieben, eingetaucht. Um den Effekt des Verhältnisses von Probenoberflächenbereich zu Volumen (SA/V) (engl.: „surface area to volume„) zu bestimmen, war das für die Eintauchversuche verwendete Material wie folgt geformt: kleine Körnchen von 500–700 μm (SA/V ca. 10 mm^–1), große Körnchen, 5 × 5 × 2 mm (SA/V = 1,5 mm^–1), Scheiben 11 mm Durchmesser × 4 mm (SA/V = 0,85 mm^–1) und Halbzylinder 5,5 mm × 4 mm (SA/V = 1,2 mm^–1).
Alle Proben wurden bei demselben Vancomycingehalt im Proben/Lösungsverhältnis gleich 1 mg Vancomycin pro 1 ml eingetaucht. Die eingetauchten Proben wurden bei 37°C für Zeitspannen im Bereich von ca. 1 Stunde bis ca. 3 Wochen inkubiert. Die Lösungen wurden zu den folgenden Zeiten komplett ausgetauscht: 1 Stunde und 1, 3, 7, 14 und 21 Tage.
Die freigesetzten Vancomycinkonzentrationen wurden gemessen unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenz-Polarisations-Immunassay Systems (TDxR-System, Abbott Diagnostics, Irving, TX). Die Ergebnisse des Vancomycinfreisetzungsversuchs sind in 3 dargestellt und in der folgenden Tabelle I zusammengefasst. In 3 stellen die ungefüllten Kreise die kleinen Körnchen dar. Ungefüllte Dreiecke stellen die großen Körnchen dar. Ungefüllte Quadrate stellen die Scheiben mit 11 mm Durchmesser dar. Ungefüllte umgedrehte Dreiecke stellen die Scheiben mit 5,5 mm Durchmesser dar.
Tabelle I
Wie durch die vorangegangenen Daten gezeigt, wird die Vancomycinfreisetzungsrate durch die Materialform beeinflusst, d. h. dem Verhältnis von Materialoberflächenbereich zu Volumen. Insbesondere war die Vancomycinfreisetzung aus den kleinen Körnchen sehr schnell, und das meiste des eingelagerten Vancomycins wurde während des ersten Tages des Eintauchens freigesetzt. Dem gegenüber zeigten die großen Körnchen (SA/V = 1,5 mm^–1) und die Scheiben (SA/V = 1,1 oder 0,8 mm^–1) eine kontinuierliche Vancomycinfreisetzung, die nach einer Stunde begann, allmählich auf ein Maximum anstieg, dann langsam abfiel und bis zu 3 Wochen später endete. Die maximale Vancomycinfreisetzung wurde während der Eintauchzeit zwischen drei Tagen und einer Woche gemessen.
Diese Befunde zeigen, dass das SA/V-Verhältnis die Freisetzung von Materialien beeinflussen kann. Die Kombination von Materialien mit unterschiedlicher Form, d. h. unterschiedlichem SA/V-Verhältnis, kann eine kontrollierte Vancomycinfreisetzung erlauben, die beim Eintauchen beginnt und für bis zu einem Monat andauert.
Beispiel 3
Auswirkung der Vancomycinkonzentration
Sol-Gel-abgeleitete Siliziumdioxid-Basis-Matrix-Vancomycin-Composits mit unterschiedlichem Vancomycingehalt wurden synthetisiert. Die Sole wurden hergestellt wie oben in Beispiel 1 offenbart. Anschließend wurden 1,2 ml des Sols in 23 mm-Durchmesser-Polystyrolgefäße gegossen. Die gegossenen Sole wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, und es wurden 0,3 ml von Lösungen mit verschiedenen Vancomycinkonzentrationen zu den gegossenen Solen beider Gruppen hinzugefügt, um das gleiche H₂O/TMOS-molare Verhältnis von 10 : 1 zu wahren. Die Mengen des eingelagerten Vancomycins betrugen 10 bzw. 20 mg für die Gruppen 1 bzw. 2. Der prozentuale Anteil von Vancomycin gegenüber dem Probengewicht betrug 2,8 bzw. 5,5%. Die Sole wurden geliert, gealtert und bis ca. 75% Gewichtsverlust getrocknet.
Ultrastrukturparameter der Sole wie spezifischer Oberflächenbereich (SSA) (engl.: „specific surface area„), durchschnittliche Porengröße (PS) (engl.: „average pore size„) und Porenvolumen (PV) der getrockneten Sole wurden bestimmt unter Verwendung der Monolayer-Gas-Absorptionstechnik (multipoint B.E.T., Quantachrome). Die gemessenen Werte waren wie folgt:
SSA, m²/g 545
PS, nm 1,8
PV, cc/g 0,45
Die erhaltenen Sol-Gel-abgeleiteten Scheiben, 11 mm Durchmesser × 2 mm, mit einem SA/V-Verhältnis gleich 1 mm^–1 wurden in eine Vancomycinfreisetzungsuntersuchung, wie sie in Beispiel 2 offenbart ist, einbezogen. Die Scheiben wurden in 5 ml SPS eingetaucht. Das Verhältnis des Vancomycingehalts in der Probe (Gesamtgewicht an Vancomycin) gegenüber dem Lösungsvolumen (Wv/V) betrug 2 bzw. 4 für die Gruppen 1 bzw. 2. Die Konzentrationen an freigesetztem Vancomycin wurden gemessen wie oben in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in 4 gezeigt. In 4 bedeuten ausgefüllte Balken Vancomycin bei 10 mg Einlagerung. Gestreifte Balken bedeuten Vancomycin bei 20 mg Einlagerung.
Die Daten zeigen, dass die Menge an freigesetztem Vancomycin mit der Menge des eingelagerten Arzneistoffs ansteigt. Damit scheint die freigesetzte Menge eine Funktion der eingelagerten Menge (bei anfangs gleichbleibenden Bedingungen) zu sein. Jedoch scheint das Profil der Arzneistofffreisetzung über die Zeit für verschiedene Konzentrationen gleich zu sein. Insbesondere begann die Arzneistofffreisetzung unmittelbar nach dem Eintauchen, erreichte ein Maximum nach 3 Tagen und fiel anschließend allmählich ab.
Beispiel 4
In vitro Bakterieninhibierungs-Test
Die SPS-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen von Vancomycin, das freigesetzt wurde aus der Sol-Gel-abgeleiteten Matrix auf Siliziumdioxid-Basis aus den Experimenten, die in den Bespielen 2 und 3 beschrieben sind, wurden hinsichtlich der Empfindlichkeit von Staphylococcus aureus-Bakterien gegenüber dem freigesetzten Arzneistoff untersucht. Die Standardtechnik des Scheibensusceptibilitätstests wurde angewendet (Siehe Lorian, supra.). Die Proben SPS-Lösungen mit Vancomycin, das während des Eintauchens freigesetzt wurde, wurden untersucht und mit Standardlösungen von Vancomycin in SPS mit Konzentrationen im Bereich von 100–10.000 μg/ml verglichen. Die Konzentrationen der Proben SPS-Lösungen mit Vancomycin, das während des Eintauchens freigesetzt wurde, wurden gemessen unter Verwendung des zuvor beschriebenen Fluoreszenz-Polarisationsimmunassays. Einzelne 20 μl Allquote jeder Lösung (entweder Standard oder Probe) wurden auf Filterpapierscheiben mit ½ inch (Nr. 740-E, Schleicher & Schnell, Keene, NH) aufgetragen. Die mit Arzneistofflösung getränkten Scheiben wurden anschließend getrocknet und in einem Exsikkator bei 4°C gelagert. Eine Blutagarplatte, die mit Staphylococcus aureus (ATCC 25923) inokuliert worden war, wurde vom Microbiology Laboratory, Hospital of the University of Pennsylvania, erhalten. Es wurde eine 1,5 × 10⁸ CFU/ml-Suspension der Bakterien in 0,45% Salzlösung hergestellt, was einem „McFarland-Equivalence Turbidity-Standard" von 0,5 (Remel, Lienexa, KA) entsprach. Müller-Hinton-Agarplatten, 15 × 100 mm (Modell 01-620, Remel, Lienexa, KA) wurden mit 10 μl der Staphylococcus aureus-Suspension durch Ausstreichen mit einem sterilen Stäbchen bzw. Tupfer inokuliert, der in der Lösung getränkt worden war, über die gesamte Agaroberfläche, um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulats zu erlauben (Standard-Inokulationsverfahren). Eine Vancomycin-imprägnierte Scheibe wurde in die Mitte jeder Agarplatte gesetzt. Die Agarplatten wurden anschließend in einer Umgebung mit angefeuchteter Luft in einem Einzelkammerwassermantel-Inkubator (Modell 3159, Forma Scientific, Marrietta, OH) bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Die Bereiche der Bakterieninhibition wurden unter Verwendung eines Messschiebers mit der Genauigkeit von 0,1 mm gemessen. Die Daten sind in den 5 und 6 gezeigt.
Die gemessenen Größen der Inhibitionsbereiche sind gegenüber der Vancomycinkonzentration in einem logarithmischen Maßstab des aus Sol-Gel freigesetzten Vancomycins, wie in Beispiel 3 offenbart, aufgetragen und in 5 dargestellt. In 5 stellen die nicht ausgefüllten Kreise Vancomycin gelöst in SPS dar. Ausgefüllte Kreise bedeuten Vancomycin, das aus dem Sol-Gel-Träger freigesetzt wurde.
Die Scheiben, die mit 30 μg Vancomycin getränkt worden waren, entweder gelöst in SPS oder freigesetzt aus der Matrix auf Siliziumdioxid-Basis, zeigten eine Bereichsgröße größer als 12 mm. Gemäß den Standards zur Interpretation von Bereichsdurchmessern (Lorian, supra, Tab. 2.1.) zeigt ein Bereich dieser Größe, dass Bakterien empfindlich gegenüber dem Material sind, und der Messpunkt bzw. Haltepunkt der äquivalenten minimalen inhibitorischen Konzentration ist geringer als 4 μg/ml. Das Verhältnis von Konzentration zum Bereich der Inhibition für die Probenlösungen von Vancomycin, das aus der Matrix auf Siliziumdioxid-Basis freigesetzt wurde, zeigte eine gute Korrelation zu jener der Standardlösungen.
6 zeigt Größen der Bereiche der Bakterieninhibition gegenüber Eintauchzeit und Konzentration von Vancomycin, das in die Sol-Gel-abgeleitete Siliziumdioxidmatrix eingelagert ist. Nicht ausgefüllte Balken stellen Vancomycin bei 1 mg dar. Ausgefüllte Balken stellen Vancomycin bei 10 mg dar. Quergestreifte Balken stellen Vancomycin bei 20 mg dar. Die Daten zeigen, dass Vancomycin, das aus der Sol-Gel-Matrix freigesetzt wurde, wirksam ist bei der Inhibition des Bakterienwachstums für bis zu drei (3) Wochen (bei 20 mg). Die gemessenen Größen der Inhibitionsbereiche scheinen mit der Konzentration von eingelagertem Vancomycin anzusteigen, was größere Mengen an freigesetztem Vancomycin widerspiegelt.
Die vorgenannten Versuche zeigen das Folgende: die Einlagerung von Vancomycin in die Matrix auf Siliziumdioxid-Basis unter Verwendung der Sol-Gel-Technologie liefert eine kontrollierte Arzneistofffreisetzung über die Zeit, die beim Eintauchen (und somit bei der Implantation) beginnt und für wenigstens drei Wochen andauert; und die verwendete Raumtemperatur, die geringe Acidität, die geringe Alkoholkonzentration, das Sol-Gel-Verfahren änderten die Vancomycineigenschaften nicht, da Vancomycin, das aus dem Sol-Gel-abgeleiteten Material freigesetzt wurde, ebenso wirksam ist bei der Inhibition von Bakterien wie Vancomycinlösungen, die nicht aus einem Sol-Gel-Träger erhalten wurden.
Beispiel 5
Sythese eines Sol-Gel/Trypsin-Inhibitor-Composits
Von Sol-Gel abgeleitete Glasscheiben mit in ihrer Matrix eingelagertem Trypsininhibitor wurden erfolgreich synthetisiert. Trypsininhibitor (SIGMA) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 21 kD. Das Sol-Gel/Protein-Composit enthält 1–10 mg Trypsininhibitor (TI) pro 150–200 mg-Scheibe. Die Proteinelution war messbar in Proben mit 2 mg oder mehr Protein pro Scheibe.
Das Verfahren, das zur Synthese von 1 g (als Trockengewicht) des Sol-Gel-abgeleiteten Glases verwendet wurde, war wie folgt: 2,48 ml TMOS (Aldrich, St. Louis, MO) wurde mit 2 ml DI Wasser und 0,68 ml Methanol in ein 30 ml-Becherglas gegeben und für 5 Minuten unter Verwendung eines Magnetrührers gemischt. Dies führte zu einem H₂O/TMOS-molaren Verhältnis von 10 : 1 und einem Methanol/TMOS-molaren Verhältnis von 1 : 1. Anschließend wurden 0,01 ml einer 1 N HCl hinzugefügt, um die Sol-Gel-Reaktion zu katalysieren. Dies führte zu einer klaren einphasigen Lösung, die für 15 Minuten gerührt wurde. Das Sol wurde in 0,8 ml-Portionen in Polystyrolbehälter gegossen, und die Trypsininhibitorlösung wurde in einem Volumen von 0,2 ml einer 0,1 N Essigsäurelösung mit einer Proteinkonzentration im Bereich von 1–10 mg/ml hinzugefügt. Die Lösung wurde durch Vortexen gemischt, und die Behälter wurden mit einer Kappe versehen. Das Gelieren fand innerhalb von 1–4 Tagen nach dem Gießen statt. Das mit einer Kappe verschlossene Sol gelierte. und alterte für Zeiten im Bereich zwischen 1 Tag und 2 Wochen, in Abhängigkeit von der gewünschten Porosität bei Raumtemperatur. Nach dem Altern wurde das Sol-Gel bei entweder Raumtemperatur oder 37°C durch Entfernen der Kappe auf dem Gießbehälter getrocknet. Falls sich Flüssigkeit gebildet hatte, wurde sie von dem Feststoff abgegossen. Eine höhere Trocknungstemperatur steigerte die Porosität und die Geschwindigkeit des Schrumpfens. Nach dem Trocknen hatte der resultierende Feststoff 60–70% seines Originalgewichts auf Grund der Verdunstung von Wasser und Alkohol (Methanol ist ein Nebenprodukt der Sol-Gel-Reaktionen) verloren.
Das resultierende feste Material war ein poröses dreidimensionales Netzwerk/Polymer aus Siliziumdioxid, das eingelagerte Biomoleküle in einer Weise der kontrollierten Freisetzung freisetzte. Die verschiedenen Verfahrensparameter sind in Tabelle II gezeigt. Die Probenbezeichnungen weisen die Formel SxxxCxxPxx (Gießdatum) auf, wobei „Sxxx" die berechneten % Siliziumdioxid, „Cxx" die berechneten % Calciumoxid und „Pxx" die berechneten % Phosphorpentoxid sind. Das Gießdatum ist dargestellt als „ die letzten beiden Ziffern des Jahres.Monat.Tag". Der Gehalt an Trypsininhibitor und die Form der Probe sind in der Basis-Formel TI = X – [Probenform] angegeben, wobei „X" die Menge an Trypsininhibitor in mg/Probe bedeutet. Der Einfluss des pH-Wertes auf die Gelierzeit geht aus Tabelle II hervor.
Tabelle II
Beispiel 6
Freisetzung von Trypsininhibitor
Die anfänglichen Versuche zur Freisetzungskinetik wurden durchgeführt durch Eintauchen der Sol-Gel/Proteinzusammensetzung (100 mg Sol-Gel/1 mg Protein pro Probe) in entionisiertem Wasser in Behältern, die mit Siliziumdioxid behandelt waren, um die Proteinbindung zu reduzieren. Der Proteingehalt in Wasser wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Das Wasser wurde nach jedem Zeitraum gegen frisches ausgetauscht. Die gesammelte Flüssigkeit, die mit der Sol-Gel/Proteinzusammensetzung in Kontakt gekommen war, wurde hinsichtlich des Proteingehalts unter Verwendung des Kolloidal-Gold/spektrophotometrischen Verfahrens (Integrated Separation Systems, Natick, MA, Stoscheck et al., Anal. Biochem., (1987) 160: 301–305) mit einer Sensitivität nach unten bis zu 0,5 μg/ml analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III gezeigt.
Die Zahlen in der Tabelle stellen die Proteinfreisetzung in μg des Trypsininhibitors nach dem Eintauchen in entionisiertem Wasser (DI Wasser) dar. Die Ergebnisse für jeden Zeitpunkt sind zusammen mit der gesamten Proteinfreisetzung angegeben.
Tabelle III
Die Kinetiken der Proteinfreisetzung der Proben und die in Tabelle II aufgeführten Ergebnisse sind in 7b gezeigt. Die Proteinfreisetzung wurde für einen Zeitraum von vier Wochen gemessen. „TI2" (nicht gefüllte Quadrate) stellt TI = 2 aus der Tabelle dar. „TI3" (nicht gefüllte Kreise) stellt TI = 3 aus der Tabelle dar. „TI5" (gefüllte Quadrate) stellt TI = 5 dar und „TI7,5" (gefüllte Kreise) stellt TI = 7,5 dar. „TI10" (gefülltes Quadrat in nicht gefülltem Quadrat) stellt TI = 10 Probe S100 (94.4.18) dar. Alle Proben lagen in Form von Körnchen mit einem Durchmesser von weniger 2 mm vor.
Wie aus 7a entnommen werden kann, wurde Trypsininhibitor ständig aus allen Proben für einen Zeitraum von wenigstens sieben (7) Wochen freigesetzt.
Beispiel 7
Bioaktivität von reinem Siliziumdioxidglas
Ein Sol-Gel-abgeleitetes Glas mit einer Zusammensetzung aus 100% Siliziumdioxid und Wasser/TMOS im molaren Verhältnis von 15 : 1 wurde synthetisiert, und seine Bioaktivität wurde in vitro in SPS durch Messen von Veränderungen in der Calciumionenkonzentration untersucht. Eine 5 g-Probe wurde hergestellt durch Mischen von 12,38 ml TMOS mit 8,87 ml DI Wasser und Behandeln mit Ultraschall für 5 Minuten in einem eisgekühlten Bad. Zu dieser Mischung wurden 8,87 ml einer 0,1 N Essigsäure hinzugefügt, und die Mischung wurde mit Ultraschall für weitere 15 Minuten behandelt. Anschließend wurden 4,43 ml Natriumphosphat (0,01 M, pH 7) Puffer hinzugefügt, und die Mischung wurde für eine Minute mit Ultraschall behandelt. Das flüssige Sol wurde als 3 ml-Proben gegossen. Der pH des Sols beim Gießen betrug 4,5. Die Gelierzeit betrug ca. zwei Stunden. Das Altern der Proben wurde bei Raumtemperatur für einen Tag durchgeführt. Die Proben wurden für 3 Tage bei 37°C getrocknet und wogen ca. 500 mg.
Anschließend wurden Proben in Form von Scheiben mit ca. 1 cm im Durchmesser und 4 mm in der Höhe (1,76 cm² SA) in SPS (17,6 ml) eingetaucht, mit einem Verhältnis von Oberflächenbereich der Probe zu Eintauchlösungsvolumen von 0,1 cm^–1. Die Proben wurden für zwei Wochen bei ständigem Rühren bei 37°C eingetaucht. Die SPS-Konzentration von Calcium betrug im Durchschnitt 100 ppm. Nach zwei Wochen des Eintauchens der Proben betrug die Calciumkonzentration in dem verwendeten SPS im Durchschnitt 25 ppm. Dies bedeutet, dass Calcium durch das Glas aus der Lösung aufgenommen wurde, am wahrscheinlichsten durch Bildung einer Calciumphosphatschicht auf seiner Oberfläche.
Beispiel 8
Bioaktivität von Glas auf Siliziumdioxid-Basis, das andere Oxide enthält
Sol-Gel-Proben mit einer Zusammensetzung aus 65 Gew.-% SiO₂, 30 Gew.-% CaO und 5 Gew.-% P₂O₅ wurden hergestellt durch Mischen von 1,61 ml TMOS, 5,04 ml 20% Calciummethoxyethoxidlösung in Methoxyethanol und 0,12 ml Triethyphosphat und Rühren auf einem Magnetrührer für 5 Minuten bei 4°C. Zu dieser Mischung wurde 1 ml 0,1 N HCl hinzugefügt, um die Bedingungen zum Einlagern von Proteinen nachzuahmen und für eine weitere Minute gerührt, bei einem Wasser/TMOS-molaren Verhältnis von 5,13. Vier 1 ml-Proben wurden gegossen, und das Sol gelierte in ca. 5 Minuten. Diese Proben wurden für 3 Tage gealtert und anschließend für 4 Tage bei Raumtemperatur getrocknet. Die Proben wogen nach dem Trocknen ca. 600 mg.
Die Sol-Gel-Proben wurden anschließend in 12 ml SPS eingetaucht, um die Bildung der Calciumphosphatoberflächeschicht zu untersuchen. Die Proben wurden herausgenommen, nachdem sie für 5 Tage in SPS unter konstantem Rühren bei 37°C eingetaucht waren. Die Proben wurden unter Verwendung von Raster-Elektronenmikroskopie (SEM) (engl.: „scanning-electron microscopy„) betrachtet, und eine Oberflächenanalyse wurde unter Verwendung von Energie-Streuungs-Röntgenstrahlanalyse (EDXA) (engl.: „energy dispersive x-ray analysis„) durchgeführt. Die Oberfläche der Proben enthielt Blasen mit 1–3 μm im Durchmesser (1), die, wenn sie mit EDXA (2) untersucht wurden, große Anteile von Calcium und Phosphat enthielten. Dies zeigt die Bildung von Calciumphosphatkernstellen als ein Vorläufer der Bildung einer Calciumphosphatschicht.
Beispiel 9
Synthese eines Sol-Gel/TGF-β-Composits
Rekombinanter humaner Wachstumsfaktor beta (TGF-β1) wurde in reines Sol-Gel-Glas aus Siliziumdioxid eingelagert. Das Sol-Gel wurde synthetisiert durch Mischen von 5 ml TMOS mit 5,4 ml Wasser und Methanol mit einem Wasser/TMOS/Methanol-molaren Verhältnis von 9 : 1 : 1 und auf einem Magnetrührer für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. 10 μl einer 1 N HCl wurden zu der Mischung hinzugefügt, und das Sol wurde für 30 Minuten gerührt. Anschließend wurden 0,9 ml des Sols in einen Polystyrolbehälter gegossen und 0,1 ml einer TGF-β-Lösung mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) (engl.: „bovine serum albumin„), um unspezifische Bindung des Wachstumsfaktors an den Gießbehälter zu verhindern, wurden hinzugefügt. Unterschiedliche Mengen an TGF-β wurden zu jeder gegossenen Probe im Bereich von 0,5 μg bis 2 μg an TGF-β für jede Lösung, der 1 BSA hinzugefügt worden war, hinzugefügt. Die Proben wurden für 3 Tage bei 37°C gealtert und bei 37°C getrocknet, bis sie ca. 50% ihres Gewichts, „wie gegossen", verloren hatten.
Beispiel 10
TGF-β-Freisetzung
Sol-Gel-abgeleitetes Glas auf Siliziumdioxid-Basis wurde synthetisiert durch Mischen und Rühren von TMOS, DI Wasser und 1 N HCl in einem molaren Verhältnis von 1 : 10 : 0,001. Anschließend wurden 0,9 ml des Sols in Polystyrengefäße mit 15 mm Durchmesser gegossen, und 0,1 ml einer Lösung enthaltend entweder 0,5 oder 1 μg TGF-β1 wurden zu den Solproben hinzugefügt. TGF-β1 (Celtrix Lab., Inc.) wurde entsprechend den mitgelieferten Anweisungen hergestellt. In Kürze, es wurden Allquote aus einer 2,347 μl/ml-TGF-β1-Stocklösung in 10 mM HCl resuspendiert, gefolgt von Lyophilisieren in 1% Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma Chemical Co.). Die erhaltenen TGF-β1-Lösungen wurden in 1,5 ml-Mikrozentrifugengefäßen (USA Scientific) bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Der pH der Sole zum Zeitpunkt des Gießens wurde gemessen und betrug 1,7. Die Gefäße wurden verschlossen, und die Sole gelierten (15 Stunden) und alterten (24 Stunden) in einem Inkubator bei 37°C. Anschließend wurden die Gele bis entweder 50 oder 70% Gewichtsverlust getrocknet, was zu durchsichtigen Glasscheiben mit ca. 10 mm im Durchmesser führte. Ein Teil der Proben in jeder Gruppe wurden zerdrückt, um Körnchen in einer Größe im Bereich von ca. 500 bis ca. 1.000 μm zu erhalten. Insgesamt vier Ansätze von Siliziumdioxidglas/TGF-β1-Zusammensetzungen wurden wie folgt hergestellt: 1 μg-Dosis: Scheiben und Körnchen wurden bis 50% Gewichtsverlust getrocknet und Körnchen, die bis 70% Gewichtsverlust getrocknet wurden; 0,5 μg-Dosis: Körnchen, die bis 50% Gewichtsverlust getrocknet wurden. Zusätzlich wurden sechs Siliziumdioxidglasscheiben, enthaltend 0,5 μg TGF-β1 und zwei Kontrollen (ohne TGF-β1) hergestellt und bis 57% Gewichtsverlust getrocknet. Die Scheiben besaßen gleichmäßige Ausmaße mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10,17 mm und einer durchschnittlichen Höhe von 4,93 mm.
Die Freisetzung von TGF-β1 aus den Sol-Gel-abgeleiteten Siliziumdioxidglaskörnchen und -scheiben wurde durch Eintauchen in 1 ml einer sterilen phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) (engl.: „phosphate buffered saline„), enthaltend 1% BSA, gemessen. Vor dem Eintauchen wurden alle Proben durch UV-Bestrahlung sterilisiert. Das BSA verhindert die unspezifische Bindung von TGF-β1 an den Eintauchbehälter. Die Konzentrationen wurden bestimmt unter Verwendung des enzymgekoppelten Immunabsorptionsassays (ELISA) (engl.: „enzyme linked immunoabsorbent assay).
Die Menge an aktivem TGF-β1, das aus den Sol-Gel-Materialien freigesetzt wurde, wurde bewertet unter Verwendung des Mv1Lu-Nerz-Lungenepithel-Zellinhibitionsassays (engl.: „Mv1Lu mink lung epithelial cell inhibition assay„). Dieser Assay bestimmt die TGF-β1-Aktivität basierend auf seiner Inhibition der Mv1Lu-Zellproliferation durch Messung der [³H]-Thymidin-Einlagerung. Jennings et al., „Comparison of the biological activities of TGF beta 1 and TGF beta2: Differential activity in endothelial cells", J. Cell Physiol. 137: 167–172 (1988). Konfluente Mv1Lu-Zellen (ATCC) wurden aus Gewebekulturflaschen unter Verwendung von Zelltrennungslösung (engl.: „Cell Dissociation Solution„) (Speciality Media) gelöst und in Corning-24-Well-Polystyrol-Gewebekulturschalen ausgebracht. Die Zellen wurden in einer Dichte von 4,0 × 10⁴ Zellen/Well in 1 ml von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das mit 1% fötalem Kälberserum (engl.: „fetal bovine serum„) (FBS) (Hyclone) und 50 μg von je Penicillin und Streptomycin (Sigma Cell Culture) angereichert worden war, ausgebracht. Die Schalen wurden bei 37°C und 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert, um das Anwachsen der Zellen auf dem Boden der Wells zu erlauben.
Nach der Inkubation wurden die Wells belüftet und mit Medien, enthaltend TGF-β1 mit bekannten pikomolaren (pM) Konzentrationen, behandelt, wobei lyophilisiertes 1% BSA in 10 mM HCl als die Kontrolle diente. Die Konzentrationen reichten von 0,1 pM bis 10,0 pM und wurden dreifach hinzugefügt. Allquote von Probeösungen, d. h. enthaltend TGF-β1, das aus Siliziumdioxidglas nach dem Eintauchen freigesetzt wurde, wurden im selben Konzentrationsbereich verdünnt und den Zellen ebenfalls hinzugefügt. Die Schalen wurden für weitere 24 Stunden inkubiert.
Nach der Behandlung mit TGF-β1-Standard- und Probenlösung, wurden die Wells belüftet und die Zellen für 2 Stunden mit 1 μCi/ml [³H]-Thymidin (NEN Research Products) in 1 ml des Zellkulturmediums markiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die relativen Mengen der in die zelluläre DNA eingelagerten Radioaktivität bestimmt. Jedes Well wurde mit 1 ml PBS, pH 7,4 gewaschen, anschließend für 10 Minuten mit Trichloressigsäure (TCA) behandelt, um alles nicht eingebaute [³H]-Thymidin zu präzipitieren. Anschließend an die TCA-Präzipitation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 2% Natriumdodecylsulfat durch Schütteln bei Raumtemperatur für zwei Stunden gelöst. Der Einbau der radioaktiven Isotope in jede Probe wurde durch Flüssig-Szintillations-Messung eines 200 μl Aliquots in 5 ml ICN-Ecolume-Szintillations-Flüssigkeit unter Verwendung eines Beckman-LS1800-Flüssig-Szintillations-Zählers bestimmt. Es wurde eine zweifache Messung für jede Probe durchgeführt.
Der Einfluss von verschiedenen Parametern wie Konzentration des eingelagerten TGF-β1, der Trocknungsgrad und das Verhältnis von Oberflächenbereich zu Volumen, auf die gesamt Freisetzung von biologisch aktivem TGF-β1 gegenüber der Zeit ist in den 8, 9 und 10 dargestellt. Es wurde eine anhaltende Freisetzung von biologisch aktivem TGF-β1 über einen Zeitraum von 7 Tagen mit einer maximalen Freisetzung, die nach 3 Tagen auftrat, für die verschiedenen Gruppen Proben beobachtet. Die Menge des freigesetzten TGF-β1 hing von den Verfahrensparametern ab. Insbesondere stieg die freigesetzte Menge mit der eingelagerten Konzentration an, und sie fiel mit dem Grad des Trocknens ab. Die Freisetzung hing ebenfalls von der Materialform ab, d. h. dem SA/V-Verhältnis. Mit einem Anstieg des eingelagerten Gehalts von 0,5 auf 1 μg stieg die aus den Körnchen freigesetzte Menge von 3,4 auf 10,5 ng nach 7 Tagen Eintauchzeit (8) an. Die gesamt Freisetzung stieg ebenfalls signifikant mit der Verringerung im Trocknungsgrad von 70 auf 50% (9). Außerdem war die Freisetzung aus kleinen Körnchen dreimal größer als die Freisetzung aus Scheiben auf Grund eines signifikanten Anstiegs im SA/V- Verhältnis von 1,1 auf 10 mm^–1 (10). Daher wurde unter den Versuchsgruppen die größte freigesetzte Menge von 10,5 ng, was 1% der eingelagerten Menge entspricht, im Falle der Proben beobachtet, die mit 1,0 μg TGF-β1 beladen, auf 50% Gewichtsverlust getrocknet und zu Körnchen mit einer Größe im Bereich von 500– 1.000 μm zerdrückt waren. Die Messungen, die dreifach durchgeführt wurden, bestätigten eine anhaltende Freisetzung von biologisch aktivem TGF-β1 über 7 Tage des Eintauchens (11).
Die Sol-Gel-Technologie, die verwendet wurde, um Glas/TGF-β1-Composits zu synthetisieren, veränderte nicht die biologische Funktionalität von TGF-β1. Die Träger zeigten eine andauernde Freisetzung von therapeutischen Mengen an osteoinduktivem Wachstumsfaktor in dieser biologisch aktiven Form.
Beispiel 11
Synthese und Charakterisierung von Ca- und P-enthaltenden Gläsern
Ein Sol-Gel-abgeleitetes Glas auf Siliziumdioxid-Basis, enthaltend Ca und P, wurde synthetisiert durch Mischen der drei Alkoxide TMOS, CME und TEP unter einer Argonatmosphäre und Rühren der Mischung für 5 Minuten unter Verwendung eines Magnetrührers. Es wurde ein Glas mit der Endzusammensetzung von ca. 70% SiO₂, 25% CaO und 5% P₂O₅ (Prozent Trockengewicht) durch Mischen von 3,47 ml TMOS, 8,4 ml CME und 0,24 ml TEP hergestellt. Anschließend wurden 1,1 ml des Sols pro Polystyrolgefäß mit 15 mm Durchmesser gegossen, und 0,38 ml einer 0,1 N Essigsäure wurden zu jedem der Sole hinzugefügt, um die Bedingungen zur Einlagerung von Proteinen nachzuahmen. Die Gele wurden verschlossen, für drei Tage bei Raumtemperatur gealtert und bei 37°C auf 50% Gewichtsverlust getrocknet.
Die Mikrostruktur des hergestellten Ca-P-enthaltenden Glases auf Siliziumdioxid-Basis wurde unter Verwendung der Oberflächenbereichsanalyse (Autosorb-1, Quantachrome) charakterisiert. Vor der Analyse wurden die Proben bei 30°C entgast. Die Porenstruktur des Materials kann gekennzeichnet werden durch die Form der Absorptionsisotherme, d. h. der Ausdruck zeigt Änderungen im Volumen des absorbierten Gases (N₂) gegenüber dem relativen Druck P/P₀. Die Isotherme für das Ca-P-enthaltende Glas auf Siliziumdioxid-Basis ist in 12 gezeigt. Die Form der Isotherme ist charakteristisch für ein mesoporöses Material, wie es in dem Manual on Using a Surface Analyzer Autosorb-1, Quantachrome Corp., S. II-4-46, 1992, definiert ist. Mesoporöse Materialien werden hier definiert als Materialien mit einer Zwischenporengröße oder Poren in einem Größenbereich von größer als 20 Å und weniger als 500 Å. SSA, PV und die durchschnittliche Porengröße wurden jeweils bei 331 m²/g, 0,97 cc/g und 58,4 Å bestimmt.
Die Fähigkeit des synthetisierten Ca-P-enthaltenden Glases, eine Oberflächen-HA-Schicht zu bilden, wurde nach dem Eintauchen in SPS für eine Woche untersucht. Die Proben wurden vor und nach dem Eintauchen unter Verwendung von FTIR untersucht. Die FTIR-Spektren der Proben vor und nach einer Woche des Eintauchens sind in 13 gezeigt. Die Absorptionsbanden in dem Spektrum vor dem Eintauchen (unteres Spektrum) sind charakteristisch für Siliziumdioxidgel. Nach dem Eintauchen trat eine Dublette von Banden bei 603 und 580 cm^–1 (oberes Spektrum) auf. Diese Banden zeigen die Bildung von HA auf der Glasoberfläche, wodurch sich bioaktives Verhalten zeigt.
Beispiel 12
Synthese eines Ca- und P-enthaltenden Sol-Gel-TI-Composits
Sol-Gel-abgeleitetes Glas, enthaltend Si, Ca und P, wurde synthetisiert durch Mischen von TMOS (3,47 ml), CME (8,40 ml) und TEP (0,24 ml), um eine Zusammensetzung mit 70% SiO₂, 25% CaO und 5% P₂O₅ zu bilden, unter einer Argonatmosphäre und Mischen für 15 Minuten. Für jede Probe wurden 0,75 ml der Alkoxidmischung in einen Polystyrolbehälter gegossen und anschließend durch Vortexen mit 0,25 ml einer 0,1 N Essigsäure/Proteinlösung (TI-Konzentration = 2, 3, 4, 5 mg) gemischt. Das Wasser/TMOS-Verhältnis betrug 10 : 1, und das Gelieren aller Proben trat unter 1 Minute ein. Das Altern fand über 3 Tage in verschlossenen Behältern bei Raumtemperatur statt. Die Proben wurden auf 50% ihres Gewichts beim Gießen bei 37°C durch Entfernen der Kappe ihrer Behälter getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Proben zerdrückt, um Körnchen in einem Größenbereich von ca. 100–1.000 μm im Durchmesser zu erhalten.
Beispiel 13
Freisetzung von Trypsininhibitor
Versuche zur Proteinfreisetzung wurden durchgeführt durch Eintauchen von 500 mg der Körnchen in 1 ml 50 mM tris-gepufferter Lösung (pH 7,3 bei 37°C). Die Lösungen wurden nach jedem Zeitpunkt, die zwischen 1 Stunde bis 7 Wochen schwankten, vollständig ausgetauscht. Die Proben wurden eingetaucht in 1 ml reiner Trislösung bei 37°C unter konstantem Schütteln. Für jeden gemessenen Zeitpunkt (1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen) wurde die Lösung gegen frische Trislösung ausgetauscht, und die Proteinkonzentration wurde gemessen unter Verwendung des Kolloidal-Gold-Assays.
Die Proteinkonzentrationen in den Lösungen wurden gemessen unter Verwendung eines Gold-Kolloidal-Assays (Integrated Separation Systems, Natick, MA). Die gesamte Proteinfreisetzung aus dem Ca-P-enthaltenden Glas ist in 14 dargestellt.
Ein Vergleich mit 7 zeigt, dass eine anhaltende Freisetzung über lange Eintauchzeiträume für beide Typen von Glaszusammensetzungen beobachtet wurde. In beiden Fällen wurde eine etwas schnelle Freisetzung beobachtet bei Eintauchzeiten zwischen 4 und 7 Tagen, danach wurde eine gleichförmigere Freisetzung beobachtet. Die freigesetzte Menge hängt von der eingelagerten TI-Konzentration ab, d. h. mit einem größeren TI-Gehalt in der Glasmatrix war die freigesetzte Menge größer. Eine 10%-ige Freisetzung aus der Glasmatrix aus Siliziumdioxid wurde nach 6 Wochen Eintauchen gemessen, während eine 5%-ige Freisetzung aus dem Ca-P-enthaltenden Glas nach 4 Wochen des Eintauchens erhalten wurde. Das Hinzufügen von Ca und P zu einem Sol-Gel-abgeleiteten Siliziumdioxidglas beeinflusste nicht signifikant das Profil der TI-Freisetzung und die freigesetzte Menge.
Beispiel 14
Bioaktivitätsuntersuchungen einschließlich Sol-Gelen mit Trypsininhibitor
Die Proben wurden in gleicher Weise wie oben in Beispiel 12 beschrieben synthetisiert mit der Ausnahme, dass die Verhältnisse der Alkoxide geändert wurden, um drei verschiedene Zusammensetzungen zu erhalten:

(1) 70% SiO₂, 25% CaO und 5% P₂O₅
(2) 87% SiO₂, 10% CaO und 3% P₂O₅
(3) 94% SiO₂, 5% CaO und 1% P₂O₅

Zusammensetzung (1) wurde synthetisiert sowohl mit als auch ohne 4 mg TI, die anderen beiden Zusammensetzungen wurden ohne TI synthetisiert. Die Proben wurden als 25 mg Körnchen in 25 ml einer SPS-Lösung (eine tris-gepufferte Lösung mit Elektrolytkonzentrationen ähnlich dem Plasma) bei 37°C unter konstantem Schütteln eingetaucht. Am Ende der Eintauchzeit (entweder 1, 3 oder 7 Tage) wurde die SPS-Lösung herauspipettiert und anschließend hinsichtlich Ca und PO₄ unter Verwendung von Atomabsorptionsspektrometrie und Kolorimetrie analysiert. Die Körnchen nach dem Eintauchen wurden analysiert nach dem Eintauchen unter Verwendung von FTIR hinsichtlich der Anwesenheit von P-O-Biegepeaks (engl.: „bend peaks„) bei ca. 600 cm^–1.
Die FTIR-Spektren der Glaszusammensetzung (1) vor und nach dem Eintauchen in SPS für eine Woche sind in 15 dargestellt. Das Spektrum der Probe vor dem Eintauchen (unteres Spektrum) zeigt Absorptionsbanden von Siliziumdioxid und Proteinen jeweils in den unteren (1.200 cm^–1) und den höheren (über 1.200 cm^–1) Energiebereichen. Eine Dublette von Banden, angeordnet bei 562 und 603 cm^–1, trat in dem Spektrum nach Eintauchen (oberes Spektrum) auf. Die Dublette, charakteristisch für die P-O-Biegeschwinnungsmode, zeigt die Bildung einer Hydroxyapatit(HA)-Schicht auf der Oberfläche des Sol-Gel-abgeleiteten Glases. Die Bildung der HA-Schicht wurde ebenfalls auf dem Glas der Zusammensetzung (1) ohne TI nachgewiesen. Die Zusammensetzungen (2) und (3) zeigten ebenfalls die Bildung einer HA-Schicht.
Beispiel 15
Synthese unter Verwendung von Calciumsalz
Ein bioaktives Sol-Gel-abgeleitetes Glas mit einer Endzusammensetzung von ca 70 Gew.-% SiO₂, 20 Gew.-% CaO und 5 Gew.-% P₂O₅ wurde wie folgt synthetisiert: 9,3 ml TMOS wurden mit 5,8 entionisiertem Wasser (DI) gemischt und in einem Eis-Ultraschall-Bad für 10 Minuten gerührt. Anschließend wurden 15 μl einer 1 N HCl hinzugefügt, und das Rühren dauerte an bis die Mischung klar wurde. Der pH wurde bei 3,0 gemessen. Die Mischung wurde anschließend zum Rühren auf einen Magnetrührer überführt. Während die Mischung ständig gerührt wurde, wurden 3,08 g CaCl₂ gelöst in 5 ml DI Wasser und 2 ml TEP tropfenweise zu der Mischung hinzugefügt. Das Gesamt-N₂O/TMOS-Verhältnis betrug ca. 10; das Säure/H₂O-Volumenverhältnis betrug ca. 0,0015. Das Sol wurde in Polystyrolgefäße mit 17 mm Durchmesser jeweils 1 ml pro Gefäß gegossen, verschlossen und bei Raumtemperatur geliert. Die Gelierzeit betrug ca. eine Stunde. Die Gele wurden für zehn Tage gealtert und bis zu einem Gewichtsverlust von ca. 70% des Gewichts beim Gießen getrocknet, beides fand bei Raumtemperatur statt. Die resultierenden Glasscheiben waren 8 mm im Durchmesser, 4 mm hoch, und sie waren durchsichtig, was eine homogene Verteilung der Legierungsoxide zeigte. Es wurden keine Brüche in den erhaltenen Monolithen beobachtet.
Beispiel 16
Synthese eines Ca- und P-enthaltenden Sol-Gel/biologisch aktives Molekül-Composit unter Verwendung von Calciumsalz
Ein bioaktives Sol-Gel-abgeleitetes Glas wurde wie in Beispiel 15 hergestellt mit Hinzufügen von biologisch aktiven Molekülen entweder vor oder nachdem das Sol gegossen wurde. Die biologisch aktiven Moleküle werden beispielsweise hinzugefügt wie in den Beispielen 5, 10 oder 11 oben beschrieben.
Die zuvor beschriebenen Beispiele sollen die Erfindung beschreiben und sie nicht in irgendeiner Weise beschränken. Der Fachmann wird erkennen, dass Veränderungen im Schutzbereich der Erfindung, so wie er in den angefügten Ansprüchen dargelegt ist, gemacht werden können.

Claims

Träger mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist, das Glas von 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach Anspruch 1, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas von 60 bis 100 Gew.-% SiO₂, bis zu 40 Gew.-% CaO und bis zu 10 Gew.-% P₂O₅ und von 0,0001 bis 10 Gew.-% biologisch aktive Moleküle umfaßt.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 und 2, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas von 60 bis 80 Gew.-% SiO₂, bis zu 40 Gew.-% CaO und bis zu 10 Gew.-% P₂O₅ umfaßt, wobei der Träger durch ein Verfahren unter Verwendung von Bedingungen, welche die biologische Aktivität der Moleküle erhalten, hergestellt wird.
Träger nach Anspruch 3, wobei die Bedingungen Verfahrenstemperaturen von weniger als 40°C und einen pH-Wert von 1 bis 4,5 umfassen.
Träger nach Anspruch 4, wobei das Verfahren gemäß Anspruch 38 ist.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas von 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und der Träger durch ein Verfahren unter Verwendung eines Siliziumalkoxidvorläufers und Wasser unter Bedingungen hergestellt wird, welche die biologische Aktivität der Moleküle erhalten und die anhaltende Freisetzung der biologisch aktiven Moleküle nach Eintauchen in eine Lösung begünstigen.
Träger nach Anspruch 6, wobei die Bedingungen Verfahrenstemperaturen von weniger als 40°C, einen pH-Wert von 1 bis 4,5 und ein Molverhältnis Wasser zu Siliziumalkoxidvorläufer von 6 : 1 bis 20 : 1 umfassen.
Träger nach Anspruch 6, wobei das Verfahren gemäß Anspruch 37 ist.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei der Träger in eine Lösung mit einem Eisengehalt, entsprechend einem interstitiellen Fluid, für eine Zeitdauer von bis zu etwa 7 Tagen eingetaucht worden ist.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die biologisch aktiven Moleküle von 0,0001 bis 10 Gew.-% des Trägers umfassen.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die biolögisch aktiven Moleküle ein Arzneimittel umfassen.
Träger nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel ein Antibiotikum umfaßt.
Träger nach Anspruch 12, wobei das Antibiotikum Vancomycin ist.
Träger nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel ein Wachstumsfaktor ist.
Träger nach Anspruch 14, wobei der Wachstumsfaktor TGF-β ist.
Träger nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel ein entzündungshemmender Wirkstoff ist.
Träger nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel ein Schmerzmittel ist.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das biologisch aktive Molekül ein Protein umfaßt.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Glas in granulierter Form vorliegt.
Träger nach Anspruch 19, wobei die Körnchen weniger als 2 mm im Durchmesser sind.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Glas in Scheibenform vorliegt.
Träger nach Anspruch 21, wobei die Scheiben einen Durchmesser von etwa 11 mm und eine Höhe von etwa 4 mm aufweisen.
Träger nach Anspruch 21, wobei die Scheiben einen Durchmesser von etwa 5,5 mm und eine Höhe von etwa 8 mm aufweisen.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und mindestens zwei verschiedenen Arten von biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt.
Träger nach Anspruch 24, wobei der Träger ein Verbundträger ist, umfassend Körnchen und einen Überzug, wobei die Körnchen eine erste Art von darin eingelagerten, biologisch aktiven Molekülen enthalten und der Überzug eine zweite Art von darin eingelagerten, biologisch aktiven Molekülen enthält.
Verbundträger mit kontrollierter Freisetzung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix umfaßt, wobei der Träger Körnchen und einen Überzug umfaßt, wobei die Körnchen die darin eingelagerten, biologisch aktiven Moleküle in einer ersten Konzentration enthalten und der Überzug die darin eingelagerten, biologisch aktiven Moleküle in einer zweiten Konzentration enthält.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Träger in der Form eines Überzugs auf einem Implantat zur Füllung eines Knochendefekts vorliegt.
Träger nach Anspruch 27, wobei das Implantat in granulierter Form vorliegt.
Träger nach Anspruch 27, wobei das Implantat eine Prothesevorrichtung ist.
Implantat mit einem Überzug auf mindestens einem Teil des Implantats, wobei der Überzug einen Träger mit kontrollierter Freisetzung umfaßt, der ein Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist, das Glas von 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt.
Implantat nach Anspruch 30, wobei das bioaktive Glas in granulierter Form vorliegt.
Implantat nach Anspruch 30 oder 31, wobei das Implantat eine Prothesevorrichtung umfaßt.
Zusammensetzung, umfassend Körnchen von Trägern mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Zusammensetzung Körnchen im Größenbereich von 500 μm bis 700 μm umfaßt.
Zusammensetzung, umfassend Körnchen von Trägern mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Zusammensetzung Körnchen im Größenbereich von 500 μm bis 5 mm im Durchmesser umfaßt.
Zusammensetzung, umfassend Körnchen von Trägern mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Zusammensetzung mindestens zwei Populationen von Körnchen umfaßt, wobei jede der Populationen eine andere Art von darin eingelagerten, biologisch aktiven Molekülen aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei weiter mindestens eine der Populationen Körnchen eines anderen Größenbereichs als die anderen Populationen umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist und 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte (a) des Kombinierens eines Siliziumalkoxidvorläufers mit deionisiertem Wasser, um ein erstes Gemisch zu bilden, (b) des Zugebens von Säure, um ein zweites Gemisch mit einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 4,5 zu bilden, (c) des Zugebens der biologisch aktiven Moleküle in das Gemisch von Schritt (b), während der pH-Wert im Bereich von 1 bis 4,5 gehalten wird, um ein weiteres Gemisch zu bilden, wobei das weitere Gemisch ein Molverhältnis Wasser/Vorläufer von 6 : 1 bis 20 : 1 aufweist und in der Form eines biologisch aktive Moleküle-enthaltenden flüssigen Sols vorliegt, (d) des Bildenlassens eines Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C aus dem flüssigen Solgemisch von Schritt (c), (e) des Alterns des Gels bei einer Temperatur von 0° bis 40°C für etwa einen Tag bis zu etwa vier Wochen und (f) des Trocknens des gealterten Gels bei einer Temperatur von 15°C bis 40°C, bis ein Gewichtsverlust von 50% bis 80% im Gel beobachtet wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist und 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte (a) des Kombinierens eines Siliziumalkoxidvorläufers und eines Calciumalkoxids oder eines Phosphoralkoxids oder beiden, um ein erstes Gemisch zu bilden, (b) des Zugebens der biologisch aktiven Moleküle in einer Säurelösung zum ersten Gemisch, um ein zweites Gemisch mit einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 4,5 zu bilden, (c) des Bildenlassens eines Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C aus dem zweiten Gemisch, (d) des Alterns des Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C für etwa einen Tag bis zu etwa vier Wochen und (e) des Trocknens des gealterten Gels bei einer Temperatur von 15°C bis 40°C, bis ein Gewichtsverlust von 50% bis 80% im Gel beobachtet wird, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Oxide in den folgenden Gewichtsprozenten nach dem Trocknen vorhanden sind: von 60 bis 100% Silizium, bis zu 40% Calcium und bis zu 10% Phosphor.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist und 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte (a) des Kombinierens eines Siliziumalkoxidvorläufers mit deionisiertem Wasser und Methanol in einem Molverhältnis von Methanol/Vorläufer von etwa 1 : 1, um ein erstes Gemisch zu bilden, (b) des Zugebens von Säure, um ein zweites Gemisch mit einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 4,5 zu bilden, (c) des Zugebens der biologisch aktiven Moleküle in das zweite Gemisch, während der pH-Wert im Bereich von 1 bis 4,5 gehalten wird, um ein drittes Gemisch zu bilden, wobei das dritte Gemisch ein Molverhältnis Wasser/Vorläufer von 6 : 1 bis 20 : 1 aufweist, (d) des Bildenlassens eines Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C aus dem dritten Gemisch, (e) des Alterns des Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C für etwa einen Tag bis zu etwa vier Wochen und (f) des Trocknens des gealterten Gels bei einer Temperatur von 15°C bis 40°C, bis ein Gewichtsverlust von 50% bis 80% im Gel beobachtet wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist und 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte (a) des Kombinierens eines Siliziumalkoxidvorläufers und eines Calciumalkoxids unter einer Argonatmosphäre und des Mischens für bis zu 15 Minuten, um ein erstes Gemisch zu bilden, (b) des Zugebens der biologisch aktiven Moleküle zum ersten Gemisch unter wässrigen Bedingungen innerhalb eines pH-Bereichs von 1 bis 4,5, um ein zweites Gemisch zu bilden, (c) des Bildenlassens eines Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C aus dem zweiten Gemisch, (d) des Alterns des Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C für etwa einen Tag bis zu etwa vier Wochen und (e) des Trocknens des gealterten Gels bei einer Temperatur von 15°C bis 40°C, bis ein Gewichtsverlust von 50% bis 80% im Gel beobachtet wird, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 41, das weiter die Zugabe von Phosphoralkoxid in Schritt (a) umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix des Glases eingelagert sind, umfaßt, wobei das Glas bioaktiv ist und 60 bis 100 Gew.-% SiO₂ umfaßt und die poröse Matrix Porengrößen im Nanometerbereich umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte (a) des Kombinierens eines Siliziumalkoxidvorläufers mit deionisiertem Wasser, um ein erstes Gemisch zu bilden, (b) des Zugebens von Säure, um ein zweites Gemisch mit einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 4,5 zu bilden, (c) des Zugebens eines Calciumsalzes zum zweiten Gemisch unter Rühren, um ein drittes Gemisch zu bilden, (d) des Zugebens der biologisch aktiven Moleküle zum dritten Gemisch, während der pH-Wert innerhalb des Bereiches von 1 bis 4,5 gehalten wird, um ein viertes Gemisch zu bilden, wobei das vierte Gemisch ein Molverhältnis Wasser/Vorläufer von 6 : 1 bis 20 : 1 aufweist, e) des Bildenlassens eines Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C aus dem vierten Gemischs, (f) des Alterns des Gels bei einer Temperatur von 0°C bis 40°C für etwa einen Tag bis zu etwa vier Wochen und g) des Trocknens des gealterten Gels bei einer Temperatur von 15°C bis 40°C, bis ein Gewichtsverlust von 50% bis 80% im Gel beobachtet wird, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 43, das weiter die Zugabe von Phosphoralkoxid in Schritt (c) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Oxide in den folgenden Gewichtsprozenten nach dem Trocknen vorhanden sind: von 60 bis 100% Silizium, bis zu 40% Calcium und bis zu 10% Phosphor.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 45, wobei der Siliziumalkoxidvorläufer Tetramethylorthosilan ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 46, wobei die biologisch aktiven Moleküle von 0,0001 bis 10 Gew.-% des Trägers umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 47, wobei die biologisch aktiven Moleküle ein Arzneimittel umfassen.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Arzneimittel ein Antibiotikum umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei das Antibiotikum Vancomycin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 50, wobei das biologisch ak tive Molekül ein Protein umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Arzneimittel ein Wachstumsfaktor ist.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei der Wachstumsfaktor TGF-β ist.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Arzneimittel ein entzündungshemmender Wirkstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Arzneimittel ein Schmerzmittel ist.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 36 zur Abgabe biologischer Moleküle an einen Knochendefekt, umfassend das Implantieren des Trägers in den Defekt.
Träger nach Anspruch 56, wobei der Träger in der Form eines Überzugs auf einem Implantat zur Füllung des Knochendefektes vorliegt.
Träger nach Anspruch 57, wobei das Implantat in granulierter Form vorliegt.
Träger nach einem der Ansprüche 56 bis 58, wobei das Implantat eine Prothesevorrichtung ist.
Träger nach einem der Ansprüche 56 bis 59, wobei die biologisch aktiven Moleküle nach Implantation ohne größere Änderungen der Rate abgegeben werden.
Träger nach Anspruch 60, wobei der Träger in eine Lösung mit einem Eisengehalt, entsprechend einem interstitiellen Fluid, für eine Zeitdauer von bis zu etwa sieben Tagen vor der Ausführung eingetaucht wird.
Träger mit kontrollierter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 36 für die anhaltende Abgabe eines Antibiotikums in situ, umfassend das Inkontaktbringen des Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und mindestens ein in die Matrix eingelagertes Antibiotikum umfaßt, mit einer Probe.
Verwendung eines Trägers mit kontrollierter Freisetzung, der Glas auf Siliziumdioxid-Basis mit einer porösen Matrix und biologisch aktiven Molekülen, die überall in die Matrix eingelagert sind, umfaßt, wobei der Träger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 36 vorliegt, zur Herstellung eines Trägers für die Abgabe biologischer Moleküle bei einem Knochendefekt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei der Träger in der Form eines Implantats vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 64, wobei das Implantat eine Prothesevorrichtung ist.